RU2646103C2 - Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля - Google Patents
Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646103C2 RU2646103C2 RU2016111874A RU2016111874A RU2646103C2 RU 2646103 C2 RU2646103 C2 RU 2646103C2 RU 2016111874 A RU2016111874 A RU 2016111874A RU 2016111874 A RU2016111874 A RU 2016111874A RU 2646103 C2 RU2646103 C2 RU 2646103C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- gel
- hours
- stage
- buffer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 36
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 46
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 13
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 10
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 claims 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 34
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 29
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 29
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 26
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 15
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 13
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 13
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 6
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000486679 Antitype Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000001759 immunoprophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/24—Extraction; Separation; Purification by electrochemical means
- C07K1/26—Electrophoresis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения ренатурированного белка G из маркированного полиакриламидного геля. Предложенный способ включает этапы маркирования положения белка G в составе полиакриламидного геля, отделения фрагмента маркированного геля, содержащего белок G, последовательной обработки фрагмента геля денатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 6 М мочевину, 2 М тиомочевину, в течение 1 час и ренатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаина, 1 мМ ЭДТА, в течение 3 час при 20°С с трехкратной сменой буфера и завершающей электроэлюцией ренатурированного белка G из измельченного геля в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5), в течение 2 часов и силой тока 200 мА. Предложенный способ может быть использован для выделения белка G, имеющего сохраненные иммунобиологические свойства. 7 ил., 7 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и описывает сочетанный способ очистки и ренатурации белка G, который может использоваться при создании специфических иммунодиагностических и иммунопрофилактических средств.
Известны многочисленные методы очистки белков, включающие, в том числе, электроэлюцию из агарозных и полиакриламидных гелей, которые широко распространены в повседневной лабораторной практике [Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. - М.: Наука, 1991. - 290 с., Финдлей Д.Б. Биологические мембраны: Методы / Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза. М.: Мир, 1990. С. 271-273]. Их популярность связана с возможностью наработать некоторые необходимые для исследователей количества белка и избегать при этом трудоемких этапов выделения индивидуальных белков как и фрагментов ДНК (для выделения последних электроэлюция применяется значительно чаще). При очистке белков электроэлюция может не только выступать в качестве единственного и самостоятельного метода выделения, но и дополняется в некоторых случаях хроматографией, дифференциальным осажденим и другими.
Известны ренатурационные способы, имеющие одно принципиальное сходство, которое заключается в разбавлении концентрированного раствора денатурированного белка специальными буферами, что сопровождается образованием нативной, биологически активной структурой полипептида [Richard R, Burgess 2009. Meth Enzym 463: 259-281].
К настоящему времени опубликованы многочисленные протоколы ренатурации отдельных белков способом, в основе которого лежит разведение ренатурационных растворов, однако, метод имеет несколько существенных недостатков [Cabrita LD, Bottomley SP. 2004. Biotech Ann Rev 10: 31-49]. Известна альтернативная техника перевода белков в растворы с низкой ионной силой, использующая диализ или ультрафильтрацию [Yoshii Н, Furuta Т, Yonehara Т, Ito D, Linko Y-Y, Linko P: Biosci Biotechnol Biochem 2000, 64:1159-1165].
Предложен ряд методических подходов, имеющих целью преодолеть концентрационный барьер [Li М, Poliakov A, Danielson UH, Su Z, Janson JC: Biotechnol Lett 2003, 5:1729-1734].
Однако все вышеуказанные методы приводят к агрегации, очень низкому выходу и сильному разбавлению конечного раствора.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в том, что не изменяется антигенная и функциональная активность белка, что сохраняет иммунобиологические и функциональные свойства очищенного белка и позволяет включать его в состав иммунохимических тест-систем.
Технический результат достигается путем получения очищенного белка при помощи препаративного электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия с последующей ренатурацией в геле и электороэлюции биологически активного восстановленного белка, а ренатурация биологически активной третичной структуры белка G оценивается по восстановлению его антителсвязывающей способности в иммунохимических тестах.
Технический результат достигается тем, что лизированную бактериальную культуру, продуцировавшую белок G преимущественно в составе телец включения, центрифугируют в течение 15 мин при 1500×g. Полученный осадок переосаждают при тех же условиях при 10°С, ресуспендируют в растворе 8 М мочевины, содержащем 10 мM Трис-HCI (рН 8,0) и 1,5 мM ЭДТА и перемешивают длительное время для наиболее полного растворения. Полученную суспензию центрифугируют при 14000×g в течение 30 мин и 12°С. Отбирают надосадочную фракцию и используют ее для фракционирования белков при помощи препаративного электрофореза в полиакриламидном геле в редуцирующих условиях (ДСН-ПААГ). По завершении электрофореза гели подвергают экспресс окраске холодным 0,4 М раствором калия хлористого с целью экспресс-идентификации. Идентифицированную полосу белка G вырезают из геля и промывают денатурирующим буфером, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 6 М мочевину, 2 М тиомочевину в течение 1 час, после чего погружают гель в ренатурационный буфер, содержащий 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаин, 1 мМ ЭДТА. Ренатурацию проводят при умеренном перемешивании емкости с гелем в течение 3 час при 20°С, буфер меняют три раза, строго контролируя его температуру, после чего промывают деионизованной водой и замораживают при - 80°С или жидким азотом. Гель измельчают в замороженном состоянии и проводят электроэлюцию ренатурированного белка в течение 2 час и силой тока 200 мА в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5). Элюированный белок концентрируют ультрафильтрацией над мембраной YM-10 и диализуют против того же буфера, раствор меняют три раза. Полученный таким образом белок G представляет собой высокоочищенный препарат, обладающий присущими ему иммунобиологическими свойствами.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг. 1. Электрофорез препаратов белка G на различных этапах выделения.
Фиг. 2. Иммуноферментный анализ препаратов белка G.
Фиг. 3. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ препаратов белка G.
Фиг. 4. Электрофорез и иммуноблот белка G, обработанный различными иммуноглобулинами.
Фиг. 5. Определение иммунохимических свойств ренатурированного белка G при помощи дот-блота по схеме иммуноблота с электропереносом белков после электрофореза в ДСН-ПААГ.
Фиг. 6. Определение иммунохимических свойств ренатурированного белка G при помощи дот-блота.
Фиг. 7. Определение иммунохимических свойств ренатурированного белка G при помощи непрямого дот-блота с исключением возможного неспецифического взаимодействия конъюгатов и белка G.
Пример 1. Условия ренатурации белка G.
Применение электрофореза позволяет решить две задачи: во-первых, разделить сложную белковую смесь с выделением зоны, содержащей гомогенный белок, и, во-вторых, создать условия, ограничивающие подвижность молекул белка и предотвратить агрегацию в процессе ренатурации. Предварительные опыты показали, что приемлемое разрешение белков электрофорезом достигается при нанесении на препаративный мини-гель 250 мкл препарата белков, растворенных в 8 М мочевине. Маркировку геля проводят при помощи предокрашенных белковых маркеров молекулярных масс, которые вносят в отдельный колодец препаративного мини-геля. После одновременного разделения маркеров и образца, находящегося в препаративной части геля, полосу с маркерами отделяют, окрашивают препаративную часть отдельно, используя раствор хлористого калия, после чего сопоставляют разделенные части геля для точной идентификации положения белка G.
Для экспресс-окраски и идентификации термоденатурированного ДСН белка G, находящегося в составе геля, используют обработку холодным 0,4 М раствором калия хлористого (Фиг. 1, линия 1. Числами в верхней части фигуры обозначены линии: 1 - фрагмент геля, окрашенный хлористым калием после разделения клеточного лизата, содержащего белок G; 2 - клеточный лизат; 3 - белок G, ренатурированный и выделенный из фрагмента геля; 4 - препарат как в линии 3, разведенный в 15 раз; 5 - маркеры молекулярных масс, числовые значения приведены в правой части фигуры и выражены в килодальтонах; 6 - надосадочная фракция клеточного лизата, содержащая растворимые белки; 7 - белок G, выделенный из растворимой фракции клеточного лизата при помощи аффинной хроматографии на IgG Sepharose® 6 FF с привитыми иммуноглобулинами человека из нормальной сыворотки крови).
Идентифицированную полосу белка G вырезают из геля и насыщают буфером, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 6 М мочевину и 2 М тиомочевину в течение 1 час, при этом происходит удаление хлористого калия, замещение ДСН тритоном Х-100, а 6 М мочевина в составе буферного раствора поддерживает денатурирующие условия для молекул белка G. Гель помещают в ренатурационный буфер, содержащий 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаин, 1 мМ ЭДТА. Ренатурацию проводят с контролем температуры в течение 3 час при 20°С при умеренном перемешивании емкости с гелем и трехкратной сменой буфера, после чего промывают деионизованной водой, замораживают, измельчают в замороженном состоянии и проводят электроэлюцию ренатурированного белка из диспергированного геля в течение 2 час и силой тока 200 мА в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5). Результаты электроэлюции контролируют ДСН-ПААГ (Фиг. 1). Было выделено до 1,8 мг белка G после электрофореза в геле мини-формата с использованием аппарата MiniVE, GE Healthcare, ренатурации и электроэлюции. Функциональную активность очищенного и ренатурированного белка G в дальнейшем подтверждают иммуноферментным анализом и иммуноблотами.
Пример 2. Применение буферного раствора с увеличенной концентрацией денатурирующего компонента.
Электрофорез проводят как в примере 1, вместе с тем, для растворения препарата белков используют буфер состава - 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 4% додецилсульфата натрия (SDS), 20% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола и 0,02% бромфенолового синего. Растворение белков достигается прогреванием проб, суспензированных в этом буфере в объемном соотношении 1:1 в течение 15 мин [Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (5259): 680-685]. Определяют положение полосы белка G, вырезают ее из геля и помещают для насыщения в буферный раствор, содержащий 25 мМ Трис (рН 8.0-8.2), 1% Тритон Х-100 и 8 М мочевину в течение 1-2 час, в результате чего происходит удаление хлористого калия, введенного для обратимой окраски геля, замещение ДСН тритоном Х-100, а 8 М мочевина в составе денатурирующего буферного раствора поддерживает условия, при которых полипептидные цепи молекулы белка G находятся в «развернутом» состоянии. Гель с денатурированным белком помещают в ренатурационный буфер, содержащий 25 мМ Трис (рН 8.0), 150 мМ NaCl, 0,02% твин-80, 1 мМ ЭДТА и инкубируют при умеренном перемешивании буфера в емкости с гелем в течение 18 час при 12-14°С. Объем буфера должен не менее чем в 200 раз превосходить объем полоски геля. Полученные результаты аналогичны примеру 1.
Пример 3. Использование буферных растворов с компонентами, обеспечивающими тиол-дисульфидное равновесие.
Электрофорез проводят как в предыдущих примерах, однако, для обработки гелевых полос, содержащих белок G, используют буферные растворы, которые на этапе денатурации обеспечивают расщепление возможных дисульфидных связей между цистеинами полипептидной цепи, а на этапе ренатурации - их восстановление. Денатурирующий буфер содержит 20 мМ Трис (рН 8.0), 8 М мочевину, 0,3% саркозил, 20 мМ CHAPS и 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Для ренатурации белка полоску геля помещают в 200-кратный избыток (по объему) буферного раствора, содержащего 20 мМ Трис (рН 8.0), 150 мМ натрия хлористого, 20 мМ CHAPS, 5 мМ цистеина и 50 мМ цистина. Перед этим этапом температура буферного раствора должна быть обязательно доведена до 18°С. Наличие в буфере цистеин/цистиновой пары, слабощелочная среда, умеренная температура и продолжительная инкубация (не менее 12 час) способствуют восстановлению дисульфижных связей. Полученные результаты аналогичны примеру 1.
Пример 4. Твердофазный иммуноферментный анализ.
Планшеты (96 лунок) сенсибилизируют последовательным внесением в каждую лунку 100 мкл раствора, содержащего 0,1 М карбонатный буфер (рН 9,6) и 800 нг белка G с инкубацией при температуре 6°С в течение 18 час, после чего проводят четырехкратную промывку 10 мМ фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2), содержащим 0,05% твина-20 (ФСБТ). Неспецифическую сорбцию блокируют 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБТ в течение 2 час при 37°С, причем на этом этапе объем наполнения лунок составлял 120 мкл. Лунки промывают, как описано ранее, но трехкратно, после чего сразу же наполняют предварительно приготовленными растворами нормальных иммуноглобулинов кролика в ФСБТ. Иммуноглобулины разводят, начиная с наибольшей концентрации, составлявшей 2500 нг/мл с кратностью разведения 2,5. Последующие стадии анализа проводят аналогично с включением промежуточных промывок ФСБТ между каждой инкубацией. Этапы включали инкубацию с раствором биотинилированных антикроличьих F(ab)2 фрагментов антител (1:3000, 2 час, 37°С) в ФСБТ, с раствором стрептавидин-пероксидазы (1:4000, 1 час, 37°С), визуализацию субстратом и остановку реакции 2 М раствором серной кислоты. Субстратом служил 0,1% раствор о-фенилендиамина и 0,03% раствор перекиси водорода в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5,0) (Фиг. 2. Буквами в верхней части фигуры обозначены кривые: А, В - лунки сенсибилизированы белком G, очищенным аффинной хроматографией на IgG Sepharose® 6 FF с привитыми иммуноглобулинами человека из нормальной сыворотки крови; С, D - лунки сенсибилизированы белком G, ренатурированного и выделенного электроэлюцией из полиакриламидного геля). Титрование IgG на планшетах, сенсибилизированных различными препаратами белка G, представлено S-образными кривыми, горизонтальные участки которых в области высоких концентраций соответствуют области насыщения. Восходящие участки кривых А и В расположены в области концентраций IgG от 2,5 нг/мл до 80 нг/мл, для кривых С и D - от 10 нг/мл до 300 нг/мл. Принимая во внимание одинаковые номинальные концентрации белка G в препаратах, установленное различие концентрационных интервалов показывает сниженную долю функционально-активных молекул белка G в ренатурированном препарате по сравнению с белком G, очищенным аффинной хроматографией на IgG Sepharose® 6 FF с привитыми иммуноглобулинами человека из нормальной сыворотки крови.
Пример 5. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ.
Для проведения непрямого твердофазного ИФА каждую лунку планшета (96 лунок) сенсибилизируют, заполняя 100 мкл раствора, содержащего 0,1 М карбонатный буфер (рН 9,6) и 500 нг иммуноглобулинов нормальной сыворотки кролика с инкубацией при температуре 6°С в течение 18 час, после чего проводят четырехкратную промывку ФСБТ. Неспецифическую сорбцию блокируют 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБТ в течение 2 час при 37°С, причем на этом этапе объем наполнения лунок составлял 120 мкл. В последующем, этапы анализа проводят аналогично, с промежуточными промывками ФСБТ и включают инкубацию с приготовленными предварительно разведениями белка G (начиная с наибольшей концентрации 600 нг/мл), с кратностью 2,5, с раствором нормальной сыворотки мыши (1:350, 2 час, 37°С), раствором антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (1:4000, 2 час, 37°С), и субстратом. Раствор субстрата содержал 0,1% о-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5,0). Реакцию останавливают 2 М раствором серной кислоты. (Фиг. 3 показывает, что белок G титруется и интервале концентраций от 10 нг/мл до 150 нг/мл для кривых А и В и от 20 нг/мл до 300 нг/мл для кривых С и D. Буквами в верхней части фигуры обозначены кривые титрования: А, В - белка G, очищенного аффинной хроматографией на IgG Sepharose® 6 FF с привитыми иммуноглобулинами человека из нормальной сыворотки крови; С, D - белка G, ренатурированного и выделенного электроэлюциией из полиакриламидного геля.) Различие интервалов титрования и их параллельный характер указывают на концентрационные, но не функциональные различия двух использованных препаратов белка G.
Пример 6. Иммуноблот.
Разделение очищенного белка G и предокрашенных маркеров проводили ДСН-электрофорезом в 12,5% полиакриламидном геле в редуцирующих условиях в режиме постоянного тока 20 мА. После завершения ДСН-ПААГ гель освобождали от стеклянных пластин и помещали на 15 мин в буферный раствор, содержащий 25 мМ трис основной, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, 20% этанол (рН 8,3). Раствор в кювете с гелем периодически перемешивают. Гель с необходимыми прокладками помещают в устройство для переноса, накладывают на него нитроцеллюлозную мембрану со стороны анода, слои фильтровальной бумаги для уплотнения, предварительно увлажненные буфером, электроды и подключают ток. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят перпендикулярно первому направлению разделения при постоянном токе 400 мА и температуре 22°С, в течение 1 час, после чего мембрану осторожно извлекают и немедленно помещают в блокирующий раствор, содержащий 1% бычий сывороточный альбумин, или 5% обезжиренное молоко в ФСБТ. Подавление неспецифических взаимодействий проводят при перемешивании раствора на качалке в течение 2 час при 37°С. Для промывки мембран и разведения белков на каждом промежуточном этапе используют ФСБТ. Блокированную и промытую мембрану разрезают на части, каждую из которых инкубируют в отдельных кюветах с различными растворами нормальных сывороток в течение 2 час при 37°С, после чего промывают и инкубируют при тех же условиях с соответствующими растворами конъюгатов антивидовых антител с пероксидазой хрена. Далее промывают ФСБТ и помещают в раствор хромогенного субстрата, содержащего 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), хлорид никеля (0,1 мг/мл), 0,03% Н2О2, 0,05 М Трис-HCl (рН 7,6). Перекись водорода добавляют после растворения всех компонентов субстрата и используют его немедленно, реакцию останавливают, промывая окрашенные фрагменты мембран дистиллированной водой (Фиг. 4. Числами в верхней части фигуры обозначены линии: 1, 2, 3, 4 - фрагменты мембран иммуноблота; 5 - фрагмент геля, окрашенный кумасси G-250; 3 - предокрашенные маркеры молекулярных масс, числовые значения приведены в правой части фигуры и выражены в килодальтонах, все остальные линии содержат очищенный белок G. Обработка мембран: линия 1 - сыворотка крови человека; линия 2 - сыворотка крови мышей; линия 4 - сыворотка крови кролика.). Анализ иммуноблотов позволяет сделать заключение о том, что белок G денатурируется в результате термообработки образцов в присутствии 0,1% ДСН буфера Лэмли перед электрофорезом, утрачивает способность связывать различные иммуноглобулины G и остается преимущественно в денатурированном состоянии после переноса на нитроцеллюлозную мембрану, что подтверждается чрезвычайно слабой окраской полос или ее отсутствием (Фиг. 4, линии 1, 2 и 4). В это же время, электрофореграмма (Фиг. 4, линия 5) указывает на значительное (не менее 1 мкг) количество белка G в линиях.
Пример 7. Дот-блот.
Для подготовки различных вариантов рабочей нитроцеллюлозной мембраны готовят ряд последовательных двукратных разведений белков «первого слоя», в качестве которых выступают белок G, или иммуноглобулины G нормальной сыворотки крови различных животных, в частности кролика и мыши. Растворы белков переносят в объеме 1 мкл каждого разведения рядами на поверхность размеченной мембраны. Мембрану сушат в течение 1 час при 23°С, после чего погружают в блокирующий раствор, содержащий 1% бычий сывороточный альбумин или 5% обезжиренное молоко в ФСБТ. Блокировку проводят на качалке в течение 2 час при 37°С. Для промывок мембран и разведения белков на каждом промежуточном этапе используют ФСБТ. Перечисленные этапы являются общими для всех проводок. На последующих этапах, в зависимости от схемы эксперимента, применяют различные последовательности инкубации мембран в растворах нормальных сывороток животных, белка G, конъюгатов различных антивидовых антител с пероксидазой хрена, как правило, в течение 2 час при 37°С с необходимыми промежуточными промывками ФСБТ. При длительных экспериментах, выходящих за пределы одного рабочего дня, этапы инкубации проводят в течение ночного времени, но при 6°С. Этап обработки субстратом является общим и завершающим для всех схем проводки: промытую мембрану помещают в раствор субстрата, содержащего 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), хлорид никеля (0,1 мг/мл), 0,03% Н2О2, 0,05 М Трис-HCl (рН 7,6). После добавления перекиси водорода субстрат используют немедленно, реакцию останавливают, промывая мембрану дистиллированной водой. Описания всех использованных схем дот-блотов приведены на Фиг. 5. Числами в верхней части фигуры обозначены секторы нитроцеллюлозной мембраны с сорбированными белками в последовательных двукратных разведениях, начиная с наибольшей концентрации, составляющей 1000 мкг/мл (секторы 1 всех полос). Полосы с сорбированным белком G обозначены слева надписью «Белок G», полосы с сорбированным бычьим сывороточным альбумином обозначены слева надписью «Альбумин». Полосы, обозначенные справа как «А» и «В» вместе с прилегающими полосами «Альбумин», отличаются проводкой мембран.
Проводка А: этап 1 - сорбция белка G и альбумина, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - промывка ФСБТ; этап 5 - инкубация с раствором IgG мыши, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 6 - промывка ФСБТ; этап 7 - инкубация с конъюгатами антимышиных антител с пероксидазой хрена, 2 час, 37°С; этап 8 - промывка ФСБТ; этап 9 - хромогенный субстрат.
Проводка В: этап 1 - сорбция белка G и альбумина, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - промывка ФСБТ; этап 5 - инкубация с раствором IgG кролика, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 6 - промывка ФСБТ; этап 7 - инкубация с конъюгатами антикроличьих антител с пероксидазой хрена, 2 час, 37°С; этап 8 - промывка ФСБТ; этап 9 - хромогенный субстрат. Числами в верхней части фигуры обозначены участки нитроцеллюлозной мембраны с сорбированными иммуноглобулинами G (IgG) в последовательных двукратных разведениях, начиная с наибольшей концентрации IgG, составляющей 1000 мкг/мл (участки 1). Виды сорбированных на нитроцеллюлозную мембрану IgG обозначены в левой части фигуры.
Проводку мембран осуществляли следующим образом: этап 1 - сорбция IgG мыши или кролика, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - инкубация с раствором ренатурированного белка G, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 5 - промывка ФСБТ; этап 6 - инкубация с растворами IgG: верхний ряд - IgG кролика, нижний ряд - IgG мыши, 1 мкг/мл, 18 час, 6°С; этап 7 - промывка ФСБТ; этап 8 - инкубация с конъюгированными с пероксидазой хрена антивидовыми антителами против IgG, использованных на этапе 6, 2 час, 37°С; этап 9 - промывка ФСБТ; этап 10 - хромогенный субстрат. Числами в верхней части фигуры обозначены секторы нитроцеллюлозной мембраны с сорбированными белками в последовательных двукратных разведениях, начиная с наибольшей концентрации, составляющей 1000 мкг/мл (секторы 1 всех полос). Полосы с сорбированными IgG мыши в составе сыворотки крови мышей также обозначены надписью слева. Полосы, обозначенные справа как «А», используют в проводке белок G, очищенный из растворимой фракции лизатов клеток Е. coli аффинной хроматографией при помощи IgG Sepharose 6В. Полосы «В» используют в проводке белок G, ренатурированный и выделенный электроэлюцией в настоящем исследовании.
Проводка полос «А» и «В» с сорбированными IgG кролика: этап 1 - сорбция IgG кролика, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - промывка ФСБТ; этап 5 - инкубация с растворами белка G: линия «А» - очищенного аффинной хроматографией, линия «В» - ренатурированного и выделенного электроэлюцией, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 6 - промывка ФСБТ; этап 7 - инкубация с раствором нормальной сыворотки мышей (1:100), 2 час, 37°С; этап 8 - промывка ФСБТ; этап 9 - инкубация с конъюгатами антимышиных антител с пероксидазой хрена, 2 час, 37°С; этап 10 - промывка ФСБТ; этап 11 - хромогенный субстрат.
Проводка полос «А» и «В» с сорбированной нормальной сывороткой мышей (1:30): этап 1 - сорбция белков сыворотки, включая IgG мыши, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - промывка ФСБТ; этап 5 - инкубация с растворами белка G: линия «А» - очищенного аффинной хроматографией, линия «В» - ренатурированного и выделенного электроэлюцией, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 6 - промывка ФСБТ; этап 7 - инкубация с раствором IgG кролика (1 мкг/мл), 2 час, 37°С; этап 8 - промывка ФСБТ; этап 9 - инкубация с биотинилированными F(ab)2 фрагментами антикроличьих антител, 2 час, 37°С; этап 10 - промывка ФСБТ; этап 11 - стрептавидин-пероксидаза (1:3000), 2 час, 37°С; этап 12 - промывка ФСБТ; этап 13 - хромогенный субстрат.
Для подтверждения свойств ренатурированного белка используют различные схемы последовательных иммунохимических взаимодействий (различные проводки). При схеме прямого дот-блота, как и в иммуноблоте (Фиг. 4), на нитроцеллюлозную мембрану первым слоем сорбируют очищенный, функционально активный ренатурированный белок G и после блокировки проводят через растворы различных антител, соответствующих антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и субстрата (Фиг. 5). Появление окрашенных пятен в 11 секторе для кроличьих антител и в 12 секторе для антител мыши соответствуют количествам белка G 0,98 нг и 0,49 нг в 1 мкл раствора, сорбированного на мембраны. Альбумин, использованный в качестве контроля в проводках А и В, не показывает окраски пятен даже при сорбции на мембрану 1000 нг белка (Фиг. 5). По сравнению с иммуноблотом (Фиг. 4) ренатурированный белок G в прямом варианте дот-блота проявляет способность связывать IgG кролика и мыши в концентрациях на три порядка меньше, чем белок G, термоденатурированный перед ДСН-электрофорезом.
В отличие от прямого дот-блота, новый вариант использует белок G в качестве «мостика», связывающего иммуноглобулины различных видов животных (Фиг. 6). В этом случае макромолекула белка G должна нести по крайней мере два центра связывания константных областей IgG, и проявление такой способности доказывает наличие функциональной активности белка G, подвергнутого ренатурации. Для подтверждения, в эксперименте на нитроцеллюлозную мембрану сорбируют различные виды иммуноглобулинов G, соответственно, кролика и мыши в последовательных двукратных разведениях от нулевого до 1:2048, что соответствует в последней, 12-й ступени концентрации 0,488 мкг/мл. Далее, IgG первого слоя взаимодействуют с белком G, к которому перекрестно присоединяют IgG мыши и кролика. Обработка соответствующими конъюгированными антивидовыми антителами и субстратом приводит к появлению окрашенных пятен, отчетливо различимых в шестом и седьмом разведениях, что доказывает наличие у ренатурированного белка G способности связывать IgG мыши и кролика. Расчеты показывают, что для связывания белка G необходимо сорбировать на мембрану в одном пятне не менее 30 нг антител (Фиг. 6, участки 6 и 7). Однако в этой схеме мы не можем исключить вероятность прямого взаимодействия антивидовых конъюгатов с сорбированным белком G первого слоя за счет оставшихся свободных мест связывания. Схема дот-блота, исключающая такую возможность, и его результаты приведены на Фиг. 7. Проводка отличается от предыдущего варианта тем, что на завершающих этапах вместо конъюгатов антивидовых антител используют биотинилированные F(ab)2 фрагменты антител, утратившие способность к взаимодействию с белком G вследствие удаления константной Fc области молекулы IgG. Окраска пятен на полосах А и В с сорбированной сывороткой мыши доказывает отсутствие неспецифического связывания конъюгата с белком G.
Claims (1)
- Способ выделения ренатурированного белка G из маркированного полиакриламидного геля, включающий разделение субфракций бактериальной массы центрифугированием в течение 15 мин при 1500×g с последующим переосаждением полученного осадка при тех же условиях при 10°С, ресуспендированием в растворе 8 М мочевины, содержащем 10 мM Трис-HCl (рН 8,0) и 1,5 мM ЭДТА и длительным перемешиванием с финальным центрифугированием суспензии при 14000×g в течение 30 мин при 12°С для получения надосадочной фракции, отличающийся тем, что для денатурации и ренатурации используют белок G, иммобилизованный в составе полиакриламидного геля в редуцирующих условиях (ДСН-ПААГ) с маркированием положения белка G по завершении и отделением фрагмента маркированного геля, содержащего белок G с последующей последовательной обработкой фрагмента геля денатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 6 М мочевину, 2 М тиомочевину в течение 1 час и ренатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаина, 1 мМ ЭДТА в течение 3 час при 20°С с трехкратной сменой буфера и завершающей электроэлюцией ренатурированного белка G из измельченного геля в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5) в течение 2 час и силой тока 200 мА.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016111874A RU2646103C2 (ru) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016111874A RU2646103C2 (ru) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016111874A RU2016111874A (ru) | 2017-10-05 |
| RU2646103C2 true RU2646103C2 (ru) | 2018-03-01 |
Family
ID=60047516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016111874A RU2646103C2 (ru) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646103C2 (ru) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990000200A1 (en) * | 1988-06-27 | 1990-01-11 | Genex Corporation | Thermal release of recombinant protein into culture media |
| RU2070888C1 (ru) * | 1990-11-22 | 1996-12-27 | Берингер Маннхайм ГмбХ | Способ реактивации рекомбинантного белка |
| WO2002057296A1 (en) * | 2001-01-16 | 2002-07-25 | Københavns Universitet | A method for refolding of proteins |
| RU2208445C1 (ru) * | 2002-02-20 | 2003-07-20 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКА 39 кДа НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА |
| RU2278870C2 (ru) * | 2004-08-30 | 2006-06-27 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе |
| RU2448116C2 (ru) * | 2010-02-01 | 2012-04-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Способ получения активного фрагмента альфа-фетопротеина человека |
-
2016
- 2016-03-30 RU RU2016111874A patent/RU2646103C2/ru active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990000200A1 (en) * | 1988-06-27 | 1990-01-11 | Genex Corporation | Thermal release of recombinant protein into culture media |
| RU2070888C1 (ru) * | 1990-11-22 | 1996-12-27 | Берингер Маннхайм ГмбХ | Способ реактивации рекомбинантного белка |
| WO2002057296A1 (en) * | 2001-01-16 | 2002-07-25 | Københavns Universitet | A method for refolding of proteins |
| RU2208445C1 (ru) * | 2002-02-20 | 2003-07-20 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКА 39 кДа НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА |
| RU2278870C2 (ru) * | 2004-08-30 | 2006-06-27 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе |
| RU2448116C2 (ru) * | 2010-02-01 | 2012-04-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") | Способ получения активного фрагмента альфа-фетопротеина человека |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016111874A (ru) | 2017-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hedrick et al. | On the macromolecular composition of the zona pellucida from porcine oocytes | |
| Butkowski et al. | Properties of the globular domain of type IV collagen and its relationship to the Goodpasture antigen. | |
| Krakow et al. | Cyclic adenosine monophosphate receptor: loss of cAMP-dependent DNA binding activity after proteolysis in the presence of cyclic adenosine monophosphate | |
| Fullmer et al. | Bovine intestinal calcium-binding proteins: Purification and some properties | |
| Peter et al. | Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. | |
| Klekamp et al. | Partial purification and characterization of the Saccharomyces cerevisiae transcription factor TFIIIB. | |
| Bjerrum et al. | Some recent developments of the electroimmunochemical analysis of menbrane proteins. Application of Zwittergent, Triton X-114 and Western blotting technique | |
| Plumley et al. | Rocket and crossed immunoelectrophoresis of proteins solubilized with sodium dodecyl sulfate | |
| Patterson et al. | High-yield recovery of electroblotted proteins and cleavage fragments from a cationic polyvinylidene fluoride-based membrane | |
| RU2018138782A (ru) | Антитела к фактору ix padua | |
| Leick et al. | Insulin/FGF-binding ciliary membrane glycoprotein from Tetrahymena | |
| US7026453B2 (en) | Method of protein purification | |
| SASAKI et al. | Similarity and dissimilarity in subunit structures of calpains I and II from various sources as demonstrated by immunological cross-reactivity | |
| Mappouras et al. | Purification and characterization of L-dopa decarboxylase from human kidney | |
| KR910700463A (ko) | 암과 관련된 헵토글로빈 | |
| RU2646103C2 (ru) | Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля | |
| CN104597256B (zh) | 一条与牛病毒性腹泻病毒e2蛋白相结合的多肽序列及其应用 | |
| CN106146627A (zh) | Fc特异结合蛋白、IgG亲和层析介质及其制备方法与应用 | |
| Lomonte et al. | Detection of proteins antigenically related to Bothrops asper myotoxin in crotaline snake venoms | |
| WO2001016182A3 (en) | POLYPEPTIDES THAT BIND HIV gp120 AND RELATED NUCLEIC ACIDS, ANTIBODIES, COMPOSITIONS, AND METHODS OF USE | |
| Springer et al. | Protein-linked oligosaccharide implicated in cell-cell adhesion in two Dictyostelium species | |
| Bhambure et al. | A novel aqueous two phase assisted platform for efficient removal of process related impurities associated with E. coli based biotherapeutic protein products | |
| Burgess | Elution of proteins from gels | |
| Lompre et al. | Detection of antibodies specific to sodium dodecyl sulfate-treated proteins | |
| US8586315B2 (en) | Fluorescent protein particles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20171110 |