HU202275B - Process for producing functional human viii factor - Google Patents

Description

A találmány tárgyát a humán Vili. faktor, ennek új formái, az ezt tartalmazó készítmények, továbbá a humán V1U. faktor funkciós származékainak előállítására szolgáló eljárás képezik, elsősorban DNS rekombinációs tech- 5 nológiával.

A találmány részben a humán Vili. faktor és az ennek molekulájához hasonló szerkezetű, biológiailag aktívnak bizonyult anyagok DNS szekvenciájának ismeretén és az 10 ebből következtetett aminosav-szekvenciák ismeretén alapul.

Ehhez a felismeréshez az vezetett, hogy eredménnyel járt a Vili. faktor különböző formáinak elóállitására a DNS rekombinációs 15 technológia alkalmazásával, és ezáltal megfelelő minőségben és mennyiségben termelhettük ezeket az anyagokat a biológiai vizsgálatokhoz és a biológiai aktivitás bebizonyításához. Ezeknek az ismereteknek a birtokában 20 tetszés szerint állíthatjuk elő a VIII. faktor megszabott származékait génmanipuláció útján és in vitro feldolgozással. Ilyen módon hatékonyan termelhetjük az aktív VIII. faktor származékait olyan mennyiségben, amely 25 korábban elérhetetlen volt.

Az érintetlen érrendszer fenntartása sokféle sejt és fehérje kölcsönhatását igényli. Az érrendszer sérülésekor egy sor reakció indul be a folyadék veszteség megakadó- 30 lyozása érdekében. Az első válasz a vérlemezkék aktiválása: a vérlemezkék a sebhez tapadnak és egy sor reakción mennek át. E reakciók közé tartoznak a következők: más vérlemezkék odavonzása, szerves vegyületek 35 és fehérjék felszabadítása, valamint trombogén felület kialakítása a véralvadási reakciósor (kaszkád) aktiválásához. A végbemenő reakciók együttes eredményeként dugó képződik a vérlemezkékből, amely elzárja a se- 40 bet. A vérlemezkékből álló dugót az stabilizálja, hogy fibrinszálak jönnek létre körülötte, s ezek megakadályozzák a nem kívánt folyadékveszteséget. Ahogy a seb gyógyul, a vérlemezkékből álló dugó és a fibrinváz las- 45 san feloldódik. (Részletesebb áttekintést ad a következő kiadvány: Hemostasis and Thrombosis, szerkeszti Bloom és Thomas, Churchill, Livingstone, N.Y., 1981).

A vérzés megállításánál kritikus tényező 50 az alvadási reakciósor aktiválása a kezdeti vérlemezke-dugó stabilizálása érdekében. Ez a rendszer több, mint egy tucat fehérje kölcsönhatásából áll; e fehérjék részben a plazmában vannak jelen, részben felszabadult 55 és/vagy aktivált sejtfehérjék [Davie és munkatársai, Ann. Rév. Biochem., 44, 799 (1975); Jakson és munkatársai, Ann. Rév. Biochem.,

49, 767 (1980)].

A reakciósorban lejátszódó minden 60 egyes lépés során valamelyik proteáz egy specifikus inaktív (zimogén) alakja a katalitikusán aktív formává aktiválódik. Nemzetközi megegyezés alapján a reakciósor mindegyik fehérjéjét római számmal jelöljük meg 65 (Wright, J. Am. Med. Assoc., 170, 325 (1959)]. Az illető proteáz zimogén alakját a római szám jelzi, mig az aktivált formánál a római szám után egy .a' alsó indexet Írunk. A reakciósor minden egyes lépésénél a proteáz aktivált alakja aktiválja a reakciósor következő lépésében résztvevő proteázt. Ilyen módon egy kis kezdeti inger, amely a reakciósor elején fehérjeaktiválást eredményez, mindegyik lépésnél katalitikusán felerősödik úgy, hogy végül robbanásszerűen képződik trombin, és ez utóbbi hatására az oldható fibrinogén fehérje oldhatatlan fibrinné alakul át. A fibrinnek az a tulajdonsága, hogy önmagához tapadva szálakat vagy rostokat képez. Ennek az a szerepe, hogy stabilizálja a vérlemezkékből létrejött dugót és igy az nem mozdítható el könnyen a helyéről.

Az 1. ábrán összefoglaltuk a véralvadásban szerepet játszó fehérjék kölcsönhatásaival kapcsolatos jelenlegi ismereteinket. A reakciósorban szerepet játszó bármelyik fehérje hiánya azzal járna, hogy megáll a fibrinképződést célzó kezdeti inger továbbterjedése.

Az 1. ábrán bemutatott reakciósor közepén található egy olyan lépés, amelyben a IXa. faktor hatására a X. faktor altivélt formává, a Xa. faktorrá alakul át. Jelenleg úgy vélik, hogy a Vili. faktor (amelyet VIIIC. faktornak is neveznek,) részt vesz ebben a lépésben, foszfolipid és kalciumionok, mint kofaktorok jelenlétében, az nem ismeretes, hogy önmagukban is szerepük lenne, így csak azért van rá szükség, hogy növelje a IXa. faktor aktivitását.

Ez a lépés a reakciósorban kritikus, mivel megállapították, hogy két leggyakoribb vérzékenység! panaszt a VIII. faktor csökkent működése (A. vérzékenység vagy klaszszikus vérzékenység) vagy pedig a IXa. faktor csökkent működése (B. vérzékenység) okozza. A vérzékenységgel kapcsolatos rendellenességeknek közelítőleg 80%-a a Vili. faktor elégtelen mennyiségének a következménye. A betegségtünetek mindkét vérzékenységtípusnál azonosak: nem képződik elegendő fibrin a vérlemezkékből álló dugó stabilizálásához, ezért a dugó könnyen elmozdul a helyéről, és ennek következtében a vérzés újból megindul. Az a tény, hogy a

VIII. faktor és a IX. faktor hiánya viszonylag gyakran fordul elő a véralvadás során lejátszódó reakciósorban résztvevő többi faktor hiányához képest, annak a következménye, hogy genetikailag az X kromoszómával vannak kapcsolatban. A VIII. faktorra vagy a

IX. faktorra vonatkozó gén egyetlen hibás allélje vérzékenységet okoz férfiaknál, akiknél az X kromoszóma csak egyetlen példányban található meg. A többi véralvadási tényező autoszomálisan összekapcsolt, és általában két hibás alléi jelenlétére van szükség ahhoz, hogy zavar lépjen fel a véralvadásnál - ez lényegesen kevésbé gyakori. Ezért az

HU 202275 A

A. és B. vérzékenység messze a leggyakoribb örökletes véralvadási rendellenesség, amely szinte kizárólag férfiaknál fordul eló.

Néhány évtizeddel ezelőtt a vérzékenységben szenvedő emberek általában 20 éves koruk előtt meghaltak. Az 1950-es évek eleje és az 1960-as évek vége közötti időszakban a Vili. faktor által kiválasztott rendellenesség kutatása azt eredményezte, hogy az A. vérzékenységet kezdetben egész vérplazmá- 10 val, később pedig a Vili. faktor koncentrátumaival gyógyították. A humán VIII. faktor egyetlen forrása az emberi vérplazma volt. A költségekhez hozzájáruló egyik tényező a nagy mennyiségű, felhasználható vérplazma 15 megszerzésével kapcsolatos kiadások. A gyártó cégeknek véradó központokat kell létrehozniok, a véradóknak fizetni kell, s a vérplazmát fagyasztott állapotban kell tartani közvetlenül a vérvétel utáni időponttól égé- 20 szén a feldolgozóüzembe szállításig. Több, mint ezer véradótól vett vérplazmát egyesítenek, és az igy kapott mennyiséget dolgozzák fel. Tekintettel arra, hogy a VIII. faktor aktivitása instabil, nagy veszteségekkel jár 25 az a néhány egyszerű tisztító művelet, amellyel a koncentrátumokat előállítják (az eredeti aktivitásnak mindössze mintegy 15%-a marad meg).

Az ilyen módon előállított gyógyászati 30 termékek igen szennyezettek, a fajlagos aktivitásuk 0,5-2 VIII. faktor egység per mg fehérje (egy Vili. faktoraktivitás-egység definíció szerint az az aktivitás, amely az Egészségügyi Világszervezet (WHO) által 35 standardként elfogadott humán vérplazma minta 1 ml-jében jelen van).

A Vili. faktort tartalmazó koncentrátum becsléssel meghatározott tisztasága közelítőleg 0,04 tömegX VIII. faktor fehérje. Ezt a 40 nagyfokú szennyezettséget sokféle súlyos szövődmény is kiséri, ezek között találjuk a fehérje-kicsapódást, a hepatitiszt; és feltehetően jelen van az az anyag is, amely a szerzett immunhiány szindrómáért felelős. 45

A Vili. faktort tartalmazó koncentrátumokkal kapcsolatos fenti hátrányok okai tehát a kővetkezők: a vérplazma-eredetű VIII. faktor instabil, kevéssé tiszta és nagy számú véradótól származik. Ez azt jelenti, hogy ha 50 az ezer véradó közül csak egy is hepatitiszben szenved például, akkor a teljes vérplazmamennyiség a vírussal szennyezetté válik. A véradókat előzetesen megvizsgálják, hogy van-e a vérükben hepatitisz B, ismeretes 55 azonban, hogy a koncentrátumokban néha jelen van mind hepatitisz A, mind pedig hepatitisz nem-A nem-B is. A nagyobb tisztaságú termék előállítására irányuló próbálkozások elfogadhatatlanul nagy aktivitásveszteségeket 60 eredményeznek, növelve ezáltal a költséget.

A Vili. faktor tisztításának története megvilágítja azt, hogy milyen nehézségekbe ütközik az ezzel a fehérjével történő munka.

Az okok közül elsősorban a VIII. faktor in- C5 4 stabilitását és azt emelhetjük ki, hogy a teljes vérben valójában csak nyomnyi mennyiségekben van jelen.

Az 1970-es évek elején leírtak egy 5 olyan fehérjét, amelyről akkor feltételezték, hogy az a VIII. faktor ISchmer és munkatársai, J. Bioi. Chem., 247, 2512 (1972); Legaz és munkatársai, J. Bioi. Chem., 247, 3946 (1973); Shapiro és munkatársai, J. Clin. Invest., 52, 2198 (1973)]. E fehérjéről megállapították, hogy egy glikoprotein alegység aggregátuma, ahol az alegység molekulatömege közelítőleg 240.000 dalton, nátrium-dodecil-szulfát (SDS) gélelektroforézissel meghatározva. Ez az alegység nagyobb molekulatöniegű, heterogén populációhoz aggregálódott (e heterogén populáció molekulatömege 1 millió és 20 millió dalton közötti tartományban van).

A feni fehérje megtalálható volt vérzékenységben szenvedők vérplazmájában, hiányzott azonban a von Willebrand-kórban szenvedő betegek vérplazmájából - ez a betegség autoszomálisan közvetített genetikai rendellenesség, amelyet hosszú vérzési idő és igen csekély mennyiségű VIII. faktor jelenléte jellemez (Nilsson és munkatársai, Acta Med. Scand., 159, 179 (1957)J. Az akkor kidolgozott elmélet szerint ez a nagymolekulatömegű fehérje - amelyet von Willebrand-faktornak (vWF) vagy VIII. faktorral rokon antigénnek (FVIIIRAg) neveztek - volt a felelős a véralvadási zavarért' mindkét betegségnél, ahol a von Willebrand-kór esetén ez a fehérje nem volt jelen, mig a klasszikus vérzékenységi állapotokban valamiképpen működésképtelen volt [McK.ee, Ann. NY Acad. Sci., 240, 8 (1975).

Később megfigyelték azonban, hogy bizonyos körülmények között, nevezetesen nagy sókoncentrációk esetén a VIII. faktor aktivitása elválasztható ettől a fehérjétől, amelyet felelősnek véltek a VIII. faktor aktivitásáért [Thelin és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 95, 70 (1961); Griggs és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 70, 2814 (1973); Donáti és munkatársai, Thromb. Rés., 2, 97 (1973); Weiss és munkatársai, Br. J. Haematol., 18, 89 (1970); Weiss és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 212 (1972); Weiss és munkatársai, Science, 182, 1149 (1973); Rick és munkatársai, Blood, 42, 737 (1973); Rick és munkatársai, Thromb. Rés., 7, 909 (1975); Thelin és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 95, 70 (1961); Owen és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 502 (1972); Cooper és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 70, 2326 (1973)].

Ilyen körülmények között az alvadást aktiváló VIII. faktor 100.000 és 300.000 közötti molekulatömeget mutat. Azóta nagy erőfeszítések történtek a VIII. faktor véralvadást elősegítő hatásáért felelős fehérje/fehérjék azonosítására és jellemzésére. Ezeket a vizsgálatokat azonban akadályozta az, hogy a teljes vérben ez a fehérje csak nyomnyi

-3HU 202275 A mennyiségekben all rendelkezésre, emellett az anyag instabil.

A szakirodalomban beszámoltak azokról az erőfeszítésekről, amelyek különböző tisztaságú Vili. faktor fehérjék elkülönítésére 5 irányultak, temészetes eredetű, emberi és állati forrásokból (Vehar és munkatársai, Biochemistry, 19, 401 (1980); Fulcher és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 1648 (19821; Fulcher és munkatársai, Blood, 61, 807 10 (1983); Fulcher és munkatársai, Blood, 63,

486 (1984); Fass és munkatársai, Blood, 59,

594 (1982); Knutson és munkatársai, Blood,

59, 615 (1982); Fay és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 7200 (1982); Tuddenham 15 és munkatársai, Symposium on Factor Vlll/von Willebrand Factor, October 7-9, 1982, p.l.J.

Tekintettel a fentebb említett nehézségekre, fennáll az a lehetőség, hogy a meg- 20 célzott Vili. faktor fehérje helyett tévedésből egy, a VIII. faktort tartalmazó készítményben lévő szennyező fehérjét azonosítunk, majd klónozunk és termelünk. Erinek a lehetőségnek a valóságos voltát alátámasztja 25 a von Willebrand-fehérje előbb említett téves azonosítása véralvadást okozó VIII. faktor fehérjeként. A Vili. faktoréhoz hasonló aktivitás azonosításánál jelentkező tévedés szintén határozott lehetőség. Akár a Xa. faktor, 30 akár a trombin lerövidíti az alvadási időt a különböző vérplazmáknál, beleértve a VIII. faktorban hiányos vérplazmát is, és ennek következtében úgy tűnik, hogy a Vili. faktorhoz hasonló aktivitást mutat, hacsak meg- 35 felelő ellenőrzéseket nem végzünk. Bizonyos sejtekről szintén ismert, hogy olyan aktivitást hoznak létre, amely nagyon hasonló módon hathat, mint a várt Vili. faktor [Gordon és munkatársai, Thrombosis Rés., 6, 127 40 (1975); Sacharski és munkatársai, Mayo Clinic Proc., 44, 784 (1969); Green és munkatársai, Blood, 37, 47 (1971)).

Az utóbbi irodalmi hely azt támasztja alá, hogy ez a VIII. faktorszerű aktivitás 45 ténylegesen egy szöveti faktornak nevezett fehérjének tulajdonítható. Ugyanezt az anyagot vagy hasonló anyagot az emberi méhlepényből is elkülönítettek tisztítással [Schwinn és munkatársai, 4 067 964 sz. ame- 50 rikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

Ez a fehérje, a vérplazma VII. faktor fehérjével együtt ugyanannál a lépésnél játszik szerepet, mint a VIII. faktor és a IXa. faktor, s a X. faktornak a Xa. faktorrá történő 55 aktiválását eredményezi.

Ezért a rekombináns VIII. faktor kifejezésénél először annak bizonyítása szükséges, hogy vajon kétségtelenül a VIII. faktornak megfelelő aktivitású anyag kifejeződése tör- 60 ténik meg. A korábbi kutatóknak azt is meg kellett mutatniuk, hogy egy teljes vagy részleges kiónhoz jutottak, amely az egész Vili. faktort vagy annak egy részét kódolja, azonban az átlagos szakember számára meg- 65 oldhatatlan műszaki feladatot jelenthetett egy olyan rekombináns fehérje kifejezése, amely négyszer olyan nagy, mint bármelyik más, napjainkig kifejezett rekombináns fehérje.

A fentiekben ismertetett nehézségekből következik, hogy alapos vizsgálatnak kell alávetni minden olyan bejelentést, amely szerint eredménnyel járt a humán VIII. faktor klónozása és kifejezése. A jelen találmánnyal elért eredményt az alábbi tények támasztják alá:

1) A klón eredetű VIII. faktor fehérjék elleni antitestek immunológiai kereszt-reaktivitása a vérplazma eredetű VIII. faktor fehérjékkel.

2) Az emberi vérplazmában lévő VIII. faktor elleni semlegesítő monoklonális antitestek keresztreakciója a klón nal kódolt fehérjével.

3) Egy olyan genomikus DNS azonosítása, amely megfelel az X kromoszómában elhelyezkedő VIII. faktor cDNS-nek. (Ismeretes, hogy a VIII. faktor génjének kódolása az X kromoszómában történik).

4) Olyan funkcionális fehérje kifejezése, amely az alábbiakat mutatja.

a) A VIII. faktor-hiányos vérplazma helyreállítása.

b) Az X. faktor aktiválása Xa. faktorrá IXa. faktor, kalcium és foszfolipid jelenlétében.

c) A fenti a) és b) pont szerint megfigyelt aktivitás inaktiválása a VIII. faktorra specifikus antitestekkel.

d) Az aktivitás hozzákapcsolhatósága egy olyan immobilizált, monoklonális antitest oszlophoz, amely specifikus a VIII. faktorra.

e) A VIII. faktor aktiválása trombinnal.

f) A Vili. faktor kötődése immobilizólt von Willebrand-faktorhoz, és eluálhatösága erről.

A találmány azon alapul, hogy eredménnyel járt a rekombináns DNS technológia alkalmazása működőképes humán Vili. faktor termelésére, olyan mennyiségekben, amelyek elegendők az azonosításhoz, a működőképesség alátámasztásához, továbbá állatkísérletek és klinikai kipróbálások lefolytatásához, hiszen ez utóbbiak a piaci bevezetés előfeltételeit képezik.

A találmány szerint előállított humán VIII. faktor valamennyi működőképes alakjában alkalmas olyan emberek megelőző és gyógyító kezelésére, akiknél nem kielégítő a VIII. faktor véralvadásra gyakorolt hatása. Ennek megfelelően a találmány részben a klasszikus vérzékenység (vagy A hemofilia) embereknél történő kimutatására és a VIII. faktor alkalmazásával történő kezelésére, továbbá a VIII. faktort tartalmazó alkalmas gyógyászati készítményekre irányul.

-4HU 202275 A

I

A találmány foglalkozik a lényegében tiszta, funkcionális humán VIII. faktorral is.

A találmány értelmében megfelelő, genetikailag manipulált gazdasejtek segítségével állítunk elő emberi Vili. faktort a gyógyászatban alkalmazható mennyiségben és tisztaságban. Emellett a találmány szerint termelt Vili. faktor mentes azoktól a szennyező anyagoktól, amelyek a nem-rekombináns sejtkörnyezetben általában kísérik.

A találmány foglalkozik továbbá olyan dezoxiribonukleinsav (DNS) izolátumokkal és DNS kifejező hordozókkal, amelyek a humán VIII. faktort kifejezhető formában kódoló génszekvenciákat tartalmaznak, valamint 15 olyan transzformáns gazdasejt-tenyészetekkel, amelyek a fentieket tartalmazzák, és képesek a működőképes emberi VIII. faktor termelésére.

Mindazok az eljárások is a találmány 20 tárgyát képezik, amelyekkel előállíthatok a fenti DNS-izolátumok, DNS kifejező hordozók és gazdasejt-tenyészetek. E sejttenyészetek fermentációs tenyészeteinek előállítására szolgáló eljárás is a találmány tárgyát képe- 25 zi.

Továbbá a találmány olyan új polipeptideket biztosit, amelyek az emberi VIII. faktor működőképes szegmenseinek megfelelő rószt/részeket tartalmaznak. Ezek az új poli- 30 peptidek alkothatják a természetes eredetű Vili. faktor biológiailag aktív és/vagy antigén determináns szegmenseit. Például a találmány szerinti polipeptidek alkalmasak vérzékenységben szenvedők kezelésére, különösen 35 olyan betegek esetén, akik a VIII. faktort semlegesítő antitesteket fejlesztenek ki a vérben. Ez utóbbi esetben, ha a betegeket a megfelelő antigén determinánsokat hordozó polipeptidekkel kezeljük, hatékonyan megköt- 40 hetjük ezeket az antitesteket, növelve ezáltal a humán VIII. faktor biológiailag aktív részeit hordozó polipeptidekkel történő kezelés hatásfokát.

A találmány szerint előállított VIII. fák- 45 tor DNS izolátumok, amelyek a humán VIII. faktor funkcionális részeit kódolják, alkalmazhatók a génterápiában, mivel helyreállítják a VIII. faktor aktivitását az ezt nélkülöző betegekben az ilyenfajta DNS beépítésé- 50 vei, például vérképző nyélsejtek útján.

Előnyösen a humán VIII. faktort funkcionális alakban állítjuk elő egy különösen alkalmas gazdasejt rendszerben. Ez a rendszer újszülött hörcsög-vesesejteket [BHK-21 55 (C-13), ATCC No. CCL 10] tartalmaz, amelyeket átfertőztünk a humán VIII. faktort kódoló DNS-t tartalmazó kifejező vektorral. (Ez magába foglalja a 3’- és 5'- leforditatlan DNS-részt, és a 3’- leforditatlan rész össze 60 van kapcsolva a 3’- leforditatlan terminátor DNS-szekvenciával, amely például a hepatitisz B felületi antigénből származik.) A gén kifejezését átírási és átforditáei szabályozó elemek segítik elő, amelyek közt találhatók az 65 6 β

adenovirus főbb késői promotora az 5' illeszkedő vezetőjével, továbbá olyan elemek, amelyek SV40 replikációs origó tartományból származnak, pl. átirásfokozó és proraotor5 szekvenciák. Emellett a kifejező vektor tartalmazhat egy DI1FR gént is, amelyet egy SV40 kezdeti promotor működét - ez génerősitési képességet biztosit -, továbbá egy szelektálható marker gént, például a neomi10 cinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént. Ez utóbbit úgy vihetjük be, hogy együttes átfertózést végzünk egy másik vektorral, amely a neomicinnal szembeni rezisztencia lehetőségét hordozza.

Az 1. ábra a véralvadási reakciósor vázlatát múltja be. [Davie és munkatársai, Ann. Rév. Biochem., 44, 799 (1975)].

A 2. ábrán a DNS olvadása látható TMAC1 és 6x SSC jelenlétében.

2A. ábra: Minden egyes feltüntetett ponthoz a lambda DNS tíz párhuzamos alikvot mintáját először nitrocellulóz szűrökhöz kapcsoljuk. Ezeket a szűrőket ezután formamid nélkül hibridizáljuk 37 °C-on a módszerek ismertetésénél leírtak szerint. A foltpárokat ezután 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 6xSSC oldattal (u) vagy a következő összetételű oldattal mossuk: 3,0 M TMAC1, 50 mM trisz-hidroklorid, pH=8, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát és 2 mM etilén-diamin-tetraecetsav (0). Eközben mindig 2 °C értékkel növeljük a hőmérsékletet 38 °C-tól 56 °C-ig. Az olvadási hőmérséklet az a pont, ahol a hibridizációs intenzitás 50%-a megmarad.

2B. ábra: Az olvadási hőmérsékletet hasonló módon határozzuk meg, mint a 2A. ábránál, azonban pBR322 DNS alikvot mintáit kapcsoljuk a nitrocellulóz szűrőkhöz. Különféle hosszúságú töredékeket készítünk oly módon, hogy a pBR322 plazmidot Mspl-vel emésztjük, a töredékek végét ³²P izotóppal megjelöljük, és poliakrilamid gélen elkülönítjük. A 18 és 75 bázispár közötti töredékeket formamid nélkül hibridizáljuk 37 °C-on, a módszerek ismertetésénél leírtak szerint. A szűrőket az alábbi összetételű oldattal mossuk: 3,0 M tetrametil-ammónium-klorid (TMAC1), 50 mM trisz-hidroklorid, pH=8,0, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát és 2 mM etilén-diamin-tetraecetsav. Eközben a hőmérsékletet mindig 3 °C értékkel növeljük, hogy meghatározzuk az olvadási hőmérsékletet.

Az ábrán karikával jelzett pont a pBR322 plazmid Mspl vizsgáló töredékeire meghatározott olvadási hőmérséklet. A háromszöggel jelzett pont a 11 és 17 bázispár közötti mintákra vonatkozó, a 2A. ábráról átvett olvadási hőmérséklet 3,0 M tetrametil-ammónium-klorid alkalmazása esetén.

A 3. ábra a Vili. faktor génjének kimutatását szemlélteti a 8.3. vizsgáló minta segítségével. Az ábra bal oldalán lévő három lemez: 46,XY (IX, hím) DNS és 49, XXXXY (4X) emberi DNS foltokat, amelyek EcoRI-gyel és Bamlil-gyel emésztettünk, a következő oldat-59

HU 202275 A bán hibridizalunk: 6xSSC, 50 mM nátrium-foszfát (pH=6,8), 5x Denhardt-oldat, 0,1 g/1 forralt, ultrahanggal kezelt lazacspenna DNS és 20% formamid. A hibridizálást 42 °C-on végezzük a módszereknél leírtak szerint. A hérom foltot lxSCC-t és 0,1% nátrium-dodecil-szulfátol tartalmazó oldatban mossuk a lemez felett feltüntetett hőmérsékleten. Az egyes lemezek egyes oszlopai a következő feltárt töredékekre vonatkoznak: 1. számú oszlop - EcoRI IX; 2. számú oszlop - EcoRl 4X; 3. számú oszlop - BamHI IX; 4. számú oszlop - BamHI 4X; M. jelzésű oszlop - a végén jelzett, lambdaHindlII és HaelII-vel emésztett $X174 marker töredékek.

Az ábra jobb oldalán egy nitrocellulóz szűrő látható a 8.3. vizsgáló mintával hibridizált lambda/4X könyvtár átvizsgálásából. A nyilak két független, a Vili. faktorra pozitív kiónt jeleznek. A könyvtár átvizsgálása és mosása úgy történik, mint fentebb a Southern-foltképzésnél leírtuk, s a mosást 37 °C-on végezve. A 4. ábra a humán VIII. faktor génjének térképét mutatja be. Az ábra felső sorában a VIII. faktor génben lévő 26 fehérjekódoló tartomány (A-Z exonok) helyzetét és viszonylagos hosszúságát jelezzük. Az átírás iránya balról jobbra van.

A második sorban a térkép méretaránya látható kilobázispár (kb) egységekben. A Vili. faktor gén térképezéséhez használt 10 restrikciós enzim felismerési helyeinek elhelyezkedését az ezt kővető vonalsorok mutatják be a 4. ábrán. Az üres téglalapok azoknak a humán genomikus [ez alatt a továbbiakban genomiális értendő, DNS-eknek a kiterjedését mutatják, amelyek az egyes lambda fág (lambda 114, lambda 120, lambda 222, lambda 482, lambda 599 és lambda 605) és kozmid (p541, p542, p543, p612, p613, p624) kiónokban jelen vannak. Az ábra alsó sora a genomikus átvizsgálásokhoz használt és a leírásban imertetett vizsgólómintók elhelyezkedését mutatja:

1) 0,9 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredék a p543-ból;

2) 2,4 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredék a lambda 222 fágból;

3) 1,0 kb nagyságú Ndel/BamHI tőredéktriplett a lambda 120-ból;

4) 8.3 oligonukleotid vizsgálóminta;

5) 2,5 kb nagyságú StuI/EcoRI töredék a lambda 114 fágból;

6) 1,1 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredék a lambda 482 fágból;

7) 1,1 kb nagyságú BamHI/EcoRI töredék a p542-ből.

A 46,XY és 49,XXXXY genomikus DNS Southern folt analízise nem tár fel észrevehető különbségeket a VIII. faktor génjének felépítésében.

Az 5. ábra a pGcos 4 kozmid vektort szemlélteti. A pGcosl plazmid kialakításához a lambda C 1857S7 (Bethesda Research Láb.) 403 bázispórból álló összeforrasztott HincII töredékét, amely a cos helyet tartalmazza, klónozzuk a pBR322 Aval és PvuII közötti részére. Az mp33dhfr plazmid előállítása céljából a pBR322 AbalII helyre klónozzuk a pFR400 (49n) 1624 bázispárból álló, PvuII és Nael közötti töredékét, amely egy SV 40 origót és promotort, egy mutáns dihidrofolát reduktáz gént és hepatitisz B felületi antigén terminációs szekvenciát tartalmaz. Háromrészes ligálást és klónozást végzünk a pGcosl 1497 bázispárból álló Sphl és Ndel közötti töredéke, az mp33dhfr 3163 bázispárból álló Ndel és EcoRV közötti töredéke, valamint a pKT19 376 bázispárból álló EcoRV és Sphl közötti töredéke között, és ilyen módon létrehozzuk a pGcos3 kozmid vektort. A pKT19 a pBR322 olyan származéka, amelyben a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító génben levő BamHI hely nitroguanozinos kezeléssel mutálva van. A pGcos4 kialakítására a pGcos3 EcoRI helyébe klónozunk egy szintetikus 20-mert terméket: 5’ AATTCGATCGGATCCGATCG.

A 6. ábra a pESVDA térképét mutatja be. Korábban már leírták az SV40 vírus 342 bázispárból álló, PvuII Hindii! közötti töredékét, amely átfogja az SV40 replikóciós origót, és az EcoRI helyekhez való kapcsolással módosított [Crowley és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 3, 44 (1983)]; a hepatitisz B (HBV, felületi antigén (49n) poliadenilezési helyét, amely egy 580 bázispárból álló, BamHI és Bglll közötti töredéken helyezkedik el; valamint a pBR322 plazmid pML származékát [Lusky és munkatársai, Natúré, 293, 79 (1981)]. Az SV40 korai proraotorót követő EcoRI hely és a HBV BamHI helye közé illesztjük a PvuII-HindlII töredéket (az ábrán az adenovírus 2, 16,63-17,06 koordinátákkal), amely az első késői vezető donor összefonódási helyét (helyzete 16,65) tartalmazza, s ezt közvetlenül az adenovírus 2 840 bázispárból álló HindlII-Sacl töredéke (helyzete 7,67-9,97) követi, (49 j), amely az Elb akceptor összefonódási helyet tartalmazza 9,83 értékű helyzetnél. A donor és az akceptor helyek között helyezkedik el egy egyedi Bglll és a HindllI hely a genomikus DNS töredékek beillesztéséhez.

A 7. ábra a pESVDA vektorból történő ribonukleinsav átírások analízisét mutatja be. Összefolyó COS-7 sejteket tartalmazó, 10 cm átmérőjű lemezeket [Gluzman, Cell, 23, 175 (1981) átfertőzünk 2 ug plazmid DNS-val, a módosított DEAE-dextrán módszer [Sompayrac és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7575 (1981)] alkalmazásával a következő szakirodalmi helyen leirt módon [Crowley és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 3, 44 (1983)]. Az átfertözés után 4 nappal ribonukleinsavat készítünk a citoplazma kivonatokból (49n), és elektroforézisnek vetjük alá denaturáló formaldehid-agaróz géleken. Nitrocellulóz szűrőkre visszük át, és az utóbbiakat hibridizáljuk a megfelelő ³²P izotóppal jelzett DNS7

-611 HU 20227

-val a módszereknél ismertetett módon. A szűrőket 0,2% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 2x SSC oldatban mossuk 42 °C-on, és Kodak XR5 filmen exponáljuk. A 28S és a 18S riboszomális ItNS-ek helyzetét nyíl jelzi 5 mindegyik lemezen.

A lambda 114 9,4 kb értékű BaniHI töredékét, amely az A exont tartalmazza (lásd a

4. ábrát), a pESVDA BglII helyére klónozzuk (lásd a C. ábrát). A pESVDA111.6 plazmid io olyan irányítottsággal beillesztve tartalmazta a töredéket, hogy az SV-10 korai promotor a megfelelő irányban írja át a genomikus töredéket. A pESVDA111.7 az ellenkező irányitottságú, 9,4 kb értékű Bam töredéket tartalmaz- 15 za. A pESVDA.S127 plazmid a lambda 114 12,7 kb nagyságú Sacl töredékét tartalmazza, amely (tompa végű összekapcsolással) ugyanolyan irányítottsággal lett beillesztve a pESVDA BglII helyére, mint a pESVDA111.6 20 plazmid.

A. lemez: pESVDA-vel, pESVDA111.7-tel és pESVDA111.6-tal átfertőzött sejtekből származó teljes citoplazma RNS-t tartalmazó szűrök hibridizációja. A pESVD RNS (1. ősz- 25 lop), pESVDA111.7 (2. oszlop), pESVDA111.6 (3-5. oszlop). 8. faktor A exont tartalmazó töredékkel (1-4. oszlop) vagy 1800 bázispárból álló Stul/Bam töredékkel (5. oszlop) átvizsgálva. Gyenge kereszt-hibridizáció ta- 30 pasztaiható a 18S RNS esetén.

B. lemez: RNS hibridizációja StuI/BamHI vizsgálómintával (.intron vizsgálóminta'). A kővetkezőkből származó RNS:

1, pESVDA, poliA; 2, pESVDA, poliA*; 3) 35 pESVDA111.7 poliA; 4) pESVDA111.7, poliA*;

5) pESVDA111.6, poliA; 6) pESVDA111.6, poliA*;.

Az A5, Bl, B3 és B5 oszlopban látható kis sötét hibridizáló sáv valószínűleg a 40 tRNS-val vagy az ebben a tartományban található Alu ismétlődő szekvenciával történő hibridizálást jelenti.

C. lemez: A pESVDA111.6 plazmidból (1. oszlop) és a pESVDA.S127 plazmidból (2. ősz- 45 lop) származó A exont tartalmazó töredékkel átvizsgált citoplazma RNS összehasonlítása. Megfigyelhető a kis mértékű méretnövekedés a 2. oszlopban, amely a nagyobb genomikus töredékben lévő további exon szekvenciának 50 felel meg.

A 8. ábrán a pESVDA.S127 S36 cDNS klón szekvenciája látható. A pESVDA.S127 exonkifejező plazmidból nyert S36 cDNS kiónhoz tartozó humán DNS betét DNS szék- 55 venciája látható. (A részleteket lásd később).

A 4. ábrán alkalmazottal hasonló módon látjuk el betűjelzésekkel a függőleges vonalakkal jelölt exonhatárokat, a VIII. faktor és az exonok genomikus cDNS kiónjainak analízise g0 alapján. Megjelöljük a kiválasztott restrikciós endonukleáz helyeket.

A 9. ábra a cDNS klónozását mutatja be.

A Vili. faktor mRNS-t a harmadik sorban lévő üres téglalap szemlélteti, a rovátkolt 05 8

A résszel és a mellette levő vonalakkal együtt. Maga a fehéren hagyott téglalap az érett fehérjét kódoló tartománynak, a rovátkolt rész a jelpeptidet kódoló szakasznak, a kétoldalt lévő vonal pedig az üzenet leforditatlan szakaszainak felel meg. Az mRNS 5’ vége bal oldalon helyezkedik el. Az mRNS sora felett a lambda 222 genomikus klón B exon tartományának kiterjedése látható, alatta pedig az mRNS vonalak azt a hat cDNS kiónt jelentik, amelyekből a VIII. faktor teljes hosszúságú kiónja felépül (a részleteket lásd később a leírásban,. Az 1., 3. és 4. cDNS szintézis primerek, valamint az oligo(dT) nyilakkal van megjelölve, jelezve annak a szintézisnek az irányát, amelyet beindítanak. Az ábra kiválasztott restrikciós endonukleáz helyeket és kilobázis egységekkel ellátott méretskálát is tartalmaz.

A 10. ábra a VIII. humán faktor génjének szekvenciáját mutatja be. Az összetett VIII. faktor cDNS klón teljes nukleotid szekvenciája látható, ahol a nukleotidok mindegyik sor bal oldalán számozva vannak. Az ATG forditásbeindíLó kódon A nukleotidja az 1. számú. A negatív számok az 5’ leforditatlan szekvenciára vonatkoznak. (Az mRNS feltérképezésére irányuló kísérletek azt mutatják, hogy a VIII. faktor mRNS közelítőleg 60 nukleotiddal nyúlik túl 5’ felé, mint az ábrán feltüntetett -109 helyzet.) A megjósolt fehérjeszekvencia a DNS felett látható. Az aminosavak feletti számok a következők: Sl-19 a megjósolt jelpeptidre, 1-2332 pedig a megjósolt érett fehérjére vonatkozik. .Op a TAG fordítás stop kódont jelzi. Az AATAAA 3' poliadenilezési jel alá van húzva, és a poli(A) farok nyolc maradéka is látható, amely a lambda cl0.3 kiónban található. A 8.3 szintetikus oligonukleotid vizsgáló mintával homológ szekvenciát is aláhúzzuk (5557-5592. számú nukleotidok). A kiválasztott restrikciós endonukleáz hasítási helyeket a megfelelő szekvencia felett tüntetjük fel. A 2671-217. számú nukleotidok genomikus kiónokból származó szekvenciát képviselnek, a többi pedig cDNS szekvenciának felel meg.

A VIII. humán faktor gén fehérje-kódoló tartományának teljes DNS szekvenciáját is meghatározzuk a leírt genomikus kiónokból. Mindössze két nukleotid tér el a cDNS klónokból származó és ezen az ábrán bemutatott szekvenciától (kivéve a 2671-3217. nukleotidokat). a 3780. számú nukleotid (amelyet aláhúztunk) G a cDNS kiónban, s aszparaginsavról glutaminsavra változtatja meg a 1241. számú aminosav kodont. A 8728. számú nukleotid (amelyet aláhúztunk) a 3’ leforditatlan tartományban A a genomikus kiónban.

A 11. ábra a teljes hosszúságú rekombináns VIII. faktor plazmid összeállítását mutatja be. A teljes hosszúságú VIII. humán faktor cDNS-t tartalmazó pSVEFVIII plazmid felépítésével kapcsolatos részleteket a leirás egy későbbi részében, a 8a. pontban ismer-713

HU 202275 A tétjük. A leírásban és a 10. ábrán alkalmazott helyzetek számozása 72 bázispár értékkel tér el egymástól.

A 12. ábrán a VIII. faktort kifejező plazmid összeállítása látható. A pAML3p.8cl plazmid összeállítását a leirás 8b. pontjában részletezzük. Ez a plazmid irányítja a működőképes VIII. humán faktor BHK sejtekben történő kifejezését.

A 13. ábra a VIII. faktor Northern foltanulízisét mutatja be, fúziós fehérje antiszérumok alkalmazásával. A humán Vili. faktort

5-10% poliakrilamid grádiens nátrium-dodecil-szulfát gélen különítjük el a szakirodalomban ismertetett eljárással ILaemmli, Natúré, 227, 680 (1970)]. A VIII. faktorra vonatkozó egyik oszlopot ezüsttel festjük meg (Morrissey, Anal. Biochem., 117, 307 (1981)], A VIII. faktor többi oszlopát nitrocellulózra visszük át elektroforetikusan, Northern foltanalizis céljára. Radioaktív izotóppal jelzett standard mintákat alkalmazunk a Vili. faktorral szomszédos oszlopokban, hogy meghatározzuk a megfigyelt sávok molekulatömegét. Amint jeleztük, a nitrocellulóz csikókat a megfelelő antiszérumokkal inkubáljuk, mossuk, majd ¹²⁵I izotóppal jelzett A fehérjével vizsgáljuk át. A nitrocellulóz lapokat autoradiográfiának vetjük alá.

A 14. ábrán fúziós fehérjék analízisét mutatjuk be C8 monoklonális antitest alkalmazásával. Az 1., 3. és 4. számú fúziós fehérjét Northern foltanalizissel vizsgáljuk, hogy meghatározzuk a reakcióképességüket a VIII. faktorra specifikus C8 monoklonális antitesttel.

A 15. ábrán a VIII. faktor nagynyomású folyakékkromatográfiájának (HPU) eluciós görbéje látható, Toya Soda TSK 4000 SW oszlopon. Az oszlopon az egyensúly kialakítását és a kifejlesztést szobahőmérsékleten végezzük, 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,1 M nátrium-foszfát-oldat alkalmazásával (pH=7,0).

A 16. ábra a VIII. faktor triptikus peptidjeinek fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás elválasztására vonatkozó elúciós görbét mutatja be. Az elválasztást Synchropak RP-P C-18 oszlopon végezzük (az oszlop méretei: 0,46 cm x 25 cm, 10 mikron). Az elúcióhoz acetonitril gradienst használunk, amelynek a koncentrációját 200 perc alatt 1%-ról 70%-ra növeljük. Az acetonitril 0,1%-os trifluor-ecetsavban van jelen. A nyíl azt a csúcsot jelzi, amely az AWAYFSDVDLEK szekvenciájú pepiidnek felel meg.

A 17. ábra a tisztított VIII. faktor aktivitásának trombinnal történő aktiválását mutatja be. A sejt felülúszó folyadékot a C8 monoklonális gyantán kromatografáljuk, és dialízisnek vetjük alá az elúcióhoz alkalmazott puffer eltávolítására. Zérus időpontban 25 ng trombint adunk hozzá. Alikvot részeket hígítunk a jelzett időpontokban 1:3 arányban, és meghatározzuk a véralvadást előidéző aktivitást. Az egjség/ml dimenziójú értékeket a normális emberi vérplazma segítségével felállított standard görbéről számítjuk ki.

Az ábrák ismertetésénél számmal hivatkozott irodulmi helyek: (49j) Gingeras és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 13475 (1982); (49n) Simonson és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 3, 2250 (1983);

A találmányt az alábbiakban részletesen ismertetjük.

A. A leírásban alkalmazott definíciók

A .humán VIII. faktor' kifejezésen olyan működőképes fehérjét értünk, amely képes in vivő vagy in vitro a humán VIII. faktor hiányának korrigálására, ilyen hiány például az A. hemofilia. A fehérjével és annak aktivitásával kapcsolatban a VIIIC faktor (FVII1C) és Vili. faktor alvasztó antigén (FVIIICAg) kifejezéseket is használjuk [Zimmermann és munkatársai, Haemostasis and Thrombosis, szerkesztő Bloom és Thomas, Churchill, Livingstone, 111. oldal (1981)]. A fenti Vili. faktort rekombináns sejttenyészetben állítjuk elő aktív alak (ok) bán, az emberi vérplazmában lévő, natív Vili. faktor aktivitásának megfelelően. (Egy egység humán VIII. faktor aktivitás definíció szerint az az aktivitás, amely az Egészségügyi Világszervezet által standardként elfogadott humán vérplazma minta 1 milliliterjében fennáll.) A találmány szerint előállított Vili. faktor fehérjét a meghatározott DNS gén- és aminosav-szekvenciával, fizikai jellemzőkkel és biológiai aktivitással definiáljuk.

A VIII. faktornak több lebomlási vagy feldolgozott alakja van természetes állapotban. Ezek proteolitikusan képződnek egy elövegyületből, amely egy láncból álló fehérje, amint azt a későbbiek során bemutatjuk. A találmány ilyen egyetlen láncból álló fehérjéket ismertet és bemutatja ezek előállítását önmagában, vagy a különböző lebomlási termékek egy szülővegyületének in vitro feldolgozásával. Ezeket a különféle lebomlási termékeket, amelyekről kimutattuk, hogy szintén rendelkeznek aktivitással, felhasználhatjuk a vérzékenység kezelésére. Ezek a termékek működőképesen aktiv részt/részeket tartalmaznak, amelyek natív anyagnak felelnek meg.

Valószínűleg léteznek alléi változatok. Ezeknél a változatoknál egy vagy több aminosav eltérő lehet a teljes szekvenciától, vagyis egy vagy több aminosavra kiterjedő törlés, beillesztés, vagy inverzió lehet a teljes szekvenciában. Ezen túlmenően, a glikozilezödés helye és mértéke függhet a gazdasejt környezetétől. Annak a lehetősége is fennáll a rekombináns DNS technológia különféle humán VIII. fakLor származékok előállítására történő fehasználásánál, hogy különféle módosítások lépnek fel egy vagy több 9

-815

HU 202275 A aminosav törlése, helyettesítése, beillesztése vagy inverziója folytán, például egy adott DNS helyre irányuló mutagenezise következtében. Emellett a humán Vili. faktor töredékei, akár in vivő, akár in vitro képződtek, rendelkezhetnek a szükséges hasznos aktivitással, amint azt fentebb már kifejtettük. Valamennyi ilyen alléi változat, glikozilezett változat, módosítás és töredék, amely a VIII. faktor származékait eredményezi, a találmány 10 körébe tartozik, amennyiben tartalmazza a humán Vili. faktor működőképes szegmensét, és megmarad az elengedhetetlen, a humán VIII. faktorral jellemző működési aktivitás. Ezeket a működőképes változatokat vagy mó- 15 dosított származékokat .humán Vili. faktor származékok'-nak nevezzük.

Azokat a VIII. faktor származékokat, amelyek rendelkeznek a szükséges működőképes aktivitással, könnyen azonosíthatjuk in 20 vitro vizsgálatokkal, amelyeket a későbbiek során ismertetünk. A humán VIII. faktor DNS szekvenciájának általunk történő leírása és a humán VIII. faktor aminosav-szekvenciájának ismerete alapján a szakember számára nyíl- 25 vánvaló, hogy milyen töredékek állíthatók elő a DNS restrikciós enzimmel történő elhasitásával vagy a humán VIII. faktor fehérjének proteolitikus vagy másmilyen elbontásával.

A működőképes alakban jelenlevő humán 30 VIII. faktor' képes arra, hogy katalizálja a

X. faktor Xa. faktorrá történő átalakulását a faktor Xa. faktorrá történő átalakulását a IXa. faktor, kalcium ás foszfolipid jelenlétében. Képes továbbá arra, hogy korrigálja az 35 A. típusú vérzékenységben szenvedő betegektől vett vérplazmában fennálló véralvadási fogyatékosságot. Az immunológiai tulajdonságai alapján is azonosítható vagy lényegében azonosítható az emberi vérplazmában je- 40 lenlevő VIII. faktorral.

Amikor a találmány szerint előállított humán VIII. faktor állapotát úgy jellemezzük, hogy .lényegében tiszta alak'-bán van jelen, ezen azt értjük, hogy gyakorlatilag mentes 45 azoktól a fehérjéktől vagy egyéb anyagoktól, amelyek rendszerint a VIII. faktort kisérik, amikor azt nem rekombináns forrásokból különítjük el, azaz a .natív', vérplazma-tartalmú környezetből különítjük el. 50 .DHFR fehérjén olyan fehérjét értünk, amely rendelkezik a dihidrofolát reduktázzal (DHFR) kapcsolatos aktivitással, és amelyet ezért olyan sejteknek kell termelniük, amelyek képesek a túlélésre hipoxantinban, gli- 55 cinben és timidinben hiányos táptalajon (-HGT táptalajon). Általában azok a sejtek, amelyekből hiányzik a DHFR fehérje, képtelenek a növekedésre ezen a táptalajon. A DHFR-tartalmú sejtek viszont növekednek az gQ ilyen táptalajon.

.Kifejező vektro’-on olyan vektorokat értünk, amelyek képesek a bennük jelenlevő DNS szekvenciák kifejezésére, ha ezeket a szekvenciákat működőképesen összekapcsol- gg 10 juk más olyan szekvenciákkal, amelyek képesek a kifejezés végrehajtására. Ezek a kifejező vektorok replikálódnak a gazdasejtben, vagy egy ép, működőképes replikációs origó 5 segítségével, vagy a sejtkromoszómába történő működőképes beépülés hatására. A kifejező vektor funkcionális definíciót is kaphat; minden olyan DNS szekvencia, amely képes egy benne lévő adott DNS kód hatékony kifejezésére, beleértendő ebbe a kifejezésbe. Általában a rekombináns technikáknál használt kifejező vektorok gyakran plazmidok alakjában vannak jelen, amelyek kör alakú, kettős szálú hurkok. A találmány azonban a kifejzö vektorok más olyan formáira is kiterjed, amelyek egyenértékű feladatokat látnak el.

.DNS izolátum kifejezésen azt a DNS szekvenciát értjük, amely a humán VIII. faktort kódoló szekvenciát tartalmazza, akár önmagában, akár egy klónozó vektorba beépítve.

A .rekombináns gazdasejt* kifejezés olyan sejtre/sejtekre vonatkozik, amelyet/amelyeket rekombináns DNS tecnikákkal kialakított vektorokkal transzformálunk. Amint arra utalunk, a VIII. faktor vagy annak működőképes részei e transzformáció segítségével jelentős mennyiségben képződnek, szemben a kisebb termeléssel és csekélyebb mértékű tisztasággal, amely egy transzformálatlan, természetes eredetű gazdasejt segítségével érhető el. Az ilyenfajta rekombináns gazdasejt által termelt VIII. faktort rekombináns humán VIII. faktornak is nevezhetjük.

A DNS és RNS méretére vonatkozó egységeket gyakran a következőképpen rövidítjük: b=bázis vagy bázispár, kb=kilo (ezer) bázis vagy kilobázispár. Fehérjékre vonatkozólag D=Dalton, kD=kiloDalton. A hömérséklet-értékek mindig °C-ban vannak megadva.

B. Gazdasejt-tenyészetek és vektorok

A találmány szerint sokféle rekombináns gazdasejtben termelhetünk értékes rekombináns humán VIII. faktort. Az alábbiakban eg.v különösen előnyős rendszert ismertetünk.

Általában a prokarióták előnyösen a DNS szekvenciák klónozásához a találmány szerint alkalmazott vektorok létrehozásához. Például különösen előnyös az Escherichia coli K12 294 törzs (ATCC 31446). Más használható mikrobiális törzsek a következők: Escherichia coli törzsek, például Escherichia coli B és Escherichia coli xl776 (ATCC 31537) és Eschericia coli c600 és cÖOOhfl, Escherichia coli W3110 (R·, lambda, prototróf, ATCC

27325), Bacillusok, például Bacillus subtilis és más Enterobacteriaceae törzsek, például Salmonella typhimurium vagy Serratia marcesceris, valamint különféle Pseudomonas fajták. A felsorolt példák természetesen semmiképpen nem korlátozzák a szóba jövő törzsek

-917

HU 202275 A körét, csak szemléltetésül szolgálnak.

Általában ezekhez a gazdasejtekhez olyan plazmidvektorokat használunk, amelyek replikon és szabályozó szekvenciákat tartalmaznak; ezek a gazdasejtekkel összeférhető sejtekből származnak. A vektor rendszerint hordoz egy replikációs helyet, valamint jelzöszekvenciákat, amelyek képesek a transzformáit sejtek közül a fenotipus kiválasztására. Például az Escherichia coli törzseket többnyire pBR322 plazmiddal transzformáljuk. Ez a plazmid egy Escherichia coli fajból származik [Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95 (1977,]. A pBR322 plazmid az ampicillinnel és tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító géneket tartalmaz, és ezáltal könnyen azonosíthatók és kiválaszthatók a transzformált sejtek.

A pBR322 plazmidnak vagy más mikrobiális plazmidnak olyan promotorokat is tartalmaznia kell - vagy úgy kell módosítani, hogy tartalmazzon -, amelyeket a mikroorganizmus felhasználhat a saját fehérjéinek a kifejezésére. A rekombináns DNS kialakításához leggyakrabban használt promotorok a béta-lak tamáz (penicillináz, és laktóz promotor rendszerek [Chang és munkatársai, Natúré, 275, 615 (1978); Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977); Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 (1979)], valamint egy triptofán (trp) promotor rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acid Rés., 8, 4057 (1980); 0036776 sz. publikált európai szabadalmi bejelentés). Bár ezek a leggyakrabban alkalmazott promotor rendszerek, más mikrobiális promotorokat is felfedeztek és hasznosítottak, s ezek nukleotid szekvenciával kapcsolatos részleteket publikálták, igy a szakember számára lehetővé vált, hogy működőképesen ligálja ezeket plazmid vektorokkal [Siebenlist és munkatársai, Cell, 20, 269 (1980)].

A prokariótákon kívül eukarióta mikrobák, például élesztötenyészetek is használhatók. A Saccharomyces cerevisiae vagy közönséges sütőipari élesztő a leggyakrabban használt az eukarióta mikroorganizmusok közül, jóllehet több más törzs is rendelkezésre áll. A Saccharomyces törzsekben történő kifejezéshez például az YRp7 plazmidot használják [Stinchcomb és munkatársai, Natúré, 282, 39 (1979); Kingsman és munkatársai, Gene, 7, 141 (1979); Tschemper és munkatársai, Gene, 10, 157 (1980)]. Ez a plazmid már tartalmazza trpl gént, amely szelekciós markert biztosit egy olyan mutáns élesztőtörzs számára, amelyből hiányzik a triptofánban való növekedés képessége. Ilyen törzs például az ATCC 44076 vagy PEP4-1 [Jones, Genetics, 85, 12 (1977)]. A trpl rendellenesség jelenléte, mint az élesztő gazdasejt genom jellemzője így hatékony környezetet biztosit a transzformáció kimutatásához a triptofán távollétében történő növekedés révén.

Alkalmas promotor szekvenciák az élesztő vektorokban a 3-foszfo-glicerát-kinázhoz tartozó promotorok [Hitzeman és munkatársai,

J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980)], vagy más glikolitikus enzimekhez tartozó promotorok [Hess és munkatársai, J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 (1968); Holland és munkatársai,

Biochemistry, 17, 4900 (1978), mint amilyenek például a következők: enoláz, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glukóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvátkináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglukóz izomeráz és glukokináz.

Az alkalmas kifejező plazmidok kialakításakor az ezekhez a génekhez, tartozó terminációs szekvenciákat is ligáljuk a kifejező vektorhoz, a kifejezni kívánt szekvencia 3’ végéhez, hogy biztosítsuk az mRNS poliadenilezését és a terminációt. Más promotorok, amelyeknek az a további előnye, hogy az átírást a növekedési feltételek szabályozzák, a következők: promotor tartományok az alkohol dehidrogenáz 2, izocitokróm C, savas foszfatáz enzimekhez, a nitrogén-anyagcserével kapcsolatos bontóenzimekhez, a fentebb említett glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenázhoz, valamint a maltóz és galaktóz hasznosításáért felelős enzimekhez. Minden olyan plazmidvektor alkalmas, amely az élesztővel összeférhető promotort, replikációs origót és terminációs szekvenciákat tartalmaz.

Gazdasejtkénl előnyösen többsejtű szervezetektől származó sejtek tenyészetét használjuk, különösen a találmány szerinti működőképes humán Vili. faktor termelésére szolgáló DNS kifejezésére. Általában a gerincesekből származó sejtek különösen érdekesek, például a VERŐ és HeLa sejtek, a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonalak, továbbá a W138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak. A kifejező vektorok az ilyen sejtek számára rendszerint tartalmaznak - ha szükséges egy vagy több replikációs origót, a kifejezni kivánt gén előtt elhelyezkedő promotort a szükséges riboszóma kötési helyekkel, RNS összefonódási helyekkel, poliadenilezési helyekkel és átíráslezáró szekvenciákkal együtt.

Az emlősöktől származó sejtekben történő alkalmazásnál a kifejező vektorokon lévő szabályozó funkciókat vírusos eredetű anyag biztosíthatja. Például szokásosan alkalmazott promotorok származnak a poliomából, a Simian Vírus 40 (SV40)-ból és különösen az adenovirus 2-ből.

Az SV40 vírus korai és késői promotorai hasznosak, akárcsak az adenovirus fő késői promotora, amelyet fentebb említettünk. Az is lehetséges és gyakran kívánatos továbbá, hogy a kivánt gén szekvenciával általában társult promotor vagy szabályozó szekvenciákat használjuk fel, feltéve, hogy ezek a szabályozó szekvenciák összeférhetők a gazdasejt rendszerrel.

-1019

HU 202275 A

Λ replikációs origó vagy a vektor olyan jellegű felépítésével biztosítható, hogy egy exogón origót biztosítson (ilyen az adenovirusból vagy más virusforrásböl, például polioma, SV40, VSV, BPV stb. vírusokból származhat), vagy a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmusa biztosíthatja, ha a vektor beépül a gazdasejt kromoszómájába.

Amikor kiválasztunk egy előnyös gazdasejtet, a találmány szerinti olyan vektorokkal való átfei-tőzéshez, amelyek mind a Vili. faktort, mind a DHFR fehérjét kódoló DNS szekvenciákat tartalmazzák, célszerűen az alkalmazott DHFR fehérje típusa szerint választjuk ki a gazdasejtet. Abban az esetben, ha vad típusú DHFR fehérjét használunk, előnyös olyan gazdasejt választása, amely DHFR-ben hiányos. Ez lehetővé teszi ugyanis azt, hogy a DHFR kódoló szekvenciát jelzőként használjuk a sikeres átfertözéshez olyan szelektív táptalajon, amelyből hiányzik a hipoxantin, glicin és a timidin.

Másrészt, ha szabályozó szekvenciaként olyan DHFR fehérjét használunk, amelynek csekély a megkötő affinitása az MTX iránt, akkor nincs szükség a DHFR-rezisztens sejtek alkalmazására. Tekintettel arra, hogy a mutáns DHFR rezisztens a metotrexátra, az MTX-tartalmú táptalajok felhasználhatók a kiválasztás eszközeként, feltéve, hogy maguk a gazdasejtek érzékenyek metotrexátra. A legtöbb eukarióta sejt, amely képes MTX-et abszorbeálni, inetotrexát-érzékeriy.

Úgy is eljárhatunk, hogy vad típusú DHFR gént alkalmazunk erősítő jelzőként olyan gazdasejtben, amely nem hiányos DHFR-ben, feltéve, hogy egy második szelekciós markert is alkalmazunk, például a neomicinnel szembeni rezisztenciát.

A leírás egy későbbi részében közölt példák BHK sejtek, mint gazdasejtek alkalmazását ismertetik, és olyan kifejező vektorok használatát, amelyek tartalmazzák az adenovírus fő késői promotorát.

C. Általános módszerek

Ha vastag, sejtfalnélküli, sejteket használunk gazdasejtként, az átfertözést a kalcium-foszfátos kicsapásos módszerrel végezzük [Graham és munkatársai, Virology, 52, 546 (1978)]. Más módszereket is alkalmazhatunk azonban a DNS sejtekbe történő bevitelére, például magba fecskendezést vagy protoplasztfúziót.

Ha prokariota sejteket vagy olyan sejteket használunk, amelyek tekintélyesebb 6ejtfalszerkezeteket tartalmaznak, az az átfertözés előnyös módszere a kalciumos kezelés kalcium-klorid alkalmazásával [Cohen és munkatársai, PNAS (USA), 69, 2110 (1972)].

A kívánt kódoló és szabályozó szekvenciákat tartalmazó alkalmas vektorok felépítéséhez szokásos ligálásos módszereket használunk. Az elkülönített plazmidokat vagy DNS 12 töredékeket elhasítjuk, a végeket megfelelőre szabjuk, és újra ligáljuk olyan formában, amely a kívánt plazmidok létrehozásához szükséges.

Az elhasitást restrikciós enzimmel (vagy enzimekkel) történő kezeléssel végezzük, alkalmas pufferoldatban. Általában mintegy 1 pg plazmidot vagy DNS töredéket kezelünk 1 egység enzimmel körülbelül 20 pl pufferoldatban 1 órán át. (Az egyes restrikciós enzimekre a gyártók megadják az alkalmas pufferoldatokat és a szubsztrátum mennyiségeit. Hasonló módon, a gyártó cégek rendelkezésére bocsájtják a T4 ligáz, T4 polinukleotid kináz és a bakteriális lúgos foszfatáz alkalmazásának szokásos körülményeit.) Inkubálás után a fehérjét fenollal és kloroformmal végzett extrakcióval eltávolítjuk, a nukleinsavat pedig etanolos kicsapással nyerjük ki a vizes frakcióból. A szokásos laboratóriumi eljárások ismertetése rendelkezésre áll [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982].

A .tapadós végű (átfedő) restrikciós enzimtöredékek .tompa végű' töredékekké válnak például a következő módszerek alkalmazásával.

Betöltés párképzéssel: 2-15 pg DNS-t °C-on 30 percig inkubálunk egy olyan oldatban, amely a következőket tartalmazza: 50 mM nátrium-klorid, 10 mM trisz (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 1 mM ditiotreitol, a négy dezoxinukleozid-trifoszfát 250-250 mikroM koncentrációja és 8 egység DNS polimeréi Klenow-töredék. A reakciót fenolos és kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással fejezzük be.

Emésztés SÍ nukleázzal: 2-17 pg- DNS-t 600 egység Si nukleázzal inkubálunk 37 °C-on 30 percig egy olyan oldatban, amely mM nátrium-acetátot (pH=4,5), 1 mM cink-kloridot és 300 mM nátrium-kloridot tartalmaz. Ezután extrakciót végzünk fenollal és kloroformmal, majd etanolos kicsapást hajtunk végre.

Szintetikus DNS töredékeket készítünk az ismert foszforsav-triészteres [Crea és munkatársai, Nukleic Acids Rés., 8, 2331 (1980)] vagy foszforamidites módszerekkel (Beaucage és munkatársai, Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)]. A DNS-t elektroforézisnek vetjük alá agaróz vagy poliakrilamid gélen a szokásos módszerekkel [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982). A töredékeket elektroelúcióval tisztítjuk a gélről [Lawn és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 9, 1045 (1981)].

Ezután a DNS-sel Southern-folt hibridizációt végzünk [Southern, J. Molec. Bioi., 98, 503 (1975)].

-1121

HU 202275 A

Az RNS Northern-folt hibridizációjának befejezése után elektroforézist végeztünk 6% formaldehidet tartalmazó agaróz gélen [Maniatis és munkatársai idézett munkája; Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5794 (1980)].

Radioaktív izotóppal jelzett vizsgálómintákat készítünk úgy, hogy ³²P izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású nukleotid Lrifoszfátok (³²P: Amersham; Klenow-féle DNS 1 polimeráz; BRL, NEB vagy Boehringer-Mannheim) alkalmazásával véletlenszerű borjú-esecsemómirigy DNS-sel beindított szintézist végzünk [Taylor és munkatársai, Biochem. Biophys. Acta, 442, 324 (1976)]. A rövid öli- 1 gonukleotid vizsgálómintákat a végükön megjelöltetjük T4 polinukleotid kináz segítségével.

A .standard sós’ Southern-féle hibridizáció körülményei: hibridizáció 5 x SSC ol- 2 datban (1 x SSC oldat összetétele: 0,15 M nátrium-klorid és 0,015 M trinátrium-citrát,), mbl nátrium-foszfát (pH=7), 10%-os dextrán-szulfát, 5x Denhardt-oldat (lx Denhardt oldat összetétele: 0,02% ficoll, 0,02% polivinil- 2 -pirrolidon, 0,02% szarvasmarha szérum albumin), 20-100 jug/ml denaturált lazacsperma DNS és 0-50% formamid jelenlétében, 24-42 “C közti hőmérséklet-tartományban, majd mosás 0,2-lx SSC oldatban, amely 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot is tartalmaz, 24-65 °C közötti hőmérséklet-tartományban. A megszáritott szűrökkel Kodak XAR filmet exponálunk -80 °C-on, DuPont .Lightning-Plus erősítő szűrök alkalmazásával. (Lásd általában Maniatis és munkatársai idézett munkáját].

A sejt- és szövet-ribonukleinsavak Northern-féle foltvizsgálatához a hibridizációt az alábbi közegben végezzük: 5x SSC, 5x Denhardt-féle oldat, 10% dextrán-szulfát, 50% forniamid, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát, 0,1% nátrium-pirofoszfát, 0,1 mg/ml Escherichia coli tRNS. A 42 °C-on egy éjszakán át kivitelezett hibridizációhoz egy ³²P izotóppal jelzett mintát használunk, amely a lambda 120 A exon szekvenciát tartalmazó, 189 bázispárból álló Stul/HincI töredékéből készült. A mosást 42 °C-on végezzük 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,2x SSC oldattal.

Emberi DNS-t készítünk perifériás vér limfocitákból (46,XY) vagy limfoblaszt sejtekből (49,XXXXY, N.I.G.M.S. Humán Genetic Mutant Cell Repository, Camden, N.J., deponálás száma GM1202A) [Maniatis és munkatársai idézett műve). Escherichia coli piazmid DNS-t és bakteriofág lambda DNS-t állítunk elő a Maniatis és munkatársai munkájában megadott módon. Szöveti RNS-t állítunk elő, vagy a guanidin-tiocianátos módszerrel [Maniatis és munkatársai idézett munkája; Ullrich és munkatársai, Science, 196, 1313 (1977)], vagy Goldberg módszerével [Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5794 (1980)]. A poliadenilezett RNS-t oligo (dT) cellulózon különítjük el [Aviv és munkatársai, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 69, 1408 (1972)1.

A DNS szekvencia-analízist Sanger és munkatársai módszerével végezzük [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

74, 5463 (1977)].

A lambda/lx könyvtárhoz a 49, XXXXY DNS öt, 50-50 pg mennyiségű alikvot részét emésztjük Sau3AI enzimmel, 1 ml térfogatban, 0 3,12; 1,56; 0,782; 0,39 és 0,195 egység/ml enzinikoncentráció alkalmazásával, 37 °C-on. Az emésztést 1 órán át végezzük. A próbaemésztés és a gélanalizis azt mutatja, hogy ilyen körülmények között, 0,782 egység/ml 5 Sau3AI-koncentráció esetén a DNS tömeg szerinti átlagos mérete körülbelül 30 kb. igy ezek az emésztések 15 kb körül elhelyezkedő átlagos számszerű eloszlást adnak.

Az öt emésztésből nyert DNS-t egyesit0 jük, fenollal és kloroformmal extraháljuk, etanoilal kicsapjuk és elektroforézisnek vetjük alá 6g/l koncentrációjú, alacsony gélesedési hőmérsékletű, vízszintes agaróz gélen [Maniatis és munkatársai idézett munkája] 5 (Seaplaque agaróz, FMC Corp.), két 5,6 x x 0,6 x 0,15 cm nagyságú lemezen. A 12-18 kb részt tartalmazó géldarabot kivágjuk, és a DNS-t a gélszelet megolvasztásával tisztítjuk a Maniatis és munkatársai által leirt módon.

Charon 30 karokat készítünk oly módon, hogy a vektor 50 ng mennyiségét emésztjük BamHI enzimmel, és elkülönítjük a 31,9 kb nagyságú kar-töredéket egy 6 g/1 koncent5 rációjú, alacsony gélesedési hőmérsékletű agaróz gélről a fentebb ismertetett módon. A lambda/4X könyvtár kialakításához a Charon 30 BamHI karok és a 12-18 kb nagyságú Sau3A részleges 49, XXXXY DNS optimális 0 koncentrációját a Maniatis és munkatársai által leírt módon határozzuk meg. A ligáit DNS-t egy in vitro extraktumba .csomagoljuk (.Packagene,) gyártó: Promega Biotec,

Inc., Madison, WI).

Egy szokásos reakcióban mintegy 1,3 Mg

Charon 30 BamHI kart ligálunk 0,187 Mg mennyiségű, 12-18 kb nagyságú Sau3A DNS betéttel 10 m1 térfogatban. A DNS lemezre vitelével, becsomagolva körülbelül 1,3 χ 10⁶ fág tarfoltot kapunk. A lambda/4X könyvtár kialakításához 1,7 x 10® fágot szélesztünk, mégpedig 17000 fágot 150 mm-es lemezenként. Ezeken a lemezeken egy éjszakán át folytatunk szaporítást, majd egy olyan közegbe kaparjuk, amely 10 inM trisz-hidrokloridot (pH=7,5), 0,1 M nátrium-kloridot, lOmM magnéziura-kloridot és 0,5 g/1 zselatint tartalmaz, majd rövid ideig centrifugáljuk, mindezt a fág erősítése érdekében. Általában ulkalmas számú fágot (0,5-2 χ 10⁶) viszünk át lemezre, és vetünk alá a vizsgálatoknak [Maniatis és munkatársai idézett, munkája]. Egyes esetekben a ligáit és in vitro csomagolt fágot erősítés nélkül, közvetlenül vetjük alá a vizsgá5 latoknak.

-1223

HU 202275 A

A lambda 482 elkülönítéséhez a VIII. faktor genom 22 kb nagyságú Bell töredékét és a lambda 1059 vektoi· BaniHI kar töredékeit tartalmazó kiónt különítjük el gélelektroforézissel [Karn és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5172 (19801J. A 49.XXXXY sejtvonaltól származó 100 pg DNS-t emésztjük Bell enzimmel, és a 20-24 kb nagyságú frakciót gélclektroforézissel elkülönítjük. Mintegy 0,8 ug lambda 1059 kar-töredéket és 5% elkülönített Bell DNS-t ligálunk 10 pl térfogatban, és így 712 000 tarfoltot hozunk létre [Maniatis és munkatársai idézett munkája]. Közülük négyszázezret vizsgálunk meg 2,2 kb nagyságú, a lambda 114-ből származó Stul/EcoRI vizsgáló mintával, 2-2 párhuzamos méréssel.

A kozmid/4X könyvtárat a lambda/4X könyvtár kialakításához használt 49.XXXXY DNS-ből hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy nagy gondot fordítunk a DNS elkülönítésénél a nyírás vagy más szakadás elkerülésére. A DNS-t részlegesen elhasitjuk a Sau3AI enzim öt különböző koncentrációjának alkalmazásával, és az egyesített DNS-t méret szerint szétválasztjuk 100-400 g/1 szacharóz-grádiens alkalmazásával [Karn és munkatársai idézett közleménye]. A 35-45 kb nagyságú DNS-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, dializáljuk, és etanollal kicsapjuk. ’

A pGcos4 kozmid vektor kar-töredékeit ismert elvek szerint állítjuk elő [Ish-Horovitz és munkatársai, Nucl. Acids Kés., 9, 2989 (1981)]. Röviden, a pGcos4 kozmid vektor két különálló, egyenlő alikvot részét szétvágjuk SstI enzimmel (amely a SacI izoskizomerje) vagy Sáli enzimmel, majd pedig bakteriális lúgos foszfatázzal kezeljük. Ezeket az alikvot részeket ezután fenollal és kloroformmal extraháljuk, egyesítjük, etanollal kicsapjuk és BamHI enzimmel szétvágjuk. Ebből a feltárásból a 4394 és 4002 bázispárból álló kar-töredéket különítjük el alacsony gélesedési hőmérsékletű agaróz gélen. Ezeket a kar-töredékeket ezután ligáljuk az elkülönített, Sau3Al enzimmel részlegesen emésztett, 40 kb nagyságú DNS-hez.

Egy szokásos reakciónál 0,7 ug mennyiségű pGcos4 kartöredéket ligálunk 1 ug mennyiségű, 40 kb méretű, humán 4X DNS-hez 10 yl térfogatban [Maniatis fenti munkája]. A reakcióelegyet ezután in vitro becsomagoljuk, és felhasználjuk Escerichia coli HB101, egy recA' törzs megfertőzésére [Maniatis idézett munkája]. Ez a reakció mintegy 120.000 telepet hoz létre tetraciklint tartalmazó lemezekre történő átvitel esetén. Körülbelül 150.000 kozmidot vizsgálunk át, 20 darab 150 mm-es lemezen, 2-2 párhuzamos méréssel, a leirt módon, egy éjszakán át erősítést végezve kloramfenikol-tartalmú lemezeken [Maniatis és munkatársai idézett munkája].

Kétszálú cDNS-t állítunk elő a korábban leirt módon [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 4057 (1980); Capon és munkatársai, Natúré, 304, 507 (1983)], vagy oligo(dT)12-18-at vagy szintetikus dezoxioligonukleotid 16-mereket (hexadekamereket) használva primerekként az első szál szintéziséhez reverz transzkriptáz alkalmazásával. Poliakrilamid géleken történő elkülönítés után a megfelelő méretű (rendszerint 600 bázispár nagyságú vagy nagyobb) cDNS-t vagy C farokkal látunk el terminális transzferázzal, hozzákapcsolunk G farokkal ellátott, PstI enzimmel emésztett pBR322 plazmidot, és Escherichia coli DH1 törzsbe transzformáljuk [Hanahan, J. Mól. Bioi., 166, 557 (1983)], vagy pedig 100-szoros mólfeleslegben vett szintetikus DNS EcoRl adapterekhez ligáljuk, újból elkülönítjük poliakrilamid gélen, ligálással beillesztjük EcoRl enzimmel emésztett lambda GTlO-be, fág részecskékbe csomagoljuk és Escherichia coli C600hfl törzsön szaporítunk [Huynh és munkatársai, Practical Approaches in Biochemistry, ORL Press Ltd., Oxford, England, 1984],

A szokásos eljárások módosításaként egy kiegészítő szintetikus DNS 18-mert és 22-mert (5’-CCTTGACCGTAAGACATG és 5’AATTCATGTCTTACGGTCAAGG) tartalmazó adaptert foszforilezünk a tompa végén - azonban az EcoRl kohéziv végén nem, és ilyen módon hatékonyan ligáljuk az adaptert a kétszálú cDNS-val anélkül, hogy jelentős mértékű őnösszekapcsolódás következne be az EcoRl helyen. Ezáltal eredményesen helyettesítjük azt a munkaigényes eljárást, amelynél önkiegészitö EcoRl kapcsolókat ligálnánk az EcoRl metiláz enzimmel kezelt kétszálú cDNS-hez, majd pedig EcoRl enzimmel végzett emésztéssel eltávolitanánk a kapcsoló oligomerek feleslegét a cDNS végződésekből.

Annak érdekében, hogy növeljük a 3500 bázispárnál nagyobb cDNS kiónok kinyerésének hatékonyságát - amely kiónok a poli(A)-tól a genomikus klónozással hozzáférhetővé tett, 3’ irányban legközelebbi VIII. faktor vizsgálómínta szekvenciáig terjednek, (vagyis A exon) -, a második szál cDNS szintézisét specifikusan beindítjuk oly módon, hogy egy B exorion belüli szekvenciának megfelelő szintetikus DNS 16-mert iktatunk be a reakcióba az mRNS .értelmes' (sence) szálon.

D. Adenovírus alklónozás

Az adenovírus 2 DNS-t a Bethesda Research Laboratories (BRL) cégtől szerezzük be. A vírusos eredetű DNS-t HíndlII enzimmel elhasitjuk, és elektroforézisnek vetjük alá 5%-os poliakrilamid gélen (TBE puffer). A HindlII B töredéket tartalmazó gélrészt [Gingeras és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 13475 (1982)] kimetsszük, és a DNS-t elektroelúcióval eltávolítjuk a gélből. Fenollal és kloroformmal végzett extrakció után etanolos

-1325

HU 202275 A kicsapással töményítjük a DNS-t, és a pAdHindB plazmid létrehozására a Hindin enzimmel hasított pUC13-ba klónozzuk INorrander és munkatársai, Gene, 26, 101 (1983)]. Ezt a Hindii! szubklónt emésztjük Hindui és Sáli enzimmel, és egy olyan töredéket különítünk el, amely a 17,1-25,9 koordináták közötti adenovírus résznek felelt meg [Gingeras és munkatársai idézett publikációja]. Ezt a töredéket HindllI és Sáli enzimekkel hasított pUC13-ba klónozzuk, és így a pUCHs plazmidot kapjuk.

A pAdHindB plazmidból elkülönítjük a Sáli és Xhol közötti, 25,9-26,5 koordinátájú töredéket, és a pUCHS plazmid ba, az egyetlen Sáli helyre klónozzuk. Ilyen módon a pUCHSX plazmidot hozzuk létre. Ez a plazmid helyreállítja az adenovírus szekvenciákat a 17,1 helyzettől kiindulva (első késői vezető közbeavatkozó szekvencián belül) a 26,5 helyzetű Xhol helyig (harmadik késői vezető exorion belül).

Az adenovírus fö késői promotorát úgy klónozzuk, hogy az akrilamid gélből kimetszszük a HindllI C, D és E töredékeket (amelyek együtt vándorolnak), a pUC13-ba klónozzuk ezeket a HindllI helyre, és restrikciós analízissel átvizsgáljuk a HindllI C töredéket tartalmazó rekombinánsokat. Ezt a szubklónt SacI enzimmel emésztjük, amely 15,4 helyzetben, a fő késői promotortól 5’ felé [Gingeras és munkatársai idézett közleménye], valamint a pUC13 polilinkerben hasit. A DNS-t ismét kör alakúvá tesszük, és igy a pMLP2-t kapjuk, amely a pUC13 SacI és HindllI helyébe klónozott SacI és HindllI közötti (15,4-17,1 helyzetű) töredéket tartalmazza.

E. Neomicinnel szemben rezisztens vektor kialakítása

Az Escherichia coli 5. transzpozonban lévő, neomicinnel szembeni rezisztenciát adó jelzőt (markert) egy Tn5-tartalmu plazmidból különítjük el [Picken és munkatársai, Inf. and Immun., 42, 269 (1983)]. A neomicinnel szembeni ellenállást biztosító gén szekvenciáját korábban már publikálták [Beck és munkatársai, Gene, 19, 327 (1982)1. A neo töredéket BglII enzimmel tárjuk fel, amely a neomicin foszfotranszferáz gén lefordítás-beindító kodonjától 5’ felé 36 bázispár távolságra elhelyezkedő ponton hasít, és Bal31 exonukleázzal kezeljük. A foszfotranszferáz gént BamHI enzimmel elmetsszük. Ez az enzim a lefordítás-lezáró kodon után 342 bázispárral hasítja a DNS-t. Az így kapott részt beillesztjük a pBR322 plazmid ba egy betöltött Hindui hely és a BamHI hely közé.

Az egyik klón (pNeoBalö) tartalmazza a betöltött HindllI helytől 3’ felé 3 bázispár távolságra elhelyezkedő lefordítást beinditó kodont (TCATCGATAAGCTCGCATG...). Ezt a plazmidot Clal és BamHI enzimmel emésztjük, majd a foszfotranszferáz gént átfogó, 1145 bázispár nagyságú töredéket elkülönítjük, és beillesztjük a pCVSVEHBS emlős kifejező vektorba (lásd alább). Az igy kapott pSVENeoBal6 plazmid tartalmazza a foszfotranszferáz gént az SV40 korai promotortól 3’ felé, és a HBV felületi antigén gén poliadenilezési helyétől 5’ felé tartalmazza [Simonson és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 3, 2250 (1983)]. Ha ezt a plazmidot bevisszük emlős szóvettenyészet sejtjeibe, képes a foszfotranszferáz fén kifejezésére, és rezisztenciát biztosit a G418 aminoglikozid ellen [Southern és munkatársai, J. Mól. and Applied Gén., 1, 327 (1982)].

F. Szövettenyészet sejtjeinak átfertózése

A BHK-21 sejtek (ATCC) szövettenyészeten növesztett gerinces sejtek. Mint ismeretes, ezek a sejtek állandó sejtvonalként tarthatók fenn. E sejtvonalak az elkülönített közönséges sejtek egymást követő sorozatátvitelével állíthatók elő. Ezeket a sejtvonalakat vagy szilárd hordozón tartjuk fenn cseppfolyós táptalajon, vagy szilárd hordozó tápanyagokat tartalmazó szuszpenziókban növesztjük őket.

A sejteket a kívánt vektor 5 ug menynyiségével fertőzzük át (4 ug pAML3P.8cl és 1 ug pSVEneoBal6). A vektorokat a fentiek szerint állíthatjuk eló, ismert eljárás alapján [Graham és munkatársai, Virology, 52, 456 (1978)].

Az eljárás biztosítja egy plazmidgyüjtemény kölcsönhatását egy adott gazdasejttel, növelve ezáltal annak valószínűségét, hogy ha egy plazmidot abszorbeál egy sejt, további plazmidok is éppúgy abszorbeálódnak [Wigler és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3567 (1980)]. Ennek megfelelően, mind az elsődleges, mind a másodlagos kódoló szekvenciákat különálló vektorok alkalmazásával külön-külön célszerű bevinni, vagy egyetlen olyan vektort alkalmazunk, amely mindkét szekvenciát tartalmazza.

G. Az átfertözött sejtek növesztése és peptidek kifejezése

A fentiek szerint átfertözésnek alávetett BHK sejteket először két napig növesztjük nem-szelektiv táptalajon, majd a sejteket 400 ug/ml G418 koncentrációjú táptalajra visszük át, ilyen módon kiválasztva azokat a sejteket, amelyek képesek a foszfotranszferáz plazmid kifejezésére. A G418 jelenlétében lefolytatott 7-10 napos növesztés után a telepek szabad szemmel is láthatókká válnak. A több száz telepet tripszinnel kezeljük és újabb lemezre szélesztjük ezeket, lehetővé téve a gyors növekedést összefolyásig egy 10 cm átmérőjű lemezen. Ilyen módon G418 rezisztens sejteket kapunk.

-1427

HU 202275 A

Ez a sejtpopuláció sokféle jellemzőjű sejtből áll. Ahhoz, hogy olyan sejtekhez jussunk, amelyek a FV1II kifejező plazmid legnagyobb számú másolatával rendelkeznek, a sejteket ezután a DHFR fehérje egy inhibitorával inkubáljuk.

H. Kezelés metotrexáttal

A G418-nak ellenálló sejteket gátolja a metotrexát (MTX), a DHFR egy specifikus inhibitora, 50 nM-nál nagyobb koncentrációkban.

A metotrexátnak szövettenyészetben szaporított sejtekre gyakorolt hatásával foglalkozó korábbi vizsgálatoknak megfelelően azokat a sejteket választjuk ki, amelyek rezisztensek metotrexáttal szemben, mivel az FVIII kifejező vektorban lévő DHFR génnek többszörös másolatát fejezik ki. Ennek eredményeként az FVlII-at kódoló szekvenciák kifejezésének növekedése figyelhető meg. Ha fokozatosan növeljük az MTX mennyiségét, ezzel befolyásoljuk a pAML3P.8cl plazmid sokszorozódását, növelve ezáltal a másolatszámot. A sokszorozás felső határa sok tényezőtől függ ugyan, azonban ilyen módon kiválaszthatók olyan sejtek, amelyek rezisztensek az MTX millimól nagyságú koncentrációval szemben, s a DHFR-t kifejező (s igy az FVIII-at kifejező) plazmid másolatainak százait vagy ezreit tartalmazzák.

A VIII. faktor kifejezéséhez a G418-cal szemben rezisztens BHK sejteket, amelyek pAML3P.8cl-gyel és pSVENeoBal6-tal történő atfertözés után képződtek, olyan táptalajokon inkubáljuk, amelyek 100 nm illetve 250 nm MTX-et tartalmaznak [Simonson és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2495 (1983)]. 7-10 nap elteltével a 250 nM MTX-szel szemben rezisztens sejteket megvizsgáljuk a Vili. faktor kifejezésére vonatkozólag, az aktivitás, a radioaktív immun-vizsgálat és az mRNS Northern-féle analízise alapján.

I. A VIII. faktor antitestjej

Munkánk során sokféle, VIII. faktorral szembeni poliklonális antitestet használunk. A CC olyan poliklonális antitest, amely súlyos bemofíliás beteg vérplazmájából származik [Rotblat és munkatársai, Thromb. Rés., 21, 431 (1981)]. A C8 olyan semlegesítő monoklonális antitest, amely a VIII. faktor 210 kD nagyságú részéhez kötődik [Rotblat és munkatársai, J. Láb. Clin. Med., 101, 736 (1983)]. A CIO olyan monoklonális antitest, amelynek a tulajdonságai hasonlítanak a C8 tulajdonságaihoz, és az elkülönítése lényegében a Rotblat és munkatársai utóbbi közleményében leírtak szerint történik. Egy kereskedelemben hozzáférhető, semlegesítő monoklonális antitestet, amely a VIII. faktor 80 kD nagy16 ságú részéhez kötődik, a Synbiotic Corp.

(San Diego, California) cégtől szereztük be, termékszáma 1000-1.

A C7F7 olyan semlegesítő monokonális antitest, amely a Vili. faktor 80 kD nagyságú részéhez kötődik. Ezt az antitestet a következőképpen indukáljuk és tisztítjuk:

Hathetes nőstény BALB/c egereket többször beoltunk körülbelül 10 pg tisztított VIII. faktorral, majd az utolsó beoltás után X63-Ag8.653 egér mielóma sejtekkel fuzionált lépsejtekkel oltjuk be az állatokat, három nap elteltével [Kearney és munkatársai, J. Immun., 123, 1548 (1979)]. A hibridizációt és a hibrid sejteket klónozó módszerekkel történő elkülönítését a már korábban leírtak szerint végezzük [Simonson és munkatársai, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2495 (1983)]. A specifikus antitest-termelő kiónokat szilárd fázisú radioaktív immunvizsgálattal (RIA) mutatjuk ki IBenton és munkatársai, Virol., 117, 490 (1982)]. A pozitív kiónokat azután átvizsgáljuk a véralvadást megnyújtó képességre a fentebb leírt APTT vizsgálattal. A monoklonális C7F7 antitestet szingenikus állatokban szaporítjuk. Az antitestet fehérje A-Sepharose CL-4B kromatográfiával tisztítjuk az ascites folyadékokból IChalon és munkatársai, J. Immun., 9, 359 (1979)].

J. A VIII. faktor radioaktív immunvizsgálatai

Két radioaktív immunvizsgálatot fejlesztettünk ki a BHK és más sejtvonalakból termelt VIII. faktoi- vizsgálatára. Mindkét módszer két szakaszból áll, ahol szilárd hordozóhoz kapcsolt CC antitestet használunk fel a VIII. faktor megkötésére [Rotblat és munkatársai, J. Láb. Clin. Med., 101, 736 (1983)]. Ezt az immunkomplexet azután I¹²⁵ izotóppal jelzett CIO antitesttel (210 kD specifikus) vagy I¹²⁵ izotóppal jelzett C7F7 antitesttel (80 kD specifikus) detektáljuk.

Röviden, a két szakaszból álló radioaktív immunvizsgálatokat a következőképpen vitelezzük ki.

Egy mikrotitráló lemez 96 bemélyedését egy éjszakán át bevonjuk 100 pl 50 mM nátrium-hidrogén-karbonát pufferoldattal (pH= =9,6), amely 2,5 mg/1 CC antitestet tartalmaz. Ez utóbbit A-fehérje-szefaróz kromatográfiával tisztítottuk [Chalon és munkatársai, 3. Immun, 9, 359 (1979)]. A bemélyedéseket háromszor mossuk 200 pl PBS-oldattal, amely 0,05% Tween 20-t tartalmaz, és 1-2 órán át blokkoljuk 0,1% zselatint és 0,01% mertiolátot tartalmazó 200 ul PBS-oldattal. A bemélyedéseket ismét mossuk az előzők szerint, hozzáadunk 100 pl mintát, és egy éjszakán át inkubáljuk. A bemélyedéseket mossuk a fentebb leírtak szerint, hozzáadunk 100 pl mennyiségű, I¹²⁵ izotóppal jelzett [Greenwood és munkatársai, Biochem. J., 89, 114 (1963)] CIO vagy C7F7 antitestet (1000

-1529

IIU 202275 A cpm/μΐ), és 6-8 órán ét inkubálunk. A bemélyedéseket ismét mossuk, és a radioaktivitást mérjük. A standard görbét közönséges vérplazma 1:10 és 1:320 közötti higítású mintáinak mérése alapján állítjuk fel.

K. 17//. faktor monoklonális antitest oszlop

Humán VIII. faktor monoklonális antitest oszlopot készítünk el úgy, hogy 1,0 mg C8 antitestet (0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban, pH=8,5) 1,0 ml Affi-Gel 10 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) jelenlétében 4 órán át inkubálunk 4 °C-on. Az antitestnek több, mint 95%-a a gélhez kapcsolódik, amint azt a Bio-Rad fehérjevizsgálat (Bio-Rad Laboratories) jelzi. A gélt 50 térfogat vizzel és 10 térfogat 0,05 M iniidazollal (pll=6,9), amely 0,15 M nátrium-kloridot tartalmaz, mossuk.

L. Táptalajok kromatografálása a monoklonális oszlopon

A táptalajokat a monoklonális antitest oszlopra visszük fel, amely 1 ml gyantát tartalmaz. Az oszlopot 0,05 M imidazol pufferoldattal (pH=6,4) - amely 0,15 M nátrium-kloridot is tartalmaz - mossuk mindaddig, amig a 280 nm-nél abszorpciót mutató anyagot ki nem mostuk. Az oszlopot ezután 1,0 M kálium-jodidot és 20% etilénglikolt tartalmazó 0,05 M imidazol pufferoldattal (pH=6,4) eluáljuk. A mintákat a vizsgálathoz felhígítjuk, és dialízisnek vetjük alá őket a későbbi analízishez.

M. A Vili. faktor fúziós fehérjéknek és a fúziós fehérje antiszérumoknak az előállítása

A fúziós fehérje kifejezésére kialakított plazmidokat tartalmazó Escherichia coli törzset M-9 táptalajon növesztjük 37 °C-on. A fúziós fehérje kifejezését indolil-akriisav hozzáadásával inkubáljuk. Az indolil-akriisav végső koncentrációját 50 Mg/ml értékre állítjuk be, 2,5-4 óránként történő hozzáadással. A sejteket centrifugálással különítjük el, és felhasználásig fagyasztva tartjuk.

A sejtüledéket a fúzióhoz 100 ml 20 mM nátrium-foszfát-oldatban (pH=7,2) szuszpendáljuk, amely 10 Mg/ml lizozimot és 1-1 Mg/ml RNázt és DNázt tartalmaz. A szuszpenziót 30 percig kevertetjük szobahőmérsékleten, hogy alaposan diszpergáljuk a eejtüledéket. A szuszpenziót 4 percig ultrahanggal kezeljük (60%-os teljesítménnyel sugározzuk be). Az oldatot GSA rotorral ellátott Sorvall RC-2B centrifugában centrifugáljuk 8000/perc fordulatszámon. A kapott üledéket újraszuszpendáljuk 100 ml 0,02 M nátrium-foszfát-oldatban (pH=7,2), majd a szuszpenziót 300 ml 60%-os glicerinre rétegezzük. A mintát

4000/perc fordulatszámon centrifugáljuk 20 percig RC-3B centrifugával. A glicerinben két fázis különül el. Mind az üledék, mind pedig az alsó glicerines fázis a nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid gélen végzett analízisnél egyetlen fehérjesávot mutat, amelynek a molekulatömege a várt 25000 dalion. Az üledéket 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,02 M nátrium-foszfát pufferoldatban oldjuk. Az ismét szuszpendált üledéket és az alsó glicerines fázist 0,02 M ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal szemben (pH=8,0) dializáljuk a glicerin eltávolítására. Az oldatot liofilizáljuk és újból oldjuk 0,1% nátriuni-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,01 M nátrium-foszfát pufferoldatban, majd a felhasználásig fagyasztva tartjuk.

A fentiekben a 3. számú fúziós fehérje előállítását ismertettük.

Az 1. és 4. számú fúziós fehérjénél a sejtüledéket 0,05 M trisz-oldalban (pH=7,2) szuszpendáljuk, amely 0,3 M nátrium-kloridot és 5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmaz. Lizozimot adunk hozzá 10 Mg/ml koncentráció eléréséig, majd a mintákat 5 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. ΝΡ-40-t adunk hozzá 0,2% mennyiségben, és a szuszpenziót jégen inkubáljuk 30 percig. Nátrium-kloriddal 3M végső koncentrációt állítunk be, és 1 Mg/ml DNázt adunk hozzá. A szuszpenziót 5 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. A mintát centrifugáljuk, és a feiülúszó folyadékot elöntjük. Az üledéket kevés vízben ismét szuszpendáljuk, és a szuszpenziót centrifugáljuk. A sejtüledéket olyan oldatokban oldjuk, amelyek 0,1-1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmaznak, és a tisztítást vagy preparatív nátrium-dodecilszulfátos poliakrilamid gél elektroforézissel, és fúziós fehérjének megfelelő sáv azt követó elektroelúciójával, vagy nagy nyomású folyadékkromatográfiával végezzük TSK 3000 oszlopon, amelyet előzetesen 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,1 M nátrium-foszfát-oldattal hozunk egyensúlyba.

Nyúl antiszérumot oly módon állítunk elő, hogy új-zélandi fehér nyulakba Freund-féle teljes adjuvánsban szuszpendált fúziós fehérjemintát fecskendezünk (első injeciókét), majd kéthetenként további befecskendezéseket végzünk, Freund-féle inkomplett adjuvánsban szuszpendált minta alkalmazásával. Hat hét elteltével szérumokat veszünk az állatoktól, és analízisnek vetjük alá a szérumokat Western-fcle foltanalizissel, amelynél az emberi vérplazmából származó Vili. faktor fehérjékkel szembeni reakcióképességet vizsgáljuk.

-1631

HU 202275 A

N. Vizsgálatok a VIJI. faktornak az A.-hemofiliás plazma helyreállítását biztosító aktivitásának kimutatására

A vizsgálat elmélete 5

Λ VIII, faktor aktivitása definíció szerint az az aktivitás, amely korrigálja a Vili. faktorban hiányos vérplazma véralvadási hibáját. A Vili. faktor aktivitásának 1 egysége 10 az az aktivitás, amely 1 milliliter normális emberi vérplazmában jelen van. A vizsgálat annak az időnek a megfigyelésén alapul, amely egy látható fibrinrőg képződéséhez szükséges A. vérzékenységben (klasszikus 15 hemof illában) szenvedő betegtől származó vérplazmában. Ennél a vizsgálatnál minél rövidebb idő szükséges a vérrög képződéséhez, annál nagyobb a VIII. faktor aktivitása a vizsgált mintában. Ezt a vizsgálattípust 20 aktivált részleges tromboplasztin időnek (APTT) nevezzük. Az ilyen vizsgálatokhoz a reagensek a kereskedelemből beszerezhetők (például General Oiagnostics Platelin Plus Activator, termékszám 35503). 25

A vizsgálat kivitelezése

Mindegyik véralvadási vizsgálatot 10 x x 75 mm méretű, boroszilikát üvegből készült 30 kémcsövekben vitelezünk ki. A kémcsöveket szilikonnal vonjuk be, 1-10-szeresre hígított SurfaSil (a Pierce Chemical Company, Rockford, II. terméke) alkalmazásával, ahol a hígítást petroléterrel végezzük. A kémcsöveket 35 megtöltjük ezzel az oldattal, 15 másodpercig inkubáljuk, majd az oldatot eltávolítjuk. A kémcsöveket háromszor mossuk csapvízzel, háromszor pedig desztillált vízzel.

Platelin Plus Activator készítményt 40 (gyártó: General Diagnostics, Morris Plains,

NJ) 2,5 ml desztillált vízben oldunk a csomagoláson feltüntetett útmutatás szerint. Ahhoz, hogy mintát készítsünk a véralvadási vizsgálatokhoz, a Platelin Plus Activator oldatát 45 37 °G-on 10 percig inkubáljuk, majd felhasználásig jégen tároljuk.

Egy szilikonnal bevont kémcsőbe 50 mikroliter Platelin Plus Activatort és 50 mikroliter, VIII. faktorban hiányos vérplazmát 50 (George Ring Bioinedical Inc., Overland Park,

KA) mérünk. Ezt az oldatot összesen 9 percig inkubáljuk 37 °C-on. Közvetlenül a 9 perces inkubálási idő vége előtt a vizsgálandó mintát 0,02% szarvasmarha szérum albumint tar- 55 talmazó 0,05 M trisz-hidroklorid-oldattal (pH=7,3) hígítjuk. A vérplazma (aktivátor szuszpenzióhoz 50 mikroliter mennyiséget adunk a hígított mintából, és pontosan amikor letelt a szuszpenzió inkubálásának kilen- 60 cedik perce, a véralvadási reakciósort 50 mikroliter 0,033 M kalcium-klorid-oldat hozzáadásával beindítjuk. A reakcióelegyet gyorsan összekeverjük, és a kémcsövet enyG5 hén rázogatva megfigyeljük azt az időt, amely egy látható fibrinrőg képződéséhez szükséges.

Standard görbét vehetünk fel a VIII. faktor aktivitásáról, ha a közönséges vérplazmát (George King Bíomedical, Inc., Overland Park, KA) 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 és 1:200 arányban hígítjuk. A vérrögképződési időt féllogaritniusos beosztású papíron ábrázoljuk a vérplazma hígításának függvényében. A kapott görbét ezután felhasználhatjuk ahhoz, hogy a vérrögképződés idejét a VIII. faktor aktivitásának egységeivé alakítsuk át.

O. Meghatározás kromogén pepiiddel

A meghatározás elmélete

A Vili. faktor szerepet játszik a X. faktor Xa. faktorrá történő aktiválásában, IXa. faktor, foszfolipid és kalciumionok jelenlétében. Igen specifikus vizsgálatot dolgoztunk ki, amelynél a IXa. faktort, a X. faktort, a foszfolipidet és a kaciumionokat alkalmazunk.

Ezért ennél a vizsgálatnál a Xa. faktor képződése a VIII. faktor aktivitású forrás adagolásától függ. Minél több VIII. faktort adunk a vizsgálathoz, annál több Xa. faktor képződik. Miután kialakult a Xa. faktor, kromogén peptid szubsztrátumot adunk a reakcióelegyhez. Ezt a pepiidet specifikusan hasítja a Xa. faktor, nem befolyásolja azonban a X. faktor, és csak lassan hasítják más proLeázok. A peptid elhasitásakor para-nitro- ,

-anilid-csoport szabadul fel, amelynek abszorbanciája 405 nm, mig a nem hasított peptid szubsztrátum csak csekély mértékű vagy semmilyen abszorbanciát nem mutat ezen a hullámhosszúságon. A kromogén szubsztrátum elhasitása folytán létrejövő abszorbancia kialakulása függ a reakcióelegyben az inkubálás után jelenlevő Xa. faktor mennyiségétől, amely viszont a reakcíóelegyhez adott vizsgált mintában lévő működőképes VIII. faktor mennyiségétől függ. Ez a vizsgálat rendkívül specifikus a Vili. faktor aktivitására, és kevésbé van kitéve az esetleges hamis pozitív reagálásnak, mint a VIII. faktorban hiányos vérplazmával történő vizsgálat.

A vizsgálat kivitelezése

A Helena Laboratories, Beaumont, Texas cégtől szerezzük be VIII. faktort (Coatest Pactor VIII, katalógusszáma 5293). Gyakorlatilag azt az eljárást alkalmazzuk, amelyet a gyártó javasol a .végpontot meghatározó módszerhez’ olyan mintáknál, amelyek 5%-nál kevesebb VIII. faktort tartalmaznak. Ahol jelezzük, az inkubálási időt megnyújtjuk annak érdekében, hogy érzékenyebbé tegyük a vizsgálatot. Egyes vizsgálatoknál megváltoztatjuk a reagensek gyártó által javasolt térfogatát. Ez a módosítás azonban nem zavarja a vizsgálati eredményt.

-1733

HU 202275 A

A Xa. faktorhoz használt kromogén alapanyagot (S-2222 + 1-2581) 10 ml vizben oldjuk. igy 2,7 millimól) liter alapanyag-koncentrációt kapunk. Az alapanyagnak ezt az oldatát alikvot részekre osztjuk, és -20 °C- 5

-on fagyasztva tároljuk. A FIXa + FX reagens tartalmazza a IXa. és X. faktort, ezt 10 ml vizben oldjuk. Az oldatot alikvot részekre osztjuk, és a felhasználásig -70 °C-on megfagyasztva tároljuk. A reagenskészlet 10 még a kővetkező oldatokat tartalmazza: 0,025 mólos kalcium-klorid-oldat; foszfolipid (sertésagy) és puffer törzsoldat (Buffer Stock Solution). Ez utóbbi oldatból 1 részt 9 rész vizzel higitunk, igy a vizsgálathoz 15 használt végső oldat 0,05 M trisz-hidrokloridot (pH=7,3) és 0,02% szarvasmarha albumint tartalmaz. Ezeket az oldatokat a felhasználásig 4 °C-on tároljuk.

A foszfolipid + FIXa + FX reagenst ügy 20 készítjük el, hogy 1 térfogatrész foszfolipidet 5 térfogatrész FIXa + FX reagenssel keverünk össze.

Az alábbi eljárást alkalmazzuk:

Reagens Minta Vakpróba

Foszfolipid + + FIXa + FX 200 μΐ 200 μΐ

Vizsgált minta 100 - 30

Pufferoldat - 100

Alaposan összekeverjük, és 37 °C-on 4 percig inkubálunk

Kalcium-klorid 100 100

Alaposan összekeverjük, és 37 °C-on 35 pontosan 10 percig inkubálunk

S-2222 + 1-2581 200 200

Alaposan összekeverjük, és 37 °C-on pontosan 10 percig inkubálunk

Ecetsav (50%-os) 100 100 40

Alaposan összekeverjük

Meghatározzuk a minta abszorpcióját 405 nm-nél a reagens vakpróbával szemben 45 spektrofotométer segítségével, 30 percen belül. A 405 nm-nél mért abszorbancia és a Vili. faktoraktivitás egységei közötti összefüggést kalibrálással határozzuk meg, amelyhez standard emberi vérplazmát (George King 50 Biomedical, Overland Park, KS) használunk.

A találmány egy előnyős kiviteli alakját az alábbi példán mutatjuk be.

1. A VIII. faktor gén előállításának álta- 55 lános stratégiája

Rekombináns DNS gént a legáltalánosabban elfogadott eljárás szerint úgy állíthatunk elő, hogy a megfelelő szövet- vagy 60 sejttípus mRNS-éböl nyert cDNS kiónok könyvtárát átvizsgáljuk. Számos tényező járul hozzá ahhoz, hogy a VIII. faktor gén genomikus DNS-ének átvizsgálásához egy alternatív módszert is alkalmazzunk. 65

Először is ismeretlen volt a Vili. faktor szintézisének a helye. Jóllehet, gyakran úgy vélik, hogy a szintézis legvalószínűbb helye a máj, a bizonyítékok nem meggyőzőek. A májban és esetleg a lépben lejátszódó szintézisre a szervátáramoltatásos és szervátültetési vizsgálatok mutatnak [Zimmerman és munkatársai, Haemostasis and Thrombosis, Bloom, A.L. és Duncan, P.T., Churchill Livinstone, New York, 111-123. oldal, 1981]. Gyakran tapasztalható azonban a VIII. faktor nagyobb mértékű aktivitása olyan betegeknél, akik súlyos májbetegségben szenvednek [Meili és munkatársai, Thromb. Diathes. Haemorrh. 24, 161 (1970)]. A sejtekhez kötődő monoklonális antitestet alkalmazó, újabb, ellentmondásos vizsgálatoknál igen nagy koncentrációkban mutatták ki a fehérjét mind a máj szinuszoid andoteliális [Stel és munkatársai, Natúré, 303, 530 (1983)], mind hepatocita [Kelly és munkatársai, Brit. J. Haera., (1984)], mind a nyirokcsomó sejtekben (a mennyiségek tekintetében utánuk a tüdő, a máj és a lép következik) [Exmer és munkatársai, Thrombosis Ree., 32, 427 (1983)]. Ugyanekkor a VIII. faktorral kapcsolatos antigént (von Willebrand-faktort) majdnem bizonyosan szintetizálják az endoteliális sejtek [Jaffe és munkatársai, J. Clin. Invest., 53, 36a (1974)]. Nemcsak a szöveti forrás bizonytalan, hanem a VIII. faktornak a vérplazmában lévő mennyisége is rendkívül csekély. A 100-200 ng/ml körüli áramló koncentráció (Zimmerman és munkatársai, Haemostasis and Thrombosis, 111-123. oldal) például a szérum albumin mólkoncentrációjának mintegy két milliomod része. Ezért nem volt nyilvánvaló, hogy egy adott szövetnek megfelelő RNS-böl készült cDNS könyvtárak a VIII. faktor kiónjait fogják eredményezni.

A fenti megoldások alapján úgy döntöttünk, hogy először a lambda bakteriofágban lévő humán genom rekombináns könyvtárát vetjük alá szűrővizsgálatnak (a következőkben ezt genomikus könyvtárnak nevezzük). Jóllehet a genomikus könyvtáraknak tartalmazniuk kell a Vili. faktor génjét, intronok valószínű jelenléte akadályozhatja a rekombináns fehérje végső kifejezését. Stratégiánk általánosságban a következő volt:

1. Azonosítunk egy genom kiónt, amely megfelel a humán VIII. faktor fehérje egy maghatározott szekvenciájú részének.

2. .Genomikus sétát* (genomic walk) végzünk, hogy meghatározzuk az átfedő genomikus kiónokat, amelyek tartalmazzák a teljes mRNS kódoló tartományt.

3. A genomikus kiónok töredékeit felhasználjuk azonosításra a Vili. faktor mRNS szövet vagy sejt forrásaiban levő RNS-hez történő hibridizációval, majd ezekből a sejtekből cDNS kiónokat készítünk.

4. A fenti 3. ponttal párhuzamosan genomikus kiónok részeit fejezzük ki SV40 rekombináns .exonkifejező* plazmidokban. Az ezekből a plazinidokból a szövettenyészet

-1835

Hl) 202275 A (cos) sejtjeinek átfertőzése után átírt RNS-t in vivő alakítjuk, és ez a cDNS kiónok alternatív forrása lehet a rekombináns VIII. faktor fehérje termeléséhez.

A fenti eljárás tényleges kivitelezésekor a cDNS kiónokból, különféle típusú genomikus klónokból és SV40 rekombináns .exontermelő’ klónokból származó információk is szerepet játszottak. Ezekkel az alábbiakban külön foglalkozunk. 10

2. A gcnomikus könyvtár átvizsgálása

Ismeretes, hogy a VIII. faktor génje az emberi X kromoszómán helyezkedik el [Zim- 15 mermari és munkatársai idézett munkája.) A pozitív kiónok részarányának növelésére genom könyvtárat hozunk létre 4X kromoszómákat tartalmazó egyénből kinyert DNS-böl. (A limfoblaszt sejtvonal 49.XXXXY kariotipusú; 20 az ebből a DNS-ből létrehozott könyvtárat a leírásban a továbbiakban 4X könyvtárnak nevezzük.) A 49.XXXXY DNS-t részlegesen emésztjük Sau 3AI enzimmel, és a megfelelő méretű frakciókat ligáljuk lambda fág vagy 25 kozmid vektorokhoz. Az alábbiakban ismertetjük ezeknek a lambda/4X és kozmid/4X könyvtáraknak a létrehozásával kapcsolatos részleteket. A VIII. faktor génjének a várható gyakorisága a lambda/4X kőnvtárban kö- 30 rülbelül egy, 110.000 klón közül, a kozmid könyvtárban pedig körülbelül egy, 40.000 klón közül.

Ezeket a könyvtárakat szűrővizsgálatnak vetjük alá a VIII. faktor génjére vonat- 35 kozólag, a VIII. faktor fehérjeszekvencia részletein alapuló, szintetikus oligonukleotid vizsgálóminták segítségével. Ezek az oligonukleotid vizsgálóminták két típusba sorolhatók: 30-100 nukleotidból álló egyedi szekven- 40 cia, amely a kódon kiválasztás alkalmazásán alapul (hosszú minták); és 14-20 nukleotid hosszúságú vizsgáló minták keveréke, amely minden lehetséges degenerációs kombinációnak megfelel az egyes kódonok kiválasztása- 45 nál (rövid minták).

A hosszú minták fö előnye az, hogy a fehérje bármelyik, 10-30 aminosavat tartalmazó szekvenciája alapján szintetizálhatok. Nincs szükség kis kódonböségű különleges 50 részekre. Egy másik előny az, hogy mivel nincs szükség a génszekvenciával való pontos megfelelésre (csak 10-14 nukleotid komplementer egyezésű szakaszokra van szükség), az alkalmas hibridizációt nem akadályozza 55 meg szükségszerűen, ha a komplementaritás megszakad intron jelenléte folytán, vagy génpolimorfizmus vagy fehérjeszekvencia-hiba van jelen. A hosszú minták hátránya viszont, hogy mindössze egy kodon kiválasztá- θθ sa történik meg minden egyes aminosavra. A kodonok kiválasztásánál egy, az emlősöknél tapasztalható kódongyakoriságra vonatkozó táblázatot használunk [Grantham és munkatársai, Nuclei Árts Rés., 8, r49 (1980)], és ha 55 20 ebből nem derül ki világosan, hogy mit részesítünk előnyben, a IX. faktor génjének kodon-gyakoriságát vesszük figyelembe [Kurachi és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 5 USA, 79, 6461 (1982)]. Mivel a hosszú minták várt szekvencia-illeszkedését nem ismerjük, minden egyes vizsgálómintánál empirikusan kell meghatároznunk a hibridizáció szigorúságát. Ebből a célból a hibridizációt genomikus DNS foltokkal, valamint a mosás különböző szigorúságokkal végezzük.

A rövid vizsgálóminták előnye az, hogy mindegyik lehetséges kodon oligonukleotidok keverékeként szintetizálható. Ha tehát az aminosav-szekvencia helyes, egy rövid vizsgálóminta mindig hibridizálódik a számunkra fontos génnel. A fő korlátozás a szintetizálható szekvenciakeverék összetett volta. A működés szempontjából 32 különféle szekvenciából álló keverék tekinthető a maximális keverékméretnek, tekintetbe véve a genoniikus könyvtárhoz történő hibridizáció jel/zaj arányából adódó korlátozásokat. Ez azt jelenti, hogy csak a kis kodonbóségű tartományokban levó fehérjeszekvenciák alkalmazhatók. Egy jellegzetes vizsgáló minta 16-17-merek keveréke, amely valamennyi lehetséges szekvenciának megfelel egy 6 aminosavból álló fehérjeszekvencia-töredéknél.

Ugyanúgy, mint a hosszú mintáknál, empirikusan határozzuk meg a rövid vizsgáló mintákhoz használt hibridizációs szigorúságot. Ennek oka az, hogy a szokásos hibridizációs körülmények között (6xSSC) a hibridek stabilitása két tényezőtől függ: a hoszszúságtól és a G-C tartalomtól. A kis G-C tartalmú vizsgálóminták esetén szigorú körülmények egyáltalán nem szigorúak a nagy G-C tartalmú vizsgáló mintákra vonatkozólag. 16-17-merek szokásos keverékében a G-C-tartalom 41-65%, és ezek a vizsgálóminták 6xSSC-ben 10 °C nagyságú hőmérséklet-tartományon belül (48-58 °C között, olvadnak meg. Mivel a 16-os keveréken belül nem ismerjük előre a helyes szekvenciát, közvetlenül 48 °C alatti hibridizációs szigorúságot használunk, hogy a legkisebb G-C tartalmú szekvencia is hibridizálódjék. Amikor azonban nagy számú klón szűrővizsgálatát végezzük el, ez a megoldás sok hamis pozitív eredményt ad rövidebb hosszúság és nagyobb a G-C tartalom esetében. Mivel az olvadási hőmérséklet változása bázispár-illeszkedésenként 1-2 “C, azok a vizsgálóminta-szekvenciák, amelyek 12 vagy 13 szekvenciát tartalmaznak a 17-ból, szintén kötődnek, ha nagy a G-C tartalmuk. Általában az emberi genomban 16-17-merek keverékéből álló vizsgálóminta 1200-szor annyi 13 tagú bázisszekvenciával hibridizál, mint 17 tagú bázisszekvenciával.

Olyan hibridizációs módszert fejlesztettünk ki a rövid vizsgálómintákra, amely egyensúlyba hozza a G-C és A-T bázispárok stabilitását, és jelentős mértékben növeli a

-1937

HU 202275 A rövid minták használhatóságát bonyolult DNS-szekvenciájú könyvtárak átvizsgálásához.

A 24. ábrán négy rövid minta olvadási hőmérsékletét ábrázoljuk szokásos (6xSSC) és 3,0 M TMACl-t alkalmazó mosási körülmények között. 3,0 M TMAC1 esetén a minták olvadása közel lineárisan változik a hosszúsággal, mig 6xSSC közegben az olvadást jelentős mértékben befolyásolja a G-C tartalom. Ezt a következtetést világosan alátámasztja a 13-mer 6xSSC-ben tapasztalt magas olvadási hőmérséklete, mivel ebben az esetben a G-C tartalom 65%.

A 2B. ábrán a 3,0 M TMACl-ben mért olvudási hőmérséklet látható a 11 és ezer közötti bázishosszúság függvényében. Ez az’ ábra lehetővé teszi a hibridizációs körülmények gyors kiválasztását bármilyen kivánt hosszúságú, pontos illeszkedésű vizsgálóminta esetén.

A TMAC1 hibridizációs eljárás igen jól használható minden olyan esetben, amikor ismert hosszúságú, pontos szekvenciailleszkedésre van szükség. Példák erre a módszerre:

1. Humán genomikus könyvtár szűrővizsgálata 16-17-merek keverékével. 3,0 M TMACl-es mosást alkalmazunk 50 °C-on, ami csak 17, 16 és néhány 15 bázisos szekvencia hibridizációját teszi lehetővé. Ilyen módon kizárjuk az alacsonyabb homológiájú, nagy számú, nagy G-C tartalmú vizsgálómintákat.

2. Ha egy rövid vizsgálómintával végzett szűrővizsgálatnál túlságosan sok pozitív eredményt kapunk ahhoz, hogy könnyen meg lehessen a szekvenciát állapítani, a legvalószínűbb jelölteket TMACl-es olvasztási módszerrel találhatjuk meg. A pozitív eredményt adó minták másolatait hibridizáljuk, és mossuk, mindig 2 °C értékkel emelve a hőmérsékletet (17-merek esetén, amelyek 54 °C-on olvadnak, 46, 48, 50, 52, 54 és 56 °C értéket alkalmazunk).

3. Hasonló módon, ha egy hosszú vizsgálómintával végzett szűrővizsgálatnál túlságosan sok pozitív eredményt kapunk, ugyanolyan fehérjeszekvencián alapuló rövid vizsgálóminták keverékét szintetizálhatjuk. Mivel a keveréknek az egyik tagja tökéletes illeszkedést is tartalmazhat, a TMAC1 alkalmazásával végzett olvasztási kísérletekkel finomíthatjuk a legmegfelelőbb pozitív erdményt adó vizsgálóminta kiválasztását.

4. Helyre irányuló mutagenezisnél olyan oligonukleotidot szintetizálunk, amely általában 20 hosszúságú, és 1 vagy több változást tartalmaz a központban. A TMACl-es mosó eljárással könnyen megkülönböztethetjük a szülő és a mutáns származékokat, még akkor is, ha egy 20-mer közepén csak 1 hibás illeszkedési bázis van. Ez annak köszönhető, hogy a kivánt mutáció pontosan illeszkedik a vizsgálómintához. A mosási körülményeket egyszerűen meghatározhatjuk a 2B. ábráról.

5. Egy adott gén kiválasztása igen hasonló gének közül. A fentebb leírthoz igen hasonló olvasztó kísérletet alkalmazunk egy adott génnek 100 nagyon hasonló szekvenciájú gén közül történő kiválasztásához.

3. A VIII. faktor genomikus klón első elkülönítése

VIII. faktorban dúsított készítményeket állítunk eló emberi vér krioprecipitátumból polielektrolit kromatográfiával és immunadszorpcióval a korábban leírtak szerint [Tuddenham és munkatársai, Symposium on Factors VIII/von Willebrand Factor, 1982. október 7-9, 1. oldalj. Ezt az anyagot 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot és 1% ammónium-hidrogén-karbonátot tartalmazó oldattal szemben dializáljuk, liofilizáljuk és felhasználásig -20 °C-on tároljuk.

Mivel a Vili. faktort tartalmazó készítményeket más vérplazmafehérjék szennyezik, további frakcionálásra van szükség ahhoz, hogy tisztítsuk a Vili. faktort és elválasszuk a különféle polipeptidláncokat, amelyek valószínűleg a Vili. faktortól származnak. Ezt a frakcionálást a fehérje kromatográfiájával végezzük el, Toya Soda TSK 4000 SW oszlopokon, nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével, nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében. Ennél a kromatográfiánál a molekulaméret alapján választjuk szét a fehérjéket.

A liofilizált fehérjét felhasználás előtt desztillált vízhez adjuk, majd 1%-os nárium-dodecil-szulfát-tartalmat és 0,1 M nátrium-foszfát-tartalmat állítunk be (pH=7,5). A TSK oszlopot (0,75 x 50 cm; gyártó: Alltech, Deerfield, Illinois) szobahőmérsékleten egyensúlyba hozzuk 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,1 M nátrium-foszfát-oldattal (pH= =7,0). 0,15-0,25 ml térfogatú mintákat fecskendezünk be az oszlopba, és az oszlopot izokratikusan fejlesztjük ki 0,5 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az abszorbanciát 280 nm-nél vizsgáljuk, és 0,2 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Egy jellegzetes elúciós profilt a 15. ábra mutat be. Az alikvot részeket nátrium-dodecil-szulfátos gélelektroforézissel analizáljuk, ahol a gélek poliakrilamid tartalmát 5%-ról 10%-ra növeljük; majd megfestjük ezüsttel [Morrissey Anal. Biochem., 117, 307 (1981)], és így elemezzük. A 25 perc elteltével eluált anyag egy fehérjekettősnek felel meg, 80.000 és 78.000 D értékkel. Az ezeket a fehérjéket tartalmazó frakciókat egyesítjük, amint azt a vonal mutatja a 15. ábrán, három különálló preparatív TSK sarzsból, és az elegyet felhasználásig -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A TSK oszloppal végzett frakcionálással nyert tisztított, 80.000 dalton molekulatömegű fehérje 0,8 nanomól mennyiségét egy éjszakán át dializájuk nitrogénatmoszférában egy olyan oldattal szemben, amely 8 M karbamidot, 0,36 M trisz-hidrokloridot (pH=8,6) és 21

-2039

HU 202275 A

3,3 mM etilén-diamin-tetra-ecetsavat tartalmaz. A diszulfid-kötéseket oly módon redukáljuk, hogy a fenti pufferhez 10 mM ditiotreitolt is adunk. A végső térfogat 1,5 ml. A ciszteineket 15 mikroliter 5M jód-ecetsavval l 5 alkilezzük, amelyet 1 M nátrium-hidroxidban oldunk. A reagáltatást 35 percig végezzük szobahőmérsékleten, sötétben, és az alkiiezési reakciót ügy állítjuk le, hogy ditiotreitol hozzáadásával 100 mM végső ditiotreitol-kon- 10 centrációt állítunk be. A fehérjeoldatot 4 órán át dializáljuk 0,1 M ammónium-hidrogénkarbonát-oldatban oldott 8 M karbamiddal szemben. A dialízishez használt oldatot fokozatos hígítással változtatjuk meg: a karb- 15 amid-koncentrációt 24 óra alatt fokozatosan csökkentjük (8 M, 4 M, 2 Μ, 1 M, végül 0,5 M karbamid-koncentrációt állítunk be).

A redukált, alkilezett, 80.000 dalton molekulatömegű fehérjét triptikus emésztésnek 20 vetjük alá TPCK-val kezelt tripszin (gyártó: Sigma Chem. Co.) alkalmazásával. Ennek során 30 rész VIII. faktor fehérjére 1 rész tripszint veszünk. Az emésztést 12 órán át végezzük 37 °C-on, majd a reakcióelegyet 25 felhasználásig megfagyasztva tartjuk. Az emésztéssel kapott peptideket nagynyomású folyadékkromatográfiával választjuk szét nagy felbontóképességű Synchropak RP-P C-18 oszlopon (0,46 x 25 cm, 10 mikron), szó- 30 bahómérsékleten, Spectra-Physics 8000 kromatográf alkalmazásával. Körülbelül 0,8 ml térfogatú mintákat fecskendezünk be. Az oszlop kifejlesztéséhez 0,1%-os rifluorecetsavban acetonitril-gradienst használunk, 35 amelyben az acetonitril mennyiségét 200 perc alatt 1%-ról 70%-ra növeljük. Az abszorbanciát 210 nm-riél és 280 nm-nél figyeljük (16. ábra). Az egyes csúcsoknak megfelelő frakciókat összegyűjtjük, és 4 °C-on tároljuk, 40 amíg szekvencia-analízisnek nem vetjük alá őket, PTH aminosav-azonositó on-line programmal ellátott, Beekmán forgócsészés szekvenciameghatározó segítségével. A körülbelül 23% acetonitril-koncentrációnál eluálódó, a 16. 45 ábrán nyíllal jelölt csúcs az AWAYFSDVDLEK szekvenciájú peptidnek felel meg. Ezt a szekvenciát használjuk a 8.3 oligonukleotid vizsgálóminta kialakításához, a humán genomikus könyvtár szűrővizsgálata céljára. 50

A fentebb kifejtett megfontolások alapján hosszú és rövid mintákat szintetizálunk.

A második hosszú minta, amelyet használunk, egy 12 aminosavból álló, a Vili. faktor triptikus hasításánál képződő töredék AWAYFSDV- 55 DLEK szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta szintéziséhez kiválasztott DNS szekvencia a következő: 5’-CTTTTCCAGGTCAACGTCGGAGAAATAAGCCCAAGC.

Ezt a vizsgálómintát (elnevezése 8.3) először 60 genomikus folt hibridizálásában teszteljük. A 3A. ábrán jelzett 8.3 mintával hibridizált és különböző szigorúságok mellett mosott közönséges him (IX) és 49.XXXXY (4X) DNS genomikus Southern-foltjai láthatók. Még a legna- 65 22 gyobb szigorúságnál is (lxSSC, 46 °C) csak egyetlen sávot figyelünk meg, amely 3,8 kb nagyságú (EcoRI) és 9,4 kb nagyságú (BamHI). Ennek a sávnak az intenzitása 1:4 körüli aránnyal jellemezhető az IX és 4X mezőben, amint az várható az X-hez kapcsolódó Vili. faktor génnél. Az összehasonlító kísérletek azt mutatják, hogy egy ismert X-hez kapcsolódó gén vizsgáló minta (IX. faktor) a várt 1:4 hibridizációs arányt adja, mig egy autoszom gén (albuniin) 1:1 arányt ad.

E genomikus foltvizsgálatok eredményei alapján felhasználjuk a 8.3 mintát a lambda/4X könyvtár szűrővizsgálatára. 500,000 fágot növesztünk ötven, 150 mm átmérőjű lemezen, és 2-2 párhuzamos nitrocellulóz szűrőt hibridizálunk ^3ZP izotóppal jelzett 8.3 mintával; a mosás szigorúsága lxSSC és 37 °C (3. ábra). Ismételt vizsgálatkor 15 erősen hibridizáló és 15 gyengébben hibridizáló kiónt kapunk. Ezekből az elkülönített tarfoltokból DNS-t állítunk elő, restrikciós endonukleázokkal elhasítjuk és folt-hibridizálásnak vetjük alá 8.3 vizsgálóminta alkalmazásával. Az erősen hibridizáló kiónok közül jó néhány egy 3,8 kb nagyságú hibridizáló EcoRI töredéket szolgáltat. Ugyanezt a méretet a genomikus foltvizsgálatnál is kimutatjuk. Ezen túlmenően, az összes erősen hibridizáló klón egy azonos, 262 bázispárból álló Sau3AI töredéket ad a 8.3 vizsgálómintával történő hibridizációnál. A Sau3AI töredékeket egyszálú M13mp8 fág vektorba [Messíng és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 9, 304 (1981)] klónozzuk, hibridizálóssal átvizsgáljuk, a szekvenciát a didezoxi-eljárással meghatározzuk. A 262 bázispárból álló töredék jelentős mértékben homológ a 8.3 mintával. Az összesített homológia 83%-os, a homológia 14 és 10 bázispárból álló, folyamatos illeszkedésű területeket is érint.

A peptidtöredék első tíz maradéka megegyezik azzal, amelyet a rekombináns kiónok DNS szekvenciájából következtethetünk, és előttük egy lizin kodon helyezkedik el, amint az egy tripszinnel feltárt terméknél várható. Az utolsó két következtetett maradék nem illeszkedik a DNS szekvenciához. Ennél a csatlakozásnál azonban a DNS egy jó konszenzus RNS kapcsolási donor szekvenciát tartalmaz (Breathnach és munkatársai, Ann. Rév. Biochem., 50, 349 (1981); Sharp, Cell, 23, 643 (1981), amelyet rövidesen megállító (STOP) kodonok követnek mindhárom lehetséges keretben. Ez intron jelenlétére mutat, ahol az intron ebben a helyzetben kezdődik. (Ezt a feltevést megerősítik az alábbiakban leirt cDNS kiónok).

Egy nyitott leolvasó keret majdnem 400 bázispár távolságra nyúlik a homológia tartományától 5’-felé. Ebben a tartományban több konszenzus illesztési akceptor szekvenciát azonosítunk. Az erre a tartományra vonatkozó, DNS-e alapján megjósolt fehérjeszekvencia ellenőrzése a VIII. faktor több további triptikus peptidtöredékének fehér jeszekven-2141

HU 202275 A ciájával való illeszkedéseket tár fel. Ez azt mutatja, hogy a humán Vili. faktor egy genomikus kiónjának exonjához jutunk.

4. A genomikus klánok kiterjesztése: lambda könyvtár genomikus séta

Kezdetben 8 független Vili. faktor genomikus kiónt kapunk a lambda/4X könyvtárból. Ezek mintegy 28 kb nagyságú átfedő ] szegmenseket tartalmaznak a humán genomból. A VIII. faktor fehérjéjének feltételezett mérete alapján ügy véljük, hogy a teljes gén 100-200 kb nagyságú részt fog át, az intronok hosszúságától függően. Ezért az átfedő ] kiónok készletét megnöveljük .genomikus séta’ segítségével.

Ennél az eljárásnál az első lépés a restrikciós endonukleáz hasítási helyek feltérképezése a meglévő genomikus kiónoknál (4. j ábra). A kIónokból származó DNS-t egy vagy több restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott termékeket gélelektroforézissel jellemezzük, majd egyes esetekben utána Southern-folt hibridizációt végzünk. Az EcoRl és ₂ BamHI enzimmel végzett emésztéssel nyert DNS töredékeket az egyszerűség kedvéért pUC plazmid vektorokba [Viera és munkatársai, Gene, 19, 259 (1982)] alklönozzuk. A restrikciós enzimekkel végzett felLérképezés, a DNS szekvencia analízis és a 8.3 mintával végzett folthibridizációk meghatározzák a gén orientációját.

Ezután a 28 kb nagyságú tartomány végei közelében lévő, egyetlen példányú töredékeket mint .séta* vizsgálómintákat azonosítjuk. A klónozott DNS emésztésével nyert termékeket folt hibridizációnak vetjük alá ³²P izotóppal jelzett teljes humán DNS segítségével. Ezen módszer szerint csak azok a töredékek hibridizálnak, amelyek szekvenciái több, mint körülbelül 50-szer megismétlődnek a genomban [Wood és munkatársai, J. Bioi. Chem., 256, 1502 (1981); Shen és munkatársai, Cell, 19, 379 (1981)]. A nem hibridizálő séta vizsgálóminta töredékeket újra megvizsgáljuk az ismétlődő szekvenciákra vonatkozólag, a lambda/4X könyvtárból származó 50.000 fághoz történő hibridizá)ással.

Az 5’ irányban 1 kb nagyságú vizsgáló minta töredékekből álló triplettet különítünk el az Ndel és BamHI enzimekkel emésztett lambda 120 DNS-ből (lásd a 4. ábrát). Egy millió lambda/4X bakteriofágot vetünk alá szűrővizsgálatnak ezzel a vizsgálómintával. Kimutatjuk, hogy egy kapott klón, a lambda 222, mintegy 13 kb értékkel nyúlik túl a lambda 120 5’ részén (lásd a 4. ábrát).

A 3' irányban a lambda 114 egy 2,5 kb nagyságú StuI/EcoRI restrikciós töredékét¹ azonosítjuk, mint egyetlen példányban levő .séta vizsgálómintat. A lambda/4X könyvtár, majd azt követően más lambda/emberi genom könyvtárak kimerítő szűrővizsgálatával nem kapunk túlnyúló kiónokat. Korábban már megfigyelték, hogy a genomikus tartományok nincsenek kellőképpen képviselve a lambda könyvtárakban Fritsch és munkatársai, Cell, 19, 959 (1980)]. Úgy döntöttünk, hogy specifikusan dúsítunk genomikus DNS-t a kívánt szekvenciákhoz, és egy korlátozott bakteriofág könyvtárból építjük fel azt.

A humán genomikus DNS-nek a 2,5 kb nagyságú StuI/EcoRI vizsgálómintával történő 0 Southern folt hibridizálása egy 22 kb nagyságú, hibridizálő Bell restrikciós töredéket mutat. A restrikciós feltérképezés azt mutatja, hogy ennek a töredéknek a klónozása és kinyerése a genomikus kiónok nagy 3' ki5 terjesztését eredményezi.

Emberi 49.XXXXY DNS-t emésztünk Bell enzimmel, és egy körülbelül 22 kb nagyságú frakciót gélelektroforézissel tisztítunk. Ezt a DNS-t ligáljuk a lambda 1059 bakteriofág 0 vektor BamHI heyébe, és könyvtárat készítünk. (A korábban alkalmazott Charon 30 vektor nem tud befogadni egy ilyen nagy betétet.) Hat hibridizálő kiónt kapunk az ebből a dúsított könyvtárból átvizsgált 400.000 5 fágból. A kívánt, lambda 482 jelzésű klón 17 kb értékkel nyúlik túl a 3’ végen, összehasonlítva az eredeti átfedő genomikus klónjaínkkal (4. ábra).

5. Genom .séta': kozmid kiónok

Új genom könyvtárat hozunk létre kozmid vektorokkal. A kozmidok [Collins és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5 4242 (1978)], amelyek egy plazmid és egy bakteriofág hibridjei, körülbelül 45 kb nagyságú betétet képesek befogadni. Ez körülbelül háromszoros növekedést jelent a lambda/4X DNS könyvtár átlagos betétméreté3 hez képest.

Egy újabban kialakított kozmidvektor, a pGcos4 a következő kívánatos jellemzőkkel rendelkezik:

1. A pBR322 tetraciklínnel szemben re5 zisztens génjének egy olyan származékát használjuk, amely nem tartalmaz BamHI helyet. Ez lehetővé teszi, hogy a plazmidban máshová elhelyezzünk egy BamHI helyet, és klónozó helyként használjuk azt. A tetracik3 linnel szembeni rezisztenciával valamivel könnyebben tudunk dolgozni, mint a gyakrabban alkalmazott ampicillinnel szembeni rezisztenciával, a tetraciklin nagyobb stabilitása következtében.

j 2. A lambda 403 bázispár nagyságú

HincII töredékével - amely a cos helyet tartalmazza - helyettesítjük a pBR322-nek 641 bázispárból álló Aval/PvuII töredékét. Ilyen módon megnöveljük a plazmid példány számát, ) és eltávolítjuk a pBR322 azon szekvenciáit, amelyek zavarják az eukarióta sejtek transzformálását [Lusky és munkatársai, Natúré, 293, 79 (1981)].

-2243

III; 202275 A

3. A pGcos4 vektorban található egy mutáns dihidrofolát reduktáz gén, amely magába foglal egy SV40 replikációs origót és promotort. Ezáltal bármelyik, ebbe a vektorba klónozott töredék sokféle eukarióta sejt- 5 ben vélik szaporithatóvá. Várakozásaink szerint ez hasznos lehet a természetes promotoraikkal bíró nagy geriomikus DNS töredékek kifejezésében.

4. A klónozó hely kialakításához EcoRI, 10 Pvul, BamHI, Pvul és EcoRI restrikciós helyeket tartalmazó szintetikus 20-mert klónozunk a pBR322-ből származó EcoRI helyre. Az egyedi BamHI helyet a genomíkus DNS 35-45 b nagyságú Sau3Al töredékeinek klónozására 15 használjuk fel. A szegélyező EcoRI helyek a betét EcoRI töredékeinek alklónozásához használhatók fel. A legtöbb esetben a Pvul helyek az egész betét hasításához hasznosíthatók. A Pvul helyek rendkívül ritkák euka- 20 rióta DNS-ekben, és várhatóan minden 134.000 bázispárban csak egyszer fordulnak elő az emberi DNS dinukleotid-gyakoriságai alapján.

Az 5. ábrán bemutatjuk a pGcos4 koz- 25 midvektor felépítésének vázlatát. A 49,XXXXY DNS 35-45 kb nagyságú Sau3Al töredékeit klónozzuk ebbe a vektorba. Mintegy 150.000 rekombinánssal végzünk 2-2 párhuzamos szűrővizsgálatot a lambda 222 2,4 kb nagysá- 30 gú EcoRI/BamHI töredéke (5’-végén) és a lambda 482 1 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredéke (3’-végén) segítségével. Ezek egyetlen példányban lévő vizsgálóminták, amelyek a meglévő genomíkus tartomány végei közeié- 35 ben azonosíthatók.

Négy pozitív eredményt adó kozmid kiónt különítünk el és térképezünk fel. A 4. ábrán szerepel a p541, p542 és p543 kozmid.

A szűrővizsgálatból megállapítjuk, hogy ezek 40 a kozmid kiónok összesen 114 kilobázispár értékre növelik a VIII. faktor genomíkus tartományát. A cDNS kiónokkal ezt követően végzett vizsgálatok számos exont azonosítanak az átfedő genomíkus kiónok meglévő 45 készletéből, jelzik azonban, hogy a genomikus .séta még nem teljes. További lépéseket végzünk mindegyik irányban.

A p542 kozmid egyik 1,1 kb nagyságú BamHI/EcoRI töredékéből 3’ .séta vizsgáló- 50 mintát készítünk. (4. ábra). Ez a vizsgálóminta kimutatja a p613 átfedő kozmid kiónt, amely mintegy 35 kb értékkel nyúlik túl a 3’ végen. Később a teljes VIII. faktor üzenetszekvenciát megkapjuk cDNS klónozással 55 (lásd alább). Amikor a cDNS 3’-terminális részét tartalmazó, 1,9 nagyságú EcoRI cDNS töredéket humán genomikue és kozmid klónozott DNS Southern - foltjaihoz hibridizáljuk, ez egy egyedi 4,9 kb-s EcoRI sávot és 5,7; 60 3,2 és 0,2 kb nagyságú BamHI sávokat azonosít mind a nem-klónozott (genomíkus), mind a p613 DNS-ben. Ebből következik, hogy most elérjük a gén 3' végét, amint azt később DNS szekvencia analízissel igazoljuk. 65 24

A p534 kozmid egyik 0,9 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredékéből egy 5’ .séta' vizsgálómintát készítünk. Ez kimutat egy átfedő kozmid kiónt (p612), amely kissé túlnyúlik az átfedő tartományon. A leginkább 5’ felé levő genomikus kiónokat végül úgy kapjuk, hogy a kozmid/4X és a lambda/4X könyvtárakat szűrővizsgálatnak vetjük alá cDNS eredetű vizsgálómintákkal. Amint az a 4. ábrán látható, a lambda 599, lambda 605 és p624 teljessé teszi a rekombináns kiónok sorozatát, amely átfogja a VIII. faktor génjét. (Ezek a kiónok átfednek és tartalmazzák a humán genom ezen tartományának egész DNS-ét egy 8,4 kb nagyságú hézag kivételével, amely a p624 és a lambda 599 között van, és kizárólag intron DNS-ből áll.) Együttesen, a gén az emberi X kromoszóma 200 kb nagyságú részét öleli át. Ez messze a legnagyobb gén, amelyről eddig beszámoltak. A génnek durván 95%-a intronokból áll, amelyeket megfelelő kezelésnek kell alávetni ahhoz, hogy megfelelő templát mRNS-t kapjunk a VIII. faktor fehérje szintéziséhez.

A lambda és kozmid rekombináns kiónokban lévő VIII. faktor géntartomány elkülönítése nem elegendő a hasznos termék, a VIII. faktor fehérje előállításához. Több megközelítést alkalmazunk .a gén fehérjekódoló (exon) részeinek azonosítására és jellemzésére annak érdekében, hogy végül létrehozzunk egy rekombináns kifejező plazmidot, amely képes az aktív VIII. faktor fehérje átfertözőtt mikroorganizmusokban vagy szövettenyészet sejtekben történő szintézisének irányítására.

Két megközelítési móddal nem jutunk gyakorlatilag használható eredményhez: a genomikus kiónoknak fehérje-szekvenciameghatározáson alapuló új oligonukleotíd vizsgálómintákkal való további szűrővizsgálatával; és genomikus kiónok kiválogatott töredékeinek vizsgálómintaként való alkalmazásával RNS folthibridizálásokhoz. A VIII. faktor fehérje kódoló tartományokat azonban elkülönítjük SV40 .exonkifejezö vektorok alkalmazásával, és végül cDNS klónozással.

6. SV40 exonkifejezö vektorok

Rendkívül valószínűtlen, hogy egy több száz kb nagyságú genomikus tartomány tökéletesen jellemezhető DNS szekvencia analízissel, vagy közvetlenül felhasználható használható mennyiségű VIII. faktor fehérje szintéziséhez. A humán VIII. faktor génjének durván 95%-a tartalmaz intronokat (beavatkozó szekvenciákat), amelyeket el kell távolitanunk mesterségesen vagy eukarióta RNS összeillesztő szerkezettel, mielőtt kifejezni lehetne a fehérjét. Eljárást fejlesztünk ki az intronok eltávolítására genomikus kiónok tökéletlenül jellemzett restrikciós töredékeiből, SV40 kifejező vektorok alkalmazásával. Az eljárás alapelve szerint genomikus DNS töredé-2345

HU 202275 A keket illesztünk egy SV40 promotort tartalmazó plazmid ba, és jelentős mennyiségű rekombináns RNS-t termelünk, amelyet átfertózött majom cos sejtekben dolgozunk fel. A képződő összeillesztett RNS közvetlenül analizálható, vagy felhasználható anyagot nyújt cDNS klónozáshoz. Legalábbis elméletileg ez a módszer használható lehet a Vili. faktor gén teljes összeillesztett változatának az összeállításához.

Az első exon-kifejező konstrukcióinknál meglévő SV40 cDNS vektorokat használtunk, amelyek a hepatitisz felületi antigén génjét fejezik ki [Crowley és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 3, 44 (1983)]. Az ezekbe a vektorokba klónozott genomikus VIII. faktor töredékek azonban nem szolgáltatnak megfigyelhető mennyiségű VIII. faktor RNS-t, amikor analízist végzünk folt hibridizációval. Úgy véljük, hogy a nehézséget az okozhatja, hogy ezeknek az összeállításoknak a folyamán a cDNS vektorok exon-tartoményait hozzákapcsoltuk a VIII. faktor génjének intron részeihez. Ennek elkerülésére, a pESVDA exonkifejezó vektort hozzuk létre a 6. ábrán látható módon. Ez a vektor tartalmazza az SV40 korai promotort, az adenovirus II fő késői első összekapcsoló donorhelyét, intron szekvenciákat, amelyekbe klónozhatok a genomikus Vili. faktor töredékek, utána az adenovirus II Elb összekapcsoló akceptorhelyét, valamint a hepatitisz B felületi antigén 3’ lefordíthatatlan- és poliadenilezési szekvenciáit [Gingeras és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 13475 (1982)].

Legelőször a lambda 114 9.4 kb nagyságú BamHI töredékét és 12,7 kb nagyságú SstI töredékét klónozzuk a pESVDA intron tartományába, (lásd 6. ábrát). Az ezzel a két szerkezettel szintetizált RNS Northern-féle folt analízise cos sejtek átfertőzése után a 7. ábrán látható. A 9,4 kb nagyságú BamHI szerkezet alkalmazásakor körülbelül 1,8 kb nagyságú hibridizáló RNS sávot találunk az A exonra és a hepatitisz 3’ leforditatlan szekvenciára vonatkozó vizsgálóminták segítségével. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az RNS-t az új VIII. faktor exonokra vonatkozólag, egy párhuzamos mezőben a lambda 114 2,0 kbp nagyságú StuI/BamHl töredékét (A exon 3' vége) hibridizáljuk. Ennél a vizsgálómintánál szintén egy 1,8 kb nagyságú RNS sáv mutatkozik, ami arra mutat, hogy további új VIII. faktor exonok vannak jelen ebben a tartományban. E három vizsgálóminta mindegyike szintén hibridizál egy olyan RNS sávhoz, amely egy 12,7 kb nagyságú SstI genomikus töredéket tartalmazó konstrukcióból származik. Ez az RNS sáv mintegy 2,1 kb nagyságú. Ez a megfigyelés arra mutat, hogy az exon szekvenciáknak egy további, 200-300 bázispárból álló részét tartalmazza ez a szerkezet, a 9,4 kb nagyságú BamHI töredéket határoló BamHI helytől 3’ felé.

Az összehasonlító kísérletek azt mutatják, hogy ez a rendszer képes az ismert exontartományok helyes összekapcsolására. Rágcsáló dhfr 3,2 kb nagyságú genomikus HindllI töredékét - amely átfogja a III. és IV. exont - klónozzuk pESVDA-ba. Egy 1 kb nagyságú RNS sávot találunk a rágcsáló dhfr vizsgáló mintával. Ez a várható méret, ha az exonokat helyesen kapcsoljuk össze. A Vili. faktor 9,4 kb nagyságú BamHI genomikus töredékével vagy a 3,2 kb nagyságú dhfr genomikus töredékkel létrehozott, ellenkező irányitottságú szerkezetek egyik vizsgálómintával sem adnak megfigyelhető RNS sávot. (7. ábra).

A 12,7 kb nagyságú SstI szerkezetből nyert RNS cDNS másolatát pBR322 plazmidba klónozzuk, és szűrővizsgálatot végzünk. Egy közel teljes hosszúságú (1700 bázispár) cDNS kiónt (S36) találunk. A 8. ábrán mutatjuk be a 950 bázispárból álló SstI töredék szekvenciáját; ez a töredék az egész VIII. faktor betétet és a pESVDA vektor egy részét tartalmazza valamelyik oldalon. A szekvencia a várt módon, az adenovirus összekapcsoló donor és akceptor szekvenciákkal kezdődik és fejeződik be. Közöttük helyezkedik el a VIII. faktor 888 bázispárból álló szekvenciája, amely az A. exont is tartalmazza. Az A. exont megelőző 154 bázispár és az azt követő 568 bázispár a Vili. faktor több 80K triptikus töredékét tartalmazza, bizonyítva, hogy ezek újonnan azonosított exonok.

Az ezeknek az exonoknak megfelelő genomikus tartomány szekvenciái azt mutatják, hogy az A. exontól 5’ felé lévő 154 bázispár a C. exonban található meg, és az A. exonból 3' felé levő tartomány pedig 3 exonból, a D., E. és exonból áll, amelyek 229, 193 illetve 156 bázispárt tartalmaznak. A felsorolt exonok mindegyike megfelelő összekapcsolódó donor és akceptor hely segítségével kötődik [Breathnach és munkatársai, Ann. Rév. Biochem., 50, 349 (1981); Sharp, Cell, 23, 643 (1981)].

Amikor az S36 exon-kifejezö cDNS-t összehasonlítjuk a Vili. faktor sejtvonal cDNS kiónokkal, azt tapasztaljuk, hogy az S36 valamennyi összekapcsolt VIII. faktor szekvenciája a VIII. faktor exonjaiból származik. Ide tartoznak a várt módon a C., A., D., E. és I. exonok. Az A. exonból azonban 47 bázispár hiányzik a C. és A. exon összekapcsolódásánál, az F., G. és H. exon pedig teljesen kimarad. Az ilyenfajta eltérő RNS felhasználásból eredő leolvasókeret-eltolódások azt mutatják, hogy ezek nem felelhetnek meg pontosan a VIII. faktor szekvenciájának. A C. és A. exon összekapcsolódásánál az autentikus összekapcsolódás! hely helyett egy konszenzus összekapcsolódási helyet használunk. Az S36 klón eltérő kapcsolódása, összehasonlítva az autentikus VIII. faktor átirattal, annak lehet a következménye, hogy az RNS elsődleges átírásának csak egy része fejeződik ki a cos sejt szerkezetben. Az is lehetséges 25

-2447

HU 202275 A azonban, hogy a sejttípus vagy a fajták változékonysága okozza ezt az eltérést.

7. cDNS klónozása

a. Egy VIII. faktor mRNS-t termelő sejtvonal azonosítása

Annak érdekében, hogy azonosítsunk egy RNS-forrást a VIII. faktor cDNS kiónok 10 elkülönítéséhez, poliadenilezett RNS-t különítünk el számos emberi sejtvonalból és szövetből, és szűrővizsgálatot végzünk Northern-féle folthibridizációval, a lambda 120 A. exon-tartományából nyert, 189 bázispárból 15 álló StuI-HincIII töredék alkalmazásával. A CH-2 humán T-sejt hibridomából nyert poly(A)‘ RNS hibridizáló RNS-nek mutatkozik. A hibridizáló RNS mérete becslésünk szerint 10 kb körül van. Ez olyan méretű mRNS, 20 amelytől várható, hogy egy 300 kD körüli molekulatömegü fehérjét kódoljon. Kontroll DNS pont folt (.dot-blot, hibridizációkkal [Kafatos és munkatársai, Nucleic Acids Rés.,

7, 1541 (1979)] végzett összehasonlítás alap- 25 ján ez az RNS-mennyiség 0,0001-0,001%-a a CH-2 sejtvonalban lévő teljes sejt poli(A)¹ RNS mennyiségnek. Ez az eredmény arra mutat, hogy a VIII. faktor cDNS szekvenciáknak ebből a forrásból történő elkülönítése spéci- 30 fikus szekvenciák további dúsítását igényli, máskülönben rendkívül nagy számú cDNS klón szűrővizsgálatát kell elvégeznünk.

b. Fajlagosan beindított cDNS kiónok 35

A Vili. faktor genomikus kiónok DNS szekvencia-analízise lehetővé teszi 16 bázisos szintetikus oligonukleotidok szintézisét a cDNS első szálának szintézisénél a fajlagos 40 beindításhoz. Általában oligo(dT)-t használunk a cDNS szintézisének beindításához az mRNS poli(A) farkainál. A fajlagos beindításnak két előnye van az oligo(dT) alkalmazásához képest. Először, dúsítja a VIII. faktor 45 cDNS klón populációt. Másodszor, a gén olyan tartományaiban helyezi el a cDNS kiónokat, amelyekre vonatkozólag hibridizáló vizsgálómintákkal rendelkezünk. Ez különösen fontos egy ilyen nagy gén klónozásakor. Tekintettel 59 arra, hogy a cDNS kiónok ritkán hosszabbak 1000-2000 bázispárnál, az oligo(dT) segítségével beindított kiónok rendszerint nem mutathatók ki olyan vizsgálómintával, amely a Vili. faktor génjének legtöbb tartományából 55 készült. Alkalmazott módszerünk abból áll, hogy u kiindulási A. exon tartományból származó DNS töredékeket és szekvenciainforraációt használjuk fel a fajlagosan beindított cDNS kiónok előállításához. Úgy járunk el, gQ hogy egy sor átfedő cDNS kiónt állítunk elő az 5’ irányban a korábban kialakított cDNS kiónok jellemzése alapján. Annak érdekében, hogy a cDNS még inkább a 3’ tartományban legyen 3’ exonokból származó cDNS és genom gg 26 klón töredékeket alkalmazunk az oligo(dT) segítségével aktivált cDNS kiónok kimutatásához. A cDNS klónozó eljárások számos típusát felhasználjuk kísérleteink folyamán; 5 ezekkel a későbbiekben foglalkozunk.

A kiindulási fajlagos cDNS prímért: 5’-CAGGTCAACATCAGAG (1. számú primer, lásd a 9. ábrát) az A. exon szekvencia 16 3’-terminális maradéka reverz kiegészítéseként szintetizáljuk. C-farokkal ellátott cDNS-t 5 pg mennyiségű CH-2 sejt poli(A)’-RNS-bóI szintetizálunk 1. számú primer alkamazásával, és G-farokkal ellátott pBR322-hez forrasztjuk Capon és munkatársai általános módszerével (Natúré, 304, bffJ (1983)]. Mintegy 100.000 Escherichia coli transzformánst szélesztunk át 100 db 150 mm méretű lemezre, és szűrővizsgálatot végzünk [Maniatis és munkatársai fentebb idézett munkája] a lambda 120 genomikus klón A. exon tartományából származó, 189 bázispárból álló Stul/HinclI töredékkel hibridizálva. (4. ábra). Egy szigorúan hibridizáló kiónt (.pl.ll*) kapunk (lásd a 9. ábrát). A pl.11 klón DNS szekvencia analízise azonosságot mutat a Vili. faktor genomikus kiónjaikkal. A pl.ll kiónban lévő 447 bázispár nagyságú cDNS betét tartalmazza a genomikus A. exon első 104 bázispárját (a második szál szintézise nyilvánvalóan nem nyúlt vissza a prirnerekhez), majd folytatódik tovább egy olyan résszel, amelyről később kimutatjuk, hogy az a B. és C. exon. Az A. exontól való elválás 5* pontját egy jellegzetes RNS összekapcsoló akceptor hely határolja [Sharp, Cell, 23, 643 (1981)].

Jóllehet eddig bemutattuk, hogy a Vili. faktor cDNS kiónok előállíthatók a CH-2 sejtvonalból, további finomításokat végzünk az eljáráson. Különféle erőfeszítéseket tettünk, hogy tovább dúsítsuk a CH-2 RNS-t a VIII. faktor .üzenet’-hez. Egy eredményes módszer szerint a fajlagosan beindított egyszálú cDNS szintézist kombináljuk a kapott egyszálú cDNS hibrid kiválasztásával. Az egyszálú cDNS szintézishez az 1. számú prímért használjuk 200 pg poli(A)' CH-2 RNS-sel együtt. Ahelyett, hogy DNS polimerázt használnánk ennek kétszálú DNS-sé történő azonnali átalakításához, az egyszálú DNS-t 2 pg mennyiségű, 189 bázispárból álló, StuI/HincII genomikus DNS töredékhez hibridizáljuk, ahol ez utóbbit előzetesen hozzákapcsoltuk aktivált ABM cellulózpapírhoz (Schleicher és Schuell .Transa-Bind, lásd Maniatis idézett munkáját). Mig általában az RNS-t vetik alá hibrid-kiválasztásnak, mi az eljárást a cDNS szintézis után alkalmazzuk, hogy elkerüljük a ritka, nagy és viszonylag bomlékony VIII. faktor RNS molekulák további kezelését. Elúció után az anyagot kétszálú cDNS-sé alakítjuk, méret szerint osztályozzuk, és a kinyert DNS 0,5 ng mennyiségét C-farokka) látjuk el és pBR322-be klónozzuk a korábban leírtak szerint. Mintegy 12.000 rekombináns kiónt

-2549

HU 202275 A kapunk és vizsgálunk át hibridizálással, a korábbi pl. 11 cDNS kiónból származó, 364 bázispárból álló Sau3A/StuI töredék segítségével. A vizsgálómintának használt töredéket szándékosan úgy választottuk ki, hogy ne fedje át a hibridkiválasztáshoz használt DNS-t. Ilyen módon elkerüljük olyan ál-rekombinánsok azonosítását, amelyek bizonyos Stul/HinclI DNS töredéket tartalmaznak, és változatlanul szabadulnak fel a DBM cellulózról. 29 hibridizáló tenyészetet kapunk. Ez durván 250-szeres dúsítást jelent a kivánt klónokból a korábbi eljáráshoz képest.

A 29 új rekombináns mindegyikét restrikciós feltérképezéssel jellemezzük, és a két leghosszabb termék (p3.12 és p3.48; 9. ábra) szekvenciáját meghatározzuk. Ezek a cDNS kiónok mintegy 1500 bázispár értékkel nyúlnak túl 5’ irányban, mint a pl. 11. A cDNS és genomikus kiónok párhuzamos feltérképezése és szekvencia-analízise egy szokatlanul nagy exon (B. exon, 4. ábra) jelenlétét tárja fel, amely átfogja a p3.12-t és p3.48-at. E megfigyelés alapján kiterjesztjük a lambda 222 genomikus klón DNS szekvencia analízisét a fenti exon nagyságának meghatározására. A B. exontartomány tartalmaz egy nyitott leolvasökeretet, amelynek nagysága 3 kb körüli. A 2. és 3. számú 16-mer aktiválókat szintetizáljuk, hogy illesszük a szekvenciát ebben a nagy exonban, abban a reményben, hogy jelentős mértékben kiterjesztjük a cDNS klónozást.

Ezen a ponton kimutatjuk, hogy egy bakteriofág-alapú cDNS klónozó rendszer alkalmazható, lehetővé téve óriási számú cDNS klón termelését és szűrővizsgálatát, hibrid-kiválasztással történő előzetes dúsítás nélkül. A lambda GT10 [Huynh és munkatársai, Practical Approaches in Biochemistry, IRL Press Ltd., Oxford, England, 1984] lambda fág származék, amelynek a represszor génjében egyetlen EcoRI restrikciós hely található. Hu kétszálú cDNS töredékeket EcoRI helyek szegélyeznek, ezek ligálhatók ebbe az egyetlen helybe. Ha idegen DNS-t illesztünk be ebbe a helybe, a fág represszor negatívvá válik, és tiszta tarfolt képződik. A betét nélküli lambda GT10 zavaros tarfoltokat képez, amelyek így megkülönböztethetők a rekombinánsoktól. A fág .csomagolás -bán levő nagy transzformálási hatékonyságon túlmenően a lambda cDNS tarfoltok könnyebben vizsgálhatók át nagyobb sűrűségnél, mint a baktérium-telepek.

Kétszálú cDNS-t készítünk a korábban leírtak szerint, a 3. számú primer felhasználásával. Ez a primer 5’-AACTCTGTTGCTGCAG, amely körülbelül 550 bázispárral helyezkedik el a B. exon feltételezett 5' végétől lefelé. EcoRI .adaptereket' ligálunk a .tompa végű cDNS-hez. Az adapterek egy kiegészítő szintetikus 18-merből és 22-merböl állnak, amelyek szekvenciája 5'-CCTTGACCGTAAGACATG illetve 5’-AATTCATGTCTTACGGTCAAGG. A 18-mer 5' végét foszforilezzük, mig a 22-mer 5’ végén megtartjuk az 5’-OH csoportot, amellyel azt szintetizáltuk. igy, amikor összeforrasztjuk és ligáljuk a cDNS-sel, az adapterek túlnyomó EcoRI helyeket képeznek, amelyek ónligálódásra nem képesek. Ez lehetőséget ad arra, hogy elkerüljük a cDNS EcoRI metilezését, és utána az EcoRI-emésztést, amíg inás ismert eljárásoknál a kapcsolóval történő ligálás után bekövetkezik [Maniatis és munkatársai, Cell, 15, 687 (1963)]. Miután a gélen méretkiválasztás céljából elkülönítettük a cDNS-t és eltávolítottuk a reagálatlan adaptereket, e cDNS ekvimoláris mennyiségét ligáljuk EcoRI enzimmel hasított lambda GTlO-hez, .csomagoljuk, és Escherichia coli c600hfl-t tartalmazó lemezre szélesztjük. 1 ug poli (A)‘ RNS-ból körülbelül 3 millió kiónt szélesztünk át 50 darab 150 mm átmérőjű Petri-csészébe, és hibridizációs átvizsgálást végzünk a B. exon 5’ végéből származó, 300 bázispár nagyságú HinfI töredékkel. 46 párhuzamosan is pozitív eredményt adó mintát azonosítunk és elemzőnk EcoRI emésztéssel. Úgy tűnik, hogy a számos cDNS betét körülbelül 2500 bázispárral túlnyúlik a 3. számú primertől 5’ felé. Ezeket a hosszú kiónokat a DNS szekvencia meghatározásával vizsgáljuk. A lambda 13.2 és a lambda 13.27 5’ végeinek szekvenciája a 10. ábrán látható. Ezek számos olyan vonással bírnak, amely arra mutat, hogy elértük a Vili. faktort kódoló tartomány 5’ végét. A kiindulási 109 bázispár megállító (stop) kodonokat tartalmaz az összes lehetséges leolvasó keretben. Ezután megjelenik egy ATG triplett, s azt egy nyitott leolvasó keret követi a lambda 13.2-beri lévő, 2724 bázispárból álló cDNS betét fennmaradó része számára. Az ATG iniciátort követő szekvencia lefordítása egy 19 aminosavból álló szekvenciát szolgáltat, amely jellemző egy kiválasztott fehérje .vezető vagy .elő -szekvenciára [Perlman és munkatársai, J. Mól. Bioi., 167, 391 (1983)]. Feltűnő jellemzője az, hogy két, töltéssel rendelkező gyök határol egy 10 aminosavakból álló hidrofób magot. E feltételezett vezető szekvencia után egy olyan tartomány helyezkedik el, amely a VIII. faktor trombinos feltárásánál képződő, 210 kD és 95 kD molekulatömegű termékek fehérjeszekvencia-analiziséböl nyert amino-terminális maradékoknak felel meg.

c. OligofdTl-vül beindított. cDNS klánok

A VIII. faktor mRNS több ezer további 3’ bázisa marad vissza, hogy cDNS-sé alakítsuk. Választásunk szerint fordított átírást indítunk be oligo(dT) segítségével, és olyan cDNS kiónokat keresünk, amelyek az mRNS 3' poli(A)* farkait tartalmazzák. A kiónok dúsításánál és a DNS második szála szintézis hatékonysága növelésénél az ismert és megalapozott eljárásokat a cDNS második szál 27

-26HU 202275 A szintézis egy fajlagos printerjének alkalmazásával helyettesítjük. A 4. számú, 16-nter prímért: S'-TATTGCTGCAGTGGAG, szintetizáljuk, hogy üzenetérzékeny szekvenciát képviseljen egy PstI helyen, körülbelül 400 bázispár tá- 5 volságra az A. exon 3’ végétől felfelé (9. ábra).

Az mRNS-t reverz átírásnak vetjük alá oligo (dT) beindítással, hozzáadjuk a 4. számú prímért DNS polimerázzal együtt a máso- 10 dik szál szintéziséhez, majd az EcoRI-hez adaptált cDNS-t a lambda GTlO-be ligáljuk, amint ezt fentebb leírtuk. Három millió tarfoltot vetünk alá szűrővizsgálatnak egy 419 bázispárból álló Pstl/HincII töredék segítse- 15 gével, amely p3.12-n helyezkedik el. Ez a töredék a 4. számú primertól lefelé (.downstream) van. A kinyert négy kiónból DNS-t állítunk eló. Ezeket emésztjük és feltérképezzük restrikciós enzimekkel, és folthibridi- 20 zációt végzünk velük további olyan, lefelé levő genomikus töredékek segítségével, amelyeket éppen korábban azonosítottuk mint exonokat, SV40 exon-kifejező plazmidok alkalmazásával, amiért fentebb leírtuk. A négy 25 rekombináns közül három hibridizál. A leghosszabb, a lambda 10.44, közelítőleg 1800 bázispárból áll. A lambda 10.44 DNS szekvenciája azt mutatja, hogy a második szál szintézise valóban a 4. számú prímeméi 30 kezdődik. Ez az összes exon-szekvenciát tartalmazza, amely az S36 SV40 exon kifejező kiónban megtalálható, és még továbbiakat is magában foglal. A lambda 10.44 nyitott leolvasó kerete azonban a cDNS 35 végéig folytatódik. Sem lefordíthatatlan 3* tartományt, sem poli(A) farkat nem találtunk. Feltehetően a második szál szintézise nem fejeződik be teljességig.

Annak érdekében, hogy megtaláljuk a 40 teljes 3’ végződést tartalmazó kiónokat, ismételt szűrővizsgálatnak vetjük alá ugyanezeket a szűröket a lambda 10.44-ből származó jelzett DNS-sel. 24 további kiónt nyerünk ki és térképezünk fel. A két leghosszabb 45 klón (lambda 10.3 és lambda 10.9.2) szekvenciáját meghatározzuk. Ezek lényegében azonos szekvenciákat tartalmaznak, amelyek átfedi a lambda 10.44 kiónt, és körülbelül 1900 bázispárra] többet tartalmaznak a 3’ felé. 51 50 bázispárral lambda 10.44 terminális végén túl a DNS szekvencia egy TGA lefordítás-megállitó kodont mutat, amely után egy 1805 bázispárból álló, látszólag leforditatlan 3’ tartomány következik. Ezt a tartományt a követ- 55 kezők jellemzik: mind a három leolvasókeretben elosztott megállító kodonok és egy poli(A) jel szekvencia, AATAAA [Proudfoot és munkatársai, Natúré, 252, 359 (1976)], majd 15 bázis következik lefelé egy poli(A) kinyú- θο lássál a cDNS végénél (a lambda 10.3 klón 8 A-t tartalmaz, amelyet az EcoRI adapter követ ezen a ponton, míg a lambda 10.9.2 klón több, mint 100 A-t tartalmaz a 3’ végénél).

G5 (J. A teljes cbNS szekvencia

Az egymástól átfedő kiónok teljes szekvenciáját a 10. ábrán mutatjuk be. Ez egy folytonos nyitott leolvasókeretból áll, amely 2351 aminosavat kódol. 19 aminosavból álló terminális jelpeptidet tételezve fel, az .érett'fehérje 2332 aminosavat tartalmaz. Ennek a fehérjének a számított molekulatömege körülbelül 267.000 dalton. Figyelembe véve a lehetséges glikozileződést, ez megközelíti a természetes fehérje molekulatömegét, amint azt nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamidgél elektroforézissel meghatározzuk.

A .teljes cDNS hosszúsága, amely körülbelül 9000 bázispár a 3’ poli(A) hosszúságától függően, megegyezik az mRNS Northern-féle folthibridizációval meghatározott hosszúságával. Az amino végcsoportot kódoló 5’ tartomány lényegében megfelel a Vili. faktor 210 kD molekulatőmegű származéka peptidszekvenciájának, s a karboxil végcsoportot kódoló 3’ tartomány gyakorlatilag megfelel a 80 kD molekulatőmegű fehérje peptid szekvenciájának.

8. A rekombináns Vili. faktor kifejezése

a. .4 teljes hosszúságú klón összeállítása

Annak érdekében, hogy kifejezzük a rekombináns Vili. faktort, a teljes 7 kb nagyságú fehérjekódoló tartományt összeállítjuk több különálló cDNS- és genomikus kiónból. Az alábbiakban és a 11. ábrán ismertetjük három közbülső plazmid szerkezetét. Ezek a gén 5’, középső és 3’ tartományát tartalmazzák. A közbülső plazmidokat egy kifejező plazmidban egyesítjük egy SV 40 korai promotor után. Ez a plazmid viszont kiindulási pontul szolgál olyan különféle szerkezetek kialakításához, amelyek módosított terminálisszekvenciákat, eltérő promotorokat és kiválasztható jelzőket (markereket, tartalmaznak különféle emlős sejtek transzformálásához.

Az 5’ kódoló tartományt olyan módon állítjuk össze egy pBR322 származékban, hogy egy Clal restrikciós helyet helyezünk el a VIII. faktor jel szekvenciájának ATG start kódonja elé. Mivel más Clal hely nem található a génben, ez alkalmas helyet képez a kifejező plazmid finomításához.

Az alkalmas Clal és SacI helyeket tartalmazó PT24-10 plazmidot [Capon és munkatársai, Natúré, 301, 33 (1983)] Hindlll enzimmel hasítjuk, DNS polimerázzal betöltjük, és SacI enzimmel elhasitjuk. Egy 77 bázispárból álló AluI/SacI töredéket nyerünk ki a VIII. faktor lambda cDNS kiónja 5’ tartományából, és ebbe a vektorba ligáljuk. Ilyen módon a pF8Cla-Sac jelölésű közbülső plazmidot kapjuk. (Az Alul hely a VIII. faktor 5’ lefordi-2753

HU 202275 A tatlan tartományában helyezkedik el, a SacI hely pedig a 10. helyzetű nukleotidnál lévő ATG iniciációs kodonon túl 10 bázispárral található [10. ábra]. Az összes restrikciós hely nukleotid helyzetét a 10. ábrán bemutatott 5 módon számozzuk, az ATG iniciációs kodon A nukleotid jóval kezdve).

A pF8Cla-Sac-ból egy 85 bp-s Clal/SacI töredéket különítünk el, amely 11 bázispárt tartalmaz az adapter szekvenciából (az 5’ 10

ATCGATAAGCT adapterszekvencia teljesen a pBR322 plazmid ból származik), és egy, a lambda 13.2-bői származó 1801 bázispáros SacI/KpnI (1811. nukleotid) töredékkel együtt ligáljuk egy Clal/KpnI vektorhoz, 15 amely a VIII. faktor HindlII töredékét (1019-2277. nukleotid) tartalmazó pBR322 alklónból készült. Ez a pF8Cla-Kpn elnevezésű közbenső termék tartalmazza a VIII. faktor kezdeti 2277 kódoló nukleotidját, előtte 65 5’ lefor- 20 díthatatlan bázispárral ée a 11 bázispáros Clal adapter szekvenciával. A pF8Cla-Kpn közbenső terméket a pBR322 részben KpnI és Sphl enzimmel felnyitjuk, és a kapott terméket vektor-töredékként használjuk egy 466 25 bázispárból álló KpnI/HindlII töredékkel és egy 1654 bázispárból álló HindlII/Sphl (4003. nukleotid) töredékkel történő ligálásban. (A KpnI/HindlII töredék a lambda 13.2 EcoRI alklónjából, a HindlII/Sphl töredék pedig a B- 30 -exont tartalmazó p222.8 alklónból származik), így a pF8Cla-Sph terméket kapjuk, amely a VIII. faktor kódoló szekvenciájának első 3931 bázispárját tartalmazza.

A kódoló tartomány középső részét há- 35 rom pBR322/cDNS klón vagy alklón töredékeinek háromrészes ligálásával nyerjük. A p3.48 kiónt felnyitjuk BamHI (4743. nukleotid) és Sáli alkalmazásával) a pBR322-tet tartományban), hogy vektorként szolgáljon. 40 Ezekbe a helyekbe ligálunk egy 778 bózispóros töredéket (BamHI/Ndel töredék, 5520. nukleotid), amely a p3.12-ből származik, és egy 2106 bázispáros Ndel/Sall töredéket (pBR322-ben), amely a p-lambda-10.44R1.9 al- 45 klónból származik. A megfelelő összekapcsolás a pF8Sca-RI plazmidot eredményezi, amely tetraciklinnel szemben rezisztens.

A VIII. faktor cDNS 3’ végének legtöbb részét közvetlenül egy SV40 kifejező 50 vektorba klónozzuk. A pCVSVEHBV plazmid tartalmaz egy SV40 korai promotort, amelyet egy polilinker és a hepatitisz B felületi antigén gén követ.

A pCVSVEHBV plazmid, amelyet pCVSV- 55 EHBS jelöléssel is illetnek, a p342E kis mértékű variánsa [Crowley és munkatársai, Moll.

Cell. Bioi., 3, 44 (1983)]. Ezt a plazmidot a következőképpen állítjuk elő: Az 540 bázispórból álló HindlII-HindlII töredéket, amely 60 átfogja az SV40 replikációs origót [Liu és munkatársai, DNA, 1, 213 (1982)], a pML plazmádhoz ligáljuk [Lusky és munkatársai, Natúré, 293, 79 (1981)], az EcoRI hely és a

HindlII hely közé. A plazmid EcoRI helyét és 65 az SV40 HindlII helyét tompavégüvé tesszük oly módon, hogy Klenow DNS polimeráz I-t adunk hozzá a 4 dNTP jelenlétében, a HindlII enzimmel végzett emésztés előtt. A kapott pESV plazmidot emésztjük HindlII és BamHI enzimmel, és elkülönítjük a 2900 bázispáros vektortöredéket. Ehhez a töredékhez ligálunk egy 2025 bázispáros HindlII-BglII töredéket, amely a HBV-ből származik, és amelyet úgy módosítunk, hogy az EcoRI helyen egy Polliinkért (több restrikciós helyet magábafoglaló DNS töredéket) tartalmazzon. A HBV töredék átfogja a felületi antigén gént, és a klónozott HBV DNS EcoRI és BglII enzimmel végzett emésztéséből származik [Liu és munkatársai, DNA, 1, 213 (1982)].

A kettösszálú kapcsoló DNS töredéket:

(5’ dAAGCTTATCGATTCTAGAATTC 3’...) emésztjük HindlII és EcoRI enzimmel, majd a HBV töredékhez adjuk, HindlII-BglII töredékké alakítva át az EcoRI-BglII töredéket. Ez elvégezhető ugyan háromrészes ligálással - a kapcsoló, a HBV töredék és a vektor ligálásával, - mégis célszerűbb ha először a HindllI-EcoRl kapcsolót hozzáadjuk a klónozott HBV DNS-hez, majd pedig kihasítjuk a HindlII-BglII töredéket a plazmid fenti enzimekkel végzett együttes emésztésével. Ezért ez utóbbi módszer szerint járunk el.

A képződő pCVSVEHBV plazmid tartalmaz egy bakteriális replikációs origót a pBR322ből származó pML-ből, tartalmazza az amplicinnel szembeni rezisztencia jelzőjét, szintén a pML-böl, tartalmaz egy olyan orientációjú SV40 töredéket, hogy a korai promotor irányítsa a beillesztett HBV töredék átírását, valamint tartalmazza a HBV-től származó felületi antigén gént. A HBV töredék poliadenilezési jelet is biztosit a poliadenilezett mRNS-ek termeléséhez, amelyek általában az emlős sejtek citoplazmá jában képződnek.

A pCVSVEHBV plazmid tartalmaz egy hasznos Clal helyet, közvetlenül 5’ irányban a polilinkerben lévő Xbal helyhez képest. Ezt a plazmidot Xbal és BamHI enzimekkel felnyitjuk (a hepatitisz Ag 3* lefordítatlan tartományban), és a végeket betöltjük DNS polimerázzál. Ez eltávolítja . a hepatitisz felületi antigén kódoló tartományt, megmarad azonban a 3’ poliadenilezési jeltartománya, valamint az SV40 promotor. Ebbe a vektorba ligálunk egy, a lambda 10.3 cDNS kiónból származó 1883 bázispáros EcoRI töredéket (amelynek a végei betöltötték). Ez tartalmazza a VIII. faktor végső 77 kódoló bázispárját, az 1805 bázispáros 3* lefordítatlan tartományt, 8 adenozin maradékot, és a betöltött EcoRI adaptert. A betöltött restrikciós helyek összekapcsolásával ismét létrehozzuk az EcoRI véget az 5’ végződésnél (a betöltött Xbal helyet egyesítjük a betöltött EcoRI hellyel), megszüntetjük azonban a 3’ végződésnél) a betöltött EcoRI helyet egyesítjük a betöltött BamHI hellyel). Ez a plazmid a pCVSVE/10.3 elnevezést kapja.

-2855

HU 202275 A

A VIII. faktor teljes cDNS tartományát háromrészes ligálással alakítjuk ki. A pCVSVE/10.3 plazmidot felnyitjuk Clal és EcoRI enzimekkel majd vektorként használjuk a pF8Cla-Sca-ból származó, 3870 bázispáros Clal/Scal töredék és a pF8Sca-RI-böl származó 3182 bázispáros Scal/EcoRI töredék beillesztéséhez. Az igy nyert kifejező plazmid elnevezése pSVEFVIII.

b. Konstrukció a VIII. faktor kifejezésére szövettenyészet sejtjeiben.

Egy másmilyen vektor, amely a PSVEFVIII plazmidon alapul, és tartalmazza az ade- 15 novirus fő késői promotorát, a háromrészes vezető szekvenciát és egy rövidített VIII. faktor leforditatlan 3’ tartományt, BHK sejtekbe történő stabil átfertőzés után aktiv VIII. faktort termel. 20

A 12. ábra az aktiv VIII. faktort termelő kifejező plazmid, a pAML3P.8cl kialakítását mutatja be. Ehhez először Klenow DNS I polimerázzal eltávolítjuk az SstlI helyet a pFDll-ból [1983. január 19-én benyújtott, 25 459 152 sz. amerikai _ egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés] és a Clal helyet a pEHED22-ból [Simonson és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2495 (1983)]. Ezek a helyek a DHFR gén 3’ illetve 5’ leforditatlan 30 tartományaiban találhatók ezeken a plazmidokon. Ezután háromrészes ligálást végzünk a törölt helyeket tartalmazó töredékekkel és a fenti pCVSVEHBS plazmidból származó hepatitisz B felületi antigén génnel. Ilyen módon a 35 pCVSVEHED22aCS vektort kapjuk, amely csak egyetlen Clal helyet és egyetlen SstI helyet tartalmaz. Az összeállított VIII. faktor gént tartalmazó pSVEFVIII plazmidot (11. ábra) elhasítjuk Clal és Hpal enzimmel. Ezáltal ki- 40 metsszük a teljes kódoló tartományt ée a 3' leforditatlan tartománynak mintegy 380 bázispár nagyságú részét. Ezt beillesztjük a Clal, SstlI deléciös vektorba az egyedüli Clal és Hpal helyekre, helyettesítve a felületi an- 45 . tigén gént. így a pSVE.8clD termeld plazmidot kapjuk.

Az adenovirus fő késői promotorát háromrészes 5’ vezetőjével együtt állítjuk öszsze az adenovirus genom részeinek két al- 50 kiónjából, a pEHD22 DHFR-termelő plazmiddal együtt [459 152 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés]. A két adenovirus alklón - pUCHSX és pMLP2 - kialakulását a módszereknél ismertettük. A pMLP2 55 tartalmazza az Sstl-től HindlII-ig terjedő töredéket adenovirusböl, amelynek koordinátái 15,4-17,1, a pUC13 SstI és HindlII közötti helyére klónozva [Viera és munkatársai, Gene 19, 259 (1982)]. A pUCHSX a HindlII és Xhol 60 közötti töredéket tartalmazza (koordinátái: 17,1-26,5), amely a pUC13 HindlII és Sáli közötti helyére van kiónozva. A hindin helyen összeállítva, ez a két adenovirus töredék tartalmazza az adenovirus fő késői promoto- 65 rát, az első két exon és intron egészét, to30 vábbá a harmadik exon egy részét az 5' leforditatlan tartományban lévő Xhol helyig.

Háromrészes ligálással állítjuk össze a DHFR gén előtti adenovirus promotort a 5 pAML3P.D22 plazmidban. Ezzel egy Clal helyet alakítunk ki röviddel a korábbi Xhol hely után az adenovirus háromrészes 5’ vezető harmadik exonjában, Végül a VIII. faktort kifejező pSVE.8clD plazmid SV40 korai promotorát eltávolítjuk Clal és Sáli enzimekkel, és egy SV40 korai adenovirus tandem promotorral helyettesítjük (lásd a 12. ábrát), így a végső pAML3P.8cl kifejező plazmidot kapjuk.

Ez a plazmid tartalmazza az adenovirus háromrészes vezetőt, amely a harmadik exonban lett a Vili. faktor 5’ leforditatlan tartományához kapcsolva. Utána a Vili. faktor teljes hosszúságú szerkezeti génje következik, jelszekvenciájával együtt. A VIII. faktor gén 3’ leforditatlan tartománya a Hpal helyen kapcsolódik a hepatitisz B felületi antigén gén 3’ leforditatlan részéhez. Ezt a DHFR gén követi, amely rendelkezik egy SV40 korai promotorral ée egy hepatitisz 3’ leforditatlan tartománnyal, amely funkcionális poliadenilezési jelet biztosit.

A VIII. faktort kifejező pAML3P.8cl plazmidot BHK sejtekbe fertőzzük át a neomicinnel szemben rezisztens pSVEneBal6 vektorral (1984. április 20-án lett ATCC CRL 8544 számon deponálva) együtt. Ezeket a sejteket először G418 segítségével, majd utána metotrexáttal szelektáljuk.

A BHK sejtvonal által termelt VIII. faktor RNS-t először úgy azonosítjuk, hogy elvégezzük a poli (A)* citoplazmás RNS Northern-féle analízisét ³²P izotóppal jelzett VIII. faktor DNS vizsgálómintához történő hibridizálással. Ennél az analízisnél 9 kb körüli hosszúságú sávot kapunk. A hibridizálási intenzitások alapján ez a sáv 100-200-szorosra dúsul, a CH-2 sejtvonalban található 9 kb nagyságú sávhoz képest.

9. A rekombináns VIII. faktor azonosítása

a. Radioaktív immunvizsgálat

Radioaktív immunvizsgálatot végzünk a módszerek ismertetésénél leírtak szerint a VIII. faktort termelő BHK sejtvonalból nyert felülúszó folyadékokon és lízált sejteken. Az eredményeket tartalmazó 1. táblázat azt mutatja, hogy a felülúszó folyadékok (amelyek a Vili. faktor aktivitását tartalmazzák) közelítőleg azonos mennyiségben magukban foglalják a VIII. faktor 210 kD molekulatömegű részét (CIO) és 80 kD molekulatömegű részét (C7F7) is. A VIII. faktor a sejtlizátumokb&n is kimutatható. A VIII. faktort ki nem fejező, kontrollként alkalmazott sejtvonalaknál a radioaktív immunvizsgálat során kapott érték kisebb, mint 0,001 egység/ml.

-2957

HU 202275 A

1. táblázat pAML3P.8cl plazmiddal átfertőzött BHK sejtvonal VIII. faktor tartalma a radioaktív immunvizsgálat alapján

CIO C7F7

Sejt felülúszó
1. számú kísérlet	0,14 egység/ml	0,077 egység/ml
2. számú kísérlet	0,022 egység/ml	0,021 egység/ml
Sejt lizátum
1. számú kísérlet	0,42 egység/ml	0,016 egység/ml

A megkötött I¹²⁵ izotóptól származó percenkénti beütés (cpm) értékeket a közönséges vérplazma hígításain alapuló standard görbe segítségével alakítjuk át egység/ml értékké. Valamennyi kapott érték lényegesen meghaladja a háttér értéket. A kimutatási 20 határ 0.005 egység/ml a CIO-nél, és 0,01 egység/ml a C7F7 vizsgálatánál.

b. Kromogén vizsgálat BHK sejtet tartalmazó tápközegeken 25

Amint az a 2. táblázatból látható, az ezekből a sejtekből kialakult tápközegek abszorbanciát mutatnak 405 nm-nél a Coates vizsgálat szerint. Amint fentebb arra kitér- 30 tünk, ez a vizsgálat specifikus a VIII. faktor aktivitásra a X. faktor aktivitásánál. Amikor a VIII. faktorra specifikus monoklonális antitesteket adunk hozzá, csökkent a képződő Xa faktor mennyisége. Ez abból látható, hogy a tápközeg 0,155 értékű abszorbanciája 0,03 értékre csökkent antitesteket is tartalmazó tápkőzeg esetén (a vakpróbára kapott érték kivonása után). A sejtek tehát olyan aktivitást termelnek, amely jelentkezik egy, a VIII. faktor aktivitására specifikus vizsgálatnál, és ezt az aktivitást semlegesítik a VIII. faktorra specifikus antitestek.

Amikor a tápközeget IXa faktor, X. faktor és foszfolipid hozzáadása nélkül reakcióelegyben inkubáljuk, a 405 nm hullámhosszúságon mért abszorbancia nem növekszik a vakpróbának megfelelő értékhez képest. A megfigyelt aktivitás tehát nem egy olyan nem-specifikus proteáz jelenlétének a következménye, amely elhasltja a szubsztrátumot, és az aktivitást emellett semlegesítik a VIII. ' faktorra specifikus antitestek.

2. táblázat

BHK sejtvonal VIII. faktor aktivitása, kromogén vizsgálattal meghatározva¹

Minta

Abszorbancia 405 nm-nél

Abszorbancia 405 nm-nél (a kontroll érték levonása után)

Tápközeg	0,193	0,155
Puffer kontroll2	0,038	(0,0)
Tápközeg + VIII. faktor antitest3	0,064	0,030
Puffer kontroll2 + VIII.
faktor antitest	0,034	(0,0)

¹ A reakciókat a kővetkezőképpen módosítjuk: a IXa faktor (X. faktor) foszfolipid, a kalcium-klorid-oldat és az 1-100 higitású minta 50-50 pl mennyiségét 10 percig inku- 55 báljuk 37 °C-on. 50 pl S2222-t adunk hozzá, percig tartjuk 37 °C-on, és a reakciót 100 pl 50%-os ecetsav hozzáadásával állítjuk le.

² A minta helyett használt pufferoldat 0,2% θθ szarvasmarha szérum albumint tartalmazó 0,05 M trisz-hidroklorid-oldat, pH=7,3.

³ Az antitest 10 pg C8 és 10 pg C7F7 keveréke. A tápközeget 5 percig előinkubáljuk a vizsgálat megkezdése előtt. ®5

c. Tápközegek kromatográfiája monoklonális gyantán

VIII. faktor aktivitással rendelkező tápközegeket tartalmazó szérumot C8 monoklonális antitestet tartalmazó oszlopon kromatografálunk a fentebb leírt módon (a C8 monoklonális antitest 1984. árpilis 20-án lett deponálva ATCC 40115 számon). Az eluált frakciókat 1:100 arányban higitjuk, és meghatározzuk az aktivitást. A hígított csúcs-frakció 50 pl térfogatú mennyiségeihez különféle monoklonális antitesteket adunk, amelyekről ismeretes, hogy semlegesítik a plazma VIII.

-3059 HU 202275 A

GO

1. táblázat

Monoklonális antitesten tisztított VIII. faktor véralvasztó hatása faktor aktivitásét. A 3. táblázatban található eredmények azt mutatják, hogy az oszloptól eluált VIII. faktor aktivitást (amely sokkal töményebb, mint a tápközeg), szintén semlegesítik ezek a Vili. faktor antitestek.

3. táblázat

Monoklonális antitest eluátum csúcsfrakcióinak kromogén vizsgálata

Minta Abszorbancia 405 nm hullámhosszúságon¹

Csúcsfrakció2 Csúcsfrakció + Vili. faktor	0,186
antitest3 Puffer-oldat	0,060
(kontroll) Puffer-oldat (kontroll) + Vili. faktor	0,000
antitest	0,045

¹ A vizsgálatot a kővetkezőképpen vitelezzűk ki: 50 ul mennyiségű hígított mintát 5 percig inkubálunk 50 ul térfogatú IXa faktor (X. faktor) foszfolipid oldattal 37 °C-on. Az elegyet 50 ul kalcium-klorid-oldattal inkubáljuk 10 percig 37 °C-on. Hozzáadunk 50 ul kromogén szubsztrátumot, majd 10 perc elteltével 100 ul 50%-os ecetsav hozzáadásával állítjuk le a reakciót.

² A csúcsfrakciót a vizsgálatokhoz 1:100 arányban hígítjuk, 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 M trisz-oldattal, pH pH=7,2.

³ Az antitest 10 ul szimbiotikus antitest, amelyet a hígított mintához adunk, és 5 percig inkubálunk szobahőmérsékleten.

d. A tisztított VIII. faktor véralvasztó ak tivitása

A sejt tápközegében észlelt aktív anyagot tisztítjuk és töményítjük C8 monoklonális gyantán történő átengedéssel. A csúcsfrakciót az elúciós puffer eltávolítása céljából dializáljuk a következő összetételű oldattal szemben: 0,05 M imidazol, pH=6,9, 0,15 M nátrium-klorid 0,02 M glicin-etilészter, 0,01 M kalcium-klorid és 10% glicerin. Az aktív csúcsfrakció véralvasztó hatását vizsgáljuk VIII. faktorban hiányos plazmában (4. táblázat). 81 másodperc elteltével figyelünk meg fibrinrögöt. A hemofíliás plazma önmagában 104,0 másodperc elteltével képez vérrögöt. Az eluált frakció tehát javítja a hemofíliás plazma csökkent mértékű véralvadását. Közönséges emberi plazmát hígítunk, és hasonló vizsgálatnak vetjük alá. Az ennek a plazmának a felhasználásával felállított standard görbe azt mutatja, hogy az eluált frakció Vili. faktor véralvasztó hatása közelítőleg 0,01 egység/milliliter.

Minta Vérrögképződés ideje, sec.

Rekombináns Vili.
faktor1* Rekombináns Vili. faktor1* +	86,5
C7F7 antitest	101,3
Kontroll Rekombináns Vili.	101,3
faktor1·* Rekombináns Vili. faktor1·1 + 10 lambda szimiotikus	82,4
antitest	110,6
Kontroll2	95,5

¹ A Vili. faktor a C8 monoklonális gyantából eluált csúcsfrakció, amelyet az elűcióhoz használt puffer eltávolítására 1,5 órán át (la) vagy 2 órán át (lb) dializálunk.

² A kontrollként alkalmazott puffer-oldat 0,05 M trisz-oldat lpH=7,3), amely 0,2% szarvasmarha szérum albumint tartalmaz.

e. A tisztított Vili. faktor aktiválása trorubinnal

A VIII. faktor ismert tulajdonsága, hogy a véralvasztó hatását a trombin aktiválja. A monoklonális oszlopról eluált frakciót analízisnek vetjük alá e tulajdonság vizsgálatára. Miután a mintát dializáltuk az elűcióhoz használt puffer eltávolítása érdekében, az eluátum 100 ul mennyiségét 100 ul 0,05 M imidazol-oldattal hígítjuk (pH=7,6), amely 0,15 M nátrium-kloridot, 0,02 M glicin-etil-észtert, 0,01 M kalcium-kloridot és 10% glicerint tartalmaz.

Ennek a hígításnak az a célja, hogy tovább hígítsuk az esetleg még jelenlevő elúciós puffért, amely zavarhatja a trombin aktiváló hatását. A hígítás további célja a reakcióelegy pH-értékének növelése. Az oldathoz

25 ng trombint adunk, és a reagáltatást szobahőmérsékleten folytatjuk. 25 ul térfogatú alikvot részeket veszünk ki a reakcióelegyből különböző időpontokban, 1:3 arányban hígítjuk, és meghatározzuk a véralvasztó ak55 tivitást. A kapott, eredményeket a 17. ábrán mutatjuk be. A Vili. faktor aktivitása növekszik az idő függvényében, majd csökken, amint az várható a VIII. faktor aktivitásnál. A hozzáadott trombínmennyiség hatására nem képződik vérróg a VIII. faktorban hiányos vérplazmában a vizsgálatok során alkalmazott megfigyelési idők alatt. A véralvadási idő megfigyelt, a vizsgálati időtől függő növekedése, majd azt követő csökkenése bizonyítja, hogy az aktivitás valóban annak következmé-3161

HU 202275 A nye, hogy a trombin aktiválja a VIII. faktort. A trombin hatására fellépő, közelítőleg 20-szoros aktiválás jól egyezik a plazmában lévő VIII. faktorra megfigyelt értékkel.

f. A rekombináns VIII. faktor megkötése Sepharose gyantához kapcsolt von Willebrand faktoron

Ismeretes, hogy a VIII. faktor a von Willebrand faktorral (vWF) képzett reverzibilis komplex alakjában kering a vérplazmában [Thelin és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 95, 70 (1961); Griggs és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 70, 2814 (1973); Donáti és munkatársai, Thromb. Rés., 2, 97 (1973); Weiss és munkatársai, Br.J. Haematol., 18, 89 (1970; Weiss és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 212 (1972); Weiss és munkatársai, Science, 182, 1149 (1973); Rick és munkatársai, Blood, 42, 737 (1973); Rick és munkatársai, Thromb. Rés., 7, 909 (1975); Thelin és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 95, 70 (1961); Owen és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 502 (1972);

Cooper és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 70, 2326 (1973).

Ezért a rekombináns VIII. faktor használható formájának szintén rendelkeznie kell azzal a képességgel, hogy ilyen komplexet képezzen. Ezzel megerősíthetjük az előállított Vili. faktor azonosságát. Ezen túlmenően, ez a komplexképzö képesség bizonyítja a rekombináns VIII. faktornak azon képességét, hogy a VIII. faktor természetes, vérben áramló aktív formáját hozza létre és hemofíliás betegek vérébe történő infúzió után a von Willebrand faktorral komplexet képez. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk a rekombináns VIII. faktort, a von Willebrand faktorral történő kölcsönhatásra, a von Willebrand faktort megtisztítjuk és gyantához kötjük a következőképpen:

Humán Vili. faktor koncentrátumokat (amelyeket például a Cutter Laboratories cégtől szerezhetünk be) Sepharose CL4B gyantán kromatografálunk, a humán von Willebrand faktor előállítása érdekében. A gyantát előzetesen egyensúlyba hozzuk 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 M trisz-oldattal, pH=7,3. A von Willebrand faktor az oszlop üres térfogatában eluálódik. Ezt a részt egyesítjük, 40% ammónium-szulfát-koncentráció beállításával kicsapva töményitjük, és ismét kromatografáljuk az oszlopon a fenti puffer-oldat jelenlétében, amely 0,25 M kalcium-kloridot is tartalmaz. Ilyen módon elválasztjuk a VIII. faktornak megfelelő véralvasztó aktivitást a von Willebrand faktortól. Az üres térfogatnak megfelelő frakciókat ismét egyesítjük, ammónium-szulfát hozzáadásával koncentráljuk, és 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal szemben dializáljuk. A kapott készítményt kovalens kötéssel hozzákapcsoljuk cianogén-bromiddal aktivált Sepharose gyantához (amelyet a Pharmacia cégtől szerzünk be), a gyártó által ajánlott módon. Az oszlopot 0,05 M nátrium-kloridot és 0,25 M kalcium-kloridot tartalmazó 0,02 M trisz-oldattal (pll=7,3) mossuk a gyantához nem kötődó fehérjék eltávolítására. A rekombináns Vili. faktort szérumtól mentes közegben állítjuk elő, és szobahőmérsékleten viszszük fel a von Willebrand faktort tartalmazó gyanta 0,1 ml térfogatú oszlopára.

Az oszlopot mossuk a nem kötődő fehérje eltávolítására, majd eluáljuk. Ehhez a következő oldatot használjuk: 0,02 M trisz-oldat, pH=7,3, amely 0,05 M nátrium-kloridot és 0,25 M kalcium-kloridot tartalmaz. 1,0 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk, 1:1 arányban hígítjuk, és elvégezzük a vizsgálatokat. A kapott eredményeket az 5. táblázat tartalmazza. A VIII. faktornak megfelelő aktivitás a közegből az oszlopba abszorbeálódik. Ezt az aktivitást azután eluálhatjuk az oszlopról, nagy sótartalmú oldat alkalmazásával (5. táblázat), amint az a humán VIII. faktornál várható.

A BHK sejtek által termelt VIII. faktor tehát rendelkezik azzal a tulajdonsággal, hogy specifikus módon kölcsönhatásba lép von Willebrand faktornak megfelelő fehérjével.

5. táblázat

Minta Abszorbancia

405 nm hullámhosszúságon¹

Sejt tápközeg	0,143
Mosófolyadék	0,015
Eluált frakciók: 1	0,000
2	0,410
3	0,093
4	0,017
5	0,000
6	0,000

¹ A méréseknél a gyártó által javasolt módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az összes térfogatértéket a felére csökkentjük.

10. A fúziós fehérjék analízise

Ennek a kísérletsorozatnak az a célja, hogy bizonyítsa a klón által kódolt fehérje immunológiai azonosságát a plazmában lévő polipeptidekkel. Ehhez a gén egyes részleteit fúziós fehérjékként fejezzük ki Escherichia coli törzsben. A klónozott gén kódoló szekvenciáinak egésze vagy egy része kifejezhető olyan formában, amely antitestek létrehozásához alkalmas anyagot biztosit. Ezek az antitestek, amelyek specifikusak a klónozott fehérje kivánt tartományaira, alkalmazhatók a fehérjék analízisénél és tisztításánál.

-3263

HU 202275 A

Egy sor Escherichia coli (Vili. faktor .fúziós fehérjét állítunk eló erre a célra. A Vili. faktor kiónjainak töredékeit ligáljuk a pNCV piazmid [Kleid és munkatársai, Science, 214, 1125 (1981)] BglII helyébe oly módon, hogy egyesítsük a VIII. faktort kódoló szekvenciákat, megfelelő leolvasókeretben, a fuzionált Escherichia coli trp LE fehérje első 12 aminosavjával [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Kleid és munkatársai, Science, 214, 1125 (1981); Goeddel és munkatársai, Natúré, 287, 411 (1980)]. Ebből az erős trp promotor rendszerből rendszerint jelentős mennyiségű rekombináns fehérje termék képződik.

Pfusl-et állítunk elő oly módon, hogy elkülönítjük a Vili. faktor 189 bázispárból álló StuI/HincII töredékét (amely az 1799-1860. számú aminosavakat kódolja), majd ligáljuk ezt a pUC13 Smal helyébe [Norrander és munkatársai, Gene, 26, 101 (1983)]. A kapott közbülső plazmidot emésztjük BamHI és EcoRI enzimekkel, a 200 bázispárból álló töredéket pedig beillesztjük pNCV-be [Kleid és munkatársai, Science, 214, 1125 (1981)1, amelyből előzőleg eltávolítottuk az 526 bázispárból álló, BglII és EcoRI közötti töredéket. Ez a pfusl piazmid a trp promotor irányítása mellett egy 10 kD nagyságú fúziós fehérjét termel, amely a trpLE és a kapcsoló által kódolt 16 aminosavból, majd a VIII. faktor 61 maradékából, végül a kapcsoló által kódolt maradékból és trpE karboxi terminális 9 maradékból áll.

A pfus3 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy eltávolítjuk a VIII. faktor egy 290 bázispárból álló Avall töredékét (1000-1096. aminosav), betölt jük a túlnyúló nukleotidokat a DNS polimeráz Klenow töredékének alkalmazásával, és ligáljuk ezt már tompa végű DNS töredéket pNCV-be, amelyet előzetesen elhasitottunk BglII enzimmel, és hasonló módon betöltöttünk. Ez a piazmid - a betöltött töredékkel a megfelelő orientációban, amint azt restrikciós enzimes emésztéssel és DNS-szekvencia analízissel meghatározzuk - irányítja egy közelítőleg 40 kD molekulatömegü fúziós fehérje szintézisét. Ez a fehérje a Vili. faktor 97 aminosavját tartalmazza, beágyazva a 192 aminosavból álló trpLE fehérjébe.

A pfus4 piazmid előállítására a lambda 222.8 nevű Vili. faktor alklónt hasítunk Báni enzimmel, leemésztjük a túlnyúló részt Sí nukleáz segítségével, majd emésztést végzünk PstI enzimmel, és elkülönítjük a kapott, 525 bázispárból álló, tompa végű PstI töredéket (710-885. aminosav). Ezt ligáljuk pNCV-be, amelyet előzetesen emésztettünk BglII enzimmel, Sí nukleázzal kezeltünk, PstI enzimmel emésztettünk, és a vektor-töredéket elkülönítettük. A pfus4 piazmid irányítja agy 22 kD nagyságú fúziós fehérje szintézisét. Ez a fehérje a VIII. faktor 175 aminosavját tartalmazza a trpLE kezdeti 12 aminosavja után.

A fúziós fehérjéket tisztítás után nyulakba fecskendezzük, hogy antitesteket hozzunk létre a fentebb ismertetett módon. Ezeket az antitesteket Western foltanalizissel vizsgáljuk át a plazma eredetű Vili. faktor megkötésére vonatkozólag.

Egy ilyen Western átvitel eredményét a 13. ábrán mutatjuk be. A fúziós fehérjék mindegyike reakcióba lép a plazmában lévő Vili. faktorral. Az 1. fúziós fehérjét a génnek abból a részéből alakítjuk ki, amely egy 80.000 dalton molekulatömegü polipeptídet kódol. Látható, hogy az 1. fúziós fehérje antiszéruma csak a 80.000 dalton molekulatömegű sávval reagál, és nem lép reakcióba a nagyobb molekulatömegü fehérjékkel. A 3. és 4. fúziós feliérje antiszéruma kereszt-reakcióképességet mutat a 80.000 daltonnál nagyobb molekulatömegü fehérjékkel, nem lép reakcióba viszont a 80.000 dalton molekulatömegü sávval. A C8 monoklonális antitest aktivitást semlegesítő monoklonális antitest, amely a VIII. faktorra irányul, és ismeretes, hogy reakcióba lép a 210.000 dalton molekulatömegü fehérjével. A 14. ábra azt mutatja be, hogy a

4. fúziós fehérje reakcióba lép ezzel a monoklonális antitesttel, jelezve, ezáltal, hogy a C8 monoklonális antitest által felismert aminosavszekvenciát a 4. fúziós polipeptid kódolja. Ez még inkább alátámasztja a 4. fúziós fehérjét tartalmazó fehérje azonosságát a 210.000 dalton molekulatömegü fehérjével.

A fenti vizsgálatok igazolják, hogy a gén kódolja mind u 210.000 dalton molekulatömegű, mind a 30.000 dalton molekulatömegü fehérjék aminosav-szekvenciáját.

11. Gyógyászati készítmények

A jelen találmány szerinti vegyületeket önmagukban ismert módszerekkel gyógyászati készítményekké alakíthatjuk. Ennek során a találmány szerinti humán VIII. faktort egy vagy több gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal keverjük össze. Az alkalmas vivőanyagokat és gyógyászati készítmények kikészítését más humán fehérjéknél, például a humán szérum albuminnál a következő kézikönyv ismerteti: Remington’s Pharmaceutical Sciences, szerkesztő Martin E.W.

A gyógyászati készítmények hatékony mennyiségű találmány szerinti fehérjét tartalmaznak, alkalmas mennyiségű, a gyógyszerkészitésnél szokásosan használt vivőanyaggal együtt. A találmány szerinti humán VIII. faktort beadhatjuk például parentálisan olyan betegeknek, akik például A. haeniofillában szenvednek.

A vérzékenységben szenvedő betegek kezelésénél alkalmazott átlagos dózis függ a vérzés súlyosságától. Az intravénásán beadott átlagos dózis a következő: 40 egység/kg operáció előtti esetekben; 15-20 egység/kg kisebb vérzéseknél; és 20-40 egység/kg 8 órán át beadva fenntartó dózisként.

Claims (12)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás humán VIII. faktort, vagy annak legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származékát kódoló nukleinsav-szekvencia előállítására természetes forrásból, azzal jellemezve, hogy

   1., valamely VIII. faktor mRNS forrást azonosítunk;
2. 2., az mRNS-ből cDNS könyvtárat készítünk;
3. 3., a könyvtárat átvizsgáljuk VIII. faktor részeit kódoló kiónokra;
4. 4., humán lambda és kozmid könyvtárakat létesítünk és vizsgálunk át Vili. faktor részeit kódoló kiónokra;
5. 5., a VIII. faktort kódoló nukleinsavak 5’ és 3’ végeinek azonosítására vizsgálómintákat alkalmazunk;
6. 6., pozitív kiónokat izolálunk és térképezünk fel; és
7. 7., pozitív átfedő és szomszédos genomikus és cDNS kiónokból fragmentumokat ligólunk össze, így állítva össze a teljes humán VIII. faktor fehérjét vagy származékot kódoló nukleinsav-szekvenciát.

   2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kozmid könyvtár létesítéséhez pGcos4 kozmidot alkalmazunk.

   3. Eljárás humán VIII. faktort vagy ennek legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származékát kódoló kifejező vektor előállítására azzal jellemezve, hogy

   1., szabályozó elemeket és más kifejező vektor elemeket tartalmazó egy vagy több vektort restrikciós enzimekkel elhasitunk, izoláljuk a szabályozó- és más vektro-elemeket tartalmazó nukleinsav fragmentumo(ka)t; és

   2., a lineáris nukleinsav vektor fragmentumo(ka)t ligáljuk olyan, a humán VIII. faktort vagy származékát kódoló nukleinsawal, amely végein megfelelően illeszkedő restrikciós helyekkel bir.

   4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy vektor fragmentumkét adenovirus késői fő promotort, háromrészes vezető szekvenciát és DHFR-t kódoló DNS-t tartalmazó fragmentumot alkalmazunk.

   5. A 4. igénypont szerinti eljárás a pAML3P. 8cl kifejező vektor előállítására azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

   6. Eljárás humán VIII. faktort vagy annak legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származékát termelő eukarióta gazdasejt előállítására azzal jellemezve, hogy eukarióta sejteket

   a., valamely 3. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk, vagy

   b., együtt transzformálunk valamely 4. igénypont szerint előállított vektorral és valamely szelektálható markert tartalmazó vektorral, a transzformáláshoz mindkét esetben előnyösen kalcium-foszfátos kicsapást, sejtbe injekciót vagy protoplaszt-fúziót alkalmazva.

   7. A 6. igénypont szerinti b., eljárás azzal jellemezve, hogy szelektálható markéiként neomicin rezisztenciával bíró vektorral transzformálunk.
8. 8., A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy eukarióta sejtként emlős sejteket alkalmazunk.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emlős sejtként újszülött hörcsög vese (BHK) sejtvonalat alkalmazunk.
10. 10. Eljárás szennyező fehérjéktől és vírusoktól mentes humán VIII. faktor vagy annak legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származéka előállítására azzal

    jellemezve, hogy a. 1. valamely eukarióta gazdasejtet valamely 3. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk, előnyösen kalcium-foszfátos kicsapást, sejtbe injektálást vagy protoplaszt-fúziól. alkalmazva; 2. a sejteket tenyésztjük; és 3. a VIII. faktort vagy származékát a tenyészetből kinyerjük; vagy b. 1. ,, valamely eukarióta gazdasejtet együtt transzformálunk valamely 4. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral és egy valamely szelektálható markért tartalmazó vektorral, előnyösen kalcium-foszfátos kícsapást, sejtbe injektálást vagy protoplaszt-fúziót alkalmazva; 2. a szelektálható markert tartalmazó sejteket szelektáljuk; 3. a DHFR-t kódoló DNS-t tartalmazó sejtek DNS-ét sokszorozzuk; 4. a kiválasztott és DNS-ében sokszorozott sejteket tenyésztjük; és 5. a VIII. faktort vagy származékát a tenyészetből kinyerjük. 11. A 10. igénypont szerinti b., eljárás

    azzal jellemezve, hogy szelektálható markerként neomicin rezisztenciával bíró vektorral transzformálunk és a szelekciót a szelektálható markerral úgy végezzük, hogy G418 antibiotikumot adunk a tenyésztő tápközeghez.
11. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy gazdasejtként újszülött hörcsög vese (BHK) sejtvonalat alkalmazunk.
12. 13. Eljárás szennyező fehérjéktől és vírusoktól mentes humán VIII. faktor hatású gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy valamely 10. igénypont sze35

    -3467

    HU 202275 A rint előállított humán Vili. faktort vagy ennek legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származékát valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverjük. 5

    Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető

    R 4981 - KJK

    91.3911.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató