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JP2694280B2 - 第▲ｖｉｉｉ▼因子類縁体、その製造法及びそれを含む医薬 - Google Patents

第▲ｖｉｉｉ▼因子類縁体、その製造法及びそれを含む医薬

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JP2694280B2
JP2694280B2 JP63201003A JP20100388A JP2694280B2 JP 2694280 B2 JP2694280 B2 JP 2694280B2 JP 63201003 A JP63201003 A JP 63201003A JP 20100388 A JP20100388 A JP 20100388A JP 2694280 B2 JP2694280 B2 JP 2694280B2
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JP
Japan
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factor viii
vector
analog
factor
viii analog
Prior art date
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JP63201003A
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ミューリアン ピエール
パビラニ アンドレア
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トランスジーン ソシエテ アノニム
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9354094&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2694280(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by トランスジーン ソシエテ アノニム filed Critical トランスジーン ソシエテ アノニム
Publication of JPS6479124A publication Critical patent/JPS6479124A/ja
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
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Description

【発明の詳細な説明】 第VIII因子（F VIII）（１−３）のcDNAのクローニン
グにより、この複雑な分子の構造及び機能がより理解さ
れるようになった。
mRNAの最初の翻訳産物は、19個のアミノ酸のシグナル
ペプチドを含む2,351個のアミノ酸の分子である。内部
相同性（internal homology）が、アミノ酸配列におい
て観察され、それによりドメインが明確化される:3つの
ドメインＡ、単一のドメインＢ及び一対のドメインＣが
次の順、即ちA1−A2−Ｂ−A3−C1−C2の順で配置されて
いる（2,4）。
上記単一のドメインＢは、3,100−bpのエクソン（F V
III遺伝子のエクソン14）によりコードされており
（５）、25の可能なグリコシル化サイト（Asn）の19を
含んでおり、分子のこの部分はトロンビンによる活性化
の間に開裂され失われる（2,4,6）。
第VIII因子（factor VIII）の成熟（maturation）の
機構の現在のモデルは、第１図に図式的に示されている
通りである。
このモデルにおいて、最初の活性化は、アミノ酸Arg
1648及びGlu1649間の分子の開裂によるものであり、そ
れは、80−kdの軽鎖前駆体及び200kd超の重鎖前駆体を
与える。
これら２つの鎖は、開裂が生じる前は、おそらく金属
イオン（Ca++か？）により結合されているものと思われ
る。
ドメインＢは、次いで、数回の蛋白質分解的開裂によ
り分解され、その後、トロンビンによる活性化が、アミ
ノ酸Agr739及びSer740間並びにArg1689及びSer1690間で
の開裂により完了し、これにより、90−kdの重鎖と73−
kdの軽鎖とが生成する。最大限の活性化を得るために更
にArg371とSer372との間を開裂する必要があるか否かに
ついては、尚、論争があるが、一方、この開裂分子を不
安定化させるかもしれない（6,7）。
トロンビンの存在下に長時間インキュベートすると活
性が急速に減少することが一般に認められている。他の
ファクター、例えば、分子を数ヶ所で、特にArg336/Met
337において開裂するファクターXa及び活性化プロテイ
ンＣ等も、第VIII因子を不活性化し得る（７）。
この成熟過程において、ドメインＢは成熟分子の活性
についての役割を果さない。なぜなら、それは、トロン
ビンによる活性化後に失われるからである。加えて、ツ
ール（Toole）ら（８）は、ヒト及びブタの第VIII因子
の遺伝子のヌクレオチド配列を比較し、２つのドメイン
Ｂが高度に分散的（divergent）であるが、重鎖と軽鎖
は高度に保持（conserved）されていることを示した。
このことから、ドレインＢを欠失する分子はその凝血
原（procoagulant）機能が失わないであろうことが示唆
される（8,9,10,11）。
この仮説を確認するために、２つのアプローチが行な
われた。即ち、cDNAにおいて、ドメインＢに対応する大
きなDNAフラグメントを欠失させ、より短い第VIII因子
誘導体を得る（8,9）か、或は重鎖及び軽鎖に対応するD
NAフラグメントを哺乳類細胞中で共発現（coexpressio
n）させる（10,11）ものである。
哺乳類細胞中で重鎖及び軽鎖を共発現させると、F VI
II:Cが検出可能に産生されるが、完全なモジュールを発
原させた場合に比し５倍も低いレベルで産生されるに過
ぎない。このことから、上記２つの鎖の結合は非効率的
であり、従って分子の活性を減少させてしまう（10,1
1）。
これら実験から、ドメインＢのほとんどを欠失する
が、（活性化に必要と思われる）アミノ酸740,1649及び
1690に対応する成熟サイト（maturation sites）を保持
している分子が、正常な凝血促進性活性（procoagulant
activity）を示し、しかも、哺乳類細胞中で10倍も効
率的に発現されることが示された（８）。この分子は、
完全な天然の分子と同様に、トロンビンにより活性化さ
れ得る（９）。
血漿中で循環する第VIII因子は、フォン・ウィルブラ
ンド因子（vWf）と結合し、安定化されるように思われ
る。事実、F VIIIのイン・ビボの半減期は、vWfの不存
在下では非常に強く減少する（16）。
イートン（Eaton）ら（９）は、第VIII因子誘導体を
記載している。この第VIII因子誘導体は、ドメインＢに
おいて欠失を受けており、vWfと効率良く結合し、これ
により、ドメインＢの欠失を受けている分子に対しイン
・ビボの正常な半減期を期待し得るようにしている。
本発明は、アミノ酸771〜1666が欠失されている第VII
I因子類縁体に関し、より詳細には、実質的にアミノ酸
配列Ala1〜AsP770及びThr1667〜Tyr2332を有し、該アミ
ノ酸配列Asp770とThr1667とがペプチド結合してなる第V
III因子類縁体に関するものである。尚、本発明におい
て「実質的に」とは、本発明の第VIII因子類縁体は、凝
血促進性活性又は血液凝固障害改善作用を有する詐欺
り、上記アミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸
が、欠失置換乃至付加されていてもよいことを意味す
る。以下の記載及び実施例において、これを「F VIIIΔ
II」と称することもある。
本発明の第VIII因子類縁体は、好ましくは、適当な培
養倍地上で該類縁体を産生する真核細胞を培養し、得ら
れる第VIII因子を分離することにより製造される。
本発明では、上記細胞は、該細胞中で第VIII因子類縁
体のcDNAの発現を与える、ワクシニアウイルス等の組換
ウイルスベクターで感染されているのが好ましい。該細
胞としては、BHK21細胞が好ましい。
しかし、本発明では、上記細胞を、組込ベクター（in
tegration vector）でトランスフェクトすることもでき
る。該組込ベクターは、第VIII因子類縁体のcDNA、これ
を囲むと共に真核細胞中でのその発現に必要なエレメン
ト及び該ベクターの細胞DNA中への組込みを増進するDNA
セグメントを含有する。
この場合、本発明の第VIII因子類縁体をコードするcD
NAは、好ましくは、選択マーカー（selection marker）
をコードする遺伝子の前に挿入され、バイシストロニッ
ク（bicistronic）転写生成物を与える。
トランスフェクトされた細胞は、好ましくは、CHO細
胞である。
本発明の第VIII因子は、凝血促進性活性を有し、各種
凝血障害の治療、例えば血友病の治療に使用できる。
また、本発明は、活性成分として、本発明の第VIII因
子類縁体を含有する薬理組成物に関するものでもある。
該組成物は、更に、フォン・ウィルブランド因子を含
んでいてもよい。
本発明の医薬製剤は、滅菌注射剤として調整されるの
が好ましい。
以下、添附図面を参照しつつ、実施例を掲げて本発明
をより詳しく説明する。尚、ヌクレオチド及びアミノ酸
の番号は、ウッド（Wood）ら（１）によるものである。
実施例１ ドメインＢに対応する領域において欠失を受けた第VI
II因子のcDNA誘導体を有するプラスミドの構築。
出発プラスミドは、プラスミドpTG1080であり、これ
は、第VIII因子のcDNAを含み、ヌクレオチド−64〜8230
がpUC8のSal Iサイトにクローン化されている（このプ
ラスミドは、フランス特許第86/08,258号に記載されて
いる）。
このプラスミドから、２つの誘導体が調製された。一
方は、ΔＩであり、これは、アミノ酸868〜1562に対応
するドメインＢにおいて欠失をし、他方（ΔII）は、ア
ミノ酸771〜1666の欠失に対応する。
従って、構築物ΔIIは、位置1649における開裂部位を
有しない。
これら２つの構築物を、第２図に図式的に示す。
ａ）プラスミドpTG1080を、酸素Pst Iで消化し、第VIII
因子のcDNAのヌクレオチド−64〜2641に対応する５′末
端を有する2.7−kbのフラグメントを遊離した。
このPst Iフラグメントを、ベクターpTG1−POLY（大
腸菌（E.coli）において活性な複製起源及びβ−ラクタ
マーゼ遺伝子を含み、12の単一制限部位を有するポリリ
ンカーが挿入されているpML2から誘導されたクローニン
グベクター）中にクローン化した。このベクターは、PC
T出願PCT−FR85/00096に記載のベクターcTG14と、ポリ
リンカーがHind IIIリンカーを置き換えている点を除
き、同一である。この構築物において、ポリリンカーの
Bgl IIサイトはF VIII配列のPstIサイト（ヌクレオチド
2641）の隣にある。
次いで、F VIIIコーディング配列（ヌクレオチド4801
〜8230）の３′−位を、このBgl IIサイト中に、やはり
pTG1080から単離されたBamH Iフラグメントの形態で、
導入する。
この２つのF VIIIセグメントを正しいオリエンテーシ
ョンで含む構築物を、pTG1501と称する。この構築物に
含まれる第VIII因子cDNA配列を、FVIIIΔＩと称する。
こうして形成されるPst I/Bgl II/BamH I結合物は、F V
IIIのリーディングフレームを保存する。
ｂ）pTG1501から、Kpn I−Sph Iフラグメント（ヌクレ
オチド1811〜6580に対応）を回収し、これをベクターM1
3TG131（20）中に導入し、ヌクレオチド2367〜5056を、
下記配列 ５′TCATTTCAACTGATATGGTGTCAGTCTT3′ を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、所謂“ルー
プアウト突然変異（loop out mutagenesis）法（17）に
より、欠失させた。
この欠失を受けたベクターをM13TG1510と称する。ま
た、欠失を受けたF VIIIcDNA配列をF VIIIΔIIと称す
る。配列決定分析の結果、配列は正しいことが確認され
た。
実施例２ 組換ワクシニアウイルスによるF VIIIΔＩおよびΔIIの
発現 フランス特許第86/08,258号には、ワクシニアウイル
スの7.5K蛋白質をコードする遺伝のプロモーターの下流
側に第VIII因子のcDNA配列を有するプラスミドpTG1016
が記載されている。この発現ブロックをワクシニアウイ
ルスのTG遺伝子内にインサートする。
プラスミドpT1016の誘導体であるpTG1030（F VIII配
列の未翻訳５′領域におけBgl II−Pst I欠失以外の点
では、前者に同じ）を使用して、ワクシニアウイルスゲ
ノム内への組入れを行なうようにデザインされたベクタ
ー中で、天然の配列に代えてF VIIIΔＩおよびΔIIの欠
失を経た構造の形成を行なった。
pTG1030の天然配列のBamH I−Bgl IIフラグメント
（ヌクレオチド1864から6056に対応する）を切り出し、
pTG1501のBamH I−Bgl IIフラグメント（F VIIIΔＩ）
により置換えてpTG1506を得るか、またはM13TG1510のBa
mH I−Bgl IIフラグメント（F VIIIΔII）により置換え
てpTG1507を得る。
ワクシニア7.5Kの制御下に置かれたF VIIIΔcDNAによ
り中断されたワクシニアのTK遺伝子を備えたDNAブロッ
クは、常法にしたがって（18）、相同組換により、ワク
シニアウイルスゲノム中に組込まれる。
対応する組換ウイルスをVV.TG.F VIII1506（F VIIIΔ
Ｉ）およびVV.TG.F VIII1507（F VIIIΔII）と呼ぶ。
これらの組換ウイルスを1pfu/細胞の割合でHBK21細胞
ローン（細胞数２×106）に感染させた。１時間吸着さ
せた後、倍地を洗浄し、BSA1％およびCaCl21mMを予め加
えた、血清なしの新鮮な媒体に補充した。24時間後およ
び48時間後に媒体サンプルを取り出し、第VIII因子の存
在量を測定した。測定は、免疫放射性定量測定法（F VI
II:Ag）による定量および第VIII因子のプロコアギュラ
ント活性（pro−coagulant activity）について行なっ
た。
F VIIIまたはF VIIIΔ抗原は、リーらの方法にしたが
って（21）、血友病患者の阻害血清の免疫グロブリンＧ
（免疫グロブリンは、試験管の壁に吸着されている）と
軽鎖のエピトープに対して特異的な放射性抗第F VIII因
子モノクローナル抗体との間にサイドイッチすることに
より、定量した。
第VIII因子活性（F VIII:C）の測定は、古典的な手段
に従って（22）、活性化部分トロンボプラスチン時間
（APTT）により、行なった。
結果は、下記の表に示す通りである。
第１表に示す結果から、血失を受けた２種の分子は、
血液凝固テストにおいて、生物学的に活性であること、
および未処理のF VIIIに比して、F VIIIΔ構造でより多
量の蛋白質が得られている（F VIIIΔＩの場合には、２
倍の増大:F VIIIΔIIの場合には、５倍の増大）ことが
明らかである。
さらに、欠失を受けた２種の分子の場合には、24時間
と48時間との間でF VIII:C活性は、低下していないが、
未処理分子の場合には、低下している。後者は、その活
性を維持するために、フォン・ウィルブランド因子によ
り安定化する必要があることが知られている（フランス
特許86/08,258）。
実施例３ 第F VIII因子または第F VIIIΔII因子を発現する細胞系
統の確立 １）プラスミドの構築 第F VIII因子または第F VIIIΔII因子をコードする配
列をマルチコピー形態の哺乳動物細胞のゲノム中での組
込みを促進するようにデザインされたベクターpTG384内
に導入した。このベクターは、フランス特許86/09,043
に記載されている。このベクターの重要な要素（第３図
参照）は： ａ）縦列の数個のコピーの形態からなる外部DNA配列の
組込みを促進するマウスミトコンドリアDNAセグメント
（15） ｂ）SV40のエンハンサー（転写活性を有する）配列（72
bpの繰返し配列）と、アデノウイルス２の主要後期プロ
モーター（MLP、major late promoter）と、XGRPT（キ
サンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラー
ゼ）選択マーカーをコードする遺伝子とを備えた発現カ
セット。このベクターは、選択されたcDNAをXGPRT遺伝
子の５′側にインサートすることを可能とし、以て２シ
ストロン性の（bicistronic）転写産物を得ることを可
能とする。このベクターは、さらに、XGPRT遺伝子の
３′側にSV40の小さなｔ抗原のイントロンとそのポリア
デニル化配列を含む。
ｃ）複製開始点CoLE1は、ベクターE.coliの繁殖を行な
わせるものである。
F VIIIのコード化配列をベクターpTG384の単一Hind I
II部位（XGPRT遺伝子の上流）にインサートした。Hind
IIIによる消化で解放された末端は、DNAポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントにより、平滑とされた。
全F VIII配列をプラスミドpTG1080（実施例１参照）
からSma I−Hpa Iフラグメントの形態で回収した（Sma
I部位は、イニシエーターATGの上流のポリリンカー中に
位置しており、Hpa I部位は、ヌクレオチド7,434に位置
している）。Hind IIIにより開かれ、クレノウにより処
理されたベクターpTG384中でこのフラグメントをライゲ
イトすることにより、プラスミドpTG1020が得られた。
pTG1507の構築と同様の原則にしたがって、欠失を受
けた第F VIII因子遺伝子について同様な構築を行なうた
めに、pTG1020中のBmaH I:−Bgl Iフラグメント（F VII
Iのヌクレオチド1864および6050）をF VIIIΔIIフラグ
メント、すなわちM13TG1510のBamH I−Bgl Iフラグメン
トで置換えた。インサートされたF VIIIΔIIフラグメン
トを有するベクターpTG304をpTG1507と呼ぶ。
２）プラスミドpTG1020およびpTG1509によるCHO細胞の
トランスフェクション 燐酸カルシウム析出法により（19）、直径8.5cmの皿
当たりDNA ５または10μｇの割合で、CHO細胞のローン
をプラスミドpTG1020（F VIII）またはプラスミドpTG15
09（F VIIIΔII）のDNAでトランスフェクトした。トラ
ンスフェクションから48時間後、細胞をトリプシン化
し、希釈し、ヒポキサンチン（15mg/）、チミジン（1
0mg/）、キサンチン（250mg/）、アミノプロテイン
（0.2mg/）、マイコフェノール酸（250mg/）および
透析ウシ胎児血清10％を補給したMEMα2000選択性媒液
に接種した。
２週間後、選択性媒液に対して抵抗性のある細胞のク
ローンを除去し、1mlカップで、次いで2mlカップで培養
した。細胞が70％の融合状態（confluence）に達した時
点で、媒液を除去し、細胞ローンを洗浄し、不活性化し
た血清５％（凝集テストにおける高いバックグラウンド
を避けるため）を含む新鮮な媒液を補給した。
24時間後、培地を分析して、第VIII因子の存在（F VI
II:Ag）および活性（F VIII:C）について分析した。
数種のクローンが得られた。第１の分析において、完
全なF VIIIを発現するクローンの多くは、第VIIIΔII因
子を発現するクローンよりも少量の物質を製造すること
が判明した。
２種のクローンを選択した： 完全なF VIIIを発現するクローンCHO−TG1020−22−1
2およびF VIIIΔIIを発現するクローンCHO−TG1509−18
である。
F VIII発現および活性のレベルを第２表に示す。、 完全なF VIIIの10倍にのぼる第VIIIΔII因子の製造が
観察された。これは、ワクシニアモデルにおいて観察さ
れた結果を裏付けるものである。
実施例４ トロンビンによる種々の天然および組換第VIII因子分子
の活性化 トロンビンによる活性化の動態観察において、異なる
第VIII因子分子を比較した：すなわちプラズマから得た
天然第VIII因子と、CHOクローン中で発現された組換第V
III因子（完全およびΔII）とを比較した。
活性化は、触媒量のトロンビンの存在下にインキュベ
ートした後、古典的な凝集テストに従って、測定され
た。
第４図は、組換F VIIIおよびプラズマF VIIIが、同様
にして（係数20で）且つ非常に似た動態で活性化される
ことを示している。F VIIIΔIIは、より強く活性化され
ている（トロンビンとともに５分間インキュベートした
後、係数80で）。
F VIIIΔIIは、より強く活性化されているが、他の２
種の分子に比してより急速に活性化されている訳ではな
い（この点で、F VIIIΔ構築に関して他の者（９）によ
り観察されているところとは対照的である）。従って、
第VIIIΔII因子は、予備活性化されていないことが明ら
かであり、このことは、その治療目的での用途にとって
重要である。
F VIIIΔIIが活性化されていないという事実は、ワク
シニアモデルおよびCHO系統の両方におけるF VIII:Agレ
ベルとF VIII:Cレベルとの間の良好な相関により裏付け
られている。
本発明を表わす菌株の寄託 下記の菌株は、パリ、リュ デュ ドクトゥール ル
ー25のコレクシオン ナシオナル ドクルチュール デ
ミクロオルガニスムスに1987年７月24日に寄託され
た： E.coli BJM83/pTG1020、寄託番号Ｉ−679 E.coli 5K/pTG1507、寄託番号Ｉ−680 E.coli BJ1509/pTG1509、寄託番号Ｉ−681 参考資料 １）ウッドら、ネイチャー 312,330（1984） ２）トゥールら、ネイチャー 312,342（1984） ３）トルーエットら、DNA 4,333（1985） ４）ヴェハールら、ネイチャー 312,337（1984） ５）ギッチェーら、ネイチャー 312,326（1984） ６）フルチャーら、ブラッド 61,807（1983） ７）イートンら、バイオケミストリー 25,505（1986） ８）トゥールら、プロシーディンクグス オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ
ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ 83,5939（1
986） ９）イートンら、バイオケミストリー 25,8343（198
6） 10）バークら、バイオロジカル ケミストリー 261 1
2574（1986） 11）パヴィラニら、印刷中 12）パヴィラニら、バイオテクノロジー （1987） 13）マリゲンら、プロシーディンクグス オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ
ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ 78,2072−2
076（1981） 14）デ ラ サルら、フランス特許第86.09043号 15）ルトファラら、ソマティック セル アンド モレ
キュラー バイオロジー 11,233−238 16）ブリンクハウスら、プロシーディンクグス オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ
ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ 82,8
752−8756（1985） 17）ツォラーら、メソッズ イン エンザイモロジー
100B 408−500（1983） 18）キーニーら、ネイチャー 312,163−166（1984） 19）グラハムら、エイ．ジェイ．ヴィロロジー 52,456
−467（1983） 20）キーニーら、ジーン 26,91−99（1983） 21）リーら、トロンボシス リサーチ 30,511−519（1
983） 22）ギルマら、ブリティッシュ ジャーナル オブ ヘ
マトロジー 47,269−282（1981）
【図面の簡単な説明】
第１図は、連続的な蛋白質分解的開裂により第VIII因子
分子の成熟のダイアグラムを示す（ツール（Toole）
ら、1984（２）及びイートン（Eaton）ら、1986（７）
より）。 第２図は、第VIII因子分子のダイアグラム及び２つの欠
失ΔＩ（aa868〜1562）及びΔII（aa771〜1666）のダイ
アグラムを示す。 トロンビンによる開裂部位（II a）及び不明のプロテア
ーゼによる開裂部位（位置1649でのX1）は、矢印で示さ
れている。 底部に示す線は、各種構築物において使用される制限部
位を有するcDNAの配列を表わす。 第３図は、CHO細胞の形質転換に使用されるrF VIII発現
ベクターのダイアフラムである。 第４図は、トロンビンによる各種第VIII因子分子の活性
化の動態を示すグラフである。 pd＝プラズマ誘導体 ｒ＝インタクトの組換分子 ΔII＝欠失されたΔII分子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】実質的にアミノ酸配列Ala1〜Asp770及びTh
    r1667〜Tyr2332を有し、該アミノ酸配列中Asp770とThr
    1667とがペプチド結合してなる第VIII因子類縁体。
  2. 【請求項２】請求項１記載の第VIII因子類縁体の製造法
    であって、該類縁体を産生する真核細胞を適当な培養培
    地上で培養し、得られた第VIII因子類縁体を分離するこ
    とを特徴とする製造法。
  3. 【請求項３】真核細胞が、第VIII因子類縁体をコードす
    るcDNAの発現を可能とする組換ウイルスベクターで感染
    されたものである請求項２記載の製造法。
  4. 【請求項４】ウイルスベクターが、ワクシニアウイルス
    である請求項３記載の製造法。
  5. 【請求項５】感染された細胞が、BHK21細胞である請求
    項３又は４記載の製造法。
  6. 【請求項６】真核細胞が、組込ベクター（integration
    vector）でトランスフェクトされており、該組込ベクタ
    ーが、第VIII因子類縁体のcDNA及び該真核細胞中でのそ
    の発現に必要なエレメント及び該ベクターの細胞DNAへ
    の組込を増進するDNAセグメントを含んでいることを特
    徴とする請求項２記載の製造法。
  7. 【請求項７】第VIII因子類縁体をコードするcDNAが、選
    択マーカーをコードする遺伝子の前に挿入されており、
    バイシストロニック転写産物（bicistronic transcript
    ion product）を生成する請求項６記載の製造法。
  8. 【請求項８】真核細胞が、CHO細胞である請求項６又は
    ７記載の製造法。
  9. 【請求項９】請求項１記載の第VIII因子類縁体を有効成
    分として含有する、血液凝固を改善するための薬理組成
    物。
  10. 【請求項１０】更にフォン・ウィルブランド因子（von
    Willebrand factor）を含有する請求項９記載の薬理組
    成物。
  11. 【請求項１１】滅菌注射液の形態の組成物である請求項
    ９又は10記載の薬理組成物。
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