FI86885B - Foerfarande foer framstaellning av human rekombinantfaktor viii och nukleinsyrasekvenser och vektorer anvaend daertill. - Google Patents

Description

1 86885

Menetelmä ihmisen funktionaalisen yhdistelmä-tekijän VIII valmistamiseksi sekä siinä käytettävät nukleiinihappojaksot ja vektorit 5 Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen funktionaalisen yhdistelmä-tekijän VIII ja sen johdannaisten valmistamiseksi sekä valmistuksessa käytettäviä nukleiinihapposek-venssejä ja vektoreita.

Tämä keksintö perustuu osittain ihmisen tekijän 10 VIII samoin kuin tekijä VIII -molekyylin niiden osien, joiden on havaittu olevan biologisesti aktiivisia funktionaalisia osia, DNA-jakson ja päätellyn aminohappojakson selvittämiseen. Tämän selvittämisen teki mahdolliseksi eri muodoissa olevan tekijän VIII tuottaminen yhdistelmä-DNA-15 tekniikkaa käyttämällä, mikä puolestaan teki mahdolliseksi tuottaa riittävä määrä kyllin hyvälaatuisia materiaaleja biologisen testauksen tekemiseksi ja biologisen toimivuuden osoittamiseksi. Kun nämä määritykset on tehty, on mahdollista valmistaa räätälintyönä erilaisia toimivia te-20 kijän VIII muotoja geeniteknologianmenetelmien ja in vit-ro-käsittelyn kautta, jolloin saadaan aikaan tehokkaasti tähän asti saavuttamattomissa olleita kaupallisesti käyttökelpoisia määriä aktiivisia tekijä VIII-tuotteita. Tämä ··· keksintö koskee kaikkia näitä aiheeseen liittyviä suori- . 25 tusmuotoja.

Julkaisut ja muu materiaali, joita käytetään kek sinnön taustan ja erityistapauksissa käytännön toteutuksen lisäyksityiskohtien valaisemiseen, mainitaan tässä viitteinä ja annetaan selitysosan lopussa kirjallisuusluette-30 lon muodossa.

Häiriöttömän verisuonijärjestelmän ylläpito vaatii erilaisten solujen ja proteiinien yhteistoimintaa. Veri-suonikudoksen vaurioituessa käynnistyy sarja reaktioita nestehukan estämiseksi. Ensimmäinen reaktio on verihiuta-35 leiden, jotka kiinnittyvät haavaan ja käyvät läpi sarjan 2 86885 reaktioita, aktivoituminen. Näihin reaktioihin kuuluvat muiden verihiutaleiden tarttuminen mainittuun kohtaan, useiden orgaanisten yhdisteiden ja proteiinien vapautuminen ja trombogeenisen pinnan muodostuminen veren hyytymi-5 seen johtavan tapahtumasarjan aktivoimiseksi. Tämän reak-tiosarjan seurauksena muodostuu verihiutaletulppa, joka sulkee haavan. Verihiutaletulppa stabiloidaan muodostamalla fibriinilankoja tulpan ympärille epätoivottavan neste-hukan estämiseksi. Verihiutaletulppa ja fibriinimatriisi 10 liukenevat sitten hitaasti haavan parantuessa. Yleiskatsaus tähän aiheeseen on viitteessä [1],

Ratkaiseva tekijä verenvuodon tukahduttamisessa on hyytymistapahtumasarjän aktivoiminen alunperin muodostuneen verihiutaletulpan stabiloimiseksi. Tähän järjestel-15 mään kuuluu yli tusina plasmassa esiintyviä sekä vapautuvia ja/tai aktivoituvia solujen proteiineja, jotka ovat vuorovaikutuksessa keskenään [2, 3]. Kuhunkin tapahtumasarjan vaiheeseen liittyy jonkin proteaasin spesifisen inaktiivisen (tsymogeenisen) muodon aktivoituminen kata-20 lyyttisesti aktiiviseksi muodoksi. Kansainvälisellä sopimuksella [4] kutakin tapahtumasarjan proteiinia merkitään roomalaisella numerolla. Kunkin proteiinin tsymogeenistä muotoa merkitään roomalaisella numerolla, kun taas aktiivista muotoa merkitään roomalaisella numerolla, jonka jäl-25 jessä on "a". Tapahtumasarjan kussakin vaiheessa esiintyvä proteaasin aktivoitunut muoto aktivoi tapahtumasarjan seu-raavaan vaiheeseen liittyvän proteaasin. Tällä tavalla pieni alkuärsyke, joka johtaa proteiinin aktivoitumiseen tapahtumasarjan alussa, vahvistuu katalyyttisesti kussakin 30 vaiheessa niin, että lopputuloksena on trombiinipurkaus, jonka seurauksena on trombiinin katalysoima liukoisen fib-rinogeeniproteiinin muuttuminen liukenemattomaksi muodok-seen, fibriiniksi. Fibriinille on ominaista itseaggregoi-tuminen langoiksi tai kuiduiksi, jotka stabiloivat veri-35 hiutaletulppaa niin, ettei se helposti lähde liikkeelle.

3 86885

Kuviossa 1 on yhteenveto veren hyytymiseen liittyvien proteiinien vuorovaikutuksia koskevasta tietämyksestä. Minkä tahansa tapahtumasarjaan osallistuvan proteiinin puute tai vajaus johtaisi fibriinin tuottamiseen joh-5 tavan alkuärsykkeen etenemisen estymiseen. Keskellä kuviossa 1 esitettyä tapahtumasarjaa on vaihe, jossa tekijä IXa initioi tekijän X muuttumisen aktiiviseksi muodoksi, tekijäksi Xa. Nykyisin uskotaan, että tekijä VIII (josta käytetään myös nimitystä tekijä VIIIC) toimii fosfolipidin 10 ja kalsiumionien läsnäollessa kofaktorina tässä vaiheessa; so. sillä ei itsellään ole tunnettua toimintaa ja sitä tarvitaan tekijän IXa aktiivisuuden edistämiseen. Tämä tapahtumasarjan vaihe on ratkaiseva, sillä kahden yleisimmän hemofiliahäiriön on määritetty aiheutuvan joko tekijän 15 VIII (hemofilia A eli klassinen hemofilia) tai tekijän IXa (hemofilia B) alentuneesta toiminnasta. Noin 80 % hemofi-liahäiriöistä johtuu tekijän VIII vajauksesta. Kliiniset oireet ovat samanlaiset kummassakin häiriötyypissä; veri-hiutaletulpan stabilointiin vaadittavan fibriinimuodostuk-20 sen riittämättömyys, joka johtaa helposti irtoavaan tulppaan ja verenvuodon uusiutumiseen ko. kohdassa. Tekijän Vili ja tekijän IX vajauksen suhteellisen suuri yleisyys verrattuna tapahtumasarjan muihin tekijöihin johtuu ensin-mainittujen tekijöiden geneettisestä liittymisestä X-kro-25 mosomiin. Yksi vajavainen tekijän VIII tai tekijän IX koo-daavan geenin alleeli johtaa hemofiliaan miehillä, joilla on vain yksi X-kromosomi. Muut hyytymistekijät ovat auto-someihin liittyneitä ja veren hyytymishäiriön syntymiseen tarvitaan yleensä kahden puutteellisen alleelin esiintymi-30 nen, joka on paljon harvinaisempaa. Siten hemofilia A ja B ovat yleisimmät perinnölliset veren hyytymishäiriöt ja niitä esiintyy miltei yksinomaan miehillä.

Useita vuosikymmeniä sitten hemofiilikkojen keskimääräinen elinikä oli 20 vuotta tai lyhyempi. 1950-luvun 35 alun ja 1960-luvun lopun välisenä ajanjaksona tekijää 4 86 S 85 VIII koskeva tukimus johti hemofilia A:n hoitamiseen aluksi kokoplasmalla ja myöhemmin tekijä VHI-tiivisteillä. Ihmisen tekijän VIII ainoana lähteenä on ollut ihmisen veriplasma. Eräänä korkeaan hintaan vaikuttavana tekijänä 5 ovat kulut, jotka liittyvät suurten plasmamäärien hankkimiseen. Kaupallisten yhtiöiden täytyy perustaa luovutus-keskuksia, maksaa korvauksia luovuttajille, pakastaa plasma heti luovutuksen jälkeen ja kuljettaa se jäädytettynä käsittelylaitokseen. Yli tuhannelta luovuttajalta saadut 10 plasmanäytteet yhdistetään ja käsitellään. Tekijän VIII aktiivisuuden pysymättömyyden takia tiivisteiden valmistukseen käytettäviin muutamaan yksinkertaiseen puhdistus-menettelyyn liittyy suuria häviöitä (aktiivisuudesta saadaan talteen noin 15 %). Saatavat farmaseuttiset tuotteet 15 ovat hyvin epäpuhtaita ja niiden ominaisaktiivisuus on 0,5 - 2 tekijä VIII-yksikköä/mg proteiinia (yksi tekijä VIII-yksikkö on määritelmän mukaan 1 ml:n plasmaa sisältämä aktiivisuus). Tekijä VIII-tiivisteen arvioitu puhtausaste on noin 0,04 paino-% tekijä VIII-proteiinia. Tämä korkea 20 epäpuhtausaste johtaa erilaisiin vakaviin komplikaatioihin, joihin kuuluu proteiinin saostuminen, hepatiitti ja mahdollisesti AIDS:n aiheuttava tekijä. Nämä tekijä VIII-tiivisteiden epäkohdat aiheutuvat plasmasta eristetyn tekijän VIII pysymättömyydestä, sen heikosta puhtausastees-25 ta ja sen eristämisestä useilta luovuttajilta kootusta yhdistetystä plasmaerästä. Tämä tarkoittaa sitä, että jos yhdellä tuhannesta luovuttajasta sattuisi olemaan esimerkiksi hepatiitti, saastuisi koko erä tällä viruksella. Luovuttajat tutkitaan hepatiitti B:n suhteen, mutta tii-30 visteiden tiedetään sisältävän sekä hepatiitti A: ta että hepatiitti non-A non-B:tä. Yritykset tuottaa puhtaampaa tuotetta johtavat liian suuriin aktiivisuushäviöihin ja nostavat siten kustannuksia.

Tekijän VIII puhdistuksen historia valaisee vai-35 keuksia, joita liittyy työskentelyyn tämän proteiinin 5 66885 kanssa. Tämä vaikeus aiheutuu suurelta osin tekijän VIII epästabiilisuudesta ja kokoveren sisältämistä hyvin pienistä määristä tätä tekijää. 1970-luvun alussa karakterisoitiin proteiini, jonka silloin uskottiin olevan tekijä 5 VIII [5, 6, 7]. Tämä proteiini määritettiin aggregaatiksi, joka sisälsi glykoproteiiniosayksikköä, jonka molekyyli-painoksi määritettiin SDS-geelielektroforeesilla noin 240 000 daltöniä. Tämä osayksikkö liittyi heterogeeniseen joukkoon suurempimolekyylisiä yksiköitä, joiden molekyyli-10 paino vaihteli miljoonasta daltonista 20 miljoonaan dalto-niin. Tätä proteiinia esiintyi hemofiilikkojen plasmassa, mutta se puuttui niiden potilaiden plasmasta, jotka sairastivat von Willebrandin tautia, joka on autosomivälitteinen geneettinen häiriö, jolle on ominaista pidentynyt 15 vuotoaika ja pienet tekijän VIII pitoisuudet [8]. Silloin esitettiin teoria, että tämä suurimolekyylinen proteiini, jolle annettiin nimeksi von Willebrand-tekijä (vWF) eli tekijään VIII liittyvä antigeeni (FVIIIRAg), olisi syynä hyytymishäiriöön kummassakin sairaudessa, jolloin proteii-20 ni puuttuisi von Willebrandin taudin yhteydessä ja olisi jollakin tavalla toimimaton klassisissa hemofiliasairauk-sissa [9]. Myöhemmin havaittiin kuitenkin, että tietyissä olosuhteissa, nimittäin suurten suolapitoisuuksien vallitessa, tekijän VIII aktiivisuus voitiin erottaa tästä pro-25 teiinista, jonka uskottiin aiheuttavan tekijän VIII aktiivisuuden [10 - 20]. Näissä olosuhteissa hyytymistekijän VIII aktiivisuus esiintyi molekyylissä, jonka koko oli 100 000 - 300 000 dal töniä. Sen jälkeen on tehty paljon tutkimustyötä tekijän VIII hyytymisaktiivisuuden aikaan-30 saavien yhden tai useamman proteiinin identifioimiseksi ja karakterisoimiseksi. Kokoverestä saatavat vain hyvin pienet proteiinimäärät yhdistyneinä tämän proteiinin pysymät-tömyyteen ovat kuitenkin tehneet nämä tutkimukset tuloksettomiksi .

6 86885

Kirjallisuudessa [21 - 27, 79] kuvataan yrityksiä eristää tekijä VIII-proteiinia/proteiineja luonnollisesta lähteestä, sekä ihmisistä että eläimistä, puhtausasteeltaan vaihtelevina. Edellä mainittujen ongelmien takia on 5 olemassa mahdollisuus väärään identifiointiin ja sitä seu-raavaan kontaminoivan proteiinin kloonaamiseen ja ilmentämiseen tekijä VIII-valmisteessa halutun tekijä VIII-pro-teiinin sijasta. Sitä, että tämä mahdollisuus on todellinen, korostaa edellä mainittu von Willebrand-proteiinin 10 virheellinen identifiointi tekijä VIII-hyytymisproteiinik-si. Sekoittuminen identifioinnissa tekijän VIII kaltaiseen aktiivisuuteen on myös selvästi mahdollista. Joko tekijä Xa tai trombiini aiheuttaa hyytymisajan lyhenemisen erilaisissa plasmoissa, mukaan luettuna plasma, josta puuttuu 15 tekijä VIII, joten tällöin saadaan näkyviin tekijän VIII kaltainen aktiivisuus, ellei tehdä asianmukaisia vertailu-kokeita. Tiettyjen solujen tiedetään myös tuottavan aktiivisia tuotteita, jotka voivat toimia hyvin samalla tavalla, kuin mitä tekijältä VIII odotetaan [28, 29, 30], 20 Viimeisessä viitteessä [30] osoitetaan, että tämä tekijän VIII kaltainen aktiivinen tuote on itse asiassa kudoste-kijäksi kutsuttu proteiini. Samaa tai samankaltaista materiaalia on eristetty myös ihmisen istukasta [31]. Tämä proteiini toimii yhdessä plasmaproteiinitekijän VII kanssa 25 samassa vaiheessa kuin tekijä VIII ja tekijä IXa ja johtaa tekijän X aktivoitumiseen tekijäksi Xa.

Yhdistelmätekijän VIII muodostumisen todistaminen perustuisi siten siihen, että osoitettaisiin se, että syntyy funktionaalinen aktiivisuus, joka selvästi on tekijän 30 VIII aktiivisuus. Vaikka aiempien tutkijoiden olisi ollut määrä osoittaa, että he ovat saaneet aikaan kokonaisen tai osittaisen kloonin, joka koodaa koko yhdistelmäproteiinia tai osaa siitä, olisivat tekniset ongelmat, jotka liittyvät yhdistelmäproteiinin, joka on neljä kertaa niin suuri 35 kuin mikään muu tähän mennessä tuotettu yhdistelmäproteii- 7 86 8 85 ni, tuottamiseen voineet hyvinkin osoittautua voittamattomiksi alaa tavanomaisesti hallitseville.

Edellä kuvatut mahdolliset muuntuneet tuotteet ja ongelmat antavat aiheen tutkia tarkasti kaikkia väitteitä 5 onnistuneesta ihmisen tekijän VIII kloonauksesta ja tuottamisesta. Tämän keksinnön onnistuminen osoitetaan seuraa-vin menetelmin: 1) Kloonaamalla tuotettuja tekijä VIII-proteiineja vastaan syntyneiden vasta-aineiden immunologinen risti- 10 reaktiivisuus plasmaperäisten tekijä VIII-proteiinin kanssa.

2) Ihmisen plasman tekijää Vili vastaan muodostettujen, sen toiminnan estävien monoklonaalisten vasta-aineiden ristireaktio kloonin koodaaman proteiinin kanssa.

15 3) Sen määrittäminen, että keksinnön mukaista te kijä VIII-cDNA:ta vastaava genomi-DNA sijaitsee X-kromoso-missa, missä tekijä VIII-geenin tiedetään sijaitsevan.

4) Funktionaalisen proteiinin tuottaminen, jolla on seuraavat ominaisuudet: 20 a) kyky korjata plasma, josta puuttuu tekijä VIII, b) kyky aktivoida tekijä X tekijäksi Xa tekijän IXa, kalsiumin ja fosfolipidin läsnäollessa, c) kohdissa a) ja b) havaitun aktiivisuuden häviäminen tekijälle VIII spesifisten vasta-aineiden vaikutuk- 25 sesta, d) aktiivisuuden sitoutuminen kolonniin, joka si sältää immobilisoitua tekijälle VIII spesifistä monoklo-naalista vasta-ainetta, e) tekijän VIII aktiivisuuden aktivointi trombii- 30 nin vaikutuksesta, f) aktiivisuuden sitoutuminen immobilisoituun von

Willebrand-tekijään ja sen jälkeen tapahtuva eluoituminen tästä tekijästä.

Siten tämä keksintö perustuu yhdistelmä-DNA-teknii- 35 kan menestykselliseen käyttöön ihmisen funktionaalisen te- 8 6 8 85 8 kijän VIII valmistamiseksi riittävinä määrinä, jotta se voidaan identifioida ja sen toimivuus osoittaa ja aloittaa ja tehdä markkinoille hyväksymiselle välttämättömät eläin-ja kliiniset kokeet. Tuote, ihmisen tekijä VIII on sovel-5 tuva käytettäväksi kaikissa toimivissa muodoissaan profylaktiseen ja terapeuttiseen hoitoon ihmispotilailla, joilla on todettu tekijän VIII koagulantti-aktiivisuuden puute.

Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen yhdistelmä-10 tekijän VIII tai sen johdannaisen valmistamiseksi. Tuote, jota keksinnön mukaisesti tuottavat geneettisesti käsitellyt asianmukaiset isäntäsysteemit, sisältää ihmisen tekijää Vili määrältään ja puhtausasteeltaan terapeuttiseen käyttöön soveltuvana. Lisäksi keksinnön mukaisesti saatu 15 tekijä VIII on vapaa epäpuhtauksista, joihin se tavallisesti liittyy soluympäristössään, silloin kun yhdistelmä-DNA-tekniikkaa ei käytetä.

Tämä keksintö koskee myös eristettyjä DNA-jaksoja samoin kuin DNA-ilmentämisvektoreita, jotka sisältävät ih-20 misen tekijää VIII koodaavia geenijaksoja ilmentyvässä muodossa, ja näitä vektoreita sisältäviä transformoitujen isäntäsolujen viljelmiä, joilla on kyky tuottaa funktionaalista ihmisen tekijää VIII. Lisäksi keksintö koskee menetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia valmistettaessa 25 mainittuja eristettyjä DNA-jaksoja.

Keksinnön mukaisesti saatavat ihmisen tekijän VIII funktionaaliset johdannaiset ovat uusia polypeptidejä, jotka sisältävät yhden tai useamman ihmisen tekijän VIII funktionaalisia osia vastaavan ryhmän. Näissä uusissa po-30 lypeptideissä voi esiintyä luontaisen tekijän VIII biologisesti aktiivinen ja/tai antigeenideterminanttijakso. Tällaiset polypeptidit ovat käyttökelpoisia esimerkiksi hemofiilikkojen hoitoon sinänsä ja erityisesti sellaisten hemofiilikkojen hoitoon, jotka ovat kehittäneet tekijän 35 VIII vaikutuksen kumoavia vasta-aineita. Jälkimmäisessä g 86885 tapauksessa tällaisten potilaiden hoito polypeptideillä, jotka sisältävät yhden tai useamman asianmukaisen antigee-nideterminantin, sitoisi tehokkaasti tällaiset vasta-aineet parantaen sitä kautta hoitotehoa polypeptideillä, 5 jotka sisältävät ihmisen tekijän VIII biologisesti aktiiviset osat.

Tämän keksinnön mukaisesti eristetyille tekijä VIII-DNA-jaksoille, jotka koodaavat ihmisen tekijän VIII yhtä tai useampaa funktionaalista osaa, löytyy käyttöä 10 geenihoidossa, sillä niillä voidaan palauttaa tekijän VIII toiminta potilailla, joilta tämä puuttuu, antamalla tällaista DNA:ta esimerkiksi verta muodostavien kantasolujen kautta.

Toimivassa muodossa olevaa ihmisen tekijää VIII 15 tuotetaan tarkoitukseen erityisen hyvin soveltuvassa isän-täsolusysteemissä. Tämä systeemi koostuu hamsterinpoikasen munuaissoluista [BHK-21 (C-13), ATCC n:o CCL 10], jotka on transfektoitu ilmentämisvektorilla, joka sisältää ihmisen tekijää VIII koodaavan DNA:n mukaan luettuna 3'- ja 5'-20 alueet, joille ei ole tehty luentaa, ja joka liittyy 3'-alueestaan, jolle ei ole tehty luentaa, 3'-terminaattori-DNA-alueeseen, jolle ei ole tehty luentaa, kuten hepatiitti B-viruksen-pinta-antigeeniä koodaavan geenin tällaiseen alueeseen. Tämän geenin ilmentymistä ohjaavat kopiointia 25 ja luentaa säätelevät osat myötävaikuttajinaan adenoviruk-sen myöhempi pääpromoottori yhdessä 5'-päähän liittyneen loppujaksonsa kanssa samoin kuin rakenneosat, jotka ovat peräisin SV40:n replikaation aloituskohdasta mukaan luettuna kopioinnin edistämis ja promoottorijaksot. Ilmentä-30 misvektori voi lisäksi sisältää myös dihydrofolaattireduk-. . taasi(DHFR)-geenin, jota ohjaa SV40:n aiempi promoottori, joka antaa geenille amplifikaatiokyvyn, ja valittavissa olevan markkerigeenin, esimerkiksi neomysiiniresistenssi-geenin (joka voidaan tuoda mukaan tekemällä rinnakkais-35 transfektointi erillisellä vektorilla, joka antaa neomy-siiniresistenssin).

10 8 6 8 8 5

Kuvio 1 on kaavamainen esitys hyy tyrni s tapahtumaketjusta [2],

Kuvio 2 kuvaa DNA:n sulamisen TMACl:ssä ja 6 x SSC:ssä.

5 A: Kutakin pistettä varten kymmenen rinnakkaisnäytettä DNA:ta kiinnitettiin ensin nitroselluloosasuodattimille. Näille suodattimille tehtiin sitten hybridisaatio ilman formamidia 37 °C:ssa menetelmien yhteydessä esitetyllä tavalla. Täpläparit pestiin sitten 6 x SSC:ssä, joka sisälsi 10 0,1 % SDSrää (D), tai 3,0 M TMACl:ssä, joka sisälsi 50- mmol/1 Tris-HCl:ää (pH 8,0), 0,1 % SDS:ää ja 2 mmol/1 EDTA:a (O), lämpötiloissa 38, 40, 42...56 °C. Sulamisläm-pötila on lämpötila, jossa 50 % hybridisaatiointesiteetis-tä on jäljellä.

15 B: Tehtiin kohdassa A kuvattu sulatuskoe sitoen pBR322-DNA-näytteet nitroselluloosasuodattimille. Eri pituiset koetinfragmentit valmistettiin pilkkomalla pBR322 MspI:-llä, leimaamalla fragmentin päät 32p:llä ja eristämällä polyakryyliamidigeelillä. Koetinfragmentit, joiden pituus 20 oli 18 - 75 emästä, hybridisoitiin ilman formamidia 37°-C:ssa, ja 46 - 1374 emäksen pituiset fragmentit 40-%Reessä formamidissa 37 °C:ssa menetelmien yhteydessä kuvatulla tavalla. Suodattimet pestiin 3,0 M tetrametyyliammonium-kloridissa (TMAC1), joka sisälsi 50 mmol/1 Tris-HCl:ää (pH 25 8,0), 0,1 % SDS:ää ja 2 mmol/1 EDTA:a, eri lämpötiloissa 3 °C:n välein sulamislämpötilan määrittämiseksi. (0) = pBR322:n Mspl-koetinfragmenttien sulamislämpötila (Δ) = kohdan A 11 - 17 emäksen pituisten koettimien sulamisläm-pötilat 3,0 M TMAC1:ssä.

30 Kuvio 3 kuvaa tekijä VIII-geenin havaitsemisen koettimen 8.3 avulla.

Kolme vasemmanpuoleista kuvaa: EcoRI- ja BamHI- pilkottujen 46,XY-DNA:n (IX, uros) ja ihmisen 49,XXXXY-DNA:n (4X) Southern-täplät hybridisoitiin 6 x SSC:ssä, 35 joka sisälsi 50 mmol/1 natriumfosfaattia (pH 6,8), 5 x li 86885

Denhardtin liuosta, 0,1 g/1 keitettyä, äänikäsiteltyä lohen sperman DNA:ta ja 20 % formamidia, 42 °C:ssa menetelmien yhteydessä kuvatulla tavalla. Saadut kolme täplää pestiin 1 x SSC: ssä, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää mainitussa 5 lämpötilassa. Kaista 1, EcoRI IX; kaista 2, EcoRl 4X, kaista 3, BamHl 1 X; kaista 4, BamHI 4X. Kaista M, päistä leimatut λ Hindlll- ja 0X174 HaelII-pilkotut markkerifrag-mentit.

Oikeanpuoleinen kuva: YksiA/4X-kirjaston tutkimuk-10 sesta saatu, koettimen 8.3 kanssa hybridisoitu nitrosellu-loosasuodatin. Nuolet osoittavat kahta itsenäisistä tekijä VIII-positiivisista klooneista. Kirjaston tutkimisen yhteydessä tehtiin hybridisaatio ja pesu edellä Southern-täplien yhteydessä kuvatulla tavalla pesulämpötilan olles-15 sa 37 eC.

Kuvio 4 esittää ihmisen tekijä VIII-geenin kartan

Ylimmällä vaakarivillä esitetään tekijä VIII-gee-nissä esiintyvien 26 proteiinia koodaavan alueen (eksonit A - Z) asemat ja suhteelliset pituudet. Kopiointisuunta on 20 vasemmalta oikealle. Toinen vaakarivi osoittaa kartan mittakaavan kiloemäspareina (kb). Tunnistuskohtien sijainnit niille 10 restriktioentsyymille, joita käytettiin tekijä VIII-geenin kartoitukseen annetaan seuraavilla vaakari-veillä. Avoimet laatikot kuvaavat sitä, missä määrin ihmi-25 sen genomi-DNA:ta sisältävät kukin λ-fagikloohi ( X114, λ120, λ222, λ482, λ 599 jaA605) ja kosmidiklooni (p541, p542, p543, p612, p613 ja p624). Alimmalla rivillä esitetään genomitutkimuksissa käytettyjen koettimien, joihin viitataan tekstissä, sijaintikohdat: 1) 0,9 kb:n EcoRI/BamHI-30 fragmentti p543:sta; 2) 2,4 kb:n EcoRI/BamHI-fragmentti A222:sta; 3) 1,0 kb:n Ndel/BamHI-fragmenttitripletti A120:-sta; 4) oligonukleotidikoetin 8.3; 5) 2,5 kb:n StuI/EcoRI-fragmentti A114:sta; 6) 1,1 kb:n EcoRI/BamHI-fragmentti A482:sta; 7) 1,1 kb:n BamHI/EcoRI-fragmentti p542:sta.

35 46,XY- ja 49,XXXXY-genomi-DNA:iden Southern-täpläanalyysi i2 86885 ei osoittanut havaittavissa olevia muutoksia tekijä VIII-geenin rakenteessa.

Kuvio 5 esittää kosmidivektoria pGcos4 403 emäksen pituista Acl857S7:n (Bethesda Research 5 Lab.) lämpökäsiteltyä HincII-fragmenttia, joka sisältää cos-kohdan, kloonattiin pBR322:ssa Aval-PvuII-välillä, jolloin saatiin plasmidi pGcosl. pFR400:n (49n) 1624 emäksen pituinen PvuII-Nael-fragmentti, joka sisälsi SV40-aloituskohdan ja -promoottorin, dihydrofolaattireduktaasi-10 mutanttigeenin ja hepatiitti B-viruksen-pinta-antigeenin terminaatiojaksot, kloonattiin erikseen pBR322:n Ahalll-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi mp33dhfr. Sitten tehtiin kolmiosainen ligaatio ja kloonaus pGcosl:n 1497 emäksen SphI-Ndel-fragmentilla, mp33dhfr:n 3163 emäksen Sphl-Ndel-15 fragmentilla, mp33dhfr:n 3163 emäksen Ndel-RcoRV-fragmentilla ja pKT19:n 376 emäksen EcoRV-SphI-fragmentilla, jolloin saatiin kosmidivektori pGcos3. pKT19 on pBR322:n johdos, jossa tetrasykliiniresistenssigeenin BamHI-kohta on käsitelty muunnetulla nitroguanosiinilla. pGcos4 muodos-20 tettiin kloonaamalla synteettistä 20-meeriä, 5'AATTCGATCGGATCCGATCG:a, pGcos3:n EcoRI-kohdassa.

Kuvio 6 esittää pESVDA:n kartan SV40-viruksen 342 emäksen PvuII-Hindlll-fragment-tia, joka ulottuu yli SV40-replikaation aloituskohdan ja 25 on muunnettu sitoutumaan EcoRI-kohtiin [73], 580 emäsparin BamHI-Bglll-fragmentissa olevaa hepatiitti B-viruksen (HBV) pinta-antigeenin polyadenylaatiokohtaa [49n] ja pBR322-johdosta pML [75] on kuvattu aiemmin. SV40:n aiempaa promoottoria seuraavan EcoRI-kohdan ja HBV:n BamHI-30 kohdan väliin sijoitettiin PvuII-Hindlll-fragmentti (adenovirus 2 -kartan koordinaatit 16.63 - 17.06), joka sisältää ensimmäisen myöhemmän esijakson donoriliittämiskohdan (asema 16.65), ja heti sen jälkeen adenovirus 2:n 840 emäsparin Hindlll-SacI-fragmentti (asema 7.67 - 9.97) 35 [49j], joka sisältää Elb-akseptoriliittymiskohdan kartan 13 868S5 asemassa 9.83. Donori- ja akseptorikohtien välissä sijaitsevat ainutlaatuiset Bglll- ja HindiII-kohdat genomi-DNA-fragmenttien sijoittamiseksi.

Kuvio 7 esittää pESVDA-vektorien RNA-kopioiden ana-5 lysointia

Yhtenevät COS-7-soluja [77] sisältävät 10 cm:n levyt transfektoitiin 2 pgrlla plasmidi-DNA:ta käyttäen muunnettua DEAE-dekstraanimenetelmää [84] kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [73]. RNA valmistettiin 4 vrk:n kuluttua 10 tranfektiosta sytoplasmauutteista [49n] ja käsiteltiin elektroforeettisesti denaturoivilla formaldehydi-agaroosi-geeleillä. Nitroselluloosalle siirtämisen jälkeen suodattimille tehtiin hybridisaatio asianmukaisen 32p-leimatun DNA: n kanssa menetelmien yhteydessä kuvatulla tavalla.

15 Suodattimet pestiin 2 x SSC:ssä, joka sisälsi 0,2 % SDS:ä, 42 °C:ssa ja kuvattiin Kodak XR5-filmille. Ribosomi-RNA:-iden 28S ja 18S sijainnit osoitetaan kussakin kuvassa nuolilla.

Eksonin A sisältävä λΐΐ4:η BamHI-fragmentti, jonka 20 pituus oli 9,4 kb, kloonattiin pESVDA:n Bglll-kohtaan (kuvio 6). Plasmidi pESVDAlll.6 sisälsi fragmentin siten orientoituneena, että SV40:n aiempi promoottori kopioisi ge-nomifragmentin oikeassa suunnassa. Plasmidi pESVDA111.7 sisältää 9,4 kb:n Bam-fragmentin päinvastoin orientoitu-25 neena. Plasmidi pESVDA.S127 sisältääλΐΐ4:n 12,7 kb:n Sacl-fragmentin sijoitettuna (tylppä pää-liitoksella)pESVDA:n Bglll-kohtaan samoin orientoituneena kuin pESVDAlll.6:ssa.

A. pESVDA:11a, pESVDAlll.7:11a ja pESVDAlll.6:11a transfektoitujen solujen koko sytoplasma-RNA:n sisältävien 30 suodattimien hybridisaatio. pESVDA-RNA (kaista 1), pESVDAlll.7 (kaista 2), pESVDAlll.6 (kaistat 3-5). Koettimena tekijän VIII eksoni A:ta sisältävä fragmentti (kaistat 1-4) tai 1800 emäksen StuI/Bam-fragmentti (kaista 5). Heikkoa ristihybridisaatiota 18 S-RNA:han on havaitta-35 vissa.

14 8 6 8 8ο Β. RNA:n hybridisaatio StuI/BamHI-koettimen ("int-ronikoettimen") kanssa. RNA-lähde: 1) pESVDA, polyA";2) pESVDA, polyA*; 3 ) pESVDA111.7, polyA';4) pESVDAlll.7,polyA*; 5) pESVDAlll.6, polyA"; 6) pESVDAlll.6, polyA*. Pieni tumma 5 hybridisaatiovyöhyke, joka havaitaan kaistoissa A5, Bl, B3 ja B5 edustaa todennäköisesti hybridisaatiota tällä alueella esiintyvän tRNA:han tai Alu-toistojaksoon.

C. pESVDAlll.6:n (kaista 1) ja pESVDA.S127 (kaista 2) sytoplasma-RNA:n vertailu, kun koettimena käytetään ek-10 sonia A sisältävää fragmenttia. Huomaa pieni koon kasvaminen kaistassa 2, joka edustaa suuremman genomifragmentin sisältämiä ylimääräisiä eksonijaksoja.

Kuvio 8 esittää pESVDA.S127-cDNA-kloonin S36 jaksoa.

15 Ihmisen insertoidun DNA-jakson DNA-sekvenssi esite tään eksoni-ilmentämisplasmidi pESVDA.SI27:sta saadulle cDNA-kloonille S36 (yksityiskohdat, katso infra). Pystyviivat osoittavat eksonien rajoja, jotka on määritetty tekijän VIII genomi- ja cDNA-kloonit analysoimalla, ja ek-20 sonit on merkitty kirjaimin samalla tavalla kuin kuviossa 4. Kuviossa esitetään valittuja restriktioendonukleaasi-kohtia.

Kuvio 9 esittää cDNA-kloonausta

Tekijä VIII-mRNA esitetään kolmannella vaakarivil-25 lä, jossa avoin pylväs esittää valmista proteiinia koodaa-vaa aluetta, varjostettu alue signaalipeptidiä koodaavaa aluetta ja päissä olevat viivat viestin niitä alueita, joille ei tehdä luentaa. mRNA:n 5'-pää on vasemmalla. Tämän vaakarivin yläpuolella esitetään genomikloonin λ 222 30 eksoni B-alue, ja mRNA-rivin alapuolella näkyvät ne kuusi cDNA-kloonia, joista täyspitkä tekijä VIII-klooni rakennettiin (yksityiskohdat tekstissä). Kuviossa esitetään cDNA-synteesiin käytetyt mallijaksot 1, 3, 4 ja oligo(dT); synteesin, jonka mallina ne toimivat, suunta osoitetaan - 35 nuolilla. Kuviossa esitetään myös valittuja restriktio- is 66885 endonukleaasikohtia ja mittakaava kiloemäksinä.

Kuvio 10 esittää ihmisen tekijä VIII-geenin jaksoa.

Rakennetun tekijä VIII-cDNA-kloonin koko nukleotidi jakso esitetään; nukleotidit on numeroitu kunkin rivin 5 vasempaan reunaan. Numero 1 vastaa luennan aloituskodonin ATG A:ta. Negatiiviset numerot viittaavat 5’-pään jaksoon, jolle ei ole tehty luentaa. (mRNA-kartoituskokeet viittaavat siihen, että tekijä VIII-mRNA ulottuu 5'-suunnassa noin 60 nukleotidia kauemmaksi kuin tässä esitetty asema-10 109.) Ennustettu proteiinijakso esitetään DNA-ketjun ylä puolella. Aminohappojen yläpuolella olevat numerot ovat SI - 19 ennustetulle signaalipeptidille ja 1 - 2331 ennustetulle valmiille proteiinille. "Op" tarkoittaa luennan lo-petuskodonia TAG. 3 *-polyadenylaatiosignaali AATAAA on 15 alleviivattu ja poly(A)-hännän kahdeksan ryhmää (esiintyvät kloonissa Acl0.3) ovat näkyvissä. Synteettiselle oli-gonukleotidikoettimelle 8.3 homologinen jakso on myös alleviivattu (nukleotidit 5557 - 5592). Valittuja restrik-tioendonukleaasipilkkomiskohtia on merkitty näkyviin asian-20 mukaisen jakson yläpuolelle. Nukleotidit 2671 - 3217 edustavat genomiklooneista johdettua jaksoa, kun taas muut cDNA-jaksoa.

Ihmisen tekijä VIII-geenin proteiinia koodaavan alueen täydellinen DNA-jakso määritettiin myös kuvaamis-25 tamme genomiklooneista. Vain kaksi nukleotidia erosi tässä kuvassa esitetystä cDNA-klooneista johdetusta jaksosta (lukuun ottamatta nukleotideja 2671 - 3217). Nukleotidi 3780 (alleviivattu) on G cDNA-kloonissa, jolloin aminohappo 1241 muuttuu asp:sta glurksi. Nukleotidi 8728 (allevii-30 vattu) 3'alueella, jolle ei ole tehty luentaa, on A geno-mikloonissa.

Kuvio 11 esittää täysimittaisen tekijä VIII-yhdis-telmäplasmidin rakentamisen

Tekstin kohdassa 8a annetaan yksityiskohdat, jotka 35 koskevat ihmisen tekijä VIII-cDNA:n koko jakson sisältä- ie 86 8 85 vän plasmidin pSVEFVIII rakentamista. Asemien numerointi poikkeaa tekstissä ja kuviossa 10 esitetystä 72 emäsparil-la.

Kuvio 12 esittää tekijä VHI-ilmentämisplasmidin 5 rakentamisen

Tekstin kohdassa 8b annetaan yksityiskohdat, jotka koskevat plasmidin pAML3p.8cl, joka ohjaa funktionaalisen ihmisen tekijän VIII muodostumista BHK-soluissa, rakentamista.

10 Kuvio 13 esittää tekijä VIII:n Viestern-täpläanalyy- sin fuusioproteiini-antiseerumeja käyttäen

Ihmisen tekijä VIII erotettiin 5-10 %:isella po-lyakryyliamidigradientti-SDS-geelillä kirjallisuudessa esitetyllä menetelmällä [81]. Yksi tekijä VIII-kaista käsi-15 teltiin hopealla [80]. Muut tekijä VIII-kaistat siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosalle Western-täp-läanalyysiä varten. Tekijä VIII-kaistojen viereisille kaistoille sijoitettiin radionuklidileimatut standardit havaittujen vyöhykkeiden molekyylipainojen arvioimiseksi.

20 Kuten tekstistä ilmenee, nitroselluloosaliuskoja inkuboi- tiin asianmukaisten antiseerumien läsnäollessa, pestiin, ja lisättiin koettimeksi 1Z5I-leimattua proteiini A:ta. Nit-roselluloosalevyille tehtiin autoradiografia.

Kuvio 14 esittää fuusioproteiinien analysointia mo-25 noklonaalisen vasta-aineen C8 avulla

Fuusioproteiineista 1, 3 ja 4 analysoitiin Western-täpläanalyysillä tekijän Vili reaktiivisuus spesifisen mo-noklonaalisen vasta-aineen C8 suhteen.

Kuvio 15 esittää tekijä VIII suurpainenestekromato-30 grafinen (HPLC) eluoitumiskäyrän Toya Soda TSK 4000 SW-kolonnissa

Kolonni tasapainotettiin ja kehitettiin huoneen lämpötilassa liuoksella, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää 0,1 M natriumfosfaatissa (pH 7,0).

35 Kuvio 16 esittää eluoitumiskäyrän tekijän VIII

86885 trypsiinipilkkoutumispeptidien RP-HPLC-erotuksessa

Erotus tehtiin Synchropak RP-P C-18-kolonnissa (0,46 cm x 25 cm, 10 pm) eluoiden asetonitriiligradien-tilla (1 % -*70 % 200 minzssa) 0,l-%:isessa trifluorietik-5 kahapossa. Nuoli osoittaa piikkiä, joka sisältää peptidin, jonka jakso on AWAYFSDVDLEK.

Kuvio 17 esittää puhdistetun tekijän VIII aktivoitumista trombiinin vaikutuksesta

Solusupernatantti käsiteltiin kromatografisesti C8-10 monoklonaalisella hartsilla ja dialysoitiin eluointipus-kurin poistamiseksi. Trombiini (25 ng) lisättiin ajankohtana 0. Annokset laimennettiin suhteessa 1:3 mainittuina aikoina ja niiden hyytymisaktiivisuus tutkittiin. Tulokset (yksikköä/ml) laskettiin ihmisen normaalin plasman antaman 15 standardikäyrän perusteella.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisen yhdistelmä-tekijän Vili tai sen johdannaisen valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) valmistetaan ekspressiovektori, joka koodaa ku-20 viossa 10 esitettyä ihmisen tekijän VIII aminohapposekvenssiä tai sen johdannaista, jolla on ihmisen tekijän VIII aktiivisuutta, b) eukaryoottinen isäntäsolulinja transformoidaan ekspressiovektori11a, 25 c) solut viljellään, ja d) tekijä VIII tai sen johdannainen otetaan talteen soluviljelmästä.

Edullisesti ekspressiovektori sisältää lisäksi dihydrofo-laattireduktaasia koodaavaa DNA:ta, isäntäsolulinja kot-30 ransformoidaan a) vaiheen mukaisella ekspressiovektorilla ja selektiivisen leiman sisältävällä vektorilla, selektiivisen leiman sisältävät solut valikoidaan, dihydrofolaat-tireduktaasia koodaavaa DNA:ta sisältävien solujen DNA amplifioidaan, valikoidut ja amplifioidut solut viljellään 35 ja tekijä VIII tai sen johdannainen otetaan talteen soluviljelmästä.

18 86885

Keksinnön mukaiselle eristetylle DNA-jaksolle ihmisen yhdistelmä-tekijän VIII ilmentämistä varten on tunnusomaista, että se käsittää kuviossa 10 esitetyn nukleiinihappo jakson, joka koodaa ihmisen funktionaalista tekijää 5 VIII tai sen johdannaista, jolla on ihmisen funktionaalisen tekijän Vili aktiivisuutta. Em. DNA-jakso voidaan muodostaa keksinnön mukaisella menetelmällä nukleiinihappo-sekvenssin valmistamiseksi luonnollisesta lähteestä, jolle on tunnusomaista, että a) mRNA-lähde identifioidaan, 10 b) cDNA-kirjasto muodostetaan mRNA:n perusteella, c) kirjasto seulotaan tekijän VIII osia koodaavien kloonien suhteen, d) ihmisen lambda- ja kosmidikirjastot seulotaan tekijän VIII osia koodaavien kloonien suhteen, 15 e) tekijää VIII koodaavan nukleiinihapon 5'- ja 3'- päät tunnistetaan koettimien avulla, f) positiiviset kloonit eristetään ja kartoitetaan, ja g) positiivisista päällekkäisistä ja vierekkäisis-20 tä genomi- ja cDNA-klooneista saadut fragmentit liitetään yhteen ihmisen tekijä VIII-proteiinia koodaavan nukleii-nihapposekvenssin kokoamiseksi.

Keksinnön mukaisten ekspressiovektoreiden ja vektoreiden PAML3P.8C1, P G Cos 4 ja PESVDA tunnusmerkit ilmenevät 25 patenttivaatimuksista 2, 10, 3, 9 ja 11, vastaavasti.

A. Määritelmät "Ihmisen tekijä VIII" tarkoittaa tässä käytettynä funktionaalista proteiinia, jolla on kyky in vivo tai in vitro korjata ihmisen tekijän VIII puutoksia, joille on 30 luonteenomaista esimerkiksi hemofilia A. Proteiinista ja siihen liittyvistä toiminnoista käytetään myös nimityksiä "tekijä Vine (FVIIIC)" ja tekijä VIII-koagulanttianti-geeni (FVIIICAg)" [31a]. Tällaista tekijää tuottavat yh-distelmäsoluviljelmäsysteemit yhdessä tai useammassa ak-35 tiivisessa muodossa, jotka vastaavat ihmisen plasmalle 19 86855 luontaista aktiivista tekijää VIII. (Yksi "yksikkö" ihmisen tekijän VIII aktiivisuutta on määritetty aktiivisuudeksi, joka esiintyy yhdessä millilitrassa ihmisen normaalia plasmaa). Keksinnön mukaisesti tuotettu tekijä VIII-5 proteiini määritellään määritettyjen DNA- ja aminohappo-jaksojen, fysikaalisten ominaisuuksien ja biologisen aktiivisuuden perusteella.

Tekijällä VIII on luonnossa useita pilkkoutumisen tai käsittelyn tuloksena syntyneitä muotoja. Nämä syntyvät 10 proteolyysin kautta esiasteesta, yksiketjuisesta proteiinista, kuten tässä osoitetaan. Tämä keksintö koskee tällaisen yksiketjuisten proteiinin ja myös näiden erilaisten pilkkoutumistuotteiden tuottamista sinänsä tai käsittelemällä lähtöainemolekyyliä in vitro, sekä näiden erilaisten 15 pilkkoutumistuotteiden, joiden on myös osoitettu olevan aktiivisia, antamista. Tällaiset tuotteet sisältävät luontaista materiaalia vastaavaa funktionaalisesti aktiivista yhtä tai useampaa osaa.

Todennäköisesti alleelisia muunnoksia esiintyy.

20 Tällaisia muunnoksia voivat olla yhden tai useamman aminohapon erilaisuus koko jaksossa tai yhden tai useamman aminohapon puuttuminen, korvautuminen, lisäys tai inversio koko jaksossa. Lisäksi voi glykosylaatiokohta ja -asterii-ppua isäntäsoluympäristön luonteesta. Käytettäessä yhdis-25 telmä-DNA-tekniikkaa on olemassa myös mahdollisuus esimer kiksi perustana olevaa DNA:ta paikkaohjatusti muuttamalla valmistaa erilaisia ihmisten tekijä VIII-johdoksia, joita vaihtelevalla tavalla muuntavat tuloksena olevat yhden tai useamman aminohapon puuttumiset, korvautumiset, lisäykset 30 tai inversiot. Lisäksi ihmisten tekijä VIII-fragmenteilla joko tuotettuina in vivo tai in vitro, voi olla vaadittava käyttökelpoinen aktiivisuus kuten edellä kuvattiin. Kaikki tällaiset alleeliset muunnokset, glykosyloidut muodot, muunnokset ja fragmentit, jotka johtavat tekijän VIII johdok-35 siin, kuuluvat keksinnön piiriin, kunhan ne sisältävät 20 6 6 8 S 5 ihmisen tekijän VIII funktionaalisen segmentin, ja oleellinen, ihmisen tekijälle VIII luonteenomainen funktionaalinen aktiivisuus säilyy muuttumattomana. Tällaisista funktionaalisista muunnoksista ja tunnetuista johdoksista 5 käytetään nimitystä "ihmisen tekijä VIII-johdokset" tässä yhteydessä. Ne tekijä VIII-johdokset, joilla on vaadittava funktionaalinen aktiivisuus, on helppo identifioida tässä kuvatuilla suorilla in vitro-kokeilla. Tässä esitetyn ihmisen tekijä VIII-DNA:n jakson ja ihmisen tekijän VIII 10 aminohappojakson perusteella ovat alan asiantuntijalle selviä fragmentit, joita voidaan johtaa pilkkomalla DNA:ta restriktioentsyymeillä tai hajottamalla proteolyyttiset tai muulla tavalla ihmisen tekijä VIII-proteiinia.

Siten toimivassa muodossa olevalla ihmisen tekijä 15 VIII:lla, so. "funktionaalisella ihmisen tekijällä VIII", on kyky katalysoida tekijän X muuttumista tekijäksi Xa tekijän IXa, kalsiumin ja fosfolipidin läsnäollessa, samoin kuin kyky korjata hemofilia A:ta sairastavien henkilöiden plasmassa esiintyvä hyytymishäiriö, ja lisäksi tämä 20 tekijä luokitellaan "funktionaaliseksi tekijäksi VIII" sillä perusteella, että sen immunologiset ominaisuudet ovat samanlaiset tai suurin piirtein samanlaiset kuin ihmisen tekijällä VIII plasman.

"Suurin piirtein puhdas muoto" käytettynä kuvaamaan 25 keksinnön mukaisesti tuotetun "ihmisen tekijän VIII" tilaa tarkoittaa sitä, että tuote on suurin piirtein vapaa proteiinista tai muista materiaaleista, joita tavallisesti liittyy tekijän VIII, kun se eristetään ei-yhdistelmäläh-teistä, so. "luontaisesta" plasmaa sisältävästä ympäris-30 töstään.

"DHFR-proteiinilla" tarkoitetaan proteiinia, jolla on kyky osoittaa dihydrofolaattireduktaasiin (DHFR) liittyvää aktiivisuutta ja jonka tuottamista siitä syystä vaaditaan soluilta, joilla on kyky pysyä hengissä alustalla, 35 josta puuttuu hypoksantiini, glysiini ja tymidiini (-HGT- 2i S 6 8 8 5 alusta). Solut, joilta puuttuu DHFR-proteiini, eivät yleensä pysty kasvamaan tällä alustalla, sen sijaan DHFR-proteiinia sisältävät solut onnistuvat tekemään sen.

Termi "ilmentämisvektori" sisältää vektorit, joilla 5 on kyky saada aikaan sisältämiensä DNA-jaksojen ilmentyminen, kun tällaiset jaksot ovat toimivasti liittyneinä muihin jaksoihin, joilla on kyky saada aikaan niiden ilmentyminen. Nämä ilmentämisvektorit replikoituvat isäntäsolus-sa, joko oman toimivan replikoi tiimi sen aloituskohtansa 10 vaikutuksesta tai integroitumalla toimivalla tavalla solun kromosomiin. Myös "ilmentämisvektori" määritellään toiminnan perusteella, ja mikä tahansa DNA-jakso, jolla on kyky saada aikaan sisältämänsä tietyn DNA-koodin ilmentyminen, kuuluu tämän termin piiriin, kun sitä sovelletaan tiettyyn 15 jaksoon. Yleisesti voidaan sanoa, että yhdistelmä-DNA-tekniikassa käyttökelpoiset ilmentämisvektorit ovat usein "plasmidien" muodossa, joilla tarkoitetaan kaksisäikeisiä DNA-renkaita. Keksinnön tarkoituksena on kuitenkin sisältää sellaiset muut ilmentämisvektorimuodot, jotka toimivat 20 vastaavalla tavalla.

"Eristetyllä DNA-jaksolla" tarkoitetaan DNA-jaksoa, joka koostuu ihmisen tekijää Vili koodaavasta jaksosta, joko sinänsä tai sijoitettuna kloonausvektoriin.

"Yhdistelmäisäntäsoluilla" tarkoitetaan solua/solu-25 ja, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttämällä rakennetuilla vektoreilla. Kuten tässä on määritelty, tekijää VIII tai sen funktionaalisia segmenttejä tuotetaan määrinä, jotka saavutetaan tämän transformaation ansiosta, eikä sellaisina pienempinä määrinä ja puhtausas-30 teeltaan heikoimpina, jollaisina transformoimaton luonnollinen isäntä saattaisi niitä tuottaa. Tekijästä VIII, jota tuottavat tällaiset "yhdistelmäisäntäsolut", voidaan käyttää nimitystä "ihmisen yhdistelmätekijä VIII".

DNA:n ja RNA:n kokoa kuvaavat yksiköt lyhennetään 35 usein seuraavasti: b = emäs tai emäspari; kb * kilo(tu- 22 8 6 8 8 5 hat)-emäs tai kiloemäspari. Proteiinien yksiköistä käytetään lyhenteitä: D = dalton; kD = kilodalton. Lämpötilat annetaan aina Celsius-asteina.

B. Isäntäsoluviljelmät ja vektorit 5 Käyttökelpoista ihmisen tekijää VIII voidaan tämän keksinnön mukaisesti tuottaa erilaisissa yhdistelmäisän-täsoluissa. Seuraavassa kuvataan erityisen edullista systeemiä.

Prokaryootit ovat yleensä edullisia rakennettaessa 10 vektoreita tämän keksinnön yhteydessä käyttökelpoisia DNA-jaksojen kloonausta varten. Esimerkiksi E. coli K12-kanta 294 (ATCC n:o 31446) on erityisen käyttökelpoinen. Muihin käyttökelpoisiin mikrobikantoihin kuuluvat E. coli-kannat, kuten E. coli B, E. coli X1776 (ATCC n:o 31537), E. coli 15 c600 ja c600hfl ja E. coli W3110 (F"; λ', prototrooppinen, ATCC n:o 27325), basillit, kuten Bacillus subtilis; muut enterobakteerit, kuten Salmonella typhirum ja Serratia marcesans, sekä erilaiset Pseudomonas-lajit. Nämä esimerkit on luonnollisesti tarkoitettu valaiseviksi eikä ra-20 joittaviksi.

Yleensä näiden isäntien ynteydessä käytetään repli-konin ja säätelyjakson sisältäviä plasmidivektoreita, jotka on johdettu isäntäsolun kanssa yhteensoveltuvasta lajista. Vektori sisältää yleensä replikoitumiskohdan sekä 25 markkerijaksot, joiden avulla voidaan tehdä fenotyypin valinta transformoiduissa soluissa. Esimerkiksi E. coli transformoidaan tyypillisesti käyttämällä pBR322:a, plas-midia, joka on peräisin eräästä E. coli-lajista [32]. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssi-30 geenit ja antaa siten helpon keinon transformoitujen solu jen identifioimiseksi ja valitsemiseksi. pBR322:n tai muun mikrobiplasmidin tulee myös sisältää, tai se tulee muuntaa sisältämään promoottoreja, joita mikrobiorganismi voi käyttää omien proteiiniensa tuottamiseen. Yhdistelmä-DNA-35 rakenteessa tavallisesti käytettyihin tällaisiin promoot- 23 868 85 toreihin kuuluvat 8-laktamaasi-(penisillinaasi) ja laktoo-sipromoottorisysteemit [33 -35] ja tryptofaani(trp)pro-moottorisysteemi [36-37]. Vaikka nämä ovat yleisimmin käytetyt, on keksitty ja otettu käyttöön muitakin mikrobipro-5 moottoreita, ja niiden nukleotidijaksoja koskevia yksityiskohtia on julkaistu, mikä tekee alan asiantuntijalle mahdolliseksi niiden liittämisen toimivalla tavalla plas-midivektoreihin [38].

Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää eukaryootti-10 siä mikrobeja, kuten hiivaviljelmiä. Saccharomyces cerevi-siae, eli tavallinen leivinhiiva on kaikkein useimmin käytetty eukaryoottisista mikro-organismeista, vaikka nykyään on saatavana joukko muitakin kantoja. Saccaharomycesissä tapahtuvaa ilmentämistä varten käytetään yleisesti esimer-15 kiksi plasmidia YRp7 [39 - 41]. Tämä plasmidi sisältää valmiiksi trpl-geenin, joka tarjoaa valintamarkkerin sille hiivan mutanttikannalle, jolta puuttuu kyky kasvaa trypto-fäänissä, esimerkiksi ATCC n:o 44076:lie tai PEP4-l:lle [42] . Hiivaisäntäsolugenomin luonteenomaisena piirteenä 20 esiintyvä trpl-vaurion läsnäolo tarjoaa siten tehokkaan ympäristön transformaation havaitsemiseksi ilman trypto-faania tapahtuvan kasvun alla.

Soveltuviin hiivavektoreissa esiintyviin promoottori jaksoihin kuuluvat promoottorit 3-fosfoglyseraattikinaa-25 sille [43] tai muille glykolyyttisille entsyymeille [44,-45], kuten enolaasille, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydro-genaasille, heksokinaasille, pyruvaattidekarboksylaasille, fosfofruktokinaasille,glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasille, 3-fosfoglyseraattimutaasille, pyruvaattikinaasille, trioo-30 sifosfaatti-isomeraasille, fosfoglukoosi-isomeraasille ja glukokinaasille. Rakennettaessa soveltuvia ilmentämisplas-mideja liitetään myös näihin geeneihin liittyvät lopetus-jaksot ilmentämisvektoriin suuntaan 3' siihen jaksoon nähden, jonka halutaan ilmentyvän, mRNA:n polyadenylaation ja 35 terminaation aikaan saamiseksi. Muihin promoottoreihin, 66885 24 joiden lisäetuna on kasvuolosuhteiden säätelemä kopioituminen, kuuluvat promoottorijaksot alkoholidehydrogenaasi 2:lie, isosytokromi C:lle, happofosfataasille, typpimetaboliaan liittyville hajottaville entsyymeille, edellä mai-5 nitulle glyresaldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasille sekä maltoosin ja galaktoosin hyväksikäytöstä vastaaville entsyymeille. Mikä tahansa plasmidivektori, joka sisältää hiivan kanssa yhteensopivan promoottorin, replikoitumisen aloituskohdan ja terminaatiojakson, on soveltuva.

10 Monisoluisista organismeista peräisin olevien solu viljelmien käyttö soluisäntinä on edullista erityisesti haluttaessa saada aikaan DNA:n ilmentyminen keksinnön mukaisena funktionaalisena ihmisen tekijänä VIII, ja viitataan erityisesti tähän keksinnön mukaiseen edulliseen suo-15 ritusmuotoon. Periaatteessa erityisen mielenkiinnon koh teena ovat selkärankaissolut, kuten VERO- ja HeLa-solut, kiinanhamsterin munasarjasolulinjat (CHO-solulinjat) ja W138-, BHK- ja MDCK-solulinjat. Tällaisissa soluissa käytettävät ilmentämisvektorit sisältävät tavallisesti (mikä-20 li välttämätöntä) yhden tai useamman reaplikoitumisen aloituskohdan ja promoottorin, joka sijaitsee ilmennettävän geenin edellä, yhdessä mahdollisten tarpeellisten ri-bosomiensitomiskohtien, RNA-liittämiskohtien, polyadeny-laatiokohdan ja kopioinnin lopetusjaksojen kanssa.

' 25 Käytettäessä ilmentämisvektoreita nisäkässoluissa voi niiden säätelytoimintojen antajana olla virusmateriaa- li. Yleisesti käytettyjä promoottoreja ovat esimerkiksi polyomasta, Simian-virus 40:stä (SV40) ja aivan erityisesti adenovirus 2:sta lähtöisin olevat. SV40-viruksen aiem-30 mat ja myöhemmät promoottorit ovat käyttökelpoisia samoin kuin adenoviruksen myöhempi pääpromoottori, kuten edellä kuvattiin. Lisäksi on myös mahdollista ja usein toivottavaa käyttää haluttuun geenijaksoon normaalisti liittyviä promoottori tai säätelyjaksoja sillä edellytyksellä, että 35 tällaiset säätelyjaksot ovat yhteensopivia isäntäsolusys-teemien kanssa.

25 8 6 8 8 5

Replikoitumisen aloituskohta voidaan saada aikaan joko rakentamalla vektori, joka sisältää ulkopuolelta tulleen aloituskohdan, kuten adenoviruksesta tai muusta vi-ruslähteestä (esimerkiksi Polyoma, SV40, VSV, BPV, jne.) 5 peräisin olevan, tai kahdentuminen voidaan saada aikaan isäntäsolun kromosomaalisella replikoitumismekanismilla, jos vektori liitetään isäntäsolun kromosomiin.

Valittaessa edullista isäntäsolua transfektoitavak-si keksinnön mukaisilla vektoreilla, jotka sisältävät sekä 10 tekijää VIII että DHFR-proteiinia koodaavat DNA-jaksot, on asianmukaista valita isäntäsolu käytettävän DHFR-pro-teiinin tyypin mukaan. Jos käytetään villiä tyyppiä olevaa DHFR-proteiinia, on edullista valita isäntäsolu, josta puuttuu DHFR, jolloin on mahdollista käyttää DHFR:ä koo-15 daavaa jaksoa onnistuneen transfektion markkerina selektiivisessä alustassa, josta puuttuu hypoksantiini, glysii-ni ja tymidiini.

Toisaalta, jos käytetään säätelyjaksona DHFR-proteiinia, jolla on alhainen sitoutumisaffiniteetti MTXrään, 20 ei ole välttämätöntä käyttää DHFR-resistenttejä soluja. Koska mutantti-DHFR on resistentti metotreksaatille, voidaan käyttää MTX-pitoista alustoja valintavälineenä sillä edellytyksellä, että isäntäsolut itse ovat metotreksaatti-herkkiä. Useimmat eukaryoottisolut, joilla on kyky absor-25 boida MTX:ä, osoittautuvat metotreksaattiherkiksi.

Vaihtoehtoisesti voidaan villiä tyyppiä olevaa DHFR-geeniä käyttää amplifikaatiomarkkerina isäntäsolus-sa, jolta ei puutu DHFR, sillä edellytyksellä, että käytetään markkeria, joka tekee mahdolliseksi valinnan lääkeai-30 neeh avulla, kuten neomysiiniresistenssigeeniä.

Jäljempänä olevissa esimerkeissä kuvataan BHK-solu-jen käyttöä isäntäsoluina sekä ilmentämisvektoreiden, jotka sisältävät adenoviruksen myöhemmän pääpromoottorin, käyttöä.

26 86885 C. Yleiset menetelmät

Jos isäntäsoluina käytetään soluja, joiden seinät eivät muodosta vakavia esteitä, transfektio tehdään kal-siumfosfaattisaostusmenetelmällä [46]. Voidaan kuitenkin 5 käyttää myös muita menetelmiä DNA:n viemiseksi soluihin, kuten ruiskuttamista tumaan tai protoplastifuusiota.

Jos käytetään prokaryoottisoluja tai soluja, jotka sisältävät huomattavia soluseinämärakenteita, edullinen transfektiomenetelmä on kalsiumkäsittely kalsiumkloridia 10 käyttäen [47].

Rakennettaessa vektoreita, jotka sisältävät halutut koodaus- ja säätelyjaksot, käytetään tavanomaisia ligaa-tiomenetelmiä. Eristetyt plasmidit tai DNA-fragmentit pilkotaan, muokataan ja liitetään takaisin haluttuun muotoon 15 tarvittavien plasmidien muodostamiseksi.

Pilkkominen tehdään käsittelemällä yhdellä tai useammalla restriktioentsyymillä soveltuvassa puskurissa. Yleensä käsitellään noin 1 pg plasmidia tai DNA-fragment-teja noin 1 yksiköllä entsyymiä noin 20 pl:ssa puskuri-20 liuosta tunnin ajan. (Valmistaja ilmoittaa asianmukaiset puskurit ja substraatin määrät kullekin restriktioentsyy-mille. Samalla tavoin valmistaja antaa standardiolosuhteet T4-ligaasin, T4-polynukleotidiligaasin ja emäksisen bak-teerifosfataasin käytölle). Proteiini poistetaan inkuboin-25 tien jälkeen uuttamalla fenolilla ja kloroformilla, ja nukleiinihappo otetaan talteen vesifraktiosta seostamalla etanolilla. Saatavana on standardimenettelyjä laboratorioille [48].

Tarttuvapäiset (päistä yksisäikeiset) restriktio-30 entsyymifragmentit muutetaan tylppäpäisiksi esimerkiksi seuraavasti:

Korjaaminen täyttämällä: 2 - 15 pg DNA:ta inkuboi-tiin liuoksessa, joka sisälsi 50 mmol/1 NaCl:a, 10 mmol/1 Trislä (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl2:a, 1 mmol/1 ditiotreito-35 lia, 250 ,pmol/l kutakin deoksinukleosiditrifosfaattia ja 27 66885 8 yksikköä DNA-polymeraasin Klenow-fragmenttia, 24 °C:ssa 30 min. Reaktio päätettiin fenolilla ja kloroformilla uuttamalla ja etanolisaostuksella.

Sl-pilkkominen: 2 - 15 pg DNA:ta inkuboitiin liu-5 oksessa, joka sisälsi 25 mmol/1 NaOAcria (pH 4,5), 1 mmol/1 ZnCl2:a, 300 mmol/1 NaCl:a, 600 yksikön kanssa nukleaasia 37 °C:ssa 30 min, minkä jälkeen uutettiin fenolilla ja kloroformilla ja seostettiin etanolilla.

Synteettiset DNA-fragmentit valmistettiin tunnetuin 10 fosfotriesteri- [47a] tai fosforiamidiittimenettelyin [47b]. DNA:lie tehtiin elektroforeesi agaroosi- tai poly-akryyliamidigeelilevyillä tavanomaisin menettelyin [48], ja fragmentit puhdistettiin geeleistä elektroeluutiolla [48a]. DNA:n Southern-täplähybridisaatio tehtiin viitteen 15 [49a] mukaisesti.

RNA:n Northern-täplähybridisaatiot seurasivat elektroforeesia, joka tehtiin 6 % formaldehydiä sisältävillä agaroosigeelilevyillä [48, 49b]. Radionuklidileimatut hyb-ridisaatiokoettimet valmistetaan synteettisesti mallina 20 sattumanvarainen vasikan kateenkorva-DNA [49c] käyttäen suuren ominaisaktiivisuuden omaavia 32p-leimattuja nukleo-tiditrifosfaatteja (32p: Amersham; Klenow-DNA-polymeraasi: BRL, NEB tai Boehringer-Mannheim). Lyhyiden oligonukleoti-dikoettimien päät voidaan leimata T4-polynukleotidikinaa-.. 25 silla. "Standardisuola"-Southern-hybridisaation olosuhteet olivat seuraavat: Hybridisaatioseos: 5 X SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3-sitraatti), 50 mM Na-fosfaattia (pH 7), 10 % dekstraanisulfaattia, 5 x Denhardtin liuosta (1 x Denhardt = 0,02 % ficollia, 0,02 % polyvinyylipyrro-30 lidonia, 0,02 % naudan seerumialbumiinia), 20 - 100 ,pg/ml denaturoitua lohen maidin DNA:ta ja 0 - 50 % formamidia. Lämpötila: 24 - 42 eC. Hybridisaation jälkeen pesu 0,2-1 x SSC:ssä, joka sisälsi 0,1 % SDS:ä, lämpötilassa 24 - 65 “C. Kuivatut suodattimet kuvattiin Kodak XAR-filmille 35 käyttäen DuPontin Lightning-Plus-kuvanvahvistuslevyjä 28 86885 80 °C:ssa. Yleiskatsaus viitteessä [48].

Solujen ja kudosten RNAriden Northern-täpläanalyy-siä varten hybridisaatio tehtiin 5 x SSC:n ja 5 x Denhard-tin liuoksen seoksessa, joka sisälsi 10 % dekstraanisul-5 faattia, 50 % formamidia, 0,1 % SDS:ä, 0,1 % natriumpyro-fosfaattia ja 0,1 mg/ml E. coli -tRNA:ta, 42 °C:ssa yön yli käyttäen 32p-leimattua koetinta, joka valmistettiin λ120:η 189 bp:n Stul/Hincl-fragmentista, joka sisälsi ek-soni A-jakson. Pesuolosuhteet olivat 0,2 x SSC ja 0,1 % 10 SDS:ä 42 °C:ssa.

Ihmisen DNA valmistettiin perifeerisistä veren lymfosyyteistä (46,XY) tai lymfoblastisoluista (49,XXXXY, N.I.G.M.S. Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, N.J., n:o GM1202A) [48]. E. colin plasmidi-DNA valmistet-15 tiin kirjallisuuden mukaan [48], samoin bakteriofagi λ-DNA [48] . Kudos-RNA valmistettiin joko guanidiumtiosyanaa-ttimenetelmällä [48, 49f] tai viitteen [49b] menetelmällä. Polyadenyloitu RNA eristettiin oligo(dT)selluloosalla [49h].

20 DNA-sekventointi tehtiin viitteen [49i] mukaisella menetelmällä.

λ/4X-kirjastoa varten pilkottiin viisi 50 pg:n annosta 49,XXXXY-DNA:ta 1 ml:n tilavuudessa Sau3AI:lla, jonka pitoisuus oli 3,12, 1,56, 0,782, 0,39 ja 0,195 ky/ml, 25 1 h 37 °C:ssa. Koepilkkominen ja geelianalyysi oli osoit tanut, että näissä olosuhteissa pitoisuuden ollessa 0,782 ky/ml Sau3AI:a DNA:n painokeskimääräinen koko oli noin 30 kb; siten nämä pilkkomistuotteet muodostivat lukukeskimää-räisen jakautuman, jonka keskikohta oli 15 kb:n kohdalla. 30 5 pilkkomiserän DNA:t yhdistettiin, uutettiin fenolilla ja kloroformilla, saostettiin etanolilla ja tehtiin tuotteelle elektroforeesi matalassa lämpötilassa hyytyvällä vaakasuoralla agaroosigeelillä (6 g/1) [48] (Seaplaque agarose, FMC Corporation) kahdessa urassa, joiden mitat olivat 5,6 35 x 0,6 x 0,15 cm. Geelistä leikattiin irti alue 12 18 kb, 29 86885 ja DNA puhdistettiin sulattamalla geelipala viitteessä [48] kuvatulla tavalla.

Charon 30-haarat valmistettiin pilkkomalla 50 yg vektoria BamHItlla ja eristämällä 31,9 kb:n haarafragment-5 ti matalassa lämpötilassa hyytyvältä agaroosigeeliltä (6 g/1) edellä kuvatulla tavalla. A/4X-kirjaston rakentamiseksi määritettiin Charon 30-BamHI-haarojen ja 12 - 18 kb:n 49,XXXXY-Sau3A-fragmenttien optimipitoisuus viitteessä [48] kuvatulla tavalla. Ligaatiokäsitelty DNA pakat-10 tiin in vitro-uutteen kanssa ("packagene", Promega Biotec, Inc., Madison, WI). Tyypillisessä reaktiossa noin 1,3 yg Charon 30-BamHI-haaroja liitettiin 0,187 yg:aan 12 - 18 kb:n Sau3A-DNA:ta 10 yl:n tilavuudessa. Pakkaamalla DNA-levy saatiin noin 1,3 x 106 fagipesäkettä. λ/4X-kirjaston 15 muodostamiseksi siirrostettiin 1,7 x 106 fagia laittaen aina 17 000 fagia 150 mm:n levylle. Näitä levyjä inkuboi-tiin yön yli, kaavittiin seokseen, joka sisälsi 10 mmol/1 Tris-HCl:ä (pH 7,5), 0,1 mol/1 NaCl:a, 10 mmol/1 MgCl2:a ja 0,5 g/1 gelatiinia, ja sentrifugoitiin nopeasti fagi-20 määrän kasvattamiseksi. Yleensä levitettiin levylle sopiva lukumäärä (0,5 - 2 x 106) näitä f age ja ja tutkittiin ne [48]. Joissakin tapauksissa in vitro-pakatut fagit tutkittiin suoraan ilman amplifikaatiota.

λ482:η, kloonin, joka sisältää tekijä Vlll-genomin 25 22 kb:n Bell-fragmentin, eristämiseksi eristettiin vektori λΐ059:η BamHI-fragmentit [49] geelielektroforeesilla. Erikseen pilkottiin 100 yg 49,XXXXY-solulinjan DNA:ta Bcll:llä ja eristettiin fraktio 20 - 24 kb geelielektroforeettises-ti. Noin 0,8 yg A1059-haarafragmentteja ja 5 % eristetystä 30 BclI-DNA:sta ligatoitiin 10 yl:n tilavuudessa [48], jol-. . loin saatiin 712 000 pesäkettä. 400 000 näistä tutkittiin rinnakkaismääritykset tehden λ 114:n 2,2 kb:n StuI/EcoRI-koettimellä.

30 86 8 8 5

Kosmidi/4X -kirjasto muodostettiin λ/4X-kirjaston muodostamiseen käytetystä 49,XXXXY-DNA:sta, paitsi että noudatettiin suurta varovaisuutta DNA:n eristämisessä leikkaus- tai muiden rikkoutumisien välttämiseksi. DNA 5 pilkottiin osittain viittä Sau3AI-pitoisuutta käyttäen ja yhdistetty DNA lajiteltiin koon mukaan sakkaroosigradien-tilla 100 -*400 g/1 [49] .35 - 45 kb:n DNA:n sisältävät fraktiot yhdistettiin, dialysoitiin ja saostettiin etanolilla. Kosmidivektorin pGcos4 haarafragmentit valmistet-10 tiin kirjallisuudessa [50] esitettyjä periaatteita noudattaen. Lyhyesti ilmaistuna: kaksi erillistä, yhtä suurta annosta pGcos4:ä pilkottiin Sstl:llä (Sacl:n isoskitsomee-ri) tai Sall:llä ja käsiteltiin sitten emäksisellä baktee-rifosfataasilla. Nämä annokset uutettiin sitten fenolilla 15 ja kloroformilla, yhdistettiin, saostettiin etanolilla ja pilkottiin BamHIrllä. Tästä pilkkomistuotteesta eristettiin kaksi haarafragmenttia, joiden pituudet olivat 4392 ja 4002 b, matalassa lämpötilassa hyytyvällä agaroosigee-lillä. Nämä haarafragmentit ligatoitiin sitten eristet-20 tyyn, DNA:ta Sau3AI:llä osittain pilkkomalla saatuun 40 kb: n fragmenttiin. Tyypillisessä reaktiossa ligatoitiin 0,7 pg pGcos4-haarafragmentteja 1 pg:aan 40 kb:n pituista ihmisen 4X-DNA:ta 10 pl:n tilavuudessa [48]. Tämä reaktio-tuote pakattiin sitten in vitro, ja sitä käytettiin E. 25 coli HB101:n recA'-kannan infektointiin [48]. Tästä reaktiotuotteesta saatiin noin 120 000 pesäkettä siirrostettu-na tetrasykliiniä sisältäville levyille. Noin 150 000 kos-midia tutkittiin 20:llä 150 mm:n levyllä rinnakkaiskokeet tehden edellä kuvatulla tavalla, tehden amplifikaatio in-30 kuboimalla yön yli kloramfenikolia sisältävillä levyillä [48].

Kaksisäikeinen cDNA valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla [36, 37] käyttäen joko oligo(dT)12-18:a tai synteettisiä deoksiolidonukleotidi-16-meereja malleina kään-35 teiskopioijaentsyymin avulla tehtävään ensimmäisen säi- 3i 86 885 keen synteesiin. Polyakryyliamidigeeleillä tehdyn eristämisen jälkeen asianmukaisen kokoinen (tavallisesti 600 bp tai suurempi) cDNA tehtiin C-päiseksi terminaalitransfe-raasin avulla, liitettiin yhteen G-päisen PstI-pilkotun 5 pBR322:n kanssa, ja transformoitiin tällä yhdistelmällä E.coli-kanta DH1 [76], tai tehtiin ligaatio 100-kertaisen moolimäärän kanssa synteettisiä DNA-EcoRI-adaptoreita, eristettiin uudelleen polyakryyliamidigeelillä, sijoitettiin ligaation kautta EcoRI-pilkottuun λ GT10:een, pakat-10 tiin fagihiukkasiin ja lisättiin määrää E. coli-kannassa CöOOhfl [68]. Muunnoksena tällä hetkellä tunnettuihin menettelytapoihin fosforyloitiin adaptori, joka koostui komplementaarisesta synteettisestä DNA -18-meeeristä ja -22-meeristä (5'-CCTTGACCGTAAGACATG ja 5'-15 AATTCATGTCTTACGGTCAAGG) tylpästä päästä muttei tarttuvasta EcoRl—päästä, jolloin saadaan mahdollisesti adaptorin tehokas ligaatio kaksisäikeiseen cDNA:han ilman, että tapahtuu liiallista itseligaatiota EcoRl-kohdassa. Tämä menettely korvasi tehokkaalla tavalla työläämmän menettelyn, 20 jossa ligatoidaan itsekomplementaariset EcoRI-liittäjät

EcoRl-metylaasikäsiteltyyn kaksisäikeiseen cDNA:han ja poistetaan sitten ylimääräiset liittäjäoligomeerit cDNA:n päistä pilkkomalla EcoRl:llä. Yli 3500 bp:n mittaisten cDNA-kloonien, jotka ulottuvat poly(A):sta lähimpiin 3'-25 suunnan genomikloonauksella saatuihin tekijä VIII-koetin- jaksoihin (so. eksoni A), saannon parantamiseksi käytettiin toisen säikeen cDNA:n synteesiin spesifisenä mallina synteettistä DNA-16-meeriä, joka vastaa mRNA-säikeen ekso-nissa B olevaa jaksoa.

30 D. Adenovirus-alakloonaus

Adenovirus 2 -DNA:n hankintapaikka oli Bethesda Research Laboratories (BRL). Viruksen DNA pilkottiin Hind-III:llä ja käsiteltiin elektroforeettisesti 5-%:isella polyakryyliamidigeelillä (TBE-puskuri). Hindlll B-fragmentin 35 sisältävä geelin alue [49j] otettiin irti ja DNA elektro- 32 8 6 8 8 5 eluoitiin geelistä. Fenolikloroformiuuton jälkeen DNA vä-kevöitiin saostamalla etanolilla ja kloonattiin Hindlll-pilkottuun pUC13:een [49k], jolloin saatiin plasmidi pAdHindB. Tämä HindiII-alaklooni pilkottiin HindIII:llä ja 5 Sällillä ja eristettiin fragmentti joka ulottui adenovi-ruskoordinaatista 17.1. koordinaattiin 29.9 [49j]. Tämä fragmentti kloonattiin Hindlll:llä ja Sällillä pilkottuun pUC13ieen, jolloin saatiin plasmidi pUCHS. pAdHindBistä eristettiin fragmentti Sali - XhoI, koordinaatit 25.9 -10 26.5, ja kloonattiin se pUHCHSiään ainutlaatuiseen Sali- kohtaan, jolloin saatiin pUCHSX. Tässä plasmidissa ovat uudelleenrakennettuina adenoviruksen jaksot asemasta 17.1, joka on ensimmäisessä jälki-välijaksossa, XHoI-kohtaan asemassa 26.6, joka on kolmannessa jälkieksonissa.

15 Adenoviruksen myöhempi pääpromoottori kloonattiin ottamalla talteen Hindlll C, D jä E-fragmentit (jotka liikkuvat yhdessä) akryyliamidigeeliltä, kloonaamalla ne pUC13:n HindiII-kohtaan ja etsimällä restriktioanalyysin avulla ne yhdistelmät, jotka sisältävät Hindlll C-fragmen-20 tin. Tämä alaklooni pilkottiin Sacl:llä, joka katkaisi ketjun asemassa 15.4, joka on myöhemmin pääpromoottorin 5'-päässä [49j], samoin kun pUC13:n polyliittäjän alueelta. DNA liitettiin takaisin renkaaksi, jolloin muodostui pMLP2, joka sisältää fragmentin Sacl - Hindlll (asemat 25 15.4 - 17.1) kloonattuna pUC13:n Sacl- ja HindiII-kohtiin.

E. Neomysiiniresistenssivektorin rakentaminen E. coli-transposoni 5:ssä esiintyvä neomysiinire-sistenssimarkkeri eristettiin Tn5:ä sisältävästä plasmidi-sta [49]. Neomysiiniresistenssigeenin nukleotidijakso on 30 julkaistu aiemmin [49m]. Neo-fragmentti pilkottiin Bglll:-llä, joka katkaisee ketjun kohdassa 36 bp 5'-suuntaan neo-mysiinitransferaasigeenin luennan aloituskodonista, ja käsiteltiin eksonukleaasi Bal31:llä. Fosfotransferaasigee-ni irroitettiin BamHI:llä, joka katkaisee DNA:n 342 emäs-35 paria luennan lopetuskodonin jälkeen, ja sijoitettiin 33 86 8 8 5 pBR322:een täytetyn HindiII-kohdan ja BamHI-kohdan väliin. Eräällä kloonilla, pNeoBalö:11a, oli luennan aloituskodoni 3 emäsparia 3'-suuntaan täytetystä HindiII-kohdasta (TCATCGATAAGCTCGCATG...) Tämä plasmidi pilkottiin Clalrllä 5 ja BamHIrllä, minkä jälkeen 1145 bp:n fragmentti, joka ulottuu yli fosfotransferaasigeenin, eristettiin ja sijoitettiin nisäkkään ilmentämisevektoriin pCVSVEHBS (katso infra.). Saatavassa plasmidissa, pSVENeoBalö:ssa, neomy-siinifosfotransferaasigeeni sijaitsee SV40:n aiemman pro-10 moottorin 3'-puolella ja HBV-pinta-antigeenigeenin poly- adenylaatiokohdan 5'-puolella [49n]. Vietynä nisäkäskudos-viljelmäsoluihin on tällä plasmidilla kyky saada aikaan fosfotransferaasigeenin ilmentyminen ja resistenssi amino-glykosidi G418:lle [49o].

15 F. Kudosviljelmäsolujen transfektointi BHK-21-solut (ATCC) ovat selkärankaissoluja, jotka on kasvatettu kudosviljelmässä. Näitä soluja voidaan, kuten alalla on tunnettua, pitää yllä pysyvinä solulinjoina, jotka valmistetaan tekemällä peräkkäisiä sarjasiirrostuk-20 siä eristetyistä normaalisoluista. Näitä solulinjoja pidetään yllä joko kiinteällä kantajalla nestemäisessä kasvualustassa tai kasvattamalla tukiravinteita sisältävissä suspensioissa.

Solut transfektoidaan 5 pg:lla edellä kuvatulla ta-25 valla valmistettua haluttua vektoria (4 pg pAML3P.8cl:ä ja 1 pg pSVEneoBalöra) viitteen [49p] mukaista menetelmää käyttäen.

Tällä menetelmällä varmistetaan plasmidikokoelman vuorovaikutus tietyn isäntäsolun kanssa, jolloin toden-30 näköisyys, että solun absorboidessa yhden plasmidin absorboituu myös muita plasmideja [49q], paranee. Siten on käytännössä mahdollista tuoda soluun sekä primaariset että sekundaariset koodaavat jaksot käyttäen erillisiä vektoreita kullekin samoin kuin käyttäen yhtä vektoria, joka 35 sisältää molemmat jaksot.

34 868S5 G. Transfektoitujen solujen kasvatus ja peptidien tuottaminen

Edellä kuvatulla tavalla transfektoituja BHK-soluja kasvatettiin ensin 2 vrk ei-selektiivisessä alustassa ja 5 sitten solut siirrostettiin alustaan, joka sisälsi G418:a (400 pg/ml), jolloin saatiin valituksi ne solut, joilla on kyky tuottaa plasmidi-fosfotransferaasia. Kun oli kasvatettu 7-10 vrk G418:n läsnäollessa, tuli pesäkkeistä paljain silmin nähtäviä. Useiden satojen pesäkkeiden tryp-10 siinikäsittely ja uudelleensiirrostus teki mahdolliseksi nopean kasvun, jolloin saatiin 10 cm:n maljallinen yhtenäistä G418-resistenttien solujen kasvustoa.

Tämä solupopulaatio koostuu soluista, jotka edustavat erilaisia alkuperäisiä yhteenliittymistuotteita. Jot-15 ta saataisiin soluja joissa FVIII-ilmentämisplasmidin kopioiden lukumäärä on suurin, soluja inkuboitiin seuraavak-si DHFR-proteiinin inhibiittorin läsnä ollessa.

H. Metotreksaattikäsittely

Metotreksaatti (MTX), joka on DHFR:lle spesifinen 20 inhibiittori pitoisuuksina yli 50 nM, toimii G418-resis-tenttien solujen inhibiittorina. Yhteensopivasti aiempien tutkimusten kanssa, jotka koskevat MTX:n vaikutuksia ku-dosviljelmäsoluihin, valikoituvat ne solut, jotka ovat resistenttejä MTX:lie monilukuisina kopioina esiintyvän 25 FVIII-ilmentämisplasmidin sisältämän DHFR-geenin ilmentymisen ansiosta ja samalla on havaittavissa FVIII:a koodaa-vien jaksojen ilmentymisen lisääntyminen. Lisäämällä MTX:n määrää asteettain saadaan aikaan plasmidin pAML3P.8cl amp-lifikaatio, siis kopioiden lukumäärän kasvu. Amplifikaa-30 tioasteen yläraja riippuu monista tekijöistä, joka tapauksessa tällä tavalla voidaan saada valituksi solut, jotka ovat resistenttejä mmol-luokan MTX-pitoisuuksille ja jotka sisältävät satoja tuhansia kopioita DHFR-ilmentämisplasmi-dista (ja siten FVIII-ilmentämisplasmidista).

35 86885

Tekijän VIII tuottamiseksi inkuboitiin G418-resis-tenttejä BHK-soluja, joita syntyi pAML3P.8cl:llä ja pSVEeoBalö:11a tehdyn transfektoinnin jälkeen, inkuboitiin alustoissa, jotka sisälsivät 100 ja 250 mmol/1 MTX:ä 5 viitteessä [49r] kuvatulla tavalla. 7-10 vrk:n kuluttua soluista, jotka olivat resistenttejä MTX-pitoisuudelle 250 mmol/1, tutkittiin tekijän VIII tuottaminen aktiivisuus-mittauksin, RIA-menetelmin ja mRNA-Northern-analyysillä.

I. Tekijän Vili vasta-aineet 10 Tämän työn aikana käytettiin erilaisia polyklonaa- lisia ja monoklonaalisia tekijä VIII-vasta-aineita. CC on vakavaa hemofiliaa sairastavan henkilön plasmasta peräisin oleva polyklonaalinen vasta-aine [49s]. C8 on vaikutuksen kumoava monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu tekijän 15 VIII 210 kD:n osaan [49t]. CIO on monoklonaalinen vasta-aine, jolla on samanlaiset ominaisuudet kuin C8:lla ja joka eristettiin suurin piirtein viitteessä [49t] kuvatulla tavalla. Kaupallista vaikutuksen kumoavaa monoklonaa-lista vasta-ainetta, joka sitoutuu tekijän Vili 80 kD:n 20 osaan, hankittiin yhtiöstä Synbiotic Corp., San Diego, CA., tuote n:o 10004. C7F7 on vaikutuksen kumoava monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu tekijän VIII 80 kD:n osaan. C7F7 indusoitiin ja puhdistettiin seuraavasti: 6 viikon ikäiset BALB/c-naarashiiret inokuloitiin useaan . 25 kertaan noin 10 pg:lla puhdistettua tekijää VIII ja sple-nosyytit liitettiin hiiren myeloomasoluihin X63-Ag8.653 [49u] kolmen vuorokauden kuluttua viimeisestä inokuloin-nista. Hybridisaatiomenettely ja hybridisolujen eristäminen kloonausmenetelmin noudattivat aiemmin julkaistuja oh-30 jeita [49r]. Spesifistä vasta-ainetta tuottavat kloonit tunnistettiin kiinteäfaasi-RIA-menetelmin [49w]. Positiivisista klooneista tutkittiin sitten hyytymisajan pidentä-miskyky edellä kuvatulla APTT-kokeella. Monoklonaalista C7F7:a lisättiin kasvattamalla suvullisesti lisätyissä 35 eläimissä; vasta-aine puhdistettiin vesivatsanmesteistä proteiini A - Sepharose^ Cl-4B-kromatografiällä [49x].

36 86 8 85 J. Tekijän VIII radioimmunologiset määritykset

Kehitettiin kaksi radioimmunologista koetta (RIA-menetelmää) BHK- ja muissa solulinjoissa tuotetun tekijän VIII tutkimiseksi. Molemmat ovat kaksivaiheisia kokeita, 5 joissa käytetään kiinteälle kantajalle sidottua CC-vasta-ainetta tekijän VIII sitomiseen [49t]. Tämä immuunikom-pleksi detektoidaan sitten 125I-leimatulla CIO -vasta-aineella (210 kD-spesifinen) tai 125I-leimatulla C7F7-vasta-aineella (80 kD-spesifinen).

10 Kaksivaiheiset RIA:t toteutetaan lyhyesti ilmaistu na seuraavasti: Mikromaljan 96 syvennystä peitetään yön ajaksi 100 pl:lla 50 mM NaHC03-puskuria (pH 9,6), joka sisältää 2,5 mg/1 CC-vasta-ainetta, joka on puhdistettu proteiini A Sepharose®-kromatografiällä [49x]. Syvennykset 15 pestään kolmesti 200 pl:lla PBS:ä, joka sisältää 0,05 % Tween® 20:a ja käsitellään sitten 1 - 2 h:n ajan 200 μ:11a PBS:ä, joka sisältää 0,1 % gelatiinia ja 0,01 % metiolaat-tia. Syvennykset pestään edellä kuvatulla tavalla, lisätään 100 μΐ näytettä ja inkuboidaan yön yli. Syvennykset 20 huuhdotaan, lisätään 100 μΐ 125I-leimattua [82] CIO- tai C7F7-vasta-ainetta (1000 cpm/μΐ) ja inkuboidaan 6 - 8 h. Syvennykset huuhdotaan jälleen ja tehdään laskenta. Stan-dardikäyrä määritetään normaalista plasmasta, joka laimennetaan suhteessa 1:10 - 1:320.

25 K. Tekijän VIII monoklonaalista vasta-ainetta si sältävä pylväs

Ihmisen tekijän VIII monoklonaalista vasta-ainetta sisältävä pylväs valmistettiin inkuboimalla 1,0 mg C8-vas-ta-ainetta (0,1 M NaHC03:ssa, pH 8,5) 1,0 ml:n kanssa Affi-30 Gel 10:ä (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) 4 h 4 eC:-ssa. Yli 95 % vasta-aineesta kiinnittyi geeliin Bio-Rad Protein Assay-määrityksen perusteella (Bio Rad Laboratories). Geeli pestiin 50-kertaisella tilavuudella vettä ja 10-kertaisella tilavuudella 0,05 M imidatsolia (pH 6,9), 35 joka sisälsi 0,15 mol/1 NaCl:a.

37 86 8 8 5 L. Alustojen kromatografia monoklonaalisessa pylväässä

Alustat laitettiin monoklonaalista vasta-ainetta sisältävään pylvääseen (1 ml hartsia) ja huuhdottiin 0,05 5 M imidatsolipuskurilla (pH 6,4), joka sisälsi 0,15 mol/1 NaCl:a, kunnes aallonpituudella 280 nm absorboiva materiaali huuhtoutui ulos. Kolonni eluoitiin 0,05 M imidatso-lilla (pH 6,4), joka sisälsi 1,0 mol/1 Kl:a ja 20 % ety-leeniglykolia. Näytteet laimennettiin tutkimista varten ja 10 dialysoitiin myöhemmin tehtävää analyysiä varten.

M. Tekijä VIII-fuusioproteiinin ja fuusioproteii-niantiseerumien valmistus E. colia, joka sisälsi fuusioproteiinin tuottamista lvarten rakennettuja plasmideja, kasvatettiin M-9-alustas-15 sa 37 °C:ssa. Fuusioproteiinin tuotanto indusoitiin lisäämällä indoliakryylihappoa loppupitoisuudeksi 50 pg/ml 2,5 - 4 h:n ajaksi. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja säilytettiin pakastettuina käyttöön asti.

Fuusioproteiinin 3 valmistukseen käytettävät solu-20 pelletit suspendoitiin 100 ml:aan 20mM natriumfosfaattia (pH 7,2), joka sisälsi 10 pg/ml lysotsyymiä ja 1 pg/ml sekä RNaasia että DNaasia. Suspensiota sekoitettiin 30 min huoneen lämpötilassa solupelletin dispergoimiseksi perusteellisesti. Suspensiota äänikäsiteltiin sitten 4 min (60-25 %:isella pulssivoimalla). Liuosta sentrifugoitiin nopeudella 8000 rpm Sorvali RC-2B-sentrifugissa GSA-roottoria käyttäen. Pelletti suspendoitiin uudelleen 100 ml:aan 0,02 M natriumfosfaattia (pH 7,2). Suspensio levitettiin kerrokseksi 300 ml:lie 60-%:ista glyserolia. Näytettä sentri-30 fugoitiin nopeudella 400 rpm 20 min RC-3B-sentrifugissa. Sekä pelletistä että alimmasta glyserolikerroksesta löytyi yksi odotettua molekyylipainoa (25 000 daltonia) vastaava vyöhyke analysoitaessa ne SDS-polyakryyliamidigeelillä. Pelletti liuotettiin 0,02 M natriumfosfaattipuskuriin, 35 joka sisälsi 0,1 % SDS:ä. Uudelleen suspendoitua pellettiä 38 868 85 ja alempaa glyserollkerrosta dialysoitiin 0,02 M ammonium-bikarbonaattia (pH 8,0) vastaan glyserolin poistamiseksi. Liuos kylmäkuivattiin ja liuotettiin takaisin 0,01 M nat-riumfosfaattipuskuriin, joka sisälsi 0,1 % SDS:ä, ja säi-5 lytettiin pakastettuna käyttöön asti.

Fuusioproteiinien 1 ja 4 valmistukseen käytettävät solupelletit suspendoitiin 0,05 M Tris-puskuriin (pH 7,2), joka sisälsi 0,3 mol/1 natriumkloridia ja 5 mmol/1 EDTAra. Lisättiin lysotsyymiä pitoisuudeksi 10 pg/ml. Näytteitä 10 inkuboitiin 5 min huoneen lämpötilassa. Lisättiin NP-40:ä pitoisuudeksi 0,2 % ja suspensiota inkuboitiin jäähautees-sa 30 min. Lisättiin natriumkloridia loppupitoisuudeksi 3 mol/1 ja DNaasia (1 pg/ml). Suspensiota inkuboitiin 5 min huoneen lämpötilassa. Näyte sentrifugoitiin ja superna-15 tantti heitettiin pois. Pelletti suspendoitiin takaisin pieneen tilavuuteen vettä ja sentrifugoitiin uudelleen. Solupelletit liuotettiin liuoksiin, jotka sisälsivät 0,1 -1 % SDS:ä ja puhdistettiin joko preparatiivisella SDS-po-lyakryyliamidigeelielektroforeesilla, jota seurasi fuusio-20 proteiinin elektroeluutio, tai HPLC-käsittelyllä TSK 3000-kolonnissa, joka oli tasapainotettu 0,1 M natriumfosfaa-tilla, joka sisälsi 0,1 % SDS:ä.

Kaniinin antiseerumeja tuotettiin ruiskuttamalla Uuden Seelannin valkoisiin kaniineihin fuusioproteiininäy-25 te suspendoituna Freund's complete adjuvant:iin (ensimmäinen ruiske), ja antamalla sen jälkeen tehosteruiskeet kahden viikon välein käyttäen Freund's incomplete adjuvant:-iin suspendoitua näytettä. Seerumi eristettiin 6 viikon kuluttua ja siitä tutkittiin Western-täpläanalyysillä 30 reaktiivisuus ihmisen plasmasta saatujen tekijä VIII-pro- teiinien kanssa.

N. Tutkimukset tekijän VIII aktiivisuuden tuottamisen havaitsemiseksi

Hemofilia A-plasman korjaaminen 35 Teoria 39 S 6 8 8 5

Tekijän VIII-aktiivisuus on määritelmän mukaan aktiivisuus, joka korjaa plasman, josta puuttuu tekijä VIII, hyytymishäiriön. Yksi yksikkö tekijän VIII aktiivisuutta on määritelmän mukaan 1 mlrssa normaalia ihmisen plasmaa 5 esiintyvä aktiivisuus. Koe perustuu siihen, että mitataan aika, joka kuluu näkyvän fibriinihyytymän muodostumiseen plasmassa, joka on peräisin potilaalta, jonka on todettu sairastavan hemofilia A:ta (klassista hemofiliaa). Mitä lyhyempi on hyytymän muodostumiseen kuluva aika tässä ko-10 keessa, sitä suurempi on tekijän VIII-aktiivisuus tutkittavassa näytteessä. Tästä koetyypistä käytetään lyhennettä APTT (activated partial thromboplastin time). Tällaisiin määrityksiin on saatavana kaupallisia reagensseja (esimerkiksi General Diagnostics Platelin Plus Activator; tuote 15 n:o 35503).

Kaikki hyytymiskokeet tehtiin 10 x 75 mm;n borosi-likaattilasikoeputkissa. Silikonikäsittely tehtiin käyttäen SurfaSilriä (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), joka oli laimennettu suhteessa 1:10 petrolieetterillä. 20 Koeputket täytettiin tällä liuoksella, inkuboitiin 15 s, ja liuotin poistettiin. Putket pestiin kolmesti vesijohtovedellä ja kolmesti tislatulla vedellä.

Platelin Plus Activator (General Diagnostics, Morris Plains, NJ) liuotettiin 2,5 ml:aan tislattua vettä 25 pakkauksen ohjeiden mukaisesti. Näytteen preparoimiseksi hyytymiskokeita varten Platelin Plus Activator-liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa 10 min ja säilytettiin jäähauteessa käyttöön asti. Silikonikäsiteltyyn koeputkeen lisättiin 50 μΐ Platelin Plus Activatoria ja 50 μΐ plasmaa, josta puut-30 tuu tekijä VIII (George King Biomedical Inc, Overland Park, KA). Tätä liuosta inkuboitiin 37 eC:ssa kaikkiaan 9 min. Juuri ennen edellä mainitun liuoksen 9 min:n inku-boinnin loppumista laimennettiin tutkittava näyte 0,05 M Tris-HCl:llä (pH 7,3), joka sisälsi 0,02 % naudan seerumi- 35 albumiinia. Plasmaaktivaattorisuspensioon lisättiin 50 μΐ 86885 40 laimennettua näytettä, ja kun suspensiota oli inkuboitu täsmälleen 9 min, initioitiin hyytymistapahtumaketju lisäämällä 50 μΐ kalsiumkloridiliuosta (0,033 M). Reaktio-seos sekoitettiin nopeasti ja liikutellen koeputkea varo-5 vasti mitattiin näkyvän fibriinihyytymän muodostumiseen kuluva aika. Tekijän VIII aktiivisuus-standardikäyrä voidaan mitata laimentamalla normaalia plasmaa (George King Biomedical, Inc., Overland Park, KA) suhteissa 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 ja 1:200. Piirretään puolilogaritmipaperille 10 käyrä, joka kuvaa hyytymisaikaa plasman laimennussuhteen funktiona. Tätä käyrää voidaan sitten käyttää hyytymisajan muuttamiseksi tekijän VIII aktiivisuusyksiköiksi.

O. Kromogeenisen peptidin määritys Teoriaa 15 Tekijä VIII aktivoi tekijän X tekijäksi Xa tekijän IXa, fosfolipidin ja kalsiumionien läsnäollessa. On suunniteltu hyvin spesifinen koemenettely, jossa seos sisältää tekijää IXa, tekijää X, fosfolipidiä ja kalsiumioneja. Tekijän Xa muodostuminen riippuu tässä kokeessa siten teki-20 jän VIII aktiivisuuslähteen lisäämisestä. Mitä enemmän koeseokseen lisätään tekijää VIII, sitä enemmän tekijää Xa muodostuu. Kun tekijän Xa on annettu muodostua, lisätään reaktioseokseen kromogeenista peptidisubstraattia. Tämä peptidi pilkkoutuu spesifisesti tekijän Xa vaikutuksesta, 25 siihen ei vaikuta tekijä X ja muut proteaasit pilkkovat sitä vain hitaasti. Peptidisubstraatin hajotessa vapautuu paranitriamilidiryhmä, joka absorboi aallonpituudella 405 nm, kun taas pilkkoutumaton peptidi ei absorboi tai absorboi vain vähän tällä aallonpituudella. Kromogeenisen subs-30 traatin pilkkoutumisen aiheuttama absorbanssi on riippuvainen tekijän Xa määrästä tutkittavassa seoksessa inku-bointijakson jälkeen, joka määrä puolestaan on riippuvainen funktionaalisen tekijän VIII määrästä reaktioseokseen lisätyssä tutkittavassa näytteessä. Tämä koe on erittäin 4i 86885 spesifinen tekijän VIII aktiivisuuden suhteen ja sen pitäisi olla vähemmän altis mahdollisille väärille positiivisille tuloksille kuin koe, jossa käytetään plasmaa, josta puuttuu tekijä VIII.

5 Coatest-tekijä VIII hankittiin Helena Laborato- riesrlta, Beaumont, TX (luettelo-n:o 5293). Käytetty menettely vastasi periaatteessa menettelyä, jota valmistaja suosittelee nimellä "End Point Method" näytteille, jotka sisältävät vähemmän kuin 5 % tekijää VIII. Inkubointiaiko-10 ja pidennettiin tarpeen vaatiessa kokeen herkkyyden parantamiseksi. Tietyissä kokeissa valmistajan suosittelemia reagenssitilavuuksia muutettiin. Tämä testiohjeiden muuttaminen ei vaikuta kokeessa saatuihin lopputuloksiin heikentävästi .

15 Tekijän Xa kromogeeninen substraatti (S-2222 + I- 2581) liuotettiin 10 ml:aan vettä, jolloin substraattipi-toisuudeksi tuli 2,7 mmol/1. Tämä substraattiliuos jaettiin yhtä suuriksi annoksiksi ja säilytettiin -20 9C:ssa. FlXa + FX-reagenssi sisälsi tekijää IXa ja tekijää X:ä, ja 20 se liuotettiin 10 ml:aan vettä. Tämä liuos jaettiin yhtä suuriksi annoksiksi ja säilytettiin -70 °C:ssa käyttöön asti. Testipakkaus sisälsi myös seuraavat liuokset: 0,025 M kalsiumkloridiliuos; fosfolipidi (sian aivot); ja pusku-rivarastoliuos (laimennettiin suhteessa 1 osa varasto-25 liuosta ja yhdeksän osaa vettä testiä varten, jolloin saatiin liuos, joka sisälsi 0,05 mol/1 Tris-HCl:ä (pH 7,3), ja 0,02 % naudan albumiinia). Nämä liuokset säilytettiin 4 °C:ssa käyttöön asti.

Fosfolipidi + FlXa + FX -reagenssi valmistetaan se-30 koittamalla yksi tilavuusosa fosfolipidiä viiteen tila-vuusosaan FlXa + FX -reagenssia.

Käytetty menettely oli seuraava: 86885 42

Reagenssi Näyteputki Sokea koe

Fosfolipidi + FIXa + FX 200 μΐ 200 μΐ

Tutkittava näyte 100 5 Puskurikäyttöliuos -- 100

Sekoitetaan hyvin 4 min 37 °C:ssa

Kalsiumkloridia 100 100

Sekoitetaan hyvin ja inkuboidaan täsmälleen 10 min 37 eC:ssä 10 S-2222 + 1-2581 200 200

Sekoitetaan hyvin ja inkuboidaan täsmälleen 10 min 37 °C:ssä Etikkahappoa (50-%:ista) 100 100

Sekoitetaan hyvin 15 Näytteen absorbanssi aallonpituudella 405 nm määri tettiin sokea koe-vertailunäytteenä spektofotometrisesti 30 min kuluessa.

Absorbanssi aallonpituudella 405 nm suhteutettiin tekijä VIII-yksiköiden määrään tekemällä kalibrointikäyrä 20 tavanomaista normaalia ihmisen plasmaa käyttäen (George King Biomedical, Overland Park, KS).

Esimerkki edullisesta suoritusmuodosta 1. Yleinen strategia tekijä VIII-geenin saamiseksi Yleisin menetelmä yhdistelmä-DNA-geenituotteen saa-25 miseksi on seuloa asianmukaisen kudos- tai solutyypin mRN-A:sta valmistetuista cDNA-klooneista koostuva kirjasto. Useat tekijät antoivat aiheen käyttää myös vaihtoehtoista menetelmää, jossa tutkitaan genomi-DNA:ta tekijä VIII-gee-nin löytämiseksi. Tekijän VIII-synteesin tapahtumapaikka 30 oli ensinnäkin tuntematon. Vaikka maksaa usein pidetäänkin todennäköisimpänä syntetisointipaikkana, ovat todisteet epävarmoja. Elinperfuusio- ja siirtotutkimukset ovat viitanneet maksassa ja mahdollisesti pernassa tapahtuvaan synteesiin [56]. Tekijän VIII aktiivisuus on kuitenkin 35 usein kohonnut potilailla, joilla on vakava maksavaurio 43 S 6 8 8 5 [56a]. Viimeaikaisissa tutkimuksissa, joissa käytettiin soluihin sitoutuvaa monoklonaalista vasta-ainetta, on havaittu suurimpia proteiinipitoisuuksia maksan poukamien endoteeli-[51], hepatosyytti-[52] tai imusolmukesoluissa 5 (pitoisuudet keuhkoissa, maksassa ja pernassa ovat seuraa-vaksi suurimmat [53]. Sitä vastoin tekijään VIII liittyvän antigeenin (von Willebrand-tekijän) synteesi tapahtuu miltei varmasti endoteelisoluissa [54]. Sen lisäksi että alkuperäkudos on epävarma, on tekijän VIII määrä plasmassa 10 äärimmäisen pieni. Pitoisuus verenkierrossa, noin 100 -200 ng/ml [55], on esimerkiksi noin 1/2 000 000 seerumi-albumiinin konsentraatiosta. Siten ei ollut selvää, että tietyn kudoksen RNA:sta valmistetuista cDNA-kirjestoista saataisiin tekijä VIII-klooneja.

15 Näiden seikkojen perusteella päätettiin ensin seu loa yhdistelmäkirjastoja, jotka koostuivat ihmisen geno-mista bakteriofagi lambdassa (tästedes käytetään nimitystä genomikirjastot). Vaikka genomikirjastojen pitäisi sisältää tekijä VIII-geeniä, saattaisi intronien todennäköinen 20 esiintyminen haitata lopullista ilmentymistä yhdistelmä- proteiinina. Yleinen strategia oli seuraava: 1. Identifioidaan genomiklooni, joka vastaa jotakin ihmisen tekijä VIII-proteiinin sekventoitua osaa.

2. Tehdään "genomikävely" ("genomic walk") koko ... 25 mRNA-koodausalueen sisältävien toistensa päälle ulottuvien genomikloonien saamiseksi.

3. Käytetään genomikloonifragmentteja tekijä VIII-mRNA:n kudos- tai solulähteiden identifioimiseksi tekemällä hybridisaatio RNA-täpliin ja eristetään cDNA-kloonit 30 tällaisista soluista.

4. Rinnakkain kohdan 3 kanssa saatetaan ilmentymään SV40-yhdistelmä-"eksoni-ilmentämis"plasmideihin sijoitettuja genomikloonien osia. Näistä plasmideista kudosviljelmä solujen (cos-solujen) transfektoinnin jälkeen kopioituneesta 35 RNA:sta pitäisi intronien poistua in vivo, ja se toimisi siten yhdistelmätekijä VIII-proteiinin tuottamiseen so- 86885 44 veltuvien cDNA-kloonien vaihtoehtoisena lähteenä.

Tämän yrityksen todelliseen etenemiseen liittyi cDNA-klooneista, eri tyyppisistä genomiklooneista ja SV40-yhdis-telmä-"eksoni-ilmentämis"-klooneista peräisin olevan infor-5 maation samanaikainen vuorovaikutus; näitä osatekijöitä kuvataan seuraavassa välttämättömyyden pakosta erikseen.

2. Genomikirj aston tutkimismenettelyt Tekijä VIII-geenin tiedetään sijaitsevan ihmisen X-kromosomissa [56]. Positiivisten kloonien osuuden lisäämi-10 seksi genomikirjastot muodostettiin DNArsta, joka saatiin yksilöstä, jolla oli 4 X-kromosomia. (Varhaisimusolulinjan karyotyyppi on 49,XXXXY; tästä DNAista rakennettuja kirjastoja kutsutaan tässä "4X-kirjastoiksi"). 49,XXXXY-DNA, pilkottiin osittain Sau3AI:llä ja sopivan kokoiset fraktiot 15 ligatoitiin λfagi- tai kosmidivektoriin. Jäljempänä annetaan yksityiskohtia, jotka koskevat näiden λ/4X- ja kosmi-di/4x-kirjastojen muodostamista. Tekijä VIII-geenin odotettavissa oleva esiintymistiheys on V4X-kirjastossa noin 1 kappale 110 000 kloonin joukossa ja kosmidikirjastossa noin 20 1 kappale 40 000:ssa.

Näistä kirjastoista etsittiin tekijä VIII-geeni käyttäen synteettisiä oligonukleotidikoettimia, jotka perustuivat osiin tekijä VIII-proteiinijaksosta. Näitä oligonukkeo-tidikoettimia on kahta tyyppiä, yksi 30 - 100 nukleotidin 25 jakso, joka perustuu kodonivalikoiman käyttöanalyysiin (pitkät koettimet), sekä 14 - 20 nukleotidin mittaisten koetti-mien yhdistelmä, joka vastaa kaikkia mahdollisia degeneraa-tioyhdistelmiä kullekin mahdolliselle kodonivalikoimalle (lyhyet koettimet).

30 Pitkien koettimien pääetuna on se, että ne voidaan syntetisoida proteiinin minkä tahansa 10 - 30 aminohapon jakson perusteella. Ei tarvitse löytää erityisiä alhaisen kodonirunsauden alueita. Toisena etuna on se, että koska täsmällinen yhteensopivuus geenijakson kanssa ei ole vält-35 tämätöntä (vain 10 - 14 nukleotidin mittaisia komplementaarisia osia vaaditaan), ei komplementaarisuuden katkeaminen 45 86885 intronin esiintymisen takia tai geenin polymorfismin tai proteiinin sekventointivirheen aiheuttamana välttämättä estä käyttökelpoista hybridisaatiota. Pitkien koettimien epäkohtana on se, että kullekin aminohapolle valitaan vain yksi 5 kodoni. Kodonit on valittu nisäkäskodonien esiintymistiheystaulukon [57] perusteella ja ellei täten löydetty selvää edullisuusjärjestystä, tekijä IX-geenin ko-donien käyttömäärien perusteella [58]. Koska pitkien koettimien jakson todennäköistä yhteensopivuutta ei tiedetä, hyb-10 ridisaatio-olosuhteiden ankaruus täytyy määrittää kokeellisesti kullekin koettimelle. Tämä tehtiin tekemällä hybridisaatio genomi-DNA-täpliin ja pesemällä ankaruudeltaan erilaisissa olosuhteissa.

Lyhyiden koettimien etuna on se, että jokainen mah-15 dollinen kodoni syntetisoidaan olgonukleotidien yhdistelmänä. Siten jos aminohapposekvenssi on oikea, pitäisi lyhyen koettimen hybridisoitua aina mielenkiinnon kohteena olevaan geeniin. Pääasiallisena rajoituksena on syntetisoitavissa olevan sekvenssiyhdistelmän monimutkaisuus. Käytän-20 nön työn kannalta voitaisiin 32 erilaista jaksoa pitää suurimpana mahdollisena yhdistelmän kokona, kun kiinnitetään huomio genomikirjastohybridisaatioiden häiriörajoituksiin. Tämä tarkoittaa sitä, että voidaan käyttää vain sellaisia proteiinijaksoja, joita esiintyy alhaisen kodonirunsauden ... 25 alueilla. Tyypillinen koetin olisi kuudentoista 17-meerin yhdistelmä, joka vastaa kaikkia 6 aminohapon pituisen proteiini jakson mahdollisia sekvenssejä.

Kuten pitkien koettimienkin yhteydessä, oli lyhyille koettimille käytettävien hybridisaatio-olosuhteiden anka-30 ruus määritetty kokeellisesti. Tämä johtuu siitä, että koska tavallisesti käytetyissä hybridisaatio-olosuhteissa (6 x SSC) hybridien stabiilisuus riippuu kahdesta tekijästä, pituudesta ja G-C-pitoisuudesta; olosuhteet, jotka ovat ankarat koettimelle, joissa G-C-pitoisuus on pieni, eivät ole 35 lainkaan ankarat koettimille, joissa G-C-pitoisuus on suuri. Tyypillisessä kuudentoista 17-meerin yhdistelmässä voisi G- 86885 46 C-pitoisuus olla alueella 41 - 65 %, ja nämä koettimet sulavat 6 x SSC:ssä 10 °C:n lämpötila-alueella (48 - 58 °C). Koska oikeaa jaksoa 16 jakson joukossa ei ennalta tiedetä, käytetään hybridisaatiolämpötilaa juuri alle 48 °C, jotta 5 pienimmän G-C-pitoisuuden sisältävän jakson hybridisaatio tulee mahdolliseksi. Seulottaessa suurta kloonilukumäärää täten saadaan kuitenkin monia vääriä positiivisia klooneja, joiden pituus on pienempi ja G-C-pitoisuus suurempi. Koska su1amislämpötilan muutos on 1 - 2 °C emäsparia kohden, sitou-10 tuvat niin lyhyet koetinjaksot kuin 12 tai 13 nukleotidia, jos niiden G-C-pitoisuus on suuri. Toimiessaan sattumanvaraisesti ihmisten genomissa hybridisoituu kuudentoista 17-meerin muodostama yhdistelmäkoetin 1200 kertaa niin moneen 13 emäksen jaksoon kuin 17 emäksen jaksoon.

15 Lyhyille koettimille kehitettiin hybridisaatiotek- niikka, jossa G-C ja A-T-emäsparien stabiilisuus tehdään yhtä suuriksi ja parannetaan suuresti lyhyiden koettimien käyttökelpoisuutta kirjastojen, joissa vallitsee suuri DNA-jaksojen monimutkaisuus, seulontaan.

20 Kuviossa 2A esitetään 4 lyhyen koettimen sulamisläm- pötila tavanomaisissa (6 X SSC) ja 3,0 mol/1 TMAC1 sisältävissä pesuseoksissa. 3,0 M TMACl:ssä koettimien sulamispiste on lähes lineaarisesti riippuvainen pituudesta, kun taas 6 X SSC:ssä G-C-pitoisuus vaikuttaa suuresti sulamiseen. 13-25 meerin, jonka G-C-pitoisuus on 65 %, korkea sulamislämpötila näyttää selvästi toteen tämän päätelmän. Kuviossa 2B esitetään sulamislämpötila 3,0 M TNAC1:ssä pituuden funktiona tämän vaihdellessa ll:stä tuhansiin emäksiin. Tämä kuva antaa mahdollisuuden valita nopeasti hybridisaatio-olosuhteet 30 minkä tahansa halutun mittaiselle tarkasti yhteensopivalle koettimelle.

TMACl-hybridisaatiomenettely on hyvin käyttökelpoinen aina kun halutaan tarkkaa tunnetun pituisen jakson yhteensopivuutta. Esimerkkeihin tästä menetelmästä kuuluvat: 35 (1). Ihmisen genomikirjaston tutkiminen kuudentoista 17-mee- rin yhdistelmällä. On käytetty pesua 3,0 M TMAC1:ssä 50 °C:- 47 86885 ssa, joka tekee mahdolliseksi vain 17, 16 ja harvojen 15 emäksen jaksojen hybridisaation. Lyhyempien koettimien, joiden G-C-pitoisuus on korkea, suuri lukumäärä suljetaan täten pois. (2). Jos lyhyillä koettimilla tehtävä seulonta antaa 5 liian paljon positiivisia tuloksia helposti sekventoitaviksi, voidaan todennäköisimmät ehdokkaat löytää TMAC1-sulatus-menettelyllä. Positiivisten jaksojen kaksoiskappaleet hybri-disoidaan ja pestään eri lämpötiloissa 2 °C:n välein [17-mee-reille (jotka sulavat 54 °C:ssa) voitaisiin käyttää lämpöti-10 loja 46, 48, 50, 52, 54 ja 56 °C]. Ne positiiviset jaksot, jotka sulavat korkeimmassa lämpötilassa, sopivat yhteen koettimen kanssa parhaiten. Käyttämällä standardia, jonka sekvenssi tunnetaan, voidaan homologia ennustaa ± 1 emäksen tarkkuudella tai tarkemmin 17-meerin ollessa kyseessä. (3). 15 Jos pitkällä koettimella tehtävässä seulonnassa saadaan liian monta positiivista jaksoa, voidaan samoin syntetisoida samaan proteiinijaksoon perustuva lyhyiden koettimien yhdistelmä. Koska yksi tämän yhdistelmän jäsen sisältää täydellisesti sopivan jakson, parantaisivat TMACl-sulatuskokeet par-20 häiden positiivisten ehdokkaiden valintaa. (4). Paikkaohja-tussa mutageneesissä syntetisoidaan tyypillisesti 20 emäksen mittainen oligonukleotidi, jonka keskellä on 1 tai useampia muutoksia. TMACl-pesumenettelyllä on helppo erottaa toisistaan perus- ja mutanttijohdoksista jopa 1 emäksen ero 20-25 meerin keskellä. Tämä johtuu siitä, että haluttu mutaatio sopii tarkasti yhteen koettimen kanssa. Pesuolosuhteet voidaan yksinkertaisesti määrittää kuvasta 2B. (5). Yhden tietyn geenin valinta toisiinsa läheisesti liittyvien geenien ryhmästä. Samanlaista sulatuskoetta kuin edellä kuvattu on 30 käytetty valittaessa yksi tietty geeni 100 hyvin samanlaisen jakson kokoelmasta.

3. Tekijä VIII-genomikloonin ensimmäinen eristäminen Tekijän VIII suhteen rikastetut valmisteet tehtiin ihmisen kylmäsaostustuotteesta polyelektrolyyttikromatogra-35 fian ja immuuniadsorption avulla aiemmin kuvatulla tavalla 48 86885 [79], Tämä materiaali dialysoitiin liuokseen, joka sisälsi 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS) ja 1 % ammoniumbikar-bonaattia, kylmäkuivattiin ja säilytettiin -20 °C:ssa käyttöön asti.

5 Koska tekijä VIII-valmisteet sisältävät epäpuhtauk sina muita plasman proteiineja, vaadittiin edelleenfrakti-ointia tekijän VIII puhdistamiseksi samoin kuin erilaisten polypeptidiketjujen, joiden uskotaan olevan lähtöisin tekijästä VIII, erottamiseksi. Tämä tehtiin käsittelemällä pro-10 teiini kromatografisesti Toya Soda TSK 4000 SW-koloneissa HPLC-menetelmällä SDS:n läsnäollessa. Tällainen kromatogra-fia erottelee proteiinit molekyylikoon mukaan.

Kylmäkuivattu proteiini sekoitettiin tislattuun veteen ja seokseen lisättiin 1 % SDS:ä ja 0,1 mol/1 natrium-15 fosfaattia (pH 7,5). TSK-kolonni (0,75 x 50 cm;

Alltech, Deerfield, IL) tasapainotettiin huoneen lämpötilassa liuoksella, joka sisälsi 0,1 % SDS:ä 0,1 M natrium-fosfaatissa (pH 7,0). Noin 0,15 - 0,25 ml:n näytteet ruiskutettiin sisään ja kolonni kehitettiin isokraattisesti vir-20 tausnopeudella 0,5 ml/min. Seurattiin absorptiota aallonpituudella 280 nm ja kerättiin 0,2 ml:n fraktioita. Kuviossa 15 esitetään tyypillinen eluutiokäyrä. Annokset analysoitiin natriumdodekyylisulfaattigeelielektroforeettisesti geeleillä, joissa vallitsi polyakryyliamidigradientti 5 -♦ 10 %, ja 25 tehtiin hopeavärjäys [80]. Materiaali, joka eluoitui 25 min:n kuluttua, vastasi proteiinidublettia 80 000 ja 78 000 D. Kolmesta erillisestä TSK-ajosta saadut fraktiot, jotka sisälsivät nämä proteiinit, ja jotka esitetään janalla kuviossa 15, yhdistettiin ja säilytettiin -20 °C:ssa käyttöön 30 asti.

TSK-fraktioinnista saatua puhdistettua 80 000 dalto-nin proteiinia (0,8 nmol) dialysoitiin yön yli liuosta vastaan, joka sisälsi 8 mol/1 ureaa, 0,36 mol/1 Tris-HCl:ä (pH

8,6), ja 3,3 mmol/1 etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, typpi 35 suojakaasuna. Disulfidisillat pelkistettiin lisäämällä edel- 49 8 6 8 S 5 lä mainittuun dialyysipuskuriin 10 mmol/1 ditiotreitolia. Lopputilavuus oli 1,5 ml. Kysteiinit alkyloitiin 15 pl:lla 5 M jodietikkahappoa (liuotettuna 1 M NaOH:iin). Reaktion annettiin edetä 35 min huoneen lämpötilassa pimeässä ja al-5 kyloitumisreaktio päätettiin lisäämällä ditiotreitolia lop-pupitoisuudeksi 100 mmol/1. Proteiiniliuosta dialysoitiin liuosta vastaan, joka sisälsi 8 mol/1 ureaa 0,1 M ammonium-bikarbonaatissa, 4 h. Dialyysiliuosta vaihdettiin siten, että ureapitoisuus aleni asteittain (8 M, 4 M, 2 M, 1 M ja 10 lopuksi 0,5 M urean suhteen) 24 h:n aikana. Pelkistetty, al-kyloitu 80 000 daltonin proteiini pilkottiin lisäämällä TPCK-käsiteltyä trypsiiniä (Sigma Chem. Co.) painosuhteessa 1 osa trypsiiniä 30 osaa kohden tekijä VIII-proteiinia. Pilkkoutumisen annettiin edetä 12 h 37 °C:ssa. Reaktioseos 15 säilytettiin pakastettuna käyttöön asti. Trypsiinipilkkoutu-mispeptidien HPLC-erotus tehtiin suuren erotuskyvyn Synchropak RP-P C-18-kolonnissa (0,46 x 25 cm, 10 pm) huoneen lämpötilassa Spectra-Physics 8000-kromatografilla. Ruiskutetun näytteen tilavuus oli noin 0,8 ml, ja kolonni 20 kehitettiin käyttäen asetonitriiligradienttia (1 -» 70 % 200 min:ssa) 0,1 %:isessa trifluorietikkahapossa. Seurattiin absorbanssia aallonpituuksilla 210 ja 280 nm (kuvio 16). Kukin piikki kerättiin ja säilytettiin 4 °C:ssa, kunnes tehtiin sekvenssianalyysi Beckmanin pyörivä kuppi-sekventorissa 25 tehden suora aminohappojen PTH-identifiointi. Kuviossa 16 asetonitriilipitoisuuden noin 23 % kohdalla oleva nuoli osoittaa piikin, joka sisältää peptidiä, jonka jakso on AWAYFSDVDLEK. Tätä jaksoa käytettiin muodostettaessa oli-gonukleotidikoetin 8.3 ihmisen genomikirjaston tutkimista 30 varten.

Lyhyet ja pitkät koettimet syntetisoitiin edellä esitettyjen tarkastelujen pohjalta. Toinen käytetty pitkä koetin perustui trypsiinillä pilkotun tekijän VIII 12 aminohapon fragmenttiin, AWAYFSDVDLEK. Koettimen synteesiin valittu 35 DNA-jakso oli 5 ' - CTTTTCCAGGTCAACGTCGGAGAAATAAGCCCAAGC. Tätä so 8 6 8 8 5 koetinta (josta käytetään nimitystä 8.3) testattiin ensin genomitäplä-hybridisaatioissa. Kuvio 3a esittää Southern-täpliä genomin normaalille miehen DNA:lie (IX) ja 49,XXXXY-DNArlle (4X), jotka on hybridisoitu leimatun 8.3-koettimen 5 kanssa ja pesty erilaisissa ankaruusolosuhteissa. Jopa ankarimmissa olosuhteissa (1 x SSC, 46 °C) havaittiin yksi 3,8 kb:n (EcoRI) ja 9,4 kb:n (BamHI) vyöhyke. Tämän vyöhykkeen intensiteettisuhde oli noin 1:4 lX-kaistan ja 4X-kaistan välillä, kuten oli odotettavissa X-kromosomiin liittyneeltä 10 tekijä VHI-geeniltä. Vertailukokeet olivat osoittaneet, että tunnetulla X-liittyneen geenin koettimella (tekijä IX) saatiin odotettu hybridisaatiosuhde 1:4, kun taas autosomi-selle geenille (albumiini) saatiin suhde 1:1.

Näiden genomitäplätulosten perusteella 8.3-koetinta 15 käytettiin λ/4X-kirjaston tutkimiseen. 500 000 fagia kasvatettiin viidelläkymmenellä 150 mm:n maljalla ja nitrosellu-loosasuodattimia hybridisoitiin kahtena kappaleena 32p-leima-tun 8.3-koettimen kanssa pesuolosuhteiden ollessa 1 x SSC, 37 °C (kuvio 3). Testattaessa uudelleen havaittiin 15 voimak-20 kaasti hybridisoituvaa ja 15 heikommin hybridisoituvaa kloonia. Näistä eristetyistä täplistä valmistettiin DNA, pilkottiin se restriktioendonukleaaseilla ja täplähybridisoitiin koettimen 8.3 kanssa. Monista voimakkaasti hybridisoituvista klooneista saatiin 3,8 kb:n hybridisoituva EcoRI-fragmentti, 25 joka on saman kokoinen kuin genomin täpläanalyysissä havaittu. Lisäksi kaikista voimakkaasti hybridisoituvista klooneista saatiin samanlainen 262 emäsparin Sau3AI-fragmentti hybridisoitaessa 8.3-koettimen kanssa. Sau3AI-fragmentit kloonattiin yksisäikeiseen fagivektoriin M13mp8 [86], tut-30 kittiin hybridisoimalla ja sekventoitiin dideoksimenettelyl-lä. 262 bp:n fragmentin DNA-jakso oli huomattavassa määrin homologinen 8.3-koettimen kanssa. Havaittiin 14 ja 10 bp:n pituiset jatkuvasti yhteensopivat alueet, ja kokonaishomolo-gia-aste oli 83 %. Peptidifragmentin kymmenen ensimmäistä 35 ryhmää sopivat yhteen yhdistelmäkloonien DNA-jakson perus- si 8 6 8 85 teella pääteltyjen ryhmien kanssa, ja niitä edelsi lysiini-kodoni, kuten trypsiinipilkkomistuotteelta on odotettavissa.

Kaksi viimeistä ennustettua ryhmää eivät sopineet yhteen DNA-jakson kanssa. DNA sisälsi tässä liitoskohdassa 5 kuitenkin hyvän konsensus-RNA-liitosdonorijakson [60, 61], jota pian seurasi lopetuskodoni kaikissa kolmessa mahdollisessa luentakehyksessä. Tämä viittasi siihen, että tässä asemassa on intronin alkukohta. (Tämä viite vahvistettiin jäljempänä kuvattavilla cDNA-klooneilla). Homologisesta alu-10 eesta 5'-suuntaan oli melkein 400 emäksen avoin luentakehys. Tällä alueella identifioitiin useita konsensusliitosaksep-torijaksoja. Tämän alueen DNA:n perusteella ennustetun proteiini jakson tutkiminen osoitti yhteensopivuuksia useiden muiden tekijän VIII trypsiinipilkkomisessa syntyneiden pep-15 tidifragmenttien sekvenssin kanssa. Tämä osoitti sen, että oli saatu ihmisen tekijää VIII koodaavan genomikloonin ekso-ni.

4. Genomikloonien laajennus: λ-kirjaston "genomikä- vely” 20 λ/4X-kirjestosta saatiin alunperin 8 riippumatonta tekijä VIII-genomikloonia. Nämä sisälsivät ihmisen genomin päällekkäisiä osia noin 28 kb:n matkalla. Tekijä VIII-prote-iinin arvioidun koon perusteella otaksuttiin, että koko geenin pituus olisi 100 - 200 kb, intronien pituudesta riip-25 puen. Siitä syystä päällekkäisten kloonien kokoelmaa laajennettiin "genomikävelyllä".

Tämän prosessin ensimmäisenä vaiheena oli olemassa olevien genomikloonien restriktioendonukleaasikohtien kartoitus (kuvio 4). Kloonien DNA pilkottiin joko yhdellä res-30 triktioentsyymillä tai useamman restriktioentsyymin yhdistelmillä ja karakterisoitiin geelielektroforeesin avulla (jota seurasi joissakin tapauksissa Southern-täplähybridi-saatio). EcoRI- ja BamHI-pilkkomisella saadut DNA-fragmentit alakloonattiin pUC-plasmidivektoreihin [59] mukavuuden vuok-35 si. Geenin orientaatio määritettiin restriktiokartoituksen, DNA-sekvenssianalyysin ja 8.3-koettimella tehtyjen täplähyb- 52 868 85 ridisaatioiden avulla.

Seuraavaksi lähellä 28 kb:n alueen päitä sijaitsevat yhtenä kopioina esiintyvät fragmentit identifioitiin "kävely" -koettimiksi. Kloonatun DNA:n pilkkomistuotteet hybridi-5 soitiin 32p-leimatun ihmisen koko DNA:n kanssa. Käytettäessä tätä tekniikkaa hybridisoituvat vain ne fragmentit, jotka sisältävät jaksoja, jotka toistuvat yli 50 kertaa genomissa [87, 88], Hybridisoitumattomat "kävely"-koetinfragmenttieh-dokkaat testattiin uudelleen toistuvien jaksojen suhteen 10 hybridisoimalla ne ^/4X-kirjestosta otettuihin 50 000 fa-giin.

5'-suunnassa eristettiin 1 kb:n osoitinfragmenttien tripletti Ndel:llä ja BamHI:llä pilkotustaλ120-DNA:sta (kuvio 4). Tällä koettimella tutkittiin miljoona A/4X-bakterio-15 fagia. Saadun kloonin,A 222:n, osoitettiin ulottuvan noin 13 kb 5'-suuntaan Ai20:stä (katso kuvio 4).

3'-suunnassa identifioitiin 2,5 kb:n Stul/EcoRIres-triktiofragmentti yhtenä kopiona esiintyväksi "kävely"koet-timeksi. Tutkittaessa perinpohjin^ /4X- ja sen jälkeen muita 20 λ/ihmisen genomikirjastoja ei onnistuttu löytämään laajoja klooneja. Genomialueiden aliedustus A-kirjastoissa on havaittu aiemmin [62]. Päätettiin rikastaa genomi-DNA:ta erityisesti haluttujen jaksojen suhteen ja muodostaa siitä rajoitettu bakteriofagikirjasto.

: 25 Tekemällä ihmisen genomi-DNA:n Southem-täplähybri-

disaatio 2,5 kb:n StuI/EcoRI-koettimen kanssa saatiin näkyviin 22 kb: n hybridisoituva Bcll-restriktiofragmentti. Restriktiokartoituksella osoitettiin, että tämän fragmentin kloonauksella ja talteenotolla päästäisiin laajaan genomik-30 loonien pidentymiseen 3'-suunnassa. Ihmisen 49,XXXXY-DNA

pilkottiin Bcll:llä, ja kooltaan noin 22 kb:n fraktio puhdistettiin geelielektroforeesilla. Tämä DNA ligatoitiin bak-teriofagivektorin A1059 BamHI-kohtaan ja valmistettiin kirjasto. (Aiemmin käytetty vektori, Charon 30, ei pystynyt 35 ottamaan vastaan näin suurta jaksoa). Tästä rikastetusta kirjastosta otettujen 400 000 fagin seulonnassa löytyi kuusi 8 6 δ 8 δ 53 hybridisoituvaa kloonia. Haluttu klooni, jolle annettiin nimeksi a482 ulottui 17 kb kauemmaksi 3'-suunnassa kuin alkuperäinen päällekkäisten genomikloonien ryhmämme (kuvio 4).

5. "Genomikävely": Kosmidikloonit 5 Muodostettiin uusi genomikirjasto kosmidivektorien avulla. Kosmidi [63], plasmidin ja bakteriofagin hybridi, voi ottaa vastaan 45 kb:n jakson, joka on suurin piirtein kolme kertaa enemmän kuin A/4X-DNA-kirjaston vastaanottaman jakson keskikoko. Uudelleen rakennetulla kosmidivektorilla, 10 pGcos4:llä, on seuraavat toivottavat ominaisuudet: 1. Käytettiin sellaista pBR322:n tetrasykliiniresis-tenssigeenin johdosta, joka ei sisältänyt BamHI-kohtaa. Tämä teki mahdolliseksi BamHI-kohdan sijoittamisen muualle plasmidiin ja sen käytön kloonauskohtana. Tetrasykliinire- 15 sistenssiä on jonkin verran helpompi käyttää kuin tavallisemmin käytettyä ampisilliiniresistenssiä lääkeaineen suuremman pysyvyyden ansiosta.

2. pBR322:n 641 emäksen Aval/PvuII-fragmentti korvattiin cos-kohdan sisältävällä λ :n 403 emäksen HincII-frag- 20 mentilla, niin että plasmidin kopiomäärää voitiin suurentaa ja pBR322-jaksot, jotka häiritsevät eukariottisten solujen transformointia [75], poistuivat.

3. pGcos4-vektoriin sisällytettiin dihydrofolaatti-reduktaasi-mutanttigeeni, jossa on SV40:n kahdentumisen ‘25 aloituskohta ja promoottori. Tällä tavalla tässä vektorissa kloonattuja mitä tahansa fragmentteja voitiin sitten lisätä monenlaisissa eukarioottisoluissa. Odotettiin, että tämä voisi osoittautua hyödylliseksi ilmennettäessä suuria geno-mi-DNA-fragmentteja niiden luonnollisten promoottorien avul- 30 la.

4. pBR322:n EcoRI-kohtaan kloonattiin synteettinen 20-meeri, joka sisälsi restriktiokohdat EcoRI, PvuI,

BamHI, PvuI ja EcoRI, kloonauskohdaksi. Ainutkertaista BamHI-kohtaa käytetään kloonattaessa genomi-DNA:n 35-45 em- 35 äksen Sau3Al-fragmentteja. Reunoissa olevia EcoRI-kohtia 54 86885 voidaan käyttää sijoitettavan jakson EcoRI-fragmenttien ala-kloonaukseen. Pvul-kohtia voidaan useimmissa tapauksissa käyttää koko sijoitetun jakson poistamiseen. PvuI-kohdat ovat hyvin harvinaisia eukarioottien DNArssa ja niitä otak-5 sutaan esiintyvän vain kerran 134 000 emäksen matkalla ihmisen DNA:n dinukleotidien esiintymistaajuuksien perusteella.

Kuviossa 5 on kosmidivektorin, pGcos4:n, rakentamista kuvaava kaavio. Tässä vektorissa kloonattiin 49,XXXXY-DNA:n 35-45 kb:n Sau3AI-fragmentteja. Noin 10 150 000 yhdistelmää tutkittiin rinnakkaismäärityksinä λ222:η 5'-pään 2,4 kb:n EcoRI/BamHI-fragmenteilla ja λ482:η 3'-pään 1 kb:n EcoRI/BamHI-fragmentilla, jotka olivat yhtenä kopioina esiintyviä, olemassa olevan genomialueen päiden läheltä identifioituja koettimia. Eristettiin ja kartoitettiin neljä 15 positiivista kosmidikloonia. Kuvio 4 sisältää kosmidit p541, p542 ja p543. Tämän tutkimuksen perusteella nämä kosmidik-loonit laajensivat tekijä Vlll-genomialuetta kaikkiaan 114 kb:ksi. Sen jälkeen tehty tutkiminen cDNA-klooneilla johti lukuisien eksonien identifiointiin olemassa olevasta osit-20 tain päällekkäisten genomikloonien ryhmästä, mutta osoitti, että "genomikävely" ei ollut vielä loppuun suoritettu. Sitä jatkettiin kumpaankin suuntaan.

3'-pään "kävely"-koetin valmistettiin p542:n 1,1 kb:n BamHI/EcoRI-fragmentista (kuvio 4). Tällä koettimella ha-25 valttiin osittain päällekkäinen kosmidiklooni p613, joka ulottuu noin 35 kb kauemmaksi 3'-suuntaan. Myöhemmin saatiin koko tekijän VIII viestijakso cDNA-kloonauksella (katso jäljempänä). Kun 1,9 kb:n EcoRI-cDNA-fragmentti, joka sisälsi cDNA:n 3'-terminaalisen osan, hybridoitiin ihmisen 30 genomi-DNA:n ja kosmidikloonatun DNA:n Southern-täpliin, se identifioi yhden 4,9 kb:n EcoRI-vyöhykkeen ja 5,7, 3,2 ja 0,2 kb:n BamHI-vyöhykkeet sekä kloonaamattomassa (genomin) että p613-DNA:ssa. Tämä osoitti sen, että geenin 3'-päätä ei ollut saavutettu, kuten myöhemmin todistettiin DNA-sekvens-35 sianalyysillä.

55 86 8 85 5'-pään "kävely"-koetin valmistettiin p543:n 0,9 kb:n EcoRI/BamHI-fragmentista. Sillä havaittiin osittain päällekkäinen kosmidiklooni p612, joka hieman pidensi päällekkäistä aluetta. Kauimpana 5'-päässä olevat genomikloonit saatiin 5 tutkimalla kosmidi/4X- ja λ/4X-kirjastot cDNA-peräisillä koettimilla. Kuten kuviosta 4 ilmenee, 599, 605 ja p624 täydentävät yhdistelmäklooniryhmän, joka ulottuu yli tekijä VIII-geenin. (Nämä kloonit ovat osittain päällekkäisiä ja sisältävät ihmisen genomin tämän alueen kaiken DNA:n poik-10 keuksena 8,4 kb:n aukko p624:n ja 599:n välissä, joka koostuu kokonaan introni-DNA:sta). Geeni ulottuu kaikkiaan 200 kb:n matkalle ihmisen X-kromosomissa. Tämä on ylivoimaisesti suurin tähän mennessä raportoiduista geeneistä. Noin 95 % tästä geenistä koostuu introneista, jotka täytyy asianmukai-15 sella tavalla käsitellä, jotta saataisiin malli-mRNA tekijä VIII-proteiinin syntesiä varten.

λ-kloonissa ja kosmidiyhdistelmäkloonissa oleva tekijä VIII-geenialueen eristäminen ei riitä käyttökelpoisen tuotteen, tekijä VIII-proteiinin, tuottamiseksi. Monilla eri 20 tavoilla pyrittiin identifioimaan ja karakterisoimaan geenin proteiinia koodaavat jaksot (eksonit), jotta loppujen lopuksi saataisiin rakennetuksi yhdistelmäilmentämisplasmidi, jolla on kyky ohjata aktiivisen tekijä VIII-proteiinin synteesiä transfektoiduissa mikro-organismeissa tai kudosvil-25 jelmäsoluissa. Oleellisesti hyödyllisiä tuloksia ei saavutettu kahdella seuraavalla lähestymistavalla; proteiinin sekventoinnin perusteella saatujen uusien oligonukleotidi-koettimien avulla tehtävällä genomikloonien tutkimisella edelleen ja genomikloonien valittujen fragmenttien käytöllä 30 koettimina RNA-täplähybridisaatioihin. Tekijä VIII-proteii-nia koodaavat alueet eristettiin kuitenkin käyttämällä SV40-"eksoni-ilmentämis"-vektoreita ja viime kädessä cDNA-kloo-nauksella.

6. SV40-eksoni-ilmentämisvektorit .35 On erittäin epätodennäköistä, että useiden satojen 56 86 8 35 kiloemästen pituinen genomialue voitaisiin täydellisesti karakterisoida DNA-sekvenssianalyysin avulla tai käyttää sitä suoraan syntetisoitaessa käyttökelpoisia määriä tekijä VIII-proteiinia. Noin 95 % ihmisen tekijä VHI-geenistä koo-5 stuu introneista (välijaksoista), jotka täytyy poistaa joko teknisin keinoin tai eukaryootin RNA-liittämiskoneiston avulla ennen kuin proteiinia voitaisiin tuottaa. Kehitettiin menettely intronien poistamiseksi epätäydellisesti karakterisoiduista genomikloonien restriktiofragmenteista käyttä-10 mällä välineitä, joista käytämme nimitystä SV40-ilmentämis-vektorit. Yleisesti ilmaistuna menettely on se, että sijoitetaan genomi-DNA:n fragmentteja plasmideihin, jotka sisältävät SV40-promoottorin, ja tuotetaan merkittäviä määriä yhdistelmä-RNA:ta, joka olisi käsiteltävissä transfektoi-15 duissa apinan cos-soluissa. Saatu RNA, josta intronit jaksot puuttuvat, voidaan analysoida suoraan tai se voi toimia materiaalina cDNA-kloonauksessa. Ainakin teoriassa tällä menetelmällä voitaisiin rakentaa kokonaisuudessaan tekijä VIII-geenin versio, josta intronit on poistettu.

20 Ensimmäisissä eksoni-ilmentämisrakenteissa käytet tiin olemassa olevia SV40-CDNA -vektoreita, jota tuottivat hepatiittipinta-antigeenigeeniä [73]. Näihin vektoreihin kloonatuista genomin tekijä VHI-fragmenteista ei kuitenkaan saatu havaittavissa olevaa tekijää VIII-RNA:ta täplä-25 hybridisaatiomenetelmällä analysoitaessa. Otaksuttiin, että vaikeutena voisi olla se, että näiden rakentamisten aikana cDNA-vektorien eksonialueet olivat liittyneet tekijä VIII-geenin intronialueisiin. Näiden ongelmien kiertämiseksi muodostettiin kuviossa 6 esitetty eksoni-ilmentämisvektori 30 pESVDA. Tämä vektori sisältää SV40:n aiemman promoottorin, adenovirus II:n myöhemmän ensimmäisen tärkeimmän liitosdono-rikohdan, intronijaksot, joihin genomin tekijä VIII-frag-mentit voitiin kloonata, ja niiden jälkeen adenovirus II Elb:n liitosakseptorikohdan ja hepatiitti B-viruksen pinta-35 antigeenin 3'-pään jaksot, joille ei tehdä luentaa, sekä polyadenylaatiojaksot [49j].

57 86885

Aluksi kloonattiin λ114:n 9,4 kb:n BamHI-fragmentti ja 12,7 kb:n Sstl-fragmentti pESVDAin intronialueessa (katso kuvio 6). Näiden kahden rakenteen cos-soluihin transfek-toituina syntetisoiman RNA:n Northern-täpläanalyysi esite-5 tään kuviossa 7. 9,4 kb:n BamHI-fragmentin sisältävällä rakenteella löydetään noin 1,8 kb:n hybridisoituva RNA-vyöhy-ke, joka toimii koettimena eksoni A:lie ja hepatiittigeenin 3’-pään jaksolle, jolle ei tehdä luentaa. Mahdollisia uusia tekijä VHI-eksoneita vastaavan RNA:n tutkimiseksi A114:n 10 2,0 kb:n StuI/BamHI-fragmentti, eksoni A:n 3'-puolelta, hyb- ridisoitiin rinnakkaisella kaistalla. Myös tällä koettimella esiintyi 1,8 kb:n RNA-vyöhyke, joka osoittaa vielä uusien tekijä VIII-eksonien esiintymisen tällä alueella. Kukin näistä kolmesta koettimesta hybridisoitui myös RNA-vyöhykkee-15 seen, joka saatiin 12,7 kb:n Sstl-genomifragmentin sisältävästä rakenteesta. Tämän RNA-vyöhykkeen koko oli noin 2,1 kb. Tämä havainto viittasi siihen, että tämä rakenne sisälsi lisäksi 200 - 300 bp:n verran eksonijaksoja 3'-suuntaan BamHI-kohdasta, joka rajoittaa 9,4 kb:n BamHI-fragmenttia. 20 Vertailukokeet osoittivat, että tällä systeemillä on kyky liittää oikealla tavalla yhteen tunnetut eksonijaksot. Hiiren dhfr:n 3,2 kb:n HindiII-genomifragmentti, joka ulottuu eksonien III ja IV yli, kloonattiin pESVDA:ssa. Hiiren dhfr-koettimella havaittiin 1 kb: n RNA-vyöhyke. Tämä on ·· 25 odotettavissa oleva koko, kun eksonit ovat oikein yhteen liittyneinä. Rakenteet, jotka sisältävät tekijän VIII 9,4 kb:n BamHI-fragmentin tai 3,2 kb dhfr-genomifragmentin päinvastaiseen suuntaan orientoituneena, eivät antaneet havaittavissa olevia RNA-vyöhykkeitä millään koettimista (kuvio 30 7).

12,7 kb:n SstI-rakennetta vastaavan RNA:n cDNA-kopio kloonattiin pBR322:ssa ja tutkittiin. Löydettiin yksi lähes täysmittainen (1 700 bp) cDNA-klooni (S36). Kuviossa 8 esitetään 950 bp:n Sstl-fragmentti, joka sisältää koko vekto-; 35 riin sijoitetun tekijä VIII-jakson ja osan pESVDa-vektoria 58 86885 sen kummallakin puolella. Jakso alkaa ja loppuu adenovirus-liitosdonori ja -akseptorijaksoilla, kuten oli odotettavissa. Näiden välissä on 888 bp tekijä VIII-jaksoa ekoni A mukaan luettuna. Eksonia A edeltävät 154 bp ja sen jäljessä 5 olevat 568 bp sisältävät useita tekijä VIII 80 K-trypsiini-pilkkomisfragmentteja, minkä varmistaa sen että nämä ovat äsken identifioituja eksoneita. Näitä eksoneita vastaavan genomialueen sekvenssit osoittivat, että yksi eksoni (C) sisältää 154 bp 5'-suuntaan eksonista A, ja että eksonista 10 3'-suuntaan oleva alue koostuu kolmesta eksonista (eksoneis- ta D, E ja I), joiden pituudet ovat 229, 183 ja 156 bp. Kutakin näistä eksoneista rajoittaa järkevä liitosdonori- ja akseptorikohta [60, 61].

Myöhemmin tehty S36-eksoni-ilmentämis-cDNA:n vertaa-15 minen tekijä VIII-solulinja-cDNA-klooneihin osoitti, että koko S36:n tekijä VIII-jakso, josta intronit puuttuvat, muodostuu tekijä VIII-eksoneista. Se sisälsi odotetusti eksonit C, A, D, E ja I. C,A-liittymiskohdasta puuttui kuitenkin 47 bp:n pituinen osa eksoni A:ta, ja eksonit F, G ja H olivat 20 jääneet kokonaan pois. Tällaisen virheellisen RNA-käsittelyn seurauksena olevat luentakehyssiirrot osoittivat, ettei jakso voinut täsmällisesti vastata tekijä VIII-jaksoa. C,A-liittymiskohdassa käytettiin hyväksi hyvää konsensus-liitoskohtaa autenttisen kohdan sijasta. S36-kloonin erilainen 25 liittyminen autenttiseen tekijän VIII transkriptiotuottee-seen verrattuna voi johtua siitä, että vain osa RNA:n primaarisesta transkriptiotuotteesta ilmentyi cossolurakentees-sa. Vaihtoehtoisesti voi tämän eron aiheuttaa solutyyppi-tai lajivaihtelu.

/ 30 7. cDNA-kloonaus a. Tekijä VIII-mRNA:ta tuottavan solulinjan identifiointi RNA-lähteen identifioimiseksi tekijä VIII-cDNA-kloo-nien eristämistä varten eristettiin polyadenyloitua RNA:ta 35 lukuisista ihmissolulinjoista ja kudoksista ja tutkittiin 59 8 6 8 8 5

Northern-täplähybridisaatiomenetelmällä 120:n eksoni A-alueelta erotetulla 189 bp:n StuI-HincII-fragmentilla. Ihmisen T-soluhybridoman CH-2 poly(A)*-RNA:ssa esiintyi hybridi-soituva RNA-laji. Hybridisoituvan RNA:n kooksi arvioitiin 5 noin 10 kb. Tämä on sen kokoinen mRNA, jonka odotetaan koo-daavan noin 300 kD:n proteiinia. Vertaamalla vertailu-DNA-hajatäplähybridisaatioihin [66] määritettiin tämän RNA:n määräksi 0,0001 - 0,001 % solun koko poly(A)+-RNA:sta CH-2-solulinjassa. Tämä viittasi siihen, että tekijä VIlI-cDNA-10 jaksojen eristäminen tästä lähteestä vaatisi spesifisten jaksojen lisärikastusta tai muussa tapauksessa äärimmäisen suurten cDNA-kloonilukumäärien seulomista.

b. Spesifisten mallien avulla valmistetut cDNA-kloo- nit 15 Tekijä VIII-genomikloonien DNA-sekvenssianalyysi antoi mahdollisuuden syntetisoida 16 emäksen oligonukleo-tideja, jotka toimivat spesifisinä malleina cDNA:n ensimmäisen säikeen synteesissä. Normaalisti cDNA-synteesissä käytetään mayIina mRNA:n poly(A)-päissä olevaa oligo(dT):tä. 20 Spesifisillä malleilla on kaksi etua oligo(dT):hen nähden. Ensinnäkin, niiden avulla voidaan rikastaa cDNA-populaatiota tekijän VIII suhteen. Toiseksi tällä menetelmällä sijoitetaan cDNA-kloonit niihin geenin alueisiin, joille hybridi-' saatiokoettimia on valmiina. Tämä on erityisen tärkeää kloo- • 25 nattaessa tällaista suurta geeniä. Koska cDNA-kloonit ovat harvoin pidempiä kuin 1 000 -2 000 bp, olisivat oligo(dT)-mallina valmistetut kloonit tavallisesti mahdottomia havaita useimmista tekijä VIII-geenin alueista valmistetulla koetti-mella. Käytetty strategia oli käyttää alkuperäisestä eksoni 30 A-alueesta saatuja DNA-fragmentteja ja sekvenssitietoa spe-. . sifisisten mallien avulla valmistettujen cDNA-kloonien saa miseksi. Edettiin valmistamalla ryhmä päällekkäisiä 5'-suunnan cDNA-klooneja aiemman sukupolven cDNA-kloonien karakterisoinnin perusteella. Enemmän 3'-alueella esiintyvän cDNA:n 35 saamiseksi käytettiin 3'-eksoneista peräisin olevia cDNA- ja genomikloonifragmentteja oligo(dT):tä mallina käyttäen vai-

60 8 6 8 8S

mistettujen cDNA-kloonien detektointiin. Tämän työn aikana käytettiin usean tyyppisiä cDNA-kloonausmenettelyjä, joita kuvataan jäljempänä.

Alkuperäinen spesifinen cDNA-malli, 5'-5 CAGGTCAACATCAGAG (malli 1". katso kuvio 9) syntetisoitiin eksoni A-jakson 16 3'-terminaalisen ryhmän käänteiskomple-menttijaksona. C-päinen cDNA syntetisoitiin 5 pg:sta CH-2-solun poly(A)*-RNA:ta mallin 1 avulla, ja liitettiin G-päi-seen pBR322:een viitteessä [67] yleisesti esitetyllä taval-10 la. Noin 100 000 saatua E. coli-transformanttia siirrostet-tiin 100:lie 150 mm:n maljalle ja tutkittiin tekemällä hybridisaatio [48] genomikloonin A120 eksoni A-alueen 189 bp:n StuI/HincII-fragmentin kanssa (kuvio 4). Yksi bona fide hyb-ridisoituva klooni ("pl.ll") otettiin talteen (kuvio 9). 15 pl.ll:n DNA-sekvenssianalyysi osoitti identtisyyden tekijä VIII-genomikloonien kanssa, pl.ll:n sisällä oleva 447 bp:n cDNA-jakso sisälsi genomin eksonin A 104 ensimmäistä emästä (toisen säikeen synteesi ei ilmeisesti ulottunut takaisin malliin asti) ja jatkui jaksona, jonka myöhemmin osoitettiin 20 muodostuvan eksoneista B ja C. 5'-pään eroamiskohtaa eksoni A:sta reunusti tyypillinen RNA-liitosakseptorikohta [61].

Vaikka mahdollisuudet saada tekijä Vlll-cDNA-kloo-neja CH-2-solulinjasta oli nyt näytetty toteen, tehtiin vielä parannuksia. Tehtiin monen tyyppisiä yrityksiä CH-2-RNA:n 25 rikastamiseksi edelleen tekijä VIII-viestin suhteen. Menestyksellinen toimintatapa oli yhdistää spesifisen mallin avulla tehtävä ensimmäisen säikeen cDNA-synteesi saadun yk-sisäikeisen cDNA:n hybridivalintaan. Käytettiin mallia 1 ja 200 pg poly(A)+-CH-2-RNA:ta yksisäikeisen cDNA:n syntetisoi-30 miseen. Sen sijaan, että olisi käytetty DNA-polymeraasia tämän muuttamiseksi kaksisäikeiseksi DNA:ksi, hybridisoitiin yksisäikeiden DNA 2 pg:aan 189 bp:n StuI/HincII-genomifrag-mentti-DNA:ta, joka oli immobilisoitu aktivoidulle ABM-sel-luloosapaperille (Schleicher and Schuell "Transa-Bind"; kat-35 so [48]). Vaikka hybridivalinnan kohteena on tavallisesti RNA, tätä menettelyä käytettiin cDNA-synteesin jälkeen har- 61 86385 vinaisten, suurten ja suhteellisen labiilien tekijä VIII-RNA-molekyylien lisäkäsittelyn välttämiseksi. Materiaali muutettiin eluoinnin jälkeen kaksisäikeiseksi DNAiksi, lajiteltiin koon mukaan, ja 0,5 ng talteen otettua DNA:ta va-5 rustettiin C-päillä ja kloonattiin pBR322:een edellä kuvatulla tavalla. Saatiin noin 12 000 yhdistelmäkloonia, jotka tutkittiin tekemällä hybridisaatio aiemmasta cDNA-kloonista pl.ll peräisin olevan 364 pb:n Sau3A/StuI-fragmentin kanssa. Koetinfragmentti valittiin siten, ettei se osu päällekkäin 10 hybridivalintaan käytetyn DNA:n kanssa. Siten vältyttiin identifioimasta vääriä yhdistelmiä, jotka sisältävät jonkin verran Stul/Hindi-DNA-fragmenttia, jota väistämättömästi vapautuu DBM-selluloosasta. Saatiin 29 hybridisoituvaa pesäkettä. Tämä merkitsee haluttujen kloonien noin 250-kertais-15 ta rikastumista aiempaan menettelyyn nähden.

Kukin 20 uudesta yhdistelmästä karakterisoitiin restriktiokartoituksella ja kaksi pisintä (p3.12 ja 03.48; kuvio 9) sekventoitiin. Nämä cDNA-kloonit ulottuivat noin 1500 bp kauemmaksi 5'-suunnassa kuin pl.ll. cDNA- ja genomikloo-20 nien samanaikainen kartoitus ja sekventointi osoitti epätavallisen laajan eksonin (eksoni B, kuvio 4), joka sisälsi p3.12:n ja p3.48:n, läsnäolon. Genomikloonin λ222 DNA-sek-venssianalyysiä jatkettiin tämän eksonin laajuuden määrittämiseksi. Eksoni B-alue sisälsi noin 3 kb:n pituisen avoimen 25 luentakehyksen. Syntetisoitiin tämän laajan eksonin sekvenssin kanssa yhteensopivat 16-meerimallit 2 ja 3 siinä toivossa, että saataisiin aikaan huomattava laajeneminen cDNA-kloonauksessa.

Tässä vaiheessa osoitettiin, että voitiin käyttää 30 bakteriofagiin perustuvaa cDNA-kloonausjärjestelmää, mikä . . teki mahdolliseksi valtavien cDNA-kloonimäärien tuotannon ja tutkimisen ilman etukäteen tehtävää rikastusta hybridiva-linnan avulla, λ GT10 [68] on fagin johdos, jolla on yksi EcoRI-restriktiokohta respressorigeenissään. Jos kaksisäi-35 keisten cDNA-fragmenttien päissä on EcoRI-kohdat, ne voidaan ligatoida tähän ainutlaatuiseen kohtaan. Vieraan DNA:n si- 62 B 6 a 8 5 joittaminen tähän kohtaan tekee fagista repressori miinus-tyyppisen, jolloin muodostuu kirkas täplä. AGT10, johon ei ole lisätty vieraita jaksoja, muodostaa sameita täpliä, jotka ovat siten erotettavissa yhdistelmistä. Fagien käytölle 5 ominaisen suuren transformointitehon lisäksi ovat λ-cDNA-täplät helpoimpia tutkia tiheyden ollessa suuri kuin baktee-ripesäkkeet.

Kaksisäikeinen cDNA valmistettiin edellä kuvatulla tavalla käyttäen mallia 3, 5'-AACTCTGTTGCTGCAG (joka sijait-10 see noin 5000 bp eteenpäin eksonin B otaksutusta 5’-päästä). Tylppäpäiseen cDNAthan liitettiin EcoRI-"adaptorit". Adapto-rit koostuivat komplementaarisista synteettisistä 18-meeris-tä ja 22-meeristä, joiden jaksot olivat 5'-CCTTGACCGTAAGACATG ja 5'-AATTCATGTCTTACGGTCAAGG. 18-meerin 15 5'-pää fosforyloitiin, kun taas 22-meerin 5'-päässä säilyi alkuperäinen 5'-0H-ryhmä. Liitettäessä cDNA:hän adaptorit muodostavat siten päissä olevia EcoRI-kohtia, jotka eivät voi ligatoitua itsensä kanssa. Tämä tekee mahdolliseksi välttää cDNA:n EcoRI-metyloinnin ja sitä seuraavan EcoRI-pilk-20 komisen, joka seuraa liittäjän avulla tehtävää ligaatiota muissa julkaistuissa menettelyissä [83]. Kun oli tehty eristys geeliltä cDNA:n valitsemiseksi koon mukaan ja reagoimattomien adaptorien poistamiseksi, liitettiin toisiinsa yhtä suuret moolimäärät tätä cDNA:ta ja EcoRI-pilkottua AGTIOrä, 25 pakattiin E. coli c600hfl:ään ja tehtiin siirrostus. 1 pg:-sta poly( A)+-RNA: ta saadut noin 3 000 000 kloonia siirrostet-tiin 50:lie 150 mm:n petrimaljalle ja tutkittiin hybridisoi-malla eksonin B 5'-päästä saadun 300 bp:n Hinfl-fragmentin kanssa. Identifioitiin 46 positiivista kaksoiskappaletta ja 30 analysoitiin ne pilkkomalla EcoRI:11a. Useiden sijoitettujen cDNA-jaksojen havaittiin ulottuvan noin 2500 bp 5'-suuntaan mallista 3. Nämä pitkät kloonit analysoitiin DNA-sekvetoin-nilla. λ 13.2:n ja λ 13.27:n 5'-päiden sekvenssit esitetään kuviossa 10. Niillä oli monia sellaisia piirteitä, jotka .35 osoittivat, että oli saavutettu tekijää VIII koodaavan alueen 5'-pää. Ensimmäiset 109 bp sisälsivät lopetuskodonit 63 86 8 85 kaikissa mahdollisissa luentakehyksissä. Sitten oli ATG-tri-pletti, jota seurasi avoin luentakehys λ 13.2reen sijoitetun cDNArn lopuille 2724 emäsparille. Aloituskodonia ATG seu-raavan jakson luenta antaa tulokseksi 19 aminohapon jakson, 5 joka on tyypillinen erittyneen proteiini "esi-" eli "pre-"jaksolle [69]. Sen silmiin pistäviä piirteitä ovat kaksi varauksellista ryhmää, jotka rajoittavat 10 aminohaposta koostuvaa hydrofobista ydintä. Tätä oletettua esijaksoa seuraa alue, joka vastaa aminoterminaalisia ryhmiä, jotka saa-10 daan tekemällä proteiinisekvenssianalyysi 210 ja 95 kDrn jaksoille, jotka saadaan pilkkomalla tekijä VIII trombiinil-la.

c. Oligo(dT) mallina valmistetut cDNA-kloonit Vielä monta tuhatta tekijä VIII-mRNArn 3'-pään 15 emästä oli muuttamatta cDNArksi. Päätettiin käyttää kään-teiskopiointimallina oligo(dT):tä ja etsiä niitä cDNA-kloo-neja, jotka sisälsivät mRNArn 3' -poly(A)+ hännät. Yritettäessä rikastaa klooneja ja parantaa toisen säikeen DNA-syn-teesin tehoa, korvattiin vakiintuneet menettelyt kuitenkin 20 käyttämällä spesifistä mallia toisen säikeen cDNA-syntee-siin. Syntetisoitiin 16-meerimalli 4, 5'-TATTGCTGCAGTGGAG, joka edustaa viestiä vastaavaa jaksoa Pstl-kohdassa noin 400 bp eteenpäin eksonin A 3’-päästä (kuvio 9). mRNA käänteisko-pioitiin oligo(dT):tä mallina käyttäen, lisättiin malli 4 • 25 DNA-polymeraasin avulla toisen säikeen synteesiä varten ja liitettiin sitten EcoRI-adaptorilla varustettuun GTlOreen edellä kuvatulla tavalla. 3 000 000 täplää tutkittiin 419 bprn Pstl/HincII-fragmentilla, joka sijaitsee p3.12:ssa mallin 4 jälkeen. Neljästä talteenotetusta kloonista valmistet-30 tiin DNA-preparaatit. DNA:t pilkottiin, kartoitettiin ja täplähybridisoitiin fragmenttien kanssa, joiden sijaintikoh-ta oli vielä kauempana eteenpäin ja jotka oli identifioitu eksoneiksi edellä kuvattuja SV40-eksoni-ilmentämisplasmideja käyttäen. Kolme neljästä yhdistelmästä hybridisoitui. Pisin 35 niistä AIO.44, oli noin 1 800 emäsparin mittainen. Al0.44:n DNA-sekvenssi osoitti, että toisen säikeen synteesi todella 64 8 6 3 3 5 alkoi mallin 4 kohdalta. Se sisälsi kaikkien SV40-eksoni-ilmentämiskloonista S36 löydettyjen eksonijaksojen lisäksi muita eksoneja. λ 10.44:n avoin luentakehys jatkui kuitenkin cDNA:n päähän asti. Lukematonta 3'-suunnan aluetta ei löy-5 detty, eikä myöskään poly(A)-häntää. Toisen säikeen synteesi ei ollut oletettavasti mennyt loppuun.

Koko 3'-pään sisältävien kloonien löytämiseksi tutkittiin uudelleen samat suodattimet Aio.44:n leimatulla DNA-11a. Otettiin talteen ja kartoitettiin vielä 24 kloonia ja 10 sekventoitiin kaksi pisintä (Ä10.3 ja λΐθ.9.2). Ne sisälsivät miltei identtiset jaksot, jotka peittivät osittain AIO.44:n ja ulottuivat noin 1900 emäsparia kauemmaksi 3'-suuntaan. 51 emäsparin päässä AIO.44:n päästä DNA-jaksossa oli luennan lopetuskodoni TGA, jota seurasi ilmeisesti luke-15 maton 1 805 emäsparin 3'-alue. Tämän alueen diagnostisina piirteinä ovat kaikkiin kolmeen luentakehykseen jakautuneet lopetuskodonit ja poly(A)-signaalijakso, AATAAA [89], Jota seurasi 15 emäksen päässä poly(A)-jatke cDNA:n päässä (klooni AIO.3 sisältää 8 A:ta, joita seuraa EcoRI-adapteri tässä 20 kohdassa, kun taas λιο.9.2. sisältää yli 100 A:ta 3'-päässään).

d. Täydellinen cDNA-jakso

Osittain päällekkäisten kloonien mudoostama täydellinen jakso esitetään kuviossa 10. Se koostuu jatkuvasta • 25 avoimesta luentakehyksestä, joka koodaa 2 351 aminohappoa.

Kun otetaan huomioon oletettu päätesignaalipeptidi 19 aminohapon, olisi "valmiissa" proteiinissa siten 2 332 aminohappoa. Tälle proteiinille laskettu molekyylipaino on noin 267 000 daltöniä. Kun otetaan huomioon mahdollinen glyko-30 sylaatio, tämä vastaa suunnilleen luontaisen proteiinin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla määritettyä molekyy-lipainoa.

cDNA:n "kokopituus", noin 9000 emäsparia (riippuen 3'-poly(A):n pituudesta) sopii yhteen Northern-täplähybri-35 disaatiolla määritetyn mRNA:n arvioidun pituuden kanssa. 5'-alue (aminopäätä koodaava) vastasi oleellisesti tekijän VIII

65 86885 210 kO:n peptidijaksoa ja 3'-alue (karbokyylipäätä koodaava) vastasi oleellisesti 80 kD:n proteiinin peptidijaksoa.

8. Yhdistelmätekijän VIII tuottaminen a. Täysimittaisen kloonin rakentaminen 5 Yhdistelmätekijän VIII tuotannon aikaansaamiseksi koottiin täysi 7 kb:n proteiinia koodaava alue useista erillisistä cDNA- ja genomiklooneista. Seuraavassa ja kuviossa 11 kuvataan kolmen väliplasmidin, jotka sisälsivät geenin 5'-, keski- ja 3'-alueet, rakentamista. Nämä plasmidit koo-10 taan ilmentärnisplasmidiksi ja niiden jälkeen tulee SV40:n aiempi promoottori. Tämä plasmidi toimii puolestaan lähtökohtana useille rakenteille, joissa on muunnettuja pääte-jaksoja ja erilaisia promoottoreita ja valintamarkkereita transformoinnin mahdollistamiseksi erilaisiin nisäkässolu-15 tyyppeihin.

5'-suunnan koodausalue sijoitettiin pBR322-johdok seen sillä tavalla, että Clal-retriktiokohta tuli tekijä VIII-signaalijakson ATG-aloituskodonin eteen. Koska geenissä ei esiinny muita Clal-kohtia, tästä tulee kätevä kohta il-20 mentämisplasmidin parannuksiin. Kätevät Clal- ja Sacl-kohdat sisältävä plasmidi pT24-10 [67a] pilkottiin Hindllltllä, täytettiin DNA-polymeraasilla ja pilkottiin Sacl:llä. Tekijä VIII-cDNA-kloonin A13.2 5'-alueelta otettiin talteen 77 b:n Alul/Sacl-fragmentti ja ligatoitiin se tähän vektoriin, jol-: : : 25 loin saatiin välituote, jolle annettiin nimeksi pF8Cla-Sac.

(Alul-kohta sijaitsee tekijän VIII lukemattomalla 5'-alueella, ja Sacl-kohta 10 emästä aloituskodonin ATG takana nuk-leotidiasemassa 10 kuviossa 10. Kaikkien seuraavassa esitettävien restriktiokohtien nukleotidiasema numeroidaan kuten 30 kuviossa 10, aloituskodoni ATG:n A:sta alkaen). 85 b:n Clal/SacI-fragmentti, joka sisälsi 11 bp:n verran adaptori-jaksoa (adaptor!jakso 5'-ATCGATAAGCT on kokonaan pBR322:sta lähtöisin), eristettiin pF8Cla-Sac:sta ja ligatoitiin yhdessä Ai3.2:sta saadun 1801 b:n Sacl/Kpnl (nukleotidi 1811)-35 fragmentin kanssa pBR322-alakloonista valmistettuun Clal/Kpnl-vektoriin, joka sisälsi tekijän VIII Hindlll-frag- 66 86 8 85 mentin (nukleotidit 1 019 - 2 277). Tämä välituote, pF8Cla-Kpn, sisälsi tekijää VIII koodaavat 2 277 ensimmäistä nukleotidia ja niiden edellä 65 5'-pään lukematonta emäsparia ja 11 emäsparin Clal-adaptorijakson. pF8Cla-Kpn avattiin 5 Kpnlrllä ja Sphl:llä (pBR322-osasta), jolloin saatiin vektori fragmentti, joka ligatoitiin A13.2:n EcoRI-alakloonista saadun 466 b:n Kpnl/Hindlll-fragmentin ja eksonin B sisältävästä alakloonista p222.8 saadun 1654 b:n Hindlll/Sphl (nukleotidi 4003)-fragmentin kanssa. Täten saatiin pF8Cla-Sph, 10 joka sisälsi tekijää VIII koodaavan jakson 3931 ensimmäistä emästä.

Koodaavan alueen keskiosa saatiin kolmen osan ligaa-tiolla, jolla yhdistettiin kolmen pBR322/cDNA-kloonin tai -alakloonin fragmentteja. p3.48 avattiin BamHI:lla (nukleo-15 tidi 4743) ja Sall:llä (pBR322:n tet-alueelta), minkä jälkeen sitä käytettiin vektorina. Näihin kohtiin ligatoitiin p3.12:sta saatu 778 b:n BamHI/Ndel (nukleotidi 5520)-fragmentti ja alakloonista pA10.44Rl.9. Saatu 2106 b:n Ndel/-Sall (pBR322:ssa)-fragmentti. Ligaation tapahtuessa asian-20 mukaisesti saatiin tetrasykliiniresistentti plasmidi pF8Sca-RI.

Tekijä VIII-cDNA:n 3'-pää kloonattiin suoraan SV40-ilmentämisvektoriin. Plasmidi pCVSVEHBV sisälsi SV40:n aiemman promoottorin, jota seurasi polyliittäjä ja hepatiitti B-. 25 viruksen pinta-antigeeniä koodaava geeni.

[pCVSVEHBV, josta käytetään myös nimitystä pCVSVEHBS, on hieman muunnettu p342E [73]. Tarkemmin ilmaistuna . . pCVSVEHBV saatiin seuraavasti: 540 bp:n Hindlll-Hindlll- fragmentti, joka sisälsi SV40:n kahdentumisen aloituskohdan • 30 [74], ligatoitiin plasmidiin pML [75] EcoRI-kohdan ja

HindiII-kohdan väliin. Plasmidin EcoRI-kohta ja SV40:n Hindlll-kohta muutettiin tylppäpäisiksi lisäämällä Klenow-DNA-polymeraasi I:tä kaikkien neljän dNTP:n läsnä ollessa ennen pilkkomista Hindlllrllä. Saatu plasmidi, pESV, pilkot-... 35 tiin Hindlllrllä ja BamHI:llä ja eristettiin 2 900 b:n vektori fragmentti. Tähän fragmenttiin ligatoitiin HBV:sta saatu 67 B 6 8 8 5 2 025 b:n Hindlll-BgllI-fragmentti, joka oli muunnettu sisältämään polyliittäjä (DNA-fragmentti, joka sisältää useita restriktiokohtia) EcoRI-kohdassa. HBV-fragmentti sisältää pinta-antigeeni-geenin, ja se saadaan tekemällä EcoRI-Bglll-5 pilkkominen kloonatulle HBV-DNA:lle [74]. Kaksisäikeinen liittäjä-DNA fragmentti (5'-dAAGCTTATCGATTCTAGAATTC3'...) pilkottiin Hindlllrllä ja EcoRI:llä ja lisättiin HBV-frag-menttiin, jolloin EcoRI-Bglll-fragmentti muuttui Hindlll-Bglll-fragmentiksi. Vaikka tämä voitaisiin tehdä 3-osaisena 10 liittäjän, HBV-fragmentin ja vektorin ligaationa, on helpompaa lisätä ensin Hindlll-EcoRI-liittäjä kloonattuun HBV-DNAhan ja paljastaa sitten Hindlll-Bglll-fragmentti tekemällä rinnakkaispilkkominen plasmidin näillä entsyymeillä, kuten tehtiinkin. Saatava plasmidi, pCVSVEHBH, sisältää 15 pBR322-johdoksen, pML:n, bakteeri-kahdentumisen aloituskoh dan, samoin pML:sta lähtöisin olevan ampisilliiniresitenssi-markkerin, SV40-fragmentin siten orientoituneena, että aiempi promoottori ohjaa sijoitetun HBV-fragmentin kopioimista, sekä HBV:stä lähtöisin olevan pinta-antigeeni-geenin. HBV-20 fragmentti antaa myös polyadenylaatiosignaalin, joka saa aikaan sellaisten polyadenyloitujen mRNA:iden tuotannon, joita normaalisti muodostuu nisäkässolujen sytoplasmassa.]

Plasmidi pCVSVEHBV sisälsi käyttökelpoisen Clal-koh-dan heti polyliittäjässä olevan Xbal-kohdan 5'-puolella. Tä-25 mä plasmidi avattiin Xval:llä ja BamHl:llä (hepatiitti Ag:n lukemattomalta 3'-alueelta) ja päät täytettiin DNA-polyme-raasilla. Täten poistui hepatiitti-pinta-antigeenin koodaava alue, mutta sen 3'-pään polyadenylaatiosignaalialue, samoin kuin SV40-promoottori, jäivät jäljelle. Tähän vektoriin li-30 gatoitiin cDNA-kloonista AIO.3 lähtöisin oleva 1 883 b:n . . EcoRI-fragmentti (päät täytettyinä). Tämä fragmentti sisälsi loput 77 tekijää VIII koodaavaa emäsparia, 1 805 b:n lukemattoman 3'-alueen, 8 adenosiiniryhmää ja täytetyn EcoRI-adaptorin. Liitettäessä yhteen täytetyt restriktiokohdat, 35 syntyi 5'-päähän uudelleen EcoRI-pää (täytettyyn EcoRI-koh-taan liitetystä täytetystä Xbalistä), mutta tämä pää tuhou- ö 6 o 8 5

DO

tui 3'-päässä (täytetty EcoRI liittyi täytettyyn BamHI-koh-taan). Tälle plasmidille annettiin nimeksi pCVSVE/10.3.

Koko tekijä VIII-cDNA-alue liitettiin kolmen osan ligaatiolla. pCVSVE/10.3 avattiin Clal:llä ja EcoRI:llä ja 5 se toimi vektorina pF8Cla-Sca:sta saadun 3870 b:n Clal/Scal-fragmentin ja pF8Sca-RI:stä saadun 3182 b:n Scal/EcoRI-frag-mentin sijoittamiseksi. Tästä ilmentämisplasmidista käytettiin nimitystä pSVEFVIII.

b. Rakenne tekijän VIII tuottamiseksi kudosviljel-10 mäsoluissa pSVEFVIII:iin perustuva muunnosvektori, joka sisälsi adenoviruksen myöhemmän pääpromoottorin, kolmiosaisen esijakson ja lyhennetyn tekijän VIII lukemattoman 3'-alueen, tuotti aktiivista tekijää VIII, kun sillä transfek-15 toitiin BHK-solut.

Kuvio 12 esittää pAML3P.8cl:n, aktiivista tekijää VIII tuottavan ilmentämisplasmidin, rakentamista. Tämän rakenteen muodostamiseksi poistettiin ensin pFDllrn Sstlkohta [49r] ja pEHED22:n Clal-kohta [49y] Klenow-DNA-polymeraasi 20 I:llä. Nämä kohdat sijaitsevat näiden plasmidien DHFR-geenin lukemattomilla 3'- ja 5'-alueilla. Sitten tehtiin kolmen palan ligaatio, jossa liitettiin poistetut kohdat sisältävät fragmentit ja pCVSVEHBS (supra)-peräinen hepatiitti B-viruk-sen pinta-antigeeni-geeni, jolloin saatiin vektori 25 pCVSVEHED22ACS, jossa on vain yksi Clal- ja yksi Sstll-koh-ta. Plasmidi pSVEFVIII, joka sisältää rakennetun tekijä VIII-geenin (kuvio 11) pilkottiin Clalrllä ja Hpalrllä koko koodaavan alueen ja noin 380 b:n pituisen lukemattoman 3'-alueen paljastamiseksi. Tämä sijoitettiin vektoriin, josta 30 Clal- ja Sstll-kohdat oli täytetty, sen ainutkertaisiin Glal- ja Hpal-kohtiin, jolloin se korvasi pinta-antigeeni-geenin ja saatiin ilmentämisplasmidi pSVE.8clD.

Erikseen muodostettiin adenoviruksen myöhempi pää-35 promoottori kolmiosaisine 5'-esijaksoineen kahdesta adeno- .o 86885 69 virusgenomin osan alakloonista ja DHFR-ilmentämisplasmidista pEHD22 [49y]. Näiden kahden adenovirusalakloonin, pUCHSX:n ja pMLP2:n muodostusta kuvataan menetelmien yhteydessä. pMLP2 sisältää fragmentin SstI-HindiII adenoviruksen koor-5 dinaateista 15.4 - 17.1 kloonattuna pUC13:n [59] alueelle Sstl-Hindlll. pUCHSX sisältää HindiII-XhoI-fragmentin (koordinaatit 17.1 - 26.5) kloonattuna pUC13:n alueeseen

Hindlll-Sall. Sijoitettuna HindiII-kohtaan nämä kaksi ade-novirusfragmenttia sisältävät adenoviruksen myöhemmän pää-10 promoottorin, ensimmäiset kaksi eksonia ja intronia kokonaisuudessaan ja osan kolmatta eksonia, aina 5'-alueella lukemattomalla olevaan Xhol-kohtaan asti.

Kolmen osan ligaatiolla sijoitettiin adenoviruspro-moottori DHFR-geenin eteen plasmidissa pAML3P.D22. Täten 15 saatiin Clal-kohta pian aiemman XhoI-kohdan jälkeen adenoviruksen kolmiosaisen 5'-esijakson kolmanteen eksoniin. Lopuksi poistettiin tekijä VHI-ilmentämisplasmidin, pSVE.8clD:n SV40-alkupromoottori Clal:llä ja Sällillä ja korvattiin se SV40-alku/adenovirus-tandempromoottorilla 20 (katso kuvio 12), jolloin saatiin lopullinen ilmentämisplas-midi, pAML3P.8cl. Tämä plasmidi sisältää adenoviruksen kolmiosaisen esijakson liitettynä kolmannen eksonin kohdalla tekijän VIII lukemattomaan 5'-alueeseen. Tätä seuraa täysmittainen tekijä VIII-rakennegeeni signaalijaksoineen. Te-25 kijä VIII-geenin lukematon 3'-alue liittyy Hpal-kohdassa hepatiitti B-viruksen pinta-antigeeni-geenin lukemattomaan 3'-alueeseen. Tätä seuraa DHFR-geeni, jossa on SV40-alku-promoottori ja hepatiittigeenin lukematon 3'-alue, joka antaa funktionaalisen polyadenylaatiosignaalin.

30 Tekijä VHI-ilmentämisplasmidilla, pAML3P.8cl:llä kotransfektoitiin BHK-solut yhdessä neomysiiniresistenssi-vektorin pSVEneoBallö kanssa (ATCC n:o CRL 8544, talletettu 20.4.1984). Näille soluille tehtiin ensin valinta 6418:11a ja sitten valinta metotreksaatilla.

35 BHK-solulinjan tuottaman tekijä VIII-RNA:n alkuka- 70 86 8 85 rakterisointi tehtiin Northern-analyysillä hybridisoimalla poly( A)*-sytoplasma-RNA 32p-leimattuun tekijä VIII-DNA-koettimeen. Tässä analyysissä saadaan noin 9 kb:n mittainen vyöhyke. Hybridisaatiointensiteettien perusteella tämä vyö-5 hyke on noin 100 - 200-kertaisesti rikastunut verrattuna CH- 2-solulinjasta löytyvään 9 kb:n vyöhykkeeseen.

9. Yhdistelmätekijän VIII identifiointi a. RIA-tutkimus

Radioimmuunikokeet tehtiin menetelmien yhteydessä 10 kuvatulla tavalla tekijää VIII tuottavan BHK-solulinjan supernatanteille ja hajotetuille soluille. Taulukko 1 osoittaa, että supernatantit (jotka sisältävät tekijän VIII aktiivisuutta) (katso 96] sisältävät näiden RIA-kokeiden perusteella myös suurin piirtein yhtä suuret määrät tekijän 15 VIII 210 kD:n (CIO) osia ja 80 kD:n (C7F7) osia. Tekijä VIII on myös havaittavissa solulysaateissa kummallakin RIA-ko-keella. Vertailusolulinjat, jotka eivät tuota tekijää VIII, antoivat RIA-analyysissä arvoja, jotka olivat alle 0,001 ky/ml.

20

Taulukko 1 pAML3P.8cl:llä transfektoidun BHK-solulinjan tekijä VIII-RIA 1 2 3 4 5

Solujen supernatantti CIO C7F7 2

Koe 1 0,14 ky/ml 0,077 3

Koe 2 0,022 0,021

Solulysaatti 4

Koe 1 0,42 0,016 5 : 30

Sitoutunut 125I (cpm) muutettiin ky/ml-yksiköiksi käyt-: tämällä laimennetulle normaaliplasmalle saatua vertailukäy- rää. Kaikki arvot ovat selvästi taustan yläpuolella. Havait-tavuusrajat olivat 0,005 ky/ml C10:lle ja 0,01 ky/ml C7F7:-: 35 lie.

71 86885 b. BHK-solujen kasvualustojen kromogeenikoe

Kuten taulukosta 2 Ilmenee, näiden solujen kasvualustat absorboivat aallonpituudella 405 nm Coatest-kokeella tutkittaessa. Kuten edellä kuvattiin, tämä koe on spesifinen 5 tekijän VIII aikaan saamalle tekijän X aktivoitumiselle. Tekijälle VIII spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisääminen alensi syntyneen tekijän Xa määrää, minkä osoittaa absorbanssin aleneminen 0,155:stä (alusta) 0,03reen (alusta + vasta-aineet) (sokean kokeen antamat arvot vähennettiin). 10 Siten solut tuottavat aktiivisuutta, joka toimii tekijän VIII aktiivisuudelle spesifisessä kokeessa, ja tämä aktiivisuus kumoutuu tekijälle VIII spesifisten vasta-aineiden vaikutuksesta.

Inkuboitaessa alustaa reaktioseoksessa lisäämättä te-15 kijää IXa, tekijää X ja fosfolipidiä ei absorbanssi aallonpituudella 405 nm kohonnut sokean kokeen antamaa arvoa korkeammalle. Havaittu aktiivisuus ei siis aiheudu alustaa pilkkovan ei-spesifisen proteaasin läsnäolosta ja kumoutuu lisäksi tekijälle VIII spesifisten vasta-aineiden vaikutuk-20 sesta.

Taulukko 2 BHK-solulinjan tekijä VIII-aktiivisuus kromogeenikokeella 25 määritettynä'1

Absorbanssi, 405 nm

Absorbanssi (sokean kokeen 30 Näyte 405 nm_ tulos vähennetty)

Alusta 0,193 0,155

Puskurivertailu*2 0,038 (0,0)

Alusta + tekijä VIII -vasta-aine*3 0,064 0,030 35 Puskurivertailu*2 + tekijä VIII vasta- aine 0,034 (0,0) 72 86885 11 Reaktioita muunnettiin seuraavasti: lXa:ta, X:ä, fosfo-lipidiä, CaCl2:a ja suhteessa 1 - 100 laimennettua näytettä (50 μΐ kutakin) inkuboitiin 10 min 37 °C:ssa. Lisättiin 50 μΐ S2222:a ja reaktio päätettiin lisäämällä 100 μΐ 50-%:ista 5 etikkahappoa, kun oli inkuboitu 60 min 37 °C:ssa.

2> Näytteen tilalla käytetty puskuriliuos sisälsi 0,05 mol/1 Tris-HCl:ä (pH 7,3) ja 0,2 % naudan seerumialbumii-nia.

3) Vasta-aine oli C8:n ja C7F7:n seos (10 pg kumpaakin). 10 Alustoja esi-inkuboitiin 5 min ennen kokeen aloitusta.

c. Alustojen kromatografia monoklonaalisella hartsilla

Seerumi, joka sisälsi tekijän VIII aktiivisuutta sisältävää alustaa, käsiteltiin kromatografisesti kolonnissa, 15 joka sisälsi monoklonaalista vasta-ainetta C8 (ATCC n:o 40115, talletettu 20.4.1984), kuvatulla tavalla (supra). Eluoituneet fraktiot laimennettiin suhteessa 1:100 ja niiden aktiivisuus mitattiin. 50 pl:aan laimennettua piikkifraktio-ta lisättiin erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita, joiden 20 tiedetään kumoavan plasman tekijän VIII aktiivisuuden. Taulukossa 3 esitetyt tulokset osoittavat, että kolonnista elu-oitunut tekijän VIII aktiivisuus (nyt paljon suurempana pitoisuutena kuin alustassa) myös kumoutui näiden tekijän VIII vasta-aineiden vaikutuksesta.

.. 25

Taulukko 3

Monoklonaalisesta vasta-aineesta eluoidun piikkifraktion kromogeenikoe(1 . 30 Absorbanssi, Näyte 405 nM(1_

Piikkifraktio(2 0,186

Piikkifraktio + tekijä VIII -vasta-aine(3 0,060 35 Puskurivertailu 0,000

Puskurivertailu + tekijä VIII -vasta-aine 0,045 5 6 8 8 5 73 11 Koe tehtiin seuraavasti: 50 μΐ laimennettua näytettä inku-boitiin 5 min 50 μ1:η kanssa IXa/X/fosfolipidiliuosta 37 °C:ssa. Reaktioseokseen lisättiin 50 μΐ CaCl2:a ja rektion annettiin edetä 10 min 37 °C:ssa. Lisättiin kromogeeninen 5 substraatti (50 μΐ) ja reaktio päätettiin lisäämällä 100 μΐ 50-%:ista etikkahappoa 10 min:n kuluttua.

2) Piikkifraktio laimennettiin 1:100 0,05 M Tris-puskurilla (pH 7,2), joka sisälsi 0,15 mol/1 NaCl:a, mittauksia varten.

10 3) Vasta-aineena oli 10 μΐ Symbiotic-vasta-ainetta, joka li sättiin laimennettuun näytteeseen ja inkuboitiin 5 min huoneen lämpötilassa.

d. Puhdistetun tekijän VIII koagulanttiaktiivisuus Solujen kasvualustoissa havaittu aktiivisuus puhdis-15 tettiin ja väkevöitiin johtamalla alustat C8-monoklonaali-sen hartsin läpi (supra). Piikkifraktiota dialysoitiin liuosta vastaan, joka sisälsi 0,05 mol/1 imidatsolia (pH 6,9), 0,15 mol/1 NaCl:a, 0,02 mol/1 glysiinin etyyliesteriä, 0,01 mol/1 CaCl2:a ja 10 % glyserolia, eluointipuskurin poistami-20 seksi. Aktiivisuuspiikin kohdalta otettu fraktio tutkittiin tekemällä hyytymisanalyysi plasmassa, josta puuttuu tekijä VIII (taulukko 4). Fibriinitulppa havaittiin 84 s:n kuluttua. Näytettä sisältämätön hemofiilikon plasma muodosti tulpan 104,0 s:ssa. Siten eluoitunut fraktio korjasi hemofiili-25 kon plasman hyytymishäiriön. Ihmisen normaaliplasma laimennettiin ja tutkittiin samalla tavalla. Tästä plasmasta mitattu vertailukäyrä osoitti, että eluoitunut fraktio sisälsi suunnilleen 0,01 ky/ml tekijän VIII aktiivisuutta.

30 Taulukko 4

Monoklonaalisella vasta-aineella puhdistetun tekijän VIII koagulanttiaktiivisuus B 6 8 8 5 74 Näyte Hyytymisaika (s)

Yhdistelmätekijä VIII(la 86,5

Yhdistelmä tekijä VIII(la ja C7F7-vasta-aine 101,3 5 Vertailu12 101,3

Yhdistelmätekijä VIII(lb 82,4

Yhdistelmätekijä VIII(lb ja 10λ-synbiotic-vasta-aine 110,6 10 Vertailu12 95,5 11 Tekijä VIII oli C8-monoklonaalisesta hartsista eluoitunut piikin kohdalta otettu fraktio, jota oli dialysoitu (la) 1,5 tai (Ib) 2 h eluointipuskurin poistamiseksi.

15 2) Vertailupuskuri oli 0,05 M Tris (pH 7,3), joka sisälsi 0,2 % naudan seerumialbumiinia.

e. Puhdistetun tekijän VIII aktivointi trombiinilla Koagulanttiaktiivisuuden aktivoituminen trombiinin vaikutuksesta on hyvin tunnettu tekijän VIII ominaisuus. 20 Monoklonaalisesta kolonnista eluoituneesta fraktiosta analysoitiin tämä ominaisuus. Kun näyte oli dialysoitu eluointipuskurin poistamiseksi (supra), laimennettiin 100 μΐ eluaattia 100 pltlla 0,05 M imidatsoliliuosta (pH

7,6), joka sisälsi 0,15 mol/1 NaCl:a, 0,02 mol/1 glysiinin 25 etyyliesteriä, 0,01 mol/1 CaCl2:a ja 10 % glyserolia. Tämä laimennus tehtiin mahdollisesti jäljellä olevan eluointipuskurin (joka saattaisi häiritä trombiinin toimintaa) laimentamiseksi edelleen sekä reaktioseoksen pH:n kohottamiseksi. Liuokseen lisättiin trombiini (25 ng) ja reaktio teh-30 tiin huoneen lämpötilassa. Seoksesta erotettiin 25 μ1:η annoksia eri aikoina, laimennettiin ne (1:3) ja tutkittiin koagulanttiaktiivisuus. Tulokset esitetään kuviossa 17. Tekijän VIII aktiivisuus kohosi ajan funktiona, ja aleni sitten kuten tekijän VIII aktiivisuuden odotetaan käyttäytyvän. 35 Lisätty trombiinimäärä ei hyydyttänyt plasmaa, josta puuttui 868 85 75 tekijä VIII, näissä kokeissa käytettyjen aikojen kuluessa ja havaittu ajasta riippuva havaitun hyytymisajan nousu ja sen jälkeen tapahtuva lasku osoitti, että seurattu aktiivisuus todella oli trombiinin aikaansaamaa tekijän VIII aktivoitu-5 mistä. Havaittu trombiinin aikaan saama noin 20-kertainen aktivoituminen sopii yhteen plasman tekijän VIII käyttäytymisen kanssa.

f. Yhdistelmätekijän VIII sitoutuminen immobilisoi-tuun von Willebrand-sepharoseen 10 Tekijän VIII tiedetään esiintyvän plasmassa rever- siibelinä kompleksina von Willebrand-tekijän (vWF) kanssa [10 - 20]. Yhdistelmätekijän VIII käyttökelpoisen muodon tulisi siten pystyä muodostamaan tällainen kompleksi, jotta se varmistuisi tekijäksi VIII. Lisäksi kyky muodostaa täl-15 lainen kompleksi todistaisi yhdistelmätekijän VIII kyvyn muodostaa luonnollinen, verenkierrossa oleva aktiivinen muoto, tekijä VIII/vWF-kompleksi, hemofiilikolle annettaessa. Jotta saataisiin tutkituksi yhdistelmätekijän VIII kyky olla vuorovaikutuksessa vWF:n kanssa, vWF puhdistettiin ja immo-20 bolisoitiin hartsille seuraavasti:

Ihmisen von Willebrand-tekijä valmistettiin käsittelemällä ihmisen tekijä VIII-tiivisteet (Cutter Laboratories) kromatografisesti Sepharose® CL4B hartsilla, joka oli tasapainotettu 0,05 M Tris-puskurilla (pH 7,3), joka sisälsi 25 0,15 mol/1 NaCl:a. Von Willebrand-tekijä eluoituu kolonnin huokostilavuudessa. Tämä alue yhdistettiin, väkevöitiin seostamalla ammoniumsulfaatilla (kylläiseen nähden 40-%:inen liuos) ja käsiteltiin uudelleen kromatografisesti kolonnissa edellä mainitun puskurin, joka sisälsi 0,25 mol/1 CaCl2:a, 30 läsnä ollessa tekijä VIII-koagulanttiaktiivisuuden erotta miseksi von Willebrand-tekijästä. Huokostilavuusfraktio yhdistettiin jälleen, väkevöitiin seostamalla ammoniumsulfaatilla ja dialysoitiin 0,1 M natriumbikarbonaattiliuosta vastaan. Saatu preparaatti liitettiin kovalenttisesti syanogee-35 nibromidilla aktivoituun Sepharoseen®(Pharmacia) valmistajan 76 86885 suosittelemalla tavalla. Kolonni huuhdottiin 0,02 M Tris-puskurilla (pH 7,3), joka sisälsi 0,05 mol/1 NaClra ja 0,25 mol/1 CaCl2:a sitoutumattomien proteiinien poistamiseksi. Yhdistelmätekijä VIII preparoitiin seerumittomaan väliainee-5 seen ja laitettiin 1,0 ml:n vWF-hartsikolonniin huoneen lämpötilassa.

Kolonni huuhdottiin sitoutumattoman proteiinin poistamiseksi ja eluoitiin 0,02 M Tris-puskurilla (pH 7,3), joka sisälsi 0,05 mol/1 NaClra ja 0,25 mol/1 CaCl2:a. Kerättiin 10 1,0 ml:n fraktioita, jotka laimennettiin (1:10) ja tutkit tiin. Tulokset ovat taulukossa 5. Tekijän VIII aktiivisuus absorboituu väliaineesta kolonniin. Aktiivisuus voidaan sitten eluoida ulos kolonnista käyttämällä suurta suolapitoisuutta (taulukko 5), kuten ihmisen tekijältä VIII on odotet-15 tavissa. Sitten BHK-solujen tuottamalla tekijällä VIII on kyky spesifiseen vuorovaikutukseen von Willebrand-tekijäpro-teiinin kanssa.

Taulukko 5 20 Absorbanssi, Näyte 405 nM(1_

Solujen alusta 0,143

Huuhteluliuos 0,015

Eluoituneet fraktiot 25 1 0,000 2 0,410 3 0,093 4 0,017 5 0,000 30 _6_ 0,000 11 Koemenettelyt olivat muuten valmistajan suositusten mukaiset, mutta kaikki tilavuudet pienennettiin puolella 77 668 85 10» Fuusioproteiinien analysointi Tämän koesarjan tarkoituksena oli osoittaa kloonin koodaaman proteiinin identtisyys plasman polypeptidien kanssa. Tämä tehtiin ilmentämällä osia geenistä fuusioproteii-5 neina E. colissa. Kloonatun geenin koodausjaksoja voidaan kokonaan tai osina ilmentää muodoissa, jotka on suunniteltu antamaan vasta-ainemuodostukseen soveltuvaa materiaalia. Näitä vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä halutuille kloonatun proteiinin alueille, voidaan käyttää proteiinien ana-10 lysointiin ja puhdistukseen. Tähän tarkoitukseen valmistettiin sarja E. coli/tekijä VIII-"fuusioproteiineja". Fragmentteja tekijä VIII-klooneista ligatoitiin plasmidin pNCV [70] Bglll-kohtaan sillä tavalla, että tekijä VIII-koodaus-jaksot liittyivät oikeassa luentakehyksessä E. coli trp LE-15 fuusioproteiinin 12 ensimmäistä aminohappoa vastaavaan jaksoon [48, 70, 71]. Tämä vahva trp-promoottorisysteemi tuottaa yleensä huomattavia määriä yhdistelmäproteiinia.

pfusl rakennettiin eristämällä tekijä VIII-geenin 189 bp:n Stu/HincII-fragmentti (koodaa aminohappoja 20 1 799 - 1 860) ja ligatoimalla tämä pUC13:n [49k] Smal-koh- taan. Tämä väliplasmidi pilkottiin BamHItllä ja EcoRlrllä ja 200 bp:n fragmentti sijoitettiin pNCV:een [70], josta oli poistettu 526 bp:n Bglll-EcoRI-fragmentti. Tämä plasmidi, pfusl, tuottaa trp-promoottorin ohjauksessa 10 kD:n fuusio-25 proteiinia, joka koostuu 16 trpLE:n ja liittäjän koodaamasta aminohaposta, joita seuraa 61 tekijä VHI-ryhmää ja lopuksi 9 liittäjän ja trpE:n koodaamaa karboksyylipään ryhmää.

pfus3 muodostettiin poistamalla 260 bp:n Avall-frag-mentti tekijä VHI-geenistä (aminohapot 1 000 - 1 096), 30 täyttämällä yksisäikeiset päät DNA-polymeraasin Klenow-frag-mentin avulla, ja ligatoimalla tämä nyt tylppäpäinen DNA-fragmentti pNCV:en, joka oli pilkottu BglII:llä ja täytetty päistä samalla tavalla.

Tämä plasmidi, jossa päistä täytetty fragmentti on 35 oikein orientoituneena (mikä määritetään restriktiopilkko- 78 8 6 8 85 misten ja DNA-sekvenssianalyysin avulla), ohjaa noin 40 kD fuusioproteiinin, joka sisältää 97 tekijän VIII aminohappoa 192 trpLE-proteiinin 192 aminohapon sisällä, synteesiä.

pfus4 valmistettiin pilkkomalla tekijä VIII-alakloo-5 ni, A222.8,BanI:llä, pilkkomalla takaisin yksisäikeinen pää-nukleaasi S^llä, pilkkomalla Pstl:llä ja eristämällä tuloksena oleva 525 bp:n tylppäpäinen/Pstl-fragmentti (aminohapot 710 - 885). Tämä fragmentti ligatoitiin pNCV:een, joka oli pilkottu BglII:lla, käsitelty S^llä, pilkottu Pstl:llä ja 10 josta oli eristetty vektorifragmentti. pfus4 ohjaa 22 kD:n fuusioproteiinin, joka sisältää tekijästä VIII 175 aminohappoa, joita seuraa trpLE:n 12 ensimmäistä aminohappoa, synteesiä.

Fuusioproteiinit puhdistettiin ja ruiskutettiin ka-15 niineihin vasta-aineiden muodostamiseksi kuvatulla tavalla (supra). Näiden vasta-aineiden sitoutuminen plasmaperäiseen tekijään VIII testattiin Western-täpläanalyysillä.

Tällaisen Western-siirron tulokset esitetään kuviossa 13. Kukin fuusioproteiini reagoi plasman tekijän VIII 20 kanssa. Fuusio 1 oli peräisin geenialueelta, joka koodaa 80 000 daltönin polypeptidiä. On nähtävissä, että fuusio 1-antiseerumi reagoi vain 80 000 daltonin vyöhykkeen kanssa eikä reagoi suurempimolekyylisten proteiinien kanssa. Fuusio 3- ja 4-antiseerumit reagoivat ristiin proteiinien kanssa, 25 jotka ovat suurempia kuin 80 000 daltöniä, eivätkä reagoi 80 000 daltonin vyöhykkeen kanssa. Monoklonaalinen vastaaine C8 on aktiivisuuden kumoava monoklonaalinen vasta-aine, joka vaikuttaa tekijän VIII vastaisesti ja jonka tiedetään reagoivan 210 000 daltonin proteiinin kanssa. Kuvio 14 osoit-30 taa, että fuusioproteiini 4 reagoi tämän monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, mikä osoittaa sen, että C8:n tunnistama aminohappojakso on fuusio 4-polypeptidin koodaama. Tämä tukee edelleen sitä, että fuusioproteiini 4 on proteiini, joka sisältää 210 000 daltonin proteiinin jaksot. Edellä esitetyt 35 tutkimukset todistavat pitävästi sen, että ko. geeni koodaa 79 B6885 sekä 210 000 että 80 000 daltonin proteiinien aminohappojak-soja.

11. Farmaseuttiset koostumukset Tämän keksinnön mukaisesti saatavat yhdisteet voi-5 daan formuloida tunnetuin menetelmin farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumusten valmistamiseksi, jolloin ihmisen tekijä VIII yhdistetään farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen. Soveltuvia kantoaineita ja niiden formulointia, ihmisen muut proteiinit, esimerkiksi ihmisen see-10 rumialbumiini, mukaan luettuina kuvaa esimerkiksi E.W. Martin teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, joka mainitaan tässä viitteenä. Tällaiset koostumukset sisältävät vaikuttavan määrän keksinnön mukaisesti saatua proteiinia yhdessä soveltuvan määrän kanssa kantoainetta farmaseutti-15 sesti hyväksyttävien koostumusten, jotka soveltuvat tehokkaaseen antoon isännälle, valmistamiseksi. Keksinnön mukaista ihmisen tekijää VIII voidaan esimerkiksi antaa parente-raalisesti esimerkiksi hemofilia A:ta sairastaville potilaille.

20 Hemofiilikon hoitoon käytettävä kulloinkin keskimää räinen annos vaihtelee vuotokohtauksen vakavuuden mukaan. Laskimon sisäisesti annettavat keskimääräiset annokset ovat alueella; 40 yksikköä/kg ennen leikkauksia, 15-20 yksik-köä/kg pienempään vuotoon ja 20 - 40 yksikköä/kg annettuna 8 25 h:n aikana ylläpitohoitoon.

80 86 8 85

Kirjaili suusluettelo 1. Hemostasis and Thrombosis, Bloom and Thomas, Eds., Churchill, Livingstone, NY (1981).

5 2. Davie, et al., Ann. Rev. Biochem. 44, 799 (1975).

3. Jackson, et al., Ann. Rev. Biochem. 49, 767 (1980).

4. Wright, J. Am. Med. Assoc. 170, 325 (1959).

5. Schmer, et al., J. Biol. Chem. 247, 2512 (1972).

6. Legaz, et al., J. Biol. Chem. 247, 3946 (1973).

10 7. Shapiro, et al., J. Clin. Invest. 52, 2198 (1973).

8. Nilsson, et al., Acta. Med Scanl. 159, 179 (1957).

9. McKee, Ann. NY Acad. Sci. 240, 8 (1975).

10. Thelin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 95, 70 (1961).

15 11. Griggs, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 70, 2814 (1973).

12. Donati, et al., Thromb. Res. 2, 97 (1973).

13. Weiss, et al., Br. J. Haematol 18, 89 (1970).

14. Weiss, et al., Thromb. Diath. Haemorrh 27, 212 20 (1972).

15. Weiss, et al., Science 182, 1149 (1973).

16. Rick, et al., Blood 42, 737 (1973).

17. Rick, et al., Thromb. Res. 7, 909 (1975).

18. Thelin, et al.. Arch. Biochem. Biophys. 95, 70 25 (1961).

19. Owen, et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 27, 502 (1972) .

20. Cooper, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 70, 2326 (1973) .

30 21. Vehar, et al., Biochemistry 19, 401 (1980).

22. Fulcher, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 1648 (1982).

23. Fulcher, et al., Blood 61, 807 (1983).

24. Fulcher, et al., Blood 63, 486 (1984).

35 25. Fass, et al., Blood 59, 594 (1982).

81 868S5 jatkuu 26. Knutson, et ai.. Blood 59, 615 (1982).

27. Fay, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 79, 7200 (1982).

28. Gordon, et ai., Thrombosis Res. 6, 127 (1975).

5 29. Sacharski, et ai., Mayo Clinic Proc. 44, 784 (1969).

30. Green, et ai., Blood 37, 47 (1971).

31. Schwinn, et ai., U.S. Patent 4067964.

31a. Zimmerman, et ai., Haemostasis and Thrombosis, Bloom and Thomas, 10 Eds., Churchill, Livingstone, NY, p.lll (1981).

32. Bolivar, et ai., Gene 2, 95 (1977).

33. Chang, et ai., Nature 275, 615 (1978).

34. Itakura, et ai., Science 198, 1056 (1977).

35. Goeddel, et ai., Nature 281, 544 (1979).

15 36. Goeddel, et ai., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).

37. European Patent Appln. Pubi. No. 0036776.

38. Siebenlist, et ai., Cell 20, 269 (1980).

39. Stinchcomb, et ai., Nature 282, 39 (1979).

40. Kingsman, et ai., Gene 7, 141 (1979).

20 41. Tschemper, et ai., Gene 10, 157 (1980).

42. Jones, Genetics 85, 12 (1977).

43. Hitzeman, et ai., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980).

44. Hess, et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968).

45. Holland, et ai., Biochemistry 17, 4900 (1978).

25 46. Graham, et ai., Virology 52, 546 (1978).

47. Cohen, et ai., PNAS (USA) 69, 2110 (1972).

47a. Crea, et ai., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980) 47b. Beaucage, et ai., Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981) 48. Maniatis, et ai., Molecular Cloning: A Laboratory 30 Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, N.Y. (1982).

48a. Lawn, et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

49. Karn, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5172 (1980).

35 49a. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975).

82 8 6 8 S 5 jatkuu 49b. Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5794 (1980). 49c. Taylor, et ai., Biochem. biophys. Acta 442, 324 (1976).

5 49f. Ullrich, et ai., Science 196, 1313 (1977).

49g. Berger, et ai., Biochemistry 18, 5143 (1979).

49h. Aviv, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972).

49i. Sanger, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 10 (1977).

49 j. Gingeras, et ai., J. Biol. Chem. 257 13475 (1982). 49k. Norrander, et ai., Gene 26, 101 (1983).

491. Picken, et ai., Inf, and Immun. 42, 269 (1983).

49m. Beck, et ai., Gene 19, 327 (1982).

15 49n. Simonson, et ai., Mol. Cell Biol. 3, 2250 (1983).

49o. Southern, et ai., J. Mol. and Applied Gen. 1, 327 (1982) .

49p. Graham, et ai., Virology 52, 456 (1978).

49q. Wigler, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 3567 20 (1980).

49r. Simonson, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 2495 (1983) .

49s. Rotblat, et ai., Thromb. Res. 21, 431 (1981).

49t. Rotblat, et ai., J. Lab. Clin. Med. 101, 736 (1983). 25 49u. Kearney, et ai., J. Immun. 123, 1548 (1979).

49v. Kohler ,et ai., Nature 256, 495 (1975).

49w. Benton, et ai., Virol. 117, 490 (1982).

49x. Chalon, et ai., J. Immun. 9, 359 (1979).

49y. U.S.S.N. 459152, filed 19 Jan. 83.

30 50. Ish-Horowitz, et ai., Nucl. Acids Res. 9, 2989 (1981).

51. Stel, et ai., Nature 303, 530 (1983).

52. Kelly, et ai., Brit. J.Haem. (1984).

53. Exmer, et ai., Thrombosis Res. 32, 427 (1983).

35 54. Jaffe, et ai., J. Clin. Invest. 53, 36a (1974).

83 6 6 S δ 5 jatkuu 55. Fay, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79,. 7200 (1982).

56. Zimmerman, et ai., Haemostasis and Thrombosis Bloom, 5 A.L. and Duncan, P.T. (Churchill Livinstone, New

York) pp. 111-123 (1981).

56a. Meili, et ai., Thromb. Diathes. Haemorrh. 24, 161 (1970).

57. Grantham, et ai., Nuclei. Arts Res. 8 r49 (1980).

10 58. Kurachi, et ai., Proc..natl. Acad. Sei. USA 79, 6461 (1982).

59. Viera, et,ai., Gene 19, 259 (1982).

60. Breathnach, et ai., Ann. Rev. Biochem 50, 349 (1981).

61. Sharp, Cell 23, 643 (1981).

15 62. Fritsch, et ai., Cell 19, 959 (1980).

63. Collins, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 4242 (1978).

66. Kafatos, et ai., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).

67. Capon, et al., Nature 304, 507 (1983).

20 67a. Capon, et ai., Nature 301, 33 (1983).

68. Huynh, et ai., Practical Approaches in Biochemistry (IRL Press Ltd., Oxford, England) (1984).

69. Perlman, et al., J. Mol. Biol. 167, 391 (1983).

70. Kleid, et al., Science 214, 1125 (1981).

25 71. Goeddel, et al., Nature 287, 411 (1980).

73. Crowley, et al.. Mol. Cell Biol. 3, 44 (1983).

74. Liu, et al., DNA 1, 213 (1982).

75. Lusky, et al., Nature 293, 79 (1981).

76. Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).

30 77. Gluzman Cell 23, 175 (1981).

78. Grunstein, et al.,.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975).

79. Tuddenham, et al.. Symposium on Factors VIII/von Willebrand Factor, October 7-9, 1982, p.l.

35 80. Morrissey, Anal. Bioclem 117, 307 (1981).

84 8 6 8 8 5 jatkuu 81. Laenunli, Nature 227, 680 (1970).

82. Greenwood, et ai., Biochem. J. 89, 114 (1963).

83. Maniatis, et al., Cell 15, 687 (1963).

5 84. Sompayrac. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7575 (1981).

86. Messing, et al., Nucl. Acids Res. 9, 304 (1981).

87. Wood, et al., J. Biol. Chem. 256, 1502 (1981).

88. Shen, et al., Cell 19, 379 (1981).

10 89. Proudfoot, et al.. Nature 252, 359 (1976).

Claims (11)

85 86885

1. Eristetty DNA-jakso ihmisen yhdistelmä-tekijän VIII ilmentämistä varten, tunnettu siitä, että se 5 käsittää kuviossa 10 esitetyn nukleiinihappojakson, joka koodaa ihmisen funktionaalista tekijää VIII tai sen johdannaista, jolla on ihmisen funktionaalisen tekijän VIII aktiivisuutta.

2. Replikoituva ekspressiovektori, tunnettu 10 siitä, että sillä on kyky transfektoidussa selkärankaissolu- viljelmässä saada aikaan patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-jakson ilmentyminen.

3. Vektori pAML3P.8cl, tunnettu siitä, että se sisältää adenoviruksen kolmiosaisen leader-sek- 15 venssin, joka on liitetty kolmannesta eksonistaan yhteen tekijän VIII 5’-pään kääntämättömän alueen kanssa, jota seuraa täysmittaista tekijää VIII koodaava rakennegeeni signaalisekvensseineen, jonka 3'-pään kääntämätön alue on liitetty Hpal-kohdalta hepatiitti B-viruksen pinta-antigee-20 nin geenin 3'-pään kääntämättömään alueeseen, jota seuraa dihydrofolaattireduktaasia koodaava geeni, jossa on SV40-aikainen promoottori ja hepatiitin kääntämätön 3'-alue, joka antaa toiminnallisen polyadenylaatiosignaalin, kuten kuviossa 12 (III) on esitetty.

4. Menetelmä ihmisen yhdistelmä-tekijän VIII tai sen johdannaisen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) valmistetaan ekspressiovektori, joka koodaa kuviossa 10 esitettyä ihmisen tekijän VIII aminohapposekvenssiä tai sen johdannaista, jolla on ihmisen tekijän VIII 30 aktiivisuutta, b) eukaryoottinen isäntäsolulinja transformoidaan ekspressiovektorilla, c) solut viljellään, ja d) tekijä VIII tai sen johdannainen otetaan talteen 35 soluviljelmästä. 86 86885

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressiovektori sisältää lisäksi dihydrofolaattireduktaasia koodaavaa DNA:ta, isäntä-solulinja kotransformoidaan a) vaiheen mukaisella eks- 5 pressiovektorilla ja selektiivisen leiman sisältävällä vek torilla, selektiivisen leiman sisältävät solut valikoidaan, dihydrofolaattireduktaasia koodaavaa DNA:ta sisältävien solujen DNA amplifioidaan, valikoidut ja amplifioidut solut viljellään ja tekijä VIII tai sen johdannainen otetaan tallo teen soluviljelmästä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selektiivinen leima on neomy-siiniresistenssi ja selektiivisen leiman sisältävät solut valikoidaan lisäämällä antibioottia viljelyväliaineeseen.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntä on nuoren hamsterin mu-nuaissolulinj a.

8. Menetelmä nukleiinihapposekvenssin valmistamiseksi luonnollisesta lähteestä, joka nukleiinihapposekvenssi koo-20 daa kuviossa 10 esitettyä ihmisen tekijän Vili aminohappo-sekvenssiä, tunnettu siitä, että a) mRNA-lähde identifioidaan, b) cDNA-kirjasto muodostetaan mRNA:n perusteella, c) kirjasto seulotaan tekijän VIII osia koodaavien 25 kloonien suhteen, d) ihmisen lambda- ja kosmidikirjastot seulotaan tekijän VIII osia koodaavien kloonien suhteen, e) tekijää VIII koodaavan nukleiinihapon 5'- ja 3'-päät tunnistetaan koettimien avulla, 30 f) positiiviset kloonit eristetään ja kartoitetaan, ja g) positiivisista päällekkäisistä ja vierekkäisistä genomi- ja cDNA-klooneista saadut fragmentit liitetään yhteen ihmisen tekijä VIII-proteiinia koodaavan nukleiinihap-35 posekvenssin kokoamiseksi. 87 86885

9. Vektori pGcos4, tunnettu siitä, että se on käyttökelpoinen kosmidikirjaston konstruoinnissa tekijää VIII koodaavan geenin eristämiseksi ja sisältää SV40-aloi-tuskohdan ja promoottorin, joka käsittää dihydrofolaattire- 5 duktaasimutanttigeenin ja hepatiitti B-pinta-antigeenin lo-petussekvenssit, cos-geenin ja pBR322-aloituskohdan, kuten kuviossa 5 on esitetty.

10. Yhdistelmä-DNA-ekspressiovektori, tunnet-t u siitä, että se sisältää intronin, jota edeltää liitos- 10 donorikohta ja seuraa liitosakseptorikohta ja introniin sijoitetun DNA-fragmentin, jolla on haluttua polypeptidiä koo-daava jakso, ja siitä, että ekspressiovektorilla on kyky transfektoidussa eukaryoottisoluviljelmässä kopioitumisen tapahtuessa saada aikaan mainittua sijoitettua DNA-fragment-15 tia vastaava RNA-segmentti, joka on vapaa mahdollisista in-troneista.

11. Vektori pESVDA, tunnettu siitä, että se kykenee tuottamaan insertoitua tekijä VIII-DNA-fragmenttia vastaavan RNA-segmentin, joka on vapaa mahdollisista 20 introneista, transkriptoitaessa transfektoidussa eukaryoot tisoluviljelmässä ja käsittää SV40-viruksen 342 bp PvuII-Hindlll-fragmentin, jossa on EcoRI-kohtien rajaama SV40-rep-likaation aloituskohta, 580 bp BamHI-Bglll-fragmentissa olevan hepatiitti B-viruksen pinta-antigeenin polyadenylaatio-25 kohdan, jolloin SV40- aiempaa promoottoria seuraavan EcoRI- kohdan ja hepatiitti B-viruksen pinta-antigeenin BamHI-kohdan väliin on sijoitettu PvuII-Hindlll-fragmentti, joka sisältää ensimmäisen myöhemmän leader-jakson donorikatkaisu-kohdan ja heti sen jälkeen adenoviruksen 2 840 bp Hindlll-30 Sacl-fragmentti, joka sisältää Elb-akseptorikatkaisukohdan, ja jolloin donori- ja akseptorikohtien välissä sijaitsevat ainutlaatuiset Bglll- ja HindiII-kohdat genomisten DNA-frag-menttien lisäämiseksi, kuten kuviossa 6 on esitetty. 86885