NO174934B

NO174934B - Fremgangsmåte for fremstilling av funksjonell human faktor VIII

Info

Publication number: NO174934B
Application number: NO851563A
Authority: NO
Inventors: Daniel J Capon; Richard Mark Lawn; Gordon Allen Vehar; William Irwin Wood
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1984-04-20
Filing date: 1985-04-18
Publication date: 1994-04-25
Also published as: EP0385558A3; PT80292B; FI86885C; IE57677B1; GR850947B; HK8395A; HU202275B; AR241314A1; NL940016I1; NZ211824A; AU601358B2; NO851563L; AU5295890A; JPS60243023A; HUT37654A; EP0160457B1; FI851497L; DE3581312D1; IL74909A; PT80292A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av human faktor VIII og vektorene pAML3P.8cl og pESVDA.

Foreliggende oppfinnelse er basert delvis på oppdagelsen av DNA-sekvensen og den avledete aminosekvensen av human faktor VIII samt tilknyttede deler av faktor Vlll-molekylet som man har funnet er funksjonelle bioaktive delgrupper. Denne opp-dagelse ble muliggjort ved fremstilling av faktor VIII i forskjellige former via anvendelsen av rekombinant DNA-teknologi, hvilket igjen muliggjorde fremstillingen av materialer av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet, med hvilke det kunne utføres biologiske forsøk og bevis for biologisk funksjonalitet. Etter å ha bestemt dette er det mulig å skreddersy spesielle typer av faktor VIII via genetisk manipulasjon og in vitro-behandling, og på effektiv måte å komme frem til hittil uoppnåelige kommersielle praktiske mengder av aktive faktor Vlll-produkter. Foreliggende oppfinnelse er rettet mot disse tilknyttede utførelsene.

Publikasjoner og andre materialer herav benyttet for å be-lyse oppfinnelsens bakgrunn, og i spesielle tilfeller for å tilveiebringe ytterligere detaljer vedrørende dens ut-førelse er vist til heri og oppsummert til slutt i foreliggende beskrivelse i form av en litteraturfortegnelse.

Vedlikeholdet av et intakt vaskulært system krever samvirke av en rekke forskjellige celler og proteiner. Ved skade på det vaskulære sjikt igangsettes en rekke reaksjoner for å hindre væsketap. Den innledende reaksjon er aktivering av blodplater som fester seg til såret og gjennomgår en rekke reaksjoner. Disse reaksjoner innbefatter tiltrekning av andre blodplater til stedet, frigjøring av en rekke organiske forbindelser og proteiner og dannelse av en trombogen over-flate for aktivering av blodkoaguleringskaskaden. Gjennom denne kombinerte rekke av reaksjoner dannes en blodplateplugg som tetter såret. Blodplatepluggen stabiliseres ved dannelsen av fibrintråder rundt pluggen og hindrer uønsket væsketap. Blodplatepluggen og fibrinmatrisen oppløses deretter langsomt ettersom såret leges. For en generell over-sikt vises det til (1).

En kritisk faktor når det gjelder å stoppe blødning, er aktiveringen av koaguleringskaskaden for å stabilisere den innledende blodplateplugg. Dette system består av over et dusin samvirkende proteiner som er til stede i plasma, samt frigjorte og/eller aktiverte cellulære proteiner (2, 3). Hvert trinn i kaskaden innebærer aktivering av en spesifikk inaktiv (zymogen) form av en protease til den katalytisk aktive formen. Ved en internasjonal overenskomst (4)

har hvert protein i kaskaden blitt tildelt en romertall-betegnelse. Den zymogene formen for hver er representert ved romertallet, mens den aktiverte formen er representert ved romertallet fulgt av et indeks "a". Den aktiverte formen for proteasen ved hvert trinn i kaskaden aktiverer på katalytisk måte proteasen som er involvert i det etter-følgende trinn i kaskaden. På denne måte blir en liten innledende stimulus som resulterer i aktiveringen av et protein ved begynnelsen av kaskaden katalytisk for-sterket ved hvert trinn slik at det endelige resultat er dannelsen av et utbrudd av trombin, med den resulterende trombinkatalyserte omdannelse av det oppløselige protein-fibrinogen til dens uppløselige form, fibrin. Fibrin har egenskapen av selv-aggregatdannelse til tråder eller fibre som virker slik at de stabiliserer blodplatepluggen slik at pluggen ikke lett løsner.

Fig. 1 oppsummerer den alminnelig utbredte forståelse av reaksjoner mellom proteinene som er involvert i blod-koagulering. Mangelen eller mangelfullheten på noen av proteinene som er involvert i kaskaden, ville resultere i en blokkering av propageringen av den innledende stimulus for fremstillingen av fibrin. I midten av kaskaden representert på fig. 1 er det et trinn hvori faktor IXa initierer omdannelsen av faktor X til den aktiverte formen, faktor Xa. Faktor VIII (også synonymt referert til som faktor VIIIC) blir i dag antatt å virke ved dette trinnet, i nærvær av fosfolipid og kalsiumioner, som en kofaktor; dvs. den har ingen kjent funksjon i seg selv, og er nødvendig for å for-øke aktiviteten til faktor IXa. Dette trinnet i kaskaden er kritisk fordi de to mest vanlige hemofili-sykdommene har blitt bestemt til å forårsakes av den nedsatte funk-sjonering av enten faktor VIII (hemofili A eller klassisk hemofili) eller faktor IXa (hemofili B). Omkring 80% av hemofiliforstyrrelsene skyldes en mangel på faktor VIII. Kliniske manifestasjon i begge typer av sykdommer er den samme: en mangel på tilstrekkelig fibrindannelse som er nødvendig for blodplateplugg-stabilisering, hvilket resulterer i en plugg som lett løsner med etterfølgende ny blødning på stedet. Den relativt høye hyppighet av mangel på faktor VIII og faktor IX sammenlignet med de andre faktorene i koaguleringskaskaden skyldes deres genetiske binding til X-kromosomet. Et enkelt defekt arveanlegg i gener for faktor VIII eller faktor IX resulterer i hemofili hos hankjønn som bare har en kopi av X-kromosomer. De andre koaguleringsfaktorene er autosomalt bundet og krever vanligvis tilstedeværelsen av to defekte arveanlegg for å forårsake en blodkoaguleringssykdom, - et meget mindre vanlig tilfelle. Således er hemofili A og B langt de mest vanlige arvelige blodstørkningssykdommene, og de fore-kommer nesten utelukkende hos hankjønn.

For flere tiår siden var gjennomsnittsalderen for dødsfall hos personer med hemofili 20 år eller mindre. Mellom tidlig i 1950-årene og sent i 1960-årene ledet forskning omkring faktor VIII-sykdommen til behandling hemofili A til å begynne med hel plasma og senere med konsentrater av faktor VIII. Den eneste kilden for human faktor VIII har vært humant plasma. En annen faktor som bidrar til omkostningene, er prisen som er forbundet med oppnåelse av store mengder brukbart plasma. Kommersielle firmaer må etablere donasjonssentere, gi godtgjørelse til donorer og opprettholde plasma i en frossen tilstand umiddelbart etter donasjonen og gjennom forsendelse til bearbeidelses-anlegget. Plasmaprøvene samles i partier på over 1000 donorer og behandles. P.g.a. ustabiliteten til faktor VIII-aktiviteten er store tap knyttet til noen få enkle rense-metoder som benyttes for fremstilling av konsentratene

(som resulterer i omkring en 15% aktivitetsgjenvinning).

De resulterende farmasøytiske produktene er meget urene

og har en spesifikk aktivitet på 0,5-2 faktor Vlll-enheter pr. mg protein (en enhet av faktor Vlll-aktivitet er ved definisjon den aktivitet som er til stede i 1 ml plasma). Den bestemte renhet for faktor VIII-konsentrat er

omkring 0,04% faktor VIII protein, beregnet på vekt.

Dette høye urenhetsnivå er forbundet med en rekke alvor-lige komplikasjoner inkl. utfelt protein, hepatitt, og muligens det materiale som er ansvarlig for ervervet immundefektsyndrom (AIDS). Disse ulemper med faktor VIII-konsentratene skyldes ustabiliteten til det plasma-

avledede faktor VIII, og dets ervervelse fra en samling av flere donorer. Dette betyr at skulle et individ blant de 1000 donorene ha f.eks. hepatitt, ville hele partiet være infisert med viruset. Donorer undersøkes for hepatitt B, men det er kjent at konsentratene inneholder både hepatitt A og hepatitt ikke-A ikke-B. Forsøk på å fremstille et produkt med høyere renhet resulterer i uakseptable store tap av aktivitet, og derved økes omkostningene.

Historikken med rensing av faktor VIII illustrerer vanskeligheten ved å arbeide med dette proteinet. Denne vanskelighet skyldes for en stor del ustabiliteten og spormengdene av faktor VIII som inneholdes i helt blod. I de tidlige 1970-årene ble det karakterisert et protein som da ble antatt å være faktor VIII (5, 6, 7). Dette proteinet ble bestemt for å være et aggregat av et underenhet-glykoprotein, idet underenheten viste en molekylvekt på omkring 240.000 dalton bestemt ved SDS-gelelektroforese. Denne underenheten aggre-gerte til en heterogen populasjon av enheter med høyere molekylvekt varierende fra mellom en million og 20 millioner dalton. Proteinet var til stede i hemofilisk plasma, men manglet i plasma hos pasienter med von Willebrand's sykdom, en autosomalt overført genetisk forstyrrelse kjennetegnet ved en forlenget blødningstid og lave nivåer av faktor VIII (8). Den teori som da ble fremsatt, var at dette høymolekylære protein, betegnet von Willebrand-faktor (vWF) eller faktor Vlll-beslektet antigen (FVIIIRAg), var ansvarlig for koagule-ringsdefekten i begge sykdommer, idet proteinet var fra-værende i von Willebrand's sykdom og på en viss måte ikke-funksjonelt i klassiske hemofilisykdomstilstander (9).

Det ble imidlertid senere observert at under visse betingelser, særlig høye saltkonsentrasjoner, så kunne faktor VIII-aktiviteten separeres fra dette protein som var antatt å

være ansvarlig for aktiviteten til faktor VIII (10-20).

Under disse forhold viste faktor VIII koagulant aktivitet en molekylvekt på 100.000-300.000. Etter denne tid har store anstrengelser konsentrert seg om å identifisere og karakterisere proteinet (proteinene) som er ansvarlige for koagulantaktiviteten til faktor VIII. Tilgjengeligheten av bare spormengder av proteinet i helt blod koblet med dets ustabilitet har imidlertid vanskeliggjort slike studier.

Forsøk på å isolere faktor VIII protein(er) fra naturlige kilder, både humane og animalske, i varierende renhets-tilstander, har blitt rapportert (21-27, 79). P.g.a. de ovennevnte problemer eksisterer muligheten for feilaktig identifikasjon og etterfølgende kloning og ekspresjon av et kontaminerende protein i et faktor Vlll-preparat istedenfor det tilsiktede faktor Vlll-protein. At denne mulighet er virkelig, understrekes ved den ovennevnte feilaktige identifikasjon av von Willebrand-protein til å være faktor VHI-koaguleringsproteinet. Forvirring angående identifikasjonen av faktor Vlll-lignende aktivitet er også en avgjort mulighet. Enten faktor Xa eller trombin ville forårsake en forkortning av levringstiden for forskjellige plasmaer, inkludert faktor Vlll-mangelfullt plasma, og derved synes å utvise faktor Vlll-lignende aktivitet med mindre riktige kontroller ble foretatt. Visse celler er også kjent for å produsere aktiviteter som kan funksjonere på en måte meget lik den som forventes av faktor VIII (28, 29, 30). Sist-nevnte referanse (30) beviser at denne faktor VIII-

lignende aktivitet faktisk er en proteinbetegnet vevs-faktor. Det samme eller lignende materiale har også blitt renset fra human placenta (31). Dette protein virker, i sammenheng med plasmaproteinfaktor VII, ved det samme trinnet som faktor VIII og faktor IXa, hvilket resulterer av aktivering av faktor X til faktor Xa.

Bevisbyrden for ekspresjon av en rekombinant faktor VIII ville derfor ligge på beviset for funksjonell ekspresjon av det som utvilsomt er en faktor Vlll-aktivitet. Skulle endog tidligere forskere vise at de oppnådde en full eller partiell klon som koder all eller en del av faktor VIII, kunne de tekniske problemer ved ekspresjonen av et rekombinant protein som er fire ganger større enn noe annet rekombinant protein som hittil er uttrykt, godt ha vist seg å være uoverstigelig for forskere av vanlig dyktighet.

De potensielle artifakter og problemer som er beskrevet ovenfor, antyder i kombinasjon behovet for grundig under-søkelse av eventuelle påstander om vellykket kloning og ekspresjon av human faktor VIII. Foreliggende oppfinnelses vellykkethet fremgår ved: 1) Immunologisk kryssreaktivitet for antistoffer satt opp mot klon-avledede faktor Vlll-proteiner med plasma-avledede faktor Vlll-proteiner. 2) Kryssreaksjon av nøytraliserende monoklonale antistoffer satt opp mot human plasma faktor VIII med protein kodet av klonen. 3. Identifikasjon av genomisk DNA tilsvarende faktoren VIII-cDNA til å være lokalisert i X-kromosomet, hvor faktor

VIII-genet er kjent for å være innkodet.

4. Ekspresjon av et funksjonelt protein som viser:

a) Korreksjon av faktor Vlll-mangelfullt plasma.

b) Aktivering av faktor X til faktor Xa i nærvær av faktor IXa, kalsium og fosfolipid. c) Inaktivering av aktiviteten observert i a) og b) ved antistoffer som er spesifikke for faktor VIII. d) Binding av aktiviteten til en immobilisert monoklonal-antistoffkolonne som er spesifikk for

faktor VIII.

e) Aktivering av faktor Vlll-aktiviteten med trombin. f) Binding av aktiviteten til og etterfølgende

eluering fra immobilisert von Willebrand-faktor.

Foreliggende oppfinnelse er således basert på den vellykkede bruk av rekombinant DNA-teknologi for fremstilling av funksjonell human faktor VIII, og i mengder som er tilstrekkelig til å bevise identifikasjon og funksjonalitet og for å initiere og utføre animalsk og klinisk testing som vilkår for godkjennelse på markedet. Produktet, human faktor VIII, er egnet for bruk i alle sine funksjonelle former, ved profylaktisk eller terapeutisk behandling av mennesker som ved diagnose er blitt funnet å mangle faktor VIII-koaguleringsaktivitet. Foreliggende oppfinnelse er således i et viktig aspekt rettet mot fremgangsmåter for dignose og behandling av klassisk hemofili, hemofili

hos mennesker ved bruk av faktor VIII og mot egnede farma-søytiske preparater for dette.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av human faktor VIII, kjennetegnet ved at eukaryote vertsceller transformeres med ekspresjonsvektoren pAML3P. 8 cl, (fig. 12 III), cellene dyrkes og faktor VIII isoleres fra cellene.

Vektor pAML3P.8cl (fig. 12III) er også beskrevet. Den er kjennetegnet ved at den kan uttrykke i en pattedyrvertscelle DNA kodende for full-lengde humanfaktor VIII, og den inneholder en adenovirus tripartitt-leder spleiset i dennes tredje exon til den 5' utranslaterte regionen til humanfaktor VIII, etterfulgt av et strukturelt gen kodende for full-lengde humanfaktor VIII inkludert dets signalsekvens, den 3' utranslaterte regionen som er spleiset ved et Hpal sete til den 3' utranslaterte regionen til hepatitt B overflateantigenet, etterfulgt av et gen kodende for DHFR som har en SV40 tidlig promoter og en hepatitt 3' utranslatert region som utviser et funksjonelt polyadenyleringssignal.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også vektor pESVDA, kjennetegnet ved at den kan tilveiebringe den korresponderende RNA-segmentet av et innskutt faktor VIII DNA-fragment fri for intron ved transkripsjon i en transfektert eukaryot cellekultur, og den inneholder 342 bp PvuII-Hindlll-fragmentet til SV40 virus, som dekker SV40 replikasjonsorigo omgitt av EcoRI seter, og den inneholder polyadenyleringssetet til hepatitt B virus overflateantigen, innbefattet på et 580-bp BamHI-Bglll-fragment, der det mellom EcoRI-setet etter SV40 til promoteren og BamHI-setet til hepatitt B virusoverflateantigenet er skutt inn PvuII-Hindlll-fragmentet , inneholdende donorspleisesetet til den første sene lederen, øyeblikkelig etterfulgt av 840-bp Hindlll-SacI-fragmentet til Adenovirus 2, inneholdende Elb akseptorspleisesetet, og hvor det mellom donor og akseptorsetene ligger unike Bglll og Hindlll-seter for innskudd av genomiske (f.eks. faktor VIII) DNA-fragmenter, som vist i figur 6. Faktor VIII DNA-isolatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, som koder for funksjonell enhet(er) av human faktor VIII, finner anvendelse innen genterapien idet de gjenoppretter faktor VIII-aktivitet hos individer som mangler denne ved inkorporering av slikt DNA, f.eks. via hemato-poetiske stamceller.

Særlig foretrukken utførelse

Human faktor VIII fremstilles i fuksjonell form i et spesielt egnet vertcellesystem. Dette system innbefatter nyreceller fra babyhamster (BHK-21 (C-13), ATCC Nr. CCL 10) som har blitt transformert med en ekspresjonsvektor omfattende DNA som koder for human faktor VIII, inkludert 3'- og 5'-utranslatert DNA derav og sammenføyet ved det 3'-utranslaterte området med 3'-utranslatert terminator DNA-sekvens, f.eks. slik som fra hepatitt B-overflateantigen-gen. Ekspresjonen av genet drives av transkripsjonshoved/sen-promoter sammen med dens 5'-spleisede leder samt elementer avledet fra SV40-replikasjonsonsopprinnelsesområde inkludert transkripsjonsfremmende sekvenser og promotersekvenser. I tillegg kan ekspresjonsvektoren også inneholde et gen kodende for DHFR drevet av en SV40 tidlig promoter som gir gen-amplifikasjonsevne, og et utvelgbart markørgen, f.eks. neomycinbestandighet (som kan tilveiebringes vis kotrans-feksjon med et separat vektorbærende neomycinbestandig-hetspotensial).

Beskrivelse av tegningene

Fig. 1. Skjematisk representasjon av koaguleringskaskaden (2) . Fig. 2. Smelting av DNA i TMAC1 og 6x SSC. A: For hvert punkt ble ti duplikataliquoter av *y DNA først bundet til nitro-cellulosefilteret. Disse filtre ble deretter hybridisert uten formamid ved 37°C som beskrevet i nedenfor angitte metoder. Par av flekker ble deretter vasket i 6xSSC, 0,1% SDS ( ) eller 3,0 M TMAC1, 50 mM Tris HCl, ;pH 8,0, 0,1% SDS, 2mM EDTA (0) i 2°C-forøkelser fra 38 ;til 56°C. Smeltetemperaturen er det punkt hvor 50% av hybridiseringsintensiteten ble beholdt. B: Et smelteforsøk som panel A ble foretatt ved binding av aliquoter av pBR322 DNA til nitrocellulosefiltere. Probe-fragmenter av forskjellige lengder ble utviklet ved nedbrytning av pBR322 ;32 ;med Mspl, ende-merking av fragmentene med P og isolering på polyakrylamidgeler. Probe-fragmentene fra 18 til 75 b ble hybridisert uten formamid ved 37°C og de fra 46 til 1374 b i 40% formamid ved 37°C som beskrevet i metodene. Filtrene ble vasket i 3,0 M tetrametylammoniumklorid (TMACl), 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 0,1% SDS, 2 mM EDTA i 3°C- økninger ;for å bestemme smeltetemperaturen. (0) smeltetemperatur bestemt for pBR322 Mspl-probe-fragmenter (A) smelte-temperaturer i 3,0 M TMACl for panel A for 11-17 b prober. ;Fig. 3. Deteksjon av faktor Vlll-genet med probe: 8,3. De tre panelene til venstre: Southern-flekker av 46, XY (IX, hankjønn) DNA og 49,XXXXY (4X) human DNA nedbrutt med EcoRI og BamHI ble hybridisert i 6xSSC, 50 mM natrium fosfat ;(pH 6,8), 5x Denhardfs oppløsning, 0,1 g/l kokt, sonikert laksesperm av DNA, 20% formamid ved 42°C som beskrevet i metodene. De tre flékkene ble vasket i IxSSC, 0,1% SDS ved den angitte temperatur. Spor 1, EcoRI IX; spor 2, EcoRI 4X; spor 3, BamHI IX; og spor 4, BamHI 4X. Spor M, ende- ;merket XHindlll og ... 4>X174 ,HaeIII nedbrutte markør-fragmenter. Høyre panel: Et nitrocellulosefilter fra X/4X biblioteket hybridisert med probe 8,3. Piler indikerer to av de uavhengige faktor Vlll-positive klonene. Hybridisering og vasking for arkivutvalget var som ;beskrevet ovenfor for Southern-flekkene, med en vaske-temperatur på 37°C. ;Fig. 4. Kart av human faktor VIII gen. ;Topplinjen viser stillingene og de relative lengdene av ;de 26 proteinkodende områdene (eksoner A til Z) i faktor ;VHI-genet. Transkripsjonsretningen er fra venstre mot ;høyre. Den andre linjen viser kartets skala i kilobasepar (kb). Plasseringen av gjenkjennelsessetene for de 10 restriksjonsemzymene som ble benyttet for å kartlegge faktor VTII-genet er gitt i neste serie av linjer. ;De åpne rektanglene representerer utstrekningen av ;human genomisk DNA som inneholdes i hvert av Xfag (X114, X120, X222, X482, X599 og X605)- og kosmid (p541, p542, p543, p612, 613, p624)-klonene. Bunnlinjen viser plasseringene av prober benyttet i de genomiske avsøkningene og referert til i teksten: 1) 0,9 kb EcoRI/ BamHI fragment fra p543; 2) 2,4 kb EcoRI/BamHI fragment fra X222; 3) 1,0 kb Ndel/BamHI triplet av fragmenter fra ;yl20; 4/ oligonikleotid-probe 8,3; 5) 2,5 kb StuI/EcoRI fragment fra X114; 6) 1,1 kb EcoRI/BamHI fragment fra X48 2; 7) 1,1 kb BamHI/EcoRI fragment fra p54 2. Southern-flekkanalyse av 46,XY og 4 9,XXXXY genomisk DNA viste ingen skjelnelige forskjeller i organisasjonen av faktor VIII genet. ;Fig. 5. Kosmid-vektor pGcos4. Det 403 b-fusjonerte HincII-fragment i i Xcl857S7 (Bethesda Research Lab.) inneholdende cos-setet, ble. klonet i pBR322 fra Aval til PvuII for å utvikle plasmidet pGcosl. Separat ble 1624 b PvuII til Nael fragmentet av pFR400 (49n) inneholdende SV40 opphav ;og promoter et mutant dihydrofolat-reduktasegen og hepatitt B overflateantigen-termineringssekvenser, klonet inn i pBR322 Ahalll-sete for å utvikle plasmidet mp33dhfr. ;En tre-del ligering og kloning ble deretter foretatt med ;1497 b SphI til Ndel fragmentet av pGcosl, 3163 b Ndel til EcoRV fragmentet i mp33dhfr, og 376 b EcoRV til SphI fragmentet i pKT19 for å utvikle kosmidvektoren pGcos3. ;pKTl9 er et derivat av pBR322 hvori BamHI-setet i tetra-cyklin-resistensgenet har den muterte nitroguanocin-behandling. pGcos4 ble utviklet ved kloning av den syntetiske 20mer, ;5' AATTCGATCGGATCCGATCG, i EcoRI til pGcos3. ;Figur 6. Kart av pESVDA. 342 b PvuII-Hindlll fragmentet i SV40 virus som spenner over SV40 replikasjonsopphavet og modifisert til å bli bundet av EcoRI-seter (73), poly-adenyleringssete til hepatitt B virus (HBV)-overflateantigen (49n), som befinner seg på et 580 bp BamHI-Bglll fragment, ;og pBR322 derivatet pML (75) har tidligere blitt beskrevet. Mellom EcoRI-setet etter SV40-tidlig promotoren, og BamHI-setet i HBV ble innført PvuII-HindIII-fragmentet (kart-koordinater 16.63-17.06 i adenovirus 2) inneholdende donorspleisesetet i den første sene lederen (stilling 16.65) umiddelbart fulgt av 84 0 bp Hindlll-SacI fragmentet i adenovirus 2 (stilling 7.67-9.97) (49j), inneholdende Elb-akseptorspleisesete ved kartstilling 9.83. Mellom donor- og akseptorsetene ligger unike Bglll og Hindlll-seter for innføring av genomiske DNA-fragmenter. ;Fig. 7. Analyse av RNA-transkripter fra pESVDA-vektorer. Sammenløpende 10 cm skåler med COS-7-celler (77) ble transfisert med 2^ug plasmid DNA ved bruk av den modifiserte DEAE-dekstranmetoden(84) som beskrevet (73). RNA ble fremstilt fire dager post-transfeksjon fra cytoplasmiske ekstrakter (49n) og elektroforesebehandlet i denaturerende formaldehyd-agarose-geler. Etter overføring til nitrocellulose ble filteret hybridisert med passende 32 ;P-merket DNA som beskrevet senere under metoder. Filteret ble vasket i 2X SSC, 0,2% SDS ved 4 2° og eksponert for "Kodak XR5"-film. Stillingen de 28S og 18S ribosomale RNA'er er angitt med pil i hvert panel. ;9,4 kb BamHI-fragmentet i A114 inneholdende ekson A ;(se fig. 4) ble klonet i Bglll-setet i pESVDA (fig. 6). Plasmid pESVDAlll.6 inneholdt det innførte fragment i orienteringen slik at SV4 0-tidligpromotoren ville transkribere det genomiske fragment i den riktige (dvs. "sense") retning. pESVDAlll.7 inneholder 9,4 kb Bam-fragmentet i den motsatte orientering. Plasmid pESVDA.S127 inneholder 12,7 kb Sacl-fragmentet til X 114 innført (ved butt ende-ligering) i Bglll-setet i pESVDA i den samme orienti ;ringen som pESVDA111.6. ;A. Hybridisering av filtere inneholdende totalt cytoplasmisk RNA fra celler transfisert med pESVDA, pESVDAlll.7 ;og pESVDAlll.6. pESVDA RNA (spor 1), pESVDA111.7 (spor 2), pESVDAlll.6 (spor 3-5). Probet med faktor 8 ekson A-holdig fragment (spor 1-4) eller 1800 b StuI/Bam-fragment (spor 5). Svak kryss-hybridisering sees til 18S RNA. ;B. Hybridisering av RNA med StuI/BamHI probe ("intron-probe"). RNA fra: 1) pESVDA, polyA<->; 2) pESVDA, polyA<+>;3) pESVDAlll.7; polyA~; 4) pESVDAlll.7, polyA<+>; 5) pESVDAlll.6, polyA ; 6) pESVDAlll,6, polyA<+>. Et lite, mørkt hybridiserings-bånd som sees i spor A5, Bl, B3 og B5 representerer sannsynligvis hybridisering til tRNA eller til en Alu-gjentagelsessekvens som finnes i dette område. ;C. Sammenligning av cytoplasmisk RNA fra pESVDAlll.6 (spor ;1) og pESVDA.S127 (spor 2) probet med ekson. A-holdig ;fragment. Merk den svake størrelsesøkning i spor 2, hvilket representerer ytterligere ekson-sekvenser som inneholdes i det større genomiske fragmentet. Fig. 8. Sekvens av pESVDA.S127 cDNA klon S36. DNA-sekvensen i det humane DNA-innskudd er vist for cDNA-klon S36 oppnådd fra ekson-ekspresjonsplasmidet pESVDA.S127 (se infra. for detaljer). Vertikale linjer markerer ekson-grenser som bestemt ved analyse av genomiske og cDNA-kloner i faktor VIII, og eksoner er bokstavbetegnet som på fig. 4. Valgte restriksjon-endonukleaseseter er indikert. Fig. 9. cDNA-kloning. Faktor VIII mRNA er angitt på den tredje linjen idet det åpne rektangelet representerer det modne proteinkodende området, det skraverte arealet representerer det signalpeptid-kodende område, og tilstøtende linjer representerer utranslaterte områder i meddeler-elementet. 5<1->enden i mRNA befinner seg på venstre side. ;Over denne linjen er vist utstrekningen av ekson B- ;området i den genomiske klon X222, og under mRNA-linjen er representert de seks cDNA-klonene ut fra hvilke den fulle mengden av faktor Vlll-klonen er sammensatt (se tekst for detaljer). cDNA-synteseprimere 1, 3, 4 og oligo(dT) er vist med piler som illustrerer synteseretningen for hvilken de primet. Valgte restriksjon-endonukleaseseter og en størrelsesskala i kilobaser er inkludert. ;Fig. 10. Sekvens av human faktor VIII gen. Den fullstendige nukleotidsekvensen til kompositt faktor VIII cDNA klonen er vist med nukleotider nummerert fra til venstre for hver linje. Nr. 1 representerer A i translasjon-initieringskodonet ATG. Negative tall refererer til 5'-utranslatert sekvens. (mRNA-kartleggingseksperimenter foreslår at faktor VIII mRNA strekker seg omtrent 6 0 nukleotider lengre enn 5'-stillingen minus 109 som er vist her. ;Den predikerte proteinsekvens er vist over DNA. Tall over aminosyrene er Sl-19 for det predikerte signalpeptid, og 1-2332 for det predikerte modne protein. "Op" betegner opal-translasjonsstoppkodonet TAG. 3'- polyadenylerings-signalet AATAAA er understreket og åtte rester av poly(A)-halen (funnet i klon Åcl0.3) er vist. Sekvenshomologene til den syntetiske oligonukleotidproben 8.3 har også blitt, understreket (nukleotider 5557-5592). Valgte restriksjon-endonukleasespaltningsseter er vist over den riktige sekvens. Nukleotider 2671-3217 representerer sekvens avledet fra genomiske kloner mens resten representerer cDNA-sekvens. ;Den komplette DNA-sekvens for det proteinkodende området ;i human faktor Vlll-genet ble også bestemt fra de genomiske kloner som er beskrevet. Bare to nukleotider adskilte seg fra sekvensen vist på denne figur avledet fra cDNA-kloner (unntatt nukleotider 2671-3217) . Nukleotid 3780 (understreket) er G i cDNA-klonen, hvilket endrer aminosyre- ;kodonen 1241 fra asp til glu. Nukleotid 8728 (understreket) ;i det 3'-utranslaterte området er A i den genomiske klon. ;Fig. 11. Sammensetning av den fulle lengde av rekombinant faktor VIII plasmid. Se teksten i seksjon 8a for detaljer ved sammensetningen av plasmid pSVEFVIII inneholdende den fulle lengde av humanfaktor VIII cDNA. Nummereringen av stillinger adskiller seg fra dem i teksten og fig. 10 ved 72bp. Fig. 12. Sammensetning av faktor VIII ekspresjonsplasmidet. Se teksten i seksjon 8b for detaljer vedrørende sammensetningen av plasmidet pAML3p.8cl som dirigerer ekspresjonen av funksjonelle humanfaktor VIII i BHK-celler. Fig. 13. Western-analyse av faktor VIII ved anvendelse av fusjonsprotein-antisera. Human faktor VIII ble separert på ;en 5-10% polyakrylamidgradient-SDS-gel ifølge metoden i (81). Et spor for faktor VIII ble farget med sølv (80). ;De resterende spor for faktor VIII ble elektroforetisk overført til nitrocellulose for western-flekkanalyse. Radioaktivt merkede standarder ble anbragt i spor tilstøtende faktor VIII for å bestemme molekylvekten til observerte bånd. Som antydet ble nitrocellulosestrimlene inkubert med hensiktsmessig antisera, vasket og probet med 125 ;I protein A. Nitrocellulosearkene ble underkastet autoradiografi. ;Fig. 14. Analyse av fusjonsproteiner under anvendelse av C8 monoklonalt antistoff. Fusjonsproteiner 1, 3 og 4 ;ble analysert ved Western-flekkanalyse med henblikk på reaktivitet med faktor VIII spesifikt monoklonalt antistoff C8. ;Fig. 15. Elueringsprofil for høytrykk-væskekromatografi (HPLC) av faktor VIII på en "Toya Soda TSK 4 000 SW"-kolonne. Kolonnen ble ekvilibrert og utviklet ved romtemperatur med 0,1% SDS i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0. Fig. 16. Elueringsprofil for reversert fase HPLC-separering av faktor VIII tryptiske peptider. Separeringen ble foretatt på en "Synchropak RP-P C-18"-kolonne (0,46 cm x 25 cm x lOyum) under anvendelse av en gradienteluering av acetonitril (1% til 70% i 200 min.) i 0,1% trifluoreddiksyre. Pilene indikerer toppen inneholdende peptidet med sekvensen AWAYFSDVDLEK. Fig. 17. Trombinaktivering av renset faktor VIII aktivitet. Celle-supernatanten ble kromatografert på C8 monoklonal-harpiksen, og dialysert for å fjerne elueringsbuffer. Trombin (25ng) ble tilsatt ved tid 0. Aliquoter ble fortynnet 1:3 ved de angitte tider og analysert med henblikk på koaguleringsaktivitet. Enheter pr. ml ble beregnet fra en standard-kurve for normal humanplasma. ;A. Definisjoner ;Den heri benyttede betegnelse "human, faktor VIII" betegner et funksjonelt protein som in vivo eller in vitro kan korrigere human faktor VIII mangler, kjennetegnet f.eks. ved hemofili A. Proteinet og tilknyttede aktiviteter er også referert til som faktor VIIIC (FVIIIC) og faktor VIII koagulantantigen (FVIIICAg)(31a). Slik faktor VIII fremstilles ved hjelp av rekombinante cellekultur-systemer i aktiv form(er) tilsvarende faktor VIII-aktivitet som er nativt til humanplasma. (En "enhet" av human faktor VIII aktivitet har blitt definert som den aktivitet som er til stede i 1 ml normalt humanplasma.) Faktor VIII protein fremstilt heri er definert ved hjelp av DNA-gen- og aminosyre-sekvensangivelse, ved fysikalske egenskaper og ved biologisk aktivitet. ;Faktor VIII har flere nedbrytningsformer eller behandlede former i naturlig tilstand. Disse er proteolytisk avledet fra en forløper, et kjedeprotein, som demonstrert heri. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et slikt enkelt kjedeprotein og tilveiebringer også fremstilling per se Slike produkter inneholder eh funksjonell aktiv del eller deler tilsvarende nativt materiale. ;Det er sannsynlig at alleliske variasjoner eksisterer. Disse variasjoner kan demonstreres ved en eller flere aminosyreforskjeller i den totale sekvensen eller ved utelatelser, substitusjoner, innskudd eller inversjoner av en eller flere aminosyrer i den totale sekvensen. ;I tillegg kan plasseringen og graden av glykosylering avhenge av naturen av det cellulære vertmiljø. Ved bruk av rekombinat DNA-teknologi eksisterer også potensiale for fremstilling av forskjellige human faktor VIII-derivater, forskjellig modifisert ved resulterende enkle eller multiple aminosyreutelatelser-substitusjoner-innskudd eller -inversjoner, f.eks. ved hjelp av sete-rettet mutagenese av underliggende DNA. I tillegg kan fragmenter av human faktor VIII, enten fremstilt in vivo eller in vitro, være i besittelse av den nødvendige nyttige aktivitet, som omtalt ovenfor. Alle slike alleliske variasjoner, glykosylerte versjoner, modifikasjoner og fragmenter resulterende i derivater av faktor VIII, inn-befattes i foreliggende oppfinnelse så lenge som de inneholder det funksjonelle segment av human faktor VIII og den vesentlige, karakteristiske human faktor VIII funksjonelle aktivitet forblir upåvirket i type. Slike funksjonelle varianter eller modifiserte derivater er betegnet "human faktor Vlll-derivater" heri. De derivater av faktor VIII som er i besittelse av den nødvendige funksjonelle aktivitet kan lett identifiseres ved enkle in vitro forsøk som beskrevet heri. Fra angivelsen av sekvensen av human faktor VIII DNA heri og aminosyresekvensen for human faktor VIII, vil de fragmenter som kan avledes via restriksjonsenzym-avspalting av DNA eller proteolytisk nedbrytning eller annen nedbrytning av human faktor Vlll-protein, være åpenbare for fagmannen. ;Således er human faktor VIII i funksjonell form, dvs. "funksjonell human faktor VIII", i stand til å katalysere omdannelsen av faktor X til Xa i nærvær av faktor IXa, kalsium og fosfolipid, samt å korrigere koagulerings-defekten i plasma avledet fra hemofili A-angrepne individer, og klassifiseres ytterligere som "funksjonell human faktor VIII" basert på immunologiske egenskaper som demonstrerer identitet eller vesentlig identitet med human plasma VIII. ;Benyttet for å beskrive tilstanden til "human faktor VIII" fremstilt ifølge oppfinnelsen betyr "vesentlig ren form" vesentlig fri for protein eller andre materialer som vanligvis er forbundet med faktor VIII når denne er isolert fra ikke-rekombinante kilder, dvs. fra dets "native" plasmaholdige miljø. ;"DHFR protein" refererer til et protein som kan utvise aktivitet forbundet med dihydrofolatreduktase (DHFR) og som derfor må fremstilles av celler som kan overleve på medium som mangler hypoxantin, glycin og tymidin (-HGT medium). Generelt er celler som mangler DHFR protein ute av stand til å vokse på dette mediet, celler som inneholder DHFR-protein lykkes i dette. ;"Ekspresjonsvektor" innbefatter vektorer som kan uttrykke DNA-sekvenser inneholdt deri når slike sekvenser er opererbart forbundet med andre sekvensen som kan bevirke deres ekspresjon. Disse ekspresjonsvektorer replikerer ;i vertcellen enten ved hjelp av et intakt, opererbart replikasjonsopphav eller ved hjelp av funksjonell integre-ring til cellekromosomet. Igjen er "ekspresjonsvektor" gitt en funksjonell definisjon, og enhver DNA-sekvens som kan bevirke ekspresjon av en spesifisert DNA-kode beliggende deri, er inkludert i denne betegnelsen når den benyttes på den spesifiserte sekvens. Generelt er ekspresjonsvektorer med nyttevirkning innen rekombinante DNA-teknikker ofte i form av "plasmider" som referer til sirkulære, dobbeltkjedede DNA-sløyfer. Oppfinnelsen skal imidlertid også innbefatte slike andre former for ekspresjonsvektorer som tjener ekvivalente funksjoner. ;"DNA-isolat" betyr DNA-sekvensen innbefattende sekvensen som koder for human faktor VIII, enten alene eller som inkorporert i en kloningsvektor. ;"Rekombinant vertcelle" refererer til celler/celler som. har blitt transformert med konstruerte vektorer ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker. Som definert heri, fremstilles faktor VIII eller funksjonelle segmenter derav i de mengder som oppnås i kraft av denne transformasjon i stedet for i slike mindre mengder og renheter som ville kunne fremstilles av en utransformert, naturlig vertskilde. Faktor VIII fremstilt av slike "rekombinante vertceller" kan betegnes som "rekombinant human faktor ;VIII". ;Størrelsesenheter for DNA og RNA er ofte forkortet som følger: b=base eller basepar; kb = kilo (ett tusen) base eller kilobasepar. For proteiner forkortes: D = Dalton; kD = kiloDalton. Temperaturer er alltid gitt i grader Celcius. ;B. Vertcellekulturer og vektorer ;Nyttig rekombinant human faktor VIII kan fremstilles ;ifølge foreliggende oppfinnelse i en rekke forskjellige rekombinante vertceller. Et spesielt foretrukket system er beskrevet heri. ;Generelt er prokaryoter foretrukket for kloning av DNA-sekvenser ved konstruksjon av vektorer som er nyttige i oppfinnelsen. F.eks. er E. coli K12 stamme 294 ;(ATCC nr. 31446) særlig nyttig. Andre mikrobielle stammer som kan anvendes, innbefatter E. coli-stammer, slik som E. coli B, og E. coli X1776 (ATTC No. 31537), og E. coli c600 og c600hfl, E. coli W3110 (F~, A~, prototrofisk, ;ATTC nr. 27325), basiller slik som Bacillus subtilus, og andre enterobakteriaceae slik Salmonella typhimurium eller Serratia marcesans, og forskjellige pseudomonas-arter. Disse eksempler er naturligvis bare ment å være illustrerende istedenfor begrensende. ;Generelt blir plasmidvektorer inneholdende replikon og kontrollsekvenser som er avledet fra arter forenlige med vertcellen benyttet i forbindelse med disse verter. Vektoren bærer i alminnelighet replikasjonssete samt markeringssekvenser som kan tilveiebringe fenotypt utvalg ;i transformerte celler. F.eks. blir E. coli typisk transformert ved bruk av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli art (32). pBR322 inneholder gener for ampicillin-og tetracyklinresistens og gir således lett midler for identifikasjon og valgt av transformerte celler. pBR322-plasmidet eller et annet mikrobielt plasmid må også inneholde, eller være modifisert til å inneholde, promotere som kan benyttes av den mikrobielle organismen for ekspresjon av dens egne proteiner. Dissepromoterene som vanligvis benyttes i rekombinant DNA-konstruksjon innbefatter &-laktamase (penicillinase)- og laktose-promotersystemer (33-35) og tryptofan (trp) promoter- ;system (36, 37). Mens disse er de mest vanlig benyttede, ;har andre mikrobielle promotere blitt oppdaget og benyttet, og detaljer angående deres nukleotid-sekvenser har blitt publisert, hvilket gjør det mulig for fagmannen å ligere dem funksjonelt med plasmidvektorer (38). ;I tillegg til prokaryoter kan eukaryotiske mikrober, slik som gjærkulturer, også benyttes. Saccharomyces cerevisiae eller vanlig bakegjær er mest vanlig benyttet blant eukaryote mikroorganismer, skjønt en rekke andre stammer er vanlig tilgjengelige. For ekspresjon i Saccharomyces blir plasmidet YRp7, f.eks., (39 - 41) vanligvis benyttet. Dette plasmidet inneholder allerede trpl-genet som gir en seleksjonsmarkør for en mutant gjærstamme som mangler evne til å vokse i tryptofan, f.eks. ATCC nr. 44076 ;eller PEP-1 (42). Tilstedeværelsen av trpl-lesjonen som et karakteristisk trekk i gjær-vertcellefenomet gir da et effektivt miljø for detektering av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan. ;Egnede promoterende sekvenser i gjærvektorer innbefatter promoterene for 3-fosfoglyceratkinase (43) eller andre glykolytiske enzymer (44, 45), slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, 3-fosfoglycerat-mutase, pyruvat-kinase, triose-fosfat-isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinase. ;Ved konstruksjon av egnede ekspresjonsplasmider blir ;også termineringssekvensene forbundet med disse gener ligert i ekspresjonsvektoren 3' i sekvensen som er ønsket uttrykt for tilveiebringelse av polyadenylering av mRNA og terminering. Andre promotere som har den ytterligere fordel av transkripsjon regulert av vekstbetingelser er promoterområdene for alkoholdehydrogenase 2, iso-cytokrom C, syrefosfatase, nedbrytbare enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme, og ovennevnte glyceraldehyd-3- ;fosfat-dehydrogenase, og enzymer som er ansvarlig for maltose- og galaktoseutnyttelse. Enhver plasmidvektor inneholdende gjær-kompatibel promoter , replikasjonsopphav og termineringssekvenser er egnet. ;Bruk av kulturer av celler avledet fra multicellulære organismer som celleverter er foretrukne, spesielt for ekspresjon av underliggende DNA for fremstilling av den funksjonelle humane faktor VIII herav, og det vises særlig til den foretrukne utførelse herav. I prinsippet er hvirveldyrceller av spesiell interesse, slik som VERO- og HeLa-celler, cellelinjer fra eggstokker hos kinesisk hamster (CHO), og W138-, BHK-, C0S-7- og MDCK-cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler innbefatter vanligvis (om nødvendig) (en) opprinnelse(r) ;for replikasjon, en promoter som befinner seg foran genet som skal uttrykkes sammen med eventuelle nødvendige ribosom-bindende seter, RNA-spleiseseter, polyadenylerings-sete, og transkripsjonene terminatorsekvenser. ;For bruk i pattedyrceller kan kontrollfunksjonene og ekspresjonsvektorene tilveiebringes av viralt materiale. F.eks. er vanlig benyttede promotere- avledet fra polyoma, Simian Virus 40 (SV40) og mest spesielt Adenovirus 2. De tidlige og sene promoterene i SV4 0-virus er nyttige, hvilket også er tilfelle for den sene hovedpromotere. i adenovirus som beskrevet ovenfor. Videre, det er også mulig, og ofte ønskelig, å benytte promoter eller kontrollsekvenser som normalt er forbundet med den ønskede gen-sekvens, forutsatt at slike kontrollsekvenser er kompatible med vertcellesystemene. ;En replikasjonsopprinnelse kan tilveiebringes enten ved konstruksjon av vektoren til å innbefatte en eksogen opp-rinnelse, slik som man kan avlede fra adenovirus eller annen viral (f.eks. polyoma, SV40, SW, BPV, osv.) kilde, eller kan tilveiebringes av den kromosomale replikasjons-mekanismen til vertcellen, dersom vektoren er integrert i vertcellekromosomet. ;Ved lagt av en foretrukken vertcelle for transfeksjon av vektorene ifølge oppfinnelsen som omfatter DNA-sekvenser som koder både faktor VIII og DHFR-protein, er det hensiktsmessig å velge verten i overensstemmelse med typen av benyttet DHFR-protein. Dersom villtype-DHFR-proteinet benyttes, er det foretrukket å velge en vertcelle som mangler DHFR, hvorved man kan benytte den DHFR-kodende sekvens som en markør for vellykket transfeksjon i selektivt medium som mangler hypoxantin glycin og tymidin. ;På den annen side, dersom DHFR-protein med lav bindings-affinitet for MTX anvendes som kontrollsekvens, er det ikke nødvendig å benytte DHFR-resistente celler. P.g.a. at den mutante DHFR er resistent overfor metotreksat, kan MTX-holdige media anvendes som et middel for seleksjon forutsatt at vertcellene i seg selv er metotreksat-sensitive. De fleste eukaryote celler som kan absorbere MTX, synes å være metotreksat-sensitive. ;Alternativt kan et villtype-DHFR-gen anvendes som en forsterkningsmarkør i en vertcelle som ikke mangler DHFR forutsatt at en annen legemiddel-selekterbar markør anvendes, slik som neomycinresistens. ;Eksempler som er angitt i det nedenstående, beskriver ;bruk av BHK-celler som vertceller og ekspresjonsvektorer som innbefatter den sene hoved-adenoviruspromoteren. ;C. Generelle metoder ;Dersom celler uten formidable celleveggbarrierer benyttes som vertceller, utføres transfeksjon ved hjelp av kalsiumfosfat-utfellingsmetoden (46). Andre metoder for innføring av DNA i celler slik som nukleær injeksjon eller ved protoplastfusjon kan imidlertid også benyttes. ;Dersom prokaryote celler eller celler som inneholder vesentlige celleveggkonstruksjoner benyttes, er den foretrukne transfeksjonsmetoden kalsiumbehandling ved bruk av kalsiumklorid (47). ;Konstruksjon av egnede vektorer inneholdende de ønskede kode- og kontrollsekvenser benytter standard ligerings-teknikker. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter spaltes, tilpasses og religeres i den ønskede form for dannelse av de nødvendige plasmidene. ;Spalting foretas ved behandling med restriksjonsenzym (eller enzymer) i egnet buffer. Generelt blir ca. l^ug plasmid eller DNA-fragmenter benyttet med ca. en enzymenhet i ca. 20^ul bufferoppløsning i en time. (Hensiktsmessige buffere og substratmengder for spesielle restriksjonsenzymer er spesifisert av produsenten.Likeledes blir standard-betingelser for bruk av T4-ligase, T4-polynukleotid-kinase og bakteriell alkalisk fosfatase gitt av produsenten. ;Etter inkubasjoner blir protein fjernet ved ekstraksjon med fenol og kloroform og nukleinsyren utvinnes fra den vandige fraksjonen ved utfelling med etanol. Standard laboratorieteknikker er tilgjengelige (48). ;Restriksjonsenzymfragmenter med klebrige ender (overhengende) gis butte ender, f.eks. ved enten: ;Ifyllingsreparasjon: 2-15^ug DNA ble inkubert 50 mM NaCl, ;10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol med 250^um hver av fire deoksynukleosidtrifosfater og åtte enheter DNA-polymerase Klenow-fragment ved 24°C i 30 min. Reaksjonen ble terminert ved fenol- og kloroformekstråksjon og etanolutfelling, eller ;Sl-nedbrytning: 2-15^ug DNA ble inkubert i 25 mM NaOAc (pH 4,5), 1 mM ZnCl2, 300 mM NaCl med 600 enheter S^nuklease ved 37°C i 30 min., fulgt av fenol-, kloroform- og etanolutfelling. ;Syntetiske DNA-fragmenter ble fremstilt ved kjente fosfo-triester (47a)- eller fosforamiditt (47b)-metoder. DNA ut-settes for elektroforese i agarose- eller polyakrylamidgeler i plateform ved standard metoder (48) og fragmenter ble renset fra geler ved elektroeluering (48a). DNA "Southern"-flekkhybridisering fulgte (49a)-metoden. ;RNA "Northern"-flekkhybridiseringer fulgte elektroforese ;i agarosegeler i plateform inneholdende 6% formaldehyd. ;(48, 49b) radiomerkede hybridiseringsprober fremstilles ved vilkårlig kalvetymus-DNA-primet syntese (49c) ved anvendelse av <32>P-merkede nukleotidtrifosfater av høy spesifikk ;32 ;aktivitet ( P: Amersham; Klenow DNA-polymerase: BRL, NEB eller Boehringer-Mannheim). Korte oligonukleotidprober kan ende-merkes med T4-polynukleotidkinase. "Standard salt"-Souther-hybridiseringsbetingelser varierte fra: Hybridisering i 5x SSC (lx SSC = 0,15 M NaCl 0,015 M Na3 citrat , 50 mM Na fosfat, pH 7, 10% dekstransulfat, 5x Denhardfs oppløsning (lx Denhardfs = 0,02% ficoll, 0,02% polyvinyl-pyrroiidon, 0,02% storfe-serumalbumin) , 20-100^ug/ml denaturert laksesperm-DNA, 0-50% formamid ved temperaturer varierende fra 24 til 42°C, fulgt av vaskinger i 0,2-lx SSC pluss 0,1% SDS ved temperaturer varierende fra 24 til 65°C. Tørkede filtere ble eksponert for "Kodak XAR"-film ved bruk av DuPont "Lightning-Plus" intensiverende filtere ved -80°C. Se generelt (48). ;For Northern-flekk-screening av celle- og vev-RNA, ble hybridisering foretatt i 5x SSC, 5x Denhardfs oppløsning, 10% dekstransulfat, 50% formamid, 0,1% SDS, 0,1% natrium-pyrofosfat, 0,1 mg/ml E. coli tRNA ved 42°C natten over med 32 ;P-merket probe fremstilt fra 189 bp StuI/HincI-fragment ;i A120-holdig ekson A sekvens. Vaskebetingelser var 0,2x SSC, 0,1% SDS ved 42°C. ;Human DNA ble fremstilt fra perifere blodlymfocytter (46,XY) eller lymfoblastceller (49,XXXXY, N.I.G.M.S. Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, N.J. No. GM1202A) (48). ;E. coli plasmid DNA ble fremstilt som i (48) og bakteriofag A DNA (48). Vev-RNA ble fremstilt ved enten guanidinium-tiocyanat-metoden (48, 49f) eller ved metoden ifølge (49b). Polyadenylert RNA ble isolert på oligo(dT)cellulose ;(49h) . ;DNA-sekvensanalyse ble foretatt ved metoden ifølge (49i) . ;For "Y/4X biblioteket ble 50 ug aliquoter av 49 ,XXXXY DNA fordøyd i et 1 ml volum med Sau3AI konsentrasjoner på 3,12, 1,56, 0,782, 0,39 og 0,195 U/ml i en time ved 37°C. Testnedbrytning og gelanalyse hadde vist at under disse betingelsene ved 0,782 U/ml Sau3AI, var vektgjennomsnitts-størrelsen for DNA omkring 30 kb; således utvikler disse spaltninger en antallsmidlere fordeling sentrert ved 15 kb. DNA fra 5 spaltninger ble oppsamlet, fenol- og kloroformekstrahert, etanolutfelt og elektroforesebehandlet på en 6 g/l horisontal lavt smeltepunkts-agarosegel (48) ;(Seaplaque-agarose, FMC Corporation), i to 5,6 x 0,6 x 0,15 cm spalter. 12-18 kb-området av gelen, ble utskåret, og DNA-materialet renset ved smelting av gel-stykket som beskrevet i (48) . ;Charon 30 - f ragmenter ble fremstilt ved nedbrytning av 50 jjg ;av vektoren med BamHI og isolering av det fusjonerte 31,9 kb-fragmentet fra en 6 g/l lavtsmeltepunkts-agarosegel gel som beskrevet ovenfor. For konstruksjon av X/4X- biblioteket ble den optimale konsentrasjon av Charon 30 BamHI-fragmenter og 12-18 kb Sau3A partial 49,XXXXY DNA bestemt som beskrevet (48). Den ligerte DNA ble emballert med et in vitro ekstrakt "packagene" (Promega Biotec, Inc., Madison, WI). I en typisk reaksjon ble ca. l,3^g Charon 30 BamHI-fragmenter ligert til 0,187^ug av 12-18 kb Sau3A innskudds-DNA i et lO^ul volum. Emballering av utplatingen av DNA-materialet ga ca. I,3xl0<6> fag-plaquer. For å utvikle X4X-biblioteket ble l,7xl0<6 >fag utplatet ved 17.000 fag pr. 150 cm plate. Disse plater ble dyrket natten over, skrapet i 10 mM Tris HCl, pH 7,5, ;0,1 M NaCl, 10 mM MgCl2, 0,5 g/l gelatin og sentrifugert kort, for å forsterke fagen. Generelt ble et egnet antall (0,5-2x10 ) av disse fag utplatet og sortert (48). I noen tilfeller ble den ligerte og in vitro pakkede fag sortert direkte uten forsterkning. ;For isolering av X482 ble en klon inneholdende et 22 kb Bell fragment av faktor Vlll-genomet, BamHI- fragmentene av vektoren X1059 (49) , isolert ved gelelektroforese. Separat ble lOO^ug DNA fra 49,XXXXY-cellelinjen nedbrutt med Bell og 20-24 kb-fraksjonen isolert ved gelelektroforese. ;Ca. 0,8^ug av X1059- f ragmenter og 5% av den isolerte ;Bell DNA ble ligert i et volum av lO^ul (48) for å utvikle 712.000 plaquer. 400.000 av disse ble sortert i duplikat med 2,2 kb StuI/EcoRI probe av X114. ;Kosmid/4x-biblioteket ble utviklet fra 49,XXXXY DNA benyttet for å utvikle X/4x-biblioteket, med unntagelse for at det ble utvist stor nøyaktighet ved DNA-isoleringen for å unngå skjæring eller annen bryting. DNA-materialet ble delvis spaltet med fire konsentrasjoner av Sau3AI og det opp- ;samlede DNA målt på en 100-400 g/l sukrosegradient (49). Fraksjonene inneholdende 35-45 kb DNA ble oppsamlet, dia- ;lysert og etanolutfelt. Fragmenter av kosmid- ;vektoren pGcos4 ble fremstilt ved å følge prinsippene som beskrevet annetsteds (50). I korthet ble to separate, like aliquoter av pGcos4 spaltet med Sstl (en iso-schizomer av SacI) eller Sali og deretter behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase. Disse aliquoter ble deretter fenol- og kloroformekstrahert, oppsamlet, ;etanolutfelt og kuttet med BamHI. Fra dette nedbrytnings-produkt ble to fragmenter av 4394 og 4002 b isolert fra en lavtsmeltepunkts-agarosegel. Disse ;fragmentene ble deretter ligert til det isolerte, 40 kb Sau3AI partialdigest DNA. I en typisk reaksjon ble 0, 7^,ug pGcos4 armfragmenter ligert til l^ug av 40 kb human 4X DNA ;i et volum på 10^,ul (48) . Denne reaksjonen ble deretter pakket in vitro og benyttet for å infisere E. coli HB101, ;en recA stamme (48). Denne reaksjon utviklet ca. 120.000 kolonier ved utplating på tetracyklinholdige plater. Ca. 150.000 kosmider ble sortert på 20 150 mm plater i duplikat som beskrevet med amplifikasjon natten over på kloramfenikol-holdige plater (48). ;Dobbelttrådet cDNA ble fremstilt som tidligere beskrevet ;(36, 67) under anvendelse av enten oligo(dT)12-18 eller syntetiske deoksyoligonukleotid 16-merer som primere for første tråd-syntese ved reversert transkriptase. Etter isolering med polyakrylamidgeler, ble cDNA med den hensiktsmessige størrelsen (vanligvis 600 bp) eller større enten C-haleforsynt med terminal-transferase, fusjonert sammen med G-haleforsynt Pstl-nedbrutt pBR322 og transformert til E. coli stamme DHl (76), eller ligert med et 100 ganger molar overskudd av syntetiske DNAEcoRI-adaptorer, reisolert på en polyakrylamidgel, innført ved ligering i EcoRI-nedbrutt X GT10, pakket i fagpartikler og propagert på E. coli stamme C600hfl (68). Som en modifika-sjon av eksisterende metoder ble en adaptor bestående av en komplementær syntetisk DNA 18-mer og 22-mer (5<1->;CCTTGACCGTAAGACATG og 5'AATTCATGTCTTACGGTCAAGG) ble fosforylert ved den butte terminusen, men ikke ved den EcoRI kohesive terminus for å tillate effektiv ligering ;av adaptoren til dobbelttrådet cDNA i fravær av utstrakt selvligering ved EcoRI-setet. Dette gjorde på effektiv måte tjeneste istedenfor den mer tungvinte metode med ligering av selvkomplementære EcoRI-bindere til EcoRI-metylasebehandlet dobbelttrådet cDNA, og etterfølgende fjerning av overskudd binder-oligomerer fra cDNA- ;termini ved EcoRI-nedbrytning. For å forbedre effektiviteten av oppnåelse av cDNA-kloner :>3500 bp ragende fra polyXA) til de nærmest eksisterende 3'-faktor VIII probesekvenser gjort tilgjengelig ved genomisk kloning, (dvs. ekson A), ble annen-tråd cDNA-syntese spesifikt primet ved in-kludering i reaksjonen av en syntetisk DNA 16-mer tilsvarende til en sekvens innen ekson B på mRNA-"sense" tråden. ;D. Adenovirus- subkloning ;Adenovirus 2 DNA ble innkjøpt fra Bethesda Research Laboratories (BRL). Den virale DNA ble spaltet med Hindlll og elektroforesebehandlet gjennom en 5% polyakrylamidgel (TBE-buffer). Området av gelen inneholdende Hindlll B-fragmentet (49j) ble utskåret, og DNA-materialet elektro-eluert fra gelen. Etter fenol-kloroform-ekstraksjon ble DNA-materialet konsentrert ved etanolutfelling og klonet inn i Hindlll-spaltet -pUC13(49k) for å utvikle plasmidet pAdHindB. Denne Hindlll-subklon ble nedbrutt med Hindlll og Sali, og det ble isolert et fragment som spente over adenovirale koordinater 17.1 - 25,9 (49j). Dette fragmentet ble klonet inn i Hindlll, Sali spaltet pUCl3 for å utviklet plasmidet pUCHS. Fra pAdHindB ble Sali til Xhol-fragmentet, koordinater 25,9 - 26,5, ;isolert og klonet inn i pUCHS ved det unike Sall-setet for å danne pUCHSX. Dette plasmidet rekonstruerer de adenovirale sekvensene fra stilling 17,1 i den første sene ;leder-mellomliggende sekvens til Xhol-setet ved stilling 26,5 innen den tredje sene leder-ekson. ;Den sene hoved-adenoviruspromoteren ble klonet ved utskjæring av Hindlll C, D og E fragmentene (som komigrerer) fra akrylamidgelen, de ble klonet inn i pUC13 og Hindlll-setet, og det ble foretatt undersøkelse med henblikk på rekombinanter inneholdende Hindlll C fragmentet ved restriksjonsanalyse. Denne subklon ble nedbrutt med SacI som spaltet ved stilling 15,4, 5' i den sene hovedpromotoren (49j) samt i polylinkeren til pUC13. DNA-materialet ble resirkulert for dannelse av pMLP2, inneholdende SacI ;til Hindlll fragmentet (stillinger 15,4 17,1) klonet i SacI og Hindlll-setene i pUC13. ;E. Konstruksjon av neomycin- resistensvektor ;Neomycin-resistensmarkøren som befinner seg i E. coli transposon 5 ble isolert fra et Tn5-holdig plasmid (491). Sekvensen i neomycin-resistensgenet har tidligere blitt publisert (49m). Neofragmentet ble nedbrutt med Bglll, ;som spalter ved et punkt 36 bp 5' fra det translasjonale initieringskodonet i neomycin-fosfotransferasegenet, ;og behandlet med eksonuklease Bal31. Fosfotransferasegenet ble utskåret med BamHI, som spalter DNA 34 2 bp etter det translasjonale termineringskodonet, : og innført i pBR322 mellom et ifylt Hindlll-sete og BamHI-setet. ;En klon (pNeoBal6, hadde det translasjonale initieringskodonet plassert 3 bp 3' fra det ifylte Hindlll-setet (TCATCGATAAGCTCGCATG...). Dette plasmid ble nedbrutt med Clal og BamHI hvorved 1145 bp-fragmentet som spente over fosfotransferasegenet ble isolert og innført i pattedyr-ekspresjonsvektoren pCVSVEHBS (se infra.). Det resulterende plasmid, pSVENeoBal6, har neomycin-fosfotransferasegenet beliggende 3' fra SV40-tidligpromoteren og 5' fra polyadenyleringssetet i HBV-overflateantigen-genet (4 9n). Når Når det er innført i pattedyrvev-kulturceller, kan dette plasmid uttrykke fosfotransferasegenet og gi resistens til aminoglukosidet G418 (49o). ;F. Transfeksjon av vevskulturceller ;BHK-21 celler (ATCC) er hvirveldyrceller dyrket i vevskultur. Disse cellene kan som kjent innen teknikken holdes som permanente cellelinjer fremstilt ved suksessive . serieoverføringer fra isolerte normale celler. Disse celle-linjene holdes enten på en fast bærer i flytende medium, eller ved vekst i suspensjoner inneholdende bærer-næringsmidler. ;Cellene transformeres med 5 pg av ønsket vektor (4 pg pAML3P.8cl og 1 pg pSVEneoBal6) under anvendelse av metoden ifølge (49p). ;Metoden sikrer reaksjonen av en korreksjon av plasmider ;med en spesiell vertcelle og øker derved sannsynligheten for at dersom et plasmid absorberes av en celle, så ;vil ytterligere plasmider også bli absorbert (49q). Følge-lig er det praktisk å innføre både de primære og sekundære kodesekvensene under anvendelse av separate vektorer for hver samt ved å benytte en enkelt vektor inneholdende begge sekvenser. ;G. Vekst av transformerte celler og ekspresjon av peptider ;BHK-cellene som ble underkastet transfeksjon ;ble først dyrket i to dager i ikke-selektivt medium, deretter ble cellene overført i medium inneholdende G418 (400^ug/ml), hvorved det således ble valgt celler som kunne uttrykke uttrykke fosfotransferase. ;Etter 7-10 dager i nærvær av G418 ble kolonier synlige ;for det blotte øye. Trypsinering av flere hundre kolonier . og nyutplating ga hurtig vekst av en sammenløpende 10 cm skål av G418 resistente celler. ;Denne cellepopulasjonen består av celler som representerer en rekke forskjellige initial-integranter. For å oppnå celler som hadde det største antall kopier av FVIII-ekspresjonsplasmidet, ble cellene deretter inkubert med en inhibitor for DHFR-proteinet. ;H. Behandling med metotreksat ;De G418-resistente cellene inhiberes med metotreksat ;(MTX), en spesifikk inhibitor for DHFR ved konsentrasjoner på over 50 nM. I overensstemmelse med tidligere studier på effektene av MTX på vevskulturceller, blir celler som er resistente overfor MTX i kraft av ekspresjon av de multiple kopier av DHFR-genet som inneholdes i FVIII-ekspresjonsvektoren utvalgt, og en samtidig økning i ekspresjon av de FVIII-kodende sekvensene kan observeres. Ved trinnvis økning av mengden av MTX påvirkes amplifikasjon av plasmidet pAML3P.8cl hvilket således øker kopiantallet. Den øvre grense for amplifikasjonen er avhengig av mange faktorer, men celler som er resistente over- ;for millimolare konsentrasjoner av MTX som har flere hundre eller tusen kopier av DHFR-ekspresjons (og således FVIII ekspresjons)-plasmidet kan selekteres på ;denne måten. ;For faktor VIII ekspresjon ble G418-resistente BHK-celler som ble oppnådd etter transfeksjon med pAML3P.8cl og pSVENeoBal6, inkubert med media inneholdende 100 nM og 250 nM MTX som beskrevet (4 9r). Etter 7-10 dager ble celler som var resistente overfor 250 nM MTX analysert med henblikk på faktor Vlll-ekspresjon ved aktivitets-.;radioimmunoanalyse- og mRNA Northern-analyse. ;I. Faktor VIII antistoffer ;En rekke forskjellige polyklonale og monoklonale antistoffer til faktor VIII ble benyttet gjennom dette arbeidet. CC er et polyklonalt antistoff avledet fra plasmaet fra hardt angrepne hemofilipasienter (49s). C8 er et nøy-traliserende monoklonalt antistoff som binder til 210 kD-delen i faktor VIII (49t). CIO er et monoklonalt anti- ;stoff med egenskaper lik dem til C8 og ble isolert vesentlig som beskrevet i (49t). Et kommersielt nøytraliserende monoklonalt antistoff som binder 80 kD-delen i faktor VIII ble oppnådd fra Synbiotic Corp., San Diego, CA., Product No. 10004. C7F7 er et nøytraliserende monoklonalt antistoff som binder til 80 kD-delen i faktor VIII. C7F7 ble indusert og renset som følger: Seks uker gamle BALB/c hunnmus ble multippel-inokulert med omkring lO^ug renset faktor VIII og splenocytter sammensmeltet myd X63-Ag.8.653 muse-myelomaceller (49u) tre dager etter den sluttlige inokuleringen. Hybridiseringsmetoden og isoleringen av hybridceller ved kloningsmetoder fulgte tidligere beskrevne protokoller (49r). Spesifikke antistoff-produserende kloner ble detektert ved fast fase RIA-metoder (4 9w). Positive kloner ble deretter analysert for koagulasjon-forlengelses-kapasitet ved APTT-analyse som beskrevet ovenfor. Monoklonalt C7F7 ble ekspandert ved vekst i syngenetiske dyr; antistoff ble renset fra ascites-væsker ved protein A-sefarose CL-4B-kromatografi,(49x). ;J. Radioimmunanalyse for faktor VIII ;To radioimmunanalyser (RIA) ble utviklet for å analysere faktor VIII fremstilt fra BHK og andre cellelinjer. Begge er totrinnsanalyser hvori CC antistoffet bundet til en fast bærer anvendes for å binde faktor VIII (49t). Dette ;125 ;immunkompleks detekteres deretter med I -merket C10-antistoff (210 kD spesifikt) eller I<125->merket C7F7-antistoff (80 kD spesifikt). ;I korthet foretas de totrinns RIA-metodene som følger: ;De 96 brønnene i en mikrotiter skål belegges natten over med lOO^ul 50 mM NaHC03-buffer, pH 9,6 inneholdende 2,5 mg/l CC-antistoff som har blitt renset ved protein A-sefarose-kromatografi (49x) . Brønnene vaskes tre ganger med 200^,ul PBS inneholdende 0,05% "Tween 20" og blokkeres med 200^1 PBS inneholdende 0,1% gelatin og 0,01% mertiolat i 1-2 timer. Brønnene vaskes som før og lOO^ul prøve tilsettes og inkuberes natten over. Brønnene vaskes, og lOO^ul av I<125->merket (82) CIO- eller C7F7-antistoff (1000 cpm/^ul) tilsettes og inkuberes i 6-8 .timer. Brønnene vaskes igjen og telles. Standardkurven oppnås fra prøver av normalplasma fortynnet 1:10 til 1:320. ;K. Faktor VIII monoklonalantistoff- kolonne ;En human faktor VIII monoklonalantistoff-kolonne ble fremstilt ved inkubering av 1,0 mg C8-antistoff (i 0,IM NaHC03, pH 8,5) med 1,0 ml "Affi-Gel 10" (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) i 4 timer ved 4°C. Mer enn 95% av antistoffet ble koblet til gelen, som bestemt ved Bio-Rad protein-analysen (Bio-Rad Laboratories). Gelen ble vasket med 50 volumdeler vann og 10 volumdeler 0,05M imidazol, pH ;6,9, inneholdende 0,15 M NaCl. ;L. Kromatografi av media på monoklonalkolonne ;Media ble påført på monoklonalantistoff-kolonnen (1 ml harpiks) og vasket med 0,05 imidazolbuffer, pH 6,4, inneholdende 0,15 M NaCl inntil materialet som absorberte ved 280 nm var vasket bort. Kolonnen ble eluert med 0,05 M imidazol, pH 6,4, inneholdende 1,0 M Kl og 20% etylen-glykol. Prøver ble fortynnet for analyse og dialysert for etterfølgende analyse. ;M. Fremstilling av faktor VIII fusjonsproteiner og f usjonsprotein- antisera ;E. coli inneholdende plasmidene konstruert for fusjonsprotein-ekspresjon ble dyrket i M-9 media ved 37°C. Fusjonsprotein-ekspresjon ble indusert ved tilsetning av indol akryleddiksyre ved en sluttlig konsentrasjon på 50yug/ml i tidsperioder på 2,5-4 timer. Cellene ble høstet ved sentrifugering og frosset inntil bruk. ;Cellepelletene for fusjon 3 ble suspendert i 20 ml 20 mM natriumfosfat, pH 7,2, inneholdende 10^ug/ml lysozym og lyug/ml hver av RNase og DNase. Suspensjonen ble omrørt i 30 min. ved romtemperatur for grundig å dispergere celle-pelleten. Suspensjonen ble deretter sonikert i 4 min. (pulset ved 60% effekt). Oppløsningen ble sentrifugert ved 8000 omdr./min. i en Sorvall RC-2B-sentrifuge i en GSA-rotor. Pelleten ble resuspendert i 10 mL 0,02M natriumfosfat, ;pH 7,2. Suspensjonen ble fordelt som et lag over 300 ml 60% glycerol. Prøven ble sentrifugert ved 4000 omdr./min. ;i 20 min. i en RC-3B-sentrifuge. To lag resulterte i glycerolen. Både pellet- og bunnglycerollaget viste et enkelt proteinbånd for den forventede molekylvekt på ;25.000 dalton ved analyse på SDS-polyakrylamidgeler. Pelleten ble oppløst i 0,02 M natriumfosfatbuffer inneholdende 0,1% SDS. Den resuspenderte pelleten og det nedre glycerollaget ble dialysert mot 0,02 M ammoniumbikarbonat, pH 8,0, for å fjerne glycerol. Oppløsningen ble lyofilisert og gjenoppløst i 0,01 M natriumfosfat-buf f er inneholdende 0,1% SDS, og frosset inntil bruk. ;Cellepelletene for fusjonsproteiner 1 og 4 ble suspendert ;i 0,05 M Tris, pH 7,2, inneholdende 0,3M natriumklorid og 5 mM EDTA. Lysozym ble tilsatt til en konsentrasjon på 10yug/ml. Prøver ble inkubert i 5 min. ved romtemperatur. NP-40 ble tilsatt til 0,2%, og suspensjonen inkubert i is ;i 30 min. Natriumklorid ble tilsatt for oppnåelse av en sluttkonsentrasjon på 3M og DNase tilsatt (l^ug/ml). Suspensjonen ble inkubert i 5 min. ved romtemperatur. Prøven ble sentrifugert og supernatanten kassert. Pelleten ble resuspendert i et volum vann og sentrifugert. Cellepelletene ble oppløst i oppløsninger inneholdende 0,1- ;1% SDS og renset ved enten preparativ SDS-polyakrylamid-gelelektroforese fulgt av elektroeluering av fusjons-proteinbåndet, eller ved HPLC på en TSK 3000-kolonne ekvilibrert med 0,1M natriumfosfat inneholdende 0,1% SDS. ;Kanin-antisera ble produsert ved injisering av hvite kaniner fra New Zealand med en prøve av fusjonsprotein suspendert i Freund's komplette hjelpemiddel (første injeksjon) fulgt av stigende mengder ved to ukers intervaller under anvendelse av prøven suspendert i Freund's ukomplette hjelpemiddel. Etter 6 uker ble det oppnådd sera, og disse ble analysert ved Western-flekkanalyse med henblikk på reaktivitet med humanplasma-avledede faktor Vlll-proteiner. ;N. Analyse for detektering av ekspresjon av faktor VIII-aktivitetskorreksjon i hemofili A plasma. Teori - ;Faktor VIII aktivitet er definert som den aktivitet som vil korrigere koagulasjonsdefekten til faktor Vlll-mangelfullt plasma. En enhet av faktor VHI-aktivitet har blitt definert som den aktivitet som er til stede i 1 ml normalt humanplasma. Analysen er basert på observasjon av den tid som skal til for dannelse av en synlig fibrinklump i plasma avledet fra en pasient som ved diagnose er funnet å ha hemofili A (klassisk hemofili). I denne analysen: jo kortere tid som er nødvendig for klumpdannelse, jo større er faktor Vlll-aktiviteten i prøven som testes. Denne analysetype refereres til som aktivert partiell tromboplastintid (APTT). Kommersielle reagenser er tilgjengelige for slike bestemmelser (f.eks. General Diagnotics Platelin Plus Activator; produkt nr. 35503). ;Metode - Alle koagulasjonsanalyser ble utført i 10 x 75 mm reagensrør av borsilikatglass. Silikonisering ble foretatt under anvendelse av "SurfaSil" (produkt fra Pierce Chemical Company, Rockford, IL) som hadde blitt fortynnet 1 til 10 med petroleumenheter. Reagensrørene ble fylt med denne oppløsningen, inkubert i 15 sek., og oppløsningen ble fjernet. Alle rørene ble vasket tre ganger med lednings-vann og tre ganger med destillert vann. ;"Platelin Plus"-aktivator (General Diagnostics, Morris Plains, NJ) ble oppløst i 2,5 ml destillert vann ifølge retningslinjene på pakningen. For å fremstille prøven for koaguleringsanalyser, ble "Platelin Plus"-aktivator-oppløsningen inkubert ved 37°C i 10 min. og lagret på ;is inntil bruk. Til et zirkonisert reagensrør ble det tilsatt 50 mikroliter "Platelin Plus"-aktivator og 50 mikroliter faktor Vlll-mangelfullt plasma (George King Biomedical Inc., Overland Park, KA).. Denne oppløsningen ble inkubert med 37°C i totalt 9 min. Like før slutten på ni minutter-inkuberingen av den ovenfor angitte oppløsning, ble prøven som skulle testes, fortynnet i 0,05 M Tris-HCl, ;pH 7,3, inneholdende 0,0 2% storfeserumalbumin. Til plasma/- aktivator-suspensjonen ble det tilsatt 50yUl av den fortynnede prøven, og nøyaktig ni minutter inn i inkubasjonen av suspensjonen ble koagulasjonskaskaden initiert ved tilsetning av 50 mikroliter kalsiumklorid (0,033 M). Reaksjonsblandingen ble hurtig blandet og under forsiktig agitasjon av reagensrøret, ble den tid som skulle til for dannelse av en synlig fibrinklump, overvåket. En standard kurve for faktor Vlll-aktivitet kan oppnås ved fortynning av normalplasma (George King Biomedical, ;Inc., Overland Park, KA) 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, og ;1:200. Størkningstiden plottes mot plasmafortynning på ;semilog-grafisk papir. Denne kan deretter anvendes for å omdanne en størkningstid til enheter for faktor VIII-aktivitet. ;0. Kromogen Peptidbestemmelse ;Teori - Faktor Vlll-funksjoner i aktiveringen av faktor X til faktor Xa i nærvær av faktor IXa, fosfolipid, og kalsiumioner. En høyspesifikk analyse har blitt satt opp, hvori faktor IXa, faktor X, fosfolipid og kalsiumioner til-føres . Utviklingen av faktor Xa i denne analysen er derfor avhengig av tilsetningen av en kilde for faktor VIII-aktivitet. Jo mer faktor VIII som tilsettes til analysen, jo mer faktor Xa utvikles. Etter man har latt faktor Xa utvikle seg, tilsettes et kromogent peptidsubstrat til reaksjonsblandingen. Dette peptidet spaltes spesifikt av faktor Xa, mens dette ikke bevirkes av faktor X, og bare langsom spalting forårsakes av andre proteaser. Spalting av peptidsubstratet frigjør en para-nitroanilid-gruppe som har absorbans ved 405 nm, mens det uspaltede peptidsubstratet har liten eller ingen absorbans ved denne bølgelengden. Utvikling av absorbans p.g.a. ;spalting av det kromogene substratet er avhengig av mengden av faktor Xa i testblandingen etter inkuberings-perioden, mengden av hvilket igjen er avhengig av mengden av funksjonell faktor VIII i testprøven tilsatt til reaksjonsblandingen. Denne analysen er meget spesifikk for faktor Vlll-aktivitet, og bør være mindre utsatt for potensielle falske positiver sammenlignet med faktor Vlll-mangelfullt plasma-analyse. ;Metode - Coatest faktor VIII ble innkjøpt fra Helena Laboratories, Beaumont, TX (Cat. No. 529 3). Den grunn-leggende metode som ble benyttet, var vesentlig den som ble gitt av produsenten av "endepunktmetoden" for prøver-inneholdende mindre enn 5% faktor VIII. Der det er indikert, ble inkubasjonstidene forlenget for å gjøre analysen mer sensitiv. For visse analyser ble de reagensvolumer som er anbefalt av produsenten, endret. Denne endring i protokollen forstyrrer ikke analysens totale resultater. ;Det kromogene substratet (S-2222 + 1-2581) for faktor Xa ble oppløst i 10 ml vann hvilket resulterte i en substrat-konsentrasjon på 2,7 millimol pr. 1. Denne substrat-oppløsningen ble aliquotert, og lagret i frossen tilstand ved -20°C. FlXa + FX-reagensen inneholdt faktor IXa og faktor X, og ble oppløst i 10 ml vann. Oppløsningen ble aliquotert og lagret i frossen tilstand ved -70°C inntil bruk. Også levert med utstyret var følgende oppløsninger: 0,025 molar kalsiumklorid; fosfolipid (svinehjerne); ;og buffer-lageroppløsning (fortynnet en del lageroppløsning til 9 deler vann for analysen, hvilket resulterte i en sluttkonsentrasjon på 0,05 M Tris-HCl, pH 7,3, inneholdende 0,02% storfealbumin). Disse oppløsningene ble lagret ved 4°C inntil bruk. ;Fosfolipid + FlXa + FX-reagensen fremstilles ved blanding av en volumdel fosfolipid med fem volumdeler FlXa +FX-reagens. ;Følgende metode ble benyttet: ;Bland godt. ;Absorbansen til prøven ved 405 nm ble bestemt mot reagens-blindprøven i et spektrofotometer i løpet av 30 min. ;Absorbansen ved 405 ble relatert til faktor Vlll-enheter ved kalibrering av analysen ved anvendelse av standard normal humanplasma (George King Biomedical, Overland Park, ;KS) . ;Eksempel på foretrukken utførelse ;1. Generell strategi for oppnåelse av faktor Vlll- genet ;Den vanligste prosess for oppnåelse av et rekombinant DNA-genprodukt er å undersøke bibliotek eller utvalg av cDNA-kloner oppnådd fra mRNA i det hensiktsmessige vev eller celletype. Flere faktorer bidro til også å benytte en alternativ ;metode for sortering av genomisk DNA for faktor Vlll- ;genet. For det første var setet for syntese av faktor VIII ukjent. Selv om leveren ofte anses som den mest sannsynlige kilde for syntese, er beviset tvetydig. Syntese i lever og eventuelt milt har blitt foreslått ved organperfusjon og transplantasjonsstudier (56). Faktor Vlll-aktivitet blir imidlertid ofte forøket hos pasienter med alvorlig lever-svikt (56a). Nylige motstridende studier hvor det er benyttet monoklonal antistoff-binding til celler detekterer høyeste nivåer av proteinet i enten leversinusoid-endotelceller (51), hepatocyttcellér (52) eller lymfeknute-celler (fulgt i mengde av lunge, lever og milt; (53)). ;I motsetning til dette blir faktor Vlll-relatert antigen ;(von Willebrand-faktor) omtrent helt sikkert syntetisert ;av endotelceller (54). Ikke bare er vevskilden usikker, mengden av faktor VIII i plasma er meget lav. Den sirkulerende konsentrasjon på ca. 100-200 ng/ml (55) er ca. 1/2.000.000 molarkonsentrasjonen av serumalbumin, f.eks. Det var så- ;ledes ikke klart av cDNA-bibliotek fremstilt ;fra RNA i et gitt vev ville gi faktor Vlll-kloner. ;Basert på disse betraktninger ble det avgjort først å under-søke rekombinante bibliotek av det humane genom i bakteriofag lambda (i det følgende referert til som genomiske forråd). Selv om genomiske bibliotek skulle inneholde faktor Vin-genet, kan den sannsynlige tilstedeværelsen av introner representere hindringer for den endelige ekspresjon av det rekombinante protein. ;Den generelle strategi var å: ;1. Identifisere en genomisk klon tilsvarende en sekvensert del av human faktor Vlll-proteinet. 2. Utføre en "genomisk spasertur" for oppnåelse av overlappende genomiske kloner som ville innbefatte hele det mRNA-kodende område t. 3. Anvende fragmenter av de genomiske klonene for å indentifisére ved hydridisering til RNA-flekker, vev- ;eller cellekilder for faktor VIII mRNA og deretter gå videre og oppnå cDNA-kloner fra slike celler. ;4. I parallell med nr. 3, uttrykke deler av genomiske kloner i SV40-rekombinante "eksonekspresjons" - plasmider. RNA transkribert fra disse plasmidene etter transfeksjon ;av vevskultur (cos) celler bør spleises in vivo og ville være en alternativ kilde for cDNA-kloner egnet for ekspresjon av rekombinant faktor Vlll-protein. ;Det aktuelle forløp for denne bestrebelse involverte samtidig mellomspill av informasjon avledet fra cDNA-kloner, genomiske kloner av flere typer, og SV40-rekombinante "eksonekspresjons"-kloner, som, av nødvendighet er beskrevet separat nedenfor. ;2. Undersøkelsesmetoder for genomisk bibliotek ;Faktor VII-genet er kjent for å befinne seg på det humane X-kromosomet (56). For å øke andelen av positive kloner, ble det konstruert genomiske bibliotek fra DNA opnådd fra et individ inneholdende 4X kromosomer. (Lymfoblastcelle-linjen er kariotypet 49,XXXXY: bibliotek konstruert fra denne DNA er referert til heri som "4X bibliotek). 49,XXXY DNA ble partielt nedbrutt med Sau3AI og hensiktsmessige størrelsesfraksjoner ble ligert til X fag- eller kosmidvektorer. Detaljer ved konstruksjonen avdisse X/4X- og kosmid/4X- bibliotekene er gitt nedenfor. Den forventede fre-kvens for faktor Vlll-genet i X/4X-forrådet er omkring en i 110.000 kloner og i kosmid-biblioteket ca. en i 40.000. ;Disse bibliotekene ble undersøkt med henblikk på faktor Vin-genet med syntetiske oligonukleotid-prober basert på ;deler av faktor Vlll-proteinsekvensen. Disse oligonukleotid-probene faller i to typer, en enkel sekvens på 30-100 nukleotider basert på kodonvalg-anvendelsesanalyse (lange prober) og en ansamling av prober med en lengde på 14-20 nukleotider som spesifiserer alle mulige degenerasjons-kombinasjoner for hvert kodonvalg (korte prober). ;Hovedfordelen med lange prober er at de kan syntetiseres basert på enhver 10-30 aminosyresekvens i proteinet. Ingen spesielle områder med lav kodon-dominans behøver å bli funnet. En annen fordel er at siden en nøyaktig tilpasning med genesekvensen ikke er nødvendig (bare strekninger av komplementaritet på 10-14 nukleotider er nødvendig), av-brudd av komplementariteten p.g.a. tilstedeværelsen av et intron, eller forårsaket av gen-polymorfisme eller protein-sekvensfeil ville nødvendigvis ikke hindre brukbar hybridisering. Ulempen med lange prober er at bare et kodon velges for hver aminosyre. Man har basert sitt valg av kodoner på en tabell over kodonfrekvens hos pattedyr (57), ;og når dette ikke ga noen klar preferanse, på kodon-behandlingen av faktor IX-genet (58). Siden den forventede sekvens-avstemning for de lange probene er ukjent, må hybridiseringsstringensen bestemmes empirisk for hver probe. Dette ble foretatt ved hybridisering til genomiske DNA-flekker ("blot") og vaskinger ved forskjellige stringenser . ;Fordelen med korte prober er at hvert mulig kodon syntetiseres som en en ansamling av oligonukleotider. Således, dersom animosyresekvensen er korrekt, skulle en kort probe alltid hybridisere til det gen som er av interesse. Hovedbegrensningen er kompleksiteten til ansamlingen av sekvenser som kan syntetiseres. Operasjonelt kan en ansamling av 32 forskjellige sekvenser anses som en maksimum ansamlingsstørrelse gitt signalet til "noise"-begrensninger for hybridisering til genomiske bibliotek. Dette betyr at bare proteinsekvenser i områder med lav kodon-overflødighet kan benyttes. En typisk probe ville være en ansamling av 16 17-merer som spesifiserer alle mulige sekvenser over et 6-aminosyre-fragment i proteinsekvens. ;Som med lange prober har hybridiseringsstringensen benyttet for korte prober blitt bestemt empirisk. Dette er fordi under vanlig benyttede hybridiseringsbetingelser (6xSSC), avhenger stabiliteten til hybridene av de to faktorene—lengden og G-C-innholdet; stringente betingelser for probene med det lave G-C-innholdet er i det hele tatt ikke stringent for de som har høyt G-C-innhold. ;En typisk ansamling av 16 17-merer kan ha et område ;av 41-65% G-C, og disse prober vil smelte i 6xSSC over et 10°C temperaturområde (fra 48 til 58°C). Siden den korrekte sekvensen i ansamlingen av 16 ikke er kjent på forhånd, anvendes en hybridiseringsstringens like under 48°C for å tillate hybridisering av sekvensen med det laveste G-C-innhold. Ved undersøkelse av et stort antall kloner vil dette imidlertid gi mange falske positiver av kortere lengde og høyere G-C-innhold. Siden endringen i smeltetemperatur er 1-2°C pr. basepar-tilsvarlighet, vil probesekvenser så korte som 12 eller 13 av de 17 også bindes dersom de har et høyt G-C-innhold. Vilkårlig i det humane genom vil en ansamlet probe av 16 17-merer hybridisere med 1200 ganger så mange 13-basesekvenser som 17-basesekvenser. ;En hybridiseringsteknikk ble utviklet for korte prober som ekvaliserer stabiliteten til G-C- og A-T-basepar og sterkt fremmer nyttevirkningen for bruk av korte prober ;for å undersøke forråd av høy DNA-sekvenskompleksitet. ;På fig. 2A har man plottet smeltetemperaturen for 4 korte prober under ordinære (6xSSC) og 3,0 M TMACl-vaskebetingelser. I 3,0 M TMACl smelter probene som en nærmest lineær ;funksjon av lengde, mens i 6xSSC påvirkes smeltingen sterkt av G-C-innholdet. Den høye smeltetemperaturen i 6xSSC ;til 13-meren som er 65% G-C, demonstrerer klart denne kon-klusjon. Fig. 2B viser smeltetemperaturen i 3,0 M TMACl som en funksjon av lengde for 11 til flere tusen baser. Denne figur gir anledning for hurtig valg av hybridiseringsbetingelser for en probe med en eksakt tilpasning ("match") av enhver ønsket lengde. ;TMACl-hybridiseringsmetoden har stor nyttevirkning når en eksakt sekvensavpasning av en viss kjent lengde er ønsket. Eksempler på denne teknikk innbefatter: 1. Undersøkelse av ;et humant genomisk forråd med en ansamling av 16 17-merer. Man har benyttet en 3,0 M TMACl-vask ved 50°C, hvilket ;gir hybridisering av bare 17, 16, og noen 15 basesekvenser. Det store antall av prober med høyt G-C-innhold av lavere homologi blir dermed ekskludert. 2. Dersom en kortprobe-undersøkelse gir for mange positiver for lett sekvensering, kan de mest sannsynlige kandidatene finnes ved en TMAC1-smeltemetode. Replikaer av positivene hybridiseres og vaskes ved 2°C-intervaller (for 17-merer,(som smelter ved 45°C) ville 46, 48, 50, 52, 54, og 56°C bli benyttet). ;De positiver som smelter ved den høyeste temperaturen, ;vil passe best til proben. Med en standard av kjent sekvens kan homologien forutsis -1 base eller bedre for en 17-mer. ;3. Likeledes, dersom en langprobe-undersøkelse gir for mange positiver, kan ansamlede korte prober basert på ;den samme proteinsekvensen syntetiseres. Siden et medlem av denne ansamling ville inneholde en perfekt tilpasning, kunne TMACl-smelteforsøk raffinere valget av de beste kandidatpositivene. 4. I sete-rettet mutagenese blir et oligonukleotid som typisk er 20 langt med en eller flere endringer i sentrum, syntetisert. TMACl- ;vaskemetoden kan lett skjelne de parenterale og mutante derivatene selv for en base-mistilpasning i midten av en 20-mer. Dette er fordi den ønskede mutasjon passer eksakt til proben. Vaskebetingelsene kan ganske enkelt bestemmes ut fra fig. 2B. 5. Valg av et spesielt gen fra en familie av nær beslektede gener. Et smelteforsøk lik det som beskrevet ovenfor har blitt benyttet for å velge et spesielt gen ut fra en samling av 100 meget like sekvenser. ;3. Første isolasjon av faktor VIII genomisk klon ;Faktor Vlll-anrikede preparater ble fremstilt fra humant kryobunnfall ved polyelektrolytt-kromatografi og immuno-adsorpsjon som beskrevet tidligere (79). Dette materiale ble dialysert i 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) og 1% ammoniumbikarbonat, lyofilisert og lagret ved -20°C inntil bruk. ;P.g.a. kontaminering av faktor Vlll-preparatene med andre plasmaproteiner, var ytterligere fraksjonering nødvendig for å rense faktor VIII samt separere de forskjellige polypeptidkjedene som antas å skrive seg fra faktor VIII. Dette ble oppnådd ved kromatografi av proteinet på ;Toya Soda TSK 4000 SM-kolonner under anvendelse av høytrykk-væskekromatografi i nærvær av SDS. Slik kromatografi separerer proteinene etter molekylstørrelse. ;Det lyofiliserte proteinet ble rekonstituert i destillert vann og tilsatt 1% SDS og 0,1 M natriumfosfat, pH 7,5. TSK-kolonnen (0,75 x 50 cm; Alltech, Deerfield, IL) ble ekvilibrert ved romtemperatur med 0,1% SDS i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0. Prøver av omkring 0,15-0,25 ml ble injisert og kolonnen utviklet isokratikalt ved en strømnings-hastighet på 0,5 ml pr. min. Absorbansen ble overvåket ved 280 nm og fraksjoner på 0,2 ml ble oppsamlet. En representativ elueringsprofil er vist på fig. 15. Aliquoter ble analysert ved hjelp av natriumdodecylsulfat-gelelektroforese på gradientgeler av 5-10% polyakryl- ;amid og analysert ved sølvflekking (80) . Materialet som eluerte etter 25 min. tilsvarte en dublett av proteiner ved 80.000 og 78.000 D. Fraksjonene inneholdende disse proteiner ble oppsamlet som angitt ved den avkortede streken på fig. 15, fra tre separate preparative TSK-forsøk, og lagret ved -20°C inntil bruk. ;Det rensede 80.000 dalton proteinet fra TSK-fraksjoneringen (0,8 nmoles) ble dialysert natten over mot 8 M urea, 0,36 M Tris-Hcl, pH 8,6, og 3,3 mM etylendiamintetraeddiksyre under en nitrogenatmosfære. Disulfidbindinger ble redusert ved tilførsel av 10 mM ditiotreitol i den ovenfor angitte dialysebuffer. Sluttvolumet var 1,5 ml. Cysteinene ble alkylert med 15 mikroliter 5 M iodeddiksyre (oppløst i IM NaOH). Reaksjonen fikk forløpe ved 35 min. ved romtemera-tur i mørket, og alkyleringsreaksjonen ble stoppet ved tilsetning av ditiotreitol til en sluttkonsentrasjon på ;100 mM. Proteinoppløsningen ble dialysert mot 8 M urea i 0,1 M ammoniumbikarbonat i fire timer. Dialyseoppløsningen ble endret for gradvis å fortynne ureakonsentrasjonen (8 M, 4 M, 2 M, 1 M, og til slutt 0,5 M urea) i løpet av en periode på 24 timer. Tryptisk nedbrytning ble foretatt på det reduserte, alkylerte 80.000 dalton proteinet ved tilsetning av TPCK-behandlet trypsin (Sigma Chem. Co.) ved et vektforhold av 1 del trypsin til 30 deler faktor VIII protein. Nedbrytningen fikk fortsette i 12 timer ved 37°C. Reaksjonsblandingen ble frosset inntil bruk. HPLC-separering av de tryptiske peptidene ble foretatt på en Synchropak RP-P C-18 kolonne (0,46 x 25 cm, lO^um) med høy opp-løsning ved romtemperatur med en Spektra-Physics 8000 kromatograf. Prøver på omtrent 0,8 ml ble injisert og kolonnen utviklet med en gradient av acetonitril (1% til 70% i 200 min.) i 0,1% trifluoreddiksyre. Absorbansen ble overvåket ved 210 nm og 280 nm (fig. 16). Hver topp ;ble oppsamlet og lagret ved 4°C inntil den ble underkastet sekvensanalyse i en Beckman-spin cup-sekvenser med samtidig PTH-aminosyreidentifikasjon. Pilen på ;fig. 16, eluering ved omtrent 23% acetonitril, indikerer toppen som inneholder peptidet med sekvensen AWAYFSDVDLEK. Denne sekvensen ble benyttet for å utvikle oligonukleotidproben 8,3 for human genomisk forrådsundersøkelse. ;Lange og korte prober ble syntetisert basert på de nettopp omtalte betraktninger. Den andre lange proben som ble benyttet, var basert på sekvensen i et 12 aminosyre- ;faktor Vlll-tryptisk fragment, AWAYFSDVDLEK. DNA-sekvensen som ble valgt for å syntetisere for proben, var 5 *-CTTTTCCAGGTCAACGTCGGAGAAATAAGCCCAAGC. Denne proben (kalt 8,3) ble først testet i genomiske "blot"-hybridiseringer. Fig. 3A viser genomiske Southern-blot til normalt hankjønn (IX) og 49,XXXXY (4X) DNA hybridisert med merket 8,3-probe og vasket ved forskjellige stringenser. Selv ved den høyeste stringens (lxSSC, 4 6°C) ble et enkelt bånd på 3,8 kb (EcoRI) og 9,4 kb (BamHI) observert. Inten-siteten til dette bånd hadde et forhold på ca. 1:4 i en X- og 4X-sporene slik det ville forventes for det X-bundede faktor Vlll-genet. Kontrollforsøk hadde demonstrert av en kjent X-bundet genprobe (faktor IX) ga det forventede 1:4-hybridiseringsforhold, mens et autosomalt gen (albumin) ga et l:l-forhold.

Basert på disse genomiske blot-resultater, ble 8,3-proben benyttet for å undersøke X/4X- biblioteket. 500.000 fag ble dyrket på femti 150 mm plater og duplikat-nitrocellulose-32

filtere ble hybridisert med P-merket 8,3 probe ved en vaskestringens på lxSSC, 37°C (fig. 3). Ved ny testing ble 15 sterkt hybridiserende og 15 mer svakt hybridiserende kloner oppnådd. DNA ble fremstilt fra disse isolerte plateelementer, spaltet med restriksjonsendonuklease, og blot-hybridisert med probe 8,3. Mange av de sterkt hybridiserende klonene ga et hybridiserende EcoRI-

fragment på 3,8 kb, den samme størrelsen ble detektert i

den genomiske blot eller flekk. I tillegg viste alle sterkt hybridiserende kloner et identisk 262 basepar Sau3AI-fragment ved hybridisering med 8,3 proben. Sau3AI-fragmentene ble klonet inn i den enkeltkjedede fag-vektoren M13mp8 (86) undersøkt ved hybridisering, og sekvensert ved dideoksymetoden. DNA-sekvensen til 262 bp-fragmentet viste betydelig homologi med 8,3-proben. Homologien inkluderte områder av kontinuerlige tilpasset-heter av 14 og 10 bp med en total homologi på 83%. De første ti restene i peptidfragmentet var i overensstemmelse med det som ble utledet fra DNA-sekvensen i rekombinant-klonene, og de ble forutgått av et lysin-kodon som forventet for produktet av en tryptisk nedbrytning. De to forutsagte rester passet ikke DNA-sekvensen. DNA-materialet ved denne stilling inneholdt en god consensus RNA-spleisedonorsekvens (60, 61) som like etter var fulgt av stoppkodoner i alle tre mulige leserammer. Dette foreslo tilstedeværelsen av en intron som begynte ved denne stillingen.(Dette forslag ble bekreftet ved cDNA-kloner beskrevet nedenfor). En åpen leseramme utgikk nesten 400 b 5' fra homologiområdet. I dette området ble flere konsense spleise-akseptorsekvenser identifisert. Inspeksjon av den DNA-forutsagte proteinsekvsns for dette området viste tilpasninger med proteinsekvens for flere ytterligere tryptiske peptidfragmenter i faktor VIII. Dette demonstrerte at et ekson for en genomisk klon for human faktor VIII

var blitt oppnådd.

4. Forlengelse av genomiske kloner:A. bibliotek- genomwalking

Til å begynne med ble 8 uavhengige faktor VIII genomiske kloner oppnådd fra X/4X biblioteket. Disse inneholdt overlappende segmenter av humangenomet som spente over ca.

28 kb. Fra den estimerte størrelsen av faktor Vlll-proteinet ble det antatt at det fullstendige gen ville omfatte

100200 kb, avhengig av lengden på introner. Deretter ble kolleksjonen av overlappende kloner utvidet ved "genomwalking" .

Det første trinnet i denne prosessen var kartlegging av restriksjonsendonuklease-spaltningsseter i de eksisterende genomiske kloner (fig. 4). DNA fra klonene ble nedbrutt med restriksjonsenzymer alene eller i kombinasjoner, og karakterisert ved gelelektroforese (fulgt av Southern-blot hybridisering i noen tilfeller). DNA-fragmenter utviklet ved EcoRI- og BamHI-nedbrytning ble subklonet inn i pUC-plasmidvektorer (59) for hensiktsmessighetens skyld. Re-striks jonskartlegging, DNA-sekvensanalyse og blot-hybridiseringer med 8,3-proben bestemte genorienteringen.

Deretter ble enkeltkopifragmenter nær endene av 28 kb-området identifisert som "walking"-prober. Nedbrytings-produkter av klonet DNA ble blot-hybridisert med total 32

P-merket human DNA. Med denne teknikken ville bare fragmenter inneholdende sekvenser gjentatt mer enn ca. 50 ganger i genomet, hybridisere (87, 88). Ikke-hybridiserende walkingprobe-kandidat f ragmenter ble testet på nytt for gjentatte sekvenser ved hybridisering til 50.000 fag fra X/4X-biblioteket.

I 5'-retningen ble en triplet av 1 kb probefragmenter isolert fra X120 DNA nedbrutt med Ndel og BamHI (se fig. 4). En million X/4X bakteriofag ble undersøkt med denne

proben. En resulterende klon, X222, ble vist å rage ca.

13 kb 5' fra X120 (se fig. 4).

I 3'-retningen ble et 2,5 kb StuI/EcoRI-restriksjons-fragment av X114 identifisert som en enkel kopi-walkingprobe. Uttømmende undersøkelse av X/4X biblioteket og deretter andre X/humane genomiske bibliotek, ga ikke forlengede kloner Underrepresentasjon av genomiske områder i X- bibliotek har blitt observert før (62). Det ble bestemt spesifikt å

anrike genomisk DNA for de ønskede sekvensene og fra denne

konstruere et begrenset bakteriofag- bibliotek

Southern-blot hybridisering av human genomisk DNA med 2,5 kb StuI/EcoRI-probe viste et 22 kb hybridiserende Bcll-restriksjonsfragment. Restriksjonskartlegging viste at kloning og utvinning av dette fragmentet ville resultere i en stor 3'-utvidelse av genomiske kloner. Human 4 9,XXXXY DNA ble nedbrutt med Bell, og en størrelsesfraksjon på

ca. 22 kb ble renset ved gelelektroforese. Denne DNA ble, ligert inn i BamHI-setet i bakteriofagvektoren X1059

og et bibliotek ble fremstilt. (Den tidligere benyttede vektoren,.Charon 30, kunne ikke romme et slikt stort innskudd). Seks hybridiserende kloner ble oppnådd fra 400.000 fag undersøkt fra dette anrikede bibliotek. Den ønskede klon, betegnet ^482, raget 17 kb utover 3'enn det opp-rinnelige sett man hadde av overlappende genomiske kloner (fig. 4) .

5. Genom- walking: Kosmidkloner

Et nytt genomisk bibliotek ble konstruert med kosmidvektorer. Kosmider (63), et plasmid og bakteriofaghybrid, kan romme omkring 4 5 kb innskudd, omtrent en tre gangers økning over den gjennomsnittlige innsuddsstørrelse for X/4X DNA-forrådet. En nykonstruert kosmidvektor, pGcos4, har følgende ønskelige attributer: 1. Et derivat av tetracyklinresistensgene av pBR322 ble benyttet, og som ikke inneholdt et BamHI-sete. Dette tillot at et BamHI-sete kunne innføres et annet sted i plasmidet og bli benyttet som kloningssete. Tetracyklinresistensen er noe lettere å arbeide med enn den mer vanlig benyttede ampicillinresistens p.g.a. den større stabiliteten til legemiddelet. 2. 40 3 b HincII-fragmentet av X inneholdende cos-setet ble erstattet med 641 b Aval/PvuII-fragmentet i pBR322 slik at kopiantallet i plasmidet ville bli forøket og for å fjerne pBR322-sekvenser som forstyrrer transformasjonen av eukaryotceller (75). 3. Et mutant dihydrofolat-reduktasegen med en SV40 replikasjonsopprinnelse og - promoter ble inkludert i pGcos4-vektoren.

På denne måten kunne ethvert fragment klonet i denne vektoren deretter propageres i et bredt område av eukaryotceller. Det var forventet at dette kunne vise seg å være nyttig når man skulle uttrykke store fragmenter av genomisk DNA med deres naturlige promotorer. 4. For kloningssetet ble en syntetisk 20-mer med restriksjonssetene EcoRI, Pvul, BamHI, Pvul, og EcoRI klonet inn i EcoRI-setet fra pBR322. Det unike BamHI-setet anvendes for

å klone 35-45 b Sau3Al-fragmenter i genomisk DNA. De flankerende EcoRI-setene kan benyttes for subkloning av EcoRI-fragmentene i innskuddet. Pvul-setene kan anvendes for å skjære ut hele innskuddet i det fleste tilfellene. Pvul-setene er meget sjeldne i eukaryotisk DNA og er forventet bare å forekomme en gang hver 134.000 b basert på

de nukleotidsekvenser i human DNA.

Fig. 5 gir skjema for konstruksjon av kosmidvektoren, pGcos4. 35-45 kb Sau3Al-fragmenter i 49,XXXXY DNA ble klonet i denne vektoren. Ca. k50.000 rekombinanter ble under-

søkt i duplikat med et 5<1> 2,4 kg EcoRI/BamHI-fragment i X222 og et 3' 1 kb EcoRI/BamHI-fragment i A482 som var enkle kopiprober identifisert nær endene av det eksisterende genomiske området. Fire positive kosmidkloner ble isolert og kartlagt. Fig. 4 innbefatter kosmider p541, p542 og p543. Fra denne sortering forlenget disse kosmidklonene det genomiske område for faktor VIII til et totale på 114 kbp. Etterfølgende probing med cDNA-kloner identifiserte flere eksoner i det eksisterende sett av overlappende genomiske kloner, men indikerte at den genomiske skritting enda ikke var fullstendig. Ytterligere trinn ble tatt i hver retning.

En 3'-skrittprobe ble fremstilt fra 1,1 kb BamHI/EcoRI-fragment av p542 (fig. 4). Denne proben detekterte den overlappende kosmidklonen p613 som raget ca. 35 kb utover 3'. Ved et senere tidspunkt ble den fulle faktor Vlll-meddeler-sekvens oppnådd ved cDNA-kloning (se nedenfor). Når et 1,9 kb EcoRI cDNA-fragment inneholdende 3<1->terminaldelen av cDNA-materialet ble hybridisert til Southern-blot i human genomisk og kosmidklonet DNA, identifiserte det seg som et enkelt 4,9 kb EcoRI-bånd og 5,7, 3,2 og 0,2 kb BamHI-bånd i både ikke-klonet (genomisk) og p613 DNA. Dette innebar at 3'-enden til genet nå var nådd, hvilket senere ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse.

En 5' - walkingprobe ble fremstilt fra et 0,9 kb EcoRI/BamHI-fragment av p543. Den detekterte en overlappende kosmidklon p612, som raget noe utover det overlappende område.

Klonene nærmest 5'-ende ble til slutt oppnådd ved

screeing av kosmid/4X og X/4X-forråd med cDNA-avledede prober. Som vist på fig. 4 kompletterer X599, X605 og p624 settet av rekombinante kloner som spenner over faktor VIII.

(Disse klonene overlapper og inneholder alt DNA-materialet

i dette området av det humane genom med unntagelse for en 8,4 kb-åpning mellom p624 og X599 bestående utelukkende av intron DNA.) Tilsammen spenner genet over 200 kb av human X-kromosom. Dette er langt det største gen som hittil er rapportert. Grovt regnet omfatter 95% av genet introner som må behandles på riktig måte for å fremstille templat mRNA for syntese av faktor Vlll-protein.

Isoleringen av faktor Vlll-genområdet i X- og kosmid-rekombinante kloner ér ikke tilstrekkelig til å gi et nyttig produkt, faktor Vlll-proteinet. Flere metoder ble fulgt for å identifisere og karakterisere de proteinkodende (ekson) delene i genet for til slutt å konstruere et rekombinant ekspresjonsplasmid som kan dirigere syntesen av aktiv faktor Vlll-protein i transfekterte mikroorganismer eller vevskulturceller. To strategier ville ikke gi vesentlig nyttige resultater: ytterligere screeing av genomiske kloner med nye oligonukleotidprober basert på proteinsekvensering, og bruk av utvalgte fragmenter av genomiske kloner som prober til RNA-blot-hybridiseringer. Kodingsområder for faktor Vlll-proteinet ble imidlertid isolert ved bruk av SV40 "ekson-ekspresjons"-vektorer og til slutt ved cDNA-kloning.

6. SV40 ekson- ekspresjonsvektorer

Det er meget usannsynlig at et genomisk område på flere hundre kb ville kunne bli fullstendig karakterisert ved DNA-frekvensanalyse eller direkte benyttet for å syntetisere nyttige mengder av faktor Vlll-protein. Grovt regnet omfatter 95% av human faktor Vlll-genet introner (mellomliggende sekvenser) som må fjernes på kunstig måte eller ved eukaryotisk RNA-spleising før proteinet kan uttrykkes. Det ble skapt en metode for å fjerne introner fra ufull-stendig karakteriserte restriksjonsfragmenter i genomiske kloner under anvendelse av det man kaller SV40-ekspresjonsvektorer. Den generelle konsept innebærer innføring av fragmenter av genomisk DNA inn i plasmider inneholdende en SV40-promotor og produsere signifikante mengder rekombinant DNA, hvilket ville bli behandlet i transfekterte cos-celler hos ape. Den resulterende spleisede RNA kan analyseres direkte eller tilveiebringe materialer for cDNA-kloning. I det minste i teorien kunne denne teknikk anvendes for å sammensette en hel spleiset versjon av faktor Vlll-genet.

Ved de første ekson-ekspresjonskonstruksjoner benyttet man eksisterende SV40 cDNA vektorer som uttrykte hepatitt-overflateantigen-genet (73). De genomiske faktor VIII-fragmentene klonet inn i disse vektorene ga imidlertid ingen observerbar faktor VIII RNA ved analyse med blot-hybridisering. Det ble antatt at vanskeligheten kunne være at i løpet av disse konstruksjoner så hadde ekson-områdene i cDNA-vektorene blitt sammenføyet til intron-områder i faktor Vlll-genet. For å omgå disse vanskelig-hetene ble ekson-ekspresjonsvektoren pESVDA konstruert som vist på fig. 6. Denne vektor inneholder SV4 0-tidlig-promoteren, det større sene/første spleise-donorsete i adenovirus II, intronsekvenser hvori de genomiske faktor VIII-fragmentene kunne klones, fulgt av adenovirus II Elb-spleise-akseptorsete og hepatitt B overflateaktigen-3<1->utranslaterte og polyadenyleringssekvenser (49j).

Til å begynne med ble 9,4 kb BamHI-fragmentet og 12,7 kb Sstl-fragmentet i A114 klonet i intronområdet av pESVDA

(se fig. 6). Northern-blot-analyse av RNA-materialet syntetisert ved disse to konstruksjonene etter transfeksjon av cos-celler, er vist på fig. 7. Med 9,4 kb BamHI-konstruksjonen, finnes et bånd for hybridiserende RNA

på ca. 1,8 kb med prober for ekson A, og hepatitt 3'-utranslatert sekvens. For å undersøke RNA-materialet for eventuelle nye faktor Vlll-eksoner, ble et 2,0 kbp Stul/ BamHI-fragment av X114, 3' i ekson A, hybridisert i et parallelt spor. Denne proben viste også et RNA-bånd på

1,8 kb hvilket demonstrerer tilstedeværelsen av ytterligere nye faktor Vlll-eksoner i dette område. Hver av disse tre probene hybridiserte også til et RNA-bånd fra en konstruksjon inneholdende det 12,7 kb Sstl genomiske fragment. Dette RNA-bånd var omkring 2,1 kb. Denne observasjon foreslo at ytterligere 200-300 bp av eksonsekvenser befant seg i denne konstruksjonen 3' fra BamHI-setet som lå i grenseområdet for 9,4 kb BamHI-fragmentet.

Kontrolleksperimenter viste at dette systemet er i stand til korrekt spleising av kjente ekson-områder. Et 3,2 kb genomisk HindIII-fragment av eksoner III og IV fra mus og som spente over dhfr, ble klonet i pESVDA. Et RNA-bånd på 1 kb ble funnet med en dhfr-probe fra mus. Dette er den størrelse som forventes dersom eksonene spleises korrekt. Konstruksjoner med 9,4 kb BamHI faktor VIII

eller 3,2 kb dhfr genomiske fraksjoner i den motsatte orientering, ga ingen observerbare RNA-bånd med noen av probene, (fig. 7).

En cDNA-kopi av RNA-materialet fra 12,7 kb Sstl-konstruksjonen ble klonet i pBR322 og kontrollert. En nesten full lengde (1700 bp) cDNA-klon (S36) ble funnet. Sekvensen til 950 bp Sstl-fragmentet inneholdende hele faktor VIII-innskuddet og en del av pESVDA-vektoren på hver side, er vist på fig. 8. Sekvensen begynner og slutter med adenovirus-spleisedonor- og akseptor-sekvenser som forventet. Imellom er det 888 bp av faktor Vlll-sekvens innbefattende ekson A. De 154 bp som går forut for og de 56 8 bp som følger ekson A, inneholder flere faktor VIII 80K tryptiske fragmenter, hvilket bekrefter at disse er nye, identifiserte eksoner.

Sekvenser av det genomiske området eller region tilsvarende disse eksoner viste at 154 bp 5' av ekson A inneholdes i en ekson, C, og at området 3' i ekson A består av 3 eksoner, D, E og I med 229, 183 og 156 bp. Hver av disse eksoner er bundet ved hjelp av en rimelig spleisedonor og akseptor-sete (60, 61).

Etterfølgende sammenligning av S36 ekson-ekspresjons-cDNA med faktor Vlll-cellelinje ved DNA-klonene viste at hele den spleisede faktor Vlll-sekvensen i S36 er fra faktor VIII-eksoner. Dette inkluderte som forventet eksoner C. A, D, E og I. 4 7 bp i ekson A manglet imidlertid ved C-, A-forbindelsen og eksoner F, G og H var fullstendig utelatt. Forflytningene i leserammen som resulterer fra slik avvikende RNA-behandling viste at den ikke kunne tilsvare nøyaktig til faktor Vlll-sekvensen. Ved C, A-forbindelsen ble et godt konsens-spleisesete benyttet istedenfor det autentiske. Den forskjellige spleising av av S36-klonen sammenlignet

med det autentiske faktor Vlll-transkriptet, kan være fordi bare en del av RNA-primærtranskriptet ble uttrykt i cos-cellekonstruksjonen. Celletype- eller artvariabilitet kan alternativt være grunnen til denne forskjell.

7. cDNA- kloning

a. Identifikasjon av en cellelinjeproduserende faktor

VIII mRNA

For å identifisere en kilde for RNA for isolasjon av

faktor VIII cDNA-kloner, ble polyadenylert RNA isolert fra flere humane cellelinjer og et vev og undersøkt ved Northern-blot-hybridisering med 189 bp Stul-Hinc II-fragmentet fra ekson A-området i A120. Poly(A)<+> RNA fra CH-2 human T-celle-hybridoma viste en hybridiserende RNA-type. Størrelsen av det hybridiserende RNA ble bestemt til å være ca. 10 kb. Dette er den mRNA-størrelse som er forventet å kode for et protein på ca. 300 kD. Ved sammenligning med kontroll DNA "dot-blot"-hybridiseringer (66), ble mengden av denne RNA bestemt til å være 0,0001-0,001% av den totale cellulære poly(A)<+> RNA i CH-2 cellelinjen. Dette resultat tydet på at isolering av faktor VIII cDNA-sekvenser fra denne kilden ville kreve ytterligere anrikning av spesifikke sekvenser eller ellers medføre screeing av ekstremt store antall cDNA-kloner.

b. • Spesifikt primede cDNA- kloner

DNA-sekvensanalysen av faktor VIII genomiske kloner ga syntesen av 16 base-syntetiske oligonukleotider anledning til spesielt å prime første kjede-syntese av cDNA. Normalt anvendes oligo(dT) for å prime cDNA-syntese ved poly(A)-halene til mRNA. Spesifikk priming har to fordeler i forhold til oligo(dT). For det første tjener det til å

anrike cDNA-klonpopulasjonen for faktor VIII. For det annet posisjonerer det cDNA-klonene i områder i genet for hvilket man var i besittelse av hybridiseringsprober. Dette er spesielt viktig ved kloning av et slikt stort

gen. Siden cDNA-kloner sjelden er lengre enn 1000-2000 basepar, ville oligo(dT) primede kloner vanligvis være

ikke-detekterbare med en probe fremstilt fra de fleste områder i faktor Vlll-genet. Den benyttede strategi var å anvende DNA-fragmenter og sekvensinformasjon fra det innledende ekson A-området for å oppnå spesifikt primede cDNA-kloner. Man fortsatte ved å oppnå et sett av overlappende cDNA-kloner i 5<1->retningen basert på karakteri-seringen av den tidligere generasjon av cDNA-kloner. Fo å utlede det mer 3<1->området i cDNA, benyttet man cDNA

og genomiske klonfragmenter fra 3'-eksoner for å detektere oligo(dT) primet cDNA-kloner. Flere typer av cDNA-kloningsmetoder ble benyttet i denne sammenheng og vil bli beskrevet nedenfor.

Den innledende spesifikke cDNA-primer, 5'-CAGGTCAACATCAGAG ("primer 1"; se fig. 9) ble syntetisert som det reverse komplement til de 16 3'-terminalrestene i ekson A-sekvensen. cDNA med C-hale ble syntetisert fra 5,ug CH-2 celle-poly(A) + RNA med primer 1, og smeltet inn i pBR322 med G-hale som beskrevet generelt i (67). Omkring 100.000 resulterende E. coli-transformanter ble utplettert på

100 150 mm skåler og kontrollert ved hybridisering (48)

med 189 bp StuI/HincIII-fragmentet fra ekson A-området i den genomiske klon A120 (fig. 4). En ekte hybridiserende klon ("pl.11" ble utvunnet (se fig. 9). DNA-sekvensanalyse av pl.11 demonstrerte identiteten med foreliggende faktor VIII genomiske kloner. 447 bp cDNA-innskuddet i pl.11 inneholdt de første 104 b i genomisk ekson A (annen tråd-syntese strakk seg tydeligvis ikke tilbake til primeren)

og fortsatte ytterligere inn i det som senere skulle vise seg å være eksoner B og C. 5'-divergenspunktet med ekson A-sekvens grenset til et typisk RNA-spleiseakseptor-sete (61) .

Selv om muligheten for oppnåelse av faktor VIII cDNA-kloner fra CH-2-cellelinje nå var demonstrert, ble ytterligere forbedringer foretatt. Forsøk av forskjellige typer ble foretatt for ytterligere å anrike CH-2 RNA for faktor VIII-meddelelse ("message"). En vellykket strategi var å kombinere spesifikt primet første tråd-cDNA-syntese med hybridseleksjon av den resulterende enkelttrådede cDNA. Primer 1 ble benyttet med 200^ug poly(A)<+> CH-2 RNA for å syntetisere enkelttrådet cDNA. Istedenfor å bruke DNA-polymerase for umiddelbart å omdanne denne til dobbelttrådet DNA, ble enkelttrådet DNA hybridisert til 2^ug av 189 bp StuI/HincII genomisk fragment DNA som hadde blitt immobilisert på aktivert ABM-cellulosepapir (Schleicher og Schuell "Transa-Bind"; se (48)). Selvom

RNA vanligvis er utsatt for hybrid seleksjon, ble metoden anvendt etter cDNA-syntese for å unngå ytterligere manipulering av de sjeldne, store og relativt labile faktor VIII RNA-molekylene. Etter eluering ble materialet omdannet til dobbelttrådet cDNA, størrelsesselektert og 0,5 ng av utvunnet DNA ble forsynt med C-hale og klonet inn i pBR322 som før. Omkring 12.000 rekombinante kloner ble oppnådd og kontrollert ved hybridisering med et

364 bp Sau3A/StuI-fragment avledet fra den tidligere cDNA-klon pl.11. Probefragmentet ble valgt med hensikt for ikke å overlappe med det DNA-materialet som var benyttet for hybridseleksjon. Man unngikk således identifikasjonen av uekte rekombinanter inneholdende noe av StuI/HincII-DNA fragmentet som uvegerlig frigjøres fra DBM-cellulosen.

29 hybridiserende kolonier ble oppnådd. Dette representerer en grovt regnet 250-gangers anrikning av ønskede kloner

i forhold til den tidligere metoden.

Hver av de 29 nye rekombinantene ble karakterisert ved restriksjonskartlegging og de lengste (p3.12 og p3.48; fig. 9) ble sekvensert. Disse cDNA-klonene strakk seg ca. 1500 bp utover 5' enn pl.11. Samtidig kartlegging og sekvensanalyse av cDNA og genomiske kloner avslørte tilstedeværelsen av et uvandig stort ekson (ekson B, fig. 4) som omfattet p3.12 og p3.48. Basert på denne observasjon ble DNA-sekvensanalysen av den genomiske klon X222 utvidet til å definere omfanget av dette ekson. Ekson B-området inneholdt en åpen leseramme på ca. 3 kb. 16 mer-primere 2 og 3 ble syntetisert til å passe til sekvensen innen dette store ekson i det håp å oppnå en betydelig forlengelse i cDNA-kloning.

Ved dette punkt ble det demonstrert at et bakteriofag-

basert cDNA-kloningssystem kunne anvendes, hvilket muliggjorde produksjon og screeing av store antall cDNA-kloner uten forutgående anrikning ved hybridseleksjon. AGT10 (68)

er et fag X-derivat med et enkelt EcoRI-restriksjonssete i dets repressor-gen. Dersom dobbelttrådede cDNA-fragmenter flankeres av EcoRI-seter, kan de ligeres inn i dette unike setet. Innføring av fremmed DNA i dette setet gjør fagen repressor-minus, hvorved det dannes et klart plaque-

element. XGT10 uten innskudd danner uklare plaque-elementer som således kan skjelnes fra rekombinanter. I tillegg til den store transformasjonseffektiviteten som er uløselig knyttet til fag-pakking, er X cDNA-plaque-elementer mer hensiktsmessig å undersøke ved høy densitet enn tilfellet er for bakteriekolonier.

Dobbelttrådet cDNA ble fremstilt som før ved bruk av

primer 3, 5'-AACTCTGTTGCTGCAG (beliggende ca. 550 bp ned-strøms fra den postulerte 5'-enden i ekson B. EcoRI "adaptorer" ble ligert til cDNA-materiale med butt ende. Adaptorene besto av en komplementær syntetisk 18-mer og 22-mer av sekvens 5'-CCTTGACCGTAAGACATG og

5<1->AATTCATGTCTTACGGTCAAGG. 5'-enden til 18-meren ble fosforylert, mens 5'-enden til 22-meren beholdt 5'-

OH med hvilket den var syntetisert. Således, når adaptorene er sammensmeltet og ligert med cDNA-materialet, danner de overhengende EcoRI-seter som ikke kan selvligere. Dette gjør at man kan unngå EcoRI-metylering av cDNA og etter-følgend3 EcoRI-nedbrytning som følger linker-ligering i andre publiserte metoder (83). Etter gelisolering for å størrelsesselektere cDNA-materialet og fjerne ureagerte adaptorer, ble en ekvimolar mengde av dette cDNA ligert inn i EcoRI-utskåret XGT10, pakket og utplatet på E. coli c600hfl. Ca. 3.000.000 kloner fra l^ug av poly(A)<+> RNA ble utplettert på 50 150 mm petriskåler og hybridiseringsundersøkt med en 300 bp Hinfl-fragment fra 5'-enden i ekson B.

46 duplikatpositiver ble identifisert og analysert ved

EcoRI-nedbrytning. Flere cDNA-innskudd viste seg å utrage ca. 2.500 bp 5' i primer 3. Disse lange klonene ble analysert ved DNA-sekvensering. Sekvensen i 5<1->endene til X13,2 og X13.27 er vist på fig. 10. De var i besittelse av flere trekk som indikerte at man hadde nådd 5'-enden til kodnings-området for faktor VIII. De innledende 109 bp inneholdt

stoppkodoner i alle mulige leserammer. Deretter opptrådte en ATG-triplet fulgt av en åpen leseramme for resten av de 2724 bp i cDNA-innskuddet i X13.2. Translasjon av sekvensen etter initiatoren ATG gir en 19 aminosyresekvens som er typisk for en utskilt protein-"leder"- eller "pre"-sekvens (69). Dens fremspringende trekk er to ladde rester som grenser til en hydrofob kjerne med 10-aminosyrer. Etter denne antatte ledersekvens er et område tilsvarende amino-terminalrester oppnådd fra proteinsekvensanalyse av 210 kD og 95 kD trombin-nedbrytningstyper av faktor VIII.

c. Oligo( dT)- primede cDNA- kloner

Flere tusen"flere"-3'-baser i faktor-VIII mRNA var tilbake for omdannelse til cDNA. Valget var å prime revers transkripsjon med oligo(dT) og søke etter cDNA-kloner inneholdende 3'-poly(A)<+->halene i mRNA. I en bestrebelse på

å anrike klonene og å øke effektiviteten til annentråd-DNA-syntese, ble imidlertid etablerte metoder erstattet med anvendelse av en spesifikk primer for annentråd-cDNA-syntese. 16-mer primeren 4, 5'-TATTGCTGCAGTGGAG,

ble syntetisert for å representere meddeler-retnings-sekvens ved et Pstl-sete ca. 400 bp oppstrøms for 3'-enden i ekson A (fig. 9). mRNA ble reverstranskribert med oligo(dT) priming, primer 4 ble tilsatt med DNA-polymerase for annentråd-syntese, og EcoRI-tilpasset cDNA ble deretter

ligert inn i AGT10 som før. 3.000.000 plaque-elementer ble kontrollert med et 419 bp Pstl/HincII-fragment inneholdt p3.12, liggende nedstrøms fra primer 4. DNA

ble fremstilt fra de utvunnede fire klonene. Disse ble nedbrutt, kartlagt og blot-hybridisert med ytterligere genomiske nedstrømsfragmenter som nettopp var blitt identifisert som eksoner ved anvendelse av SV4 0-ekson-ekspresjonsplasmider som beskrevet ovenfor. Tre av de fire rekombinantene hybridiserte. Den lengste, A10.44, var omkring 1800 basepar. DNA-sekvensen i A10.4 4 viste at annentråd-syntese virkelig begynte ved primer 4. Den inneholdt alle ekson-sekvenser funnet i SV40 ekson-ekspresjonsklonen S36 og mer. Den åpne leserammen til A10,44 fortsatte imidlertid til enden av cDNA. Intet 3<1->utranslatert område og heller ikke poly(A)-hale ble funnet. Antageligvis hadde annentråd-syntese gått til fullførelse.

For å finne kloner inneholdende den komplette 3'-enden,

ble de samme filtere underkastet ny screeing med merket DNA fra A10,44. 24 ytterligere kloner ble utvunnet og kartlagt, og de to lengste (A10.3 og A10.9.2)ble sekvensert.

De inneholdt vesentlig identiske sekvenser som overlappet A10.44 og tilføyet ca. 1900 flere 3'-basepar. 51 basepar utover enden til A10.44-terminusen, viste DNA-sekvensen et TGA-translasjonsstoppkodon fulgt av et tilsynelatende 3'-utranslatert område med 1805 basepar. Diagnostiske trekk i dette området er stoppkodoner spredt i alle tre leserammer og en poly(A)-signalsekvens, AATAAA (89),

fulgte 15 baser nedstrøms med en poly(A)-lengde ved enden av cDNA-materialet (klon A10.3 inneholder 80 A'er fulgt av EcoRI-adaptor ved dette punkt, mens A10.9.2 inne-

holder over 100 A'er ved dens 3'-ende).

d- Komplett cDNA- sekvens

Den komplette sekvens for overlappende kloner er gitt på fig. 10. Den består av en kontinuerlig åpen leseramme som koder for 2351 aminosyrer. Ved å anta et formodet terminal-signalpeptid på 19 aminosyrer, ville det "modne" protein derfor ha 2332 aminosyrer. Den beregnede molekylvekt for dette protein er ca. 267.000 dalton. Ved å ta hensyn til mulig glykosylering nærmer dette seg molekylvekten til nativt protein som bestemt ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese .

Den "komplette" cDNA-lengden på ca. 9000 basepar (avhengig av lengden av 3' poly(A)) er i overensstemmelse med den estimerte lengden til mRNA-materialet bestemt ved Northern-blot-hybridisering. 5' (aminoterminalkodingfområdet inneholder vesentlig tilsvarighet til peptidsekvensen i 210 kD-avledet faktor Vlll-materiale og 3' (karboksy-terminalkoding)-område inneholder vesentlig tilsvarighet til peptidsekvensen i 80 kD-protein.

8. Ekspresjon av rekombinant faktor VIII

a. Sammensetning av klon med full lengde

For å uttrykke rekombinant faktor VIII ble hele det 7 kb proteinkodende område sammensatt ut fra flere separate cDNA og genomiske kloner. Det beskrives nedenfor og i fig. 11 konstruksjon av 3 intermediære plasmider inneholdende 5'- midtre, og 3<1->områdene i genet. Intermediær-elementene kombineres i et ekspresjonsplasmid fulgt av en SV4 0 tidligpromotor. Dette plasmid tjener igjen som utgangspunkt for forskjellige konstruksjoner med modifiserte terminalsekvenser og forskjellige promotorer og selekterbare markører for transformasjon av en rekke forskjellige pattedyr-celletyper.

5<1->kodingsområdet ble sammensatt i et pBR322-derivat på

en slik måte at et Clal-restriksjonssete ble plasset før ATG-startkodonet i faktor Vlll-signalsekvensen. Siden intet annet Clal-sete finnes i genet, blir det et hensikts-

messig sete for raffineringer av ekspresjonsplasmidet.

Det hensiktsmessige Clal- og Sacl-holdige plasmid pT24-10 (6 7a) ble spaltet med Hindlll, ifylt med DNA polymerase,

og oppdelt med SacI. Et 77 b AluI/SacI ble oppnådd fra 5'-området i faktor VIII cDNA-klonen A13.2 og ligert inn i denne vektoren for dannelse av intermediærproduktet betegnet pF8Cla-Sac. (Alul-setet er beliggende i det 5'-utranslaterte område i faktor VIII og Sacl-setet 10 b utenfor initiator-ATG ved nukleotidstilling 10 på fig. 10; nukleotidposisjonen til alle restriksjonssetene som følger vil bli nummerert som på fig. 10 idet man begynner med A i initiatorkodonet ATG.) Et 85 b Clal/SacI-fragment inneholdende 11 bp av adaptorsekvens (adaptorsekvensen 5' ATCGATAAGCT erfullstendig avledet fra pBR322), ble isolert fra pF8Cla-Sac og ligert sammen med et 1801 b Sacl/Kpnl

.(nukleotid 1811)-fragment fra X13.2 inn i Clal/Kpnl-

vektor fremstilt fra en pBR322-subklon inneholdende et Hindlll-fragment (nuc. 1019-2277) fra faktor VIII. Dette intermediærprodukt, betegnet pF8Cla-Kpn, inneholdt de innledende 2277 kodingsnukleotider til faktor VIII forutgått av 6 5 5<1->utranslaterte basepar og 11 basepar-Clal-adaptorsekvensen. pF8Cla-Kpn ble åpnet med Kpnl og SphI

(i pBR322-delen) for å tjene som vektorfragment i en ligering med et 466 b KpnI/HindIII-fragment oppnådd fra en EcoRI-subklon i X13.2 og et 1654 b Hindlll/SphI (nuc. 4 003)-fragment oppnådd fra den ekson B-holdige subklon p222.8. Dette ga pF8Cla-Sph inneholdende de første 3931 b i faktor Vlll-kodingssekvens.

Den midtre delen av kodingsområdet ble oppnådd fra en tre-delers ligering som kombinerte fragmenter av pBR322/cDNA-kloner eller subkloner. p3.48 ble åpnet med BamHI (nuc. 4743) og Sali (pBR322 tet-området) for å tjene som vektor. Inn i disse seter ble det ligert et 778 b BamHI/Ndel (nuc. 5520) fragment fra p3.12 og en 2106 b Ndel/Sall (i pBR322)

fragment fra subklonen pA10.44RI.9. Riktig ligering resulterte i et tetracyklinresistent plasmid pF8Sca-RI.

Den meste 3'-delen i faktor VIII cDNA ble klonet direkte inn i en SV4 0-ekspresjonsvektor. Plamidet pCVSVEHBV inneholder en SV40-tidligpromotor fulgt av en polylinker og genet for hepatitt B-overflateantigenet.

[pCVSVEHBV, også betegnet pCVSVEHBS, er en svak variant av p342E (73). Spesielt ble pCVSVEHBV oppnådd som følger: 540 bp Hindlll-Hindlll-fragmentet omfattende SV40-replikasjonsopprinnelsen (74) ble ligert inn i plasmid pML (75) mellom EcoRI-sete og Hindlll-setet. Plasmidet EcoRI-setet og SV40 Hindlll-setet ble gjort butt ved tilsetning av Klenow DNA-polymerase I i nærvær av 4 dNTPs før nedbrytning med Hindlll. Det resulterende plasmidet, pESV ble nedbrutt med Hindlll og BamHI og 2900 b vektorfragmentet isolert. Til dette fragment ble ligert et Hindlll-Bglll-fragment på 2025 b fra HBV modifisert til å inneholde en polylinker (DNA-fragment inneholdende flere restriksjonsseter) ved EcoRI-setet. HBV-fragmentet omfatter overflateantigen-genet og er avledet ved EcoRI-Bglll-nedbrytning av klonet HBV DNA (74). Det dobbelttrådede linker-DNA-fragmentet (5'dAAGCTTATCGATTCTAGAATTC3<1>...) ble nedbrutt med Hindlll og EcoRI og tilsatt til til HBV-fragmentet, idet EcoRI-BglII-fragmentet ble omdannet til et HindIII-BglII-fragment. Selv om dette kunne gjøres som en tre-del-ligering bestående av linker, HBV-fragment og vektor, er det mer hensiktsmessig og ble slik foretatt at man først tilsatte Hindlll-EcoRI-linkeren til den klonede HBV DNA og deretter sørget for utskjæring av HindIII-BglII-fragmentet ved ko-nedbrytning av plasmidet med de enzymene. Det resulterende plasmid, pCVSVEHBV, inneholder en bakteriell replikasjonsopprinnelse fra den pBR322-avledede pML, og ampicillin-resistensmarkør, også fra pML, et SV40-fragment orientert slik at tidligpromotoren vil dirigere transkripsjonen av det innførte HBV-fragment, og overflateantigen-genet fra HBV. HBV-fragmentet tilveiebringer også et polyadenyleringssignal for produksjon av polyadenylert mRNA'er slik som normalt dannes i cytoplasma i pattedyrceller.

Plasmidet pCVSVEHBV inneholdt et nyttig Clal-sete umiddelbart 5' til et Xbal-sete i polylinkeren• Dette plasmidet ble åpnet med Xbal og BamHI (i det hepatitt Ag 3'-. utranslaterte område) og endene ble ifylt med DNA-polymerase. Dette fjernet det hepatitt-overflateantigen-kodende område, men bibeholdt dets 3'-polyadenylering-signalområde, samt SV40-promotoren. Inn i denne vektoren ble det ligert et 1883 b EcoRI-fragment (med ifylte ender) fra cDNA-klonen Å10.3. Dette inneholdt de endelige 77 kodende basepar til faktor VIII, det 1805 b 3'-utranslaterte område, 8-adenosinrester og den ifylte EcoRI-adaptoren. I kraft av :koblingen av de ifylte restriksjonssetene, ble EciRI-enden gjenskapt ved 5'-enden fra ifylt Xbal koblet med ifylt EcoRI) men ødelagt ved 3<1->enden ifylt EcoRI koblet med ifylt BamHI). Dette plasmidet ble betegnet pCVSVE/10.3.

Det komplette faktor VIII cDNA-området ble forbundet i en tre-delers ligering. pCVSVE/10.3 ble åpnet med Clal og EcoRI og tjente som vektor for innføringen av 3870 b Clal/Scal-fragmentet fra pF8Cla-Sca og 3182 b Scal/EcoRI-fragmentet fra pF8Sca-RI. Dette ekspresjonsplasmidet ble betegnet

pSVEFVIII.

b. Konstruksjon for ekspresjon av faktor VIII i vevskulturceller

En variantvektor basert på PSVEFVIII, inneholdende adenovirus hoved-senpromotoren, tredelt ledersekvsns, og et forkortet faktor VIII 3'-utranslatert område produserte aktiv faktor VIII når den på stabil måte ble transfektert inn i BHK-celler.

Fig. 12 viser konstruksjonen av pAML3P.8cl, ekspresjonsplasmidet som produserer aktiv faktor VIII. For å komme frem til denne konstruksjon ble først Sstll-setet i pFDll

(49r) og Clal-setet i pEHED22 (49y) fjernet med Klenow-DNA-polymerase I. Disse setene er de 3'- og 5'-utranslaterte områdene i DHFR-genet på disse plasmidene. Deretter ble en tre-del-ligering av fragmenter inneholdende de sløyfede setene og hepatitt B-overflateantigen-genet fra pCVSVEHBS (supra) foretatt for å utvikle vektoren pCVSVEHED22ACS som bare har et Clal- og et Sstll-sete. Plasmidet pSVEFVIII inneholdende det sammensatte faktor VIII-gen (fig. 11) ble spaltet med Clal og Hpal for å utskjære hele det kodende område og ca. 380 b av det 3<1->utranslaterte område. Dette ble innført i Clal, Sstll-sløyfingsvektoren ved dens unike Clal- og Hpal-seter, idet man erstattet overflateantigen-genet for oppnåelse av ekspresjonsplasmidet pSVE.8clD.

Separat ble adenovirus-hoved-senpromotoren med dens tredelte 5'-leder sammensatt fra to subkloner av deler av adenovirus-genomet sammen med et DHFR-ekspresjonsplasmid, pEDH22 (49y). Konstruksjon av de to adenovirus-subklonene (pUCHSX og pMLP2 er beskrevet i metodene. pMLP2 inneholder Sstl til HindIII-fragmentet fra adenoviruskoordinater 15.4 til 17.1 klonet i Sstl til Hindlll-setet i pUCl3 (59). pUCHSX inneholder Hindlll til Xhol-fragmentkoordinater 17.1 til 26.5 klonet i Hindlll til Sall-setet i pUC13. Ved sammensetning ved Hindlll-setet inneholder disse to adenovirus-fragmentene hoved-senpromoteren i adenovirus, de første to eksonene og intronene, og endel av det tredje ekson opp til Xhol-setet i det 5'-utranslaterte området.

En tre-delligering sammensatte adenovirus-promoteren f oran DHFR-genet i plasmidet pAML3P.D22. Dette anbragte et Clal-sete kort etter det foregående Xhol-setet i det

tredje ekson i den tredelte 5'-leder i adenovirus. Til slutt ble SV40-tidligpromotoren i faktor Vlll-ekspresjonsplasmidet, pSVE.8clD fjernet med Clal of Sali og erstattet med en SV40 tidlig/adenovirus-tandempromotor (se fig. 12) for å utvikle det sluttlige ekspresjonsplasmidet pAML3P.8cl. Dette plasmidet inneholder den tredelte lederen i adenovirus

speliset i det tredje ekson til det 5'-utranslaterte område i faktor VIII. Dette følges av den fulle lengde av faktor Vlll-strukturgen inkludert dets signalsekvens. Det 3'-utranslaterte området i faktor Vlll-genet spleises ved Hpal-setet til det 3'-utranslaterte området i hepatitt B overflateantigén-gen. Dette følges av DHFR-genet som har en SV40-tidligpromoter og et hepatitt 3'-utranslatert område som bidrar med en funksjonelt polyadenyleringssignal.

Faktor Vlll-ekspresjonsplasmidet, pAML3P.8cl, ble ko-transfektert inn i BHK-celler med neomycin-resistensvektoren pSVEneoBal6 (ATCC No. CRL 8544, deponert 20. april 1984). Disse cellene ble først selektert med G418 fulgt av en seleksjon med metotreksat.

Innledende karakterisering av faktor VIII RNA produsert med BHK-cellelinjen ble foretatt ved Northern-analyse av

+ 32 poly(A) cytoplasmisk RNA ved hybridisering til en P-merket faktor VIII DNA-probe. Denne analysen viser et bånd med en lengde på omkring 9 kb. Basert på hybridiserings-intensiteter er dette båndet ca. 100-200 ganger anriket sammenlignet med 9 kb-båndet som finnes i CH-2-cellelinjen.

9. Identifikasjon av rekombinant faktor VIII

a. Radioimmu n- analyse

Radioimmun-analyser ble foretatt som beskrevet i metodene angående supernatanter og lyserte celler fra BHK faktor Vlll-produserende cellelinjer. Tabell 1 viser at super-natantene (som inneholder faktor Vlll-aktivitet) (se 96) også inneholder omtrent like mengder av 210 kD (C10)-

og 80 kD (C7F7) delene i faktor VIII bedømt ved disse radioimmun-analysene. Faktor VIII kan også detekteres i cellelysatene ved begge radioimmunanalysene. Kontroll-cellelinjer som ikke uttrykket faktor VIII ga verdier ved radioimmunanalyse på mindre enn 0,001 enheter pr. ml.

I 125 cpm bundet ble omdannet til enheter/ml med en standard kurve basert på fortynninger av normalt plasma. Alle verdier er signifikant over bakgrunnsverdien. Grenser for detektering var 0,005 U/ml for CIO- og 0,01 U/ml for C7F7-analysene.

b. Kromogenanalyse på BHK- cellemedia

Som vist i tabell 2 utviklet media fra disse celler en absorbans ved 4 05 nm ved testing i Coatest-analysen. Som beskrevet ovenfor er denne analysen spesifikk for faktor Vlll-aktivitet i aktiveringen av faktor X. Tilsetning

av monoklonale antistoffer som er spesifikke for faktor VIII nedsatte mengden av utviklet faktor X clhvilket fremgår ved nedgangen i absorbans fra 0,155 for media til 0,03 for media pluss antistoffer (etter subtrahering av blindverdien). Derfor produserer cellene en aktivitet som virker i en analyse som er spesifikk for faktor Vlll-aktivitet,

og denne aktiviteten nøytraliseres av antistoffer som er spesifikke for faktor VIII.

Inkubering av mediaene i reaksjonsblandingen uten tilsetning av faktoren IXa, faktor X og fosfolipid resulterte ikke i en økning i absorbansen ved 405 nm over blindverdien. Den observerte aktiviteten skyldes derfor ikke tilstedeværelsen av en ikke-spesifikk protease som spalter substratet, og i tillegg nøytralisert av antistoffer som er spesifikke for faktor VIII.

c. Kromatografi av media på monoklonal harpiks

Serumholdige media inneholdende faktor Vlll-aktivitet ble kromatografert på C8 monoklonal antistoff (ATCC No. 40115, deponert 20. april 1984)-kolonnen som beskrevet (supra). De eluerte fraksjonene ble fortynnet 1:100 og analysert for aktivitet. Til 50yUl av den fortynnede toppfraksjon ble det tilsatt forskjellige monoklonale antistoffer kjent for å være nøytraliserende for plasmafaktor Vlll-aktivitet. Resultatene som er vist i tabell 3 demonstrerer at faktor Vlll-aktiviteten eluert fra kolonnen (nå mye mer konsentrert enn mediaene) ble også nøytralisert av disse faktor Vlll-antistoffene

d. Koaguleringsaktivitet for renset faktor VIII

Aktiviteten detektert i cellemediaene ble renset og konsentrert ved føring over en C8-monoklonalharpiks (supra). Toppfraksjonen ble dialysert mot 0,05 M imidazol, pH 6,9, inneholdende 0,15 M NaCl, 0,02 glycinetylester, 0,01 M CaCl2> og 10% glycerol for å fjerne elueringsbufferen. Aktivitettoppfraksjonen ble analysert ved koagulerings-analyse i faktor Vlll-mangelfullt plasma (tabell 4).

En fibrinklump ble observert ved 84 sek. Uten noen tilsetning dannet hemofiliplasma en klump i løpet av 104,0 sek. Derfor korrigerte den eluerte fraksjonen koagulerings-defekten i hemofiliplasma. Normalt humanplasma ble fortynnet og analysert på samme måte. En standard kurve preparert for dette plasma indikerte at den eluerte fraksjonen hadde omtrent 0,01 enheter pr. ml av faktor VIII-koaguleringsaktivitet.

e. Trombinaktivering av renset faktor VIII

Aktivering av koaguleringsaktivitet med trombin er en vel-etablert egenskap til faktor VIII. Den eluerte fraksjonen fra monoklonalkolonnen ble analysert med henblikk på denne egenskap. Etter dialyse av prøven for å fjerne eluerings-bufferet (supra), ble lOO^ul av eluatet fortynnet med lOOyUl 0,05 M imidazol, pH 7,6, inneholdende 0,15 M NaCl, 0,0 2 M glycinetylester, 0,01 M CaCl2 og 10% glycerol. Denne fortynning ble foretatt for ytterligere å fortynne eventuell gjenværende elueringsbuffer (som ville kunne forstyrre trombinfunksjoneringe<n>) samt for å øke pH-verdien til reaksjonsblandingen. Trombin (25 ng) ble tilsatt til oppløsningen, og reaksjonen ble foretatt ved romtemperatur. Aliquoter på 25^ul ble fjernet ved forskjellige tids-punkter, fortynnet 1:3, og analysert med henblikk på koaguleringsaktivitet. Resultatene er vist på fig. 17. Faktor Vlll-aktiviteten øket med tiden og avtok senere,

som forventet for en faktor Vlll-aktivitet. Mengden av tilsatt trombin levret ikke faktor Vlll-mangelfullt plasma i

løpet av tider observert for disse analyser, og den observerte, tidsavhengige økning og etterfølgende minsking av observert koaguleringstid, viste at aktiviteten som ble overvåket, i virkeligheten skyldtes trombinaktivering av faktor VIII. Den observerte, omtrentlige 20-gangers aktiveringen med trombin er i overensstemmelse med den som ble observert for plasma faktor VIII.

f. Binding av rekombinant faktor VIII til immobilisert von Willebrand sefarose

Faktor VIII er kjent for å sirkulere i plasma i et reversibelt kompleks med von Willebrand faktor (vWF) (10-20) . En nyttig form av rekombinant faktor VIII skulle derfor også være i besittelse av denne evne for dannelse av en slik kompleks for å bekrefte identiteten som faktor VIII. I tillegg ville evnen til å danne et slikt kompleks bevise evnen til en rekombinant faktor VIII til å danne den naturlige, sirkulerende form for denne aktivitet som faktor VIII/vWF-komplekset ved infusjon inn i pasienter med hemofili. For å teste evnen til rekombinant faktor VIII til å reagere med vWF, ble vWF

renset og immobilisert på en harpiks som følger:

Human von Willebrand-faktor ble fremstilt ved kromatografi

av human faktor Vlll-konsentrater (innkjøpt fra f.eks.

Cutter Laboratories) på en sefarose CL4B-harpiks ekvilibrert med 0,05 M Tris, pH 7,3, inneholdende 0,15 M NaCl. von Willebrand-faktoren eluerer ved kolonnens tomvolum. Dette området ble oppsamlet, konsentrert ved utfelling med ammoniumsulfat ved 40% metning og rekromatografert på

kolonnen i nærvær av den ovenfor angitte buffer inneholdende 0,25 M CaCl2 for å separere faktor Vlll-koagulerings-aktiviteten fra von Willebrand-faktoren. Tomvolumfraksjonene ble igjen oppsamlet, konsentrert under anvendelse av ammonium-sulf at og dialysert mot 0,1 M natriumbikarbonat. Det resulterende preparat ble kovalent festet til cyanogenbromid-

sefarose (innkjøpt fra Pharmacia) som anbefalt av produsenten. Kolonnen ble vasket 0,02 M Tris, pH 7,3, inneholdende 0,05 M NaCl og 0,25 M CaCl2 for å fjerne ubundede proteiner. Rekombinantfaktor VIII ble fremstilt i serumfrie media og anbragt på én 1,0 ml kolonne av vWF-harpiksen ved romtemperatur.

Kolonnen ble vasket for å fjerne ubundet protein og eluert med 0,02 M Tris, pH 7,3, inneholdende 0,05 M NaCl og 0,25 M CaCl2. Fraksjoner på 1,0 ml ble oppsamlet, forsynnet 1:10 og analysert. Resultatene er vist i tabell 5.

Faktor Vlll-aktiviteten blir absorbert fra mediaene på kolonnen. Aktiviteten kan deretter elueres fra kolonnen under anvendelse av høyt saltinnhold (tabell 5) som forventet for human faktor VIII. Derfor har faktor VIII produsert av BHK-cellene egenskapen med spesifikk reaksjon med von Willebrand-faktorprotein.

10. Analyse av fusjonsproteiner

Formålet med dette sett av forsøk var å bevise immunolo-

gisk identitet for proteinet innkodet av klonen med poly-peptider i plasma. Dette ble oppnådd ved å uttrykke deler av genet som fusjonsproteiner i E. coli. Alle eller en del av kodingssekvensene i det klonede gen kan uttrykkes i former som er konstruert for å tilveiebringe materiale egnet for oppnåelse av antistoffer. Disse antistoffene,

som er spesifikke for ønskede områder i det klonede protein, kan være nyttige i analyse og rensing av proteiner. En rekke E. coli/faktor VIII-"fusjonsproteiner" ble fremstilt for dette formål. Fragmenter av faktor Vlll-kloner ble ligert inn i Bglll-setet i plasmid pNCV (70) på en slik måte at faktor Vlll-kodingssekvensene ble sammenføyet, i riktig leseramme, med de første 12 aminosyrene i det sammensmeltede E. coli trp LE proteinet (48, 70, 71). Vesentlige mengder rekombinant proteinprodukt produseres vanligvis fra dette sterke trp-promotorsystemet.

pfusl ble konstruert ved isolering av et 189 bp StuI/HincII-fragment i faktor VIII (koder for aminosyrer 1799-1860) og ligering av dette inn i Smal-setet i pUC13 (49K). Dette intermediære plasmid ble nedbrutt med BamHI og EcoRI og 200 bp-fragmentet innført i pNCV (70) hvorfra 526 bp Bglll til EcoRI-fragmentet hadde blitt fjernet. Dette plasmidet, pfusl, produserer under kontroll av trp-promotor et 10 kD-fusjonsprotein bestående av 16 trpLE og linker-kodede aminosyrer, fulgt av 61 rester av faktor VIII og en sluttlig kodet 9-linker og trpE karboksy-terminalrester.

pfus3 ble konstruert ved fjerning av et 290 bp Avall-fragment i faktor VIII (aminosyrer 1000-1096), ifylling av de overhengende nukleotidene under anvendelse av Klenow-fragment i DNA-polymerase, og ligering av dette nå butt-endede DNA-fragmentet inn i pNCV som hadde blitt kuttet med Bglll og likeledes ifylt. Dette plasmidet, med det ifylte fragmentet i riktig orientering (som bestemt ved restriksjons-

nedbrytninger og DNA-sekvensanalyse), dirigerer syntesen av et omtrent 40 kD fusjonsprotein inneholdende 9 7 aminosyrer i faktor VIII innleiret i 192 aminosyre trpLE-proteinet.

pfus4 ble fremstilt ved kutting av en faktor Vlll-subklon, A222.8 med BanI, tilbakenedbrytning av overhenget med nuklease S^, fulgt av Pstl-nedbrytning og isolering av det resulterende 525 bp butte/Pstl-fragmentet (aminosyrer 710-885). Dette ble ligert inn i pNCV, som hadde blitt nedbrutt med Bglll, behandlet med S^, nedbrutt med Pstl, og vektorfragmentet ble isolert. pfus4 dirigerer syntesen av et 22 kD-fusjonsprotein inneholdende 175 aminosyrer i faktor VIII etter de innledende 12 aminosyrene i trpLE.

Fusjonsproteinene ble renset og injisert i kaniner for å utvikle antistoffer som beskrevet ovenfor. Disse antistoffene ble testet for binding til plasmaavledet faktor VIII ved Western-blot-analyse.

Resultatene fra en slik Western-overføring er vist på fig. 13. Hvert av fusjonsproteinene reagerer med plasmafaktor VIII. Fusjon 1 ble utviklet fra området i genet som koder et

80.000 dalton polypeptid. Det fremgår at fusjon 1-antisera bare reagerer med 80.000 dalton-båndet, og reagerer ikke med proteiner av høyere molekylvekt. Fusjon 3- og 4-antisera viser kryssreaktivitet med proteinene større enn 80.000 dalton og reagerer ikke med 80.000 dalton-båndet. Det monoklonale antistoff C8 er en aktivitetsnøytraliserende monoklonal rettet mot faktor VIII og er kjent for å reagere med 210.000 dalton-proteinet. Fig. 14 viser at fusjon 4-protein vil reagere med dette monoklonale antistoffet og dermed demonstrere at aminosyresekvensen som gjenkjennes av C8, er kodet av fusjon 4-polypeptidet. Dette understøtter videre identiteten til fusjon 4-protein inneholdende proteinsekvenser som koder 210.000 dalton proteinet. De ovenfor omtalte studier beviser på avgjørende måte at genet koder aminosyresekvensen for både 210.000 dalton-proteinet og

80.000 dalton-proteinet.

11. Farmasøytiske preparater

Forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres ifølge kjente metoder for fremstilling av farmasøytisk nyttige preparater, hvorved human faktor Vin-produktet heri kombineres i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Egnede bærere og deres formulering, inkl. andre humanproteiner, f.eks. human serumalbumin, er beskrevet f.eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences av E. W. Martin, som det herved vises til. Slike preparater vil inneholde en effektiv mengde av det aktuelle protein sammen med en egnet mengde bærer for å fremstille farma-søytisk akseptable preparater som er egnet for effektiv administrasjon til en vert. F.eks. kan den aktuelle humanfaktor VIII administreres parenteralt til individer som lider av f.eks. hemofili A.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av human faktor VIII, karakterisert ved at eukaryote vertsceller transformeres med ekspresjonsvektoren pAML3P. 8 cl, (fig. 12 III), cellene dyrkes og faktor VIII isoleres fra cellene.

2 . Vektor pAML3P.8cl, (fig. 12 III) karakterisert ved at den kan uttrykke i en pattedyrvertscelle DNA kodende for full-lengde humanfaktor VIII, og den inneholder en adenovirus tripartitt-leder spleiset i dennes tredje exon til den 5' utranslaterte regionen til humanfaktor VIII, etterfulgt av et strukturelt gen kodende for full-lengde humanfaktor VIII inkludert dets signalsekvens, den 3' utranslaterte regionen som er spleiset ved et Hpal sete til den 3' utranslaterte regionen til hepatitt B overflateantigenet, etterfulgt av et gen kodende for DHFR som har en SV40 tidlig promoter og en hepatitt 3' utranslatert region som utviser et funksjonelt polyadenyleringssignal.

3. Vektor pESVDA, karakterisert ved at den kan tilveiebringe det korresponderende RNA-segmentet av et innskutt faktor VIII DNA-fragment fri for intron ved transkripsjon i en transfektert eukaryot cellekultur, og den inneholder 342 bp PvuII-Hindlll-fragmentet til SV4 0 virus, som dekker SV40 replikasjonsorigo omgitt av EcoRI seter, og den inneholder polyadenyleringssetet til hepatitt B virus overflateantigen, innbefattet på et 580-bp BamHI-Bglll-fragment, der det mellom EcoRI-setet etter SV40 til promoteren og BamHI-setet til hepatitt B virusoverflateantigenet er skutt inn PvuII-Hindlll-fragmentet, inneholdende donorspleisesetet til den første sene lederen, øyeblikkelig etterfulgt av 840-bp Hindlll-SacI-fragmentet til Adenovirus 2, inneholdende Elb akseptorspleisesetet, og hvor det mellom donor og akseptorsetene ligger unike Bglll og Hindlll-seter for innskudd av genomiske (f.eks. faktor VIII) DNA-fragmenter, som vist i figur 6. L itteraturfortengelse 1. Hemostasis and Thrombosis, Bloom and Thomas, Eds., Churchill, Livingstone, NY (1981). 2. Davie, et al., Ann. Rev. Biochem. 44, 799 (1975). 3. Jackson, et al., Ann. Rev. Biochem. 49, 767 (1980). 4. Wight, J. Am. Med. Assoc. 170, 325 (1959). 5. Schmer, et al., J. Biol. Chem. 247, 2512 (1972). 6. Legaz, et al., J. Biol. Chem. 247, 3946 (1973). 7. J. Shapiro, et al., J. Clin. Invest, 52, 2198 (1973). 8. Nilsson, et al., Acta. Med Scanl. 159, 179 (1957). 9. McKee, Ann. NY Acad. Sei. 240, 8 (1975). 10. Thelin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 95, 70 (1961). 11. Griggs, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 70, 2814 (1973). 12. Donati, et al., Thromb. Res. 2, 97 (1973). 13. Weiss, et al., Br. J. Haematol 18, 89 (1970). 14. Weiss, et al., Thromb. Diath. Haemorrh 27, 212 (1972). 15. Weiss, et al., Science 182, 1149 (1973).. 16. Rick, et al., Blood 42, 737 (1973). 17. Rick, et al., Thromb. Res. 7, 909 (1975). 18. Thelin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 95, 70 (1961). 19. Owen, et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 27, 502 (1972). 20. Cooper, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 70, 2326 (1973) 21. Vehar, et al., Biochemistry 19, 401 (1980). 22. Fulcher, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 79, 1648 (1982). 23. Fulcher, et al., Blood 61, 807 (1983). 24. Fulcher, et al., Blood 63, 486 (1984). 25. Fass, et al., Blood, 594 (1982). 26. Knutson, et al., Blood 59, 615 (1982). 27. Fay, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 79, 7200 (1982). 28. Gordon, et al., Thrombosis Res. 6, 127 (1975). 29. Sacharski, et al., Mayo Clinic Proe. 44, 784 (1969). 30. Green et al., Blood 37, 47 (1971). 31. Schwinn, et al., US patent 4067964. 31a. Zimmerman, et al., Haemostasis and Thrombosis, Bloom and Thomas, Eds., Churchill, Livingstone, NY, p.lll (1981). 32. Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977). 33. Chang, et al., Nature 275, 615 (1978). 34. Itakura, et al., Science 198, 1056 (1977). 35. Goeddel, et al., Nature 281, 544 (1979). 36. Goeddel, et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980). 37. Europeisk patentsøknad nr. 0036776. 38. Siebenlist, et al., Cell 20, 269 (1980). 39. Stinchcomb, et al., Nature 282, 39 (1979). 40. Kingsman, et al., Gene 7, 141 (1379). 41. Tschemper, et al., Gene 10, 157 (1980). 42. Jones, Genetics 85, 12 (1977) . 43. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980). 44. Hess, et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968). 45. Holland, et al., Biochemistry 17, 4900 (1978). 46. Graham, et al., Virology 52, 546 (1978). 47. Cohen, et al., PNAS (USA) 69, 2110 (1972). 47a. Crea, et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980). 47b. Beaucage, et al., Tetrahedrcn Lett. 22, 1859 (1981)

48. Maniatis, et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). 48a. Lawn, et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

49. Karn, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 5172 (1980). 49a. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975). 49b. Goldberg, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 5794 (1980). 49c. Taylor, et al., Biochem. biophys. Acta 442, 324 (1976). 49f. Ullrich, et al., Science 196, 1313 (1977). 49g. Berger, et al., Biochemistry 18, 5143 (1979). 49h. Aviv, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972). 49i. Sanger, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1977) . 49j. Gingeras, et al., J. Biol. Chem. 257 13475 (1982). 49k. Norrander, et al., Gene 26, 101 (1983). 491. Picken, et al., Inf. and Immun. 42, 269 (1983). 49m. Beck, et al., Gene 19, 327 (1982). 49n. Simonson, et al., Mol. Cell Biol. 3, 2250 (1983). 49o. Southern, et al., J. Mol. and Applied Gen. 1, 327 (1982) . 49p. Graham, et al., Virology 52, 456 (1978). 49q. Wingler, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 3567 (1980) . 49r. Simonsen, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 2495 (1983) . 49s. Rotblat, et al., Thromb. Res. 21, 431 (1981). 49t. Rotblat, et al., J. Lab. Clin. Med. 101, 736 (1983). 49u. Kearney, et al., J. Immun. 123, 1548 (1979). 49v. Kohler, et al., Nature 256, 495 (1975). 49w. Benton, et al., Virol. 117, 490 (1982). 49x. Chalon, et al., J. Immun. 9, 259 (1979). 49y. U.S.S.N. 459152, 19. januar 1983.

50. Ish-Horowitz, et al., Nucl. Acids Res. 9, 2989 (1981) .

51. Stel, et al., Nature 303, 530 (1983).

52. Kelly, et al., Brit. J. Haem. (1984).

53. Exmer, et al., Thrombosis Res. 32, 427 (1983).

54. Jaffe, et al., J. Clin. Invest. 53, 36a (1974).

55. Fay, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 7200 (1982) .

56. Zimmerman, et al., Haemostasis and Thrombosis Bloom, A.L. and Duncan, P.T. (Churchill Livinstone, New York) pp 111-123 (1981). 56a. Meili, et al., Thromb. Diathes. Haemorrh. 24, 161 (1970).

57. Grantham, et al., Nuclei Arts Res. 8, r49 (1980).

58. Kurachi, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 6461 (1982).

59. Viera, et al., Gene 19, 259 (1982).

60. Breathnach, et al., Ann. Rev. Biochem 50, 349 (1981).

61. Sharp, Cell 23, 643 (1981).

62. Fritsch, et al., Cell 19, 959 (1980).

63. Collins, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 4242 (1978) .

66. Kafatos, et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).

67. Capon, et al., Nature 304, 507 (1983). 67a. Capon, et al., Nature 301, 33 (1983).

68. Huynh, et al., Practical Approaches in Biochemistry (IRL Press Ltd., Oxford, England) (1984).

69. Perlman, et al., J. Mol. Biol. 167, 391 (1983).

70. Kleid, et al., Science 214, 1125 (1981).

71. Goeddel, et al., Nature 287, 411 (1980).

73. Crowley, et al., Mol. CellBiol. 3, 44 (1983).

74. Liu, et al., DNA 1, 213 (1982).

75. Lusky, et al., Nature 293, 79 (1981).

76. Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).

77. Gluzman Cell 23, 175 (1981).

78. Grunstein, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72, 3961 (1975).

79. Tuddenham, et al., Symposium on Factors VIII/ von Willebrand Factor, October'7-9, 1982, p.l.

80. Morrissey, Anal. Bioclem 117, 307 (1981).

81. Laemmli, Nature 227, 680 (1970).

82. Greenwood, et al., Biochem. J 89, 114 (1963).

83. Maniatis, et al., Cell 15, 687 "(1963).

84. Sompayrac. et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 78, 7575 (1981).

86. Messing, et al., Nucl. Acids. Res. 9, 304 (1981).

87. Wood, et al., J. Biol. Chem. 256, 1502 (1981).

88. Shen, et al., Cell 19, 379 (1981).

89. Proudfoot, et al., Nature 252, 359 (1976).