HRP941020A2 - Thrombopoietin - Google Patents

Description

Ovaj se izum odnosi na izolaciju, pročišćavanje i rekombinantnu ili kemijsku sintezu proteina koji utječe na preživljenje, proliferaciju, diferencijaciju ili sazrijevanje hematopoetičnih stanica, naročito trombocitnih matičnih stanica. Ovaj se izum specifično odnosi na kloniranje i ekspresiju nukleinskih kiselina koje kodiraju proteinski ligand, koji se veže na, i aktivira mpl, član obitelji receptora za citokine. Ovaj se izum dalje odnosi na uporabu ovog proteina samog, ili u kombinaciji s drugim citokinima za terapiju imunih ili drugih bolesti hematopoetičnog sustava, uključujući trombocitopeniju.

DO SADA POZNATE SPOZNAJE

I. Hematopoetički sustav

Hematopoetički sustav stvara zrele visoko specijalizirane krvne stanice za koje je poznato da su neophodne za preživljavanje svih sisavaca. Ove zrele stanice uključuju: eritrocite, koji su specijalizirani za prijenos kisika i ugljik-dioksida, T- i B- limfocite, koji su odgovorni za staničnu i humoralnu imunost, trombocite, koji su specijalizirani za stvaranje ugruška, i granulocite i makrofage, koji su specijalizirani kao odstranjivači mrtvih stanica i kao pomoćne stanice za suzbijanje infekcije. Granulociti su dalje podijeljeni u; neutrofile, eozinofile, bazofile i mast stanice, specijalizirane stanične vrste koje imaju posebne funkcije. Značajno je primijetiti da se sve ove specijalizirane, zrele krvne stanice razvijaju iz jedne zajedničke primitivne stanične vrste koju se smatra pluripotentnom (ili totipotentnom) stem stanicom, koja se može naći prvenstveno u koštanoj srži (Dexter et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3:423-441 [1987]).

Zrele, visoko specijalizirane krvne stanice moraju se stvarati u velikom broju, kontinuirano, tijekom cijeloga životnog ciklusa u sisavaca. Velika većina ovih specijaliziranih krvnih stanica su predodređene da ostanu funkcionalno aktivne samo nekoliko sati ili tjedana (Cronkite ef al., Blood Cells, 2:263-284[1974]). Zbog toga je za održavanje normalnog homeostatskog stanja krvnih stanica u sisavaca neophodna kontinuirana obnova zrelih krvnih stanica, primitivnih stem stanica, ili bilo kojih među-staničnih faza, ili matičnih stanica pojedinih staničnih loza koje se javljaju između primitivne i zrele stanice.

U središtu hematopoetskog sustava leži pluripotentna stem stanica(e). Broj ovih stanica je relativno ograničen i one podliježu samoobnavljanju putem proliferacije, kada se stvara kćerinja generacija stem stanica ili kada se transformacijom u nizu diferencijacijskih stupnjeva stvaraju sve zrelije stanice iz kojih mogu nastati sada već određene-jedinstvene stanične linije koje, na kraju dovode do stvaranja visoko specijalizirane zrele krvne stanice(a).

Na primjer, određene multipotentne matične stanice, nazvane CFC-Mix koje nastaju iz stem stanica podliježu proliferaciji (vlastitom obnavljanju) i razvoju koji vodi stvaranju kolonija koje sadržavaju sve različite mijeloične stanice: eritrocite, neutrofile, megakarioeite (predhodnike trombocita), makrofage, bazofile, eozinofile i mast stanice. Druge matične stanice limfoidne loze podliježu proliferaciji i razvoju u T-stanice i B-stanice.

Dodatno, između CFC-Mix matične stanice i mijeloidne stanice leži drugi nivo matičnih stanica koje direktno prethode odgovarajućoj zreloj stanici. Ove su matične stanice klasificirane prema konačnim stanicama do čijeg stvaranja one direktno vode. Poznati direktni prethodnici mijeloičnih stanica su: kolonija koja stvara eritroidnu cjelinu (CFU-E) za eritrocite, kolonija koja stvara granulocitno/makrofagne stanice(GM-CFC) za neutrofile i makrofage, kolonija koja stvara megakariocitne stanice (Meg-CFC) za megakarioeite, kolonija koja stvara eozinofilne stanice (Eos-CFC) za eozinofile i kolonija koja stvara bazofilne stanice (Bas-CFC) za mast stanice. Drugi, direktni prethodnici staničnih linija koji se nalaze između pluripotentne stem stanice i zrele krvne stanice su poznati (vidi dalje) ili će najvjerojatnije biti otkriveni na temelju posjedovanja samo ograničene mogućnosti stvaranja različitih staničnih linija i na temelju različitog samo-obnavljajućeg potencijala.

Temeljni princip normalnog hematopoetskog sustava može se formulirati na slijedeći način: smanjivanje kapaciteta za samo-obnavljanje javlja se usporedo s gubitkom multipotencijalnosti i s usmjeravanjem ka stvaranju samo određene stanične loze i postizanjem zrelosti. Tako se, na jednom kraju spektra hematopoetskih stanica nalazi multipotentna stem stanica koja ima kapacitet samo-obnavljanja i diferenciranja u sve vrste matičnih stanica za pojedine stanične loze. Ovaj kapacitet je temelj terapije transplantacijom koštane srži gdje primitivne stem stanice obnavljaju kompletni hematopoetski stanični sustav. Na drugom kraju spektra se nalaze matične stanice za pojedine stanične loze i njihovi krajnji produkti koji su izgubili sposobnost samo-obnavljanja i dobili aktivnost zrele stanice.

Proliferacija i razvoj stem stanica, kao i matičnih stanica pojedinih staničnih loza pažljivo je kontrolirana različitim faktorima rasta hematopoetičkog sustava ili citokinima. Uloga ovih faktora rasta in vivo je kompleksna i nije u potpunosti razjašnjena. Neki faktori rasta, kao što je interleukin-3 (IL-3), sposobni su stimulirati i multipotentnu stem stanicu, kao i matičnu stanicu za pojedinu staničnu lozu, uključujući npr. megakariocite.

Za druge faktore kao što je faktor stimuliranja granulocitno/megakariocitnih kolonija (GM-CSF) se mislilo da mu je djelovanje ograničeno na GM-CFC stanice. Kasnije je utvrđeno da GM-CSF također utječe na proliferaciju i razvoj drugih stanica, osim megakariocita. Tako je utvrđeno da IL-3 i GM-CSF imaju međusobno preklapajuće aktivnosti, iako su jm potencijali različiti. U skorije vrijeme je utvrđeno da interleukin-6 (IL-6) i interleukin-11 (IL-11) nemaju nikakav direktan ujecaj na stvaranje meg-kolonija, ali da u sinergističkom učinku s IL-3 stimuliraju sazrijevanje megakariocita (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Iz toga proizlazi da hematopoetski faktori rasta mogu utjecati na rast i diferencijaciju jedne ili više loza, da se mogu preklapati s drugim faktorima rasta u djelovanju na pojedinačnu matičnu staničnu liniju, ili da mogu djelovati sinergistički s drugim faktorima.

Čini se također, da hematopoetički faktori rasta mogu iskazivati svoje učinke na različitim stupnjevima razvoja stanice iz totipotentne stem stanice kroz različite stadije pojedinačnih matičnih stanica za određene stanične loze, sve do zrelih krvnih stanica. Na primjer, čini se da, eritropoetin (epo) stimulira proliferaciju samo zrele eritroidne matične stanice. Čini se da IL-3 iskazuje svoj učinak ranije, utječući na primitivnu stem stanicu i na intermedijarne matične stanice za određene stanične loze. Drugi faktori rasta, kao što je faktor rasta stem stanica (SCF), mogu utjecati na razvoj još primitivnijih staničnih oblika.

Iz prethodno navedenog treba naglasiti da novi hematopoetski faktori rasta koji utječu na preživljenje, proliferaciju, diferencijaciju i sazrijevanje bilo kojih krvnih stanica ili njihovih prethodnika mogu biti korisni, naročito kod pomaganja ponovnog uspostavljanja prethodno smanjene aktivnosti hematopoetskog sustava, uzrokovanog bolestima, ili nakon radijacijske ili kemoterapije.

II. Megakariocitopoeza - produkcija trombocita

Regulacija megakariocitopoeze i stvaranja trombocita prikazana je u preglednim člancima: Mazur, Exp. Hematol., 15:248[1987] i Hoffman, Blood, 74:1196-1212 [1989]. Ukratko, pluripotentne stem stanice iz koštane srži se diferenciraju u megakariocitnu, eritrocitnu i mijeloičnu staničnu lozu. Vjeruje se da postoji hijerarhija stanično predodređenih matičnih megakariocitnih stanica između stem stanice i samog megakariocita. Identificirane su barem tri klase megakariocitnih progenitor stanica, to su; unija megakariocita koji se rasprskavaju (BFU-MK), unija megakariocita koji stvaraju kolonije (CFU-MK), megakariocitne progenitor stanice male gustoće (LD-CFU-MK). Sazrijevanje megakariocita je kontinuirani proces razvoja koji se dijeli u faze na temelju standardnih morfoloških kriterija. Najraniji pripadnik megakariocitne obitelji koji se može raspoznati (MK ili meg) je megakarioblast. Ove stanice imaju u početku dijametar od 20 do 30 μm, bazofilnu citoplazmu i blago nepravilnu jezgru s rahlim, retikularnim kromatinom, te nekoliko nukleola. Megakarioblast može kasnije sadržavati čak do 32 jezgre (poliploidija), ali citoplazma ostaje rijetka i nezrela. Kako sazrijevanje napreduje, jezgra postaje sve više globularna i piknotička, povećava se količina citoplazme koja postaje acidofilna i granulirana. Potpuno zrele stanice iz ove obitelji mogu izgledati kao da otpuštaju trombocite u svojoj periferiji. Normalno se manje od 10% megakariocita nalazi u blast stadiju, a više od 50% ih je zrelih. Arbitralne morfološke klasifikacije za megakariocitnu seriju postavljaju megakarioblast kao najraniju formu; promegakariocit ili bazofilni megakariocit kao intermedijarnu formu; i zreli (acidofilna, granulirana stanica koja stvara trombocite) megakariocit kasne forme. Zreli megakariocit izbacuje filamente citoplazme u sinusoidalne prostore gdje se oni odvajaju i fragmentiraju u pojedinačne trombocite (Williams et al., Hematology, 1972).

Vjeruje se da megakariocitopoeza uključuje nekoliko regulatornih faktora (Williams et al., Br. J. Haematol., 52: 173 [1982] i Williams et al., J. Celi Physiol., 110:101 [1982]). Postulirano je da je rani stadij megakariocitopoeze mitotički i da se odnosi na proliferaciju stanica i inicijaciju stvaranja kolonija iz CFU-MK i da nije ovisan o broju trombocita (Burstein et al., J. Celi Physiol., 109:333[1981] i Kimura et al., Exp. Hematol., 13:1048[1985]. Kasniji stadij sazrijevanja je ne-mitotički, uključuje poliploidizaciju jezgara i sazrijevanje citoplazme, te je najvjerojatnije reguliran mehanizmom povratne sprege putem broja trombocita u periferiji (Odell et al., Blood 48:765[1976] i Ebbe et al., Blood, 32:787[1968]).

Postojanje različitih i specifičnih faktora koji stimuliraju rast megakariocitnih kolonija (MK-CSF) opovrgao je (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350[1987]). Ipak, može se reći da većina autora tvrdi da proces koji je toliko značajan za preživljenje kao što je stvaranje trombocita mora biti reguliran citokinima koji su isključivo odgovorni za taj proces. Hipoteza o postojanju citokina specifičnih za megakariocite/trombocite poslužila je kao inspiracija za više od 30 godina ispitivanja - ali do danas nije pročišćen, sekvenciran i ustanovljen način određivanja takvog citokina koji bi bio jedinstveni MK-CSF (TPO).

lako je opisano da je MK-CSF djelomično pročišćen iz eksperimentalno izazvane trombocitopenije (Hill et al., Exp. Hematol., 14:752[1986], i iz medija koji sadržava embrione humanih bubrega [CM] (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., 85:59 [1975] i u urinarnim ekskretima ljudi koji boluju od aplastične anemije i idiopatske trombocitopenične purpure (Kawakit et al., Blood, 6:556[1983], te u njihovoj plazmi (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 75:1174[1985], njihova je fiziološka uloga u većini slučajeva još uvijek nerazjašnjena.

Medij koji sadržava mitogen dobiven od jedne američke biljke (pokevveed), koji aktivira stanice slezene (PWM-SpCM) i stanična linija mijelomonocita glodavaca WEHI-3 (WEHI-3CM) bili su upotrijebljeni kao potencijatori megakariocita. PWM-SpCM sadržava faktore koji pojačavaju rast CFU-MK (Metcalf et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood, 65:214 [1985]; i Iscove, N.N., u Hematopoietic Celi Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al., ur. [New York, Acad. Pess] pp 37-52 [1978], a jedan od njih je i interleukin-3 (IL-3), faktor koji stimulira rast različitih kolonija (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11:469 [1986]). Ostali faktori rasta iz ovog medija nisu još ni identificirani niti izolirani. WEHI-3 je stanična linija mijelomonocitnih stanica glodavaca koja luči relativno velike količine IL-3 i nešto manje količine GM-CSF. Za IL-3 je bilo utvrđeno da potencira rast širokog spektra hematopoetskih stanica (Ihle et al., J. Immunol., 13:282 [1983]). Ustanovljeno je također da IL-3 pokazuje sinergističko djelovanje s mnogim poznatim hematopoetskim hormonima ili faktorima rasta (Bartelmez et al., J. Celi Physiol., 122:362-369 [1985] i Warren et al., Celi, 46:667-674 [1988], uključujući oboje, i eritropoetin (EPO) i interleukin-1 (IL-1), u indukciji vrlo ranih multipotencijalnih prekursora i stvaranju velikih miješanih hematopoetskih kolonija.

Drugi izvori stimulatora rasta megakariocita nađeni su u mediju koji sadržava pluća glodavaca, stanične linije makrofaga, stanice peritonealnog eksudata i embrionalne stanice humanih bubrega. Usprkos pojedinim kontradiktornim nalazima (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987], postoje podaci (Geissler et al., Br. J. Hematolol., 60:233-238 [1985] da aktivirani T-limfociti, a ne monociti igraju ulogu pojačala u megakariocitopoezi. Ovi nalazi govore da sekreti aktiviranih T-limfocita, kao što su interleukini, najvjerojatnije mogu biti regulatorni čimbenici u razvoju MK (Geissler et al., Exp. Hematol., 15:845-853 [1987]). Brojne studije o megkariocitopoezi s pročišćenim eritropoetinom EPO (Vainchenker ef al., Blood, 54:940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261:492-4 [1976]; i Williams ef al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]) indiciraju da ovaj hormon ima učinak pojačivača na stvaranje kolonija MK. Ovo je također pokazano i na kulturama koje su rasle u mediju koji je sadržavao serum i u mediju koji nije sadržavao serum, te u odsutnosti pomoćnih stanica (Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). Pretpostavlja se da je EPO više uključen u jednostanični i dvostanični stadij megakariocitopoeze, upravo obratno od utjecaja PWM-SpCM koji je uključen u četverostanični stadij razvoja megakariocita. Interakcije svih ovih čimbenika u ranoj i u kasnoj fazi razvoja megakariocita još uvijek nisu utvrđene.

Podaci dobiveni u različitim laboratorijima govore da jedini faktori koji djeluju na različite stanične linije, a imaju i individualni učinak na stimulaciju rasta MK-kolonija su GM-CSF i IL-3, i u manjoj mjeri, faktor stimulacije B-stanica IL-6 (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9035[1987]). U novije vrijeme, neki su autori utvrdili da IL-11 i faktor koji inhibira leukemiju (LIF) djeluju sinergistički s IL-3 t izazivaju povećanje veličine megakariocita i njegovu ploidiju (Vonemura ef al., British J. Hematol, 84:16-23[1993J.; Burstein et al., J. Celi. Physiol., 153:305-312[1992]; Metcalf et al., Blood, 76:50-56[1990 ]; Metcalf et al., Blood, 77:2150-2153[1991]; Bruno et al., Exp. hematol., 19:378-381 [1991]; i Vonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016[1992]).

Drugi radovi koji su od interesa su: Eppstein et al., U.S. Patent No. 4,962,091; Chong, U.S. Patent No. 4,879,111; Fernandes et al., U.S. Patent No. 4,604,377; Wissler et al., U.S. Patent No. 4,512,971; Gottlieb et al., U.S. Patent No. 4,468,379; Bennett et al., U.S. Patent No. 5,215,895; Kogan et al., U.S. Patenet No. 5,250,732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20(9):1927-1931[1990]; Secor et al., Eur. J. Immunol., 144(4):1484-1489[1990]; Warren et al., J. Immunol., 140(1):94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol, 17(11):1095-1099[1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10):1038-1043[1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17(8):883-888[1989]; Koike et al., Blood, 75(12):2286-2291[1990]; Lotem et al., Blood, 75(5):1545-1551[ 1989]; Rennick et al., Blood, 73(3):1828-1835[1989]; Clutterbuck et al., Blood, 73(6):1504-1512[1989].

III. Trombocitopenia

Trombociti su bitni elementi mehanizma zgrušavanja krvi. Značajno smanjenje broja trombocita u periferiji, zvano trombocitopenija, se javlja u različitim kliničkim stanjima i poremećajima. Trombocitopenija se najčešće definira kao stanje kod kojega broj trombocita padne ispod 150 x 109 u litri. Glavni uzroci trombocitopenije mogu se grubo podijeliti u tri kategorije na temelju vremene života trombocita; (1) poremećeno stvaranje trombocita u koštanoj srži, (2) eliminacija trombocita putem slezene (splenomegalija), ili (3) pojačano razaranje trombocita u perifernoj cirkulaciji (npr., autoimuna trombocitopenija ili kemo- ili radijacijska terapija). Uz gore navedeno, u pacijenata koji brzom aplikacijom dobivaju velike volumene krvnih produkata siromašnih trombocitima može doći do trombocitopenije zbog razrijeđenja.

Klinički manifestna krvarenja uzrokovana trombocitopenijom ovise o težini trombocitopenije, njezinim uzrocima i mogućim pratećim defektima koagulacije. Općenito govoreći, pacijenti koji imaju između 20 i 100 x 109 na litru trombocita, pripadaju rizičnoj skupini koja može razviti post-traumatsko krvarenje, dok oni koji imaju ispod 20 x 109 na litru trombocita mogu razviti spontano krvarenje. Ovi posljednji su kandidati za transfuziju trombocita sa pratećim imunim i viralnim rizikom. Kod bilo kojeg stupnja trombocitopenije, krvarenje će biti ozbiljnije ako je uzrok u smanjenoj produkciji nego ako se radi o pojačanom razaranju tombocita. U ovoj drugoj situaciji, rezultantno pojačano stvaranje trombocita će značiti cirkulaciju mlađih, većih i hemostatski efikasnijih trombocita. Trombocitopenija može biti izazvana rzličitim poremećajima koji su ovdje kratko navedeni. Detaljniji opis može se naći u Schafner, A.I., "Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function," Internal Medicine, 3. izd., J.J. Hutton et al., Eds., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London [1990].

(a) Trombocitopenija uzrokovana poremećenim stvaranjem trombocita

Uzroci kongenitalne trombocitopenije uključuju konstitucijsku aplastičnu anemiju (Fankonijev sindrom) i kongenitalnu amegakariocitnu trombocitopeniju, koje se mogu javljati zajedno sa malformacijama skeleta. Stečeni poremećaji stvaranja trombocita mogu biti uzrokovani bilo hipoplazijom megakariocita ili neučinkovitom trombopoezom. Megakariocitna hipoplazija može biti rezultat različitih stanja, uključujući aplaziju koštane srži (uključujući idiopatske oblike ili mijelosupresiju putem kemoterapijskih sredstava ili radijacijsku terapiju), mijelofibrozu, leukemiju te invaziju koštane srži metastatskim tumorima ili granulomima. U nekim slučajevima, toksini, infektivni agensi ili lijekovi mogu remetiti trombopoezu relativno selektivno; primjeri uključuju prolaznu trombocitopeniju uzrokovanu alkoholom i određenim virusnim infekcijama i blagu trombocitopeniju koja se javlja uz davanje tiazidnih diuretika. Na kraju, neučinkovita trombopoeza, koja se javlja sekundarno uz megaloblastične procese (deficijencija folata ili vitamina B12) može također uzrokovati trombocitopeniju, najčešće uz postojeću anemiju i leukopeniju.

Sadašnji način terapije trombocitopenije koja je uzrokovana smanjenim stvaranjem trombocita ovisi o identifikaciji i ispravljanju početnog uzroka tj. problema koštane srži. Transfuzije trombocita se obično čuvaju za pacijente koji imaju ozbiljne probleme s krvarenjima, ili za pomoć kod kirurških zahvata, budući da izoimunizacija može dovesti do refraktornosti na daljnje transfuzije trombocita. Krvarenja iz sluznica koje su posljedica teških trombocitopenija mogu se olakšati oralnim ili intravenoznim davanjem antifibrinolitičkih sredstava. Ako se antifibrinolitička sredstva primjenjuju kod pacijenata s diseminiranim intravaskularnim koagulacijskim smetnjama (DIC), mogu se razviti trombotičke komplikacije.

(b) Trombocitopenija uzrokovana eliminacijom putem slezene

Splenomegalija, uzrokovana bilo kojim uzrokom, može biti povezana s blagom do umjerenom trombocitopenijom. To je u najvećoj mjeri pasivni proces (hipersplenizam) eliminacije trombocita putem slezene, za razliku od aktivne destrukcije trombocita u slezeni, u slučajevima imunoposredovanih trombocitopenija koje će biti dalje opisane. Mada je najčešći uzrok hipersplenizma kongestivna splenomegalija izazvana portalnom hipertenzijom, zbog alkoholne ciroze, drugi oblici kongestivne, infiltrativne, ili limfoproliferativne splenomegalije su također povezane s trombocitopenijom. Broj trombocita obično ne pada ispod 50 x 109 na litru, kao isključivi rezultat hipersplenizma.

(c) Trombocitopenija uzrokovana neimunološkom razgradnjom trombocita

Trombocitopenija može biti uzrokovana pojačanim razaranjem trombocita putem različitih neimunoloških procesa. Poremećaji ovog tipa uključuju diseminiranu intravaskularnu koagulaciju, umjetna intravaskularna pomagala, ekstrakorporalnu cirkulaciju krvi i trombotičke mikroangiopatije kao što je trombotička purpura. U svim ovim situacijama, cirkulirajući trombociti koji su izloženi, bilo umjetnim površinama, bilo nenormalnoj površini intime krvnih žila, bivaju uništeni ili oštećeni tako da na kraju budu preuranjeno odstranjeni iz cirkulacije djelovanjem retikuloendotelnog sistema. Bolesna stanja ili poremećaji u kojima se može javiti diseminirana intravaskularna koagulacija (DIC) nalaze se opisana u knjizi Braunwald et al. (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 11th Izd., str.1478, McGraw Hill [1987]. Intravaskularna umjetna pomagala, uključujući srčane zaliske i intra-aortalne balone mogu uzrokovati blage ili umjerene destruktivne trombocitopenije i prolazne trombocitopenije u pacijenata kojima se izvodi kardiopulmonarni "bvpass", ili hemodijaliza, te ta stanja mogu izazvati gubitak trombocita u vantjelesnoj cirkulaciji.

(d) Imunološka trombocitopenija uzrokovana lijekovima Smatra se da više od 100 lijekova može sudjelovati u izazivanju imunološki posredovane trombocitopenije. Međutim temeljito su karakterizirani jedino kinidin, kinin, zlato, sulfonamidi, cefalotin i heparin. Trombocitopenija uzrokovana lijekovima često znade biti vrlo ozbiljna i najčešće se pojavljuje naglo nakon nekoliko dana od uzimanja lijekova koji izazivaju reakciju preosjetljivosti.

(e) Imuna (autoimuna) trombocitopenična purpura (ITP) ITP kod odraslih predstavlja kroničnu bolest karakteriziranu autoimunim razaranjem trombocita. Autoantitijela su najčešće IgG, iako su opisani i drugi imunoglobulini. lako su antitijela kod ITP povezana s GPIIbIIIa membrane trombocita, nije točno utvrđena trombocitna antigena specifičnost za većinu slučajeva. Ekstravaskularno razaranje senzitiziranih trombocita odvija se u retikuloendotelnom sustavu u slezeni i u jetri. Premda je utvrđeno da je više od jedne polovine slučajeva ITP idiopatsko, mnogi pacijenti imaju temeljnu reumatsku ili autoimunu bolest (npr. sistemski lupus eritematosus) ili limfoproliferativne poremećaje (npr. kroničnu limfatičnu leukemiju)

(f) ITP uzrokovana HIV virusom

ITP se sve više pojavljuje kao uobičajena komplikacija HIV infekcija (Morris et al., Ann. Intern.Med.,96:714-717[1982]), i može se javiti u bilo kojem stadiju progresije bolesti, i kod pacijenata s dijagnosticiranim stečenim sindromom imunodeficijencije (AIDS), onih s AIDS- pratećim poremećajima, te kod onih koji imaju HIV infekciju, ali bez AIDS simptoma. HIV infekcija je zarazna bolest koja je u svom konačnom obliku karakterizirana teškim manjkom stanične imune funkcije, uz popratnu pojavu oportunističkih infekcija i malignih promjena. Primarni imunološki problem koji nastupa kao rezultat HIV infekcije je progresivni manjak i funkcionalni poremećaj T limfocita koji eksprimiraju CD4 stanični membranski glikoprotein (Lane et al., Ann. Rev. Immunol. 3:477[1985]). Gubitak funkcije T- stanica CD4 pomagača/induktora najvjerojatnije je temelj teških poremećaja u staničnoj i humoralnoj imunosti koje vode do oportunističkih infekcija i do pojave malignih karakteristika AIDS-a (H. Lane supra).

lako mehanizam ITP koja se javlja uz AIDS nije poznat, vjeruje se da je različit od mehanizma razvoja ITP koji se javlja nevezano od AIDS (Walsh et al., N. Eng. J. Med. 311:635-639,[ 1984]; i Ratner, Am. J. Med., 86:194-198 [1989]).

IV. Postojeća terapija trombocitopenije

Terapijski pristup obradi pacijenata koji pate od trombocitopenije ovisi o ozbiljnosti i hitnosti kliničke slike. Terapija je slična i za HlV-povezane i za HlV-nevezane trombocitopenije i premda je broj različitih terapijskih pristupa velik ipak je u suštini on još uvijek kontroverzan.

Broj trombocita u pacijenata s dijagnosticiranom trombocitopenijom može se uspješno povećati terapijom glukokortikoidima (npr. prednisolonom), mada je kod većine pacijenata odgovor nekompletan, te se relaps javlja kada se smanji doza glukokortikoida ili ako je primjena diskontinuirana. Na temelju iskustva s pacijentima koji imaju HlV-povezanu ITP, neki istraživači smatraju da terapija glukokortikoidima može dovesti do predispozicije za AIDS. Glukokortikoidi se najčešće daju onda kada broj trombocita padne ispod 20 x 109 na litru ili kada se pojavi spontano krvarenje.

Kod pacijenata koji su neosjetljivi na glukokortikoide, spoj: 4-(2-klorofenil)-9-metil-2-[3-(4-morfolinil)-3- propanon-1-il]6H-tieno[3,2,f][1,2,4]triazolo[4,3,a][1,4]diazepin (WEB 2086) je uspješno primjenjen u terapiji ozbiljnih slučajeva HIV-nevezanih ITP. Pacijent kojemu je broj trombocita iznosio 37000-58000/μl bio je tretiran preparatom WEB 2086, te je nakon 1-2 sedmice terapije broj trombocita bio povećan na 140000-190000/μl. (EP 361,077 i Lohman et al., Lancet, 1147 [ 1988]).

lako je optimalna terapija za stečenu amegakariocitnu trombocitopeničnu purpuru (AATP) nesigurna, pokazano je da antitimocitni globulin (ATG), konjski antiserum na humano timusno tkivo izaziva produženu kompletnu remisiju (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37:126-127 [1991]). Sadašnji rezultati pokazuju da se hematopoetski učinci ATG trebaju pripisati timerosalu, gdje se najvjerojatnije radi o proteinu koji djeluje kao prijenosnik žive (Panella et al., Cancer Research, 50:4429-4435 [1990]).

Dobri rezultati dobiveni su i kod splenektomije. Splenektomija uklanja glavno mjesto razaranja trombocita i glavno mjesto stvaranja antitijela u većine pacijenata. Ovaj postupak dovodi do produžene remisije bez dodatne terapije kod velikog broja pacijenata. Međutim, smatra se da treba izbjegavati kirurške zahvate kod pacijenata kod kojih je imunološki sustav poremećen, te se splenektomija preporučuje samo u slučajevima teške trombocitopenije (npr. teške HIV-povezane ITP), te u pacijenata koji ne reagiraju na terapiju od 2-3 tjedna glukokortikoidima, ili ne postižu trajni odgovor nakon prekida primjene glukokortikoida. Na temelju sadašnjeg znanstvenog iskustva, nije posve jasno da li splenektomija izaziva razvijanje predispozicije za AIDS.

Uz to je utvrđeno da terapija prednisolonom i splenektomija, određeni citotoksični spojevi, npr., vinkristin i azidotimidin (AZT, zidovudin) pokazuju obećavajuće rezultate u terapiji HlV-uzrokovane ITP; međutim ti su rezultati još uvijek preliminarni.

Iz gore navedenog uzet ćemo u obzir da se jedan od načina tretmana trombocitopenije sastoji u dobivanju supstance koja će biti sposobna da ubrza diferencijaciju i sazrijevanje megakariocita ili njegovih prekursora u oblik koji stvara trombocite. Značajni su napori bili usmjereni ka identifikaciji takve supstance, koja se najčešće naziva "trombopoetinom" (TPO). Druga imena za TPO koja se mogu naći u literaturi uključuju: faktor koji stimulira trombocitopoezu (TSF), faktor koji stimulira megakariocitne kolonije (MK-CSF), faktor koji stimulira . megakariocite, potencijator megakariocita. Aktivnost TPO je opisana još 1959 (Rak et al., Med. Exp., 1:125), a pokušaji da se karakterizira i pročisti ova supstanca se nastavljaju do današnjih dana. Postoje podaci o djelomičnom pročišćavanju TPO-polipeptida (vidi npr. Tavrien et al., J. Biol. Chem., 262:3262 [1987] i Hoffman et al., J. Clin.lnvest., 75:1174 [1985]), dok su drugi autori utvrdili da TPO nije određena molekula sam po sebi već da se jednostavno radi o polifunkcionalnoj manifestaciji određenog poznatog hormona (IL-3, Sparrow et al., Prog. Clin. Biol. Res.,215:123[1986]). Bez obzira na svoje porijeklo, molekula koja bude imala trombopoetske aktivnosti će imati značajnu terapijsku vrijednost, lako niti jedan protein nije do sada nedvosmisleno bio identificiran kao TPO, mnogo je interesa pobudilo nedavno otkriće da mpl, mogući receptor citokina, može prenijeti trombocitopetski signal.

V. Mpl je megakariocitopoetski receptor citokina

Vjeruje se da je proliferacija i sazrijevanje hematopoetskih stanica čvrsto regulirano čimbenicima koji pozitivno ili negativno moduliraju proliferaciju pluripotentne stem stanice i njezinu , diferencijaciju u različite stanične loze. Ovi se učinci prenose putem visoko afinitetnog vezanja vanstaničnog proteina na specifične stanične receptore. Ovi receptori na površini stanice pokazuju značajnu homologiju i općenito su svrstani u superobitelj receptora citokina. Članovi obitelji uključuju receptore za : IL-2 (β i γ lanci)(Hatakeyama et al., Science, 244:551-556[1989]); Takeshita et al., Science, 257:379-382[1991] ), IL-3 (Itoh et al.,Sc/ence,247:324-328[1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5459-5463[1990]; Kitamura et al. Celi, 66:1165-1174[1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5082-5086[1991b]), IL-4 (Mosley ef al., Celi, 59:335-348[1990]), IL-5 (Takaki et al., EMBO J., 9:4367-4374[ 1990]; Tavernier et al., Celi, 66:1175-1184[1991]), IL-6 (Vamasaki et al., Science, 241:825-828[1988]; Hibi et al., Celi, 63:1149-1157[1990]), IL-7 (Goodwin et al., Celi, 60:941-951 [1990 ]), 1 L-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5690-5694[1992]), faktor koji stimulira granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF) (Gearing et al., EMBO J., 8:3667-3676[1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244:96559659[ 1990]), faktor koji stimulira granulocitne kolonije (GM-CSF) (Fukunaga et al., Celi, 61:341-350[1990a]; Fukunaga ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8702-8706[1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172:1559-1570[1990]), EPO (D1 Andrea et al., Celi, 57:27-285[1989]; Jones et al., Blood, 76:31-35[1990]), faktor koji inhibira leukemiju (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10:2839-2848[1991]), onkostatin M (OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8641-8645[1991]) i također receptori prolaktina (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7744-7748[1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-2116[1989]), hormon rasta HR (Leung et al., Nature, 330:537-543[1987]), te cilijarni neutrofilni faktor (CNTF) (Davis et al., Science, 253:59-63[1991].

Članovi obitelji receptora citokina mogu se grupirati u tri funkcionalne kategorije (vidi revijalni rad Nicola et al., Celi, 67:1-4[1991]). Prva kategorija uključuje jednolančane receptore, kao što je receptor za eritropoetin (EPO-R) ili receptor za faktor koji stimulira granulocitne kolonije (G-CSF-R), koji visokoafinitetno veže svoj ligand puteim vanstanične domene i također stvara intracelularni signal. Druga kategorija receptora, takozvane α-podjedinice, uključuje receptor za interleukin-6 (IL6-R), receptor za faktor koji stimulira granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF-R), receptor za interleukin-3 (IL3-Raα) i druge članove superobitelji receptora za citokine. Ove a-podjedinice niskoafinitetno vežu ligand, ali ne mogu prenositi signal. Visokoafinitetni receptor koji je sposoban za prijenos signala stvara se od heterodimera između jedne α-podjedinice i člana treće kategorije raceptora za citokine, nazvanog β-podjedinica, npr., βC, uobičajena β-podjedinica za tri α-podjedinice IL3-Raα i GM-CSF-R.

Podaci koji govore da je mpl član superobitelji receptora za citokine dolazi od homologie u sekvenci (Gearing, EMBO J., 8:3667-3676[1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6834-6938[1990]; Davis et al. , Science, 2531:59-63[1991]; Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644[1992]) i njegova sposobnost da prenosi proliferativne signale.

Uspoređivanjem sekvencije aminokiselina u proteinu, koja je dobivena na temelju molekularnog kloniranja c-mpl laboratorijskih miševa i štakora (murine) ustanovljeno je da je ovaj protein homologan drugim receptorima citokina. Vanstanična domena sadrži 465 aminokiselinskih ostataka, te se sastoji od dvije poddomene a svaka od njih sadrži sačuvane cisteine i određeni motv u N-terminalnoj poddomeni, te u C-terminalnoj poddomeni. Smatra se da vanstanična domena koja veže ligand ima sličnu strukturnu geometriju koja sadrži β-nabor. Ova udvostručena vanstanična domena je visoko homologna lancu odgovornom za prijenos signala u IL-3, IL-5 i GM-CSF receptorima kao i domeni koja nisko-afinitetno veže ligande kod LIF (Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615[1993]). Čini se da mpl pripada grupi nisko- afinitetnih ireceptora za citokine.

Usporedba mpl glodavaca i zrelog ljudskog mpl pokazuje da ova dva proteina imaju 87% homologije u sekvenci. Još preciznije, vanstanične poddomene N-terminalnog i C-terminalnog dijela pokazuju 75% i 80% homologije u sekvenci. Najviše sačuvana regija u mlp je citoplazmatska domena koja pokazuje 91% identičnosti u sadržaju aminokiselina, sa 37 identičnih aminokiselinskih ostataka u blizini transmembranske regije, u obje vrste. S tim u svezi, smatra se da je mlp jedan od strukturno najviše sačuvanih receptora citokina u mnogim vrstama. (Vigon, supra).

Podaci koji govore da je mpl funkcionalni receptor sposoban da prenosi proliferativne signale dolaze iz pokusa konstrukcije kimernih receptora koji sadrže ekstracelularnu domenu receptora citokina, a koja ima visoki afinitet za određeni citokin i mpl citoplazmatsku domenu. Budući da do sada nije otkriven ligand za mpl, bilo je neophodno konstruirati kimerni protein kkoji sadrži ekstracelularnu domenu visokog afiniteta iz klase receptora citokina kao što su IL-4R ili G-CSFR. Vigon ef al., supra su izvršili fuziju ekstracelularne domene G-CSFR s transmembranskom i citoplazmatskom domenom c-mpl. Izvršena je transfekcija stanične linije BAF/B03 (Ba/F3), koja ovisi o IL-3, sa G-CSFR/mpl kimerom zajedno s kompletnim kontrolnim dijelom G-CSFR. Stanice kojima je izvršena transfekcija su rasle jednako dobro u prisutnosti IL-3 ili G-CSF. Jednako tako, stanice kojima je izvršena transfekcija s G-CSFR su rasle jednako dobro u prisutnosti IL-3 ili G-CSF. Sve su stanice umirale u odsutnosti faktora rasta. Sličan eksperiment su izvršili Skoda et al., EMBO J., 12(7):2645-2653[ 1993], u kojem su obje ekstracelularna i transmembranska domena ljudskog IL-4 receptora (hlL-4-R) bile fuzionirane s citoplazmatskom domenom mpl laboratorijskih miševa i štakora (murine) i transfekcijom ubačene u staničnu liniju laboratorijskih miševa i štakora Ba/F3, koja ovisi o IL-3. Ba/F3 stanice koje su transfekcijom primile divlji tip hlL-4-R normalno su proliferirale u prisutnosti bilo IL-4 ili IL-3. Ba/F3 stanice koje su transfekcijom primile hlL-4-R/mpl normalno su proliferirale u prisutnosti hlL-4 (u prisutnosti ili odsutnosti IL-3), pokazujući tako da u Ba/F3 stanicama citoplazmatska domena sadrži sve elemente potrebne za prijenos proliferativnog signala.

Ovi eksperimenti s kimerama pokazuju da citoplazmatska domena mpl ima mogućnost prijenosa signala za proliferaciju, ali ne govore o tome da li ekstracelularna domena mpl može vezati ligand. Ovi rezultati su u skladu s najmanje dvije mogućnosti tumačenja, naime, mpl može biti receptor koji se sastoji od jednog lanca (klasa jedan) poput EPO-R ili G-CSFR, ili naprotiv je to β-podjedinica (klasa tri) koja zahtijeva a-podjedinicu poput IL-3 (Skoda et al, supra).

VI. Mpl ligand jest trombopoetin (TPO)

Kao što je prije izneseno, smatra se da serum sadrži jedinstveni faktor, koji se ponekad naziva trombopoetinom (TPO), koji djeluje sinergistički s različitim drugim citokinima tako da stimulira rast i sazrijevanje megakariocita. Do sad nije izoliran takav prirodni faktor ni iz seruma niti iz bilo kojeg drugog izvora iako su mnoge grupe uložile dosta truda na ovom polju, lako se u stvari ne zna da li je mpl u stanju vezati faktor koji stimulira megakariocite, noviji eksperimenti govore da je mpl uključen u prijenos proliferativnih signala faktora iz seruma pacijenata koji boluju od aplazije koštane srži (Methia et al., Blood, 82 (5):1395-1401 [1993]).

Podaci da faktor koji stimulira stvaranje kolonija, a koji je različit od IL-1α, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF, i GM-CSF prenosi proliferativne signale putem mpl dolaze od istraživanja distribucije ekspresije c-mpl u primitivnim već definiranim hematopoetskim staničnim linijama, te iz ispitivanjima s mpl- "antisens" nukleotidnim sekvencijama u jednoj od ovih staničnih linija.

Upotrebom reverzne transkriptaze (RT)-PCR u imunoploški pročišćenim humanim hematopoetskim stanicama, Methia et al., supra su pokazali da se snažni mpl mRNA trnskripti mogu naći jedino u CD34+ pročišćenim stanicama, megakariocitima i trombocitima. CD34+ iz koštane srži (BM) predstavljaju oko 1% svih BM stanica i obogaćene su primitivnim i progenitor stanicama svih određenih staničnih loza (npr. eritroidna, granulomakrofagna i megakariocitna).

Pokazano je da "antisens" mpl oligodeoksinukleotidna sekvencija izaziva supresiju stvaranja kolonija iz pluripotentne CD34+ stanice koja je uzgajana u serumu pacijenata koji boluju od aplazije koštane srži (to je bogati izvor aktivnosti koja stimulira stvaranje megakariocitnih kolonija [MK-CSA]). Sama ova "antisens" mpl oligodeoksinukleotidna sekvencija nema nikakav učinak na formiranje kolonija eritrocitne ili granulomakrofagne loze.

Još uvijek nije razjašnjeno da li mpl sam veže ligand, i da li serumski faktor za koji je utvrđeno da uzrokuje megakariocitopoezu djeluje putem mpl. Pokazano je da ukoliko mpl stvarno direktno veže ligand, njegova aminokiselinska sekvencija je najvjerojatnije sačuvana kroz mnoge vrste, te postoji unakrsna reaktivnost zbog značajne podudarnosti sekvencija između vanstanične domene mpl u ljudi i u glodavaca Vigon et al., supra 1993]).

VII. Ciljevi istraživanja

U svjetlu gore navedenoga, može se ustvrditi da postoji trajna i neposredna potreba da se izoliraju i identificiraju molekule koje su sposobne stimulirati proliferaciju, diferencijaciju i sazrijevanje hematopoetskih stanica, naročito megakariocita ili njihovih prethodnika za uporabu u terapiji trombocitopenija. Vjeruje se da je ta molekula ligand za mpl, i da tako postoji daljnja potreba da se izoliraju ovi ligand(i) da bi se mogla procijeniti njihova uloga u rastu i diferencijaciji stanica.

S tim u svezi, jedan od ciljeva ovog izuma je dobivanje farmaceutski čiste molekule koja može stimulirati proliferaciju, diferencijaciju, i/ili sazrijevanje megakariocita u zrele oblike koji stvaraju trombocite.

Drugi cilj je dobivanje molekule u obliku pogodnom za terapiju hematopoetskih poremećaja, naročito trombocitopenija.

Daljnji cilj ovog izuma je izolacija, pročišćavanje i specifično identificiranje proteinskih liganada koji se mogu vezati in vivo za mpl, receptror iz superobitelji citokinskih receptora i time prenijeti proliferativni signal.

Slijedeći cilj je sinteza nukleinskih kiselina koje kodiraju takve proteinske ligande i njihova uporaba za produkciju takvih liganada koji se vežu na mpl u rekombinantnoj staničnoj kulturi, a koristili bi se u dijagnostičke i terapijske svrhe.

Slijedeći cilj ovog izuma je stvaranje derivata i modificiranih proteinskih liganada koji uključuju varijante u aminokiselinskom slijedu, varijante glikoproteinskih oblika i njihove kovalentne derivate.

Dodatni cilj je stvaranje fuzijskih proteinskih oblika koji sadržavaju ligand za mpl i heterologni protein i njihove kovalentne derivate.

Još je slijedeći cilj stvaranje varijantnih polipeptidnih oblika u kojima je stvorena kombinacija liganda za mpl s dodacima aminokiselina i supstitucijama iz sekvencije od EPO, tako da se stvori protein koji je sposoban regulirati proliferaciju i rast trombocita i matičnih stanica za eritrocite.

Slijedeći je cilj stvaranje imunogenih oblika koji su pogodni za produkciju antitijela protiv liganada za mpl, ili njihovih fuzijskih oblika, te za dobivanje antitijela koja mogu vezati takve ligande. Ovi, kao i drugi ciljevi izuma bit će jasni i razumljivi stručnjaku, nakon upoznavanja s cjelokupnom specifikacijom.

SAŽETAK IZUMA

Ciljevi ovog izuma su stvaranje i izoliranje proteina koji potiče proliferaciju i sazrijevanje u megakariocitopoetskoj lozi, koji je označen kao "mpl ligand" (ML) ili "trombopoetin" (TPO), i koji može stimulirati sazrijevanje i/ili diferencijaciju megakariocita u zrele oblike koji produciraju trombocite.

Ovaj u biti homogeni protein može biti pročišćen iz prirodnih izvora metodama koje uključuju; (1) obradu plazme, koja služi kao izvorni materijal za pročišćavanje molekula mpl liganda s imobiliziranim receptorskim polipeptidom, naročito s mpl ili s mpl fuzijskim polipeptidom imobiliziranim na podlozi, pod uvjetima gdje se mpl- Ugandske molekule koje treba pročistiti selektivno adsorbiraju na imobilizirani receptorski polipeptid, (2) ispiranje imobiliziranog receptorskog polipeptida i njegove podloge s ciljem da se odstrani ne-adsorbirani materijal, i (3) eluiranje mpl-ligandskih molekula s imobiliziranog receptorskog polipeptida na koji su one adsorbirane pomoću pufera za eluiranje. Poželjni prirodni izvori su plazma ili urin sisavaca, a koji sadržavaju ligand za mpl. Ponekad se radi o sisavcu koji ima aplaziju i imobilizirani receptor je fuzijski proizvod sastavljen kao mpl-lgG.

Ponekad je poželjni protein koji potiče proliferaciju i sazrijevanje megakariocita izoliran kao, u biti homogeni polipeptidni ligand za mpl, dobiven sintetski ili putem rekombinantnih tehnika.

"Mpl-ligandni" - polipeptid ili "TPO" iz ovoga izuma poželjno ima barem 70% ukupne identičnosti u aminokiselinskom slijedu s visoko pročišćenim, u biti homogenim mpl-ligandnim polipeptidom u svinja, i barem 80% identičnosti u aminokiselinskom slijedu s "EPO-domenom" mpl-ligandnog polipeptida u svinja. Ponekad je mpl-ligandna varijanta iz ovog izuma zreli humani mpl-ligand (hML), koji ima zrelu sekvenciju prikazanu na SL.1 (SEQ ID NO: 1), ili njegov posttranskripcijski modificirani oblik, ili protein koji ima oko 80% identičnosti u aminokiselinskom slijedu sa zrelim humanim mpl-ligandom. Ponekad je mpl-ligandna varijanta fragment, i to fragment s amino-terminalnog kraja ili "EPO-domene", ili zreli humani mpl ligand (hML). Poželjno je da amino-terminalni završetak zadrži cijelu humanu sekvenciju između prvog i četvrtog cisteinskog ostatka, no on može sadržavati i značajne dodatke, delecije ili supstitucije izvan te regije. Prema ovim navodima, takav fragmentni polipeptid se može prikazati formulom:

X-hML(7-151)-Y

gdje hML(7-151) predstavlja sekvenciju humanog TPO (hML od Cys7 pa sve do Cys151 uključivo; X predstavlja amino skupinu od Cys7- ili jednu ili više aminokiselina s amino-terminalnog završetka u zrelom hML, ili aminokiselinski produžetak u obliku Met ili Tyr, ili vodeću sekvenciju koja sadrži mjesta proteolitičkog cijepanja (npr. Faktor Xa ili trombin); a Y predstavlja karboksi-terminalni aminokiselinski ostatak(e) u zrelom hML ili njegovim ekstenzijama.

Ponekad mpl-ligandni polipeptid ili njegov fragment mogu biti fuzionirani s heterolognim polipeptidom (kimera). Poželjni heterologni polipeptid je citokin, faktor koji stimulira kolonije, ili interleukin ili njihov fragment, specijalno kit-ligand (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF ili LIF. Jedan mogući poželjni heterologni polipeptid je jedan imunoglubulinski lanac, naročito humani lgG1, lgG2, lgG3,lgG4, IgA, IgE, IgD, IgM, ili njihov fragment, naročito onaj koji sadržava konstantnu domenu teških lanaca IgG.

Slijedeći aspekt ovog izuma opisuje pripravak koji se sastoji od izoliranod agonista od mpl koji je biološki aktivan i koji može stimulirati inkorporaciju obilježenih nukleotida (npr. 3H-timidina) u DNA Ba/F3 stanica koje ovise o IL-3, a kojima je transfekcijom ubačen humani mpl. Ponekad je mpl-agonist biološki aktivni mpl-ligand koji je sposoban stimulirati inkorporaciju 35S u cirkulirajuće trombocite u povratnom pokusu s mišjim trombocitima. Prikladni mpl agonisti uključuju hML153, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML i pML2 ili njihove fragmente.

U slijedećoj cjelini ovaj izum opisuje atitijela koja se mogu vezati na mpl-ligand. Izolirano antitijelo koje može vezati mpl-ligand može ponekad biti fuzionirano sa sekundarnim polipeptidom i antitijelo ili fuzionirana struktura se može upotrijebiti za izolaciju i pročišćavanje mpl-liganda iz izvora kako je to prije opisano za imobilizirani mpl. U slijedećem aspektu ove cjeline izum opisuje metodu za detekciju mpl-liganda in vivo i in vitro koja uključuje interakciju antitijela i uzorka, naročito seruma za koji se smatra da sadrži ligand i nakon toga određivanje ako je došlo do vezanja.

U slijedećem dijelu ovaj izum opisuje izoliranu molekulu nukleinske kiseline, koja kodira mpl-ligand ili njegove fragmente, te ta molekula nukleinske kiseline može biti obilježena s dijelom koji se može detektirati, i nukleinsku kiselinu koja ima njoj komplementarnu sekvenciju i koja može hibridizirati pod blagim do vrlo strogim uvjetima, s molekulom nukleinske kiseline koja ima sekvenciju koja kodira mpl-ligand. Naročito su povoljne molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju humani, svinjski ili mpl-ligand laboratorijskih miševa ili štakora, a uključuju RNA i DNA i to obje genomsku i cDNA.

U slijedećem aspektu ove cjeline molekula nukleinske kiseline je DNA koja kodira mpl-ligand i dalje uključuje replicirajući vektor u kojem je DNA operativno vezana s kontrolnom sekvencom koju prepoznaje domaćin koji je transformiran vektorom. Ponekad je DNA koja je upotrijebljena cDNA koja ima sekvenciju prikazanu na Sl.1 5'-3' (SEQ ID NO: 2), 3'-5' ili njihov fragment. Ovaj aspekt uključuje i stanice domaćina, poželjno CHO stanice koje su transformirane s vektorom i metodu upotrebe DNA kojom se postiže produkcija mpl-liganda, koja se sastoji od ekspresije cDNA koja kodira mpl-ligand u kulturi transformiranih stanica domaćina. Poželjno je da je ovako pripravljeni mpl-ligand humani mpl-ligand.

Ovaj izum nadalje uključuje metodu za terapiju sisavaca koji imaju hematopoetski poremećaj, naročito trombocitopeniju, a koja se sastoji od davanja terapijski učinkovitih količina mpl-liganda sisavcima. Ponekad mpl-ligand se daje u kombinaciji s citokinima, naročito faktorom koji stimulira kolonije ili interleukinom. Poželjni faktori koji stimuliraju kolonije ili interleukini uključuju: kit-ligand (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6, i IL-11.

Ovaj izum dalje uključuje postupke izolacije i pročišćavanja TPO (ML), iz mikroorganizama koji produciraju TPO, koji se sastoje od:

(1) razaranja i liže stanica koje sadrže TPO,

(2) razdvajanja topljivog od netopljivog materijala koji sadrži TPO (po potrebi),

(3) solubilizacije TPO iz netopljivog materijala pomoću pufera za solubilizaciju,

(4) razdvajanja solubiliziranog TPO od drugog topljivog ili netopljivog materijala,

(5) ponovnog konformacijskog smatanja TPO u redoks puferu i

(6) odvajanja pravilno smotanog TPO od pogrešno smotanog TPO.

Proces opisuje solubilizaciju netopljivog materijala koji sadrži TPO, ako je kao kaotropsko sredstvo korištena sol gvanidina, natrijev tiocijanat ili urea. Proces dalje opisuje kako se solubilizirani TPO odvaja od drugog topljivog ili netopljivog materijala putem jednog ili više stupnjeva bilo da se radi o centrifugiranju, gel filtraciji ili kromatografiji reverzne faze. Ponovno smatanje proteina zahtijeva redoks pufer koj sadrži oboje, i oksidirajuće i reducirajuće sredstvo. Općenito, oksidirajuće sredstvo je kisik ili spoj koji sadrži barem jednu disulfidnu vezu, a reducirajuće sredstvo je spoj koji sadrži barem jednu sulfhidrilnu skupinu. Poželjno je da se kao oksidirajuće sredstvo upotrijebi bilo oksidirani glutation (GSSG) bilo cistin, a kao reducirajuće sredstvo se upotrebljava bilo reducirani glutation (GSH) bilo cistein. Najbolje je kada je oksidirajuće sredstvo oksidirani glutation (GSSG), a reducirajuće sredstvo reducirani glutation (GSH). Također je poželjno da je molarni udjel oksidirajućeg sredstva jednak ili veći od molarnog udjela reducirajućeg sredstva. Redoks pufer također sadržava detergent, i to poželjno CHAPS i CHAPSO, u koncentraciji od barem 1%. Redoks pufer također sadrži NaCl, poželjno u koncentracijskom rasponu od oko 0,1-0,5 M, i glicerol u koncentraciji većoj od 15%. Poželjno je da je pH redoks pufera u rasponu između pH 7,5-9,0 i da se reakcijski korak ponovnog smatanja proteina provodi na 4 stupnja kroz 12-48 sati. Korak ponovnog smatanja proteina stvara biološki aktivan TPO u kojemu se stvara disulfidna veza između Cys koji je najbliži amino-terminalnom kraju s Cys koji je najbliži karboksi-terminalnom kraju EPO domene.

Izum nadalje uključuje postupke pročišćavanja biološki aktivnog TPO iz mikroorganizama koji uključuju:

(1) ližu barem ekstracelularne membrane mikroorganizma,

(2) obradu lizata koji sadržava TPO kaotropskim sredstvom,

(3) ponovno smatanje TPO i

(4) odvajanje nečistoća i pogrešno smotanog TPO od pravilno smotanog TPO.

KRATKI OPIS SLIKA

Sl. 1 prikazuje deducirani aminokiselinski slijed (SEQ ID NO: 1) humanog mpl-liganda (hML) cDNA i kodirajući nukleotidni slijed (SEQ ID NO: 2). Nukleotidi su numerirani na početku svakog reda. 5' i 3' netranslatirane regije su naznačene malim slovima. Aminokiselinski ostaci su numerirani iznad slijeda s početkom na Ser 1 u sekvenci zrelog mpl-ligandnog proteina. Granice pretpostavljenog eksona 3 su naznačene strelicama, a potencijalna mjesta N-glikozilacije su uokvirena. Potcrtana sekvencija odgovara N-terminalnom slijedu koji je određen u mpl-ligandu pročišćenom iz svinjske plazme.

Sl. 2 pokazuje postupak upotrijebljen za pokus inkorporacije 3H timidina. Za određivanje prisutnosti mpl-liganda iz različitih izvora, u inkubatoru s vlaženjem, na 37 °C u 5% CO2 i zraku, uzgajane su mpl P Ba/F3 stanice u mediju iz kojega je bio isključen IL-3 kroz 24 sata. Nakon isključenja IL-3 stanice su zasađene na ploče s 96 jažica sa ili bez razrijeđenih uzoraka i kultivirane kroz 24 sata u inkubatoru za stanične kulture. 20 μl medija RPMI koji nije sadržavao serum, a koji je sadržavao 1 μ, Ci 3H timidina dodan je u svaku zdencu tijekom poslijednjih 6-8 sati. Stanice su tada sakupljene na filter-pločama s 96 jažica i oprane vodom. Filteri su tada upotrijebljeni za brojanje radioaktivnosti.

Sl. 3 prikazuje utjecaj pronaze, DTT i topline na sposobnost APP da stimulira proliferaciju Ba/F3-mpl stanica. Za digestiju APP pronazom, pronaza (Boehringer, Mannheim) ili serumski goveđi albumin su bili povezani s Affi-gelom10 (Biorad) i individualno inkubirani s APP kroz 18 sati na 37 °C. Nakon toga smole su uklonjene centrifugiranjem i nadslojevi analizirani.

APP je također grijana na 80 °C kroz 4 min ili je koncentracija DTT podešena na 100 μM, nakon čega je slijedila dijaliza prema PBS.

Sl. 4 prikazuje eluiranje mpl-liganda s Phenyl-Toyopearl, Blue sefaroze i s Ultralink-mpl kolona. S mpl-kolone za afinitetnu kromatografiju eluirane su frakcije 4-8 u kojima se nalazi maksimum aktivnosti.

Sl. 5 prikazuje SDS-PAGE eleferogram frakcija eluiranih s Ultralink-mpl kolone. U 200 μl svake od frakcija 2-8, dodano je po 1 ml acetona, koji je sadržavao 1mM HCI, na temperaturi -20°C. Nakon 3 sata na -20 °C uzorci su centrifugirani i dobiveni taloži su oprani 2x s acetonom na -20 °C. Acetonski taloži su nakon toga otopljeni u 30 μl SDS-pufera za solubilizaciju, dodan je DTT do koncentracije 100 μM i grijani su na 90 °C kroz 5 min. Uzorci su tada ponovno razdvojeni na 4-20% SDS-poliakrilamidnom gelu, i proteini učinjeni vidljivima bojenjem srebrom.

Sl. 6 prikazuje eluiranje mpl-liganda s SDS-PAGE elferograma. Frakcija 6 s mpl-afinitetne kolone je dalje razdvojena na 4-20% SDS-poliakrilamidnom gelu pod nereducirajućim uvjetima. Nakon elektroforeze gel je razrezan u 12 jednakih regija i elektroeluiran kao što je opisano u primjerima. Elektroeluirani uzorci su dijalizirani prema PBS i ispitivani u razrjeđenju 1/20. Standardi relativnih molekulskih masa za kalibraciju gela bili su Novex Mark 12 standardi.

Sl. 7 prikazuje utjecaj APP iz kojeg je izdvojen mpl-ligand na humanu megakariocitopoezu. APP iz kojeg je izdvojen mpl-ligand je dobiven nakon prolaza 1ml preko mpl-afinitetne kolone (700 μg mpl-lgG/ml NHS-superoza, Pharmacia). Kulture humanih perifernih stem stanica su načinjene tako da imaju 10% APP ili da imaju 10% APP iz kojeg je izdvojen mpl-ligand i zatim uzgajane 12 dana. Megakariocitopoeza je kvantificirana kako je to objašnjeno u primjerima.

Sl. 8 prikazuje utjecaj mpl-lgG na stimulaciju humane megakariocitopoeze pomoću APP. Kulture humanih perifernih stem stanica su načinjene tako da imaju 10% APP i zatim uzgajane 12 dana. Na dane 0, 2 i 4 dodani su mpl-lgG (0,5μg) ili ANP-R-lgG (0,5μg). Nakon 12 dana megakariocitopoeza je kvantificirana kako je to objašnjeno u primjerima. Srednja vrijednost dvaju uzoraka je prikazana grafički, zajedno s obima podacima u zagradama.

Sl. 9 prikazuje oba standarda dužine od 390 parova baza iz humane genomske DNA koja kodira mpl-ligand. Prikazana je deducirana aminokiselinska sekvencija "eksona 3" (SEQ ID NO: 3), kodirajuća sekvencija (SEQ ID NO: 4), te njezin komplement (SEQ ID NO: 5).

Sl. 10 prikazuje deduciranu aminokiselinsku sekvenciju zrelog humanog mpl-liganda (hML) (SEQ ID NO: 6) i zreli humani eritropoetin (hEPO) (SEQ ID NO: 7). Pretpostavljena aminokiselinska sekvencija za humani mpl-ligand je prikazana usporedno sa sekvencom humanog eritropoetina. Identične aminokiseline su uokvirene, a razmaci koji su uvedeni da se postigne optimalna usporedivost su naznačeni crtkanim linijama. Potencijalna mjesta za N-glikozilaciju su podvučena punom crtom za hML te izlomljenom crtom za hEPO. Dva cisteina koji su važni za aktivnost eritropoetina su naznačena velikom točkom.

Sl. 11 prikazuje deduciranu aminokiselinsku sekvenciju izoformi zrelog humanog mpl-liganda hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9), te hML4 (SEQ ID NO: 10). Identične aminokiseline su uokvirene, a razmaci koji su uvedeni da se postigne optimalna usporedivost su naznačeni crtkanim linijama.

Sl. 12A, 12B i 12C prikazuju utjecaj humanog mpl-liganda na proliferaciju Ba/F3-mpl stanica (A), humanu megakariocitopoezu in vitro, kvantificiranu upotrebom radioaktivno obilježenog monoklonalnog IgG antitijela glodavaca, upravljenom prema glikoproteinu GPIIbIIIa (B), i trombocitopoezu glodavaca mjerenu pomoću trombocitnog povratnog pokusa (C).

Na dvije stotine devedeset i tri stanice je izvršena transfekcija pomoću CaPO4 metode (Gorman, C., u: DNA Cloning: A New Approach 2:143-190 [1985]) pomoću pRK5 vektora samog, pRK5-hML ili uz pRK5-hML153 preko noći (pRK5-hML-153 je stvoren tako da je stop kodon uveden nakon aminokiselinskog ostatka 153 u hML pomoću PCR). Mediji su tada ostavljeni 36 sati i ispitivani na stimulaciju proliferacije stanica Ba/F3-mpl kao što je to opisano u Primjeru 1 (A) ili in vitro humanoj megakariocitopoezi (B). Megakariocitopoeza je kvantificirana upotrebom 125l obilježenog monoklonalnog IgG antitijela (HP1-1D), upravljenog prema megakariocitnom specifičnom glikoproteinu GPIIbIIIa prema (Grant et al., Blood 69:1334-1339 [1987]). Utjecaj djelomično pročišćenog rekombinantnog ML (rML) ili in vivo stvaranje trombocita (C) je određeno pomoću trombocitnog povratnog pokusa, prema McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144:1006-1012 [1973]. Djelomično pročišćeni rML je pripravljen iz 200 ml punog medija koji je sadržavao rekombinantni ML. Medij je propušten kroz kolonu Blue-Sepharose od 2 ml, koja je bila prethodno uravnotežena s PBS-om, te je kolona isprana s PBS-om i eluirana s PBS-om koji je sadržavao 2M ureu i 2M NaCI. Aktivna frakcija je dijalizirana prema PBS-u i koncentracija podešena na 1 mg/ml s BSA koji nije sadržavao endotoksin. Uzorak je sadržavao manje od jedne jedinice endotoksina/ml. Miševima je injicirano 64000, 32000, ili 16000 jedinica rML ili otapalo samo. Svaka se grupa sastojala od 6 miševa. Prikazane su srednja vrijednost i standardna devijacija za svaku grupu, p-vrijednosti su određene upotrebom dvostranog t-testa za usporedbu medijana.

Sl. 13 uspoređuje utjecaje različitih izoformi i varijanti humanog mpl-liganda u pokusu proliferacije Ba/F3-mpl stanica. hML, lažno, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) i hML153 su ispitivani pri različitim razrjeđenjima kao što je to opisano u Primjeru 1.

Sl. 14A, 14B i 14C prikazuju deduciranu aminokiselinsku sekvenciju humanog mpl-liganda hML (SEQ ID NO: 1), ili humanog TPO (hTPO) i humanu genomsku DNA koja kodira sekvenciju (SEQ ID NO: 11). Nukleotidi i aminokiselinski ostaci _su numerirani na početku svakog reda.

Sl. 15 prikazuje SDS-PAGE elferogram pročišćenog 293-rhML332 i pročišćenog 293-rhML153.

Sl. 16 prikazuje nukleotidnu sekvenciju: cDNA koja kodira (SEQ ID NO: 12) i petpostavljenu aminokiselinsku sekvenciju (SEQ ID NO: 13) u otvorenom okviru čitanja, izoforme ML laboratorijskih miševa i štakora (murine). Zreli mpl-ligand sadrži 331 aminokiselinski ostatak, četiri manje nego što je pretpostavljena puna dužina mML i zbog toga je označen kao mML2. Nukleotidi su numerirani na početku svakog reda. Aminokiselinski ostaci su numerirani iznad sekvencije i počinju sa Ser 1. Potencijalna mjesta za N-glikozilaciju su podvučena. Cisteinski ostaci su označeni točkom iznad sekvencije.

Sl. 17 prikazuje cDNA sekvenciju (SEQ ID NO: 14) i pretpostavljenu aminokiselinsku sekvenciju (SEQ ID NO: 15) ove izoforme ML porijeklom iz laboratorijskih miševa i štakora (mML). Nukleotidi su numerirani na početku svakog reda. Aminokiselinski ostaci su numerirani iznad sekvencije i počinju sa Ser 1. Ovaj zreli mpl-ligand sadrži 335 aminokiselinskih ostataka, i vjeruje se da je to puna dužina mpl-liganda, označena mML. Signalna sekvencija je potcrtana crtkano i pretpostavljeno mjesto cijepanja je označeno strelicom. 5' i 3' netranslatirane regije su označene malim slovima. Dvije delecije koje su rezultat alternativnog "splicinga" (mML2 i mML3) su potcrtane. Četiri cisteinska ostatka su označena točkom. Sedam potencijalnih mjesta za N-glikozilaciju su uokvirena.

Sl. 18 uspoređuje pretpostavljenu aminokiselinsku sekvenciju humane izoforme hML3 (SEQ ID NO: 9) i izoformu ML laboratorijskih miševa i štakora označenu kao mML3 (SEQ ID NO: 16). Predviđena aminokiselinska sekvencija humanog mpl-liganda je uspoređena sa sekvencijom mpl-liganda laboratorijskih miševa i štakora. Identične aminokiseline su uokvirene, a razmaci koji su uvedeni da se postigne optimalna usporedivost su naznačeni crtkanim linijama. Aminokiseline su numerirane na početku svakog reda.

Sl. 19 uspoređuje predviđenu aminokiselinsku sekvenciju izoformi zrelog ML, mišjeg-ML (SEQ ID NO: 17), svinjskog-ML (SEQ ID NO: 18) i humanog-ML (SEQ ID NO: 6). Aminokiselinske sekvencije su uspoređene s takvim razmacima, koji su označeni crticama da se postigne maksimalna usporedivost. Aminokiseline su numerirane na početku svakog reda. Identični ostaci su uokvireni. Potencijalna mjesta za N-glikozilaciju su označena sjenčanjem, a cisteinski ostaci su označeni točkom. Motiv s konzerviranim di-bazičnim aminokiselinama koji predstavlja potencijalno mjesto za cijepanje proteazama je potcrtan. Delecija od četiri aminokiseline koja se javlja u sve tri vrste (ML2) je naznačena uokvirenjem u debelom tisku.

SI. 20 prikazuje cDNA sekvenciju (SEQ ID NO: 19) i predviđenu aminokiselinsku sekvenciju zrelog proteina (SEQ ID NO: 18) izoforme ML porijeklom iz svinje (pML). Ovaj zreli mpl-ligand svinje sadrži 332 aminokiselinska ostatka, i vjeruje se da je to puna dužina mpl-liganda iz svinje, označena pML. Nukleotidi su numerirani na početku svakog reda. Aminokiselinski ostaci su numerirani iznad sekvencije i počinju sa Ser 1.

Sl. 21 prikazuje cDNA sekvenciju (SEQ ID NO: 20) i predviđenu aminokiselinsku sekvenciju zrelog proteina (SEQ ID NO: 21) izoforme ML porijeklom iz svinje (pML2). Ova izoforma mpl-liganda svinje sadrži 328 aminokiselinskih ostataka, i predstavlja formu dobivenu delecijom četiriju aminokiselinskih ostataka od pune dužine mpl-liganda iz svinje, označena kao pML2. Nukleotidi su numerirani na početku svakog reda. Aminokiselinski ostaci su numerirani iznad sekvencije i počinju sa Ser 1.

Sl. 22 uspoređuje deduciranu aminokiselinsku sekvenciju izoforme svinjskog ML pune dužine pML (SEQ ID NO: 18) i izoformu ML svinje označenu kao pML2 (SEQ ID NO: 21). Predviđena aminokiselinska sekvencija za pML je uspoređena sa pML2 sekvencpm. Identične aminokiseline su uokvirene, a razmaci koji su uvedeni da se postigne optimalna usporedivost su naznačeni crtkanim linijama. Aminokiseline su numerirane na početku svakog reda.

Sl. 23 prikazuje pripadne osobine plazmida pSVIS.ID.LL.MLORF (puna dužina ili TPO332) koji je upotrijebljen za transfekciju stanica domaćina CHO-DP12 za stvaranje CHO-rhTP0332.

Sl. 24 prikazuje pripadne osobine plazmida pSVIS.ID.LL.MLEPO-D (skraćena verzija ili TPO-153) koji je upotrijebljen za transfekciju stanica domaćina CHO-DP12 za stvaranje CHO-rhTP0153.

Sl. 25A, 25B i 25C prikazuju utjecaj E. coli-rhTPO(Met-1 155) na trombocite (A), crvena krvna zrnca (B), i bijela krvna zrnca (C) u normalnih miševa. Dvije grupe od 6 ženki C57 B6 miševa su bile dnevno injicirane s PBS puferom ili sa 0,3 μq E. coli-rhTPO(Met-1, 153) (100 μl sc.). Na dan 0 i na dane 3-7 40 μl krvi je izvađeno iz orbitalnog sinusa. Krv je odmah razrijeđena u 10 ml standardnog sredstva za razrjrđenje i kompletni parametri za krv su dobiveni na Serrono Baker hematološkom analizatoru 9018. Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± standardna pogreška srednje vrijednosti.

Sl. 26A, 26B i 26C prikazuju utjecaj E. coli-rhTPO(Met-1 153) na trombocite (A), crvena krvna zrnca (B), i bijela krvna zrnca (C) u subletalno ozračenih miševa. Dvije grupe od 10 ženki C57 B6 miševa su bile subletalno ozračene sa 750 cGy gama -zračenja iz 137Cs izvora zračenja i injicirane dnevno s PBS puferom ili sa 3 μg E.Coli-rhTPO(Met-1 153) (100 μl sc.). Na dan 0 i u kasnijim međuvremenskim intervalima 40 μl krvi je izvađeno iz orbitalnog sinusa. Krv je odmah razrjeđena u 10 ml standardnog sredstva za razrjrđenje i kompletni parametri za krv su dobiveni na Serrono Baker hematološkom analizatoru 9018.

Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± standardna pogreška srednje vrijednosti.

Sl. 27A, 273 i 27C prikazuju utjecaj CHO-rhTPO332 na trombocite (A), crvena krvna zrnca (eritrocite) (B), i bijela krvna zrnca (leukocite) (C) u normalnih miševa. Dvije grupe od 6 ženki C57 B6 miševa su bile dnevno injicirane s PBS puferom ili sa 0,3 μg CHO-rhTP0332(100 μl sc.). Na dan 0 i na dane 3-7 40 μl krvi je izvađeno iz orbitalnog sinusa. Krv je odmah razrjeđena u 10 ml standardnog sredstva za razrjrđenje i kompletni parametri za krv su dobiveni na Serrono Baker hematološkom analizatoru 9018. Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± standardna pogreška srednje vrijednosti.

Sl. 28 prikazuje krivulje učinka i doze za različite oblike rhTPO dobivene iz različitih staničnih linija. Krivulje učinka i doze za rhTPO načinjene su za slijedeće stanične linije hTPO332 iz CHO (kompletna dužina iz stanica ovarija kineskog hrčka), hTPO(Met-1 153) (nekompletna forma iz E. coli koja sadrži N-terminalni metionin), hTPO332 (kompletna dužina TPO iz humanih 293 stanica); bez metionina 155 E. coli (skraćeni oblik od [rhTPO-155)], bez terminalnog metionina iz E. coli). Grupe od 6 ženki C57 B6 miševa su bile dnevno injicirane s rhTPO, ovisno o grupi. Svaki je dan 40 μl krvi izvađeno iz orbitalnog sinusa. Podaci prikazuju maksimalne učinke koji su opaženi uz različite obrade i uz izuzetak (met 153 E. coli) ovo se dešavalo sedmog dana obrade. U prethodno navedenoj "met 153 E. coli" skupini maksimalni učinak je opažen petog dana. Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± standardna pogreška srednje vrijednosti.

Sl. 29 prikazuje krivulje učinka i doze koje uspoređuju aktivnosti rhTPO stvorenog u CHO stanicama, i to formi pune dužine i onih skraćenih, sa skraćenom formom stvorenom u E.Coli. Grupe od 6 ženki C57 B6 miševa su bile dnevno injicirane s 0,3 μg rhTPO, različitih tipova. Na dane 2-7 izvađeno je 40 μl krvi iz orbitalnog sinusa za kompletne krvne pretrage. Grupe u obradi su bile TPO153 skraćeni oblik TPO iz E.Coli; TPO332 (miješana frakcija). Puna dužina TPO sadržava otprilike 80-90% pune dužine i 10-20% skraćene forme; TPO332(30K frakcija) = pročišćena skraćena frakcija iz originalnog "miješanog" pripravka; TPO332(70K frakcija) = frakcija pune dužine TPO pročišćena iz originalnog "miješanog" pripravka. Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± standardna pogreška srednje vrijednosti.

Sl. 30 je shematski prikaz KIRA ELISA postupka za određivanje TPO. Slika pokazuje MPL/Rse.gD kimerni protein i važne dijelove matične molekule receptora te konačni konstrukt (desni dio slike) i dijagram toka (lijevi dio slike) koji pokazuju važne stupnjeve u postupku određivanja.

Sl. 31 je cjeloviti dijagram KIRA ELISA postupka koji pokazuje svaki pojedini stupanj procedure.

Sl. 32A-32L prikazuju sekvenciju nukleotida (SEQ ID NO: 22) ekspresijskog vektora pSVI17.ID.LL, koji je upotrijebljen za ekspresiju Rse.gD u Primjeru 17.

Sl. 33 je shematski prikaz priprave plazmida pMP1.

Sl. 34 je shematski prikaz priprave plazmida pMP21.

Sl. 35 je shematski prikaz priprave plazmida pMP151.

Sl. 36 je shematski prikaz priprave plazmida pMP202.

Sl. 37 je shematski prikaz priprave plazmida pMP172.

Sl. 38 je shematski prikaz priprave plazmida pMP210.

Sl. 39 je tablica pet najboljih klonova za ekspresiju TPO iz banke pMP210 plazmida (SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, 27 i 28).

Sl. 40 je shematski prikaz priprave plazmida pMP41.

Sl. 41 je shematski prikaz priprave plazmida pMP57.

Sl. 42 je shematski prikaz priprave plazmida pMP251.

DETALJNI OPIS IZUMA

I. Definicije

Općenito uzevši slijedeće riječi ili fraze imaju naznačenu definiciju kada su upotrijebljene u opisu, primjerima ili zahtjevima.

"Kaotropsko sredstvo" se odnosi na spoj koji u vodenoj otopini i u odgovarajućim koncentracijama može uzrokovati promjenu prostorne konfiguracije ili konformacije proteina tako da barem djelomično izazove prekidanje sila koje su odgovorne za održavanje normalne sekundarne i tercijarne strukture proteina. Takvi spojevi uključuju, na primjer, ureu, gvanidin-HCI i natrijev tiocijanat. Visoke koncentracije, obično 4-9 M, ovih spojeva su neophodne da se ispolji konformacijski utjecaj na proteine.

"Citokin" je generički termin za proteine koje oslobađa jedna stanična populacija, a koji djeluju na drugu stanicu kao međustanični posrednici. Primjeri takvih citokina su limfokini, monokini, i tradicionalni polipeptidni hormoni. U njih su uključeni hormon rasta, inzulinu-slični faktori rasta, ljudski hormon rasta, N-metionil ljudski hormon rasta, goveđi hormon rasta, paratireoidni hormon, tiroksin, inzulin, proinzulin, relaksin, prorelaksin, glikoproteinski hormoni kao što su folikul stimulirajući hormon (FSH), tireoidea stimulirajući hormon (TSH) i leutinizirajući hormon (LH), hematopoetski faktor rasta, hepatički faktor rasta, faktor rasta fibroblasta, prolaktin, placentalni laktogen, tumorski faktor nekroze (TNF-α i TNF-β), mullerijska inhibirajuća supstanca, mišji gonadotropinu slični peptid, inhibin, aktivin, vaskularno endotelni faktor rasta, integrin, nervni faktor rasta, kao što je NGF-β, faktor rasta trombocita, transformacijski faktori rasta (TGFs) kao što su TGF-α i TGF-β, inzulinu-slični faktor rasta-I i -II, eritropoetin (EPO), osteoinduktivni faktori, interferoni kao što su interferon-α, -β, -γ, faktor koji stimulira kolonije (CSFs), kao što su makrofagni-CSF (M-CSF), granulocitno-makrofagni-CSF (GM-CSF), granulocitni-CSF (G-CSF), interleukini (ILs) kao što su IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4 IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 i drugi polipeptidni faktori koji uključuju LIF, SCF i kit-ligand. Kako su ovdje upotrijebljeni ovi termini uključuju proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantnih staničnih kultura. Slično tome, termini uključuju i njihove biološki aktivne ekvivalente; npr., one koji se razlikuju u aminokiselinskoj sekvencijj_ u jednoj ili više aminokiselina, ili u tipu, ili po opsegu glikozilacije.

"Mpl-ligand", "mpl-ligandni polipeptid", "polipeptidni mpl-ligand", "ML", "trombopoetin" ili "TPO" se upotrebljavaju naizmjenično ovdje i uključuju bilo koji polipeptid koji posjeduje osobine vezanja na mpl, člana superobitelji raceptora citokina i ima biološke osobine ML kako je to dalje naznačeno. Jedna tipična biološka aktivnost je sposobnost stimuliranja inkorporacije radioaktivno obilježenih nukleotida (npr. 3H-timidina) u DNA od Ba/F3 stanica koje ovise o IL-3, a kojima je izvršena transfekcija humanog mpl P. Druga tipična biološka aktivnost je sposobnost stimuliranja inkorporacije 35S u cirkulirajuće trombocite u povratnom pokusu s mišjim trombocitima. Ova definicija uključuje i polipeptid koji je izoliran iz izvora mpl-liganda kao što su plazma svinja s aplazijom opisana ovdje, ili iz drugih izvora, kao što je druga životinjska vrsta što uključuje i ljudsku, ili koji je pripravljen rekombinantnim ili sintetskim metodama i uključuje varijantne oblike, odnosno funkcionalne derivate, fragmente, alele, izoforme i njihove analoge.

"Fragment mpl-liganda" ili "TPO fragment" je dio prirodnog zrelog mpl-liganda pune dužine ili TPO sekvencije koji ima deleciju jedne ili više aminokiselina, ili uglikohidratnog dijela. Delecija aminokiseline(a) može se nalaziti bilo gdje uključujući N-termnalni kraj ili C-termnalni kraj, ili u unutrašnjosti molekule. Fragment ima barem jednu biološku osobinu zajedničku s mpl-ligandom. Fragment mpl-liganda tipično će sadržavati konsekutivnu sekvenciju od barem 10, 15, 20, 25, 30 ili 40 aminokiselinskih ostataka koje su identične sekvenci mpl-liganda izoliranog iz sisavaca uključivo iigand izoliran iz plazme svinja s aplazijom, ili humani ili Iigand koji je izoliran iz glodavaca, naročito ako sadrži njihovu EPO-domenu. Reprezentativni primjeri N-terminalnog fragmenta su hML153 ili TPO(Met-11-153).

"Varijante mpl-liganda" ili "varijante sekvencije mpl-liganda" kako su ovdje definirane označavaju biološki aktivan mpl-ligand kako je niže definirano koje imaju manje od 100% identičnosti sekvencije s mpl-ligandom izoliranim iz rekombinantne stanične kulture ili plazme svinja s aplazijom ili humani ligand koji ima deduciranu sekvenciju opisanu na Sl.1 (SEQ ID NO: 1). Najčešće će, varijanta biološki aktivnog mpl-liganda imati sekvenciju koja će pokazivati barem 70% identičnosti aminokiselinske sekvencije s mpl-ligandom izoliranim iz plazme svinja s aplazijom, ili zrelim humanim, ili ligandom iz laboratorijskih miševa i štakora, ili njihovim fragmentima (vidi Sl.1 [SEQ ID NO: 1]), poželjno barem oko 75%, još bolje barem 80%, ili još bolje barem 85%, čak još bolje 90%, a najbolje barem 95% identičnosti.

"Kimerični mpl-ligand" je polipeptid koji sadržava cjelokupnu dužinu mpl-liganda, ili jedan ili više njegovih fragmenata fuzioniranih ili povezanih s drugim heterolognim polipeptidom, ili jedan ili više njihovih fragmenata. Kimerični protein će dijeliti barem jednu biološku osobinu zajedničku s mpl-ligandom. Sekundarni polipeptid će tipično biti citokin, imunoglobulin ili njihov fragment.

"Izolirani mpl-ligand", "visoko pročišćeni mpl-ligand", "u biti homogeni mpl-ligand" će biti naizmjenično upotrebljavani termini i znače mpl-ligand koji je bio izoliran iz izvora mpl-liganda ili je bio pripravljen rekombinantnim ili sintetičkim metodama i koji je dovoljno čist od drugih polipeptida ili proteina da (1) sadrži barem 15, a poželjno 20 aminokiselinskih ostataka s N-terminalnog kraja, ili neke unutrašnje sekvencije, upotrebom sekvenatora s rotirajućom posudicom, ili najboljeg komercijalno dostupnog aminokiselinskog sekvenatora, ili da je modificiran poznatim publiciranim metodama, kao što je sadržaj ove aplikacije, ili da je (2) do homogenosti pročišćen, prema SDS-PAGE elektroforezi pod nereducirajućim, ili reducirajućim uvjetima, upotrebom Coomassie plavila, ili poželjno bojenjem srebrom. Homogenost ovdje znači manje od 5% kontaminacije s drugim proteinima iz izvora.

"Biološke osobine", kada se upotrebljavaju uz "mpl-ligand" ili "Izolirani mpl-ligand" znače da ima trombopoetičku aktivnost, ili da ima in vivo efektorsku ili antigenu funkciju ili aktivnost koja je direktno ili indirektno uzrokovana mpl-ligandom (bilo njegovom nativnom ili denaturiranom konformacijom) ili njegovim fragmentima. Efektorske funkcije uključuju vezanje mpl i bilo koju drugu ulogu vezanja prenositelja, agonizam ili antagonizam s mpl, naročito prijenos proliferativnog signala, uključujući replikaciju, regulatornu funkciju za DNA, modulaciju biološke aktivnosti drugih citokina, aktivaciju receptora (naročito onih za citokine), deaktivaciju, regulaciju na više i na niže, rast i diferencijaciju stanica i slično. Antigena funkcija znači posjedovanje epitopa ili antigenog mjesta koje može unakrsno reagirati s antitijelima koja su stvorena prema nativnom mpl-ligandu. Glavna antigena funkcija mpl-ligandnog polipeptida izoliranog iz plazme svinja s aplazijom je da se vezuje s afinitetom od barem oko 106 l/mol. Najbolje je kada se antigene aktivni mpl-ligandni polipeptid veže na antitijela koja su stvorena prema mpl-ligandu koji ima jednu od gore navedenih funkcija. Antitijela koja se upotrebljavaju da se definira "biološka aktivnost" su zečja poliklonalna antitijela stvorena prema formulaciji mpl-liganda izoliranog iz rekombinantne stanične kulture ili iz plazme svinja s aplazijom, u kompletnom Freundovom adjuvansu, ako je formulacija injicirana subkutano, pojačanje imunološke reakcije postiže se intraperitonealnom injekcijom formulacije sve dok titar mpl-liganda ne postigne plato.

"Biološki aktivan" kada se upotrebljava zajedno s "mpl-ligand" ili "izolirani mpl-ligand", znači mpl-ligand ili polipeptid koji iskazuje trombopoetičku aktivnost, ili dijeli efektorsku funkciju mpl-liganda izoliranog iz plazme svinja s aplazijom ili je eksprimiran u ovdje opisanoj rekombinantnoj staničnoj kulturi. Glavna poznata efektorska funkcija mpl-liganda ili polipeptida, ovdje je vezanje za mpl i stimuliranje inkorporacije radioaktivno obilježenih nukleotida (3H-timidina) u DNA Ba/F3 stanice koje ovise o IL-3, a kojima je izvršena transfekcija humanim mpl P. Druga poznata efektorska funkcija mpl-liganda ili polipeptida ovdje opisanog je sposobnost stimulacije inkorporacije 35S u cirkulirajuće trombocite u povratnom trombocitnom pokusu. Još jedna poznata efektorska funkcija mpl-liganda je sposobnost stimulacije humane megakariocitopoeze in vitro koja može biti kvantificirana upotrebom radioaktivno obilježenog monoklonalnog antitijela koje je specifično za megakariocitni glikoprotein GPIIbIIIa.

"Postotak identičnosti aminokiselinske sekvencije" s obzirom na sekvenciju mpl-liganda je ovdje definiran kao postotak aminokiselinskih ostataka u ispitivanoj sekvenciji koji je identičan sa sekvencijom mpl-liganda koji je izoliran iz plazme svinja s aplazijom, ili iz laboratorijskih miševa i štakora, ili s humanim ligandom koji ima sekvenciju opisanu na Sl.1 (SEQ ID NO: 1), nakon što se usporede sekvencije uz uvođenje razmaka, ako je to nužno, da se postigne maksimalno poklapanje i ne uzimajući u obzir konzervirane supstitucije kao dio identičnosti sekvencija. Niti jedna od N-terminalnih, C-terminalnih, ili unutarnjih ekstenzija, delecija, ili insercija u mpl-ligandu neće biti uzeta u obzir pri određivanju identičnosti sekvencije ili homologije. Tako, modelni biološki aktivni mpl-ligandni polipeptid, za koji se matra da ima identičnu sekvenciju uključuje; prepro-mpl-ligand, pro-mpl-ligand, i zreli mpl-ligand.

"Mikrosekvenciranje mpl-liganda" se može izvršiti bilo kojom prikladnom standardnom metodom, pod uvjetom da se radi o dovoljno osjetljivoj metodi. U jednoj takvoj metodi, visoko pročišćeni polipeptid koji je dobiven sa SDS gelova ili na kraju HPLC postupka je sekvencioniran direktno automatskom Edmanovom (fenil izotiocianat) razgradnjom uz upotrebu plinskog sekvenatora, modela 470A Applied Biosystems koji je opskrbljen s 120A feniltiohidantoin (PTH) aminokiselinskog analizatora. Dodatno, fragmenti mpl-liganda koji su dobiveni kemijskom (npr. CNBr, hidroksilamin, 2-nitro-5-tiocijanobenzoata) ili enzimskom (npr. tripsinom, klostripainom, stafilikoknom proteazom) digestijom, nakon koje je slijedila purifikacija fragmenata (npr., HPLC) mogu biti sekvencirani na slični način. PTH aminokiseline su analizirane upotrebom sistema ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, CA). Interpretacija sekvencije je načinjena na VAX 11/785 Digital Equipment Co. računalu prema Henzel et al., J. Cromatography, 404:41-52 [ 1987]. Ponekad su alikvoti HPLC frakcija podvrgnuti elektroforezi na 5-20% SDS-PAGE, elektropreneseni na PVDF membrane (ProBlott, AIB, Foster City, CA) i obojani Coomassie Brilliant Blue bojom (Matsurdiara et al., J. et al., Chem., 262:10035-10038 [1987]). Specifični protein koji je identificiran bojom izrezan je s blota i izvršeno je sekvencioniranje sa sekvenatorom plinske faze kako je to prije opisano. Za interne proteinske sekvencije, HPLC frakcije su razgrađene s "cijanogen bromidom, s lys-specifičnim enzimom Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA), ili Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Nakon digestije, dobiveni peptidi su sekvencionirani kao smjesa nakon HPLC razdvajanja na C4 koloni, razvijeni su s propanolnim gradijentom u 0,1% TFA, prije sekvencioniranja sa sekvenatorom plinske faze.

"Trombocitopenija" je definirana kao stanje kada je broj trombocita manji od 150x109 po litri krvi.

"Trombocitopoetička aktivnost" je definirana kao biološka aktivnost koja se sastoji od ubrzavanja proliferacije, diferencijacije i/ili sazrijevanja megakariocita ili prekursora megakariocita u trombocite koji se stvaraju iz ovih stanica. Ova se aktivnost može mjeriti različitim postupcima koji ukjučuju in vivo mišji povratni trombocitni pokus sinteze, pokus indukcije antigenosti trombocitne stanične površine koji se mjeri anti-trombocitnim imuno-određivanjem (anti-GPIIbIIIa) za humanu megakarioblastičnu leukemičnu staničnu liniju (CMK), i indukciju poliploidizacije u megakarioblastičnoj staničnoj liniji (DAMI).

"Trombopoetin" (TPO) je definiran kao spoj koji ima trombopoetičku aktivnost i koji je sposoban izazvati povećanje broja trombocita u sisavaca. Poželjno je da je TPO sposoban izazvati povećanje endogenog broja trombocita za barem 10%, ili još bolje do 50%, a najbolje da je sposoban povećati broj trombocita do 150x 109 na litru krvi.

"Izolirana nukleinska kiselina mpl-liganda" je RNA ili DNA koja sadrži više od 16, poželjno 20 ili više nukleotida u slijedu koji kodiraju biološki aktivan mpl-ligand ili njegov fragment, ili je komplementarna s RNA ili DNA, ili hibridizira s RNA ili DNA i ostaje stabilno vezana pod blagim do strogim uvjetima. Ova RNA ili DNA je slobodna od barem jednog kontaminirajućeg izvora nukleinskih kiselina s kojim je normalno povezana u prirodnom izvoru i poželjno je da je potpuno slobodna od bilo koje druge RNA ili DNA sisavaca. Izraz "slobodna od od barem jednog kontaminirajućeg izvora nukleinskih kiselina s kojim je normalno povezana" uključuje slučaj kada je nukleinska kiselina prisutna u prirodnom staničnom izvoru, ali je u drugačijoj kromosomskoj lokaciji ili na drugi način povezana sa sekvencom koja nije normalno prisutna u toj stanici. Jedan primjer izolirane nukleinske kiseline mpl-liganda je RNA ili DNA koja kodira biološki aktivan mpl-ligand koji dijeli barem 75% identičnosti sekvencije, bolje barem 80%, još bolje 85%, čak još bolje 90%, a najbolje 95% identičnosti sekvencije s humanim, svinjskim ili mpl-ligandom glodavaca.

"Kontrolna sekvencija" kada se odnosi na ekspresiju znači DNA sekvenciju neophodnu za ekspresiju jedne operabilno povezane kodirajuće sekvencije u određenom organizmu domaćina. Kontrolna sekvencija koja je prikladna za prokariote, na primjer, uključuje promotor, po mogućnosti operatorsku sekvenciju, mjesto vezanja ribosoma, i po mogućnosti druge za sada još slabo poznate sekvencije. Eukariotske stanice su poznate po tome da upotrebljavaju promotore, poliadenilacijske signale i pojačivače.

"Operabilno povezan", kada se to odnosi na nukleinske kiseline, znači da je nukleinska kiselina postavljena u funkcionalni odnos s drugom nukleinsko kiselinskom sekvencom. Na primjer, DNA za presekvenciju ili za sekretornu vodilju je operabilno povezana za DNA za polipeptid ako se on eksprimira kao preprotein koji sudjeluje u sekreciji polipeptida; promotor ili pojačivač je operabilno povezan za kodirajuću sekvenciju ako je pozicioniran tako da olakšava translaciju. Općenito "operabilno povezan" znači da je DNA sekvencija povezana kontinuiranoj, u slučaju sekretorne vodilje, kontinuirano u istom okviru čitanja. Povezivanje se izvodi ligacijom na pogodnim restrikcijskim mjestima. Ako takva mjesta ne postoje, sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri se upotrebljavaju u skladu s uobičajenom praksom.

"Egzogeni", kada se odnosi na jedan element znači nukleinsko kiselinska sekvencija koja je strana stanici, ili homologna stanici ali na mjestu u nukleinsko kiselinskoj sekvenci stanice domaćina na kojoj se taj element ne nalazi.

"Stanica", "stanična linija", "stanična kultura" se ovdje naizmjenično upotrebljavaju i ta obilježja uključuju sve matične stanice jedne stanice ili stanične linije. Tako, na primjer, termini kao "transformanti" i "transfprmirane stanica" uključuju primarnu stanicu o kojoj se radi i iz nje razvijene kulture bez obzira na broj transfera. Također se podrazumijeva da sve matične stanice ne moraju imati precizno isti DNA sadržaj, zbog namjerne ili nepredviđene mutacije. Mutirana matična stanica koja ima istu funkciju ili biološku aktivnost koja se ispituje u originalnoj transformiranoj stanici je također uključena. Tamo gdje se nalaze posebne oznake bit će to jasno iz konteksta.

"Plazmidi" su autonomno replicirajuće cirkularne DNA molekule koje imaju neovisne početke replikacije i ovdje su označeni s malim slovom "p" koje prethodi i/ili slijedi velikim slovima i/ili brojevima. Početni plazmidi ovdje naznačeni su ili komercijalno dostupni, javno poznati bez ograničenja, ili se mogu konstruirati iz tako dostupnih plazmida koji su poznati u struci i svakom stručnjaku ovog područja.

"Digestija restrikcijskim enzimima", kada se odnosi na DNA označava katalitičko cijepanje internih fosfodiesterskih veza u DNA s enzimom koji djeluje jedino na određenoj lokaciji ili mjestima DNA sekvencije. Takvi enzimi se nazivaju "restrikcijskim endonukleazama". Svaka restrikcijska endonukleaza raspoznaje specifičnu DNA sekvenciju koja se zove "restrikcijsko mjesto" koje pokazuje dvostranu simetriju. Različiti restrikcijski enzimi koji su ovdje upotrijebljeni su komercijalno dostupni i njihovi reakcijski uvjeti, kofaktori i druge osobine i zahtjevi su primjenjeni kako to proizvođač navodi.

Restrikcijski enzimi su uobičajeno označeni skraćenicama koje se sastoje od velikog slova iza kojeg slijede druga slova koja označuju mikroorganizam iz kojeg je svaki restrikcijski enzim originalno pribavljen i nakon toga broj koji označava određeni enzim. Općenito, oko 1 μg plazmida ili fragmenta DNA upotrebljava se s oko 1-2 jedinice enzima u oko 20μl pufera. Prikladni puferi i količine substrata za određeni restrikcijski enzim specificirani su od strane proizvođača. Inkubacija je najčešće trajala 1 sat na 37 °C, ali može varirati u skladu s uputama proizvođača. Nakon inkubacije, protein ili polipeptid se ukloni ekstrakcijom s fenolom ili kloroformom, i digerirana nukleinska kiselina se izdvoji iz vodene faze precipitacijom etanolom. Nakon digestije restrikcijskim enzimima može slijediti hidroliza bakterijskom alkalnom fosfatazom terminalnih 5' fosfata da se spriječi "cirkularizacija" DNA putem spajanja dvaju restrikcijski stvorenih krajeva, ili da se spriječi stvaranje unutrašnjih petlji što bi moglo ometati inserciju drugih DNA fragmenata u restrikcijskom mjestu. Osim ako nije drugačije naznačeno, digestija plazmida ne završava se 5' terminalnom defosforilacijom. Postupci i reagensi za defosforilaciju su uobičajeni kao što je opisano u poglavljima 1.56-1.61 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

"Iskorištenje" ili "izolacija" određenog fragmenta DNA iz smjese DNA nakon izvršene restrikcijske digestije znači separaciju produkata na poliakrilamidnom gelu ili agaroznom gelu elektroforezom, identifikacija fragmenta od interesa usporedbom njegove mobilnosti prema markerima DNA fragmenata poznate molekulske mase, uklanjanje sekcije gela koji sadrži traženi fragment i separaciju gela od DNA. Ovaj postupak je općenito poznat. Na primjer, vidi Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114[1980] i Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057[1980].

"Southern analiza" ili "Southern blotting" je metoda pomoću koje se može dokazati, postupkom hibridizacije s poznatom obilježenom oligonukleotidnom sekvencom ili fragmentom DNA, prisutnost DNA sekvencije u smjesi DNA nakon izvršene restrikcijske digestije, ili u DNA-sadržavajućoj kompoziciji. Southern analiza tipično uključuje elektroforetsko razdvajanje DNA fragmenata nakon izvršene restrikcijske digestije na agaroznom gelu, denaturaciju DNA nakon elektroforeze, transfer DNA na nitrocelulozu, najlon ili drugi prikladni membranski nosač za analizu s radioaktivno označenim, biotiniliranim, ili enzimski obilježenim sondama kao što je to opisano u poglavljima 9.37-9.52 u knijzi Sambrook et al., supra.

"Northern analiza" ili "northern blotting" je metoda koja se upotrebljava za identifikaciju sekvenci RNA koje mogu hibridizirati s poznatom sondom kao što su oligonukleotidi, fragmenti DNA, fragmenti cDNA ili njihovi fragmenti, ili fragmenti RNA. Sonda je obilježena radioizotopom kao što je 32P, ili biotinilacijom, ili s enzimom. RNA koja se analizira je najčešće elektroforetski separirana na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu, prebačena na nitrocelulozni najlon, ili drugu prikladnu membranu, ili hibridizirana sa sondom upotrebom standardnih tehnika koje su dobro poznate u struci kao što su one opisane u poglavljima 7.39-7.52 u knijzi Sambrook et al., supra.

"Ligacija" je proces stvaranja diesterskih veza između dvaju fragmenata nukleinskih kiselina. Za ligaciju dvaju fragmenata, krajevi fagmenata moraju biti kompatibilni jedan s drugim. U nekim slučajevima, krajevi mogu postati direktno kompatibilni nakon digestije endonukleazom. Međutim, može biti potrebno da se krajevi direktno stvoreni digestijom endonukleazom prvo modificiraju tako da postanu kompatibilni za digestiju. Za modifikaciju krajeva, DNA se obrađuje u pogodnom puferu barem 15 minuta na 15°C s oko 10 jedinica Klenow fragmenta DNA polimeraze 1 ili T4 DNA polimeraze u prisutnosti četiri deoksiribonukleozid trifosfata. DNA se nakon toga pročišćava ekstrakcijom fenol-kloroformom i precipitacijom etanolom. DNA fragmenti koje je potrebno vezati ligacijom se stavljaju u otopinu u podjednakim molarnim odnosima. U otopini se mora naći i ATP, pufer za ligazu i ligaza, kao na primjer T4 DNA ligaza u koncentraciji od oko 10 jedinica po 0,5 μg DNA. Ako je potrebno da se DNA veže ligacijom u vektor, vektor se mora najprije linearizirati digestijom uz odgovarajuću restrikcijsku endonukleazu(e). Linearizirani fragment se tada obrađuje bakterijskom alkalnom fosfatazom ili telećom crijevnom fosfatazom da se spriječi auto-ligacija za vrijeme postupka ligacije.

"Priprava" DNA iz stanica znači izoliranje plazmidne DNA iz kulture stanica domaćina. Najčešće upotrebljavane metode za pripravu DNA su velike i male preparacije plazmida koje su opisane u poglavljima 1.25-1.33 u knijzi Sambrook et al., supra. Nakon preparacije, DNA može biti pročišćena metodama koje su dobro poznate u struci i koje su opisane u u poglavlju 1.40 u knijzi Sambrook et al., supra.

"Oligonukleotidi" su polinukleotidi kratke dužine, jednolančani ili dvolančani koji su kemijski sintetizirani poznatim metodama (kao što su fosfotriester, fosfit, ili fosforamidit kemijskim metodama, upotrebom tehnika čvrste faze kao što su one opisane u EP 266,032 publiciranom 4 svibnja 1988, ili putem deoksinukleozid H-fosfonat međuprodukata kao što je opisano u Froehler et al., Nucl. Acids fleš., 14:5399-5407[1986]. Druge metode uključuju lančanu reakciju polimeraze koja je definirana kasnije i druge autoprimer metode i sintezu oligonukleotida na čvrstim podlogama. Sve su te metode opisane u Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 [1989].

Ove se metode upotrebljavaju ako je poznata kompletna sekvencija gena, ili ako je dostupna sekvencija nukleinskih kiselina koja je komplementarna kodirajućem lancu. Alternativno, ako je poznata ciljna aminokiselinska sekvencija moguće je odrediti potencijalnu sekvenciju nukleinskih kiselina uzimajući poznatu i poželjnu kodirajuću sekvenciju za svaki aminokiselinski ostatak. Oligonukleotidi se tada pročišćavaju na poliakrilamidnom gelu.

"Lančana reakcija polimeraze" ili "PCR" se odnosi na proceduru ili tehnike u kojima se minimalne količine specifičnog dijela nukleinske kiseline, RNA i/ili DNA umnožavaju kako je to opisano u US Patentu No 4,683,195 od 28 srpnja 1987. Općenito, koristi se informacija o sekvenci s kraja regije od interesa, ili ona izvan potrebnog dijela, tako da se mogu dizajnirati oligonukleotidne klice; ove klice će biti identične ili slične u sekvenci sa suprotnim lancima kalupa koji mora biti umnožen. 5' terminalni nukleotidi dvaju klica mogu koincidirati s krajevima materijala koji mora biti umnožen. PCR se može upotrijebiti da se umnoži specifična RNA sekvencija, specifična DNA sekvencija iz totalne DNA i cDNA koja je transkribirana s totalne stanična RNA, iz bakteriofaga ili iz plazmidne sekvencije. Vidi općenito Mullis et al., Cold of Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 [1987]; Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). U ovom tekstu, PCR se smatra jednim, ali ne jedinim primjerom lančane reakcije polimeraze koja se upotrebljava za umnožavanje uzorka nukleinskih kiselina, koji označava uporabu poznate nukleinske kiseline kao klice, i polimeraze nukleinskih kiselina da se umnoži ili stvori specifični komad nukleinske kiseline.

"Strogi uvjeti" su oni koji (1) uporabljuju nisku ionsku jakost kod visokih temperatura za ispiranje, na primjer 0,015 M NaCl/0,0015 M natrijev citrat/0,1% NaDodSO4 (SDS) pri 50°C, ili (2) uporabu denaturirajućeg agensa za vrijeme hibridizacije, kao što je formamid, na primjer, 50% (vol/vol) formamid s 0,1% goveđim serumskim albuminom/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirolidon/50 mM natrijev fosfatni pufer kod pH 6,5 sa 750 mM NaCI, 75 mM natrijev citrat pri 42°C. Drugi primjer je uporaba 50% formamida, 5x SSC (0,75 M NaCI, 0,075 M natrijev citrat), 50 mM natrijev fosfat (pH 6,8), 0,1% natrijev pirofosfat, 5x Denhartova otopina, DNA iz sonicirane sperme lososa (50 μg/ml), 0,1% SDS, i 10% dekstran sulfat kod 42°C, s ispiranjima pri 42°C u 0,2 x SSC i 0,1% SDS.

"Srednje strogi uvjeti" su opisani u knijzi Sambrook et al., supra, i uključuju uporabu otopine za ispiranje i uvjete za hibridizaciju (npr., temperaturu, ionsku jakost i % SDS-a) manje strogih od gore navedenih. Primjer srednje strogih uvjeta su inkubacija preko noći na 37 °C u otopini koja sadržava: 20% formamid, 5 x SSC (150 mM NaCI, 15 mM trinatrijev citrat), 50 mM natrijev fosfat (pH 7,6), 5x Denhardova otopina, 10% dekstran sulfat i DNA iz denaturirane usitnjene sperme lososa (20 μl/ml), nakon čega slijedi ispiranje filtera u 1 x SSC kod 37-50 °C. Vješti stručnjak će raspoznati kako treba prilagoditi temperaturu, ionsku jakost itd. da se zadovolje faktori kao što su dužina sonde i slično.

"Antitijela" (Abs) i "imunoglobulini" (Igs) su glikoproteini koji imaju neke strukturne karakteristike. Dok antitijela ispoljavaju specifičnost vezanja za određeni antigen imunoglobulini uključuju oboje i antitijela i druge antitijelima slične molekule koje nemaju antigenu specifičnost. Polipeptidi ove druge vrste su, na primjer, stvoreni u niskim količinama u limfnom sustavu, a u povećanim količinama u mijelomima.

"Nativna antitijela i imunoglobulini" su najčešće heterotetramerni glikoproteini od oko 150 000 daltona, sastoje se od dvaju identičnih lakih (L) lanaca i dvaju identičnih teških (H) lanaca. Svaki laki lanac je vezan za teški lanac jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira među teškim lancima različitih imunoglobulinskih izotipova. Svaki laki i teški lanac ima također pravilno postavljene disulfidne mostove unutar lanca. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilnu domenu (VH) nakon koje slijedi određeni broj konstantnih domena. Svaki laki lanac ima na jednom kraju varijabilnu domenu (VL), i konstantnu domenu na drugom kraju; konstantna domena lakog lanca je poravnata s prvom konstantnom domenom teškog lanca, a varijabilna domena lakog lanca je poravnata s varijabilnom domenom teškog lanca. Vjeruje se da određeni aminokiselinski ostaci stvaraju međupoviršinu između varijabilnih domena lakih i teških lanaca (Clothia et al., J.Mol.Biol., 186: 651-663 [1985]; Novotny i Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-4596 [1985]).

Termin "varijabilni" se odnosi na činjenicu da se određeni dijelovi varijabilnih domena značajno razlikuju u sekvenci između pojedinih antitijela, i da se upotrebljavaju u vezanju, i da su specifični za svako pojedino antitijelo za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije jednoliko raspoređena kroz varijabilnu domenu antitijela. Ona je koncentrirana u trima segmentima koji se zovu komplementarnim određujućim domenama (CDRs) ili hipervarijabilnim regijama u varijabilnim regijama i teških i lakih lanaca. Bolje konzervirani dijelovi varijabilnih domena se zovu kostur (FR). Svaka od varijabilnih domena nativnih teških i lakih lanaca sadržava po četiri FR regije, koje najčešće zauzimaju konformaciju p-nabora, te su povezane s trima CDR domenama, koje povezuju petlje, a u nekim slučajevima čine dijelove p-nabrane strukture. CDR domene se u svakom lancu drže zajedno na bliskoj udaljenosti pomoću FR regija i s CDR iz drugog lanca mogu doprinijeti stvaranju veznog mjesta za antigen na molekuli antitijela (vidi Kabat et at., Sequences of Proteins of Immunological Interesi, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). Konstantne domene nisu direktno uključene u vezanje antigena i antitijela, ali imaju različite efektorske funkcije, kao što je sudjelovanje antitijela u celularnoj toksičnosti koja ovisi o antitijelu.

Digestija antitijela papainom stvara dva identična fragmenta koji mogu vezati antigen, koji se zovu "Fab" fragmenti, svaki od kojih ima jedno mjesto za vezanje antigena, i ostatni "Fc" fragment, čije ime oslikava njegovu laku sposobnost kristalizacije. Obrada pepsinom daje F(ab')2 fragment koji ima dva mjesta za reakciju s antigenom i još je u mogućnosti za unakrsno vezanje antigena.

"Fv" je minimalni fragment antitijela koji sadrži cjelovita mjesta za prepoznavanje i vezanje antigena. Ova se regija sastoji od dimera kojeg čine varijabilna domena jednog teškog i jednog lakog lanca međusobno povezane čvrstom nekovalentnom asocijacijom. U ovoj konfiguraciji tri CDR dijela svake varijabilne domene interreagiraju tako da definiraju vezno mjesto za antigen na površini VH-VL dimera. Kolektivno uzevši, šest CDR dijelova omogućava specifičnost antigenog vezanja za antitijelo.

Fab fragment također sadržava i konstantnu domenu lakog lanca i prvu konstantnu domenu (CH1) teškog lanca. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata zbog dodatka nekoliko aminokiselinskih ostataka na CH1 domenu karboksilnog kraja teškog lanca, koji uključuju jedan ili više cisteina iz regije "šarke" antitijela. Fab'-SH je oznaka koja se ovdje odnosi na Fab' u kojoj cisteinski ostaci konstantne domene nose slobodne tiolne skupine. F(ab')2 fragmenti antitijela su originalno stvoreni kao parovi Fab' fragmenata koji imaju cisteine s ulogom "šarke" u sebi. Poznati su i drugi kemijski načini povezivanja fragmenata antitijela.

"Laki lanci" antitijela (imunoglobulina) iz bilo koje vrste kralježnjaka mogu biti svrstani u jedan od dva jasno razlučiva tipa, koji se zovu kapa i lambda (λ), na temelju aminokiselinske sekvencije njihove konstantne domene.

Ovisno o aminokiselinskoj sekvenci konstantne domene njihovog lakog i teškog lanca, imunoglobulini se mogu podijeliti u različite klase. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neki od navedenih mogu biti dalje podijeljeni u podklase (izotipove), npr. lgG-1, lgG-2, lgG-3 i lgG-4; lgA-1 i lgA-2. Konstantne domene teških lanaca koje odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se nazivaju α, delta, epsilon, γ i μ. Strukture podjedinica i trodimenzijske konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.

Termin "antitijela" se upotrebljava u najširem smislu i specifično pokriva jedinstvena monoklonalna antitijela (uključujući antagonistička i agonistička antitijela), pripravak antitijela s poliepitopskom specifičnosti, kao i fragmente antitijela (npr., Fab, F(ab')2 i Fv) sve dok oni pokazuju poželjnu biološku aktivnost.

Termin "monoklonalna antitijela" se upotrebljava ovdje da se označe antitijela koja su dobivena iz populacije u biti homogenih antitijela, a ta individualna antitijela su identična osim nekih prirodno izazvanih mutacija koje se mogu javiti u manjim količinama. Monoklonska antitijela su visoko specifična, usmjerena protiv jednog antigenog mjesta. Za razliku od konvencionalnih (poliklonalnih) preparacija antitijela, koje tipično uključuju različita antitijela usmjerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitijelo je usmjereno protiv jedne determinante na antigenu. Uz njihovu specifičnost, monoklonska antitijela imaju prednost da ih sintetiziraju kulture hibridoma stanica koje nisu kontaminirane drugim imunoglobulinima. Atribut monoklonalna indicira karakter antitijela koja su dobivena iz u biti homogene populacije antitijela, i ne znači produkciju antitijela na neki određeni način. Na primjer, monoklonalna antitijela koja se upotrebljavaju u iznesenom izumu mogu biti dobivena hibridoma metodom koja je prvi puta opisana od Kohlera i Milsteina, Nature, 256:495 (1975), ili može biti načinjena rekombinantnom DNA (vidi, npr., US Patent No. 4 816 567 [Cabilly et al.]).

Monoklonalna antitijela u ovom izumu specifično uključuju "kimerična" antitijela (imunoglobuline) u kojima je dio teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućoj sekvenciji antitijela koja su dobivena iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitijela, te fragmenti ukoliko pokazuju poželjnu biološku aktivnost US Patent No. 4 816 567 (Cabilly et al.); i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).

"Humanizirane" forme ne-humanih (npr. izoliranih iz laboratorijskih miševa i štakora) antitijela su kimerični imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge supstance ili antitijela koja vežu antigene) koja sadržavaju minimalnu sekvenciju koja je porijeklom iz non-humanih imunoglobulina. U svom većem dijelu, humanizirana antitijela su humani imunoglobulini (antitijela recipijenta) u kojima su ostaci iz komplementarne determinirajuće domene (CDR) recipijenta zamijenjena ostacima iz CDR ne-humane vrste (donorska antitijela) kao što je miš, štakor ili zec, koja imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim su slučajevima, aminokiselinski ostatci u kosturu Fv imunoglobulina čovjeka zamijenjeni odgovarajućim non-humanim ostacima. Humanizirana antitijela mogu sadržavati ostatke koji se ne mogu naći ni u antitijelima recipijenta, niti u dobivenim CDR domenama kostura. Ove modifikacije se rade da bi se rafinirali i optimizirali učinci antitijela. Općenito, humanizirana antitijela će uključivati sve, ili gotovo sve, od barem jedne, a tipično dvije varijabilne domene, u kojima sve, ili gotovo sve od CDR regija odgovara ne-humanim imunoglobulinima, a sve, ili gotovo sve od FR regija su humane imunoglobulinske konsensus sekvencije.

Humanizirana antitijela optimalno uključuju barem dio konstantne regije (Fc), tipično od humanog imunoglobulina. Za detaljniju informaciju vidi: Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986], Reichmann et al., Nature, 332:323-329[1986]; i Presta, Curr. Op. Struci. Biol., 2:593-596[ 1992]).

"Ne-imunogeničan u čovjeka" znači da se nakon kontakta polipeptida, u farmaceutski prihvatljivom nosaču i u terapijski efikasnoj količini s odgovarajućim tkivom čovjeka, ne stvara stanje osjetljivosti ili rezistencije na polipeptid, te se ne može dokazati nakon druge primjene polipeptida i nakon odgovarajućeg latentnog perioda (npr., 8 do 14 dana).

II. Glavne cjeline izuma

Glavni polipeptidi iz ovoga izuma su u biti homogeni polipeptid(i), označeni kao mpl-ligand(i) ili trombopoetin (TPO), koji posjeduju svojstvo vezanja za mpl, član superobitelji receptora citokina, i koji imaju biološko svojstvo stimuliranja inkorporacije radioaktivno obilježenih nukleotida (3H-timidina) u DNA Ba/F-3 stanica koje su ovisne o IL-3, a kojima je izvršena transfekcija humanog mpl P. Bolji mpl-ligandi su izolirani proteini sisavaca koji imaju hematopoetičku, osobito megakariocitopoetsku ili trombocitopoetsku aktivnost - odnosno oni koji su sposobni stimulirati proliferaciju, sazrijevanje i/ili diferencijaciju nezrelih megakariocita ili njihovih prethodnika u zrele forme koje stvaraju trombocite. Najbolji polipeptidi iz ovog izuma su humani mpl-ligand(i) i njihovi fragmenti koji imaju hematopoetsku, megakariopoetsku ili trombopoetsku aktivnost. Ponekad ovim humanim mpl-ligand(i)ma nedostaje glikozilacijski dio. Drugi važni humani mpl-ligand(i) su u stvari "EPO-domene" od hML, koje se označava kao hML153 ili hTPO-153, skraćene forme hML koje se označavaju kao hML245 ili hTPO245 i zreli polipepticl cjelovite dužine koji ima aminokiselinsku sekvenciju prikazanu na Sl. 1 (SEQ ID NO: 1), koji se označava kao hML, hML332 ili hTPO332 i biološki aktivne substitucijske varijante hML(R153A, R154A).

Mogući preferirani polipeptidi iz ovog izuma su biološki ili imunološki aktivne varijante mpl-liganda koje su selekcionirane iz hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML i pML2.

Mogući preferirani polipeptidi iz ovog izuma su biološki ili imunološki aktivne varijante mpl-liganda koje imaju aminokiselinsku sekvenciju koja ima barem 70% identičnosti s aminokiselinskom sekvencijom humanog mpl-liganda (vidi Sl.1 [ SEQ ID NO: 1], mpl-liganda iz laboratorijskih miševa i štakora, (vidi SI.16 [SEQ ID NOS: 12&13], rekombinantnog svinjskog mpl-liganda (vidi Sl.19 [SEQ ID NO: 18], ili mpl-liganda izoliranog iz plazme svinja koje imaju aplaziju, ili barem 75%, bolje 80%, još bolje 85%, ili još bolje barem 90%, a najbolje barem 95% identičnosti sekvencije.

Mpl-ligand izoliran iz plazme svinja koje imaju aplaziju ima slijedeće karakteristike:

(1) Djelomično pročišćeni ligand eluiran s kolone za gel filtraciju pojavit će se bilo u PBS, PBS koji sadrži 0,1% SDS ili PBS koji sadrži 4M MgCl2 s rel. mol. masom od 60 000-70 000;

(2) Aktivnost liganda se uništava pronazom;

(3) Ligand je stabilan na niskom pH (2,5), uz SDS do 0,1% i u 2M urei

(4) Ligand je glikoprotein, što je utvrđeno vezivanjem za različite kolone s lektinima;

(5) Visoko pročišćeni ligand eluira se s nereducirajućeg SDS-PAGE s rel. mol. masom od 25 000-35 000. Manje količine aktivnosti se također eluiraju kod rel. mol. masa od približno 18 000-22 000 i 60 000;

(6) Visoko pročišćeni ligand razdvaja se na reducirajućoj SDS-PAGE kao dublet s rel. mol. masom od 28 000 i 31 000;

(7) Aminoterminalna sekvencija u vrpcama od 18 000-22 000, 28 000 i 31 000 je ista:

SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 29); i

(8) Ligand se veže i eluira sa slijedećih afinitetnih kolona:

Blue-Sepharose,

CM Blue-Sepharose,

MONO-O.,

MONO-S,

Lentil lectin-Sepharose,

WGA-Sepharose,

ConA-Sepharose,

Ether 650m Toyopearl,

Butyl 650m Toyopearl,

Phenyl 650m Toyopearl, i

Phenyl-Sepharose.

Bolji mpl-ligandni polipeptidi su oni koji su kodirani humanom genomskom ili cDNA i koji imaju aminokiselinsku sekvenciju prikazanu na Sl. 1 (SEQ ID NO: 1).

Drugi preferirani biološki aktivni mpl-ligandni polipeptidi koji se mogu naći u prirodi iz ovog izuma uključuje prepro-mpl-ligand, pro-mpl-ligand, zreli mpl-ligand, fragmente mpl-liganda i njihove varijante s različitim stupnjem glikozilacije.

Još drugi preferirani polipeptidi iz ovog izuma uključuju mpl-ligandne sekvencije, varijante i kimere. Najčešće su preferirane varijante mpl-ligandne sekvencije biološki aktivne mpl-ligandne varijante koje imaju aminokiselinsku sekvenciju koja ima barem 70% identičnosti aminokiselinske sekvencije s humanim mpl-ligandom ili s mpl-ligandom koji je izoliran iz plazme svinja s aplazijom, poželjno barem 75%, bolje barem 80%, još bolje 85%, ili još bolje barem 90%, a najbolje barem 95%. Jedan primjerno poželjni mpl-ligandni oblik je N-terminalna domena hML varijante (koja se naziva "EPO-domena" zbog njene homologije u sekvenci s eritropoetinom). Preferirana hML EPO-domena sadržava otprilike prva 153 aminokiselinska ostatka zrelog hML i označena je kao hML153. Jedna od preferiranih hML varijanti sekvenci čini onu u kojoj je jedan ili više bazičnih ili dibazičnih aminokiselinskih ostataka (npr., hidrofobni, neutralni, kiseli, aromatski, Gly, Pro i si.). Preferirana varijanta hML C-terminalne domene ima sekvenciju u kojoj su Arg ostaci na poziciji 153 i 154 zamijenjeni s Ala ostacima. Ova varijanta je označena kao hML332 (R153A, R154A). Jedna druga preferirana hML varijanta sadržava bilo hML332 ili hML153 u kojoj su amiriokiselinski ostaci 111-114 (OLPP ili LPPO) bilo deletirani, bilo zamijenjeni s različitim sekvencijama tetrapeptida (npr., AGAG ili slično). Navedene delecijske mutante se označavaju kao ΔhML332 ili ΔhML-153.

Preferirana kimera je fuzijski produkt između mpl-liganda ili njegovog fragmenta (niže definiranog) s heterolognim polipeptidom ili njegovim fragmentom. Na primjer, hML153 može biti fuzioniran s IgG fragmentom da se produži vrijeme poluživota u serumu, ili s IL-3, G-CSF, ili s EPO da se stvori molekula s pojačanom trombopoetskom ili kimeričnom hematopoetskom aktivnosti.

Jedna alternativna preferirana humana mpl-ligandna kimera je "kimera ML-EPO domene" u kojoj su jedan ili više, ali ne svi aminokiselinski ostataci na pozicijama 153-157 iz N-terminusa hML supstituirani sa ostacima iz humane EPO domene kada su sekvencije približno uspoređene kako je to prikazano na SI.10 (SEQ ID NO:7). U ovoj cjelini, hML kimera će biti duga oko 153-166 ostataka u kojoj će pojedine aminokiseline ili blokovi aminokiselinskih ostataka iz humane EPO sekvencije biti dodani ili substituirani u hML sekvenciju na pozicijama koje odgovaraju usporedbi prikazanoj na SI. 10 (SEQ ID NO: 6). Primjerna sekvencija bloka koji će biti insertiran u porciju N-terminusa hML će uključivati jedno ili više mjesta za N-glikozilaciju na pozicijama (EPO) 24-27, 38-40, i 83-85; jedan ili više od četiri pretpostavljenih amfipatskih nakupina a-uzvojnica na pozicijama (EPO) 9-22, 59-76, 90-107 i 132-152; i drugih visoko sačuvanih regija koje uključuju regije N-terminusa i C-terminusa i ostatke na pozicijama (epo) 44-52 (vidi npr., Wen et al., Blood, 82:1507-1516 [1993] i Boissel et al., J. Biol. Chem., 268(21):15983-15993 [1993]). Smatra se da će ova "kimera ML-EPO domene" imati miješanu trombopoetsku-eritropoetsku (TEPO) biološku aktivnost.

Drugi preferirani polipeptidi iz ovog izuma uključuju fragmente mpl-liganda koji imaju konsekutivne sekvencije od barem 10, 15, 20, 25, 30, ili 40 aminokiselinskih ostataka koji su identični sekvenci mpl-liganda izoliranog iz plazme svinja s aplazijom ili humanog mpl-liganda koji je ovdje opisan (vidi npr. Tablicu 14, Primjer 24). Preferirani mpl-ligand je humani ML[1-X], gdje X predstavlja 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229, ili 245 (vidi Sl. 1 (SEQ ID NO: 1) za sekvencije ostataka 1-X). Drugi preferirani fragmenti mpl-liganda uključuju one koji se stvaraju kao rezultat kemijske ili enzimske hidrolize ili digestije pročišćenog liganda.

Drugi važni aspekt ovog izuma je metoda purifikacije mpl-liganda koja uključuje interakciju izvora mpl-liganda koji sadržava mpl-ligand, s imobiliziranim polipeptidnim receptorom, specifično mpl ili mpl-fuzijskim polipeptidom, pod uvjetima kada su molekule mpl-liganda koje će biti pročišćene selektivno adsorbirane na imobiliziranom polipeptidnom receptoru, ispiranje imobilizirane podloge da se ukloni ne-adsorbirani materijal, i eluiranje molekule koje će biti pročišćene s imobiliziranog polipeptidnog receptora pomoću pufera za eluiranje. Izvor koji sadrži mpl-ligand može biti plazma gdje je najbolje da je imobilizirani receptror fuzijski produkt mpMgG.

Alternativno, izvor koji sadrži mpl-ligand može biti rekombinantna stanična kultura gdje je koncentracija mpl-liganda u mediju za kulturu ili u staničnom lizatu općenito veća nego u plazmi ili drugim prirodnim izvorima. U ovom slučaju, gore navedena mpMgG imunoafinitetna metoda, iako je još uvijek uspješna, nije nužna i druge uobičajene, tradicionalne metode pročišćavanja proteina mogu biti primijenjene. Ukratko, najbolja metoda purifikacije za dobivanje u biti homogenog mpl-liganda sastoji se od: uklanjanja nečistoća veličine čestica, bilo stanica domaćina ili fragmenata nastalih lizom, putem, na primjer centrifugiranja ili ultrafiltracije; ponekad se protein može ukoncentrirati komercijalnim filterom za pročišćavanje proteina; nakon čega slijedi razdvajanje liganda od drugih nečistoća pomoću jednog ili više stupnjeva selekcioniranog između imunoafinitetne kromatografije, ionske izmjene, (npr., DEAE ili matrice koje sadrže karboksimetil ili sulfopropilne skupine), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-0, MONO-S, Sepharose s lektinom iz leće, WGA-Sepharose, ConA-Sepharose, Ether Tovpearl, Butyl Toypearl, Phenyl Toypearl, protein A Sepharose, SDS-PAGE, visokotlačna tekućinska kromatografija reverzne faze, (npr., silika gel s nadodanim alifatskim skupinama), ili molekularno sito Sephadexa, ili kromatografija za odjeljivanje čestica određenih veličina, ili precipitacija etanolom ili amonijevim sulfatom. Inhibitori proteaza kao što je metilsulfonilfluorid (PMSF) mogu se primjeniti u navedenim postupcima, da se irihibira proteoliza tijekom reakcija pročišćavanja.

U drugom svom važnom dijelu ovaj izum daje način izolacije antitijela koje se veže na mpl-ligand. Najbolja antitijela koja se vežu na mpl-ligand su monoklonalna (Kohler i Milstein, Nature, 256:495-497 [1975]; Cambell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et a/., Eds, Volume 13, Elsevier science Publishers, Amsterdam [1985]; Huse et al., Science, 246:1275-1281 [1989]. Najbolja od antitijela koja se vežu na mpl-ligand su ona koja se vežu na mpl-ligand s afinitetom od barem oko 106 l/mol. Još je bolje ako antitijelo veže mpl-ligand s afinitetom od barem oko 107 l/mol. Najbolje je ako antitijela koja vežu mpl-ligand imaju neka od gore navedenih svojstava. Izolirana antitijela koja vežu mpl-ligand mogu ponekad biti fuzionirana sa sekundarnim polipeptidom i antitijela ili njihov fuzijski produkt se mogu upotrijebiti za izolaciju i pročišćavanje mpl-liganda iz izvora kao što je ovdje opisano za stvaranje (mobiliziranih mpl-polipeptida. U slijedećem važnom dijelu ove cjeline, izum iznosi metodu za određivanje mpl-liganda in vitro i in vivo koja se sastoji od interakcije antitijela i uzorka, naročito uzorka seruma za koji se sumnja da sadrži ligand i određuje se da li je došlo do vezanja.

U slijedećoj važnoj cjelini, ovaj izum daje način izolacije molekule nukleinske kiseline koja kodira mpl-ligand ili njegove fragmente, a ta nukleinska kiselina može biti obilježena ili neobilježena dijelom koji se može detektirati, i nukleinska kiselina koja ima komplementarnu sekvenciju, ili hibridizira pod strogim ili srednje strogim uvjetima s molekulom nukleinske kiseline koja kodira mpl-ligand. Najbolje molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju mpl-ligand su RNA ili DNA koje kodiraju biološki aktivan mpl-ligand, a koje dijele barem 75% identičnosti sekvencije, bolje barem 80%, još bolje barem 85%, još bolje barem 90%, a najbolje 95% identičnosti sekvencije s humanim mpl-ligandom. Preferirane izolirane molekule nukleinskih kiselina su molekule DNA koje kodiraju biološki aktivan mpl-ligand, izolirane iz : (a) DNA bazirane na kodirajućoj regiji gena sisavaca za mpl-ligand (npr. DNA koja ima nukleotidnu sekvenciju prikazanu na SI. 1 (SEQ ID NO: 2), ili njihove fragmente); (b) DNA koja hibridizira s DNA (a) pod barem srednje strogim uvjetima; i (c) DNA koja je degenerirana u odnosu na DNA definirane pod (a) ili (b) što je rezultat degeneriranosti genetičkog koda. Smatra se da novi mpl-ligandi koji su ovdje opisani mogu biti članovi obitelji Uganda ili citokina koji imaju odgovarajuću identičnost sekvencije tako da njihova DNA može hibridizirati s DNA sa Sl. 1 (SEQ ID NO: 2) (ili komplement njihovih fragmenata) pod blagim ili srednje strogim uvjetima hibridizacije. Tako slijedeći aspekt ovog izuma uključuje DNA koje hibridiziraju pod blagim ili srednje strogim uvjetima hibridizacije s DNA koja kodira mpl-ligandne polipeptide.

U slijedećem važnom dijelu ove cjeline, molekula nukleinske kiseline može biti cDNA koja kodira mpl-ligand i dalje uključuje replikabilni vektor u kojemu je cDNA operativno vezana na kontrolnu sekvenciju koju raspoznaje domaćin koji je transformiran vektorom. Ovaj aspekt dalje uključuje stanice domaćina koje su transformirane vektorom i metodu uporabe cDNA da se utječe na stvaranje mpl-liganda, a koja se sastoji od ekspresije cDNA koja kodira mpl-ligand u kulturi transformiranih stanica domaćina i izdvajanje mpl-liganda iz kulture stanica domaćina. Mpl-ligand koji je pripravljen na ovaj način je u suštini homogeni humani mpl-ligand. Poželjne stanice domaćina za produkciju mpl-liganda su stanice ovarija kineskog hrčka (CHO).

Ovaj izum dalje uključuje izabranu metodu za obradu sisavaca koji imaju imunološke ili hematološke poremećaje, naročito trombocitopeniju, te uključuje primjenu terapijski aktivnih količina mpl-liganda sisavcima. Ponekad se mpl-ligand daje u kombinaciji s citokinima, naročito faktorom koji stimulira kolonije ili interleukinom. Izabrani faktori koji stimuliraju kolonije uključuju; kit-ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, l L-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, ili IL-11.

III. Metode priprave

Dugo se smatralo da je produkcija trombocita kontrolirana višestrukim lozama specifičnih humoralnih faktora. Smatralo se da dvije pojedinačne aktivnosti citokina, koje su označavane kao faktor koji stimulira kolonije megakariocita (meg-CSF) i trombopoetin reguliraju megakariocitopoezu i trombocitopoezu (Wiliams et al., J. Celi Physiol., 110:101-104 [1982]; Williams et al., Blood Cells, 15:123-133 [1989] i Gordon et al., Blood, 80:302-307 [1992]). Prema ovoj hipotezi, meg-CSF stimulira proliferaciju progenitor megakariocita dok trombopoetin primarno utječe na sazrijevanje više diferenciranih stanica i na konačno otpuštanje trombocita. Od 1960.-ih indukcija i pojavljivanje meg-CSF i trombopoetinskih aktivnosti u plazmi, serumu i urinu životinja i ljudi nakon trombocitopeničnih epizoda je obilno dokumentirano (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Haematol, 54:340-344 [ 1975] Specter et al., Proc. Soc. Exp. Biol., 108:146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Cim. Invest, 49:1709-1713 [1970]; Ebbe et al., Blood, 44:605-608 [1974]; Hoffman et al., N. Engl. J. Med, 305:533 [1981]; Straneva et al., Exp. Haematol., 17:1122-11127 [ 1988]; Mazur al., J. din. Invest, 68:733-741 [1981] Mazur et al., Exp. Haematol., 13:1164 [1985]; Sheiner et al., Blood, 56:183-188 [1980] Hill et al., Exp. Haematol., 20:354-360 [1992]; Hegyi et al., Internat. J. Celi Cloning., 8:236-244 [1990]). Smatra se da su ove aktivnosti specifične za lozu i različite od poznatih citokina (Hill RJ. et al., Blood, 80:346 [1992]; Erickson-Miller C.L. et al., Brit. J. Haematol, 84:197-203 [1993]; Straneva J.E. et al., Exp. Haematol., 20:4750 [1992] i Tsukada al., Blood, 81:866-867[1993]). Do sada su pokušaji da se pročisti meg-CSF ili trombopoetin iz trombocitopenične plazme ili urina bili neuspješni.

U skladu s navedenim opisom za trombocitopeničnu plazmu mi smo ustanovili da plazma svinja s aplazijom (APP) koja je dobivena od ozračenih svinja stimulira humanu megakariocitopoezu in vitro. Mi smo ustanovili da se ovaj stimulatorni učinak može poništiti pomoću solubilne vanstanične domene c-mpl, što potvrđuje da je APP potencijalni izvor pretpostavljenog mpl-liganda (ML). Mi smo sada uspješno pročistili mpl-ligand iz APP i aminokiselinska sekvencija je upotrijebljena za izolaciju humane, svinjske i iz glodavaca dobivene ML cDNA. Ovi ML uzorci imaju homologiju sekvencije s eritropoetinom i imaju obje i meg-CSF-u i trombopoetinu-sličnu aktivnost.

1. Pročišćavanje i identifikacija mpl-liganda iz plazme

Kao što je već bilo naglašeno, smatra se da aplastična plazma različitih životinjskih vrsta sadrži aktivnost koja stimulira hematopoezu in vitro, no međutim nema podataka da je do sada iz plazme izoliran stimulatorni hematopoetski faktor. Jedan izvor aplastične plazme je plazma ozračenih svinja. Ova plazma svinja s aplazijom (APP) stimulira humanu hematopoezu in vitro. Za ispitivanje prisutnosti mpl-liganda u aplastičnoj plazmi (APP), njezini su učinci određivani mjerenjem inkorporacije 3H-timidina u Ba/F3 stanice kojima je izvršena transfekcija humanim mpl P (Ba/F3-mplJ, postupkom koji je prikazan na Sl.2. AAP je stimulirala inkorporaciju 3H-timidina u Ba/F3-mpl stanice, ali ne u kontrolne Ba/F3 stanice (tj. one kojima nije izvršena transfekcija humanim mpl P). Dodatno, takva aktivnost nije opažena ni za normalnu plazmu. Ovi rezultati ukazuju da APP sadrži faktor(e) koji prenose proliferativni signal putem mpl-receptora i da zbog toga mogu biti prirodni ligandi ovog receptora. Ovo je dalje poduprto nalazom da obrada APP topljivim mpl-lgG blokira stimulatorne efekte APP na Ba/F3-mpl stanice.

Izgleda da je aktivnost APP proteinske prirode jer pronaza, DTT ili toplina uništavaju aktivnost iz APP (Sl. 3). Ova se aktivnost ne može ukloniti dijalizom. Aktivnost je otporna na niski pH (pH 2,5 kroz 2 sata) i pokazano je da se veže i može biti eluirana s više lektinskih afinitetnih kolona, što ukazuje da je riječ o glikoproteinu. Zbog daljnjeg objašnjavanja strukture ona je pročišćena iz APP upotrebom mpl-lgG kimere.

APP je obrađen prema postupku koji je iznesen u Primjerima 1 i 2. Ukratko, mpl-ligand je pročišćen upotrebom kromatografije bazirane na hidrofobnim interakcijama, kromatografije bazirane na imobiliziranoj boji, i mpl-afinitetnoj kromatografiji. Iskorištenje aktivnosti u svakom stupnju je prikazano na Sl. 4 i faktor pročišćenja je prikazan u Tablici 1. Ukupna iskoristivost nakon mpl-afinitetne kromatografije iznosila je oko 10%. Frakcija s najvećom aktivnosti (F6) s mpl-afinitetne kolone je imala pretpostavljenu aktivnost od 9,8 x 106 jedinica/mg. Cjelokupno pročišćavanje iz 5 litara APP je otprilike 4 x 106 puta (od 0,8 jedinica/mg do 3,3 x 106 jedinica/mg) s redukcijom mase proteina 83 x 106 puta (od 250 g na 3 mp/g). Mi pretpostavljamo da je specifična aktivnost liganda eluiranog s mpl-afinitetne kolone negdje oko 3 x 106 jedinica/mg.

[image]

Analiza eluiranih frakcija s mpl-afinitetne kolone pomoću SDS-PAGE (4-20%, Novex gel) koja je vođena pod reducirajućim uvjetima, pokazala je prisutnost više proteina (Sl.5). Proteini koji su se obojali srebrom s najačim intenzitetom razdvojili su se s približnim rel. mol. masama 66 000, 55 000, 30 000, 28 000 i 18 000-22 000. Da se odredi koji od ovih proteina stimulira proliferaciju stanične kulture Ba/F3-mpl, proteini su eluirani s gela kako je to opisano u Primjeru 2.

Rezultati eksperimenta su pokazali da je većina aktivnosti eluirana s dijela gela koji je sadržavao proteine s rel. mol. masama od 28 000-32 000, i slabiju aktivnost koja je eluirana u području gela od 18 000-22 000 (Sl.6). Jedini proteini koji su vidljivi u ovom području su imali rel. mol. mase 30 000, 28 000 i 18 000-22 000. U svrhu identifikacije i dobivanja proteinske sekvencije proteina koji su se razdvojili u ovoj regiji gela (tj. vrpce na 30, 28, i 18-22 kDa), ova tri proteina su prenesena procesom "electro-blotting" na PVDF i sekvencionirani kao što je to opisano u Primjeru 3. Sekvencija amino-terminalnog kraja je prikazana na Tablici 2.

[image]

Analizom uz pomoć računala se pokazalo da se radi o novoj sekvenci. Kako su sve tri sekvencije bile iste, vjeruje se da su 30 kDa, 28 kDa i 18-22 kDa proteini međusobno srodni i da bi mogli biti različite forme istog novog proteina. Nadalje, ovaj protein(i) su vjerojatni kandidati za prirodni mpl-lgand jer je aktivnost razdvojena na SDS-PAGE u istom području (28 000-32 000) na 4-20% gelu. Dodatno, djelomično pročišćeni ligand je putovao s rel. mol. masama od 17 000 - 30 000, kada je bio podvrgnut gel filtracijskoj kromatografiji upotrebom Superose 12 (Pharmacia) kolone. Vjeruje se da forme s različitim rel. mol. masama nastaju kao rezultat proteolize, ili razlika u glikozilaciji, ili drugih post ili pre-translacijskih modifikacija.

Kao što je prije pokazano RNA s antisens sekvencom humanog mpl-liganda sprečava megakariocitopoezu u kulturi humane koštane srži koja je obogaćena s CD 34 + progenitor stanicama bez da utječe na druge hematopoetske stanične loze (Methia et al., supra). Ovaj rezultat sugerira da mpl-receptor može igrati važnu ulogu u diferencijaciji i proliferaciji megakariocita in vitro. U cilju daljnjeg objašnjavanja uloge mpl-liganda u megakaricitopoezi, uspoređeni su utjecaji APP i APP iz kojega je uklonjen mpl-ligand, na in vitro humanu megakariocitopoezu. Utjecaj APP na humanu megakariocitopoezu je određen primjenom modifikacije postupka tekuće suspenzije megakariocitopoeze kako je to opisano u Primjeru 4. U ovom su pokusu humane periferne stem stanice (PSC) obrađene s APP prije i nakon mpl-lgG afinitetne kromatografije. GPIIbIIIa stimulacija megakariocitopoeze je kvantificirana pomoću antitijeja 125l-anti-IIbIIIa (Sl. 7). Na Sl. 7 je pokazano da 10% APP uzrokuje približno 3-struku stimulaciju, dok APP iz kojega je uklonjen mpl-ligand ne uzrokuje proliferaciju Ba/F3-mpl stanica. U drugom pokusu, topljivi humani mpl-lgG, dodan na dane 0, 2 i 4, kulturama stanica koje sadrže 10% APP, neutralizira stimulatorni efekt kojeg stvara APP na regulaciju humane megakariocitopoeze (Sl. 8). Ovi rezultati ukazuju da mpl-ligand igra određenu ulogu u regulaciji humane megakariocitopoeze i da zbog toga može biti koristan u terapiji trombocitopenije.

2. Molekularno kloniranje mpl-liganda

Na temelju aminokiselinske sekvencije aminoterminalnog dijela dobivenog iz proteina rel. mol. mase 30 kDa, 28 kDa i 18-22 kDa (vidi Tablicu 2), dva degenerirana skupa oligonukleotidnih klica bila su dizajnirana i upotrijebljena da se umnoži svinjska genomska DNA korištenjem PCR. Bilo je zaključeno da će duljina ispravnog PCR produkta iznositi 69 parova baza, ukoliko je aminokiselinska sekvencija aminoterminalnog dijela Kodirana jednim jedinim eksonom. DNA fragment ove dužine bio je nađen i subkloniran u pGEMT. Sekvencija oligonukleotidnih klica za PCR, te triju dobivenih klonova prikazana je u Primjeru 5. Aminokiselinska sekvencija (PRLLNKLLR [SEQ ID N0:3] polipeptida kodiranog između PCR klica bila je identična onoj koja je dobivena aminoterminalnim sekvencioniranjem liganda iz svinje (vidi gore, ostatke 9-17 za 28 i 30 kDa sekvencije proteina iz svinje).

Sintetički oligonukleotid koji se temelji na sekvenciji PCR fragmenta upotrijebljen je da se izvrši pretraživanje humane genomske DNA biblioteke. 45-merni oligonukleotid, označen kao pR45, dizajniran je i sintetiziran na temelju sekvencije PCR fragmenta. Ovaj oligonukleotid je imao slijedeću sekvenciju:

5' GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-ACG-AAGCAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3'

(SEQ ID NO:34)

Ovaj deoksioligonukleotid je upotrijebljen za pretraživanje humane genomske DNA knižnice u Xgem12 pod uvjetima niske strogosti hibridizacije i uvjetima ispiranja prema Primjeru 6. Pozitivni klonovi su izdvojeni, pročišćeni na plakovima i analizirani restrikcijskim mapiranjem i "southern blottingom". EcoRI-Xbal fragment dug 390 parova baza koji je hibridizirao s 45-mernim oligonukleotidom je subkloniran u pBluescript SK-. DNA sekvencioniranje ovog klona potvrdilo je da je izolirana DNA koja kodira humani homolog svinjskog mpl-liganda. Humana DNA sekvencija i deducirana aminokiselinska sekvencija je prikazana na Sl. 9 (SEQ ID NOS: 3 i 4). Pretpostavljena pozicija introna u genomskoj sekvenci je također indicirana strelicama, i definiran je pretpostavljeni ekson ("ekson 3").

Na temelju sekvencije humanog "eksona 3" (Primjer 6) sintetizirani su oligonukleotidi koji odgovaraju 3' i 5' kraju eksona. Ove 2 klice su upotrijebljene u reakciji PCR uz upotrebu kalupa cDNA koji je pripravljen iz različitih ljudskih tkiva. Očekivana dužina točnog PCR produkta bila je 140 parova baza. Nakon analize PCR produkata na 12% poliakrilamidnom gelu, fragment DNA očekivane dužine je identificiran u cDNA bibliotekama pripremljenim iz odraslog humanog bubrega, fetalnih bubrežnih stanica 293 i cDNA humane fetalne jetre.

cDNA biblioteka fetalne jetre (7x106 klonova) u lambda DR2 je nakon toga pretražena pomoću istog 45-mernog oligonukleotida koji je upotrijebljen i za pretraživanje humane genomske biblioteke i cDNA biblioteke fetalne jetre, te hibridizirana pri uvjetima niske strogosti. Izdvojeni su pozitivni klonovi, pročišćeni na plakovima i dužina inserta je određena pomoću PCR metode. Jedan klon s insertom dugim 1,8 kb bio je odabran za daljnju analizu. Upotrebom procedure opisane u Primjeru 7 određena je nukleotidna i deducirana aminokiselinska sekvencija humanog mpl-liganda (hML). Ove sekvencije su prikazane na SI. 1 (SEQ ID NOS: 1 i 2).

3. Struktura humanog mpl-liganda (hML)

Sekvencija cDNA humanog mpl-ligand (hML) (Sl.1) [SEQ ID NO:2] sadrži 1774 nukleotida nakon čega slijedi poli(A) rep. Ona sadrži 215 nukleotida 5' netranslatirane sekvencije i 3' netranslatiranu regiju od 498 nukleotida. Pretpostavljeni inicijacijski kodon na nukleotidnoj poziciji (216-218) je unutar konsenzus sekvencije koja je povoljna za inicijaciju eukariotske translacije. Sekvencija s otvorenim okvirom čitanja je duga 1059 nukleotida, te kodira polipeptid od 353 aminokiselinskih ostataka, koji počinje s nukleotidom na poziciji 220. Pretpostavljena sekvancija N-terminalnog kraja je jako hidrofobna i vjerojatno odgovara signalnom polipeptidu. Kompjutorska analiza pretpostavljene sekvancije (von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133:17-21 [1983] naznačuje potencijalna mjesta cijepanja za signalnu peptidazu između aminokiselinskih ostataka 21 i 22. Cijepanje na tom mjestu će osloboditi zreli polipeptid od 332 aminokiselinska ostatka s početkom amino-terminalnog kraja dobivenog od mpl-liganda koji je pročišćen iz svinjske plazme. Pretpostavljena mol. masa ne-glikozilirane molekule s 332 aminokiselinska ostatka je oko 38 kDa. Postoji 6 potencijalnih N-glikozilacijskih mjesta i 4 cisteinska ostatka.

Usporedba sekvencije mpl-liganda s podacima iz Genbanke sekvenci je pokazala 23% identičnosti između 153 amino terminalnih ostataka zrelog mpl-liganda i humanog eritropoetina (Sl. 10 [SEQ ID NOS: 6 i 7]). Kada se uzmu u obzir konzervativne supstitucije, ova regija hML pokazuje 50% sličnosti s humanim eritropoetinom (hEPO). Obadva i hEPO i hML sadrže četiri cisteina. Tri od četiri cisteina su konzervirani u hML, uključujući prvi i krajnji cistein. Eksperimentima ciljane mutageneze je pokazano da prvi i krajnji cistein u eritropoetinu stvaraju disulfidnu vezu koja je nužna za ispoljavanje funkcije (Wang, F.F. et al., Endocrinology 116:2286-2292[1983]). Prema analogiji, prvi i krajnji cistein u hML mogu stvarati kritičnu disulfidnu vezu. Niti jedno od glikozilacijskih mjesta nije konzervirano u hML. Sva potencijalna N-vezana glikozilacijska mjesta u hML su locirana u karboksi-terminalnoj polovici hML polipeptida.

Slično kao kod hEPO, mRNA iz hML ne sadrži konsenzusnu poliadenilacijsku sekvenciju AAUAAA, niti regulatorni element AUUUA koji je prisutan u 3' netranslatiranom dijelu mnogih citokina i za koji se smatra da utječe na stabilnost mRNA (Shaw et al., Celi, 46:659-667[1986]). Analiza "northern blottingom" je pokazala nisku razinu jedinstvenog hML RNA transkripta dugog 1,8 kb i u fetalnoj i u odrasloj jetri. Nakon dužeg izlaganja, slabija vrpca iste duljine može se uočiti u odraslom bubregu. Zbog usporedbe, humani eritropoetin se eksprimira u fetalnoj jetri, i kao odgovor na hipoksiju u odrasloj jetri i bubregu (Jacobs et al., Nature, 313:804-809[1985] i Bondurant et al., Molec.Cell. Biol., 6:2731-2733[1986]).

Važnost C-terminalne regije hML još uvijek nije razjašnjena. Na temelju postojanja 6 potencijalnih mjesta za N-vezanu glikozilaciju i sposobnosti da se veže za lektinske afinitetne kolone, ova regija hML je vjerojatno glikozilirana. U nekim gel elucijskim eksperimentima smo ustanovili aktivnost koja se može razdvojiti kod rel. mol. masa od oko 60 000, što može predstavljati glikoziliranu molekulu pune dužine. C-terminalna regija tako, može služiti za stabilizaciju i produljenje poluživota cirkulirajućeg hML. U slučaju eritropoetina, ne-glikozilirana forma ima punu biološku aktivnost in vitro, ali ima značajno skraćeno vrijeme poluživota u plazmi u odnosu na glikozilirani eritropoetin (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265:12127-12130[1990]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266:23022-23026[1991] i Spivack et al., Blood, 7:90-99[1989]). C-terminalna domena hML sadrži dvije di-bazične aminokiselinske sekvencije [Arg-Arg motive na pozicijama 153-154 i 245-246] koji mogu služiti kao potencijalna mjesta za procesiranje. Cijepanje na ovim mjestima može biti odgovorno za stvaranje formi hML s rel. mol. masom od 30, 28 i 18-22 kDa koje su izolirane iz APP. Značajno je da se sekvencije Arg153-Arg154 javljaju neposredno nakon domene ML koja je nalik eritropoetinu. Ova opažanja nagovještavaju da ML pune duljine može predstavljati prekursorski protein koji se podvrgava ograničenoj proteolizi i tako stvara zreli ligand.

4. Izoforme i varijante humanog mpl-liganda

Izoforme ili alternativno "splicingom" dobivene forme humanog mpl-liganda su utvrđene uporabom PCR metode u odrasloj humanoj jetri. Ukratko, sintetizirane su klice koje odgovaraju svakom kraju kao odabranoj unutarnjoj regiji kodirajuće sekvencije hML. Ove su klice uporabljene u RT-PCR metodi da se umnoži RNA odrasle humane jetrene RNA kao što je to opisano u Primjeru 10. Osim forme koja ima punu duljinu, koja se označava kao hML, tri druge forme, koje se označavaju kao hML2, hML3, i hML4 su opažene ili deducirane. Deducirana zrela aminokiselinska sekvencija svih četiriju izoformi je prikazana na SI. 11 (SEQ ID NOS: 6, 8 i 10). hML3 ima deleciju dugu 116 nukleotida na poziciji 700 koja ima za posljedicu deleciju aminokiselina i pomak okvira čitanja. cDNA sada kodira zreli polipeptid koji je dug 265 aminokiselina i koji se razlikuje od hML sekvencije na aminokiselinskom ostatku 139. Konačno, hML4 ima oboje deleciju 12 nukleotida nakon pozicije 618 (također nađena u sekvenci kod miša i svinje [vidi niže]) i deleciju 116 parova baza koja se može naći u hML3. Premda u čovjeka nisu izolirani klonovi koji sadrže deleciju 12 parova baza (nakon nukleotida 619), postoji vjerojatnost da ova forma egzistira jer je takva izoforma identificirana kod miša i svinje (vidi niže), i zbog toga jer je identificirana zajedno s delecijom 116 nukleotida u hML4.

Obje supstitucijske varijante hML u kojima je di-bazična aminokiselinska sekvencija Arg153-Arg154 zamijenjena s dva alaninska ostatka "EPO-domene" odvojene od hML, su konstruirane da se odredi da li je puna duljina ML neophodna za biološku aktivnost. Supstitucijska varijanta di-bazične aminokiselinske sekvencije Arg-153-Arg-154 koja se označava kao hML(R153A, R154A) je konstruirana upotrebom PCR kako je to opisano u Primjeru 10. Forma kojoj je odstranjena "EPO-domena", hML153, je također pripravljena uporabom PCR uz uvođenje stop kodona nakon Arg153.

5. Ekspresija rekombinantnog humanog mpl-liganda u stanicama bubrega humanog embriona (293) na kojima je izvršena prolazna transfekcija

U cilju potvrđivanja da klonirana humana cDNA kodira ligand za mpl, ligand je eksprimiran u stanicama sisavaca 293 pod kontrolom direktnog ranog promotora citomegalovirusa, upotrebom ekspresijskih vektora pRK5-hML ili pRK5-hML153 Ustanovljeno je da nadsloj kulture stanica bubrega humanog embriona (293) na kojima je izvršena prolazna transfekcija stimulira inkorporaciju 3H-timidina u Ba/F3-mpl stanice, ali ne u roditeljske Ba/F3 stanice (SI.12A). Mediji od 293 stanica kojima je izvršena transfekcija sa samim pRK vektorom nisu sadržavali ovu aktivnost. Dodatak mpl-lgG u medij spriječio je stimulaciju (rezultati nisu izneseni). Ovi rezultati pokazuju da klonirana cDNA kodira funkcionalni humani ML (hML).

U cilju utvrđivanja da li "EPO-domena" sama može vezati i aktivirati mpl, skraćena forma hML, rhML153 je eksprimirana u stanicama 293. Nadslojevi kulture stanica kojima je izvršena transfekcija su imali aktivnost sličnu onoj koja je prisutna u nadslojevima kulture stanica koje su eksprimirale hML pune dužine (SI.12A), ukazujući da C-terminalna domena ML nije potrebna za vezanje i aktivaciju c-mpl.

6. mpl-ligand stimulra magakariocitopoezu i trombopoezu

Obje forme, i forma pune dužine rhML i skraćena forma rhML-153 rekombinantnog hML su stimulirale humanu trombocitopoezu in vitro (SI.12B). Ovaj učinak je opažen u odsutnosti drugih egzogeno dodanih hematopoetskih faktora rasta. Uz izuzetak IL-3, ML je jedini hematopoetski faktor rasta, od onih koji su testirani, a koji je ispoljio ovu aktivnost. IL11, IL-6, IL-1, eritropoetin, G-CSF, IL-9, LIF, kit-ligand (KL), M-CSF, OSM i GM-CSF nisu imali učinka na megakariocitopoezu kada su bili testirani pojedinačno u našim pokusima (rezultati nisu prikazani). Ovi rezultati pokazuju da ML ima megakariocit-stimulirajuću aktivnost, i ukazuje na ulogu ML u regulaciji magakariocitopoeze.

Pokazano je da trombopoetska aktivnost koja je prisutna u plazmi trombocitopeničnih životinja stimulira produkciju trombocita u mišjem povratnom trombocitoznom pokusu (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1011 [1973] i McDonald et al., Scand. J. Hematol., 16:326-334[1976]). U ovom je modelu izazvana akutna trombocitopenija u miševa, upotrebom specifičnog antitrombocitnog seruma, koja je stvorila predvidivu povratnu trombocitozu. Ovi miševi s imuno-trombocitemijom su bolje odgovarali na egzogene trombopoetinu-slične aktivnosti nego normalni miševi (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1011 [1973]), upravo kao što su eksipoksični miševi više osjetljivi na eritropoetin nego normalni miševi (McDonald et al., J. Lab.Clin Med., 77:134-143[1971]). U svrhu određivanja da li rML stimulira stvaranje trombocita in vivo, miševima s povratnom trombocitozom je injiciran djelomično pročišćeni rhML. Nakon toga je određen broj trombocita i inkorporacija 35S u trombocite. Kada se miševima injicira 64000 ili 32000 jedinica rML značajno poraste produkcija trombocita, što je prikazano kao porast broja trombocita od oko 20% (p=0,0005 i 0,0001), i oko 40% porasta inkorporacije 35S u trombocite (p=0,003) tretiranih miševa, u odnosu na kontrolnu skupinu kojoj je bilo injicirano jedino otapalo (SI.12C). Ovaj stupanj stimulacije je usporediv s onim koji je opažen s IL-6 u ovom modelu (rezultati nisu prikazani). Primjena količine od 16000 jedinica rML nije značajno stimulirala produkciju trombocita. Ovi rezultati pokazuju da ML stimulira produkciju trombocita na način koji ovisi o dozi, te zbog toga posjeduje trombopoetinu-sličnu aktivnost.

Stanicama 293 je također bila izvršena transfekcija drugim izoformama hML, koje izoforme su gore opisane, te je s odgovarajućim nadslojevima izvršen test proliferacije Ba/F3-mpl (vidi SI.13) hML2 i hML3 nisu pokazali nikakvu mjerljivu aktivnost u ovom pokusu, međutim aktivnost hML(R153A, R154A) se pokazala sličnom onoj od hML i hML153, pokazujući da procesiranje na Arg153-Arg154 dibazičnom mjestu nije nužno, niti odlučujuće za aktivnost.

7. Megakariocitopoeza i mpl-ligand

Pretpostavlja se da je megakariocitopoeza regulirana na višestrukim staničnim razinama (Williams et al., J.Celi Physiol., 110:101-104[1982]). Ovo mišljenje se većinom zasniva na opažanju da određeni hematopoetski faktori rasta stimuliraju proliferaciju megakariocitnih matičnih stanica, dok drugi prvenstveno utječu na sazrijevanje. Rezultati prikazani u ovom radu sugeriraju da ML djeluje dvostruko, kao faktor za stimulaciju proliferacije i sazrijevanja. Tvrdnja da ML stimulira proliferaciju megakariocitnih matičnih stanica je višestruko potvrđena. Prvo, APP stimulira oboje, proliferaciju i sazrijevanje humanih megakariocita in vitro, i ova se stimulacija može kompletno inhibirati pomoću mpl-lgG (SI.7 i 8). Nadalje, inhibicija stvaranja megakariocitnih kolonija pomoću c-mpl antisens oligonukleotida (Methia et aL., Blood, 82:1395-1401 [1993]) i nalaz da c-mpl može prenijeti proliferativni signal u stanice u koje je unesen transfekcijom (Skoda et al., EMBO, 12:2645-2653[1993] i Vigon eT aL., Oncogene, 8:2607-2615[1993] ) također ukazuju da ML stimulira proliferaciju. Očevidna ekspresija c-mpl za vrijeme svih stadija diferencijacije megakariocita (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) i sposobnost rekombinantnog ML da brzo stimulira stvaranje trombocita in vivo ukazuje da ML također stimulira sazrijevanje. Raspoloživost rekombinantnog ML omogućava pažljivo vrednovanje njegove uloge u regulaciji megakariocitopoeze i trombopoeze kao i njegov potencijal da utječe na druge hematopoetske loze pod uvijetima niske strogosti ili visoke strogosti zajedno s fragmentom koji odgovara 3' polovici humane cDNA koja kodira mpl-ligand. Izolirana su dva preklapajuća lambda klona koji pokrivaju 35 kb. Dva preklapajuća fragmenta (BamH1 i EcoRI) koji sadrže cjelokupni TPO gen bila su subklonirana i sekvencirana (vidi SI. 14A, 14B i 13C).

Struktura humanog gena pokazuje da se on sastoji od 6 eksona unutar 7 kb genomske DNA. Granice svih dodirnih točaka ekson/intron su u skladu s konsensus motivom utvrženim za gene sisavaca (Shapiro, M. B. et ai, Nucl. Acid. Res., 15:7155 [1987]). Ekson 1 i ekson 2 sadrže 5' netranslatiranu sekvencu i 4 početne aminokiseline signalnog peptida. Ostatak sekretornog signala i prvih 26 aminokiselina zrelog proteina kodirani su eksonom 3. Cjelokupna karboksi domena i 3' netranslatirana, kao i oko 50 aminokiselina signalne sekvence eritropoetina.

9. Ekspresija i pročišćavanje TPO iz 293 stanica

Priprava i pročišćavanje ML ili TPO iz 293 stanica opisano je detaljno u Primjeru 19. Ukratko, cDNA koja odgovara cjelokupnoj sekvenciji TPO u otvorenom okviru čitanja je dobivena primjenom PCR korištenjem pRK5-hmpl l. Produkt PCR je pročišćen i kloniran između restrikcijskih mjesta Clal i Xbal plazmida pRKStkneo (pRK5 vektor modificiran tako da ekprimira gen na rezistenciju prema neomicinu pod kontrolomtimidin promotora timidin kinaze), pri čemu nastaje vektor pRK5tkneo.ORF (vektor koji kodira cjeli otvoreni okvir čitanja).

Drugi vektor, koji kodira EPO homolognu domenu, generiran je na ista način, ali korištenjem druge PCR klice da bi se dobio konačni konstrukt nazvan pRKStkneo EPO-D.

S ta dva konstrukta je izvedena transfekcija u stanice bubrega humanog embriona metodom s kalcij-fosfatom, a klonovi rezistentni na neomicin su odabrani i ostavljeni da rastu do konfluencije. Stupanj ekspresije M L153 ili Ml332 iz tih klonova je određen u kondicioniranom mediju, korištenjem testa proliferacije Ba/F3-mpl.

Pročišćavanje rhMl332 izvedeno je kako je opisano u Primjeru 19. Ukratko, 293-rhML332 kondicionirani medij je nanesen na kolonu Blue-Sepharose (Pharmacia) koja je isprana s puferom koji sadrži 2 M ureu. Kolona je eluirana puferom koji sadrži 2 M ureu i 1 M NaCI. Sakupljeni eluat s Blue-Sepharose je izravno nanesen na kolonu WGA-Sepharose, prano je s 10 volumena kolone pufera koji sadrži 2 M ureu i 1 M NaCI, te je eluirano istim puferom koji sadrži 0.5 M N-acetil-D-glukozamina. Eluat s WGA-Sepharose je nanesen ja C4-HPLC kolonu (Synchrom, Inc.) i eluirano je diskontinuiranim gradijentom propanola. Na SDS-PAGE pročišćeni 293-rhML332 migrira u obliku široke vrpce u regiji gela od 68-80 kDa (vidi SI. 15).

Pročišćavanje rhML153 je također provedeno kao što je opisano u Primjeru 19. Ukratko, 293-rhMI153 kondicionirani medij je razdvojen na Blue-Sepharose kao što je opisano za 293-rhMI332. Eluat s Blue-Sepharose je izravno nanesen na mplafinitentnu kolonu, kao što je gore opisano. RhML153 eluiran s mplafinitentne kolone je pročišćen do homogenosti korištenjem C4-HPLC kolone pod istim uvjetima kao rhMI332. Na SDS-PAGE pročišćeni 293-rhMI153 razdvaja se u dvije glavne i dvije manje vrpce s Mr oko 18000-22000 (vidi SI. 15).

10. mpl-ligand laboratorijskih miševa i štakora

DNA fragment koji odgovara kodirajućoj regiji humanog mpl liganda dobiven je korištenjem PCR, pročišćen je elektroforezom na gelu i obilježen u prisutnosti 32P-ATP i 32-dCTP. Ta proba je korištena za pretraživanje 106 klonova cDNA biblioteke jetre miša u XGT10. Klon laboratorijskog miša ili štakora (SI. 16 [SEQ ID NO: 12 i 13]) koji sadrži insert od 1443 bp je izoliran i sekvenciran. Pretpostavljeni inicijacijski kodon kod nukleotida u položaju 137-141 nalazi se u konsenzus sekvenciji koja je bitna za inicijaciju translacije kod eukariota (Kozak, M. J. Celi Biol., 108:229-241 [1989]). Ta sekvencija definira otvoreni okvir čitanja od 1056 nukleotida, i predviđa primarni translacijski produkt s 352 aminokiseline. U okruženju tog otvorenog okvira čitanja su 137 nukleotida na 5' i 247 nukleotida na 3' netranslatiranoj sekveniciji. Ne postoji poli(A) rep koji slijedi 3' netranslatirnu regiju, pokazujući da klon možda nije komletan. N-terminalni kraj predviđene sekvencije aminokiselina je vrlo hidrofiban i vjerojatno predstavlja signalni peptid. Kompjutorska analiza (von Heijne, G. Eur. J. Biochem., 133:17-21 [1983]) pokazuje da je potencijalno mjesto cijepanja za siganlnu peptiazu između aminokiselinskih ostataka 21 i 22. Cijepanje bi u tom položaju generiralo zreli polipeptid s 331 aminokiseline (35 kDa), identificiran kao mML331 (ili mML2 zbog dolje navedenih razloga). Sekvencija sadrži 4 cisteina, koji su svi konzervirani u humanoj sekvenciji, a sedam potencijalnih mjesta za N-glikozilaciju, od kojih su 5 konzervirani u humanoj sekvenciji. Isto kao s hML, svih sedam potencijalnih mjesta za N-glikozilaciju su smještena na C-terminalnoj polovici proteina.

Usporedbom s humanim ML uočen je znčajan stupanj identičnosti za obje, za nukleotidnu i deduciranu sekvenciju aminokiselina u "EPO-domeni" tih ML. Međutim, kada su uspoređene deducirane aminokiselinske sekvencije humanog i mišjeg ML, vidjelo se da je u sekvenciji miša deletiran tetrapeptid između ostataka 111-114, koji odgovara deleciji 12 nukleotida iza položaja 618, a uočena je i u humanoj (vidi gore) i u svinjskoj (vidi niže) cDNA. Prema tome, istaživani su dodatni klonovi da bi se utvrdile moguće ML izoforme laboratorijskih miševa i štakora. Jedan klon, koji kodira deduciranu polipeptdinu sekvenciju od 335 aminokiselina, sadrži tetrapeptid LPLQ koji "nedostaje". Za taj oblik se vjeruje da je ML laboratorijskih miševa i štakora pune duljine, i označen je kao mML ili mML335. Nukleotid i deducirana aminokselinska sekvencija za mML prikazani su na SI. 17 (SEO ID NO: 14 i 15). Taj cDNA klon sastoji se od 1443 parova baza nakon čega slijedi poli(A) rep. On sadrži 1068 db u otvorenom okviru čitanja u okruženju 134 baza na 5' i 241 baza na 3' netranslatirarioj sekvenciji. Pretpostavljeni inicijacijski kodon se nalazi položaju nukleotida138-140. Otvoreni okvir čitanja koji kodira pretpostaljeni protein s 356 aminokiselina, od kojih su prvih 21 vrlo hidrofobne i vjerojatno imaju funkciju sektricski signal.

Konačno, izoliran je i sekvenciran treći klon laboratorijskih miševa i štakora i nađeno je da ima deleciju od 116 nukleotida koji odgovaraju hML3. Taj izoform laboratorijskih miševa i štakora je stoga nazvan mML3. Usporedba deduciranih arniriokiselinskih sekvencija od ta dva izoforma prikazana je u SI. 18 (SEQ ID NO: 9 i 16).

Ukupna identičnost humanih i mišjih amnokiselinskih sekvencija ML (SI. 19 [SEQ ID NO: 6 i 17]) je 72%, ali homologija nije jednolično raspoređena. Regija definirana kao "EPO-domena" (aminokiseline 1-153 u humanoj sekvenciji i 1-149 u mišjoj) je bolje sačuvana (86% homologije) nego karboksi-terminalna regija proteina (62% homologije). Ovo nadalje može ukazivati na to da je samo "EPO-domena" važna za biološku aktivnost proteina. Zanimljivo je da od dva dibazna aminokiselinska motiva nađena u hML, samo dibazni motiv koji odmah slijedi iza "EPO-domene" (položaja ostatka 153-154) prisutan u humanoj sekvenciji se nalazi i u sekvenciji laboratorijskih miševa i štakora. To je u skladu s mogućnošću da ML pune duljine predstavlja prekursor proteina koji podliježe ograničenoj proteolizi generirajući zreli ligand. Alternativno se proteoliza između Arg153Arg154 može olakšati otpuštanje.

Vektor za ekspresiju koji sadrži ukupnu kodirajući sekvenciju mML upotrijebljen je za prolaznu transfekciju u 293 stanice kao što je opisano u Primjeru 1. Kondicionirani medij od tih stanica stimulirao je ugradnju 3H-timidina u Ba/F3 stanice koje eksprimiraju ili humani mplili mpl laboratorijskih miševa ili štakora, a pri tome nije imao utjecaj na roditeljsku staničnu liniju (bez mpl). Ovo pokazuje da klonirani cDNA ML laboratorijskih miševa ili štakora kodira funkcionalni ligand koji može aktivirati i humani ML receptor (mpl) i receptor laboratorijskih miševa ili štakora.

11. Svinjski mpl ligand

Svinjska cDNA ML (pML) izoliran je korištenjem RACE PCR kao što je opisano u Primjeru 13. PCR cDNA produkt dug 1342 parova baza je nađen u bubregu i subkloniran je. Nekoliko klonova je sekvencirano i nađeno je da kodiraju svinjski mpl ligand dug 332 aminokiselinska ostatka koji su nazvani pML (ili pML332), a imaju nukletid i deduciranu aminokiselinsku sekvenciju koja je prikazana na SI. 20 (SEQ ID NO: 18 i 19).

Identificiran je drugi oblik, obilježen kao pML2, koji isto kodira protein kojem su deletirana 4 aminokiselinska ostatka (228 aminokselinska ostatka) (vidi SI. 21 [SEQ ID NO: 21]). Usporedba pML i pML2 aminokiselinskih sekvencija pokazuje da je drugi oblik identičan osim za tetrapeptid OLPP koji odgovara ostacima 111-114 uključivo, koji su deletirani (vidi SI. 22 [SEQ ID NO: 18 i 21]). Delecija četiri aminokiseline uočena u cDNA svinjskig ML i ML laboratorijskih miševa i štakora pojavljuju se na potpuno istom mjestu u predviđenim proteinima.

Uspredba predviđene zrele aminokiselinske sekvencije humanog, mišjeg i svinjskog ML (SI. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 i 18]) pokazuje da je identičnost ukupne sekvencije 72% između mišje i humane, 68% između mišje i svinjske i 73% između svinjske i humane. Homolognost je znatno veća u amino-terminlanoj polovici ML (EPO homologna domena). Ta domena je 80 do 84% identična između bilo koje dvije vrste, dok je C-teminalna polovica (ugljikohidratna domena) samo 57 do 67% identična. Dibazni aminokiselini motiv koji može predstavljati mjesto cijepanja proteazom je prisutan na karboksilnom kraju homologne domene eritropoetina. Taj motiv je konzerviran u tri specije u ovom položaju (SI. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 i 18]). Drugo dibazno mjesto prisutno u položaju 245 i 246 humane sekvencije nije prisutno u mišjoj i svinjskoj sekvenciji. ML sekvencija svinje i laboratorijskih miševa i štakora sadrži 4 cisteina i svi su konzervirani u humanoj sekvenciji. Ima sedam potencijalnih mjesta za N-glikozilaciju u mišjem ligandu i šest u svinjskom ML, od kojih su 5 konzervirani u humanoj sekvenciji. Ponovo su sva potencijalna mjesta za N-glikozilacijusmještena u C-terminalnoj polovici proteina.

12. Ekspresija i pročišćavanje TPO iz stanica ovarija kineskog hrčka (CHO)

Vektor za ekspresiju korišten za transfekciju CHO stanica je označen pSVIS.ID.LL.MLORF (puna duljina ili TPO332) i pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (odrezan ili TPO-153). Svojstva ovih plazmida prikazana su na SI. 23 i 24.

Postupak transfekcije opisan je u Primjeru 20. Ukratko, cDNA koja odgovara cijelom otvorenom okviru čitanja TPO je dobivena korištenjem PCR.

PCR produkt je čišćen i kloniran između restrikcijskih mjesta (Clal i Sali) plazmida pSVI5.ID.LL, da bi se dobio vektor pSVIS.ID.LL.MLORF. Drugi konstrukt koji odgovara EPO homolgnoj domeni je generiran na isti način, ali uz korištenje različite reverzne klice (EPOD.Sal). Konačni konstrukt za vektor koji kodira EPO homolgnu domenu TPO označen je pSVI5.ID.LL.MLEPo-D.

Ova dva konstrukta su linearizirani s Noti i izvedena je transfekcija elektroporacijom u stanice ovarija kinseskoh hrčka (CHO-DP12 stanice, EP 307,247 objavljen 15. ožujka 1989). 107 stanica elektroporirano je u BRL aparatu za elektroporiranje (350 V, 330 mF, niski kapacitet) u prisutnosti 10, 25 ili 50 mg DNA kao što je opisano (Anderson, G. L. J. Tissue Cult. Meth., 15, 56 [1993]). Dan nakon transfekcije, stanice su radijeljene u DHFR selektivne medije (visoka koncentracija glukoze DMEM-F12 50:50 bez glicina, s 2 mM glutamina, 2-5% dializiranog seruma telećeg fetusa). Nakon 10 do 15 dana na individualnim kolonijama izvršena je transfekcija na ploči s 96 jažica i ostavljeno je da rastu do konfluencije. Ekpresija ML-153 ili ML332 u kondicioniranom mediju ovih klonova praćena je korištenjem testa proliferacije Ba/F3-mpl (opisan u Primjeru 1).

Proces pročišćavanja i izolacije TPO iz sakupljene tekućine stanične kulture CHO opisan je u Primjeru 20. Ukratko, sakupljena tekućina stanične kulture HCCF nanesena je na kolonu Blue Sepharose (Pharmacia) u omjeru približno 100 mL HCCF na litru smole. Kolona je zatim prana s 3 do 5 volumena kolone pufera, a zatim s 3 do 5 volumen kolone pufera koji sadrži 2.0 M ureu. TPO je eluiran s 3 do 5 volumen kolone pufera koji sadrži 2.0 M ureu i 1.0 M NaCI.

Sakupljeni eluat s Blue Sepharose koji sadrži TPO je zatim nanesen na kolonu Wheat Germ Lectin Sepharose (Pharmacia) koja je ekvilibrirana u puferu za eluiranje s Blue Sepharose u omjeru 8 do 16 mL eluata s Blue Sepharose po mL smole. Kolona je zatim prana s 2 do 3 volumena kolone puferom za ekvilibriranje. TPO je zatim eluiran s 2 do 5 volumena kolone pufera koji sadrži 2.0 M ureu i 0.5 M N-acetil-D-glukozamin.

Eluat s Wheat Germ Leitin koji sadrži TPO je zakiseljen i dodan je C12E8 do konačne koncentracije 0.04%. To je naneseno na C4 kolonu reverzne faze ekvilibriranu u 0.1% TFA, 0.04% C12E8, a naneseno je oko 0.2 do 0.5 mg proteina po mL smole.

Protein je eluiran u dvofaznom linearnom gradijentu acetonitrila koji sadrži 0.1% TFA i 0.04% C12E8, a protein je sakupljen na osnovu SDS-PAGE.

Sakupljeni eluat s C4 je zatim razrijeđen i diafiltriran prema približno 6 volumena pufera na Amicorn YM ili na ultrafiltracijskoj membrani koja propušta molekularne mase manje od 10000 do 30000 Daltona. Nastali diafiltrat može se koristiti izravo ili dalje koncentrirati ultrafiltracijom. Diafiltrat/koncentrat je obično podešen tako da konačna koncentracija Tween-80 bude 0.01%.

Cjela količina ili dio diafiltrata/koncentrata što je ekvivalentno 2 do 5% proračunatog volumena kolone, nanesena je na Sephacryl S-300 HR kolonu (Pharmacia) ekvilibriranu u puferu koji sadrži 0.01% Tween-80 i kromatogratirano je. Frakcije koje sadrže TPO bez agregata i produkata proteolitičke razgranje su sakupljene na osnovu SDS-PAGE. Spojeni eluati su filtrirani i čuvani pri 2-8 °C.

13. Metoda za transformaciju i indukciju sinteze TPO u mikroorganizmu i izolazija, pročišćavanje i nabiranje tako pripravljenog TPO

Konstrukcija vektora za ekspresiju TPO u E. colli opisana je deteljno u Primjeru 21. Ukratko, plazmidi pMP21, pMP151, pMP41, pMLP57 i pMP202 su dizajnirani da eksprimiraju prvih 155 aminokiselina TPO nizvodno od male vodeće sekvencije koja može biti različita kod različitih konstrukata. Vodeće sekvencije prvenstveno omogućuju visoki stupanj inicijacije translacije i brzo pročišćavanje. Plazmidi pMP210-1. -T8, -21. -22. -24. -25 dizajnirani su da eksprimiraju prvih 153 aminokiselina TPO nizvodno od početnog metionina i razlikuju se samo u upotrebi kodona za prvih 6 aminokiselina od TPO, dok je plazmid pMP251 derivat pMP210-1 u kojem je karboksi-terminalni kraj TPO produljen za dvije aminokiseline. Svi gornji plazmidi producirat će visoku razinu intracelularne ekspresije TPO u E colli nakon indukcije triptofanskih promotora (Yasura, D. G. et al., Methods in Enzymology (Geoddel, D. V. izd.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmidi pMP1 i pMP172 su međuprodukti u konstrukciji gornjih intracelularnih plazmida za ekspresiju.

Gornji TPO plazmidi za ekspresiju su korišteni za transformaciju E. colli koristeći CaCl2 metodu toplinskog šoka (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53:159-162, [1970] i druge postupke koji su opisani u Primjeru 21. Ukratko, transformirane stanice su uzgajane 2-3 h pri 37 °C do optičke gustoće 600 nm. Kultura je zatim razrijeđena i nakon rasta uz propuhivanje zraka, dodana je kiselina. Ostavljeno je da kultura dalje raste uz propuhivanje zraka slijedećih 15 h, nakon čega su stanice sakupljene i centrifugirane.

Niže prikazani postupci izolacije, pročišćavanja i nabiranja kod priprave biološki aktivnog nabranog humanog TPO ili odgovarajućeg fragmenta, dani su niže i u Primjerima 22 i 23, a mogu se primjeniti za dobivanje bilo koje TPO varijante uključujući produljene oblike na N- i C-teminalnim krajevima. Drugi postupci pogodni za nabiranje rekombinantnog ili sintetiskog TPO mogu se naći u slijedećim patentima: Builder et al., U.S. Patent 4,511,502, Jones et al., U.S. Patent 4,518,526, Olson U. S. Patent 4,518,526 i Builder et al., U.S. Patent 4,620,948; i općeniti opisi dobivanja i nabiranja raznih rekombinantnih proteina eksprimiranih u netopljivom obliku u E. colli.

A. Dobivanje netopljivog TPO

Mikroorganizam kao što je E. colli koji eksprimira TPO kodiran pomoću bilo kojeg pogodnog plazmida, je fermantiran pod uvjetima u kojima je TPO pohranjen u obliku netopljivih "refraktilnih čestica". Stanice se mogu po želji prvo prati u puferu za razaranje stanica. Tipično se oko 100 g stanica suspendira u oko 10 volumena pufera za razaranje stanica (t.j. 10 mM Tris, 5 mM EDTA pH 8) s primjerice Polvtron homogenizatorom i stanice su centrifugi rane kod 5000 x g 30 minuta. Stanice su zatim lizirane korištenjem konvencionalnih tehnika kao što je: osmotski šok, soniciranje, ciklična promjena tlaka, kemijske ili enzimske metode. Primjerice, oprani stanične talog može biti resuspendiran u još 10 volumena pufera za razaranje stanica s homogenizatorom i suspenzija stanica prolazi kroz LH Celi Disrupter (LH Inceltech, Inc.) ili kroz Microfluidizer (Microfluidizer International) prema postupku proizvođača. Čestice koje sadrže TPO su odijeljene od tekuće faze i mogu se prati s bilo kojom pogodnom tekućinom.

Primjerice, suspenzija lizata stanica može se centrifugirati, resuspendirati i po mogućnosti drugi put centrifugirati da se dobije talog refraktilnih čestica. Oprani talog se može odmah koristiti ili se može čuvati zaleđen (pri npr. -70 °C).

B. Otapanje i čišćenje monomernog TPO

Netopljivi TPO u talogu refraktilnih čestica je zatim otopljen u puferu za otapanje. Pufer za otapanje sadrži kaotropsko sredstvo i obično je puferiran kod bazičnog pH, a sadrži i reducirajući agens da bi se povećao prinos monomerne TPO. Predstavnici kaotropnih sredstava uključuju ureu, gvanidin-HCI i natrij-tiocijanat. Preferirano kaotropno sredstvo je gvanidin-HCI. Koncentracija kaotropnog sredstva je obično 5-9 M, preferirano 6-8 M. pH pufera za otapanje je održavan pri bilo kojim prikladnim puferom u rasponu pH od oko 7.5-9.5, preferirano od 8.0-9.0, a najviše preferirano 8.0. Pufer za otapanje preferirano sadrži reducirajuće sredstvo koji pomaže stvaranju monomernog oblika TPO. Pogodno reducirajuće sredstvo uključuje organske spojeve koji sadrže slobodnu tiol skupinu (RSH). Predstavnici redukcijskog sredstava uključuju ditiotreitol (DTT), ditioeritriol (DTE), merkaptoetanol, glutation (GSH), cisteinamin i cistein. Preferirano sredstvo za redukciju je ditiotreitol (DTT). Pufer za otapanje može sadržavati i blago oksidacijsko sredstvo (npr. molekuski kisik) i sol sulfita za stvaranje monomerne TPO putem sulfitolize. U okviru ovog izuma nastali TPO-S sulfonat je kasnije nabran u prisutnosti redoks pufera (npr. GSH/GSSG) pri čemu nastaje izpravno nabrani TPO.

TPO protein je obično dalje čišćen korištenjem primjerice centrifugiranja, gel filtracijske krommatografije i kolonske kromatografije reverzne faze.

Na način kako je već pokazano, u slijedećim postupcima nastaje monomerni TPO u dovoljnom iskorištenju. Talog refraktilnih čestica je resuspendiran u oko 5 volumena pufera za otapanje po jedinici mase (20 mM Tris pH 8 s 6-8 M gvanidinom i 25 mM DTT) i miješano je 1-3 h ili preko noći pri 4 °C, dok se TPO protein ne otopi. Visoka koncentracije uree (6-8 M) također je učinkovita, ali je općenito iskorištenje manje nego s gvanidinom. Nakon otapanja, otopina je centrifugirana kod 30000 x g 30 minuta, pri čemu nastaje bistri supernatnat koji sadrži denaturirani monomerni TPO protein. Supernatant je zatim kromatografiran na Superdex 200 gel filtracijskoj koloni (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) kod brzine protoka 2 mL/min. i protein je eluiran s 20 mM Na fosfatnim puferom pH 6.0 s 10 mM DTT. Frakcije koje sadrže monomerni denaturirani TPO protein eluirane su između 160 i 200 mL, te su sakupljene. TPO protein je zatim čišćen na semipreparativnoj C4 koloni reverzne faze (2 x 20 cm VVDAC). Uzorak je nanesen pri 5 mL/min na kolonu koja je ekvilibrirana u 0.1% TFA (trifluoroctena kiselina) s 30% acetonitrila. Protein je eluiran linearnim gradijentom acetonitrila (30-60% kroz 60 minuta). Pročišćeni reducirani protein eluiran je kod približno 50% acetonitrila. Taj materijal je korišten za nabiranje da bi se dobila biološki aktivna TPO varijanta.

C. Nabiranje TPO da bi nastao biološki aktivan oblik

Nakon otapanja i daljnjeg pročišćavanja, biološki aktivni oblik TPO dobiven je nabiranjem denaturianog monomernog TPO u redoks puferu. Zbog velike aktivnosti TPO (polumaksimalna stimulacija u Ba/F3 testu postignuta je kod približno 3 pg/mL), moguće je dobiti biološko aktivni materijal korištenjem mnogih različitih pufera, detergenata i redoks uvjeta. Međutim, u većini uvjeta dobivena je samo mala količina ispravno nabranog materijala (<10%). Za komercijalnu proizvodnji poželjno je da iskorištenje nabiranja bude najmanje 10%, preferirano 30-50%, a posebno preferirano >50%. Nađeno je da su mnogi detergenti, uključujući Triton X-100, dodecil-β-maltozid, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozil, Tween 20 i Tween 80, Zvvittergent 3-14 i drugi pogodni za pripravu barem nešto izpravno nabranog materijala. Od tih detergenata najpreferiraniji su, međutim, oni iz CHAPS skupine (CHAPS i CHAPSO1), za koje je nađeno da doprinose reakciji nabiranja i da ograničuju agregaciju proteina i sprječavaju tvorbu neispravnih disulfidnih veza. Najpreferiranija koncnetracija CHAPS je veća od 1%. Za najbolje iskorištenje bio je potreban natrij-klorid s optimalnom koncentracijom između 0.1 M i 0.5 M. Prisutnost EDTA (1-5 mM) i redoks puferu također je preferirana, da bi se ograničila metalom katalizirana oksidacija (i agregacija) koja je uočena u nekim pripravcima. Optimalni uvjeti za nabiranje dobiveni su s glicerolom čija je koncentracija veća od 15%. Za maksimalna iskorištenja nužno je da se redoks par sastoji od oksidiranog i reduciranog organskog tiola (RSH). Pogodni redoks parovi uključuju merkaptoetanol, glutation (GSH), cisteiamin, cistein i njihove odgovarajuće oksidirane oblike. Preferirani redoks parovi su glutation (GSH)/oksidirani glutation (GSSG) ili cistein/cistin. Najpreferiraniji par je glutation(GSH)/oksidirani glutation (GSSG). Općenito je uočeno veće iskorištenje kad je molarni omjer oksidiranog oblika bio isti ili u suvišku prema reduciranom obliku. pH vrijednost između 7.5 do oko 9 bila je optimalna za nabiranje ovih TPO varijanata. Organska otapala (npr. etanol, acetonitril, metanol) mogu biti prisutna u koncentracijama 10-15% i nižim. Velike koncentracije organskih otapala povećavaju količinu neispravno nabranih oblika. Općenito su korisni Tris i fosfatni puferi. Inkubacijom pri 4 °C također se povećava količina ispravno nabranih TPO.

Iskorištenja nabiranja od 40-60% (temeljeno na količini korištenog reduciranog i denaturiranog TPO u reakciji nabiranja) tipična su za pripravu TPO koji je pročišćen u C4 koraku. Aktivni materijal može se dobiti i kada se koristi manje čisti priravak (npr. odmah nakon Superdex 200 kolone ili nakon početne ekstrakcije refraktilnih čestica), mada su iskorištenja niža zbog velike količine taloga koji stupa u interakciju s proteinima koji nisu TPO tijekom procesa nabiranja TPO.

Kako TPO sadrži 4 ostatka cisteina, moguće je stvaranje tri različite disulfidne varijante tog proteina.

varijanta 1: disulfidi između cisteinskih ostataka 1-4 i 2-3

varijanta 2: disulfidi između cisteinskih ostataka 1-2 i 3-4

varijanta 3: disulfidi između cisteinskih ostataka 1-3 i 2-4

Tijekom početnih istraživanja u kojima su određivani uvjeti za nabiranje, razdvojeno je više različitih vršaka koji su sadržavali TPO protein upotrebom kromatografije C4 reverzne faze. Samo je jedan od tih imao značajnu biološku aktivnost, koja je utvrđena korištenjem Ba/F3 testa. Uvjeti za nabiranje su se postupno mijenjali tako da prvenstveno nastane ta varijanta. Pod tim uvjetima količina krivo nabranih varijanata bila je manja od 10-20% od ukupnog monomernog TPO dobivenog u stupnju otapanja.

Spektrometrijom mase i sekvenciranjem proteina određeno je da je mjesto disulfida biološki aktivnog TPO 1-4 i 2-3, pri čemu su cisteini numerirani od amino-terminalnog kraja. Taj tip unakrsnog povezivanja cisteina u skladu je s poznatim strukturama dislufida odgovarajućih eritroproteina.

D. Biološka aktivnost rekombinantnog nabranog TPO

Nabran i pročišćen TPO pokazuje aktivnost i pri in vitro i pri in vivo testovima. Primjerice, u Ba/F3 testu, polumaksimalna stimulacija ugradnje timidina u Ba/F3 stanice postignuta je kod 3.3 pg/mL (0.3 pM) za TPO (Mer1 1-153). U ELISA testu koji se temelji na mpl receptom, polumaksimalna aktivnost primjećena je kod 19 ng/mL (120 pM). Kod normalnih i mielosuprimiranih životinja nastalih X-zračenjem u skoro letalnim dozama, nabrani TPO (Met1 1-153) je bio vrlo učinkovit (aktivnost za stimuliranje produkcije novih trombocita uočena je kod tako niskih doza kao što je 30 ng/mišu). Slična biološka aktivnost opažena je kod drugih oblika TPO nabranog u skladu s gore opisanim postupcima (vidi Slike 25, 26 i 28).

14. Metode mjerenja trombopoetske aktivnosti

Trombopoetska aktivnost može se mjeriri različitim testovima uključujući: test Ba/F3 mpl liganda opisanom u Primjeru 1, in vivo povratni test sinteze mišjih trombocita, test indukcije antigenosti površine tromobocita mjeren uporabom antitrombocitnog imuno postupka (anti-GPIIbIIIa) za humanu leukemiju megakarioblastičnih staničnih linija (CMK) (vidi Sato et al., Brit. J. Heamatolog., 72:184-190 [1989]) (vidi također test mekakariocitopoeze u tekućoj suspenzij Primjeru), te test indukcije poliploidizacije u megakarioblastičnim staničnim linijama (DAMI) (vidi Ogura et al., Blood, 72(1):49-60 [1988]). Sazrijevanje megakariocita iz nezrelih stanica koje uglavnom ne sintetiziraju DNA, u megakariocite koji se mogu morfološki prepoznati, uključuje proces koji se sastoji od pojavljivanja citoplazmatskih organela, dobivanja membranskih antigena (GPIIbIIIa), endoreplikaciju i oslobađanje trombocita kao što je opisano u uvodu. Očekivalo bi se da će specifični promotor za sazrijevanje megakariocitne loze (t.j. mpl ligan) inducirati barem nešto od ovih promjena u nezrelim megakariocitima, što vodi do osloabađanja trombocita i poboljšanja trombocitopenije. Tako su testovi dizajnirani da mjere neophodnost ovih parametara u nezrelim staničnim linijama megakariocita t.j. CMK i DAMI stanicama. CMK test (Primjer 4) mjeri pojavljivanje specifičnog markera trombocita, GPIIbIIIa i gubitak trombocita. DAMI test (Primjer 15) mijeri endoreplikaciju budući da je povećanje plodije bitno obilježje zrelih megakariocita. Megakariociti koji se mogu prepoznati imaju vrijednosti ploidije 2N, 4N, 8N, 16N, 32N itd. Konačno, povratni test in vivo mišjih trombocita (Primjer 16) je učinkovit jer pokazuje da davanje najmanje jednog spoja (ovdje mpl liganda) rezultira povećavanjem broja trombocita.

Razvijena su dva dodatna in vivo testa za mjerenje TPO aktivnosti. Prvi je aktivacija receptora kinaze (KIRA) ELISA u kojem je na CHO stanicama izvršena transfekcija kimerom mpl-Rase i mjerena je fosforilacija tirozina od Rse s ELISA nakon izlaganja mpldijela kimera mpl ligandu (vidi Primjer 17). Drugi test je ELISA zasnovana na receptoru u kojem je ploča za ELISA presvučena zečjim anti-humanim IgG koja hvata humani kimerni receptor mpl-lgG koji se vezuje na mpl ligand. Biotinilirana zečje poliklonalna antitijela prema mpl ligandu (TPO-iss) korištena su da se utvrdi vezani mpl ligand koji je mjeren korištenjem streptavidin-peroksidaze kao što je opisano u Primjeru 18.

15. In vivo biološki odgovor normalnih i subletalno ozračenih miševa tretiranih s TPO

Na normalne i subletlno ozračene miševe djelovano je sa skraćenom TPO i TPO pune duljine izoliranih iz stanica ovarija kineskog hrčka (CHO), stanica E. colli i embrionalnih stanica humanog bubrega (293 stanice). Oba oblika TPO producirana u ova tri domaćina stimuliraju produkciju trombocita u miševima, međutim TPO pune duljine izoliran iz CHO ima najjači in vivo odgovor. Ovi rezultati polazuju da odgovarajuća glikozilacija na karboksi-terminalnoj domeni može biti neophodna za optimalnu in vivo aktivnost.

(a) E. colli-rh TPO (Met-1, 153)

"Met" iz EPO domene (Met u -1 položaju plus prvih 153 ostataka humanog TPO) produciran u E. colli (vidi Primjer 23) injektiran je dnevno u normalni ženski C57 miš kao što je opisano u legendi Slike 25 A, B i C. Ti brojevi pokazuju da neglikozilirani skraćeni oblik TPO produciran u E. colli, te nabran kao što je gore opisano, može stimulurati povećanje produkcije trobmbocita oko dva puta u normalnom mišu, a da pri tome ne utječe na populaciju crvenih ili bijelih krvnih stanica.

Ista molekula injektirana svaki dan u subletalno ozračene (137Cs) ženske miševe kao što je opisano u legendama za SI. 27 A, B i C, stimulira nastajanje trombocita i smanjuje nadir, a ne utječe na eritrocite i leukocite.

(b) CHO-rhTPO332

TPO pune duljine produciran u CHO injektiran svaki dan u normalne C57 B6 miševe kao što je opisano u legendama Slike 27 A, B i C stimulira nastajanje trombocita u mormalnim miševima, a ne utječe na populaciju eritrocita ili leukocita.

(c) CHO-rhTPO332, E. colli-rhTPO(Met-153), 293-rhTPO332 i E. colli-rhTPO155

Krivulje koje odgovaraju dozi su konstruirane za djelovanje rhTPO iz različitih staničnih linija (CHO-rhTPO332; E. colli-rhTPO(Met-1, 153); 293-rhTPO332; i E. colli-rhTP0155) u normalnim miševima kao što je opisano i u legendi SI. 28. Ova slika pokazuje da su svi testirani oblici molekula stimulirali produkciju trombocita, međutim onaj pune duljine produciran u CHO ima najveću iv vivo aktivnost.

(d) CHO-rhTPO153, CHO-rhTPO”clipper" i CHO-rhTPO332

Krivulje koje odgovaraju dozi su također konstruirane u ovisnosti djelovanja različitih oblika rgTPO produciranih u CHO (CHO-rtTPO-153, CHO-rhTPO”clipper" i CHO-rhTPC332) na normalne miševe, što je opisano u legendi SI. 29. Ti brojevi pokazuju da svi testirani CHO oblici molekule stimulraju produkciju trombocita, ali da 70 Kda CHO oblik pune duljine imaj najveću in vivo aktivnost.

16. Općenita rekombinacijska priprava mpl liganda i odgovarajućih varijanata

Mpl ligand se preferirano pripravlja standardnim rekombinatnim postupkom, koji obuhvaća pripravu polipeptidnog mpl liganda kultiviranjem ekspresijskih stanica mpl liganda nukleinske kiseline na kojima je izvršena transfekcije (tipično transformiranjem stanica s vektorom za ekspresije) i izdvajanje polipeptida iz stanice. Međutim, općenito je predviđeno da se mpl ligand može producirati homolognom rekombinacijom ili s metodama rekombinantne piprave koristeći kontrolne elemente uvedenih u stanice koje već imaju DNA koja kodira mpl ligand. Primjerice, moćni promotor/pojačivač element, supresor, ili modulacijski element egzogene transkripcije može se umetnuti u susjedstvo genomne stanice domaćina s orijentacijom da dovoljno utječe na trnaskripciju DNA koja kodira željeni polipeptidni mpl ligand. Kontrolni element ne kodira mpl ligand već priprodni genom stanice domaćina. Zatim se može pretraživati s ciljem nalaženja stanica koje pripravljaju polipeptidni receptor u ovom izumu, ili s ciljem nalaženje povećavanja ili smanjivanja stupnja ekspresije.

Tako se u izumu razmatra metoda za produkciju mpl liganda koji sadrži inserciju modulatornog elementa za transkripciju u genom stanice koja sadrži nukleinsku kiselinu za mpl ligand, dovoljno blizu i s orijentacijom prema molekuli nukleinske kiseline da djeluje na njezinu transkripciju, s mogućim daljnjim korakom koji uključuje kultiviranje stanica koje sadrže modulatorni element transkripcije i molekulu nukleinske kiseline. Izum također razmatra da stanica domaćina sadrži prirodni nukleinsku kiselinu za mpl ligand koja je operativno vezana za egzogenu kontrolnu sekvenciju koju preihvaća stanica domaćina.

A. Izolacija DNA koja kodira polipeptidni mpl ligand

DNA koja kodira polipeptidni mpl ligand može se dobiti iz cDNA biblioteke pripravljene iz tkiva za koje se vjeruje da ima mRNA za mpl ligand i da je eksprimira u koncentraciji koja se može detektirati. Gen mpl liganda može se također dobiti iz genomske DNA knjižnice ili in vitro sintezom oligonukloetida iz kompletnog nukleotidne ili aminokiselinske sekvencije.

Bibiloteka je pretražena s probama dizajniranim da identificiraju traženi gen ili njime kodirani protein. Za cDNA ekspresijske knjižnice podogdne probe uključuju monoklonalna ili poliklkonalna antitijela koja raspoznaju i specifično se vežu za mpl ligand. Prikladne probe za cDNA biblioteke uključuju oligonukleotide duljine od oko 20-80 baza koje kodiraju poznatu ili pretpostavljeni dio cDNA mpl liganda iz iste ili različitih vrsta; i/ili komplementarne ili homologne cDNA ili njihove fragmente koji kodiraju isti ili slični gen. Pogodne probe za pretraživanje genomske knjižnice uključuju, ali nisu ograničene na njih, olugonukleotide ili njihove fragmente koji kodiraju isti ili sličan gen, i/ili odgovarajuće homologne genomske DNA ili njihove fragmente. Pretraživanje cDNA genomske knjižnice s odabranim probama može se izvesti korištenjem standardnih postupaka opsanih u poglavljima 10-12 od Sambrook et. al, supra.

Alternativni način za izolaciju gena koji kodira mpl ligand je korištenje PCR metodologije kao što je opisano u odjeljku 14 od Sambrook et. al., supra. Ta metoda zahtjeva korištenje proba oligonukleotida koje će hibridizirati s DNA koja kodira mpl ligand. Strategija za odabir oligonukleotida opisana je dolje.

Preferirana metoda ovog izuma koristi pažljivo odabrane sekvencije oligonukleotida za pretraživanje cDNA knjižnica iz različitih tkiva, preferirano iz humanog ili svinjskog bubrega (odrasli ili fetalni) ili staničnih linija jetre. Primjerice, humane fetalne jetrene stanične linije cDNA knjižnice su pretraživane oligonukleotinim probama. Alternativno se humane genomske knjižnice mogu pretraživati oligonukleotidnim probama.

Oligonukleotidne sekvencije koje su odabrane za probe trebaju biti dovoljne duljine i dovoljno jednoznačne da se količina krivo pozitivnih rezultata svede na minimum. Aktualna sekvencija(e) nukleotida je obično dizajnirana na osnovu regije mpl liganda koji ima najmanji suvišak kodona. Oligonukleotidi mogu biti degenerirani u jednom ili u više položaja. Korištenje degeneriranih oligonukleotida je posebno važno kada je biblioteka pretražena za vrste u kojima se ne zna preferirani kodon.

Oligonukleotidi moraju biti obilježeni tako da se mogu detektirati u knjižnici koja je pretraživana nakon hibridizacije s DNA. Preferirana metoda obilježavanja je korištenje ATP (npr. γ32P) i polinukleotid kinaze radi obilježavanja na 5' kraju oligonukleotida. Međutim, mogu se koristiti u druge metode za obilježavanje oligonukleotida uključujući, ali ne ograničujući s na njih, biotinilaciju ili enzimsko obilježavanje.

Od posebnog je interesa nukleinska kiselina mpl liganda koja kodira polipeptidni mpl ligand u punoj duljini. U nekim preferiranim dijelovima, sekvencija nukleinske kiseline uključuje prirodnu signalnu sekvenciju mpl lignda. Nukleinske kiseline koje imaju cijelu kodirajuću sekveniju proteina dobivene su pretraživanjem cDNA ili genomske knjižnice korištenjem deducirane aminokiselinske sekvencije.

B. Varijante aminokiselinskih sekvencija prirodnog mpl liganda

Vrste aminokiselinskih sekvencija mpl liganda pripravljene su uvođenjem odgovarajuće nukleotidne promjene u DNA mpl liganda, ili in vitro sintezom željenog polipeptidnog mpl liganda. Takve vrste uključuju, primjerice, delecije ili insercije ili supstitucije aminokiselinskih ostataka unutar aminokiselinske sekvencije svinjskog mpl liganda. Primjerice, karboboksi-terminalni dio odraslog mpl liganda pune duljine može se ukloniti in vivo ili in ivtro proteolitičkim cijepanjem, ili kloniranjem i ekprimiranjem DNA fragmenta koji kodira mpl ligand u punoj duljini, tako da nastane biološki aktivna varijanta. Bilo koja kombinacija delecije, instercije i supstitucije izvedena je da se dođe do konačnog konstrukta s tim da taj filnalni konstrukt posjeduje željenu biološku aktvnost. Promjene aminkiselina mogu također poremetiti post-translacijske procese mpl liganda, kao što je mijenjanje broja ili položaja mjesta glikozilacije. Za dizajniranje varijante aminokiselinske sekvencije mpl liganda lokacija mjesta mutacije i priroda mutacije ovisit će na svojstvu (svojstvima) mpl liganda koji je modificiran. Mjesta mutacije mogu se modificirati pojedinačno ili su seriji, npr. (1) supstitucijom prve s odabranom sličnom aminokiselinom i zatim s radikalnijim izborom ovisno o postignutom rezultatu, (2) delecijom određenog ostatka, ili (3) insercijom ostataka iste ili različite vrste pokraj definiranog mjesta ili komabinacijom mogućnosti 1-3.

Korisna metoda za identifikaciju određenih ostataka ili regija polipeptidnog mpl liganda koja čine preferirana mjesta za mutagenezu, nazvana je "alanine scanning mutagenesis" kao što je opisano od Cunningham i Wells, Science, 244:1081-1085 [1989]. Ovdje je ostatak ili skupina određenih ostataka identificiran (npr. nabijeni ostatak kao što je Arg, Asp, Lys i Glu) i zamijenjen bilo kojim, preferirano neutralnom i negativno nabijenom aminokiselinom (najbolje alaninom i polialaninom) da bi se djelovalo na interakciju aminokiseline s vodenim okolišem koja je okružuje u stanici ili izvan nje. Te domene koje pokazuju funcionalnu ovisnost za supstitucije su podvrgnute daljnjem poboljšavanju uvođenjem daljnjih ili drugih varijanti na ili za mjesto supstitucije. Tako, dok je mjesto uvođenja sekvencije aminokiselina unaprijed određeno, priroda mutacije per se nije unaprijed određena. Primjerice, da bi učinak mutacije bio optimalan na danom mjestu, "alanine scanning mutagenesis" ili slučajna mutageneza provedena je na željenom kodonu ili regiji, te je ekspresija varijanata mpl liganada bila prosijavana za optimalnu kombinaciju željene aktivnosti.

Postoje dvije glavne varjable za konstrukciju varijanata sekvencije aminokiselina: određivanje mjesta mutacije i priproda mutacije. Primjerice, vrsta polipeptidnog mpl liganda uključuje varijantu sekvencije mpl liganda i može predstavljati prirodne alele (koji neće zahtjevati manipulaciju s DNA mpl liganda) ili predodređene mutantne oblike koji su pripravljeni mutacijom DNA, bilo da se dođe do alela ili varijante koja nije nađena u prirodi. Općenito, mjesto i priroda odabrane mutacije će ovisiti o svojstvu mpl liganda koje se modificira.

Delecija aminokiselinskih sekvencija općenito se kreće u rasponu od 1 do 30 ostataka, preferirano 1 do 10 ostakatak, a tipično je da se nalaze u susjedstvu. Alternativno delecija aminokiselinske sekvencije mpl liganda može uključivati dio ili cijelu karboksi-terminalnu glikoproteinsku domenu. Delecije aminokiselinske sekvencije mogu također uključivati jedan ili više od prvih 6 amino-terminalnih ostataka zrelog proteina. Delecija aminokiselinske sekvencije može sadržavati jedan ili više ostataka u jednom ili više regija koje čine petlju i koje postoje između dviju "nakupina uzvojnica". Susjedne delecije se obično izvode s parnim brojem ostataka, ali jedan ili neparni broj ostataka s kojima je izvršena delecija su također dio ove cijeline. Delecija se može izvesti u regiji niske hoimologije mpl liganada koji imaju veliki stupanj identičnosti, da bi se modificirala aktivnost mpl liganda. Delecije se mogu izvesti u regijama niske homlogije mpl liganda čovjeka i ostalih sisavaca koji imaju veliki stupanj identičnost u odnosu na humani polipeptidni mpl ligand. Vjerojatno je da će delecijama u regijama polipeptidnog mpl liganda sisavaca koje pokazuju značajnu homologiju s regijama polipeptidnim mpl liganada drugih sisavaca, biološka aktivnost biti još znatnije modificira. Broj delecija koje slijede jedna drugu će biti odabran tako da se sačuva tercijarna struktura mpl liganda u domeni na koju se djelovalo, npr. β-nabrana ploča ili α-uzvojnica.

Insercija u aminokiselinsku sekvenciju uključuje amino- i/ili karboksi-terminalnu fuziju u rasponu od jednog ostatka do polipeptida koji sadrži sto ili više ostataka, kao i inserciju unutar sekvencije jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Insercije unutar sekvencije (t.j. insercija unutar zrele sekvencije mpl liganda) općenito se kreće u rasponu od oko 1 do 10 ostataka, preferirano 1 do 5 ostataka, a još više preferirano 1 do 3 ostatka. Primjer preferirane fuzije je fuzija mpl liganda ili njegovog fragmenta s nekim drugim citokinom ili njegovim fragmentom. Primjer terminalne insercije uključuje zreli mpl ligand s N-terminalnim ostatkom metionina, artefakt direktrne ekspresije zrelog mpl liganda u rekombonatnoj kulturi stanica i fuziju heterologne N-terminalne signalne sekvencije s N-terminusom zrele molekule mpl liganda za olakšavanje sekrecije zrelog mpl liganda iz rekombinantnog domaćina. Takve signalne sekvencije će se općenito dobivati, te će stoga biti homolegne, željenim specijama stanica domaćina. Pogodne sekvencije uključuju STII ili Ipp za E. colli, alfa faktor za kvasce, te virusne signale kao što je herpes gD za stanice sisavaca.

Druge insercijske varijante molekule mpl liganda uključuju fuziju imunogenih polipeptida na N- ili C-terminus mpl liganda (t.j. ne-endogenih domaćinu kojemu je primjenjena fuzija), npr. bakterijski polipeptidi kao što je p-laktamaza ili enzim kodiran od trp lokusa E. colli, ili protein kvasaca, te C-terminalna fuzija s proteinom koji ima veliko poluvrijeme života kao što je konstantna regija imunoglobulina (ili ostale regije imunoglobulina), albumin ili feritin, kao što je opisano u WO 89/02922 objavljeno 6. travnja 1989.

Teću skupinu varijanata čine supstitucijske varijante aminokiselina. Te varijane imaju najmanje jedan uklonjen aminokisleinski ostatak u molekuli mpl liganda i drugi ostatak insertiran umjesto njega. Ta mjesta od najvećeg interesa za supstitucijsku mutagenezu uključuju mjesta identificirana kao aktivno mjesto (mjesta) mpl liganda i mjesto gdje su aminokiseline koje su nađene u drugim analozima bitno različite u veličini bočnog lanca, naboju ili hidrofobnim svojstvima, ali kod koji također postoji visoki stupanj identičnosti sekvencije u odabranom mjestu među različitim vrstama mpl liganda i/ili unutar različitih životinjskih analoga jednog člana mpl liganda.

Ostala mjesta od interesa su ona u kojima je određeni ostatak mpl liganda dobiven od različitih članova obitelji i/ili je unutar jednog člana animalnih vrsta identičan. Ta mjesta, posebice koja spadaju u sekvenciju s najmanje tri identična konzervirana mjesta, su supstituirana na relativno konzervativan način, kao što je prikazano u Tablici 3 pod naslovom preferirana supstitucija. Ako takve supstitucije rezultiraju u promjeni u biološkoj aktivnosti, tada su uvedene bitnije promjene nazvane primjerne suptitucije u Tablici 3, ili kako je dalje dolje opisano u odnosu na klase aminokiselina, te su produkti ispitani.

[image]

Značajne modifikacije u funkciji ili imunološkom identitetu mpl liganda upotpunjena su odabirom supstitucije koja se znatno razlikuje u učinkovitosti u održavanju (a) strukture polipeptinog skeleta u dijelu gdje je izvršena supstitucija, primjerice kao β-nabrana ploča ili konformacija uzvojnice, (b) naboja ili hidrofobnog svojstva molekule na određenom mjestu, ili (c) veličine bočnog lanca. Prirodni aminokiselinski ostaci podijeljeni su na slijedeći način u skupine na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca:

(1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr;

(3) kisele: Asp, Glu

(4) bazične: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) ostaci koje utječu na orijentaciju lanca: Gly, Pro, te

(6) aromatočne: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativna supstitucija će supstituirati član jjedne skupine s drugim članom iste skupine. Takvi supstituirani ostaci mogu se također uvesti na mjesta konzervtivne supstitucije ili, što je više preferirano, u mjesta (konzervatrivna) koja su ostala.

U jednoj cjelini ovog izuma poželjno je inaktivirati ili više mjesta cijepanja proteze koja su prisutne u molekuli. Ta mjesta su identificirana pregledom kodirane aminokiselinske sekvencije, u slučaju tripsina, npr. za arginiski ili lizinski ostatak. Kada su mjesta cijapanja proteaze utvrđena, ona se dezaktiviraju proteolitičkom supstitucijom željenog ostatka s drugim ostatkom, preferirano bazičnim, kao što je glutamin ili hidrofobnim ostatkom kao što je serin, ili delecijom ostatka, ili insercijom prolina odmah nakon traženog ostatka U drugoj cijelini ovog izuma je također obuhvaćeno da bilo koji metionilski ostatak koji nije metionilski ostatak signalne sekvencije, ili neki ostatak smješten unutar oko tri ostatka na N- ili C-terminalnom kraju od svakog takvog metioninskog ostatka, supstituiran drugim ostatkom (preferirano prema Tablici 3) ili je deletiran. Alternativno se oko 1-3 ostatka insertiraju u susjedstvo takvog mjesta.

Bilo koji cisteinski ostatak koji nije obuhvaćen u održavanju ispravne konformacije mpl liganda također može biti supstituiran, općenito serinom, da bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekule i da se izbjegne krivo unakrsno povezivanje. Nađeno je da su prvi i četvrti cistein u epo domeni, numerirani od N-terminusa, neophodni za održavanje ispravne konformacije, ali da drugi i treći nisu. Prema tome, drugi i teći cistein se mogu supstituirati u epo domeni.

Molekule nukleinske kiseline koje kodiraju aminokiselinsku sekvenciju varijanata mpl liganda su pripravljene raznim poznatim metodama. Te metode uključuju, ali nisu na to ograničene, izolaciju iz prirodnih izvora (u slučaju varijanti prirodne aminokiselinske sekvencije) ili pripravljanje oligonukleotidnomm (ili ciljenom) mutagenezom, PCR mutagenezom i kazetnom mutagenezom u ranije pripravljenim varijantama ili nevarijantnim verzijama polipeptidnog mpl liganda.

Oigonukleotidna mutageneza je preferirana metoda za pripravu varijanata DNA mpl liganda na kojem je izvršena supstituicja, delecija i insercija. Te tehnike su već poznate i opisane od Adelman et al., DNA, 2:183 [1983]. Ukratko, DNA mpl ligand je promjenjen hibridizacijom oligonukleotida koji kodira željenu mutaciju u DNA templatu, pri čemu je templat jednolančani oblik plazmida ili bakteriofaga koji sadrži nepromjenjenu ili nativnu DNA sekvenciju mpl liganda. Nakon hibridizacije, korištena je DNA polimeraza za sintezu cijelog drugog komplemntarnog lanca templata, koji će tako ugraditi oligonukleotidnu klicu i kodirati odabranu promjenu u DNA mpl ligandu.

Općenito su korišteni oligonukleotidi najmanje duljine 25 nukleotida. Optimalni oligonukleotid imat će 12 do 15 nukleotida koji su potpuno komplementarni templatu na bilo kojem kraju nukleotida koji kodira (kodiraju) mutaciju. Ovo osigurava da će oligonukleotid ispravno hibridizirati s jednolančanom molekulom DNA templata. Oligonukleotide se lako sintetiziraju koristeći poznate tehnike kao što je opisano od Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 75:5765 [1978].

DNA templat se može generiran s onim vektorima koji su dobiveni iz M13 vektora bakteriofaga (pogodni su komercijalno pristupačni vektori M13mp18 i M13mp19) ili iz vektorima koji sadrže ishodište replikacije jednolančanog faga kao što je opisano od Viera et al., Meth Enzymol., 153:3 [1987]. Tako DNA koju treba mutirati može biti insertirana u jedan od tih vektora da bi se generirao jednolančani templat. Produkcija jednalančanog templata je opisana u Odjeljku 4.21-4.41 od Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press NY 1989).

Alternativno se jednolančani DNA templat može generirati denaturiranjem dvolančanog DNA plazmida (ili drugog) koristeći standardne tehnike.

Za mijenanje prirodne DNA sekvencije (da bi se primjerice generirala varijanta aminokiseiinske sekvencije), oligonukleotid je hibridiziran u jednolančani templat pod uvjetima pogodnim za hibridizaciju. Enzim za DNA polimerizaciju, obično Klenovv fragment DNA polimeraze l, je zatim dodan da sintetizira komplemntarni lanac templata koristeći Oligonukleotide kao klice za sintezu. Heterodupleksna molekula se tako stvara na taj način da samo jedan lanac DNA kodira mutirani oblik mpl liganda, a drugi lanac (originalni templat) kodira prirodni, nepromjenjeni mpl ligand. Ta heterodupleksna molekula je zatim transformirana u pogodnoj stanici domaćina, obično prokariota kao što je E. colli JM101. Nakon rasta stanica, one su nasađene na agarozne ploče i pretražene koristeći oligonukleotidne klice radioobiljžene fosforom-32, da bi se identifdicirale bakterijske kolonije koje sadrže mutiranu DNA. Mutirana regija je zatim uklonjena i smještena u odgovarajući vektor za produkciju proteina, općenito se koristi tip ekspresijskog vektora koji se najčešće koristi za transformaciju u odgovarajućem domaćinu.

Metoda opisana neposredno iznad se može modificirati tako da se kreira homodupleksna molekula u kojoj oba lanca plazmida sadrže mutaciju(e). Ta modifikacija se izvodi na slijedeći način: Jednolančani oligonukleotid je povezan s jednolančanim kalupom kao što je gore opisano.

Smjesa od tri deoksiribonukleotida, deoksiriboadenozin (dATP), deoksiribo-guanozin (dGTP) i deoksiribotimidin (dTTP) je spojena s modificiranom tio deoksiribocitozinom nazvanim dCTP8-aS) (koji se može dobiti od Amersham Corporation). Ta smjesa je dodana u templat-oligonukleotid kompleks. Nakon dodatka. DNA polimeraze u smjesu, generira se lanac DNA identičan templatu, osim za mutirane baze. Nadalje, novi lanac DNA će sadržati dCTP-(aS) umjesto dCTP, koji služi da ga zaštiti od digestije restrikcijskom endonukleozom.

Nakon što je u lancu templata dvostrukog lanca heterodupleksa napravljena pukotina s odgovarajućim restrikcijskim enzimom, lanac templata se može digerirati s nukleazom ExoIII ili s drugom odgovarajućom nukleazom nakon regije koja sadrži rnjesto(a) za mutiranje. Reakcija je zatim zaustavljena da bi molekula ostala parcijalno jednolančana. Potpuno dvostrukolančani DNA homodupleks molekula stvara se uz DNA polimerazu u prisutnosti sva četiri deoksiribonukleotid trifosfata, ATP, i DNA ligaze. Ta homodupleks molekula može se transformirati u pogodnu stanicu domaćina kao što je E. colli JM101, kao što je gore opisano.

DNA koja kodira mutant mpl liganda s više od jednom zamjenjenom aminokiselinom može se generirati na nekoliko načina. Ako su aminokiseline u polipeptidnom lancu smještene blizu jedna drugoj, mogu se mutirati simultano korištenjem jednog oligonukleotida koji kodira sve aminokiseline koje se žele zamijeniti. Ako su, međutim, aminokiseline udaljene jedna od druge (odvojene s više od oko deset aminokiselina), teže je generirati jedan oligonukleotid koji kodira sve željene promjene. Umjesto toga mogu se koristit jedna od dvije alternativne metode.

U prvoj metodi generiraju se oligonukleotidi odvojeno za svaku aminokiselinu koju se želi supstituirati. Oligonukleotidi su zatim simultano povezani u jednolančani templat, a drugi lanac DNA sintetiziran iz templata će kodirati željenu supstitucijsku aminokiselinu.

Alternativna metoda obuhvaća dva ili više ciklusa mutageneze da bi nastao željeni mutant. Prvi stupanj je kao što je opisano za jednostruke mutante: DNA divljeg tipa je korištena kao templat, oligonukleotid koji kodira prvu željenu supstitucijsku amnokiselinu(e) je povezan s tim templatom, pri čemu je generirana heterodupleksna DNA molekula. Drugi ciklus mutagenze koristi mutiranu DNA nastalu kao templat u prvom ciklusu mutageneze. Tako ovaj templat već sadrži jednu ili više mutacija. Oligonukleotid koji kodira dodatnu željenu supstitucijsku aminokiselinu(e) je zatim povezan s tim templatom, i nastali DNA lanac sada kodira mutacijski oblik iz oba ciklusa mutageneze. Rezultantna DNA se može koristiti kao templat u trećem ciklusu mutangenze, itd.

PCR mutageneze je također pogodna za priravu varijantnih aminoksleina polipeptidnog mpl liganda. Mada se slijedeća diskusija odnosi na DNA, podrazumijeva se da se ta tehnika može primjeniti i na RNA. PCR tehnika se općenito odnosi na slijedeći postupak (vidi Erlich, supra, poglavlje od R. Hiiguchi, str. 61-70): Kada se koristi mala količina DNA templata koji je ishodni materijal u PCR, mogu se koristiti klice čije se sekvencije malo razlikuju od odgovarajuće regije DNA templata za generiranje realtivno velike količine specifičnog fragmenta DNA koji se razlikuje od templatne sekvencije samo u položajima gdje se klice razlikuju od templata. Za uvođenje mutacije u DNA plazmid, jedna od klica je dizajnirana tako da prekriva položaj mutacije i da sadrži mutaciju; sekvencija druge klice mora biti identična dijelu sekvencije suprotnog lanca plazmida, ali ova sekvencija može biti locirana bilo gdje duž DNA plazmida. Preferirano je međutim da je sekvencija druge klice smještena unutar udaljenosti od 200 nukleotida od prve, tako da je kraj cijele umnožene regije DNA vezan na klice koje se mogu lako sekvencirati. PCR umnožavanje koje koristi par klica kao što je ovaj upravo opisan, rezultira populacijom DNA fragmenata koji se razlikuju u položaju mutacije određene klicom, a mogu biti na drugim mjestima, budući da se mogu desiti greške u kopiranju templata.

Ako je omjer templata prema produktu izuzetno mali, velika većina produciranih DNA fragmenata uključuje željenu mutaciju(e). Ti produkti se koriste da bi se zamijenila odgovarajuća regija u plazmidu koji služi kao PCR templat koristeći standardnu DNA tehnologiju. Mutacije na odvojenim položajima se mogu uvesti itovremeno korištenjem druge mutirane klice, ili izvođenjem druge PCR s različitom mutiranom klicom i ligacijom dva nastala PCR fragmenta istovremeno u fragmentni vektor u trostrukoj (ili višestrukoj) ligaciji.

U specifičnom primjeru PCR mutagenzene, templatni DNA plazmid (1 μg) je lineariziran digestijom s restrikcijskom endonukleazom koja ima jedno mjesto prepoznavanja u DNA plazmidu izvan regije koja se umnožava. Od tog materijala je 100 ng dodano PCR smjesi s puferom koja sadrži četiri deoksinukleotid-trifosfata i uključen je u Gene Apm® kit (dobiven od Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT i Emeryville, CA) i 25 pmol od svake oligonukleotidne klice, do konačnog volumena 50 μL Reakcijska smjesa je nadslojena s 35 μL mineralnog ulja. Reakcijska smjesa je denaturirana pet minuta pri 100 °C, smještena na led kratko vrijeme, te je ispod sloja mineralnog ulja dodan 1 μL Thermus aquaticus (Taq) DNA polimeraze (5 jedinica/μL, kupljeno od Perkin-EImer Cetus). Reakcijska smjesa je zatim smještena u DNA Thermal Cycler (kupljen od Perkin-EImer Cetus) koji je programiran na slijedeći način:

2 min, 55 °C

30 s 72 °C, te 19 ciklusa slijedeće:

30 s 94 °C

30 s 55 °C, te

30 s 72 °C.

Kad je program završen, uklonjena je reakcijska posuda iz aparata i vodena faza je prenesena u novu posudu, ekstrahirana je fenol/kloroformom (50:50 vol.) i taložena je etanolom, a DNA je izolirana standardnim postupcima. Taj materijal je zatim podvrgnut odgovarajućim postupcima za inserciju u vektor.

Druga metoda za pripravu varijanata, kazetna mutageneza, se zasniva na tehnikama opisanim od Wells etal., Gene, 34:315 [1985]. Polazni materijal je plazmid (ili vektor) koji sadrži DNA mpl ligand koji treba mutirati. Kodon(i) DNA mpl liganda koji mutira je identificiran. Mora biti prisutno jedinstveno mjesto za restrikcijsku endonukleazu na svakoj strani identificiranog mjesta mutacije(a). Ako takvo restrikcijsko mjesto ne postoji, mora se generirati koristeći gore opisanu metodu oligonukleotidne mutageneze da ih se uvede na odgovarajuće mjesto u DNA mpl ligandu. Nakon što su restrikcijska mjesta uvedena u plazmid, plazmid se reže na tim mjestima da bi se linearizirao. Dvostruki lanac oligonukleotida koji kodira sekvenciju DNA između restrikcijskih mjesta, a pri tom sadrži željenu mutaciju(e) je sintetiziran korištenjem standardnih postupaka. Dva lanca su sintetizirana odvojeno, te su hibridizirani koristeći standardne tehnike. Dvolančani oligonukleotid se naziva kazeta. Ta kazeta je dizajnirana tako da ima 3' i 5' krajeve koji su kompatibilni krajevima lineariziranog plazmida, tako da-se ligacija s plazmidom može izvesti direktno. Taj novi plazmid sadrži mutiranu sekvenciju DNA mpl liganda.

C. Insercija nukleinske kisline u vektor za replikaciju

Nukleinska kiselina (t.j. cDNA ili genomska DNA) koja kodira prirodni ili varijantni polipeptidni mpl ligand je insertirana i vektor za replikaciju koji se dalje koristi za kloniranje (umnožavanje DNA) ili ekspresiju. Mogu se koristiti mnogi vektori, a odabir će ovisiti:(1) o tome da li se koristi za DNA replikaciju ili ekspresiju, (2) o veličini nukleinske kiseline koja se insertira u vektor, te o stanici domaćina koja se transformira tim vektorom. Svaki vektor sadrži različite komponente, ovisno o funkciji vektora (umnožavanje ili ekspresija DNA) i o stanici domaćina koja je s njima kompatibilna. Komponente vektora općenito uključuju, ali nisu ograničeni na slijedeće:

(i) Dio koji predstavlja signalnu sekvenciju

mpl-ligand iz ovog izuma može biti eksprimiran ne samo direktno, nego i kao fuzijski produkt s heterolognim polipeptidom, a poželjno je da je to signalna sekvencija ili drugi polipeptid koji ima specifično mjesto cijepanja na N-kraju zrelog proteina ili polipeptida. Općenito, signalna sekvencija može biti komponenta vektora, ili može biti dio DNA mpl-liganda koji je ubačen insercijom u vektor. Heterologna signalna sekvencija može biti ona koja je pepoznata i procesirana od (tj., pocijepana djelovanjem signalne peptidaze) stanice domaćina. Za prokariotske stanice domaćina koje ne raspoznaju i ne procesiraju nativnu signalnu sekvenciju mpl-liganda, ona je zamijenjena izabranom prokariotskom signalnom sekvencom, na primjer, iz grupe alkalne fosfataze, penicilinaze, Ipp, ili vodiljom enterotoksina II stabilnog na toplinu. Za sekreciju iz kvasaca nativna signalna sekvencija može biti zamijenjena s npr. invertazom iz kvasaca, alfa faktorom, vodiljom kisele fosfataze, vodiljom glukoamilaze iz C. albicans (EP 362,179 publicirano 4 travnja 1990), ili signal koji je opisan u WO 90/13646, publicirano 15 studenog 1990. Kod ekspresije u stanicama sisavaca nativna signalna sekvencija (t.j. presekvencija mpl-liganda koja normalno usmjerava sekreciju forme mpl-liganda iz njegovih nativnih stanica sisavaca in vivo) je zadovoljavajuća, mada druge signalne sekvencije stanica sisavaca mogu biti prikladne, kao što su signalne sekvencije drugih mpl-ligandnih polipeptida ili od samog mpl-liganda iz drugih životinjskih vrsta, signalne sekvencije mpl-liganda, te signalne sekvencije secerniranih polipeptida te iste ili srodnih vrsta, kao i sekretorne virusne vodilje, na primjer herpes simplex gD signal.

(ii) Komponenta ishodišta replikacije

Oba i ekspresijski i vektor za kloniranje sadrže sekvenciju nukleinskih kiselina koja omogućuje vektoru da se replicira u jednoj ili više stanica domaćina. Općenito, kod vektora za kloniranje ova sekvencija je ona koja omogućava vektoru da se replicira neovisno o kromosomalnoj DNA domaćina, i uključuje ishodište replikacije ili autonomne replikacijske sekvencije. Takve su sekvencije dobro poznate za različite bakterije, kvasce i viruse. Ishodište replikacije iz plazmida pBR322 je prikladno za većinu gram negativnih bakterija, 2μ plazmidnog ishodišta je prikladno za kvasce i različita virusna ishodišta (SV40, polioma, adenovirus, VSV ili BPV), te su korisni kao vektori za kloniranje u stanicama sisavaca. Općenito, ishodište replikacijske komponente nije potrebno za ekspresijske vektore u sisavaca (ishodište SV40) može tipično biti upotrijebljeno jedino zato jer sadrži rani promotor). Mnogi ekspresijski vektori su "shuttle" vektori, tj. oni se mogu replicirati u barem jednoj klasi organizama, ali mogu biti ubačeni transfekcijom i u drugi organizam za ekspresiju. Na primjer, vektor je bio kloniran u E. Coli i tada je taj isti vektor transfekcijom ubačen u kvasac ili stanice sisavaca za ekspresiju iako se on ne može replicirati neovisno o kromosomu stanica domaćina.

DNA može također biti replicirana insercijom u kromosom domaćina. To je lako izvršiti upotrebom Bacillus vrste kao domaćina, na primjer uključujući u u vektor DNA sekvenciju koja je komplementarna sekvenci koja se može naći u genomskoj DNA Bacillusa. Transfekcija Bacillusa s ovim vektorom rezultira homolognom rekombinacijom s genomom i insercijom DNA mpl-liganda. Međutim, dobivanje genomske DNA koja kodira mpl-ligand je nešto kompliciranije nego kod vektora koji se egzogeno repicira zato jer je potrebna digestija restrikcijskim enzimima da se izdvoji DNA mpl-liganda.

(iii) Selekcijska komponente gena

Vektori za kloniranje i ekspresiju moraju sadržavati selekcijski gen koji se naziva i biljegom za selekciju. Ovaj gen kodira protein koji je nužan za preživljenje ili rast transformiranih stanica domaćina u selektivnom mediju za kultivaciju. Stanice domaćina koje nisu trnsformirane vektorom koji sadrži selekcijski gen neće preživjeti u mediju za kultivaciju. Tipični selekcijski geni kodiraju proteine koji (a) omogućuju rezistenciju na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat, ili tetracikline, (b) komplementiraju auksotrofne deficijencije, ili (c) stvaraju kritične hranidbene sastojke koji nedostaju u kompleksnom mediju, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacillus.

Jedan primjer selekcijske sheme upotrebljava lijek koji zaustavlja rast stanice domaćina. One stanice koje su uspješno transformirane s heterolognim genom eksprimiraju protein koji omogućuje rezistenciju na lijek i preživljenje u režimu za selekciju.

Primjeri za takvu dominantnu selekciju upotrebljvaju lijek neomicin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genef.,1:327[1982]), mikofenolnu kiselinu (Mulligan et al., Science, 209:1422[1980]), ili higromicin Sugden et al., Mol. Cei. Biol., 5:410-413[1985]). Ova tri primjera upotrebljavaju bakterijske gene pod eukariotskom kontrolom da prenesu rezistenciju prema odgovarajućem lijeku G418 ili neomicinu (geneticinu), xgpt (mikofenolnoj kiselini), ili higromicinu.

Primjeri drugih prikladnih markera za selekciju za stanice sisavaca su oni koji su sposobni identificirati stanice kompetentne za prihvaćanje nukleinske kiseline mpl-liganda, kao što je dihidrofolat reduktaza (DHFR) ili timidin kinaza. Transformirane stanice sisavaca su stavljene pod selekcijske uvjete koje mogu preživjeti jedino one stanice koje su primanjem biljega osposobljene za preživljenje. Selekcijski uvjeti su stvoreni kultiviranjem transformiranih stanica pod uvjetima u kojima se koncentracija selekcijskog agensa u mediju sukcesivno mijenja, tako da dovodi do amplifikacije selekcijskog gena i DNA koja kodira mpl-ligandni polipeptid. Amplifikacija je proces kojim se geni koji su važni za produkciju proteina koji je bitan za rast umnožavaju u tandemu, unutar kromosoma u generacijama u slijedu u rekombinantnim stanicama. Iz ovako umnožene DNA sintetizirane su povećane količine mpl-liganda.

Na primjer, stanice koje su transformirane pomoću DHFR selekcijskog gena, najprije se identificiraju kultiviranjem svih transformanata u mediju za kultiviranje koji sadrži metotreksat (Mtx), kompetitivni antagonist DHFR. Prikladne stanice domaćini za divlji tip DHFR su stanična linija ovarija kineskog hrčka (CHO) kojoj nedostaje DHFR aktivnost, pripremljene i propagirane kao što je to opisano od Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216[1980]. Transformirane stanice su tada izložene povećanim koncentracijama Mtx. Ovo dovodi do sinteze multiplih kopija gena za DHFR, usputno do stvaranja multiplih kopija druge DNA koja sadrži ekspresijski vektor, kao što je DNA koja kodira mpl-ligand. Ova amplifikacijska tehnika može biti upotrijebljena s bilo kojim drugim prikladnim domaćinom, npr., ATCC No. CCL61 CHO-K1, usprkos prisutnosti endogene DHFR ako se , npr. upotrijebi mutantni DHFR gen koji je izuzetno rezistentan na Mtx (EP 117,060). Alternativno, stanice domaćina [naročito divlji tip domaćina koji sadrži endogeni DHFR] transformiran ili ko-transformiran s DNA sekvencijama koje kodiraju mpl-ligand, protein DHFR divljeg tipa, i drugi biljeg pogodan za selekciju kao što je aminoglikozid 3' fosfotransferaza (APH) može biti selekcioniran rastom stanica u mediju koji sadrži selekcijski agens za selekcijski biljeg kao što je neki aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin ili G418. Vidi US Patent No. 4,965,199.

Prikladni gen za selekciju za upotrebu u kvasaca je crpi gen koji je prisutan kvašćevom plazmidu YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39[1979]; Kingsman et al., Gene, 7:141 [1979]; ili Tschemper et al., Gene, 10:157[1980]. Trp1 gen pruža selekcijski marker za mutantni soj kvasaca kojima nedostaje sposobnost rasta u triptofanu, npr., ATCC No. 44076 ili PEP4-1 (Jones et al., Genetics, 85:12[1977]). Prisutnost lezije trpi u genomu stanica kvasaca koje su domaćini u ovom slučaju stvara efektivni okoliš za detekciju transformacije rastom u odsutnosti triptofana. Slično, Leu2-manjkavi sojevi kvasaca (ATCC No. 20,622 ili 38,626) se mogu komplementirati poznatim plazmidima koji nose Leu2 gen.

(iv) Promotorska komponenta

Vektori za ekspresiju i kloniranje uobičajeno sadrže promotor koji raspoznaje organizam domaćina i koji je operativno povezan s nukleinskom kiselinom mpl-liganda. Promotori su netranslatirane sekvencije koje su lokalizirane uzvodno (5') od startnog kodona strukturnog gena (uobičajeno unutar oko 100 do 1000 parova baza), a koji kontroliraju transkripciju i translaciju određene sekvencije nukleinskih kiselina, kao što je sekvencija nukleinskih kiselina mpl-liganda, s kojom su oni operativno povezani. Takvi promotori tipično spadaju u dvije klase, inducibilni i konstitutivni. Inducibilni promotori su oni koji iniciraju povećanu razinu transkripcije DNA koja je pod njihovom kontrolom kao odgovor na neke promjene u uvjetima kultiviranja, npr., prisutnost ili odsutnost hranidbenog sastojka ili na promjenu temperature. Do sada je poznat veliki broj promotora koje prepoznaju različite vrste stanica domaćina.

Ovi promotori su operativno povezani s DNA koja kodira mpl-ligand, tako da je izvršeno uklanjanje promotora iz DNA izvora digestijom uz restrikcijski enzim i ubacivanjem izolirane sekvencije promotora u vektor. Oboje i nativne promotorske sekvencije mpl-liganda i mnogi heterologni promotori mogu biti upotrijebljeni za direktnu amplifikaciju i/ili ekspresiju DNA mpl-liganda. Međutim, smatra se da su heterologni promotori bolji, budući da oni u pravilu omogućavaju veću transkripciju i veće iskorištenje ekspresije mpl-liganda kada se usporede s nativnim promotorom mpl-liganda.

Promotori koji su pogodni za uporabu kod prokariotskih domaćina uključuju β-laktamazu i promotorski sistem laktoze (Chang et al., Nature, 275:615[1978]; i Goeddel et al., Nature, 281:544[1979]), zatim onaj od alkalne fosfataze, te triptofanski (trp) promotorski sistem (Goeddel et al., Nucl. Acid. Res, 8:4057[1980] i EP 36,776) i hibridne promotore kao što je tac promotor (deBoer ef al,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25[ 1983]. Međutim, mogu se primijeniti i drugi poznati bakterijski promotori. Njihova je nukleotidna sekvencija publicirana, što omogućuje stručnjaku u području da ih operativno veže za DNA koja kodira mpl-ligand (Siebenlist et al., Celi, 20:269[1980]) uporabom linkera ili adaptera da se stvori potrebno restrikcijsko mjesto. Promotori koji se upotrebljavaju u bakterijskim sistemima također će sadržavati Shine-Dalgrano (S.D.) sekvencije koje su operativno povezane s DNA koja kodira mpl-ligandni polipeptid.

Promotorske sekvencije su poznate za eukariote. Skoro svi eukariotski geni imaju jednu AT-bogatu regiju koja je smještena otprilike 25 do 30 baza uzvodno od mjesta inicijacije transkripcije. Druga sekvencija koja se nalazi 70 do 80 baza uzvodno od starta transkripcije mnogih gena je CXCAAT regija gdje X može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju mnogih eukariotskih gena postoji jedna AATAAA sekvencija koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodirajuće sekvencije. Sve ove sekvencije mogu biti prikladno ubačene u eukariotske ekspresijske vektore.

Primjeri prikladnih promotorskih sekvenci za uporabu s kvascima kao domaćinima uključuju promotore za 3-fosfoglicerat kinazu (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073[1980]) ili druge glikolitičke enzime (Hess et al., J.Adv. Enzyme Reg., 7:149[1968]; i Holland Biochemistry, 17:4900[1978]), kao što je enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza.

Drugi promotori u kvasaca, koji su inducibilni promotori i koji imaju dodatnu prednost da im je transkripcija kontrolirana uvjetima rasta, su promotori regija alkohol dehidrogenaze 2, izocitokrorna C, kisele fosfataze, razgradnih enzima povezanih s metabolizmom dušika, metalotioneina, gliceraldehi-3-fosfat dehidrogenaze, te enzima koji su odgovorni za uporabu maltoze i galaktoze. Prikladni vektori i promotori za uporabu pri ekspresiji u kvasaca su detaljnije opisani u Hitzeman et al., EP 73.657A. Pojačivači iz kvasaca se također mogu dobro uporabiti zajedno s promotorima iz kvasaca.

Transkripcija mpl-liganda iz vektora kada su domaćini stanice sisavaca je kontrolirana, na primjer, promotorima iz genoma virusa kao što su polioma virusi, fowlpox virusi (UK 2,211,504 publicirano 5 srpnja 1989), adenovirusi (kao što je adeno virus 2), goveđi papiloma virusi, avian sarkoma virusi, citomegalovirusi, retrovirusi, hepatitis-B virus i najbolje Simian virus 40 (SV40), iz heterolognih promotora sisavaca, npr., aktinski promotor ili imunoglobulinski promotor, promotor proteina toplinskog šoka, te iz promotora koji su normalno povezani sa sekvencom mpl-liganda, pod uvijetom da su ti promotori kompatibilni sa staničnim sistemom domaćina.

Rani i kasni promotori SV40 virusa se uobičajeno dobivaju kao SV40 restrikcijski fragment koji također sadrži ishodište replikacije SV40. Fiers et al., Nature, 273:113[1978]; Mulligan and Berg, Science, 209:1422-1427[1980]; Pavlakis ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402[1981]. Neposredni rani promotor humanog citomegalovirusa se može prikladno dobiti kao HindIII E restrikcijski fragment. Greenway et al., Gene, 18:355-360[1982]. Sistem koji za ekspresiju DNA u sisavcima kao domaćinima uporabljuje goveđe papiloma viruse kao vektore je opisan u U.S. Patentu No. 4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u U.S. Patentu No. 4,601,978. Ekspresija cDNA koja kodira imuni interferon u stanicama majmuna opisana je kod Gray et al., Nature, 295:503-508[1982]; ekspresija cDNA humanog β-interferona u stanicama miša je pod kontrolom promotora timidin kinaze iz herpes simpleks virusa opisana je kod Reyes et al., Nature, 297:598-601 [1982]; ekspresija gena humanog β-interferona u kultiviranim stanicama miša i zeca opisana je kod Canaani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170[1982]; te ekspresija bakterijske GAT sekvencije u CV-1 stanicama bubrega majmuna i fibroblastima pilećeg embrija, stanicama ovarija kineskog hrčka, HeLa stanicama, mišjim NIH-3T3 stanicama uz uporabu dugog terminalnog ponavljajućog dijela Rous sarkoma virusa kao promotora opisana je kod Gorman et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6871 [ 1982].

(v) Komponenta pojačivačkog elementa

Transkripcija dijela DNA koja kodira mpl-ligand ovog izuma u višim eukariotirna se obično može pojačati ubacivanjem sekvencije pojačivača u vektor. Pojačivači su cis-djelujući elementi DNA, uobičajeno dugi 10 do 300 parova baza, koji djeluju na promotor tako da se pojača transkripcija. Pozicija i orijentacija pojačivača nije značajna, jer su nađeni i na 5' (Laimnis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993[1981]) i na 3' kraju (Lusky et al., Mol. Celi Bio., 3:1108[1983]) u odnosu na transkripcijsku jedinicu, unutar introna (Banerji et al., Celi, 33:729[1983]), a također i unutar same kodirajuće sekvencije (Osborne et al., Mol. Celi Bio., 4:1293[1984]). Mnoge sekvencije pojačivača su sada poznate i za gene sisavaca (globin, elastaza, albumin, a-fetoprotein, i insulin). Tipično je međutim da se upotrebljavaju pojačivači iz virusa eukariotskih stanica. Primjeri uključuju SV40 pojačivač koji se nalazi na krajnjem dijelu ishodišta replikacije (bazni parovi 100-270), rani pojačivač promotora citomegalovirusa, pojačivač promotora polioma virusa koji se nalazi na krajnjem dijelu ishodišta replikacije, te pojačivači adenovirusa. Pojačivački elementi za aktivaciju eukariotskih promotora su opisani kod Yaniv et al., Nature, 297:17-18[1982]. Pojačivač može biti ubačen u vektor na poziciji 5' ili 3' kodirajuće sekvencije mpl-liganda, ali najbolje je da je lociran na mjestu 5' od promotora.

(vi)Komponenta za terminaciju transkripcije

Vektori za ekspesiju koji se uporabljuju u eukariotskim stanicama domaćina (kvasci, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudi, ili stanice s jezgrom drugih višestaničnih organizama) će također sadržavati sekvencije koje su neophodne za terminaciju transkripcije i za stabilizaciju mRNA. Takve se sekvencije najčešće nlaze na 5' ili ponekad na 3' netranslatiranom dijelu eukariotske ili virusne DNA ili cDNA. Ove regije sadrže nukleotidne segmente koji se transkribiraju kao poliadenilirani fragmenti iz netranslatiranog dijela mRNA koja kodira mpl-ligand.

(vii) Konstrukcija i analiza vektora

Konstrukcija prikladnih vektora koji sadrže jednu ili više od gore nabrojanih komponenti uporabljuje standardne tehnike ligacije. Izolirani plazmidi ili fragmenti DNA su pocijepani, izdjelani i ponovno povezani u obliku poželjnom da se dobije potrebni plazmid.

U svrhu analiziranja i potvrde da se u plazmid ubacila ispravna sekvencija uporabljene su smjese za ligaciju kojima se transformirao soj 294 bakterije E.Goli K12 (ATCC No. 31,446) a uspješna selekcija transformiranih stanica izvršena je utvrđivanjem rezistencije prema ampicilinu ili tetraciklinu, kako je to bilo prikladno. Plazmidi iz transformiranih stanica su pripravljeni, analizirani digestijom restrikcijskim endonukleazama, i/ili sekvencionirani metodom Messing et al., Nucleic Acids fleš., 9:309[1981] ili metodom Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499[1980].

(viii) Vektori za prolaznu ekspresiju

Naročito koristan u okviru ovog izuma je vektor za ekspresiju koji stvara prolaznu ekspresiju DNA koja kodira mpl-ligandni polipeptid u stanicama sisavaca. Općenito, prolazna ekspresija uključuje uporabu ekspresijskog vektora koji se može efikasno replicirati u stanici domaćina, tako da stanica domaćina akumulira mnogo kopija ekspresijskog vektora i da zbog toga sintetizira visoke razine željenog polipeptida koji je kodiran ekspresijskim vektorom. Sambrook et al., supra, pp 16.17-16.22.

Sistemi za prolaznu ekspresiju, uključuju prikladni ekspresijski vektor i stanice domaćina, te moraju omogućavati prikladnu pozitivnu identifikaciju polipeptida koji su kodirani kloniranom DNA, kao i brzo pretraživanje tih polipeptida za poželjnu biološku ili fiziološku osobinu. Tako su sistemi za prolaznu ekspresiju naročito prikladni u ovom izumu za svrhu identifikacije analoga i varijanti mpl-ligandnog polipeptida koje imaju biološku aktivnost mpl-ligandnog polipeptida.

(ix) Tipični prikladni stanični vektori vertebrata

Druge metode, vektori, i stanice domaćina koji su prikladni za adaptaciju na sintezu mpl-liganda u rekombiniranim stanicama kralježnjaka u kulturi opisani su u Gething et al., Nature, 293:620-625[1981]; Mantei et al., Nature, 281:40-46[1979 ]; i Levinson et al., EP 117,060; i EP 117,058. Naročito koristan plazmid za ekspresiju mpl-liganda u kulturama stanica sisavaca pRK5 (EP 307,247 U.S. patent no. 5,258,287) ili pSVI6B (PCT Publication No. WO 91/08291).

D. Selekcija i transformacija stanica domaćina

Stanice domaćina prikladne za kloniranje ili ekspresiju vektora u ovom izumu su prokarioti, kavsci, ili više eukariotske stanice kako je to gore opisano. Prikladni prokarioti uključuju eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primjer E. Coli, Bacilli kao što su B. subtillis, Pseudomonas vrste kao što su P. aeruginosa, Salmonella tvphimurium, ili Serratia marcescans. Jedan naročito prikladan domaćin za kloniranje iz soja E. Coli je E. Coli 294 (ATCC No. 31,446), premda su i drugi sojevi kao što su E. Coli B, E. Coli X1776 (ATCC No. 31,537) i E. Coli W3110 (ATCC No.27,325) prikladni. Ovi primjeri su više u svrhu ilustracije nego ograničavanja od uporabe drugih sojeva. Poželjno je da stanica domaćin secernira minimalne količine proteolitičkuh enzima, Alternativno, in vitro metode kloniranja, npr., PCR ili druge metode koje uporabljuju lančanu reakciju polimeraze su također prikladne.

Osim prokariota, i eukaritoski mikrobi kao što su filamentozne gljive ili kvasci su prikladni domaćini za vektore koji kodiraju mpl-ligand. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvasac se najčešće uporabljuju među nižim eukariotskim mikroorganizmima. Međutim, i veći broj drugih rodova, vrsta i sojeva su uobičajeno prikladni i korisni u ovom izumu, kao što je Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., Nature, 290:140[1981]; EP 139,383 publiciran 2. svibnja 1985), Kluyveromyces domaćini (U.S. Patent No. 4,943,529) kao što je, npr. K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737[1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans i K marxianus, yarrowia [EP 402,226], Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiolog., 28: 265-278[1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa (Caše et al., Proc. Natl. Acad. USA., 76: 5259-5263[1979], te filamentozne gljive kao što su npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, publicirano 10 siječnja 1991), te Aspergillus domaćini kao što je A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys Res. Commun., 112: 284-289[1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Velton et al., Proc. Natl. Acad. USA., 81: 1470-1474[1984] i A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479[1985]).

Prikladni domaćini za ekspresiju glikoziliranog mpl-liganda su izabrani među višestaničnim organizmima. Takve stanice domaćini su sposobne da izvrše kompleksne reakcije sazrijevanja i glikozilacije. U principu, bilo koja eukariotska stanična kultura je je prikladna, bilo da se radi o kulturi stanica kralježnjaka ili beskralježnjaka. Primjeri za kulturu stanica beskralježnjaka uključuju stanice biljaka ili insekata. Opisani su brojni sojevi baculovirusa i njihove varijante i odgovarajuće permisivne stanice kukaca kao domaćina, i oni ukjučuju Spodoptera frugiperda (gusjenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (vinska mušica), te Bombyx mori. Vidi Luckow et al., Bio/Technology, 6: 47-55[1988]; Miller et al., Genetic engineering, Setlow et al. eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp 277-279; Maeda et al., Nature, 315:592-594[1985]). Javno su dostupni različiti virusni sojevi kao što je npr., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi mogu biti uporabljeni kao virusi prema ovom izumu, naročito za transfekciju Spodoptera frugiperda stanica.

Biljne stanice pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, rajčice i duhana mogu biti uporabljene kao domaćini također.

Uobičajeno je da se biljnim stanicama izvrši transfekcija inkubacijom s određenim sojevima bakterija Agrobacterium tumefaciens koja je prije toga bila tako obrađena tako da sadrži DNA mpl-liganda. Za vrijeme inkubacije biljne stanične kulture s Agrobacterium tumefaciens, DNA koja kodira mpl-ligand je ubačena transfekcijom u biljnu stanicu domaćina koja će, pod odgovarajućim uvjetima eksprimirati DNA koja kodira AnpMigand. Dodatno su potrebne regulatorne i signalne sekvencije koje su kompatibilne s biljnim stanicama, kao što je promotor nopalin sintaze i poliadenilacijska signalna sekvencija. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 [1982]. Dodatno, DNA segmenti koji su izolirani uzvodno od regije T-DNA 780 gena su sposobni da aktiviraju ili pojačaju razinu transkripcije za one gene koji se eksprimiraju u biljnom tkivu koje sadrži rekombinantnu DNA. EP 321,196 publicirano 21 lipnja 1989.

Međutim, najveći interes postoji za stanice kralježnjaka, te je propagiranje stanica kralježnjaka u kulturi (kultura tkiva) postala rutinska procedura u poslijednjim godinama. (Tissue Culture, Acad. Press, Kruse and Patterson, eds. [1973]. Primjeri korisnih stanica domaćina sisavaca su stanične linije bubrežnih stanica majmuna CV1 linija koja je transformirana pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionska bubrežna linija (293 ili 293 stanice koje su subklonirane za rast u kulturi u suspenziji, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59[1977]; bubrežne stanice novorođenog hrčka (BHK, ATCC CCL 10); stanice ovarija kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216[1980]); mišje sertolijeve stanice (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); bubrežne stanice majmuna (CV1 ATCC CCL 70); bubrežne stanice afričkog zelanog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); stanice humanog cervikalnog karcinoma (HELA, ATCC CCL 2), pseće bubrežne stanice (MDCK, ATCC CCL 34); jetrene stanice "buffalo" štakora (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane plućne stanice (W138, ATCC CCL 75); humane jetrene stanice (Hep g2, HB 8065); stanice mišjeg tumora dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI stanice (Mahter et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68[1982] ); MRC 5 stanice; FS4 stanice; humana hepatoma stanična linija (Hep G2).

Transfekcija stanica domaćina i, poželjno njihova transformacija, može se učiniti gore naznačenim vektorima za ekspresiju ili kloniranje opisanim u ovom izumu i kultivirati u konvencionalnim hranjivim medijima koji su modificirani kako je to pogodno za indukciju promotora, selekciju transformiranih stanica ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvencije.

Transfekcija se odnosi na prihvaćanje ekspesijskog vektora od stanice domaćina bez obzira da li je, ili nije eksprimirana bilo koja kodirajuća sekvencija. Iskusnom stručnjaku su poznate brojne metode transfekcije, na primjer, CaPO4 i elektroporacija. Uspješna transfekcija se općenito prepoznaje po postojanju bilo kakve indikacija djelovanja vektora u stanici domaćinu.

Transformacija znači ubacivanje DNA u neki organizam tako da se ta DNA replicira, bilo kao ekstrakromosomalni element ili kao integralni dio kromosoma. Ovisno o tome koje stanice domaćina su izabrane, transformacija se izvršava standardnom metodom prikladnom za te stanice. Obrada kalcijem koja uporabljuje kalcijev klorid, kao što je to opisano u sekciji 1.82 knige Sarnbrook et al., supra, se najčešće primjenjuje za prokariote ili druge stanice koje sadrže značajne barijere stanične stijenke. Infekcija s Agrobacterium tumefaciens se koristi za transformaciju određenih biljnih stanica, kao što je to opisano u Shaw ef al., Gene., 23: 315[1983] i WO 89/05859 publicirano 29 lipnja 1989. Dodatno, biljkama može biti izvršena transfekcija obradom ultrazvukom kao što je to opisano u WO 91/00358 publicirano 10 siječnja 1991. Za stanice sisavaca bez takve stanične stijenke preferirana je metoda precipitacije kalcijevim fosfatom prema Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457[1978]. Općenite aspekte sistema za transformaciju stanica sisavaca opisao je Axel u U.S. Patentu No. 4,399,216 koji je izašao 16 kolovoza 1983. Transformacija u kvasce se tipično izvodi prema metodi Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946[1977] i Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3829[ 1979]. Moguće je, međutim, uporabiti i druge metode za ubacivanje DNA u stanice, kao što su nuklearna injekcija, elektroporacija ili fuzija protoplasta.

E. Kultiviranje stanica domaćina

Prokariotske stanice koje se upotrebljavaju za proizvodnju mpl-ligandnog polipeptida iz ovog izuma su kultivirane u prikladnom mediju kao što je to općenito opisano kod Sambrook et al., supra.

Stanice domaćina sisavaca koje se upotrebljavaju za proizvodnju mpl-liganda iz ovog izuma mogu se kultivirati u različitim medijima. Komercijalno dostupni mediji kao što su Ham F10-medij (Sigma), minimalni esencijalni medij ([MEM], Sigma), te Dulbecco modificirani Eagle medij ([DMEM], Sigma) su pogodni za kultiviranje stanica domaćina. Dodatno, bilo koji od medija koji su opisani u Ham and Wallace, Meth. Enz., 58: 44 [1979], Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 [1980], U.S. Patent No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; ili 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S. Patent Re. 30, 985; ili u isto vrijeme prijavljeni U.S.S.N. 07/592,107 ili 07/592,141, koja su oba prijavljena 3 listopada 1990, i čiji su sadržaji inkorporirani ovdje kao reference, mogu biti uporabljeni kao madiji za kultiviranje stanica domaćina. Svaki od tih medija može biti obogaćen ako je potrebno hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što je insulin, transferin, ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijev klorid, kalcij, magnezij, i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleozidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je Gentamicin™ lijek), elementima u tragovima (definirani kao anorganski spojevi koji su uobičajeno prisutni u finalnim koncentracijama u mikromolarnom rasponu), i glukozom ili nekim ekvivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi bitni dodaci mogu također biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje su dobro poznate stručnjaku iz područja. Uvjeti kultiviranja, kao što je temperatura, pH, i slično, su oni koji su prethodno uporabljeni za stanice domaćina koje su slekcionirane za ekspresiju, i koji će biti jasni svakom stručnjaku u području.

Termin stanice domaćina, o okviru ovog izuma, se odnosi na stanice u in vitro kulturi kao i na stanice koje su u životinji domaćinu.

F. Detekcija amplifikacije/ekspresije gena

Amplifikacija/ekspresija gena se može mjeriti direktno u uzorku, na primjer, uobičajenim "Southern blottingom", "northern blottingom" tako da se kvantificira transkripcija mRNA (Thomas, Proc Natl. Acad. Sci USA, 77: 5201-5205 [1980], "dot blottingom" (DNA analizom), ili hibridizacijom in situ, upotrebom prikladno obilježene probe, što se bazira na sekvenci koja je ovdje iznesena. Mogu biti uporabljeni različiti obilježivači, najčešće su to radioizotopi, naročito 32P. Međutim, mogu biti uporabljene i druge tehnike, kao što su biotinilirani nukleotidi za ubacivanje u polinukleotide. Biotin tada služi kao mjesto za vezivanje na avidin ili antitijela, koja mogu biti označena s velikim brojem obilježivača kao što su radionuklidi, fluorescentni obilježivači, enzimi, ili slično. Alternativno, mogu biti uporabljena antitijela koja raspoznaju specifične dvolančane strukture, uključujući DNA dvolančane strukture, RNA dvolančane strukture, i DNA-RNA hibridna dvolančane strukture ili DNA-protein dvolančane strukture. Antitijela, nasuprot tome mogu biti obilježena i pokus se može izvesti tako da se dvolančane strukture vežu na površinu, tako da nakon formiranja dvolančane strukture na površini, može biti utvrđena prisutnost antitijala koje je vezano za dvolančanu strukturu.

Ekspresija gena, nasuprot tome, se može mjeriti imunološkim metodama, kao što je imunohistokemijsko bojanje sekcija tkiva i pokus stanične kulture ili tkivnih tekućina, da se kvantificira direktno ekspresija genskog produkta. Uz pomoć tehnika za imunohistokemijsko bojanje, pripremi se stanični uzorak, uobičajeno dehidracijom i fiksacijom, nakon čega slijedi reakcija s obilježenim antitijelima koja su specifična za genski produkt koji je povezan s njima, a ti su obilježivači vizulano uočljivi, kao što su enzimske oznake, fluorescentne oznake, luminescentne oznake, i slično. Naročito osjetljiva tehnika bojanja koja je prikladna za uporabu u okviru ovog izuma je opisana od Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75: 734-738[1980].

Antitijela koja su korisna za imunohistokemijsko bojanje i/ili pokus s tekućim uzorcima mogu biti bilo monoklonalna, bilo poliklonalna i mogu biti pripravljena u bilo kojem sisavcu. Prikladno je da antitijela mogu biti pripravljena prema nativnom mpl-ligadndnom polipeptidu ili prema sintetičkom peptidu koji se bazira na DNA sekvenci koja je ovdje iznesena kao što je niže opisano.

G. Pročišćavanje mpl-ligandnog polipeptida

Mpl-ligand se najbolje pročišćava iz medija za kultiviranje budući da se radi o polipeptidu koji se secernira, premda se on može također dobiti iz lizata stanica domaćina kada je direktno eksprimiran bez sekretornog signala.

Kada je mpl-ligand eksprimiran u rekombinantnim stanicama koje nisu humanog porijekla, tada je mpl-ligand u potpunosti slobodan od proteina ili polipeptida ljudskog porijekla. Međutim, najčešće je još uvijek nužno pročistiti mpl-ligand od drugih rekombinantnih staničnih proteina ili polipeptida da se dobije preparacija koja je u biti homogena kao što je mpl-ligand per se. Kao prvi stupanj, medij za kultiviranje ili lizat se centrifugira da se uklone čestice koje čine otpadni stanični dijelovi. Nakon toga se odijele se membrane i solubilni proteini. Alternativno, mogu se uporabiti komercijalno dostupni fiilteri za ukoncentriravanje proteina (npr., Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracijski sistemi). Nakon toga se mpl-ligand može pročistiti iz frakcije solubilnih proteina i iz membranske frakcije lizata kulture, ovisno o tome da li je mpl-ligand slobodan ili vezan. Nakon toga se mpl-ligand pročisti od kontaminirajućih topljivih proteina i polipeptida tako da se primijeni iseljavanje i izmjena ili kromatografske procedure koje uporabljuju različite gel matrice. Ove matrice uključuju; akrilamid, agarozu, dekstran, celulozu i drugo što je prikladno za pročišćavanje proteina. Tipični kromatografski postupci koji su prikladni za pročišćavanje proteina uključuju; imunoafinitetnu (npr., anti-hmpl ligand Mab), receptor-afinitetnu (npr., mpl-lgG ili protein A Sepharose), hidrofobnu interaktivnu kromatografiju (HIC)(npr., eter, butil, ili fenil Toyopearl), lektinsku kromatografiju (npr. Gon A-Sepharose, lentil-lectin Sepharose), kromatografiju prma veličini čestica (npr., Sephadex G-75), kationske i anionske izmjenjivačke kolone (npr. DEAE ili karboksimetil i sulfopropil-celuloze), tekuću kromatografiju visoke preciznosti i reverzne-faze (RP-HPLC)) (vidi npr. Urdal et al., J. Chromatograph, 296: 171 [1984], gdje su dva sukcesivna stupnja RP-HPLC uporabljena da se pročisti rekombinantni humani IL-2). Drugi stupnjevi pročišćavanja mogu ponekad uključivati; precipitaciju etanolom, precipitaciju amonijevim sulfatom; kromatofokusiranje; preparativnu SDS-PAGE elektroforezu i slično.

Varijante mpl-liganda u kojima su neki aminokiselinski ostaci isključeni, ubačeni ili supstituirani se dobivaju na isti način kao i nativni mpl-ligand, tako da se uzmu u obzir sve bitne promjene koje rezultiraju iz tih varijacija. Na primjer, priprava mpl-liganda fuzijom s drugim proteinom ili polipeptidom, npr., bakterijskim ili virusnim antigenom, olakšava pročišćavanje; imunoafinitetna kolona koja sadrži antitijelo prema tome antigenu sada može biti uporabljena za adsorpciju fuzijskog polipeptida. Imunoafinitetna kolona kao što je kolona koja sadrži zečje poliklonalno anti-mpl-ligand antitijelo može se uporabiti za absorpciju mpl-ligandne varijante vezanjem za barem jedan od postojećih imunih epitopa. Alternativno, mpl-ligand se može pročistiti afinitetnom kromatografijom koja uporabljuje pročišćeni mpl-lgG koji je vezan za (poželjno) imobiliziranu smolu kao što je Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) ili slično, na načine koji su dobro poznati u struci. Inhibitor proteaza kao što je fenil metil sulfonil klorid (PMSF) također može biti koristan za inhibiciju proteolitičke razgradnje za vrijeme pročišćavanja, a antibiotici se mogu uključiti da se spriječi rast kontaminirajućih organizama. Stručnjak u poslu će uočiti da metode koje su prikladne za pročišćavanje nativnog mpl-liganda mogu zahtijevati neke modifikacije neophodne zbog promjena u karakteru mpl-liganda ili njegovih varijanti nakon ekspresije u rekombinantnoj staničnoj kulturi.

H. Kovalentne modifikacije mpl-ligandnog polipeptida

Kovalentne modifikacije mpl-ligandnog polipeptida su uključene u opseg ovog izuma. Oboje, nativni mpl-ligand i aminokiselinska sekvencija varijanti mpl-liganda mogu biti kovalentno modificirani. Jedan tip kovalentne modifikacije uključen u opseg ovog izuma je mpl-ligandni fragment. Varijanta mpl-ligandnog fragmenta koja ima do oko 40 aminokiselinskih ostataka može se prikladno prirediti kemijskom sintezom ili enzimskim ili kemijskim cijepanjem varijante mpl-ligandnog polipeptida pune dužine. Drugi tipovi kovalentne modifikacije mpl-liganda ili njegovih fragmenata se uvode u molekulu tako da se izvodi reakcija na ciljanom aminokiselinskom ostatatku mpl-liganda ili ostatku njegovih fragmenata, s organskim derivatizirajućim sredstvom koje može reagirati sa selekcioniranim pokrajnjim lancima ili s N- ili C- terminalnim krajem.

Cisteinilski ostaci najčešće reagiraju s α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što je klorooctena kiselina, kloroacetamid i tako nastaju karboksimetil ili karboksiamido metil derivati. Cisteinilski ostaci se također mogu derivatizirati reakcijom s bromotrifluoracetonom, α-bromo-β-(5-imidozoil) propionskom kiselinom, kloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, p-kloromerkuribenzoatom, 2-kloromerkuri-4-nitrofenolom, ili kloro-7-nitrobenzo-2oksa-1,3-diazolom.

Histidilni ostaci se derivatiziraju reakcijom s dietilpirokarbonatom na pH 5,5-7,0 budući da je ovaj reagens relativno specifičan za histidilni pokrajnji lanac. Para-bromofenacil bromid je također koristan; za reakciju je najbolje da se provodi u 0,1 M natrijevom kakodilatu pH 6,0.

Lizinilni ostaci i amino terminalne ostaci reagiraju sa sukcinatnim ili drugim anhidridom karboksilnih kiselina. Derivatizacija s ovim agensima ima utjecaja na stvaranje suprotnog naboja lizinilnih ostaka. Drugi prikladni reagensi za derivatizaciju ostataka koji imaju amino-skupinu uključuju imidoestere kao što su metil pikolinimidat; piridoksal fosfat, piridoksal, kloroborohidrid; trinitrobenzen sulfonska kiselina; O-metilizourea; 2,4 pentandion; i reakciju s glioksilatom kataliziranu transaminazama.

Arginilni ostaci se modificiraju reakcijom s jednim ili više konvencionalnih reagensa, na primjer fenilglioksalom, 2,3 butandionom, 1,2-cikloheksandionom i nhidrinom. Derivatizacija argininskih ostataka zahtijeva da reakcija bude izvedena u alkalnim uvijetima budući da je pKa gvanidinske funkcionalne skupine visok. Nadalje, ovi reagensi mogu reagirati s grupama lizina kao i argininskom epsilon-amino skupinom.

Specifična modifikacija tirozilnih ostataka može se načiniti, s naročitom namjerom da se uvedu spektralni obilježivači u tirozilne ostatake reakcijom s aromatskim diazonijevim spojevima ili tetranitrometanom. Najčešće se uporabljuju N-acetilimidazol i tetranitrometan za stvaranje 0-acetil tirozil specija i 3-nitro derivata. Tirozilni ostaci se jodiraju uporabom 125I i 131I i tako se dobivaju obilježeni proteini za uporabu u radioimuno određivanju, za to je prikladna prije opisana kloramin T metoda.

Karboksilni pokrajnji lanci (aspartil ili glutamil) se selektivno modificiraju reakcijom s karbodiimidima (R-N=C=N-R’) gdje su R i R' različite alkilne skupine, kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimd. Nadalje, aspartilni i glutamilni ostaci se prevode u asparaginilne i glutaminilne ostatke reakcijom s amonijevim ionima.

Derivatizacija s bifunkcionalnim reagensima je korisna za unakrsno povezivanje mpl-liganda s u vodi netopljivom matriksnom podlogom ili površinom za uporabu u metodi za pročišćavanje anti-mpl-ligandnih antitijela i viče versa. Najčešće uporabljivani reagensi za unakrsno povezivanje uključuju, npr., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidni esteri, na primjer, esteri s 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalni imidoesteri, uključujući disukcinirnidil estere kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalni maleimidi kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Derivatizirajući agensi kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat daju međuprodukte koji se mogu fotoaktivirati i koji mogu stvarati unakrsna povezivanja u prisutnosti svjetla. Alternativno, reaktivne i u vodi netopive matrice, kao što je cijanogen bromom aktivirani ugljikohidrat i reaktivni supstrati opisani u U.S. Patentima No. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 se uporabljuju za imobilizaciju proteina.

Glutaminilni i asparaginilni ostaci su često deamidirani u odgovarajuće glutamilne i aspartilne ostatke. Ovi ostaci se deamidiraju pri neutralnim ili bazičnim uvjetima. Deamidirane forme ovih ostataka spadaju u opseg ovog izuma.

Druge modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih skupina serilnih ili treonilnih ostataka, metilaciju α-amino skupina lizina, arginina, i histidinskih pokrajnjih lanaca (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco pp. 79-86 [1983]), acetilaciju N-terminalnog amina i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne skupine.

Drugi tip kovalentne modifikacije mpl-ligandnog polipeptida koji je uključen u opseg ovog izuma uključuje mijenjanje nativnog glikozilacijskog uzorka polipeptida. Pod promijenom se podrazumijeva uklanjanje jedne ili više ugljikohidratnih jedinica koje se mogu naći u nativnom mpl-ligandu i/ili dodavanje jednog ili više mjesta za glikozilaciju koja nisu bila prisutna u nativnom mpl-ligandu.

Glikozilacija polipeptida je tipično, bilo N-vezana ili O-vezana. N-vezana označava vezivanje ugljikohidratnog dijela na pokrajnji lanac argininskog ostatka. Tripeptidna sekvencija asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gdje je X bilo koja aminokiselina osim prolina, je sekvencija za raspoznavanje za enzimsko pričvršćivanje ugljikohidratnog dijela na pokrajnji lanac argininskog ostatka.

Tako, prisutnost bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno glikozilacijsko mjesto. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, premda 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin mogu također biti uporabljeni.

Dodavanje glikozilacijskih mjesta na mpl-ligandni polipeptid najčešće se izvršava mijenjanjem aminokiselinskog slijeda tako da on sada sadrži jednu ili više gore navedenih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana glikozilacijska mjesta). Promjena može također biti izvršena dodatkom, ili supstitucijom s jednim ili više serinskih ili treoninskih ostataka u nativnu sekvenciju mpl-liganda (za O-vezanu glikozilaciju). Zbog jednostavnosti, aminokiselinska sekvencija se najčešće mijenja promjenama na DNA razini, naročito mutiranjem DNA koja kodira mpl-ligandni polipeptid na predodređenom mjestu, tako da se generiraju kodoni koji će zatim biti translatirani u poželjnu aminokiselinu. Mutacije u DNA mogu se izvoditi korištenjem metoda koje su opisane pod naslovom "Aminokiselinska sekvencija varijanti mpl-liganda."

Drugi način povećanja broja ugljikohidratnih jedinica na mpl-ligandu je kemijsko ili enzimsko vezivanje glikozida na polipeptid. Ove metode su prikladne zbog toga što ne zahtijevaju sintezu polipeptida u stanici domaćinu koja ima sposobnost N- ili O- vezane glikozilacije. U ovisnosti o tome koji je način vezanja odabran šećer(i) se mogu vezati na (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobnodne sulfhidrilne grupe kao što su one od cisteina (d) slobnodne hidroksilne grupe kao što su one od serina, treonina ili hidroksiprolina, (e) na aromatske ostatke kao što su fenilalanin, tirozin ili triptofan, ili (f) amidna grupa glutamina. Ove metode su opisane u WHO 87/05330 publicirane 11 rujna 1987, te u Aplin i Wriston, CRC Crit. Rev.Biochem., pp. 259-306 [1981].

Uklanjanje ugljikohidratnih jedinica koje se nalaze na molekuli mpl-ligandnog polipeptida može se izvršiti kemijski ili enzimski. Kemijska deglikozilacija zahtijeva interakciju polipeptida i trifluormetansulfonske kiseline, ili nekog drugog ekvivalentnog spoja. Kao rezultat ovakove obrade doći će do cijepanja većine od svih šećera osim veznog šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), dok će sam polipeptid ostaviti intaktnim. Kemijska deglikozilacija je opisana u Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 [1987], te u Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 [1981]. Enzimsko cijepanje ugljikohidratnih jedinica na polipeptidirna može se učiniti upotrebom različitih endo- i egzo-glikozidaza kao što je to opisano kod Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 [1987].

Glikozilacija, na potencijalnim mjestima za glikozilaciju, se može spriječiti upotrebom tunikamicina kao što je to opisao Duskin et al., J. Biol. Chem., 257: 3105 [1982]. Tunikamicin blokira stvaranje veze protein-N-glikozid.

Drugi tip kovalentne modifikacije mpl-liganda odnosi se na vezivanje mpl-ligandnog polipeptida s jednim od množine neproteinskih polimera, kao što je to polietilen glikol, polipropilen glikol, ili polioksialkilen, na način kako je to opisano u U.S. Patentima Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337.

Treba imati u vidu da je potrebno provesti određeno pretraživanje pripravljenog mpl-liganda da bi se izdvojila optimalna varijanta za vezivanje na mpl koja će imati imunološku i/ili biološku aktivnost koja je gore opisana. Ispitivati se može stabilnost u rekombinantnoj staničnoj kulturi ili u plazmi (npr., u odnosu na proteolitičko cijepanje), visoki afinitet za mpl član, oksidacijsku stabilnost, mogućnost izlučivanja u povećanim količinama, i slično. Na primjer, promjena u imunološkim osobinama mpl-ligandnog polipeptida, kao što je afinitet za određeno antitijelo, se mjeri primjenom kompetitivnog tipa irnuno oderđivanja. Druge potencijalne modifikacije karakteristika proteina ili polipeptida kao što je redoks ili termalna stabilnost, hidrofobnost ili osjetljivost na proteolitičku razgradnju se određuju metodama koje su dobro poznate svakom stručnjaku u području.

17. Opće metode za pripravu antitijela na mpl-ligand

Priprava antitijela

(i) Poliklonalna antitijela

Poliklonalna antitijela na mpl-ligandni polipeptid ili njegove fragmente se općenito stavraju u životinjama nakon višekratnih subkutanih (se) injekcija ili nakon intraperitonealnih (ip) injekcija mpl-liganda i adjuvantnog sredstva. Može se pokazati korisnim konjugirati mpl-ligand ili fragment koji koji sadrži ciljanu aminokiselinsku sekvenciju s proteinom koji je imunogeničan za vrstu koju treba imunizirati, npr., hemocijanin morskog puža (Keyhole limpet), serumski albumin, goveđi tireoglobulin, tripsin inhibitor iz soje, korištenjem bifunkcionalnog ili derivatizirajućeg sredstva, kao što je maleimidobenzoil sulfosukcinimid ester (konjugacijom preko cisteinskih ostataka), N-hidroksisukcinimid (preko lizinskih ostataka), glutaraldehida, sukcinatnog andidrida, SOCl2 ili R1N = C = NR, gdje su R1 i R različite alkilne skupine.

Životinje se imuniziraju prema mpl-ligandnom polipeptidu ili fragmentu imunogenim konjugatima ili derivatima kombiniranjem 1 mg od 1 μg peptida ili konjugata (za zečeve ili miševe) s 3 volumena Freundovog kompletnog adjuvanta i to se injicira životinjama intradermalno na više mjesta. Jedan mjesec nakon toga životinjama se ponovno daje poticajna doza od 1/5 do 1/10 od originalno primijenjene doze polipeptida ili konjugata u Freundovom kompletnom adjuvantu te se injicira intradermalno na više mjesta. Sedam do 14 dana kasnije životinje se iskrvare i u serumu se izvrši određivanje titra antitijela na mpl-ligand. Životinjama se ponovno daje poticajna doza dok se ne postigne maksimalni titar antitijela. Poželjno je da se poticajna doza daje u obliku konjugata samog mpl-liganda, ali konjugiranog s različitim proteinom i/ili putem različitog reagensa za unakrsno povezivanje. Konjugati se također mogu načiniti u rekombinantnoj staničnoj kulturi kao fuzijski proteini. Mogu se također primijeniti i agregirajući agensi kao što je alum tako da se pojača imuni odgovor.

(ii) Monoklonalna antitijela

Monoklonalna antitijela se dobivaju iz populacije u biti homogenih antitijela, tj. individualnih antitijela koja čine populaciju i koja su međusobno identična osim za slučaj da je došlo do prirodno uzrokovanih mutacija koje se mogu javljati u manjim količinama. Tako opis "monoklonalni" naznačuje karakter antitijela koja nisu smjesa pojedinačnih antitijela.

Na primjer, mpl-ligandna antitijela iz ovog izuma mogu se načiniti uporabom hibridoma metode koja je prvi puta opisana od Kohler & Milsteina, Nature, 256: 495 [1975], ili se mogu pripraviti uporabom rekombinantnih DNA metoda (U.S. Patent No. 4,816,567 [Cabilly et al.]).

U hibridoma metodi se, miš ili druga prikladna životinja kao što je hrčak, imunizira na prije navedeni način tako da se stvore limfociti koji su sposobni stvarati antitijela koja će se specifično vezati na protein koji je uporabljen za imunizaciju. Alternativno, limfociti se mogu imunizirati in vitro. Nakon toga limfociti se fuzioniraju s mijeloma stanicama uz uporabu prikladnog agensa za fuziju, kao što je polietilan glikol, i tako stvore hibridoma stanice (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 [Academic Press, 1986]).

Hibridoma stanice koje su pripravljene na ovaj način zasade se i uzgajaju u prikladnom mediju za uzgajanje za koji je poželjno da sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljenje nefuzioniranih, parentalnih mijeloma stanica. Na primjer, ako parentalnim mijeloma stanicama nedostaje enzim hipoksantin gvanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), medij za uzgajanje hiibridoma stanica tipično će sadržavati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medij), supstance koje sprečavaju rast stanica koje nemaju HGPRT.

Poželjne mijeloma stanice su one koje se efikasno fuzioniraju, podupiru stabilnu, visoku razinu ekspresije antitijela od selekcionirannih stanica koje stvaraju antitijela i osjetljive su na medij kao što je HAT medij. Među njima, nabolje su mijeloma stanične linije koje potječu od laboratorijskih miševa i štakora, kao što su one koje potječu od MOPCK-1 i MPC-11 mišji tumori koji se mogu dobiti sa Salk Institute Celi Distribution Center, San Diego, California USA, te SP-2 stanice koje se mogu dobiti od American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Humane mijeloma i humane-mišje heteromijeloma stanične linije su također opisane za produkciju humanih monoklonalnih antitijela (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Medij za kultiviranje u kojemu se uzgajaju hibridoma stanice se ispituje na produkciju monoklonalnih antitijela koja su usmjerena na mpl-ligand. Poželjno je da se specifičnost vezanja monoklonalnih antitijela koja stvaraju hibridoma stanične linije utvrdi imunoprecipitacijom ili nekim in vitro testom vezanja, kao što je radioimunološko određivanje (RIA) ili enzim-vezani imunoadsorpcijski test (ELISA).

Afinitet vezanja monoklonalnih antitijela može, na primjer, biti određen Scatchard analizom prema Munson & Pollard Anal. Biochem., 107: 220 [1980].

Nakon što se utvrdi da hibridoma stanice stvaraju antitijela koja imaju poželjnu specifičnost, afinitet, i/ili aktivnost, klonovi se mogu dalje subklonirati s ograničenim postupcima razrjeđivanja i uzgajati uobičajenim metodama (Goding, supra). Prikladni mediji za kultiviranje za ovu svrhu uključuju, na primjer, Dulbecco's Modified Eagle's Medium ili RPMI-1640 medij. Nadalje, hibridoma stanice mogu rasti in vivo kao ascitesni tumori u životinji.

Monoklonalna antitijela koja secerniraju subklonovi mogu se prikladno odijeliti od medija za kultiviranje, ascitesne tekućine ili seruma konvencionalnim imunoglobulinskim metodama pročišćavanja kao što su na primjer protein-A Sepharose, hidroksilapatit kromatografijom, gel elektroforezom, dijalizom, ili afinitetnom kromatografijom.

DNA koja kodira monoklonalna antitijela iz ovog izuma se lako može izolirati i sekvencionirati uporabom konvencionalnih procedura (npr., uporabom oligonukleotidnih proba koje se mogu specifično vezati za gene koji kodiraju teške i lake lance antititijela koja potječu od laboratorijskih miševa ili štakora). Hibridoma stanice iz ovog izuma služe kao preferirani izvor takve DNA. Kada je jednom izolirana, DNA se može uklopiti u ekspresijski vektor koji se nakon toga koristi za transfekciju stanica domaćina kao što su majmunske COS stanice, stanice ovarija kineskog hrčka (CHO), ili mijeloma stanice koje inače ne produciraju imunoglobulinske proteine, tako da se se potakne sinteza monoklonalnaih antitijela u rekombinantnim stanicama domaćina. DNA može također biti modificirana, na primjer, supstitucijom kodirajuće sekvencije za konstantnu domenu humanih teških i lakih lanaca na mjestu homologne sekvencije kod laboratorijskih miševa ili štakora (Cabilly et al., supra; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851 [1984], ili kovalentnim povezivanjem s imunoglobulinskom kodirajućom šekvencom cjelokupnog ili dijela kodirajuće sekvencije za ne-imunoglobulinski polipeptid.

Tipično je da su takavi ne-imunoglobulinski polipeptidi supstituirani za konstantnu domenu antitijela iz ovog izuma, ili su supstituirani za varijabilnu domenu jednog antigen vežućeg mjesta iz antitijela iz ovog izuma tako da stvaraju kimerično bivalentno antitijelo koje se sastoji od jednog antigen vežućeg mjesta koje ima specifičnost prema mpl-ligandu i drugog antigen vežućeg mjesta koje ima specifičnost prema drugom antigenu.

Kimerična ili hibridna antitijela mogu biti također pripravljena in vitro uporabom poznatih metoda sintetske proteinske kemije, uključujući one koje uporabljuju unakrsno-povezujuće reagense. Na primjer, imunotoksini se mogu konstruirati uporabom disulfidne reakcije izmjene ili stvaranjem tioeterske veze. Primjeri prikladnih reagensa sa ove svrhe uključuju iminotiolat i rnetil-4-merkaptobutirimidat.

Za dijagnostičku primjenu, antitijela iz ovog izuma tipično će biti obilježena sa skupinom koja se može određivati. Skupina koja se može određivati može svaka ona koja može stvarati direktno ili indirektno neki signal dostupan određivanju ili mjerenju. Na primjer, skupina koja se može određivati može biti radioizotop, kao što je 3H, 14C, 32P, 35S, ili 125I, fluorescentni ili kemiluminescentni spojevi kao što su fluorescein, izotiocijanat, rodamin, ili luciferin; radioaktivni izotopni bilježi ako što su npr., 3H, 14C, 32P, 35S, ili 125I, ili enzimi poput alkalne fosfataze, beta-galaktozidaze ili peroksidaze iz hrena.

Može se uporabiti bilo koja metoda koja je poznata u struci za konjugiranje antitijela sa skupinom koja se može određivati, uključujući one metode koje su opisane od Hunter et al., Nature, 144:945 [1962]; David et al., Biochemistry, 13:1014 [ 1974]; Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219[1981]; Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 [1982].

Antitijela iz iznesenog izuma mogu se uporabiti u bilo kojem eksperimentalnom postupku, kao što su kompetititvni postupci vezanja, direktni i indirektni "sandwich" postupci i imunoprecipitacijski postupci. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Kompetititvni postupci vezanja temelje se na sposobnosti obilježenog standarda (koji može biti mpl-ligand ili neki njegov imunološki reaktivno dio) da kompetira s analitom iz uzorka (mpl-ligand) za vezanje na ograničenu količinu antitijela. Količina mpl-liganda u testiranom uzorku je obrnuto proporcionalna količini standarda koji se vezao za antitijela. Da se olakša određivanje količine standarda koji se vezao, najčešće se antitijela vežu za neku čvrstu podlogu te tako imobiliziraju prije ili poslije reakcije vezanja, te se tada standard i analit koji su vezani za antitijela mogu prikladno odijeliti od standarda i anlita koji su ostali nevezani.

"Sandvvich" postupci uključuju uporabu dvaju antitijela, gdje je svako u stanju vezati različiti imunogeni dio, ili epitop, nekog proteina (mpl-liganda) i tako omogućiti određivaje. U "sandwich" postupku, analit iz testiranog uzorka se veže s prvim antitijelom koje je imobilizirano na čvrstoj podlozi, i nakon toga se drugo antitijelo veže za analit i stvara netopivi kompleks sastavljen od triju komponenata. David& Green, U.S. Patent No. 4,376,110. Sekundarno antitijelo može samo po sebi biti obilježeno pomoću nekog biljega koji se može određivati (direktni "sandwich" postupak), ili se može mjeriti korištenjem anti-imunoglobulinskog antitijela koje je obilježeno s biljegom koji se može određivati (indirektni "sandwich" postupak). Na primjer, jedan tip "sandvvich" postupaka koji se koristi u ELISA postupku, je onaj kada se kao biljeg za određivanje koristi neki enzim (npr. peroksidaza iz hrena).

(iii) Humanizirana i humana antitijela

Metode za humaniziranje ne-humanih antitijela su dobro poznate u struci. Općenito, humanizirana antitijela su ona koja imaju jedan ili više aminokiselinskih ostataka ubačenih u izvor koji originalno nije humani. Ovi ne-humani aminokiselinski ostaci se obično opisuju kao "uvezene" varijabilne domene. Humanizacija se može u biti načiniti prema metodi Wintera i sur. (Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332:323-327 [1988]; Verhoeven et al., Science, 239:1534-1536 [1988], supstitucijom CDR iz glodavaca ili CDR sekvenci za odgovarajuću sekvenciju humanog antitijela. U skaladu s iznesenim, takva "humanizirana" antitijela su kimerična antitijela (Cabilly et al., supra), gje je bitno manje nego što je intaktna humana varijabilna domena supstituirano odgovarajućom sekvencom ne-humane vrste. U praksi, humanizirana antitijela su tipična humana antitijela u kojima su neki CDR ostaci i moguće neki FR ostaci supstituirani ostacima analognih mjesta u antitijelima glodavaca.

Izbor humanih varijabilni domena, i lakih i teških, koja će biti korištena za stvaranje humaniziranih antitijela je vrlo važan u svrhu smanjenja antigeničnosti. U skladu s tzv. "metodom najboljeg poklapanja", sekvencija varijabilne domene u antitijelu glodavaca se pretražuje i uspoređuje s cjelokupnom bibliotekom poznatih sekvenci humanih varijabilnih domena. Humana sekvencija koja je najbliža onoj od glodavaca se tada prihvaća kao humani okvir (FR) za humaniziranao antitijelo (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 [1993]; Chotia & Lesk, J.Mol. Biol., 196:901 [1987]). Druga metoda koristi specijalni okvir koji se izvodi iz konsenzus sekvencije za sva humana antitijela određene subgrupe lakih i teških lanaca. Isti okvir se može koristti za više različitih humaniziranih antitijela (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285[1992]; Presta et al., J. Immunol., 151:2623 [1993]).

Dalje je važno da antitijela budu humanizirana uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen, te uz sačuvane ostale poželjne biološke osobine. U svrhu postizanja tog cilja, u skaladu s poželjnom metodom, humanizirana antitijela se pripravljaju procesom analize parentalne sekvencije i različitih konceptualiziranih humaniziranih produkata korištenjem trodimenzionalnih modela parentalne i humanizirane sekvencije. Trodimenzionalni imunoglobulinski modeli su vrlo često dostupni i poznati stručnjacima u području. Danas su dostupni programi za računalo koji opisuju vjerojatnu trodimenzionalnu konformacijsku strukturu pojedinih izabranih imunoglobulinskih sekvencija. Analiza takvih podataka dozvoljava predviđanje uloge pojedinih aminokiselinskih ostataka u djelovanju određene imunoglobulinske sekvencije, tj. analizu ostataka koji utječu na sposobnost imunoglobulina da veže odgovarajući antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti izabrani i kombinirani od konsenzus i "uvezene" sekvencije, tako da se postigne poželjna osobina antitijela, kao što je povećani afinitet za ciljni antigen. Općenito, CDR ostaci su direktno i najhitnije uključeni u djelovanje na vezivanje antigena. Detaljnije je to izneseno u U.S. aplikaciji Serijski broj 07/934,373 prijavljenoj 21 kolovoza 1992, koja je u kontinuitetu dio aplikacije ser. br. 07/715,272 prijavljenoj 14 lipnja 1991.

Alternativno, sada je moguće stvoriti transgenične životinje (npr., miša) koji su sposobni da nakon imunizacije stvaraju cijeli spektar humanih antitijela u odsutnosti endogenog stvaranja imunoglobulina. Na primjer, bilo je opisano da homozigotna delecija regije koja povezuje teške lance antitijela (JH) gena u kimeričnom mišu i u mutantu za germinativnu staničnu liniju rezultira kompletnom inhibicijom endogene produkcije antitijela. Transfer humanog gena za germinativnu staničnu liniju rezultira da se u takvom mutantnom mišu za germinativnu staničnu liniju, počnu stvarati humana antitijela kao odgovor na izlaganje antigenu. Vidi, npr., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555[1993]; Jakobovits et at., Alafure,362:255-258[19.93]; Bruggerman et al.,Year in Immuno., 7:33[1993]. Humana antitijela se mogu također stvarati u bibliotekama faga (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol.,222:581 [1991]).

(iv) Bispecifična antitijela

Bispecifična antitijela su monoklonalna, poželjno humana ili humanizirana, antitijela koja imaju specifičnost vezanja za barem dva antigena. Metode priprave bispecifičnih antitijela su dobro poznate u struci.

Tradicionalno, rekombinantna produkcija bispecifičnih antitijela se temelji na koekspresiji dvaju imunoglobulinskih parova teški lanci-laki lanci, gdje dva teška lanca imaju različite specifičnosti Millstein & Cuello Nature, 305:537-539[1983]). Zbog slučajnog svrstavanja imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ove hibridoma stanice (Ikvadroma) stvaraju potencijalnu smjesu od 10 različitih molekula antitijela, od kojih samo jedna imaju ispravnu bispecifičnu strukturu. Pročišćavanje ispravne molekule, koje se najčešće radi uporabom više stupnjeva afinitetne kromatografije, vrlo je nepraktično, a i iskorištenje produkta je relativno nisko. Slični postupci su objavljeni u PCT publikaciji No. WO 93/08829 (publicirano 13 svibnja 1993), te u Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659[1991].

Prema različitim i boljim pristupima, varijabilne domene antitijela koje imaju poželjnu specifičnost vezanja (antigen-antitijelo vezno mjesto) se fuzioniraju sa sekvencijama konstantne domene imunoglobulina. Poželjno je da se fuzijom povezu konstantna domena imunoglobulinskih teških lanaca, koja uključuje dio "šarke", CH2 i CH3 regije. Poželjno je da u barem jednoj od fuzija bude prisutna prva konstantna regija teških lanaca (CH1) i da ona sadrži mjesto koje je neophodno za vezanje lakih lanaca. DNA koja kodira fuzije teških imunoglobulinskih lanaca i, ako je potrebno imunoglobulinske lake lance, je ubačena u posebne ekspresijske vektore, i nakon toga je ubačena kotransfekcijom u pogodni organizam domaćina. Ovaj postupak stvara veliku fleksibilnost u prilagođavanju međusobnih proporcija triju polipeptidnih fragmenata u cjelinu kada se ovi poMpeptidni lanaci koriste u međusobno nejednakim omjerima da bi se postigla maksimalna učinkovitost. Moguće je, također, ubaciti kodirajuću sekvenciju za dva ili tri polipeptidna lanca u jedan ekspresijski vektor kada ekspresija dvaju polipeptidnih lanaca u jednakim omjerima rezultira visokim iskorištenjem, ili kada omjeri nisu od posebnog značenja. U predloženoj cjelini ovoga pristupa, bispecifična antitijela se sastoje od hibridnih teških lanaca imunoglobulina s prvom regijom specifičnog vezanja u jednoj ruci, i hibridnog para sastavljenog od teškog lanca i lakog lanca imunoglobulina (koji daje sekundarnu specifičnost vezanja) u drugoj ruci. Pronađeno je da ova asimetrična struktura olakšava odjeljivanje poželjnih bispecifičnih spojeva od nepoželjnih kombinacija imunoglobulinskih lanaca, kao što je prisutnost jednog lakog lanca imunoglobulina u samo jednoj polovici bispecifične molekule što olakšava načine separacije. Ovaj pristup je opisan u također predloženoj aplikaciji serijski broj No. 07/931,811 prijavljenoj 17 kolovoza 1992.

Drugi detalji stvaranja bispecifičnih antitijela opisani su u , na primjer, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210[1986]

(v) Heterokonjugirana antitijela

Heterokonjugirana antitijela su također obuhavaćena opsegom ovog izuma. Heterokonjugirana antitijela se sastoje od dvju kovalentno povezanih antitijela. Takva antitijela imaju mogućnost, na primjer, usmjeravanja sistemskih imunoloških stanica na nepoželjne stanice (U.S. Patent No. 4,676,980), te za tretman HIV infekcija (PCT publikacije Nos. WO 91/00360 i WO 92/00373; EP 03089). Heterokonjugirana antitijela se mogu načiniti korištenjem određenih metoda za unakrsno povezivanje. Pogodna sredstva za unakrsno povezivanje su dobro poznata u struci, te su također objavljena u U.S. Patentu No. 4,676,980, zajedno s brojnim drugim tehnikama za unakrsno povezivanje.

IV Terapijska uporaba megakariocitopoetskog proteinskog mpl-liganda

Biološki aktivan mpl-ligand koji ima efektorsku funkciju i koji se ovdje opisuje kao megakariocitopoetski ili trombocitopoetski protein (TPO) može se uporabiti u sterilnoj farmaceutskoj preparaciji ili formulaciji za stimulaciju megakariocitopoetske ili trombocitopoetske aktivnosti u pacijenata koji pate od trombocitopenije koja je uzrokovana poremećenom produkcijom, lučenjem ili pojačanom destrukcijom trombocita. Trombocitopenija koja je povezana s hipoplazijom koštane srži (npr. aplastična anemija koja je posljedica kemoterapije ili transplantacije koštane srži) može se uspješno liječiti spojevima iz ovog izuma, kao i poremećaji poput diseminirane . intravaskularne koagulacije (DIC), imune trombocitopenije (uključujući ITP induciranu HlV-om, ili non-HIV induciranu ITP), kronične idiopatske trombocitopenije, kongenitalne trombocitopenije, mijelodisplazije, te trombotičke trombocitopenije. Dodatno, ovi megakariocitopoetski proteini mogu se uspješno koristiti u trapiji mijeloproliferativnih trombocitotičkih bolesti kao i trombocitoza koje su rezultat upalnih stanja ili nedostatka željeza.

Preferirana uporaba megakariocitopoetskih ili trombocitopoetskih proteina naznačenih ovim izumon (TPO) je u vezi s mijelotoksičnom terapijom, mijeloablativnom terapijom i trombocitopenijom koja je uzrokovana problemima s koštanom srži.

Drugi poremećaji koji se uspješno tretiraju s megakariocitopoetskim proteinima naznačenim u ovom izumu uključuju probleme ili oštećenja trombocita koji su posljedica primjene lijekova, otrovanja ili aktivacijom na umjetnim površinama. U ovim slučajevima moraju biti uporabljeni neposredni spojevi koji će stimulirati izbacivanje novih "neoštećenih" trombocita. Za stvaranje kompletnije liste korisnih primjena, vidi poglavlje "Temelji izuma", supra, naročito odjeljke (a)-(f) i literaturne navode koji su tamo citirani.

Megakariocitopoetski proteini naznačeni ovim izumom mogu se uporabiti sami ili u kombinaciji s drugim citokinima, hematopoetinima, interleukinima, faktorima rasta, ili antitijelima u tretiranju gore navedenih poremećaja i stanja. Tako, navedeni spojevi mogu biti korišteni u kombinaciji s drugim proteinima ili peptidima koji imaju trombopoetsku aktivnost uključujući; G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, l L-3, eritropoetin (EPO), kit-ligand, IL-6 i IL-11.

Megakariocitopoetski proteini naznačeni ovim izumom su pripravljeni u smjesi s farmaceutski prikladnom pomoćnom tvari. Ova terapijska kombincija može se primjenjivati intravenozno, ili kroz nos ili pluća. Pripravak se također može davati parenteralno ili supkutano, prema potrebi. Kada se daje sistemski, terapijska kombincija ne smije sadržavati nikakav pirogen, te mora biti u obliku prikladnom za parenteralnu primjenu, vodeći računa o pH, Izotoničnosti i stabilnosti. Ovi su uvijeti dobro poznati svakom stručnjaku. Ukratko, oblici za doziranje spojeva iz opsega ovog izuma su pripravljeni za čuvanje ili primjenu miješanjem spojeva koji imaju poželjan stupanj čistoće s fiziološki prihvatljivim pomoćnim sredstvima, ekscipijentima ili stabilizatorima. Takvi materijali su netoksični za primatelja u dozama i koncentracijama koje se primjenjuju i uključuju pufere kao što je fosfatni, citratni, acetatni i druge soli organskih kiselina; antioksidanse kao što je askorbinska kiselina; niskomolekularne peptide (manje od 10 aminokiselinskih ostataka) poput poliarginina, proteina kao što je serumski albumin, gelatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidinon; aminokiseline kao što je glicin, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina ili arginin; monosaharide, disaharide i druge ugljikohidrate uključivši celulozu ili njezine derivate, glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense poput EDTA; Šećerne alkohole kao što je manitol ili sorbitol; protu ione kao što su natrij i/ili neionske površinski aktivne tvari kao što je Tween, Pluronics ili polietilenglikol.

Otprilike 0,5 do 500 mg spoja ili smjese megakariocitopoetskih proteina u obliku slobodnih kiselina ili baza ili kao farmaceutski prihvatljive soli se pomiješa s fiziološki prihavtljivom pomoćnom tvari, nosačem, ekscipijentom, tvari za vezanje, prezervativom, stabilizatorom, aromatizirajućim sredstvom, itd. kao što to već traži prihvaćena farmaceutska praksa. Količina aktivnog sredstva u ovim pripravcima je takova da se dobije raspon doza prikadan za primjenu.

Sterilne kombinacije za injekcije mogu se pripraviti prema konvencionalnim načinima farmaceutske prakse. Na primjer, otapanje ili suspendiranje aktivne tvari u pomoćnom sredstvu kao što je voda ili normalno prirodno biljno ulje poput sezama, kikirikija ili ulju pamučnih sjemenaka, ili sintetičnom masnom pomoćnom sredstvu poput etilnog oleata ili već prema potrebi. Puferi, prezervativi, antioksidansi i slično mogu se uporabiti u skladu s načelima prihvaćene farmaceutske prakse.

Prikladni primjeri za preparate produženog djelovanja uključuju semipermeabilne matrice krutih hidrofobnih polimera koji sadržavaju polipeptide, a matrice mogu biti određenog definiranog oblika kao što su npr., filmovi ili mikrokapsule. Primjeri matrica za produženo otpuštanje uključuju poliestere, hidrogelove, [npr. poli(2-hidroksietil metakrilat) kao što je to opisano u Langer et al., J. Biomed. Mater, fleš., 15:167-277[ 1981]; i Langer, Chem.Tech., 12:98-105[1982] ili poli(vinilalkohol) ] poliaktidi (U.S. Patent No. 3,773,919, EP 58,481), kopolimeri L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556|[1983]), nerazgradivi etilen-vinil acetat (Langer et al., supra), razgradivi kopolimeri mliječne kiseline i glikolne kiseline kao što je Lupron Depot™ ( mikrosfere pogodnje za injiciranje koje su sastavljene od mliječne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksimliečne kiseline (EP 133,988).

Dok su polimeri poput etilen-vinil acetata i kopolimeri mliječne kiseline i glikolne kiseline sposobni otpuštati molekule više od 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine u kraćim vremenskim periodima. Kada inkapsulirani protein ostane u tijelu kroz duže vrijeme može se denaturirati ili agregirati kao rezultat izloženosti vlagi na 37°C, što može imati za poslijedicu gubitak aktivnosti i moguće promjene u imunogeničnosti. Moguće je razviti racionalne strategije koje omogućavaju stabilizaciju ovisno o mehanizmu koji je primjijenjen. Na primjer, ako je otkriveno da se mehanizam agregacije temelji na stvaranju intramolekularnih S-S veza putem izmjene disulfida, stabilizacija se može postići modificiranjem sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih otopina, kontroliranjem sadržaja vlage, korištenjem odgovarajućih aditiva, i razvijanjem specifičnih polimernih matriksnih kompozicija.

Kompozicije megakariocitopoetskog proteina koje imaju produženo oslobađanje također uključuju pripravak megakariocitopoetskog proteina koji se nalazi u liposomima. Liposomi koji sadrže megakariocitopoetski protein se pripravljaju jednom od već poznatih metoda: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692[1985]; Hvvang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034[1980]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; aplikacia japanski patent 83-118008; U.S. Patenti Nos. 4,485,045 i 4,544,545; i EP 102,324. Najčešće su liposomi vrlo mali (oko 200-800 Angstrema) unilamelarnog tipa u kojem je lipidni sadržaj veći od 30 mol. % kolesterola, a selekcinirana proporcija je takova da omogućuje optimalnu terapiju megakariocitopoetskim proteinom.

Dozu će odrediti liječnik koji će uzeti u obzir različite faktore za koje je poznato da modificiraju djelovanje lijekova uključujući ozbiljnost i tip bolesti, tjelesnu težinu, spol, prehranu, vrijeme i put primjene, liječenje i druge važne kliničke faktore. Tipično, dnevna doza će se kretati u rasponu od 0,1-100 μg kg tjelesne težine. Preferirana doza će biti u rasponu od 1-5 μg/kg/danu. Raspon doza se može kretati na isti način kao i za druge citokine, posebice G-CSF, GM-CSF i EPO. Terapijski efektivna doza se može odreditit in vitro ili in vivo metodama.

PRIMJERI

Bez dodatnog opisivanja vjeruje se da stručne osobe koristeći opise i ilustrativne primjere, mogu koristiti predstavljeni izum u cjelosti. Stoga slijedeći radni primjeri specifično izdvajaju preferirane dijelove predstavljenog izuma, a nisu pripremljeni da bi ga ograničavali na bilo koji način.

PRIMJER 1

Djelomično pročišćavanje svinjskog mpl liganda

Plazma siromašna trombocitima je sakupljena od normalnih ili aplastičnih anemičnih svinja. Aplazija kod svinja je izazvana zračenjem s 900 gGy ukupnog zračenja koristeći 4 mEV linearni akcelerator. Ozračenim svinjama davane su intramuskularne injekcije cefalozina 6-8 dana. Zatim je sva krv uklonjena pod totalnom anestezijom, heparinizirana i centrifugirana pri 1800 x g kroz 30 minuta, pri čemu je dobivena plazna siromašna trombocitima. Nađeno je da je je aktivnost koja stimulira megakariocite maksimalna 6 dana nakon zračenja.

Aplastična svinjska plazma dobivena zračenjem svinja, podešena ja na koncentraciju 4 M s NaCI i miješana je 30 minuta pri sobnoj temperaturi. Nastali talog je uklonjen centrifugiranjem pri 3800 rpm u Sorval RC3B i supernatant je nanesen na Phenyl-Toyopearl kolonu (220 ml) ekvilibriranu u 10 mM Na fosfatnom puferu (pH 7.4) koji sadrži 4 M NaCI. Kolona je prana s puferom sve dok je A280 <0.05, te je eluirana s H2O dest. Signalna eluirana frakcija koja je sadržavala maksimalni količinu proteina je razrijeđen s H2O dest., tako da vodljivost iznosi 15 mS, te je nanesen na Blue-Sepharose kolonu koje je uravnotežena u PBS (240 ml). Zatim je kolona prana s 5 volumena kolone PBS, te uireom koja je sadržavala 10 mM Na fosfatni pufer (pH 7.4). Proteini su eluirani s kolone s 10 mM Na fosfatnim puferom (pH 7.4) koja je sadržavala 2 M ureu i 1 M NaCI. Eluirana frakcija koja je sadržavala maksimalni količinu proteina je podešena da sadrži 0.01% oktil glukozid (n-okstil β-D-glukopiranozid) i 1 mM EDTA i Pefabloc (Boehinger Mannheim), te je direktno nanesen na tandemski povezane kolone CD4-lgG (Capon, D. J. et al. Nature, 337: 525-531 [1989]) ia mpl-lgG Ultralink (Pierce) (vidi dolje). CD4-lgG (2 ml) kolona je uklonjena nakon što je uzorak nanesen na mpl-lgG (4 ml) kolonu i pran je s 10 volumena kolone s PBS i s PBS koji je sadržavao 2 M NaCI, te je eluiran s 0.1 M glicin-HCI pH 2.25. Frakcije su sakupljene u 1/10 volumenu Tris-HCI (pH 8.0).

Analiza eluiranih frakcija s mpl-afinitetne kolone koristeći SDS-PAGE (4-20%. Novex gel) provedena je pod redukcijskim uvjetima i pokazala je prisutnost nekoliko proteina (SI. 5). Proteini koji se boje srebrom s najjačim intenzitetom pojavili su se kod Mr 66000, 55000, 30000, 28000 i 14000. Da bi se utvrdilo koji protein stimulira proliferaciju Ba/F3-mpl staničnih kultura, ti proteini su eluirani s gela kao što je opisano u donjem Primjeru 2.

Ultralink afinitetne kolone

10-20 mg mpl-lgG ili CD4-lgG u PBS vezano je na 0.5 g Ultralink smolu (Pierce) na način kako je opisano od proizvođača.

Konstukcija i ekspresija mpl-lgG

Kimerična molekula koja sadrži cijelu ekstracelularnu domenu humanog mpl (aminokiseline 1-491) i Fc regiju humane lgG1 molekule, je eksprimirana u 293 stanicama. cDNA fragment koji kodira aminokiseline 1-491 humanog mpl dobiven PCR iz humane megakariotske CMK stanice cDNA knižnice, je sekvenciran. Clal dio je insertiran na 5' kraj, a BstEII dio na 3' kraj. Taj fragment je kloniran uzvodno od IgGI Fc regije kodiranja u Bluescrpit vektoru između Clal i BstEII mjesta nakon djelomične digestije PCR produkta s BstEII, zboj postojanja dvaju drugih BstEII mjesta u DNA koja kodira ekstracelularnu domenu mpl. BstEII mjesto uvedeno u 3' kraj mpl PCR produkta je dizajniran da ima Fc regiju u okviru čitanja ekstracelularne domene mpl. Konstrukt je subkloniran u pRK5-tkneo vektoru između Clal i Xbal dijela i izvršena je transfekcija u 293 bubrežne stanice humanog embrija metodom s kalcij-fosfatom. Stanice su odabrane u 0.4 mg/mL G418 i izolirani su individualni klonovi. Mpl-lgG ekspesija iz izoliranih klononova je utvrđena korištenjem humane Fc specifičnog ELISA postupka. Najbolja ekspresija klonova imala je nivo ekspresija 1-2 mg/mL mpl-lgG.

Ba/F3 stanice koje ekspimiraju mpl P

cDNA koja odgovara cijeloj kodirajućoj regiji humanog mpl P je klonirana u pRK5-tkneo koji je zatim lineariziran s Noti i izvršena je transfekcija Ba/F3 staničnoj liniji ovisnoj o IL-3 pomoću elektroporacije (1x107 stanica, 9605F, 250 Volta). Nakon tri dana selekcija je započeta u prisutnosti 2 mg/mL G418. Stanice su odabrane kao skupine ili su individualni klonovi dobiveni ograničenim razrijeđenjem na ploči s 96 jažica. Odabrane stanice su čuvane u RPMI koji je sadržavao 15% FBS, 1 mg/mL G418, 20 mM glutamina, 10 mM HEPES i 100 μg/mL Pen-Strep. Ekspresija mpl P u odabranim klonovima je određena FACS analizom korištenjem anti-mpl P zečjih poliklonalnih antitijela.

Postupak odeređivanja mpl liganda u Ba/F3

Test na mpl ligand je proveden kao što je prikazano na Slici 2. Da bi se odredila prisutnost mpl liganda iz različitih izvora, mpl P Ba/F3 stanice su uzgajane bez IL-3 kroz 24 sata pri gustoći stanica 5 x 105 stanica/mL u vlažnom inkubatoru pri 37 °C u 5% CO2 i zraku. Nakon uzgoja bez IL-3, stanice su nasađene u posudu s 96 jažica pri gustoći od 50000 stanica u 200 μL medija s ili bez razrijeđenog uzorka i kultivirane su 24 sata u inkubatoru za stanične kulture. 20μL RPMI medija bez seruma sadržavalo je 1 μCi 3H-timidina što je dodano u svaku jažicu zadnjih 6-8 sati. Stanice su sakupljene na G F/C filter-pločama s 96 jažica i prane 5 puta vodom. Filteri su brojani u prisutnosti 40 μL otopine za scintilaciju (Microscint 20) u Packard Top Count brojaču.

PRIMJER 2

Visoko pročišćen svinjski mpl ligand

Protokol za eluiranje s gela

Jednake količine atinitetno pročišćenog mpl liganda (frakcija 6 eluirana s mpl-lgG kolone) i 2X Laemmli pufer za uzorak miješanje su pri sobnoj temperaturi bez reduktivnog sredstva i nanesene na Novex 4-20% poliakrilamidni gel najbrže što je moguće. Uzorak nije zagrijavan. Kao kontrola, u susjednoj traci je pufer za uzorak nanesen bez liganda. Elektroforeza je provedena pri 4-6 °C, pri 135 volta tijekom približno 2 i 1/4 sata. Pufer za elektroforezu je početno imao sobnu temperaturu. Gel je zatim uklonjen iz kutije za elektroforezu i ploča je s jedne strane gela uklonjena.

Replika gela na nitrocelulozu je pripravljena na slijedeći način: Komad nitroceluloze je ovlažen destiliranom vodom i pažljivo je postavljen na površinu eksponiranog gela, tako da zračni mjehuri ne budu prisutni. Markeri su smješteni na nitrocelulozu i na gel ploču, tako da se mjesto replike može točno odrediti nakon bojanja. Nakon približno dvije minute, nitroceluloza je pažljivo maknuta i gel je zamotan u plastični omotač i smješten je u hladionik. Nitroceluloza je bojana Biorad's zlatom za sve proteine, potresanjem u 3 x 10 ml 0.1% Tween 20 + 0.5 M NaCI + 0.1 M Tris-HCI pH7.5 kroz približno 45 minuta, a zaitm s 3 x 10 ml pročišćene vode kroz 5 minuta. Dodana je zlatna boja i ostavljeno je da se razvija sve dok nisu vrpce standarda bile vidljive. Replika je zatim isprana vodom, smještena preko plastičnog omotača na gel i pažljivo uspoređena s markerom. Položaj Novex standarda je obilježen na gel ploči i povučene su crte koje naznačuju mjesto rezanja. Nitroceluloza i platični omotač su uklonjeni i gel je rezan po nanzačenoj crti oštrim žiletom. Mjesto rezanja bilo je produljeno preko linija uzoraka, tako da su oni mogli biti korištena za utvrđivanje položaja vrpci kad je gel bio bojan. Nakon što su dijelovi gela uklonjeni, preostali gel je bojan srebrom i mjeren je položaj standarda i mjesta rezanja. Molekulska masa koja odgovara mjestu rezanja je određena Navex standardima.

12 vrpci gela je smješteno u komorice u dva elektroelutor Biorad modela 422. U komoricama su korištene membranske posudice koje izdvajaju molekule veće i manje mase12-14K. Kao pufer za eluiranje korišten je 50 nM amonij-bikarbonat + 0.05% SDS (pH približn 7.8). Jedan litar pufera je hlađen u ledenici do 4-6 °C približno 1 sat prije upotrebe. Vrpce gela su eluirane pri 10 mA/stanici (40 V početno) u ledenici pri 4-6°C. Eluiranje je trajalo približno 4 sata. Stanice su pažljivo uklonjene, a tekućina koja se nalazila iznad je uklonjena pipetom. Posuda za eluiranje je uklonjena i sva tekućina iznad membranske posudice je uklonjena pipetom. Tekućina u membranskoj posudici je uklonjena pipetmanom i sačuvana. 50 μL alikvoti pročišćene vode je zatim smješteno u posudicu, potresano je i uklanjano sve dok se nisu svi SDS kristali otapili. Nakon što su spojeni, prani su sa sačuvanom tekućinom iznad njih. Volumen ukupnog eluiranog uzorka bio je 300-500 μL po vrpci gela. Uzorci su smješteni u 10 mm Spectrapor 4 cijev za dializu koja propušta manje molekulske mase od 12-14K, a koja su bila potopljena nekoli sati u pročišćenoj vodi. Uzorci su bili dializirani preko noći pri 4-6 °C prema 600 ml fiziološke otopine puferirane fosfatom (PBS je približno 4 mM u kaliju) po 6 uzoraka. Pufer je promijenjen slijedeće jutro i dializa je nastavljena 2.5 sata. Uzorci su zatim izvađeni iz vrećica za dializu i smješteni u kivete za mikrocentrifugiranje. Uzorci su smješteni na led 1 sat, mikrocentrifugirani pri 14 rpm kroz 3 minute i supernatanti su pažljivo uklonjeni od taloga SDS. Supernatanti su zatim smješteni na led kroz približno još 1 sat i mikrocentrifugirani ponovo 4 minuta. Supernananti su razrijeđeni u PBS i podvrgnuti testu aktivnosti. Ostali uzorci su zamrznuti pri -70 °C.

PRIMJER 3

Mikrosekvenciranje svinjskog mpl liganda

Frakcija 6 (2.6 mL) s mpl-lgG afinitetne kolone je ukoncentrirana na Microcon-10 (Amicon). Da bi se spriječila apsorpcija mpl liganda na Microcon, membrana je isprana 1% SDS, te je frakciji 6 dodano 5 μL 10% SDS. Dodan je pufer za uzorke 2X (20 μl) frakciji broj 6 nakom koncnetriranja na Microconu i ukupni volumen (40 μL) smješten je u jednu traku 4-20% gradijenta akrilamidnog gela (Novex). Elektroforeza je provedena slijedeći protokol Novexa. Gel je ekvilibriran 5 minuta prije nego je proveden "elektroblotting" u 10 mM puferu 3-(cikloheksilamino)-1-propansulfonske kiseline (CAPS), pH 11.0 koje je sadržavao 10% metanola. "elektroblotting" na lmmobilon-PSQ membrani (Milipore) je izveden tijekom 45 minuta pri 250 mA konstantne struje u BioRad Trans-Blot transfer komori (32). PVDC membrana je bojana s 0.1% Coomassie Biue R-250 u 40% metanolu, 0.1% octenoj kiselini tijekom 1 minute i obezbojeni 2-3 minute s 10% octenom kiselinom u 50% metanolu. Jedini proteini koji su bili vidljivi u "blotu" u dijelu mase Mr 18000-35000 regije "blota" imali su Mr 30000, 280000 i 22000.

Vrpce pri 30, 28 i 22 kDa su podvrgnute sekvenciranju. Automatizirano sekvenciranje proteina je izvedeno u modelu 470A Applied Biosvstem sekvenatora snabdjevenim "on-line" PTH analizatorom. Sekvenator je bio modificiran da injektira 80-90% uzorka (Rodriguez, J. Chromatogr., 350:217-225 [1985]). Aceton (-12 μL/L) je dodan otapalu A za balansiranje UV apsorpcije. "Elektroblottirani" proteini su sekvencirani u posudi za "blotting". Signali su integrirani korištenjem Justice Innovation softvvare Nelson Analutical interface. Interpretacija sekvencija je provedeno na VAX 5900 (Henzel et al. J. Chromatogr., 404:41-52 [1987]. N-terminalne sekvencije (korištene su šifre od jednog slova, a nesigurnosti su naznačene zagradom) i količina dobivenog materijala (u zagradama) prikazani su u Tablici 2'.

[image]

PRIMJER 4

Test megakariocitopoeze u tekćoj suspenziji

Humane periferne skupne stanice koje su dobivene od dobrovoljnih davatelja su razrijeđene peterostuko u IMDM mediju (Gibco) i centrifuriane su 15 minuta pri sobnoj temperaturi kod 800 x g. Stanični taloži su ponovo suspendirani u IMDM i naneseni u sloju na 60% Percoll (gustoća 1.077 g/mL) (Pharmacia) i centrifuriane su pri 800 x g kroz 30 minuta. Mononuklearne stanice niske gustoće su aspirirane na međusloju i prane su 2x s IDMD i nasađene pri gustoći 1-2 x 106 stanica/mL u IMDM koji sadrži 30% FBS (1 ml konačnog volumena) u 24 jažičnu posudu za uzgajanje tkivnih kultura (Costar). APP ili APP kojem je uklonjen mpl ligand je dodan tako da koncentracija bude 10% i kulture su uzgajane 12-14 dana u vlažnom inkubatoru pri 37 °C u 5% CO2 i zraku. Kulture su također uzgajane u prisutnosti 10% APP uz dodatak 0.5 μg mpl-lgG nultog, drugog i četvrtog dana. Uklanjanje mplligandu iz APP je provedeno prelaženjem APP kroz mpl-lgG afinitetnu kolonu.

Određivanje stupnja megakariocitopoeze u tim tekućim suspenzijama kulture provedeno je modificiranom metodom Solberg et al. i korištena su radioobilježena IgG monoklonalna antitijela (HP1-1D) laboratorijskih miševa ili štakora prema GPIIbIIIa (dobiveni od Dr. Nicholsa, Mayo Clinic). 100 μg HP1-1D (vidi Grant, B. et al. Blood 69:1334-1339 [1987]) je radiooblilježeno s 1 mCi Na125l korištenjem Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) kao što je opisano od proizvođača. Radioobilježeni HP1-1D je čuvan pri -70 °C u PBS koji sadrži 0.1% oktil-glukozida. Tipična specifična aktivnost bila je 1-2 x 106 cpm/μg (>95% taloženo je u trikloroctenoj kiselini).

Tekuća suspenzija kulture je pripravljena u triplikatu za svaku ekperimentalnu točku. Nakon 12-14 dana uzgajanja, 1 ml kulture je prenesen u 1.5 mL ependorf eptuvete i centrifugirano je pri 800 x g i sobnoj temperaturi 10 minuta, a dobiveni stanični taloži su ponovo suspendirani u 100 μL PBS koji je sadržavao 0.02% EDTA i 20% telećeg seruma. 10 ng 125L. HP1-1D u 50 μl testiranog pufera je dodano suspendiranoj kulturi i inkubirano je 60 minuta pri sobnoj temperaturi (ST) uz povremeno potresivanje. Zatim su stanice sakupljene centrifugiranjem kod 800 x g kroz 10 minuta pri ST i prane su 2x puferom za testiranje. Talog je brojan 1 min. u gama brojaču (Packard). Nespecifično vezanje je određeno dodavanjem 1 μg neobilježenog HP1-1D kroz 60 minuta prije dodatka obilježenog HP1-1D. Specifično vezanje je određeno kao ukupno vezani 125I-HP1-1D umanjen za količinu vezanog u prisutnosti suviška neobilježenog HP1-1D.

PRIMJER 5

Oligonukleotidne PCR klice

Na osnovu amino-terminalne sekvencije aminokiselina dobivene od proteina s 30 kDa, 28 kDa i 18-22 kDa, pripravljeni su degenerirani oligonukleotidi za korištenje kao klice za lančanu reakciju polimeraze (PCR) (vidi Tablicu 4). Dvije skupine klica su sintetizirane, skupina 20-mera za smisleni lanac koji kodiran aminokiselinske ostatke 2-8 (mpl 1) i skupina 21-mera nesmislenog lanca koji je komplementaran sekvinciji koja kodira aminokiseline 18-24 mpl 2.

[image]

Svinjska genomna DNA izolirana iz svinjskih limfocita iz periferne krvi je korištena kao templat za PCR. 50 μL reakcije sadržavalo je: 0.8 ng svinjske genomne DNA u 10 mM Tris-HCI (pH 8.3), 50 mM KCI, 3 mM MgCl2, 100 μg/mL BSA, 400 μM dNTPs, 1μM od svake klice i 2.5 jedinica Taq polimeraze. Denaturiranje početnog templata provedeno je pri 94°C kroz 8 minuta, a zatim su slijedilo 35 ciklusa od 45 sekundi pri 94 °C, 1 minut pri 55 °C i 1 minut pri 72 °C. Završni ciklus je ostavljen 10 minuta pri 72°C. PCR produkti su odijeljeni elektroforezom na 12% poliakrilamidnom gelu i obojeni su etidij bromidom. Ukoliko je amino-terminalna sekvencija aminoliselina bila kodirana s jednim eksonom, tada se očekivalo da će ispravni PCR produkt imati 69 pb. DNA fragment te veličine je eluiran iz gela i subkloniran u pGEMT (Promega). Sekvencije triju klonova prikazane su u Tablici 5.

[image]

Mjesto PCR klice pokazano je podvučenim bazama. Ovi rezultati dokazuju N-terminalnu sekvenciju dobivenu za aminokiseline 9-17 za proteine od 30 kDa, 28 kDa i 18-22 kDa i pokazuju da je ta sekvencija kodirana jednim eksonom svinjeske DNA.

PRIMJER 6

Humani gen mpl liganda

Na osnovu rezultata iz Primjera 5, 45-mer deoksioligonukleotid nazvan pR45, dizajniran je i sintetiziran za pretraživanje genomske knjižnice. 45-mer je imao slijedeću sekvenciju:

5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3'

(SEQIDNO:28)

Taj oligonukleotid je obilježen s 32P pomoću (γ32P)-ATP i T4 kinaze i korištena za pretraživanje humane genomske DNA biblioteke u λgem12 i hibridiziran i ispiran pod uvjetima niske strogost (vidi Primjer 7). Izdvojeni su pozitivni klonovi, proočišćeni na plakovima i analizirani restrikcijskim mapiranjem i "southem blottingom" . Klon broj 4 je odabran za dodatne analize.

2.8 kb BamHI-Xbal fragment koji je hibridizirao s 45-merom je subkloniran u pBluescript SK-. Djelomično sekvenciranje DNA tog klona je izvedeno korištenjem oligonukleotidnih klica specifičnih za svinjsku sekvenciju DNA mpl liganda. Dobivena sekvencija dokazuje daje izolirana DNA koja kodira humani homolog svinjskog mpl liganda. EcoRI restrikcijsko mjesto je detektirane u sekvenciji što je omogućavalo da se izolira 390 bp EcoRI-Xbal fragment iz 2.8 kb BamHI-Xbal i subklonira u pBluescript SK-.

Oba lanca ovog fragmenta su sekvencirana. Sekvencija humane DNA i deducirana sekvencija aminokiselina prikazane su na Slici 9 (SEQ ID NO: 3 i 4). Predviđeni položaj introna u genomskoj sekvenciji također je prikazan strelicama i definira pretpostavljeni ekson ("ekson 3").

Ispitivanje predviđene sekvencije aminokiselina potvrđuje da je serinski ostatak prva aninokiselina u zrelom mpl ligandu, što je određeno izravno sekvencijskom analizom aminokiselina. Odmah uzvodno od tog kodona na predviđenu sekvenciju aminokiselina snažno upućuje signalna sekvencija koja je uključena u sekreciju zrelog mpl liganda. Regija kodiranja siganlne sekvencije je vjerojatno prekinuta na položaju nukleotida 68 introna.

u 3' smjeru izgleda da ekson završava nukleotidom 196. Taj ekson stoga kodira sekvenciju od 42 aminokiseline, od kojih su vjerojatno 16 dijelovi siganlne sekvencije, a 26 su dio zrelog humanog mpl liganda.

PRIMJER 7

cDNA humani mpl ligand pune duljine

Na osnovu humane "ekson 3" sekvencije (Primjer 6) sintetizirana su dva nedegenerirana oligonukleotida, koji odgovaraju 3' i 5' krajevima "ekson 3" sekvencije (Tablica 6).

[image]

Ove dvije klice su korištene u PCR reakciji upotrebom templata DNA iz različitih humanih cDNA biblioteka ili 1 ng Quck Clone cDNA (Clonetech) iz različitih tkiva u uvjetima opisaniim u Primjeru 5. Očekivana veličina svih ispravnih PCR produkata bila je 140 bp. Nakon analize PCR produkata na 12% poliakrilamidnom gelu, očekivana veličina DNA fragmenta detektirana je u cDNA bibliotekama pripravljenim od odraslog bubrega, 293 stanica fetalnog bubrea i cDNA pripravljene od humanih stanica fetalne jetre (Clonetech kat. br. 7171-1).

cDNA biblioteka fetalne jetre u λ DR2 (Clonetech kat. br. HL1151x) je pretražena istim 45-mernim oligonukleotidom koji je korišten za pretaživajne humane genomske biblioteke. Oligonukleotid je obilježen (γ32P)-ATP korištenjem T4 polinukleotid kinaze. Knjižnica je pretražena pod uvjetima niske strogisti hibridizacije. Filteri su prehibridizirani 2 h, te su hibridizirani s probom preko noći pri 42 °C u 20% formamidu, 5xSSC, 10xDenhardt's, 0.05M natrij-fosfatu (pH 6.5), 0.1% natrij-pirofosfatu, 50 μg/mL DNA iz sonicirane sperme lososa tijekom 16 sati. Filteri su zatim isprani u 5xSSC, te su prani jedanput u 0.5xSSC, 0.1% SDS pri 42 °C. Filteri su izloženi preko noći Kodak X-Ray filmu. Izdvojeni su pozitivni klonovi, plakovi pročišćeni, a veličina umetnutog dijela određena je s PCR korištenjem oligonukleotida koji okružuju BamHI-Xbal klonirane u λDR2 (Clonetech kat. br. 6475-1). 5 μL matičnog faga je korišteno kao izvor templata. Nakon početnog denaturiranja kroz 7 minuta pri 94 °C, slijedilo je 30 ciklusa umnožavanja (1 min. pri 94 C, 1 min. pri 52 °C i 1.5 min pri 72 °C). Završna ekstenzija provedena je 15 min. pri 72 °C. Klon br. FL2b imao je insert odi .8 kb i odarban je za daljnje analize.

Plazmid pDR2 (Clontech, λDR2 i pDR2 Cloning i Expression Systrem Librarv Protocol Handbook, str. 42) koji je sadržan je unutar ruku faga λDR2 je izdvojem kao što je opisano od proizvođača (Clontech, λDR2 i pDR2 Cloning i Expression System Library Protocol Handbook, str. 29-30). Restrikcijska analiza plazmida pDR2-FL2b s BamHI i Xbal pokazuje prisutnost internog BamHI restrikcijskog mjesta u insertu približno u položaju 650. Digestijom plazmida s BamHI-Xbal insert je cijepan u dva fragmenta, jedan od 0.65 kb i jedan s 1.15 kb. DNA sekvencija je određena s tri različite klase templata deriviranih od plazmida pDR2-FI2b. DNA sekvenciranje dvolančane DNA plazmida je izvedeno s ABI373 (Applied Biosystems, Foster City, California) u automatskom fluorescentnom DNA sekvenatoru, korištenjem standardnih protokola za bojenje dideoksi nukleozid trifosfat terminatora (obojeni terminatori), a na uobičajeni način sintetiziranim "vvalking" klicama (Sagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977]; Smith et al., Nature 321:674-679 [1986]). Izravno sekvenciranje umnoženih fragmenata iz plazmida dobivenih lančanom reakcijom polimeraze izvedeno je s ABI373 sekvenatorom korištenjem uobičajenih klica i obojenog terminatora reakcije. Pojedini standardni templati su stvoreni s M13 Janus vektorom (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21:3385-3390 [1993]). BamHI-Xbal (1.15 kb) i BamHI (0.65 kb) fragmeti su izolirani iz plazmida pDR2-FL2b, krajevi su povezani s T4 DNA polimerazom u prisutnosti deoksinukleotida, te su subklonirani na Smal mjestu M13 Janus. Sekvenciranje je izvedeno po standardnom- protokolu za bojom označene M134 univerzalne i reverzne klice, ili "vvalking" klice i terminatore boja. Reakcija ručnog sekvenciranja je izvedena na jednolančanoj M13 DNA korištenjem "vvalking" klica i na temelju znanja standardne dideoksi terminatorske kemije (Sagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977], upotrebom 32P-obilježenog a-dATP i sekvenzaze (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Organizacija DNA sekvenca je izvedena u Sequncher V2.1b12 (Gene Codes Corporation, Ann, Arbor, Michigan). Nukleotid i deducirane sekvencije hML prikazane su u Slici 1 (SEQIDNO:1).

PRIMJER 8

Izolacija gena za humani mpl ligand (TPO)

Humani genomni DNA klonovi TPO gena su izolirani pretraživanjem sekvencirane humane genomne knjižnice u λ-Gem12 s pR45, a prethodno opisane oligonukleotidne probe pod relaksiranim uvjetima hibridizacije (vidi Primjer 7) ili strogim uvjetima hibridizacije s fragmentom koji odgovara 3' polovici humane cDNA koja kodira mpl ligand (od BamH1 mjesta do 3' kraja). Izolirana su dva lambda klona od 35 kb koji se preklapaju. Dva preklapajuća fragmenta (BamH1 i EcoRI) koji sadrže cijeli TPO gen su subklonirani i sekvencirani. Struktura humanog gena sastavljena je od 6 eksona s 7 kb genomne DNA (Slika 14 A, B i C). Granice svih ekson/intron veza su u skladu s konsenzus motivom utvrđenom za gene sisavaca (Shapiro, M. B. et al., Nucl. Acids Res., 15:7155 [1987]). Ekson 1 i ekson 2 sadrže 5' n et ran s lati ran u sekvencu i početne četiri aminokiseline signalnog peptida. Ostatak sekrecijskog siganala kod prvih 26 aminokiselina zrelog proteina kodiran je s ekson 3. Cjelokupna karboksilna domena i 3' netranslatirani dio, kao i ≈50 aminokiselina domene slične eritropoetinu su kodirane s ekson 6. Četiri aminokiseline obihvaćene u deleciji koja je uočena kod hML-2 (hTPO-2) su kodirane kod 5' karaja eksona 6.

PRIMJER 9

Prolazna ekspresija humanog mpl liganda (hML)

Da bi se subklonirao insert pune duljine sadržan u pDR2-FL2b, plazmid je cijepan s Xbal do kraja, a zatim djelomično s BamHI. DNA fragment koji odgovara 1.8 kb insertu je pročišćavan elektroforezom i subkloniran u pRK5 (pRK5-hmpl l) (vidi U. S. Patent br. 5,258,287 za konstrukciju pRK5) pod kontrolom neposrednog ranog pormotora citomegalovirusa. DNA iz konstrukta pRK5-hAnp/1 je pripravljena PEG metodom i transfekcija je izvedena u 293 stanicama bubrega humanog embrija u Dulbecco's modificiranom Eagle's mediju (DMEM) uz dodatak F-12 hranjive smjese, 20 mM Hepes (pH 7.4) i 10% fetalnog goveđeg seruma.

Transfekcija stanica je izvedena metodom s kalcij-fosfatom kao što je opisno (Gorman, C. [1985] i DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D. M., er) Voli. II, str. 143-190, IRL Press, Washington, D. C.). 36 h nakon transfekcije, testirana je aktivnost supernatanta tranficiranih stanica testom proliferacije (vidi Primjer 1). Supernatant 293 stanica tranficiranih pRK vektorom samim, nije pokazao stimulaciju Ba/F3 ili Ba/F3-mplstanica (Slika 12A). Supernatant transficiranih stanica s pRK-hmpll nije imao udjela na Ba/F3 stanice, ali je drastično stimulirao proliferaciju Ba/F3-mpl stanica (Slika 12A), pokazujući da su ova cDNA kodira funkcionalno aktivni humani mpl ligand.

PRIMJER 10

Izoforme humanog mpl liganda hML2, hML3 i hML4

Da bi se identificirali oblici hML dobiveni uz "alternativni splicing", klice su sintetizirane prema svakom kraju kodirajuće sekvence hML. Te klice su korištene u RT-PCR da se umnoži RNA odrasle humane jetre. Nadalje, konstruirane su i slično korištene unutrašnje klice koje okružuju izabrane regije od interesa (vidi dolje). Izravno sekvenciranje krajeva PCR produkata pokazalo je da samo jedna sekvencija točno odgovara sekvenciji cDNA izoliranoj iz biblioteke humane fetalne jetre (vidi Sliku 1 [SEO ID NO: 1]. Međutim, regija blizu C-terminusa EPO domene (vidi sredinu PCR produkta) pokazuje kompleksni sekvencijski uzorak, ukazujući na postojanje moguće "splice" varijante u regiji. Da bi se izolirale te "splice" varijante uporabljene su klice prikazane u Tablici 7, koje okružuju područje od interesa, te su korištene kao PCR templati za cDNA odrasle humane jetre.

[image]

PCR produkti su subklonirani tupim krajevima u M13. Sekvenciranje individualnih subklonovaa pokazalo je postojanje najmanje 3 ML izoforma. Jedan od njih, hML (također spomenut kao kML332) je najdulji oblik i točno odgovara sekvenciji izoliranoj iz fetalne jetrene biblioteke. Sekvencije izoforma od četiri humana mpl liganda navedene od najduljeg (hML) prema najkraćem pokazani su u Slici 11 [SEQ ID NO: 6, 8, 9 i 10].

PRIMJER 11

Konstrukcija i prolazna ekspresija humanih izoformi mpl liganda i supstitucijske varijante

hML2, hML3 i hML(R153A, R154A)

Izoforme hML2 i hML3 i supstitucijska varijanta hML(R153A, R154A) su rekonstituirani iz hML korištenjem rekombinatne PCR tehnike opisane od Russell Higuchi, u PCR proteklima, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky i T. L. White izdavači.

U svim konstruktima korištene "vanjske" klice prikazane su u Tablici 8, a "prekrivajuće" klice u Tablici 9.

[image]

Sva PCR umnožavanja su izvedena s kloniranom Pfu DNA polimerazom (Stratagene) u slijedećim uvjetima: inicijalno denaturiranje templata izvedeno je je pri 94 °C kroz 7 min. a zatim je slijedilo 30 ciklusa odi min. pri 94 °C, 1 min. pri 55 °C i 1.5 min pri 72 °C. Završni ciklus je ostavljen 10 min. pri 72 °C. Završni PCR produkt je pocijepan s Clal-Xbal, pročišćavan elektroforezom i kloniran u pKRStkneo. U 293 stanice je izvršena transfekcija s različitim konstruktima, kao što je opisano gore, a supernatant je testiran korištenjem Ba/F3-mpl proliferacijskog pokusa. hML-2 i hML-3 nisu pokazali aktivnost koja se može detektirati testom, međutim, aktivnost hML(R153A, R154A) bila je slična onoj od hML, pokazujući da procesiranje ovog dibazičnog mjesta nije potrebno za aktivnost (vidi SI. 13).

PRIMJER 12

cDNA mpl ligand laboratorijskih miševa i štakora mML, mML2 i mML3

Izolacija mML cDNA

DNA fragment koji odgovara cjelokupnoj kodirajućoj regiji humanog mpl liganda dobiven je pomoću PCR, pročišćavan je elektroforezom i oblilježen slučajnim klicama, u prisutnosti 32P-dATP i 32pdCTP. Ta proba je korištena za prosijavanje 106 klonova cDNA biblioteke mišje jetre u XGT10 (Clontech kat. br. ML3001a). Duplicirani filteri su hibridizirani u 35% formamidu, 5xSSC, 10xDenhardt's, 0.1% SDS, 0.05M natrij-fosfatu (pH 6.5), 0.1% natrij-pirofosfatu i 100 μg/mL DNA iz sonicirane sperme lososa, preko noći u prisutnosti probe. Filteri su isprani u 2xSSC i prani jedanput u 0.5xSCC, 0.1% SDS pri 52 °C. Hibridizirani fagi su pročišćavani od plaka i cDNA insert je subkloniran u Eco R1 mjestu Bluescript SK-plazmida. Klon "LD" s 1.5 kb insertom je odabran za daljnje analize i oba lanca su sekvencionirana kao što je opisano za cDNA humanog ML. Nukleotid i deducirana aminokiselinska sekvencija iz LD klona prikazana je u SI.14 (SEQ. ID NO: 1 i 11). Deducirana zrela ML sekvencija tog klona je bila duga 331 aminokiselinskih ostataka i identificirana je kao mMLaai (ili mML-2 iz razloga opisanih dolje). Značajna identičnost nukleotida i deduciranih aminokiselinskih sekvencija primjećena je u EPO-sličnoj domeni. Međutim, kada su deducirane sekvencije humanih aminokiselina uspoređene s mišjom ML, mišja sekvencija imala je deleciju tetrapeptida izneđu humanih ostatkaka 111-114, koji odgovaraju deleciji 12 nukleotida iza položaja nukleotida 618, koji se nalazi i u humanoj (vidi gore) i u svinjskoj (vidi dolje) cDNA. Prema tome, dodatni klonovi su ispitivani da bi se utvrdili mogući ML izoformi laboratorijskih miševa i štakora. Jedan klon "L7" imao je insert od 1.4 kb sa deduciranom sekvencijom od 335 aminokiselina koji je sadržavao "izgubljeni" tetrapeptid LPLO. Vjeruje se da taj oblik ima punu duljinu ML laboratorijskih miševa i štakora i označen je kao mML ili mML335. Nukleotid i deducirana sekvencija aminokiselina za mML prikazana je u SI.16. (SEQ ID NO: 12 i 13). Konačno je izoliran i sekvenciran klon "L2". Taj klon ima deleciju 116 nukleotida koji odgovaraju hML3 i stoga je preimanovanje u mML3. Usporedba deduciranih aminokislelinskih sekvencija ovih dviju izoformi prikazana je na Sl. 16.

Ekspresija rekombinatnog mML. Vektori za ekspresije za ML laboratorijskih miševa i štakora opisan je u Primjeru 8. Klonovi koji kodiraju mML i mML-2 subklonirani su u pRK5tkneo, ekspresijski vektor sisavaca koji osigurava ekspresiju pod kontrolom CMV promotora i SV40 poliadenilacijskog signala. S nastlim mML2pRKtkneo vektorima za ekspresiju izvršena je prolazna transfekcija u 293 stanicama korištenjem metode kalcij-fosfata. Nakon prolazne transfekcije mediji su kondicionirani pet dana. Stanice su održavane u DM EM mediju s visokom koncentracijom glukoze uz dodatak 10% seruma fetalnog teleta.

Ekspresija laboratorijskih miševa i štakora mpl (mmpl) u Ba/F3 stanicama. Stabilne stanične linije koje eksprimiraju c-mpl su dobivene transfekcijom mmpl pRKtkneo, u suštini kako je opisano za humani mpl u Primjeru 1. Ukratko, ekspresijski vektor (20 μg; lineariziran) koji sadrži cjelokupnu kodirajuću sekvenciju mpl laboratorijskih miševa i štakora (Skoda, R. C. et al., EMBO J. 12:1645-1653 [1993] izvršena je transfekcija u Ba/F3 stanice elektroporacijom (5 x 106 stanica, 250 V 960μ) nakon čega slijedi selekcija za rezistenciju na neomicin s 2 mg/mL G418. Ekspresija mpl je praćena pomoću analize tekućom citometrijom korištenjem zečjeg anti-"murin" mpl IgG antiseruma. Ba/F34 stanice su održavane u RPMI 1640 mediju, a izvor IL-2 bile su WEHI -3B stanice. Supernatanti od 293 prolazno transficiranih stanica s mML i s mMI-2 su testirani u BaF3 stanicama kojima je izvršena transfekcija i s mmpl i hmpl kao što je opisano u Primjeru 1.

PRIMJER 13

cDNA svinjski mpl ligand

pML i pML-2

cDNA svinjskog ML (pML) je izoliran pomoću RACE PCR. Ukratko, oligo dT klica i 2 specifične klice bile su dizajnirane na osnovu sekvencije eksona svinjskog ML gena koji kodira amino-terminus od ML koji je pročišćen iz seruma aplastičnih svinja. Dobivena cDNA pripravljena iz različitih tkiva aplastičnih svinja je umnožena. PCR cDNA produkt od 1342 bp je nađen u bubregu, te je subkloniran. Nekoliko klonova je sekvencirano i nađeno je da kodiraju zreli svinjski mpl ligand (koji nije ukjučivao cijeli sekrecijski signal). Nađeno je da cDNA kodira 332 aminokiseline zrelog proteina (pML332) koji ima sekvenciju prikazanu na SI.18 (SEQ l D NO: 9 i 16).

Metoda:

Izolacija pML gena i cDNA. Genomski klonovi svinjskog ML gena su izolirani pretraživanjem svinjske genomske biblioteke u EMBL3 (Clontech Inc.) s pRK45. Bibloteka je u osnovi pretražena kako je opisano u Primjeru 7. Nekoliko klona je izolirano, a ekson koji kodira aminokiselinsku sekvenciju koja je identična onoj dobivenoj pročišćavanjem ML, je sekvencioniran. Svinjska cDNA ML je dobivena korištenjem modifikacije RACE PCR protokola. Dvije specifične ML klice su dizajnirane na osnovu sekvencije gena svinjskog ML. Poliadenilirana mRNA je izolirana iz bubrega aplastičnih svinja, u osnovi kako je prije opisano. cDNA je pripravljena reverznom transkpripcijom s BamdT klicom

(BamdT: 5'GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTT 3')

(SEQ ID NO:55)

koja je usmjerena prema poliadenozinskom repu mRNA. Početni krug PCR umnožavanja (28 ciklusa pri 95 °C kroz 60 sekundi, 58 °C kroz 60 sekundi i 82 °C kroz 90 sekundi) vođen je korištenejm specifičnog ML h-uzvodne-klice

(h-uzvodno1 :5' GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT31)

(SEO ID NO: 43)

i BAMAD klice

(BAMAD: 5'GACTCGAGGATCCATCG 3')

(SEO ID NO: 56)

u 100 mL reakcije (50 mM KCI, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris pH 8.0, 0.2 mM dNTPs s 0.05 U/mL Amplitag polimeraze [Perkin Elmer Inc.]). PCR produkt je zatim cijepan s Cla1, ekstrahiran fenol/kloroformom (1:1), taložen etanolom i podvrgnut je ligaciji s 0.1 mg Bluescript SK- vektorom (Stratagene ine.), koji je bio prerezan s Cla1 i Kpn 1. Nakon inkubacije dva sata pri sobnoj temperaturi, jedna četvrtina smjese za ligaciju dodana je izravno u drugi krug PCR (22 ciklusa kao što je opisano gore) korištenjem drugog ML specifične uzvidne-1 klice.

(uzvodno-1: 5' GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3')

(SEQ ID NO: 57)

i T3-21 (oligonukleotid koji povezuje susjednu sekvenciju na višerstuko kloniranoj regiji s Bluescript SK- vektorom):

(5' CGAAAT TAACCCTCACTAAAG 3')

(SEQIDNO:58)

Nastali PCR produkt je cijepan s XBa1 i Cla1 i subkloniran u Bluescript SK-. Nekoliko klonova iz neovisne PCR reakcije su sekvencirani.

Identificiran je drugi oblik, ozančen kao pML-2 koji kodira protein kojem su deletirana 4 aminokiselinska ostatka (328 aminokiselinski ostatak) (vidi SI. 21 [SEQ ID NO: 21]). Usporedba pML i pML-2 sekvencija amionkiselina pokazala je da je drugi oblik identičan, osim što se kod drugog pojavila delecija za tetrapeptid QLPP koji odgovara aminokiselinskim ostacima 111-114 uključivo (vidi si. 22 [SEQ ID NO: 18 i 21]). Delecija četiriju aminokselina opažena u cDNA ML laboratorijskih miševa i štakora, čovjeka i svinja se pojavljuje na potpuno istom mjestu u pretpostavljenim proteinima.

PRIMJER 14

CMK test za indukciju ekspresije trombocitnog antigena GPIIbIIIa trombopoetinom (TPO)

CMK stanice su održavane u PMPI 1640 mediju (Sigma) uz dodatak 10% seruna fetalnog goveda i 10 mM glutamina. Tijekom priprave za test, stanice su sakupljene, prane i ponovo suspendirane u 5x105 stanica/mL u GIF mediju bez seruma, uz dodatak 5 mg/L goveđeg insulina, 10 mg/L apo-transferina, 1 X elemenata u tragovima. Na ploču ravnog dna s 96 jažica TPO standard ili ekperimentalni uzorci su dodani u svaku jažicu pri pogodnom razrijeđenju u volumenu od 100μ. U svaku jažicu je dodano 100 uL CMK suspenzije stanica i ploče su inkubirane pri 37 °C u 5% CO2 inkubatoru 48 sati. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane kod 1000 rpm pri 4 °C tijekom pet minuta. Supernatanti su bačeni i 100 μL FITC-konjugiranih GPIIbIIIa monoklonalnih 2D2 anititijela je dodano u svaku jažicu. Nakon inkubacije 1 sat pri 4 °C, ploče su ponovo centrifugirane kod 1000 rpm tijekom 5 minuta. Supernatanti koji sadrže nevezana antitijela su bačeni i 200 μL 0.1% BSA-PBS otopine za ispiranje je dodano u svaku jažicu. Postupak ispiranja s 0.1% BSA-PBS otopinom je ponovljen tri puta. Stanice su zatim analizirane na FASCAN korištenjem standadne jednoparametaske analize mjerenjem relativnog intenziteta fluorescencije.

PRIMJER 15

DAMI test za trombopoetin (TPO) mjerenjem endomitotičke aktivnosti DAMI stanica na mikrotitarskoj ploči s 96 jažica

DAMI stanice su održavane u IMDM + 10% konjskog seruma (Gibco) uz dodatak 10 mM glutamina, 10 ng/mL penicilina G i 50 μg/mL streptomicina. Tijekom prirave za test, stanice su sakupljene, prane i resuspendirane u 1x106 stanica/mL u IMDM mediju + 1% konjskog seruma. Na ploči s 96 jažica s okruglim dnom, 100 μL TPO standarda ili ekperimentalnih uzoraka je dodano suspenziji DAMI stanica. Stanice su inkubirane pri 37 °C u 5% CO2 inkubatoru 48 sati. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane u Sorvall 6000B centrifugi kod 1000 rpm pri 4 °C pet minuta. Supernatanti su bačeni i pranje s 200 n-L PBS-0.1% BSA je ponovljeno. Stanice su zatim fiksirane dodatkom 200 μL ledom hlađenog etanol/PBS i resuspendirane aspiracijom. Nakon inkubacije 15 minuta pri 4 °C, ploča je centrifugirana pri 2000 rpm pet minuta i u svaku jažicu je dodano 150 μL 1 mg/mL RNAaze koja je sadržavala 0.1 mg/mL propidij-jodida i 0.05% Tween-20. Nakon jednog sata inkubacije pri 37 °C, sadržaj DNA mjeren je tekućnom citometrijom. Poliploidija je mjerena i izračunana je po slijedećoj formuli:

[image]

PRIMJER 16

In vivo tešu za trombopoetin (TPO)

(Povratni test mišjih trombocita)

In vivo test produkcije trombocita određivanjem 35S

Prvog dana je C57BL6 miševima (dobiveni iz Charles River) intraperitonalno injektirano (IP) 1 ml kozjeg seruma upravljenog protiv mišjih trombocita (6 ampula), da bi se izazvala trobocitopenija. Petog i šestog dana miševima su dane dvije intraperitonalne injekcije faktora ili PBS kao kontrole. Sedmog danšTlntravenozno je injektirano trideset μNa235SO4 u 0.1 ml fiziološke otopine, a postotak inkorporiranog 35S od injektirane doze u cirkulirajuće trombocite mjeren je u uzorcima krvi tretiranih miševa i kontrolnih miševa. Brojanje trombocita i leukocita izvedeno je istovremeno u krvi dobivene iz retro-obritanog sinusa.

PRIMJER 17

KIRA ELISA za trombopoetin (TPO) mjerenjem fosforilacije mpl-Rse.gD kimeričnog receptrora

Humani mpl receptor je opisan od Vigon et al. PNAS, USA 89:5640-5644 (1992). Kimerični receptor koji sadrži ekstracelularnu domenu (ECD) mpl receptora i transmembransku (TM) i intracelularnu domenu (ICD) Rse (Mark et al., J. of Biol. Chem. 269(14):10720-10728 [1994]) s polipeptidnom karboksi-terminalnom zastavicom (i.e. Rse.gG) priređen je za korišten u KIRA ELISA, kao što je ovdje opisano (vidi SI. 30 i 31 za opis testa u dijagramu).

(a) Priprava sredstva za hvatanje

Monoklonalna anti-gD tijela (klon 5B6) su producirana prema peptidu iz glikoproteina D Herpes simplex virusa (Paborsky et al., Protina engineering 3(6):547-553 [1990]). Pročišćenom matičnom preparatu je koncentracija podešena da bude 3.0 mg/μL u PBS, pH 7.4 i po 1 ml alikvota je čuvano pri -20 °C.

(b) Prirava anit-fosfortirozin antitijela

Monoklonalni anit-fosfortirozin, klon 4G10, je kupljen od UBI (Lake Placid, NY) i biotiniliran korištenjem biotin-N-hidroksisukcinamida duge ruke (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).

(c) Ligand

Mpl ligand je pripravljen rekombinatnim tehnikama opisanim ovdje. Pročišćen mpl ligand je čuvan pri 4 °C kao matična otopina.

(d) Pirava Rse.gD nukleinske kiseline

Sintetski dvolančani oligonukleotidi su korišteni za rekonstituciju kodirajuće sekvencije 10 C-terminalih aminokiselina (880-890) humanog Rse, te za dodavanje još 21 aminokiseline koje sadrže epitop za antitijela 5B6 za stop kodon. Tablica 10 prikazuje završnu sekvenciju sintetskog dijela fuzioniranog gena.

[image]

Sintetska DNA podvrgnuta je ligaciji s cDNA koja kodira aminokiseline 1-880 humanog Rse kod Pstl mjesta, počevši kod nukleotida 2644 humane Rse cDNA sekvencije koja je publicirana (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269(14):10720-10728 [1994]) i HindIII mjesta u polilinkeru vektora za ekspresiju pSVI7.ID.LL (vidi SI. 32 A-L; SEQ ID NO: 22) da bi nastao ekspresijski plazmid pSV.ID.Rse.gD. Ukratko, ekspresija plazmida obuhvaća dicistronski primarni transkript koji sadrži sekvenciju koja kodira DHFR vezan na 5' "splice donor" i 3' "splice akceptor" u "splice" mjestu introna, nakon čega slijedi sekvencija koja kodira Rse.gD. Puna duljina ("nespliced") poruke sadrži DHFR kod prvog otvorenog okvira čitanja i stoga generira DHFR protein da bi se omogućio odabir stablinih transformanata.

(e) Priprava mpl-Rse.gD nukleinske kiseline

Ekpresijski plazmid pSV.ID.Rse.gD pripravljen kao što je gore opisano je modificiran tako da proizvodi plazmid pSV.ID.M.tmRdG koji sadrži kodirajuću sekvenciju ECD humanog mpl (aminokiseline 1-491) koja je fuzionirana s transmembranskom domenom i s intracelularnom domenom Rse.gD (aminkoseline 429-911). Sintetski oligonukleotidi su korišteni da se u dva stupnja PCR kloniranja spoji kodirajuća sekvencija dijela ekstracelularne domene humanog mpl s dijelom Rse kodirajuće sekvencije, kao što je opisano od Mark et al., J. of Biol. Chem. 267:26166-26171 (1992). Korištene klice za prvu PCR reakciju su M1

(5-TCTCGCTAGCGTTTACAG-31)

(SEQIDNO:61)

i M2

(5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3’)

(SEQ ID NO: 62)

s mplcDNA templatom i R1

(5-GGGCCATGACACTGTCAA-3’)

(SEQ ID NO: 63)

i R2

(5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3')

(SEQIDNO:64)

s Rse cDNA templatom. Pvull-Smal dio tog spajanja korišten je za konstrukciju kimeričnog receptora pune duljine.

(f) transformacija stanica

DP12.CHO stanice (EP307,247 objavljen 15. ožujka 1989.) su elektroporirane s pSV.ID.M.tmRdG koji je bio lineariziran na jedinstvenom Noti mjestu u skeletu plazmida. DNA je taložena etanolom nakon ekstrakcije fenol/kloroformom i resuspendirana je u 20 μl 1/10 Tris EDTA. Zatim je 10 μg DNA inkubirano s 107CHO DP12 stanica u 1 ml PBS na ledu 10 minuta, prije elektroporacije kod 400 volta i 330μ. Stanice su vraćene na led 10 minuta, prije nego su nasađene na neselektivni medij. Nakon 24 sata, stanice su hranjene medijem bez nukleozida da bi se odabrali stabilni DHFR+ klonovi.

(g) Odabir transformiranih stanica za upotrebu u KIRA ELISA

Klenovi koji eksprimiraju mpl/Rse.gD su identificirani korištenjem "vvestern blotting" cijelokupnog lizata stanica koji je post-frakcioniran SDS-PAGE, korištenjem antitijela 5B6 koji prepoznaju gD epitopnu oznaku.

(h) Mediji

Stanice su uzgajane u F12/DMEM 50:50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). Tom mediju je dodano 10% diafiltriranog FBS (hyClone, Lofan, Utah), 25 mM HEPES i 2 mM L-glutanima.

(i) KIRA ELISA

mpl-Rse-gD tranformirane DP-12.CHO stanice su nasađene (3x104 po jažici) u jažice na ploču s 96 jažica ravog dna u 100 μL medija i kultivirane su preko noći pri 37 °C u 5% CO2. Slijedeće jutro supernanant je dekantiran i ploče su lagano prislonjene na papirnati ubrus. U svaku jažicu je dodano 50 μl medija koji je sadržavao ili ekperimentalne uzorke ili 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 ili 0 ng/mL mpl liganda. Stanice su stimulirane pri 37 °C 30 min., supernatanti u jažicama su dekantirani, a ploče su ponovo lagano prislonjene na papirnati ubrus. Da bi se stanice lizirale i da bi se otopili kimerični receptori, u svaku jažicu je dodano 100 \±L pufera za liziranje. Pufer za liziranje se sastoji od 150 mM NaCI koji sadrži 50 mM HEPES (Gibco), 0.5% Triton-X 100 (Gibco), 0.01% thimerosal, 30 KIU/mL aprotinina (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 mM 4-(2-aminoetil)-benzensulfonil fluorid hidroklorida (AEBSF; ICN, Biochemicals), 50 ja M leupeptina (ICN, Biochemicals) i 2 mM natrij-ortovanadata (Na3VO4; sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7.5. Ploča je zatim lagano pretresana i mućkalici (Bellco Insruments, Vineladns, NJ) kroz 60 min pri sobnoj temperaturi.

Kad su se stanice otopile, ELISA mikrotitarska ploča (NuncMaxisorp, Inter Med Denmark) koja je bila presvučena preko noći s 5B6 monoklonalnim anti-gD tijelima pri 4 °C (5.0 μg/mL u 50 mM karbonatnom puferu, pH 9.6, 100 (i/jažici) je dekantirana, prislonjena na papirnati ubrus i blokirano je s 150 μl/jažici pufera za blokiranje [PBS koji sadrži 0.5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) i 0.01% thimerosal] kroz 60 minuta pri sobnoj temperaturi uz lagano potresivanje. Nakon 60 minuta, anti-gD 5B6 presvučene ploče su prane 6 puta puferom za ispiranje (PBS koji sadrži 0.05% Tween-20 i 0.01% thimerosala) korištenjem automatskog perača ploča (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Ine, sterling VA).

Lizat koji sadrži otopljene MPL/Rse.gD iz mikrotiratskih jažica kultura stanica je dodan (85 μL/jažici) anti-gD 5B6 presvučenim i blokiranim ELISA jažicama, te je inkubirano 2 h pri sobnoj temperaturi uz lagano potresanje. Nevezani mpl-Rse.gD je uklonjen pranjem s puferom za ispiranje, te je 100 μl biotiniliranog 4G10 (anti-phosphotyrosine) razrijeđeno 1:18000 s puferom za razrjeđivanje (PBS koji sadrži 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 5 mM EDTA i 0.01% thimerosala) t.j. 56 ng/mL je dodano u svaku jažicu. Nakon inkubacije 2 h pri sobnoj temperaturi, ploča je prana, te je 100 μL streptavidinom konjugirane peroksidaze iz hrena (HRPO) (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) razrijeđeno 1:60000 puferom za razrjeđivanje i dodano je u svaku jažicu. Ploča je inkubirana 30 minuta pri sobnoj temperaturi uz lagano potresanje. Slobodni avidinski konjugat je uklonjen pranjem i u svaku jažicu je dodano novih 100 μL svježe pripravljene otopine supstrata (tetrametil-benzidin [TMB] i dvokompoentni susptratski kit, Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD). Reakcija je ostavljena 10 minuta nakon čega je razvijanje boje zaustavljeno dodatkom 100 μL/jažici H3PO4. Apsorbancija pri 450 nm je očitana s referentnom valnom duljinom od 650 nm (ABS450/650) korištenjem čitača za ploče (Molecular Devices, Palo Alto, CA) koji je provjeravan s Macintosh Centris (Apple Computers, Cupertino, CA) i s DeltaSoft software (Biometallics, Ine, Priceton, NJ).

Standardna krivulja je generirana stimuliranjem dp12.trk.A,B ili C.gD stanica s 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 ili 0 ng/mL mpl liganda i prikazano je kao ng/mL TPO prema srednjoj vrijednosti ABS450/650 ± standardna devijacija, a korišten je Delta Soft program. Koncentracija uzorka dobivena je interpolacijom njihovih apsorbanija na standardnu krivulju i izražena je kao ng/mL TPO aktivnosti.

Nađeno je da mpl ligand može aktivirati mpl-Rse-gD kimmerični receptor i da aktivnost ovisi o koncentraciji ili specifičnosti liganda. Nadalje, nađeno je da jempl-Rse.gD KIRA-ELISA učinkovita do 100% humanog seruma (pokazano) ili do 100% plazme (nija pokazano), dozvoljavajući da se test koristi za testiranje pacijenta i pK uzoraka.

[image]

[image]

PRIMJER 18

ELISA na trombopoetion (TPO) na osnovu receptorskog vezanja

ELISA ploče su presvučene zečjim F(ab')2 anti-humanim IgG (Fc) u pH 9.6 karbonatnom puferu pri 4 °C preko noći. Ploče su blokirane s 0.5% goveđeg serumskog albumina u PBS pri sobnoj temperaturi tijekon jednog sata. Sakupljeni fermentirani materijal koji sadrži kimerični receptor, mpl-lgG, je dodan na ploče i inkubirano je 2 sata. Pločama su dodavana dvostruka serijska razrjeđenja (0.39-25 ng/mL) standarda (TPO322 priravljen u 293 stanicama s koncentracijom određenom kvantitativnom analizom aminokiselina). Serijski razrijeđeni uzorci u 0.5% goveđem serumskom albumin i 0.05% Tween 20, su inkubirani 2 sata. Vezani TPO je određen s biotiniliranim zečjim antitijelima prema TPO-isskoja su pročišćena proteinom A, a koja su nastala u E. colli (1 sat inkubacije), nakon čega slijedi reakcija strepravidin-peroksidaze (30 min. inkubacije) uz 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin kao supstrat. Apsorbancija je očitana kod 450 nm. Ploče su prane između pojedinih koraka. Za analizu podataka standardna krivulja je usklađena koristeći četvero parametarski program Kaleidagraph za usklađivanje krivulja. Koncentracija uzoraka bila je računana iz standardne krivulje.

PRIMJER 19

Ekspresija i pročišćavanje TPO iz 293 stanica

1. Priprava vektrora za ekspresiju u 293 stanicama

cDNA koja odgovara, cjelokupnom otvorenom okviru čitanja TPO je dobivena PCR korištenjem slijedećih oligonukleotida kao klica:

[image]

PRK5-hmpl1 (opisan u Primjeru 9) je korišten kao templat za reakciju u prisutnosti pfu DNA polimeraze (Stratagene). Početna denaturacija bila je pri 94 °C kroz 7 min., a zatim je slijedilo 25 ciklusa umnožavanja (1 min. pri 94 °C, 1 min. pri 55 °C i 1.5 min pri 72 °C). Završni ciklus je ostavljen 15 min. pri 72 °C. PCR produkt je pročišćavan i kloniran između restrikcijskih mjesta Clal i Xbal plazmda pRK5tkneo, a pRK5 vektor je modificiran tako da eksprimira gen za rezistenciju na neomicin pod kontrolom promotora timidin kinaze, da bi se dobio vektor pRKStkneo.ORF. Drugi konstrukt koji odgovara homolognoj epo domeni je generiran na isti način korištenjem Cla.FL.F. kao uzvodne klice, te slijedeće kao revezne klice: Arg.STOP.Xba: 5' TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GAG GGT GGA CC 3'

Završni konstrukt nazvan je pRK5-tkneoEPO-D. Sekvencija oba konstrukta je dokazana kako je opisano i Primjeru 7.

2 Tranfekcija humanih embrionalnih stanica bubrega

S ta dva konstrukta je izvršena transfekcija u embrionalne stanice humanog bubrega metodom s kalcij-fosfatom, kao što je opisano u Primjeru 9. Selekcija klonova rezistentnih na neomicin počela je 24 sata nakon transfekcije u prisutnosti 0.4 mg/mL G418.10, a 15 nakon dana pojedine kolonije su prenesene u ploču s 96 jažica i ostavljene da rastu do konfluencije. Ekspresija ML153 ili ML332 kondicioniranim medijima iz ovih klonova je ispitana upotrebom testa proliferacije Ba/F3 mpl koji je opisan u Primjeru 1.

3. Pročšćavanje rhMl332

293-phML332 kondicionirani medij je nanesen na Blue-Sepharose (Pharmacia) kolonu koja je ekvilibrirana u 10 mM natrij-fosfatu pH 7.4 (pufer A). Kolona je zatim prana s 10 volumena kolone pufera A, te s puferom A koji je sadržavao 2 M uree. Kolona je zatim eluirana puferom A koji je sadržavao 2 M ureu i 1 M NaCI. Eluat s Blue-Sepharose je zatim direktno nanesen na WGA-Sepharose kolonu koje je bila ekvilibrirana u puferu A. WGA-Sepharose kolona je zatim prana s 10 volumena kolone pufera A koji je sadržavao 2 M ureu i 1 M NaCI i eluirano je istim puferom koji je sadržavao 0.5 M N-acetil-D-glukozamin.

Eluat s WGA-Sepharose kolone je nanesen na C4-HPLC kolonu (Synchrom, Inc.) uravnoteženu u 0.1% TFA. C4-HPLC kolona je eluirana nekontinuiranim gradijentom propanola (0-25%, 25-35%, 35-70%). rhML332 je nađen u regiji gradijenta koja sadrži 28-30% propranola. Pomoću SDS-PAGE pročišćeni rhML332 migrira u obliku široke vrpce u području gela koje odgovara 68-80 kDa (vidi Sliku 15).

4. Pročišćavanje rhML153

293-rhML153 kondicionirani medij je razdijeljen na Blue-Sepharose kao što je opisano za 293-rhML332. Eluat s Blue-Sepharose je zatim direktno nanesen na mpl afinitetnu kolonu kako je gore opsano. RhML153 eluiran s mpl afinitetne kolone je pročišćavan do homogenosti korištenjem C4-HPLC kolone pod istim uvjetima kao što je opisano za 293-rhML332. Pomoću SDS-PAGE pročišćeni rhMLiss radvaja se u dvije glave i dvije slabije vrpce s Mr oko 18000-21000 (vidi Sliku 15).

PRIMJER 20

Ekspresija i pročišćavanje TPO iz CHO stanica

1. Opis vektora za ekspresiju u CHO

Vektor za rekspresiju koji je uporebljen u niže opisanim postupcima elektroporacije označen je kao:

pSVIS.ID.LLMLORF (puna duljina ili hTPO332)

pSVIS.ID.LLMLEPO-D (skraćeni ili HtPO153)

Bitna svojstva ovih plazmida su priakazana na Slikama 23 i 24

2. Priprava vektora za ekspresiju u CHO

cDNA koja odgovara cjelokupnom otvorenom okviru čitanja TPO je dobivena PCR metodom korištenjem oligonukleotidnih klica prikazanih u Tablici 12.:

[image]

PRKS.hmpl (opisan u Primjeru 7 i 8) je korišten kao templat za reakciju u prisutnosti pfu DNA polimeraze (Stratagene). Početna denaturacija bila je pri 94 °C kroz 7 min., a zatim je slijedilo 25 ciklusa umnožavanja (1 min. pri 94 °C, 1 min. pri 55 °C i 1 min. pri 72 °C). Završni ciklus je ostavljen 15 min. pri 72 °C. PCR produkt je pročišćavan i kloniran između restrikcijskih mjesta Clal i Xbal plazmda pSVI5.ID.LL tako da bi se dobio vektor pSVI5.ID.LLMLORF. Drugi konstrukt, koji odgovara homolognoj EPO domeni, je generiran na isti način korištenjem Cla.FL.F2 kao uzvodne i revezne klice:

EPOD-Sal: 5' AGT CGA CGT CG A CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3'

(SEO ID NO: 67)

Završni konstrukt nazvan je pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Sekvencija oba konstrukta je dokazana kako je opisano u Primjerima 7 i 9.

U suštini, kodirajuća sekvencija pune duljine i skraćeni ligand uvedeni su u višestruko mjesto za kloniranje CHO vektora za ekspresiju pSVI5.ID.LL Taj vektror sadrži regiju ranog promotora/pojačivača virusa SV40, modificiranu "splice" jedinicu koja sadrži cDNA mišjeg DHFR, višesruko mjesto kloniranja za uvođenje gena od interesa (u ovom slučaju je to opisana TPO sekvencija), poliadenilacijski signal od SV40 i ishodište replikacije i gen (3-laktamaze za odabir plazmida i umnožavanje u bakteriji.

3. Metodologija za utvrđivanje stabilnih CHO staničnih linija koje eksprimiraju rekombinatni humaniTPO332 i TPO153

a. Opis CHO roditeljskih staničnih linija

Stanične linije CHO domaćina (ovarij kineskog hrčka) korištene su za ekpresiju TPO molekula opisanih i ovdje označenih kao CHO-DR12 (vidi EP 307,247 objavljena 15. ožujka 1989.). Te stanične linije sisavaca su odabrane kloniranjem iz transficiranih roditeljskih linija (CHO-K1 DUX-B11(DHFR-)- dobivene od Dr. Frank Lee sa Stanford Universitv, dozvolom Dr. L. Chasin) s vektorom za ekspresiju preproinsulina da di se dobili klonovi s reduciranim zahtjevima za insulinom. Te stanice bile su također bez DHFR i kolonovi mogu biti odabrani prema prisutnosti DHFR cDNA sekvencijkog vektora, uzgojem u mediju bez dodatka nukleozida (glicin, hipoksantin i timidin). Obično je korišten ovaj selekcijski sustav za stabilnu ekspresiju CHO staničnih linija.

b. Metoda transfekcije (elektroporacija)

TPO332 i TPO153 stanične linije za ekspresiju su stvorene transfekcijom DP12 stanica elektroporacijom (vidi npr. Andreason, G. L. J, Tiss. Cult. Meth., 15,56 [1993]) s lineariziranim pSVI5.ID.LL.MLORF, odnosno pSVI5.ID.LLMLEPO-D plazmidima. Reakcijske smjese triju (3) rekstrikcijskih enzima su postavljene za rezanje svakog plazmida: 10μg, 25 μg i 50 μg vektora s enzimom NOTI korištenjem standarnog postupka molekularne biologije. To mjesto restrikcije je nađeno samo jedanput u vektoru u lineariziranoj 3' regiji i izvan jedinice za transkripciju TPO liganda (vidi SI. 23). 100 μl reakcije je postavljeno za inkubaciju preko noći pri 37 °C. Slijedeći dan, smjesa je jedanput ekstrahirana fenol/kloroform/izmoamil alkoholom (50:49:1) i taloženo je etanolom uz suhi led približno jedan sat. Talog je zatim sakupljen mikrocentrifugiranjem 15 minuta, te je sušen. Linearizirana DNA je resuspendirana u 50 μL Ham's DMEM-F12 1:1 mediju kojem su dodani standardni antibiotci i 2 mM glutamin.

Stanice DP12 uzgojene u suspenziji su sakupljene, prane jedanput u istom mediju koji je opisan za resuspendiranje DNA i konačno resuspendirane u istom mediju pri koncentraciji od 107 stanica po 750 μL-Alikvot stanica (750 μL) je inkubiran sa svakom lineariziranom DNA smjesom pri sobnoj temperaturi jedan sat, te je preneseno u BRL posudu za elektroporaciju. Svaka reakcijska smjesa je zatim podvrgnuta elektroporaciji u standardnom aparatu kod 350 volti podešenom na 330 μF i niski kapacitet. Nakon elektroporacije, stanice su ostavljene u apararu još 5 minuta i na ledu u inkubacijskoj periodu od 10 minuta. Elektroporirane stanice su prenesene u posude od 60 mm za uzgoj kultura koje sadrže 5 ml standarda, kompletan medij rasta za CHO stanice (visoka koncentracija glukoze, DMEM-F12 50:50 bez glicina uz dodatak 1x GHT, 2 mM glutarnina i 5% seruma telećeg fetusa) i uzgajane su preko noći u komori za inkubaciju stanica u 5% CO2.

c. Odabir i metoda pretraživanja

Slijedećeg su dana stanice skinute tripsinizacijom s ploča standardnim metodama i prenesene su u posude od 150 mm za uzgoj kultura koje sadrže DHFR selektivni medij (Ham's DMEM-F12, 1:1 medij, gore opisan uz dodatak 2% ili 5% dializiranog seruma telećeg seruma ali bez glicina, hipoksantina i timidina, što predstavlja standardni DHFR selekcijski medij). Stanice iz svake posude od 60 mm su zatim presađene u 5/150 mm posude. Stanice su inkubirane 10 do 15 dana (uz jedno mijenjenje medija) pri 37 °C u 5% CO2, sve dok se klonovi nisu počeli pojavljivati i dostizati veličinu dovoljnu za prenošenje u posudu s 96 jažica. Nakon perioda od 4-5 dana, stanične linije su prenesene u posude s 96 jažica korištenjem sterilnih žutih nastavaka na pipetmanu koji je podešen na 50 ml. Stanice su ostavljene rasti do konfluencije (obično 3-5 dana), a zatim su podloge tripsinizirane i dvije kopije originalnie podloge su reproducirane. Dvije od tih kopija su na kratko vrijeme skladištene u zamrzivaču sa stanicama iz svake jažice razrijeđene u 50 μL 10% FCS u DMSO. Uzorci koji su 5 dana kondicionirani u mediju bez seruma testirani su iz konfluentnih jažica na trećoj podlozi na ekspresiju TPO, putem testa zasnovanog na aktivnosti Ba/F3 stanica. Klonovi koji su imali najveću ekspresiju pokazano ovim pokusom, su ponovo oživljeni iz zaliha i povećani su do 2 konfluentnih 150 mm T-tikvica za prijenos u kultivacijske skupine za suspenziju, adaptaciju, ponovni test i skladišenje.

d. Protokol umnožavanja

Nekoliko staničnih linija koje su imale najveći titar iz gore opisanog odabira su zatim podvrgnute umnožavanju standardnim postupkom umnožavanja metotreksatom da bi nastali klonovi višeg titra. Klonovi CHO stanica su prošireni i nasađeni u posude od 10 cm kod četiri koncentracije metotreksata (t.j. 50 nM, 100 nM, 200 nM i 400 nM) kod dvaju ili triju koncentracija stanica (105, 5x105 i 106 stanica po posudi). Te kulture su zatim inkubirane pri 37°C/5% CO2 sve dok klonovi nisu dostigli veličinu dovoljnu za prenošenje u posudu s 96 jažica za daljnji test. Nekoliko klonova visokog titra iz tog odabira su ponovo izloženi većoj koncentraciji metotreksata (t.j. 600 nM, 800 nM, 1000 nM i 1200 nM) i kao i prethodno rezistentni klonovi ostavljeni su da rastu, te su preneseni u posudu s 96 jažica i testirani su.

4. Kultiviranje stabilnih CHO staničnih linija koje stabilno eksprimiraju rekombinantni humani TPO332 i TPO153.

Uskladištene stanice su odmrznute i populacija stanica je proširena standardnom metodom rasta u mediju bez seruma ili koji je sadržavao serum. Nakon proširenja na dovoljnu gustoću stanica, stanice su prane za se ukloni iscrpljeni medij kulture stanica. Stanice su zatim kultivirane standradnom metodom koja uključuje: rast u nakupinama (engl. batch i fed-bach), ili kontinurano kultiviranje pri 25-40 °C, neutralni pH s otopljenim sadržajem O2 najmanje 5%, sve dok se nije konstitutivno izlučeni TPO akumulirao. Tekućina za kultiviranje stanica je mehanički zatim odijeljena od stanica, centrifugiranjem.

5. Pročišćavanje rekombinantne humane TPO iz tekućine za kultiviranje CHO stanica

Sakupljena tekućina za kultiviranje stanica (HCCF) je izravno nanesene na Blue Sepharose 6 Fast Flow kolonu (Pharmacia) koja je ekvilibrirana u 0.01 M natrij-fosfatu pH 7.4, 0.215 M NaCI u omjeru približno 100 L HCCF po litri smole i pri linearnoj brzini protoka približno 300 mL/h/cm2. Kolona je zatim prana s 3 do 5 volumena kolone pufera za ekvilibriranje, a zatim s 3 do 5 volumena kolone s 0.01 M natrij-fosfatom pH 7.4, 2.0 M urea. TPO je zatim eluiran s 3 do 5 volumena kolone 0.01 M natrij-fosfatom pH 7.4, 2.0 M urea, 1.0 M NaCI.

Eluat s Blue Sepharose koji je sadržavao TPO je nanesen na Wheat Germ Lectin Sepharose 6MB kolonu (Pharmacia) koja je ekvilibrirana u 0.01 M natrij-fosfatu pH 7.4 2.0 M urea i 1.0 M NaCI u omjeru od 8 do 16 mL eluata s Blue Sepharose po mL smole i pri brzini protoka približno 50 mL/h/cm2. Kolona je zatim prana s 2 do 3 volumena kolone pufera za ekvilibriranje. TPO je zatim eluiran s 2 do 5 volumena kolone 0.01 M natrij-fosfatom pH 7.4, 2.0 M ureom, 0.5 M N-acetil-D-glukozaminom.

Eluat s Wheat Germ Lectina je podešen tako da završna koncentracija bude 0.04% Ci2Es i 0.1% trifluoroctene kiseline (TFA). Nastala konačna koncentracija je nanesena C4 kolonu reverzne faze (Vvdac 214TP1022) ekvilibriranu u 0.1% TFA i 0.04% C12E8, a naneseno je približno 0.2 do 0.5 mg proteina po mL smole pri brzini protoka 127 mL/h/cm2. Protein je eluiran gradijentom acetonitrila u dvije faze koji je sadržavao 0.1% TFA i 0.04% C-iaEs- Prva faza sastavnjena je od linearnog gradijenta acetonitrila od 0 do 30% kroz 15 minuta. Druga faza sastavnjena je od linearnog gradijenta acetonitrila od 30 do 60% kroz 60 minuta. TPO je eluiran kod približno 50% acetonitrita. Eluat je sakupljen na bazi SDS-PAGE.

C4 eluat je razrijeđen s dva volumena 0.01 Na fosfatnog pufera pH 7.4, 0.15 M NaCI i diafitriran je prema približno 6 volumena 0.01 M Na fosfatnog pufera pH 7.4 i 0.15 M NaCI na Amicon YM ili na sličnim ultrafiltacijskom membranama koje ne propuštaju molekulske mase veće od 10000 do 30000 Daltona. Nastali diafiltrat se može izravno koristiti ili se može još koncentrirati ultrafiltracijom. Taj diafiltrat/koncentrat je podešen tako da konačna koncentracija Tween-80 bude 0.01%.

Ukupan ili dio diafiltrat/koncentrata ekvivalenta 2 do 5% izračunanom volumenu kolone je nanesen na Sephracyl S-300 HR kolonu (Pharmacia) ekvilibriranu u 0.01 M Na fosfatnom puferu pH 7.4, 0.15 M NaCI, 0.01% Tween-80 i kromatografiran je pri sporom protoku približno 17 mL/h/cm2. Frakcije koje sadrže TPO bez agregata i produkata proteolitičke degradacije su sakupljene na osnovi SDS-PAGE. Spojeni eluati su filtrirani na 0.22 μ filteru Millex-GV ili sličnom i skladišteni su piri 2-8°C.

PRIMJER 21

Transformacija i indukcija sinteze TPO proteina u E. colli

1. Konstrukcija ekspresijskih vektrora za TPO u E. colli

Plazmidi pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 i pMP202 su svi bili konstruirani da ekspreimiranju prvih 155 aminokiselina TPO nizvodno od male vodeće sekvencije koja je promjenjljiva među različitim konstruktima. Vodeća sekvencija osigurava visoki stupanj inicijacije translacije i brzo pročišćavanje. Plazmidi pMP210-1, -T8, -21, -22. -24 i -25 su bili konstruirani da ekspreimiraju prvih 153 aminokiselina TPO nizvodno od početnog metionina i razlikuju se samo u korištenju kodona za prvih 6 aminokiselina TPO, dok plazmid pMP251 predstavlja derivat pMP210-1 u kojem je karboksi-terminalni kraj TPO produljen za dvije aminokiseline. Svi gornji plazmidi se produciraju visoku razinu intracelularne ekspresije TPO u E. colli nakon indukcije triptofanskog promotora (Vansura, D. G. et al., Methods in Enzymology (Goeddel, D. V. Ed.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmidi pMP1 i pMP172 su međuprodukti u konstrukciji gornjih TPO intracelularnih ekspresijskih plazmida.

(a) Plazmid pMP1

Plazmid pMP1 koji je sekrecijski vektor za prvih 155 aminokiselina TPO je konstruiran međusobnom ligacijom 5 fragmenata DNA kao što je prikazano na SI. 33. Prvi je bio vektor phGH1 u kojem je mali Mlul-BamHI fragment bio uklonjen. pPho21 je deriviran od phGH1 (Chang C. N. et al., Gene 55:189-196 [1987]) u kojem je humani hormon rasta zamijenjen s phoA genom E. colli, a Mlul restrikcijsko mjesto je prevedeno u kodirajuću sekvenciju za STII signalnu sekvenciju kod aminokiselina 20-21.

Sa slijedeća dva fragmenta, 258 bp Hinfl-Psti dio od DNA iz pRK5-hmpl (Primjer 9) koja kodira TPO aminokiseline 19-103 i sintetska DNA koja kodira aminokiseline 1-18

5'GCGGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGT AAACTGCTTCGTG

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCA TTTGACGAAGCACTGA-5'

(SEQ ID NO: 69)

(SEQ ID NO: 70)

je prvo izvršena ligacija uz T4-DNA ligazu, a zatim je rezano s Pstl. Četvrti fragment je bio Pstl-Haelll fragment s 152 bp iz pRK5hmpll koji kodira aminokiseline 104-155 od TPO. Zadnji Stul-Bam-HI fragment je sadržavao 412 parova baza od pdh108 koji sadrži lambda za transkripcijski terminator kao što je ranije opisano (Scholtissek, S. et al., NAR 15:3185 [1987]).

(b) Plazmid pMP21

Plazmid pMP21 dizajniran je da eksprimira prvih 155 aminokiselina TPO s pomoći 13 aminokiselinske vodeće sekvencije koja sadrži STII signalnu sekvenciju. On je konstruiran ligacijom tri (3) DNA fragmenta kao što je prikazano u SI. 34, prvi je bio vektor pVEG31 iz kojem je uklonjen mali Xbal-Sphl fragment. Vektor pVEG31 je dobiven od pHGH207-1 (de Boer, H. A. et al., u Promoter Structure and Finction (Rodriguez, R. L. i Chamberlain M. J. Ed) 462, Praeger, New York [1982]), u kojem je gen humanog hormona rasta zamijenjen genom za vaskularni endotelialni faktor rasta (taj identični fragmentni vektor može se dobiti iz tog zadnjeg plazmida).

Drugi dio u ligaciji je bila sintetska dupleks DNA sa slijedećom sekvenijom:

5-CTAGAATTATGAMAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA

TTAATATrTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-51

(SEQ ID NO:71)

(SEQ ID NO: 72)

Zadnji dio bio je Mlul-Sphl fragment s 1072 parova baza iz pMP1 koji kodira 155 TPO aminokiselina.

(c) Plazmid pMP151

Plazmid pMP151 konstruiran je da eksprimira prvih 155 aminokiselina TPO nizvodno od vodeće sekvencije koja je sadržavala 7 aminokiselina STII signalne sekvencije. Kao što je prikazano u SI. 35, pMP151 je konstruiran ligacijom tri DNA fragmenta, prvog koji je prethodno opisani vektor pVEG31 iz kojeg je uklonjen mali fragment Xbal-Sphl. Drugi je sintetska dupleks DNA koja je imala slijedeću sekvenciju:

5'CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCAT CACATCGAGGGTCGTAGCC

TTAATAATTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTG TAGCTTCCAGCAT-5'

(SEQ ID NO:73)

(SEQ ID NO:74)

Zadnji je bio fragment Bgll-Sphl s 1064 parova baza iz pMP11 koji kodira aminokiseline od TPO. Plaz:mid pMP11 identičan je onom pMP1 s izuzetkom nekih promjena koda u STII signalnoj sekvenciji (taj fragment se može dobiti izpMOI).

(d) Plazmid pMP151

Plazmid pMP202 je vrlo sličan vektoru za ekspresiju pMP151 osim što je faktor Xa mjesta cijepanja u vodećoj sekvenciji zamijenjen mjestom cijepanja za trombin. Kako je pokazano u SI. 36, pMP202 je konstruiran ligacijom tri DNA fragmenta. Prvi od njih je prethodno opisani pVEH31 u kojem je mali Xbal-Sphl fragment uklonjen. Drugi je sintetska dupleks DNA slijedeće sekvencije:

S'-CTAGAATTATGAAAAGAAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCA CCATCACATCGAACCACGTAGCC' TTAATACTTTTTCTTAJAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTSGTGGTA GTGTAGCTTGGTGCAT-51

(SEQ ID NO: 75)

(SEQ ID NO:76)

Zadnji je bio fragment Bgll-Sphl s 1064 parova baza iz prethodno opisanog plazmida pMP11.

(e) Plazmid pMP 172

Plazmid pMP172 je sekrecijski vektor za prvih 153 aminokiselina TPO, a međuprodukt je pri konstrukciji pMP210. Kao što je pokazano u SI. 37, pMP172 je priravljen ligacijom tri DNA fragmenta, prvi je bio vektor pLS32lamB u kojem je mali EcoRI-Hindlll dio uklonjen. Drugi je bio EcoRI-Hgal fragment s 946 parova baza iz prethodno opisanog plazmida pMP11. Zadnji je dio sintetske dupleks DNA sa slijedećom sekvencijom:

5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT

(SEQ ID NO: 77)

GGAGACGCAGTCCATCGA-5'

(SEQ ID NO: 78)

(f) Plazmid pMP210

Plazmid pMP210 je konstruiran je da eksprimira prvih 153 aminokiselina TPO nakon translacije početnog metionina. Plazmid je zapravo načinjen kao banka plazmida u kojem su u prvih 6 kodona TPO u položaju tri svakog kodona aminokiseline slučajne, a konstruiran je kao što pokazuje SL.38 ligacijom tri fragmenta DNA. Prvi fragment je prethodno opisani vektor pVEG31 iz kojeg je mali fragment Xbal-Sphl uklonjen. Drugi je sintetska dupleks DNA koja je prikazana dolje, a na koju se prvo djelovalo s DNA polimerazom (Klenovv), a zatim je digerirana s Xbal i Hinfl, te je slijedilo kodiranje početnog metioniria i uvođenjem slučajnih prvih 6 kodona od TPO.

5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGSCCTC

CGAACACTGGAGGCT GTTCTCAGTAAA

(SEQ ID NO: 79)

CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5'

(SEQ ID NO: 80)

Treći je bio fragment Hinfl-Sphl s 890 parova baza pMP172 koji kodira aminokiseline 19-153 od TPO.

Banka plazmida pMP'210 s približno 3700 klonova je retransformirana na pločama tetraciklina visoke koncentracije (50 |ig/mL), da bi se izdvojili klonovi visoke translacijeske inicijacije (Vansura, D. G. et al., Methods: A Comanion to Methods in Enzymo/ogy4:151-158 [1992]). Od 8 kolonija koje su narasle na pločama tetraciklina, pet najboljih glede TPO ekspresije su podvrgnute DNA sekvenciranju i rezultati su prikazani na SI. 39 (SEO ID NO: 23, 24, 25, 26 i 28).

(g) Plazmid pMP41

Plazmid pMP41 je konstruiran da eksprimira prvih 155 aminokiselina TPO vezanih na vodeću sekvenciju koja je sadržavala 7 aminokiselina STII signalne sekvencije, nakon čega slijedi Xa mjesto cijepanja. Plazmid je konstruiran kao što je prikazano u SI.40 ligacijom tri fragmenta DNA, prvi je opisani vektora pVEG31 iz kojeg je mali fragment Xbal-Sphl uklonjen. Drugi fragment je sintetska dupleks DNA koja je imala slijedeću sekvenciju:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ ID NO: 81) TTAATAATTTTTATTATAGCGTMATAGCTTCCAGCAT-5' {SEO ID NO: 82)

Zadnji je bio fragment Bgll-Sphl s 1064 parova baza iz prethodno opisanog plazmida pMP11.

(h) Plazmid pMP57

Plazmid pMP57 eksprimira prvih 155 aminokiselina TPO nizvodno od vodeće sekvencije koja je sadržavala 9 aminokiselina STII signalne sekvencije i dibazno mjesto Lys-Arg. Dibazno mjesto omogućuje uklanjanje vodeće sekvencije s proteazom ArgC. Plazmid je konstruiran kao što je prikazano u SI.41, ligacijom tri fragmenta DNA. Prvi je prethodno opisani vektor pVEG31 iz kojeg je mali fragment Xbal-Sphl uklonjen. Drugi sintetska dupleks DNA koja je imala je slijedeću sekvenciju:

S'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83) TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ID NO: 84)

Zadnji je bio fragment Bgll-Sphl s 1064 parova baza iz prethodno opisanog plazmida pMP11.

(i) Plazmid pMP251

Plazmid pMP251 je deTivat pMP210-1 u kojeg su uključene dvije dodatne aminokiseline TPO na karboksi-teriminalnom kraju. Plazmid je konstruiran kao što je prikazano u SI.41, ligacijom tri fragmenta DNA. Prvi je prethodno opisani pMP21 u kojem je uklonjen mali Xbal-Apal fragment. Drugi je Xbal-Apal fragment s 316 parova baza iz pMP210-1.

2. Transformacija i indukcija E. coli s TPO ekspresijskim vektrorima

Gornji TPO ekspresijski plazmidi su korišteni za transformaciju lanca E. colli44C6 (w3110 IonAΔ rpoHts IonAΔ clpPΔ galE) korištenjem CaCl2 metodu toplinskog šoka (Mandel, M. et al., J. Mol. Bioi, 53:159-162, [1970]). Transformirane stanice su prvo rasle pri 37 °C u LB mediju koji sadrži 50 |ig/mL karbenicilina sve dok je optička gustoća (600 nm) dostigla približno 2-3. LB Kultura je zatim razrijeđena 20x u M9 mediju koji sadrži 0.49% casamino kiselinu (mas %) i 50 ng/mL karbenicilina. Nakon rasta uz propuhavanje zrakom pri 30 °C tijekom 1 sata, dodana je indol-3-akrilna kiselina do konačne koncentracije 50 |ig/mL. Kultura je zatim ostavljena da raste pri 30 °C uz propuhivanje zraka slijedećih 15 sati, nakon čega su stanice sakupljene centrifugiranjem.

PRIMJER 22

Priprava biološki aktivnog TPO (Met1 1-153) u E. colli

Dolje dani postupci za pripravu biološki aktivnih, nabranih TPO (met-1 1-153) mogu se primjeniti po analogiji za dobivanje ostalih TPO varijanata uključujući N- i C-terminalno proširene oblike (vidi Primjer 23).

A Dobivanje ne topljivih TPO (met-1 1-153)

Stanice E colli koje eksprimiraju TPO (met-1 1-153) kodirane plazmidom pMP210-1 su fermentirane kao što je gore opisano. Tipično, oko 100 g stanica je resuspendiorano u 1 L (10 volumena) pufera za razaranje stanica (10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) s Polvtron homogenizatorom i stanice su centrifugirane kod 5000 x g kroz 30 minuta. Prani stanični talog je resuspendiran u 1 L pufera za razaranje stanica s Polytron homogenizatorom i suspenzija stanica je prošla kroz LH Celi Disrupter (LH Inceltech, Ine) ili kroz Microfluidzer (Microfluids Internetional) prema postupku proizvođača. Suspenzija je centrifugirana kod 5000 g 30 minuta, te je po drugi put suspendirana i centrifugirana, da nastane oprani talog refraktilnih čestica.

Prani talog je korišten odmah ili je skladištem pri -70 °C.

B. Solubilizacija i purifikacija monomerne T PO (Met-1 1-153)

Gornji talog je resuspendiran u 5 volumena po masi s 20 mM Tris, pH 8 s 6-8 M gvanidinom i 25 mM DTT (ditiotreitol) i miješano je 1-3 h ili preko noći pri 4 °C, da bi se pospješilo otapanje TPO proteina. Visoka koncentracija uree (6-8 M) također je korisna, ali su iskorištenja manja u odnosu na ona s gvanidinom. Nakon solubilizacije, otopina je centrifugirana kod 30000 x g 30 minuta pri čemu se dobiva bistri supernatnat koji sadrži monomerne TPO proteine. Supernatant je zatim kromatografiran na Superdex 200 koloni za gel filtraciju (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) pri brzini protoka 2 mL/min., a protein je eluiran s 20 mM Na fosfatnog pufera pH 6.0 i 10 mM DTT. Frakcije koje sadrže monomerni TPO protein ispirane su s 160 do 200 mL, te su sakupljene. TPO protein je dalje pročišćavan na polupreparativnoj C4 koloni reverzne faze (VYDAC).

Uzorak je nanesen brzinom 5 mL/min na prethodno ekvilibriranu kolonu u 0.1% TFA (trifluoroctena kiselina) s 30% acetonitrila. Protein je eluiran linearnim gradijentom acetonotrila (30-60% u 60 minuta). Pročišćeni reducirani protein je eluiran kod približno 50% acetonitrila. Taj materijal je korišten za nabiranje, da bi se dobila biološki aktivna varijanta TPO.

C Dobivanje biološki aktivnog TPO (Met-1 1-153)

Oko 20 mg monomernog reduciranog i denaturiranog TPO proteina u 40 mL 0.1% TFA/50% acetonitrila otopljeno je u 360 mL pufera za nabiranje koji optimalno sadrži slijedeće reagense:

50 mM Tris

0.3 M NaCI

5 mM EiDTA

2% CHAPS detergent

25% glicerola

5 mM oksidiranog glutationa

1 mM reduciranog glutationa

pH podešen na 8.3

Nakon što se pomiješalo, pufer za nabiranje je lagano miješan pri 4 °C 12-48 h da bi se dobio maksimalni prinos nabiranja ispravno disulfidno veznanog TPO (vidi ispod). Otopina je zatim zakiseljena s TFA do konačne koncentracije 0.2%, filtrirana kroz filter od 0.45 ili 0.22 mikrona, te je dodan 1/10 volumen acetonitrila. Otopina je zatim nanesena na C4 kolonu reverzne faze i pročišćeni nabrani TPO (Mer-1 1-153) je eluiran s približno 45% acetonitrilom pod ovim uvjetima. Neispravno disulfidno vezani TPO je eluiran ranije. Konačno pročišćeni TPO (Mer-1 1-153) je više od 95% čist prema SDS gelu i analitičkoj kromatografiji reverzne faze. Za studij životinja, C4 pročišćeni materijal je dializiran u fiziološki kompatibilnom puferu. Korišteni su izotonični puferi (10 mM Na acetat, pH 5.5, 10 mM sukcinat, pH 5.5 ili 10 mM Na fosfat, pH 7.4) koji sadrže 150 mM NaCI i 0.01% Tween 80.

Zbog velike aktivnosti TPO u Ba/F3 testu (polumaksimalna stimulacija je postignuta kod približno 3 pg/mL) moguće je dobiti biološki aktivan materijal korištenjem različitih pufera, detergenata i redoks uvjeta. Međutim, kod većine uvjeta dobivena je samo se mala količina ispravno nabranog materijala (<10%). Za komercijalnu priravu poželjno je da prinos nabiranja bude najmanje 10%, preferirano 30-50%, a posebno preferirano >50%. Testiran je utjecaj mnogih raznih detergenata (Triton X-100, dodecil-β-maltozid, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozil, Tween 20 i Tween 80, Zwittergent 3-14 i ostali) na iskorištenje nabiranja. Od tih detergenata samo je za obitelj CHAPS (CHAPS i CHAPSO) nađeno da mogu biti korisni u reakciji nabiranja, zato jer ograničuju agregaciju proteina i sprječavaju nastajanje neispravnih disulfidnih veza. Najkorisnije je ako je koncentracija CHAPS veća od 1%. Za najbolji prinos potreban je natrij-klorid, a optimalna koncentracija se kreće između 0.1 M i 0.5 M. Prisutnost EDTA (1-5 mM) ograničava oksidaciju kataliziranu metalom (i agregaciju), koja je uočena kod nekih pripravaka. Koncentracija glicerola veća od 15% omogućuje optimalne uvjete za nabiranje. Za maksimalni prinos potrebno je da budu prisutni i oksidirani i reducirani glutation ili oksidirani i reducirani glicerol kao redoks par. Općenito, primjećeno je iskorištenje veće kada je molarni omjer oksidiranog i reduciranog reagensa jednak ili ako je reducirani u suvišku. Optimalno je da se pri nabiiranju TPO varijanata pH vrijednosti kreću između 7.5 do oko 9. Organska otapala (npr. etanol, acetonnitril, metanol) mogu biti prisutna u koncentracijama 10-15% ili u nižim. Veća koncentracija organskih otapala povećava količinu neispravno nabranih oblika. Općenito se mogu koristiti Tris i fosfatni puferi. Inkubacija kod 4 °C također pogoduje nastajanju izpravno nabranog TPO.

Iskorištenja nabiranja od 40-60% (prema korištenom reduciranom i denaturiranom TPO za reakciju nabiranja) tipična su za pripravu TPO koji su pročišćeni u C4 koraku. Aktivni materijal može se dobiti i kada se manje čisti priravak (npr. odmah nakon Superdex 200 kolone ili nakon početne ekstrakcije refraktilnih čestica), mada su iskorištenja niža zbog velike količine taloga koji stupa u interakciju s proteinima koji nisu TPO tijekom procesa nabiranja TPO.

Kako TPO sadrži 4 ostatka cisteina, moguće je stvaranje triju različitih disulfidnih varijanata tog proteina.

varijanta 1: disulfidne veze između cisteinskog ostatka 1-4 i 2-3

varijanta 2: disulfidne veze između cisteinskog ostatka 1-2 i 3-4

varijanta 3: disulfidne veze između cisteinskog ostatka 1-3 i 2-4

Tijekom početnih istraživanja za određivanje uvjeta za nabiranje, razdvojeno je nekoliko TPO proteina kromatografijom na C4 reverznoj fazi. Samo je jedan od tih imao značajnu biološku aktivnost, koja je utvrđena korištenjem Ba/F3 testa. Uvjeti za nabiranje su se postupno mijenjali tako da prvenstveno nastane ta varijanta. Pod tim uvjetima količina krivo nabranih varijanata bila je manja od 10-20% ukupnog monomera TPO dobivenog u stupnju otapanja.

Masenom spektrometrijom je odeređeno da je 1-4 i 2-3 disulfidna varijanta TPO biološki aktivna (i.e. vrsta 1). Alikvoti od različitih odijeljenih siganala na C4 (5-10 nmol) su digestirani s tripsinom (1:25 molarni omjer tripsina prema proteinu). Smjesa dobivena digestijom je analizirana masenom spektrometrijom prije i poslije redukcije s DTT. Nakon redukcije detektirane su mase koje odgovaraju najvećem tripsiniranim peptidima TPO. Masa novih siganala u osnovi odgovara zbroju masa pojedinih tripsiniranih peptida koji čine disulfidni par. Tako je moguće sa sigurnošću odrediti da je bioliški aktivna disulfidna vrsta rekombinantne TPO nakon nabiranja 1-4 i 2-3. Ovo je u skladu s poznatom disulfidnom vrstom slične molekule eritroproteina.

C. Biološka aktivnost nabranog TPO (Met-1 1-153) dobivenog rekombinanacijom

Nabran i pročišćen TPO pokazuje aktivnost i pri in vitro i pri in vivo testovima. U Ba/F3 testu, polumaksimalna stimulacija ugradnje timidina u Ba/F3 stanice postignuta je kod 3.3 pg/mL (0.3 pM) za TPO (Mer1 1-153). U ELISA testu koji se temelji na mpl receptom, polumaksimalna aktivnost primjećena je kod 1.9 ng/nnL (120 pM). Kod normalnih i mielosuprimiranih životinja nastalih X-zračenjem u skoro letalnim dozama, nabrani TPO (Met-1 1-153) je bio vrlo učinkovit (aktivnost za stimuliranje produkcije novih trombocita uočena je kod tako niskih doza kao što je 30 ng/mišu).

PRIMJER 23

Priprava drugih varijanata biološki aktivnog TPO u E. colli

Dolje su prikazane tri različite TPO varijante producirane u E. colli, koje su pročišćene i nabrane u biološki aktivni oblik.

(1) MLF - 13 ostaci iz signalne sekvencije STII koja je dobivena iz bakterije su fuzionirani u N-terminalnoj domeni TPO (ostaci 1-155). Nastala sekvencija je

MKKNIAFLLNAYASPAPPAC--CVRRA (SEQ ID NO: 85)

gdje je vodeća sekvencija podvučena, a C -C predstavlja Cys7 preko Cys151. Taj oblik je konstruiran da omogući tirozin zaradio-jodiranje TPO za receptor i biološka studije.

(2) H8MLF - 7 ostaci iz STII sekvencije, 8 histidinski ostaci i Faktor Xa enzimskog cijepanja IEGR sekvencije su spojeni u N-terminalnoj domeni TPO (ostaci 1-155). Nastala sekvencija je

MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC--CVRRA (SEQ ID NO: 86)

gdje je vodeća sekvencija podvučena, a C----C predstavlja Cys7 preko Cys151. Na taj oblik se nakon pročišćavanja i nabiranja moglo djelovati s enzimatskim faktorom Xa koji će cijepati nakon argininskog ostatka sekvencije IEGR pri čemu nastaje TPO oblik s 155 ostataka u duljini s prirodnim serinom kao N-terminalnom aminokiselinom.

(3) T-H8MLF - je pirpravljen kako je opisano gore za varijatu (2), osim što je sekvencija IEPR, osjetljiva na trombin, fuzionitana na N-terminalnu domenu TPO. Nastala sekvencija je

MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC--CVRRA (SEQ ID NO: 87)

gdje je vodeća sekvencija podvučena, a C----C predstavlja Cys7 preko Cys151. Na taj oblik se nakon pročišćavanja i nabiranja moglo djelovati s enzimom trombinom da bi nastala prirodna N-terminalna vrsta TPO duljine 155 ostataka.

A. Dobivanje, solubilizacija i čišćenje monomernih, biološki aktivnih TPO varijanata (1), (2) i (3)

Sve varijante su eksprimirane u E. colli. Glavnina varijanata je nađena u refraktilnim česticama, kao što je primjećeno u Primjeru 22 za TPO (Met-1-153). Identične procedure za dobivanje, solubilizaciju i pročišćavanje monomernih TPO varijanata postignute su kako je opisano u Primjeru 22. Korišteni su identični uvjeti nabiranja onima za TPO (Met-1 1-153) s ukupnim iskorištenjem 30-50%. Nakon nabiranja, TPO varijante su pročišćavane C4 kromatografijom reverzne faze u 0.1% TFA, korištenjem gradijenta acetontrila kako je prije opisano. Sve TPO varijante (u njihovoj neproteoliziranom obliku) imale su biološku aktivnost u Ba/F3 testu s polumaksimalnom aktivnosti 2-5 pM.

B. Proteoliza varijanata (2) i (3) da bi nastala autentična N-teminalna TPO (1-155)

Gore dobivene TPO varijante (2) i (3) su konstruirane da imaju vodeći peptid koji se može enzimski cijepati prije cijepanja normalnog N-terminalnog aminokiselinskog ostatka TPO. Nakon nabiranja i pročišćavanja varijanata (2) i (3) kako je gore opisano, svaki je podvrgnut digestiji s odgovarajućim enzimom. Svakoj varijanti je nakon čišćenja na C4 raverznoj fazi, acetonitril uklonjen blagim propuhavanjem dušika kroz otopinu. Zatim je na obje varijante djelovano ili s Faktorom Xa ili trombinom kao što je dolje opisano.

Otopini TPO varijante (2) kojoj je acetonitril uklonjen, dodan je 1 M Tris pufer, pH 8 do konačne koncentracije 50 mM, a pH je podešen na 8, ukoliko je bilo potrebno. Dodani su NaCI i CaCl2 do 0.1 M i 2 mM. Faktor Xa (New England Biolabs) je dodan da se postigne molarni omjer 1:25 do 1:100 enzima prema varijanti. Uzorak je inkubiran pri sobnoj temperaturi 1-2 h da se postigne maksimalno cijepanje što je uočeno promjenom migracije na SDS gelu zbog gubitka vodeće sekvencije. Zatim je reakcijska smjesa pročišćavana C4 kromatografijom reverzne faze, koristeći uvjete kako je gore opisano za pročišćavanje ispravno nabranih varijanata. Necijepana varijanta B je odijeljena od varijante (2) pod ovim uvjetima. Pokazalo se da N-terminalne aminokiseline jesu SPAPP, ukazujući za je uklanjanje N-terminalne vodeće sekvencije bilo uspješno. Faktor Xa također je generirao promjenjljive količine cijepanja unutar TPO domene; cijepanje je uočeno nakon što je argininski ostatak u položaju 118 uspješno generirano dodatnu N-terminalnu sekvenciju TTAHKDP (SEQ ID NO: 88). Na nereducirajućem SDS gelu, uočena je jedna vrpca kod približno 17000 daltona za varijantu cijepanu Faktorom Xa; na reducirajućem gelu uočene su dvije vrpce molekularne mase približno 12000 i 5000 daltona, što je u skladu s cijepanjem kod arginina 118. Ovo zapažanje je također potvrđuje da su dva dijela moleklule vezana disulfidnom vezom između prvog i četvrtog cisteinskog ostatak, kao što je zaključeno iz gore opisanog ekspreimenta digestije tripsinom. U Ba/F3 biološkom testu, pročišćena TPO (1-155) varijanta je nakon uklanjanja N-terminalne vodeće sekvencije i internog cijepanja imala od 0.2 do 0.3 pikomolarnu polumaksimalnu aktivnost.

Za varijantu (3) pufer za digstiju sastoji se od 50 mMTris, pH 8, 2% CHAPS, 0.3 M NaCI, 5 mM EDTA i humanog ili goveđeg trombina (Calbiovhem) kod 1:25 do 1:50 masa enzima prema TPO varijanti proteina. Digestija je vođena pri sobnoj temperaturi 2-6 sati. Napredovanje digestije je testirano na SDS gelu, kao što je gore opisano za reakciju cijepanja uz Faktor Xa. Općenito je u tom vremenu postignuto više od 90% cijepanja vodeće sekvencije. Nastali TPO je pročišćavan na C4 koloni reverzne faze kako je gore opisano i pokazano je da ima željenu N-terminalnu sekvenciju aminokiselina. Dobivena je vrlo mala količina (<5%) inertnog cijepanja kod iste arginin-treonin veze kao što je i gore primjećeno za Faktor Xa. Nastali TPO protein imao je visoku biološku aktivnost, s polumaksimalnim odgovorom u Ba/F3 testu kod 0.2-0.4 pikomolarnog proteina. U ELISA testu koji se temelji na mpl receptom, taj protein je imao polumaksimalni odgovor kod 2-4 ng/mL pročišćenog proteina (120-240 pikomolarno) dok je cijela varijanta koja sadrži vodeću sekvenciju bila 5-10 puta manje aktivna po oba testa. Za studij životinja cijepani protein pročišćavan HPLC je dializiran u fiziološki prihvatljivom puferu s 150 mM NaCI, 0.1% Tvveen 80 i 10 mM natrij-sukcinata pH 5.5 ili 10 mM natrij-acetata pH 5.5 ili 10 mM natrij-fosfata pH 7.4. Protein pročišćavan HPLC i SDS elektroforezom na gelu bio je stabilan nekoliko tjedana ukoliko je skladišten pri 4 °C. Kod normalnog ili mielosuprimiranih miševa taj pročišćeni TPO s autentičnom N-terminalnih sekvencijom bio je vrlo aktivan, stimulirajući produkciju trombocita pri dozama tako niskim kao što je 30 ng/mišu.

PRIMJER 24

Sintetski mpl Ugandi

Mada se humani mpl (hML) lignadi obično pripravljaju korištenjem metode rekombinacije, mogu se također sintetizirani enzimskom ligacijom fragmenata sintetskih peptida, korištenjem dolje opisane metode. Sintetska priprava hML dozvoljava ugrađivanje sintetskih aminokiselina ili sintetskih funkcionalnih skupina kao što je polietilenglikol. Prethodno je mutant serin proteaze subtilizin BPN, (S221C/P225A) bio promjenjen subtiligazom tako da efikasno vezuje peptidne estere u vodenoj otopini (Abrahmsen et al., Biochem., 30:4151-4159 [1991]). Sada je pokazano da sintetski peptidi mogu biti vezani enzimski u sekvencijama tako da produciraju enzimski aktivne duge peptide i proteine kao što je ribonukleaza A (Jackson et al., Science, [1994]). Ta tehnologija, opisana detaljno niže, omogućuje sintezu dugih proteina koji su prije mogli biti pripravljeni samo tehnologijom rekombinantne DNA.

Općenita strategija za hML153 sintezu korištenjem subligata je prikazana (Shema 1). Potpuno nezaštićenom peptidu, koji odgovara C-terminalnom fragmentu proteina, dodaje se C-terminalno aktivirani peptidni ester zaštićen na N-terminalnom kraju skupa sa subligazom. Kad je reakcija zvršena, produkt je izoliran HPLC reverzne faze, a zaštitna skupina je uklonjena s N-terminalnog kraja. Slijedeći peptidni frgament je vezan, uklonjena mu je zaštitna skupina i proces se ponavlja koristeći slijedeći peptid sve dok nije dobiven protein u cijeloj duljini. Proces je sličan onom na krutom nosaču, jer se peptid koji je N-zaštićen a C-aktiviran vezuje .na N-terminus prethodnog peptida i protein se sintetizira u smjeru C->N. Međutim, zbog toga što se svakom spajanje ostatak povećava za 50, te što se produkt izolira poslije svakog spajanja, moguće je sintetizirati mnogo dulje proteine u razumnom iskorištenju.

[image]

Na osnovi našeg saznanja o specifičnosti sekvencije subligaze kao i sekvencije aminokiseline biološki aktivne "epo-domene" hML, podijelili smo hML153 u sedam fragmenata duljine od 18-28 ostataka. Tetrapeptidi za probne ligacije su sintetizirani da bi se odredilo pogodno vezivanje za 18-25 mere. Tablica 13 prikazuje rezultate tih vezivanja.

TABLICA 13

Test hML vezivanja. Peptidi donora i nukleofila su otopljeni kod 10 mM u 100 mM tricinu (pH 7.8) pri 22 °C. Dodano je 1.6 mg/mL ligaze do konačne koncentracija 10 μM (oko 70 μM) i proces vezivanja je ostavljen da se odvija preko noći. Iskorištenja predstavljaju % vezivanja prema hidrolizi peptida donora.

[image]

Na osnovu ovih eksperimenata peptidi na kojima je izvršena ligacija, a prikazani su u Tablici 14, pokazuju daje ligacija učinkovita uz subligazu. Bilo je pogodno zaštitititi skupinu na N-terminalnom kraju svakog esterskog peptidnog donora, da bi se spriječila samoiigacija. Odabrali smo izonikotil (iNOC) zaštitnu skupinu (Veber et ai, J. Org. Cham., 42:3286-3289 [1977]) zbog topljivosti u vodi, a i zato što može biti ugrađen u zadnji korak sinteze peptida na krutoj fazi, te što nije reaktivan s H F koji se koristi da bi se otcjepio peptid s krute faze smole. Nadaljen, može se ukloniti iz peptida nakon svake ligacije pod blagim redukcijskim uvjetima (Zn/CH2CO2H) da bi nastao slobodan N-terminalni kraj za slijedeću ligaciju. Glikolat-lizil-amid ester (glc-K-NH2) je korišten za aktivaciju C-terminalnog kraja, jer je prethodnim eksperimentima pokazano da se taj efikasno acilira uz subligzu (Abrahmsen et al., Biochem., 30:4151-4159 [1991]). iNOC zaštićen i glc-K-amidom aktiviran peptid može se sintetizirati korištenjem standardne metode na krutoj fazi kao što je pokazano (Shema 2). Peptidi su zatim postupno podvrgnuti ligaciji sve dok nije dobiven cijeli protein koji je zatim nabran in vitro. Na osnovu homologije s EPO, vjeruje se da disulfidni parovi nastaju između cisteinskih ostataka 7 i 151 i između 28 i 85. Oksidacija disulfida može se izvesti jednostavnim miješanjem materijala za redukciju u atmosferi kisika nekoliko sati. Nabrani materijal se može pročistiti HPLC i frakcije koje sadrže aktivni protein se sakupe i liofoliziraju. Alternativno se disulfidi mogu diferencijalno zaštititi tako da se kontrolirano oksidiraju specifični disulfidni parovi. Zaštita cisteina 7 i 151 s acetamidometil (acm) skupinom osigurat će oksidaciju na položaju 28 i 85. Zatim se acm skupina može ukloniti, a ostaci 7 i 151 oksidirati. Nasuprot tomu, ostaci 28 i 85 mogu se zaštititi s acm i oksidirati u slučaju da je postupna oksidacija potrebna za pravilno nabiranje. Po izboru se mogu cisteini 28 i 85 supstituirati s drugim prirodnim ili sintetskim ostatkom koji nije Cys, da bi se osigurala odgovarajuća oksidacija cisteina 7 i 151.

[image]

[image]

Ligacija peptida provedena je pri 25 °C u 100 mM tricinu pH 8 (sveže pripravljen i degasiran vakuum filtracijom preko 5 μM filtera). Tipični, C-terminalni fragment otopljen je u puferu (2-5 mM peptid) i dodana je 10x otopina subligaze (1 mg/mL u 10 mM tricinu pH 8) da bi konačna koncentracija enzima bila do 5 μM. U obliku krutine je dodano 3-5 molarnog suviška aktiviranog donorskog peptida glc-K-NH2, otopljeno je i smjesa je ostavljena pri 25 °C. Ligacija je praćena analitičkom C18 HPLC reverzne faze (CH3CN/H2O gradijen u 0.1% TFA). Produkti ligacije pročišćavani su na preparativnoj HPLC i liofilizirani. Uklanjanje izonikoltilne (iNOC) zaštitne skupine provedeno je miješanjem zaštićenog peptida s HCI aktiviranim cinkom u prahu u octenoj kiselini. Praškasti cink je uklonjen filtracijom, a octena kiselina uparena je u vakuumu. Nastali peptid se može izravno koristiti za slijedeću ligaciju i prostupak se ponavlja. Sa sintetskim hML-153 rnože se provesti ligacija, kao što je gora opisano za sintetske ili rekombinantne Hml154-332, da bi nastao sintetski ili polusintetski hML u punoj duljini.

Sintetska hML ima prednosti pred rekombinantnom. Sintetski bočni lanci mogu se uvesti da bi se poboljšala aktivnost ili specifičnost. Polimerne funkionalnosti kao što je polietilglikol mogu se ugraditi da bi se poboljšala trajnost aktivnosti. Primjerice, poletilenglikol (Tablica 14) se može vezati na lizinski ostatak pojedinog fragmenta prije i poslije izvođenja jednog ili više koraka ligacije. Peptidna veza osjetljiva na proteazu može se in vivo ukloniti ili prevesti u drugu da bi se poboljšala stabilnost. Nadalje, mogu se sintetizirati derivati s teškim metalom, da bi pomogli pri određivanju strukture.

[image]

a) Lizil-parametilbenzhidrilaminska (MBHA) smola 1 (0.63 mekv./g, Advanced ChemTech) miješana je s bromoctenorn kiselinom (5 ekviv.) i diizopropilkarbodiimidom (5 ekviv.) 1 h pri 25 °C u dimetilacetamidu (DMA) da bi nastao bromacetil derivat 2. b) Smola je iscrpno prana s dimetilacetamidom (DMA) i pojedine Boe zaštitne skupine aminokiselina (3 ekviv., Bachem) su esterificirane miješanjem s natrij-bikarbonatom (6 ekviv.) u dimetilformamidu (DMF) 24 h pri 50 °C, da bi nastao odgovarajući glikolat-fenilalanil-amid-smola 3. Aminoacetilirana smola 3 prana je s DMF (3x) i diklormetanom (CH2Cl2) (3x) i može se čuvati pri sobnoj temperaturi nekoliko mjeseci. Smola 3 je zatim premještena u automaski stroj za sintezu peptida (Appled Biosystems 430A) i peptidi su produljeni koristeći standardne postupke na čvrstoj fazi. (5). c) N-α-Boc skupina uklonjena je otopinom 45% trifluoroctene kiseline u CH2Cl2- d) Slijedeća Boe zaštićena aminokiselina (5 ekviv.) je prethodno aktivirana korištenjem benzotriazol-l-il-oksi-tris-(dimetilamino)-fosfonij-heksafluorfosfata (BOP, 4 ekviv.) i N-metilmorfolina (NMM 10 ekviv.) u DMA i kondenzirana je tijekom 1-2 h. e) završna N-α-Boc skupina je uklonjena (TFA/CH2Cl2) pri čemu nastaje 4, te je uvedena izoniklotilna (iNOC) zaštitna skupina kao što je gore opisano (4) miješanjem s 4-izoniklotil-2,4-dinitrofenil karbonatom (3 ekviv.) i NMM (6 ekviv.) u DMA pri 25°C 24 h. f) Cijepanjem i uklanjanjem zaštitne skupine peptida djelovanjem s bezvodim HF (5% anisol/5% etil-metil-sulfid) pri 0°C kroz 1 h nastaje iNOC zaštićen i glikolat-lys-amidom aktiviran peptid 5 koji je pročišćavan C18 HPLC reverzne faze (CH3CN/H2O gradijent u 0.1% TFA). Identičnost svih supstrata potvrđena je spektrometrijom masa.

* ;DODATNE MOGUĆNOSTI ;Izvođenje izum kako je iznesen u patentnim zahtjevima, a u skladu s gornjim specifikacijama, je omogućen zbog lako dostupnih referencija i polaznih materijala. Uz to, aplikanti su pohranili u American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC) dolje navedene stanice: ;Escherichia colli, DH10B-pBSK - hmpl 1.8, ATCC broj CRL 69575, pohranjeno 24. veljače 1994. ;plazmid pSVI5.LL.MLORF, ATCC broj CRL ______, pohranjeno 6. prosinca 1994. ;CHO DP-12 stanice, ML 1/50 MCB (obilježene #1595), ATCC broj CRL 11770, pohranjeno 6. prosinca 1994. ;Pohranjivanje je provedeno po pravilima Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure i po njihovoj regulativi (Budapest Treaty). To osigurava održavanje viabilne kulture 30 godina od dana pohranjivanja. Organizmi će biti na raspolaganju kod ATCC pod uvjetima Budapest Treaty i bit će u skladu s dogovorom između aplikanta i ATCC koji osigurava neograničenu raspoloživost nakon izdavanja dozvole koja se temelji na U. S. patentu. ;*

Izum je predstavljen sa specifičnim primjerima i stručnjak nakon čitanja prethodno prikazanih specifikacija će biti u mogućnosti da unese razne promjene, zamjene ili ekvivalente i prepravljanja tog materijala koji je ovdje iznesen bez udaljavanja od njegovog osnovnog duha i opsega.

Claims (39)

1. Izoliran u biti homogen polipeptidni mpl ligand.

2. Polipeptidni mpl ligand iz patentnog zahtjeva 1, naznačen time da je odabran iz skupine koja se sastoji od: (a) fragmentnog polipeptida, (b) varijantnog polipeptida; te (c) kimeričnog polipeptida.

3. Polipeptidni mpl ligand iz patentnog zahtjeva 1, naznačen time da je odabran iz skupine koja se sastoji od: (a) polipeptida izloiranog iz sisavaca, (b) polipeptida koji je pripravljen rekombinatnim načinom, te (c) polipeptida koji je pripravljen sintetskim načinom.

4. Polipeptidni mpl ligand iz patentnog zahtjeva 1, naznačen time da je odabran iz skupine koje se satoji od: (a) humanog polipeptida, te (b) polipeptida koji nije imunogen u čovjeku.

5. Izolirani u biti homogen mpl agonist, naznačen time da je karakterističan po tome da: (a) agonist stimulira ugradnju obilježenih nukleotida (3H-timidin) u DNA Ba/F3 stanice, koje ovise od IL-3 na kojima je izvršena transfekcija humanim mpl P, ili (b) agonist stimulira ugradnju 35S u cirkulirajuće trombocite u povratnom trombocitnom testu.

6. Polipeptidni fagment prerna patentnom zahtjevu 2, predstavljen X-hTPO(7-151)-Y naznačen time da hTPO(7-151) predstavlja aminokiselinsku sekvenciju humanog TPO (hML) od Cys7 do uključujući Cys151, X predstavlja arnino skupinu Cys7 ili amino-terminalnu(e) aminokiselinu odabranu iz slijedeće skupine: [image] [image] Y predstavlja karboksi-terminalnu skupinu Cys151 ili karboksi-terminalni kraj aminokiselinskog ostatka (ostataka) koji je odabran iz slijedeće skupine: [image] i ekstenzije amino-terminalnog kraja aminokiselinskim ostatkom (ostacima) koji uključuju jedan ili više ostataka 176-332 humanog ML, kao što je pokazano na Slici 1 (SEQ ID NO:1).

7. Polipeptidni fragment prema patentnom zahtjevu 6, naznačen time da je odabran iz skupine TPO(1-153) i TPO(1-245).

8. Polipeptidni fragment prema patentnom zahtjevu 2, naznačen time da sekvencija aminokiselina polipeptidnog fragmenta sadrži: [image] i njihove kombinacije.

9. Polipeptid iz patentnog zahtjeva 6, naznačen time da nije glikoziliran.

10. Izolirani polipeptid, naznačen time da je kodiran nukleinskom kiselinom koja ima sekvenciju koja hibridizira pod uvjetima srednje strogosti s molekulama nukleinskm kiselina koje imaju sekvenciju prikazanu u Slici 1 (SEQ ID N0:2).

11. Polipeptid iz patentnog zahtjeva 10, naznačen time da je biološki aktivan.

12. Polipeptid iz patentnog zahtjeva 1, naznačen time da je odabran iz slijedeće skupine: hML, Hml153, hML(R153A), R154A), hML2, hML.3, hML4, mML, mML2, miMLS, pML i pML2.

13. Polipeptid iz patentnog zahtjeva 2, naznačen time da aminokiselinska sekvencija polipeptida sadrži aminokiselinske ostatke od 1 do X na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), gdje je X odabran iz slijedeće skupine: 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 i 332.

14. Izoliran u biti homogen polipeptidni mpl ligand, naznačen time da ima barem 80% identičnosti sekvencije s polipeptidom iz patentnog zahtjeva 13.

15. Polipeptid iz patentnog zahtjeva 13, naznačen time da X predstavlja 153.

16. Kimera, naznačena time da koja se sastoji mpl liganda iz patentnog zahtjeva 13, koja je fuzionirana s heterolognim polipeptidom.

17. Kimera iz patentnog zahtjeva 16, naznačena time da je heterologni polipeptid imunoglobinski polipeptid.

18. Kimera iz patentnog zahtjeva 16, naznačena time da je heterologni polipeptid interleukinski polipeptid.

19. Kimera, naznačena time da sadrži N-terminalne ostatke od 1 do oko 153 do 157 od hML koji je supstituiran s jednim ili više, ali ne svim, ostacima humanog EPO koji su dodani ili supstituirani u N-terminalne ostatke hML u položaju koji odgovara usporedbi sekvencija u Slici 10.

20. Anititijelo, naznačeno time da može vezati polipeptidni mpl ligand iz patentnog zahtjeva 13.

21. Stanična linija hibridoma, naznačen time da stvara antitijelo iz patentnog zahtjeva 20.

22. Izolirana molekula nukleinske kiseline, naznačen time da kodira polipeptidni mpl ligand iz patentnog zahtjeva 1.

23. Izolirana molekula nukleinske kiseline, naznačen time da kodira polipeptidni mpl ligand iz patentnog zahtjeva 13.

24. Izolirana molekula nukleinske kiseline, naznačen time da sadrži sekvenciju nukleinske kiseline s otvorenim okvirom čitanja koja je pokazana na Slici 1 (SEQ ID NO:2).

25. Izolirana molekula nukleinske kiseline iz patentnog zahtjeva 24, naznačena time da kodira polipeptidni mpl ligand odabran iz slijedeće skupine: hML, hML153, hML(R153A), R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML i pML2.

26. Izolirana molekula nukleinske kiseline, naznačena time da je odabrana od skupine koja se sastoji od: (a) cDNA klona koji sadrži sekvenciju nukleotida kodirajuće regije gena za mpl ligand, (b) DNA sekvenciju koja se može hibridizirati pod strogim uvjetima uvjetima s klonom iz (a), te (c) genetična varijanta bilo koje DNA sekvencije (a) ili (b) koja kodira polipeptid koji sadrži biološko svojstvo prirodnog polipeptidnog mpl liganda.

27. Izolirana molekula DNA, naznačena time da se sekvencija može hibridizirati s DNA sekvencijom prikazanom na Slici 1 (SEQ ID NO:2), pod srednje strogim uvjetima, pri čemu molekula DNA kodira biološki aktivan polipeptidni mpl ligand.

28. Molekula nukleinske kiseline iz patentnog zahtjeva 25, naznačena time da nadalje sadrži promotor koji je djelatno vezan na molekulu nukleinske kiseline.

29. Vektor za ekspresiju koji sadrži sekvenciju nukleinske kiseline iz patentnog zahtjeva 25, naznačen time da je djelatno vezan na kontrolnu sekvenciju koju prepoznaje stanica domaćina transformirana vektorom.

30. Stanica domaćina, naznačena time da je transformirana vektorom iz patentnog zahtjeva 29.

31. Proces uporabe molekule nukleinske kiseline koja kodira polipeptidni mpl ligand s ciljem utjecaja na produkciju polipeptidnog mpl liganda uključujući i kultiviranje stanice domaćina iz patentnog zahtjeva 30.

32. Proces iz patentnog zahtjeva 31, naznačen time da je polipeptidni mpl ligand dobiven iz stanice domaćina.

33. Proces iz patentnog zahtjeva 31, naznačen time da je polipeptidni mpl ligand dobiven iz. medija za kultiviranje stanica domaćina.

34. Metoda određivanja prisutnosti polipeptidnog mpl liganda, naznačena time da se sastoji od hibridizacije DNA koja kodira polipeptidni mpl ligand s nukleinskorn kiselinom iz testiranog uzorka i određivanja prisustnosti DNA polipeptidnog mpl liganda.

35. Metoda umnožavanje testiranog uzorka nukleinske kiseline, naznačena time da sadrži započinjanje reakcije nukleinske kiseline s nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptidni mpl ligand uz polimerazu.

36. Pripravak, naznačen time da sadrži polipeptidni mpl ligand iz patentnog zahtjeva 1 i farmaceutski prihvatljivu pomoćnu tvar.

37. Metoda tretmana sisavaca rizičnih za trombocitopeniju, naznačena time da se sastoji od davanja sisavcu terapijski efektivne količine pripravka iz patentnog zahtjeva 36, u slučaju potrebe za takvim tretamanom.

38. Pripravak iz patentnog zahtjeva 36, naznačen time da nadalje sadrži terapijski učinkovitu količinu sredstva odabranog iz skupine koja uključuje citooktin, faktor koji stimulira rast kolonija i interleukin.

39. Pripravak iz patentnog zahtjeva 38, naznačen time da je sredstvo odabrano iz slijedećih: IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 l IL-11.