BG63639B1 - Тромбопоетин-mpi-лигаден полипептид - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до изолиран тромбопоетин (ТРО), изолирана DNK, кодираща ТРО, и до рекомбинантни или синтетични методи за получаване и пречистване на ТРО. Установено е, че различните форми на ТРО влияят върху репликацията, диференциацията илизреенето на кръвните клетки, по-специално на мегакариоцитите и на мегакариоцитните родителски клетки, поради което посочените съединения могат да се използват за лечение на тромбоцитопения.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Изобретението се отнася за изолирането, пречистването и екомбинантния или химичен синтез на белтъци, които влияят върху преживяемостта, пролиферацията, диференциацията или узряване на ί ' хематопоетичните клетки и по-специално на тромбоцитните родителски клетки. По-конкретно това изобретение се отнася за клонирането и експресията на нуклеинови киселини, кодиращи белтъчен лиганд, способен да свързва и активира тр! - член на цитокиновата рецепторна суперфамилия. Това изобретение се отнася още и за използуването на тези белтъци поотделно или в комбинация с други цитокини за лечение на имунни или хематопоетични заболявания, включващи тромбоцитопенията.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

I. Хематопоетична система

Хематопоетичната система продуцира зрелите високоспециализирани кръвни клетки, за които е известно, че са необходими за преживяемостта на всички бозайници. Тези зрели клетки включват: еритроцити, специализирани да пренасят кислород и въглероден диоксид^Т- и В-лимфоцити, които са отговорни за клетъчно- и антитяло-ι медиираните имунни отговори, кръвни полчици или тромбоцити, специализирани да образуват кръвни съсиреци и гранулоцити и макрофаги, специализирани като фагоцитиращи и като помощни клетки за борба с инфекциите. Гранулоцитите допълнително се подразделят на: неутрофили, еозинофили, базофили и мастни клетки - специализирани клетъчни тиопве, които имат дискретни функции. Забележителното е, че всички тези специализирани зрели кръвни клетки произхождат от един общ примитивен клетъчен тип, означаван като плурипотентна (или тотипотентна) стволова клетка, открита най-напред в костния мозък (Dexter et al., Ann Rev. Cell Biol., 3:423-441 [1987]).

Зрелите високоспециализирани кръвни клетки трябва да се продуцидрат в големи количества непрекъснато през целия живот на бозайника. Голямата част от тези специализирани кръвни клетки са предопределени да остават функционално активни само от няколко часа до седмици (Cronkite et al., Blood Cells, 2:263-248 [1976]). По този начин, за да се обслужат нуждите от нормален статус на кръвните клетки в бозайника, е необходимо непрекъснатото обновяване на зрелите кръвни клетки, на самите примитивни стволови клетки, както и на всяка междинна или родословно-обвързана родителска клетъчна линия, лежаща между примитивните и зрелите клетки.

В центъра на хематопоетичната система лежи плурипотентната стволова клетка(и). Тези клетки са относително малко на брой и преминават през самообновяване чрез пролиферация, за да образуват дъщерните стволови клетки или се трансформират чрез серия диференциращи стъпки във все по-зрели родословно-ограничени родителки клетки, които задължително формират високоспециализираната зряла кръвна клетка(и).Например, определени мултипотентни родителски клетки, означавани като CFC-Mix, които са произлезли от стволови клетки, претърпяват пролиферация (самообновяване) и развитие, за да образуват колонии, които съдържат всичките различни миелоидни клетки: еритроцити, неутрофили, мегакариоцити (предшественици на тромбоцитите), макрофаги, базофили, еозинофили и мастни клетки. Други родителски клетки от лимфоидния ред претърпяват пролиферация и развитие в Тклетки и В-клетки.

Освен това между CFC-Mix-родителските клетки и миелоидните клетки лежи друга категория родителски клетки, които имат междинна обвързаност със своето потомство. Тези родословно-ограничени родителски клетки се класифицират на основата на потомството, което дават. Така известните междинни предшественици на миелоидните клетки са: единици, формиращи еритроидната колония (CFU-E) за еритроцити; клетки, формиращи колонията от гранулоцити и макрофаги (GM-CFC) за неутрофили и макрофаги; клетки, формиращи мегакариоцитната колония (Meg-CFC) за мегакариоцити; клетки, формиращи еозинофилната колония (Eos-CFC) за еозинофили и клетки, формиращи базаофилната колония (Bas-CFC) за мастни клетки. Известни са (виж по-долу) или по всяка вероятност ще бъдат открити и други междинни клеткипредшественици между плурипотентните стволови клетки и зрелите кръвни клетки, имащи различни степени на родословна ограниченост и на капацитет за самообновяване.

В основата на нормалната хематопоетична система изглежда лежи принципът на понижен капацитет за самообновяване, доколкото мултипотентността се загубва и се придобиват родословна ограниченост и зрялост. И така, от едната страна на хематопоетичния клетъчен спектър лежи плурипотентната стволова клетка, притежаваща капацитета за самообновяване и диференциация във всичките различни родителски клетки, обвързани с родословна специфичност. Този капацитет представлява основата на терапията чрез костномозъчна трансплантация, при която примитивните стволови клетки възстановяват цялата хематопоетична клетъчна система. От другата страна на спектъра лежат силно родословно-ограничените предшественици и тяхното потомство, които са загубили способността за самообновяване, но са придобили зряла функционална активност.

Пролиферацията и развитието на стволовите клетки и на родословноограничените родителски клетки се контролира прецизно от разнообразни хематопоетични растежни фактори или цитокини. Ролята на тези растежни фактори in vivo е сложна и ненапълно изяснена. Някои растежни фактори, такива като интерлевкин-3 (IL-З), са в състояние да стимулират както мултипотентните стволови клетки, така и родителски клетки, даващи началото на някои родословни линии, включващи например, мегакариоцитите. За други фактори, такива като фактора, стимулиращ колонията от гранулоцити/макрофаги (GMCSF) първоначално се смяташе, че действието им се ограничава само до GMCFC. По-късно обаче се откри, че GM-CSF влияе също и върху пролиферацията и развитието на мегакариоцитите. По този начин беше намерено, че IL-З и GM-CSF имат припокриващи се билолгични активности, макар и с различен потенциал. От по-скоро е известно, че интерлевкин-6 (IL-6) и интерлевкин-11 (IL-11), макар и поотделно да нямат видимо влияние върху формирането на meg-колонията, действуват синергично с IL-З и стимулират зреенето на мегакариоцитите (Yonemura etal., Exp. Hematol., 20:1011-1016(1992]).

И така, хематопоетичните растежни фактори могат да влияят върху растежа и диференцирането на една или повече родословни линии, могат частично да съвпадат в действието си върху единична родителска клетъчна линия или могат да действуват синергично с други фактори.

Изглежда също така, че хематопоетичните растяежни фактори могат да осъществят своя ефект на различни етапи от развитието на клетката - от тотипотентната стволова клетка през различно ангажираните родословноограничени предшественици до зрялата кръвна клетка. Например, изглеждаме еритропоетинът (еро) съдействува за пролиферацията само на зрелите еритроидни родителски клетки. IL-З изглежда, че осъществява своя ефект по$ рано, повлиявайки примитивните стволови клетки и междинните родословноограничени родителски клетки. Други растежни фактори, такива като стволовият клетъчен фактор (SCF), могат да въздействуват дори върху по-примитивното клетъчно развитие.

От гореизложеното може да се прецени, че специално за подпомагане възстановяването на отслабнала хематопоетична система в резултат на заболяване или след лъче- или химиотерапия от полза биха били полезни хематопоетични растежни фактори, които влияят върху преживяемостта, пролиферацията, диференциацията или зреенето на всяка от кръвните клетки или на техните предшественици.

II. Мегакариоцитопоеза * образуване на тромбоцити

Обзор върху регулацията на мегакариоцитопоезата и образуването на тромбоцитите е направен от: Mazur, Exp. Hematol., 15:248 [1987] и Hoffman, Blood, 74:1196-1212 [1989]. Накратко, плурипотентни стволови клетки на костния мозък се диференцират в мегакариоцитни, еритроцитни и миелоцитни клетъчни линии. Смята се, че между стволовите клетки и мегакариоцитите съществува йерархия от родословно ангажирани мегакариоцитни родителски клетки . Идентифицирани са били най-малко три класа мегакариоцитни родителски клетки, а именно: единица мегакариоцити (BFU-MK), формираща огнище, единица мегакариоцити, формираща колония (CFU-MK) и мегакариоцитни родителски клетки с ниска плътност (LD-CFU-MK). Самото зреене на мегакариоцитите представлява непрекъснато развитие, което е разделено на етапи, основаващи се на стандартни морфологични критерии. Най-рано разпознаващият се член на мегакариоцитната (МК или meg) фамилия са мегакариобластите. Тези клетки първоначално са с диаметър 20 до 30 мкм, имат базофилна цитоплазма и леко неправилно ядро с рехав, до известна степен мрежовиден хроматин и няколко ядърца. По-късно мегакариоцитите могат да съдържат до 32 ядра (полиплоид), но цитоплазмата остава неструктурирана и незряла. При протичане на зреенето ядрото става по-заоблено и пикнотично, цитоплазмата нараства по количество и става по-ацидофилна и грануларна. Най-зрелите клетки от това семейство могат да изглеждат като особождаващи тромбоцити по своята периферия. Нормално по-малко от 10% от мегакариоцитите са в бластен стадий и повече от 50% са зрели. Произволните морфологични класификации, които обикновено се прилагат за мегакариоцитната серия са: мегакариобласт за най-ранната форма; промегакариоцит или базофилен мегакариоцит за междинната форма; и зрял (ацидофилен, грануларен или тромбоцит-образуващ) мегакариоцит за найкъсните форми. Зрелят мегакриоцит излъчва филаменти (нишки) от цитотлазма в синусоидалните пространства, където те се отделят и фрагментират в индивидуални тромбоцити (Williams et al., Hematology, 1972).

Смята се, че мегакариоцитопоезата включва няколко регулаторни фактора (Williams et al., Br. J. Hamatol., 52:173 [1982] и Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101 [[1982]). Ранното ниво на мегакариоцитопоезата се определя като митотично, съпроводено с клетъчна пролиферация и колонийна инициация от CFU-MK, но което не се влияе от броя на тромбоцитите (Burstein et al., J. Cell Phusiol., 109:333 [1981] и Kimura et al., Exp. HematoL, 13:1048 [1985]). По-късният стадий на зреене е не-митотичен, започва с ядрена полиплоидизация и цитоплазмено зреене и вероятно се регулира по механизма на обратната връзка чрез периферния брой на тромбоцитите (Odell et al., Blood, 48:765 [1976] и Ebbe et al, Blood, 32:787[1968]).

Съществуването на различен и специфичен фактор за стимулиране на мегакариоцитната колония (MK-CSF) е бил диспутиран (Mazur, Exp. HematoL, 15:340-350(1987]). Повечето автори обаче смятат, че толкова витален процес на преживяемост, какъвто е образувнето на тромбоцитите, би трябвало да се регулира от цитокин(и), които са отговорни изключително за този процес. Хипотезата, че съществува(т) цитокин(и), специфични за мегакариоцитите/тромбоцитите, обезпечи базата за търсене в продължение на повече от 30 години, но досега подобен цитокин не беше пречистен, секвениран и доказан чрез тест като уникален MK-CSF (ТРО).

Въпреки съобщенията, че MK-CSF's са били частично пречистени от експериментално предизвикана тромбоцитопения (Hill et al., Exp. HematoL, 14:752 [1986], от културална среда на човешки ембрионален бъбрек [CM] (McDonald et al., J. Lab. din. Med., 85:59 [1975]), от човек c пластична анемия и от пурпурни уринарни екстракти в случаи на идиопатична тромбоцитопения (Kawakita et al., Blood, 6:556 [1983]) и от плазма (Hoffman et al., J. din. invest., 75:1174 [1985]), тяхната физиологична функция, както и досега в повечето случаи остава неизвестна.

Културалната среда от далачни клетки, активирани с митоген, изолиран от растението лаконос (PWM-SpCM) и мишата миеломоноцитна клетъчна линия WEHI-3 (WEHI-3CM) са били изпозувани като мегакариоцитни стимулатори. PWMSpCM съдържа фактори, усилващи растежа на CFU-MK (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood, 65:214 [1985]; и Iscove, N.N., in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Bilolgy, Vol. 10, Golde et al., eds. [New York, Academy Press] pp 37-52 [1987], един от които е интерлевкин-3 (IL-3) - фактор, стимулиращ колониите на много родсловни линии (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11:469 [1986]. Другите фактори в тази среда досега не са били идентифицирани и изолирани. WEHI-3 е миша миеломоноцитна клетъчна линия, която секретира относително големи клоичества IL-З и по-малки количества GM-CSF. За IL-З е намерено, че стимулира растежа на широк набор от хематопоетични клетки (Ihle et al., J. Immunol., 13:282(1983]). За IL-3 е намерено също, че взаимодействува с много от известните хематопоетични хормони или растежни фактори (Bartelmez et al., J. Cell Physiol., 122:362-369 [1985] и Warren et al., Cell, 46:667-674 [1988]), включващи еритропоетин (EPO) и интерлевкин-1 (IL-1), в индукцията на много ранните мултипотенциални предшественици и във формирането на много големи смесени хематопоетични колонии.

Други източници на мегакариоцитни стимулатори са намерени в културалната среда на миши бял дроб, кост, макрофагови клетъчни линии, перитонеално излъчени клетки и човешки ембрионални бъбречни клетки.

е

Независимо от някои противоречиви данни (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]), е налице известно доказателство (Geissler et al., Вг. J. Haematol., 60:233238 [1985]), че по-скоро активирани Т-лимфоцити, отколкото моноцити играят стимулираща роля в мегакариоцитопоезата. Тези открития навеждат на мисълта, че секрети на активираните Т-лимфоцити, такива като интерлевкините, могат да бъдат регулаторни фактори в развитието на МК (Geissler et al., Exp. Hematol., 15:845-853(1987]). Редица изследвания върху мегакариоцитопоезата с пречистен еритропоетин ЕРО (Vainchenker et al., Blood, 54:940(1979]; McLeod et a!., Nature, 261:492-4 [1976]; и Williams et at., Exp. Hematol., 12:734 [1984]) показват, че този хормон има усилващ ефект върху формирането на МК-колонията. Това е било също така демонстрирано и в двата случая на среди, несъдържащи и съдържащи серум в отсъствието на допълнителни клетки (Williams etal., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). За ЕРО беше постулирано, че участвува повече в аспектите на едно- и двуклетъчните стадии на мегакариоцитопоезата за разлика от ефекта на PWMSpCM, който беше включен в четириклетъчния стадий на мегакариоцитното развитие. Остава да се изясни взаимодействието на всички тези фактори и в ранните и в късните фази от развитието на мегакариоцитите.

Данните, получени от няколко лаборатории^ навеждат на мисълта, че единствените мултиродословни фактори, които индивидуално притежават активност, стимулираща МК-колонията, са GM-CSF и IL-3 и в по-малка степен факторът, стимулиращ В-клетките IL-6 (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9035 [1987]). Неотдавна някои автори съобщиха, че IL-11 и факторът, инхибиращ левкемията (LIF) действуват синергично с IL-3 за увеличаване на мегакариоцитната големина и плоидност (Yonemura et al., J. Cell. Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et al., Blood, 77:2150-2153[1991]; Bruno etal., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991]; и Yonemura etal., Exp. Hematol., 20:1011-1016(1992]).

Други документи, представляващи интересна: Eppstein etal., патент на САЩ No. 4 962 091; Chong, патент на САЩ No. 4 879 111; Fernandes et а!., патент на САЩ No. 4 604 377; Wissler etal., патент на САЩ No. 4 512 971; Gottlieb, патент на САЩ No. 4 468 379; Bennett et at., патент на САЩ No. 5 215 895; Kogan et al., патент на САЩ No. 5 250 732; Kimura etal., Eur. J. Immunol., 20(9):1927-1931 [ 1990]; Secor et al., J. of Immunol., 144(4):1484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Immunol., 140( 1):94-99[1988]; Warren etal., Exp. Hematol., 17(11);1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10):1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17(8):883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75(12):2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5):1545-1551 [1989]; Rennick etal., Blood, 73(7):1828-1835[1989]; и Clutterbuck etal., Bolld, 73(6):1504-1512[1989].

III. Тромбоцитопения

Тромбоцитите са критични елементи на кръвосъсирващия механизъм. Намаляването на циркулиращото ниво от тромбоцити, наречено тромбоцитопения, се появява при различни клинични условия и заболявания. Тромбоцитопенията обикновено се дефинира като брой на тромбоцитите под 150 X 10θ на лирър. Главните случаи на тромбоцитопения могат в най-широк план да се разделят на три категории на базата на времето на живот на тромбоцитите, а именно; (1) увредено образуване на тромбоцити от костния мозък, (2) секвестиране на тромбоцитите в далака (спленомегалия), или (3) засилено разграждане на тромбоцитите в периферната циркулация (напр., автоимунна тромбоцитопения или химио- и лъчетерапия). Освен това при пациенти, в които бързо се въвеждат големи обеми, бедни на тромбоцити кръвни продукти, тромбоцитопенията може да се развие вследствие на разреждането.

Клиничните изяви на кървене при тромбоцитопения зависят от тежестта на тромбоцитопенията, нейния причинител и възможни съпътсвуващи дефекти на коагулацията. Най-общо, пациенти с тромбоцитни числа между 20 и 100 X 10θ на литър са с риск от обилно посттравматично кървене, докато тези с тромбоцитни числа под 20 X 10θ на литър могат да кървят спонтанно. Тези последните пациенти са кандидати за тромбоцитна трансфузия със съпровождащ имунен и вирусен риск. За всяка дадена степен на тромбоцитопения кървенето показва тенденция към по-тежко, когато случаят е:

to по-скоро понижено образуване, отколкото засилено разграждане на тромбоцитие. В последната ситуация ускорената обмяна на тромбоцитите води до циркулацията на по-млади, по-големи и хемостатично по-ефективни тромбоцити. Тромбоцитопенията може да бъде резултат от различни заболявания, описани накратко по-долу. По-подробно описание може да бъде намерено в Schafner, A.I., Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function, Internal Medicine, 3rd Ed., John J. Hutton et a!., Eds., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London [ 1990].

(а) Тромбоцитопения вследствие на увредено образуване на тромбоцити

Случаите на конгенитална тромбоцитопения включват конституционална апластична анемия (синдром на фанкони) и конгенитална амегакариоцитна тромбоцитопения, които могат да бъдат съпроводени със скелетни малформации. Придобитите заболявания на образуването на тромбоцитите се причиняват или от хипоплазия на мегакариоцитите или от неефективна тромбопоеза. Мегакариоцитната хипоплазия може да бъде резултат от разнообразни условия, включващи мозъчна аплазия (включваща идиопатични форми или миелосупресия при химиотерапевтични агенти или лъчева терапия), миелофиброза, левкемия и инвазия на костния мозък от туморни метастази или грануломи. В някои ситуации токсини, инфекциозни агенти или медикаменти могат да интерферират с тромбопоезата относително селективно; примерите включват временни тромбоцитопении, причинени от алкохол или някои вирусни инфекции, както и лека форма на тромбоцитопения, свързана с приемането на тиазидни диуретици. И накрая, тромбоцитопения, обикновено със съпътствуваща анемия и левкопения, може да се причини също и от неефективна тромбопоеза, която се развива вторично след мегалобластни процеси (фолат- или В12недостатъчност).

Съвременното лечение на тромбоцитопениите, следствие от пониженото образуване на тромбоцити, зависи от идентификацията и обратимостта на лежащата в основата причина за костномозъчна и

недостатъчност. Тромбоцитните трансфузии обикновено са предназнчени за пациенти със сериозни усложнения на кървене или за покриване повреме на хирургични процедури, тъй като изоимунизацията може да доведе до устойчивост спрямо следващи тромбоцитни трансфузии. Мукозално кървене, резултат от тежка тромбоцитопения, може да се облекчи чрез орално или интравенозно въвеждане на антифибринолитичен агент. Могат обаче да се развият тромботични усложнения ако антифибринолитичният агент се използува при пациенти с дисеминирана интравазална коагулопатия (DIC).

(b) Тромбоцитопения вследствие на далачно секвестиране

Спленомегалия от всякакъв произход може да бъде съпроводена със слаба до умерена тромбоцитопения. Това е изключително пасивен процес (хиперспленизъм) на далачно секвестиране на тромбоцити за разлика от активното разграждане на тромбоцити в далака при случаите на имуноопосредствувана тромбоцитопения, която се дискутира по-долу. Въпреки че най-разпостраненият случай на хиперспленизъм е застойната спленомегалия от портална хипертония вследствие на алкохолна цироза, други форми на застойна, инфилтративна или лимфопролиферативна спленомегалия, също се съпровождат с тромбоцитопения. Като резултат от самия хиперсплениъзм тромбоцитното число обикновено не пада под 50 X 10θ за литър.

(c) Тромбоцитопения вследствие неимунно-опосредствувано разграждане на тромбоцитите

Тромбоцитопенията може да бъде резултат от ускорена деструкция на тромобоцитите при различни неимунологични процеси. Заболяванията от този тип включват дисеминирана интравазална коагулопатия, изкуствени интраваскуларни приспособления, екстракорпорална циркулация на кръвта и тромботични микроангиопатии, такива като тромботична тромбоцитоза пурпура. Във всички тези ситуации циркулиращите тромбоцити, които срещат изкуствени повърхности или абнормална васкуларна интима, или се унищожават на тези места или се увреждат и след това се отстраняват преждевременно от ретикулоендотелната система. Болестни състояния или заболявания, при които може да се развие дисеминирана интравазална коагулопатия (DIC) са поместени в по-големи детайли в Braunwald et al. (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 11th Ed., p.1478, McGraw Hill [1987]. Интраваскуларните изкуствени приспособления, включващи сърдечни клапи и интрааортни катетри, могат да причинят слаба до умерена деструктивна тромбоцитопения и временна тромбоцитопения в пациенти, претърпяли кардиопулмонарен байпас, а от от изчерпването и увреждането на тромбоцитите в екстракорпоралната циркулация може да се получи хемодиализа.

(d) Имунна тромбоцитопения, индуциране от медикаменти

Повече от 100 медикамента са включени в имунологичноопосредствуваната тромбоцитопения. Добре охарактеризирани са били обаче само хинидин, хинин, злато, сулфонамиди, цефалотин и хепарин. Индуцираната от медикаменти тромбоцитопения често е много тежка и обикновено възниква спорадично в дните, докато пациентите приемат сенсибилизиращото лекарство.

(e) Имунна (автоимунна) thrombocitopenic purpura (тромбоцитопения пурпура) (ITP)

ITP във възрастни представлява хронично заболяване, характеризиращо се с автоимунна тромбоцитна деструкция. Автоантитялото обикновено е IgG, въпреки че има съобщения също и за други имуноглобулини. Въпреки че за автоантитялото на ITP е било намерено, че е асоциирано с тромбоцитната мембрана ΘΡΙΙ^ΙΙΙθ, в повечето случаи специфичността на тромбоцитния антиген не е била идентифицирана. Екстраваскуларната деструкция на сензитирани тромбоцити става в ретикулоендотелната система на далака и черния дроб. Въпреки че над половината от всички случаи на ΙΤΡ са идиопатични, в основата им при много пациенти лежат ревматични или автоимунни заболявания (напр. системна вълчанка (lupus erithematosus)) или лимфопролиферативни заболявания (напр. хронична лимфоцитна левкемия).

(f) HIV-индуцирана ITP

ITP е все по-често срещано усложнение при инфекция с HIV (Morris et al., Ann. intern. Med., 96:714-717 [1982] и може да се появи на всеки етап от &

развитието на болестта при пациенти с диагноза Синдром на Придобита Имунна Недостатъчност (СПИН), при тези със СПИН-родствен комплекс и при тези с HIVинфекция, но без синдроми на СПИН. HIV-инфекцията е преносимо заболяване, което задължително се характеризира с изразена недостатъчност на клетъчна и иимунна функция, както и с появата на опортюнистична инафекция и малигненост. Първичната имунологична абнормалност, която произтича от инфекцията с HIV е прогресиращо изчерпване и функционално увреждане на Тлимфоцитите, експресиращи клетъчния повърхностен гликопротеин CD4 (Lane et al., Ann. Rev. Immuno!., 3ΆΤ7 [1985]). Загубата на CD4 помощна/индукторна Tклетъчна функция вероятно е в основата на изразените дефекти в клетъчния и хуморален имунитет, водещи до опортюнистични инфекции и малигнености, характерни за СПИН-а (Н. Lane, по-горе).

Въпреки че механизмът на асоциираната с HIV ITP е неизвестен, смята се, че той е различен от механизма на ITP, неасоциирана с HIV-инфекция. (Walash et al., N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984]; and Ratner, Am. J. Med., 86:194-198 [1989]).

IV. Съвременна терапия на тромбоцитопенията

Терапевтичният подход за лечението на пациенти с тромбоцитопения се определя от тежестта и неотложността (спешността) на клиничната ситуация. Лечението е сходно за HIV-асоциираната и неродствената с HIV тромбоцитопения и въпреки че са били използувани различни терапевтични подходи, терапията си остава спорна.

Броят на тромбоцитите при пациенти с поставена диагноза тромбоцитопения е бил успешно увеличен чрез глюкокортикоидна (напр. с предисолон) терапия, но в повечето пациенти отговорът е нейвлен или заболяването рецидивира, когато глюкокортикоидната доза се редуцира или се прекъсне нейното приложение. Като се основават на изследвания с пациенти, имащи HIV-асоциирана ITP, някои изследователи са предположили, че глюкокортикоидната терапия може да доведе до предразположеност към СПИН.

Глюкокортикостероидите обикновено се прилагат^ ако тромбоцитното число падне под 20 X ΙΟθ/литър или когато се появи спонтанно кървене.

При пациенти, невъзприемчиви за глюкокортикостероиди, успешно е било използувано съединението:

4-(2-хлорфенил)-9-метил-2-[3-(4-морфолинил)-3-пропанон-1-ил]6НτπβΗθ[3,2,ί][ 1,2,4]триазоло[4,3,а,][ 1,4]диазепин (WEB 2086) за лечение на тежък случай на неасоциирана с HIV ITP. Пациент с тромбоцитно число 37 000 - 58 000/мкл е лекуван с WEB 2086 и след 1-2 седмици лечение тромбоцитното число се увеличило до 140 000 -190 000/мкл. (ЕР 361 077 и Lohman et al., Lancet, 1147[1988]).

Макар че оптималното лечение на придобита амегакариоцитна тромбоцитопения пурпура (ААТР) е неопределено, беше показано, че антитимуцитният глобулин (ATG), конски антисерум срещу човешка тимусна тъкън, предизвиква продължителна пълна ремисия (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37:126-127 [1991]). Неотдавнашно съобщение обаче посочва, че хематопоетичният ефект на ATG се дължи на тимерозала, при което по всяка вероятност белтъкът действува като живачен преносител (Panella et al., Cancer Research, 50:4429-4435 [ 1990]).

Бяха съобщени добри резултати за спеленектомия. Спленектомията отстранява главните места на тромбоцитна деструкция и главния източник на образуването на автоантитела в много пациенти. Тази процедура води до продължителни ремисии без медикаментозно лечение при голям брой пациенти. Тъй като обаче хирургичните процедури като цяло трябва да се избягват при имунопроблемни пациенти, спленектомията се препоръчва само при тежки случаи на тромбоцитопения (напр. тежка HIV-асоциирана ITP), при пациенти, които до 2-3 седмици не реагират на глюкокортикоидно лечение или при които не се постига поддържащ отговор след прекъсване на глюкокортикоидната интервенция. На основата на съвременното научно познание не е ясно, дали спленектомията предразполага пациентите към СПИН.

• iF

Като допълнение към лечението с преднисолон и спленектомия, определени цитотоксични средства^апр. винк( Кристин и азидотимидин (AZT, зидовудин) също са обещаващи за лечението на HIV-индуцирана ITP; резултатите обаче са предварителни.

От гореизложеното може да се направи извода, че един от пътищата за лечение на тромбоцитопения би бил получаването на средство, способно да ’ г ~ ускорява диференциацията и зреенето на мегакариоцитите или на техните предшественици в тромбоцит-образуващи форми.. Бяха положени значителни усилия за идентифицирането на подобен средстворзначаван обикновено като тромбопоетин (ТРО). Други имена за ТРО, често срещани в литературата, включват: фактор, стимулиращ тромбоцитопоезата (TSF), фактор, стимулиращ мегакариоцитната колония (MK-CSF), мегакариоцит-стимулиращ фактор и мегакариоцитен стимулатор. ТРО-активност е била наблюдавана още през 1959 (Rak etal, Med. Exp., 1:125), а опитите за характеризиране и пречистване на този агент продължават до наши дни. Макар че съществуват съобщения за частичното пречистване на ТРО-активни полипептиди (виж например, Tayrien et al., J. Bio. Chem., 262:3262 [1987] и Hoffman et al., J. Clin. Invest. 75:1174 [1985]), други постулираха, че по своята същност ТРО не е дискретна единица, а по-скоро представлява просто полифункционално изявяване на известен хормон (IL-3, Sparrow et al., Prog. Clin. Biol. Res., 215:123 [1986]). Молекула, притежаваща тромбопоетична активност, независимо от своята форма или произход, би имала значителна терапевтична стойност. Макар че белтък не е бил идентифициран еднозначно като ТРО, съществува значичелен интерес около откритието, че mpl, предполагаем цитокинов рецептр, може да предава тромбопоетичен сигнал.

V. Mpl е мегакариоцитопоетичен цитокинов рецептор

Смята се, че пролиферацията и зреенето на хематопоетичните клетки се регулират тясно от фактори, които моделират положително или отрицателно пролиферацията и мултиродословната диференциация на плурипотентанта стволова клетка. Тези ефекти се осъществяват чрез високоафинитетното ία свързване на извънклетъчни белтъчни фактори със специфични клетъчни повърхностни рецептори. Тези клетъчни повърхностни рецептори имат занчителна хомология и се класифицират главно като членове на цитокиновата рецепторна суперфамилия. Членовете на суперфамилията включват рецептори за: IL-2 (бета и гама вериги) (Hatakeyama et al., Science, 244:551-556 [1989]; Takeshita etal., Science, 257:379382(1991], IL-3 (Itoh etal., Science, 247:324-328 [1990]; Gorman eta!., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 87:5459-5463 [1990]; Kitamura eta!., Cell, 66:1165-1174 [1991a]; Kitamura etal., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 88:5082-50-86 [1991b], IL-4 (Mosley et al., Cell, 59:335-348 [1989]), IL-5 (Takaki et a!., EMBO J., 9:4367-4374 [1990]; Tavernier et a!., Cell, 66:1175-1184 [1991], IL-6 (Yamasaki et a!., Science, 241:825-828(1988]; Hibi eta!., Cell, 63:1149-1157(1990]), IL-7 (Goodwin et a!., Cell, 60:941-951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:56905694 [1992]), фактор, стимулиращ колонията от гранулоцити-макрофаги (GMCSF)(Gearing etal., EMBO J., 8:3667-3676(1991]; Hayashida eta!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244:9655-9659(1990]), фактор, стимулиращ гранулоцитната колония (GCSF) (Fukunaga eta!., Cell, 61:341-350[1990a]; Fukunaga etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8702-8706 [1990b); Larsen eta!., J. Exp. Med., 172:1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea etal., Cell, 57:277-285[1989]; Jones etal., Blood, 76:31-35(1990]), фактор, инхибиращ левкемия (LIF) (Gearing et a!., EMBO J., 10:2839-2848 [1991]), онкостатин M (OSM) (Rose eta!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8641-8645(1991]), a също и рецептори за пролактин (Boutin et a!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:77447748(1988]; Edery etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-2116[1989]), растежен хормон (GH) (Leung et a!., Nature, 330:537-543 [1987]) и цилиарен невротропичен фактор (CNTF) (Davis eta!., Science, 253:59-63[1991]).

Членовете на цитокиновата рецепторна суперфамилия могат да се групират в три функционални категории (виж обзора на Nicola et al., Cell, 67:1-4 [1981]). Първият клас обхваща едноверижни рецептори, такива като еритропоетиновия рецептор (EPO-R) или рецептора на фактора, стимулиращ гранулоцитната колония (G-CSF-R), който свързва лиганда с висок афинитет посредством извънклетъчен домен и освен това генерира вътреклетъчен сигнал.

Вторият клас рецептори, така наречените α-субединици, включва рецептора за интерлевкин-6, рецептора за фактора, стимулиращ колонията гранулоцитимакрофаги (GM-CSF-R), рецептора за интерлевкин-3 (IL3-Ra) и други членове на цитокиновата рецепторна суперфамилия. Високоафинитетен рецептор, способен да предава сигнал, се получава от хетеродимер между a-субединица и член на трети клас цитокинови рецептори, наречени β-субединици, напр. βθ - общата субединица за трите α-субединици IL3-Ra и GM-CSF-R.

Доказателството, че тр! е член на цитокинвата рецепторна срперфамилия, произтича от хомология в последователностите (Gearing, ЕМВО J., 8:3667-3676(1988); Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6834-6938(1990); Davis et al., Science, 253:59-63(1991] и Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:56405644 [1992]) и от неговата способност да предава пролиферативни сигнали.

Белтъчната последователност, изведена от молекулното клониране на миши с-тр/, показва че този белтък е хомоложен на други цитокинови рецептори. Екстрацелуларният домен съдържа 465 аминокиселинни остатъци и е съставен от два субдомена, всеки с четири висококонсервативни цистеини и определен мотив в N-крайния субдомен и в С-крайния субдомен. Предполага се, че лигандсвързващите екстрацелуларни домени имат сходни структурни геометрии, нагънати под формата на двойни β-барели. Този дуплициран екстрацелуларен домен е високохомоложен на веригата, предаваща сигнал и обща за рецепторите IL-3, IL-5 и GM-CSF, както и на нискоафинитетния свързващ домен на LIF (Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 (1993]). Ето защо mpl вероятно принадлежи към нискоафинитетния лиганд-свързващ клас на цитоциновите рдцептори.

Сравняването на мишия тр! и на зрелия човешки mpl Р показва, че тези два белтъка имат 81% идентичност в последователностите. По-конкретно, Nкрайният и С-крайният екстрацелуларни домени са съответно със 75% и 80% идентичност в последователностите. Най-консервативната /прЛобласт е цитоплазменият домен, който показва 91% аминокиселинна идентичност, като последователността от 37 остатъци близо до трансмембранния домен е идентична в двата вида. В съгласие с това за mpl се съобщава като за един от

-18 най-консервативните членове на цитокинвата рецепторна суперфамилия (Vigon, по-горе).

Доказателството, че тр! е функционален рецептор, който може да пренася пролиферативен сигнал, произтича от конструирането на химерни рецептори, съдържащи екстрацелуларен домен от цитокинов рецептор с висок афинитет към известен цитокин, и /прАцитоплазмения домен. Тъй като е липсвало съобщение за известен лиганд на тр!, е било необходимо химерният високоафинитетен лиганд-свързващ екстрацелуларен домен да се конструира от клас едно цитокинови рецептори, такива като IL-4R или G-CSFR. Vigon et al., погоре сливат екстрацелуларния домен на G-CSFR с трансмембранния и цитоплазмения домен на c-mpl. IL-3-зависимата клетъчна линия, BAF/BO3 (Ba/F3), е била трансфектирана с химерата G-CSFR/щр/ усопредно с пълноразмерна GCSFR-контрола. Клетки, трансфектирани с химерата, растяли еднакво добре в присъствието на цитокин IL-3 или G-CSF. По подобен начин клетки, трансфектирани с G-CSFR, също растяли добре в IL-3 или G-CSF. Всички клетки умирали в отсъствието на растежни фактори. Подобен експеримент е бил проведен от Skoda et al., EMBO J., 12(7):2645-2653 [1993], в който и екстрацелуларният и трансмембранният домен на човешкия рецептор IL-4 (hlL-4R) са били сляти с цитоплозмения домен на мишия mpl и трансфектирани в мишата IL-3-зависима Ва/РЗ-клетъчна линия. Ва/РЗ-клетки, трансфектирани с дивия тип hlL-4-R, пролиферирали нормално в присъствието на всеки от видово специфичните IL-4 или IL-3. Ва/РЗ-клетки, трансфектирани с HIL-4R//np/ пролиферирали нормално в присъствието на hlL-4 (в присъствието или в отсъствието на IL-3), което показва, че в Ва/РЗ-клетки /прАцитоплзменият домен съдържа всичките елементи, необходими за предаване на пролиферативен сигнал.

Тези експерименти с химери демонстрират способността за пролиферативна сигнализация на /прАцитоплазмения домен, но не дават отговор на въпроса дали екстрацелуларният домен на тр! може да свързва лиганд. Тези резултати се съгласуват с най-малко две възможности, а именно, тр! е t9 едноверижен (клас едно) рецептор подобно EPO-R или G-CSFR или той е ^г оСсубединица (клас три), предаваща сигнал и изискваща α-субединица подобно IL-3 (Skoda eta/., по-горе).

VI. Лигандът на тр!е тромбопоетин (ТРО)

Както е описано по-горе, допуснато беше, че серумът съдържа уникален фактор, понякога означаван като тромбопоетин (ТРО), който действува синергично с различни други цитокини и отключва растежа и зреенето на мегакариоцитите. Въпреки значителните усилия, положени от редица групи, такъв природен фактор никога не е бил изолиран от серума или от някакъв друг източник. Макар че не се знае, дали тр! може да свързва директно мегакариоцитен стимулиращ фактор, съвременните изследвания показват, че mpl участвува в предаването на пролиферативен сигнал от фактор или фактори, намерени в серума на пациенти с апластичен костен мозък (Methia et al., Blood, 82(5):1395-1401 [1993]).

Доказателството за предаване на пролиферативен сигнал посредством mplox уникален серумен колония-стимулиращ фактор, различен от IL-1a, IL-3, IL4, IL-6, IL-11, SCF, ЕРО, G-CSF и GM-CSF, идва от изследване разпределението на с-трАекспресията в примитивни и ангажирани хематопоетични клетъчни линии и от /прАантисенс изследвания с една от тези клетъчни линии.

Като провеждат полимеразна верижна реакция с обратна транскриптаза (RT-PCR) в имунопречистени човешки хематопоетични клетки, Methia et al., по-горе, показват_?че силни сигнали от мРНК на щр/се откриват само в CD34+ пречистени клетки, мегакариоцити и тромбоцити. CD34+ клетки, пречистени от костен мозък (ВМ), представляват около 1% от всички ВМ-клетки и са набогатени в примитивните и ангажирани предшественици на всички родословни редове (напр. еритроиден, грануломакрофагов и мегакариоцитен).

Показано беше, че /прАантисенс олигодезоксинуклеотиди потискат формирането на мегакариоцитна колония от плурипотентните CD35+ клетки, култивирани в серум от пациенти с апластичен мозък (богат източник на активност, стимулираща мегакариоцитната колония [MK-CSA]). Същите антисенс олигодезоксинуклеотиди нямат ефект върху формирането на еритроидната или грануломакрофаговата колонии.

Дали mpl директно свързва лиганд и дали серумният фактор, за който беше показано, че причинява мегакариоцитопоеза, действува посредством mpl, беше все още неизвестно. Беше предположено обаче, че ако mpl директно свързва лиганд, то неговата аминокиселинна последователност вероятно е силно консервативна и има видова крос-реактивност, която се дължи на значителната идентичност в последователностите на екстрацелуларните домени на човешки и миши mpl(Vigon et al., по-горе [ 1993]).

VII. Цели

Като се има предвид гореказаното, става ясно, че е налице неотложна и постоянна необходимост от изолирането и идентифицирането на молекули, способни да стимулират пролиферацията, диференциаицята и зреенето на хематопоетичните клетки и по-специално на мегакариоцитите или на техните предшественици с цел използуване в терапията за лечението на тромбоцитопения. Смята се, че такава молекула представлява лиганд за mpl. Поради това съществува допълнителна необходимост от изолирането на такъв лиганд(и) за изясняване на неговата роля(и) в клетъчния растеж и диференциация.

В съответствие с това изобретението има за цел получаването на фармацевтично чиста молекула, способна да стимулира пролиферацията, диференциацията и/или зреенето на мегакариоцитите в зрели тромбоцитобразуващи форми.

Друга цел представлява обезпечаването на молекулата в терапевтично приложима форма за лечение на хематопоетични заоблявания и по-специално на тромбоцитопения.

По-нататъшна цел на настоящото изобретение представлява изолирането, пречистването и специфичното определяне на белтъчни лиганди,

2± способни да свързват in vivo рецептор от цитокиновата суперфамилия, известен като тр/у да предават пролиферативен сигнал.

Още една цел представлява обезпечаването на молекули нуклеинови киселини, кодиращи такива белтъчни лиганди с цел използуването на тези молекули нуклеинови киселини за получаване на /прАсвързваици лиганди с диагностично и терапевтично приложение в рекомбинантна клетъчна култура.

Друга една цел представлява обезпечаването на производни и модифицирани форми на белтъчните лиганиди, включващи варианти в аминокиселинната последователност, различни форми гликопротеини и техни ковалентни производни.

Допълнителна цел представлява обезпечаването на слети полипептидни форми, които комбинират трАлиганд с хетероложен белтък, както и на техните ковалентни производни.

Още една допълнителна цел представлява обезпечаването на разнообразни полипептидни форми.като се комбинират трАлиганд с ЕРОпоследователност, в която са добавени или заместени аминокиселини, за да се получи белтък, способен да регулира пролиферацията и растежа както на тромбоцитите, така и на родоначалниците на червените кръвни клетки.

Още една допълнителна цел представлява получаването на имуногени с цел образуването на антитела срещу трАлигандите и техните сл^ти форми, както и получаването на антитела, способни да свързват такива лиганди.

Тези и други цели ще станат очевидни за професионалиста след разглеждане на спецификацията като цяло.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Целите на изобретението се постигат чрез обезпечаване на белтък от бозайници, който отключва мегакариоцитопоетичната пролиферация и зреене, означаван трАлиганд (ML) или “тромбопоетин (ТРО), способен да стимулира пролиферацията, зреенето и/или диференциацията на мегакариоцитите в зрели тромбоцит-образуващи форми.

22.

Този значително хомогенен белтък може да се пречисти от природен източник чрез метод, включващ; (1) създаване на контакт между източника на плазма, който съдържа /прАл ига идните молекули, които трябва да се пречистят, с имобилизиран полипептиден рецептор, по-конкретно mpl или трАслят полипептид, имобилизиран върху подложка при условия, при които mpl· лигандните молекули, които трябва да се пречистят, се имобилизират селективно върху имобилизирания рецепторен полипептид, (2) промиване на имобилизирания рецепторен полипептид и на неговата подложка за отстраняване на неадсорбирания материал, и (3) елуиране с елуиращ брфер на трАлигандните молекули от имобилизирания рецепторен полипептид, към който те са адсорбирани. Предпочита се природният източник да бъде плазма на бозайник или урина, съдържаща трАлиганда. Бозайникът може да бъде с аплазия, а имобилизираниият рецептор - слят mpAIgG.

Предпочитаният белтък, който инициира мигакариоцитопоетичната пролиферация и зреене?може да представлява значително хомогенен mpl· лиганден полипептид, получен чрез синтетични или рекомбинантни способи.

Предпочита се трАлигандният полипептид или ТРО да има най-малко 70% пълна идентичност в последователността с аминокиселинната последователност на високопречистения и значително хомогенен свински mpl· лиганден полипептид и най-малко 80% идентичност в последователността с ΈΡΟдомена на свинския /прАлиганден полипептид. /ИрАлигандът на това изобретение може да бъде зрял човешки трАлиганд, имащ зрялата аминокиселинна последователност, дадена във фиг. 1 (SEQ ID NO: 1), негов вариант, негова посттранслационно модифицирана форма или белтък, който има около 80% идентичност в последователността със зрелия човешки трАлиганд. Възможно е вариантът на трАлиганда да бъде фрагмент и по-специално аминотерминален фрагмент или фрагмент от ΈΡΟ-домена на човешкия трАлиганд (hML). Предпочита се аминотерминалният фрагмент да запази почти цялата последователност на човешкия ML между първия и четвъртия цистеинов остатък, като може да съдържа значителни инсерции, делеции или субституции извън тази област. Съгласно това приложение полипептидният фрагмент може да бъде представен чрез формулата:

X-hML(7-151)-Y

Където hML(7-151) представлява последователността на човешкия ТРО (hML) от Cys? до Cys 151 включително; X представлява аминогрупата на Cys?, един или повече от аминокиселинните остатъци на зрелия hML, негови аминокиселинни удължения, такива като Met, Tyr или лидерни последователности, съдържащи например места за протеолитично скъсване (напр. фактор Ха или тромбин); и Y представлява крайната карбоксилна група на Cys^l, един или повече карбокситерминални аминокиселинни остатъка(ци) на зрелия hML или негови удължения.

възможно е трАлигандният полипептид или негов фрагмент да се слеят с хетероложен полипептид (химера). Предпочитан хетероложен полипептид е цитокин, колония-стимулиращ фактор, интерлевкин или негов фрагмент и поспециално търговски лиганд (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, ЕРО, GM-CSF или LIF. Условно предпочитан хетероложен полипептид е имуноглобулинова верига, поконкретно човешки lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 , IgA, IgE, IgD, IgM или техни фрагменти, които по-специално включват константния домен на IgG-тежка верига.

Друг аспект на това изобретение обезпечава препарат, включващ mpl· антагонист, който е билолгично активен и за който се предпочита да е в състояние да стимулира включването на белязани нуклеотиди (напр., Зн-тимидин) в ДНК на IL-З зависими Ва/РЗ-клетки, трансфектирани с човешки mpl. Възможно е /прАантагонистът да бъде биологично активен /лрАлиганд^като се предпочита той да може да стимулира включването на в циркулиращи тромбоцити в теста по рикошет на миши тромбоцити. Подходящите щрАантагонисти включват hML153, hML(R153A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML и pML2 или техни фрагменти. ί

Друг вариант за изпълнение на изобретението се отнася до изолирано антитяло, способно да свързва трАлиганда. Изолираното антитяло, способно да се свързва с /лрАлиганда, условно може да се слее с втори полипептид, като антитялото или неговата слята форма могат да се използуват за изолиране и пречистване на mpl· лиганд от източник, както е описано по-горе за имобилизиран тр! В следващ аспект на това приложение изобретението обезпечава метод за детектиране на /прАлиганда in vitro или in vivo, включващ контакт между антитялото и проба, поконкретно серумна проба, за която се предполага ₇ че съдържа лиганда и установяване дали свъозването е поотекло.

В други варианти на изпълнение изобретението се отнася до изолирана молекула на нуклеинова киселина, кодираща /прАлиганда или негови фрагменти, която молекула нуклеинова киселина е възможно да бъде белязана с детектируема съставка; и молекула на нуклеинова киселина, имаща последователност, която е комплементарна на (или хибридизира при умерени или много строги условия с) молекула нуклеинова киселина, която има последователност, кодираща /прАлиганд. Предпочитани молекули нуклеинови киселини са тези, кодиращи човешки, свински и миши /прАлиганд и включват РНК и ДНК - както геномна, така и кДНК. В следващ аспект на това приложение молекулата нуклеинова киселина е ДНК, кодираща /прАлиганда, която включва още вектор, който може да се реплицира и в който ДНК е оперативно свързана с контролни последователности, които се разпознават от гостоприемник, трансфектиран с вектора. ДНК е възможно да бъде кДНК, която има последователността, дадена на Фиг. 1 5'-3' (SEQ ID N0:2), 3'-5‘ или техни фрагменти. Този аспект включва още клетки-гостоприемници, за предпочитане СНО-клетки, трансформирани с вектора, както и метод за използуване на ДНК за реализиране продукцията на /прАлиганд. Предпочита се методът да включва експресия на кДНК, кодираща /прАлиганда, в култура от трансформираните гостоприемни клетки и изолиране на /прАлиганда от гостоприемните клетки или от културалната среда на гостоприемните клетки. Предпочитаният /прАлиганд, получен по този начин, е човешки /прАлиганд.

По-нататък изобретението включва метод за лечение на бозайник с хематопоетично заболяване и по-специално с тромбоцитопения, който метод включва въвеждане на терапевтично ефективно количество от /прАлиганда в бозайника. Възможно е трАлигандът да се прилага в комбинация с цитокин, поконкретно колония-стимулиращ фактор или интерлевкин. Предпочитаните колония-стимулиращи фактори или интерлевкини включват: търговски лиганд (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, М-CSF, ЕРО, IL-1, IL-3, IL-6 и IL-11.

Изобретението включва още метод за изолиране и пречистване на ТРО (ML) от ТРО-продуциращ микроорганизъм, включващ:

(1) разрушаване или лизиране на клетките, съдържащи ТРО, (2) незадължително отделяне на разтворимия материал от неразтворимия материал, съдържащ ТРО, (3) разтваряне на ТРО от неразтворимия материал с разтварящ брфер, (4) отделяне на разтворения ТРО от останалия разтворим и неразтворим материал, (5) пренагъване на ТРО в редокс-буфер, и (6) разделяне на правилно нагънатия ТРО от неправилно нагънатия ТРО.

За разтваряне на неразтворимия материал, съдържащ ТРО, методът предлага хаотропно средство,където хаотропното средство се избира от: сол на гуанидина, натриев тиоцианат или урея. По-нататък методът предлага разтвореният ТРО да се отдели от останалия разтворим и неразтворим материал чрез един или повече етапи!, като се избира между центрофугиране, гелфилтрация и обратнофазова хроматография. За етапа на пренагъване в метода се предлага редокс-буфер, съдържащ както окисляващ така и | редуциращо, средство. Окисляващото средство е главно кислород или съединение, съдържащо наймалко една дисулфидна връзка, «редуциращото средство е съединение, съдържащо най-малко един сулфхидрил. Предпочита се окисляващото средство да се избере от окислен rAyTaTHOH(GSSG) и цистин, а редуциращото средство да се избере от редуциран глутатион(63Н) или цистеин. Най-предпочитаният окисляващ агент е окислен rAyTaTHOH(GSSG), а най-предпочитаният редуциращ агент е редуциран глутатион(08Н). Предпочита се също моларното отношение на окисляващото средство Да бъде равно или по-голямо, отколкото това на редуциращото средство

2ί.

Редокс-буферът съдържа допълнително детергент, избран с предпочитание измежду CHAPS и CHAPSO, присъствуващи в концентрация най-малко 1%. Редокс-буферът съдържа още NaCI, като се предпочита концентрация в границите на около 0,1-0,5М, и глицерол с предпочитана концентрация_;по-голяма от 15%. Предпочита се pH на редокс-буфера да бъде приблизително в границите от pH 7,5 до pH 9,0, като стъпката на пренагъване се извършва на 4 градуса в продъжение на 12-48 часа. Стъпката на пренагъване продуцира биологично активен тромбопоетин, в който се образува дисулфидна връзка между найблизкия до аминокрая на ЕРО-домена цистеинов остатък (Cys) и най-близкия до неговия карбоксилен край цистеинов остатък (Cys).

Изобретението включва още метод за пречистване на билолгично активен ТРО от микроорганизъм, включващ:

(1) лизиране поне на извънклечъчната мембрана на микроорганизма, (2) третиране нализата, съдържащ ТРО, с хаотропно средство (3) пренагъване на ТРО, и (4) отделяне на онечистванията и на неправилно нагънатия ТРО от правилно нагънатия ТРО.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фиг. 1 показва изведената от кДНК аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:1) на човешкия трАлиганд (hML) и кодиращата нуклеотидна последователност (SEQ ID N0:2). Нуклеотидите са номерирани при започването на всеки ред. 5'- и 3'-нетранслиращите се области са означени с по-малки букви. Аминокиселинните остатъци са номерирани над последователността, като се започва при Ser 1 от белтъчната последователност на зрелия трАлиганд (ML). Границите на предполагаемия екзон 3 са означени със стрелки, а потенциалните места за N-гликозилиране са заградени. Цистеиновите остатъци са означени с точка над последователността. Подчертаната последователност съответствува на N-крайната последователност, определена на базата на /прАлиганд, пречистен от свинска плазма.

фиг. 2 показва процедурата, използувана в теста по включване на Зн-тимидин, опосредствувано от трАлиганда. За определяне наличието на шрАлиганд от различни източници, mpl Р Ва/РЗ-клетките се подлагат на гладуване за IL-3 в продължение на 24 часа в инкубатор с поддържана влага на 37°С в 5% СО2 и въздух. След гладуването за IL-3 клетките се посяват в 96-ямкови културални платета като разредени или неразредени проби и се култивират 24 часа в инкубатор за клетъчни култури. Във всяка ямка за последните 6-8 часа се прибавят 20 мкл RPMI-среда без серум, съдържаща 1 мкКи Зн-тимидин. След това клетките се събират върху 96-ямкови филтърни платета и се промиват с вода. След това филтрите се броят.

фиг. 3 показва ефекта на проназа. DTT и нагряване върху способността на АРР да стимулира Ва/РЗ-тр1 клетъчната пролиферация. За смилането на АРР с проназа, проназа (Boehringer Mannheim) или говежди серумен албумин се свързват с Affi-gel10 (Biorad) и се инкубират индивидуално с АРР за 18 часа на 37°С. Впоследствие смолите се отстраняват чрез центрофугиране и надстоящите течности се тестират. АРР също така се нагрява до 80°С за 4 мин или се довежда до 100 мкМ DTT, след което се извършва диализа срещу PBS.

фиг. 4 показва елуирането на трАлигандна активност от колони PhenylToyopearl, Blue-Sepharose и Ultralink-mp/. фракции 4-8 от трАафинитетната колона са фракциите с най-висока активност, елуирани от колоната.

Фиг. 5 показва SDS-PAGE (натриевододецилсулфатна полиакриламидна гелелектрофореза) на фракциите, елуирани от Ultralink-mp/. Към 200 мкл от всяка фракция 2-8 се прибавя 1 мл ацетон, съдържащ 1 мМ HCI при -20°С. След 3 часа на -20°С пробите се центрофугират и получените утайки се промиват 2Х с ацетон на -20°С. Ацетоновите утайки последователно се разтварят в 30 мкл SDSразтварящ буфер, довеждат се до 100 мкМ DTT и се нагряват на 90°С за 5 мин.

След това пробите се разделят на 4-20% SDS-полилакриламиден гел и белтъците се визуализират чрез сребърно оцветяване.

фиг. 6 показва елуирането на /прАлигандна активност от SDS-PAGE. Фракция 6 от трАафинитетната колона се разделя на 4-20% SDS-полиакриламиден гел при нередуциращи условия. След електрофорезата гелът се нарязва на 12 еднакви области и се електроелуира, както е описано в примерите. Електроелуираните проби се диализират в PBS и се тестират при разреждане 1/20. Стандартите за молекулна маса (Мг), използувани за калибриране на гела, са Novex Mark 12стандарти.

фиг. 7 показва ефекта на АРР, изчерпана за гпрАлиганд, върху мегакариоцитопоезата. Изчерпаната за трАлиганд АРР се получава като 1 мл се пропуска през 1 мл /лрАафинитетна колона (700 мкг /npAlgG/мл NHS-superose, Pharmacia). Култури от човешки периферни стволови клетки се довеждат до 10% АРР или до 10% изчерпана за /прАлиганд АРР и се култивират за 12 дни. Мегакариоцитопоезата се измерва, както е описано в примерите.

Фиг. 8 показва ефекта на /77pAlgG върху стимулирането на човешката мегакариоцитопоеза чрез АРР. Култури от човешки периферни стволови клетки се довеждат до 10% с АРР и се култивират 12 дни. В дни 0, 2 и 4 се прибавят mpl· IgG (0,5 мкг) или ANP-R-IgG (0,5 мкг). След 12 дни мигакариоцитопоезата се околичествява, както е описано в примерите. На графиката са представени средните стойности от две повторения на пробите, като действителните данни за всяко от повторенията са в скоби.

фиг. 9 показва двете вериги на фрагмент от 390 нд от човешка геномна ДНК, кодираща /прАлиганда. Показани са изведената аминокиселинна последователност на екзон 3” (SEQ ID N0:3), кодиращата последователност (SEQ ID N0:4) и нейната комплементарна (SEQ ID N0:5).

Фиг. 10 показва изведената аминокиселинна последователност на зрелия човешки /прАлиганд (hML) (SEQ ID N0:6) и на зрелия човешки еритропоетин (hEPO) (SEQ ID NO: 7). Предсказаната аминокиселинна последователност за човешкия /прАлиганд е сравнена с последователността на човешкия еритропоетин. Идентичните аминокиселини са заградени, а с тирета са означени празнините, въведени за оптимално налагане на последователностите. Потенциалните места за N-гликозилиране са подчертани с плавна линия за hML и с прекъсната линия за hEPO. Двата цистеина, важни за еритропоетиновата активност, са означени с голяма точка.

Фиг. 11 показва изведената аминокиселинна последователност на изоформи на зрелия човешки трАлиганд: hML (SEQ ID N0:6), hML2 (SEQ ID N0:8), hML3 (SEQ ID N0:9) и hML4 (SEQ ID NO: 10). Идентичните аминокиселини са заградени, a празнините, въведени за оптимално налагане, са означени с тирета.

Фиг. 12 показва ефекта на човешки /прАлиганд върху Ва/ЕЗ-тр/ клетъчната пролиферация (A), in vitro човешка мегакариоцитопоеза, околичествена чрез използуване на радиоактивно белязано мише IgG-моноклонално антитяло, специфично за мегакариоцитния гликопротеин GPIIbllla (В) и миша тромбоцитопоеза, измерена в теста по рикошет на тромбоцитите (С).

Клетки двеста деветдесет и три (293-клетки) се трансфектират чрез СаРОд-метода (Gorman, С. в DNA Cloning: А Л/еиМррлоас/? 2:143-190 [1985]) само с вектора pRK5, с pRK5-hML или с PRK5-ML153 през нощта (pRK5-ML-|53 е получен чрез въвеждане на стоп-кодон след остатъка 153 на hML чрез ПВР). След това средата се култивира 36 часа и се тестира за стимулация на клетъчната пролиферация на Ba/F3-znp/, както е описано в Пример 1 (А) или за in vitro човешка мегакариоцитопоеза (В). Мегакариоцитопоезата се околичествява^като се използува ¹25| радиоактивно белязано мише IgG-моноклонално антитяло (НР11D) срещу специфичния за мегакариоцитите гликопротеин GPIIbllla- както е описано (Grant et at., Bolld 69:1334-1339 [1987]). Ефектът на частично пречистен рекомбинантен ML (rML) върху образуването на тромбоцити in vivo (С) се определя чрез използуване на теста по експериментално предизвикана (рикошираща) тромбоцитоза, описан от McDonald, Т.Р. Proc Soc. Exp. Biol. Med. 144:1006-10012 (1973). Частично пречистен rML се получава от 200 мл културална среда, съдържаща рекомбинантния ML. Средата се пропуска през 2 мл-колона с Blue-Sepharose, уравновесена с PBS, колоната се промива с PBS и се елуира с PBS, съдържащ 2М урея и 2М NaCl. Активната фракция се диализира в PBS и се довежда до 1 мг/мл с BSA, несъдържащ ендотоксин. Пробата съдържа по-малко от една единица ендотоксин/мл. Мишки се инжектират с 64 000, 32 0900, или 16 000 единици rML или само с пълнежа. Всяка група се състои от шест мишки. Показани са средните стойности и стандартното отклонение за всяка група. Рстойностите се определят чрез двустранен Т-тесфкато се сравняват медианите.

Фиг. 13 сравнява ефекта на изоформите и вариантите на човешки /прАлиганд в теста по Ba/F3-mp/ клетъчна пролиферация. hML, контрола, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) и hMb|53 се определят при различни разреждания, както е описано в Пример 1.

Фигури 14А, 14В и 14С показват изведената аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:1) на човешкия /прАлиганд (hML) или човешкия ТРО (hTPO) и човешката геномна ДНК-кодираща последователност (SEQ ID NO: 11). Нуклеотидите и аминокиселинните остатъци са номерирани в началото на всеки ред.

фиг. 15 показва SDS-PAGE на пречистен 293-rhML332 и на пречистен 293rhML-|53.

Фиг. 16 показва нуклеотидната последователност: кДНК кодиращата (SEQ ID N0:12) и изведената от нея аминокиселинна последователност (SEQ ID NO: 13) на

ЗА отворената рамка за четене на миша ML-изоформа. Тази изоформа на зрял миши трАлиганд съдържа 331 аминокиселинни остатъци, с четири по-малко от предполагаемия пълноразмерен mML и поради това се означава mML2. Нуклеотидите са номерирани в началото на всеки ред. Аминокиселинните остатъци са номерирани над последователността, като започват със Ser 1. Потенциалните места за N-гликозилиране са подчертани. Цистеиновите остатъци са означени с точка над последователността.

Фиг. 17 показва последователността на кДНК (SEQ ID N0:14) и предсказаната белтъчна последователност (SEQ ID N0: 15) на тази миша ML-изоформа (mML). Нуклеотидите са номерирани в началото на всеки ред. Аминокиселинните остатъци са номерирани над последователността и започват със Ser 1. Тази изоформа на зрелия миши /прАлиганд се състои от 335 аминокиселинни остатъци и се смята, че е пълноразмерният трАлиганд, означен mML. Сигналната последователност е показана чрез подчертаване с прекъсната линия, а вероятното място на срязване е отбелязано със стрелка. 5'- и 3'нетранслиращите се области са посочени с малки букви. Двете делеции, намерени като резултат от алтернативен сплайсинг (mML2 и mML3), са подчертани. Четирите цистеинови остатъци са отбелязани с точка. Седемте потенциални места за N-гликозилиране са заградени.

Фиг. 18 сравнява изведената от кДНК аминокиселинна последователност на човешката ML-изоформа hML3 (SEQ ID NO: 9) и мишата ML-изоформа, означена mML3 (SEQ ID NO: 16). Предсказаната аминокиселинна поседователност за човешкия трАлиганд е наложена успоредно с мишата /прАлигандна последователност. Идентичните аминокиселини са заградени като за оптимално налагане са въведени празнини, отбелязани с тирета. Аминокиселините са номерирани в началото на всеки ред.

Фиг. 19 сравнява предсказаните аминокиселинни последователности на зрелите ML-изоформи от миши-ML (SEQ ID N0:17), свински-ML (SEQ ID NO: 18) и човешки

32.“

ML (SEQ ID NO: 6). Аминокиселинните последователности са наложени успоредно с празнини, означени с тирета, въведени за оптимално сравняване. Аминокиселините са номерирани в началото на всеки ред като идентичните остатъци са заградени. Потенциалните места за N-гликозилиране са означени чрез защриховани правоъгълници, а цистеиновите остатъци са означени с точка. Консервативният дибазичен аминокиселинен мотив, който предствлява потенциално място за протеазно скъсване, е подчертан. Делецията от четири аминокиселини, открита и в трите вида (ML2) е заградена с удебелена линия.

фиг. 20 показва последователността на кДНК (SEQ ID NO: 19) и предсказаната последователност на зрелия белтък (SEQ ID NO: 18) на свинска ML-изоформа (pML). Тази изоформа на свинския трАлиганд съдържа 332 аминокиселинни остатъци и се смята, че е пълноразмерният свински трАлиганд, означен pML. Нуклеотидите са номерирани в началото на всеки ред. Аминокиселинните остатъци са номерирани над последователността и започват със Ser 1.

фиг. 21 показва последователността на кДНК (SEQ ID NO: 20) и предсказаната последователност за зрелия белтък (SEQ ID NO: 21) на свинска ML-изоформа (pML2). Тази изоформа на свинския трАлиганд съдържа 328 аминокиселинни остатъци и представлява форма на пълноразмерния свински трАлиганд с делеция на четири остатъци, означена pML2. Нуклеотидите са номерирани в началото на всеки ред. Аминокиселинните остатъци са номерирани над последователността и започват със Ser 1.

Фиг. 22 сравнява изведената аминокиселинна последователност на пълноразмерната свинска ML-изоформа pML (SEQ ID NO: 18) и свинската MLизоформа, означена pML2 (SEQ ID N0:21). Предсказаната аминокиселинна последователност за pML е наложена успоредно с рМ1_2-последователността. Идентичните аминокиселини са заградени и са въведени празнини за оптимално ·

сравнение, означени с тирета. Аминокиселините са номерирани в началото на всеки ред.

фиг. 23 показва съществените особености на плазмида pSV15.ID.LL.MLORF (пълноразмерен или ТРО332, използуван за трансфекция на клеткигостоприемници CHO-DP12 с цел получаване на СНО-гЬТРОзз2·

Фиг. 24 показва съществените особености на плазмида pSV15.ID.LLML.ORF□(скъсен или ТРО153, използуван за трансфекция на клетки-гостоприемници CH0-DP12 с цел получаване на CHO-rhTPOi53Фигури 25А, 25В и 25С показват ефекта на Е co/ArhTPO(M_et-1, 153) върху тромбоцити (А), червени кръвни клетки (В) и (С) бели кръвни клетки в нормални мишки. Две групи от по 6 женски С57 Вб-мишки се инжектират ежедневно с PBSбуфер или с 0,3 мкг Е co/ArhTPO(|\/|et-1, 153)(100 мкл подкожно). В нулевия ден и в дните 3-7 от орбиталния синус се вземат 40 мкл кръв. Тази кръв веднага се разрежда в 10 мл търговски разредител и пълните кръвни числа се получават чрез анализатор Serrono Baker Hematology 9018. Данните се представят като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност.

Фигури 26А, 26В и 26С показват ефекта на Е co/ArhTPO(|y|_et-1, 153) върху тромбоцити (А), червени кръвни клетки (В) и (С) бели кръвни клетки в сублетално облъчени мишки. Две групи от по 10 женски С57 Вб-мишки се облъчват сублетално със 750 сГи гама лъчение от източник на 137q_{s и се} инжектират ежедневно с PBS-буфер или с 0,3 мкг Е co/ArhTPO(Mef1 > 153)(100 мкл подкожно). В нулевия ден и на последователни междинни интервали от време от орбиталния синус се вземат 40 мкл кръв. Тази кръв веднага се разрежда в 10 мл търговски разредител и пълните кръвни числа се получават чрез анализатор Serrono Baker Hematology 9018. Данните се представят като средни стойности □ стандартна грешка на средната стойност.

Фигури 27А, 27В и 27С показват ефекта на CHO-rhTPO^g върху (А) кръвни плочици (тромбоцити), (В) червени кръвни клетки (еритроцити) и (С) бели кръвни клетки (левкоцити) в нормални мишки. Две групи от по 6 женски С57 Вб-мишки се инжектират ежедневно с PBS-буфер или с 0,3 мкг СНО-гЬТРОзз2(ЮО мкл подкожно). В нулевия ден и в дните 3-7 от орбиталния синус се вземат 40 мкл кръв. Тази кръв веднага се разрежда в 10 мл търговски разредител и пълните кръвни числа се получават чрез анализатор Serrono Baker Hematology 9018. Данните се представят като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност.

фиг. 28 показва кривите доза/отговор за различни форми на rhTPO, получени от различни клетъчни линии. Кривите доза/отговор се построяват за rhTPO от следните клетъчни линии: ΙΊΤΡΟ332 от СНО (пълноразмерен, от яйчни клетки на Китайски хамстер); hTPO^efl 153 (получена в Е. coli скъсена форма с N-краен метионин); ΙΊΤΡΟ332 (пълноразмерен ТРО от човешки 293-клетки); несъдържащ метионин 155 Е-Coli (скъсената форма на [rhTPO] 55] без крайния метионин от Е. coll). Групи от 6 женски С57В6-мишки се инжектират ежедневно в продължение на 7 дни с rhTPO в зависимост от групата. Всеки ден от орбиралния синус се вземат 40 мкл кръв за пълни кръвни числа. Данните представени отгоре представляват максималните ефекти, наблюдавани при различните третирания и с изключение на (met 153 E-Coll) това става на седмия ден на третиране. В по-горе споменатата met 153 Е-Со//'-група максималният ефект се наблюдава на петия ден. Данните са представени като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност.

фиг. 29 представя кривите доза/отговор, които сравняват активността на пълноразмерните и кратките форми на rhTPO, получени в СНО-клетки със скъсената форма от Е. coli. Групи от 6 женски С57В6-мишки се инжектират дневно с 0,3 мкг различни типове rhTPO. В дни 2-7 от орбиталния синус се вземат

3S мкл кръв за пълни кръвни числа. Групите на третиране са: ТРО153 - скъсената форма на ТРО от Е. coli; ТРО332 (смесена фракция) - Пълноразмерен ТРО, съдържащ приблизително 80-90% пълноразмерни и 10-20% къси форми; ТРО332(30К-фракция)-пречистена фракция на късите форми от изходния смесен-препарат; ТРО332(70К фракция)-пречистена пълноразмерна фракция от изходния смесен-препарат. Данните са представени като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност.

фиг. 30 представлява схема, показваща KIRA ELISA-теста за измерване на ТРО. Фигурата показва химерата MPL/Rse.gD и съответните части от родителските рецептори, както и крайната конструкция (дясната част от фигурата) и разгъната диаграма (лявата част на фигурата), показваща съответните стъпки в теста.

фиг. 31 представлява разгъната диаграма на KIRA ELISA-теста, показваща всяка стъпка в процедурата.

Фигури 32A-32L представят нуклеотидната последователност (SEQ ID N0:22) на експресионния вектор pSVI17.ID.LL, използуван за експресия на Rse.gD в Пример 17.

Фиг. 33 представя схематично получаването на плазмид рМР1.

фиг. 34 представя схематично получаването на плазмид рМР21.

Фиг. 35 представя схематично получаването на плазмид рМР151.

Фиг. 36 представя схематично получаването на плазмид рМР202.

Фиг. 37 представя схематично получаването на плазмид рМР172.

-½ фиг. 38 представя схематично получаването на плазмид рМР210.

Фиг. 39 представлява таблица на петте клона от рМР210-плазмидната банка, които най-добре експресират ТРО.

Фиг. 40 представя схематично получаването на плазмид рМР41.

фиг. 41 представя схематично получаването на плазмид рМР57.

фиг. 42 представя схематично получаването на плазмид рМР251

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

I. Дефиниции

Следните думи и фрази имат предимно посочената дефиниция, когато се използуват в описанието, примерите и претенциите.

Хаотропен агент се отнася за съединение, което във воден разтвор и при подходящи концентрации може да причини изменение в пространствената конфигурация или конформация на белтък чрез най-мако частично разкъсване на силите, отговорни за запазване на нормалната вторична и третична структура на белтъка. Такива съединения включват например, урея гуанидин-HCI и натриев тиоцианат. Като правило, за да осъществи конформационният ефект върху белтъците, от тези съединения се изискват високи концентрации, обикновено 4-9 М.

Цитокин е родов термин за белтъци, които се освобождават от една клетъчна популация и действуват върху друга клетка като вътреклетъчни медиатори. Примери за такива цитокини са лимфокините, монокините и традиционните полипептидни хормони. В цитокините се включват растежния фактор, инсулиноподобни растежни фактори, човешкия растежен хормон, Nметионил човешкия растежен хормон, говежди растежен хормон, паратироиден хормон, тироксин, инсулин, проинсулин, релаксин, прорелаксин, гликопротеинови хормони, такива като фоликул-стимулиращия хормон (FSH), тироидстимулиращия хормон (TSH) и лутеинизиращия хормон (Ш), хематопоетичния растежен фактор, чернодробния растежен фактор, фибробластния растежен фактор, пролактин, плацентарен лактоген, тумор некрозис фактор-а (TNF-α и TNF-β), субстанция ихибираща гломерулите, миши гонадотропин-асоцииран пептид, инхибин, активин, васкуларно ендотелен растежен фактор, интегрин, нервни растежни фактори, такива като NGF-β, тромбоцитен растежен фактор, трансформиращи растежни фактори (TGFs), такива като TGF-a и TGF-β, инсулиноподобен расрежен фактор-1 и -II, еритропоетин (ЕРО), остеоиндуктовни фактори, интерферони, такива като интерферон-a, -β и -гама, колониястимулиращи фактори (CSFs), такива като макрофагов CSF (М-CSF), гранулоцитмакрофагов CSF (GM-CSF) и гранулоцитен CSF (G-CSF), интерлевкини (IL's), такива като IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 и други полипептидни фактори, включващи LIF, SCF и търговски лиганди. Така, както са използувани тук горните термини са предназначени да включват белтъци от природни източници или от рекомбинантна клетъчна култура. По подобен начин се цели термините да включват и биологично акивни еквиваленти; напр. различващи се в аминокиселинната последователност по една или повече аминокиселини или по типа и степента на гликозилиране.

Л/рАлиганд, трАлиганден полипептид, ML, тромбопоетин или ТРО тук се използуват взаимозаменяемо и включват всеки полипептид, който притежава свойството да се свързва с mpl - член на цитокиновата рецепторна суперфамилия, и който има биологично свойство на ML, както е дефинирано подолу. Примерно биологично свойство е способността за стимулиране включването на белязани нуклеотиди (напр., θΗ-тимидин) в ДНК на IL-3-зависими Ва/ЕЗ-клетки, трансфектирани с човешки mpl Р. Друго примерно биологично свойство е способността за стимулиране включването на 35g в циркулиращи тромбоцити в теста по рикошет на миши тромбоцити. Тази дефиниция обхваща полипептидът, изолиран от /прАлиганден източник, такъв като апластична свинска плазма, описана тук, или от друг източник, такъв като друг животински вид, включително хора, или получен чрез рекомбинантни или синтетични методи. Полипептидът включва различни форми като функционални производни, фрагменти, алели, изоформи и техни аналози.

Л/рАлиганден фрагмент'¹ или ТРО-фрагмент представлява част от природно срещащ се зрял пълноразмерен /прАлиганд или ТРО-последователност с делеция на една или повече единици от аминокиселинни остатъци или въглехидрати. Делеция на аминокиселинен остатък(ци) може да стане на всяко място в пептида, което включва на N-терминалния или на С-терминалния край или вътрешно, фрагментът ще носи най-малко едно общо биологично свойство с /прА лиганда. МрАлигандните фрагменти обикновено имат непрекъсната последователност от най-малко 10,15,20,25,30 или 40 аминокиселинни остатъци, които са идентични с последователностите на /прАлиганда, изолиран от бозайник, включващ лиганда, изолиран от апластична свинска плазма, човешки или миши лиганд и по-специално техния ЕРО-домен. Представителни примери за Nтерминални фрагменти са hML-|53 или ТРО(м_е{-1-153).

/ИрАлигандни варианти или варианти на /прАлигандната последователност така, както са дефинирани тук, означават биологично активен /прАлиганд, който както е дефинирано по-долу, има по-малко от 100% идентичност в последователността с /прАлиганда, изолиран от рекомбинантна клетъчна култура или от апластична свинска плазма, или с човешкия лиганд, имащ изведената (от кДНК) последователност, описана във Fig.1 (SEQ ID NO: 1). Обикновено Биологично активният вариант на /прАлиганда обикновено е с аминокиселинна последователност, имаща най-малко около 70% идентичност в аминокиселинната последователност с /прАлиганда, изолиран от апластична свинска плазма или със зрелия миши или човешки лиганд или с техни фрагменти (виж Фиг. 1 [SEQ ID N0:1]), като се предпочитат най-малко около 75%, повече се предпочитат най-малко около 80%, още повече се предпочитат най-малко около 85% и по-предпочитани от тях са най-малко около 90%, като най-предпочитани са най-малко около 95%.

за

Химерен трАлиганд е полипептид, включващ пълноразмерен mpl· лиганд или един или повече негови фрагменти, сляти или свързани с втори хетероложен полипептид или с един или повече негови фрагменти. Химерата разделя поне едно общо биологично свойство с трАлиганда. Вторият полипептид обикновено е цитокин, имуноглобулин или фрагменти от тях.

Изолиран трАлиганд, високо пречистен трАлиганд и значително хомогенен трАлиганд се използуват взаимозаменяемо и означават трАлиганд, който е бил пречистен от трАлиганден източник или е бил получен чрез рекомбинантни или синтетични методи. Той не съдържа други пептиди или белтъци, което е достатъчно (1), за да се секвенират най-малко 15 и с предпочитание 20 аминокиселинни остатъци от N-терминалната или от вътрешна аминокиселинна последователност като се използува секвенатор (spinning cup) или най-добрият на пазара търговски достъпен аминокиселинен секвенатор или като се модифицират методи, пчбликувани до дтата на подаване на тази заявка, или (2) за хомогенност, оценена чрез SDS-PAGE при нередуциращи или редуциращи условия, използувайки оцветяване с Coomassie blue или попредпочитаното оцветяване със сребро. Хомогенност тук означава по-малко от около 5% замърсяване с белтъци от друг произход.

Терминът биологично свойство, когато се използува във връзка с mpl· лиганд или изолиран трАлиганд, означава притежаването на тромбопоетична активност, на ефекторна или антигенна функция in vivo или на активност, която пряко или непряко се причинява или осъществява от трАлиганд (в неговата нативна или денатурирана конформация) или от негов фрагмент. Ефекторните функции включват свързване с mpl и всяка активност за свързване с носител, агонизъм или антагонизъм на mpl, по-специално предаване на пролиферативен сигнал, което включва репликация, ДНК-регулаторни функции, модулиране биологичната активност на други цитокини, рецепторно (по-специално цитокиново) активиране, инактивиране, иницииране и потискане, клетъчен растеж или диференциация и подобни на тях. Антигенна функция означава притежаването на епитоп или антигенно място, което е в състояние да реагира кръстосано с антитела, получени срещу нативния шрАлиганд. Принципната антигенна функция на трАлигандния полипептид е в това, че той свързва с афинитет най-малко около 10θ l/мол антитела, получени срещу трАлиганда, изолиран от апластична свинска плазма. Обикновено полипептидът се свързва с афинитет най-малко около 10? l/мол. Най-много се предпочита антигенно активния трАлиганден полипептид да бъде полипептид, който се свързва с антитяло, получено срещу трАлиганд, имащ една от по-горе описаните ефекторни функции. Антителата, използувани за определяне на биологична активност, са заешки поликлонални антитела, получени чрез приготвяне на препарат от щрАлиганда, изолиран от рекомбинантна клетъчна култура или от апластична свинска плазма, в пълен адювант на фройнд, подкожно инжектиране на препарата и усилване на имунния отговор чрез интраперитонеално инжектиране на препарата докато титърът на антитялото срещу /прАлиганда достигне плато.

Терминът биологично активен, когато се използува във връзка с mpl· лиганд или изолиран /прАлиганд, означава трАлиганд или полипептид, който показва тромбопоетична активност или носи ефекторната функция на mpl· лиганда, изолиран от апластична свинска плазма или експресиран в рекомбинантна клетъчна култура, описана тук. Известната по принцип ефекторна функция на /прАлиганда или полипептида е свързването с mpl и стимулиране включването на белязани нукеотиди (^Н-тимидин) в ДНК на IL-З зависими Ba/F3клетки, трансфектирани с човешки mpl Р. Друга известна ефекторна функция на трАлиганда или полипептида е способността за стимулиране включването на в циркулиращи тромбоцити в теста по рикошет на миши тромбоцити. Още една друга известна функция на трАлиганда е способността да стимулира човешка мегакариоцитопоеза in vitro, която може да се околичестви чрез използуване на радиоактовно белязано моноклонално антитяло, специфично за мегакариоцитния гликопротеин GPIIbllla·

Процент идентичност в аминокиселинната последователност по отношение на /прАлигандната последователност се дефинира тук като процент от аминокиселините остатъци в последователността-кандидат, които са идентични с остатъците в последователността на /прАлиганда, изолиран от апластична свинска плазма, или с тези в миши или човешки лиганд, имащ изведената (от кДНК) аминокиселинна последователност, описана във Фиг. 1 (SEQ ID NO: 1). Сравняването се извършва след успоредно налагане на последователността и въвеждане на празнини, ако е необходимо, за постигане на максимален процент секвенционна идентичност, при което нито една от консервативните субституции не се разглежда като част от секвенционната идентичност. Като засягащи секвенционната идентичност или хомология не се тълкуват нито N-крайните, Скрайните или вътрешни удължения, нито делециите или инсерциите в /прА лигандната последователност. Така примерните биологично активни трАлигандни полипептиди, за който се смята че имат идентични последователности, включват: препро-трАлиганд, про-трАлиганд и зрял /прАлиганд.

Микросеквениране на /прАлиганд може да се извърши чрез всяка подходяща стандартна процедура при условие, че процедурата е достатъчно чувствителна. В един такъв метод високо пречистен полипептид, получен от SDSгелове или от последна HPLC-стъпка, се секвенира директно чрез автоматизирано Едманово (фенилизотиоцианатно) разграждане, като се използува газ-фазов секвенатор, модел 470А Applied Biosystems, екипиран с фенилхидантионов (РТН) аминокиселинен анализатор 120А. Освен това по подобен начин могат да бъдат секвенирани /прАлигандни фрагменти, получени чрез химично (напр., CNBr, хидроксиламин, 2-нитро-5-тиоцианобензоат) или ензимно (напр. трипсин, клострипен, стафилококова протеаза) смилане, последвано от пречистване на фрагмента (напр., HPLCh РТН-аминокиселините се анализират като се използува системата данни ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, СА). Интерпретацията на резултатите се извършва компютърно с VAX 11/785 Digital Equipment Co., както е описано от Henzel et al., J. Chromatography, 404:41-52 [1987]. Възможно е също аликвоти от HPLC-фракциите да се разделят чрез електрофореза на 5-20% SDS-PAGE, да се пренесат чрез електроблотинг на PVDF-мембрана (ProBlott, ABI, Foster City, СА) и да се оцветят с Coomassie Brilliant

Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987]. Специфичният белтък, идентифициран при оцветяването, се изрязва от блота и се извършва N-крайно секвениране с газ-фазовия секвенатор, описан по-горе. За вътрешни белтъчни последователности HPLC-фракциите се изсушават под вакуум (SpeedVac), ресуспендират се в съответни буфери и се разграждат се с бромциан, с Lysспецифичния ензим Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA), или c Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). След разграждането получените пептиди се секвенират като смес или след HPLC-разделяне на С4-колона, елуирана преди газ-фазовото секвениране чрез разгръщане на пропанолов градиент в 0,1% TFA.

'Тромбоцитопенията се определя като тромбоцитно число под 150 X 10θ на литър кръв.

Тромбопоетичната активност се определя като биологична активност, която се изразява в усилване на пролиферацията, диференциацията и/или зреенето на мегакариоцитите или на мегакариоцитните предшественици в тромбоцит-образуващите форми на тези клетки. Тази активност може да бъде измерена в различни тестове, включващи in vivo тест по рикошираща тромбоцитна синтеза, тест за индукция на тромбоцитен клетъчно-повърхностен антиген, както това е намереноизмерено за човешка левкемична мегакариобластна клетъчна линия (СМК) чрез антитромбоцитен имунотест (антиGPIIbllla), и индукция на полиплоидизация в мегакариобластна клетъчна линия (DAMI).

Тромбопоетинът (ТРО) се определя като съединение, имащо тромбопоетична активност или способно да повишава броя на тромбоцитите в серума на бозайник. Предпочита се ТРО да може да покачва ендогенния брой на тромбоцитите с най-малко 10%, повече се предпчита с 50% и най-много се птедпочита ТРО да е в състояние да повиши броя на тромбоцитите в човек до повече от 150Χ10θ за литър кръв.

Изолирана /лрАлигандна нуклеинова киселина е РНК или ДНК, съдържаща повече от 16, за предпочитане 20 или повече последователни нуклеотидни бази, които кодират биологично активен /прАлиганд или негов фрагмент, комплементарни са на РНК или ДНК, или хибризизират с РНК или ДНК и остават здраво свързани при умерени до строги условия. Тази РНК или ДНК не съдържа най-малко една нуклеинова киселина от друг произход, с която тя нормално е асоциирана в природния източник, като се предпочита тя да е значително свободна от всякаква друга бозайнишка РНК или ДНК. Фразата несъдържаща най-малко една нуклеинова киселина от друг произход, с която тя нормално е асоциирана включва случая, при който нуклеиновата киселина присъствува в източника или природната клетка, но има различна хромозомна локализация или е фланкирана с други нуклеотидни поседователности, които нормално не се срещат в изходната клетка. Пример за изолирана /прАлигандна нуклеинова киселина е РНК или ДНК, която кодира биологично активен mpl· лиганд, който има най-малко 75% идентичност в последователността, попредпочитани са най-малко 80%, още по-предпочитани са най-малко 85% и попредпочитани от тях са 90%, като най-много се предпочитат 95% идентичност в последователността с човешкия, мишия или свинския /прАлиганд.

Терминът контролни последователности, когато се отнася до експресията, означава ДНК-последователности, необходими за експресията на оперативно свързана кодираща последователност в определен организъмгостоприемник. Контролните последователности, които са подходящи за прокариоти, например, включват промотор, незадължително операторна последователност, място за свързване с рибозомите, а възможно е и други, слабо изучени досега последователности. За еукариотните клетки се знае, че използуват промотори, сигнали за полиаденилиране и инхансъри.

Терминът оперативно свързан, когато се отнася за нуклеинови киселини, означава че нуклеиновите киселини се намират във функционална връзка с друга последователност от нуклеинова киселина. Например, ДНК за препоследователност или за секреторен лидер е оперативно свързана с ДНК за полипептид, в случай че той се експресира като пребелтък, който участвува в секрецията на полипептида; промоторът или инхансърът са оперативно свързани с кодиращата последователност, ако те влияят върху трансприпцията на последователността; или мястото за свързване с рибозомите се свързва оперативно с кодиращата поседователност, ако то е така разположено, че улеснява транслацията. Оперативно свързан означава преди всичко, че ДНКпоследователността, която е свързана, е непрекъсната, а в случай на секреторен лидер, непрекъсната и в рамка за четене. Инхансърите обаче не е необходимо да бъдат непрекъснати. Свързването се осъществява чрез лигиране в удобни рестриктазни места. Ако такива не съществуват се използуват синтетични олигонуклеотидни адаптори или линкери съгласно традиционната практика.

Терминът екзогенен, когато се отнася за елемент, означава последователност от нуклеинова киселина, която е чужда за клетката или е хомоложна за клетката, но е разположена в нуклеиновата киселина на клеткатагостоприемник на място, в което елементът обикновено не се открива.

Термините клетка, клетъчна линия и клетъчна култура тук се използуват взаимозаменяемо и тези означения включват цялото потомство на дадена клетка или клетъчна линия. Така например термини, подобни на трансформанти или трансформирани клетки включват първичната трансформирана клетка и културите, получени от нея, без отношение към броя на преносите. Знае се също така, че цялото потомство вследствие на целенасочени и случайни мутации не може да бъде идентично до прецизност по отношение съдържанието на ДНК. Термините включват и мутантното потомство, което има същата функция и биологична активност, както скринираните в първоначално трансформираната клетка. Ако се имат предвид други значения, това ще стане ясно от контекста.

Плазмидите са автономно реплициращи се кръгови ДНК-молекули, които притежават независими начала на репликация и тук са означени с малка буква р, която се предшествува или следва от главни букви и/или числа. Изходните плазмиди тук са или търговски достъпни, общодостъпни без ограничения или могат да се конструират от такива плазмиди, които са на разположение, в съгласие с публикувани процедури. Освен това в тази област са известни и други еквивалентни плазмиди, което е очевидно за обикновения специалист.

Смилане с рестрикционни ензими^ когато се отнася за ДНК^означава каталитично разкъсване на вътрешните фосфодиестерни връзки в ДНК с ензим, който действува само в определени локализации или места на ДНКпоследователностга. Такива ензими се наричат рестрикционни ендонуклеази (рестриктази). Всяка рестрикционна ендонуклеаза разпознава специфична ДНКпоследователност, наречена рестрикционно (рестриктазно) място, имащо двулъчева симетрия. Различните рестрикционни ензими, използувани тук, са търговски достъпни, като се използуват техните реакционни условия, кофактори и други изисквнаия, съгласно препоръките на ензимните производители. Рестрикционните ензими е прието да се означават чрез съкращения, съставени от главна буква, следвана от други букви, които представят микроорганизма, от който първоначално е бил получен всеки ензим и след това число, обозначаващо конкретния ензим. Използуват се предимно около 1 мкг плазмид или ДНКфрагмент с около 1-2 единици ензим в около 20 мкл буферен разтвор. Обикновено се провежда инкубация около 1 час на 37°С, но тя може да варира в съгласие с инструкциите на производителя. След инкубацията белтъкът или полипептидът се отстраняват чрез екстракция с фенол и хлороформ, а разградената нуклеинова киселина се отделя от водната фракция чрез утаяване с етанол. Смилането с рестрикционен ензим може да бъде последвато от хидролиза с бактериална алкална фосфатаза на 5'-крайните фосфати, за да се попречи на двата отрязани с рестриктаза краища на ДНК-фрагмента да циркуларизират'1 или да формират затворени бримки, което би възпрепятствувало инсерцията на друг ДНК-фрагмент в рестрикционното място. Ако специално не е отбелязано, смилането на плазмидите не се следва от S'крайно дефосфорилиране. Процедурите и реагентите за дефосфрилиране са конвенционални, както е описано в Раздели 1.56-1.61 на Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laaboratorry Press, 1989].

Термините получаване или изолиране на даден ДНК-фрагмент от реакционната смес след рестриктазното смилане означава разделяне на реакционната смес на полиакриламиден или агарозен гел чрез електрофореза, идентифициране на въпросния фрагмент чрез сравняване на неговата подвижност с тази на маркерни ДНК-фрагменти с известно молекулно тегло, отстраняване на отрязъка от гела, съдържащ желания фрагмент и отеделяне на гела от ДНК. Тази процедура е широко известна. Виж например Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114 [1981] и Goeddel et al., Nucleic Abids Res., 8:4057 [1980].

Southern-анализ или Sothern-блотинг (пренос) е метод, при който присъствието на ДНК-последователности в рестриктазната реакционна смес, в която ДНК или ДНК-съдържащ препарат е смлян с рестрикционна ендонуклеаза, се потвърждава чрез хибридизация с известен, белязан олигонуклеотид или ДНКфрагмент. Southern-анализа обикновено включва електрофоретично разделяне на ДНК-рестриктазната реакционна смес на агарозен гел, денатуриране на ДНК след електрофоретичното разделяне и пренос на ДНК върху нитоцелулозна, найлонова или друга подходяща мембранна подложка за анализ с радиоактивно белязана, биотинилирана или ензимно белязана сонда, както е описано в Раздели

9.37-9.52 на Sambrook etal., по-горе.

Northern-анализ или Northern блотинг (пренос) е метод, който се използува за идентифициране на РНК-последователности, които хибридизират са известна сонда, такава като олигонуклеотид, ДНК-фрагмент, кДНК или фрагмент от нея или РНК-фрагмент. Сондата се бележи с радиоактивен изотоп, такъв като θ2ρ, чрез биотинилиране или с ензим. РНК, която трябва да се анализира, обикновено се разделя електрофоретично на агарозен или полиакриламиден гел, пренася се върху нитроцелулозна, найлонова или друга подходяща мембрана и се хибридизира със сондата като се използуват стандартни техники, добре известни в специалността, такива като тези, описани в Раздели 7.39-7.52 на Sambrook etal., по-горе.

Лигиране е процес на формиране на фосфодиестерни връзки между два нуклеотидни фрагмента. За лигиране на двата фрагмента краищата на фрагментите трябва да бъдат съвместими едни с друг. В някои случаи краищата са директно съвнестими след ендонуклеазното смилане. Може, обаче, да се окаже необходимо най-напред стърчащите крайща, които обикновено се образуват след ендонуклеазно смилане, да се превърнат в подравнени, за да станат съвместими за лигиране. За подравняване на краищата ДНК се третира в подходящ буфер най-малко 15 минути на 15°С с около 10 единици Klenowфрагмент на ДНК-полимераза I или с Т4 ДНК-полимераза в присъствието на четирите дезоксирибонуклеотидтрифосфати. След това ДНК се пречиства чрез фенол-хлороформена екстракция и утаяване с етанол. ДНК-фрагментите, които ще се лигират заедно, се поставят в разтвор в приблизително еквимоларни количества. Разтворът трябва да съдържа още АТР, лигазен буфер и лигаза, такава като Т4 ДНК-лигазата - около 10 единици на 0,5 мкг ДНК. Ако ДНК ще се лигира във вектор, векторът най-напред се линеаризира чрез смилане със съответна рестрикционна ендонуклеаза(и). Линеаризираният фрагмент след това се обработва с бактериална алкална фосфатаза или телешка чревна фосфатаза за предотвратяване на самолигирането повреме на стъпката на лигиране.

Получаване на ДНК от клетки означава изолиране на плазмидна ДНК от култура на клетки-гостоприемници. Широко използувани методи за получаване на ДНК са методите за изолиране на големи и малки количества плазмид, описани в Раздели 1.25-1.33 на Sambrook et а!., по-горе. След получавнето на ДНК тя може да бъде пречистена чрез добре известни методи, като тези, описани в Раздел 1.40 на Sambrook et al., по-горе.

“Олигонуклеотидите са къси едно- или двуверижни полидезоксинуклеотиди, които се синтезират химично чрез известни методи (такива като фосфодиестерен, фосфитен, фосфороамидитна химия, като се използуват твърдофазови техники, както е описано в Европейски патент 266 032, публикуван на 4 май 1988, или чрез дезоксинуклеозид Н-фосфонатни междинни съединения, както е описано от Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407 <·, [1986]). Другите методи включват полимеразната верижна реакция, дефинирана по-долу, методи чрез автопраймери, както и олигонуклеотидна синтеза върху твърди подложки. Всички тези методи са описани в Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 (1989). Тези методи се използуват ако е известна цялата нуклеотидна последователност на гена или ако се разполага с нуклеотидната последователност, комплементарна на кодиращата верига. Алтернативно, ако е известна прицелната аминокиселинна последователност, може да се изведе потенциалната нуклеотидна последователност, като се използуват известните и предпочетени кодиращи остатъци за всеки аминокиселинен остстък. След това олигонуклеотидите се пречистват на полиакриламидни гелове.

Полимеразна верижна реакция или ПВР се отнася за процедура или техника, при която нищожни количества от специфични късчета нуклеинова киселина, РНК и/или ДНК, се амплифицират, както е описано в патент на САЩ No. 4 683195, издаден на 28 юли 1887. Най-общо, необходимо е да се разполага с информация за последователностите в краищата (или около тях) на областта, която представлява интерес, така че да могат да се проектират олигонуклеотидни праймери; тези праймери ще са идентични или сходни по последователност със срещуположните вериги на матрицата, която ще се амплифицира. 5'-крайните нуклеотиди на двата праймера могат да съответствуват на краищата на амплифицирания материал. ПВР може да се използува за амплификация на специфични РНК-последователности, специфични ДНК-последователности от тотална геномна ДНК и кДНК, транскрибирана от тотална клетъчна РНК, бактериофагови или плазмидни последователности, etc. Виж основно Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 [1987]; Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Така, както е използувана тук, ПВР се разглежда като един, но не като единствения пример за метод на полимеразна реакция на нуклеинова киселина с цел амплификация на тест-проба от нуклеинова киселина, който метод включва използуването на известна нуклеинова киселина като праймер и полимераза за нуклеинова киселина, за да се амплифицира или получи специфично парче нуклеинова киселина.

Строги условия са тези, които (1) използуват ниска йонна сила и висока температура за миене, например, 0,015 М NaCI/0,0015 М натриев цитрат/0,1% NaDodSO4 (SDS) на 50°С, или (2) използуват повреме на хибридизацията денатуриращ агент, такъв като формамид, например 50% (обем/обем) формамид в 0,1% говежди серумен албумин/0,1% фикол/0,1% поливинилпиролидон/50 мМ натриево-фосфатен буфер с pH 6,5 със 750 мМ NaCl, 75 мМ натриев цитрат на 42°С. Друг пример е използуването на 50% формамид, 5 X SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М натриев цитрат), 50 мМ натриев фосфат (pH 6,8), 0,1% натриев пирофосфат, 5 X разтвор на Денхард, озвучена ДНК от сперма на сьомга (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстрансулфат на 42°С с мнения при 42°С в 0,2 X SSChO,1%SDS.

Умерено строги условия са описани в Sambrook et at., по-горе, и включват използуването на миещ разтвор и условия на хибридизация (напр., температура, йонна сила и % SDS) по-малко строги, отколкото описаните погоре. Пример за умерено строги условия са условия, такива като инкубиране през нощта на 37°С в разтвор, съдържащ: 20% формамид, 5 X SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатриев цитрат), 50 мМ натриев фосфат (pH 7,6), 5 X разтвор на Денхард, 10% декстрансулфат и 20 мкл/мл денатурирана озвучена ДНК от сперма на сьомга, последвано от миене на филтрите в 1 X SSC на около 37-50°С. Опитният специалист ще се ориентира как да подбере температурата, йонната сила etc., което е необходимо за съгласуване с факторите, такива като дължиина на сондата и други подобни.

Антителата (Abs) и имуноглобулините (Igs) са гликопротеини, които имат еднакви структурни характеристики. Докато антителата показват специфичност на свързване със специфичен антиген, имуноглобулините включват както антитела, така и други антитялоподобни молекули, които не притежават антигенна специфичност. Полипептиди от последния вид се образуват например в малки колитества от лимфната система и в повишени количества от миеломите.

Нативните антитела и имуноглобулини са обикновено хетеродимерни гликопротеини от около 150 000 далтона, съставени от две идентични леки (L) вериги и две идентични тежки (Н) вериги. Всяка лека верига е свързана с тежка верига чрез една ковалентна дисулфидна връзка, докато броят на дисулфидните свързвания между тежките вериги при различниите имуноглобулинови изотипове варира. Всяка тежка и лека верига имат също така равномерно разположени вътреверижни дисулфидни мостове. Всяка тежка верига има на единия край вариабилен домен (Уц), следван от няколко константни домена. Всяка лека верига има вариабилен даомен на единия край (V|J и константен домен на другия си край; константният домен на леката верига е разположен успоредно с първия константен домен на тежката верига, а вариабилният домен на леката верига е разположен успоредно с вариабилния домен на тежката верига. Смята се, че определени аминокиселинни остатъци формират вътрешно пространство между вариабилните домени на леката и тежката верига (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 [1985]; Novotny and Haber, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 [1985]).

Терминът вариабилен има отношение към факта, че определени части от вариабилните домени в антителата силно се различават по последователност и се използуват за специфично свързване на всяко определено антитяло с неговия конкретен антиген. Вариабилността обаче не е равномерно разпределена по протежение на вариабилните домени на антителата. Тя е концентрирана в три сегмента, наречени области, определящи комплементарността (CDRs) или хипервариабилни области, както във вариабилния домен на леката, така и в този на тежката верига. По-силно консервативните участъци от вариабилните домени са наречени арматурни (скелетни) (FR). Всеки от вариабилните домени на нативните тежки и леки вериги включва четири FR-области, до голяма степен приемащи конфигурация Я-слой и свързани с три CDR, които образуват бримки, свързващи, а в някои случаи формиращи част от структурата Я-слой. CDRобластите във всяка верига се поддържат в непосредствена близост от FRобластите и заедно със CDR-областите от другата верига допринасят за образуването на антигенсвързващото място на антителата (виж Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, •Я

MD [1987]). Константните области не са въвлечени директно в свързването на антитялото с антигена, но изявяват различни ефекторни функции, такива като участие на антитялото в антитяло-зависимата цитотоксичност.

Смилането на антителата с папаин води до образуването на два идентични антигенсвързващи фрагмента, наречени Fab''-фрагменти, всеки с единично антигенсвързващо място, и остатъчен Fc''-фрагмент, чието име отразява неговата способност бързо да кристализира. Обработката с пепсин дава Е(аЬ’)2-фрагмент, който има две антигенсвързващи места и все още може кръстосано да свързва антигена.

Fv е минималният фрагмент от антитялото, който съдържа цялото антигенразпознаващо и свързващо място. Тази област се състои от димер от един вариабилен домен на лека и един вариабилен домен на тежка верига в тясна, нековалентна асоциация. В тази конфигурация трите CDR-области на всеки вариабилен домен взаимодействуват и образуват антигенсвързващо място върху повърхността на \/|-|-\/|_-димера. Шестте CDR-области заедно придават антигенсвързваща специфичност на антитялото. Дори единичен вариабилен домен обаче (или половината от Fv, съдържаща само три CDR-области, специфични за антигена) има способността да разпознава и свързва антиген, макар и с по-нисък афинитет, отколокото цялото свързващо място.

Fab-фрагментът съдържа още константния домен на леката верига и първия константен домен (СН1) на тежката верига. Fab'-фрагментите се различават от Fab-фрагментите по това, че към карбоксилния край на СН1домена на тежката верига се прибавят няколко остатъци, включващи един или повече цистеина от областта на извивката в антитялото. Fab'-SH е означението за Fab', в който цистеиновия(ите) остатък(ци) на константните домени носят свободна тиолова група. Р(аЬ')2-фрагментите от антителата първоначално бяха получени като двойки от Fab'-фрагменти, който имат помежду си цистеини от областта на извивката. Известни са и други, химични свързвания на фрагментите от антителата.

Леките вериги на антителата (имуноглобулините) от всеки вид гръбначно животно могат да бъдат отнесени към един от два ясно различими типа, наречени капа и ламбда, на основата на аминокиселинните последователности на техните константни домени.

В зависимост от аминокиселинната последователност на константните домени на техните тежки вериги, имуноглобулините могат да бъдат отнесени към различни класове. Съществуват пет основни класове имуноглобулини: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и някои от тях могат допълнително да бъдат разделени на субкласове (изотипове), напр. lgG-1, lgG-2, IgG-З и lgG-4; IgA-1 и IgA-2. Константните домени на тежките вериги, които съответствуват на различните класове имуноглобулини, са наречени алфа, делта, епсилон, гама и мю, респективно. Структурите на субединиците и пространствните конфигурации на различните класове имуноглобулини са добре известни.

Терминът антитяло се използува в най-широк смисъл и по-конкретно за отделни моноклонални антитела (включващи антитела агонисти и антагонисти), за препарати от антитела с полиепитопна специфичност, както и за фрагменти от антитела (напр. Fab, F(ab')2 и Fv), дотолкова, доколкото те проявяват желаната биологична активност.

Терминът моноклонално антитяло така, както се използува тук, се отнася за антитяло, получено от популация значително хомогенни антитела, т.е. индивидуалните антитела, съставящи популацията, са идентични с изключение на възможни естествено възникващи мутации, които могат да присъствуват в малки количества. Насочени срещу единично антигенно място, моноклоналните антитела са висркоспецифични. Освен това, за разлика от препаратите на конвенционалните (поликлонални) антитела, които обикновено включват различни антитела, насочени срещу различни детерминанти (епитопи), всяко моноклонално антитяло е насочено срещу единична детерминанта или антиген. Като допълнение към тяхната специфичност антителата имат това предимство, че те се синтизират от хибридомна култура, несъдържаща други имуноглобулини. Определението моноклонален посочва характера на антитялото като получено от значително хомогенна популация антитела и не трябва да се тълкува като изискващо получаване на антитялото по някакъв определен метод. Например, моноклоналните антитела, които ще се използуват в съгласие с настоящото изобретение, могат да бъдат направени по хибридомния метод, описан найнапред от Kohler & Milstein. Natrue, 256:495 (1975) или могат да се направят чрез рекомбинантни ДНК-методи (виж, напр., патент на САЩ No. 4 816 567 [Cabilly et al.]).

Моноклоналните антитела тук включват конкретно “химерни“ антитела (имуноглобулини), в които част от тежката и/или леката верига е идентична със, или хомоложна на съответни последователности в антителата, получени от определен вид или принадлежащи към определен клас или субклас антитела, докато останалата част от веригата(ите) е идентична със, или хомоложна на съответни последователности от антителата, получени от друг вид или принадлежащи към друг клас или субклас антитела, както и фрагменти от такива антитела, дотолкова, доколкото те проявяват желаната биологична активност (патент на САЩ No. 4 816 567 (Cabilly etal.,)·. и Morrison etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).

Хуманизираните форми на не-човешки (напр. миши) антитела са химерни имуноглобулини, имуноглобулинови вериги или техни фрагменти (такива като Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или други антигенсвързващи последователности от антителата), които съдържат минимална полследователност, получена от нечовешки имуноглобулин. В по-голямата си част хуманизираните антитела представляват човешки имуноглобулини (акцепторно антитяло), в които последователностите от областта, детерминираща комплементарността (CDR) на акцептора са заменени с остатъци от CDR-областта на не-човешки вид (донорно антитяло), такъв като мишка, плъх или заек, имаща желаната специфичност, афинитет и капацитет. В някои примери Fv-арматурните (FR) остатъци на човешкия имуноглобулин са заменени със съответни не-човешки остатъци. Нещо повече, хуманизираните антитела могат да съдържат остатъци, които не се откриват нито в акцепторното антитяло, нито във внесените CDR- или FR последователности. Тези модификации се правят за допълнително усъвършенствуване и оптимизиране ефективността на антителата. Хуманизираното антитяло включва най-общо почти всички от най-малко един, обикновено два, вариабилни домена, в които всички или почти всички от CDRобластите съответствуват на тези от не-човешки имуноглобулин и всички или почти всички от FR-областите са тези от консенсусна последователност на човешки имуноглобулин. Хуманизираното антитяло ще включва по оптимален начин най-малко част от имуноглобулинова константна област (Fc), обикновено тази на човешки имуноглобулин. За допълнителни подробности виж: Jones et al., Nature, 321:522-525 [1986]; Reichmann et at, Nature, 332:323-329 [1988]; и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 [1992]).

Неимуногенен за хората означава, че след създаване на контакт между съответната човешка тъкан и полипептида в терапевтично ефективно количество и във фармацевтично приемлив носител, второто въвеждане на полипептида след съответен латентен период (напр. 8 до 14 дни) не води до състояние на чувствителност или устойчивост към полипептида.

II. ПРЕДПОЧИТАНИ ВАРИАНТИ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Предпочетените полипептиди на това изобретение са значително хомогенни полипептид(и), означавани като /77рАлиганд(и) или тромбопоетин (ТРО), които притежават свойството да се свързват с mpl, член от цитокиновата рецепторна суперфамилия, който има биологичното свойство да стимулира включването на белязани нуклеотиди (ЗН-тимидин) в ДНК на IL-3-зависими Ba/F3клетки, трансфектирани с човешки mpl Р. По-предпочетените /прАлиганд(и) са белтъци, изолирани от бозайници, имащи хематопоетична, по-специално мегакариоцитопоетична или тромбоцитопоетична активност - а именно, да са способни да стимулират пролиферацията, зреенето и/или диференциацията на незрели мегакариоцити или техни предшественици в зрели тромбоцитобразуващи форми. Най-предпочетените полипептиди на това изобретение са човешки трАлиганди, включително и техни фрагменти? имащи хематопоетична, мегакариоцитопоетична или тромбопоетична активност. Възможно е тези човешки /прАлиганди да не са гликозилирани. Други предпочетени човешки /прА лиганди са ЕРО-домена на hML, означаван като hML-|53 ^или ЬТРО-153, скъсената форма на hML, означавана като hML245 или hTPO245, зрелият пълноразмерен полипептид, имащ аминокиселинната последователност, показана на фиг. 1 (SEQ ID NO: 1), означаван като hML, hML^ или ΙΊΤΡΟ332 и биологично активният субституционен вариант hML(R153A, R154A).

Условно предпочетени полипептиди на това изобретение са биологично или имунологично активните варианти на трАлигандите, избрани от hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML и pML2.

Условно предпочетени полипептиди на това изобретение са биологично активните вариант(и) на /прАлиганда, които имат аминокиселинна последователност, най-малко 70% идентична с аминокиселинната последователност на човешкия /прАлиганд (виж Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]), на мишия /прАлиганд (виж фиг. 16 SEQ ID NOS:12 & 13]), на рекомбинантния свински трА лиганд (виж. фиг. 19 [SEQ ID NO: 18]) или на свинския /прАлиганд, изолиран от апластична свинска плазма. Предпочита се идентичността да е най-малко 75%, повече се предпочитат най-малко 80%, още повече се предпочитат най-малко 85%, като по-предпочитани от тях са най-малко 90% и най-предпочитани са наймалко 95%.

/ИрАлигандът, изолиран от апластична свинска плазма, има следните характеристики:

(1) Частично пречистеният лиганд се елуира от гел-филтрационна колона с PBS, с PBS, съдържащ 0,1% SDS или с PBS, съдържащ 4М MgCl2 с Мг 60 000 - 70 000.

(2) Активността на лиганда се разрушава от проназа;

(3) Лигандът е стабилен при ниско pH (2,5), SDS до 1% и 2 М урея;

(4) Лигандът е гликопротеин, което се доказва от свързването му с различни лектинови колони;

(5) Високопречистеният лиганд се елуира от нередуцираща SDS-PAGE с Мг 25 000 - 35 000. Елуират се също по-малки количества активност с Мг приблизително 18 000 - 22 000 и 60 000.

(6) Високопречистеният лиганд се разделя на редуцираща SDS-PAGE като дублет с Мг 28 000 и 31 000.;

(7) Аминотерминалната последователност на ивиците 18 000 - 22 000, 28 000 и 31 000 е една и съща - SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 29); и (8) Лигандът се свързва и елуира от следните афинитетни колони:

Blue-Sepharose

CM Blue-Sepharose

MONO-Q

MONO-S

Lentil lectin-Sepharose,

WGA-Sepharose,

Con A-Sepharose,

Ether 650m Toy opearl,

Butyl 650m Toyopearl,

Phenyl 650m Toyopearl,

Phenyl-Sepharose

Най-предпочетените трАлигандни полипептиди са тези, кодирани от човешка геномна или кДНК с аминокиселинна последователност, описана във Фиг. 1 (SEQ ID NO; 1).

Други предпочетени биологично активни трАлигандни полипептиди на това изобретение, които се срещат в природата, включват препро-трАлиганд, про-трАлиганд, зрял трАлиганд, трАлигандни фрагменти и техните гликозилирани варианти.

Освен тях други предпочетени полипептиди на това изобретение включват варианти на /прАлигандната последователност и химери. Предпочетените варианти на /прАлигандната последователност и химерите обикновено са биологично активни варианти на трАлиганда, които имат аминокиселинна последователност най-малко 70% идентичност с аминокиселинната последователност на човешкия трАлиганд или с /прАлиганда, изолиран от апластична свинска плазма, за предпочитане е най-малко 75%, повече се предпочитат най-малко 80%, още повече предпочитани са най-малко 85%, като по-предпочитани от тях са най-малко 90% и най-предпочитани са 95%. Пример за предпочетен /прАлиганден вариант е вариант на N-крайния домен на hML (означаван като ЕРО-домен поради хомологията на неговата последователност с еритропоетина). Предпочетеният ЕРО-домен на hML включва около 153 аминокиселинни остатъци от началото на зрелия hML и се означава като hMLi53. Условно предпочетен вариант на hML-последователността включва такъв, в който един или повече от базичните и дибазични аминокиселинни остатък(ци) в С-крайния домен е заместен с небазичен аминокиселинен остатък(ци) (напр. хидрофобен, неутрален, кисел, ароматен, Gly, Pro и подобни на тях). Предпочетен вариант в последователността на С-крайния домен на hML включва такъв, в който Arg-остатъците 153 и 154 са заменени с Ala-остатъци. Този вариант е означен като hML332(R153A, R154A). Алтернативен предпочетен вариант на hML включва hML332 или hML-|53, в които аминокиселинните остатъци 111-114 (QLPP или LPPQ) са делетирани или заменени с друга тетрапептидна последователност (напр AGAG или подобна на нея). Споменатите делеционни мутанти се означават като делта4ЬМЕзз2 или делта4ЬМЬ|5з.

Предпочетена химера е сливането между щрАлиганда или негов фрагмент (дефиниран по-долу) с хетероложен полипептид или негов фрагмент. Например, hML153 може да бъде слят с IgG-фрагмент, за да се удължи времето на полуживот в серума или с IL-3, G-CSF или ЕРО, за да се получи молекула със посилна тромбопоетична или химерна хематопоетична активност.

Алтернативна предпочетена химера на човешкия щрАлиганд е химерата ML-ЕРО-домен, в която N-крайните остатъци на hML, от 153 до 157, са заменени с една или повече, но не с всички от остатъците на човешкия ЕРО, проблизително напаснати, както е показано във фиг. 10 (SEQ ID N0:6). Примерни инсерции на блокове от последователности в N-крайната част на hML зв биха включвали едно или повече от местата за гликозилиране в позиции (ЕРО) 2427, 38-40 и 83-85; един или повече от предсказаните четири α-спирални възли в позиции (ЕРО) 9-22, 59-76, 90-107 и 132-152; и други високо консервативни области, включващи N-крайните и С-крайните области, както и остатъците в позиции (еро) 44-52 (виж напр., Wen et al., Blood, 82:1507-1516 [1993] и Boissel et al., J. Biol. Chem., 268(21):15983-15993 [1993]). Допуска се, че тази химера MLЕРО-домен ще има смесена тромбопетична-еритропоетична (ТЕРО) биологична активност.

Други предпочетени полипептиди на това изобретение включват mpl· лигандни фрагменти с непрекъсната последователност от най-малко 10,15, 20, 25, 30 или 40 аминокиселинни остатъци, които са идентични с последователностите на /прАлиганда, изолиран от апластична свинска плазма или с тези на човешкия трАлиганд, описан тук (виж напр., Таблица 14, Пример 24). Предпочетен mpl· лиганден фрагмент е човешкият МЦ1-Х], където X е 153,164,191, 205, 207, 217, 229 или 245 (виж фиг. 1 [SEQ ID NO: 1] за последователността от остатъци 1-Х) Други предпочетени фрагменти на /прАлиганда включват тези, получени като резултат от химична или ензимна хидролиза или смилане на пречистения лиганд.

Друг предпочетен аспект на това изобретение е метод за пречистване на /лрАлигандни молекули. Методът включва създаване на контакт между източник на /прАлиганд, съдържащ молекулите на /прАлиганда, и имобилизиран рецепторен полипептид, по-конкретно mpl или тркжят полипептид. Това се извършва при условия, при които трАлигандните молекули, които ще се пречистват, се адсорбират селективно върху имобилизирания рецепторен полипептид, имобилизираната подложка се промива за отстраняване на неадсорбирания материал и молекулите, които трябва да се пречистят, се елуират от имобилизирания рецепторен полипептид с елуиращ буфер. Източникът, съдържащ /прАлиганда може да бъде плазма, в който случай се предпочита имобилизираният рецептор да бъде /npAlgG-сливане.

Като алтернатива източникът, съдържащ трАлиганда, представлява рекомбинантна клетъчна култура, където концентрацията на /прАлиганда, както в ja културалната среда, така и в клетъчните лизати като правило е по-висока, отколкото в плазмата или в други природни източници. В този случай по-горе описаният mpAlgG-имуноафинитетен метод, макар и да може да се използува, обикновено не е необходим и могат да се приложат по-традиционни, известни в практиката методи за пречистване на белтъци. Накратко, предпочетеният пречиствателен метод за получаване на значително хомогенен трАлиганд, включва: отстраняване на отломките от гостоприемни клетки или лизирани фрагменти, например чрез центрофугиране или ултрафилтрация; възможно е белтъкът да се концентрира с търговски достъпен филтър за белтъчно концентриране; следва отделяне на лиганда от други онечиствания чрез една или повече стъпки, избрани от; имуноафинитет, йонообмен (напр., DEAE или пълнежи, съдържащи карбоксиметилови или сулфопропилови групи), Blue-Sepharose, СМ Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-C, lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con ASepharose, Ether Toypearl, Butyl Toypearl, Phenyl Toypearl, protein A Sepharose, SDS-PAGE, обратнофазова високоефективна течна хроматография (HPLC) (напр., силикагел с прикачени алифатни групи), сефадексово молекулно сито, гелфилтрация и утаяване с етанол или амониев сулфат. Във вкяка от гореспоменатите стъпки може да бъде включен протеазен инхибитор, такъв като метилсулфонилфлуооид (PMSF). за инхибиоане на протеолизата.

В друг предпочитан вариант това изобретение обезпечава изолирано антитяло, способно да се свързва с трАлиганд. Предпочетеното изолирано антитяло срещу трАлиганд е моноклонално (Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et a!., Eds, Volume 13, Elsevier Science Publisrers, Amsterdaam [1985]; and Huse et al., Science, 246:1275-1281 [1989]). Предпочетено изолирано антитяло срещу трАлиганд е такова, което свързва трАлиганда с афинитет наймалко 10θ л/мол. Повече се предпочита антитялото да се свързва с афинитет наймалко около 10⁷ л/мол. Най-много се предпочита антитялото да бъде получено срещу трАлиганда, имащ една от по-горе описаните ефекторни функции. Изолираното антитяло, способно да се свързва с трАлиганда може да бъде слято с втори полипептид като антитялото или неговата слята форма могат да се използуват за изолиране и пречистване на трАлиганд от източник, както е описано по-горе за имобилизирания трАполипептид. В следващ предпочетен аспект на това приложение, изобретението осигурява метод за детектиране на mpl-лиганд in vitro или in vivo, който включва създаване на контакт между антитялото и пробата, по-конкретно серумна проба, за която се подозира, че съдържа лиганда и установяване дали свързването е протекло.

В следващи ι предпочитани варианти изобретението обезпечава изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща трАлиганда или фрагменти от него, която молекула нуклеинова киселина може да бъде белязана или небелязана с детектируем компонент, както и молекула нуклеинова киселина, имаща последователност, която е комплементарна на, или хибридизира при строги или умерено строги условия с, молекула нуклеинова киселина, имаща последователност, кодираща трАлиганд. Предпочетена трАлигандна нуклеинова киселина е РНК или ДНК, която кодира биологично активен трАлиганд, показващ идентичност в последователността с човешкия трАлиганд най-малко 75%, повече се предпочитат най-малко 80%, още повече се предпочитат най-малко 85%, като повече от тях се предпочитат 90% и най-много се предпочитат 95%. Попредпочитаните изолирани молекули нуклеинови киселини са ДНКпоследователности, кодиращи биологично активен трАлиганд, избран от: (а) ДНК на основата на кодиращата област на ген за трАлиганд от бозайник (напр., ДНК, включваща нуклеотидната последователност, дадена във фиг. 1 (SEQ ID NO: 2) или на фрагменти от нея); (Ь) ДНК, способна да хибридизира с ДНК от (а) при най-малко умерено строги условия; и (с) ДНК, която е изродена по отношение на ДНК, дефинирана в (а) и (Ь), което произтича от изродеността на генетичния код. Приема се, че новите трАлиганди, описани тук, могат да бъдат членове на фамилия лиганди или цитокини, които имат секвенционна идентичност, така че техните ДНКи да могат да хибридизират с ДНК от фиг. 1 (SEQ ID NO: 1) при условия с ниска до умерена строгост. И така, следващ аспект на това

-Г у

Gt изобретение включва ДНК, която хибридизира при ниско до умерено строги условия с ДНК, кодираща трАлигандните полипептиди.

В следващо предпочетено приложение на това изобретение молекулата нуклеинова киселина е кДНК, кодираща трАлиганда и включваща още вектор, който може да се реплицира и в който кДНК е оперативно свързана с контролни последователности, които се разпознават от гостоприемник, трансформиран с вектора. Този аспект включва още клетки-гостоприемници, трансформирани с вектора, както и метод за използуване на кДНК за реализиране продукция на трАлиганд. Методът включва експресия на кДНК, кодираща трАлиганда в култура от трансформираните клетки-гостоприемници и изолиране на трА лиганда от културата на гостоприемните клетки. Предпочита се трАлигандът, получен по този начин, да бъде значително хомогенен човешки трАлиганд. Предпочетени клетки-гостоприемници за продукция на трАлиганд са яйчни клетки от Китайски хамстер (СНО).

Това изобретение включва още предпочетен метод за лечение на бозайник с имунологично или хематопоетично заобляване, по-конкретно тромбоцитопения, като методът включва въвеждане в бозайника на терапевтично ефективно количество трАлиганд. Л/рАлигандът може да се прилага комбинирано с цитокин, по-конкретно колония-стимулиращ фактор или интерлевкин. Предпочетените колония-стимулиращи фактори или интерлевкини включват: търговски лиганд, LIF, G-CSF, GM-CSF, М-CSF, ЕРО, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 или IL-11.

III. Методи за получаване

Дълго време се смяташе от някои автори, че образуването на тромбоцитите се контролира от множество родословно специфични хуморални фактори. Беше постулирано, че мегакариоцитопоезата и тромбопоезата се регулират от две различни цитокинови активности, означавани като фактор, стимулиращ колонията от мегакариоцити (meg-CSF) и тромбопоетин (Williams et

62.

a/., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982]; Williams etal., Blood Cells, 15:123-133 [1989]; и Gordon et al., Blood, 80:302-307 [1992]). Съглсасно тази хипотеза meg-CSF стимулира пролиферацията на родителските мегакариоцити, докато тромбопоетинът влияе предимно върху зреенето на по-диференцирани клетки и задължително върху освобождаването на тромбоцитите. След 1960 бяха добре документирани индукцията и появата, както на meg-CSF-активност, така и на тромбопоетинова активност в плазмата, серума и урината на животни и хора след случаи на тромбоцитопения (Odell etal., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428431 [1961]; Nakeff etal., Acta Haematol., 54:340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108:146-149 [1961]; Schreiner etal., J. din. invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608[1974]; Hoffman etal., N. Engl. J. Med., 305:533 [1981]; Straneva et al., Exp. HematoL, 17:1122-1127(1988]; Mazur et al., Exp. Hematd., 13:1164 [1985]; Mazur etal., J. Clin. Invest., 68:733-741 [1981]; Sheiner etal., Blood, 56:183-188(1980]; Hill etal., Exp. HematoL, 20:354-360 [1992]; и Hegyi et al., Int. J. Cell Cloning, 8:236244 [1990]). За тези активности се съобщаваше, че са родословно специфични и различни от известните цитокини (Hill R.J. et al., Blood 80:346 (1992); EricksonMiller C.L. et al., Brit. J. Haematol., 84:197-203 (1993); Straneva J.E. et al., Exp. HematoL 20:4750 (1992); и Tsukada J. etal., B/ood81:866-867[1993]).

В съгласие c горните наблюдения, описващи тромбоцитопенична плазма, ние намерихме, че апластична свинска плазма (АРР), получена от облъчени прасета, стимулира човешката мегакариоцитопоеза in vitro. Ние намерихме, че тази стимиулираща активност се потиска от разтворимия извънклетъчен домен на с-тр!, което потвърждава, че АРР е потенциален източник на предполагаемия трАлиганд .(ML). Понастоящем ние успешно пречистихме гпрАлиганда от АРР и информацията за аминокиселинната последователност беше използувана за изолиране на миша, свинска и човешка ML-кДНК. Тези ML имат хомология в последователността с еритропоетина и притежават, както meg-CSF-активност, така и тромбопоетиноподобна активност.

1. Пречистване и идентифициране на /пр/-лиганд от плазма

Както е отбелязано по-горе, беше съобщено, че апластична плазма от различни видове съдържа акивности, които стимулират хематопоеза in vitro, но досега няма съобщение за хематопоетичен стимулиращ фактор, изолиран от плазма. Един източник на апластична плазма е този, получен от облъчени прасета. Тази апластична свинска плазма (АРР) стимулира човешка хематопоеза in vitro. За да се определи, дали АРР съдържа трАлиганд, неговият ефект се тестира чрез измерване включването на Зц-тимидин в Ва/РЗ-клетики, трансфектирани с човешки mpIP (Ba/F3-mpJ) чрез процедурата, описана във фиг.

2. АРР стимулира включването на ЗН-тимидин в Ва/РЗ-трАклетки, но не и в Ba/F3контролните клетки (т.е. нетрансфектирани с човешки тр!Р). Освен това такава активност не се установява в нормална свинска плазма. Тези резултати показват, че АРР съдържа фактор или фактори, които предават пролиферативен сигнал чрез /ирАрецептора и поради това биха могли да бъдат естествени лиганди за този рецептор. Това беше допълнително потвърдено от намирането, че третирането на АРР с разтворим mpAIgG блокира стимулиращия ефект на АРР върху Ва/РЗ-трАклетки.

Активността в АРР изглежда се носи от белтък, тъй като проназа, DTT или нагряване разрушават активността в АРР (фиг. 3). Активността не може също и да се диализира. Активността обаче е стабилна при ниско pH (pH 2,5 за 2 часа) и е показано, че се свързва и елуира от няколко лектин-афинитетни колони, което показва, че тя представлява гликопротеин. За да се хвърли по-нататък светлина върху структурата и идентичността на тази активност тя се пречиства афинитетно от АРР като се използува mpAIgG-химера.

АРР се третира съгласно протокола, поместен в Примери 1 и 2. Накратко, трАлигандът се пречиства като се използуват хроматография на хидрофобните взаимодействия (HIC), хроматография с имобилизирано багрило и трАафинитетна хроматография. Добивът на активност от всяка стъпка е показан на фиг. 4, а степента на пречистване е дадена в Таблица 1. Общият добив на активност след /прАафинитетната колона е приблизително 10%. Фракцията с пикова активност (F6) от /прАафинитетната колона има специфична активност, оценена на 9,8x1 Οθ единици/мг. Цялостното пречистване от 5 л АРР е 4x1 Οθ -пъти (от 0,8 ед./мг до 3,3x1 Οθ ед./мг) при 83x1 Οθ-пъти редукция на белтъка (от 250 г до 3 мкг). Ние пресметнахме, че специфичната активност на лиганда, елуиран от mplафинитетната колона, е около 3x1 Οθ ед./мг.

ТАБЛИЦА 1

Пречистване на mpl-лиганд

Специфична Проба Обем Белтък Ед./мл	Единици	активност Ед./мг	Добив %	Пъти Пречистване
мл	мг/мл
АРР 5000	50	40	200 000	0,8	-	1
фенил 4700	0,8	40	200 000	50	94	62
Blue-Sep. 640	0,93	400	256 000	430	128	538
mpl (мкл)
(Ф-ции 5-7) 12	5x10'4	1666	20 000	3 300 000	10	4100 000

Белтъкът е определен по метода на Bradford. Белтъчната концентрация на mplелуираните фракции 5-7 е оценена на базата на интензивността на оцветяване на SDS-гелове, оцветени със сребро. Една единица се дефинира като такава, която предизвиква 50% от максималната стимулация на Ва/БЗ-трАклетъчната пролиферация.

Анализът на фракциите, елуирани от трАафинитетната колона чрез SDS-PAGE (4-20%, Novex-гел), проведена при нередуциращи условия, разкрива наличието на няколко белтъка (Фиг. 5). Белтъците, които по сребро се оцветяват с най-интензивно, се разделят с видима Мг 66 000, 55 000, 30 000, 28 000 и 18 000 22 000. За да се определи кой от тези белтъци стимулира пролиферацията на Ва/БЗ-гирАклетъчни култури, белтъците се елуират от гела, както е описано в Пример 2.

-Г еб

Резултатите от този експеримент показват, че по-голямата част от активността се елуира от гелно късче, което включва белтъци с Мг 28 000 - 32 000 и по-малка активност се елуира от областта на гела 18 000 - 22 000 (Фиг. 6). Единствените белтъци, които се забелязват в тези области, имат Мг 30 000, 28 000 и 18 000 - 22 000. За да се идентифицира и получи белтъчната последователност на белтъците, които се разделят в тази област на гела (т.е. ивици при 30, 28 и 1822 кДа), тези белтъци се пренасят чрез електроблотинг върху PVDF и се секвенират, както е описано в Пример 3. Получените аминотерминални последователности са дадени в Таблица 2.

ТАБЛИЦА 2

Аминотерминални последователности на тр/-лиганда фа

5 10 15 2025 (S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD(H/S)VLH(G)RL (SEQ ID NO: 30) фа

5 10 15 2025 (S)PAPPA(X)DPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR (SEQ ID NO: 31)

18-22 к|3а

510

XPAPPAXDPRLX(N)(K) (SEQ ID NO: 32)

Компютърният анализ показва, че тези аминокиселинни последователности са нови. Тъй като всичките три последователности са едни и същи, се смята, че белтъците от 30 кДа, 28 кДа и 18-22 кДа са родствени и биха могли да представляват различни форми на същия нов белтък. Нещо повече, този белтък(ци) е вероятно кандидат за природния трЛлиганд, тъй като на SDS-PAGE активността се разделя в същата област (28 000-32 000) на 4-20% гел. Освен това частично пречистеният лиганд мигрира с Мг 17 000-30 000, когато се подложи на гел-филтрационна хроматография с използуване на колона Superose 12 (Pharmacia). Смята се, че различните Мг-форми на лиганда са резултат от различия в протеолизата, гликозилирането или други пост- или претранслационни модификации.

Както беше описано по-рано, антисенс човешка трАРНК потиска мегакариоцитопоезата в култури от човешки костен мозък, обогатени на CD 34+ родителски клетки, без да засяга диференциацията на други хематопоетични клетъчни линии (Methia et al., по-горе). Този резултат предполага, че mpl· рецепторът би могъл да играе роя в диференциацията и пролиферацията на мегакариоцитите in vitro. За да се изясни по-нататък ролята на /прАлиганда в мегакариоцитопоезата се сравняват ефектите на АРР и на изчерпана за mpl· лиганд АРР върху in vitro човешката мегакариоцитопоеза. Ефектът на АРР върху човешката мегакариоцитопоеза се определя като се използува модификация на теста за мегакариоцитопоеза в течна суспензия, описан в Пример 4. В този тест човешки периферни стволови клетки (PSC) се третират с АРР преди и след mpl· lgG-афинитетна хроматография. GPIIbllla-стимулацията на мегакариоцитопоезата се измерва с ¹²⁵1-анти-11ь111_а-антитяло (Фиг. 7). На фиг. 7 е показано, че 10% АРР предизвиква приблизително трикратна стимулация, докато АРР, изчерпана за /прАлиганд, няма ефект. Съществено е, че АРР, изчерпана за трАлиганд, не индуцира пролиферацията на Ва/РЗ-трАклетки.

В друг експеримент разтворим човешки /npAIgG, добавен в дни 0, 2 и 4 към култури, съдържащи 10% АРР, неутрализира стимулиращия ефект на АРР върху човешката мегакариоцитопоеза (Фиг. 8). Тези резултати показват, че mpl· лиганда играе роля в регулацията на човешката мегакариоцитопоеза и поради това може да бъде полезен за лечение на тромбоцитопения.

2. Молекулно клоннране на /пр/-лиганда

На основата на аминотерминалната аминокиселинна последователност, получена за белтъците от 30 кДа, 28 кДа и 18-22 кДа (виж Таблица 2 по-горе) се проектират две групи от изродени олигонуклеотидни праймери и се използуват за амплификация на свинска геномна ДНК чрез ПВР. Приема се за основателно, че ако аминотерминалната аминокиселинна последователност се кодира от отделен екзон, то правилният ПВР-продукт се очаква да бъде дълъг 69 нд. Открива се ДНК-фрагмент с тази големина и се ¢7 субклонира в pGEMT. Последователностите на олигонуклеотидните ПВРпраймери и на трите получени клона са показани в Пример 5. Аминокиселинната последователност (PRLLNKLLR) [SEQ ID NO: 33) на пептида, кодиран между ПВРпраймерите, е идентична с тази, получена при секвенирането на аминотерминалния белтък на свинския лиганд (виж остатъци 9-17 от последователностите на свинските белтъци с големина 28 и 30 кДа, по-горе).

За скриниране на човешка геномна ДНК-библиотека се използува синтетичен олигонуклеотид, базиранщ се на последователността на ПВРфрагмента. На основата на последователността на ПВР-фрагмента се проектира и синтезира 45-мер олигонуклеотид, означен pR45. Този олигонуклеотид има следната последователност:

5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG3’ (SEQ ID NO; 34)

Този дезоксиолигонуклеотид се използува за скриниране на човешка геномна ДНК-библиотека в Iambda/gem12 чрез хибридизация при ниска строгост и условия на миене, съгласно Пример 6. Положителните клонове се събират, пречистват се от единични плаки и се анализират чрез рестрикционно картиране и Southern-блотинг. EcoRI-Xbal-фрагмента от 390 нд, който хибридизира с 45-мера се субклонира в pBluescript SK-. ДНК-секвениране на този клон потвърждава, че е изолирана ДНК, кодираща човешкия аналог на свинския /прЛлиганд. Човешката ДНК-последователност и изведената от нея аминокиселинна последователност са показани на фиг. 9 (SEQ ID NOS:3 & 4). Със стрелки са посочени също и предполагаемите места на интроните в геномната полследователност, които ограничават предполагаемия екзон (екзон 3).

На основата на човешкия екзон 3 (Пример 6) се синтезират олигонуклеотиди, съответствуващи на 3'- и 5'-краищата на екзона. Тези два праймера се употребяват в ПВР-реакции, в които като матрица се използува кДНК, получена от различни човешки тъкани. Очакваната големина на правилния ПВР-продукт е 140 нд. След анализ на ПВР-продуктите на 12% полиакриламиден гел, се открива ДНК-фрагмент с очакваната големина в кДНК библиотеки,

СВ‘ приготвени от човешки бъбрек на възрастен, 293-фетални бъбречни клетки и кДНК, приготвена от човешки фетален черен дроб.

След това кДНК-библиотеката от фетален черен дроб (7х10б-клона) в lambda DR2 се скринира със същия 45-мер олигонуклеотид, използуван за скриниране на човешката геномна библиотека при ниска строгост на хибридизационните условия. Положителните клонове се събират, пречистват се от единични плаки и големината на инсерта се определя чрез ПВР. Отбира се един клон с инсерт от 1,8 кн и се анализира по-нататък. Като се използуват процедурите, описани в Пример 7 се получават нуклеотидната и изведената от нея аминокиселинна последователност на човешкия трАлиганд (hML). Тези последователности са представени на Фиг. 1 (SEQ ID NOS: 1 & 2).

3. Структура на човешкия /пр/-лиганд (hML)

Последователността на кДНК на човешкия трАлиганд (фиг. 1 SEQ ID N0:2]) включва 1774 нуклеотида, следвани от поли(А)-опашка. Тя съдържа 215 нуклеотида от 5'-нетранслиращата се последователност и 3'-нетранслираща се област от 498 нуклеотида. Предполагаемият инициаторен кодон в нуклеотидна позиция (216-218) е вътре в консенсусната последователност, която е подходяща за инициация на еукариотната транслация. Отворената рамка за четене е дълга 1059 нуклеотида и кодира полипептид от 353 аминокиселини като се започне от нуклеотидна позиция 220. N-краят на предсказаната аминокиселинна последователност е силно хидрофобен и вероятно съответствува на сигнален пептид. Компютърен анализ на предсказаната аминокиселинна последователност (von Heijne etal., Eur. J. Biochem., 133:17-21 [1983]) посочва потенциално място за скъсване от сигнална пептидаза между остатъци 21 и 22. Скъсването в тази позиция би довело до образуването на зрял полипептид от 332 аминокиселинни остатъци, започващ с аминотерминалната последователност, получена за трА лиганда, пречистен от свинска плазма. Предсказаното молекулно тегло за негликозилирания лиганд от 332 аминокиселинни остатъка е около 38 кДа.

Налице са 6 потенциални места за N-гликозилиране и четири цистеинови остатци.

Сравняване на трАлигандната последователност с последователностите от базата данни в генната банка (Genebank) разкрива 23% идентичност между аминотерминалните 153 остатъка на зрелия човешки mpl и човешкия еритропоетин (Фиг. 10[SEQ ID NOS: 6 & 7]). Ако се вземат предвид консервативните замествания (субституции) тази област на човешкия hML показва 50% сходство с човешкия еритропоетин (hEPO). Както hEPO, така и hML съдържат четири цистеина. Три от четирите цистеина са запазени (консервирани) в hML, включващи първия и последния цистеина. Експерименти по целенасочена мутагенеза показват, че първият и последният цистеини на еритропоетина формират дисулфидна връзка, която е необходима за функцията (Wang, F.F. et al., Endocrinology 116:2286-2292 [1983]). По аналогия първият и последният цистеини на hML могат също да формират критична дисулфидна връзка. Нито едно от местата за гликозилиране в hML не е консервативно. Всички потенциални места в hML за N-свързано гликозилиране са локализирани в карбокситерминалната половина на hML-полипептида.

Подобна на ЕРО, мРНК на hML не съдържа консенсусната последователност за полиаденилиране AAUAAA, нито регулаторния елемент AUUUA, който присъствува в 3'-нетранслиращите се области на много цитокини и се смята, че повлиява стабилността на мРНК (Shawet et a!., Cell, 46:659-667 [1986]). Nordern-блот анализ разкрива ниски нива от единичен 1,8 кн hML РНКтранскрипт, както във фетален, така и в черен дроб на възрастен. След по-дълга експонация би могла да се детектира по-слаба ивица със същата големина в бъбрек от възрастен. За сравнение, човешкият еритропоетин се експресира във фетален черен дроб в отговор на хипоксия, в бъбрек и черен дроб на възрастен (Jacobs eta!., Nature, 313:804-809[1985] и Bondurant eta!., Molec. Cell. Biol., 6:27312733(1986]).

Значението на С-крайната последователност на hML остава да се изясни. Като се има предвид наличието на шестте потенциални места за N свързано гликозилиране и способността на лиганда да се свързва с лектинафинитетни колони, тази област на hML вероятно е гликозилирана. В някои експерименти по елуиране от гел, ние откриваме активност, която се разделя с Мг около 60 000, която може да представлява пълноразмерната, гликозилирана молекула. Поради това С-крайната област може да съдействува за стабилизиране и повишаване полуживота на циркулиращия hML. В случая с еритропоетина негликозилираната форма има пълна in vitro биологична активност, но има значително редуциран плазмен полуживот в сравнение с гликозилирания еритропоетин (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265:12127-12130 [1990]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266:23022-23026 [1991] и Spivack et al., Blood, 7:90-99 [1989]). С-крайният домен на hML съдържа два мотива от дибазични аминокиселинни последователности [Arg-Arg-мотиви в позиции 153-154 и 245246], които биха могли да служат като потенциални места за процесиране. Скъсване в тези места може да е отговорно за образуването на ML-формите от 30, 28 и 18-22 кДа, които се изолират от АРР. Съществено е, че последователността Arg-|53-Arg-|54 се появява непосредствено след еритропоетиноподобния домен на ML. Тези наблюдения посочват, че пълноразмерният ML може да представлява белтък-предшественик, който претърпява ограничена протеолиза за да даде зрелия лиганд.

4. Изоформи и варианти на човешкия трАлиганд

Изоформи или форми, резултат от алтернативен сплайсинг на човешкия /прАлиганд^се откриват чрез ПВР в черен дроб на възрастен човек. Накратко, синтезират се праймери, съответствуващи на всеки край, както и на вътрешни области от кодиращата последователност на hML. Тези праймери се използуват в ОТ-ПВР (RT-PCR) за амплификация на РНК от човешки черен дроб на възрастен, както е описано в Пример 10. Освен пълноразмерната форма, означена hML, се наблюдават или извеждат (от ДНК-последователностите) три други форми, означени hML2, hML3 и hML4. Зрелите изведени аминокиселинни последователности на всичките четири изоформи са представени на фиг. 11 (SEQ ID NOS: 6, 8, 9 & 10). hML3 има 116-нуклеотидна делеция в позиция 700, която води както до делеция на аминокиселини, така и до изместване рамката на четене. кДНК в този случай кодира зрял полипептид, който е дълъг 265 аминокиселини и се различава от hML-последователността по аминокиселинния остатък 139. Накрая, hML4 има както 12-нуклеотидна делеция след нуклеотидна позиция 618 (намерена също в мишата и свинската последователности [виж подолу]), така и 116-нд делеция, намерена в hML3. Въпреки че при човека не са изолирани клонове само с 12-нд делецията (след нуклеотид 619), означена (hML2), тази форма вероятно съществува, тъй като такава изоформа е била идентифицирана, както в мишка, така и в прасе (виж по-долу) и тъй като тя е била идентифицирана във връзка със 116-нуклеотидната делеция в hML4.

За да се определи дали пълноразмерният ML е необходим за биологичната активност, се конструират както вариант на hML със заместване, в който дибазичната Агд^-Агд^-последователност се замества с два аланинови остатъци, така и скъсена по отношение на ЕРО-домена форма на hML Вариантът със заместване на дибазичната последователност Arg^-Arg^, означаван като hML(R153A, R154A) се конструира като се използува ПВР, както е описано в Пример 10. Скъсената за ЕРО-домена” форма, hML-|53, също се прави чрез използуване на ПВР като се въвежда стоп-кодон след Arg153.

5. Експресия на рекомбинантен човешки /прАлиганд (rhML) в транзитно трансфектирани човешки ембрионални бъбречни (293) клетки

За да потвърдим, че клонираната човешка кДНК кодидра лиганд за mpl, лигандът се експресира в бозайнишки 293-клетки под контрола на непосредствено ранния цитомегаловирусен промотр като се използуват експресионните вектори pRK5-hML или pRK5-hMLf53. Намира се, че надстоящите течности от транзитно трансфектирани човешки ембрионални бъбречни 293клетки стимулират включването на θΗ-тимидин в Вa/F3-/npAклетки, но не и в родителските Ba/FS-клетки (Фиг. 12А). Среда от 293-клетки, трансфектирани само с вектора, не съдържа такава активност. Добавянето на mpAIgG в средата прекратява стимулацията (данните не са показани). Тези резултати показват, че клонираната кДНК кодира функционален човешки ML (hML).

За да се определи дали ΈΡΟ-доменът* сам може да свързва и активира mpl, скъсената форма на hML, rhML-153, ^се експресира в 293-клетки. Открива се, че надстоящите течности от трансфектираните клетки имат активност, подобна на тази, присъствуваща в надстоящите течности от клетки, експресиращи пълноразмерния hML (Фиг. 12А), което показва, че С-крайният домен на ML не се изисква за свързване и активиране на c-mpi.

6. /прАлигандът стимулира мегакариоцитопоезата и тромбопоезата

Както пълноразмерната, така и скъсената rhML-153-форма на рекомбинантния hML стимулират човешка мегакариоцитопоеза in vitro (фиг. 12В). Този ефект се наблюдава в отсъствието на други екзогенно добавени хематопоетични растежни фактори. С изключение на IL-3, ML е единственият тестиран хематопоетичен растежен фактор, които проявява тази активност. IL-11, IL-6, IL-1, еритропоетин, G-CSF, IL-9, LIF, търговски лиганд (KL), M-CSF, OSM и GMCSF нямат ефект върху мегакариоцитопоезата, когато се тестират поотделно в нашия тест (данните не са представени). Този резултат показва, че ML има мегакариоцит-стимулираща активност и посочва роля за ML в регулацията на мегакариоцитопоезата.

Показано е, че тромбопоетични активности, присъствуващи в плазмата на тромбоцитопоетични животни, стимулират образуването на тромбоцити в теста по експериментално предизвикана (рикошираща) тромбоцитоза в мишки (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973] и McDonald etal., Scand. J. Haematol., 16:326-334 [1976]). При този модел в мишките се предизвиква акутна тромбоцитопения^като се използува специфичен антитромбоцитен серум, което води до предсказуема тромбоцитоза. Подобни имуно-тромбоцитемични мишки са по-податливи на екзогенни тромбопоетиноподобни активности, отколкото са нормалните мишки (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973]), точно така, както ексхипоксичните мишки са по-чувствителни към еритропоетина, отколкото нормалните мишки (McDonald, eta!., J. Lab. din. Med., 77:134-143 [1971]). За да се определи дали rML стимулира образуването на тромбоцити in vivo, мишки с експериментално предизвикана тромбоцитоза се инжектират с частично пречистен rhML След това се измерват тромбоцитните числа и включването на 35s в тромбоцитите. Инжектирането на мишки с 64 000 или 32 000 единици rML значително усилва образуването на тромбоцити, което се вижда от приблизително 20%-то повишаване на томбоцитните числа (р=0,0005 и 0,0001, респективно) и около 40%-то повишаване включването на 35g _в тромбоцитите (р=0,003) при третираните мишки в сравнение с контролните мишки, инжектирани само с разтворител (фиг. 12С). Това ниво на стимулация е сравнимо с това, което ние наблюдаваме с IL-6 в този модел (данните не са представени). Третиране с 16 000 единици rML не стимулира значително образуването на тромбоцити. Тези резултати показват, че ML стимулира образуването на тромбоцити по доза-зависим начин и поради това притежава тромбопоетиноподобна активност.

293-клетки се трансфектират също и с конструкциите на другите MLизоформи, описани по-горе като надстоящтите им течности се тестират, използувайки Ва/РЗ-трАпролиферационния тест (виж фиг. 13). В този тест hML2 и hML3 не показват детектируема активност, но активността на hML(R153A, R154A) е сходна с тази на hML и L-153, което показва, че процесирането в дибазичното място Arg-|53-Arg-|54 нито се изисква, нито пречи на активността.

7. Мегакариоцитопоеза и трАлиганда

Предположено беше, че мегакариоцитопоезата се регулира на множество клетъчни нива (Williams et a!., J. Cell Physio!., 110:101-104 и Williams et a!., Blood Cells, 15:123-133 [1989]). Това се основава до голяма степен на наблюдението, че определени хематопоетични растежни фактори стимулират пролиферацията на мегакариоцитните предшественици, догато други изглежда влияят предимно върху зреенето. Представените тук резултати навеждат на мисълта, че ML действува както като пролиферативен фактор, така и като фактор на зреенето. Това, че ML стимулира пролиферацията на мегакариоцитните предшественици, се потвърждава от няколко линии на доказателства. Пъвро, АРР стимулира както пролиферацията, така и зреенето на човешки мегакариоцити in vitro и тази стимулация напълно се инхибира от mpAigG (фигури 7 и 8). Освен това инхибирането на формирането на мегакариоцитната колония от c-mpl·· антисенс олигонуклеотиди (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993] и намирането, че с-mp/ може да предава пролиферативен сигнал в клетки, в които той е трансфектиран (Skoda et al., EMBO, 12:2645-2653(1993] и Vigon etal., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]?също показва, че ML стимулира пролиферацията. Очевидната експресия на с-mp/ през всички стадии на мегакариоцитната диференциация (Methia et a!., Blood, 82:1395-1401 [1993]) и способността на рекомбинантния ML бързо да стимулира образуването на тромбоцити in vivo, показва че ML влияе също и върху зреенето. Наличието на рекомбинантен ML прави възможно да се направи внимателна оценка на неговата роля в регулацията на мегакариоцитопоезата и тромбопоезата, както и на потенциалната му способност да повлиява други хематопоетични родословни линии.

8. Изолиране на гена за човешки трАлиганд (ТРО)

Човешки геномни ДНК-клонове на ТРО-гена се изолират чрез скриниране на човешка геномна библиотека в Iambda-Gem12 с pR45 при ниска строгост или при висока строгост на условията, с фрагмент, съответствуващ на 3'-половината от човешка кДНК, кодираща трАлиганда. Изолират се два припокриващи се ламбда-клонове, обхващащи 35 кн. Двата припокриващи се фрагмента (BamHI и EcoRI), съдържащи целия ТРО-ген се субклонират и секвенират (виж фигури 14А, 14В и 14С).

Структурата на човешкия ген е съставена от 6 екзона в рамките на 7 кн геномна ДНК. Граничните области на всички връзки екзон/интрон се съгласуват с консенсусния мотив, установен за гените на бозайници (Shapiro, М. В., etal., Nucl.

Acids Res. 15:7155 [19987]). Екзон 1 и екзон 2 съдържат 5'-нетранслираща се последователност и първите четири аминокиселини от сигналния пептид. Останалата част от секреторния сигнал и първите 26 аминокиселини на зрелия белтък се кодират от екзон 3. Целият карбоксилен домен и 3'-нетранслиращата се област, както и около 50 аминокиселини от еритропоетиноподобния домен се кодират от екзон 6. Четирите аминокиселини, участвуващи в деленията, наблюдавана в hML-2 (hTPO-2) се кодират от 5'-края на екзон 6.

Анализът на човешка геномна ДНК чрез Southern-блот показва, че генът за ТРО е представен в единично копие. Хромозомната локализация на гена се определя чрез флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) и се картира в хромозома 3q27-28.

9. Експресия и пречистване на ТРО от 293-клетки

Получаването и пречистването на ML или ТРО от 293-клетки е описано подробно в Пример 19. Накратко, кДНК, съответствуваща на цялата отворена рамка за четене на ТРО^се получава чрез ПВР? като се използува pRK5-h/np/1. ПВР-продуктът се пречиства и се клонира между рестриктазните места Clal и Xbal на плазмида pRKStkneo (вектор, получен от pRK5, модифициран така че да се експресира ген за неомицинова устойчивост под контрола на тимидинкиназния промотор), при което се получава вектора pRK5tkneo.ORF (вектор, кодиращ цялата отворена рамка за четене).

По същия начин се създава - втори вектор, кодиращ ЕРО-хомоложния домен, но като се използуват други ПВР-праймери, за да се получи крайната конструкция, наречена pRK5tkneoEPO D.

Двете конструкции се трансфектират в човешки ембрионални бъбречни клетки по СаРОд-метода и се отбират устойчиви към неомицин клонове, които се култивират до постигане на конфлуентност. Експресията на ML153 ^или ML332 в културалните среди на тези клонове се тестира? като се използува Ba/F3-mpA пролиферационният тест.

7С>

Пречистването на rhML.332 се извършва, както е описано в Пример 19. Накратко, 293-гЬМ1_зз2-културални среди се нанасят на колона Blue Sepharose (Pharmacia), която след това се промива с буфер, съдържащ 2М урея. Колоната се елуира с буфер, съдържащ 2М урея и 1М NaCI. Обединените проби, елуирани от Blue-Sepharose, след това се нанасят директно върху колона WGA-Sepharose, промита с 10 обема на колоната буфер, съдържащ 2М урея и 1М NaCI и се елуират със същия буфер, съдържащ 0,5М И-ацетил-О-глюкозамин. Елуата от WGA-Sepharose се нанася на С4-НPLC-колона (Synchrom, Inc.) и се елуира с прекъснат пропановов градиент. На SDS-PAGE пречистеният 293-rhML332 се движи като широка ивица в областта на гела от 68-80 кДа (виж фиг. 15).

Пречистването на rhML-|53 ^СЪЩ° ^се извършва, както е описано в Пример 19. Накратко, 293-гпМЕ-|5з-културални среди се разделят на BlueSepharose, както е описано за rhML332- Елуатът от Blue-Sepharose се нанася директно на /прАафинитетна колона, както е описано по-горе. Елуираният от mpl· афинитетната колона rhML-|53 се пречиства до хомогенност^като се използува С4-НРЕС-колона, елуирана при същите условия, изпозувани за rhML332- На SDSPAGE пречистеният rhML-|53 се разделя на 2 големи и 2 малки ивици с Мг около 18 000-22 000 (виж фиг. 15).

10. Миши /прАлиганд

ДНК-фрагмент, съответствуващ на кодиращата област на човешкия /прАлиганДуСе получава чрез ПВР, пречиства се от гел и се бележи в присъствието на 32р.<здтр _и 32ρ.ς|ογρ Пробата се използува за скриниране на 10θ клона от миша чернодробна кДНК-библиотека в lambdaGTIO. Изолира се и се секвенира миши клон (фиг. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]), съдържащ инсерт от 1443 нуклеотидни двойки. Предполагаемият иницииращ кодон в нуклеотидна позиция 138-141 е в рамките на консенсусната последователност, улесняваща инициацията на еукариотната транслация (Kozak, М. J. Cell Biol., 108:229-241 [1989]). Тази последователност определя отворена рамка за четене от 1056 нуклеотида, която предсказва първичен транслационен продукт от 352 аминокиселини. Тази отворена рамка за четене се фланкира от 137 нуклеотида 5’и 247 нуклеотида 3'-нетранслираща се последователност. След 3'нетранслиращата се област няма поли(А)-опашка, което показва, че този клон вероятно не е пълен. N-краят на предсказаната аминокиселинна последователност е силно хидрофобен и вероятно представлява сигнален пептид. Компютърният анализ (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133:17-21 [1983]) посочва потенциално място за скъсване от сигнална пептидаза между остатъци 21 и 22. Скъсване в тази позиция би довело до получаването на зрял полипептид от 331 аминокиселини (35 кДа), идентифициран като тМ1_зз-| (или тМ1_2 за целите, описани по-долу). Последователността съдържа 4 цистеина, всички съхранени (консервативни) в човешката последователност и 7 потенциални места за Nгликозилиране, 5 от които са запазени в човешката последователност. Отново, както и при hML, вкички седем потенциални места за N-гликозилиране са локализирани в С-терминалната половина на белтъка.

При сравняване с човешкия ML в ЕРО-домените на тези ML се наблюдава значителна идентичност както в нуклеотидните, така и в изведените от тях аминокиселинни последователности. Когато обаче изведените аминокиселинни последователности на човешкия и мишия ML се наложат успоредно, изглежда че мишата последователност има тетрапептидна делеция между остатъци 111-114, съответствуваща на 12-нуклеотидната делеция след нуклеотидна позиция 618, наблюдавана както в човешката (виж по-горе), така и в свинската (виж по-долу) кДНК. В съгласие с това се изследват допълнителни клонове за откриване на възможни изоформи на мишия ML. Един клон кодира полипептид с изведена последователност от 335 аминокиселини, съдържащ липсващия тетрапептид LPLQ. Смята се, че тази форма представлява пълноразмерен миши ML и се означава като mML или mML335. Нуклеотидната и изведената аминокиселинна последователност на mML са дадени на фиг. 17 (SEQ ID NOS: 14 & 15). Този кДНК-клон се състои от 1443 нуклеотидни двойки, следвани от поли(А)-опашка. Той притежава отворена рамка за четене от 1068 нд, фланкирана от 134 бази 5'- и 241 бази 3'-нетранслиращи се последователности.

Предполагаемият иницииращ кодон се намира в нуклеотидна позиция 138-140. Отворената рамка за четене кодира прогнозен белтък от 356 аминокиселини, първите 21 от които са силно консервативни и вероятно функционират като секреторен сигнал.

Накрая, изолира се трети клон, секвенира се и се намира, че той съдържа 116-нуклеотидна делеция, съответствуваща на hML3. Поради това тази миша изоформа се означава mML3. Сравнението на изведените аминокиселинни последователности на тези две изоформи е показано на фиг. 18 (SEQ ID NOS: 9 &16).

Сумарната идентичност в аминокиселинните последователности на човешкия и мишия ML (фиг. 19 [SEQ ID NOS: 6 & 17]) е 72%, но тази хомология не е рзпределена равномерно. Областта, определена като ЕРО-домен (аминокиселини 1-153 за човешката последователност и 1-149 за мишата) са поконсервативни (86% хомология), отколкото карбокситерминалната област на белтъка (62% хомология). Това може да означава още, че само ЕРО-доменът е важен за биологичната активност на белтъка. Интересно е, че от двата дибазични аминокиселинни мотива, намерени в hML, в мишата последователност присъствува само дибазичният мотив, следващ непосредствено след ΈΡΟдомена (позиция на остатъци 153-154) в човешката последователност. Това се съгласува с възможността, пълноразмерният ML да представлява белтъчен предшественик, който претърпява ограничена протеолиза до получаване на зрелия лиганд. Като алтернатива протеолизата между Arg·] 53-Arg 154 може да улеснява клирънса на hML.

Експресионен вектор, съдържащ цялата кодираща последователност на mMLyCe трансфектира транзитно в 293-клетки, както е описано в Пример 1. Културални среди от тези клетки стимулират включването на ^Н-тимидин в Ba/F3клетки, експресиращи или миши или човешки mpl, но нямат ефект върху родителската (несъдържаща mpl) клетъчна линия. Това показва, че клонираната миша ML кДНК кодира функционален лиганд, който е способен да активира както миши, така и човешки ML-рецептор (mpl).

7&

11. Свински тр!-л иганд

Свинска ML (pML) кДНК се изолира чрез RACE-ПВР, както е описано в Пример 13. В бъбрека се открива ПВР-кДНК-продукт от 1342 нд е се субклонира. Секвенират се няколко клона и се намира, че те кодират свински /прАлиганд от 332 аминокиселинни остатъци, означен като pML (или PML332), имащ нуклеотидната и изведената от нея аминокиселинна последователност, показани на Фиг. 20 (SEQ ID NOS: 18 & 19).

Отново се идентифицира втора форма, означена pML2, кодираща белтък с делеция на 4 аминокиселинни остатъци (228 аминокиселинни остатъци) (виж фиг. 21 [SEQ ID NO: 21]. Сравняване на аминокиселинните последователности на pML и pML2 показва, че последната форма е същата, с изключение на това, че тетрапептидът QLPP, съответствуващ на остатъци 111-114 включително, е делетиран (виж Фиг. 22 [SEQ ID NOS: 18 & 21]). Делециите на четири аминокиселини, наблюдавани в мишата и свинската ML-кДНК, се появяват точно на едно и също място в прогнозираните белтъци.

Сравняването на предсказаните аминокиселинни последователности за ML от човек, мишка и прасе (фиг 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 & 18]) показва, че сумарната идентичност в последователностите е 72 процента между мишка и човек, 68 процента между мишка и прасе и 73 процента между прасе и човек. Хомологията е значително по-голяма в аминотерминалната половина на ML (ЕРОхомоложния домен). Този домен е 80 до 84 процента идентичен между всеки два вида, докато карбокситерминалната половина (въглехидратен домен) е само 57 до 67 процента идентична. Дибазичен аминокиселинен мотив, който би могъл да представлява място за протеазно скъсване, присъствува в карбоксилния край на еритропоетин-хомолжния домен. Този мотив в тази позиция е консервативен за трите вида (фиг. 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 & 18]). Второ дибазично място, присъствуващо в позиция 245 и 246 на човешката последователност, не присъствува в мишата или свинската последователности. Мишата и свинската ML-последователност съдържат 4 цистеина, всичките консервирани в човешката последователност. В мишия лиганд има седем потенциални места за N8ο гликозилиране и шест в свинския ML, 5 от които са консервирани в човешката последователност. Отново всички потенциални места за N-гликозилиране са локализирани в С-крайната половина на белтъка.

12. Експресия и пречистване на ТРО от яйчни клетки (СНО) на Китайски хамстер

Експресионните вектори, използувани за трансфекция на СНО-клетки, са означени: pSVl5.ID.LL.ML0RF (пълноразмерен ТРО) и pSVI5.ID.LL.MLEP0-D (скъсен или ТРО-|5з). По-важните особености на тези плазмиди са представени на фиг. 23 и фиг. 24.

Процедурите за трансфекция са описани в Пример 20. Накратко, кДНК, съответствуваща на цялата отворена рамка за четене на ТРО, се получава чрез ПВР. ПВР-продуктът се пречиства и клонира между две рестриктазни места (Clal и Sall) на плазмида pSVl5.ID.LL, за да се получи векторът pSVI5.ID.LL.ML0RF. По същия начин, но като се използуват други обратни праймери (EPOD.Sal), се получава втора конструкция, съответствуваща на ЕРО-хомоложния домен. Крайната конструкция на вектора, кодиращ ЕРО-хомоложния домен на ТРО, е наречена pSVI5.ID.LL.MLEP0-D.

Тези две конструкции се линеаризират с Notl и се трансфектират в яйчни клетки от Китайски хамстер (СН0-0Р12-клетки, Европейски патент 307 247, публикуван на 15 март 1989) чрез електропорация. 10⁷-клетки се електропорират в апарат за електропорация на BRL (350 Волта, 330 мкф, ниско капацитивно съпротивление) в присъствието на 10, 25 или 50 мг ДНК, както е описано (Andreason, G.L. J. Tissue Cult. Meth. 15,56 [1993]). В същия ден след трансфекцията клетките се разсяват в 0НЕВ(дихидрофолатредуктаза)селективна среда (DMEM-F12 50:50 с високо съдържание на глюкоза и без глицин, 2мМ глутамин, 2-5% диализиран фетален телешки серум). 10 до 15 дни по-късно в 96-ямкови платета се прехвърлят индивидуални колонии и се оставят да растат до постигане на конфлуентност. Експресията на ML153 или ML332 в културалните r л. ϊ βΐ среди на тези клонове се тестира, като се използува Ba/F3-mpA пролиферационният тест (описан в Пример I).

Процесът за пречистване и изолиране на ТРО от събраната СНОклетъчнокултурална течност е описан в Пример 20. Накратко, събраната клетъчнокултурална течност (HCCF) се нанася на колона Blue-Sepharose (Pharmacia) при отношение приблизително 100 л HCCF на литър смола. След това колоната се промива с 3 до 5 обема на колоната буфер, следван от 3 до 5 обема на колоната буфер, съдържащ 2,0 М урея. След това ТРО се елуира с 3 до 5 обема на колоната буфер, съдържащ 2,0 М урея и 1,0 М NaCI.

Обединеният елуат след Blue-Sepharose, съдържащ ТРО, след това се нанася на сефарозна колона с прикачен лектин от зародиш на пшеница (Wheat Germ Lectin Sehparose [Pharmacia]), уравновесена c буфера за елуиране на BlueSepharose-колоната при отношение от 8 до 16 мл елуат от Blue-Sepharoseколоната на литър смола. След това колоната се промива с 2 до 3 обема на колоната уравновесяващ буфер. ТРО след това се елуира с 2 до 5 обема на колоната буфер, съдържащ 2,0 М урея и 0,5 М N-ацетил-О-глюкозамин.

Елуатът от втората колона (Wheat Germ Lectin), съдържащ ТРО, след това се подкислява и се добавя Ο-^Εθ Д° крайна концентрация 0,04%. Получената проба се нанася на С4-обратнофазова колона, уравнфсена с 0,1% TFA и 0,04% С12Е8 като се натоварват на приблизително 0,2 до 0,5 мг белтък на мл смола.

Белтъкът се елуира чрез двуфазен линеен градиент на ацетонитрил, съдържащ 0,1% TFA и 0,04% С-|2Ез,и елуираните проби се обединяват на базата /

на SDS-PAGE.

Обединената проба след С4-колоната след това се разрежда и се диафилтрува срещу приблизително 6 обема буфер върху мембрана за ултрафилтрация Amicon YM или подобна на нея с отрязък 10 до 30 Далтона молекулно тегло. Полученият диафилтрат може след това директно да се обработва или да се концентрира допълнително чрез ултрафилтрация.

Диафилтрата/концентрата обикновено се довежда до крайна концентрация 0,01% Tween-80.

Целият или част от диафилтрата/концентрата, еквивалентен на 2 до 5% от изчисления обем на колоната, след това се нанася на колона Sephacryl S-300 HR (Pharmacia), уравновесена с буфер, съдържащ 0,01% Tween 80 и се провежда хроматография. Фракциите, съдържащи ТРО, в които няма агрегати и продукти от протеолитично разграждане, след това се обединяват на базата на SDS-PAGE. Обединените проби се филтруват и се съхраняват на 2-ff С.

13. Методи за трансформация и индукция на ТРО-синтеза в микроорганизъм и изолиране, пречистване и пренагъване на така получения ТРО

Конструирането на вектори за експресия на ТРО в Е coli е описано подробно в Пример 21. Накратко, всички плазмиди рМР21, рМР151, рМР41, рМР57 и рМР202 са проектирани за експресия на първите 155 аминокиселини на ТРО след малък лидер, който варира в различните конструкции. Лидерите съдействуват предимно за високи нива на инициация на транслацията и за бързо пречистване. Плазмидите рМР210-1, -Т8, -21, -22. -24, -25 са проектирани за експресия на първите 153 аминокиселини на ТРО след иницииращ метионин и се различават само по използуването на кодоните за първите 6 аминокиселини на ТРО, докато плазмидът рМР251 е производен на рМР210-1, в който карбокситерминалният край на ТРО е удължен с две аминокиселини. Всички горни плазмиди ще продуцират високи нива на вътреклетъчна експресия на ТРО в Е. соНскед индукция на триптофановия промотор (Yansura, D. G. etal., Methods in Enzymology (Goeddel, D. V., Ed.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Плазмидите pMP1 и pMP172 са междинни в конструирането на горните плазмиди за вътреклетъчна експресия на ТРО.

8b

Горните плазмиди за експресия на ТРО се използуват за трансформация на £ coli като се използува методът с СаС12 и топлинен шок (Mandel, М. et al., J. Mol. Biol., 53:159-162, [1970] и други процедури, описани в Пример 21. Накратко, трансформираните клетки се култивират първо на 37 С? докато оптичната плътност (600 нм) на културата достигне приблизително 2-3. Културата след това се разрежда и след растеж при аерация се добавя киселина. След това културата се оставя да продължи да расте при аерация още 15 часа, след което време клетките се събират чрез центрофугиране.

Процедурите за изолиране, пречистване и пренагъване, дадени по-долу за подаване на биологично активен, нативен човешки ТРО или на фрагменти от него, са описани в Примери 22 и 23 и могат да се приложат за получаването на всякакъв вариант на ТРО, включително на N- и С-крайно удължените форми. Други процедури, подходящи за пренагъване на рекомбинантен или синтетичен ТРО, могат да се намерят в следните патенти: Builder etal., патент на САЩ 4 511 502; Jones et al., патент на САЩ 4 512 922; Olson, патент на САЩ 4 518 526 и Builder et al., патент на САЩ 4 620 948; за основно описание на процеса за получаване и пренагъване на различни рекомбинантни белтъци, експресирани в неразтворима форма в Е. coli.

А. Получаване на неразтворим ТРО

Микроорганизъм, такъв като Е. coli, експресиращ ТРО, кодиран от който и да е подходящ плазмид, се ферментира при условия, при които ТРО се складира в неразтворими твърди телца”. Възможно е клетките най-напред да се промият с буфер за клетъчно разрушаване. Обикновено около 100 г клетки се ресуспендират в около 10 обема буфер за разрушаване на клетките (напр. 10 мМ Tris, 5 мМ EDTA, pH 8) например с хомогенизатор Polytron и клетките се центрофугират на 5000 х g за 30 минути. След това клетките се лизират^като се използува която и да е конвенционална техника, като тоничен шок, озвучаване, циклиращо налягане, химични или ензимни методи. Например, промитата по-горе утайка може да се ресуспендира в други 10 обема буфер за разрушаване на клетките с хомогенизатор и клетъчната суспезия да се прекара през апарат за

8Α клетъчно разрушаване LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Inc) или през Microfluidizer (Microfluidics International), съгласно инструкциите на производителя. Материалът от частички, съдържащ ТРО, след това се разделя от течната фаза и по желание се промива с каквато и да е подходяща течност. Например, суспензия от клетъчен лизат може да се центрофугира на 5000 х g за 30 минути, да се ресуспендира и да се центрофугира втори път, за да се получи промита утайка от твърди телца. Промитата утайка може непосредствено да се използува или по желание да се съхранява замразена (напр. на -70°С).

В. Разтваряне и пречистване на мономерен ТРО

Неразтворимият ТРО в утайката от твърди телца след това се разтваря с разтварящ буфер. Разтварящият буфер съдържа хаотропно средство^обикновено се буферира до базично pH и съдържа редуциращасредствоза да се повиши добивът а ' от мономерен ТРО. Представителните хаотропни агенти включват урея, гуанидинHCI и натриев тиоцианат. Предпочитан хаотропен агент е гуанидин-НС1. Концентрацията на хаотропен агент обикновено е 4-9 М, за предпочитане 6-8 М. pH на разтварящия буфер се поддържа от всеки подходящ буфер в pH-граници от около 7,5-9,5, като се предпочитат 8.0-9,0 и най-много се предпочита 8,0. Предпочита се също разтварящият буфер да съдържа още редуциращ агент, който да подпомогне образуването на мономерната форма на ТРО. Подходящите редуциращи агенти включват органични съединения, съдържащи свободна тиолова група (RSH). Представителните редуциращи средства включват дитиотреитол (DTT), дитиоеритритол (DTE), меркаптоетанол, глутатион (GSH), цистеамин и цистеин. Предпочетено редуциращосредствоз©дитиотреитол (DTT). Възможно е разтварящият буфер да съдържа мек окисляващо средство (напр. молекулен кислород) и сулфитна сол за формиране на мономерен ТРО посредством сулфитолиза. В това приложение получаващият се TPO-S-сулфонат по-късно се пренагъва (ренатурира) в присъствието на редокс-буфер (напр., GSH/GSSG), за да се получи правилно нагънат ТРО.

ТРО-белтъкът обикновено се пречиства допълнително? като се използуват, например, центрофугиране, гел-филтрационна хроматография и обратнофазова колонна хроматография.

За илюстрация, следната процедура дава задоволителни добиви от мономерен ТРО. Утайката от твърдите телца се ресуспендира в около 5 обема (по отношение на нейното тегло) разтварящ буфер (20 мМ Tris, pH 8, с 6-8 М о гуанидин и 25 мМ DTT) и се разбърква 1-3 часа или през нощта на 4? С, за да се постигне разтваряне на ТРО-белтъка. Приложими са също и високи концентрации урея (6-8М), но като цяло това води до малко по-ниски добиви в сравнение с гуанидина. След разтварянето разтворът се центрофугира на 30 000 х g за 30 мин до получаване на бистра надстояща течност, съдържаща денатуриран, мономерен ТРО-белтък. Надстоящата течност след това се подлага на хроматография върху гел-филтрационна колона Sephadex 200 (Pharmacia, 2,6 х 60 см) при проточна скорост 2 мл/мин и белтъкът се елуира с 20 мМ натриев фосфат, pH 6,0 с 10 мМ DTT. Фракциите, съдържащи мономерен, денатуриран ТРО-белтък, който се елуира между 160 и 200 мл, се обединяват. ТРО-белтъкът по-нататък се пречиства на полупрепаративна С4-обратнофазова колона (2 х 20 см VYDAC). Пробата се нанася при 5 мл/мин на колона, уравновесена с 0,1% TFA (трифлуороцетна киселина) с 30% ацетонитрил. Белтъкът се елуира с линеен градиент на ацетонитрил (30-60% за 60 мин.). Пречистеният редуциран белтък се елуира с приблизително 50% ацетонитрил. Този материал се използува за пренагъване, за да се получи биологично активен вариант на ТРО.

С. Пренагъване (ренатурация) на ТРО за получаване на биологично активна форма

След разтваряне и допълнително пречистване на ТРО биологично активната форма се получава чрез пренагъване на денатурирания мономерен ТРО в редокс-буфер. Поради високата активност на ТРО (половината от максималната стимулация в Ва/БЗ-теста се постига при приблизително 3 Пг/ма), е възможно да се получи биологично активна форма^като се използуват много различни буферни, детергентни и редокс условия. При повечето от условията обаче се получава само малко количество правилно нагънат материал (<10%). При промишлени производствени условия е желателно да се постигне добив от пренагъването най-малко 10%, по-предпочитани са 30-50% и най-много се предпочитат >50%. Намерено е, че най-различни детергенти, включващи Triton X100, додецил-бета-малтозид, CHAPS, CHAPSO, SDS, саркозил, Tween 20 и Tween 80, Zwittergent 3-14 и други, са подходящи за получаване на поне известно количество правилно нагънат материал. От тях обаче най-предпочитани детергенти са тези от CHAPS-фамилията (CHAPS и CHAPSO), за които е намерено, че най-добре работят в реакцията по пренагъване като ограничават агрегацията и неправилното образуване на дисулфид. Най-много се предпочитат нива на CHAPS, по-големи от около 1%. За най-високите добиви се изисква натриев хлорид с оптимални нива между 0,1 М и 5,0 М. Присъствието на EDTA (1-5 мМ) в редокс-буфера се предпочита, за да се ограничи количеството на металкатализираното окисление (и агрегация), което се наблюдава при някои препарати. Оптимални условия за пренагъване създават глицеролни концентрации, по-високи от 15%. За максимални добиви е съществено да се разположа с редокс-двойки в редокс-буфера, състоящи се както от окислен, така и от редуциран тиол (RSH). Подходящите редокс-двойки включват меркаптоетанол, глутатион (GSH), цистеамин, цистин и техните съответни окислени форми. Предпочетените редокс-двойки са: глутатион(6вН):окислен ™yTaTHOH(GSSG) или цистеин: цистин. Най-предпочетената редокс-двойка е глутатион(68Н):окислен глутатион (ГССГ). Като цяло по-високи нива се получават, когато молното отношение на окисления член на редокс-двойката е равно или в излишък спрямо редуцирания член на редокс-двойката. рН-стойности между 7,5 и около 9 са оптимални за пренагъване на тези ТРО-варианти. Толерират се органични разтворители (напр. етанол, ацетонитрил, метанол) в концентрации 10-15% или по-ниски. По-високи нива на органичните разтворители повишават количеството на неправилно нагънати форми. Използуват се основно

Трие и фосфатни буфери. Инкубиране на 4°С също дава по-високи нива на правилно нагънат ТРО.

За препарати на ТРО, пречистени чрез първата С4-стъпка^са типични добиви от пренагъването 40-60% (на основата на редуцирания и денатуриран ТРО, използуван в реакцията за пренагъване). Активен материал може да се получи и когато се използуват по-малко чисти препарати (напр. директно след колона Sephadex 200 или след първоначалната екстракция на твърдите телца), въпреки че добивите са по-ниски в резултат на засилена преципитация и взаимодействие на н&-ТРО-белтъците п^време на процеса на пренагъване на ТРО.

Тъй като ТРО съдържа 4 цистеина^е възможно да се получат три различни дисулфидни версии на този белтък:

версия 1: дисулфиди между цистеинови остатъци 1-4 и 2-3 версия 2: дисулфиди между цистеинови остатъци 1-2 и 3-4 версия 3: дисулфиди между цистеинови остатъци 1-3 и 2-4.

Пс^реме на началното изследване за определяне условията на пренагъване, чрез С4-обратнофазова хроматография се разделят няколко различни пика, съдържащи ТРО-белтъка. Само един от тези пикове има значителна биологична активност, което се определя като се използува Ba/F3теста. Впоследствие условията на пренагъвф се оптимизират с оглед получаването предимно на тази форма. При тези условия погрешно нагънатите версии са по-малко от 10-20% от тоталния мономерен ТРО, получен в стъпката на разтваряне.

Чрез масспектрометрия и белтъчно секвениране дисулфидният профил на биологично активния ТРО се определя като 1-4 и 2-3, където цистеините се номерират последователно от аминокрая. Този профил на кръстосано свързване на цистеините се съгласува с известния профил на дисулфидно свързване в родствената молекула еритропоетин.

D. Биологична активност на рекомбинантния, пренагънат ТРО r

л.

Пренагънатият и пречистен ТРО показва активност в тестове, както in vitro, така и in vivo. Например, в Ва/ТЗ-теста половината от максималната стимулация на включването на тимидин в Ва/РЗ-клетките за ТРО (Met'¹ 1-153) се постига при 3,3 пг/мл (0,3 пМ). В ELISA на основата на mpl-рецептора, половината от максималната активност се получава при 1,9 нг/мл (120 пМ). В нормални и миелосупресирани животни, получени след Х-облъчване, близко до леталното, пренагънатият ТРО (Met'¹1-153) активно (активност се наблюдава при ниски дози, равняващи се на 30 нг/мишка) стимулира образуването на нови тромбоцити. Подобна биологична активност се наблюдава и за други форми на ТРО, пренагънати в съгласие с гореописаните процедури (виж фигури 25, 26 и 28).

Методи за измерване на тромбопоетичната активност

Тромбопоетичната активност може да се измери с различни тестове, влючващи Ва/РЗ-/прАлигандния тест, описан в Пример 1, in vivo тест на рикошираща синтеза в миши тромбоцити, тест за индукция на тромбоцитен повърхностен антиген, като напр. измерването, което се прави за човешката левкемична мегакариобластна клетъчна линия (СМК) чрез антитромбоцитен имунотест (анти-GPIIbllla) (виж Sato eta/., Brit. J. Heamatoi., 72:184-190(1989]) (виж също теста за мегакариоцитопоеза в течна суспензия, описан в Пример 4) и индуцирането на полиплоидизация в мегакариобластна клетъчна линия (DAMI) (виж Ogura et al., Blood, 72(1):49-60 [1988]). Зреенето на мегакариоцитите от незрели, почти несинтезиращи ДНК клетки, до морфологично различими мегакариоцити включва процес, който се изразява в появата на цитоплазмени органели, придобиването на мембранни антигени (GPIIbllla)- ендорепликация и освобождаване на тромбоцити, както е описано в ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА. Очаква се, че родословно специфичен стимулатор (т.е щоАлигандът) на мегакариоцитното зреене би индуцирал поне някои от тези изменения в мегакариоцитите, водещи до освобождаването на тромбоцити и облекчение на тромбоцитопенията. Ето защо тестовете са насочени към измерване появата на тези параметри в незрели мегакариоцитни клетъчни линии,

т. е. СМК-и DAMI-клетки. СМК-тестът (Пример 4 ) измерва появата на специфичен тромбоцитен маркер, GPIIblll_a, и тромбоцитното излъчване. DAMIтестът (Пример 15) измерва ендорепликацията, тъй като нарастванията на плоидността са маркери за зрелите мегакариоцити. Различимите мегакариоцити имат стойности за плоидността 2N, 4N, 8N, 16N, 32N и т.н. Най-накрая, in vivo тестът по рикошет на тромбоцити в мишка (Пример 16) е полезен за демонстриране на факта, че въвеждането на тестовото съединение (тук mplлиганда) води до повишаване броя на тромбоцитите).

Разработени са и два допълнителни in vitro теста за измерване на ТРОактивността. Първият е ELISA с активиране на киназния рецептор (KIRA), при което СНО-клетки се трансфектират с химерата mpARse и чрез ELISA се измерва тирозиновото фосфорилиране на Rse след взаимодействие на трАчастта от химерата с трАлиганд (виж Пример 17). вторият тест представлява ELISA на основата на рецептор, в който ELISA-платето с адсорбиран заешки античовешки IgG улавя човешки химерен рецептор mpAIgG, който свързва трАлиганда, предмет на тестирането. За детекция на свързания трАлиганд се използува биотинилирано заешко поликлонално антитяло срещу трАлиганда (ТРО-|55), като' измерването се извършва чрез използуване на стрептавидин-пероксидаза, както е описано в Пример 18.

15. Биологичен отговор In vivo на нормални и сублетално облъчени мишки, третирани сТРО

Нормални и сублетално облъчени мишки се третират със скъсен и пълноразмерен ТРО, изолиран от яйчни клетки на Китайски хамстер (СНО), Е. coli и човешки клетки от ембрионален бъбрек (293). И двете форми на ТРО, произведени в тези три гостоприемника, стимулират образуването на тромбоцити в мишки, но пълноразмерният ТРО, изолиран от СНО, изглежда предизвиква най-силен отговор in vivo. Тези резултати показват, че за максимална активност in vivo може би е необходимо правилно гликозилиране на карбокситерминалния домен.

(a) E. co/ArhTPO(Met‘¹,153)

МеГ-формата на ЕРО-домена (Met в позиция -1 плюс първите 153 остатъци от човешкия ТРО), произведена в Е. coii (виж Пример 23) се инжектира ежедневно в нормални женски С57 Вб-мишки, както е описано в легендите към Фигури 25А, 25В и 25С. Тези фигури показват, че негликозилираната скъсена форма на ТРО, синтезирана в Е. coli и пренагъната, както е описано по-горе, е в състояние да стимулира приблизително двукратно повишаване на образуването на тромбоцити в нормални мишки, без да засяга популацията от червени и бели кръвни клетки.

Същата молекула, инжектирана ежедневно в сублетално облъчени (¹³⁷Cs) женски С57 Вб-мишки, както е описано в легендите към фигури 26А, 26В и 26С, стимулира възстановяването на тромбоцитите и намалява тяхната деструкция, но няма ефект върху еритроцитите и левкоцитите.

(b) CHO-rhTPO332

Пълноразмерната форма на ТРО, произведена в СНО и инжектирана ежедневно в нормални женски С57 В6 -мишки, както е описано в легендите към Фигури 27А, 27В и 27С, предизвиква около петкратно повишаване на образуването на тромбоцити в нормални мишки, без да засяга популацията от еритроцити и левкоцити.

(c) CHO-rhTPO33₂; Е. соН-гЬТРО(МеН, 153); 293-гЬТРОзз₂ и Е. coil· rhTPOi55

Построяват се кривите на зависимостта доза/отговор за третирането на нормални мишки с rhTPO от различни клетъчни линии (СНО-ФТРОзз2; Е. co!irhTPO(Met'‘^l, 153); 293-ФТРОзз2 и Е. co/ArhTPOjss), както е описано в легендата към фиг. 28. Тази фигура показва, че всички тестирани форми на молекулата стимулират тромбоцитното образуване, но пълноразмерната форма, произведена в СНО, има висока активност in vivo.

(d) CHO-rhTPO₁₅₃, CHO-rhTPO-кьс и СНО-гбТРОззг

Криви на зависимостта доза/отговор се построяват също и за третирането на нормални мишки с различни форми на rhTPO, произведени в СНО ί

r ъ (CHO-rhTPO-|53> CHO-rhTPO_KbC'' и CHO-rhTPO^^, както е описано в легендата към фиг. 29. Тази фигура показва, че всички тестирани СНО-форми на молекулата стимулират тромбоцитното образуване, но че пълноразмерната форма от 70 кДа има най-голяма активност in vivo.

16. Основи на рекомбинантното получаване на тр/-лиганд и варианти

Предпочита се трАлигандът да се получи чрез стандартните рекомбинантни процедури, които включват продукция на /прАлигандния полипептид чрез култивиране на клетки, трансфектирани така, че да експресират шрАлигандна нуклеинова киселина (обикновено чрез трансформиране на клетките с експресионен вектор) и изолиране на полипептида от клетките. Визира се обаче и възможността трАлигандът да се получи чрез хомоложна рекомбинация или чрез рекомбинантни методи, ползуващи контролни елементи, които се въвеждат в клетки, които вече съдържат ДНК, кодираща трАлиганда. Например, в генома на целевата клетка-гостоприемник на подходящо растояние и в подходяща ориентация, така че да повлияват транскрипцията на ДНК, кодираща желания /прАлиганден полипептид, могат да се включат мощен промотор/инхансърен елемент, супресор или екзогенен елемент за модулиране на транскрипцията. Контролният елемент не кодира трАлиганда, по-скоро ДНК е ендогенна (собствена) за генома на клетката-гостоприемник. След това се скринира за клетки, синтезиращи рецепторния полипептид на това изобретение, за повишени или понижени нива на експресия в зависимост от желанието.

И така, изобретението предвижда метод за получаване на /прАлиганд, обхващащ включване в генома на клетка, съдържаща трАлигандна молекула нуклеинова киселина, на транскрипционен модулаторен елемент в достатъчна близост и ориентация по отношение на молекулата нуклеинова киселина, за да въздействува върху нейната транскрипция. Възможна е и следваща стъпка, включваща култивиране на клетката, съдържаща транскрипционния модулаторен елемент и молекулата нуклеинова киселина. Изобретението пердвижда също

32.

клетка-гостоприемник, съдържаща ендогенна трАлигандна молекула нуклеинова киселина, оперативно свързана с екзогенни контролни последователности, които се разпознават от клетката-гостоприемник.

А. Изолиране на ДНК, кодираща mpl-лиганден полипептид

ДНК, кодираща трАлиганден полипептид, може да се получи от всяка кДНК-библиотека, приготвена от тъкан, за която се смята, че притежава трА лигандна мРНК и че я експресира до забележимо ниво. Л4рАлигандният ген може също да се получи от геномна ДНК-библиотека или чрез олигонуклеотидна синтеза in vitro на базата на пълната нуклеотидна или аминокиселинна последователност.

Библиотеките се скринират със сонди, предназначени за идентефикация на гена, представляващ интерес или на белтъка, който той кодира. Подходящите сонди за кДНК-експресионни библиотеки включват моноклонални или поликлонални антитела, които разпознават и свързват специфично трАлиганда. Подходящите сонди за кДНК-библиотека включват олигонуклеотиди с дължина от около 20-80 бази, които кодират известна или предполагаема част от /прАлигандната кДНК от същия или друг вид; и/или комплементарна или хомоложна кДНК или фрагменти от нея, които кодирата същия или подобен ген. Съответните сонда за скриниране на геномни ДНКбиблиотеки включват, но не се ограничават само до, олигонуклетоиди, кДНК или фрагменти от нея, които кодират същия или друг ген и/или хомоложна геномна ДНК или фрагменти от нея. Скринирането на кДНК-библиотеката или на геномната библиотека с избраната сонда може да се проведе,като се използуват стандартните процедури, както е описано в Глави 10-12 на Sambrook et а/., погоре.

Алтернативен начин за изолиране на гена, кодиращ трАлиганд, представлява изолзуването на ПВР-методологията, както е описано в Раздел 14 на Sambrook et al., по-горе. Този метод изисква използуването на олигонуклеотидни проби, които ще хибридизират с ДНК, кодираща трАлиганда.

Стратегиите за избор на олигонуклеотиди са описани по-долу.

Предпочетен метод за практическо приложение на това изобретение представлява използуването на внимателно подбрани олигонуклеотидни последователности за скриниране на кДНК-библиотеки от различни тъкани, за предпочитане човешки или свински бъбречни (от фетален бъбрек или бъбрек на взърастен) или чернодробни клетъчни линии. Например, кДНК библиотеки от клетъчна линия на човешки фетален черен дроб се скринират с ологонуклеотидните сонди. Като алтернатива с олигонуклеотидните сонди могат да се скринират човешки геномни библиотеки.

Олигонуклеотидните последователности, избрани като проби, би трябвало да са с достатъчна дължина и достатъчно еднозначни, така че да се сведат до минимум фалшивоположителните сигнали. Работната нуклеотидна последователност(и) обикновено се избира на основата на области на тр/лиганда с най-малка изроденост на кода. Олигонуклеотидите могат да са дегенерирали (изродени) в една или повече позиции. Използуването на дегенерирали олигонуклеотиди е от особена важност в слчая, когато се скринира библиотека от вид, за който не е известно кои кодони се използуват преимуществено.

_z Олигонуклеотидът трябва са бъде белязан, така че да може да се установи след хибридизация с ДНК в библиотеката, която се скринира. Предпочетеният метод за бележене е използуването на АТР (напр. гама^2р) _{и на} полинуклеотидкиназа за радиоактивно бележене 5'-края на олигонуклеотида. Могат обаче да се използуват и други методи за бележене на олигонуклеотида, които включват, но не се ограничават само до, биотинилиране или ензимно бележене.

Определен интерес представлява трАлигандна нуклеинова киселина, която кодира пълноразмерен щоАлиганден полипептид. В някои предпочетени приложения нуклеотидната последователност включва сигналната последователност на нативния /прАлиганд. Нуклеинова киселина, която има цялата белтък-кодираща последователност, се получава чрез скриниране на избрани кДНК- или геномни библиотеки като се използува изведената аминокиселинна последователност.

В. Варианти на нативния mpl-лиганд по аминокиселинна последователност

Варианти на трАлиганда по аминокиселинна последователност се приготвят чрез въвеждане на съответни нуклеотидни изменения в /прАлигандната ДНК или чрез in vitro синтеза на желания /прАлиганден полипептид. Такива варианти например включват делеции, инсерции или субституции на остатъци в аминокиселинната последователност на свинския /прАлиганд. Например, карбокситерминалната част на зрелия пълноразмерен трАлиганд може да бъде отстранена чрез протеолитчно скъсване in vivo или in vitro, или чрез клониране и експресия на фрагмент или на ДНК, кодираща пълноразмерния трАлиганд за получаване на биологично активен вариант. Прави се всяка комбинация от делеция, инсерция или субституция (заместване) за постигне на крайната конструкция при условие, че крайната конструкция притежава желаната биологична активност. Аминокиселинните изменения могат също такда да променят посттранслационни процеси на /прАлиганда, такива като промяна в броя или мястото на местата за гликозилиране. При дизайна на варианти на mpl· лиганда по аминокиселинна последователност локализацията на мутационното място и природата на мутацията ще зависят от /прАлигандната характеристика(и), която трябва да се модифицира. Местата за мутиране могат да се модифицират индивидуално или в серия, напр. чрез (1) избор най-напред на консервативни киселини за субституция и след това по-радикални селекции в зависимост от постигнатите резултати, (2) делетиране на прицелния остатък или (3) исерция (включване) на остатъци от същия или друг клас в съседство с локализираното място, или комбинации от опции 1-3.

Методът, който се използува за идентифициране на определени остатъци или области на трАлигандния полипептид, които са предпочетени места за мутагенеза, се нарича мутагенеза чрез аланиново сканиране, както е описано от Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 [1989]. По същество, идентифицират се остатък или група от прицелни остатъци (напр. заредени остатъци, такива като arg, asp, his, lys и glu) и се заместват с която и да е, но се предпочитат неутрална или отрицатено заредена аминокиселина (найпредпочичани са аланина или полиаланина), за да се въздействува върху взаимодействието на аминокиселините с обкръжаващата ги водна среда във или извън клетката. Тези домени, които демонстрират функционална чувствителност към субституциите, след това се усъвършенствуват чрез въвеждане на допълнителни или други варианти в местата на субституция. И така, докато мястото за въвеждане на вариация в аминокиселинната последователност е предварително детерминирано, то природата на мутацията perse не се налага да се определя предварително. Например, за оптимизиране въвеждането на мутация на дадено място се извършва аланиново сканиране или случайна мутагенеза на прицелния кодон или област и експресираните щрАлигандни варианти се скринират за оптималната комбинация на желаната активност.

Съществуват две принципни променливи при конструирането на варианти в аминокиселинната последователност: локализацията на мутационното място и природата на мутацията. Например, варианти на трА лигандния полипептид включват варианти на /прАлигандната последователност и могат да представляват природно съществуващи алели (които няма да изискват манимпулация на /ирАлигандната ДНК) или предетерминирани мутантни форми, които се правят чрез мутиране на ДНК, за да се получи алел или несрещащ се в природата вариант. Като цяло изборът на локализация и природа на мутацията ще зависи от /прАлигандната характеристика, която ще се модифицира.

Делециите в аминокиселинната последователност като правило обхващат от около 1 до 30 остатъци като повече се предпочитат около 1 до 10 остатъци, които обикновено са последователни (съседни). Като алтернатива делециите в аминокиселинната последователност на трАлиганда могат да включват част от, или целия карбокситерминален гликопротеинов домен. Делециите в аминокиселинната последователност могат също така да включват един или повече от първите 6 аминотерминални остатъци на зрелия белтък.

Възможните делеции в аминокиселинната последователност включват един или повече остатъци в една или повече от областите под формата на бримка, които съществуват между спиралните възли”. Съседните делеции обикновено се правят на четен брой остатъци, но не се изключват делециите на единични или нечетен брой остатъци. Делециите могат да се въведат в области с ниска хомология между /прАлигандите, на които се дължи най-голямата секвенционна идентичност, за да се модифицира активността на трАлиганда. Или делеции могат да се въведат в области с ниска хомология между човешкия трАлиганд и други бозайнишки /прАлигандни полипептиди, които области имат най-гоялм дял за секвенционната идентичност на човешкия /прАлиганд. Делециите в бозайнишки /ярАлиганден полипептид на области, имащи съществена хомология с други бозайнишки /прАлиганди, вероятно ще модифицира по-значително биологичната активност на /прАлиганда. Броят на последователните делеции се подбира така, че да се запази третичната структура на трАлигандите в засегнатия домен, напр., бета-нагънат слой или алфа спирала.

Инсерциите в аминокиселинната последователност включват аминои/или карбокситерминални сливания, които на дължина обхващат от един остатък до полипептиди, съдържащи стотици или повече остатъци, както и инсерции на единични или множествени аминокиселинни остатъци вътре в последователността (интрасеквенционни инсерции). Интрасеквенционните инсерции (т.е. инсерции в зрялата /прАлигандна последователност) могат да обхващат най-общо от около 1 до 10 остатъка, повече се предпочитат 1 до 5 и най-много се предпочитат 1 до 3. Изключително предпочитано сливане е това на /прАлиганд или негов фрагмент с друг цитокин или фрагмент от него. Примерите за терминални инсерции включват зрял трАлиганд с N-краен метионинов остатък, артефакт от директната експресия на зрелия трАлиганд в рекомбинантна клетъчна култура и сливане на хетероложна N-крайна сигнална последователност с N-края на зрялата /прАлигандна молекула за улесняване секрецията на зрелия /прАлиганд от рекомбинантния гостоприемник. Такива сигнални последователности като правило се получават от, и затова са хомоложни на целевия вид, от който са гостоприемните клетки. Подходящите последователности включват ST1I или 1рр за Е coli, алфа-фактор за дрожди и вирусни сигнали, такива като херпесния gD за бозайнишки клетки.

Други инсерционни варианти на /77рАлиганднта молекула включват сливане към N- или С-края на /прАлиганда на имуниогенни полипептиди (т.е. неендогенни за гостоприемника, в който се въвежда сливането), напр. бактериални полипептиди, такива като бета-лактамазата или ензим, кодиран от Е coli trp-локуса, или дрожден белтък, както и С-терминални сливания с белтъци, имащи дълъг полуживот, такива като имуноглобулинови константни области (или други имуноглобулинови области), албумин или феритин, както е описано във WO 89/02922, публикуван на 6 април 1989.

Трета група варианти са вариантите с аминокиселинни субституции. Тези варианти имат най-малко един аминокиселинен остатък, отстранен от mpl· лигандната молекула и друг остатък включен на негово място. Местата от найголям интерес за субституционалната мутагенеза включват места, идентифицирани като активното място(а) на /лрАлиганда и места, в които аминокиселините, намерени в други аналози, са съществено различни в смисъл на обем на страничните вериги, товар или хидрофобност. Но в тези места съществува също и голяма степен на секвенционна идентичност на избраното място в щрАлигандите от различни видове и/или в различните животински аналози на един /прАлиганден член.

Други места, представляващи интерес са тези, в които определени остатъци на /прАлиганда, получен от различни фамилни членове и/или животински видове в рамките на един член, са идентични. Тези места, по-специално тези, попадащи в последователност на най-малко три други индентично консервирани места, се заместват по относително консервативен начин. Такива консервативни субституции са показани в Таблица 3 под заглавието предпочетени субституции. Ако такива субституции имат за резултат промяна в биологичната активност, тогава се въвеждат по-съществени изменения, отбелязани като примерни

9В субституции в Таблица 3, или както е описано по-долу по отношение на аминокиселинните класове.

ТАБЛИЦА 3

Оригинален Примерна Предпочетена остатък Субституция Субституция

Ala (A)	Vai; Leu lie	Vai
Arg (R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn (N)	Gin; His; Lys; Arg	Gin
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg
He (1)	Leu; Vai; Met; Ala; Phe; норлевцин	Leu
Leu (L)	норлевцин; lie; Vai; Met; Ala; Phe	lie
Lys (K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; lie	Leu
Phe (F)	Leu; Vai; lie; Ala	Leu
Pro (P)	Gly	Gly
Ser (S)	Thr	Thr
Trp (W)	Tyr	Tyr
Tyr(Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Vai (V)	lie; Leu; Met; Phe; Ala; норлевцин	Leu

Съществени модификации на функцията и имунологичната идентичност на /прАлиганда се осъществяват чрез селекцията на субституции, които значително се различават по своя ефект върху поддържане (а) структурата на полипептидния гръбнак в областта на субституцията, (Ь) заряда или хидрофобността на молекулата в прицелното място или (с) обема на страничната верига. Срещащите се в природата остатъци са разделени на групи на основата на общи свойства на страничните вериги:

(1) хидрофобни: норлевцин, Met, Ala, Vai, Leu, lie;

(2) неутрални хидрофилни: Cys, Ser, Thr;

(3) кисели: Asp, Glu;

(4) базични (основни): Asn, Gin, His, Lys, Arg;

(5) остатъци, които влияят върху ориентацията на веригата: Gly,

Pro; и (6) ароматни: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативните субституции ще включват смяната на член на един от тези класове с друг. Такива заместени остатъци могат също така да се въведат в консервативните субституционни места или с по-голямо предпочитание в останалите (неконсервативни) места.

В едно приложение на изобретението е желателно да се инактивира едно или повече от местата за протезно скъсване, присъствуващи в молекулата. Тези места се идентифицират _? като кодираната аминокиселинна последователност се проверява в случая на трипсин например за аргининов или лизинов остатък. Когато местата за протеазно скъсване се идентифицират, те се превръщата в неактивни чрез заместване на целевия остатък с друг остатък, за предпочитане базичен остатък, такъв като глутамин или хидрофобен остагтък, такъв като серин; чрез делеция на нуклеотида; или чрез инсерция на пролилов остатък непесредствено след остатъка.

В друго приложение, всеки метионилов остатък, различен от стартовия метионилов остатък на сигналната последователност, или всеки остатък₁ локализиран в рамките на около три остатъка N- или С-терминално на всеки такъв метионилов остатък, се замества с друг остатък (за предпочитане в съгласие с Таблица 3) или се делетира. Като алтернатива около 1-3 остатъка се включват в съседство с такива места.

Всеки цистеинов остатък, който не е въвлечен в поддържането на правилната конформация на трАлиганда? също може да се замени, главно със серин, за да се подобри стабилността на молекулата към окисление и да се предотврати погрешното кръстосано свързване. Беше намерено, че първият и четвъртият цистеини в еро-домена, номерирани от аминотерминалния край, са необходими за запазване на правилна конформация, но че вторият и третият не са. В съгласие с това вторият и третият цистеини в еро-домена могат да се заместят.

/ОС

Молекули нуклеинови киселини, кодиращи варианти на /ярАлиганда в аминокиселинната последователност, могат да се получат чрез различни методи, известни в областта. Тези методи включват, но не се ограничават само до_: изолиране от природен източник (в случая на природно срещащи се варианти в аминокиселинната последователност) или приготвяне чрез олигонуклеотидопосредствувани методи (или целенасочена) мутагенеза, ПВР-мутагенеза или блокова мутагенеза на по-рано приготвен вариант или невариантна верисия на /прАлигандиния полипептид.

Мутагенезата посредством Олигонуклеотиди е предпочетен метод за получаване на субституционни, делеционни и инсерционни варианти на mplлигандната ДНК. Тази техника е добре известна на специалистите и е описана в Adelman etal., DNA, 2:183[1983]. Накратко, трАлигандната ДНК се променя чрез хибридизация на олигонуклеотид, кодиращ желаната мутация с ДНК-матрица, където матрицата представлява едноверижна форма на плазмид или бактериофаг, съдържащ наизменената или нативна ДНК-последователност на /прАлиганда. След хибридизацията се използува полимераза за синтеза на цялостна втора комплементарна верига на матрицата, която по този начин ще включи олигонуклеотидния праймер и ще кодира избраното изменение в mplлигандната ДНК.

Използуват се основно олигонуклеотиди с дължина най-малко 25 нуклеотида. Един оптималени олигонуклеотид ще има 12 до 15 нуклеотида, които са напълно комплементарни на матрицата от всяка страна на нуклеотида(ите), кодиращ мутацията. Това ще осигури правилната хибридизация на олигонуклеотида с молекулата на едноверижната ДНК-матрица. Олигонуклеотидите се синтезират лено като се използуват техники, известни в специалността, като тази, описана от Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 [1978].

ДНК-матрицата може да се приготви от тези вектори, които са получени или от векторите на основата на бактериофага М13 (търговски достъпните вектори М13тр18 и М13тр19 са подходящи) или от векторите, които lDi съдържат начало за репликация на едноверижен фаг, както е описано от Viera et al, Meth. Enzymol., 153:3 [1987]. И така ДНК, която ще се променя (мутира)_?може да се включи в един от тези вектори за получаване на едноверижна матрица. Получаването на едноверижна матрица е описано в Раздели 4.21-4.41 на Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).

Като алтернатива едноверижна матрица може да се получи чрез денатуриране на двойноверижен плазмид (или друга) ДНК като се използуват стандартни техники.

За изменение на нативната ДНК-последователност (за получаване на варианти в аминокиселинната последователност, например) олигонуклеотидът се хибридизира с едноверижната матрица при подходящи условия на хибридизация. След това се прибавя енаим за полимеризация на ДНК, обикновено Klenowфрагмент на ДНК-полимераза I, за да се синтезира комплементарната верига на матрицата, използувайки олигонуклеотида като праймер за синтеза. По този начин се формира хетеродуплексна молекула, така че едната верига на ДНК кодира мутантната форма на трАлиганда, а другата верига (оригиналната матрица) кодира нативната, непроменена последователност на трАлиганда. Тази хетеродуплексна молекула след това се трансформира в подходяща клеткагостоприемник, обикновено прокариот, такъв като Е. coli JM101. След като клетките се култивират, те се посяват върху агарозни платета и се скринират, като се използува олигонуклеотидният праймер, белязан радиоактивно с 32фосфат, за да се идентифицират бактериалните колонии, които съдържат мутантната ДНК. Мутиралата област след това се отстранява и се поставя в съответен вектор за белтъчна продукция, главно експресионен вектор, който обикновено се използува за трансформация на съответен гостоприемник.

Методът, току що описан по-горе, може да се модифицира така, че да се получи хетеродуплексна молекула, при което и двете вериги на плазмида съдържат мутацията(ите). Тези модификации са^ както следва: Едноверижният олигонуклеотид се [хибридизира към матрицата, както е описано по/02.

горе. Смес от три дезоксирибонуклеотида, дезоксирибоаденозин (dATP), дезоксирибогуанозин (dGTP) и дезоксириботимидин (dTTP). се комбинира с модифициран тио-дезоксирибоцитозин, наречен dCTP-(aS) (който може да се получи от Amersham Corporation). Тази смес се прибавя към комплекса матрицаолигонуклеотид. След добавяне на ДНК-полимераза към тази смес се синтезира верига ДНК, идентична с матрицата^с изключение на мутиралите бази. Освен това тази нова верига ДНК ще съдържа dCTP-(aS) вместо dCTP, което служи за предпазването и от смилането и с рестрикционна ендонуклеаза.

След като матричната верига на двойноверижната хетеродуплексна молекула се скъса с подходящ рестрикционен ензим, матричната верига може да се разгради с ExoIl 1-нуклеаза или друга подходяща нуклеаза след областта, която съдържа мястото(местата), което ще се мутагенизира. След това реакцията се спира, за да остане молекула, която е само частично едноверижна. След това се формира пълен двойноверижен хетеродуплекс като се използува ДНКполимераза в присъствието на всички четири дезоксирибонуклеотидтрифосфати, АТР и ДНК-лигаза. Тази хетеродуплексна молекула след това може да се трансформира в подходяща клетка-гостоприемник, такава като Е coli, както е описано по-горе.

ДНК, кодираща трАлигандни мутанти, в които трябва да се замести повече от една аминокиселина, могат да се получат по един от няколоко начина. Ако аминокиселините са локализирани близко една до друга в полипептидната верига, те могат да се мутират едновременно като се използува олигонуклеотид, който кодира всички желани аминокиселинни субституции. Ако обаче аминокиселините са локализирани на известно растояние една от друга (разделени от повече от десет аминокиселини) е по-трудно да се направи единичен олигонуклеотид, който кодира всички желани изменения. Вместо това може да се приложи един от следните два алтернативни метода.

В първия метод се получава отделен олигонуклеотид за всяка аминокиселина, която ще се заменя. След това олигонуклеотидите се прилепват към едноверижната ДНК-матрица едновременно и по този начин втората верига

1СЗ

ДНК, която се синтезира върху матрицата, ще кодира всяка от желаните аминокиселинни субституции.

Алтернативният метод включва два или повече цикъла на мутагенеза за получаване на желания мутант. Първият цикъл е като описания за единичните мутанти: за матрица се използува див тип ДНК. Олигонуклеотид, кодиращ първата желана аминокиселинна субституция (и)_? се прилепва към тази матрица, след което се синтезира хетеродуплексна молекула. Вторият цикъл на мутагенеза използува мутантната ДНК, получена в първия цикъл на мутагенеза като матрица. Така тази матрица вече съдържа една или повече мутации. Олигонуклеотидът, кодиращ желаната допълнителна аминокиселинна субституция(и), след това се прилепва към тази матрица като получената верига на ДНК вече кодира мутации, както от първия, така и от втория цикъл на мутагенеза. Така получената ДНК може да се използува като матрица в трети цикъл на мутагенеза и т.н.

ПВР-мутагенезата също е подходяща за създаването на аминокиселинни варианти на /прАлигандния полипептид. Въпреки че следващата дискусия се отнася за ДНК, се подразбира, че техниката намира приложение също и с РНК. ПВР-техниката се отнася главно за следната процедура (виж Erlich, по-горе, главата от R. Higuchi, р. 61-70): Ако като изходен материал в ПВР се използуват малки количества матрична ДНК, могат да се ползуват праймери, които се различават леко по последователност от съответната област в матричната ДНК. По този начин се получават сравнително големи количества специфичен ДНК-фрагмент, който се различава от матричната последователност само в местата, в които праймерите се различават от матрицата. За въвеждането на мутация в плазмидна ДНК се предвижда единият от праймерите да припокрива мястото на мутацията и да съдържа мутацията; последвоателността на другия праймер трябва да бъде идентична с отрязък от последователност в срещуположната верига на плазмида, но тази последователност може да бъде локализирана където и да е по дължината на плазмидната ДНК. Предпочита се, обаче, последователността на втория праймер да бъде локализирана в границите w

на 200 нуклеотида от тази на първия, така че накрая цялата амплифицирана ДНК, ограничена от праймерите, да може лесно да се секвенира. ПВР-амплификация с използуване на двойка праймери, подобни на току що описаните, води до получаването на популация от ДНК-фрагменти, които се различават в мястото на мутацията, определено от праймерите, а вероятно и в други позиции, тъй като копирането на матрицата до известна степен е съпроводено с грешки.

Ако отношението на матрицата към продукта е изключително ниско, по-голямата част от получените ДНК-фрагменти съдържа желаната мутация(и). Този материал от продукта се използува за заместване на съответната област в плазмида, която е послужила като ПВР-матрица при използуване на стандартната ДНК-технология. Мутации в отделни места могат да се въведат едновременно или като се използува втори мутантен праймер, или като се провежда втора ПВР с различни мутантни праймери и лигиране на двата получени ПВР-фрагмента едновременно с векторния фрагмент чрез лигиране в три (или повече) стъпки.

В специфичен пример за ПВР-мутагенеза плазмидната матрична ДНК (1 мкг) се линеаризира чрез смилане в рестрикционна ендонуклеаза, която разпознава уникално място в плазмидната ДНК извън областта, която ще се амплифицира. 100 нг от този материал се прибавят към ПВР-смес, съдържаща ПВР-буфер, който съдържа четирите дезоксинуклеотидтрифосфати и е включен в набора реагенти GeneAmpR (получен от Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, СА) и 25 пмол от всеки олигонуклеотиден праймер, до краен обем 50 мкл. Реакционната смес се надслоява с 35 мкл минерално масло. Реакционната смес се денатурира за пет минути на 100°С, за кратко се поставя на лед и след това под слоя минерално масло се добавя 1 мкл ДНК-полимераза (5 единици/мкл, закупена от Perkin-Elmer Cetus) от Thermus aquaticus (Taq). След това реакционната смес се поставя в апарат за ПВР на ДНК (закупен от Perkin Elmer Cetus), програмиран както следва:

мин 55°С сек 72°С, след това следните 19 цикъла:

405 сек 94°С сек 55°С, и сек 72°С.

В края на програмата епруветката с реакцията се отстранява от ПВРапарата и водната фаза се прехвърля в нова епруветка, екстрахира се с фенол/хлороформ (50:50 об), утаява се с етанол и ДНК се получава чрез стандартни процедури. Впоследствие този материал се подлага на съответна обработка за включване във вектор.

Друг метод за приготвяне на варианти, касетъчната (блокова) мутагенеза, се основава на техниката, описана от Wells et al., Gene, 34:315 [19985]. Изходният материал представлява плазмид (или друг вектор), съдържащ щоАлигандната ДНК, която ще се мутагенизира. Идентифицира се кодонът(ите) в /прАлигандната ДНК, които ще се мутагенизират. Трябва да съществува уникално място за рестрикционна нуклеаза от всяка страна на идентифицираното място за мутацията(ите). Ако такива рестриктазни места не съществуват, те могат да се създадат като за въвеждането им на съответните места в трАлигандната ДНК се използува по-горе описаният метод за мутагенеза посредством олигонуклеотиди. След като рестриктазните места в плазмида са въведени, плазмидът се - , с? срязва в тези места, за ^а се линеаризира. Като се използуват стандартни процедури се синтезира двойноверижен олигонуклеотид, кодиращ последователността между рестриктазните места, но съдържащ желаната мутация (и). Двете вериги се синтезират поотеделно и след това се хибридизират заедно като се използуват стандартни техники. Този двойноверижен олигонуклеотид се означава като касета. Предвидено е тази касета да има 3'- и 5'-краища, които са съвместими с краищата на линеаризирания плазмид, така че касетата да може директно да се лигира с плазмида. Този плазмид сега съдържа променената ДНК последователност на щрАлиганда.

С. Включване (инсерция) на нуклеинова киселина в реплициращ се вектор

10£>

Нуклеиновата киселина (напр. кДНК или геномна ДНК), кодираща нативен трАлиганден полипептид или негов вариант, се включва в реплициращ се вектор за по-нататъшно клониране (амплификация на ДНК) или за експресия. На разположение са много вектори и изборът на съответен вектор ще зависи от (1) дали той ще се използува за амплификация на ДНК или за експресия на ДНК, (2) големината на нуклеиновата киселина, която ще се включи във вектора и (3) клетката-гостоприемник, която ще се трансформира с вектора. Всеки вектор съдържа различни компоненти в зависимост от неговата функция (амплификация на ДНК или експсресия на ДНК) и от клетката-гостоприемник, с която той е съвместим. Векторните компоненти включват главно, но не са ограничени до, един или повече от следните (компоненти): сигнална последователност, начало за репликация, един или повече маркерни гени, инхансърен елемент, промотор и последователност за терминация на транскрипцията.

(i) Компонент - сигнална последователност /ИрАлигандът на това изобретение може да се експресира не само директно, но също и като сливане с хетероложен полипептид, за предпочитане сигнална последователност или друг полипептид, имащ специфично място за скъсване в N-края на зрелия белтък или полипептид. Сигналната последователност, най-общо, може да бъде компонент на вектора или може да бъде част от /прАлигандната ДНК, която се включва във вектора. Избраната хетероложна последователност би трябвало да бъде такава, която се разпознава и процесира (т.е. скъсва се от сигнална пептидаза) от клетката-гостоприемник. За прокариотните клетки-гостоприемници, които не разпознават и не процесират нативната сигнална последователнст на /прАлиганда, сигналната последователност се замества с прокариотна сигнална последователност, селекционирана например от групата лидери на алкалната фосфатаза, прницилаза, Ipp или термостабилния ентеротоксин II. За секреция от дрожди нативната сигнална последователност може да се замести от напр., лидерите на дрождената инвертаза, алфа фактор или кисела фосфатаза, лидера на гклюкоамилазата от С. albicans (Европейски патент 362 179, публикуван на 4 fCT април 1990) или от сигнала, описан във WO 90/13646, публикуван на 15 ноември 1990. Нативната сигнална последователност (т.е., трАлигандната препоследователност, която по правило направлява секрецията на трАлиганда от неговите нативни бозайнишки клетки in v?Vo)_?e задоволителна за експресия в клетки от бозайници. За целта обаче могат да бъдат подходящи и други бозайнишки сигнални последователности, такива като сигналните последователности от други трАлигандни полипептиди или от същия трАлиганд, но от друг животински вид, сигнални последователности от трАлиганд и сигнални последователности на белтъци, които се секретират от същия или родствен вид, както и вирусни секреторни лидери, например сигнала на Herpes simplex gD.

(ii) Компонент - начало за репликация

Както експресионните, така и клониращите вектори съдържат последователност от нуклеинова киселина, която прави възможна репликацията на вектора в една или повече избрани гостоприемни клетки. В клониращите вектори тази последователност е предимно такава, която позволява на вектора да се реплицира независимо от хромозомната ДНК на гостоприемника и включва начала на репликация или автономно реплициращи се последователности. Подобни последователности са добре известни за различни бактерии, дрожди и вируси. За повечето Грам-отрицателни бактерии е подходящо началото за репликация от плазмида pBR322, началото на 2ц-плазмид е подходящо за дрожди, а за клониращите вектори в бозайнишки клетки са приложими различни вирусни начала (SV40, полиома, аденовирус, VSV или BPV). Като цяло компонентът началоо за репликация не е необходим за бозайнишките експресионни вектори (8\/40-началото обикновено се използува само поради това, че съдържа ранния промотор).

Повечето експресионни вектори са совалки“, т.е. могат да се реплицират в най-малко един клас микроорганизми, но могат да се трансфектират в друг организъм за експресия. Например, даден вектор се клонира в Е. co!iv\ след това същият вектор се трансфектира в дрожди или клетки

Ή>Ή*γ <06 на бозайници за експресия, макар че той не е способен да се реплицира независимо от хромозомата на клетката-гостоприемник.

ДНК може също така да се амплицира и като се включи в генома на гостпориемника. Това се извършва лесно, използувайки като гостоприемник вид Bacillus чрез включване във вектора на ДНК-последователност, която е комплементарна на последователност, намерена в геномната ДНК на Bacillus. Трансфекцията на Bacillus с този вектор води до хомоложна рекомбинация с генома и инсерция на /прАлигандната ДНК. Изолирането на геномната ДНК, която кодира /прАлиганда, обаче, е по-сложно, отколкото това на екзогенно реплициращ се вектор, тъй като за изрязване на /прАлигандната ДНК се изисква разграждане с рестрикционни ензими.

(iii) Компонент - ген за селекция

Експресионните и клониращи вектори би трябвало да съдържат ген за селекция, наречен още маркер за селекция. Този ген кодира белтък, необходим за преживяването и растежа на трансформираните клетки-гостоприемници в селективна хранителна среда. Гостоприемни клетки, нетрансформирани с вектора няма да преживяват в хранителната среда. Типичните гени за селекция кодират белтъци, които (а) придават устойчивост спрямо антибиотици или други токсини, напр. ампицилин, неомицин, метотрексат или тетрациклин, (Ь) допълват автотрофни дефицити или (с) доставят критични хранителни съставки, които не могат да се получат от комплексните хранителни среди, напр., генът, кодиращ Dаланин рацемаза за Bacillus.

Един пример за схема на селекция използува медикамент за преустановяване растежа на гостоприемната клетка. Тези клетки, които са трансформирани успешно с хетероложен ген, експресират белтък, който им придава устойчивост спрямо медикамента и по този начин те преживяват режима на селекция. Примери за такава доминанти селекция са лекарствата неомицин (Southern et al., J. Molec. Appt. Genet., 1:327 [1982], микофенолна киселина (Mulligan etal., Science, 209:1422(1980] или хигромицин (|Sugden etal., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 [1985]. В трите примера, дадени по-горе, се използуват ice бактериални гени под еукариотен контрол за придаване на устойчивост спрямо съответното лекарство G418 или неомицин (генетицин), xgpt (микофенолна киселина) или хигромицин, респективно.

Примери на други подходящи маркери за селекция в клетки на бозайници са тези, които позволяват идентификацията на клетки, компетентни да поемат трАлигандната нуклеинова киселина. Такива маркери са дихидрофолатредуктазата (DHFR) или тимидинкиназата. Трансформираните клетки от бозайници се поставят под селективен натиск, така че само трансформантите са единствено приспособени да преживеят, благодарение на това, че са поели маркера. Селективният натиск се осъществява чрез култивиране на трансформантите при условия, в които концентрацията на селективният агент в средата постепенно се променя, което води до амплификация, както на гена за селекция, така и на ДНК, кодираща mpl· лигандния полипептид. Амплификацията е процесът, при който гените, които в поголяма степен са необходими за производството на белтък, критичен за растежа, се повтарят тандемно в хромозомите на последователни поколения от рекомбинантните клетки. От амплифицираната ДНК се синтезират повишени количества трАлиганд.

Например клетки, трансформирани с гена за селекция DHFR, найнапред се идентифицират чрез култивиране на всички трансформанти в хранителна среда, която съдържа метотрексат (Mtx), конкурентен антагонист на DHFR. Когато се използува дивият тип DHFR, подходящ гостоприемник представлява клетъчната линия от яйчни клетки на Китайски хамстер (СНО), дефицитна за DHFR-активност, получена и размножавана, както е описано от Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]. След това трансформираните клетки се поставят в условия на покачващи се нива от Mtx. Това води до синтезата на множество копия на DHFR-гена и заедно с това на множество копия от друга ДНК, включваща експресионните вектори, такава като ДНК, кодираща трАлиганда. Тази техника на амплификация може да се използува с всеки друг подходящ гостоприемник, напр., ATCC No. CCL61 СНО-К1,

Η* «ο независимо от наличието на ендогенен DHFR ако, например, се използува мутантен DHFR-ген, който е високоусотйчив спрямо Mtx (Европрйски патент 117 060). Като алтернатива гостоприемните клетки [особено див тип гостоприемници, които съдържат ендогенен DHFR), трансформирани или котрансформирани с ДНК-последователности, кодиращи тр/-лиганд, DHFR-белтък див тип и друг маркер за селекция, такъв като аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (АРН) могат да се селекционират чрез култивиране в среда, съдържаща селективен агент за маркера на селекция, такъв като аминогликозиден антибиотик, напр., канамицин, неомицин или G 418. Виж патент на САЩ No. 4 965199.

Подходящ за използуване в дрожди е trp\ -генът за селекция, присъствуващ в дрождения плазмид YRp7 (Stinchcomb etal., Nature, 282:39 [1979]; Kingsman etal., Gene, 7:141 [1979]; или Tschemper etal., Gene, 10:157 [1980]. Trp1генът предоставя маркер за селекция на мутантен щам дрожди, който е лишен от способността да расте в триптофан, например, ATCC No. 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). Наличието на trp\-увреждане в генома на дрожедената клетка-гостоприемник осигурява ефективна среда за детекция на трансформацията чрез култивиране в отсъствието на триптофан. По подобен начин дрождените щамове, дефицитни за LeU2. (ATCC No. 20 622 или 38 626) се допълват от известни плазмиди, носещи £ес2-гена.

(iv) Компонент - промотор

Експресионните и клониращи вектори обикновено съдържат промотор, който се разпознава от организма-гостоприемник и е опреративно свързан с mpl· лигандната нуклеинова киселина. Промоторите са нетранслиращи се последователности, локализирани пред (5') началния кодон на структурен ген (главно в рамките на около 100 до 1000 нд), които контролират транскрипцията и транслацията на определена последователност от нуклеинова киселина, такава като трАлигандната нуклеинова киселина, с която те са свързани оперативно. Такива промотори обикновено попадат в два класа, индуцируеми и

111 конститутивни. Индуцируемите промотори са промотори, които инициират покачващи се нива на транскрипция от ДНК под техния контрол в отговор на някаква промяна в условията на култивиране, напр., наличието или отсъствието на хранителна съставка или промяна в температурата. Понастоящем са добре познати голям брой промотори, които се разпознават от различни потенциални клетки-гостоприемници. Тези промотори се свързват оперативно с ДНК, кодираща /прАлиганд чрез отстраняване на промотора от източника на ДНК чрез смилане с рестрикционни ензими и включване на изолираната промоторна последователност във вектора. За направляване амплификацията и/или експресията на /прАлигандната ДНК могат да се използуват, както промоторна последователност на нативен /прАлиганд, така и много херероложни промотори. Хетероложните промотори, обаче, се предпочитат, понеже като цяло те позволяват по-силна транскрипция и по-високи добиви експресиран /прАлиганд в сравнение с промотора на нативния /прАлиганд.

Подходящите промотори за използуване на прокариотни гостоприемници включват промоторните системи на Я-лактамазата и лактозата (Chang et al., Nature, 275:615 [1978]; и Goeddel et al., Nature, 281:544 [1979]), промоторните системи на алкалната фосфатаза и триптофана (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] и Европейски патент 36 776) и хибридни промотори, такива като tac-промотора (deBoer et a!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 [1983]). Подходящи са обаче и други известни бактериални промотори. Техните нуклеотидни последователности са публикувани, което позволява на опитния специалист да ги свърже оперативно с ДНК, кодираща /прАлиганд (Siebenlist et a/., Cell, 20:269 [198]). като използува линкери или адаптори за обезпечаване на всяко необходимо рестриктазно място. Промоторите, които се използуват в бактериални системи, ще съдържат последователност на ShineDalgarno (S.D.), оперативно свързана с ДНК, кодираща /прАлигандния полипептид.

Промоторни последователности са известни за еукариотите. Фактически всички еукариотни гени имат АТ-богата област, локализирана приблизително 25 до 30 бази пред мястото, където се инициира транскрипцията. Друга последовавтелност, намерена 70 до 80 бази пред началото на транскрипцията на много гени е областта СХСААТ, където X може да бъде всеки нуклеотид. В 3'-края на повечето еукариотни гени има последователност ААТААА, която може би представлява сигнал за прибавяне на поли А-опашка към 3'-края на кодиращата последователност. Всички тези последователности се включват по подходящ начин в еукариотни експресионни вектори.

Примерите за подходящи промоторни последователности, които се използуват в дрождени гостоприемници, включват промоторите за 3фосфоглицераткиназата (Hitzeman et al., J. Biol Chem., 255:2073 [1980] или за други гликолитични ензими (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]; и Holland, Biochemistry, 17:4900 [1978]), такива като енолаза, глицералдехид-3фосфатдехидрогеназа, хексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.

Други дрождени последователности, които представляват индуцируеми промотори, имащи допълнителното предимство на контролирана от растежните условия транскрипция, са промоторните области на алкохолдехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, хидролитични ензими, свързани с азотната обмяна, металотионеин, глицералдехид-3-фосфатдехидрогеназа и ензими, отговорни за усвояването на малтоза и галактоза. Подходящи вектори и промотори за експресия в дрожди са описани още от Hitzeman etal., Европейски патент 73 657А. Преимущества носи също и използуването на дрожени инхансъри с дрождените промотори.

Транскрипцията на /прАлиганда от вектори в гостоприемни клетки на бозайници се контролира, например, от промотори, получени от геномите на вируси, такива като полиома вирус, вируса по пипките (Патент на Великобритания 2 211 504, публикуван на 5 юли 1989), аденовирус (такъв като Аденовирус 2). говежди папилома вирус, вирус на птичата саркома, цитомегаловирус, ретровирус, вирус на хепатит В, като най-много се предпочита маймунският вирус 40 (SV40), от хетероложни промотори на бозайници, напр., актиновия промотор или имуноглобулинов промотор, от промотори на гените за топлинношокови белтъци и от промотор, нормално свързан са щрАлигандната последователност, при условие че тези промотори са съвместими със системата на гостоприемната клетка.

Ранният и късният промотор на вируса SV40 се получават удобно като в\/40-рестрикционен фрагмент, който съдържа също и в\/40-вирусното начало за репликация. Fiers et al., Nature, 273:113 [1978]; Mulligan and Berg, Science, 209:1422-1427 [1980]; Pavlakis etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402[1981]. Непосредствено ранният промотор на човешкия цитомегаловирус се получава удобно като АйпаНИ-рестрикционен фрагмент. Greenaway et al., Gene, 18:355-360 [1982]. Система за експресия на ДНК в гостоприемник бозайник чрез изплзуване на говеждия папилома вирус като вектор, е публикувана в патент на САЩ No. 4 419 446. Модификация на тази система е описана в патент на САЩ No. 4 601 978. Виж също Gray et al., Nature, 295:503-508 [1982] за експресията на кДНК, кодираща имунен интерферон в маймунски клетки; Reyes et a!., Nature, 297:598601 [1982] за експресията на кДНК за човешки β-интерферон в миши клетки под контрола на тимидинкиназен промотор от вируса Herpes simplex, Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 [1982] за експресията на гена за човешки интерферон β1 в култивирани миши и заешки клетки; и Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5777-6781 [1982] за експресията на бактериални CAT-последователности в маймунски бъбречни CV-1-клетки, пилешки ембрионални фибробласти, яйчни клетки от Китайски хамстер, HeLa-клетки и миши NIH-ЗТЗ-клетки, използувайки като промотор дългия терминален повтор на Раус саркома вируса.

(ν) Компонент - инхансърен елемент

Транскрипцията на ДНК, кодираща /прАлиганда на това изобретение във висши еукариоти често се усилва чрез включването на инхансърна последователност във вектора. Инхансърите са цис-действуващи елементи от ί<4

ДНК, обикновено от около 10 до 300 нд, които действуват върху промотора за усилване на неговата транскрипция. Инхансърите са с независима относителна ориентация и място, намерени са 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 [1981]) и 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol., 3:1108 [1983] по отношение на транскрипционната единица, вътре в интрон (Banerji et al., Cell, 33:729 [1983]), както и вътре в самата кодираща последователност (Osborne etal., Mol. Cell Biol., 4:1293 [1984]). Сега са известни много инхансърни последователности от гени на бозайници (глобин, еластаза, албумин, а-фетопротеин и инсулин). Обикновено, обаче, се използува инхансър от еукариотен клетъчен вирус. Примерите включват инхансъра на SV40 откъм късната страна на началото за репликация (нд 100-270), инхансъра на цитомегаловирусния ранен промотор, инхансъра на папиломата откъм късната страна на началото за репликация и аденовирусни инхансъри. Виж също Yaniv, Nature, 297:17-18 [1982] за усилващи (инхансърни) елементи за активиране на еукариотни промотори. Инхансърът може да бъде разположен във вектора в позиция 5' или 3' по отношение на /прЛлигандната кодираща последователност, но преимуществено е локализиран в място по посока 5' спрямо промотора.

(vi) Компонент за терминация на транскрипцията

Експресионните вектори, използувани в еукариотни клеткигостоприемници (дрожди, гъби, насекоми, растения, животни, хора или ядрени клетки от други многоклетъчни организми) ще съдържат също и последователности, необходими за спирането (терминацията) на транскрипцията и за стабилизиране на мРНК. Такива последователности са общодостъпни от 5'и понякога 3'-нетранслиращите се области на еукариотни или вирусни ДНКи или РНКи. Тези области съдържат нуклеотидни сегменти, транскрибирани като полиаденилирани фрагменти в нетранслиращата се част от мРНК, кодираща mplлиганда.

(vii) Конструиране и анализ на вектори

За конструирането на подходящи вектори, съдържащи един или повече от гореизброените компоненти, се използуват стандартни техники на лигиране.

115

Изолираните плазмиди или ДНК-фрагменти се срязват, сшиват и религират в желаната форма за получаване на изисквания плазмид.

За анализи с цел потвърждаване на коректните последователности в конструираните плазмиди, лигазните смеси се използуват за трансформация на щам Е coli К12 294 (ATCC No. 31 446) и сполучливите трансформанти се селекционират по съответната ампицилинова или тетрациклинова устойчивост. Получават се плазмиди от трансформантите, анализират се чрез смилане с рестрикционни ендонуклеази и/или се секвенират по метода на Messin et al., Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] или по меотда на Махат et al., Methods in Enzymology, 65:499 [ 1980].

(viii) Експресионни вектори за транзитна експресия

Особено полезни за практическото приложение на това изобретение са експресионни вектори, които дават възможност за транзитна експресия на ДНК, кодираща трАлигандния полипептид в клетки от бозайници. Транзитната експресия най-общо включва използуването на експресионен вектор, който е в състояние да се реплицира ефективно в клетка-гостоприемник, така че гостоприемната клетка да натрупа много копия от експресионния вектор и на практика да синтезира големи количества от желания полипептид, който се кодира от експресионния вектор. Sambrook et al., по-горе, pp. 16.17 - 16.22. Системите за транзитна експресия, които включват подходящ експресионен вектор и клетка-гостприемник, позволяват удобна позитивна идентификация на полипептиди, кодирани от клонираната ДНК, както и бързото скриниране на такива полипептиди за желаните биологични или физиологични свойства. Ето защо системите за транзитна експресия са особено полезни в изобретението за целите на идентификация на аналози и варианти на трАлигандния полипептид, които имат биологична активност на трАлиганден полипептид.

(ix) Подходящи примерни вектори за клетки на гръбначни

Други методи, вектори и клетки-гостоприемници, подходящи за адаптиране синтезата на трАлиганд в рекомбинантна култура от клетки на гръбначни, са описани в Gething et al., Nature, 293:620-625 [1981]; Mantei et a!.,

1I£>

Nature, 281:40-46[1979]; Levinson etal.·, Европейски патент 117 060; и Европейски патент 117 058. Особено полезен плазмид за експресия на трАлиганд в култура от клетки на бозайници е pRK5 (Европейски патент 307 247, патент на САЩ No. 5 258 287) или pSV16B (РСТ с публикационен No. WO 91/08291).

D. Селекция и трансформация на клетки-гостоприемници

Подходящи клетки-гостоприемници за клониране или експресия на включените тук вектори са прокариотните, дрождени или висши еукариотни клетки, описани по-горе. Подходящите прокариоти включват еубактерии, такива като Грам-положителни или Грам-отрицателни организми, например, Е coli, Bacilli, такива като В. subtilis, видове Pseudomonas, такива като Р. aeruginosa, Salmonella typhimurium или Serratia marcescans. Един предпочетен Е со/А гостоприемник за клониране е Е coli 294 (АТСС No. 31 446), макар че са подоходящи и други щамове, такива като E coli В, Е со//Х1776 (АТСС No. 31 537) и Е coli W3110 (АТСС No. 27 325). Тези примери са по-скоро илюстративни, отколкото ограничаващи. За предпочитане е клетката-гостоприемник да секретира минимални количества протеолитични ензими. Като алтернатива са подходящи методи за in vitro клониране, напр., ПВР или полимеразни реакции с нуклеинови киселини.

В допълнение към прокариотите подходящи гостоприемници за вектори, кодиращи /прАлиганда. са еукатиотни микроби, такива като филаментозни гъби или дрожди. Saccharomyces cerevisiae или най-общо хлебопекарните дрожди са най-широко използуваните микроорганизмигостоприемници измежду нисшите еукариоти. Редица други родове, видове и ща.мове, обаче, са общодостъпни и полезни в случая, такива като Schizosaccharomycespombe (Beach and Nurse, Nature, 290:140[1981]; Европейски патент 139 383, публикуван на 2 май 1985), гостоприемници Kluyveromyces (патент на САЩ No. 4 943 592), такива като напр., К. lactis (Louvencourt et al., J. Bacterio/., 737 [1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans и K. marxianus, yarrowia [ Европейски патент 402 226], Pichia pastoris (Европейски патент 183 070; Sreekrishna etal., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988], Candida, Trichoderma reesia

4(7 (Европейски патент 244 234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]) и филаментозни гъби, такива като напр., Neurospora, PeniciUium, Toiypocladium (WO 91/00357, публикувано на 10 януари 1991) и гостоприемници Aspergillus, такива като A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 [1984]) и A. niger (Kelly and Hynes, EMBOJ., 4:475-479 [1985]).

Подходящите клетки-гостоприемници за експресия на гликозилиран /прАлиганд се получават от многоклетъчни организми. Такива гостоприемни клетки притежават комплекс от процесиращи и гликозилиращи активности. По принцип всяка клетъчна култура от висш еукатиот е работеща, независимо дали е култура от клетки на гръбначни или безгръбначни. Примерите за клетки на безгръбначни включват растителни клетки и клетки на насекоми. Идентифицирани са редица бакуловирусни щамове, техни варианти и съответните им пермисивни гостоприемни клетки от насекоми, такива като Spodoptera frugiperda (гъсеница), Aedes aegypti (комар), Ades albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодова мушица) и Bombyx mori. Виж напр., Luckow et a!., Bio/Technology, 6:47-55 [1988]; Miller et a!., Genetic Engineering, Setlow et a!., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; и Maeda et al, Nature, 315:592594 [1985]. Публично достъпно е разнообразие от вирусни щамове за трансфекция, напр., L-1-варианта на Autographs californica NPV и щама Bm-5 на Bombyx mori NPV като такива вируси могат да се използуват подобно вирусът, съгласно настоящото изобретение, в частност за трансфекция на клетки на Spodoptera frugiperda.

Като гостоприемници могат да се използуват растителни клетъчни култури от памук, царевица, картоф, соя, петуния, домат и тютюн. Растителни клетки обикновено се трансформират чрез инкубиране с определени щамове на бактерията Agrobacterium tumefaciens, която предварително е манипулирана така, че да съдържа /прАлигандната ДНК. Пс|време на инкубацията на растителната клетъчна култура с A. tumefaciens, ДНК, кодираща /прАлиганда^се «6 пренася в гостоприемната растителна клетка, така че тя се трансфектира и при съответни условия ще експресира /прАлигандната ДНК. Освен това са на разположение регулаторни и сигнални последователности, съвместими с растителните клетки, такива като нопалинсинтазния промотор и сигнални последователности за полиаденилиране. Depicke et al., J. Moi Appl. Gen., 1:561 [1982]. И още, ДНК-сегменти, изолирани от областта пред 780-гена на Т-ДНК са способни да активират или усилват нивата на траскрипция на експресируеми от растенията гени в растителни тъкани, съдържащи рекомбинантна ДНК. Европейски патент 321 196, публикуван на 21 юни 1989.

Най-голям е, обаче, интересът към клетките на гръбначни и като размножаването на гръбначни клетки в култура (тъканна култура) стана рутинна процедура през последните години (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors [1973]). Примери за полезни гостоприемни клетъчни линии от бозайници са: маймунска бъбречна CV1-линия, трансформирана с SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); човешка ембрионална бъбречна линия (293 или 293-клетки, субклонирани за растеж в суспензионна култура, Graham etal., J. Gen Viroi, 36:59 [1977]); бъбречни клетки от новородени хамстери (ВНК, АТСС CCL 10); яйчни клетки на Китайски xaMCTep/-DHFR (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]); миши сертолиеви клетки (TM4, Mather, Bio. Reprod., 23:243251 [1980]); маймунски бъбречни клетки (CV1 АТСС CCL 70); бъбречни клетки от африканска зелена маймуна (VERO-76, АТСС CRL-1587); човешки клетки от цервикален карцином (HELA, АТСС CCL 2); кучешки бъбречни клетки (MDCK, АТСС CCL 34); чернодробни клетки от плъх (buffalo rat), (BRL ЗА, АТСС CRL 1442); човешки белодробни клетки (W138, АТСС CCL 75), човешки чернодробни клетки (Hep G2, НВ 8065); миши тумор на млечната жлеза (ММТ 060562, АТСС CCL51); TRI-клетки (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]); MRC 5-клетки; ЕБД-клетки; и човешки хепатомни клетки (Hep G2).

Клетките-гостоприемници се трансфектират и за предпочитане се трансформират с по-горе описаните експресионни или клониращи вектори на това изобретение, модифицирани по съответен начин за включване на мз промотори, селекция на трансформанти или амплифициране на гени, кодиращи желаните последователности. Клетките се култивират в конвенционални хранителни среди.

Трансфекцията се отнася за поемането на експресионен вектор от клетка-гостоприемник, независимо от това дали всяка кодираща последователност се експресира в действителност. На квалифицираните специалисти са известни редица методи за трансфекция, например, СаРОдметод и електропорация. Сполучливата трансфекция се разпознава главно по появата на някоя индикация за функционирането на този вектор в клеткатагостоприемник.

Трансформацията означава въвеждане на ДНК в организъм, така че ДНК да се реплицира или като екстрахромозомен елемент или като интегрирана в хромозомата. В зависимост от клетката-гостоприемник, която се използува, трансформацията се извършва , като се използуват стандартни техники, подходящи за такива клетки. Калциевото третиране, ползуващо калциев хлорид, както е описано в раздел 1.82 на Sambrook et al., по-горе, се използува предимно за прокариоти или други клетки, които притежават значителни клетъчностенни бариери. За трансформацията на определени растителни клетки се използува инфекция с Agrobacterium tumefaciens, както е описано от Shaw et ai., Gene, 23:315 (1983] и WO 89/05859, публикувано на 29 юни 1989. Освен това растенията могат да се трансфектират«като се използува ултразвуково третиране, както е описано в WO 91/00358, публикувано но 10 януари 1991. За клетките от бозайници, които не притежават такива клетъчни стени, се предпочита методът за прецпитация с калциев фосфат на Graham and van der EB, Virology, 52:456-457 [1978]. Основните аспекти на трансформациите на системите от бозайнишки клетки-гостоприемници са описани от Axel в патент на САЩ No. 4 399 216, издаден на 16 август 1983. Трансформациите в дрожди обикновено се извършват съгласно метода на Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 [1977] и Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:39192 [1979]. Могат, обаче, да се използуват и други (20 методи за въвеждане на ДНК в клетки, такива като инжектиране в ядрото, електропорация или сливане на протопласти.

Е. Култивиране на клетките-гостоприемници

Прокариотните клетки, използувани за продукция на /прАлигандния полипептид на това изобретение _? се култивират в подходяща среди, предимно както е описано в Sambrook etal., по-горе.

Гостоприемните клетки от бозайници, използувани за продукция на трАлиганда на това изобретение, могат да се култивират в разнообрани среди. За култивиране на гостоприемните клетки са подходящи търговски достъпни среди, такива като Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma). Като културална среда за клетките-гостоприемници освен това може да се използува и всяка от средите, описани в Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44 [1979], Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102:255 [1980], патенти на САЩ Nos. 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; или 4 560 655; WO 90/03430; WO 87/00195; патент на САЩ Re. 30 985; или висящите U.S.S.N. 07/592 107 или 07/592 141, и двете подадени на 3 октомври 1990, като данните от всички тях са включени тук чрез литературните цитати. Всяка от тези среди може да бъде допълнена, когато е необходимо, с хормони и/или други фактори (такива като инсулин, трансферни или епидермален растежен фактор), соли (такива като натриев хлорид, калций, магнезий и фосфат), буфери (такива като HEPES), нуклеозиди (такива като аденозин и тимидин), антибиотици (такива като лекарството GentamycinTM), елементи в минимални (следови) количества (дефинирани като неорганични съединения, присъствуващи обикновено в крайни концентрации от микромоларния обхват) и глюкоза или еквивалентен енергиен източник. Могат да бъдат включени също и всякакви други необходими добавки в съответните концентрации, които би трябвало да са известни на квалифицираните в тази област. Условията на култивиране, такива като температура, pH, и подобни на тях, са тези, използувани предварително с клетката-гостоприемник, избрана за експресия и ще са очевидни за рутинно квалифицирания специалист.

Ш

Клетките-гостоприемници, за които става въпрос в тази публикация, обхващат клепки в in vitro култура, както и клетки в животното гостоприемник.

F. Определяне на генната амплификация/експресия

Генната амплификация и/или експресия в дадена проба могат да се измерят директно, например, чрез конвенционален пренос на ДНК върху нитроцелулозна или найлонова мембрана (Southern-блотинг), пренос на РНК (northern-блотинг) за околичествяване транскрипцията на мРНК (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), дот-блотинг (анализ на ДНК) или in situхибридизация чрез съответно белязана сонда на основата на представените тук последователности. Могат да се използуват различни белези, най-често радиоизотопи, в частност ³²Р. Могат, обаче, да се приложат също и други техники, такива като използуването на биотин-модифицирани нуклеотиди за включване в полинуклеотид. Биотинът след това служи като място за свързване с авидин или антитела, които могат да бъдат белязани с широко разнообразие от белези, такива като радионуклиди, флуоресцентни багрила, ензими и подобни на тях. Като алтернатива могат да се използуват антитела, които могат да разпознават специфични дуплекси, включващи ДНК-дуплекси, РНК-дуплекси, ДНК-РНК хибридни дуплекси или ДНК-белтъчни дуплекси. Антителата на свой ред могат да бъдат белязани,.като може да се извърши тест, при който дуплексът се свързва с повърхност, така че след формирането на дуплекса върху повърхността може да се детектира наличието на антитяло, свързано с дуплекса.

Генната експресия, алтернативно, може да се измери чрез имунологични меотди, такива като имунохистохимично оцветяване на тъканни срези и тестиране на клетъчна култура или телесни течности за директно измерване експресията на генния продукт. При техниката на имунохистохимично оцветяване се приготвя клетъчна проба, обикновено чрез дехидратиране и фиксиране, следвани от реакция с белязани антитела, специфични за свързания генен продукт, такива като ензимни белези, флуоресцентни белези, луминесцентни белези и подобни на тях, при което белезите обикновено се детектират визуално. Особено чувствителна оцветяваща техника, подходяща за

122.

използуване в насотящото изобретение, е описана от Hsu eta/., Am. J. Clin. Path., 75:734-738(1980].

Антителата, използуващи се за хистохимично оцветяване и/или тестиране на пробни течности^ могат да бъдат моноклонални или поликлонални и могат да се приготвят във всеки бозайник. Антителата за удобство могат да се приготвят срещу нативен /прАлиганден полипептид или срещу синтетичен пептид, основаващ се на представените тук ДНК-последователности, както е описано подолу.

G. Пречистване на mpi-лиганден полипептид

Предпочита се /прАлигандът да се изолира от културална среда като секретиран полипептид, въпреки че той може да се получи също и от лизати на гостоприемните клетки, в случай че се експресира директно без секреторен сигнал.

Когато трАлигандът се експресира в рекомбинантна клетка, с произход^различен от човешкия, трАлигандът е напълно свободен от белтъци или полипептиди с човешки произход. Обикновено, обаче, си остава необходимо mpl· лигандът да се пречисти от останалите белтъци или полипептиди на рекомбинантната клетка, за да се получат препарати, които са значително хомогенни по отношение на самия трАлиганд. Като първа стъпка културалната среда или лизат се центрофугират за отстраняване на частиците от клетъчните отломки. След това мембранната и разтворимата белтъчни фракции се разделят. Като алтернатива може да се използува търговски достъпен филтър за концентриране на белтъци (напр., единици за ултрафилтрация на Amicon или Millipore Pellicon). След това /ярАлигандът може да се пречисти от разтворимата белтъчна фракция и от мембранната фракция на клетъчния лизат в зависимост от това дали гпрАлигандът е мембранно свързан. Л4рАлигандът след това се пречиства от онечистващите разтворими белтъци или полипептиди чрез изсолване и диализа или чрез хроматографски процедури като се използуват различни гелни матрикси. Тези матрикси включват: акриламид, агароза, декстран, целулоза и други общоизвестни за белтъчно пречистване. Примерните ‘23 хроматографски процедури, подходящи за белтъчно пречистване, включват: имуноафинитетна (напр. анти-ИтрАлиганд Mab), рецепторноафинитетна (напр., mpAIgG или протеин A-Sepharose), хроматография на хидрофобните взаимодействия (HIC) (напр., етер, бутил или Toyopearl), лектинова хроматография (напр., Con A-Sepharose, lentil-lektin-Sepharose), гел-филтрация (напр. Sephadex G-75 (колони за кати- и анионообмен (напр., DEAE или карбоксиметил- и сулфопропил-целулоза), обратнофазова високоефективна течна хроматография (RP-HPLC) (виж напр., Urdal et a/., J. Chromatog., 296:171 [1984], където се използуват две последователни RP-HPLC-стъпки за пречистване на рекомбинантен човешки IL-2). Други стъпки на пречистване могат да включват: утаяване с етанол; утаяване с амониев сулфат; хроматофокусиране; препаративна SDS-PAGE и др.

/ИрАлигандните варианти, в които са делетирани, включени или заместени отатъци, се получават по същия начин както нативния трАлиганд, като се държи сметка за всички съществени изменения в свойствата, настъпили в резултат на вариацията. Например сливането на трАлиганда с друг белтък или полипептид, напр., бактериален или вирусен антиген, улеснява пречистването; може да се използува имуноафинитетна колона, съдържаща антитяло срещу антигена за адсорбиране на слятия полипептид. Имуноафинитетни колони, такива като заешки поликлонален анти-трАлиганд могат да се използуват за адсорбиране на трАлиганден вариант чрез свързването му с най-малко един останал имунен епитоп. Като алтернатива /прАлигандът може да се пречисти чрез афинитетна хроматография, използувайки пречистен mpAIgG, свързан с (за предпочитане) имобилизирана смола, такава като Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, СА) или подобна, чрез добре известни способи. Може да бъде от полза също така и протеазен инхибитор, такъв като фенилметилсулфонилфлуорид (PMSF) за инхибиране на протеолитичното разграждане пс|време на пречистването или могат да се включат антибиотици за предотвратяване развитието на дучайни замърсители. Квалифицираният в тази област ще прецени, че методите за пречистване, подходящи за нативния трАлиганд, могат да изискват модификация, за да се отчетат измененията в характера на /прАлиганда или на неговите варианти след експресията в рекомбинантна клетъчна култура.

Н. Ковалентни модификации на mpl-лигандния полипептид

Ковалентни модификации на /прАлигандните полипептиди са включени в обхвата на това изобретение. Ковалентно могат да бъдат модифицирани, както нативния /прАлиганд, така и аминокиселинните варианти на /прАлиганда. Един тип ковалентна модификация, включена в обхвата на това изобретение, представлява /прАлиганден фрагмент. Различни аминокиселинни фрагменти, имащи до около 40 аминокиселинни остатъци, могат удобно да се получат чрез химична синтеза или чрез ензимно или химично разграждане на пълноразмерния /прАлиганден полипептид или на негов вариант. Други типове ковалентни модификации на /прА лиганда или на фрагменти от него се въвеждат в молекулата чрез реакция на прицелния аминокиселинен остатък на /прАлиганда или на неговите фрагменти с органичен дериватизиращ агент, който е способен да взаимодействува с определени странични вериги или с N- или С-крайните остатъци.

Цистеиновите остатъци най-често се третират с α-халоацетати (и съответните амини), такива като хлороцетна киселина или хлорацетамид, за получаване на карбоксиметилови или карбоксиаминодиметилови производни. Цистеиновите остатъци се дериватизират също и чрез въздействие с бромтрифлуорацетон, а-бром-0-(5-имидозолил)пропионова киселина, хлорацетилфосфат, N-алкилмалеимиди, З-нитро-2-пиридилдисулфид, метилов 2пиридилдисулфид, р-хлормеркурибензоат, 2-хлормеркури-4-нитрофенол или хлор-

7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол.

Хистидиновите остатъци се дериватизират чрез реакция с диетилпирокарбонат при pH 5,5-7,0, тъй като този агент е относително специфичен за хистидиновата странична верига. Прилага се също и парабромфенацилбромид; предпочита се реакцията да се провежда в 0,1 М натриев кокодилат при pH 6,0.

Лизиновите и аминотерминалните остатъци се третират с янтърен или други анхидриди на карбоновите киселини. Дериватизацията с тези агенти има

125“ ефекта на обръщане заряда на лизиновите остатъци. Други подходящи реагенти за дериватизация на аминосъдържащи остатъци включват имидоестери, такива като метилов пиколинимидат; пиридоксалфосфат; пиридоксал; хлорборхидрид; тринитробензенсулфонова киселина; О-метилизоурея; 2,4-пентандион; и трансаминаза-катализирана реакция с глиоксилат.

Аргининовите остатъци се модифицират чрез реакция с един или няколко конвенционални реагенти, между тях фенилглиоксал, 2,3-бутандион, 1,2циклохександион и нинхидрин. Дериватизацията на аргининовите остатъци изисква, реакцията да се провежда при алкални условия поради високата рК_а на гуанидиновите функционални групи.

Специфичната модификация на тирозиновите остатъци се прави при особен интерес от въвеждане на спектрални белези в тирозиновите остатъци чрез реакция с ароматни диазониеви съединения или с тетраниторметан. Найчесто се използуват N-ацетилимидизол и тетранитрометан за образуване респективно на О-ацетилови тирозинови видове и 3-нитро производни. Тирозиновите остатъци се йодират като се използуват ¹²⁵1 или за получаване на белязани белтъци, които се използуват в радиоимунологичен тест, като описаният по-горе хлорамин Т-метод е подходящ за целта.

Карбонилните странични групи (аспартил или глутамил) се модифицират избирателно чрез реакция с карбодиимиди (R-N=C=N-R‘), където R и R' са различни алкилни групи, такива като 1-циклохексил-3-(2-морфолинил-4етил)карбодиимид или 1-етил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Освен това аспартиловите и глутамиловите остатъци се превръщат в аспарагинови и глутаминови остатъци чрез реакция с амониеви йони.

Дериватизацията с бифункционални агенти е приложима за кръстосано свързване на трАлиганд с водонеразтворим матрикс-подложка или повърхност за приложение в метода за пречистване на анти-трАлигандни антитела и обратно. Често използуваните агенти за кръстосано свързване включват, напр., 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилетан, глутараледхид, N-хидроксисукцинимидни естери, например естери s 4-азидосалициловата киселина, хомобифункционални

12G имидоестери, включващи дисукцинимидни естери, такива като 3,3'дитиобис(сукцинимидпропионат) и бифункционални малеимиди, такива като бисМ-малеимидо-1,8-октан. Дериватизацията с агенти, такива като метил-3-[(разидофенил)дитио]пропиоимидат дават фотоактивиращи се междинни съединения, които са способни да образуват кръстосани връзки в присъствието на светлина. Като алтернатива за имобилизирането на белтъци се използуват реактивни водонеразтворими матрикси, такива като бромциан-активирани въглехидрати и реактивните субстрати, описани в патенти на САЩ, W' - т;а 3 969 287; 3 691 016; 4 195 128; 4 247 642; 4 229 537; и 4 330 440.

Глутаминовите и аспарагиновите остатъци често се дезаминират до съответните глутамилови и аспартилови остатъци, респективно. Тези остатъци се дезаминират при неутрални или базични условия. Дезаминираните форми на тези остатъци попадат в обхвата на това изобретение.

Други модификации включват хидроксилиране на пролин или лизин, фосфорилиране на хидроксилните групи на серинови или треонинови остатъци, метилиране на α-аминогрупите на лизиновите, аргининови и хистидинови странични вериги (Т.Е. Creghton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983]), ацетилиране на N-краен амин и амидиране на всяка С-крайна карбоксилна група.

Друг тип ковалентна модификация на трАлигандния полипептид, включена в обхвата на това изобретение, обхваща промяната в нативния профил на гликозилиране на плипептида. Чрез промяна се означава делетирането на една или повече въглехидратни единици, срещащи се в нативния трАлиганд и/или добавяне на едно или повече места за гликозилиране, които не присъствуват в нативния трАлиганд.

Гликозилирането на полипептидите обикновено е или N-свързано или 0свързано. N-свързано се отнася за присъединяването на въглехидратна единица към страничната верига на аспарагинов остатък. Трипептидните последователности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, където X е всяка аминокиселина с изключение на пролин, представляват разпознавателните

127 последователности за ензимно присъединяване на въглехидратната единица към аспарагиновата странична верига. По този начин наличието на всяка от тези трипептидни последователности в полипептид създава потенциални места за гликозилиране. О-свързано гликозилиране се отнася за присъединяване на една от захарите N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза към хидроксиаминокиселина, най-често серин или треонин, въпреки че могат да се използуват също и 5-хидроксипролин или 5-хидроксилизин.

Прибавянето на места за гликозилиране към трАлигандния полипептид се извършва удобно чрез промяна в аминокиселинната последователност, така че тя да съдържа една или повече от гореописаните трипептидни последователности (за места на N-свързано гликозилиране). Изменението може също да бъде направено чрез прибавянето на, или субституцията се един или повече серинови или треонинови остатъци към нативната /прАлигандна последователност (за места на О-свързано гликозилиране). За удобство се предпочита /ярАлигандната аминокиселинна последователност да се промени чрез изменения на ДНК-ниво, в частност, като се мутира ДНК, кодираща трк лигандния полипептид в предварително избрани бази, така че да се образуват кодони, които ще се транслират в желаните аминокиселини. ДНК-мутациите могат да се направят, като се използуват методите, описани по-горе под заглавието Варианти на /прАлиганда в аминокиселинната последователност.

Други способи за повишаване броя на въглехидратните единици в трА лиганда е чрез химично или ензимно свързване на гликозиди към полипептида. Тези процедури имат предимството, че не изискват производството на полипептида в клетка-гостоприемник, която притежава гликозилиращи способности за N- или О-свързано гликозилиране. В зависимост от използувания модел за свързване, захарта(ите) може да се присъедини към (а) аргинин или хистидин, (Ь) свободни карбоксилни групи, (с) свободни сулфхидрилни групи, такива като тези на цистеина, (d) свободни хидроксилни групи, такива като тези на серина, треонина или хидроксипролина, (е) ароматни остатъци, такива като тези на фенилаланина, тирозина или триптофана или (f) амидната група на (22 глутамина. Тези методи са описани във WO 87/05330, публикувано на 11 септември 1987 и Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 [1981].

Отстраняването на въглехидратни единици, присъствуващи в mpl· лигандния полипептид_г може да се извърши химично или ензимно. Химичното дегликозилиране изисква въздействие върху полипептида със съединението трифлуорметансулфонова киселина или еквивалентно съединение. Това третиране води до разкъсването на повечето или всички захари с изключение на свързващата захар (N-ацетилглюкозамин или N-ацетилгалактозамин), докато полипептидът остава интактен. Химичното дегликозилиране е описано от Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 [1987] и от Edge et at., Anal. Biochem., 118:131 [1981]. Ензимното разкъсване на въглехидратните единици върху полипептидите може да се постигне чрез използуването на различни ендои екзогликозидази, както е описано от Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 [1987].

Гликозилирането на потенциални места за гликозилиране може да бъде предотвратено^като се използува съединението туникамицин, както е описано от Duskin etal., J. Biol. Chem., 257:3105 [1982]. Туникамицинът блокира образуването на белтък-И-гликозиднии връзки.

Друг тип ковалентна модификация на /77рАлиганда включва свързването на трАлигандния полнпептид с един от различните небелтъчни полимери, напр., полиетиленгликол, полипропиленгликол или полиоксиалкилени по начина, поместен в патенти на САЩ, номера 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192 или 4 179 337. МрАлигандните полипептиди, свързани ковалентно с горните полимери се означават като пегилирани /прАлигандни полипептиди.

Ясно е, че ще бъде необходимо известно скриниране на получените трАлигандни варианти, за да се избере оптималният вариант за свързване с mpl, който има и имунологичната и/или биологична активност, дефинирани по-горе. Може да се скринира за стабилност в рекомбинантна клетъчна култура или в плазма (напр., срещу протеолитично смилане), висок афинитет към /прАчлен, стабилност на окисление, способност да се секретира в повишени добиви и

129 подобни на тях. Например, промяната в имунологичния характер на тр/лигандния полипептид, такъв като афинитет към дадено антитяло, се измерва чрез имунологичен тест от конкурентен тип. Други потенциални модификации на белтъчните или полипептидни свойства, такива като стабилност на редуциране и термостабилност, хидрофобност или чувствителност към протеолитично разграждане, се тестират чрез добре известни методи в тази област.

17. Основни методи за получаване на антитела срещу /прАлиганда

Получаване на антитела (ΐ) Поликлонални антитела

Поликлонални антитела срещу трАлигандните полипептиди или фрагменти се получават главно в животни чрез многократни подкожни (sc) или интраперитонеални (ip) инжекции на трАлиганда и адювант. От полза може да бъде конюгирането на /прАлиганда или на фрагмент, съдържащ прицелната аминокиселинна последователност, с белтък, който е имуногенен за вида, който ще се имунизира, напр., хемоцианин (изолиран от вид мида), серумен албумин, говежди тироглобулин или соев трипсонов инхибитор като се използуват бифункционален или дериватизиращ агент, например малеимидобензоилов сукцинимиден естер (конюгиране чрез цистеинови остатъци), Nхидроксисукцинимид (чрез лизинови остатъци), глутаралдехид, сукцинов (янтърен) анхидрид, SOCI2 или R¹N=C=NR, където R и R¹ са различни алкилни групи.

Животните се имунизират срещу трАлигандния полипептид или фрагмент, имуногенните конюгати или производни чрез комбиниране на 1 мг до 1 мкг от пептида или конюгата (респективно за зайци и мишки) с 3 обема пълен адювант на Фройнд и подкожно инжектиране на разтвора на множество места. Един месец по-късно се прави бустер (повторна имунизации за усилване на имунния отговор) с 1/5 до 1/10 от първоначалното количество пептид или конюгат в пълен адювант на фройнд чрез подкожно инжектиране на множество места. Седем до 14 дни по-късно се взема кръв от животните и серумът се тестира за

130 титър на трАлигандните антитела. На животните се прави бустер, докато титърът достигне плато. Предпочита се бустерът на животните да се направи с конюгат на същия трАлиганд, но конюгиран с друг белтък и/или чрез друг реагент за кръстосано свързване. Конюгатите могат също така да се направят в рекомбинантна клетъчна култура под формата на сляти белтъци. Използуват се също и агрегиращи агенти, такива като стипца, за усилване на имунния отговор.

(И) Моноклонални антитела

Моноклоналните антитела се получават от популация значително хомогенни антитела, т.е. индивидуалните антитела, съдържащи се в популацията, са идентични с изключение на естествено възникващи мутации, които могат да присъствуват в малки количества. Така определението моноклонално посочва характера на антитялото, което не е смес от дискретни антитела.

Например, трАмоноклоналните антитела на това изобретение могат да се направят като се използува хибридомния метод, описан за първи път от Kohler & Milstein, Nature, 256:495 [1975] или могат да се направят чрез рекомбинантни методи (патент на САЩ No. 4 816 567[Cabilly etal.]).

В хибридомния метод, мишка или друг подходящ животински гостоприемник, такъв като хамстер, се имунизира, както е описано по-горе, за да се появят лимфоцити, които произвеждат или са в състояние да произвеждат анитела, които ще се свързват специфично с белтъка, използуван за имунизация. Като алтернатива лимфоцитите могат да бъдат имунизирани in vitro. След това лимфоцитите се сливат с миеломни клетки, като се използува подходящ агент за сливане, такъв като полиетиленгликол, за да се образува хибридомна клетка (Goding, MonoclonoalAntibodies: Principles and Practice, pp.59-103 [Academic Press, 1986]).

Хибридомните клетки, получени по този начин, се посяват и култивират в подходяща хранителна среда, като се предпочита тя да съдържа една или повече субстанции, които инхибират растежа или преживяемостта на неслятите, родителски миеломни клетки. Например, ако родителските миеломни клетки не съдържат ензима хипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или

151

HPRT), културалната среда за хибридомите обикновено включва хипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда), които субстанции пречат на растежа на HGPRT-дефицитните клетки.

Предпочитани миеломни клетки са тези, които се сливат ефективно, поддържат стабилно високо ниво на експресия на антитялото от отбраните антитяло-продуциращи клетки и са чувствителни към среда, такава като НАТсредата. Между тези предпочитани миеломни клетъчни линии са мишите миеломни линии, такива като тези, получени от миши тумори МОРС-21 и МРС-11, които са на разположение в Salk Institute Cell Distrbution Center, San Diego, California USA, и SP-2-клетки на разположение в American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. За образуването на човешки моноклонални антитела са описани също и човешка миеломна и мише-човешка хетерохибридомна клетъчна линия (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 [1984]; Brodeur et a!., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 19897).

Хранителната среда, в която се култивират хибридомните клетки, се тестира за продукцията на моноклонални антитела, насочени срещу трАлиганд. Предпочита се свързващата специфичност на моноклоналните антитела, продуцирани от хибридомните клетки, да се определи чрез имунопреципитация или чрез тест за in vitro свързване, такъв като радиоимунологичен тест (RIA) или ензимносвързан имуносорбентен анализ (ELISA).

Афинитетът на свързване на антителата може, например, да се определи чрез Scatchard-анализа на Munson & Pollard, Anal., Biochem., 107:220 [1980].

След като се идентифицират хибридомни клетки, които продуцират антитела с желаната специфичност, афинитет и/или активност, клоновете могат да се субклонират чрез процедурите на лимитиращите разреждания и да се култивират чрез стандартни методи (Godin, по-горе). Подходящите за тази цел културални среди включват, например, Dulbecco's Modified Eagle's Medium или

132

RPMI-1640 средата. Освен това хибридомните клетки могат да се култивират in vivo като асцити или тумори в животно.

Моноклоналните антитела, секретирани от субклоновете се разделят по подходящ начин от културалната среда, асцитната течност или серума чрез конвенционални процедури за пречистване на имуноглобулини, такива като, например, протеин A-Sepharose, хидроксиапатитна хроматография, гелелектрофореза, диализа или афинитетна хроматография.

ДНК, кодираща моноклоналните антитела на изобретението се изолира лесно и се секвенира като се използуват конвенционални процедури (напр., чрез използуване на олигонуклеотидни проби, които са способни да се свързват специфично с гени, кодиращи тежката и леката вериги на миши антитела). Хибридомните клетки на изобретението служат като предпочетен изотчник на такава ДНК. След като веднъж се изолира, ДНК може да бъде поставена в експресионни вектори, които след това се трансфектират в гостоприемни клетки, като маймунски COS-клетки, яйчни клетки от Китайски хамстер (СНО), миеломни клетки, които не продуцират друг имуноглобулинов белтък, за да се получи синтеза на моноклонални антитела в рекомбинантните клетки-гостоприемници. ДНК може също така да бъде модифицирана, например, чрез включване на кодиращата последователност за човешките константни домени на тежката и леката верига на мястото на хомоложните миши последователности, (Cabilly et al., по-горе; Morrison, et a/., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6815 [1984]) или чрез свързване към имуноглобулиновата кодираща последователност на цялата или част от кодиращата последователност на неимуноглобулинов полипептид.

Обикновено такива неимуноглобулинови полипептиди заместват константните домени на антитяло на изобретението или те заместват вариабилните домени на едно анитген-свързващо място на антитяло на изобретението, за да се получи химерно бивалентно антитяло, включващо едно антиген-свързващо място със специфичност за трАлиганд и друго антигенсвързващо място със специфичност за друг антиген.

Химерните или хибридни антитела могат да се получат също in vitro, като се използуват известни методи в синтетичната белтъчна химия, включващи тези, в които участвуват агенти за кръстосано свързване. Например, имунотоксини могат да се конструират като се използува реакция на дисулфидна обмяна или чрез формиране на тиоетерна връзка. Примерите на подходящи реагенти за тази цел влючват иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.

За приложения в диагностигата е типично, антителата на изобретението да се бележат с детектируема съставка. Детектируема съставка може да бъде всяка, която е способна да произведе, било то директно или косвено, детектируем сигнал. Например, детектируемата съставка може да бъде радиоизотоп, такъв като ³Н, ¹⁴С, ³²Р, или 125|, флуоресцентно или хемилуминесцентно съединение, такова като флуоресцинизотиоцианат, родамин или луциферин; радиоактивни изотопни белези, такива като, напр., ¹²³1, ³²р 14д или ³Н или ензим, такъв като алкална фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза от хрян.

Може да се използува всеки известен метод за поотделно конюгиране на антитялото с детектируемата съставка, включително тези методи, описани от Hunter, etal., Nature, 144:945(1962]; David, etal., BUchemistry, 13:1014(1974]; Pain, et a!., J. Immunol. Meth., 40:219 [1981]; и Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 [1982].

Антителата на настоящото изобретение могат да се използуват във всеки известен метод за тесиране, такъв като тест по конкурентно свързване, директен и индиректен сандвичев тест и имунопреципитационен тест. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Тестовете по конкурентно свързване почиват на способността на белязан стандарт (който може да бъде трАлиганд или реагираща имунологично негова част) да се конкурира с анализираната тест-проба (тирАлиганд) за свързване с ограничено количество антитяло. Количеството трАлиганд в тестпробата е обратно пропорционално на количеството на стандарта, който се свързва с антитялото. За улесняване определянето на количеството свързан

134 стандарт, антителата по правило се превръщат в неразтворими преди и след конкурирането, така че стандартът и анализираната проба, които са свързани с антителата, лесно могат да се отделят от стандарта и пробта, които остават несвързани.

Сандвичевите тестове включват използуването на две антитела, всяко от които е способно да свързва различни имуногенни части или епитопи от белтъка (трАлиганд), който ще се детектира. Аналитичната тест-проба в сандвичев тест се свързва с първо антитяло, което е имобилизирано върху твърда подложка, след което с пробата се свързва второ антитяло, като по този начин се формира неразтворим комплекс от три части. David & Greene, патент на САЩ No. 4 376 110. Самото второ антитяло може да бъде белязано с детектируема съставка (директен сандвичев тест) или може да се измери като се използува антиимуноглобулиново антитяло, което е белязано с детектируема съставка (индиректен сандвичев тест). Например, един тип сандвичев тест е ELISA-тест, в който случай детектируемата съставка е ензим (напр., пероксидаза от хрян).

(iii) Хуманизирани и човешки антитела

Добре известни са методи за хуманизиране на не-човешки антитела.

Хуманизираното антитяло, най-общо, има един или повече аминокиселинни остатъци, които са въведени в него от източник, който е не-човешки. Тези нечовешки аминокиселинни остатъци често се означават като импорт остатъци, които обикновено се вземат от импортна вариабилна област. Хуманизирането може да се извърши главно, следвайки метода на Winter и сътрудници (Jones et ai., Nature, 321:522-525 [1986]; Riechmann et al., Nature, 332:323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 [1988]) като съответните последователности на човешко антитяло се заместят със CDRs- или CDRпоследователности на гризачи. В съгласие с това подобни хуманизирани антитела представляват химерни антитела (Cabilly et al., по-горе), в които значително по-малка част, отколкото интактния човешки вариабилен домен, е заместена чрез съответната последователност от не-човешки вид. На практика хуманизираните антитела са типично човешки антитела, в които някои CDR адостатъци, а възможно е и някои FR-остатъци, са заместени чрез остатъци от аналогични места в антителата от гризачи.

Изборът на човешки вариабилни домени, както леки^така и тежки, които да се използуват за направата на хуманизирани антитела, е много важен, за да се редуцира антигенността. В съгласие с така наречения най-добре пасващ метод, последователността на вариабилния домен от антитяло на гризач се скринира срещу цялата библиотика от известни последователности на човешки вариабилни домени. Човешката последователност, която е най-близка до тази на гризача.след това се приема за човешка арматурна област (FR) на хуманизираното антитяло (Sims et at., J. Immunol., 151:2296 [1993]; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 [1987]. Същата арматурна област може да се използува за няколко различни хуманизирани антитела (Carter et a!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 [1992]; Presta etal., J. Immunol., 151:2623 [1993]).

Освен това е важно антителата да се хуманизират при запазване на висок афинитет към антигена и други ценни биологични свойства. За да се постигне тази цел, съгласно предпочетен метод, антителата се приготвят чрез процес на анализ на родителските последователности и различни концептуални хуманизирани продукти като се използуват пространствени модели на родителските и хуманизираните последователности. Пространствените имуноглобулинови модели са общодостъпни и са нещо обикновено за професионалистите. На разположение са компютърни програми, които илюстрират и разкриват вероятните пространствени конформационни структури на избраните последователности, кандидати за имуноглобулини. Оглеждането на тези структури позволява да се анализира вероятната роля на остатъците за функционирането на имуноглобулиновата последователност - кандидат, т.е. анализ на остатъците, които повлияват способността на кандидатимуноглобулина да свързва своя антиген. По този начин могат да се изберат и комбинират FR-остатъци от консенсусна и импртна последователност, така че да се постигнат желаните характеристики на антитялото, такива като повишен афинитет към прицелния антиген(и). По правило

S6

CDR-областите участвуват директно и най-осезателно в повлияването на антигенното свързване. За допълнителни подробности виж заявка на САЩ със сериен No. 07/934 373, подадена на 21 август 1992, която представлява частично продължение на заявка със сериен No. 07/715 272, подадена на 14 юни 1991.

Днес съществува алтернативната възможност за получаването на трансгенни животни (напр. мишки), които след имунизация са способни да продуцират целия репертоар от човешки антитела при отсъствието на ендогенно образуване на имуноглобулини. Например, описано е, че хомозиготната делеция на гена за свързващата област (Jн) ^на тежката верига на антитялото в химерни и зародишни мутантни мишки води до пълно инхибиране на ендогенната продукция на антитела. Преносът на участъка на човешките зародишни имуноглобулинови гени в такива зародишни мутанти ще доведе до продукцията на човешки антитела след заразяване с антиген. Виж, напр., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255(1993]; Jakobovits eta/., Nature, 362:255-258(1993]; Bruggermann eta!., Year in Immuno., 7:33 [1993]. Човешки антитела могат също така да се произведат във фагови библиотеки, в които антителата са изложени върху повърхността на фагите (Hoogenboom and Wirier, J. Mol. Biol. 227, 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222 581(191]).

(iv) Биспецифични антитела

Биспецифичните антитела са моноклонални, за предпочитане човешки или хуманизирани, антитела, които притежават специфичности на свързване с най-малко два различни антигена. В имунологията са известни методи за получаването на биспецифични антитела.

Рекомбинантното производство на антитела традиционно се основава на коекспресията на две двойки имуноглобулинова тежка верига-лека верига, където двете тежки вериги имат различни специфичности (Millstein and Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Поради случайния подбор на имуноглобулиновите тежки и леки вериги, тези хибридоми (квадроми) продуцират потенциална смес от 10 различни молекули антитела, от които само една има коректната биспецифична структура. Пречистването на коректната молекула, което

1S7 обикновено се извършва чрез стъпки на афинитетна хроматография, е по-скоро трудоемко, а добивите от продукта -ниски. Подобни процедури са представени в РСТ-публикация No. WO 93/08829 (публикувана на 13 май 1993) и в Traunecker et al., EMBO, 10:3655-3659 [ 1991].

Съгласно друг, по-предпочитан подход, вариабилните домени на антитела с желаните специфичности на свързване (антитяло-антиген свързващи места) се сливат с последователности на имуноглобулинови константни домени. Предпочита се сливането да бъде с константен домен на имуноглобулинова тежка верига, включващ поне част от шарнирната област СН2 и СНЗ. За предпочитане е да се разполага с първата константна област на тежката верига (СН1), съдържаща мястото, необходимо за свързване на леката верига, присъствуващо в най-малко едно от сливанията. ДНКи, кодиращи сливанията на имуноглобулиновите тежки вериги и ако е желателно имуноглобулиновата лека верига се включват в отделни вектори и се котрансфектират в подходящ организъм-гостоприемник. Това осигурява голяма гъвкавост при нагласяване взаимните пропорции на трите полипептидни фрагмента в приложения, в които оптималните добиви се обезпечават от неравни отношения на трите полипептидни фрагменти, използувани в конструирането. Възможно е, обаче, кодиращите последователности за двете или всички три полипептидни вериги да се включат в един експресионен вектор, когато експресията на най-малко две полипептидни вериги в равни пропорции води до високи добиви или когато пропорциите не са от особено значение. В предпочетено приложение на този подход биспецифичните антитела са съставени от хибридна имуноглобулинова тежка верига с първа свързваща специфичност в едното рамо и хибридна имуноглобулинова двойка тежка верига-лека верига (осигуряваща втората свързваща специфичност) в другото рамо. Намерено е, че тази асиметрична структура улеснява отделянето на желаното биспецифично съединение от нежелани комбинации на имуноглобулиновите вериги, тъй като наличието на имуноглобулинова лека верига само в едната половина на биспецифичната молекула, обезпечава лесен начин за разделяне. Този подход е представен във висящата заявка със сериен No. 07/931 811, подадена на 17 август 1992.

За допълнителни подробности върху получаването на биспецифични антитела виж, например. Suresh eta/., Methods in Enzymology, 121:210(1986].

(v) Хетерокон/огирани антитела

Хетероконюгираните антитела са също в обхвата на настоящото изобретение. Хетероконюгираните антитела са съставени от две ковалентно свързани антитела. За такива антитела, например, е предположено, че се прицелват в нежелани клетки от имунната система (патент на САЩ No. 4 676 980) и за лечение на HIV-инфекция (РСТ-публикации, номера WO 91/00360 и WO/ 92/00373; Европейски патент 03089). Хетероконюгираните антитела могат да се направят^ като се използуват традиционни методи за кръстосано свързване. Подходящите агенти за кръстосано свързване са добре известни и са публикувани в патент на САЩ No. 4 676 980, заедно с редица техники за кръстосано свързване.

IV. Терапевтично използуване на мегакариоцитопоетичния белтък /прАлиганд

Биологично активният /прАлиганд, притежаващ хематопоетична ефекторна функция и означаван тук като мегакариоцитопоетичен или тромбоцитопоетичен белтък (ТРО), може да се използува в стерилен фармацевтичен препарат или приготвено по рецепта лекарство за стимулиране на мегакариоцитопоетичната или тромбопоетична активност в пациенти, страдащи от тромбоцитопения в резултат на увредено образуване, секвестиране или засилено разграждане на тромбоцитите. Асоциираната с тромбоцитопения костномозъчна хипоплазия (напр., апластична анемия след химиотерапия или костномозъчна трансплантация) може да се лекува ефективно със съединенията на това изобретение, както и болести, такива като дисеминирана интравазална коагулопатия (DIC), имунна тромбоцитопения (включваща HIV-индуцирана ITP и не HIV-индуцирана ГТР), хронична идиопатична тромбоцитопения, вродена ъз тромбоцитопения, миелодизплазия и тромботична тромбоцитопения. Освен това тези мегакариоцитопоетични белтъци могат да бъдат полезни за лечение на миелопролиферативни тромбоцитотични заболявания, както и на тромбоцитоза в условия на възпаление и дефицит на желязо.

Предпочитаните приложения на мегакариоцитопоетичния или тромбоцитопоетичен (ТРО) белтък на това изобретение са в: миелотиксична химиотерапия за лечение на левкемия и солидни тумори, миелоаблативна химиотерапия при автоложна или алогенна костномозъчна трансплантация, миелодизплазия, идиопатична апластична анемия, вродена тромбоцитопения и имунна тромбоцитопения.

Други заболявания, които успешно се лекуват с мегакариоцитопоетичните белтъци на това изобретение, включват дефекти или увреждане на тромбоцитите в резултат на медикаменти, поставянето или активирането на изкуствени повърхности. В тези случаи примерните съединения могат да се използуват за стимулиране роенето на нови неувредени тромбоцити. За по-пълен списък на полезните приложения, виж Предшествуващо състояние на техниката по-горе и по-специално раздели (a)-(f), както и цитираната в тях литература.

Мегакариоцитопоетичните белтъци на настоящото изобретение могат да се използуват сами или в комбинация с други цитокини, хематопоетини, интерлевкини, растежни фактори или антитела в лечението на по-горе идентифицираните заболявания и условия. Така примерните съединения могат да се използуват в комбинация с други белтъци или пептиди, имащи тромбоцитопоетична активност, включващи: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL3, еритропоетин (ЕРО), търговски лиганд, IL-6 и IL-11.

Мегакариоцитопоетичните белтъци на настоящото изобретение се приготвят в смес с фармацевтично приемлив носител. Този терапевтичен препарат може да се прилага интравенозно или през носа и белия дроб. Препаратът може също така да се приложи парентерално или подкожно, по желание. Когато се прилага системно, терапевтичният препарат би трябвало да <40 не съдържа пирогени, а в разтвор, приемлив за парентерално приложение, трябва да се държи сметка за pH, изотоничност и стабилност. Тези условия са известни на професионалистите в тази област. Накратко, рецептурните дози от съединенията на настоящото изобретение се приготвят за съхранение или приложение чрез смесване на съединението с желаната степен на чистота с физиологично приемливи носители, ексципиенти или стабилизатори. Тези материали са нетоксични за реципиента в използуваните дози и концентрации и включват буфери, такива като фоафатни, цитратни, ацетатни и соли на органични киселини; антиоксиданти, такива като аскорбинова киселина; нискомолекулни (по-малко от около десет остатъци) пептиди, такива като полиаргинин, белтъци, такива като серумен албумин, желатин или имуноглобулини; хидрофилни полимери, такива като поливинилпиролидинон; аминокиселини, такива като глицин, глутаминова киселина, аспарагинова киселина или аргинин; монозахариди, дизахариди и други въглехидрати, включително целулоза или нейни производни, глюкоза, маноза или декстрини; хелатиращи агенти, такива като EDTA; подслаждащи алкохоли, такива като манитол или сорбитол; противойони, такива като натриев и/или нейонни ПАВ (повърхностно актвни вещества), такива като Tween, Pluronics или полиетиленгликол.

Около 0,5 до 500 мг от съединение или от смес на мегакариоцитопоетичния белтък под формата на свободна киселина или база, или под формата на фармацевтично приемлива сол, се смесват с физиологично приемливи вехикулум, носител, ексципиент, свързващ агент, консервант, стабилизатор, оцветител и т.н., както се изисква от приетата фармацевтична практика. Количеството на активната съставка в тези препарати е такова, че се получава подходяща доза в посочения обхват.

Стерилните състави за инжектиране могат да се приготвят съгласно конвенционалната фармацевтична практика. Например, може да бъде желателно разтварянето или суспендирането на активното съединение във вехикулум, такъв като вода или природни хранителни масла като сусамено, фъстъчено, масло от памучни семена или синтетичен мастен разтворител като етилолеат или подобни.

Ml

Могат да се включат буфери, консерванти, антиоксиданти и други подобни в съгласие с приетата фармацевтична практика.

Подходящите примери за препарати с бавно отделяне на активната съставка включват полупропускливи матрикси от твърди хидрофобни полимери, съдържащи полипептида, които матрикси са под формата на оформени артикули, напр., филми или микрокапсули. Примерите за матрикси, задържащи отделянето на активната съставка, включват полиестери, хидрогелове [напр., поли(2хидроксиетилметакрилат), както е описано от Langer eta!., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277[1981] и Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982] или поли(винилалкохол)], поликиселини (патент на САЩ No. 3 773 919, Европейски патент 58 481), кополимери от L-глутаминова киселина и гама-етил-Е-глутамат (Sidman et at., Biopolymers, 22:547-556 [1983]), неразграждащ се етиленвинилацетат (Langer et at., по-горе), разграждащи се кополимери млечна киселина-гликолова киселина, такива като Lupron Depot™ (микросфери за инжектиране, съставени от кополимер млечна киселина-гликолова киселина и леупролидацетат), както и поли-0-(-)-3-хидроксибутирова киселина (Европейски патент 133 988).

Докато полимери, такива като етиленвинилацетат и млечна киселинагликолова киселина, правят възможно отделянето на молекули в продължение на над 100 дни, определени гелове освобждават белтъци за по-кратки периоди от време. Когато капсулираните белтъци остават в тялото дълго време, те могат да денатурират или агрегират, като резултат от излагането им на влага при 37ПС, което води до загуба на биологична активност и възможни изменения на имуногенността. За стабилизиране на белтъците могат да се изобретят различни стратегии в зависимост от въвлечения мехамизъм. Например, ако се разкрие, че механизмът на агрегация представлява междумолекулно формиране на S-Sвръзки посредством дисулфиден обмен, стабилизирането може да се постигне чрез модифициране на сулфхидрилните остатъци, лиофилизиране из кисели разтвори, контрол върху съдържанието на влага, като се използуват съответни добавки и чрез разработването на препарати от специфични полимерни матрикси.

142.

Препаратите за забавено отделяне на мегакариоцитопоетичен белтък включват също мегакариоцитопоетичен белтък, включен в липозоми. Липозомите, съдържащи мегакариоцитопоетичен белтък ? се приготвят чрез известни методи: DE 3 218 121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:36883692 [1985]; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 [1980]; ЕП (Европейски патент) 52 322; ЕП 36 676; ЕП 88 046; ЕП 143 949; ЕП142 641; Японска патентна заявка 83-118008; Патенти на САЩ, номера 4 485 045 и 4 544 545 и ЕП 102 324. Липозомите обикновено са от малък (около 200-800 Ангстрьома) униламеларен тип, в който липидното съдържание е повече от около 30 мол. % холоестерол, като избраната пропорция е нагласена с оглед оптимална терапия посредством мегакариоцитопоетичен белтък.

Дозировката ще се определя от лекуващия лекарската се вземат под внимание различни фактори, за които е известно?че модифицират действието на дрогите, като тежест и тип на заболяването, телесно тегло, пол, диета, време и начин на приложение, други медикаменти и съответни клинични фактори. Дневният режим обикновено ще обхваща от 0,1 до 100 мгк/кг телесно тегло. Предпочита се дозировката да обхваща от 0,1 до 50 мкг/кг телесно тего. Повече се предпочита началната доза да обхваша от 1 до 5 мкг/кг/ден. Възможно е обхватът на дозата да бъде същия, като този за други цитокини, по-конкретно GCSF, GM-CSF и ЕРО. Терапевтично ефективните дозировки могат да се определят чрез методи in vitro или in vivo.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Смята се, че и без по-нататъшно описание, рутинно подготвеният в тази област специалист може, като използува предхождащото описание и илюатративните примери, да възпроизведе и използува в най-пълна степен настоящото изобретение. Поради това следващите работни примери наблягат конкретно върху предпочетени приложения на настоящото изобретение и не трябва да се тълкуват като ограничаващи по какъвто и да е начин останалата част от изложението.

ЙЗ у

ПРИМЕР 1

Частично пречистване на свински трАлиганд

Бедна на тромбоцити плазма се приготвя от нормални прасета или от прасета с апластична анемия. Прасетата се превръщат в апластични чрез облъчване на цялото тяло с 900 сГи лъчение като се използува 4мЕВ линеен ускорител. Облъчените прасета се поддържат 6-8 дни с интрамускулни инжекции на цефазолин. Впоследствие под пълна анестезия се отстранява цялият им телесен обем, хепаринизира се и се центрофугира на 1800 х g за 30 мин, за да се получи плазма, бедна на тромбоцити. Установява се, че мегакариоцитната стимулираща активност достига пик 6 дни след облъчването.

Апластичната свинска плазма, получена от облъчените прасета, се довежда до 4М с NaCI и се разбърква 30 мин на стайна температура. Получената утайка се отстранява чрез центрофугиране на 3800 об/мин в центрофуга Sorvall RC3B и надстоящата течност се натоварва на колона Phenyl-Toyopearl (220 мл), уравновесена с 10 мМ ИаРОд, съдържащ 4М NaCI. Колоната се промва с този буфер докато А28О ^е <0,05 и се елуира с dH2O. Елуираният белтъчен пик се разрежда с CIH2O до проводимост 15мС и се натоварва на колона Blue-Sepharose, уравновесена (240 мл) с PBS. Впоследствие колоната се промива с 5 обема на колоната поотделно с PBS и с ЮмМ NaPC>4 (pH 7,4), съдържащ 2М урея. Белтъците се елуират от колоната с ЮмМ NaPC>4 (pH 7,4), съдържащ 2М урея. Елуираният белтъчен пик се довежда до 0,01% с октилглюкозид(п-октил Я-Dглюкопиранозид) и до 1мМ поотделно с EDTA и с Pefabloc (Boehringer Mannheim) и се натоварва директно върху тандемно свързани CD4-lgG (Capon, D.J. et al., Natrue 337:525-531 [1989]) и mpAIgG колони Ultrakink (Pierce) (виж по-долу). Колоната CD4-lgG (2ml) се отстранява след нанасяне на пробата, а колоната mpl· IgG (4 мл) се промива с 10 обема на колоната поотделно с PBS и с PBS, съдържащ 2М NaCI и се елуира с 0,1М глицин-HCI pH 2,25. Фракциите се събират в 1/10-та обем 1М Tris-HCI (pH 8,0).

<44

Анализът на елуираните фракции от трАафинитетната колона чрез SDS-PAGE (4-20%, Novex-гел), проведена при редуциращи условия, разкрива наличието на няколко белтъка (фиг. 5). Белтъците, които по-сребро се оцветяват с най-голяма интензивност, се разделят с видима Мг от 66 000, 55 000, 30 000, 28 000 и 14 000. За да се определи, кой от тези белтъци стимулира пролиферация на Ва/РЗ-щоАклетъчни култури, тези белтъци се елуират от гела, както е описано в Пример 2 по-долу.

Афинитетни колони UltraJink

10-20 мг от mp/IgG или CD4-lgG в PBS се свързват с 0,5 грама смола Ultralink (Pierce), както е описано в инструкциите на произвоидителя.

Конструиране и експресия на mpl-IgG

Химерна молекула, включваща целия екстрацелуларен домен на човешкия mp! (аминокиселини 1-149) и Fc-областта на човешка lgG1-молекула, се експресира в 293-клетки. Човешки кДН К-фрагмент, кодиращ аминокиселини 1149 от човешкия mpl, се получава чрез ПВР на кДНК-библиотека от човешка мегакариоцитна СМК-клетка и се секвенира. В 5'-края се въвежда Clal-място, а в 3'-края BstEII-място. Този фрагмент се клонира пред Fc-кодиращата последователност на IgGI във вектор Bluescript между местата Clal и BstEII след частично смилане на ПВР-продукта с BstEII поради наличието на две дуги BstEIIместа в ДНК, кодираща екстрацелуларния домен на mpl. BstEII-мястото, въведено в 3'-края на /прАПВР-продукта се смила, за да се получи Fc-област в рамка с екстрацелуларния домен на mpl. Конструкцията се субклонира в pRK5-tkneo между местата Clal и Xbal и се трансфектира в човешки ембрионални бъбречни клетки 293 по калциево-фосфатния метод. Клетките се селекционират в 0,4 мг/мл G418 и се изолират индивидуални клонове. Експресията на mpAIgG от изолираните клонове се определя като се използува Fc-специфична ELISA. Найдобрият експресиращ клон има ниво на експресия 1-2 мг/мл rnpAIgG.

Ва/РЗ-клетки, експресиращи mpl Р кДНК, съответствуваща на цялата кодираща област на човешки mpl Р? се клонира в pRK5-tkneo, който впоследствие се линеаризира с Notl и се

Ms' 5 трансфектира в IL-3-зависимата клетъчна линия Ba/F3 чрез електропорация (1 х 10? клетки, 9605Ф, 250Волта). Селекцията започва три дни по-късно в присъствието на 2 мг/мл G418. Клетките се селекционират на групи или се получават индивидуални клонове чрез лимитиращо разреждане в 96-ямкови платета. Отбраните клетки се съхраняват в RPMI, съдържаща 15% FSB, 1 мг/мл G418, 20 мМ глутамин, 10 мМ HEPES и 100 мкг/мл Pen-Strep. Експресията на тр!Р в отбраните клонове се определя чрез FACS-анализ (флуоресцентно-активирано клетъчно сортиране) като се използува анти-тр/ Р заешко поликлонално антитяло.

Тест за Ва/РЗ-тр!-лиганд

МрАлигандният тест се провежда, както е показано на фиг. 2. За да се определи наличието на трАлиганд от различни източници. Ва/РЗ-трАклетките се поставят 24 часа в условия на гладуване за IL-3 при клетъчна плътност 5 х 10^ клетки/мл в инкубатор с поддържана влага на 37°С в 5% СО2 и въздух. След гладуването за IL-3 клетките се посяват в 96-ямкови културални платета при плътност 50 000 клетки в 200 мкл среда със или без разредени проби и се култивират 24 часа в инкубатор за клетъчни култури. Последните 6-8 часа се добавят 20 мкл RPMI-среда без серум, съдържаща 1 мкКи ЗН-тимидин. След това клетките се събират върху 96-ямкови GF/С-филтърни платета и се промиват 5 пъти с вода, филтрите се преброяват в присъствието на 40 мкл сцинтилационна течност (Microscint 20) в брояч Packard Top Count.

ПРИМЕР 2

Високо пречистен свински /пр/-лиганд

Протокол за елуиране от тел

На стайна температура без редуциращ агент се смесват равни количества от афинитетно пречистен тирАлиганд (фракция 6 от колоната mpAIgG) и 2Х буфер на Laemmli за проби и се нанасят на Novex 4-20% полиакриламиден гел, колкото е възможно по-бързо. Пробата не се нагрява. Като контрола в съседния старт се нанася буфер за проби без лиганд. Гелът се пуска на 4-6°С при

-14Б χ

135 волта за около 21/4 часа. Първоначално електрофорезният буфер е на стайна температура. След това телът се отстранява от гелния апарат, като се отстранява и плаката от едната страна на тела.

Прави се реплика на гела върху нитроцелулоза, както следва: Късче нитроцелулоза се намокря с дестилирана вода и внимателно се поставя върху откритата повърхност на гел, така че да не се образуват въздушни мехурчета. Върху нитроцелулозата и гелната плака се поставят фиксиращи маркери, така че след оцветяването репликата да би могла да се наложи точно. След приблизитлно 2 минути нитроцелулозата се отстранява внимателно, гелът се завива с пластична обвивка и се поставя в хладилник. Нитроцелулозата се оцветява със златно багрило за тотален белтък на Biorad, като най-напред се тя се инкубира чрез разклащане в 3 х 10 мл 10% Tween 20 + 0,5 М NaCI + 0,1 М Tris-HCI pH 7,5 в продължение на приблизително 45 минути, последвано от 3 х 10 мл пречистена вода за 5 минути. След това се прибавя златното багрило и се оставя да се проявява, докато започнат да се виждат ивиците в стандартите. След това репликата се промива с вода, поставя се върху пластичната обвивка на гела и се налага внимателно с fiducial-ните маркери. Местата на стандартите Novex се маркират върху гелната плака и се начертават линии, за да се отбележат местата на срязване. След това нитроцелулозата и пластичната обвивка се отстраняват и гелът се срязва по дължината на маркираните линии с остро ножче за бръснене. Срезите се продължават и след стартовете с пробите, така че да могат да се използуват за определяне местата на късчетата след като гелът се оцвети. След отстраняване на късчетата останалият гел се оцветява по сребро и се определят местата на стандартите и на маркерите за срязване. Молекулните тегла, съответствуващи на местата на срязване, се определят от Novex-стандартите.

В клетките на два апарата за електроелуиране на Biorad, модел 422, се поставят 12-те гелни късчета. В клетките се използуват мембранни шапки с отрязък над 12-14К молекулни тегла. Буферът за елуиране представлява 50 мМ амониев бикарбонат -I- 0,05% SDS (приблизително pH 7,8). Преди употреба един литър буфер се охлажда приблизително 1 час в 4-6°С хладилно помещение.

/47

Гелните късчета се елуират при 10 мА/клетка (40 В първоначално) в 4-6°С хладилно помещение. Елуирането отнема приблизително 4 часа. След това клетките внимателно се отстраняват, като с пипета се отнема и течността над фритата. Камерата за елуиране се отстранява, като с пипета се премахва всякаква течност над мембранната шапка. Течността в мембранната шапка се събира с пипета и се съхранява. След това в шапката се поставят петдесет мкл пречистена вода, разклаща се и се отстранява, докато се разтворят кристалите от SDS. Тези промивки се обединяват със запазената течност по-горе. Тоталният обем на елуираната проба е 300-500 мкл на гелно късче. Пробите се поставят в 10 мм-ров диализен шлаух Spectrapor 4 с отрязък над 12-14К, който е бил накиснат няколко часа в пречистена вода. Те се диализират през нощта на 4-6°С срещу 600 мл буфериран с фосфат солеви разтвор (PBS е приблизително 4 мМ по калий) на 6 проби. На следващата сутрин буферът се сменя и диализата продължава 2,5 часа. Пробите след това се отстраняват от диализните шлаухи и се поставят в микроцентрофужни епруветки. Епруветките се поставят на лед за един час, центрофугират се в микроцентрофуга на 14К об/мин за 3 мин и надстоящите течности се отстраняват внимателно от преципитиралия SDS. След това надстоящите течности се поставят на лед за около повече от 1 час и отново се центрофугират 4 мин. Надстоящите течности се разреждат във фосфатно буфериран солеви разтвор и се предоставят за тестиране на активност. Останалите проби се замразяват на -70°С.

ПРИМЕР 3

Микросеквениране на свински /прАлиганд

Фракция 6 (2,6 мл) от mpAlgG-афинитетната колона се концентрира върху Microcon-10 (Amicon). За да се предотврати абсорбирането на /прАлиганда към Microcon, мембраната се промива с 1% SDS и към фракция 6 се прибавят 5 мкл 10% SDS. След концентрирането с Microcon към фракция #6 (20 мкл) се добавя 2Х буфер за проби (20 мкл) и целият обем (40 мкл) се нанася в единичен старт на 4-20% градиентен акриламиден гел (Novex). Провежда се гелна ΐ48 електрофореза като се следва протокола на Novex. След това гелът се уравновесява за 5 мин преди електроблотинга с буфер 10 мМ 3(циклохексиламино)-1-пропансулфонова киселина (CAPS), pH 11,0, съдържащ 10% метанол. Електоблотингът върху мембрани Immobilon-PSQ (Millipore) се извършва за 45 мин на 250 мА постоянен ток в клетка за пренос на апарат BioRad TransBlot. PVDF-мембраната се оцветява с 0.1 % Coomassie Blue R-250 в 40% метанол, 0,1% оцетна киселина за 1 мин и се обезиветява за 2-3 мин с 10% оцетна киселина в 50% метанол. Единствените белтъци, които се забелязват в областта на блота с Мг 18 000-35 000, имат Мг 30 000, 28 000 и 22 000.

Ивиците при 30, 28 и 22 кДа се подлагат на белтъчно секвениране. Автоматизираното белтъчно секвениране се провежда със секвенатор на Applied Biosystem, модел 470 А, екипиран с включен към него РТН-анализатор. Секвенаторът се модифицира за инжектиране на 80-90% от пробата (Rodriguez, J. Chromatogr., 350:217-225(1985]). Към разтвор А се добавя ацетон (приблизително 12 мкл/л), за да се балансира UV-поглъщането. Прехвърлените чрез електроблотинг белтъци се секвенират в блотинговата мембрана. Пиковете се интегрират с компютърната програма Justice Innovation като се използуват интерфейси Nelson Analytical 970. Интерпретацията на последователностите се извършва на VAX 5900 (Henzel et al.. J. Chromatogr., 404:41-52 [1987]). Nтерминалните последователности (като се използува еднобуквеният код, а несигурните остатъци са в скоби) и количеството получен материал (в средни скоби) са представени в Таблица 2'.

ТАБЛИЦА 2'.

/Ир/-лигандни аминокиселинни последователности

ЗОкДа [1,8пмол] 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD(H/S)VLH(G)RL	(SEQ ID N0:30)
28кДа [0,5пмол] 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR		(SEQ ID N0:31)
18-22 кДа [0,5пмол]	'ч

Ϊ43

5 10

XPAPPAXDPRLX(N)K

Jr (SEQ ID N0:32)

ПРИМЕР 4

Тест за мегакариоцитопоеза в суспенсионна течност

Човешки периферни стволови клетки (PSC) (получени със съгласието на ' пациентите) се разреждат 5 пъти с IMDM-среда (Gibco) и се центрофугират за 15 мин на стайна температура при 800 х д. Клетъчните утайки се ресуспендират в IMDM, надслояват се върху 60% Percoll (плътност 1,077 гм/мл) (Pharmacia) и се центрофугират на 800 g за 30 мин. Мононуклеарните клетки с ниска плътност се извличат от интерфазата, промиват се 2х с IMDM и се посяват при 1-2 х 10θ клетки/мл в IMDM, съдържаща 30% FBS (1 мл краен обем) в 24-ямкови платета за тъканни култури (Costar). Прибавя се АРР или изтощена с трАлиганд АРР до 10% и културите се култивират 12-14 дни във влажен инкубатор на 37°С в 5% COg и въздух. Културите се култивират също в присъствието на 10% АРР като в дни 0,2 и 4 се прибавят 0,5 мкг mpAIgG. АРР се изтощава с /прАлиганд чрез прекарване на АРР през mpAlgG-афинитетна колона.

За измерване на мегакариоцитопоезата в тези течни суспенсионни култури се използува модификация на Solberg et at. като се употребяват радиоактивно белязано мише IgG моноклонално антитяло (HP1-1D) срещу GPIIbllla (предоставено от Dr. Nichols, Mayo Clinic). 100 мкг от HP1-1D (виж Grant, В. et a!., Blood 69:1334-1339 [1987] се бележат радиоактивно с 1 мКи Na¹25| чрез Enzymobeads (Biorad, Richmond, СА), както е описано в инструкциите на производителя. Радиоактивно белязаното НР1-1 D-антитяло се съхранява на -70°С в PBS, съдържащ 0,01% октилглюкозид. Типичните спечифични активности са 1-2 х 10θ cpm/мкг (>95%, утаени с 12,5% трихлороцетна киселина).

Течните суспензионни култури се залагат в три повторения за всяка експериментална точка. След 12-14 дни култивиране 1 мл култури се прехвърлят в

1,5 мл епруветки Eppendorf, центрофугират се на 800 g за 10 мин на стайна температура и получените клетъчни утайки се суспендират в 100 мкл PBS, съдържащ 0,02% EDTA и 20% говежди телешки серум. Към ресуспендираните tSD култури се прибавят 10 нг 125|-HP1-1D в 50 мкл буфер за тестиране и се инкубира 60 мин на стайна температура (RT) с епизодично разклащане. Впоследствие клетките се събират чрез центрофугиране при 800 g за 10 мин на стайна температура и се промиват 2х с буфера за тестиране. Утайките се преброяват за 1 мин в гама-брояч (Packard). Неспецифичното свързване се определя чрез прибавяне на 1 мкг небелязано HP1-1D за 60 мин преди добавянето на белязаното HP1-1D. Специфичното свързване се определя като тоталната ¹²⁵I-HP1-1Dсвързана радиоактивност минус тази свързана в присъствието на излишък от небелязано HP1-1D.

ПРИМЕР 5

Олигонуклеотидни праймери за ПВР

Въз основа на аминотерминалната аминокиселинна последователност, получена за белтъците от 30 кДа, 28 кДа и 18-22 кДа, се проектират дегенерирали (изродени) олигонуклеотиди с цел използуването им като праймери за полимеразна верижна реакция (ПВР) (виж Таблица 4). Синтезират се две групи праймери, позитивна сенс (значеща) 20-мер-група, кодираща аминокиселинни остатъци 2-8 (mpl 1) и антисенс 21-мер-група, комплементарна на последователности, кодиращи аминокиселини 18-24 (mpl-2).

ТАБЛИЦА 4

Групи от дегенерирали олигонуклеотидни праймери

mpl 1:5' CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (2048-пъти дегенерирал)	(SEQ ID NO: 35)
mpl 2:5' NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3' (2048 пъти дегенерирал)	(SEQ ID NO: 36)

Свинска геномна ДНК, изолирана от свински лимфоцити от периферна кръв, се използува като матрица за ПВР. Реакцията от 50 мкл съдържа: 0,8 мкг свинска геноман ДНК в 10 мМ Tris-HCI (pH 8,3), 50 мМ KCI, 3 мМ MgCl2,100 мкг/мл

BSA, 400 мкМ dNTPs, 1 мкМ от всяка група праймери и 2,5 единици TaqL51 полимераза. Първоначалната денатурация на матрицата е на 94°С за 8 мин, следвана от 35 цикъла от по 45 секунди на 94°С, 1 мин на 55°С и 1 мин на 72°С. Крайният цикъл се оставя да продължи 10 мин на 72°С. ПВР-продуктите се разделят чрез електрофореза в 12% полиакриламиден гел и се визуализират чрез оцветяване с етидиев бромид. Приема се, че ако аминотерминалната аминокиселинна последователност се кодира от единичен екзон, то се очаква коректният ПВР-продукт да бъде 69 нд. ДНК-фрагмент с тази големина се елуира от гела и се субклонира в pGEMT (Promega). Последователностите на три клона са показани по-долу в Таблица 5.

ТАБЛИЦА 5

Свински геномни ДНК-фрагменти от 69 нд детТЗ

5'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA

GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT TGACCACGTT CAGCACGGC [69 нд] (SEQ ID NO: 37)

ACTGGTGCAA GTCGTCCCG (SEQ ID NO: 38) gemT7

5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA

GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT CGACCACGTC CATCACGGC [69 нд] (SEQ ID NO: 39)

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG (SEQ ID NO: 40) gemT9

PRLLNKLLR (SEQ ID NO: 32)

5'CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACGAT3 ’GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACTGCIA GTACAGATTCACGGT 3' (SEQ ID NO: 41)

CATGTCTAAGTGCCA 5' (SEQ ID NO: 42)

Местата на ПВР-праймерите са означени чрез подчертаване на базите. Тези резултати потвърждават N-терминалната последователност за аминокиселини 917 на белтъците от 30 кДа, 28 кДа и 18-22 кДа и показват, че тази последователност се кодира от единичен екзон на свинската ДНК.

ПРИМЕР 6

152.

Ген за човешкия mpl-лиганд

На основата на резултатите от Пример 5 се проектира и синтезира 45мер дезоксиолигонуклеотид, наречен pR45, за скриниране на геномна библиотека. 45-мера има следната последователност: 5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TGG-GAG-TCG3' (SEQ ID NO: 28)

Този олигонуклеотид се З^Р-бележи с (гама³2р)-АТР и Т4-киназа и се използува за скриниране на човешка геномна ДНК-библиотека в Iambdagem12 при условия на хибридизация и миене с ниска строгост (виж Пример 7). Положителните клонове се подбират, пречистват се от плаки и се анализират чрез рестриктазно картиране и Southern-блотинг. Клон #4 се избира за допълнителен анализ.

BamHI-Xbal-фрагмент от 2,8 кн, който хибридизира с 45-мера, се субклонира в pBluescript SK-. Извършва се частично ДНК-секвениране на този клон чрез използуване като праймери на олигонуклеотиди, специфични за свинската трАлигандна ДНК-последователност. Получената последователност потвърждава, че е изолирана ДНК, кодираща човешкия хомолог на свинския mpl· лиганд. В последователността се открива EcoRI-рестриктазно място, което позволява от 2,8 кн BamHI-Xbal-фрагмента да се изолира EcoRI-Xbal-фрагмент от 390 нд и да се субклонира в pBluescript SK-.

Секвенират се и двете вериги на този фрагмент. Човешката ДНКпоследователност и изведената аминокиселинна последователност са показани на фиг. 9 (SEQ ID NOS: 3 & 4). Със стрелки са показани също и предсказаните места на интроните в геномната последователност, които определят предполагаемия екзон (екзон 3).

Изследването на предсказаната аминокиселинна последователност потвърждава, че първата аминокиселина на зрелия трАлиганд е серинов остатък, което се определя от директния анализ на аминокиселинната последователност. Непосредствено пред този кодон предсказаната аминокиселинна последователност силно напомня сигнална последователност, участвуваща в (53 секрецията на зрелия /прАлиганд. По всяка вероятност тази област, кодираща сигнал, е прекъсната в нуклеотидна позиция 68 от интрон.

Изглежда, че в посока 3' екзонът завършва при нуклеотид 196. Поради това този екзон кодира последователност от 42 аминокиселини, 16 от които вероятно са част от сигнална последователност и 26 от които са част от зрелия човешки /прАлиганд.

ПРИМЕР 7

Пълноразмерна кДНК на човешкия mpl-лиганд

Като се изхожда от последователността на човешки екзон 3 (Пример 6) се синтезират два недегенерирали олигонуклеотида, съответствуращи на 3'- и 5'-краищата на екзон 3 (Таблица 6).

ТАБЛИЦА 6

Човешки кДНК недегенерирали олигонуклеотидни праймери за ПВР

Прав праймер: 5'GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTC T3‘ (SEQ ID NO: 43)

Обратен npaflMep:5'CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G3‘ (SEQ ID N0:44)

Тези два праймера се използуват в ПВР-реакции, използувайки като матрица ДНК от различни човешки кДНК-библиотеки или 1 нг кДНК Quick Clone (Clonetech) от различни тъкани, като се използуват условията, описани в Пример 5. Очакваната големина на коректния ПВР-продукт е 140 нд. След анализ на ПВРпродуктите в 12% полиакриламиден гел се открива ДНК-фрагмент с очакваната големина в кДНК-библиотеките, приготвени от бъбречни клетки на възрастен, от 293-фетални бъбречни клетки и в кДНК, приготвена от човешки фетален черен дроб (Clonetech кат. #7171-1).

кДНК-библиотеката от фетален черен дроб в lambda DR2 (Clonetech кат. # HL1151x) се скринира със същия 45-мер олигонуклеотид, използуван за скриниране на човешката геномна библиотека. Олигонуклеотидът се бележи с (гама32р)-АТР чрез използуване на Т4-полинуклеотидкиназа. Библиотеката се <54 скринира при условия на хибридизация с ниска строгост, филтрите се прехибридизират за 2 часа, след това се хибридизират със сондата през нощта на 42°С в 20% формамид, 5xSSC, IOXDenhardt-разтвор, 0,05М натриев фосфат (pH 6,5), 0,1% натриев пирофосфат, 50 мкг/мл озвучена ДНК от сперма на сьомга за 16 часа. След това филтрите се изплакват в 2xSSC и после се измиват веднъж в 0,5xSSC, 0,1% SDS на 42°С. филтрите се експонират през нощта върху рентгенов филм на Kodak. Положителните клонове се събират, пречистват се от плаки и големината на инсерта се определя чрез ПВР , като се използуват олигонуклеотиди, фланкиращи BamHI-Xbal-клонирането в lambda DR2 (Clonetech кат. #6475-1). Като източник на матрица се използуват 5 мкл от съхранените фаги. Първоначалната денатурация е за 7 мин на 94°С, следвана от 30 цикъла на амплификация (1 мин на 94°С, 1 мин на 52°С и 1,5 мин на 72°С). Крайното удължаване е за 15 мин на 72°С. Клон # FL2b има инсерт от 1,8 кн и се избира за по-нататъшнен анализ.

Плазмидът pDR2 (Clonetehch, lambda DR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p 42), който се съдържа във фаговите рамена на lambdaDR2, се изолира, както е описано в инструкциите на производителя (Clonetehch, lambda DR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p 29-30). Рестриктазният анализ на плазмида pDR2-FL2b с BamHI и Xbal посочва наличието на вътрешно BamHI-рестриктазно място в инсерта приблизително в позиция 650. Смилането на плазмида с BamHI-Xbal срязва инсерта на два фрагмента, един от 0,65 кн и един от 1,15 кн. ДНКпоследователността се определя с три различни класа матрица, получена от плазмида pDR2-FL2b. ДНК-секвенирането на двойноверижна плазмидна ДНК се извършва с автоматизирания флуоресцентен ДНК-секвенатор ABI317 (Applied Biosystems, Foster City, California), като се използуват стандартни протоколи за белязани с багрило дидезоксинуклеозидтрифосфатни терминатори (цветни терминатори) и обичайно синтезираните праймери за напредване по веригата (Sanger etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977]; Smith etal., Natrue, 321:674-679 [1986]). Директно секвениране на амплифицираните чрез

Ι55~ полимеразна верижна реакция фрагменти от плазмида се провежда със секвенатора ABI373 като се използуват реакции с обичайните праймери и цветни терминатори. Едноверижна матрица се получава с вектора М13 Janus (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21:3385-3390 [1993]. Фрагментите BamHI-Xbal (1,15 кн) и BamHI (0,65 кн) се изолират от плазмида pDR2-FL2b, краищата се запълват с Т4 ДНК-полимераза в присъствието на дезоксинуклеотиди и след това се субклонират в Smal-мястото на М13 Janus. Секвенирането се извършва по стандартни протоколи за белязани с багрило М13 универсални и обратни праймери или чрез праймери за напредване по веригата и цветни терминатори. Ръчните реакции за секвениране се извършват върху едноверижна М13-ДНК чрез използуване на праймери за напредване по веригата и стандартния протокол за терминация с дидезоксинукклеотиди ((Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977]), ЗЗр-белязан α-dATP и секвеназа (Sequenase) (Unated States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Сглобяването на ДНК-последователността се извършва със Sequencher V2.1b12 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). Нуклеотидната и изведената от нея последователност на hML са дадени на фиг. 1 (SEQ ID N0:1).

ПРИМЕР 8

Изолиране на гена за човешки mpl-лиганд (ТРО)

Човешки геномни ДНК-клонове на ТРО-гена се изолират чрез скриниране на човешка геномна библиотека в Iambda-Gem12 с pR45 - преди това описана олигонуклеотидна сонда, при условия на ниска строгост (виж Пример 7) или при условия на висока строгост с фрагмент, съответствуващ на 3'половината от човешка кДНК, кодираща трАлиганда (от BamHI-мястото до 3'края). Изолират се два припокриващи се ламбда-клонове, покриващи 35 кн. Двата припокриващи се фрагмента (BamHI и EcoRI), съдържащи целия ТРО-ген се субклонират и секвенират. Структурата на човешкия ген е съставена от 6 екзона в рамките на 7 кн генома ДНК (фиг. 14 А, В и С). Свързващите области на всички връзки екзон/интрон се съгласуват с консенсусния мотив, установен за гените на бозайници (Shapiro, М. В., etal., Nucl. Acids Res. 15:7155 [1987]). Екзон 1

15Ь и екзон 2 съдържат 5'-нетранслираща се последователност и първите четири аминокиселини от сигналния пептид. Останалата част от секреторния сигнал и първите 26 аминокиселини от зрелия белтък се кодират от екзон 3. Целият карбоксилен домен и 3'-нетранслиращата се област, както и около 50 аминокиселини от еритропоетиноподобния домен, се кодират от екзон 6. Четирите аминокиселини, включени в делецията, наблюдавана в hML-2 (hTPO-2), се кодират в 5'-края на екзон 6.

ПРИМЕР 9

Транзитна експресия на човешки mpl-лиганд (hML)

За да се субклонира пълноразмерният инсерт, съдържащ се в pDR2FL2b, плазмидът се смила напълно с Xbal и след това се смила частично с BamHI. ДНК-фрагмент, съответствуващ на инсерта от 1,8 кн се пречиства от гел и се субклонира в pRK5 (pRK5-hmp/ I) (виж патент на САЩ No. 5 258 287 за конструирането на pRK5) под контрола на непосредствено ранния промотор на цитомегаловируса. ДНК от конструкцията pRK5-hmp/1 се получава по метода с PEG (полиетиленгликол) и се трансфектира в човешки ембрионални бъбречни 293-клетки, които се култивират в модифицирана от Dulbecco среда на Eagle (DMEM), допълнена с хранителната смес F-12, 20 мМ HEPES (pH 7.4) и 10% фетален говежди серум. Клетките се трансфектират чрез калциево-фосфатния метод, както е описано от (Gorman, С. [19985] в DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D. M., ed) Vol. II, pp. 143-190, IRL Press, Washington, D. C.). 36 часа след трансфекцията надстоящата течност от трансфектираните клетки се тестира за активност чрез теста за пролиферация (виж Пример 1). Надстоящата течност от 293-клетките, трансфектирани само с вектора pRK, не показва стимулиране на Ba/F3 или на Ва/РЗ-/ирАклетките (фиг. 12А). Надстоящата течност от клетките, трансфектирани с pRK5-hmp/1, няма ефект върху Ва/ЕЗ-клетките, но стимулира драстично пролиферацията на Ва/БЗ-трАклетките (фиг. 12А), което означава, че тази кДНК кодира функционално активен човешки /прАлиганд.

157

ПРИМЕР 10

Изоформи на човешкия mpi-лиганд hML2, hML3 и hML4

За да се идентифицират форми на hML, резултат от алтернативен сплайсинг, се синтезират праймери, съответствуващи на всеки край от кодиращата последователност на hML. Тези праймери се използуват в RT-PCR за амплификация на човешка чернодробна РНК от възрастен. Допълнително се конструират вътрешни праймери, фланкиращи избрани области, представляващи интерес, (виж по-долу) и се използуват по подобен начин. Директното секвениране на краищата на ПВР-продукта разкрива единствена последователност, съответствуваща точно на последователността на кДНК, изолирана от човешката библиотека от фетален черен дроб (виж фиг. 1 [SEQ ID N0:1]). Област обаче, близо до С-края на ЕРО-домена (в средата на ПВРпродукта) показва комплексна последователност, което указва на наличието на възможни варианти за сплайсинг в тази област). За изолирането на тези сплайсингови варианти се използуват праймерите, дадени в Таблица 7, които фланкират областта, представляваща интерес. Те се използуват в ПВР като матрици за човешка кДНК от черен дроб на възрастен.

ТАБЛИЦА 7

ПВР-праймери за изоформи на човешкия ML

phmpllcdna.3e1: 5'TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3'	(SEQ ID NO: 45)
pbx4.f2: 5OGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3'	(SEQ ID NO: 46)

ПВР-продуктите се субклонират с подравнени краища в М13.

Секвенирането на индивидуални субклонове разкрива наличието на най-малко 3 ML-изоформи. Една от тях, hML (означавана също като hML^), е най-дългата форма и съответствува точно на последователността, изолирана от библиотеката от фетален черен дроб. Последователностите на четирите щоЛлигандни изоформи, изредени от най-дългата (hML) към най-късата (hML-4), са дадени на (Фиг. 11 [SEQ ID NOS: 6, 8, 9 & 10]).

tsfc

ПРИМЕР 11

Конструиране и транзитна експресия на изоформи и на субституционни варианти на човешкия mpl-лиганд hML2, hML3 и hML(R153A, R154A)

Изоформите hML2 и hML3 и субституционният вариант hML(R153A, R154A) се реконституират от hML като се използува рекомбинантната ПВРтехника, описана от Russell Higuchi, в PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A.Innis, D.H.Gelfand, J.J.Sninsky &T.J. White Editors.

Използуваните във всички конструкции външни праймери са показани в Таблица 8, а припокриващите се праймери са показани в Таблица 9.

ТАБЛИЦА 8

Външни праймери

Cla.FL.F2: 5'АТС GAT ATC GAT AGC CAG АСА ССС CGG CCA G3'	(SEQ ID NO: 47)
HMPLL-R: 5'GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA31	(SEQ ID N0:48)
ТАБЛИЦА 9
Припокриващи се праймери
hML-2; MLA4.F: 5'CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC31 MLA4.R: 5'GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG3'	(SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 50)
hML-3: hMLA116+: 5’CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT3' hMLAl 16-: 5'AAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG3'	(SEQ ID N0:51) (SEQ ID N0:52)
hML(R153A, R154A): RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA 03' RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G3‘	(SEQ ID N0:53) (SEQ ID N0:54)

Всички ПВР-амплификации се провеждат с клонирана ДНК-полимераза

Pfu (Stratagene) при използуване на следните условия: Първоначалната температура на денатурация е 94°С за 7 мин, следвана от 30 цикъла от 1 мин на

159

94°С, 1 мин на 55°С и 1,5 мин на 72°С. Последният цикъл се оставя да продължи за 10 мин на 72°С. Крайният ПВР-продукт се смила с Clal-Xbal, пречиства се от гел и се клонира в pRK5tkneo. 293-клетки се трансфектират с различните конструкции, както е описано по-горе, и надстоящата течност се тестира като се използува Ba/F3-mp/ пролиферационния тест. В този тест hML-2 и hML-З не показват детектируема активност, но активността на hML(R153A, R154A) е сходна с hML, което посочва, че процесингът в това дибазично място не е необходим за активността (виж Фиг. 13).

ПРИМЕР 12 кДНК на миши /прАлиганд mML, mML-2 и mML-З

Изолиране на mML кДНК

ДНК-фрагмент, съответствуващ на цялата кодираща област на мишия трАлиганд, се получава чрез ПВР, пречиства се от гел и се бележи чрез иницииране на синтезата със случайни праймери в присъствието на θ2ρ-άΑΤΡ и 3²P-dCTP. Тази сонда се използува за скриниране на 10® клона от миша чернодробна кДНК-библиотека в lambdaGTIO (Clonetech кат.# ML3001a). Филтри в по две повторения се хибридизират в 35% формамид, 5xSSC, 10xDenhardt's, 0,1% SDS, 0,05М натриев фосфат (pH 6,5), 0,1% натриев пирофосфат, 100 мкг/мл озвучена ДНК от сперма на сьомга в присъствието на сондата, филтрите се изплакват с 2xSSC и след това се измиват веднъж в 0,5xSSC, 0,1% SDS на 42°С. Хибридизиращите фаги се пречистват от плаки и кДНК-инсертите се субклонират в EcoRI-мястото на Bluescript SK- плазмид. Клон LD с инсерт от 1,5 кн се избира за по-нататъшен анализ и двете вериги се секвенират, както е описано по-горе за човешката ML кДНК. Нуклеотидната и изведената аминокиселинна последодвателности на клон LD са дадени във Фиг. 14 (SEQ ID NOS: 1 & 11). Изведената миша ML-последователност от този клон е дълга 331 аминокиселинни остатъци и се идентифицира като 1T1ML331 (или mML-2 за целите, описани подолу). Наблюдава се значителна идентичност, както в нуклеотидната, така и в ιιο изведената аминокиселинна последователности в ЕРО-подобните домени на тези ML's. При успоредно налагане на изведените аминокиселинни последователности на човешкия и на мишия ML, обаче, изглежда че мишата последователност има тетрапептидна делеция между човешките остатъци 111-114, съответствуваща на 12-нуклеотидната делеция след нуклеотидна позиция 618, наблюдавана както в човешката (виж по-горе), така и в свинската (виж по-долу) кДНК. В съгласие с това се изследват допълнителни клонове за откриване на възможни миши MLизоформи. Един клон, L7, има инсерт от 1,4 кн с 335 изведена аминокиселинна последователност, съдържащ липсващия тетрапептид LPLQ. Смята се, че тази форма представлява пълноразмерния миши ML и се означава като mML или mML335. Нуклеотидната и изведената аминокиселинна последователност на mML са дадени във фиг. 16 (SEQ ID NOS: 12 & 13). Най-накрая клон L2 се изолира и секвенира. Този клон има 116-нуклеотидната делеция, сответствуваща на hML3 и поради това се означава mML-З. Сравнение на изведените аминокиселинни последователности на тези две изоформи е дадено във фиг. 16.

Експресия на рекомбинантен mML. Експресионните вектори за миши ML се приготвят главно, както е описано в Пример 8. Клоновете, кодиращи mML и mML-2 се субклонират в pRK5tkneo, експресионнен вектор за бозайници, който обезпечава експресия под контрола на CMV-промотора и 8\/40-сигнал за полиаденилиране. Получените експресионни вектори, mMLpRKtkneo и mML2pRKtkneo се трансфектират транзитно в 293-клетки като се използува методът с калциев фосфат. След транзитната трасфекция средите се култивират за 5 дни. Клетките се поддържат в DMEM-среда с високо съдържание на глюкоза, допълнена с 10% фетален телешки серум.

Експресия на миши mpl (mmpl) в Ва/ЕЗ-клетки. Стабилни клетъчни линии, експресиращи c-mpl, се получават чрез трансфекция на mmpl pRKtkneo, главно както е описано за човешкия mpl в Пример 1. Накратко, експресионен вектор (20 мкг; линеаризиран), съдържащ цялата кодираща последователност на мишия mpl (Skoda, R. С., et al., EMBO J. 12:2645-2653 [1993] се трансфектира в Ва/ЕЗ-клетки чрез електропорация (5 X 10θ клетки, 250 волта, 960 мкф), с <41 последваща селекция за неомицинова устойчивост при 2 мг/мл G418. Експресията на тр! се тестира чрез проточен цитометричен анализ като се използуват заешки антимиши mpAIgG антисеруми. Ва/ГЗ-клетките се поддържат в среди RPMI 1640 от WEHI-ЗВ-клетки като източник на IL-3. Надстоящите течности от 293-клетките, трансфектирани транзитно с mML и mML-2, се тестират в Ва/ЕЗ-клетки, трансфектирани с mmp/и hmpl, както е описано в Пример 1.

ПРИМЕР 13 кДНК на свински /прЛлиганд pML и pML-2 кДНК на свински ML (pML) се изолира чрез RACE PCR (ПВР). Накратко, проектират се олиго dT-праймер и 2 специфични праймера на основата на последователността на екзона на свинския ML-ген, кодиращ аминокрая на ML, пречистен от апластичен свински серум. Получава се и се амплифицира кДНК от различни апластични свински тъкани. В бъбрека се открива ПВР-кДНК-продукт от 1342 и се субклонира. Секвенират се няколко клона и се намира, че те кодират зрял свински mplлиганд (невключващи пълния сигнал за секреция). Намира се, че кДНК кодира зрял белтък от 332 аминокиселини (PML332), имащ последователността, показана във фиг. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16).

Метод: Изолиране на pML-ген и кДНК. Геномни клонове на свинския ML-ген се изолират чрез скриниране на свинска геномна библиотека в EMBL3 (Clontech Inc.) с pR45. Библиотеката се скринира главно, както е описано в Пример 7. Изолират се няколко клона и се секвенира екзона, кодиращ аминокиселинна последователност, идентична с тази, получена от пречистения ML. Свински ML кДНКи се получават, като се използува модифициран протокол за RACE-PCR. Проектират се два специфични праймера на основата на последователността на свинския ML-ген. Полиаденилирана мРНК се изолира от бъбреците на апластични прасета в общи линии така, както е описано по-рано. кДНК се получава чрез обратна транскрипция с BamdT-праймера, (BamdT: 5'GACTCGAGGATCCATCGAH I ГТГТТ1 I ΙΤΙΊΊΊ ГЗ') £

Ъ2(SEQ ID NO: 55) насочен срещу полиаденозиновата опашка на мРНК. Първи етап на ПВРамплификация (28 цикъла на 95°С за 60 секунди, 58°С за 60 секуниди и 72°С за деветдесет секунди) се провежда като се използува специфичния за ML праймер h-forward-1 (h-forward-1: 5^,GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT3‘ (SEQ ID NO: 43) и BAMAD-праймера (BAMAD: 5OACTCGAGGATCCATCG3') (SEQ ID NO: 56) в 100 мкл реакция (50 мМ KCI, 1,5 мМ ΜςΟΙρ, 10 мМ Tris pH 8,0, 0,2 мМ dNTPs c

0,05 Е/мл полимераза Amplitaq [Perkin Elmer Inc.]). След това ПВР-продуктът се смила с Clal, екстрахира се с фенол-хлороформ (1:1), утаява се с етанол и се лигира към 0.1 мг вектор Bluescript SK- (Stratagene Inc.), който е срязан с Clal и Kpnl. След инкубиране два часа на стайна температура една четвърт от лигазната смес се прибавя директно във втори етап на ПВР (22 цикъла, както е описано погоре) като се използува втори специфичен за ML праймер forward-1 (forward-1: 5OCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG3¹) (SEQ ID NO: 57) и ТЗ-21 (олигонуклеотид, който се свързва с последователност, съседна на полилинкерната област за клониране във вектора Bluescript SK-):

(5'CGAAATTAACCCTCACTAAAG3') (SEQ ID N0:58).

Полученият ПВР-продукт се смила с Xbal Clal и се субклонира в Bluescript SK-.

Секвенират се няколко клона от независими ПВР-реакции.

Отново се идентифицира втора форма, означена pML-2, кодираща белтък с делеция на 4 аминокиселинни остатъци (328 аминокиселинни остатъци) (виж фиг. 21 [SEQ ID NO: 21]). Сравняването на аминокиселинните последователности на pML и pML-2 показва, че последната форма е идентична с изключение на това, че тетрапептидът QLPP, съответствуващ на остатъци 111-114 включително, е *

#3 делетиран (виж фиг. 22 [SEQ ID NOS: 18 & 21]). Делециите на четири аминокиселини, наблюдавани в миша, човешка и свинска ML кДНК се срещат точно на едно и също място в предсказаните белтъци.

ПРИМЕР 14

СМК-тест за тромбопоетинова (ТРО) индукция на експресията на тромбоцитния антиген GPIIplllg

СМК-клетки се култивират в среда RMP11640 (Sigma), допълнена с 10% фетален говежди серум и 10 мМ глутамин. При приготвянето за теста клетките се събират, промиват се и се ресуспендират до 5x10$ клетки/мл в безсерумна среда GIF, допълнена с 5 мг/л говежди инсулин, 10 мг/л апо-трансферин, 1 X следови елементи. В 96-ямкови платета с плоско дъно се прибавят ТРО-стандарт или експерименталните проби в съответни разреждания в обеми от 100 мкл. Към всяка ямка се добавят по 100 мкл от СМК-клетъчната суспенсия и платетата се инкубират на 37°С в 5% СО2 инкубатор за 48 часа. След инкубацията платетата се завъртат на 1000 об/мин при 4°С за пет минути. Надстоящите течности се отстраняват и към всяка ямка се прибавят по 100 мкл от конюгираното с FITC GPIIbHla ллоноклонално 2О2-антитяло. След инкубиране на 4°С за 1 час платетата отново се завъртат на 1000 об/мин за пет минути. Надстоящите течности, съдържащи несвързано антитяло се отстраняват и към всяка ямка се добавят по 200 мкл промивка от 0,1% BSA-PBS. Стъпката на промивка с 0,1% BSA-PBS се повтаря три пъти. Клетките след това се анализират на FASCAN като се използува стандартният анализ на един параметър, измервайки относителната интензивност на флуоресценция.

ПРИМЕР 15

DAMI-тест за тромбопоетин (ТРО) чрез измерване на ендомитотичната активност на DAMI-клетки в 96-ямкови микротитърни платета

DAMI-клетки се култивират в IMDM + 10% конски серум (Gibco), допълнен с 10 мМ глутамин, 100 нг/мл Penicillin G и 50 мкг/мл стрепромицин. При подготовката за теста клетките се събират, промиват се и се ресуспендират до

1χ10θ клетки/мл в IMDM + 1% конски серум. В 96-ямкови платета със заоблено дъно към DAMI-клетъчната суспензия се прибавят 100 мкл от ТРО-стандарта и от експерименталните проби. След това клетките се инкубират 48 часа на 37°С в 5% СО^инкубатор. След инкубирането платетата се завъртат в центрофуга Sorvall 6000В на 1000 об/мин за 5 мин на 4°С. Надстоящите течности се отстраняват и стъпката на промивка с 200 мкл PBS-0,1%BSA се повтаря два пъти. Клетките се фиксират чрез прибавяне на 200 мкл ледено-студен 70% етанол-PBS и се ресуспендират чрез аспириране. След инкубиране на 4°С за 15 мин платетата се завъртат на 2000 об/мин за пет минути и към всяка ямка се прибавят 150 мкл 1 мг/мл RNAse, съдържащи 0,1 мг/мл пропидиев йодид и 0,05% Tween-20. След един час инкубация ан 37°С промените в съдържанието на ДНК се измерват чрез проточна цитометрия. Полиплоидността се изчислява, както следва:

(%клетки в >Θ2+Μ/%κλθτκη в <G2+M) сТРО

NAR= --------------------------------------------------------------------------------(%клетки в >Θ2+Μ/%κλθτκη в <G2+M) в контролата, където NAR означава нормализирано полиплоидно отношение (NAR)

ПРИМЕР 16 in vivo тест за тромбопоетин (ТРО) (Тест рикошет“на миши тромбоцити) In vivo тест за ³⁵5-детерминация на образуването на тромбоцити

С57В!_6-мишки (получени от Charles River) се инжектират интраперитонеално (IP) с 1 мл кози серум срещу миши тромбоцити (6 ампули) на първия ден, за да се предизвика тромбоцитопения. На 5-тия и 6-тия ден на мишките се правят две IP-инжекции с фактора или с PBS като контрола. На 7-мия ден се инжектират интравенозно тридесет мкКи Маз^вОд в 0,1 мл физиологичен разтвор и процентът включване на 35s от инжектираната доза в циркулиращите тромбоцити се измерва в кръвни проби, получени от третираните и от контролните мишки. В същото време се правят тромбоцитните числа и левкоцитните числа на кръв, получена от ретроорбиталния синус.

165

ПРИМЕР 17

KIRA-ELISA за тромбопоетин (ТРО) чрез измерване на фосфорилирането на mpl-Rse.gD химерния рецептор

Човешкият трАрецептор е представен от Vigon et al., PNAS, USA 89:5640-5644 (1992). За използуване в KIRA-ELISA, описан тук, се приготвя химерен рецептор, включващ екстрацелуларния домен (ECD) на трАрецептора и трансмембранния (ТМ) и интрацелуларен домен (ICD) на Rse (Mark etal., J. of Biol. Chem. 269(14):10720-10728 [1994] c карбокситерминален сигнализиращ полипептид (т.е. Rse.gD). Виж фиг. 30 и 31 за описанието на теста чрез диаграма.

(a) Приготвяне на улавящ агент

Продуцира се моноклонално анти-gD (клон 5В6) срещу пептид от глигопротеин D на вируса Hepres simplex (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 [1990]). Пречистеният концентриран препарат се довежда до 3,0 мг/мл във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), pH 7,4 и аликвоти от по 1,0 мл се съхраняват на -20DC.

(b) Приготвяне на антифосфотирозиново антитяло

Моноклонално антитирозиново (антитяло), клон 4G10, се закупува от UBI (Lake Placid, NY) и се биотинилира чрез използуване на биотин-Nхидроксисукцинамид с дълго рамо (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).

(c) Аиганд

Л/рАлигандът се приготвя чрез рекомбинантните техники, описани тук. Пречистеният трАлиганд се съхранява на 4°С като концентриран-разтвор.

(d) Приготвяне на Rse.gD нуклеинова киселина

Използуват се синтетични двойноверижни олигонуклеотиди за реконституиране на кодиращата последователност за С-крайните 10 аминокиселини (880-890) на човешкия Rse и за добавяне на допълнителни 21 аминокиселини, съдържащи епитоп за антитяло 5В6 и на стоп-кодон. Таблица 10 представя крайната последователност на синтетичната част от слетия ген.

ТАБЛИЦА 10

Синтетична двойноверижна част от човешкия Rse слят ген кодираща верига: 5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA TGGCTG ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT-3' (SEQ IDNO; 59) некодираща (антисенс) верига: 5'-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCA TCTTGAGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3' (SEQIDNO:60)

Синтетичната ДНК се лигира с кДНК, кодираща аминокиселини 1-880 на човешкия Rse в Pstl-мястото, започващо при нуклеотид 2644 от публикуваната кДНК-последователност на човешкия Rse (Mark et at., Jourant of Bilolgical Chemistry 269(14):10720-10728 [1994]) и в Hindlll-местата в полилинкера на експресионния вектор pSV17.ID.LL (Виж фиг. 32 A-L; SEQ ID NOL 22), за да се получи експресионният плазмид pSV.ID.Rse.gD. Накратко, експресионният плазмид включва дицистронен първичен транскрипт, който съдържа последователност, кодираща DHFR, присъединена посредством 5'-донорно и 3'акцепторно място за интронен сплайсинг, следвана от последователност, която кодира Rse.gD. Пълноразмерният (не претърпял сплайсинг) транскрипт съдържа DHFR като първа отворена рамка за четене и поради това образува DHFR-белтък, който позволява селекция на стабилни трансформанти.

(е) Приготвяне на mpl-Rse.gD нуклеинова киселина

Експресионният плазмид pSV.ID.Rse.gD, получен_;както е описано погоре, се модифицира, за да се получи плазмида pSV.ID.M.tmRd6, който съдържа кодиращата последователност на ECD на човешкия mpl (аминокиселини 1-491), слята с трансмембранния домен и интрацелуларния домен на Rse.gD (аминокиселини 429-911). Използуват се синтетични олигонуклеотиди, за да се свърже кодиращата последователност на част от екстрацелуларния домен на човешкия mpl с част от Rse-кодиращата последователност в двустъпална ПВРклонираща реакция, както е описано от Mark etal., J. Biol. Chem. 267:26166-26171 (1992). Праймерите, използувани за първата ПВР-реакция са М1 (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3') (SEQ ID NO: 61) и M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3,) (SEQ ID NO: 62) c гпр/кДНК-матирица и R1 (5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3·) (SEQ ID NO: 63) и R2 (5-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO: 64) c Rse кДНК-матрица. Частта Pvull-Smal от тази област на сливане се използува за конструирането на пълноразмерен химерен рецептор.

(f) Клетъчна трансформация

ОР12.СНО-клетки (Европейски патент 307 247, публикуван на 15 март 1989) се електропорират с pSV.ID.M.tmRd6, който се линеаризира в уникалното Notl-място в гръбнака на плазмида. След екстракция с фенол/хлороформ ДНК се утаява с етанол и се ресрспендира в 20 мкл 1/10 Tris EDTA. След това 10 мкг ДНК се инкубират с 10? СНО ОР12-клетки в 1 мл PBS на лед за 10 мин преди електропорация при 400 волта и 330 мкф. Клетките отново се поставят на лед за 10 мин преди да се посеят в неселективна среда. След 24 часа клетките се подхранват със среда без нуклеозиди, за да се отберат стабилни DHFR+ клонове.

(д) Селекция на трансформирани клетки за използуване в KIRA-ELISA

Клонове, експресиращи (WPURse.gD, се идентифицират чрез Westernблотинг (имуноблотинг) на тотални клетъчни лизати след разделяне на SDS-PAGE като се използува антитялото 5В6, което детектира gD-епитопния белег.

(h) Среди

tes

Клетките се култивират в F12/DMEM 50:50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). Средите се допълват c 10% диафилтруван FBS (HyClone, Logan, Utah), 25 mM HEPES и 2 мМ L-глутамин.

(I) KIRA-ELISA

0Р12.СН0-клетки, трансформирани c /npARse.gD, се посяват (3x10^ на ямка) в ямките на плоскодънни 96-ямкови културални платета в 100 мкл среда и се култивират през нощта на 37°С в 5% СО2. На следващата сутрин надстоящата течност в ямките се декантира и платетата леко се изтръскват върху филтърна хартия. След това към всяка ямка се прибавят или изследваните проби или 200, 50, 12,5, 3,12, 0,87, 0,19, 0,048 или 0 нг/мл /?7рАлиганд. Клетките се стимулират на 37°С за 30 мин, надстоящата течност в ямките се декантира и платетата отново леко се обръщат и се изтръскват върху филтърна хартия. За да се лизират клетките и да се разтворят химерните рецептори, към всяка ямка се добавят 100 мкл лизиращ буфер. Лизиращият буфер се състои от 150 мМ NaCl, съдържащ 50 мМ HEPES (Gibco), 0,5% Triton-X 100 (Gibco), 0,01% тимерозал, 30 KIU/мл апротинин (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 мМ 4-(2-аминоетил)бензенсулфонилфлуорид хидрохлорид (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 mkM леупептин (ICN Biochemicals) и 2 мМ натриев ортованадат (ИазХ/Од; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7,5. След това платето се клати леко на клатачка за платета (Bellco Instruments, Vineland, NJ) за 60 мин на стайна температура.

Докато клетките се разтварят, микротитърното плата за ELISA, натоварено през нощта на 4°С с моноклоналното антитяло 5В6 (5,0 мкг/мл в 50 мМ карбонатен буфер, pH 9,6, 100 мкг/ямка) се декантира, изтръсква се върху филтърна хартия и се блокира със 150 мкл/ямка блокиращ буфер [PBS, съдържащ 0,5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) и 0,01% тимерозал] за 60 мин на стайна температура при леко клатене. След 60 минути платето, натоварено с анти-gD 5В6 се промива 6 пъти с миещ буфер (PBS, съдържащ 0,05% Tween-20 и 0.01% тимерозал) като се използува автоматично миещо устройство за платета (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc, Sterling, VA).

169

Лизатът, съдържащ разтворен MPL/Rse.gD_;OT клетъчнокултуралните микротитърни ямки се прехвърля (85 мкл/ямка) в ELISA-ямките, натоварени с анти-gD 5В6 и блокирани^ и се инкубира 2 часа на стайна температура при леко разклащане. Несвързаният mpARse.gD се отстранява чрез промиване с миещ буфер и към всяка ямка се добавят 100 мкл биотинилирано 4G10 (антифосфотирозиново антитяло), разредено 1:18 000 в буфер за разреждане (PBS, съдържащ 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, 5 мМ EDTA и 0,01% тимерозал), т.е. 56 нг/мл. След инкубиране 2 часа на стайна температура платето се промива и към всяка ямка се прибавят 100 мкл стрептавидин, конюгиран с пероксидаза от хрян (HRPO) (Zymed Laboratories, S. San Francisco, СА), разреден 1:60000 в буфер за разреждане. Платето се инкубира 30 минути на стайна температура при леко разклащане. Свободният авидинов конюгат се отмива и към всяка ямка се прибавят 100 мкл прясно приготвен субстратен разтвор (тетраметилбензидин [TMBJ; 2-компонентен субстратен набор реагенти; Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD). Реакцията се оставя да продължи 10 минути, след което цветното проявяване се спира чрез добавяне на 100мкл/ямка 1,0 Μ Н3РО4. Поглъщането на 450 нм се прочита при референтна дължина на вълната от 650 нм (ABS45Q/650) като се използува апарат за прочитане на платета Vmax (Molecular Devices, Palo Alto, СА), който се командва от Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, СА) и програмен продукт DeltaSoft (BioMetallics, Inc, Princeton, NJ).

Стандартната крива се получава чрез стимулиране на dp12.trkA,B- или

C.gD-клетки с 200, 50, 12,5 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 или 0 нг/мл трАлиганд и се представя като нг/мл ТРО срещу средно ABS45q/65q ± sd^KaTo се използува програмата DeltaSoft. Концентрациите на пробите се получават чрез интерполация на тяхното поглъщане върху стандартната крива и се изразяват като нг/мл ТРО-активност.

Намира се, че трАлигандът е способен да активира химерния рецептор mpARse.gD по начин, зависещ от концентрацията и от специфичността на лиганда. Освен това, намира се, че Rse.gD KIRA-ELISA толераира до 100% (70 · човешки серум (показано е) или 100% плазма (не е показано), което позволява този тест да се използува за лесно скриниране на пациенти и рК-проби.

СТАНДАРТНА КРИВА С ТРО332 ПОЛУЧЕН ОТ 293-КЛЕТКИ

КОНЦЕНТРАЦИЯ НА ТРО (нг/мл)

В-среда; J-100% човешки серум

Обобщение на стойностите ЕС50 за ТРО

ТРО от (клетки)	ЕС50 (тегло/обем)	ЕС50 (моларност)
Ни ТРО 332 (293)	2,56 нг/мл	67,4 пМ
Ми ТРО 332 (293)	3,69 нг/мл	97,1 пМ
Ни ТРО 153 )293)	~41 нг/мл	~ 1,08 нМ
Ни ТРО 155 (Е coll)	0,44 нг/мл	11,6 пМ
Ни ТРО 153met (Е coif)	0,829 нг/мл	21,8 пМ

ПРИМЕР 18

171

EUSA за тромбопоетин (ТРО) на основата на рецептор

ELISA-платета се натоварват със заешко F(ab')2 античовешко IgG (Fc) в карбонатен буфер с pH 9,6 на 4°С през нощта. Платетата се блокират с 0,5% говежди серумен албумин в PBS на стайна температура за един час. Към платетата се прибавя химерен рецептор mpAIgG, продукт на ферментация, и се инкубира 2 часа. Към платетата се прибавят двукратни серийни разреждания (0,39-25 нг/мл) от стандартния ТРО (ТРО332, продуциран в 293-клетки с концентрация, определена чрез количествен аминокиселинен анализ) и серийно разредени проби в 0,5% говежди серумен албумин, 0,05% Tween-20 и се инкубира 2 часа. Свързаният ТРО се детектира с протеин-А-пречистени биотинилирани заешки антитела срещу ТРО155, ^{който е} продуциран в Е. coli (1 час инкубация), последвано от стрептавидин-пероксидаза (30 мин инкубация) и 3,3',5,5'тетраметилбензидин като субстрат. Поглъщането се чете на 450 нм. Между стъпките платетата се промиват. За анализ на данните стандартната крива се построява като се използува програмата на Kaleidagraph за напасване на кривата по четири параметъра.

ПРИМЕР 19

Експресия и пречистване на ТРО от293-клетки

1. Приготвяне на вектори за експресия в 293-кл етки кДНК, сответствуваща на цялата отворена рамка за четене на ТРО, се получава чрез ПВР като се използуват следните олигонуклеотиди като праймери:

ТАБЛИЦА 11

293-ПВР-праймери

Cla.FL.F: 5'ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC COG GCC AG3' (SEC ID NO: 65) hmpll-R: 5' GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA3' (SEQ ID NO: 48) (72

Като матрица в реакцията се използува PRK5-hmp/l (описан в Пример 9) в присъствието на pfu ДНК-полимераза (Stratagene). Първоначалната денатурация е за 7 мин на 94°С, следвана от 25 цикъла на амплификация (1 мин на 94°С, 1 мин на 55°С и 1 мин на 72°С). Крайното удължаване е за 15 мин на 72°С. ПВР-продуктът се пречиства и клонира между рестриктазните места Clal и Xbal на плазмида pRK5tkneo, вектор производен на pRK5 и модифициран за експресия на ген за неомицинова устойчивост под контрола на тимидинкиназния промотор за получаване на вектора pRK5tkneo.ORF. Втора конструкция, сответствуваща на еро-хомоложния домен се получава по същия начин, но като се използува Cla.FLF като прав праймер и следния обратен праймер: Arg.STOP.Xba: 5'ТСТ AGA ТСТ AGA ТСА ССТ GAC GCA GAG GGT GGA ССЗ' (SEQ ID NO: 66)

Крайната конструкция се нарича pRK5-tkneoEP0-D. Последователността на двете конструкции се потвъреждава, както е описано в Пример 7.

2. Трансфекция на човешки ембрионални бъбречни клетки

Тези две конструкции се трансфектират в човешки ембрионални бъбречни клетки чрез СаРОд-метода, както е описано в Пример 9. 24 часа след трансфекцията в присъствието на G418 започва селекцията на клонове, устойчиви на неомицин. 10 до 15 дни по-късно в 96-ямкови платета се прехвърлят индивидуални клонове и се оставят да растат до конфлуентност. Експресията на МЬ|5з или MI-332 в културалните среди от тези клонове се тестира като се използува Ba/F3 пролиферационният тест (описан в Пример 1).

3. Пречистване на rhML^jp

Хранителна среда от 293-rhMI_332 се нанася на колона Blue-Sepharose (Pharmacia), която е уравновесена с 10 мМ натриев фосфат pH 7,4 (буфер А). Колоната се промива последователно с 10 обема на колоната буфер А и буфер В, съдържащи 2 М урея. След това колоната се елуира с буфер А, съдържащ 2М урея и IM NaCI. Обединеният елуат от колоната Blue-Sepharose след това директно се нанася на колона WGA-Sepharose, уравновесена с буфер А. След това колоната WGA-Sepharose се промива с 10 обема на колоната буфер А, ' <*r I*

173 съдържащ 2M урея и 1М NaCI и се елуира със същия буфер, съдържащ 0,5М Nацетил-0-глюкозамин. Елуатът от колоната WGA-Sepharose се нанася на колона за HPLC С4 (Synchrom, Inc.), уравновесена с 0,1% TFA. Колоната C4-HPLC се елуира с прекъснат пропанолов градиент (0-25%, 25-35%, 35-70%). Намира се, че rhMI_332 се елуира в областта на градиента от 28-39% пропанол). На SDS-PAGE пречистеният rhML332 се движи като широка ивица в областта на гела от 68-80 кДа (виж фигура 15).

4. Пречистване на rhML 753

Хранителна среда от 293-rhMI_i53 се разделя на Blue-Sepharose, както е описано за rhML.332. Елуатът от Blue-Sepharose се нанася директно на mpl· афинитетна колона, както е описано по-горе. RhML.153, влуиран от mpl· афинитетната колона, се пречиства до хомогенност?като се използува колона С4HPLC, хроматографиране при същите условия, както е опкфно за rhML.332. На SDS-PAGE пречистеният rhML-|53 се разделя на 2 големи и 2 малки ивици с Мг от ~ 18 000-21 000 (виж фигура 15).

ПРИМЕР 20

Експресия и пречистване на ТРО от СНО

1. Описание на векторите за експресия в СНО

Експресионните вектори, използувани в протокола за електропорация, описан по-долу, са означени:

pSVI5.ID.LL.MLOFR (пълноразмерен или ΙΪΓΡΟ332) и pSVI5.ID.LLML.EPO (скъсен или hTPO-|53).

По-съществените черти на тези плазмиди са представени във фиг. 23 и 24.

2. Приготвяне на вектори за експресия в СНО кДНК, сответствуваща на цялата отворена рамка за четене на hTPO се получава чрез ПВР като се използуват олигонуклеотидните праймери в Таблица

12.

ТАБЛИЦА 12

ПВР-праймери за СНО-експресионни вектори : 174

Cla.FL.F2 5‘ATC GAT ATC GAT AGC CAG АСА CCC CGG CCA G3' (SEQ ID NO: 47)

ORF.Sal 5'AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC3' (SEQ ID NO: 67)

Като матрица в реакцията се използува PRK5-hn7p/l (описан в Пример 7 и 9) в присъствието на pfu ДНК-полимераза (Stratagene). Първоначалната денатурация е за 7 минути на 94°С, следвана от 25 цикъла на амплификация (1 мин на 94°С, 1 мин на 55°С и 1 мин на 72°С). ПВР-продуктът се пречиства и клонира между рестриктазните места Clal и Sall на плазмида pSVI5.ID.LL. за получаване на вектора pSVI5.ID.LL.MLORF. Втора конструкция, сответствуваща на ЕРО-хомоложния домен, се получава по същия начин, но като Cla.FLF2 се използува като прав праймер и следния обратен праймер:

EPOD.Sal 5'AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC3’ (SEQ ID NO: 68)

Крайната конструкция се нарича pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Последователността на двете конструкции се потвърждава, както е описано в Примиер 7 и 9.

По същество, кодиращите последователности на пълноразмерния и скъсения лиганд се включват в полилинкерното клониращо място на СНОекспресионния вектор pSVI5.ID.LL. Този вектор съдържа областта от SV40 на ранния промотор/инхансър, модифицирана единица за сплайсинг, съдържаща миша DHFR кДНК, полилинкерно клониращо място за въвеждане на гена, представляващ интерес (в този случай описаната ТРО-последователност), сигнал за полиаденилиране от SV40, начало за репликация и бета-лактамазния ген за плазмидна селекция и амплификация в бактерии.

3. Методология за установяване на стабилни СНО-клетъчни линии, експресиращи рекомбинантен човешки ТРО332И ТР0153

а. Описание на СНО-родителската клетъчна линия

Гостоприемната СНО (яйчни клетки от Китайски хамстер) клетъчна линия, използувана за експресията на ТРО-молекулите, описани тук, е известна като CHO-DP12 (виж Европейски патетнт 307 247, публикуван на 15 март 1989).

175

Тази бозайнишка клетъчна линия се селекционира клонално от трансфекция на родителската линия (СНО-К1 DUX-B11(DHFR-)-, получена от Dr. Frank Lee от Станфордския университет с разрешението на Dr. Chasin) с вектор, експресиращ препроинсулин, за да се получат клонове с редуцирани изисквания за инсулин. Тези клетки също са DHFR минус и могат да се селекционират клонове за наличието на DHFR кДНК-векторни последователности чрез култивиране върху среди, лишени от нуклеозидни добавки (глицин, хипоксантин и тимидин). Тази система за селекця на стабилно експресиращи СНО-клетъчни линии се използува широко.

Ь. Метод за селекция (електропорация)

Клетъчни линии, експресиращи ТРО332 и ТРО153, ^се получават чрез трансфекция на 0Р12-клетки посредством електропорация (виж напр., Andreason, G.L. J. Tiss Cult. Meth., 15,56 [1993] c линеаризирани плазмиди, сответно pSVI5.ID.LL.MLORF или pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Залагат се три (3) реакционни смеси с рестрикционни ензими за всяко плазмидно срязване: 10 мкг, 25 мкг и 50 мкг от вектора с ензима NOTI по стандартни молекулярнобиологични методи. Това рестриктазно място се среща само веднъж във вектора в областта на линеаризиране в посока 3' и извън транскрипционната единица за ТРО-лиганда (виж фиг. 23). За инкубиране през нощта на 37 градуса се залагат реакции от 100 мкл. На следващия ден смесите се екстрахират веднъж с фенол-хлороформизоамилов алкохол (50:49:1) и се утаяват с етанол на сух лед за приблизително един час. Линеаризираната ДНК се ресуспендира в 50 мкл среда на Ham DMEMF12 1:1, допълнена със стандартни антибиотици и 2 мМ глутамин.

Култивираните като суспензия ОР12-клетки се събират, промиват се веднъж в средата, описана за ресуспендирането на ДНК и накрая се ресуспендират в същата среда до концентрация 10⁷ клетки на 750 мкл. Аликвоти от клетки (750 мкл) и всяка линеаризирана плазмидна смес се инкубират заедно на стайна температура за един час и след това се прехвърлят в камера за електропорация на BRL. След това всяка реакционна смес се електропорира в стандартен апарат за електропорация на BRL при 350 волта, нагласен на 330 мкф ί

176 и ниско капацитовно съпротивление. След електропорацията клетките се оставят да престоят в апарата за 5 минути и след това на лед за допълнителни 10 минути инкубационен период. Електропорираните клетки се прехвърлят в 60 мм матраци за клетъчни култури, съдържащи 5 мл стандартна, пълна хранителна среда за СНО-клетки (DMEM-F12 с високо съдържание на глюкоза 50:50 без глицин, допълнена с 1XGHT, 2 мМ глутамин и 5% фетален телешки серум) и се култивират през нощта в 5% СО2 в инкубатор за клетъчни култури.

с. Метод за селекция и скриниране

На следващия ден клетките се отделят чрез трипсинизиране от платетата по стандартни методи и се прехвърлят в 150 мм матраци за тъканни култури, съдържащи DHFR-селективна среда (среда на Ham DMEM-F12 1:1, описана по-горе, допълнена с 2% или 5% диализиран фетален телешки серум, несъдържащ глицин, хипоксантин и тимидин - това е стандартната DHFRселективна среда, която ние използуваме). Клетките от всеки 60 мм матрак впоследствие се препосяват в 5/150 мм матраци. След това клетките се инкубират 10 или 15 дни (с една смяна на средата) на 37 градуса/5% СО2, докато започнат да се забелязват клонове, достигнали подходящи размери за прехвърляне в 96ямкови матраци. За период от 4-5 дни клетъчните линии се прехвърлят в 96ямкови матраци като се използуват стерилни жълти наконечници и пипета, нагласена на 50 мкл. Клетките се оставят да пораснат до конфлуентност (образуване на плътен монослой) (обикновено 3-5 дни) и след това матраците се трипсинизират като се възпроизвеждат 2 копия от оригиналния матрак. Две от тези копия се съхраняват за кратко време във фризера като клетките във всяка ямка преди това се разреждат с 50 мкл 10%FCS в DMSO. Пробите от конфлуентните ямки на третия матрак, култивирани 5 дни в среда без серум, се тестират за експресия на ТРО чрез теста за активност, основаващ се на Ba/Fклетки. Клоновете с най-висока експресия на основата на този тест се съживяват от фризера и се размножават в 2 конфлуентни 150 мм Т-матрака с цел прехвърлянето им към групата по клетъчни култури за адаптация в суспензия, повторно тестиране и депозиране в банката.

·,ι*4· I**

177

d. Протокол за амлификация

Няколко от клетъчните линии с най-висок титър от селекцията, описана по-горе, се поставят в режим на стандартна амлификация върху метотрексат, за да се получат клонове с по-висок титър. Клоновете от СНО-клетки се размножават и се посяват в 10 см матраци при 4 концентрации на метотрексата (т.е. 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ и 400 нМ) и при два или три броя на клетките (10⁵, 5X10^ и 10θ клетки на матрак). След това тези култури се инкубират на 37 градуса/5% СО2, докато се установят клонове, подходящи за прехвърляне в 96ямкови матраци за по-нататъшно тестиране. Няколко клона с висок титър от тази селекция отново се подлагат на по-високи концентрации метотрексат (т.е. 600 нМ, 800 нМ, 1000 нМ и 1200 нМ) и както преди се изчаква появата на устойчиви клонове, които след това се прехвърлят в 96-ямкови матраци и се тестират.

4. Кул тивиране на стабилни СНО-кл етъчни линии, експресиращи рекомбинантен човешки ТРО322 ^и ТР0153

Клетките, депозирани в банката, се размразяват и клетъчната популация се размножава чрез стандартни методи за клетъчно култивиране в среда, съдържаща или несъдържаща серум. След размножаване до достатъчна клетъчна плътност клетките се промиват за отстраняване на изчерпаната хранителна среда. След това клетките се култивират по някой от стандартните методи, включващи; еднократна култура, еднократна култура с подхранваща среда или непрекъсната култура на 25-40°С, неутрално pH при съдържание на разтвеорения О2 най-малко 5%, докато се натрупа конститутивно секретиращият се ТРО. Клетъчнокултуралната течност след това се отделя от клетките по механичен начин, такъв като центрофугиране.

5. Пречистване на рекомбинантен човешки ТРО от СНО-културални течности

Събрана клетъчнокултурална течност (HCCF) се нанася директно върху бързопроточна колона Blue Sepharose 6 (Pharmacia), уравновесена с 0,01 М Na фосфат pH 7,4, 0,15 М NaCI при отношение приблизително 100 л HCCF на литър смола и при линейна проточна скорост приблизително 300 мл/ч/см^. Колоната след това се промива с 3 до 5 обема на колоната уравновесяващ буфер,

У f» последвано от 3 до 5 обема на колоната 0,01 М Na фосфат pH 7,4, 2 М урея. След това ТРО се елуира с 3 до 5 обема на колоната 0,01 М Na фосфат pH 7,4, 1,0 М NaCI.

След това обединеният елуат от Blue Sepharose, съдържащ ТРО^се нанася на колона Sepharose 6МВ с прикачен лектин от пшенични зародиши (Pharmacia), уравновесена с 0.01 М Na фосфат pH 7,4, 2,0 М урея и 1,0 М NaCI при отношение от 8 до 16 мл елуат от Blue Sepharose на мл смола при проточна скорост 50 мл/ч/см^. Колоната след това се промива с 2 до 3 обема на колоната уравновесяващ буфер. След това ТРО се елуира с 2 до 5 обема на колоната 0,01 М Na фосфат pH 7,4, 2,0 М урея, 0,5 М N-ацетил-О-глюкозамин.

Обединеният елуат от последната колона (Sepharose 6МВ с прикачен лектин от пшенични зародиши) след това се довежда до крайна концентрация 0,04% 0-12^8 ^и 0,1% трифлуороцетна киселина (TFA). Получената проба се нанася на обратнофазова колона С4 (Vydac 214ТР1022), уравновесена с 0,1% TFA, 0,04% Cl2^E8 ^пР^и натоварване приблизително 0,2 до 0,5 мг белтък на мл смола и при проточна скорост 157 мл/ч/см^.

Белтъкът се елуира чрез двуфазов линеен градиент на ацетонитрил, съдържащ 0,1%TFA, 0,04% С-^Ев· Първата фаза се състои от линеен градиент от 0 до 30% ацетонитрил за 15 мин. Втората фаза се състои от линеен градиент от 30 до 60% ацетонитрил за 60 минути. ТРО се елуира при приблизително 50% ацетонитрил. На тази основа се обединяват пробите за SDS-PAGE.

Обединените С4 проби след това се разреждат с 2 обема 0,01 М Na фосфат pH 7,4, 0,15 М NaCI и се диафилтруват срещу приблизително 6 обема 0,01 М Na фосфат pH 7,4, 0,15 М NaCI върху ултрафилтрационна мембрана Amicon YM или подобна на нея с отрязък на молекулни тегла 10 000 до 30 000 Далтона. Полученият диафилтрат може след това директно да се обработва или да се концентрира допълнително чрез ултрафилтрация. филтратьт/концентратьт се довежда до крайна концентрация 0,01% Tween-80.

Целият или част от диафилтрата/концентрата, еквивалентен на 2 до 5% от изчисления обем на колоната^след това се нанася на колона Sephacryl S-300

1ΐ9

HR (Pharmacia), уравновесена c 0,01 M Na фосфат pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,01% Tween-80 и хроматографирана при проточна скорост приблизително 17 мл/ч/см². Съдържащите ТРО фракции, в които няма агрегати и продукти от протеолитично разграждане^се обединяват на базата на SDS-PAGE. Така обединените проби се филтруват през филтър от 0,22 мкм, Millex-GV или подобен на него, и се съхраняват на 2-8°С.

ПРИМЕР 21

Трансформация и индукция на белтъчна синтеза на ТРО в Е. coli

1. Конструиране на вектори за експресия на ТРО в Е. coli

Плазмидите рМР21, рМР151, рМР41, рМР57 и рМР202 са предназначени за експресия на първите 155 аминокиселини на ТРО след малък лидер, който варира при отделните конструкции. Лидерите осигуряват преди всичко високо ниво на инициация на транслацията и бързо пречистване. Плазмидите рМР210-1, Т8, -21, -22, -24, -25 са предназначени за експресия на първите 153 аминокиселини на ТРО след иницииращия метионин и се различават само по използуването на колоните за първите 6 аминокиселини на ТРО, докато плазмидът рМР251 е производен на рМР210-1, в който карбокситерминалният край на ТРО е удължен с две аминокиселини. Всички горни плазмиди ще продуцират високи нива вътреклетъчна експресия на ТРО в Е coli след индукция на триптофановия промотор (Yansura, D.G. etal., Methods in Enzymology (Goeddel, D. V., Ed.) 185:5460, Academic Press, San Diego [1990]). Плазмидите pMP1 и pMP172 са междинни в конструирането на горните плазмиди за вътреклетъчна експресия на ТРО.

(а) Плазмид рМР1

Плазмидът рМР1 представлява вектор за секреция на първите 155 аминокиселини на ТРО и се конструира чрез съвместно лигиране на 5 фрагмента ДНК, както е показано във фиг. 33. Първият от тях е векторът pPho21, в който е отстранен малкият Mlul-BamHI-фрагмент. pPho21 е производен на phGH1 (Chang,

С. N. etal., Gene55:189-196[1987], в който генът за човешкия растежен хормон е заменен с гена на Е coll phoA и по генноинженерен път е въведено Mlu18ο рестиктазно място в кодиращата последователност на STII-сигналната последователност при аминокиселини 20-21.

Следващите два фрагмента, 258 базови двойки Hinfl-Pstl-парче ДНК от pRK5-h/7?p/1 (Пример 9), кодиращо аминокиселини 19-103 на ТРО, и следната синтетична ДНК, кодираща аминокиселини 1-18 5'CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACT GCTTCGTG ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAG CACTGA-5' (SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70) се прелигират c Т4-ДНК-лигаза и след това се срязват с Pstl. Четвъртият (фрагмент) е 152 базови двойки Pstl-НаеШ-фрагмент от pRK5hmpll, кодиращ аминокиселини 104-155 от ТРО. Последният е 412 базови двойки Stul-BamHIфрагмент от pdh108, съдържащ терминатор на транскрипцията на λ, както е описано по-рано (Scholtissek, S. etal., NAR 15:3185[1987]).

(b) Плазмид pMP21

Плазмидът рМР21 е предназначен за експресия на първите 155 аминокиселини на ТРО с помощта на лидер от 13 аминокиселини, обхващащ част от сигналната последователност STII. Той се конструира чрез съвместното лигиране на три (3) ДНК-фрагмента, както е показано на фиг. 34, първият от които е векторът pVEG31, от който е отстранен малкият Xbal-Sph-фрагмент. Векторът pVEG31 е производен на pHGH207-1 (de Boer, Η. A. et al., in Promoter Structure and Function (Rodriguez, R. L. and Chamberlain, M. J., Ed), 462, Praeger, Ne, w York [1982]), в който генът за човешкия растежен хормон е заменен с гена за васкуларния ендотелен растежен фактор (този идентичен векторен фрагмент може да се получи от последния плазмид)

Втората част в лигирането представлява синтетичен ДНК-дуплекс със следната последователност:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA <81

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5' (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)

Последното парче представлява 1072 базови двойки Mlul-Sphl-фрагмент от рМР1, кодиращ 155 аминокиселини от ТРО.

(c) Плазмид рМР151

Плазмидът рМР151 е предназначен за експресия на първите 155 аминокиселини от ТРО след лидерна последователност, включваща 7 аминокиселини от сигналната последователност STII, 8 хистидина и място за скъсване с фактор Ха. Както е показано на фиг. 35, рМР151 се конструира чрез съвместното лигиране на три ДНК-фрагмента, първият от които е преди това описания вектор pVEG31, от който е отстранен малкият Xbal-Sph-фрагмент. Вторият представлява синтетичен ДНК-дуплекс със следната последователност: S'CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATC GAAGGTCGTAGCC TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC CAGCAT-5' (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)

Последният e 1046 базови двойки Bglll-Sphl-фрагмент от pMP11, кодиращ 154 аминокиселини от ТРО. Плазмидът рМР11 е идентичен с рМР1 с изключение на няколко изменения в кодоните наз STII-сигналната последователност (този фрагмент може да се получи от рМР1).

(d) Плазмид рМР202

Плазмидът рМР202 прилича много на експресионния вектор рМР151 с изключение на това, че мястото за скъсване от фактор Ха в лидера е заменено с място за скъсване от тромбин. Както е показано на фиг. 36, рМР202 се конструира чрез съвместното лигиране на три ДНК-фрагмента. Първият от тях е преди това описнаият pVEG 31, от който е отстранен малкият Xbal-Sphl-фрагмент. Вторият представлява синтетичен ДНК-дуплекс със следната последователност:

182

5'TAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCG AACCACGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTT GGTGCAT-5, (SEP ID NO: 75) (SEQ ID NO: 76) Последното парче е 1064 базови двойки Bgll-Sphl-фрагмент от по-рано описания плазмид рМР11.

(e) Плазмид рМР172

Плазмидьт рМР172 предстравлява вектор за секреция на първите 153 аминокиселини на ТРО и е междинен в конструирането на рМР210. Както е показано на фиг. 37, рМР172 се приготвя чрез успоредното лигиране на три ДНК-фрагмента, първият от които е векторът pLS32lamB, от който е отстран малкият EcoRI-Hindlll-отрязък. Вторият е 946 базови двойки EcoRI-Hgal-фрагмент от преди това описания плазмид рМР11. Последното парче представлява синтетичен ДНК-дуплекс със следната последователност;

5-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO: 77)

GGAGACGCAGTCCATCGA-5, (SEQ ID NO: 78) (f) Плазмид pMP210

Плазмидьт pMP210 е предназначен за експресия на първите 153 аминокиселини на ТРО след метионина за инициация на транслацията. Плазмидьт в действителност се приготвя като банка от плазмиди, в които първите 6 кодона на ТРО са синтезирани чрез включване на случаен нуклеотид в трета позиция на всеки кодон. Плазмидът, както е показано на фиг. 38, се конструира чрез лигирането на три ДНК-фрагмента. Първият от тях е преди това описаният вектор pVEG31, от който е отстранен малкият Xbal-Sphl-фрагмент. Вторият представлява ситнетичен ДНК-дуплекс, показан по-долу, кодиращ иницииращия метионин, както и първите 6 кодона на ТРО със случаен нуклеотид в трета позиция. Той се обработва най-напред с ДНК-полимераза (Klenow), следвана от смилане с Xbal и Hinfl.

5'GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA ACACTGGAGGCT GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO: 79) CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5' (SEQ ID NO: 80) Третият e 890 базови двойки Hinfl-Sphl-фрагмент от pMP172, кодиращ аминокиселини 19-153 на ТРО.

Плазмидната рМР210 банка от приблизително 3700 клона се ретрансформира върху LB-петрита с висока концентрация на тетрациклин (50 мкг/мл), за да се отберат клонове със силна инициация на транслацията (Yansura, D.G. et a!., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:151-158 [1992]). От осемте колонии, които растат върху петритата с висока концентрация на тетрациклин, пет от най-добрите в смисъл на експресия на ТРО се подлагат на ДНК-секвениране като резултатите са показани на Фиг. 39 (SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, 27 и 28).

(д) Плазмид рМР41

Плазмидът рМР41 е предназначен за експресия на първите 155 аминокиселини на ТРО, сляти с лидер, състоящ се от 7 аминокиселини на сигналната последователност STII, следвана от място за скъсване от фактор Ха. Плазмидът се конструира, както е показано на Фиг. 40^ чрез успоредното лигиране на три парчета ДНК, първото от които е по-рано описаният вектор pVEG31, от който е отстранен малкият Xbal-Sphl-фрагмент. Второто (парче) представлява следния синтетичен ДНК-дуплекс: 5'CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC(SEQ ID N0:81)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5’ (SEQ ID NO: 82) Последното парче от лигирането е 1064 базови двойки Bgll-Sphl-фрагмент от порано описания плазмид рМР11.

(h) Плазмид рМР57

Плазидът рМР57 експресира първите 155 аминокиселини на ТРО по посока след лидер, съсотящ се от 9 аминокиселини на сигналната последователност STII и дибазичното място Lys-Arg. Това дибазично място ί#4 осигурява начин за отстраняване на лидера с протеазата ArgC. Плазмидът се конструира, както е показано на фиг. 41 чрез съвместното лигиране на три ДНКпарчета. Първото от тях е преди това описаният вектор pVEG31, от който е отстранен малкият Xbal-Sphl-фрагмент. Второто прддставлява следният синтетичен ДНК-дуплекс: 5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAGAGATTTGCAT-5'

Последната част от лигирането е 1064 базови двойки Bgll-Sphl-фрагмент от описания преди това плазмид рМР11.

(i) Плазмид рМР251

Плазмидът рМР251 е производен на рМР210-1, в който на карбокситерминалния край са включени две допълнителни аминокиселини от ТРО. Както е показано на фиг. 42, този плазмид се конструира чрез съвместно лигиране на две парчета ДНК, първото от които е по-рано описаният рМР21, от който е отстранен малкият Xbal-Apal-фрагмент. Втората част от лигирането е 316 базови двойки Xbal-Apal-фрагмент от рМР210-1.

2. Трансформация и индукция на Е. coli с експресионни вектори за ТРО.

Г орните плазмиди, експресиращи ТРО, се използуват за трансформиране на Е. coli, щам 44С6 (w3110 tonAA rpoHt_s ΙοηΔ cIpPA galE) по метода с CaCl2 и топлинен шок (Mandel, М. et al., J. Mol. Biol., 53:159-162 [1970]). Трансформираните клетки се култивират най-напред на 37°С в LB-среда, съдържаща 50 мкг/мл карбеницилин, докато оптичната плътност (600 нм) на културата достигне приблизително 2-3. След това LB-културата се разрежда 20х с М9-среда, съдържаща 0,49% кезаминокиселини (тегло/обем) и 50 мкг/мл карбеницилин. След култивиране при аерация на 30°С за 1 час се прибавя индол3-акрилова киселинина до крайна концентрация 50 мкг/мл. След това културата се оставя да продължи да расте на 30°С с аерация за още 15 часа, след което клетките се събират чрез центрофугиране.

ПРИМЕР 22

185

Продукция на биологично активен ТРО (Met~¹ 1-153) в Е. coli

Дадените по-долу процедури за продукция на биологично активен, пренагьнат (ренатуриран) ТРО (met^-1 1-153) могат да се приложат по аналогичен начи за получаването на други варианти на ТРО, включващи N- и С-крайно удължени форми (виж Пример 23).

A. Получаване на неразтворим ТРО (Met¹153)

Клетки Е. coli, експресиращи ТРО (Met¹ 153), който се кодира от плазмида рМР210-1, се ферментират, както е описано по-горе. Обикновено около 100 г клетки се ресуспендират в 1л (10 обема) буфер за разрушаване на клетките (10 мМ Tris, 5 мМ EDTA, pH 8) с хомогенизатор Polytron и клетките се центрофугират на 5000 х g за 30 минути. Промитата клетъчна утайка отново се ресуспендира в 1л буфер за клетъчно разрушаване с хомогенизатора Polytron и клетъчната суспензия се прекарва през LH-клетъчна преса (LH Inceltech, Inc.) или през Microfluid izer (Microfluidics International), съгласно инструкциите на производителите. Суспензията се центрофугира на 5000 g за 30 мин, ресуспендира се и се центрофугира втори път, за да се получи промита утайка от твърди телца. Промитата утайка се използува непосредствено или се замразява на -70°С.

B. Разтваряне и пречистване на мономерен ТРО (Met¹1-153)

Утайката от по-горе се ресуспендира в 5 обема по отношение на теглото 20 мМ Tris, рН8, с 6-8 М гуанидин и 25 мМ DTT (дитиотреитол) и се разбърква 1-3 часа или през нощта на 4°С, за да се постигне разтваряне на ТРОбелтъка. Високи концентрации на урея (6-8М) също могат да се използуват, но като правило водят до по-ниски добиви в сравнение с гуанидина. След разтварянето разтворът се центрофугира на 30 000 х g за 30 мин, за да се получи бистра надстояща течност, съдържаща денатуриран, мономерен ТРО-белтък. Надстоящата течност след това се подлага на хроматография върху гелфилтрационна колона Superdex 200 (Pharmacia, 2,6 х 60 см) при ороточна скорост 2 мл/мин като белтъкът се елуира с 20 мМ Na фосфат, pH 6,0 с 10 мМ DTT. Фракциите, съдържащи мономерен, денатуриран ТРО-белтък, който се елуира

ISC между 160 и 200 мл, се обединяват. ТРО-белтькът се пречиства допълнително на полупрепаративна С4 обратнофазова колона (2 х 20 см VYDAC). Пробата се нанася при 5 мл/мин върху клолната, уравновесена с 0,1% TFA (трифлуороцетна киселина) с 30% ацетонитрил. Пречистеният редуциран белтък се елуира при приблизително 50% ацетонитрил. Този материал се използува за ренатурация, за да се получи биологично активен вариант на ТРО.

С. Получаване на биологично активен ТРО (Мед 1-153)

Приблизително 20 мг мономерен, редуциран и денатуриран ТРО-белтък в 40 мл 0,1% TFA/50% ацетонитрил, се разтваря в 360 мл буфер за ренатурация, който в оптималния си ватиант съдържа следните реагенти:

мМ Т ris

0,3 М NaCI мМ EDTA

2% CHAPS-детергент

25% глицерол мМ окислен глутатион мМ редуциран глутатион pH доведено до 8,3

След смесването ренатуриращият буфер се разбърква бавно на 4ПС за 12-48 часа, за да се постигнат максимални добиви от ренатурацията на ТРОформа с правилно формирани дисулфидни връзки (виж по-долу). След това разтворът се подкислява с TFA до крайна концентрация 0,2%, филтрува се през 0.45 или 0.22 микронови филтри и се прибавя 1/10 обем ацетонитрил. Този разтвор след това се изпомпва директно върху С4 обратнофазова колона като пречистеният, ренатуриран ТРО (Met^-1 1-153) се елуира със същата програма за градиента, както по-горе. При тези условия ренатурираният, биологично активен ТРО се елуира при приблизително 45% ацетонитрил. Версиите на ТРО с неправилно формирани дисулфидни връзки се елуират по-рано. Крайният пречистен ТРО (МеН 1-153) е с чистота повече от 95%, което се определя чрез SDS-гелове или чрез аналитична 04 обратнофазова хроматография. За

1ЯГ изследвания с животни материалът, пречистен на С4, се диализира във физиологично съвместими буфери. Употребяват се изотонични буфери (10 мМ Na ацетат, pH 5,5, 10 мМ Na сукцинат, pH 5,5 или 10 мМ Na фосфат, pH 7,4), съдържащи 150 мМ NaCl и 0,01% Tween-80.

Поради високата активност на ТРО в Ва/ЯЗ-теста (половината от максималната стимулация се постига при приблизително 3 пг/мл), е възможно да се получи биологично активен материал, като се използуват много други буфери, детергенти и редокс-условия. При повечето от условията обаче се получава само малко количество правилно нагънат материал (<10%). За промишлено производство е желателно да се постигнат добиви от ренатурацията най-малко 10%, повече предпочитани са 30-50% и най-много се предпочитат >50%. Изпитани са много различни детергенти (Triton Х-100, додецил-бета-малтозид, CHAPS, CHAPSO, SDS, саркозил, Tween-20 и Tween-80, Zwittergent 3-14 и други) за ефективно съдействие в получаването на високи добиви при ренатурацията. Установява се, че от тези детергенти само CHAPS-фамилията (CHAPS и CHAPSO) е като цяло приожима в реакцията по ренатурация за ограничаване на белтъчната агрегация и неточното формиране на дисулфиди. Най-ползотворни са нива на CHAPS по-големи от 1%. За най-добрите добиви се изисква натриев хлорид като оптималните нива са между 0,1 и 0,5М. Наличието на EDTA (1-5 мМ) ограничава количеството на метал-катализираното окисляване (и агрегация), което се наблюдава с някои препарати. Глицеролни концентрации по-високи от 15% осигуряват оптимални условия за ренатурация. За максималните добиви е съществено да имаме окислен и редуциран глутатион или окислен и редуциран цистеин като двойка редокс-реагенти. Като цяло по-високи добиви се наблюдават, когато молното отношение на окисления реагент е равно или в излишък спрямо редуцирания член на реагента от редокс-двойката. За ренатурация на тези варианти на ТРО са оптимални стойности на pH между 7,5 и 9. Толерират се органични разтворители (напр., етанол, ацетонитрил. метанол) в концентрации от 10-15% или по-ниски. Използуавт се основно Tris и фосфатни буфери. Инкубацията на 4°С също продуцира високи нива от правилно нагънат ТРО.

За препарати на ТРО, които са пречистени чрез първата С4-стъпка, са типични добиви от ренатурацията 40-50% (на основата на количеството редуциран и денатуриран ТРО, използуван в реакцията по ренатурация). Активен материал може да се получи и от по-малко чисти препарати (напр., директно след колоната Superdex 200 или след първоначалната екстракция на твърдите телца), макар че добивите са по-ниски като следствие от засилена преципитация и интерфериращо въздействие на не-ТРО-белтъци повреме на процеса на ренатурация на ТРО.

Тъй като ТРО (Met^-* 1-153) съдържа 4 цистеина е възможно да се образуват три различни дисулфидни версии на този белтък:

версия 1: дисулфиди между цистеинови остатъци 1-4 и 2-3 версия 2: дисулфиди между цистеинови остатъци 1-2 и 3-4 версия 3: дисулфиди между цистеинови остатъци 1-3 и 2-4.

Повреме на първоначалното изследване за определяне условията на ренатурация чрез С4-обратнофазова хроматография се разделят няколко различни пика, съдържащи ТРО-белтък. Само един от тези пикове има значителна биологична активност, което се определя чрез използуване на Ba/F3теста. Впоследствие условията за пренагъване се оптимизират за получаване предимно на тази версия. При тези условия неправилно нагънатите версии са помалко от 10-20% от общия получен мономерен ТРО.

Чрез масспектрометрия и белтъчно секвениране се определя, че дисулфидният профил на биологично актовния ТРО е 1-4 и 2-3 (т. е. версия 1). Аликвоти от различните пикове, разделени на С4 (5-10 нмола), се смилат с трипсин (1:25 молно отношение на трипсин към белтък). Сместа след смилането се анализира чрез масспектрометрия посредством матрикс-асистирана лазерна десорпция преди и след редукция с DTT. След редукция се определят масите, съответствуващи на повечето от големите триптични пептиди на ТРО. В нередуцираните проби някои от тези маси са липсващи като се наблюдават нови маси. Масата на новите пикове съответствува основно на сумата от индивидуалните триптични пептиди, участвуващи в дисулфидната двойка. По този начин е възможно еднозначно да се определи, че дисулфидният профил на ренатурирания, рекомбинантен, биологично активен ТРО е 1-4 и 2-3. Това е в съгласие с известния дисулфиден профил на родствената молекула еритропоетин.

D. Биологична активност на рекомбинантния, ренатуриран ТРО (met 1-153)

Ренатурирания и пречистен ТРО (МеН 1-153) има активност както в in vitro, така и в in vivo тестове. В Ва/ТЗ-теста половината от максималното стимулиране на тимидиновата инкорпорация в Ва/РЗ-клетки се постига при 3,3 пг/мл (0,3 пМ). В ELISA на основата на /прАрецептора половината от максималната активност се проявява при 1,9 нг/мл (120 пМ). В нормални и миелосупресирани животни, получени чрез Х-облъчване, близко до леталното, ТРО (Met‘1 1-153) има висока потенциална способност (активност се наблюдава при толкова ниски дози като 30 нг/мишка) да стимулират образуването на нови тромбоцити.

ПРИМЕР 23

Продукция на други биологично активни варианти на ТРО в Е. coli

По-долу са представени три различни варианта на ТРО, придуцирани в Е coli, пречистени и ренатурирани в биологично активни форми.

(1) MLF - 13 остатъци от сигналната последователност с бактериален произход STII са сляти с N-терминалния домен на ТРО (остатъци 1-155). Получената последователност е

MKKNIAFLLNAYASPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 85) където лидерната последователност е подчертана и С.....С представлява Cys⁷ до

Cys151. Този вариант се конструира, за да се въведе тирозин за радиоактивно йодиране на ТРО с цел рецепторни и биологични изследвания.

Ϊ9ο (2) H8MLF - 7 остатъци от STII-последователността, 8 хистидинови остатъци и последователността за ензимно скъсване от фактор Ха IEGR се сливат с N-терминалния домен (остатъци 1-155) на ТРО. Последователността е

MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 87) където лидерната последователност е подчертана и С.....С представлява Cys? до

Cys151. Този вариант, когато се пречисти и ренатурира, може да се третира с ензима фактор Ха, който ще къса след аргининовия остатък на последователността IEGR, което ще даде вариант на ТРО, дълъг 155 остатъци с природна серинова N-терминална аминокиселина.

(3) T-H8MLF - се приготвя, както е описано по-горе за вариант (2) с тази разлика, че с N-терминалния домен на ТРО е слята чувствителната към тромбин последователност IEPR. Получената последователност е

MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 87) където лидерната последователност е подчертана и С.....С представлява Cys? до

Cys^51. Този вариант след пречистване и ренатурация може да се третира с ензима тромбин за получаване на природен N-терминален вариант на ТРО, дълъг 155 остатъка.

А. Получаване, разтваряне и пречистване на мономерни, биологично активни варианти на ТРО (1), (2) и (3).

Всички варианти се експресират в Е. coli. По-голямата част от вариантите се откриват в твърдите телца, както е наблюдавано в Пример 22 за ТРО (Met^-1 1-153). Достига се до същите процедури за получаване, разтваряне и пречистване, както описаните в Пример 22. Използуват се идентични условия за ренатрурация като тези, използувани за ТРО (МеН 1-153) при общи добиви от 3050%. След ренатурация вариантите на ТРО се пречистват чрез С4-обратнофазова хроматография в 0,1% TFA като се изпозува градиент на ацетонитрил, както е описано по-рано. Всички варианти на ТРО (в своята непротеолизирала форма) имат биологична активност, определена чрез Ва/РЗ-теста като половината от максималната активност се постига при 2-5 пМ.

191

В. Протеолитичен процесинг на варианти (2) и (3) за получаване на автентичен

N-терминален ТРО (1-155)

Варианти на ТРО (2) и (3) по-горе са проектирани с ензимно разграждащ се лидерен пептид пред нормалния N-краен аминокиселинен остатък на ТРО. След ренатурация и пречистване на варианти (2) и (3), както е описано по-горе, всеки от тях се подлага на смилане със съответния ензим. За всеки вариант -ацетонитрилът от С4-обратнофазовата стъпка се отстранява чрез продухване на разтвора с лека струя азот. След това вариантите се третират или с фактор Ха или с тромбин, както е описано по-долу.

За варианта на ТРО (2) към свободния от ацетонитрил разтвор се добавя 1 М Tris-буфер, pH 8 до крайна концентрация 50 мМ и ако е необходимо pH се довежда до 8. Добавят се NaCl и CaCl2 респективно до 0,1 и 2 мМ. Прибавя се фактор Ха (New England Biolabs), така че да се постигне около 1:25 до 1:100 молно отношение на езима към варианта. Пробата се инкубира за 1-2 часа на стайна температура за постигане на максимално разграждане, което се определя по промяната в подвижността на SDS-гелове, което отразява загубата на лидерната последователност. След това сместа се пречиства чрез С4обратнофазова хроматограгфия като се използуват същия градиент и условия, както описаните по-горе за пречистването на правилно ренатурираните варианти. При тези условия неразграденият вариант В се разделя от разградения вариант (2). Показва се че N-крайните аминокиселини са SPAPP, което означава, че отстраняването на N-терминалната лидерна последователност е успешно. С Фактор Ха се получават също така вариабилни количества от вътрешно разграждане в ТРО-домена; разграждането се наблюдава след аргининовия остатък в позиция номер 118, при което се образува допълнителна N-терминална последователност TTAHKDP (SEQ ID NO: 88). На нередуциращи SDS-гелове се забелязва единична ивица от приблизително 17 000 далтона на варианта, разграден с фактор Ха; на редуциращи гелове се наблюдават две ивици с молекулна маса приблизително 12000 и 5000 далтона, което е в съгласие с разграждането при аргинин 118. Това наблюдение също потвърждава, че двете

1& части на молекулата се придържат заедно от дисулфидна връзка между 1-вия и 4тия цистеинови остатъци, до който извод се стига чрез експериментите по триптично смилане, описани по-горе. След отстраняване на N-терминалната лидерна последователност и с вътрешното разграждане в Ва/ЕЗ-биологичния тест пречистеният ТРО (1-155) вариант има половината от максималната си активност при концентрации 0,2 до 0,3 пикомоларни. Интактният вариант с лидерната - последователност има половината от максималната активност при концентрации

2-4 пикомоларни.

За вариант (3) буферът за смилане се състои от 50 мМ Tris, pH 8, 2% CHAPS, 0,3 М NaCl, 5 мМ EDTA и човешки или говежди тромбин (Calbiochem) при 1:25 до 1:50 тегловно отношение на ензима към ТРО-вариантния белтък. Смилането се провежда на стайна температур за 2-6 часа. Процесът на смилането се следи чреа SDS-гелове, както е описано по-горе за реакцията на смилане с фактор Ха. За това време като цяло се постига повече от 90% разграждане на лидерната последователност. Полученият ТРО се пречиства на С4-обратнофазова колона, както е описано по-горе и чрез аминокиселинно секвениране се показва че той има желания N-край. Получава се само малко количество (<5%) вътрешно разграждане на същата аргинин-треонинова връзка, както се наблюдава по-горе с фактор Ха. Полученият ТРО-вариант има висока биологична активност като половината максимални отговори в Ва/БЗ-теста се получават при 0,2-0,4 пикомолараен белтък. В ELISA на основата на тр!рецептора този белтък показва половината максимален отговор при 2-4 нг/мл пречистен белтък (120-240 пикомоларен), докато интактният вариант, съдържащ лидерната последователност, е по-слабо активен и в двата теста около 5-10 пъти. За изследвания с животни HPLC-пречистеният разграден (със сигнална пептидаза) белтък се диализира във физиологичноа приемливи буфери със 150 мМ NaCl, 0,01% Tween 80 и 10 мМ натриев сукцинат, pH 5,5 или 10 мМ натриев ацетат, pH 5,5 или 10 мМ натриев фосфат, pH 7,4. Пречистеният белтък е стабилен до няколко седмици, когато се съхранява на 4°С, което се проверява чрез HPLC и SDS-гелове. В нормални и миелосупресирани мишки този пречистен ТРО с

1«!

193 автентичната N-терминална последователност е високо активен, стимулирайки образуванто на тромбоцити при ниски дози от 30 нг/мишка.

ПРИМЕР 24

Синтетичен /пр/-лиганд

Макар че човешкият трАлиганд (hML) обикновено се получава чрез използуване на рекомбинантни методи, той може да се синтезира също така и чрез ензимно лигиране на синтетични пептидни фрагменти като се използуват методите, описани по-долу. Синтетичното получаване на hML позволява включването на неприродни аминокиселини или на синтетични функционални съставки, такива като полиетилиенгликол. Неотдавна по генноиженерен път бреше създаден мутант на сериновата протеаза субтилизин BPN, субтилигаза (S221C/P225A) за ефективно лигиране на пептидни естери във водни разтвори (Abrahamsen etal., Biochem., 30:4151-4159 [1991]). Понастоящем беше показано, че синтетичните пептиди могат да се лигират ензимно в последователен ред за получаване на ензимно активни дълги пептиди и белтъци, такива като рибонуклеаза A (Jackson et al., Science, [1994]). Тази технология, описана поподробно по-долу, ни даде възможност да синтезираме химично дълги белтъци, които преди това можеха да се направят само с рекомбинантната ДНКтехнология.

Основната стратегия за синтеза на hML-153 чрез използуване на субтилигаза е показана (Схема 1). Започва се с напълно деблокиран пептид, съответствуващ на С-терминалния фрагмент от белтъка, към който се прибавя успоредно със субтилигаза N-терминално защитен, С-терминално активиран естерен пептид. След протичане на реакцията докрай продуктът се изолира чрез обратнофазова HPLC и защитната група се отстранява от N-края. Лигира се следващият пептиден фрагмент, деблокира се и процесът се повтаря,като се използуват последователни пептиди, докато се получи пълноразмерният белтък. Процесът е сходен с твърдофазовата методология по това, че N-терминално защитен С-терминално активиран пептид се лигира към N-края на предхождащия

194 пептид и белтъкът се синтезира в посока C->N. Тъй като обаче всяко свързване има за резултат прибавянето на до 50 остатъци и тъй като след всяко лигиране продуктите се изолират, могат да се синтезират при приемливи добиви много подълги и високопречистени белтъци.

Схема 1. Стратегия за синтеза на hML чрез използуване на субтилигаза

R-NH-rienTMfl2-CO-R' + Ь^М-Пептид-рСС^

1) Субтилигаза

V

R-NH-nenTHfl2-CO-NH-nenTMfli -СО2

2) Zn/CH₃CO2H

V

Н2М-Пептид2-СО-МН-Пептид 1-СО2

3) повтори 1 + 2

Н2М-Пептидз-СО-МН'ПептиД2-СО-МН-Пептид1-СО2

На основата на нашите познания за специфичността на субтилигазата към определена последователност, както и на аминокиселинната последователност на биологично активния еро-домен на hML, ние разделихме hML^ ^на седем фрагмента с дължина 18-25 остатъци. Синтезират се тетрапептиди за тестиране на лигирането с цел да се определят подходящите

19S точки на лигиране на 18-25-мерите. Таблица 13 показва резултатите от тези тестови лигирания.

ТАБЛИЦА 13

Тестови лигирания на hML. Донорните и нуклеофилните пептиди се разтварят до 10 мМ в 100 мМ трицин (pH 7.8) на 22°С. Прибавя се лигаза до крайна концентрация 10 мкМ от концентриран разтвор 1,6 мг/мл (~70 мкМ) и лигирането се оставя да протече през нощта. Добивите са изразени като % лигиране срещу хидролиза на донорните пептиди.

място донор (glc-K-NH2) нуклеофил-ИНг %хидролиза % лигиране

1 HVLH (23/24) (SEQ ID NO: 89)	SRLS (SEQ ID NO: 90)	92	08
(22/23) SHVL	HSRL	48	52
(SEQ ID NO: 91)	(SEQ ID NO: 92)
2 AVDF	SLGE	22	78
(46/47) (SEQ ID NO: 93)	(SEQ ID NO: 94)
3 AVTL	LLEG	53	47
(69/70) (SEQ ID NO: 95)	(SEQ ID NO: 96)
4 LSSL	LGQL	95	05
(89/90) (SEQ ID NO: 97)	(SEQ ID NO: 98)
(88/89) C(acm)LSS	LLGQ	00	00
(SEQ ID NO: 99)	(SEQ ID NO: 100)
(90/91) SSLL	GQLS	45	55
(SEQ ID NO: 101)	(SEQ ID NO: 102)
(88/89) CLSS	LLGQ	90	10
(SEQ ID NO: 103)	(SEQ ID NO: 100
107/108 LQSL	LGTQ	99	01
5 (SEQ ID NO; 104)	(SEQ ID NO: 105)
106/107 ALQS	LLGT	70	30
(SEQ ID NO: 106)	(SEQ ID NO: 107)
128/129 NAIF	LSFQ	60	40
6 (SEQ ID NO: 108)	(SEQ ID NO: 109)

Като се изхожда от тези експерименти? посочените в Таблица 14 пептиди за лигиране би трябвало да се лигират ефективно със субтилигазата. За да се предотврати самолигирането?е необходима подходяща защитна група за Nкрая на всеки донор-естерен пептид. Ние избрахме изоникотинова (iNOC) защитна група (Veber et al., J. Org. Chem., 42:3286-3289 [1977], понеже тя е водоразтворима, може да се включи в последната стъпка на твърдофазовата пептидна синтеза и е стабилна в безводен HF, който се използува за деблокиране и откачване на пегттидите от твзрдофазната смола. Освен това тя може да се отстрани от пептида след лигирането при меки редуциращи условия (Zn/CH3CO2H), за да се осигури свободен N-край за следващите лигирания. На основата на предишни експерименти, които показват, че гликолат-лизиламидният (glc-K-NH2) естер се ацилира ефективно от субтилигаза (Abrahamsen et al., Biochem., 30:4151-4159 [1991]), той се използува за С-терминално активиране. iNOC-защитените активирани с glc-К-амид пептиди могат да се синтезират като се използуват стандартни твърдофазови методи, както е подчертано (Схема 2). След това пептидите се лигират последователно?докато се получи целият белтък и крайният продукт се ренатурира in vitro. Като се изхожда от хомологията с ЕРО се смята, че дисулфидните двойки се формират между цистеинови остатъци 7 и 151 и между 28 и 85. Окисляването на дисулфидите може да се проведе просто чрез разбъркване на редуцирания материал в кислородна атмосфера за няколко часа. Ренатурираният материал след това може да се пречисти чрез HPLC и фракциите, съдържащи активен белтък да се обединят и лиофилизират. Като алтернатива дисулфидите могат да се защитят диференциално, за да се контролира последователно окисление между специфични дисулфидни двойки. Блокирането на цистеини 7 и 151 с ацетамидометилови (аст) групи ще осигури окисление на 28 и 85. Групите аст след това могат да се отстранят и да се окислят остатъци 7 и 151. Обратно, остатъци 28 и 85 биха могли да се блокират с аст и да се окислят, в случай че за правилната ренатурация се изисква последователно окисление. Възможно е цистеини 28 и 85 да се заменят с друг

1ST природен или неприроден остатък, различен от Cys, за да се подсигури правилно окисление на цистеини 7 и 151.

ТАБЛИЦА 14

Пептидни фрагменти, използувани за тотална синтеза на h-ML чрез използуване на субтилигаза

Фрагмент Последователност (SEQ ID N0:110) iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH₂ (1-22) (SEQ ID NO: 111) iN0C-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2 (23-46) (SEQ ID NO: 112) iN0C-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH2 (47-69) (SEQ ID NO: 113) iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH₂ (70-90) (SEQ ID NO: 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH₂ (90-106) (SEQ ID NO: 115) iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH₂ (107-128) (SEQ ID NO: 116)

H2N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2 (129-153)

Пептидните лигирания се извършват на 25°С в 100 мМ трицин, pH 8 (прясно приготвен и дегазиран чрез филтруване под вакуум през филтър от 5 мкм). С-терминалният фрагмент обичайно се разтваря в буфер (2-5 мМ пептид) и се прибавя 10х концентриран разтвор на субтилигаза (1 мг/мл в 100 мМ трицин, pH 8) за довеждане на крайната ензимна концентрация до ~ 5 мкМ. След това се добавя 3-5 моларен излишък от активирания с glc-K-NH₂ донорен пептид под формата на твърдо вещество, разтваря се и сместа се оставя да престои на 25°С. Лигиранията се проследяват чрез аналитична обратнофазова С18 HPLC (CH3CN/H2O градиент с 0,1% TFA). Лигазните продукти се пречистват чрез препаративна HPLC и се лиофилизират. Изоникотиновото (iNOC) деблокиране се извършва чрез разбъркване на блокирания пептид в оцетна киселина с цинков прах, активиран с HCI. Цинковият прах се отстранява чрез филтруване, а оцетната киселина се изпарява под вакуум. Полученият пептид може да се използува директно в следващото лигиране като процесът се повтаря. Синтетичен hML-153 може да се лигира чрез процедури, аналогични с тези описани по-горе, със синтетичен или рекомбинантен hML-(54-332 за получаване на синтетичен или полусинтетичен пълноразмерен hML.

Синтетичният hML има редица предимства пред рекомбинантния. Могат да се въведат необичайни странични вериги, за да се подобрят активността или специфичността. Могат да се включат полимерни функционални съствки, такива като полиетиленгликол, за подобряване продължителността на действието. Например, към лизиновите остатъци на индивидуалните фрагменти (Таблица 14) може да се присъедини полиетиленгликол преди или след като са били извършени една или повече стъпки на лигиране. Могат да се отстранят или променят пептидни връзки, чувствителни на протеази, за подобряване на стабилността in vivo. Освен това могат да се синтезират производни с тежки атоми, което да помогне за определянето на структурата.

199

Схема 2. Твърдофазова синтеза на пептидни фрагменти за сегментно лигиране

Изоникотинил (iNOC)

ТМ?.

OR О (СН₂)₄

I___________|КН₂ I гликолат-лизил-амид (glc-K-NH2)

а) Смолата лизил-параметилбензхидриламин (MBHA) 1 (0,63 мекв./г, Advanced

ChemTech) се разбърква c бромоцетна киселина (5 екв.) и диизопропил карбодиимид (5 екв.) за 1 час на 25°С в диметилацетамид (DMA) за получаване на бромацетиловото производно 2. Смолата се промива обилно с DMA и индивидуалните Вос-защитени аминокиселини (3 екв., Bachem) се естерифицират чрез разбъркване с натриев бикарбонат (6 екв.) в диметилформамид (DMF) за 24 часа на 50°С за получаване на съответната гликолат-фенилаланил-амид-смолаЗ. Аминоацетилираната смола 3 се промива с DMF (Зх) и дихлорметан (CH2CI2) (Зх>

и може да се съхранява на стайна температура няколко месеца. Смола 3 след това може да се нанесе в автоматизиран пептиден синтезатор (Applied

2fio

Biosystems 430A) и пептидите да се удължат чрез използуване на стандартни твърдофазови процедури (5). с) Групата Ν-α-Вос се отстранява чрез разтвор на 45% трифлуороцетна киселина в CH2CI2. d) Следващите Вос-защитени аминокиселини (5 екв.) се преактивират чрез използуване на бензотриазол-1-илокси-трис-(диметиламино) фосфониев хексафлуорфосфат (ВОР, 4 екв.) и Nметилморфолин (NMM, 10 екв.) в DMA и се купелуват 1-2 часа, е) Крайната Ν-αВос група се отстранява (TFA/CH2CI2) за получаване на 4 и се въвежда изоникотинова (iNOC) защитна група, както е описано по-рано (4) чрез разбъркване с 4-изоникотинил-2-4-динитрофенил карбонат (3 екв.) и NMM (6 екв.) в DMA на 25°С за 24 часа, f) Откачване и деблокиране на пептида чрез третиране с безводен HF (5% анизол/5% етилметилсулфид ) на 0°С за 1 час дава iNOCзащитения активиран с гликолат-лиз-амид пептид 5, който се пречиства чрез обратнофазова С18 HPLC (CH3CN/H2O градиент, 0,1% TFA). Идентичността на всички субстрати се потвърждава чрез масспектрометиря.

*****

ДОПЪЛНИТЕЛНИ УКАЗАНИЯ

Изобретението, както се претендира, може да се изпълни в съгласие с горната спецификация, леснодостъпните цитати и изходни материали. Независимо от това Заявителите са депозирали в American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (АТСС) изброените по-долу клетъчни линии:

Escherichia coli, DHIOB-pBSK-hmpd 1,8 АТСС достъпен No. CRL 69575, депозиран на 24 февруари, 1944.

Плазмид, pSVI5.ID.LL.MLORF, АТСС достъпен No. CRL 75958, депозиран на 2 декември, 1994; и

СНО DP-12-клетки, ML 1/50 МСВ (означен #1594), АТСС достъпен No. CRL 11770, депозиран на 6 декември, 1944.

Този депозит е направен съгласно разпоредбите на Будапещенския международен договор и съответния устав (Будапещенски договор) за международно признаване депозита на микроорганизми за целите на патентната процедур. Той гарантира съхраняването на жизнени култури в продължение на 30

2Pt години от датата на депозита. Организмите ще бъдат направени достъпни от АТСС, съгласно клаузите на Будапещенския договор и ще са предмет на споразумение между Заявителите и АТСС, което гарантира неограничен достъп до тях след публикуването на същинския патент на САЩ. Достъпът до депозирания щам не трябва да се тълкува като лиценз за практикуване на изобретението в нарушение на правата, които се предоставят от всяко упълномощено правителство съгласно неговите патентни закони.

*****

Тъй като изобретението по необходимост е описанио във връзка с предпочетените приложения и специфични работни експерименти, след прочитане на гореизложената спецификация, рутинният специалист ще може да направи различни изменения, еквивалентни замествания, както и промени в поместения тук предмет, без да се отдалечава от неговия дух и форма. Следователно, изобретението може да се практикува по начини, различни от тези, които са описани конкретно тук. Поради това се предвижда защитата, придобита след регистрацията на патента, да се ограничи само до приложените претенции и техните еквиваленти.

Преднамерено са включени и данните за всички литературни източници, които са цитирани тук.

2.02.

Списък на последователностите (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗАЯВИТЕЛ: Genenech

Eaton, Dan L. de Sauvage, Frederic J.

(ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: ТРОМБОПОЕТИН (iii) БРОЙ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 144 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

(A) АДРЕСАТ: Genentech, Inc.

Corporate Patents (B) УЛИЦА: 460 Point San Bruno Blvd (C) ГРАД: South San Francisco (D) Щат: California (E) СТРАНА: САЩ (F) КОД: 94080 (v) ФОРМА ЗА КОМПЮТЪРНО ЧЕТЕНЕ:

(A) ТИП СРЕДА: 5,25 инча, 360 Кб дискета (B) КОМПЮТЪР: IBM РС-съвместим (C) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) ПРОГРАМЕН ПРОДУКТ: patin (Genentech) (vi) ТЕКУЩА ИНФОРМАЦИЯ ЗА ЗАЯВКАТА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА:

(B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ:

(C) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/176553 (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 03 януари 1994 (vii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/348657 (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 02 декември 1994 (vii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/185607 (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 21 януари 1994 (vii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/348658 (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 02 декемкври 1994 (vii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/196689 (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ^ 15 февруари 1994 (vii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/223263 (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 04 април 1994 (vii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: 08/249376 (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 25 май 1994 (viii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПЪЛНОМОЩНИКА/АГЕНТА:

(A) ИМЕ: Winter, Darly В.

(B) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 32 637 (C) НОМЕР НА УКАЗАТЕЛЯ/РЕГИСТЪРА: 871Р5РСТ (ix) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ТЕЛЕКОМУНИКАЦИЯ:

(A) ТЕЛЕФОН: 415/225-1249 (B) ТЕЛЕФАКС: 415/952-9881 (C) ТЕЛЕКС: 920/371-716 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:1:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

.(А) ДЪЛЖИНА: 353 аминокиселини (В) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:1:

Met -21

Glu -20

Leu

Thr

Glu

Leu

Leu -15

Leu

Vai

Vai

Met

Leu -10

Leu

Leu

Thr

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

-5

1

5

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

10

1 5

20

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Vai

H i s

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

25

3 0

35

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

4 5

50

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Al a

G1 n

Asp

tie

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

c c

60

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

70

75

80

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

85

90

95

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

100

1 0 5

1 1 o

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

He

Phe

Leu

115

120

125

204

Ser 13Ό

Phe

Gin ·

His

Leo

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met-

-Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

145

150

155

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

160

165

170

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

175

180

185

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

G1 y

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

190

1 95

200

Arg

Ala

Lys

He

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

205

210

215

Asp

Gin

lie

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

He

His

Glu

Leu

Leu

Asn

220

225

230

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

235

240

245

Ala

Pro

Asp

lie

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

G1 y

Ser

Leu

Pro

250

255

2 60

Pro 2 65

Asn

T.en

G1 n

Pro

G1 y 2 7' 0

Tyr

Sp r

Pro

C] Y-

Pro 27 5

Thr

H i s

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

280

285

290

Pro

Val

Val

Gin

Leu

Hi s

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

295

300

3 05

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

310

315

320

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

G1 n

G1 u

G1 y

325

330

332

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:2:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 1795 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна

205 (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2:

TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC

CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG

CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC

100

150

200

CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA

GACACCCCGG CCAGA

ATG Met -21

GAG Glu -20

CTG Leu

ACT Thr

GAA Glu

TTG Leu

CTC Leu -15

CTC Leu

239

GTG

GTC

ATG

CTT

CTC

CTA

ACT

GCA

AGG

CTA

ACG

CTG

TCC

278

Vai

Vai

Met

Leu -10

Leu

Leu

Thr

Ala

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

AGC

CCG

GCT

CCT

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

317

Ser 1

Pro

Ala

Pro

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

356

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

Hi s 20

Vai

Leu

Hi s

Ser

Arg

Leu

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

CCT

GTC

395

Ser

Gin

Cys

Pro 30

G1 u

Va 1

Hi s

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Vai

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

434

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

G1U 50

Trp

Lys

ACC

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

4 73

Thr

Gin

Met 55

G1 u

G1 u

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

He

Leu

Gly 65

GCA

GTG

ACC

CTT

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

512

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Vai

Met 75

Ala

Al a

Arg

GGA

CAA'

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

551

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

GCC

CTG

590

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Vai

Arg

Leu 100

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

206

CAG

AGC

CTC.

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

•CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

-62 9-..

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

105

110

115

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

668

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Al a

He

Phe

Leu

Ser

120

125

130

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

LEG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

707

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Met

135

140

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

746

Leu

Vai

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Vai

Arg

Arg

Ala

Pro

145

«

150

155

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

785

Pro

Thr

Thr

Ala

Vai

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Vai

Leu

160

165

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

.AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

TTG

824

Thr

Leu

Asn

G1 u

Leu

Pro

Asn

Are

Th Г

Ser

Gly

Leu

Leu

1 70

1 75

180

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

r- O'AzC

AGA

ACT

ACT

GGC

TCT

863

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

185

1 90

195

GGG

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

902

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Ph e

Arg

Ala

Lys

Tie

200

205

CCT

GGT

CTG

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

941

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

210

215

220

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

АЛС

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

980

Tie

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Il e

His

GJ u

Leu

Leu

Asn

225

230

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

1019

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

235

240

245

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

1058

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Tie

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

250

255

260

207

GGC Gly

TCC Ser

CTG· Leu

CCA Pro

CCC Pro 265

AAC Asn

CTC Leu

CAG Gin

GCT Pro

GGA Gly 270

TAT Tyr

TCT Ser

CCT Pro

1097.

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

1136

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

275

280

285

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

1175

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Th r

Pro

Vai

Va 1

Gl n

Leu

290

295

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

1214

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

300

305

310

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

1253

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

315

320

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA.

GGG

T AAGGT

TCTCAGACAC

1290

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

330

332

TGCCGACATC AGCATTGTCT CATGTACAGC 7CCCTTCCCT GCAGGGCGCC 1340

CCTGGGAGAC AACTGGACAA GATTTCCTAC TTTCTCCTGA AACCCAAAGC 1390

CCTGGTAAAA GGGATACACA GGACTGAAAA GGGAATCATT TTTCACTGTA 1440

CATTATAAAC CTTCAGAAGC TATTT7TTTA AGCTATCAGC AATACTCATC 14 90

AGAGCAGCTA GCTCTTTGGT CTATTTTCTG CAGAAATTTG CAACTCACTG 1540

ATTCTCTACA TGCTCTTTTT CTGTGATAAC TCTGCAAAGG CCTGGGCTGG 1590

CCTGGCAbTT gAAuAgAuug AoAgAu 1 aAc LrruA(jiuAG aAAacauaua 1очи

AAGGGTAATT TCCTTTGCTT CAAATTCAAG GCCTTCCAAC GCCCCCATCC 1690

CCTTTACTAT CATTCTCAGT GGGACTCTGA TCCCATATTC TTAACAGATC 1740

TTTACTCTTG AGAAATGAAT AAGCT7TCTC TCAGAAAAAA AAAAAAAAAA 1790

AAAAA 1795 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:3:

2o6 . У (i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: (A) ДЪЛЖИНА: 42 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:3:

Leu -16

Leu -15

Leu

Vai

Vai

Met

Leu -10

Leu

Leu

Thr

Ala

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

A.sp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

1

5

10

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

Hi s

Vai

Leu

H i s

Ser

Arg

Leu

15

20

25

26

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:4:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 390 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:4:

GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT ТССТССТСАТ СТТТСААССТ 50

САССТСТССТ CATCTAAGAA TTG СТС СТС GTG GTC ATG СТТ 91

Leu Leu Leu Vai Vai Mat Leu

-16 -15 -10

CTC

CTA

ACT

GCA

AGG

CTA

ACG

CTG

TCC

AGC

CCG

GCT

CCT

130

Leu

Leu

Tar

Ala

Arg -5

Leu

Thr

7 g; j

Ser

Ser 1

Pro

Ala

Pro

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

169

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

5

10

15

GAC

TCC

CAT

GTC

CTT

CAC

AGC

A.GA

CTG

GTGA GAACTCCCAA

210

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

20

25

26

CATTATCCCC TTTATCCGCG TAACTGGTAA GACACCCATA CTCCCAGGAA 260

GACACCATCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT TCTTCCCATA 310

TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT TCTTCACAAT 360

203

ACAGCCCGCA TTTAAAAGCT-CTCGTCTAGA 390 ' ..

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:5:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 390 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:5:

TCTAGACGAG	AGCTTTTAAA	TGCGGGCTGT	ATTGTGAAGA	ATAATTCTTG	50
TCAGAGAGTG	TGATCAGTAG	GTGGGGACAA	TATGGGAAGA	ATAGTCATTG	100
GGTCAAGGAG	TTAGAGGAAG	TGATGGTGTC	TTCCTGGGAG	TATGGGTGTC	150
TTACCAGTTA	CGCGGATAAA	GGGGATAATG	TTGGGAGTTC	TCACCAGTCT	200
GCTGTGAAGG	ACATGGGAGT	CACGAAGCAG	TTTACTGAGG	ACTCGGAGGT	250
CACAAGCAGG	AGGAGCCGGG	CTGGACAGCG	TTAGCCTTGC	AGTTAGGAGA	300
AGCATGACCA	CGAGGAGCAA	TTCTTAGATG	AGGAGAGGTG	AGGTTGAAAG	350
ATGAGGAGGA	AATCATTGTC	AGCTGGTATT	CCAGGAATTC	390

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:6:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(А) ДЪЛЖИНА: 332 аминокиселини

240 (В) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:6:

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu

1

5

10

15

Leu

Arg

Asp

Ser

His Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Glu

Vai

His

Pro

Leu Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

He

Leu

Gly Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

65

70

75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly Gin

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

110

115

120

His

Lys

Asp

Pro

Asn Ala

He

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

125

130

135

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg Phe

Leu

Met

Leu

Vai

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

140

145

150

Cys

Vai

Arg

Arg

Ala Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Vai

Pro

Ser

Arg

Thr

155

160

165

Ser

Leu

Vai

Leu

Thr Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

170

175

180

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

185

190

195

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

lie

Pro

Gly

200

205

210

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

He

Pro

Gly

Tyr

215

220

225

Leu

Asn

Arg

lie

His Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

230

.235

240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

He

Ser

Ser

245

250

255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

2 60

265

270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

275

280

285

2ii

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro Thr

Pro 295

Vai

Vai

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

305

310

315

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

320

325

330

Glu Gly

332 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:7:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 166 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:7:

Ala 1

Pro

Pro Arg Leu 5

lie Cys

Asp

Ser

Arg Vai 10

Leu

Glu

Arg

Tyr 15

Leu

Leu

Glu

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

lie

Thr

Thr

Gly

Cys

Ala

20

25

30

Glu

His

Cys

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn

He

Thr

Vai

Pro

Asp

Thr

Lys

35

40

45

Vai

Asn

Phe

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg

Met

Glu

Vai

Gly

Gin

Gin

Ala

50

55

60

Vai

Glu

Vai

Trp

Gin

Gly

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Glu

Ala

Vai

Leu

65

70

75

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu

Leu

Vai

Asn

Ser

Ser

Gin'

Pro

Trp

Glu

Pro

80

85

90

Leu

Gin

Leu

His

Vai

Asp

Lys

Ala

Vai

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu

95

100

105

Thr

Thr

Leu

Leu

Arg

Ala

Leu

Gly

Ala

Gin

Lys

Glu

Ala

He

Ser

110

115

120

Pro

Pro

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Pro

Leu

Arg

Thr

He

Thr

Ala

125

130

135

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Vai

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg

140

145

150

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala

Cys

Arg

Thr

Gly

Asp

155 160 165

Arg

166

242 (2) ИНФОРМАЦИЯ _3A SEQ ID N0:8:

( (i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 328 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:8:

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu

1

5

10

15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Glu

Vai

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

He

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

65

70

75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Gly

Arg

Thr Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

110

115

120

Asn

Ala

lie

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

125

130

135

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Vai

Gly

Gly

Ser Thr

Leu

Cys

Vai

Arg

Arg

140

145

150

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Vai

Pro

Ser Arg

Thr

Ser

Leu

Vai

Leu

155

160

165

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

170

175

180

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

185

190

195

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

He Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

200

205

210

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

He

Pro Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

He

215

220

225

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arc

Gly Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

230

235

240

Arg

Arq

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Д. ς-·. r-

He Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

2 4 5

250

255

Thr Gly

Ser

Leu

Pro 260

Pro Asn

Leu Gin

Pro 265

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser 270

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Vai

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

290

295

300

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

305

310

315

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

320

325

328

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:9:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 265 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:9:

Ser 1

Pro Ala

Pro

Pro Ala 5

Cys Asp

Leu

Arg Vai 10

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Glu

Vai

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

He

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

65

70

75

Ala

Al a

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

110

115

120

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

lie

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

125

130

135

Arg·

-Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

He

Vai

Gly

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

140

145

150

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Vai

Ala

Ala

Gly

He

155

160

165

Gin

Ser

Gin

Asp

Ser

-Trp

Ser

Ala

Glu

-Pro

Asn

Leu

Gin

Vai

Pro

170

175

180

Gly

Pro

Asn

Pro

Arg He 185

Pro Glu Gin Asp Thr Arg Thr Leu Glu

190

195

Trp

Asn

Ser

Trp

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

Asp

Pro

Arg

200

205

210

Ser

Pro

Gly

His

Phe

Leu

Arg

Asn

He

Arg

His

Arg

Leu

Pro

Ala

215

220

225

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala

Trp

lie

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

230

235

240

Tyr

Trp

Thr

Vai

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

245

250

255

Pro

Cys

Gly

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

AXa

Ser

260

265

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:10:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 261 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:10:

Ser 1

Pro Ala

Pro

Pro Ala Cys 5

Asp

Leu

Arg 10

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Glu

Vai

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

He

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

65

70

75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

HO

115

120

Asn

Aid

He

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Asp

125

130

135

Phe

Trp

lie

Vai

Gly

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

Ser

Gin

Asn

Tyr

140

145

150

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Vai

Ala

Ala

Gly

He

Gin

Ser

Gin

Asp

155

160

165

* ‘ » * 'r 5 ί·

US

Ser Trp Ser Ala Glu

Pro

Asn Leu

Gin Val 175

Pro

Gly

Pro

Asn

Pro 180

170

Arg

lie

Pro

Glu

Gin

Asp

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu

Trp

Asn

Ser

Trp

185

190

195

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

Asp

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

200

205

210

Phe

Leu

Arg

Asn

lie

Arg

His

Arg

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

215

220

225

Ala

Trp

He

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

Tyr

Trp

Thr

Val

230

235

240

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

Cys

Gly

Pro

245

250

255

Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

Ser

260 261 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:11 :

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 7849 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна ’(D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:11:

CCCAGCCTCC	TTTCTCTTGT	TCCCTGGTCA	TGCCTGCCTC	CCTGTCTCCT	50
GTCTCTCCCT	CCCACACACA	CCCACTATCC	TCCCAGCTAT	CCCTACACCC	100
TCCTTCCTAA	TCTTGGGAGA	CATCTCGTCT	GGCTGGACGG	GAAAATTCCA	150
GGATCTAGGC	CACACTTCTC	AGCAGACATG	CCCATCCTTG	GGGAGGAGGA	200
ACAGGAGAGA	GCCTGAGGAA	GTTCTGGGGG	ACAGGGGGAT	GATGGGATCA	250
AGGTCAGGCC	AGGAAGCCCC	TGAGGACAGA	GACTGTGGGG	AGACTGGGAC	300
TGGGAAGAAA	GCAAAGGAGC	TAGAGCCAGG	GCCAAAGGAA	AAGGGGGGCC	350
AGCAGGGAGG	TATTTGCGGG	GGAGGTCCAG	CAGCTGTCTT	TCCTAAGACA	400
GGGACACATG	GGCCTGGTTA	TTCCTCTTGT	CACATGTGGA	ACGGTAGGAG	450

ATGGAAGACG GAGACAGAAC AAGCAAAGGA GGGCCCTGGG CACAGAGGTC 500

TGTGTGTGTA	GCCATCCAAG	CCACTGGACC	CCAGCAGACG	AGCACCTAAG	550
CTCAGGCTTA	ACCCAGTGCA	CGTGTGCGCA	CATACATGTG	CCCCGCACCT	600
GACAGTCCAC	TCAACCCGTC	CAAACCCTTT	CCCCATAACA	CCAACCCATA	650
acaggagatt	TCTCTCATGT	GGGCAATATC	CGTGTTCCCA	CTTCGAAAGG	700
GGGAATGACA	AGATAGGACT	CCCTAGGGGA	TTACAGAAAG	AAAAGCAGGA	750
AAGCAAGCAT	CCTGTTGGAT	TTCAGCAGCA	GGTATGATGT	CCAGGGAAAA	SOO
GAAATTTGGA	TAGCCAGGGA	GTGAAAACCC	CACCAATCTT	AAACAAGACC	850
TCTGTGCTTC	TTCCCCAGCA	ACACAAATGT	CCTGCCAGAT	TCCTCCTGGA	900
AAAAAACTTC	TGCTCCTGTC	CCCCTCCAGG	TCCCAGGTTG	CCCATGTCCA	950
GGAAAAGATG	GATCCCCCTA	TCCAAATCTT	CTCCGTGGTG	TGTGTGGGTG	1000
GAGGAGTGGA	CCCTGGTCCA	GGCAGGGGCT	CCAGGGAAGA	GAAGGCGTCA	1050
CTTCCGGGGG	CCTTCACCAG	TGTCTGGTGG	CTCCCTTCTC	TGATTGGGCA	1100
GAAGTGGCCC	AGGCAGGCGT	ATGACCTGCT	GCTGTGGAGG	GGCTGTGCCC	1150
CACCGCCACA	TGTCTTCCTA	CCCATCTGCT	CCCCAGAGGG	CTGCCTGCTG	1200
TGCACTTGGG	TCCTGGAGCC	CTTCTCCACC	CGGTGAGTGG	CCAGCAGGGT	1250
GTGGGGTTAT	GTGAGGGTAG	AAAGGACAGC	AAAGAGAAAT	GGGCTCCCAG	1300
CTGGGGGAGG	GGCAGGCAAA	CTGGAACCTA	CAGGCACTGA	CCTTTGTCGA	1350
GAAGAGTGTA	GCCTTCCCAG	AATGGGAGGA	GCAGGGCAGA	GCAGGGGTAG	1400
GGGGTGGGGT	GCTGGTTTCT	GAGGGACTGA	TCACTTACTT	GGTGGAATAC	1450

AGCACAGCCC TGGCTGGCCC TAAGGAAAGG GGACATGAGC CCAGGGAGAA 1500

AATAAGAGAG	GGAGCTGCAC	TTAGGGCTTA	GCAAACACAG	TAGTAAGATG	1550
GACACAGCCC	CAATCCCCAT	TCTTAGCTGG	TCATTCCTCG	TTAGCTTAAG	1600
GTTCTGAATC	TGGTGCTGGG	GAAGCTGGGC	CAGGCAAGCC	AGGGCGCAAG	1650
GAGAGGGTAA	TGGGAGGAGG	GCCCACTCAT	GTTGACAGAC	CTACAGGAAA	1700
TCCCAATATT	GAATCAGGTG	CAAGCCTCTT	TGCACAACTT	GTGAAAGGAG	1750
GAGGAAGCCA	TGTGGGGGGT	CCTGTGAAGG	AACCGGAAGG	GGTTCTGCCA	1800
AGGGGGCAGG	GAGGCAGGTG	TGAGCTATGA	GACAGATATG	TTAGTGGGCG	1850
CCTAAGACAA	GGTAAGCCCC	TAAGGTGGGC	ATCACCCAGC	AGGTGCCCGT	1900
TCCTGGGCAG	CTGGTCTCAG	GAAGGAAGTC	CCAGAACTGT	TAGCCCATCT	1950
CTTGGCCTCA	GATAATGGAG	TATTTCAGGA	CTTGGAGTCC	AAAGAAAAGC	2000
TCCAGTGGCT	TTATGTGTGG	GGGTAGATAG	GGAAAGAATA	GAGGTTAATT	2050
TCTCCCATAC	CGCCTTTTAA	TCCTGACCTC	TAGTGGTCCC	AGTTACAGCT	2100
TTGTGCAGTT	CCCCTCCCCA	GCCCCA.CTCC	CCACCGCAGA	AGTTACCCCT	2150
CAACATATTG	CGCCCGTTTG	CCAGTTCCTC	ACCCAGGCCC	TGCATCCCAT	2200
TTTCCACTCT	CTTCTCCAGG	CTGAAGCCAC	AATACTTTCC	TTCTCTATCC	2250
CCATCCCAGA	TTTTCTCTGA	CCTAACAACC	AAGGTTGCTC	AGAATTTAAG	2300
GCTAATTAAG	ATATGTGTGT	ATACATATCA	TGTCCTGCTG	CTCTCAGCAG	2350
GGGTAGGTGG	CACCAAATCC	GTGTCCGATT	CACTGAGGAG	TCCTGACAAA	2400
AAGGAGACAC	CATATGCTTT	CTTGCTTTCT	TTCTTTCTTT		2450
TTTTTTTTGA	GACGGAGTTT	СДСТСТТАТТ	GCCCAGGCTG	GAGTGCAATG	2500

GTGCGATCTC GGCTCACCAC AAACCTCCGC CTCCCAGGTA CAAGCGATTC 2550.

> * » . . ο

2ί8

TCCTGTCTCA	GCCTCCCAAG	TAGCTTGGAT	TACAGGCATG	AGCCACCACA	2600
CCCTGCTAGT	TTTTTTGTAT	TTCGTAGAGC	CGGGGTTTCA	CCATGTTAGT	2650
GAGGCTGGTG	GCGAACTCCT	GACCTCAGGT	GATCCACCCG	CCTTGGACTC	2700
CCAAAGTGCT	GGGATTACAG	GCATGAGCCA	CTGCACCCGG	CACACCATAT	2750
GCTTTCATCA	CAAGAAAATG	TGAGAGAATT	CAGGGCTTTG	GCAGTTCCAG	2800
GCTGGTCAGC	ATCTCAAGCC	CTCCCCAGCA	TCTGTTCACC	CTGCCAGGCA	2850
GTCTCTTCCT	AGAAACTTGG	TTAAATGTTC	ACTCTTCTTG	CTACTTTCAG	2900
GATAGATTCC	TCACCCTTGG	CCCGCCTTTG	CCCCACCCTA	CTCTGCCCAG	2950
AAGTGCAAGA	GCCTAAGCCG	CCTCCATGGC	CCCAGGAAGG	ATTCAGGGGA	3000
GAGGCCCCAA	ACAGGGAGCC	ACGCCAGCCA	GACACCCCGG	CCAGAATGGA	3050
GCTGACTGGT	GAGAACACAC	CTGAGGGGCT	AGGGCCATAT	GGAAACATGA	3100
CAGAAGGGGA	GAGAGAAAGG	AGACACGCTG	CAGGGGGCAG	GAAGCTGGGG	3150
GAACCCATTC	TCCCAAAAAT	AAGGGGTCTG	AGGGGTGGAT	TCCCTGGGTT	3200
TCAGGTCTGG	GTCCTGAATG	GGAATTCCTG	GAATACCAGC	TGACAATGAT	3250
TTCCTCCTCA	TCTTTCAACC	TCACCTCTCC	TCATCTAAGA	ATTGCTCCTC	3300
GTGGTCATGC	TTCTCCTAAC	TGCAAGGCTA	ACGCTGTCCA	GCCCGGCTCC	3350
TCCTGCTTGT	GACCTCCGAG	TCCTCAGTAA	ACTGCTTCGT	GACTCCCATG	3400
TCCTTCACAG	CAGACTGGTG	AG.AACTCCCA	ACATTATCCC	CTTTATCCGC	3450
GTAACTGGTA	AGACACCCAT	ACTCCCAGGA	AGACACCATC	ACTTCCTCTA	3500

ACTCCTTGAC CCAATGACTA TTCTTCCCAT ATTGTCCCCA CCTACTGATC 3550 '219

ACACTCTCTG	ACAAGAATTA	TTCTTCACAA	TACAGCCCGC	ATTTAAAAGC	3600
TCTCGTCTAG	AGATAGTACT	CATGGAGGAC	TAGCCTGCTT	ATTAGGCTAC	3650
CATAGCTCTC	TCTATTTCAG	CTCCCTTCTC	CCCCCACCAA	TCTTTTTCAA	3700
CAGAGCCAGT	GCCCAGAGGT	TCACCCTTTG	CCTACACCTG	TCCTGCTGCC	3750
TGCTGTGGAC	TTTAGCTTGG	GAGAATGGAA	AACCCAGATG	GTAAGAAAGC	3800
CATCCCTAAC	CTTGGCTTCC	CTAAGTCCTG	TCTTCAGTTT	CCCACTGCTT	3850
CCCATGGATT	CTCCAACATT	CTTGAGCTTT	TTAAAAATAT	CTCACCTTCA	3900
GCTTGGCCAC	CCTAACCCAA	TCTACATTCA	CCTATGATGA	TAGCCTGTGG	3950
ATAAGATGAT	GGCTTGCAGG	TCCAATATGT	GAATAGATTT	GAAGCTGAAC	4000
ACCATGAAAA	GCTGGAGAGA	AATCGCTCAT	GGCCATGCCT	TTGACCTATT	4050
CCYGTTCAGT	CTTCTTAAAT	TGGCATGAAG	AAGCAAGACT	CATATGTCAT	4100
CCACAGATGA	CACAAAGCTG	GGAAGTACCA	CTAAAATAAC	AAAAGACTGA	4150
ATCAAGATTC	AAATCACTGA	AAGACTAGGT	CAAAAACAAG	GTGAAACAAC	4200
AGAGATATAA	ACTTCTACAT	GTGGGCCGGG	GGCTCACGCC	TGTAATCCCA	4250
GCACTTTGGG	AGGCCGAGGC	AGGCAGATCA	CCTGAGGGCA	GGAGTTTGAG	4300
AGCAGCCTGG	CCAACATGGC	GAAACCCCG?	CTCTACTAAG	AATACAAAAT	4350
TAGCCGGGCA	TGGTAGTGCA	TGCCTGTAA7	CCCAGCTACT	TGGAAGGCTG	4400
AAGCAGGAGA	ATCCCTTGAA	CCCAGGAGC-T	GGAGGTTGTA	GTGAGCTGAG	4450
ATCATGCCAA	TGCACTCCAG	CCTGGGTGAC	AAGAGCAAAA	CTCCGTCTCA	4500

AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC 4 550

			..	CTCTGGCCCT
CAGCTTTCAG	GCCACAATGC	CCTGCTTCCA	TCATTTAAGC	4600
AGCACTTCCT	ACGAAAAGGA	TCTGAGAGAA	TTAAATTGCC	CCCAAACTTA	4650
CCATGTAACA	TTACTGAAGC	TGCTATTCTT	AAAGCTAGTA	ATTCTTGTCT	4700
GTTTGATGTT	TAGCATCCCC	ATTGTGGAAA	TGCTCGTACA	GAACTCTATT	4750
CCGAGTGGAC	TACACTTAAA	TATACTGGCC	TGAACACCGG	ACATCCCCCT	4800
GAAGACATAT	GCTAATTTAT	TAAGAGGGAC	CATATTAAAC	TAACATGTGT	4850
CTAGAAAGCA	GCAGCCTGAA	CAGAAAGAGA	CTAGAAGCAT	GTTTTATGGG	4900
CAATAGTTTA	AAAAACTAAA	ATCTATCCTC	AAGAACCCTA	GCGTCCCTTC	4950
TTCCTTCAGG	ACTGAGTCAG	GGAAGAAGGG	CAGTTCCTAT	GGGTCCCTTC	5000
TAGTCCTTTC	TTTTCATCCT	TATGATCATT	ATGGTAGAGT	CTCATACCTA	5050
CATTTAGTTT	ATTTATTATT	ATTATTTGAG	ACGGAGTCTC	ACTCTATCCC	5100
CCAGGCTGGA	GTGCAGTGGC	ATGATCTCAA	CTCACTGCAA	CCTCAGCCTC	5150
CCGGATTCAA	GCGATTCTCC	TGCCTCAGTC	TCCCAAGTAG	CTGGGATTAC	5200
AGGTGCCCAC	CACCATGCCC	AGCTAATTTT	TGTAT7TTTG	GTAGAGATGG	5250
GGTTTCACCA	TGTTGGCCAG	GCTGATCTTG	AACTCCTGAC	CTCAGGTGAT	5300
CCACCTGCCT	CAGCCTCCCA	AAGTGCTGGG	ATTACAGGCG	TGAGCCACTG	5350
CACCCAGCCT	TCATTCAGTT	TAAAAATCAA	ATGATCCTAA	GGTTTTGCAG	5400
CAGAAAGAGT	AAATTTGCAG	CACTAGAACC	AAGAGGTAAA	AGCTGTAACA	5450
GGGCAGATTT	CAGCAACGTA	AGAAAAAAGG	AGCTCTTCTC	ACTGAAACCA	5500
AGTGTAAGAC	CAGGCTGGAC	TAGAGGACAC	GGGAGTTTTT	GAAGCAGAGG	5550
CTGATGACCA	GCTGTCGGGA	GACTGTGAAG	GAATTCCTGC	CCTGGGTGGG	5600

!

224

ACCTTGGTCC	TGTCCAGTTC	TCAGCCTGTA	TGATTCACTC	TGCTGGCTAC	5650
TCCTAAGGCT	CCCCACCCGC	TTTTAGTGTG	CCCTTTGAGG	CAGTGCGCTT	5700
CTCTCTTCCA	TCTCTTTCTC	AGGAGGAGAC	CAAGGCACAG	GACATTCTGG	5750
GAGCAGTGAC	CCTTCTGCTG	GAGGGAGTGA	TGGCAGCACG	GGGACAACTG	5800
GGACCCACTT	GCCTCTCATC	CCTCCTGGGG	CAGCTTTCTG	GACAGGTCCG	5850
TCTCCTCCTT	GGGGCCCTGC	AGAGCCTCCT	TGGAACCCAG	GTAAGTCCCC	5900
AGTCAAGGGA	TCTGTAGAAA	CTGTTCTTTT	CTGACTCAGT	CCCACTAGAA	5950
GACCTGAGGG	AAGAAGGGCT	CTTCCAGGGA	GCTCAAGGGC	AGAAGAGCTG	6000
ATCTACTAAG	AGTGCTCCCT	GCCAGCCACA	ATGCCTGGGT	ACTGGCATCC	6050
TGTCTTTCCT	ACTTAGACAA	GGGAGGCCTG	AGATCTGGCC	CTGGTGTTTG	6100
GCCTCAGGAC	CATCCTCTGC	CCTCAGCTTC	CTCCACAGGG	CAGGACCACA	6150
GCTCACAAGG	ATCCCAATGC	CATCTTCCTG	AGTTTCCAAC	ACCTGCTCCG	6200
AGGAAAGGTG	CGTTTCCTGA	TGCTTGTAGG	AGGGTCCACC	CTCTGCGTCA	6250
GGCGGGCCCC	ACCCACCACA	GCTGTCCCCA	GCAGAACCTC	TCTAGTCCTC	6300
ACACTGAACG	AGCTCCCAAA	CAGGACTTCT	GGATTGTTGG	AGACAAACTT	6350
CACTGCCTCA	GCCAGAACTA	CTGGCTCTGG	GCTTCTGAAG	TGGCAGCAGG	6400
GATTCAGAGC	CAAGATTCCT	GGTCTGCTGA	ACCAAACCTC	CAGGTCCCTG	6450
GACCAAATCC	CCGGATACCT	GAACAGGATA	CACGAACTCT	TGAATGGAAC	6500
TCGTGGACTC	TTTCCTGGAC	CCTCACGCAG	GACCCTAGGA	GCCCCGGACA	6550

TTTCCTCAGG AACATCAGAC ACAGGCTCCC TGCCACCCAA CCTCCAGCCT 6600

222

GGATATTCTC	CTTCCCCAAC	CCATCCTCCT	ACTGGACAGT	ATACGCTCTT	6650
CCCTCTTCCA	CCCACCTTGC	CCACCCCTGT	GGTCCAGCTC	CACCCCCTGC	6700
TTCCTGACCC	TTCTGCTCCA	ACGCCCACCC	CTACCAGCCC	TCTTCTAAAC	6750
ACATCCTACA	CCCACTCCCA	GAATCTGTCT	CAGGAAGGGT	AAGGTTCTCA	6800
GACACTGCCG	ACATCAGCAT	TGTCTCATGT	ACAGCTCCCT	TCCCTGCAGG	6850
GCGCCCCTGG	GAGACAACTG	GACAAGATTT	CCTACTTTCT	CCTGAAACCC	6900
AAAGCCCTGG	TAAAAGGGAT	ACACAGGACT	GAAAAGGGAA	TCATTTTTCA	6950
CTGTACATTA	TAAACCTTCA	GAAGCTATTT	TTTTAAGCTA	TCAGCAATAC	7000
TCATCAGAGC	AGCTAGCTCT	TTGGTCTATT	TTCTGCAGAA	ATTTGCAACT	7050
CACTGATTCT	CTACATGCTC	TTTTTCTGTG	ATAACTCTGC	AAAGGCCTGG	7100
GCTGGCCTGG	CAGTTGAACA	GAGGGAGAGA	CTAACCTTGA	GTCAGAAAAC	7150
AGAGAAAGGG	TAATTTCCTT	TGCTTCAAAT	TCAAGGCCTT	CCAACGCCCC	7200
CATCCCCTTT	ACTATCATTC	TCAGTGGGAC	TCTGATCCCA	TATTCTTAAC	7250
AGATCTTTAC	TCTTGAGAAA	TGAATAAGCT	TTCTCTCAGA	AATGCTGTCC	7300
CTATACACTA	GACAAAACTG	AGCCTGTATA	AGGAATAAAT	GGGAGCGCCG	7350
AAAAGCTCCC	TAAAAAGCAA	GGGAAAGATG	TTCTTCGAGG	GTGGCAATAG	7400
ATCCCCCTCA	CCCTGCCACC	CCAAACAAAA	AAGCTAACAG	GAAGCCTTGG	7450
AGAGCCTCAC	ACCCCAGGTA	AGGCTGTGTA	GACAGTTCAG	TAAAGACAGG	7500
ACCTGGATGT	GACAGCTGAG	CAAACAGCTA	GAGCTTTGGC	AGCTCAGCAG	7550

GAGGCTTTGC CAGGCATGGA CGCCTGCCTC CCTCCTGTGG AGGTCAGGAG 7600

223

GAAGTGCAGG	AAGTGGCATG	AGTCAGGCTC	CTTGAGCTCA	CACAGCAGGA	7 650
GAACAAGTAC	AAGTCAAGTA	CAAGTTGAAG	GCTCATTTCC	CAGTTCCCGC	7700
AAATGCATCT	AAAAAGCAGC	TCTGTGTGAC	CACCATAAAC	TCTGCTAGGG	7750
GATCTCTAAA	AAGGAGTCAG	GCTTATGGGG	CTTTGCAAAT	AAGTGCTGCC	1800
TTGGTGCTCA	GGAAAAGGTT	TGTGTTGCAC	AAAACACAAA	TTCCACTGC	1849

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:12:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 1443 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:12:

GAGTCCTTGG СССАССТСТС TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50

AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100

ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGA ATG GAG 143 Met Glu -?А -20

CTG Leu

ACT Thr

GAT Asp

TTG Leu

CTC Leu -15

CTG Leu

GCG Ala

ζ- Ala

ATG Me t

CTT Leu -10

CTT Leu

GCA Ala

GTG Vai

182

GCA

AGA

CTA

ACT

CTG

TCC

AGO

CCC

C-TA

GCT

CCT

GCC

TGT

221

Ala

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser 1

Pro

Vai

Ala

Pro 5

Ala

Cys

GAC

CCC

AGA

CTC

CTA

AAT

AAA

CTG

CTG

CGT

GAC

TCC

CAC

260

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

CTC

CTT

CAG

AGO

CGA

CTG

AGT

CAG

TGT

CCC

GAC

GTC

GAC

299

Leu

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gl n

Cys

Pro 30

Asp

Vai

Asp

CCT

TTG

TCT

ATC

CCT

GTT

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

338

Pro

Leu 35

Ser

He

Pro

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp 45

Phe

224

AGC Ser

CTG Leu

GGA GAA

TGG Trp

AAA Lys

ACC Thr

CAG Gin

ACG Thr 55

GAA G1 u

CAG Gin

AGC Ser

AAG Lys

3ΊΊ

Gly

G1 u 50

GCA

CAG

GAC

ATT

CTA

GGG

GCA

GTG

TCC

CTT

CTA

CTG

GAG

416

Ala

Gin

Asp

lie

Leu

Gly

Ala

Vai

Ser

Leu

Leu

Leu

G1 u

60

65

70

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGA

GGA

CAG

TTG

GAA

CCC

TCC

TGC

4 55

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

75

80

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGA

CAG

CTT

TCT

GGG

CAG

GTT

CGC

494

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

90

95

CTC

CTC

TTG

GGG

GCC

CTG

CAG

GGC

CTC

CTA

GGA

ACC

CAG

533

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

100

105

HO

GGC

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAC

CCC

AAT

GCC

CTC

TTC

572

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Leu

Phe

115

120

TTG

AGC

TTG

CAA

CAA

C.TG

CTT

CGG

GGA

AAG

GTG

CGC

TTC

61 1

Leu

Ser

Leu

Gin

G1 n

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

125

13G

135

CTG

CTT

CTG

GTA

GAA

GGT

CCC

ACC

CTC

TGT

GTC

AGA

CGG

650

Leu

Leu

Leu

Vai

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Cys

Vai

Arg

Arg

140

145

150

ACC

CTG

CCA

ACC

ACA

GCT

GTC

CCA

AGC

AGT

ACT

TCT

CAA

689

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr

Ala

Vai

Pro

Ser

Ser

Thr

Ser

Gin

155

1 60

CTC

CTC

ACA

CTA

AAC

AAG

TTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

728

Leu

Lau

Thr

Leu

Asn

Lys

Phe

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

165

1 70

TTG

TTG

GAG

ACG

AAC

TTC

AGT

GTC

ACA

GCC

AGA

ACT

GCT

767

Leu

Leu

G1 u

Thr

Asn

Phe

Ser

Vai

Thr

Ala

Arg

Thr

Ala

180

185

GGC

CCT

GGA

CTT

CTG

AGC

AGG

CTT

CAG

GGA

TTC

AGA

GTC

806

Gly

Pro

Gly

L on

Ge r

A rg

Leu

GI n

Gly

Pho

A rg

Va 1

190

195

200

225

AAG Lys

ATT lie

ACT Thr 205

CCT Pro

GGT Gly

CAG Gl n

CTA Leu

AAT Asn 210

CAA Gin

ACC Thr

TCC Ser

AGG Arg

TCC Ser 215

845 '

CCA

GTC

CAA

ATC

TCT

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ACA

CAC

GGA

884

Pro

Vai

Gin

lie

Ser

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr

His

Gly

220

22 5

CCT

GTG

AAT

GGA

ACT

CAT

GGG

CTC

TTT

GCT

GGA

ACC

TCA

923

Pro

Vai

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Leu

Phe

Al a

Gly

Thr

Ser

230

235

240

CTT

CAG

ACC

CTG

GAA

GCC

TCA

GAC

ATC

TCG

CCC

GGA

GCT

962

Leu

Gin

Thr

Leu

Gl u

Al a

Ser

Asp

He

Ser

Pro

Gly

Ala

245

250

TTC

AAC

AAA

GGC

TCC

CTG

GCA

TTC

AAC

CTC

CAG

GGT

GGA

1001

Phe

Asn

Lys

Gly

Ser

Leu

Al a

Phe

Asn

Leu

Gin

Gly

Gly

255

260

265

CTT

CCT

CCT

TCT

CCA

AGC

CTT

GCT

CCT

GAT

GGA

CAC

ACA

1040

Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

Asp

Gly

His

Thr

270

275

280

CCC

TTC

CCT

CCT

TCA

CCT

GCC

TTG

CCC

ACC

ACC

CAT

GGA

1079

Pro

Phe

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Thr

Thr

His

Gly

285

290

TCT

CCA

CCC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

TTT

CCT

GAC

CCT

TCC

1118

Ser

Pro

Pro

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Phe

Pro

Asp

Pro

Ser

295

300

305

ACC

ACC

ATG

CCT

AAC

TCT

ACC

GCC

CCT

CAT

CCA

GTC

ACA

1157

Thr

Thr

Met

Pro

Asn

Ser

Thr

Ala

Pro

His

Pro

Vai

Thr

310

315

ATG

TAC

CCT

CAT

CCC

AGG

AAT

TTG

TCT

CAG

GAA

ACA

TAGCGC 1199

Met

Tyr

Pro

Hi s

Pro

Arg

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Th r

320

330

331

G GGCACTGGCC CAGTGAGCGT CTGCAGCTTC TCTCGGGGAC 1240

AAGCTTCCCC AGGAAGGCTG AGAGGCAGCT GCATCTGCTC CAGATGTTCT 1290

GCTTTCACCT AAAAGGCCCT GGGGAAGGGA TACACAGCAC TGGAGATTGT 1340

AAAATTTTAG GAGCTATTTT TTTTTAACCT ATCAGCAATA TTCATCAGAG 1390

226

CAGCTAGCGA TCTTTGGTCT ATTTTCGGTA TAAATTTGAA AATCACTAAT 1440

TCT 1443 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:13:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 352 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:13:

Met -21

Glu -20

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu -15

Leu

Al a

Ala

Met

Leu -10

Leu

Ala

Val

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser 1

Pro

Val

Ala

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Leu

Leu

His

Ser

10

15

20

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Asp

Val

Asp

Pro

Leu

Ser

lie

Pro

Val

2 5

3 0

3 5

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

4 5

50

Thr

Glu

G In

Se i?

Lys

A 1 a

Gin

Asp

Tie

Leu

G1 y

Ala

V a 1

Sc r

Leu

55

60

65

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

70

75

80

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

85

90

95

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Gly

Leu

Leu

G1 y

Thr

Gin

Gly

Arg

Thr

100

105

110

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser

Leu

Gin

Gin

115

120

125

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Val

Glu

Gly

Pro

130

135

140

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

145

150

155

227

Ser 160

Thr

Ser

G1 n

Leu

I.Au 1 65

Thr

Leu

Asn

Lys

Phe 170

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Vai

Thr

Ala

Arg

Thr

Ala

175

180

185

Gly

Pro

Gly

Leu

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Phe

Arg

Vai

Lys

lie

190

195

200

Thr

Pro

G.1 y

Gin

Leu

Asn

GJ n

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro

Vai

G1 n

T1 e

205

210

2 ] 5

Ser

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr

His

Gly

Pro

Vai

Asn

Gly

Thr

His

220

225

230

Gly

Leu

Phe

Ala

Gly

Thr

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Glu

Ala

Ser

Asp

235

240

245

He

Ser

Pro

Gly

A.I a

Phe

Asn

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala

Phe

Asn

Leu

250

255

260

Gin

Gly

G1 y

Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

Ser

Leu

ΑΊ a

Pro

Asp

G1 y

His

265

270

275

Thr

Pro

Phe

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Thr

Thr

His

Gly

Ser

280

285

290

Pro

Pro

G1 n

Leu

Η ί s

Pro

T.eii

Phe

Pro

Asp

Pro

Ser

Thr

Thr

Mo p

2 95

3 0 0

3 05

Pro

Asn

Ser

Thr

Ala

Pro

His

Pro

Vai

Thr

Met

Tyr

Pro

His

Pro

310

315

32 0

Arg

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Thr

325 330 331 (2)ИНфОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:14:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 1536 базови двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна(xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:14:

GAGTCCTTGG СССАССТСТС TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50

228

AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCEGGAA AGATTCAGGG

GAGAGGCCCC

100

ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGA

ATG GAG 143

Met Gin

-21 -20

CTG Leu

ACT Thr

GAT Asp

TTG Leu

CTC Leu -15

CTG Leu

GCG Ala

GCC Ala

ATG Met

CTT Leu -1 0

CTT Leu

GCA Ala

GTG Vai

182

GCA

AGA

CTA

ACT

CTG

TCC

AGC

CCC

GTA

GCT

CCT

GCC

TGT

221

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Vai

Ala

Pro

Ala

Cys

-5

1

5

GAC

CCC

AGA

CTC

CTA

AAT

FEA

CTG

CTG

CGT

GAC

TCC

CAC

260

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

10

15

20

CTC

CTT

CAC

AGC

CGA

CTG

AGT

CAG

TGT

CCC

GAC

GTC

GAC

299

Leu

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Asp

Vai

Asp

25

30

CCT

TTG

TCT

ATC

CCT

GTT

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

338

Pro

Leu

Ser

lie

Pro

Vai

Leu

L e u

Pro

Al a

Vai

Asp

Phe

35

10

4 b

AGC

CTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ACG

GaA

CAG

AGC

AAG

377

Ser

Leu

Gly

G1 u

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

G1 u

Gin

Ser

Lys

50

55

GCA

CAG

GAC

ATT

CTA

GGG

GCA

GTG

TCC

CTT

CTA

CTG

GAG

416

Ala

Gin

Asp

lie

Leu

Gly

Ala

Vai

Ser

Leu

Leu

Leu

G1U

60

65

70

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGA

GGA

CAG

TTG

GAA

CCC

TCC

TGC

455

Gly

Vai

Met:

Ala

Ala

Arg

Gly

G1 n

Leu

G1 u

Pro

Ser

Cys

75

80

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGA

CAG

CTT

TCT

GGG

CAG

GTT

CGC

494

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

GLn

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

90

95

CTC

CTC

TTG

GGG

GCC

CTG

CAG

rrr bOO

CTC

CTA

GGA

ACC

CAG

533

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

100

105

110

CTT

CCT

CTA

CAG

GGC

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAC

CCC

572

Leu

Pro

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

115

120

223

AAT Asn 125

GCC Lal

CTC Leu

TTC Phe

TTG Leu

AGC Ser 130

TTG Leu

CAA Gin

CAA G1 n

CTG Leu

CTT Leu 135

CGG Arg

GGA Gly

611

AAG

GTG

CGC

TTC

CTG

CTT

CTG

GTA

GAA

GGT

CCC

ACC

CTC

650

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Val

Glu

XMy

Pro

Thr

Leu

140

145

150

TGT

GTC

AGA

CGG

ACC

CTG

CCA

ACC

ACA

GCT

GTG

CCA

AGC

689

Cys

Val

Arg

Arg

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

155

160

AGT

ACT

TCT

CAA

CTC

CTC

ACA

CTA

AAC

AAG

TTC

CCA

AAC

728

Ser

Thr

Ser

G1 n

Leu

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys

Phe

Pro

Asn

165

170

175

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

TTG

GAG

ACG

AAC

TTC

AGT

GTC

ACA

767

A.rg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

G1 u

Thr

Asn

Phe

Ser

Val

Thr

180

185

GCC

AGA

ACT

GCT

GGC

CCT

GGA

CTT

CTG

AGC

AGG

CTT

CAG

806

Ala

Arg

Thr

Ala

Gly

Pro

Gly

Leu

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

190

195

200

GGA

TTC

AGA

GTC

AAG

ATT

ACT

CCT

GGT

CAG

CTA

AAT

CAA

845

Gly

Phe

Arg

Val

Lys

He

Thr

Pro

Gly

Gin

Leu

Asn

Gin

205

210

215

ACC

TCC

AGG

TCC

CCA

GTC

CAA

ATC

TCI'

GGA

TAC

CTG

AAC

8 8 4

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro

Val

G1 n

Il e

Ser

Gly

Tyr

Leu

Asn

220

225

AGG

ACA

CAC

GGA

CCT

GTG

AAT

GGA

ACT

CAT

GGG

CTC

TTT

923

Arg

Thr

His

Gly

Pro

Val

Asn

Gly

Thr

Hi s

Gly

Leu

Phe

230

325

240

GCT

GGA

ACC

TCA

CTT

CAG

ACC

CTG

GAA

GCC

TCA

GAC

ATC

962

Ala

GLy

Thr

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

G1 u

Ala

Ser

Asp

lie

245

250

TCG

CCC

GGA

GCT

TTC

AAC

AAA

GGC

TCC

CTG

GCA

TTC

AAC

1001

Ser

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala

Phe

Asn

255

-

260

265

CTC

CAG

GGT

GGA

CTT

CCT

CCT

TCT

CCA

AGC

CTT

GCT

CCT

1040

Leu

Gin

G.1 y

Gly

Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

270

275

280

230

GAT Asp

GGA Gly

CAC His

ACA Thr

CCC Pro 285

TTC Phe

CCT Pro

CCT Pro

TCA Ser

CCT Pro 290

GCC Ala

TTG Leu

CCC Pro

1079

ACC

ACC

CAT

GGA

TCT

CCA

CCC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

TTT

1118

Thr

Thr

Hi s

Gly

Ser

Pro

Pro

Gl n

Leu

Hi s

Pro

Leu

Phe

295

300

305

CCT

GAC

CCT

TCC

ACC

ACC

ATG

CCT

AAC

TCT

ACC

GCC

CCT

1157

Pro

Asp

Pro

Ser

Thr

Thr

Met

Pro

Asn

Ser

Thr

Ala

Pro

310

315

CAT

CCA

GTC

ACA

ATG

TAC

CCT

CAT

CCC

AGG

AAT

TTG

TCT

1199

His

Pro

Vai

Thr

Met

Tyr

Pro

His

Pro

Arg

Asn

Leu

Ser

320

325

330

CAG GAA АСА TAGCG CGGGCACTGG CCCAGTGAGC GTCTGCAGCT 1240

Gin Glu Thr

335

TCTCTCGGGG	ACAAGCTTCC	CCAGGAAGGC	TGAGAGGCAG	CTGCATCTGC	1290
TCCAGATGTT	ctgctttcac	ctaaaaggcc	CTGGGGAAGG	GATACACAGC	1340
ACTGGAGATT	GTAAAATTTT	AGGAGCTATT	TTTTTTTAAC	CTATCAGCAA	1390
TATTCATCAG	agcagctagc	GATCTTTC-GT	CTATTTTCGG	TATAAATTTG	1440
AAAATCACTA	AAAAAAAAAA	ΛΛΛΛΛΛΑΆΛΛ	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	1 4 00
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAaAa	AAAAAAAAAA	ΑΛΑΑΑΆ 1536

(2)ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:15:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 356 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:15:

Met -21

Glu -20

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu -15

Leu

Ala

Ala

Met

Leu -10

Leu

Ala

Vai

Ala

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser 1

Pro

Vai

Ala

Pro 5

Al a

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Leu

Leu

His

Ser

15 20

231

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Asp

Vai

Asp

Pro

Leu 35

Ser

He

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

4 5

50

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala

Gin

Asp

lie

Leu

Gly

Ala

Vai

Ser

Leu

55

60

65

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Al a

Ala

Arg

Gly

Gl n

Leu

Glu

Pro

Ser

70

7 5

80

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

85

90

95

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Leu

100

105

110

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

Gys

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Leu

Phe

Leu

115

120

125

Ser

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

130

135

140

Vai

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Cys

Vai

Arg

Arg

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr

145

150

155

Ά1 a

Va 1

Pro

Ser

Ser

Thr

So r

G1 !

Leu

i /‘11

Tli r

Lou

Asn

Lys

Pho

160

165

170

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

lSu

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Vai

Thr

175

1 8 0

1 85

Ala

Arg

Thr

Ala

Gly

Pro

Gly

Leu

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Phe

190

195

200

Arg

Vai

Lys

lie

Thr

Pro

Gly

Gin

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

205

210

215

Pro

Vai

Gin

lie

Ser

Glv

Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr

His

Gly

Pro

Vai

220

225

230

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Leu

Phe

Ala

Gly

Thr

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

2 35

2 4 n

2 4 5

Glu

Ala

Ser

Asp

He

Ser

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

Ser

Leu

250

255

260

232-

Ala 265

Phe

Asn

Leu

Gin

Gly 2'7 0

Gly

Leu

Pro

Pro

Ser 275

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

Asp

Gly

His

Thr

Pro

Phe

Pro

Pro

Ser

Pro

Al a

Leu

Pro

Thr

280

285

290

Thr

His

Gly

Ser

Pro

Pro

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Phe

Pro

Asp

Pro

295

300

305

Ser

Thr

Th?

Met

Pro

Asn

Se r

Thr

Al a

Pro

H i s

Pro

Val

Thr

Met

310

315

320

Tyr

Pro

His

Pro

Arg

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Thr

325 330 335 (2)ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:16:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 241 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:16:

Ser 1

Pro

Val

Ala

Pro 5

Ala

Cys

7> sp

Pro

Arg 10

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Lj Θ U

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Asp

Val

Asp

Pro

Leu

Ser

He

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gl y

Glu

Trp

L y s

Thr

Gin

TH i-

Gl u

Gin

Ser

T,ys

A J a

50

55

60

Gin

Asp

He

Leu

Gly

Ala

V a 1

5 O r·

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

65

70

75

Al a

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

110

115

120

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

1 2 5

1 30

J 35

Arg

Gly

Lys

Asp

Pho

Trp

11 e

Val

Gl y

Asp

Gl u

Leu

Gin

Cys

His

140

145

150

Ser

Gin

Asn

Cys

Trp

Pro

Trp

Thr

Ser

Glu

Gin

Ala

Ser

Gly

He

155

1 60

165

G1 n

Se?

G1 n

Asp

Ty r

Se ?

Trp

Ser

Ala

Lys

Ser

Asn

hen

GJ n

Va 1

170

175

180

231

Pro Ser

Pro Asn

Leu Trp 185

lie Pro

Glu Gin Asp 190

Thr

Arg

Thr Cys 195

Glu

Trp

Asn

Ser

Trp

Ala

Leu

cys

Trp

Asn

Leu

Thr

Ser

Asp

Pro

200

205

210

Gly

Ser

Leu

Arg

His

Leu

Ala

ATg

Ser

Phe

Gin

Gin

Arg

Leu

Pro

215

220

225

Gly

lie

Gin

Pro

Pro

Gly

Trp

Thr

Ser

Ser

Phe

Ser

Lys

Pro

Cys

230

235

240

Ser

241 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:17:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 335 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:17:

Ser 1

Pro Vai Ala

Pro Ala 5

Cys

Asp

Pro Arg 10

Leu Leu

Asn Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Leu

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Asp

Vai

Asp

Pro

Leu

Ser

He

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

He

Leu

Gly

Ala

Vai

Ser

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

65

70

75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80·

85

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

110

115

120

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

125

130

135

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Vai

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

140

145

150

Cys

Vai

Arg

Arg

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr

Ala

Vai

Pro

Ser

Ser

Thr

155

160

165

Ser Gin Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly

170 175 180

2М

Leu Leu

Glu Thr

Asn Phe Ser Vai Thr Ala Arg Thr

Ala Gly Pro 195

185

190

Gly

Leu

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Phe

Arg

Vai

Lys

lie

Thr

Pro

200

205

210

Gly

Gin

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro

Vai

Gin

He

Ser

Gly

215

220

225

Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr

His

Gly

Pro

Vai

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Leu

230

235

240

Phe

Ala

Gly

Thr

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Glu

Ala

Ser

Asp

lie

Ser

245

250

255

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala

Phe

Asn

Leu

Gin

Gly

260

265

270

Gly

Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

Asp

Gly

His

Thr

Pro

275

280

285

Phe

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Thr

Thr

His

Gly

Ser

Pro

Pro

290

295

300

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Phe

Pro

Asp

Pro

Ser

Thr

Thr

Met

Pro

Asn

305

310

315

Ser

?hr

Ala

Pro

His

Pro

Vai

Thr

Met

Tyr

Pro

His

Pro

Arg

Asn

320

325

330

Leu Ser Gin Glu Thr

335 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:18:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 332 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (Р) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:18:

Ser 1

Pro

Ala

Pro

Pro Ala 5

Cys

Asp

Pro Arg Leu 10

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Gly

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Asp

He

Asn

Pro

Leu

Ser

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

35

40

45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

Vai

Leu

Gly

Ala

Thr

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Ala

Vai

Met

65

70

75

Thr

Ala

Arg

Gly

Gin

Vai

Gly

Pro

Pro

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

ΐ 2385*

Val Gin Leu Ser Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu Leu Leu 100

Gly Ala

Leu

Gin 105

Asp

Leu

Leu

Gly

Met

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

110

115

120

His

Lys

Asp

Pro

Ser

Ala

He

Phe

Leu

Asn

Phe

Gin

Gin

Leu

Leu

125

130

135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Val

Val

Gly

Pro

Ser

Leu

140

145

150

Cys

Ala

Lys

Arg

Ala

Pro

Pro

Ala

He

Ala

Val

Pro

Ser

Ser

Thr

155

160

165

Ser

Pro

Phe

His

Thr

Leu

Asn

Lys

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

170

175

180

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

lie

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

185

190

195

Gly

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Gin

Ala

Phe

Arg

Ala

Lys

He

Pro

Gly

200

205

210

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

He

Pro

Gly

His

215

220

225

Gin

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Pro

Leu

Ser

Gly

He

His

Gly

Leu

Phe

230

235

240

Pro

Gly

Pro

Gin

Pro

Gly

Ala

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

He

Pro

Pro

245

250

255

Ala

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Tyr

Leu

Gin

Pro

Gly

260

265

270

Glu

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

His

Pro

Ser

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Leu

275

280

285

Phe

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Val

Gin

Leu

Gin

290

295

300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

He

Thr

Pro

Asn

Ser

Thr

Ser

305

310

315

Pro

Leu

Leu

Phe

Ala

Ala

His

Pro

His

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

320 325 330

Glu Glu

332 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:19:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 1026 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейн^ (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:19:

236'

AGC Ser 1

COG Pro

GCT Ala

CCT Pro

CCT Pro 5

GCC Ala

TGT Cys

GAC Asp

CCC Pro

CGA Arg 10

CTC Leu

CT A Leu

36

ATT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

CTT

CAC

GGC

AGA

75

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

Hi s

Vai

Leu

His

Giy

Arg

15

20

25

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAC

ATT

AAC

CCT

TTG

TCC

ACA

CCT

114

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Asp

Tie

Asn

Pro

Leu

Ser

Thr

Pro

30

35

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTC

ACC

TTG

GGA

GAA

TGG

153

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Thr

Leu

Gly

Gi u

Trp

40

45

50

AAA

ACC

CAG

ACG

GAG

CAG

ACA

AAG

GCA

CAG

GAT

GTC

CTG

192

Lys

Thr

Gin

Thr

Gi U

Gin

Thr

Lys

Aia

Gin

Asp

Vai

Leu

55

60

GGA

GCC

ACA

ACC

CTT

CTG

CTG

GAG

GCA

GTG

ATG

ACA

GCA

231

Gly

Ala

Thr

Thr

Leu

Leu

Leu

Gi u

Aia

Vai

Met

Thr

Aia

65

70

75

CGG

GGA

CAA

GTG

GGA

CCC

CCT

TGC

CTC

TCA

TCC

CTG

CTG

270

Arg

Gly

Gin

Vai

Giy

Pro

Pro

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

GTG

CAG

CTT

TCT

GGA

cag

GTT

CGG.

CTC

CTC

CTC

GGG

GCC

3 0 9

Vai

GJ n

Leu

Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Giy

Ala

95

100

CTG

CAG

GAC

CTC

CTT

GGA

ATG

Cr.G

CTT

CCT

CCA

CAG

GGA

348

Leu

Gin

Asp

Leu

Leu

Giy

Met

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

105

110

115

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AGT

GCC

ATC

TTC

CTG

387

Arg

Thr

Thr

Ala

Gys

Lvs

Asp

Pro

Ser

Aia

Lie

Phe

Leu

120

125

AAC

TTC

CAA

CAA

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

426

Asn

Phe

Gin

Gin

Leu

Leu

Arg

Giy

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

130

135

!40

CTC

CTT

GTA

GTG

GGG

CCC

TCC

CTC

TGT

GCC

AAG

AGG

GCC

4 65

Leu

Leu

Vai

V.-i /

Gly

Pro

S o i:

Lou

Cys

Ala

Cys

Ai g

Ala

145

150

155

237

CCA Pro

CCC Pro

GCC ATA

GCT Ala 160

GTC Vai

CCG Pro

AGC Ser

AGC ACC

TCT Ser

CCA Pro

TTC Phe

504

Ala

He

Ser

Thr 165

CAC

ACA

CTG

AAC

AAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACC

TCT

GGA

TTG

543

His

Thr

Leu

Asn

Lys

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

170

175

180

TTG

GAG

ACA

AAC

TCC

AGT

ATC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GGC

582

Leu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

He

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

185

190

TCT

GGA

TTT

CTC

AAG

AGG

CTG

CAG

GCA

TTC

AGA

GCC

AAG

621

Ser

Gly

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Gin

Ala

Phe

Arg

Ala

Lys

195

200

205

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTA

GAC

660

lie

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

210

215

220

CAA

ATC

CCT

GGA

CAC

CAG

AAT

GGG

ACA

CAC

GGA

CCC

TTG

699

Gin

He

Pro

Gly

His

Gin

Asn

Gly

Thr

Hi s

Gly

Pro

Leu

225

230

AGT

GGA

ATT

CAT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

CAA

CCC

GGG

738

Ser

Gly

He

His

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Gin

Pro

Gly

235

2.4 0

245

GCC

CTC

GGA

GCT

CCA

GAC

ATT

CCT

CCA

GCA

ACT

TCA

GGC

777

Ala

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

He

Pro

Pro

Ala

Thr

Ser

Gly

250

255

ATG

GGC

TCC

CGG

CCA

ACC

TAC

CTC

CAG

CCT

GGA

GAG

TCT

816

Met

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Tyr

Leu

Gin

Pro

Gly

Gl u

Ser

260

265

270

CCT

TCC

CCA

GCT

CAC

CCT

TCT

CCT

GGA

CGA

TAC

ACT

CTC

855

Pro

Ser

Pro

Ala

Hi s

Pro

Ser

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Leu

275

280

285

TTC

TCT

CCT

TCA

CCC

ACC

TCG

CCC

1 L.C

CCC

ACA

GTC

CAG

894

Phe

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Vai

Gin

290

295

-

CTC

CAG

CCT

CTG

CTT

CCT

GAC

CCC

TCT

GCG

ATC

ACA

CCC

933

Leu

Gin

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

He

Thr

Pro

300

305

310

238

AAC	TCT	ACC	AGT	CCT	CTT	CTA	TTT	GCA GCT CAC	CCT	CAT 972
Asn	Ser	Thr	Ser	Pro	Leu	Leu	Phe	Ala Ala His	Pro	His
			315					320
ТТС	CAG	AAC	CTG	TCT	CAG	GAA	GAG	TAAG GTGCTCAGAC	1010
Phe	G1 n	Asn	Leu	Ser	Gin	Glu	Glu
325					310		332

CCTGCCAACT TCAGCA 1026 (2)ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:20:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 1014 базови двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:20:

AGC Ser 1

CCG Pro

GCT Ala

CCT Pro

CCT Pro 5

GCC Ala

TGT Cys

GAC Asp

CCC Pro

CGA Arg 10

CTC Leu

CTA Leu

36

AAT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

CTT

CAC

GGC

AGA

75

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

Hi s

Vai

Leu

Hi s

Gly

Arg

15

20

25

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAC

ATT

AAC

CCT

TTG

TCC

ACA

CCT

114

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Asp

lie

Asn

Pro

Leu 35

Ser

Thr

Pro

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

0 ггк' b ι kj

GAC

TTC

ACC

TTG

GGA

GAA

TGG

153

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Thr

Leu

Gly

G1 u

Trp

40

45

90

AAA

ACC

CAG

ACG

GAG

CAG

ACA

AAG

GCA

CAG

GAT

GTC

CTG

192

Lys

Thr

Gin

Thr

G1 u

Gin

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Vai

Leu

55

60

GGA

GCC

ACA

ACC

CTT

CTG

CTG

GAG

GCA

GTG

ATG

ACA

GCA

231

Gly

Al a

Thr

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Ala

Vai

Met

Thr

Ala

65

A / O

-75

CGG

GGA

CAA

GTG

GGA

ccc

CCT

TGC

CTC

TCA

TCC

CTG

CTG

270

Arg

Gly

Gin

Vai

Gly

Pro

Pro

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

SO

85

90

233

GTG Vai

CAG Gin

CTT Leu

TCT Ser

GGA Gly 95

CAG Gin

GTT Vai

CGC Arg

CTC Leu

CTC Leu 100

CTC Leu

GGG Gly

GCC Ala

309

CTG

CAG

GAC

CTC

CTT

GGA

ATG

CAG

GGA

AGG

ACC

ACA

GCT

348

Leu

Gin

Asp

Leu

Leu

Gly

Met

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

105

110

115

CAC

AAG

GAT

CCC

AGT

GCC

ATC

TTC

CTG

AAC

TTC

CAA

CAA

387

His

Lys

Asp

Pro

Ser

Ala

lie

Phe

Leu

Asn

Phe

Gin

Gin

120

125

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

CTC

CTT

GT A

GTG

426

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Vai

Vai

130

135

140

GGG

CCC

TCC

CTC

TGT

GCC

AAG

AGG

GCC

CCA

CCC

GCC

ATA

465

Gly

Pro

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

Arg

Ala

Pro

Pro

Ala

He

145

150

155

GCT

GTC

CCG

AGC

AGC

ACC

TCT

CCA

TTC

CAC

ACA

CTG

AAC

504

Ala

Vai

Pro

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro

Phe

His

Thr

Leu

Asn

160

1 65

AAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACC

TCT

GGA

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

543

Lys

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

170

175

180

TCC

AGT

ATC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GGC

TCT

GGA

TTT

CTC

582

Ser

Ser

Il e

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Phe

Leu

185

190

AAG

AGG

CTG

CAG

GCA

TTC

AGA

GCC

AAG·

ATT

CCT

GGT

CTG

621

Lys

Arg

Leu

Gin

Ala

Phe

Arg

Ala

Lys

lie

Pro

Gly

Leu

195

200

i

205

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTA

GAC

CAA

jATC

CCT

GGA

660

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

lie

Pro

Gly

210

215

220

CAC

CAG

AAT

GGG

ACA

CAC

GGA

CCC

TTG

AGT

GGA

ATT

CAT

699

His

Gin

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Pro

Leu

Ser

Gly

lie

His

-

225

230

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

CAA

CCC

GGG

GCC

CTC

GGA

GCT

7 38

Gly

Leu

Pho

Pro

Gly

Pro

G1 n

Pro

G1 y

Al a

Lon

Ala

235

240

245

40

CCA Pro

GAC ATT

CCT Pro 250

CCA Pro

GCA ACT

TCA Ser

GGC Gly 255

ATG Met

GGC Glu

TCC Ser

CGG Arg

ΊΊΊ

Asp

He

Ala

Thr

CCA

ACC

TAC

CTC

CAG

CCT

GGA

GAG

TCT

CCT

TCC

CCA

GCT

816

Pro

Thr

Tyr

Leu

Gin

Pro

G7y

G1 u

Ser

Pro

Ser

Pro

Al a

260

2 65

270

CAC

CCT

TCT

CCT

GGA

CGA

TAC

ACT

CTC

TTC

TCT

CCT

TCA

855

His

Pro

Ser

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Leu

Phe

Ser

Pro

Ser

275

280

285

CCC

ACC

TCG

CCC

TCC

CCC

ACA

GTC

CAG

CTC

CAG

CCT

CTG

894

Pro

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Val

Gin

Leu

Gin

Pro

Leu

290

295

CTT

CCT

GAC

CCC

TCT

GCG

ATC

ACA

CCC

AAC

TCT

ACC

AGT

933

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

He

Thr

Pro

Asn

Ser

Thr

Ser

300

305

310

CCT

CTT

CTA

TTT

GCA

GCT

CAC

CCT

CAT

TTC

CAG

AAC

CTG

972

Pro

Leu

Leu

Phe

Ala

Ala

His

Pro

His

Phe

Gin

Asn

Leu

315

320

TCT CAG GTA GAG TAAGGT GCTCAGACCC TGCCATCTTC 1010

Ser Gin Glu Glu

325 328

AGCA 1014

22|1 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:21:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОЗАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 328 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:21:

Ser 1

Pro

Ala

Pro

Pro 5

Ala

cys

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Gly

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Asp

lie

Asn

Pro

Leu

Ser

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

35

40

45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

Vai

Leu

Gly

Ala

Thr

Thr

Leu

Lou

Leu

Glu

Ala

Vai

Met

65

70

75

Thr

Ala

Arg

Gly

Gin

Vai

Gly

Pro

Pro

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

80

85

90

Vai

Gin

Leu

Sex'

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Asp

Leu

Leu

Gly

Met

Gin

Gly

Thr

Thr

/via

His

Lys

Asp

Pro

110

115

120

Ser

Ala

He

Phe

Leu

Asn

Phe

Gin

Gin

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

125

130

135

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Vai

Vai

Gly

Pro

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

Arg

140

145

150

Ala

Pro

Pro

Ala

He

/via

Vai

Pro

Scr

Scr

Thr

Scr

Pro

Phe

His

155

160

165

. 242

Thr

Leu

Asn

Lys

Leu 170

Pro

Asn Arg

Thr

Ser 175

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr 180

Asn

Ser

Ser

lie

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Phe

Leu

Lys

185

190

195

Arg

Leu

Gin

Ala

Phe

Arg

Ala

Lys

He

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

200

205

210

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

He

Pro

Gly

His

Gin

Asn

Gly

Thr

215

220

225

His

Gly

Pro

Leu

Ser

Gly

He

His

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Gin

230

235

240

Pro

Gly

Ala

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

He

Pro

Pro

Ala

Thr

Ser

Gly

245

250

255

Met

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Tyr

Leu

Gin

Pro

Gly

Glu

Ser

Pro

Ser

260

265

270

Pro

Ala

His

Pro

Ser

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Leu

Phe

Ser

Pro

Ser

275

280

285

Pro

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Vai

Gin

Leu

Gin

Pro

Leu

Leu

Pro

290

295

300

Asp

Pro

Ser

Ala

He

Thr

Pro

Asn

Ser

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Phe

305

310

315

Ala

Ala

His

Pro

His

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Glu

320

325

328

₍(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:22:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 5141 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина ,(С) ВЕРИЖНОСТ: двойноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:22:

TTCGAGCTCG	CCCGACATTG	ATTATTGACT	AGAGTCGATC	GACAGCTGTG	50
GAATGTGTGT	CAGTTAGGGT	GTGGAAAGTC	CCCAGGCTCC	CCAGCAGGCA	100
GAAGTATGCA	AAGCATGCAT	CTCAATTAGT	CAGCAACCAG	GTGTGGAAAG	150
TCCCCAGGCT	CCCCAGCAGG	CAGAAGTATG	CAAAGCATGC	ATCTCAATTA	200
GTCAGCAACC	ATAGTCCCGC	CCCTAACTCC	GCCCATCCCG	CCCCTAACTC	250

CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG GCTGACTAAT ТТТТТТТАТТ 300

TATGCAGAGG	CCGAGGCCGC	CTCGGCCTCT	GAGCTATTCC	AGAAGTAGTG	350
AGGAGGCTTT	TTTGGAGGCC	TAGGCTTTTG	CAAAAAGCTA	GCTTATCCGG	400
CCGGGAACGG	TGCATTGGAA	CGCGGATTCC	CCGTGCCAAG	AGTGACGTAA	450
GTACCGCCTA	TAGAGCGATA	AGAGGATTTT	ATCCCCGCTG	CCATCATGGT	500
TCGACCATTG	AACTGCATCG	TCGCCGTGTC	CCAAAATATG	GGGATTGGCA	550
AGAACGGAGA	CCTACCCTGG	CCTCCGCTCA	GGAACGAGTT	CAAGTACTTC	600
CAAAGAATGA	CCACAACCTC	TTCAGTGGAA	GGTAAACAGA	ATCTGGTGAT	650
TATGGGTAGG	AAAACCTGGT	TCTCCATTCC	TGAGAAGAAT	CGACCTTTAA	700
AGGACAGAAT	TAATATAGTT	CTCAGTAGAG	AACTCAAAGA	ACCACCACGA	750
GGAGCTCATT	TTCTTGCCAA	AAGTTTGGAT	GATGCCTTAA	GACTTATTGA	800
ACAACCGGAA	TTGGCAAGTA	AAGTAGACAT	GGTTTGGATA	GTCGGAGGCA	850
GTTCTGTTTA	CCAGGAAGCC	ATGAATCAAC	CAGGCCACCT	TAGACTCTTT	900
GTGACAAGGA	TCATGCAGGA	ATTTGAAAGT	GACACGTTTT	TCCCAGAAAT	950
TGATTTGGGG	AAATATAAAC	CTCTCCCAGA	ATACCCAGGC	GTCCTCTCTG	1000
AGGTCCAGGA	GGAAAAAGGC	ATCAAGTATA	AGTTTGAAGT	CTACGAGAAG	1050
AAAGACTAAC	AGGAAGATGC	TTTCAAGTTC	TCTGCTCCCC	TCCTAAAGCT	1100
ATGCATTTTT	ATAAGACCAT	GGGACTTTTG	CTGGCTTTAG	ATCCCCTTGG	1150
CTTCGTTAGA	ACGCGGCTAC	AATTAATACA	TAACCTTATG	TATCATACAC	1200
ATACGATTTA	GGTGACACTA	TAGATAACAT	CCACTTTGCC	TTTCTCTCCA	1250

CAGGTGTCCA CTCCCAGGTC CAACTGCACC TCGGTTCTAA GCTTCTGCAG 1300

244

GTCGACTCTA	GAGGATCCCC	GGGGAATTCA	ATCGATGGCC	GCCATGGCCC	1350
AACTTGTTTA	TTGCAGCTTA	TAATGGTTAC	AAATAAAGCA	ATAGCATCAC	1400
AAATTTCACA	AATAAAGCAT	TTTTTTCACT	GCATTCTAGT	TGTGGTTTGT	1450
CCAAACTCAT	CAATGTATCT	TATCATGTCT	GGATCGATCG	GGAATTAATT	1500
CGGCGCAGCA	CCATGGCCTG	AAATAACCTC	TGAAAGAGGA	ACTTGGTTAG	1550
GTACCTTCTG	AGGCGGAAAG	AACCAGCTGT	GGAATGTGTG	TCAGTTAGGG	1600
TGTGGAAAGT	CCCCAGGCTC	CCCAGCAGGC	AGAAGTATGC	AAAGCATGCA	1650
TCTCAATTAG	TCAGCAACCA	GGTGTGGAAA	GTCCCCAGGC	TCCCCAGCAG	1700
GCAGAAGTAT	GCAAAGCATG	CATCTCAATT	AGTCAGCAAC	CATAGTCCCG	1750
CCCCTAACTC	CGCCCATCCC	GCCCCTAACT	CCGCCCAGTT	CCGCCCATTC	1800
TCCGCCCCAT	GGCTGACTAA	TTTTTTTTAT	TTATGCAGAG	GCCGAGGCCG	1850
CCTCGGCCTC	TGAGCTATTC	CAGAAGTAGT	GAGGAGGCTT	TTTTGGAGGC	1900
CTAGGCTTTT	GCAAAAAGCT	GTTACCTCGA	GCGGCCGCTT	AATTAAGGCG	1950
CGCCATTTAA	ATCCTGCAGG	TAACAGCTTG	GCACTGGCCG	TCGTTTTACA	2000
ACGTCGTGAC	TGGGAAAACC	CTGGCGTTAC	CCAACTTAAT	CGCCTTGCAG	2050
CACATCCCCC	CTTCGCCAGC	TGGCGTAATA	GCGAAGAGGC	CCGCACCGAT	2100
CGCCCTTCCC	AACAGTTGCG	TAGCCTGAAT	GGCGAATGGC	GCCTGATGCG	2150
gtattttctc	CTTACGCATC	TGTGCGGTAT	TTCACACCGC	ATACGTCAAA	2200
GCAACCATAG	TACGCGCCCT	GTAGCGGCGC	ATTAAGCGCG	GCGGGTGTGG	2250
TGGTTACGCG	CAGCGTGACC	GCTACACTTG	CCAGCGCCCT	AGCGCCCGCT	2300

CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG 2350 '

245

TCAAGCTCTA	AATCGGGGGC	TCCCTTTAGG	GTTCCGATTT	AGTGCTTTAC	2400
GGCACCTCGA	CCCCAAAAAA	CTTGATTTGG	GTGATGGTTC	ACGTAGTGGG	2450
CCATCGCCCT	GATAGACGGT	TTTTCGCCCT	TTGACGTTGG	AGTCCACGTT	2500
CTTTAATAGT	GGACTCTTGT	TCCAAACTGG	AACAACACTC	AACCCTATCT	2550
CGGGCTATTC	TTTTGATTTA	TAAGGGATTT	TGCCGATTTC	GGCCTATTGG	2600
TTAAAAAATG	AGCTGATTTA	ACAAAAATTT	AACGCGAATT	TTAACAAAAT	2650
ATTAACGTTT	ACAATTTTAT	GGTGCACTCT	CAGTACAATC	TGCTCTGATG	2700
CCGCATAGTT	AAGCCAACTC	CGCTATCGCT	ACGTGACTGG	GTCATGGCTG	2750
CGCCCCGACA	CCCGCCAACA	CCCGCTGACG	CGCCCTGACG	GGCTTGTCTG	2800
CTCCCGGCAT	CCGCTTACAG	ACAAGCTGTG	ACCGTCTCCG	GGAGCTGCAT	2850
GTGTCAGAGG	TTTTCACCGT	CATCACCGAA	ACGCGCGAGG	CAGTATTCTT	2900
GAAGACGAAA	GGGCCTCGTG	ATACGCCTAT	TTTTATAGGT	TAATGTCATG	2950
ATAATAATGG	TTTCTTAGAC	GTCAGGTGGC	ACTTTTCGGG	GAAATGTGCG	3000
CGGAACCCCT	atttgtttat	ТТТГСТАААТ	ACATTCAAAT	ATGTATCCGC	3050
TCATGAGACA	ATAACCCTGA	TAAATGCTTC	AATAATATTG	AAAAAGGAAG	3100
AGTATGAGTA	TTCAACATTT	CCGTGTCGCC	CTTATTCCCT	TTTTTGCGGC	3150
attttgcctt	CCTGTTTTTG	CTCACCCAGA	AACGCTGGTG	AAAGTAAAAG	3200
ATGCTGAAGA	TCAGTTGGGT	GCACGAGTGG	GTTACATCGA	ACTGGATCTC	3250
AACAGCGGTA	AGATCCTTGA	GAGTTTTCGC	CCCGAAGAAC	GTTTTCCAAT	3300

GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGATG 3350

2Л6

ACGCCGGGCA	AGAGCAACTC	GGTCGCCGCA	TACACTATTC	TCAGAATGAC	3400
TTGGTTGAGT	ACTCACCAGT	CACAGAAAAG	CATCTTACGG	ATGGCATGAC	3450
AGTAAGAGAA	TTATGCAGTG	CTGCCATAAC	CATGAGTGAT	AACACTGCGG	3500
CCAACTTACT	TCTGACAACG	ATCGGAGGAC	CGAAGGAGCT	AACCGCTTTT	3550
TTGCACAACA	TGGGGGATCA	TGTAACTCGC	CTTGATCGTT	GGGAACCGGA	3600
GCTGAATGAA	GCCATACCAA	ACGACGAGCG	TGACACCACG	ATGCCAGCAG	3650
CAATGGCAAC	AACGTTGCC-C	AAACTATTAA	CTGGCGAACT	ACTTACTCTA	3700
GCTTCCCGGC	AACAATTAAT	AGACTGGATG	GAGGCGGATA	AAGTTGCAGG	3750
ACCACTTCTG	CGCTCGGCCC	TTCCGGCTGG	CTGGTTTATT	GCTGATAAAT	3800
CTGGAGCCGG	TGAGCGTGGG	TCTCGCGGTA	TCATTGCAGC	ACTGGGGCCA	3850
GATGGTAAGC	CCTCCCGTAT	CGTAGTTATC	TACACGACGG	GGAGTCAGGC	3900
AACTATGGAT	GAACGAAATA	GACAGATCGC	TGAGATAGGT	GCCTCACTGA	3950
TTAAGCATTG	GTAACTGTCA	GACCAAGTTT	ACTCATATAT	ACTTTAGATT	4000
GATTTAAAAC	TTCATTTTTA	ATTTAAAAGG	ATCTAGGTGA	AGATCCTTTT	4050
TGATAATCTC	ATGACCAAAA	TCCCTTAACG	TGAGTTTTCG	TTCCACTGAG	4100
CGTCAGACCC	CGTAGAAAAG	ATCAAAGGAT	CTTCTTGAGA	TCCTTTTTTT	4150
CTGCGCGTAA	TCTGCTGCTT	GCAAACAAAA	AAACCACCGC	TACCAGCGGT	4200
GGTTTGTTTG	CCGGATCAAG	AGCTACCAAC	TCTTTTTCCG	AAGGTAACTG	4250
GCTTCAGCAG	AGCGCAGATA	CCAAATACTG	TCCTTCTAGT	GTAGCCGTAG	4300
TTAGGCCACC	ACTTCAAGAA	CTCTGTAGCA	CCGCCTACAT	ACCTCGCTCT	4350

GCTAATCCTG	TTACCAGTGG	CTGCTGCCAG	TGGCGATAAG	TCGTGTCTTA	4400
CCGGGTTGGA	CTCAAGACGA	TAGTTACCGG	ATAAGGCGCA	GCGGTCGGGC	4450
TGAACGGGGG	GTTCGTGCAC	ACAGCCCAGC	TTGGAGCGAA	CGACCTACAC	4500
CGAACTGAGA	TACCTACAGC	GTGAGCATTG	AGAAAGCGCC	ACGCTTCCCG	4550
AAGGGAGAAA	GGCGGACAGG	TATCCGGTAA	GCGGCAGGGT	CGGAACAGGA	4600
GAGCGCACGA	GGGAGCTTCC	AGGGGGAAAC	GCCTGGTATC	TTTATAGTCC	4650
TGTCGGGTTT	CGCCACCTCT	GACTTGAGCG	TCGATTTTTG	TGATGCTCGT	4700
CAGGGGGGCG	GAGCCTATGG	AAAAACGCCA	GCAACGCGGC	CTTTTTACGG	4750
TTCCTGGCCT	TTTGCTGGCC	TTTTGCTCAC	ATGTTCTTTC	CTGCGTTATC	4800
CCCTGATTCT	GTGGATAACC	GTATTACCGC	CTTTGAGTGA	GCTGATACCG	4850
CTCGCCGCAG	CCGAACGACC	GAGCGCAGCG	AGTCAGTGAG	CGAGGAAGCG	4900
GAAGAGCGCC	CAATACGCAA	ACCGCCTCTC	CCCGCGCGTT	GGCCGATTCA	4950
TTAATCCAGC	TGGCACGACA	GGTTTCCCGA	CTGGAAAGCG	GGCAGTGAGC	5000
GCAACGCAAT	TAATGTGAGT	ТАССТСАСТС	ATTAGGCACC	CCAGGCTTTA	5050
CACTTTATGC	TTCCGGCTCG	TATGTTGTGT	GGAATTGTGA	GCGGATAACA	5100
АТТТСАСАСА	GGAAACAGCT	ATGACCATGA	TTACGAATTA	А 5141

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:23:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:23:

ATGTCNCCNG CNCCNCCNGC N 21

2*8 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:24:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:24:

ATGTCTCCAG CGCCGCCAGC G 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:25:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:25:

ATGTCGCCTG CTCCACCTGC Т 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:26:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:26:

ATGTCGCCAG CGCCACCAGC С 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:27:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:27:

ATGTCCCCAG CCCCACCCGC А 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:28:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(А) ДЪЛЖИНА: 21 бази

2Λ?9· (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:28:

ATGTCGCCAG CGCCGCCAGC G 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:29:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:29:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 10 15

Leu Arg Asp Asp His Vai Leu His Gly Arg

25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:30:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 26 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:30:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 10 15

Leu Arg Asp Asp Xaa Vai Leu His Gly Arg Leu

25 26 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:31:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ ID N0:31:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 10 15

Leu Arg Asp Asp His Vai Leu His Gly Arg

25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:32:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

2SD (A) ДЪЛЖИНА: 14 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:32:

Хаа Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys 15 10 14 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:33:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 9 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:33:

Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg

5 9 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:34:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 45 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:34:

GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 45 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:35:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:35:

CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:36:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна

251 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:36:

NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:37:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 69 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:37:

CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC СТАААТАААС TGCCTCGTGA 50

TGACCACGTT CAGCACGGC 69 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:38:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 69 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:38:

GCCGTGGCTG AACGTGGTCA TCACGAGGCA GTTTATTTGA GAGTCGGGGG 50

TCACAGGCTG GCGGCGCTGG 69 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:39:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 69 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:39:

CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC СТАААТАААС TGCTTCGTGA 50

CGACCACGTC CATCACGGC 69 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:40:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 69 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линенйна

252 (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:40: . ..

GCCGTGATGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCGGGGGT 50

CACATGCCGG AGGTGCTGG 69 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:41:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 69 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:41:

CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC СТАААТАААС TGCTTCGTGA 50

CGATCATGTC TATCACGGT 69 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:42:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 69 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:42:

ACCGTGATAG ACATGATCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCGGGGGT 50

CACATGCCGG CGGTGCTGG 69 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:43:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 37 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:43:

GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:44:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 22 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна

2Sb (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:44:

CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:45:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:45:

TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:46:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:46:

GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:47:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 31 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:47:

ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:48:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 36 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:48:

GCTAGCTCTAGACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA 36 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:49:

254 (i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:49:

CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:50:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:50:

GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:51:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 27 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:51:

CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:52:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 27 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:52:

AATCCAGAAG ТССТТТССТС GGAGCAG 27 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:53:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 28 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна

ЯБ5 (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:53:

CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC ССАСССАС 28 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:54:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 28 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:54:

GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:55:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 35 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:55:

GACTCGAGGA TCCATCGATT ТП IТ Г Π 11 ТТТТТ 35 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:56:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 17 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:56:

GACTCGAGGA TCCATCG 17 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:57:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 32 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:57:

GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32

2£έ>

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:58:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:58:

CGAAATTAAC ССТСАСТААА G 21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:59:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 103 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:59:

TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50

ATGGCTGATC CAAATCGATTCCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100

GCT 103 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:60:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 103 бази (B) ТИП: нуклдинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:60:

AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50

CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100

GCA 103 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:61:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 18 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:61:

2^7

TCTCGCTACC GTTTACAG 18 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:62:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:62:

CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:63:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 18 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:63:

GGGCCATGAC ACTGTCAA 18 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:64:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 40 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:64:

GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:65:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 32 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:65:

ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:66:

(A) ДЪЛЖИНА: 35 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:66:

TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:67:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 33 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:67:

AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:68:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 36 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:68:

AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:69:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 62 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:69;

CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50

AACTGCTTCG TG 62 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:70:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 61 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна

259 (D) ТОПОЛОГИЯ: линенйна ' · ...

(xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:70:

AGTCACGAAG CAGTTTACTG AGGACTCGGA GGTCACAAGC AGGAGGAGCC 50

GGGCTGGCAT А 61 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:71:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 37 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:71:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ТТСТТАА 37 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:72:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 37 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:72:

CGCGTTAAGA AGAAATGCGA ТАТТСТТТТТ CATAATT 37 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:73:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 69 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:73:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50

CACATCGAAG GTCGTAGCC 69 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:74:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 62 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна

2&О (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:74:

ATCGACCTTC GATGTGATGG TGATGGTGAT GGTGATGAAA TGCGATATTC 50

ТТТТТСАТАА ТТ 62 .

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:75:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 69 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:75:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC АТСАССАТСА ССАТСАССАТ 50

CACATCGAAC CACGTAGCC 69 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:76:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 62 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:76:

TACGTGGTTC GATGTGATGG TGATGGTGAT GGTGATGAAA TGCGATATTC 50

ТТТТТСАТАА TT 62 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:77:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 19 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:77:

ТССАСССТСТ GCGTCAGGT 19 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:78:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 18 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна

£.

(D) ТОПОЛОГИЯ: линейна - (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:78:

AGCTACCTGA CGCAGAGG 18 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:79:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 62 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:79:

GCAGCAGTTC TAGAATTATG TCNCCNGCNC CNCCNGCNTG TGACCTCCGA 50

GTTCTCAGTA АА 62 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:80:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 49 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:80:

GAAGGATACG GGAGTCACGA AGCAGTTTAC TGAGAACTCG GAGGTCACA 49 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:81:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 45 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:81:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 4 5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:82:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 38 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:82:

TACGACCTTC GATAAATGCG АТАТТСТТТТ ТСАТААТТ 38

2С2.

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:83:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 45 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:83:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:84:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 38 бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:84:

TACGTTTAAG AAGAAATGCG АТАТТСТТТТ ТСАТААТТ 38 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:85:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 168 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:85:

Met 1

Lys

Lys

Asn

He

Ala

Phe

neu

Leu

Asn 10

Ala

Tyr

Ala

Ser

Pro 15

Ala

Pro

Pro

Al a

Cys

Asp

Leu

A r c

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

20

25

30

Asp

Ser

H i s

Vai

Leu

His

Ser

L. r π

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Vai

35

40

45

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

50

55

60

Leu

Gly

Glu

Trp

I., y s

Thr

G1 n

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

65

70

75

lie

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

80

85

90

Ala

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

95

100

105

Z63

Leu

Ser

Gly

G1 n

Vai no

Arg

Leu

.Leu

Leu

Gly 115

Al. a

Leu

Gin

Ser

Leu 120

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

125

130

135

Asp

Pro

Asn

Ala

lie

Phe

lieu

Ser

Phe

G.l n

His

Leu

Leu

Arg

G1 y

140

145

150

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Vai

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Vai

155 160 165

Arg Arg Ala

168 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:86:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 174 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:86:

Met Ί 1

Lys

Lys

Asn

lie 5

Ala

P’ne

'-·ί ~ Q

His

His 10

His

His

His

His

His 15

Tie

Glu

G1 y

Arq

So ΐ-

Pro

A1 a

, . V /->

Pro

A1 a

Cys

Asp

T.en

A r q

Va 1

ΐυ

Ό I.

3 0

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

35

40

45

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Vai

His

Pre

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

50

55

60

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu

-- --

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

65

70

75

Glu

Thr

Lvs

Ala

Gin

Asp

1 le

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

Leu

80

85

90

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Ala

Arg

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

95

100

-

105

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

S Θ 27

Gly

G1 n

Va 1

Arg

Leu

Leu

1<еи

110

115

120

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

r·' ' , ,

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

125

130

135

264

Arg

Thr

Th ι-

Ala

His 140

1/ys Asp.

' Pro

Asn

Ala 145

12 e

Phe

Leu

Ser

Phe 150

Gin

His

Ηβυ

Leu

Arg

Gly Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Vai

Gly

155

160

165

G 1 y

S e r

Tin-

1 ,eu

Gy:-;

V,'i'; Arq

Arg

1\ i a

170

174

1&5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:87:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 174 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:87:

Met 1

Lys

Lys

Asn

lie 5

/·. 1 a

Phe His

Hi s

H i s 10

H i s

Hi s

H i s

H i s

Hi s 15

Не

Glu

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

20

25

30

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

35

40

45

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

y- Ί

His Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

Leu

50

55

60

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

65

7 0

75

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

2' c L '7

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu

Leu

80

85

90

Glu

Gly

Va 1

Met

zh ! a

Λ t a

Λ I' J l : 1 У

Glu

Leu

Gly

pro

Th r

c:ys

leuj

95

100

105

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

a:---

Leu Ser

Gly

Gin

Vai

Arg

Leu

Leu

Leu

110

1 1 5

1 20

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

T r- · J_|— —

Leu Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

125

130

135

Arg

Thr

Thr

AH a

His

Lys

Asc Pro

Asn

Ala

lie

Phe

Leu

Ser

Phe

14 0

145

150

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys Vai

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Vai

Gly

155

160

165

Gly

Ser

Thr

Ten

Cys

Va

Arc Arg

Al a

.1 7 0

174

(2) ИНФОРМАЦИЯ 3ASEQ ID N0:88:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 7 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина

Z-ΕΜ (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:88:

Thr Thr Ala His Lys Asp Pro h 7 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:89:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:89:

His Vai Leu His

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:90:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:90:

Ser Arg Leu Arg

4

2^7 14 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:91:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:91:

Ser His Vai Leu

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:92:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:92:

His Ser Arg Leu

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:93:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:93:

Ala Vai Asp Phe

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:94:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:94:

Ser Leu Gly Glu

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:95:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

Ztg (A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:95:

Ala Val Thr Leu

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:96:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:96:

Leu Leu Glu Gly

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:97:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:97:

Leu Ser Ser Leu

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:98:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:98:

Leu Gly Gin Leu

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:99:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 5 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:99;

Cys Xaa Leu Ser Ser

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:100:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:100:

Leu Leu Gly Gin

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:101:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:101:

Ser Ser Leu Leu

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:102:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:102:

Gly Gin Leu Ser

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:103:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:103:

Cys Leu Ser Ser

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:104:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

23D (A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:104:

Leu Gin Ser Leu

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:105:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:105:

Leu Gly Thr Gin

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:106:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:106:

Ala Leu Gin Ser

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:107:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:107:

Leu Leu Gly Thr

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:108:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:108:

234

Asn Ala lie Phe

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:109:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:109;

Leu Ser Phe Gin

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:110:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:110:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Vai Leu Ser Lys Leu 15 10 15

Leu Arg Asp Ser His Vai Leu

22 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:111 :

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:111:

His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Vai His Pro Leu Pro Thr 15 10 15

Pro Vai Leu Leu Pro Ala Vai Asp Phe

24 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:112:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 23 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:112:

272

Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin 15 10 15

Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu

23 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:113:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:113:

Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr 1 5 10 15

Cys Leu Ser Ser Leu Leu

21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:114:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:114:

Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin

10 15

Ser (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:115:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:115:

Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His 15 10 15

Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe

22 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:116:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна

273 (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:116:

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg GLy Lys Vai Arg Phe Leu Met 15 10 15

Leu Vai Gly Gly Ser Thr Leu Cys Vai Arg

25 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:117:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:117:

Met Pro Pro Ala

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:118:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 5 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:118:

Met Ala Pro Pro Ala

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:119:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 6 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:119:

Met Pro Ala Pro Pro Ala

5 6 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:120:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 7 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:120:

Met Ser Pro Ala Pro Pro Ala

27^· (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:121:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:121: Ala Pro Pro Ala

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:122:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 5 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:122: Pro Ala Pro Pro Ala

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:123:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 6 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:123:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala

5 6 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:124:

(4) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 4 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:124:

Vai Arg Arg Ala

4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:125:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 5 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:125:

Vai Arg Arg Ala Pro

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:126:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 6 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:126;

Vai Arg Arg Ala Pro Pro

5 6 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:127:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 7 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:127:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr

5 7 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:128:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 8 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:128:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr

5 8 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:129:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 9 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:129:

2Т6

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala

5 9 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:130:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 10 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:130:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai

5 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:131:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 11 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:131:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro

5 10 11 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:132:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 12 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:132:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser

5 10 12 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:133:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 13 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:133:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg

5 10 13 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:134:

2Ф7 (i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:134:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 15 10 14 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:135:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 15 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:135:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser

10 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:136:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:136:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser

5 10 15

Leu (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:137:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 17 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:137:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:138:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

2пе (A) ДЪЛЖИНА: 18 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:138:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:139:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 19 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:139:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:140:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:140:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser

5 10 15

Leu Val Leu Thr Leu (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:141:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:141:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn

21 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:142:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:142:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu

22 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:143:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 23 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:143:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu

23 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:144:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 24 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:144:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro

24

Claims (36)

1. Тромбопоетин-Мр1-лиганден полипептид, получен по метод, който включва:

i) скриниране на човешка геномна библиотека с олигонуклеотид на основата на геномната последователност, описана във фиг.9, за да се изолира геномна ДНК, която включва последователността, кодираща mpl-лигандния екзон, описан във фиг. 9 заедно с останалите екзони на гена;

ii) включване на ДНК в експресионен вектор;

iii) трансфекция на клетка от бозайник с вектора и експресия на гена; и iv) изолиране на mpl-лигандния полипептид от клетъчнокултуралната среда.

2. Тромбопоетин-Мр1-лиганден полипептид, получен по метод, който включва:

i) изолиране на геномна библиотека на геномна ДНК, която хибридизира при ниска строгост с ДНК-последователността

5’GCCCTGAAGGACGTGGTCGTCACGAAGCAGTTTATTTAGGAGTCG3’ и която съдържа екзоните, кодиращи mpl-лиганден полипептид;

ii) включване на ДНК в експресионен вектор;

iii) трансфекция на клетка от бозайник с вектора и експресия на гена; и iv) изолиране на mpl-лигандния полипептид от клетъчнокултуралната среда.

3. Тромбопоетин-Мр1-лиганден полипептид, получен по метод, който включва:

i) идентифициране на подходящ клетъчен източник на РНК за човешкия mplлиганд и приготвяне на една или повече кДНК-библиотеки от тази РНК;

ii) скриниране на библиотеката или библиотеките чрез хибридизация с белязан олигонуклеотид на основата на кодиращата последователност, показана на фиг.9, за да се идентифицира и изолира клон, съдържащ кодиращата последователност на mpl-лиганда;

iii) включване на кодиращата ДНК в експресионен вектор, подходящ за експресия в клетки от бозайници;

iv) трансфекция на клетка от бозайник с вектора и експресия на кДНК;

ν) изолиране на mpl-лигандния полипептид от клетъчнокултуралната среда.

4. Тромбопоетин-Мр1-лиганден полипептид, получен по метод, който включва:

281

i) приготвяне на кДНК-библиотека или библиотеки от тРНК, екстрахирана от човешки бъбречни клетки;

ii) скриниране на библиотеката или библиотеките чрез хибридизация с белязан олигонуклеотид на основата на кодиращата последователност, показана на фиг. 9, за да се идентифицира и изолира клон, съдържащ кодиращата последователност на mpl-лиганда;

iii) включване на кодиращата ДНК в експресионен вектор, подходящ за експресия в клетки от бозайници;

iv) трансфекция на клетка от бозайник с вектора и експресия на кДНК; и

v) изолиране на mpl-лигандния полипептид от клетъчнокултуралната среда.

5. Изолиран, по същество хомогенен mpl-лиганд, характеризиращ се с това, че:

a) лигандът стимулира включването на белязани нуклеотиди ( Н-тимидин) в ДНК на IL-З-зависима-Ва/РЗ-клетки, трансфектирани с човешки mplP;

b) лигандът стимулира включването на Sb циркулиращи тромбоцити в “рикошетен” тромбоцитен тест;

c) лигандът е стабилен при pH 2,5,SDS-0,l% и 2М урея;

d) лигандът е гликопротеин;

e) аминотерминалната последователност на полипептида е SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR или SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL

6. Тромбопоетин-Мр1-лиганд, получен чрез пречистване от апластична плазма чрез хроматография на хидрофобните взаимодействия, хроматография с имобилизирано багрило и mpl-афинитетна хроматография и имащ видимо молекулно тегло в областта от 18-22 kDa, 28 kDa или 30 kDa, което се установява чрез SDSPAGE, проведена при редуциращи условия.

7. Тромбопоетин-изолиран mpl-лиганден полипептид, кодиран от нуклеинова киселина, имаща последователност, която хибридизира при умерено строги условия с нуклеинова киселина, имаща последователност от нуклеотид 119 в посока напред на фиг.9 (ID N0:4 или ID N0:5).

8. Изолиран mpl-лиганд съгласно всяка една от предхождащите претенции, който е биологично активен.

9. Mpl-лиганден полипептид, който има най-малко 70% идентичност в последователността с полипептида на всяка една от претенции 1 до 7.

10. Mpl-лиганден полипептид, който е алел или вариант на полипептида на всяка една от претенции 1 до 7, който запазва биологична активност на mpl-лиганда.

11. Mpl-лиганден полипептид съгласно всяка една от предхождащите претенции, който се получава от нечовешки вид.

12. Mpl-лиганден полипептид съгласно всяка една от предхождащите претенции, който се получава от човешки вид.

13. Mpl-лиганден полипептид съгласно всяка една от предхождащите претенции, който е негликозилиран.

14. Сливане, включващо mpl-лиганда на всяка една от предхождащите претенции, слят с хетероложен полипептид.

15. Изолирана молекула нуклеинова киселина, кодираща полипептид съгласно всяка една от предходните претенции.

16. Изолирана молекула нуклеинова киселина, избрана от:

a) кДНК-клон, който се получава от етап (iii) на претенция 3 или от етап (ii) на претенция 4;

b) ДНК-последователност, която е в състояние да хибридизира при строги условия с клон от а); и

c) генетичен вариант на всяка от ДНК-последователностите на а) и Ь), който кодира полипептид, притежаващ биологични свойства на природно срещащ се mplлиганден полипептид.

17. Изолирана нуклеинова киселина, имаща последователност, която хибридизира при умерено строги условия с нуклеинова киселина, имаща последователност от нуклеотид 119 по посока напред на фиг.9 (ID N0:4 или ID N0:5) и която кодира mpl-лиганд.

18. Геномна ДНК или кДНК, съответстваща поне на част от mpl-лигандния ген и която хибридизира при умерено до силно строги условия с природно срещаща се молекула нуклеинова киселина, имаща последователност, кодираща mpl-лиганд, където mpl-лигандът е, както се дефинира във всяка една от претенции 1 до 7.

19. Нуклеинова киселина на всяка една от претенции 15 до 18, оперативно свързана с промотор.

20. Експресионен вектор, включващ нуклеиновата киселина на всяка една от претенциите 15 до 18, оперативно свързана с контролни последователности, които се разпознават от гостоприемната клетка.

21. Клетка-гостоприемник, трансформирана с нуклеиновата киселина на вся-

2-63 ка една от претенции 15 до 20, така че да е в състояние да експресира нуклеиновата киселина за получаване на mpl-лиганден полипептид.

22. Метод, характеризиращ се с това, че включва експресията на рекомбинантна нуклеинова киселина на всяка една от претенции 15 до 20 в подходяща клеткагостоприемник за получаване на mpl-лиганден полипептид.

23. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че mpl-лигандният полипептид се получава от клетката-гостоприемник или от средата, в която се култивират гостоприемните клетки.

24. Метод, характеризиращ се с това, че включва експресията в клетка на ендогенен mpl-лиганден ген под контрола на промотор/инхансърен елемент, супресор или екзогенен транскрипционен модулаторен елемент, който е включен в генома на клетката в близост и ориентация, достатъчни, за да въздействат върху транскрипцията на ДНК, кодираща mpl-лигандния полипептид.

25. Препарат, включващ mpl-лиганда на всяка една от претенции 1 до 14 или получен по метода на претенция 22 или 23 и фармацевтично приемлив носител.

26. Метод, характеризиращ се с това, че включва използването на mpl-лиганден полипептид на всяка една от претенции 1 до 14 или получен чрез метода на претенция 22 или 23 за получаване на лекарствено средство.

27. Препарат съгласно претенция 25 или получен чрез метод на претенция 26, който допълнително включва терапевтично ефективно количество от агент, избран измежду цитокини, колония-стимулиращи фактори и интерлевкини.

28. Препарат съгласно претенция 27, където средството се избира от LIF, GCSF, GM-CSF, M-CSF, Еро, IL-1, IL-2, 1L-3, IL-5, 1L-6, IL-7, IL-8, 1L-9 и 1L-11.

29. Метод за амплификация на тестова проба нуклеинова киселина, характеризиращ се с това, че включва иницииране на полимеразната реакция с нуклеиновата киселина с нуклеинова киселина, съответстваща поне на част от геномната или кДНК от претенция 18.

30. Метод за определяне наличието на mpl-лиганден полипептид, характеризиращ се с това, че включва хибридизиране на нуклеиновата киселина на претенция 18 с тестова проба нуклеинова киселина и определяне наличието на нуклеинова киселина на mpl-лигандния полипептид.

31. Метод, характеризиращ се с това, че включва използването на mpl-лиганден полипептид на всяка една от претенциите 1 до 14 или получен чрез процеса на

284 претенция 22 или претенция 23 за приготвянето на антитяло, специфично за mplлиганда.

32. Метод съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че се приготвя моноклонално антитяло.

33. Антитяло, така както се получава чрез метода на претенция 31 или претенция 32.

34. Антитяло, което е в състояние да свързва трЮлигандния полипептид на всяка една от претенции 1 до 14.

35. Антитяло съгласно претенция 34, което е моноклонално антитяло.

36. Хибридомна клетъчна линия, продуцираща антитялото на претенция 33 или 35.