FR2771104A1 - Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs del'hppd - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire conprenant, dans le sens de la transcription, des éléments de régulation en 5' nécessaires à sa transcription dans les plantes, au moins une partie codante hétérologue comprenant une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance aux herbicides inhibiteurs de l'HPPD et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, dans lequel les éléments de régulation en 5' assurent la transcription du gène chimère élémentaire au niveau des tissus chlorophylliens.La présente invention concerne également la transformation des plantes et les plantes transformées avec ledit gène chimère. Elle concerne aussi un procédé de culture des plantes transformées dans lequel on applique un inhibiteur d'HPPD pour contrôler les mauvaises herbes.
Description
Gène chimère ayant un promoteur lumière dépendant conférant la tolérance aux
inhibiteurs de l'HPPD
La présente invention a pour objet un gène chimère ayant un promoteur lumière dépendant lié de manière fonctionnelle à un gène codant pour une HPPD (hydroxy phényl pyruvate dioxygénase), conférant une tolérance améliorée aux herbicides inhibiteurs de l'HPPD à une cellule végétale et une plante normalement sensibles.
inhibiteurs de l'HPPD
La présente invention a pour objet un gène chimère ayant un promoteur lumière dépendant lié de manière fonctionnelle à un gène codant pour une HPPD (hydroxy phényl pyruvate dioxygénase), conférant une tolérance améliorée aux herbicides inhibiteurs de l'HPPD à une cellule végétale et une plante normalement sensibles.
L'invention concerne également les cellules végétales et palntes transformées avec le gène chimère selon l'invention, un procédé de transformation des cellules végétales et des plantes et un procédé de culture des plantes transformées dans lequel on applique un herbicide inhibiteur de l'HPPD pour éliminer les mauvaises herbes.
Les herbicides ayant pour cible l'HPPD sont notamment les (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier lisoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2 CH3 -4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2 CH3-4-2,3 C12 phényl) propane-l, 3-dione, les tricétones (EP 6?5 505 EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou encore les pyrazolinates. Des gènes codant pour une HPPD conférant une tolérance à ces herbicides et les plantes transgéniques contenant ce gène montrent une tolérance significative aux dits herbicides sont décrits dans la demande de brevet WO 96738567 et dans la demande de brevet FR 97 14264 déposée le 7 novembre 1997, dont le contenu est ici inclus par référence.
Jusqu'à maintenant tous les essais effectués pour conférer une bonne tolérance aux inhibiteurs de 1'HPPD l'ont été en utilisant des promoteurs constitutifs ou permettant une expression dans toutes sortes de tissus végétaux, tissus racinaires, tissus foliaires, zones en croissance plus ou moins rapides. Pour ce faire des plantes dicotylédones comme le tabac, Arabidopsis thaliana, le colza et le soja ont été transformées soit avec: - le gène chimère pRP T
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> histone <SEP> TEV <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> l'HPPD <SEP> Terminateur <SEP> nos
<tb> - le gène chimère pRP V
<tb> - le gène chimère pRP V
<tb> Promoteur <SEP> double <SEP> histone <SEP> @ <SEP> TEV <SEP> OTP <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> l'HPPD <SEP> Terminateur <SEP> nos
<tb>
Ces essais nous ont permis de confirmar que ce type d'expression permet dans les dicotylédones d'obtenir une très bonne tolérance.
<tb>
Ces essais nous ont permis de confirmar que ce type d'expression permet dans les dicotylédones d'obtenir une très bonne tolérance.
Des plantes monocotylédones comme le maïs ont également été transformées avec le gène chimère pRPA-RD-1004 (demande de brevet PCT/FR97/0l256 déposée le 10 juillet 1997):
<tb> promoteur <SEP> histone <SEP> | <SEP> Intron <SEP> I <SEP> de <SEP> | <SEP> OTP <SEP> | <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> l'HPPD <SEP> | <SEP> Terminateur <SEP> nos
<tb> <SEP> H3C4 <SEP> de <SEP> maïs <SEP> | <SEP> Adhl
<tb>
On a maintenant trouvé qu'on pouvait conférer à une cellule végétale et à une plante une tolérance herbicide améliorée par sur-expression de l'HPPD par l'intermédiaire d'un promoteur " lumière dépendant" ( appelé ci-après promoteur LD).
<tb> <SEP> H3C4 <SEP> de <SEP> maïs <SEP> | <SEP> Adhl
<tb>
On a maintenant trouvé qu'on pouvait conférer à une cellule végétale et à une plante une tolérance herbicide améliorée par sur-expression de l'HPPD par l'intermédiaire d'un promoteur " lumière dépendant" ( appelé ci-après promoteur LD).
L'utilisation de ces promoteurs LD conduit à l'expression du gène chimère dans les tissus chlorophylliens ou " tissus verts" sans aucune expression dans les tissus non chlorophylliens ou une expression très faible dans les tissus non chlorophylliens comme les tissus racinaires, une telle expression étant suffisante pour améliorer la tolérance des plantes transformées aux herbicides inhibiteurs de 1'HPPD.
La présente invention a donc d'abord pour objet un gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire contenant , dans le sens de la transcription, des éléments de régulation en 5' nécessaires à sa transcription dans les plantes au moins une partie codante hétérologue comprenant une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance aux herbicides inhibiteurs de l'HPPD et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation les éléments de régulation en 5' assurant la transcription du gène chimère élémentaire au niveau des tissus chlorophylliens, les dits éléments de régulations en 5' comprenant de préférence au moins une séquence de régulation promotrice de type promoteur LD.
Par promoteur LD , on entend selon l'invention tout promoteur de gène codant pour des peptides dont la transcription est induite par la lumière qui est fonctionnel comme promoteur dans les cellules végétales. Ces promoteurs LD peuvent être d'origine bactérienne, virale ou végétale. De tels promoteurs sont notamment décrits par Terzaghi & coll. (Light-regulated transcription, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.
Biol., 1995, 46:445-474) dont le contenu est incorporé ici par référence. Comme promoteur LD utile selon l'invention, on citera plus particulièrement le promoteur d'un gène de la petite sous unité de ribulose-biscarboxylase (rbcs) de plante, de la protéine light-harvesting chlrorophyll a/b binding (LHCP), de la plastocyanine (pet E) et de la phénylalanine ammonia lyase (pal). De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante dans les tissus chlorophylliens, telle que par exemple, celle comprenant au moins un fragment fonctionnel du promoteur de la petite sous unité de la rbcs (SSU) d'une plante, plus particulièrement isolé d'Helianthus annuus tel que décrit dans lebrevet US 5,559,024.
Parmi les promoteurs SSU, on peut également citer le promoteur SSU de pétunia décrit dans le brevet US 4962028.
Par fragment fonctionnel, on entend selon l'invention toute séquence d'ADN issue de la séquence du promoteur SSU reproduisant la fonction de la séquence d'où elle est issue.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention. la séquence du promoteur SSU d'Helianthus annuus comprend la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n" I (SEQ ID NO:1) ou une séquence homologue de ladite séquence. Plus préférentiellement, la séquence du promoteur SSU consiste en la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n" 1.
Par " homologue ", on entend selon l'invention une séquence d'ADN présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence d'ADN de référence décrite par l'identificateur de séquence n" 1, et reproduisant la fonction de cette séquence. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques pouvant être employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. De manière avantageuse. le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence. de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %.
Par "cellule végétale". on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante monocotyledone et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals. des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes monocotyledones. des plantes monocotyledones ou des semences.
On entend par '* plante " selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, plus particulièrement des plantes monocotyledones ou dicotyledones, de préférence de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme par exemple le blé, l'orge, l'avoine, le riz, le maïs, le sorgho, la canne à sucre, le soja, le colza, le coton, le tabac, la betterave ou encore desplantes de cultures maraichères ou florales.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice de type LD, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de trancription "enhancer", comme par exemple l'activateur de traduction du virus etch du tabac (TEV) décrit dans l'article de Carrington and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597, ou des séquences codant pour des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, constituée d'une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande demande de brevet EP 508 909.
Comme séquence codante pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance aux herbicides inhibiteurs de 1'HPPD, on peut notamment utiliser toutes celles connues pour conférer la tolérance de plantes à certains inhibiteurs de l'HPPD telles que les séquences codant pour une HPPD décrites dans la demande de brevet WO 96/38567 et dans la demande de brevet FR 9714264 déposée le 7 novembre 1997. Cette HPPD peut être de toute nature.
Plus particulièrement cette séquence peut être d'origine bactérienne, telle que notamment le genre Pseudomonas ou encore d'origine végétale, telle que notamment de plante monocotylédone ou dicotylédone, notamment d'Arabidopsis ou d'ombellifères comme par exemple la carotte (Daucus carotta). Elle peut être native ou sauvage ou éventuellement mutée tout en gardant fondamentalement une propriété de tolérance herbicide contre les inhibiteurs de l'HPPD, tels que les herbicides de la famille des isoxazoles ou de celle des tricétones ou des pyrazinolates.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterillm tumefnciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'une cellule végétale ou d'une plante monocotyledone ou dicotyledone. Le vecteur selon l'invention comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation de cellules végétales et de plantes monocotyledones sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié avec le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacteriitm tumefliciens ou Ri d'Agrobacterium iJiLogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales ou plantes, transformées tolérantes aux herbicides ayant pour cible 1'HPPD et contenant au moins un gène chimère selon l'invention défini ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355,
US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744,
US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744,
US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
La présente invention concerne également un procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'invention, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible 1'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention avec un gène chimère selon l'invention lequel procédé consiste à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD défini ci-dessus en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsquelles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
Dans les deux procédés ci-dessus, I'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD peut être laite selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.
Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener).
Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie
Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.
Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.
Exemple 1: Construction d'un gène chimère avec une séquence HPPD et un
promoteur LD.
promoteur LD.
Pour conférer la tolérance de plantes aux herbicides inhibant 1'HPPD, on construit un gène chimère appelé pRPA-RD-2005:
Il consiste à mettre la partie codante du gène de 1'HPPD de P. fluorescens A32 sous le contrôle du promoteur de la petite sous unité de la RuBisCO isolé d'Lkliant/ius annuits (US 5,559,024), du peptide de transit optimisé (OTP) (EP 508 909), lui même suivi de la région codante de 1'HPPD de Pseudomonasfluorescens (WO 96/38567) à son tour suivie du terminateur nos d'Agrobacterium ('(n? eyaciens. L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste et le gène s'exprime essentiellement dans les tissus chlorophylliens.
Il consiste à mettre la partie codante du gène de 1'HPPD de P. fluorescens A32 sous le contrôle du promoteur de la petite sous unité de la RuBisCO isolé d'Lkliant/ius annuits (US 5,559,024), du peptide de transit optimisé (OTP) (EP 508 909), lui même suivi de la région codante de 1'HPPD de Pseudomonasfluorescens (WO 96/38567) à son tour suivie du terminateur nos d'Agrobacterium ('(n? eyaciens. L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste et le gène s'exprime essentiellement dans les tissus chlorophylliens.
Le pRPA-RD-2005 est un vecteur binaire de type pRPA-BL-150Aα2 (EP 508 909) contenant une cassette d'expression de 1'HPPD: promoteur de la petite sous unité de la ribulose discarboxylase-OTP-gène HPPD-terminateur nos
-Pour le construire, on a utilisé le pRPA-RD 2004 qui contient la cassette d'expression de 1'HPPD
Construction du pRPA-RD-2004
- pRD-207 est un pBluescript SK(-) (stratagène catalog#21 2206) contenant le gène de la nopaline synthase (terminateur nos). Le pRD-207 est utilisé comme vecteur de base pour la construction du pRPA-RD-2004
- pRD-208 contient la cassette OTP/HPPD:nos. I1 est obtenu à partir du plasmide pRPA S, décrit dans WO 96/38567, digéré par XbaI/ClaI, traitement à la polymérase type pfu. La cassette est introduite dans le pRD-207 ouvert par une digestion SalI, traitement klenow.
-Pour le construire, on a utilisé le pRPA-RD 2004 qui contient la cassette d'expression de 1'HPPD
Construction du pRPA-RD-2004
- pRD-207 est un pBluescript SK(-) (stratagène catalog#21 2206) contenant le gène de la nopaline synthase (terminateur nos). Le pRD-207 est utilisé comme vecteur de base pour la construction du pRPA-RD-2004
- pRD-208 contient la cassette OTP/HPPD:nos. I1 est obtenu à partir du plasmide pRPA S, décrit dans WO 96/38567, digéré par XbaI/ClaI, traitement à la polymérase type pfu. La cassette est introduite dans le pRD-207 ouvert par une digestion SalI, traitement klenow.
- Le promoteur de la petite sous unité de la ribulose biscarboxylase d'Helianthus annuus (SSU HA; SEQ ID NO:1) provient du plasmide pRD-127 décrit dans WO 96/38567 digéré Ncol/XbaI est introduit dans le pRD-208. Cette construction constitue le pRPA-RD-2004
Construction du pRD-2005
- Pour construire le pRPA-RD-2005, on ouvre le vecteur pRPA-BL- 150Aα2 par les enzymes de restriction XbaI/HindIII auquel on insert la cassette d'expression de 1'HPPD du pRPA-RD-2004 (décrit ci-dessus)par les même enzymes I1 a donc comme structure:
Construction du pRD-2005
- Pour construire le pRPA-RD-2005, on ouvre le vecteur pRPA-BL- 150Aα2 par les enzymes de restriction XbaI/HindIII auquel on insert la cassette d'expression de 1'HPPD du pRPA-RD-2004 (décrit ci-dessus)par les même enzymes I1 a donc comme structure:
<tb> Promoteur <SEP> SSU <SEP> OTP <SEP> 1 <SEP> <SEP> Région <SEP> codante <SEP> de <SEP> l'HPPD <SEP> <SEP> Terminateur <SEP> nos
<tb>
Exemple 2: Transformation du tabac industriel PBD6.
<tb>
Exemple 2: Transformation du tabac industriel PBD6.
Afin de déterminer l'efficacité du ce gène chimère de l'exemple 1, il a été transféré dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande de brevet EP 508 909.
1) Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Xgrobacterium EHA 101 ou LBA 4404 (Hood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al.1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh R. et al. (1985)
Science, 227, 1229-1231.
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Xgrobacterium EHA 101 ou LBA 4404 (Hood et al,1987) porteuse du cosmide pTVK 291(Komari et al.1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh R. et al. (1985)
Science, 227, 1229-1231.
2) Régénération:
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g I de saccharose ainsi que 350 mg/l de cefotaxime et 1 mg/l du dicétonitrile dérivant de l'isoxaflutole ou 10 mg/l de 1-[4-(trifluorométhyl)-2-(méthylsulfonyl)phényl]-2-cyano- 3-(1-méthylcyclopropyl)-propan-1,3-dione, autre inhibiteur de 1'HPPD. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985,Vol 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 1 mg/l d'isoxaflutole. Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/l de saccharose et 1 mg/l d'isoxaflutole ou 10 mg/l de 1 -[4 (trifluorométhyl)-2-(méthyîsulfonyl)phényî]-2-cyano-3 -(I -méthylcyclopropyl)-propan1,3-dione mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et I mg/l d'isoxaflutole ou 10 mg/l de l-[4-(trifluorométhy1)- 3-(méthylsulfonyl)phényl]-3-cyano-3-( 1 -méthylcyclopropyl)-propan- 1.3-dione et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours les pousses enracinées sont passées en terre.
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g I de saccharose ainsi que 350 mg/l de cefotaxime et 1 mg/l du dicétonitrile dérivant de l'isoxaflutole ou 10 mg/l de 1-[4-(trifluorométhyl)-2-(méthylsulfonyl)phényl]-2-cyano- 3-(1-méthylcyclopropyl)-propan-1,3-dione, autre inhibiteur de 1'HPPD. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985,Vol 227,p.1229-1231) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 1 mg/l d'isoxaflutole. Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/l de saccharose et 1 mg/l d'isoxaflutole ou 10 mg/l de 1 -[4 (trifluorométhyl)-2-(méthyîsulfonyl)phényî]-2-cyano-3 -(I -méthylcyclopropyl)-propan1,3-dione mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et I mg/l d'isoxaflutole ou 10 mg/l de l-[4-(trifluorométhy1)- 3-(méthylsulfonyl)phényl]-3-cyano-3-( 1 -méthylcyclopropyl)-propan- 1.3-dione et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours les pousses enracinées sont passées en terre.
Exemple 3: Tolérance du tabac transformé avec le gène chimère pRPA-RD-2005
Au sortir de l'étape in-vitro de l'exemple 2, les plantules de tabac transformées ont été acclimatées à la serre (60% d'humidité relative; température: 20"C la nuit et 23"C la jour) pendant trois semaines puis traitées au 4-[4-(trifluorométhyl)-2- (méthylsulfonyl)benzoyl]-5-cyclopropylisoxazole (isoxafutole).
Au sortir de l'étape in-vitro de l'exemple 2, les plantules de tabac transformées ont été acclimatées à la serre (60% d'humidité relative; température: 20"C la nuit et 23"C la jour) pendant trois semaines puis traitées au 4-[4-(trifluorométhyl)-2- (méthylsulfonyl)benzoyl]-5-cyclopropylisoxazole (isoxafutole).
Le tabac témoin, non transformé et traité à l'isoxafutole à la doses de 400 g/ha, développe en environ 72 heures des chloroses, qui s'intensifient pour évoluer vers des nécroses très prononcées en une semaine (couvrant environ 80% des feuilles terminales).
Le tabac transformé correspondant, ci-après tabac 2005 qui surexprime l'HPPD de P. fluorescens, est très bien protégé contre un traitement à l'isoxafutole à la dose de 400 g/ha.
Exemple 4: Tolérance en serre du tabac 2005
Dans cet exemple on compare la tolérance en serre du tabac 2005 à celle du tabac CO I 1, transformé avec le gène chimère pRPA-V décrit dans la demande de brevet
WO 96/38567 et à celle du tabac non transformé.
Dans cet exemple on compare la tolérance en serre du tabac 2005 à celle du tabac CO I 1, transformé avec le gène chimère pRPA-V décrit dans la demande de brevet
WO 96/38567 et à celle du tabac non transformé.
Description des essais tabac.
Des graines de chacun de ces types de tabac sont semées en terrine et le jour même un traitement à des doses d'isoxaflutole de 0/30/200/400 g/ha appliqué donc en pré-emergence sont effectués.
Constructions testées
Coll: Double histone~TEV~OTP~HPPD Pseudomonas Nos 2005: SSUNOTPHPPD Pseudomonas Nos
PBD6: non transformé.
Coll: Double histone~TEV~OTP~HPPD Pseudomonas Nos 2005: SSUNOTPHPPD Pseudomonas Nos
PBD6: non transformé.
Bilan
Pour le tabac PBD6, la germination se fait normalement à 0 g /ha et aucune germination n'a lieu dès la dose de 30 g/ ha. Si par hasard une plantule arrive à levée elle est blanche et meurt très rapidement.
Pour le tabac PBD6, la germination se fait normalement à 0 g /ha et aucune germination n'a lieu dès la dose de 30 g/ ha. Si par hasard une plantule arrive à levée elle est blanche et meurt très rapidement.
Pour des graines issues d'un tabac CO 11, la levée est normale et sans symptômes de phytotoxicité pour les doses allant de 0 à 200 g/ ha. A 400 g/ha, les graines germent, la levée a lieu normalement mais il y a un retard de croissance ou " stunting", assez net par rapport aux plantes non traitées.
Pour des graines issues d'un tabac 2005. la levée est normale et sans symptômes de phytotoxicité pour les doses allant de 0 à 400 g/ ha. A aucune des trois doses d'isoxafiutole. en serre ne provoque de symptôme de phytotoxicité ou de -. stunting
Exemple 5: Tolérance au champ du tabac du tabac 2005
Les essais comparatifs de tolérance de l'exemple 4 sont reproduits au champ pour les même tabacs 2005, CO11 et PBD6.
Exemple 5: Tolérance au champ du tabac du tabac 2005
Les essais comparatifs de tolérance de l'exemple 4 sont reproduits au champ pour les même tabacs 2005, CO11 et PBD6.
Description des essais tabac.
Des jeunes plantes issues de semis ont été repiquées individuellement en minimottes pour être une deuxième fois repiquées au champ. Le traitement de post a été réalisé une semaine après à des doses dtisoxaflutole de 0/100/200/300/400/500/600 g/ha.
Bilan
Le diagramme ci-dessous comparant les tabacs de type COl l et 2005, montre clairement que le promoteur SSU confère une meilleure tolérance que le double histone associé au TEV ' enhancer ".
Le diagramme ci-dessous comparant les tabacs de type COl l et 2005, montre clairement que le promoteur SSU confère une meilleure tolérance que le double histone associé au TEV ' enhancer ".
% de phytotoxicité
<tb> <SEP> 2005 <SEP> 1|1 <SEP> 2005 <SEP> COlI <SEP> i3 <SEP> Wild <SEP> type
<tb> 100 <SEP> 1 <SEP> I <SEP> T
<tb> <SEP> 90 <SEP> /
<tb> <SEP> 80-1 <SEP> T <SEP> 7-
<tb> <SEP> 70 <SEP> 1
<tb> <SEP> 60 <SEP> 'r
<tb> <SEP> 60 <SEP> / <SEP> =Ctl= <SEP> ~
<tb> 40-'
<tb> 30- <SEP> ~~~~~~~~
<tb> 20
<tb> Fot1~ <SEP> i-c
<tb> <SEP> 7 <SEP> 13 <SEP> 20
<tb>
Ainsi, 13 jours après traitement à 400g/ha, on observe 15 % de phytotoxicité sur les tabacs COl 1 alors que les tabacs 2005 ne présentent pas ou peu de phytotoxicité.
<tb> 100 <SEP> 1 <SEP> I <SEP> T
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<tb> <SEP> 7 <SEP> 13 <SEP> 20
<tb>
Ainsi, 13 jours après traitement à 400g/ha, on observe 15 % de phytotoxicité sur les tabacs COl 1 alors que les tabacs 2005 ne présentent pas ou peu de phytotoxicité.
De même, 20 jours après un traitement à 400g/ha, on observe plus de 20 % de phytotoxicité sur les tabacs CO11 alors que les tabacs 2005 présentent moins de 10% de phytotoxicité.
Dans les conditions de culture en champs, les plantes transformées avec le gène pRPA-RD-2005 comprenant le promoteur SSU ont une meilleure tolérance aux inhibiteurs de 1'HPPD que celles transformées avec le gène pRPA-V comprenant le promoteur double histone combiné au TEV " enhancer " de l'état de la technique.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: LYON
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 69009
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Gène chimère ayant un promoteur lumière
dépendant conférant la tolérance aux inhibiteurs de l'HP D
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 766 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TAATTCAATA CTTGGATGAT ACAATTTTTC TAGTCTTAAT AAATTTGTAT TTGTATTTGT
TTTTTATTTA TGCTTTAATA ATTCCAACCT TACTATTAAA AGCACTAGAC TACTTATCAA 120
TAGCGGCTCA ACCACACTAC AACATATTGG TCCAGTTTCG GGTAATATTG GTCCAGTTTT 1@ D
CACGTATTTT GATATCAATA TTTTCTTTTT AGAATTTCGG TAGGTTTCAA AGAATTTACA 240
TGGTTTTTAG GTAATTTTTG AAACTCTTTT TGATTATAGG CAATGTGACG GGATGTGGAT 300
GAAAAATAAC ACATCTGCTA CTTAATTACG GTAGCAGATT TTCAAACGCT CATGATAGTT 36C AAAACATTAA CAATATAAAC CACACACTAT TAACCTCATG ATTCATAAAA ATTACACTCA 420
CCCTCCGACC CTTCCATGTC TACCTCTCCT TTAGAAGATG AGATAAGATA TTTTGAGCAA 480
TGTGCATTTG ACACGTGGCT CTCCATTTCT GGTGGCTATA TGATAAGGTC TTCAAATTGC 540
AATTATATTA TGTGGACACT ATGCATGAAA TTCCAAGAGC CACAACATCC TACGCTCAGA 600
ATCACTACAA GTTAAGATAG ATTTGTTTTT ATCCGTTGGA TGGCAGGCAG CTCATGTACA 660
AGTATTATAT ATACAGCTCA TAATCACTAA AGTCACTCAT TGGATTCTCG ACCATCGAAT 720 TCCCAAGCAA GCAGCGAGTA CATACATACT AGGCAGCCAG GCAGCC 768
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: LYON
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 69009
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Gène chimère ayant un promoteur lumière
dépendant conférant la tolérance aux inhibiteurs de l'HP D
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 766 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TAATTCAATA CTTGGATGAT ACAATTTTTC TAGTCTTAAT AAATTTGTAT TTGTATTTGT
TTTTTATTTA TGCTTTAATA ATTCCAACCT TACTATTAAA AGCACTAGAC TACTTATCAA 120
TAGCGGCTCA ACCACACTAC AACATATTGG TCCAGTTTCG GGTAATATTG GTCCAGTTTT 1@ D
CACGTATTTT GATATCAATA TTTTCTTTTT AGAATTTCGG TAGGTTTCAA AGAATTTACA 240
TGGTTTTTAG GTAATTTTTG AAACTCTTTT TGATTATAGG CAATGTGACG GGATGTGGAT 300
GAAAAATAAC ACATCTGCTA CTTAATTACG GTAGCAGATT TTCAAACGCT CATGATAGTT 36C AAAACATTAA CAATATAAAC CACACACTAT TAACCTCATG ATTCATAAAA ATTACACTCA 420
CCCTCCGACC CTTCCATGTC TACCTCTCCT TTAGAAGATG AGATAAGATA TTTTGAGCAA 480
TGTGCATTTG ACACGTGGCT CTCCATTTCT GGTGGCTATA TGATAAGGTC TTCAAATTGC 540
AATTATATTA TGTGGACACT ATGCATGAAA TTCCAAGAGC CACAACATCC TACGCTCAGA 600
ATCACTACAA GTTAAGATAG ATTTGTTTTT ATCCGTTGGA TGGCAGGCAG CTCATGTACA 660
AGTATTATAT ATACAGCTCA TAATCACTAA AGTCACTCAT TGGATTCTCG ACCATCGAAT 720 TCCCAAGCAA GCAGCGAGTA CATACATACT AGGCAGCCAG GCAGCC 768
Claims (20)
1. Gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire conprenant, dans le sens de la transcription, des éléments de régulation en 5 nécessaires à sa transcription dans les plantes, au moins une partie codante hétérologue comprenant une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance aux herbicides inhibiteurs de 1'HPPD et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, caractérisé en ce que les éléments de régulation en 5' assurent la transcription du gène chimère élémentaire au niveau des tissus chlorophylliens.
2. Gène chimère selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dits éléments de régulations en 5' comprenent au moins une séquence de régulation promotrice de type promoteur LD.
3. Gène chimère selon la revendication 2, caractérisé en ce que le promoteur LD est d'origine bactérienne, virale ou végétale.
4. Gène chimère selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur LD est choisi parmi une séquence fonctionnelle du promoteur d'un gène de la petite sous unité de la RuBisCO de plante, de la light-harvesting chîrorophyll a/b binding protéine (LHCP), de la plastocyanine (pet E) et de la phénylalanine ammonia lyase (pal).
5. Gène chimère selon la revendication 4, caractérisé en ce que le promoteur LD comprend un fragment fonctionnel du promoteur de la petite sous unité de la RuBisCO d'une plante.
6. Gène chimère selon la revendication 5 caractérisé en ce que le promoteur LD comprend un fragment fonctionnel fonctionnel du promoteur de la petite sous unité de la RuBisCO d'Helianthus annitus.
7. Gène chimère selon la revendication 6, caractérisé en ce que le promoteur LD comprend la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n" 1 (SEQ ID NO: 1) ou une séquence homologue de ladite séquence.
8. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le gène chimère élémentaire comprend en association avec les éléments de régulation en 5' au moins une séquence de régulation, située entre le promoteur et la séquence codante, choisie parmi les activateurs de trancription et/ou les séquences codant pour des peptides de transit.
9. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la séquence codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance aux herbicides inhibiteurs de l'HPPD est choisie parmi les séquences codant pour une HPPD d'origine bactérienne ou d'origine végétale.
10. Vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'une cellule végétale ou d'une plante monocotyledone ou dicotyledone, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 1 à 9, au moins une origine de réplication.
11. Vecteur selon la revendication 10, carctérisé en ce qu'il est un plasmide.
12. Procédé de transformation des cellules végétales, caractérisé en ce que l'on intègre dans ladite cellule végétale au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 9.
13. Cellule végétale transformée tolérante aux herbicides ayant pour cible 1'HPPD, caratérisée en ce qu'elle comprend au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 9.
14. Plante transformée tolérante aux herbicides ayant pour cible 1'HPPD, caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules transformées selon la revendication 13.
15. Plante transformée selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est régénérée régénérée à partir des cellules transforméesselon la revendication 14.
16. Plante transformée tolérante aux herbicides ayant pour cible 1'HPPD, caractérisée en ce qu'elle est issue de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées selon la revendication 15.
17. Graines de plantes transformées selon l'une des revendications 14 à 16.
18. Procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce que l'on applique sur la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible 1'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les dites graines ou plantes transformées.
19. Procédé de culture des plantes transformées selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce qu'il consiste à planter les graines selon la revendication 17 dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes transformées, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible 1'HPPD en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes transformées cultivées lorsquelles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes transformées récoltées.
20. Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que l'on applique l'herbicide ayant pour cible 1'HPPD en présemis et/ou en prélevée et/ou en postlevée de la culture.
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|---|---|---|---|
| FR9714591A FR2771104B1 (fr) | 1997-11-17 | 1997-11-17 | Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs del'hppd |
| PCT/FR1998/002414 WO1999025842A1 (fr) | 1997-11-17 | 1998-11-13 | Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs de l'hppd |
| AU11628/99A AU747634B2 (en) | 1997-11-17 | 1998-11-13 | Chimera gene having a light dependent promoter providing tolerance to HPPD inhibitors |
| BR9815628-4A BR9815628A (pt) | 1997-11-17 | 1998-11-13 | Gene quimérico, vetor, processo de transformação das células vegetais, célula vegetal transformada, planta transformada, sementes, processo de controle das ervas daninhas em uma superfìcie de um campo e processo de cultura das plantas transformadas |
| CA002309880A CA2309880A1 (fr) | 1997-11-17 | 1998-11-13 | Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs de l'hppd |
| EP98954565A EP1032681A1 (fr) | 1997-11-17 | 1998-11-13 | Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs de l'hppd |
| ARP980105795 AR017630A1 (es) | 1997-11-17 | 1998-11-16 | Gen quimerico que tiene un promotor dependiente de la luz, que confiere la tolerancia a los inhibidores de la hppd |
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| ZA9810498A ZA9810498B (en) | 1997-11-17 | 1998-11-17 | Chimeric gene having a light-dependent promoter conferring tolerance to HPPD inhibitors |
| CO98067540A CO4950591A1 (es) | 1997-11-17 | 1998-11-17 | Gen quimerico que tiene un promotor dependiente de la luz, que confiere la tolerancia a los inhibidores de la mppd |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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| FR2771104A1 true FR2771104A1 (fr) | 1999-05-21 |
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Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| FR9714591A Expired - Fee Related FR2771104B1 (fr) | 1997-11-17 | 1997-11-17 | Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs del'hppd |
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| AR (1) | AR017630A1 (fr) |
| AU (1) | AU747634B2 (fr) |
| BR (1) | BR9815628A (fr) |
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| CO (1) | CO4950591A1 (fr) |
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| WO (1) | WO1999025842A1 (fr) |
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Families Citing this family (18)
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| CN102741415A (zh) | 2010-02-02 | 2012-10-17 | 拜尔农科股份公司 | 使用hppd抑制剂作为选择剂的大豆转化 |
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| WO2016050512A1 (fr) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | Bayer Cropscience Nv | Procédés et moyens pour augmenter la tolérance au stress et la biomasse chez des plantes |
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| EP3429333A1 (fr) | 2016-03-16 | 2019-01-23 | Basf Se | Plantes comprenant des gènes restaurateurs de la stérilité mâle cytoplasmique de type g du blé, marqueurs moléculaires et leurs utilisations |
| EP3429334A1 (fr) | 2016-03-16 | 2019-01-23 | Basf Se | Plantes comprenant des gènes restaurateurs de la stérilité mâle cytoplasmique de type g du blé, marqueurs moléculaires et leurs utilisations |
| WO2018015403A1 (fr) | 2016-07-18 | 2018-01-25 | Bayer Cropscience Nv | Plantes comprenant des gènes de restauration de la stérilité mâle cytoplasmique de type g du blé, marqueurs moléculaires et leurs utilisations |
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