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CN116917486A - 原卟啉原氧化酶的用途 - Google Patents

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CN116917486A
CN116917486A CN202280014835.5A CN202280014835A CN116917486A CN 116917486 A CN116917486 A CN 116917486A CN 202280014835 A CN202280014835 A CN 202280014835A CN 116917486 A CN116917486 A CN 116917486A
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CN
China
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ppo inhibitor
plant
inhibitor herbicides
protoporphyrinogen oxidase
seq
Prior art date
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Pending
Application number
CN202280014835.5A
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English (en)
Inventor
肖翔
宋庆芳
陶青
于彩虹
鲍晓明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种原卟啉原氧化酶的用途，所述控制杂草的方法包括将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。本发明原卟啉原氧化酶PPO1‑PPO14对PPO抑制剂除草剂具有较高的耐受性，且含有编码原卟啉原氧化酶多核苷酸序列的植物对PPO抑制剂除草剂的耐受性强，其对4倍大田浓度的乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺和丙炔氟草胺以及2倍大田浓度的甲磺草胺几乎全部表现出高抗的耐受性。因此在植物上应用前景广阔。

Description

原卟啉原氧化酶的用途 技术领域
本发明涉及一种原卟啉原氧化酶的用途，特别是涉及一种来源于原核生物的原卟啉原氧化酶赋予植物对PPO抑制剂除草剂具有耐受性的方法及用途。
背景技术
卟啉生物合成途径用于合成在植物代谢中起重要作用的叶绿素和血红素，并且该途径发生在叶绿体中。在该途径中，原卟啉原氧化酶(简称PPO)催化原卟啉原IX氧化成原卟啉IX。在原卟啉IX产生之后，原卟啉IX通过镁螯合酶与镁结合来合成叶绿素，或通过铁螯合酶与铁结合来合成血红素。
通过抑制PPO而发挥作用的除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、三嗪酮类PPO抑制剂除草剂以及其他类型PPO抑制剂除草剂。在植物中，PPO抑制剂抑制了PPO的酶活性，导致叶绿素和血红素的合成受到抑制，并且导致底物原卟啉原IX的积累，所积累的原卟啉原IX从叶绿体快速输出到细胞质，细胞质中的原卟啉原IX在非酶促反应下转化为原卟啉IX并进一步在光和氧分子的存在下生成高反应性的单线态氧( 1O 2)，它们会破坏细胞膜并迅速导致植物细胞的死亡。
用于提供耐受PPO抑制剂除草剂植物的方法主要包括：1)使用可以将除草剂或其活性代谢物转化成无毒产物的酶，将除草剂脱毒。2)过表达敏感性PPO，使得鉴于此酶的动力学常数，在植物中产生相对于除草剂足够的靶酶量，以致尽管存在PPO抑制剂除草剂，但这些敏感性PPO与该PPO抑制剂除草剂是充分作用的，从而具有足够的可供使用的功能性酶。3)提供一种功能性PPO，该功能性PPO对于除草剂或其活性代谢物是较不敏感的，但其保留了催化原卟啉原IX氧化为原卟啉IX的性质。关于功能性PPO类，虽然一种给定的功能性PPO可以提供一个有用水平的对于一些PPO抑制剂除草剂的耐受性，但是相同的功能性PPO可能不足以提供一个商业化水平的对于一种不同的、更希望的PPO抑制剂除草剂的耐受性；例如，PPO抑制剂除草剂可以在它们控制的杂草范围、它们的制造成本、以及它们的环境友好性方面是不同的。因此，需要用于向不同的作物和作物品种赋予PPO抑制剂除草剂耐受性的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种原卟啉原氧化酶的用途，所述原卟啉原氧化酶来源于原核生物，且转入编码本发明所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物对PPO抑制剂除草剂具有较好的耐受性。
为实现上述目的，本发明提供了一种控制杂草的方法，包括将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量，其中所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
优选地，所述转基因植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述转基因植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；进一步优选地，所述转基因植物为草甘膦耐受性植物，所述杂草为草甘膦抗性杂草；
优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
优选地，所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列具有：
(a)编码与选自由SEQ ID NO:1-14具有至少88％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列不包括SEQ ID NO:15-28；或
(b)SEQ ID NO:29-42或SEQ ID NO:62-64任意一种所示的多核苷酸序 列。
进一步地，所述转基因植物还包括至少一种不同于编码所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的编码第二种除草剂耐受性蛋白质的第二种多核苷酸。
所述第二种多核苷酸编码选择标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质、影响植物产量的蛋白质和/或影响植物品质的蛋白质。
具体地，所述第二种多核苷酸编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化还原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶、α酮戊二酸依赖性双加氧酶、麦草畏单加氧酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶和/或细胞色素类蛋白质。
可选择地，所述含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂还包括草甘膦除草剂、草铵膦除草剂、植物生长素类除草剂、禾本科除草剂、发芽前选择性除草剂和/或发芽后选择性除草剂。
为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草生长的种植组合，包括PPO抑制剂除草剂和至少一种转基因植物，将含有有效剂量的所述PPO抑制剂除草剂施加到存在所述至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量，其中所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
优选地，所述转基因植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述转基因植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；进一步优选地，所述转基因植物为草甘膦耐受性植物，所述杂草为草甘膦抗性杂草；
优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉 酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
优选地，所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列具有：
(a)编码与选自由SEQ ID NO:1-14具有至少88％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列不包括SEQ ID NO:15-28；或
(b)SEQ ID NO:29-42或SEQ ID NO:62-64任意一种所示的多核苷酸序列。
进一步地，所述转基因植物还包括至少一种不同于编码所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的编码第二种除草剂耐受性蛋白质的第二种多核苷酸。
所述第二种多核苷酸编码选择标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质、影响植物产量的蛋白质和/或影响植物品质的蛋白质。
具体地，所述第二种多核苷酸编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化还原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶、α酮戊二酸依赖性双加氧酶、麦草畏单加氧酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶和/或细胞色素类蛋白质。
可选择地，所述含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂还包括草甘膦除草剂、草铵膦除草剂、植物生长素类除草剂、禾本科除草剂、发芽前选择性除草剂和/或发芽后选择性除草剂。
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生耐受PPO抑制剂除草剂的植物的方法，包括向植物的基因组中引入编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，当含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到至少存在所述植物的田地中，所述植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量，其中所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的 氨基酸序列；
优选地，所述引入的方法包括遗传转化方法、基因组编辑方法或基因突变方法；
优选地，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；
优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
为实现上述目的，本发明还提供了一种培养耐受PPO抑制剂除草剂植物的方法，包括：
种植至少一个植物繁殖体，所述植物繁殖体的基因组中包括编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
使所述植物繁殖体长成植株；
将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到至少包含所述植株的田地中，收获与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量的植株；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
优选地，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；
优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由PPO抑制剂除草剂引起的损伤或赋予植物PPO抑制剂除草剂耐受性的方法，包括将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量，其中所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
优选地，所述转基因植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述转基因植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；
优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
为实现上述目的，本发明还提供了一种原卟啉原氧化酶在赋予植物PPO抑制剂除草剂耐受性中的用途，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1 -14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
优选地，所述原卟啉原氧化酶在赋予植物PPO抑制剂除草剂耐受性中的用途包括将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量；
优选地，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；
优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
优选地，所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列具有：
(a)编码与选自由SEQ ID NO:1-14具有至少88％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列不包括SEQ ID NO:15-28；或
(b)SEQ ID NO:29-42或SEQ ID NO:62-64任意一种所示的多核苷酸序列。
作为具体的实施方式，PPO抑制剂除草剂也即“PPO抑制剂类除草剂”可以是选自由以下组成的组中的一种或多种，但不限于此：二苯醚类(草枯醚、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、甲羧除草醚(Bifenox)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、三氟羧草醚及其盐和酯、氟磺胺草醚(Fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、氯氟苯醚、苯草醚 (aclonifen)、治草醚(bifenox)、氯乳醚(ethoxyfen)、氯除草醚(chlorintrofen)、氟硝磺酰胺(halosafen))；噁二唑酮类(噁草酮(oxadiazon)、丙炔噁草酮(oxadiargyl))；N-苯基酞酰胺亚胺类(丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟烯草酸(flumiclorac-pentyl)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl))；噁唑啉酮类(环戊噁草酮(pentoxazone))；苯基吡唑类(异丙吡草酯(fluazolate)、吡草醚)；脲嘧啶类(双苯嘧草酮、氟丙嘧草酯、苯嘧磺草胺(saflufenacil))；噻二唑类(噻二唑草胺(thidiazimin)、嗪草酸甲酯(fluthiacet))；三唑啉酮类(唑啶草酮(azafenidin)、甲磺草胺(sulfentrazone)、唑酮草酯(carfentrazone))；三嗪酮类(Trifludimoxazin)；其他类(氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、双唑草腈(pyraclonil))。
本发明中使用的冠词“一种”和“一个”是指一个(种)或多于一个(种)(即至少一个)。例如，“一种要素”表示一种或多种要素(元件)。此外，术语“包括”或其变体例如“包括了”或“包含”应被理解为是指包括一种所述要素、整数或步骤，或一组要素、整数或步骤，但是不排除任何其他要素、整数或步骤，或者成组的要素、整数或步骤。
本发明中术语“除草剂不敏感的”是指在一种或多种PPO抑制剂除草剂的存在下，原卟啉原氧化酶维持其酶活性中的至少一部分的能力。原卟啉原氧化酶的酶活性可通过本领域已知的任何手段来测量，例如在一种或多种PPO抑制剂除草剂的存在下通过荧光、高效液相色谱法(HPLC)或质谱法(MS)测量原卟啉原氧化酶产物的生成量或原卟啉原氧化酶底物的消耗量来测定酶活性。“除草剂不敏感的”可以是对于特定除草剂的完全或部分不敏感性，并且可表达为对于特定PPO抑制剂除草剂的耐受性或不敏感性百分比。
本发明中术语“植物、种子、植物组织或细胞的除草剂耐受性”或“耐除草剂的植物、种子、植物组织或细胞”是指施用除草剂时，植物、种子、植物组织或细胞抵抗除草剂作用的能力。例如，耐除草剂的植物可以在除草剂的存在下存活或继续生长。植物、种子、植物组织或细胞的除草剂耐受性可以通过将植物、种子、植物组织或细胞与合适的对照进行比较来测量。例如，可以通过将除草剂施用于包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的DNA分子的植物(试验植物)和不包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的DNA分子的植物(对照植物)，然后比较两种植物的植物损伤来测量或评估除草剂耐受性，其中试验植物的除草剂耐受性由损伤率与对照植物的损伤率相比降低来指示。与对照植物、种子、植物组织或细胞相比，耐除草剂的植物、种子、植物组织或细胞对除草剂毒性作用表现出的反应降低。术语“除草剂耐受性性状”是指与野生型植物相比赋予植物改善的除草剂耐受性的转基因性状。可以产生的具有本发明的除草剂耐受性性状的植物包括，例如任何植 物，包括作物植物，诸如燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄和拟南芥。
本发明的DNA分子可以完全或部分通过本领域已知的方法合成和修饰，特别是在需要提供用于DNA操作的序列(诸如限制酶识别位点或基于重组的克隆位点)、植物优选序列(诸如植物密码子使用或Kozak共有序列)或用于DNA构建体设计的序列(诸如间隔区或接头序列)的情况下。本发明包括编码选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性、至少90％序列同一性，至少91％序列同一性，至少92％序列同一性，至少93％序列同一性，至少94％序列同一性，至少95％序列同一性，至少96％序列同一性，至少97％序列同一性，至少98％序列同一性和至少99％序列同一性的蛋白质的DNA分子，优选蛋白。术语“序列同一性百分比”或“序列同一性％”是指在两个序列进行比对时，与试验序列(或其互补链)相比，参考序列或查询序列(或其互补链)的蛋白质序列中相同氨基酸的百分比。用于序列对比的方法在本领域中是熟知的并且可以使用数学算法来完成，这些数学算法如Myers and Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比对算法；Need eman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比对算法；以及Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中的修改。对于序列比较可以利用这些数学算法的电脑实现方式以确定序列的同源性，此类实现方式包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(从Intelligenetics,Mountain View,California可获得)；ALLGN程序(版本2.0)以及GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA以及TFASTA(从Accelrys Inc.,9685 Scranton Road,San Diego,California,USA获得)。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。
本发明中所述乙氧氟草醚(oxyfluorfen)，是指2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-三氟甲基苯，为无色结晶固体。属于二苯醚类超低用量选择性、芽前芽后触杀型PPO抑制剂除草剂，可制成乳油使用。杂草主要通过胚芽鞘、中胚轴吸收药剂致死。乙氧氟草醚可以有效防治水稻、大豆、玉米、棉花、蔬菜、葡萄、果树等作物田间的杂草，可防止的杂草包括但不限于，稗草、田菁、旱雀麦、狗尾草、曼陀罗、匍匐冰草、豚草、刺黄花捻、苘麻、田芥菜单子叶和阔叶杂草。
本发明中所述有效剂量乙氧氟草醚是指180-720g ai/ha使用，包括190-700g ai/ha、250-650g ai/ha、300-600g ai/ha或400-500g ai/ha。
本发明中所述苯嘧磺草胺(saflufenacil)，是指N'-[2-氯-4-氟-5-(3-甲基-2,6-二氧-4-(三氟甲基)-3,6-二氢-1(2H)-嘧啶)苯甲酰]-N-异丙基-N-甲基硫酰胺，为浅褐色挤条颗粒状固体。属于脲嘧啶类灭生性PPO抑制剂除草剂，可制成70％水分散颗粒剂型。苯嘧磺草胺可有效防治多种阔叶杂草，包括对草甘膦、ALS和三嗪类产生抗性的杂草，其具有很快的灭生作用且土壤残留会降解迅速。
本发明中所述有效剂量苯嘧磺草胺是指以25-100g ai/ha使用，包括30-95g ai/ha、40-90g ai/ha、50-85g ai/ha或60-80g ai/ha。
本发明中所述丙炔氟草胺(Flumioxazin)，是指2-[7-氟代-3,4-二氢-3-氧代-4-(2-丙炔基)-2H-1,4-苯并嗪-6-基]-4,5,6,7-四氢-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮。属于N-苯基酞酰胺亚胺类幼芽和叶片吸收型PPO抑制剂除草剂，常用剂型为50％可湿性粉剂和48％悬浮剂。丙炔氟草胺可有效防治1年生阔叶杂草和部分禾本科杂草。其在环境中易降解，对后茬作物安全。
本发明中所述有效剂量丙炔氟草胺是指以60-240g ai/ha使用，包括70-220g ai/ha、85-200g ai/ha、90-185g ai/ha或100-150g ai/ha。
本发明中所述甲磺草胺(Sulfentrazone)，是指N-(2,4-二氯-5-(4-二氟甲基-4,5-二氢-3-甲基-5-氧代-1H-1,2,4-三唑-1-基)苯基)甲磺酰胺，为棕黄色固体。属于三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂，常用剂型为38.9％、44.5％悬浮剂。甲磺草胺可用于防治玉米、高粱、大豆、花生等田中牵牛、反枝苋、藜、曼陀罗、马唐、狗尾草、苍耳、牛筋草、香附子等1年生阔叶杂草、禾本科杂草和莎草等。
本发明中所述有效剂量甲磺草胺是指以450-900g ai/ha使用，包括500-850g ai/ha、550-700g ai/ha、500-685g ai/ha或550-650g ai/ha。
本发明中，术语“抗性”是可遗传的，并允许植物在除草剂对给定植物进行一般除草剂有效处理的情况下生长和繁殖。正如本领域技术人员所认可的，即使给定植物受到除草剂处理的一定程度损伤，如很少的坏死、溶解、萎黄或其它损伤，但至少没有在产量上有显著影响，植物仍可被认为“抗性”，也即给定植物具有的抵抗除草剂诱导的各种程度损伤的提高的能力，而在同样的除草剂剂量下一般导致相同基因型野生型植物损伤。本发明中术语“耐性”或“耐受性”比术语“抗性”更广泛，并包括“抗性”。
本发明中所述抗生物胁迫蛋白质是指抵抗由其他生物所施加的胁迫的蛋白质，如昆虫抗性蛋白质、(病毒、细菌、真菌、线虫)疾病抗性蛋白质等。
本发明中所述抗非生物胁迫蛋白质是指抵抗外界环境所施加的胁迫的蛋白质，如对除草剂、干旱、热、寒冷、冰冻、盐胁迫、氧化胁迫等具有耐性的蛋白质。
本发明中所述影响植物品质的蛋白质是指影响植物输出性状的蛋白质， 如改进淀粉、油、维生素等质量和含量的蛋白质、提高纤维品质的蛋白质等。
此外，包含编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂耐受性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂耐受性基因包括但不限于，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦氧化还原酶(GOX)、草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶(PAT)、α酮戊二酸依赖性双加氧酶(AAD)、麦草畏单加氧酶(DMO)、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、乙酰乳酸合酶(ALS)和/或细胞色素类蛋白质(P450)。
本发明中所述“草甘膦”是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的盐，用“草甘膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草甘膦的除草剂制剂进行处理。草甘膦的商业制剂包括但不限于， (作为异丙胺盐的草甘膦)、 (作为钾盐的草甘膦)、 和 (作为胺盐的草甘膦)、 (作为钠盐的草甘膦)和 (作为三甲基硫盐的草甘膦)。
本发明中所述有效剂量草甘膦是指以200-1600g ae/ha使用，包括250-1600g ae/ha、300-1600g ae/ha、500-1600g ae/ha、800-1500g ae/ha、1000-1500g ae/ha或1200-1500g ae/ha。
本发明中所述“草铵膦”又名草丁膦，是指2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵，用“草铵膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂进行处理。
本发明中所述有效剂量草铵膦是指以200-800g ae/ha使用，包括200-750g ae/ha、250-700g ae/ha、300-700g ae/ha、350-650g ae/ha或400-600g ae/ha。
本发明中植物生长素类除草剂模拟或如同称为生长素的天然植物生长调节剂起作用，其影响细胞壁可塑性和核酸代谢，从而导致不受控制的细胞分裂和生长。由植物生长素类除草剂引起的损伤症状包括茎和柄的偏上性弯曲或扭曲、叶成杯形或卷曲、以及异常的叶形状和叶脉。植物生长素类除草剂包括但不限于，苯氧基羧酸化合物、苯甲酸化合物、吡啶羧酸化合物、喹啉羧酸化合物或草除灵乙酯化合物。典型地，植物生长素类除草剂为麦草畏、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸(MCPA)和/或4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸(2,4-DB)。
本发明中所述“麦草畏”(Dicamba)是指3,6-二氯-邻-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸及其酸和盐。其盐包括异丙胺盐、二甘醇铵盐、二甲胺盐、钾盐和钠盐。麦草畏的商业制剂包括但不限于， (作为DMA盐)、 (BASF，作为DGA盐)、VEL-58-CS-11 TM和 (BASF，作为DGA盐)。
本发明中所述2,4-D是广谱、相对便宜且强力的阔叶除草剂，其已经在农业和非作物条件下用于广谱阔叶杂草控制超过65年。2,4-D对不同植物具有不同水平的选择性(如双子叶植物比禾本科植物更敏感)。通常植物缓慢代谢2,4-D，因此靶位点的不同活性更可能解释植物对2,4-D不同的应答。2,4-D的植物代谢一般通过两步代谢实现，一般是羟基化后接着与氨基酸或葡萄糖缀合。
本发明中所述发芽前选择性除草剂包括但不限于，乙酰苯胺、乙草胺、乙酰乳酸合酶抑制剂和二硝基苯胺。
本发明中所述发芽后选择性除草剂包括但不限于，烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、和精喹禾灵。
本发明中除草剂的施用量随土壤结构、pH值、有机物含量、耕作系统和杂草的大小而变化，并且通过查看除草剂标签上合适的除草剂施用量来确定。
本发明中术语“赋予”是指向植物提供特征或性状，如除草剂耐受性和/或其它所希望的性状。
本发明中术语“异源的”是指来自另一个来源。在DNA的背景下，“异源的”是指任何外来的“非自身”DNA，包括来自相同种类的另一个植物的DNA。例如，在本发明中，可以利用转基因的方法在大豆植物中表达大豆PPO基因，该大豆PPO基因仍被认为“异源的”DNA。
本发明中术语“核酸”包括涉及的单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物(例如肽核酸)，因为它们以一种类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。
本发明中，当术语“编码”或“编码的”用于一种特定核酸的上下文中时，其意指核酸包含必需的信息以指导多核苷酸序列翻译成一种特定蛋白质。用来编码蛋白质的信息通过使用密码子来详细说明。编码蛋白质的核酸可以包含在核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺少此类插入的非翻译序列(例如在cDNA中)。
编码本发明所述原卟啉原氧化酶的DNA序列用于提供本发明的植物、植物细胞以及种子，相比于不包含编码本发明所述原卟啉原氧化酶的DNA序列的相同植物(对照植物)，它们提供了对于多种PPO抑制剂除草剂较好的耐受性。
编码本发明所述原卟啉原氧化酶的基因对于产生耐受PPO抑制剂除草剂的植物是有用的。编码本发明所述原卟啉原氧化酶的基因特别适合在植物中表达，以便向植物赋予除草剂耐受性。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本发明中可互换地使用，指的是氨基酸残 基的聚合物。这些术语应用于氨基酸残基的聚合物，所述氨基酸残基的聚合物中的一个或多个氨基酸残基是一个相应的天然存在的氨基酸的一种人工化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。本发明的多肽可以从一种本发明披露的核酸或通过使用标准分子生物学技术来产生。例如，本发明的一种截短的蛋白可以通过在一种适当的宿主细胞中表达本发明的一种重组核酸，或者可选择地通过结合离体方法(如蛋白酶消化和纯化)来产生。
本发明还提供了包括编码所述原卟啉原氧化酶的核酸分子。总体上，本发明包括编码相对于所述原卟啉原氧化酶具有一个或多个保守性氨基酸替换的原卟啉原氧化酶的任何多核苷酸序列。提供功能上相似的氨基酸保守性取代是本领域技术人员所熟知的，以下五组各自包含彼此保守性取代的氨基酸：脂肪族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳香族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性的：精氨酸(I)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。
因此，具有原卟啉原氧化酶抑制剂除草剂耐受性活性并在严格条件下与本发明编码所述原卟啉原氧化酶的基因杂交的序列包括在本发明中。示例性的，这些序列与本发明序列SEQ ID NO:29-42和SEQ ID NO:62-64至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性，本发明编码所述原卟啉原氧化酶的基因不包括SEQ ID NO:15-28。
任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明PPO基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS溶液中，在65℃下与编码本发明所述原卟啉原氧化酶的基因发生特异性杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。
本发明中，术语“杂交”或“特异性杂交”是指一种分子在严格条件下仅可与特定的多核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是在该序列存在于一种复合混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时进行的。
由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响除草剂耐受性活性的序列，亦包括保留除草剂耐受性活性的片段。
术语“功能活性”或“活性”在本发明中指本发明用途的蛋白质/酶(单独或与其它蛋白质组合)具有降解或减弱除草剂活性的能力。产生本发明蛋白质的植物优选产生“有效量”的蛋白质，从而在用除草剂处理植物时，蛋白质表达的水平足以给予植物对除草剂(若无特别说明则为一般用量)完全或部分的耐受性。可以以通常杀死靶植物的用量、正常的大田用量和浓度使用除草剂。优选地，本发明的植物细胞和植物被保护免受除草剂处理引起的生长抑制或损伤。本发明的转化植物和植物细胞优选具有PPO抑制剂除草剂的耐受性，即转化的植物和植物细胞能在有效量的PPO抑制剂除草剂存在下生长。
本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、变体蛋白质、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。
本发明术语“变体”意指实质上类似的序列。对于多核苷酸，一种变体包括在参比多核苷酸之内的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或在除草剂耐受性基因中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸 的替换。本发明中术语“参比多核苷酸或多肽”对应地包括除草剂耐受性多核苷酸序列或氨基酸序列。本发明中术语“天然多核苷酸或多肽”对应地包括天然发生的多核苷酸序列或氨基酸序列。对于核酸分子，保守型变体包括编码本发明所述原卟啉原氧化酶之一的多核苷酸序列(由于遗传密码的简并性)。如这些天然发生的等位基因变体可以使用熟知的分子生物学技术，例如使用以下概述的聚合酶链式反应(PCR)以及杂交技术来鉴定。变体核酸分子还包括合成衍生的核酸分子，例如通过使用定点诱变产生的但是仍然编码本发明的一种原卟啉原氧化酶的核酸序列。通常，本发明的一种特定的核酸分子的变体将具有与该特定的核酸分子至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同源性，通过序列对比程序和参数来确定同源性。
本发明中“变体蛋白质”意指从一种参比蛋白通过在所述原卟啉原氧化酶中的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失或添加和/或在所述原卟啉原氧化酶中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的替换而衍生的一种蛋白质。由本发明涵盖的变体蛋白是生物学活性的，即它们继续具有本发明所述原卟啉原氧化酶的所希望的活性，即，仍具有所述的原卟啉原氧化酶活性和/或除草剂耐性。此类变体可以产生于例如遗传多态性或产生于人工操作。本发明的一种所述原卟啉原氧化酶的生物活性变体将具有与该所述原卟啉原氧化酶的氨基酸序列的全部的至少大约88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同源性，此同源性通过序列比对程序和参数所确定。本发明的一种蛋白质的一种生物活性变体可能不同于以少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(如6-10个)、少至5个(如4、3、2个、或甚至1个)氨基酸残基的蛋白质。
在某些实施例中，编码本发明所述原卟啉原氧化酶或它们的保留了原卟啉原氧化酶活性的变体的原卟啉原氧化酶的核酸序列可以与任何感兴趣的核酸序列的组合进行叠加从而产生具有一种所希望的性状的植物。术语“性状”是指从特定的序列或序列组得到的表型。例如，编码本发明所述原卟啉原氧化酶或保留原卟啉原氧化酶活性的变体的原卟啉原氧化酶的核酸序可以与任何其他的编码赋予一种所希望的性状的多肽的核酸进行叠加，所述性状包括但不限于：对于疾病、昆虫以及除草剂的抗性，对于热和干旱的耐受性，缩短作物成熟时间、改进工业加工(例如，用于将淀粉或生物质转化为可发酵的糖类)以及改进的农艺学品质(例如，高油含量和高蛋白含量)。
本领域技术人员所熟知的，两种或更多作用模式的组合在提高受控杂草谱和/或天然更具耐受性物种或抗性杂草物种上的益处还可扩展到通过人工(转基因或非转基因)在作物中产生除PPO耐受性作物外的除草剂耐受性的 化学品。事实上，可以单独或以多重组合叠加编码以下抗性的性状以提供有效控制或防止杂草演替对除草剂产生抗性能力：草甘膦抗性(如抗性植物或细菌EPSPS、GOX、GAT)、草铵膦抗性(如PAT、Bar)、乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂抗性(如咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸和其它化学品抗性基因如AHAS、Csrl、SurA等)、苯氧基生长素类除草剂抗性(如芳氧基链烷酸酯双加氧酶-AAD)、麦草畏除草剂抗性(如麦草畏单加氧酶-DMO)、溴草腈抗性(如Bxn)、对八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂的抗性、对光系统Ⅱ抑制性除草剂的抗性(如psbA)、对光系统Ⅰ抑制性除草剂的抗性、对4-羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制性除草剂抗性(如HPPD)、对苯脲除草剂的抗性(如CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶等等。
草甘膦被广泛地使用，因为它控制非常广谱的阔叶和禾本科杂草物种。然而，在草甘膦耐性作物和非作物应用中重复使用草甘膦已经(而且仍将继续)选择使杂草演替为天然更具有耐性的物种或草甘膦抗性生物型。多数除草剂抗性管理策略建议使用有效用量的罐混除草剂伴侣作为延缓出现抗性杂草的方法，所述除草剂伴侣提供对同一物种的控制，但具有不同的作用模式。将编码本发明所述原卟啉原氧化酶的基因与草甘膦耐性性状(和/或其他除草剂耐性性状)叠加可通过允许对同一作物选择性使用草甘膦和PPO抑制剂除草剂(如乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺和丙炔氟草胺)而实现对草甘膦耐性作物中草甘膦抗性杂草物种(被一种或多种PPO抑制剂除草剂控制的阔叶杂草物种)的控制。这些除草剂的应用可以是在含有不同作用模式的两种或更多除草剂的罐混合物中同时使用、在连续使用(如种植前、出苗前或出苗后)中单个除草剂组合物的单独使用(使用的间隔时间范围从2小时到3个月)，或者备选地，可以在任何时间(从种植作物7个月内到收获作物时(或对于单个除草剂为收获前间隔，取最短者))使用代表可应用每种化合类别的任意数目除草剂的组合。
在控制阔叶杂草中具有灵活性是很重要的，即使用时间、单个除草剂用量和控制顽固或抗性杂草的能力。作物中与草甘膦抗性基因/编码本发明所述原卟啉原氧化酶的基因叠加的草甘膦应用范围可以从250至2500g ae/ha；PPO抑制剂除草剂(一种或多种)可按照从10-1000g ai/ha。这些应用的时间的最佳组合取决于具体的条件、物种和环境。
除草剂制剂(如酯、酸或盐配方或可溶浓缩剂、乳化浓缩剂或可溶液体)和罐混添加剂(如佐剂或相容剂)可显著影响给定的除草剂或一种或多种除草剂的组合的杂草控制。任意前述除草剂的任意化学组合均在本发明的范围内。
此外，可以将编码本发明所述原卟啉原氧化酶的基因单独或与其它除草 剂耐受作物特征叠加后再与一种或多种其它输入(如昆虫抗性、真菌抗性或胁迫耐受性等)或输出(如提高的产量、改进的油量、提高的纤维品质等)性状叠加。因此，本发明可用于提供以灵活且经济地控制任何数目的农学害虫的能力和提高作物品质的完整农学解决方案。
这些叠加的组合可以通过任何方法来产生，这些方法包括但不限于：通过常规的或顶交方法的杂交育种植物或遗传转化。如果这些序列是通过遗传转化这些植物来进行叠加的，所感兴趣的多核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包括一个或多个所希望的性状的转基因植物可以用做通过后续转化而引入另外性状的靶标。这些性状可以在一个共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的感兴趣的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入两个序列，这两个序列可以包含在分开的表达盒(反式)中或包含在相同的表达盒(顺式)中。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。在某些情况下，可能希望的是引入一个抑制所感兴趣的多核苷酸的表达的表达盒。这可以与其他的抑制表达盒或过量表达盒的任何组合进行组合以在该植物中产生所希望的性状组合。进一步认识到的是，多核苷酸序列可以在一个所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行叠加。
本发明编码所述原卟啉原氧化酶的基因对PPO抑制剂除草剂具有较高的耐受性，是重要的除草剂耐受作物和选择标记物特征可能性的基础。
本发明中术语“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指引一种特定多核苷酸序列表达的一种核酸分子，包括有效连接到感兴趣的多核苷酸序列(即，一种单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合而编码一种本发明所述原卟啉原氧化酶或保留了原卟啉原氧化酶活性的变体蛋白的多核苷酸)的启动子，该感兴趣的多核苷酸序列有效连接到终止信号。该编码区通常对一种感兴趣的蛋白质进行编码，但是还可以对一种感兴趣的功能性RNA进行编码，例如在正义或反义方向上的反义RNA或一种非翻译RNA。包含该感兴趣的多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少一个它的组分相对于至少一个它的其他组分是异源的。该表达盒还可以是一种天然发生的表达盒，但一定是以在对异源表达有用的重组体形式而获得的。然而，典型地，该表达盒对于宿主是异源的，即，该表达盒的特定DNA序列并不天然发生于该宿主细胞中，并且必须已通过转化事件而被引入新宿主细胞中。在该表达盒中多核苷酸序列的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特殊的外界刺激时才引发转录。另外，该启动子对于一种特定的组织或器官或发育阶段也是特异性的。
本发明涵盖了用能够表达一种感兴趣的多核苷酸(即一种单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合而编码一种本发明所述原卟啉原氧化酶或它的保留了原卟啉原氧化酶活性的变体蛋白的多核苷酸)的表达盒来转化植物。该表达盒在5’-3’的转录方向上包括转录和翻译的起始区(即启动子)和多核苷酸开放阅读框。该表达盒可以任选地包括在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。在一些实施方案中，该表达盒包括一种选择标记基因从而允许选择稳定的转化体。本发明的表达构建体还可以包括前导序列和/或允许感兴趣的多核苷酸的诱导型表达的序列。
该表达盒的调控序列有效连接到感兴趣的多核苷酸。本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到编码所述原卟啉原氧化酶基因的调节序列。
所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。
所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列。
所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒 (CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。
对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Act1内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。
所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ(pinⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
在本发明中，术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由之再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物簇以及 在植物或以下植物的部分中完整的植物细胞，这些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药等等。
本发明所述PPO蛋白可应用于多种植物中，所述双子叶植物包括但不限于苜蓿、菜豆、花椰菜、甘蓝、胡萝卜、芹菜、棉花、黄瓜、茄子、莴苣、甜瓜、豌豆、胡椒、西葫芦、萝卜、油菜、菠菜、大豆、南瓜、番茄、拟南芥、花生或西瓜；优选地，所述双子叶植物是指黄瓜、大豆、拟南芥、烟草、棉花、花生或油菜。所述单子叶植物包括但不限于玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、粟、甘蔗、燕麦或草坪草；优选地，所述单子叶植物是指玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、粟、甘蔗或燕麦。
在本发明中术语“植物转化”是指将一种抗或耐受除草剂的编码本发明所述原卟啉原氧化酶的核酸分子单独地或与编码赋予所希望的性状的多肽的一种或多种额外的核酸分子结合而克隆到一个表达系统中，它就是被转化到了一种植物细胞中。本发明的受体和目标表达盒可以以多种公知的方法被引入到植物细胞中。在多核苷酸的背景下，术语“引入”(例如，感兴趣的核苷酸构建体)旨在表示以这样一种方式将多核苷酸提供给该植物，使得该多核苷酸获得对一种植物细胞的内部的接近或实现。其中有待引入一个以上的多核苷酸，这些多核苷酸可以作为单个核苷酸构建体的部分而进行组装，或者作为分开的核苷酸构建体，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，或作为育种方案的一部分，例如在植物中的在一个单一的转化事件中、在分开的转化事件中可以将这些多核苷酸引入到感兴趣的宿主细胞中。本发明的这些方法并不取决于一种用于引入一个或多个多核苷酸到植物中的具体方法，仅仅是获得这个或这些多核苷酸对于植物的至少一个细胞的内部的接近或实现。在本领域中已知的用于将一个或多个多核苷酸引入到植物中的方法包括但不限于瞬时转化方法、稳定转化方法、病毒介导的方法或基因组编辑技术。
术语“稳定转化”是指将外源基因导入植物基因组，且稳定地整合进该植物及其任何连续世代的基因组中，导致外源基因稳定遗传。
术语“瞬时转化”是指核酸分子或蛋白质导入植物细胞中，执行功能但不整合进植物基因组中，导致外源基因不能稳定遗传。
术语“基因组编辑技术”是指能够对基因组序列进行精确操作，实现基因定点突变、插入、删除等操作的基因组修饰技术。目前基因组编辑技术主要有HE(homing endonuclease，归巢核酸内切酶)、ZFN技术(Zinc-finger nuclease，锌指核酸酶)、TALEN技术(transcription activator-like effector nuclease，转录激活样效应因子核酸酶)、CRISPR技术(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，成簇规律间隔短回文重复)。
对本领域技术人员而言，用于植物转化的可获得的众多转化载体是已知的，并且与本发明有关的基因可以与任何上述载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标种类。对于某些目标种类，可以优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括赋予对卡那霉素以及相关抗生素或相关除草剂的抗性的nptll基因(此基因被Bevan等人于1983年发表在《自然科学》第304卷184-187页)、赋予对除草剂草丁膦(还被称作草铵膦；参见White等人于1990年发表于《Nucl.AcidsRes》第18卷1062页、Spencer等人于1990年发表于《Theor.Appl.Genet》第79卷625-631页以及美国专利5561236和5276268)抗性的pat和bar基因，赋予对抗生素潮霉素的抗性的hpn基因(Blochinger&Diggelmann,Mol.Cell Biol.4:2929-2931)以及赋予对甲氨蝶呤的抗性的dnfr基因(Bourouis等人1983年于《EMBO J.》第2卷1099-1104页)、赋予对草甘膦的抗性的EPSPS基因(美国专利4940935和5188642)、也赋予对草甘膦的抗性的草甘膦N-乙酰基转移酶(GAT)基因(Castle等人于2004年在《Science》第304卷1151-1154页；美国申请公开专利20070004912，20050246798和20050060767中有描述)以及提供代谢甘露糖的6-磷酸甘露糖异构酶基因(美国专利5767378和5994629有描述)。
用于再生植物的方法在本领域也是熟知的。例如，已经利用Ti质粒载体用于传送外源DNA，以及直接DNA摄入、脂质体、电穿孔、显微注射以及微弹。
本发明中，所述杂草是指在田地中与耕种的转基因植物竞争的植物。
本发明术语“控制”和/或“防治”是指至少将有效剂量的PPO抑制剂除草剂直接施用(例如通过喷雾)到田地中，使杂草发育最小化和/或停止生长。同时，耕种的转基因植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成；优选地，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。所述具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的茎秆抗性、和/或提高的籽粒重量等。所述原卟啉原氧化酶对杂草的“控制”和/或“防治”作用是可以独立存在的，不因其它可“控制”和/或“防治”杂草的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物(含有编码本发明所述原卟啉原氧化酶的基因)的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，所述原卟啉原氧化酶和/或可控制杂草的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响所述原卟啉原氧化酶对杂草的“控制”和/或“防治”作用，也不能导致所述“控制”和/或“防治”作用完全和/或部分由所述另一种物质实现，而与所述原卟啉原氧化酶无关。
本发明中所述的“植物繁殖体”包括但不限于植物有性繁殖体和植物无性 繁殖体。所述植物有性繁殖体包括但不限于植物种子；所述植物无性繁殖体是指植物体的营养器官或某种特殊组织，其可以在离体条件下产生新植株；所述营养器官或某种特殊组织包括但不限于根、茎和叶，例如：以根为无性繁殖体的植物包括草莓和甘薯等；以茎为无性繁殖体的植物包括甘蔗和马铃薯(块茎)等；以叶为无性繁殖体的植物包括芦荟和秋海棠等。
本发明可赋予植物新除草剂抗性性状，并且未观察到对表型包括产量的不良影响。本发明中植物能耐受住如至少一种受试除草剂2×、3×或4×一般应用水平。这些耐性水平的提高在本发明的范围之内。例如可对本领域已知的多种技术进行可预见到的优化和进一步发展，以增加给定基因的表达。
本发明提供了一种原卟啉原氧化酶的用途，具有以下优点：
1、对除草剂耐受性广。本发明首次公开了原卟啉原氧化酶PPO1-PPO14可以对PPO抑制剂除草剂表现出较高的耐受性，因此在植物上应用前景广阔。
2、对除草剂耐受性强。本发明所述原卟啉原氧化酶PPO1-PPO14对PPO抑制剂除草剂的耐受性强，其对4倍大田浓度的乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺和丙炔氟草胺以及2倍大田浓度的甲磺草胺几乎全部表现出高抗的耐受性。
3、对产量影响小。植物对除草剂的耐受性与植物的产量有直接对应关系，高抗植物基本不会受除草剂的影响从而不会影响植物的产量，而中低抗植物的产量相对高抗植物会缩减很多。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明含有所述PPO1A核苷酸序列的拟南芥重组表达载体DBN12337结构示意图；
图2为本发明对照重组表达载体DBN12337N结构示意图；
图3为本发明含有所述PPO1B核苷酸序列的玉米重组表达载体DBN12354结构示意图；
图4为本发明对照重组表达载体DBN12354N结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明原卟啉原氧化酶的用途的技术方案。
第一实施例、转基因拟南芥植株的获得和验证
1、获得编码原卟啉原氧化酶的基因
微生物原卟啉原氧化酶PPO1、PPO2、PPO3、PPO4、PPO5、PPO6、PPO7、PPO8、PPO9、PPO10、PPO11、PPO12、PPO13和PPO14的氨基酸序列，如 序列表中SEQ ID NO:1-14所示，编码相应于所述原卟啉原氧化酶PPO1-PPO14的PPO1-PPO14核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:15-28所示；依据拟南芥和大豆共同偏好性密码子获得编码相应于所述原卟啉原氧化酶PPO1-PPO14的PPO1A-PPO14A核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:29-42所示；依据玉米偏好性密码子获得编码相应于所述原卟啉原氧化酶PPO1、PPO6和PPO12的PPO1B、PPO6B和PPO12B核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:62-64所示。
大肠杆菌(Escherichia coli)原卟啉原氧化酶PPO-EC的氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO:43所示；编码相应于所述大肠杆菌原卟啉原氧化酶PPO-EC的PPO-EC核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:44所示；依据拟南芥和大豆共同偏好性密码子获得编码相应于所述大肠杆菌原卟啉原氧化酶PPO-EC的PPO-ECA核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:45所示。
拟南芥原卟啉原氧化酶PPO-AT的氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO:46所示；编码相应于所述拟南芥原卟啉原氧化酶PPO-AT的PPO-AT核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:47所示；依据拟南芥和大豆共同偏好性密码子获得编码相应于所述拟南芥原卟啉原氧化酶PPO-AT的PPO-ATA核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:48所示。
烟粉虱共生菌(Arsenophonus)原卟啉原氧化酶PPO-AP的氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO:65所示；编码相应于所述烟粉虱共生菌原卟啉原氧化酶PPO-AP的PPO-AP核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:66所示；依据拟南芥和大豆共同偏好性密码子获得编码相应于所述烟粉虱共生菌原卟啉原氧化酶PPO-AP的PPO-APA核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:67所示；依据玉米偏好性密码子获得编码相应于所述烟粉虱共生菌原卟啉原氧化酶PPO-AP的PPO-APB核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:68所示。
2、合成上述核苷酸序列
将所述PPO1A-PPO14A核苷酸序列、PPO-ECA核苷酸序列、PPO-ATA核苷酸序列和PPO-APA核苷酸序列(SEQ ID NO:29-42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:67)的5’和3’端分别连接通用接头引物1：
5’端通用接头引物1：5’-taagaaggagatatacatatg-3’如序列表中SEQ ID NO:49所示；
3’端通用接头引物1：5’-gtggtggtggtggtgctcgag-3’如序列表中SEQ ID NO:50所示。
3、分别构建含有PPO1A-PPO14A核苷酸序列、PPO-ECA核苷酸序列、PPO-ATA核苷酸序列和PPO-APA核苷酸序列的拟南芥重组表达载体
利用限制性内切酶Spe I和Asc I对植物表达载体DBNBC-01进行双酶切 反应，从而对植物表达载体线性化，酶切产物纯化得到线性化的DBNBC-01表达载体骨架(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))，将连接所述通用接头引物1的所述PPO1A核苷酸序列(SEQ ID NO:29)与所述线性化的DBNBC-01表达载体骨架进行重组反应，操作步骤按照Takara公司In-Fusion无缝连接产品试剂盒(Clontech，CA，USA，CAT：121416)说明书进行，构建成重组表达载体DBN12337，其结构示意图如图1所示(Spec：壮观霉素基因；RB：右边界；eFMV：玄参花叶病毒的34S增强子(SEQ ID NO:51)；prBrCBP：油菜真核延长因子基因1α(Tsf1)的启动子(SEQ ID NO:52)；spAtCTP2：拟南芥叶绿体转运肽(SEQ ID NO:53)；EPSPS：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID NO:54)；tPsE9：豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID NO:55)；prAtUbi10：拟南芥泛素(Ubiquitin)10基因的启动子(SEQ ID NO:56)；spAtCLP1：拟南芥白化体或浅绿色体转运肽(SEQ ID NO:57)；PPO1A：PPO1A核苷酸序列(SEQ ID NO:29)；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:58)；pr35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:59)；cPAT：膦丝菌素N-乙酰基转移酶基因(SEQ ID NO:60)；t35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:61)；LB：左边界)。
将重组表达载体DBN12337用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μL大肠杆菌T1感受态细胞、10μL质粒DNA(重组表达载体DBN12337)，42℃水浴30s；37℃振荡培养1h(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L壮观霉素(Spectinomycin)的所述LB固体平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12h，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、壮观霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入200μL新配制的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μL冰冷的溶液III(3M醋酸钾、5M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μL含RNase(20μg/mL)的TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。将提取的质粒进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN12337在Spe I和Asc I位点间的核苷酸序列为序 列表中SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列，即所述PPO1A核苷酸序列。
按照上述构建重组表达载体DBN12337的方法，将分别连接所述通用接头引物1的所述PPO2A-PPO14A核苷酸序列、PPO-ECA核苷酸序列、PPO-ATA核苷酸序列和PPO-APA核苷酸序列分别与所述线性化的DBNBC-01表达载体骨架进行重组反应，依次得到重组表达载体DBN12338至DBN12353。测序验证重组表达载体DBN12338至DBN12353中上述核苷酸序列正确插入。
按照上述构建重组表达载体DBN12337的方法，构建对照重组表达载体DBN12337N，其载体结构如图2所示(Spec：壮观霉素基因；RB：右边界；eFMV：玄参花叶病毒的34S增强子(SEQ ID NO:51)；prBrCBP：油菜真核延长因子基因1α(Tsf1)的启动子(SEQ ID NO:52)；spAtCTP2：拟南芥叶绿体转运肽(SEQ ID NO:53)；EPSPS：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID NO:54)；tPsE9：豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID NO:55)；pr35S：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:59)；cPAT：膦丝菌素N-乙酰基转移酶基因(SEQ ID NO:60)；t35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:61)；LB：左边界)。
4、拟南芥重组表达载体转化农杆菌
对己经构建正确的重组表达载体DBN12337至DBN12350、DBN12352、DBN12353和上述对照重组表达载体DBN12337N分别用液氮法转化到农杆菌GV3101中，其转化条件为：100μL农杆菌GV3101、3μL质粒DNA(重组表达载体DBN12337至DBN12350、DBN12352、DBN12353、DBN12337N)；置于液氮中10min，37℃温水浴10min；将转化后的农杆菌GV3101接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2h，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的壮观霉素的所述LB固体平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，将提取的质粒进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN12337至DBN12350、DBN12352、DBN12353、DBN12337N结构完全正确。
5、转基因拟南芥植株的获得
将野生型拟南芥种子悬浮于0.1％(w/v)琼脂糖溶液中。将悬浮的种子在4℃下保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步萌发。用蛭石混合马粪土并用水地下灌溉至湿润，使土壤混合物排水24h。将预处理后的种子种在土壤混合物上并用保湿罩覆盖7天。使种子萌发并在恒温(22℃)恒湿(40-50％)光强度为120-150μmol/m 2s -1的长日照条件(16h光照/8h黑暗)下在温室中培养植物。开始用霍格兰营养液灌溉植物，接着用去离子水灌溉，保持土壤潮湿但不湿透。
使用花浸泡法转化拟南芥。用选取的农杆菌菌落接种一份或多份15-30mL含壮观霉素(50mg/L)和利福平(10mg/L)的LB培养液的预培养物。以220rpm转速将预培养物在温度28℃恒速摇动孵育过夜。每个预培养物用于接种两份500ml含壮观霉素(50mg/L)和利福平(10mg/L)的所述YEP培养液的培养物并将培养物在温度28℃持续摇动孵育过夜。室温以转速约4000rpm离心20min沉淀细胞，弃去得到的上清液。将细胞沉淀轻柔重悬于500mL渗透培养基中，所述渗透培养基含有1/2×MS盐/B5维生素、10％(w/v)蔗糖、0.044μM苄氨基嘌呤(10μL/L(1mg/mL DMSO中的原液))和300μL/L Silvet L-77。将约1月龄的拟南芥植物在含重悬细胞的渗透培养基中浸泡5min，确保浸没最新的花序。接着将拟南芥植物侧面放倒并覆盖，黑暗环境下保湿24h后，在温度22℃以16h光照/8h黑暗的光周期正常培养拟南芥植物。约4周后收获种子。
将新收获的(PPO1A-PPO14A核苷酸序列、PPO-ATA核苷酸序列、PPO-APA核苷酸序列和对照载体DBN12337N)T 1种子在室温干燥7天。将种子种在26.5cm×51cm萌发盘中，每盘接受200mg T 1种子(约10000个种子)，所述种子事先已悬浮于蒸馏水中并在温度4℃下保存2天以完成对休眠的需要以保证种子同步萌发。
用蛭石混合马粪土并用水底部灌溉至湿润，利用重力排水。用移液管将预处理后的种子均匀地种在土壤混合物上，并用保湿罩覆盖4-5天。在使用出苗后喷洒草铵膦(选择共转化的PAT基因)进行最初转化体选择的前1天移去罩。
在7个种植天数后(DAP)并于11DAP再次使用DeVilbiss压缩空气喷嘴以10mL/盘(703L/ha)的喷洒体积用Liberty除草剂(200g ai/L的草铵膦)的0.2％溶液喷洒T 1植物(分别为子叶期和2-4叶期)，以提供每次应用280g ai/ha有效量的草铵膦。在最后喷洒后4-7天鉴定存活株(生长活跃的植物)，并分别移植到用马粪土和蛭石制备的7cm×7cm的方盆中(每盘3-5棵)。用保湿罩覆盖移植的植物3-4天，并如前置于温度22℃培养室中或直接移入温室。接着移去罩并在测试PPO1A-PPO14A核苷酸序列、PPO-ATA核苷酸序列、PPO-APA核苷酸序列和对照载体提供PPO抑制剂除草剂耐受性的能力之前至少1天将植物栽种到温室(温度22±5℃，50±30％RH，14h光照:10h黑暗，最小500μE/m 2s -1天然+补充光)。
6、转基因拟南芥植株的除草剂耐受性效果检测
首先使用草铵膦除草剂选择已转化的拟南芥T 1植株。分别将转入PPO1A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO1A)、转入PPO2A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO2A)、转入PPO3A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO3A)、 转入PPO4A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO4A)、转入PPO5A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO5A)、转入PPO6A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO6A)、转入PPO7A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO7A)、转入PPO8A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO8A)、转入PPO9A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO9A)、转入PPO10A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO10A)、转入PPO11A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO11A)、转入PPO12A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO12A)、转入PPO13A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO13A)、转入PPO14A核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO14A)、转入PPO-ATA核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO-ATA)、转入PPO-APA核苷酸序列的拟南芥T 1植株(PPO-APA)、转入对照载体的拟南芥T 1植株(对照载体)和野生型拟南芥植株(CK)各24株(播种后18天)分别用3种浓度的乙氧氟草醚(180g ai/ha(1倍大田浓度，1×)、720g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))、3种浓度的苯嘧磺草胺(25g ai/ha(1倍大田浓度，1×)、100g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))、3种浓度的丙炔氟草胺(60g ai/ha(1倍大田浓度，1×)、240g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))和3种浓度的甲磺草胺(450g ai/ha(1倍大田浓度，1×)、900g ai/ha(2倍大田浓度，2×)和0g ai/ha(水，0×))进行喷洒以检测拟南芥的除草剂耐受性。在喷施7天(7DAT)后，根据植株平均损伤百分比等级(植株平均损伤百分比＝叶片损伤面积/叶片总面积×100％)来评价除草剂对每株植株的损伤程度，即药害等级：0级为生长状况和喷施空白溶剂(水)基本一致，1级为植株平均损伤百分比小于10％，2级为植株平均损伤百分比大于10％，3级为植株平均损伤百分比为100％。以植株生长状况划入0级和1级的为高抗植株，以植株生长状况划入2级的为中低抗植株，以植株生长状况划入3级的为不抗植株。实验结果如表1-4所示。
表1、转入PPO1A-PPO14A核苷酸序列、PPO-APA核苷酸序列和PPO-ATA核苷酸序列的拟南芥T 1植株对乙氧氟草醚的耐受性实验结果
对于拟南芥，180g ai/ha乙氧氟草醚除草剂是将敏感植物与具有平均抗性水平的植物区分开来的有效剂量。表1的结果表明，对于不同浓度的乙氧氟草醚，相比于对照载体和CK，PPO1A-PPO14A全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APA和PPO-ATA基本不具有耐受性。
表2、转入PPO1A-PPO14A核苷酸序列、PPO-APA核苷酸序列、PPO-ATA核苷酸序列和对照载体的拟南芥T 1植株对苯嘧磺草胺的耐受性实验结果
对于拟南芥，25g ai/ha苯嘧磺草胺除草剂是将敏感植物与具有平均抗性水平的植物区分开来的有效剂量。表2的结果表明，相比于对照载体和CK，(1)对于1倍大田浓度的苯嘧磺草胺，PPO1A-PPO14A全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APA和PPO-ATA均不具有耐受性；(2)对于4倍大田浓度的苯嘧磺草胺，PPO1A-PPO7A和PPO9A-PPO14A全部表现出高抗的耐受性(PPO8A中仅有2株表现出中低抗的耐受性，其他22株植株全部表现出高抗的耐受性)，而PPO-APA和PPO-ATA均不具有耐受性。
表3、转入PPO1A-PPO14A核苷酸序列、PPO-APA核苷酸序列、PPO-ATA核苷酸序列和对照载体的拟南芥T 1植株对丙炔氟草胺的耐受性实验结果
对于拟南芥，60g ai/ha丙炔氟草胺除草剂是将敏感植物与具有平均抗性水平的植物区分开来的有效剂量。表3的结果表明，对于不同浓度的丙炔氟草胺，相比于对照载体和CK，PPO1A-PPO14A全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APA和PPO-ATA基本不具有耐受性。
表4、转入PPO1A-PPO14A核苷酸序列、PPO-APA核苷酸序列、PPO-ATA核苷酸序列和对照载体的拟南芥T 1植株对甲磺草胺的耐受性实验结果
对于拟南芥，450g ai/ha甲磺草胺除草剂是将敏感植物与具有平均抗性水平的植物区分开来的有效剂量。表4的结果表明，对于不同浓度的甲磺草胺，相比于对照载体和CK，PPO1A-PPO14A全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APA和PPO-ATA均不具有耐受性。
第二实施例、转基因大豆植株的获得和验证
1、重组表达载体转化农杆菌
将第一实施例3中含有所述PPO1A核苷酸序列、PPO6A核苷酸序列、PPO12A核苷酸序列、PPO-ECA核苷酸序列和PPO-APA核苷酸序列的所述重组表达载体DBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351和DBN12353以及第一实施例3中的对照重组表达载体DBN12337N分别用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10min，37℃温水浴10min；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2h，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的壮观霉素的所述LB固体平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，将提取的质粒进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351、DBN12353和对照重组表达载体DBN12337N结构完全正确。
2、获得转基因大豆植株
按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的大豆品种中黄13的子叶节组织与本实施例1中所述的农杆菌分别进行共培养，以将本实施例1中重组表达载体DBN12337、DBN12342、DBN12348、DBN12351、DBN12353和对照重组表达载体DBN12337N中的T-DNA(包括玄参花叶病毒的34S增强子序列、油菜真核延长因子基因1α(Tsf1)启动子序列、拟南芥叶绿体转运肽序列、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因、豌豆RbcS基因的终止子序列、拟南芥泛素(Ubiquitin)10基因启动子序列、拟南芥白化体或浅绿色体转运肽、PPO1A核苷酸序列、PPO6A核苷酸序列、PPO12A核苷酸序列、PPO-ECA核苷酸序列、PPO-APA核苷酸序列、胭脂碱合成酶基因的终止子序列、花椰菜花叶病毒35S启动子序列、膦丝菌素N-乙酰基转移酶基因、花椰菜花叶病毒35S终止子序列)转入到大豆染色体组中，分别获得了转入PPO1A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO6A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO12A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO-ECA核苷酸序列的大豆植株、转入PPO-APA核苷酸序列的大豆植株和转入对照载体DBN12337N的大豆植株。
对于农杆菌介导的大豆转化，简要地，将成熟的大豆种子在大豆萌发培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、琼脂8g/L，pH5.6)中进行萌发，将种子接种于萌发培养基上，按以下条件培养：温度25±1℃；光周期(光/暗)为16/8h。萌发4-6天后取鲜绿的子叶节处膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3-4mm处切去下胚轴，纵向切开子叶，去顶芽、侧芽和种子根。用解剖刀的刀背在子叶节处进行创伤，用农杆菌悬浮液接触创伤过的子叶节组织，其中农杆菌能够将所述PPO1A核苷酸序列、PPO6A核苷酸序列、PPO12A核苷酸序列、PPO-ECA核苷酸序列或PPO-APA核苷酸序列分别传递至创伤过的 子叶节组织(步骤1：侵染步骤)，在此步骤中，子叶节组织优选地浸入农杆菌悬浮液(OD 660＝0.5-0.8，侵染培养基(MS盐2.15g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2-吗啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素(ZT)2mg/L，pH5.3)中以启动接种。子叶节组织与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，子叶节组织在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、MES 4g/L、ZT 2mg/L、琼脂8g/L，pH5.6)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、ZT 2mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L，pH5.6)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素150-250mg/L)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，子叶节再生的组织块在含选择剂(草甘膦)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有选择剂的筛选固体培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L、N-(膦羧甲基)甘氨酸0.25mol/L，pH5.6)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，转化的细胞再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的子叶节再生的组织块在固体培养基(B5分化培养基和B5生根培养基)上培养以再生植物。
筛选得到的抗性组织块转移到所述B5分化培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、ZT 1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素1mg/L、生长素1mg/L、N-(膦羧甲基)甘氨酸0.25mol/L，pH5.6)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述B5生根培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、吲哚-3-丁酸(IBA)1mg/L)，在生根培养上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于26℃下培养16h，再于20℃下培养8h。
3、用TaqMan验证转基因大豆植株
取分别转入PPO1A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO6A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO12A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO-ECA核苷酸序列的大豆植株、转入PPO-APA核苷酸序列的大豆植株和转入对照载体DBN12337N的大豆植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测EPSPS 基因拷贝数以确定PPO基因的拷贝数。同时以野生型大豆植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
检测EPSPS基因拷贝数的具体方法如下：
步骤11、分别取转入PPO1A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO6A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO12A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO-ECA核苷酸序列的大豆植株、转入PPO-APA核苷酸序列的大豆植株、转入对照载体DBN12337N的大豆植株和野生型大豆植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；
步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；
步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μL；
步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型大豆植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
以下引物和探针用来检测EPSPS基因序列：
引物1：ctggaaggcgaggacgtcatcaata如序列表中SEQ ID NO:69所示；
引物2：tggcggcattgccgaaatcgag如序列表中SEQ ID NO:70所示；
探针1：atgcaggcgatgggcgcccgcatccgta如序列表中SEQ ID NO:71所示；
PCR反应体系为：
所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μL，100μM浓度的探针50μL和860μL 1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。
PCR反应条件为：
利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。
通过分析EPSPS基因拷贝数的实验结果，进而证实PPO1A核苷酸序列、PPO6A核苷酸序列、PPO12A核苷酸序列、PPO-ECA核苷酸序列、PPO-APA核苷酸序列和对照载体DBN12337N均己整合到所检测的大豆植株的染色体组中，而且分别转入PPO1A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO6A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO12A核苷酸序列的大豆植株、转入PPO-ECA核苷酸序列的大豆植株、转入PPO-APA核苷酸序列的大豆植株和转入对照载体DBN12337N的大豆植株均获得了单拷贝的转基因大豆植株。
4、转基因大豆植株的除草剂耐受性效果检测
取转入PPO1A核苷酸序列的大豆植株(PPO1A)、转入PPO6A核苷酸序列的大豆植株(PPO6A)、转入PPO12A核苷酸序列的大豆植株(PPO12A)、转入PPO-ECA核苷酸序列的大豆植株(PPO-ECA)、转入PPO-APA核苷酸序列的大豆植株(PPO-APA)、转入对照载体的大豆植株(对照载体)和野生型大豆植株(CK)各16株(播种后18天)，分别用3种浓度的苯嘧磺草胺(50g ai/ha(2倍大田浓度，2×)、100g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))、3种浓度的乙氧氟草醚(360g ai/ha(2倍大田浓度，2×)、720g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))和3种浓度的丙炔氟草胺(120g ai/ha(2倍大田浓度，2×)、240g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))进行喷洒以检测大豆植株的除草剂耐受性。按照上述第一实施例6中的方法，在喷施7天(7DAT)后，根据植株平均损伤百分比等级来评价除草剂对每株植株的损伤程度。实验结果如表5-7所示。
表5、转基因大豆植株对苯嘧磺草胺的耐受性实验结果
表5的结果表明，(1)相比于对照载体和CK，PPO1A、PPO6A、PPO12A和PPO-ECA均能够对苯嘧磺草胺产生不同程度的耐受性，而PPO-APA对苯嘧磺草胺基本不具有耐受性；(2)对于2倍大田浓度的苯嘧磺草胺，PPO1A、PPO6A和PPO12A的药害等级均为0级，而PPO-ECA中约有44％植株的药害等级为1级；(3)对于4倍大田浓度的苯嘧磺草胺，PPO1A、PPO6A和PPO12A全部表现出高抗的耐受性，而PPO-ECA中约有31％植株表现出中低抗的耐受性。
表6、转基因大豆植株对乙氧氟草醚的耐受性实验结果
表6的结果表明，相比于对照载体和CK，(1)对于2倍大田浓度的乙氧氟草醚，PPO1A、PPO6A、PPO12A和PPO-ECA均表现出高抗的耐受性，而 PPO-APA中有50％植株不具有耐受性；(2)对于4倍大田浓度的乙氧氟草醚，PPO1A、PPO6A、PPO12A和PPO-ECA均表现出高抗的耐受性，而PPO-APA不具有耐受性。
表7、转基因大豆植株对丙炔氟草胺的耐受性实验结果
表7的结果表明，对于不同浓度的丙炔氟草胺，相比于对照载体和CK，PPO1A、PPO6A、PPO12A和PPO-ECA全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APA对丙炔氟草胺不具有耐受性。
第三实施例、转基因玉米植株的获得和验证
1、构建含有PPO基因的玉米重组表达载体
将上述第一实施例1中所述PPO1B核苷酸序列、PPO6B核苷酸序列、PPO12B核苷酸序列和PPO-APB核苷酸序列的5’和3’端分别连接如下通用接头引物2：
5’端通用接头引物2：5’-ccaagcggccaagctta-3’，如序列表中SEQ ID NO:72所示；
3’端通用接头引物2：5’-tgtttgaacgatcggcgcgcc-3’，如序列表中SEQ ID NO:73所示。
用限制性内切酶Spe I和Asc I对植物表达载体DBNBC-02进行双酶切反应，从而对植物表达载体线性化，酶切产物纯化得到线性化的DBNBC-02表达载体骨架(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))，将连接所述通用接头引物2的PPO1B核苷酸序列与所述线性化的DBNBC-02表达载体骨架进行重组反应，操作步骤按照Takara公司In-Fusion无缝连接产品试剂盒(Clontech，CA，USA，CAT：121416)说明书进行，构建成重组表达载体DBN12354，其载体结构图如图3所示(Spec：壮观霉素基因；RB：右边界；prOsAct1：水稻肌动蛋白1的启动子(SEQ ID NO:74)；cPAT：膦丝菌素N-乙酰基转移酶基因(SEQ ID NO:60)；t35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:61)；pr35S-06：花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID NO:75)；iZmHSP70：玉米热休克70kDa蛋白内含子(SEQ ID NO:76)；spAtCLP1：拟南芥白化体或浅绿色体转运肽(SEQ ID NO:57)；PPO1B：PPO1B核苷酸序列(SEQ ID NO:62)；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:58)；prZmUbi：玉米泛素(Ubiquitin)1基因的启动子(SEQ ID NO:77)；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:78)；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:58)；LB：左边界)。
按照第一实施例3中所述热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞并用碱法提取其质粒，将提取的质粒进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN12354中含有序列表中SEQ ID NO:62所示核苷酸序列，即PPO1B核苷酸序列。
按照上述构建重组表达载体DBN12354的方法，将连接所述通用接头引物2的所述PPO6B核苷酸序列、PPO12B核苷酸序列和PPO-APB核苷酸序列分别与所述线性化的DBNBC-02表达载体骨架进行重组反应，依次得到重组表达载体DBN12355至DBN12357。测序验证重组表达载体DBN12355至DBN12357中PPO6B核苷酸序列、PPO12B核苷酸序列和PPO-APB核苷酸序列分别正确插入。
按照上述构建重组表达载体DBN12354的方法，构建对照重组表达载体DBN12354N，其载体结构如图4所示(Spec：壮观霉素基因；RB：右边界；prOsAct1：水稻肌动蛋白1的启动子(SEQ ID NO:74)；cPAT：膦丝菌素N-乙酰基转移酶基因(SEQ ID NO:60)；t35S：花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO:61)；prZmUbi：玉米泛素(Ubiquitin)1基因的启动子(SEQ ID NO:77)；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:78)；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:58)；LB：左边界)。
2、重组表达载体转化农杆菌
对己经构建正确的重组表达载体DBN12354至DBN12357以及上述对照重组表达载体DBN12354N用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen， Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10min，37℃温水浴10min；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2h，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的壮观霉素的所述LB固体平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，将提取的质粒进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN12354至DBN12357和DBN12354N结构完全正确。
3、转基因玉米植株的获得
按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31(Z31)的幼胚与本实施例2中所述的农杆菌共培养，以将本实施例1中构建的重组表达载体DBN12354至DBN12357以及对照重组表达载体DBN12354N中的T-DNA(包括水稻肌动蛋白1的启动子序列、膦丝菌素N-乙酰基转移酶基因、花椰菜花叶病毒35S终止子序列、花椰菜花叶病毒35S启动子序列、玉米热休克70kDa蛋白内含子序列、拟南芥白化体或浅绿色体转运肽、PPO1B核苷酸序列、PPO6B核苷酸序列、PPO12B核苷酸序列、PPO-APB核苷酸序列、胭脂碱合成酶基因的终止子序列、玉米泛素(Ubiquitin)1基因的启动子序列、磷酸甘露糖异构酶基因、胭脂碱合成酶基因的终止子序列)转入到玉米染色体组中，分别获得了转入PPO1B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO6B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO12B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO-APB核苷酸序列的玉米植株和转入对照载体DBN12354N的玉米植株，同时以野生型玉米植株作为对照。
对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将所述PPO1B核苷酸序列、PPO6B核苷酸序列、PPO12B核苷酸序列或PPO-APB核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD 660＝0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步 骤3：恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。
筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。
4、用TaqMan验证转基因玉米植株
按照第二实施例中3用TaqMan验证转基因大豆植株的方法，对分别转入PPO1B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO6B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO12B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO-APB核苷酸序列的玉米植株和转入对照载体DBN12354N的玉米植株进行检测分析。通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PMI基因拷贝数以确定PPO基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
以下引物和探针用来检测PMI基因序列：
引物3：gctgtaagagcttactgaaaaaattaaca如序列表中SEQ ID NO:79所示；
引物4：cgatctgcaggtcgacgg如序列表中SEQ ID NO:80所示；
探针2：tctcttgctaagctgggagctcgatcc如序列表中SEQ ID NO:81所示。
通过分析PMI基因拷贝数的实验结果，进而证实PPO1B核苷酸序列、PPO6B核苷酸序列、PPO12B核苷酸序列、PPO-APB核苷酸序列和对照载体DBN12354N均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且分别转入PPO1B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO6B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO12B核苷酸序列的玉米植株、转入PPO-APB核苷酸序列的玉米植株和转入对照载体DBN12354N的玉米植株均获得了单拷贝的转基因玉米植株。
5、转基因玉米植株的除草剂耐受性效果检测
取转入PPO1B核苷酸序列的玉米植株(PPO1B)、转入PPO6B核苷酸序列的玉米植株(PPO6B)、转入PPO12B核苷酸序列的玉米植株(PPO12B)、转入PPO-APB核苷酸序列的玉米植株(PPO-APB)、转入对照载体的玉米植株(对照载体)和野生型玉米植株(CK)各16株(播种后18天)，分别用3种浓度的苯嘧磺草胺(50g ai/ha(2倍大田浓度，2×)、100g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))、3种浓度的乙氧氟草醚(360g ai/ha(2倍大田浓度，2×)、720g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))和3种浓度的丙炔氟草胺(120g ai/ha(2倍大田浓度，2×)、240g ai/ha(4倍大田浓度，4×)和0g ai/ha(水，0×))进行喷洒以检测玉米植株的除草剂耐受性。按照上述第一实施例6中的方法，在喷施7天(7DAT)后，根据植株平均损伤百分比等级(植株平均损伤百分比＝叶片损伤面积/叶片总面积×100％)来评价除草剂对每株植株的损伤程度。实验结果如表8-10所示。
表8、转基因玉米植株对苯嘧磺草胺的耐受性实验结果
表8的结果表明，相比于对照载体和CK，(1)对于2倍大田浓度的苯嘧磺草胺，PPO1B、PPO6B和PPO12B全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APB中约有56％植株不具有耐受性；(2)对于4倍大田浓度的苯嘧磺草胺，PPO1B、PPO6B和PPO12B全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APB 基本不具有耐受性。
表9、转基因玉米植株对乙氧氟草醚的耐受性实验结果
表9的结果表明，相比于对照载体和CK，(1)对于2倍大田浓度的乙氧氟草醚，PPO1B、PPO6B和PPO12B全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APB中有50％植株不具有耐受性；(2)对于4倍大田浓度的乙氧氟草醚，PPO1B、PPO6B和PPO12B全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APB不具有耐受性。
表10、转基因玉米植株对丙炔氟草胺的耐受性实验结果
表10的结果表明，对于不同浓度的丙炔氟草胺，相比于对照载体和CK，PPO1B、PPO6B和PPO12B全部表现出高抗的耐受性，而PPO-APB对丙炔氟草胺基本不具有耐受性。
综上所述，就植物而言，本发明所述原卟啉原氧化酶PPO1-PPO14不仅可以赋予拟南芥对PPO抑制剂除草剂较好的耐受性，特别是PPO1、PPO6和PPO12可以赋予拟南芥、大豆和玉米对PPO抑制剂类除草剂较好的耐受性，因此，所述原卟啉原氧化酶PPO1-PPO14可以赋予植物较好的耐受性；就除草剂而言，本发明首次公开了原卟啉原氧化酶PPO1-PPO14可以赋予植物对PPO抑制剂除草剂表现出较高的耐受性，至少可以耐受4倍大田浓度的乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺和丙炔氟草胺以及2倍大田浓度的甲磺草胺，因此在植物上应用前景广阔。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (17)

  1. 一种控制杂草的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量，其中所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
    更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
    进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
    优选地，所述转基因植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述转基因植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；进一步优选地，所述转基因植物为草甘膦耐受性植物，所述杂草为草甘膦抗性杂草；
    优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
    进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
  2. 根据权利要求1所述控制杂草的方法，其特征在于，所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列具有：
    (a)编码与选自由SEQ ID NO:1-14具有至少88％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列不包括SEQ ID NO:15-28；或
    (b)SEQ ID NO:29-42或SEQ ID NO:62-64任意一种所示的多核苷酸序列。
  3. 根据权利要求1或2所述控制杂草的方法，其特征在于，所述转基因植物还包括至少一种不同于编码所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的编码 第二种除草剂耐受性蛋白质的第二种多核苷酸。
  4. 根据权利要求3所述控制杂草的方法，其特征在于，所述第二种多核苷酸编码选择标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质、影响植物产量的蛋白质和/或影响植物品质的蛋白质。
  5. 根据权利要求4所述控制杂草的方法，其特征在于，所述第二种多核苷酸编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化还原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶、α酮戊二酸依赖性双加氧酶、麦草畏单加氧酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶和/或细胞色素类蛋白质。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述控制杂草的方法，其特征在于，所述含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂还包括草甘膦除草剂、草铵膦除草剂、植物生长素类除草剂、禾本科除草剂、发芽前选择性除草剂和/或发芽后选择性除草剂。
  7. 一种控制杂草生长的种植组合，其特征在于，包括PPO抑制剂除草剂和至少一种转基因植物，将含有有效剂量的所述PPO抑制剂除草剂施加到存在所述至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量，其中所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
    更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
    进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
    优选地，所述转基因植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述转基因植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；进一步优选地，所述转基因植物为草甘膦耐受性植物，所述杂草为草甘膦抗性杂草；
    优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二 唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
    进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
  8. 根据权利要求7所述控制杂草生长的种植组合，其特征在于，所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列具有：
    (a)编码与选自由SEQ ID NO:1-14具有至少88％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列不包括SEQ ID NO:15-28；或
    (b)SEQ ID NO:29-42或SEQ ID NO:62-64任意一种所示的多核苷酸序列。
  9. 根据权利要求7或8所述控制杂草生长的种植组合，其特征在于，所述转基因植物还包括至少一种不同于编码所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的编码第二种除草剂耐受性蛋白质的第二种多核苷酸。
  10. 根据权利要求9所述控制杂草生长的种植组合，其特征在于，所述第二种多核苷酸编码选择标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质、影响植物产量的蛋白质和/或影响植物品质的蛋白质。
  11. 根据权利要求10所述控制杂草生长的种植组合，其特征在于，所述第二种多核苷酸编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化还原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶、α酮戊二酸依赖性双加氧酶、麦草畏单加氧酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶和/或细胞色素类蛋白质。
  12. 根据权利要求7-11任一项所述控制杂草生长的种植组合，其特征在于，所述含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂还包括草甘膦除草剂、草铵膦除草剂、植物生长素类除草剂、禾本科除草剂、发芽前选择性除草剂和/或发芽后选择性除草剂。
  13. 一种产生耐受PPO抑制剂除草剂的植物的方法，其特征在于，包括向植物的基因组中引入编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，当含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到至少存在所述植物的田地中，所述植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量，其中所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基 酸序列具有至少90％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
    更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
    进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
    优选地，所述引入的方法包括遗传转化方法、基因组编辑方法或基因突变方法；
    优选地，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；
    优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
    进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
  14. 一种培养耐受PPO抑制剂除草剂植物的方法，其特征在于，包括：
    种植至少一个植物繁殖体，所述植物繁殖体的基因组中包括编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
    使所述植物繁殖体长成植株；
    将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到至少包含所述植株的田地中，收获与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量的植株；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
    更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
    进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的 氨基酸序列；
    优选地，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；
    优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和/或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
    进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
  15. 一种用于保护植物免受由PPO抑制剂除草剂引起的损伤或赋予植物PPO抑制剂除草剂耐受性的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量，其中所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
    更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
    进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
    优选地，所述转基因植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述转基因植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；
    优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括二苯醚类PPO抑制剂除草剂、噁二唑酮类PPO抑制剂除草剂、N-苯基酞酰胺亚胺类PPO抑制剂除草剂、噁唑啉酮类PPO抑制剂除草剂、苯基吡唑类PPO抑制剂除草剂、脲嘧啶类PPO抑制剂除草剂、噻二唑类PPO抑制剂除草剂、三唑啉酮类PPO抑制剂除草剂和 /或三嗪酮类PPO抑制剂除草剂；
    进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
  16. 一种原卟啉原氧化酶在赋予植物PPO抑制剂除草剂耐受性中的用途，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少88％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；
    更优选地，所述原卟啉原氧化酶与选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；
    进一步优选地，所述原卟啉原氧化酶选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的氨基酸序列；
    优选地，所述原卟啉原氧化酶在赋予植物PPO抑制剂除草剂耐受性中的用途包括将含有有效剂量PPO抑制剂的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的田地中，所述转基因植物在其基因组中包含编码所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量；
    优选地，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；更优选地，所述植物为燕麦、小麦、大麦、谷子、玉米、高粱、二穗短柄草、水稻、烟草、向日葵、苜蓿、大豆、鹰嘴豆、花生、甜菜、黄瓜、棉花、油菜、土豆、番茄或拟南芥；
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    进一步优选地，所述PPO抑制剂除草剂包括乙氧氟草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺和/或丙炔氟草胺。
  17. 根据权利要求16所述原卟啉原氧化酶在赋予植物PPO抑制剂除草剂耐受性中的用途，其特征在于，所述原卟啉原氧化酶的多核苷酸序列具有：
    (a)编码与选自由SEQ ID NO:1-14具有至少88％序列同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列不包括SEQ ID NO:15-28；或
    (b)SEQ ID NO:29-42或SEQ ID NO:62-64任意一种所示的多核苷酸序列。
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