FR2796395A1 - Nouveau gene sgs3 de plante et son utilisation - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polynucléotides comprenant le gène SGS3 de plante impliqué dans les phénomènes d'inactivation post-transcriptionnelle dans les plantes transgéniques et dans la résistance des plantes aux infections virales, et son utilisation pour la préparation de plantes génétiquement modifiées.

Description

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Nouveau gène SGS3 de plante et son utilisation
La présente invention concerne un nouveau gène SGS3 de plante et son utilisation pour la préparation de plantes génétiquement modifiées.

On connaît de l'état de la technique des méthodes permettant d'intégrer des gènes hétérologues dans le génome des plantes de différentes espèces. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants : 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.

Le niveau d'expression du gène hétérologue dépendra de différents facteurs, dont le locus d'intégration du gène hétérologue dans le génome de la plante transformée et les phénomènes dits de " silencing ". Il est en effet connu de l'état de la technique que l'expression d'un gène hétérologue dans une plante peut être inhibée totalement ou en partie dans la descendance des plantes transformées régénérées, quand bien même le dit gène s'exprime correctement dans la plante régénérée directement issue de la cellule transformée. Les gènes hétérologues introduits peuvent parfois subir une inactivation épigénétique (inactivation ne s'accompagnant d'aucune modification de séquence).

Lorsque les gènes présentent des homologies avec des gènes de l'organisme hôte, l'inactivation peut affecter également l'expression de ces gènes hôtes et engendrer des effets délétères pour l'organisme (co-inactivation). Deux mécanismes distincts d'inactivation ont été mis en évidence chez les végétaux supérieurs, se traduisant soit par un blocage de la transcription (inactivation transcriptionnelle) soit par une dégradation des ARN (inactivation post-transcriptionnelle).

Ces phénomènes d'inactivation, révélés accidentellement par la transgenèse, reflètent certainement des processus fondamentaux du contrôle épigénétique de l'expression des gènes, et leur étude constitue donc un moyen original d'accès à la compréhension des mécanismes de régulation mis enjeu au cours du développement des plantes. La mise en évidence de ces phénomènes soulève par ailleurs de nombreuses questions quant à l'utilisation de plantes transgéniques tant pour des programmes d'amélioration variétale que pour des études de physiologie moléculaire.

Ainsi, des plantes homozygotes monolocus obtenues avec un gène codant la protéine
GUS sous le contrôle du promoteur CamV 35S (35S-UidA) ont présenté une inactivation du transgène quel que soit le nombre de copies du transgène insérées au locus. Le phénomène se met en place au cours du développement de chaque génération indiquant une réversibilité méiotique. Des plantes haploïdes issues de la culture d'anthères de transformants homozygotes inactivés portant une seule copie du transgène ont montré une

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réactivation du gène suivie d'une inactivation au cours du développement, suggérant que la méiose était nécessaire au déclenchement du processus de réactivation, mais que le déclenchement de l'inactivation au cours du développement ne nécessitait pas de fertilisation, et ne résultait pas de l'interaction entre différentes copies du transgène. Enfin, des expériences de run-on ont montré que le phénomène survenait au niveau posttranscriptionnel (Elmayan et Vaucheret, Plant J. 9:787-797,1996).

En induisant une mutation des plantes transformées, il est possible, non seulement d'éliminer ces phénomènes d'inhibition, mais encore d'augmenter le niveau d'expression des gènes hétérologues dans cette plante mutée (Elmayan et al., 1998, Plant Cell 10:1747- 1757, 1998).

On a maintenant isolé un nouveau gène de plante, dénommé SGS3, impliqué dans les phénomènes d'inactivation post-transcriptionnelle dans les plantes transgéniques et dans la résistance des plantes aux infections virales. L'inhibition de ce gène conduit à l'inhibition des phénomènes d'inactivation post- transcriptionnelle en particulier dans les plantes transgéniques comprenant un gène hétérologue codant pour un peptide ou une protéine particuliers, permettant un niveau d'expression dudit peptide ou de ladite protéine à un niveau particulièrement élevé. L'invention a également pour objet la surexpression du gène SGS3 pour la préparation de plantes plus résistantes aux infections virales.

Description des figures FIGURE 1: Mutants sgs3
Description de la liste de séquences SEQ ID NO.1:Gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID NO. 2 : ADNc du gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO. 3 : Polypeptide SGS3 d'Arabidopsis thaliana
Description de l'invention Polynucléotides SGS3
La présente invention concerne des polynucleotides SGS3, en particulier des polynucléotides comprenant un gène SGS3 de plante. Préférentiellement, les polynucléotides de la présente invention comprennent la séquence codante d'un gène SGS3 de plante. Le gène SGS3 peut être isolé chez les plantes dicotylédones, comme Arabidopsis, le tabac, le colza, le tournesol, le soja, le coton, le trèfle, la lentille d'eau (lemnae) ou chez les plantes monocotylédones comme le riz, le maïs ou le blé. De manière avantageuse, le gène SGS3 est isolé chez les plantes dicotylédones, en particulier les crucifères comme Arabidopsis ou le colza. De préférence, les polynucléotides de l'invention comprennent un gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana.

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Le terme "polynucléotides SGS3" désigne l'ensemble des polynucléotides de la présente invention, de préférence, les polynucléotides de la séquence génomique de SGS3, les polynucléotides de la séquence de l'ADNc de SGS3, ainsi que les polynucléotides codant pour les polypeptides SGS3 de la présente invention. Le terme "polynucléotides SGS3" désigne également des polynucléotides recombinants comprenant les dits polynucléotides.

Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide " une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le terme "polynucléotide" désigne également les oligonucléotides et les polynucléotides modifiés.

Les polynucléotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucléotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. ( Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse chimique.

L'invention comprend des polynucléotides de la séquence génomique du gène SGS3. Cette séquence génomique comprend 5 exons (positions 696-1658, 1732-2023, 2135-2379,2482-2648, 2739-2949 de la SEQ ID NO. 1), 4 introns (positions 1659-1731, 2024-2134,2380-2481, 2649-2738 de la SEQ ID NO.l) et des séquences régulatrices en 5' et en 3'. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les polynucléotides de la séquence génomique de SGS3 comprennent un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 1, b) un polynucléotide comprenant au moins un exon de la SEQ ID NO. 1; c) un polynucléotide comprenant une combinaison d'exons de la SEQ ID NO. 1.

La présente invention concerne également un polynucléotide comprenant une séquence régulatrice en 5' ou en 3' du gène SGS3. Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un polynucléotide de régulation en 5' comprenant le polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1.

Dans un deuxième mode de réalisation, l'invention concerne un polynucléotide de régulation en 3' comprenant le polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 2950 et la position 3275 de la SEQ ID NO. 1.

L'invention a également pour objet un promoteur du gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana. De préférence, le promoteur du gène SGS3 comprend un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le promoteur du gène SGS3 comprend un fragment biologiquement actif d'un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1.

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Par "fragment biologiquement actif' on entend ci-dessus un polynucléotide ayant une activité promotrice et de préférence une activité promotrice dans les plantes. Les techniques permettant d'établir l'activité promotrice d'un polynucléotide sont bien connues de l'homme du métier. Ces techniques impliquent classiquement l'utilisation d'un vecteur d'expression comprenant dans le sens de la transcription le polynucléotide à tester et un gène rapporteur (voir Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989).

L'invention concerne aussi une séquence terminatrice du gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana. De préférence, la séquence terminatrice du gène SGS3 comprend un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 2950 et la position 3275 de la SEQ ID NO. 1. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence terminatrice du gène SGS3 comprend un fragment biologiquement actif d'un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 2950 et la position 3275 de la SEQ ID NO. 1.

L'invention concerne aussi des polynucléotides de l'ADNc de SGS3. De manière préférée, les polynucléotides de la séquence codante d'un gène SGS3 de plante comprennent des polynucléotides de la SEQ ID NO. 2.

L'invention a également pour objet des polynucléotides comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide choisi parmi les polypeptides suivants : a) le polypeptide de la SEQ ID NO.3; b) un polypeptide homologue à un polypeptide de la SEQ ID NO. 3 ; c) un fragment d'un polypeptide tel que défini en a) ou b).

L'invention s'étend également aux polynucléotides comprenant un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 1; b) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 2 ; c) un polynucléotide homologue à un polynucléotide tel que défini en a) ou b) d) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide tel que défini en a) ou b); e) un fragment d'un polynucléotide tel que défini en a), b), c) ou d).

Par " fragment " on entend selon l'invention un polynucléotide d'au moins 10, 20, 30, 50,100, 200,300, 400,500 nucléotides contigus de la séquence de référence. De préférence ces fragments conservent la fonction de la séquence de référence.

Par " homologue " on entend selon l'invention un polynucléotide présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence de référence. Ces modifications peuvent être des délétions, des additions ou des substitutions d'un ou plusieurs nucléotides de la séquence de référence. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et de préférence d'au moins 98% et plus préférentiellement d'au moins 99% par rapport à la séquence de référence. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par

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exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul et al., J.Mol.Evol., 36 :290-300, 1993 ; Altschul et al., J.Mol.Biol., 215 :403-10, 1990). L'invention concerne donc des polynucléotides comprenant des polynucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec les polynucléotides SGS3, les polynucléotides de la SEQ ID NO.1 ou les polynucléotides de la SEQ ID NO. 2. De préférence l'invention concerne un polynucléotide comprenant un polynucléotide d'au moins 50,100, 200, 300, 400, 500,
1000 nucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec les polynucléotides SGS3, les polynucléotides de la SEQ ID NO.1 ou les polynucléotides de la
SEQ ID NO. 2. De préférence, ces homologues conservent la fonction de la séquence de référence.

Par " séquence capable de s'hybrider de manière sélective ", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5 C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30 C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60 C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant : SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0. 02% PVP, 0.02% Ficoll, 0. 02% BSA,
500 g/ml denatured salmon sperm DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1%SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01%SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X
SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular
Cloning : A Labratory Manual, 1989). L'invention concerne donc des polynucléotides comprenant un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective avec le polynucléotide de la SEQ ID NO.1 ou le polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. De préférence, l'invention concerne un polynucléotide comprenant un polynucléotide d'au moins 50, 100, 200,300, 400,500, 1000 nucléotides capable de s'hybrider de manière sélective avec le polynucléotide de la SEQ ID NO.1 ou le polynucléotide de la SEQ ID
NO. 2. Préférentiellement, ces polynucléotides s'hybridant de manière sélective à un polynucléotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.

La présente invention a également pour objet des polynucléotides antisens permettant l'inhibition de l'expression d'un gène SGS3 de plante. Les polynucléotides antisens

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s'hybrident spécifiquement à l'ARNm d'un gène SGS3 de plante interférant ainsi avec l'expression de ce gène. Les techniques d'inhibition de l'expression d'une protéine par un polynucléotide antisens sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature notamment par Judelson et al. (Gene, 133 :63-69,1993) ainsi que par Prokish et al. (Mol.Gen.Genet. 256:104-114, 1997).

Les polynucléotides antisens de la présente invention s'hybrident à l'ARNm d'un gène SGS3 de plante sur toute sa longueur ou seulement à une partie de l'ARNm d'un gène SGS3 de plante. Les polynucléotides antisens de la présente invention peuvent être parfaitement complémentaires à l'ARNm d'un gène SGS3 de plante ou suffisamment homologues pour permettre l'appariement et l'inhibition de l'expression d'un gène SGS3 de plante.

La présente invention a donc également pour objet des polynucléotides comprenant un polynucléotide antisens d'un gène SGS3 de plante et préférentiellement un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène SGS3 de la SEQ ID NO. 2.

Préférentiellement, les polynucléotides antisens de la présente invention sont dérivés d'un polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. Selon un premier mode de réalisation, les polynucléotides antisens de la présente invention comprennent le polynucléotide de la SEQ ID No.2. Selon un deuxième mode de réalisation, les polynucléotides antisens de la présente invention comprennent un fragment d'au moins 100 nucléotides, de préférence d'au moins 500 nucléotides et préférentiellement d'au moins 1000 nucléotides de la SEQ ID NO.2. Selon un troisième mode de réalisation, les polynucléotides antisens de la présente invention comprennent un polynucléotide présentant au moins 85%, 90%, 95% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un polynucléotide de la SEQ ID NO. 2. Selon un autre mode de réalisation les polynucléotides antisens de la présente invention comprennent un polynucléotide présentant au moins 85%, 90%, 95% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec un fragment d'au moins 100 nucléotides, de préférence d'au moins 500 nucléotides et préférentiellement d'au moins
1000 nucléotides de la SEQ ID NO.2.

De préférence, les polynucléotides antisens de la présente invention inhibent spécifiquement l'expression d'un gène SGS3 chez les plantes.

Selon un mode de réalisation préféré, les polynucléotide antisens de la présente invention sont exprimés dans les cellules végétales ou les plantes à partir d'une cassette d'expression.

La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID NO. 1 et de la SEQ ID NO. 2 selon l'invention pour l'identification du gène SGS3 dans d'autres plantes. Le clonage s'effectue par exemple par criblage de banques d'ADNc ou de banques d'ADN génomique avec un polynucléotide ou un fragment d'un polynucléotide de la SEQ ID NO.1et de la SEQ ID NO.2. Ces banques peuvent également être criblés par PCR à l'aide d'oligonucléotides spécifiques ou dégénérés dérivés de la SEQ ID NO.l ou de la SEQ ID NO.2. Les techniques de

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construction et de criblage de ces banques sont bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : Labratory Manual, 1989). Des gènes SGS3 de plante peuvent également être identifiés dans les bases de données par BLAST nucléotidique ou protéique à l'aide des SEQ ID NO. 1-3.

De préférence, on vérifie que les gènes clonés assurent la même fonction que le gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana par introduction des gènes identifiés dans des mutants SGS3 et par test de restauration de l'inactivation post-transcriptionnelle (voir ci-dessous).

Polypeptides SGS3
La présente invention concerne également des polypeptides SGS3. Le terme "polypeptides SGS3" désigne l'ensemble des polypeptides de la présente invention ainsi que les polypeptides pour lesquels codent les polynucléotides de la présente invention. Le terme "polypeptides SGS3" désigne également des protéines de fusion, des protéines recombinantes ou des protéines chimères comprenant ces polypeptides. Dans la présente description le terme "polypeptide" désigne également des protéines et des peptides ainsi que des polypeptides modifiés.

Les polypeptides de l'invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel.

Les polypeptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des cellules exprimant naturellement ces polypeptides, la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier. Ainsi, les polypeptides SGS3 de la présente invention peuvent être isolés à partir de plantes exprimant des polypeptides SGS3.

De préférence les polypeptides SGS3 de la présente invention sont isolés à partir d'organisme hôtes recombinants exprimant un polypeptide SGS3 hétérologue ou exprimant un polypeptide SGS3 naturel sous le contrôle d'un promoteur hétérologue. Ces organismes sont préférentiellement choisis parmi les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales , les cellules végétales ou les plantes.

La présente invention a pour objet un polypeptide de séquence SEQ ID NO.3ainsi qu'un un polypeptide comprenant un polypeptide de séquence SEQ ID NO. 3. L'invention comprend également des polypeptides comprenant un fragment ou un homologue d'un polypeptide SGS3 et plus particulièrement du polypeptide de la SEQ ID NO. 3.

Le terme "fragment" d'un polypeptide désigne un polypeptide comprenant une partie mais pas la totalité du polypeptide dont il est dérivé. L'invention concerne un polypeptide comprenant un fragment d'au moins 10, 15, 20,25, 30,35, 40,50 acides aminés d'un polypeptide de la SEQ ID NO.3. De préférence, ces fragments conservent au moins une activité biologique du polypeptide dont ils sont dérivés. Préférentiellement, cette activité concerne l'inactivation post-transcriptionelle chez les plantes.

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Le terme "homologue" désigne un polypeptide selon l'invention désigne un polypeptide pouvant présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé. L'invention a pour objet un polypeptide présentant au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et préférentiellement 99% d'acides aminés identiques avec un polypeptide de la SEQ ID NO. 3. De préférence, ces polypeptides homologues conservent la même activité biologique. Préférentiellement, cette activité concerne l'inactivation posttranscriptionelle chez les plantes.

Cassettes d'expression
Le gène SGS3 peut être exprimé ou sur-exprimé dans différents organismes hôtes tels que les plantes. La présente invention concerne notamment la sur-expression du gène SGS3 dans les plantes ou les cellules végétales pour améliorer leur résistance aux virus.

Le gène SGS3 peut être exprimé dans un organisme hôte sous le contrôle du promoteur SGS3 de la présente invention ou sous le contrôle d'un promoteur hétérologue et de préférence sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les plantes. Selon un mode de réalisation de l'invention, un polynucléotide codant pour un polypeptide SGS3 est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour le polypeptide SGS3.

Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide SGS 3 par une cellule hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Dans un premier mode de réalisation, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un gène SGS3 de plante ou la séquence codante d'un gène SGS3 de plante et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte. Dans un autre mode de réalisation, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour un polypeptide SGS3et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte. Préférentiellement, la cassette d'expression comprend, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotides codant pour un polypeptide SGS3 de la SEQ ID NO. 3, pour un homologue ou pour un fragment d'un polypeptide de la SEQ ID NO.3; b) un polynucléotide de la SEQ ID NO. 1; c) un polynucléotide de la SEQ ID NO. 2 ; d) un polynucléotide homologue à un polynucléotide tel que défini en b) ou c); e) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière spécifique à un polynucléotide tel que défini en b) ou c); f) un polynucléotide comprenant un fragment d'un polynucléotide tel que défini en b), c), d) et e).

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et une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.

Dans un autre mode de réalisation, les cassettes d'expression de la présente invention permettent l'expression d'un polynucléotide antisens pour l'inhibition de l'expression du gène SGS3 dans une plante. Pour l'expression d'un polynucléotide antisens dans une plante les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide antisens de la séquence codante d'un gène SGS3 de plante et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit organisme hôte. De préférence, les cassettes d'expression selon l'invention comprennent, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène SGS3 de la SEQ ID NO. 2 et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit organisme hôte. Préférentiellement, les polynucléotides antisens de la présente invention sont exprimés sous le contrôle d'un promoteur inductible.

Le promoteur SGS3 peut être utilisé pour exprimer un gène hétérologue dans un organisme hôte et notamment dans les cellules végétales ou dans les plantes. L'invention a donc également pour objet des cassettes d'expression comprenant le promoteur d'un gène SGS3 de plante associé de manière fonctionnelle à une séquence codant pour une protéine hétérologue. permettant l'expression de ladite protéine dans les cellules végétales ou les plantes. Dans un mode de réalisation, la cassette d'expression selon l'invention comprend, dans le sens de la transcription, le promoteur SGS3 d'Arabidopsis thaliana, la séquence codante pour la protéine hétérologue et une séquence terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes. De préférence, la cassette d'expression selon l'invention comprend, dans le sens de la transcription, un polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1 ou un fragment biologiquement actif du polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1, la séquence codant pour un polypeptide hétérologue et une séquence terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes.

Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression du gène d'intérêt, comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences signal permettant l'adressage du polypeptide d'intérêt.

Les techniques de construction de ces cassettes d'expression sont largement décrites dans la littérature (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory
Manual, 1989).

La présente invention a également pour objet un polynucléotide comprenant une cassette d'expression selon l'invention et notamment un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention.

Avantageusement les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur pour leur réplication ou pour la transformation d'un organisme hôte.

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Certains éléments des cassettes d'expression selon l'invention sont illustrés cidessous à titre non limitatif.

Promoteurs
Tout type de séquence promotrice peut être utilisée dans les cassettes d'expression selon l'invention. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène d'intérêt. La présente invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes. Le choix du promoteur utilisé dans la cassette d'expression détermine l'expression temporelle et spatiale du gène d'intérêt. Certains promoteurs permettent une expression spécifique dans certains tissus de la plante (racines, feuilles ou graines par exemple) ou dans certaines cellules de la plante. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311). On peut encore utiliser une séquence de régulation promotrice spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines ( Datla et al., Biotechnology Ann. Rev. 3:269-296,
1997). On peut également employer un promoteur inductible avantageusement choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US 5 670 349), le promoteur HMG2 (US 5 670 349), le promoteur de la beta-galactosidase (ABG1) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate syntase (ACC synthase) de pomme (WO 98/45445).

On pourra également utiliser le promoteur du gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana.

Séquences de régulation de l'expression
Dans les cassettes d'expression de la présente invention on peut utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans ladite cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). Parmi les séquences leader dérivées de virus on citera par exemple l'activateur du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la

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demande WO 87/07644, ou l'activateur du virus etch du tabac (TEV). Différentes séquences dérivées d'introns de plantes peuvent également être utilisées pour augmenter le niveau d'expression du gène d'intérêt notamment chez les plantes monocotylédones. On citera par exemple l'intron I du gène de mais AdhI (Callis et al., Genes Develop., 1:1183- 1200, 1987).

Séquences terminatrices
Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention. Ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée. Pour l'expression dans les plantes on peut notamment utiliser le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore des séquences terminatrices d'origine végétale, comme par exemple le terminateur d'histone (voir EP 0 633 317), le terminateur CaMV 35 S et le terminateur tml. Ces séquences terminatrices sont utilisables dans les plantes monocotylédones et dicotylédones.

La séquence terminatrice du gène SGS3 d'Arabidopsis thaliana est un autre exemple de séquence terminatrice utilisable dans les cassettes d'expression selon l'invention.

Gènes hétérologues
Tout gène d'intérêt peut être exprimé dans un organisme hôte sous le contrôle d'un promoteur SGS3. De préférence, le promoteur SGS3 est utilisé pour l'expression d'un gène hétérologue dans des cellule de plante ou dans une plante. Les gènes d'intérêt pouvant être exprimés dans les plantes sous le contrôle d'un promoteur SGS3 sont plus largement illustrés ci-dessous.

Vecteurs
La présente invention concerne également des vecteurs de transformation ou d'expression comprenant au moins un polynucléotide SGS3 ou une cassette d'expression selon la présente invention. Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte et pour exprimer un polypeptide SGS3 ou un polynucléotide SGS3 dans ledit organisme hôte. L'organisme hôte est par exemple une bactérie, une levure, un champignon, une cellule de plante ou une plante. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide SGS3 ou une cassette d'expression selon l'invention. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte afin d'induire l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être utilisé.

Les techniques de construction de ces vecteurs et les techniques d'insertion d'une séquence appropriée dans ces vecteurs sont largement décrites dans la littérature (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : Labratory Manual, 1989).

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Avantageusement, les vecteurs selon l'invention comprennent au moins une origine de réplication. De manière préférée, les vecteurs de l'invention comprennent également au moins un marqueur de sélection et de préférence un marqueur de sélection utilisable dans les cellules végétales ou dans les plantes. Parmi les marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques tel que le gène nptll pour la résistance à la kanamycine (Bevan et al., Nature 304:184-187, 1983) et le gène hph pour la résistance à l'hygromycine (Gritz et al., Gene 25:179-188, 1983). On citera également les gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyophosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On pourra également utiliser les gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS ou des gènes codant pour des pigments et des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.

Avantageusement, ces vecteurs sont utilisés pour la transformation d'un organisme hôte. L'homme du métier choisira les vecteurs de transformation appropriés notamment en fonction de l'organisme hôte à transformer et en fonction de la technique de transformation mise en #uvre.

Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.

De nombreux vecteurs ont été développés pour la transformation des plantes avec Agrobacterium tumefaciens. D'autres vecteurs sont utilisés pour les techniques de transformation ne reposant pas sur l'utilisation d'Agrobacterium. Ces vecteurs sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

Transformation
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales avec un polynucléotide SGS3, une cassette d'expression ou un vecteur de transformation ou d'expression selon l'invention.

Selon la présente invention la transformation de l'organisme hôte peut être obtenue par tout moyen connu approprié, les techniques de transformation et notamment de transformation des plantes sont amplement décrites dans la littérature spécialisée. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants : 4,459,355, US 4,536,475, US
5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US

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5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071, WO 95/06128 et WO 99/19497.

Certaines techniques utilisent Agrobacterium notamment pour la transformation des dicotylédones. Une série de méthodes consistent à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes consistent àbombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. D'autres méthodes peuvent également être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.

L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.

Organismes hôtes
La présente invention concerne également un organisme hôte transformé avec un polynucléotide SGS3, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.

Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons ou les cellules végétales et les plantes. De manière avantageuse, les bactéries sont choisies parmi Escherichia coli, les levures sont choisies parmi Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisae, les champignons sont choisis parmi Aspergillus niger. De manière préférentielle, l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante.

Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, le trèfle, la lentille d'eau (lemnae) etc.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte comprend au moins un autre gène hétérologue codant pour un peptide, un polypeptide ou une protéine d'intérêt. Le polynucléotide comprenant un polynucléotide SGS3 selon l'invention et le ou les autres gènes hétérologues peuvent avoir été introduits dans l'organisme hôte simultanément au moyen d'un même vecteur les comprenant, ou au moyen de plusieurs vecteurs, ou de manière séquentielle au moyen de plusieurs vecteurs, ou encore par croisement de plusieurs organismes hôtes, chacun comprenant un gène hétérologue.

Par gène hétérologue, on entend selon l'invention tout gène introduit de manière artificielle dans l'organisme hôte, et plus particulièrement intégré de manière artificielle dans son génome, les méthodes permettant cette introduction ou intégration pouvant être

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celles décrites précédemment, le contenu des références citées étant incorporé ici par référence.

Le gène hétérologue, autre que les polynucléotides SGS3 selon l'invention, peut être un gène comprenant une séquence codante et les éléments de régulation en 5' et 3' de ladite séquence codante non modifiés par rapport au gène naturel, réintroduit de manière artificielle dans le génome d'un organisme hôte pouvant être de la même espèce que celui d'où le gène a été isolé, ou d'une espèce différente. Le gène hétérologue peut également être un gène chimère ou une cassette d'expression comprenant une séquence codante d'origine, végétale, bactérienne, fongique, virale ou animale, sous le contrôle d'éléments de régulation fonctionnels dans l'organisme hôte, différents de ceux naturellement liés fonctionnellement à la séquence codante.

La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées telles que définies ci-dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées et leur descendance. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.

La présente invention concerne aussi les plantes génétiquement modifiées dans le génome desquelles un polynucléotide SGS3 ou une cassette d'expression selon l'invention sont intégrés de manière stable et transmissible par reproduction sexuée.

La présente invention concerne également des plantes obtenues par croisement des plantes régénérées ci-dessus avec d'autres plantes. Elle concerne aussi les graines de plantes transformées.

Mutants sgs3
L'invention concerne également des mutants sgs3 dans lesquels le gène SGS3 est inactivé. L'inactivation de ce gène conduit à l'inhibition des phénomènes d'inactivation post-transcriptionnelle chez ces mutants.

L'inactivation du gène SGS3 dans les plantes peut être obtenue au moyen de différentes techniques de mutagenèse, de mutagenèse dirigée, de "gene machine" ou par des techniques de recombinaison homologue (Kempin, S.A.et al., Targeted disruption in Arabidopsis, Nature 389 :802-803, Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Parmi les techniques de mutagenèse on citera les techniques de mutagenèse chimique. On citera également les techniques de mutagenèse utilisant des éléments transposables permettant l'inactivation de gènes par insertion. Lorsque les techniques de mutagenèse utilisées ne permettent pas de spécifiquement inactiver le gène SGS3, les mutants obtenus sont criblés pour identifier les mutants affectés dans le gène SGS3. Ce criblage peut être un criblage phénotypique ou un criblage basé sur l'amplification et le séquençage du gène SGS3 dans les mutants selon des techniques décrites dans la littérature.

Parmi les techniques de mutagenèse dirigée on citera la chimeraplasty (US 6,010,907).

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Dans un mode de réalisation particulier de l'invention des mutants sont obtenus selon le procédé décrit par Elmayan et al. (Plant Cell, 10:1747-1757, 1998) par traitement de graines avec une solution d'EMS (ethyl methanesulfonate) à 0,4%. Les mutants sont ensuite analysés pour identifier les mutants affectés dans le gène SGS3. Ce criblage peut par exemple s'effectuer par PCR.

La présente invention concerne également l'utilisation de mutants SGS3 pour l'identification de gènes SGS3 dans d'autres espèces végétales telles que par exemple le tabac, le colza, le tournesol, le soja, le coton, le riz, le maïs, le sorgho, l'orge ou le blé. Les homologues fonctionnels de SGS3 chez d'autres espèces sont identifiés par complémentation des mutants sgs3 selon l'invention. Un polynucléotide qui restaure le phénotype sauvage d'inactivation post-transcriptionnelle est cloné. La séquence de ce polynucléotide est ensuite déterminée afin d'identifier les éléments constitutifs du gène cloné.

Inhibition/Inactivation de SGS3 et expression de gènes hétérologues dans les plantes
Le développement des techniques de transferts génétiques a permis l'expression de gènes dans les plantes notamment en vue de l'amélioration de leur propriétés agronomiques ou pour la production de protéines d'intérêt. Cependant, les phénomènes d'inactivation post-transcriptionnelle constituent un obstacle important à la stabilité de l'expression des transgènes dans les plantes. Ces phénomènes de suppression de l'expression du transgène sont particulièrement fréquents dans le cadre de transgènes fortement exprimés. La présente invention concerne un nouveau gène de plante SGS3.

L'inhibition ou l'inactivation de ce gène SGS3 dans les plantes provoquent une inhibition du phénomène d'inactivation post-transcriptionnelle et permet donc d'obtenir des plantes dans lesquelles l'expression des gènes hétérologues est plus stable ainsi que des plantes dans lesquelles le niveau d'expression des gènes hétérologues est plus élevé.

Inactivation/inhibition du gène SGS3 dans les plantes
Dans un premier mode de réalisation l'invention concerne un procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de la plante avec le gène hétérologue et l'inhibition de l'expression du gène SGS3 dans ladite plante. Préférentiellement, l'inhibition de l'expression du gène SGS3 comprend la transformation de la plante avec un polynucléotide comprenant un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) un polynucléotide antisens de la séquence codante d'un gène SGS3 de plante; b) un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène SGS3 de la SEQ ID
NO.2; c) une cassette d'expression comprenant, dans le sens de la transcription, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide tel que défini en a) ou b) et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit organisme hôte.

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Dans un autre mode de réalisation l'invention concerne un procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de la plante avec le gène hétérologue et l'inactivation de l'expression du gène SGS3 dans ladite plante.

Dans le cadre de la présente invention il est bien entendu que l'étape d'inactivation ou d'inhibition du gène SGS3 de plante et l'étape de transformation de la plante avec un gène hétérologue peuvent être réalisés simultanément sur une même plante ou de manière séquentielle ou encore par croisements de plusieurs plantes. Les procédés selon l'invention peuvent donc également comprendre des étapes de régénération des plantes, de multiplication asexuée ou de croisements des plantes.

Gènes hétérologues
Différents gènes hétérologues d'intérêt peuvent être exprimés dans les plantes dans lesquelles l'expression du gène SGS3 est inhibé ou inactivé. De préférence, le gène hétérologue code pour des peptides, des protéines ou des enzymes. Il peut s'agir de protéines rapporteurs, des marqueurs de sélection ou de peptides ou de protéines d'intérêt conférant à l'organisme hôte de nouvelles propriétés, plus particulièrement de nouvelles propriétés agronomiques pour les plantes transformées.

Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.

Parmi les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bar conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175), ou encore un gène codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comme les isoxazoles, notamment l'isoxafutole (FR 95 06800, FR 95 13570), les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631) ou les tricétones, notamment la sulcotrione (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195). De tels gènes codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD sont décrits dans la demande de brevet WO 96/38567.

Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).

Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate

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oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; & al., 1995).

On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit et al., Eur. J. Biochem. 195 :329-334, WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants: l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).

Les organismes hôtes de la présente invention peuvent également être utilisés pour la production de protéines d'intérêt dans les plantes ou "molecular farming". En effet l'invention concerne notamment des plantes transformées permettant d'obtenir des niveaux d'expressions de gènes hétérologues plus élevés. Parmi les protéines d'intérêt, on citera notamment les peptides et les protéines de mammifères. La production d'immunoglobulines (US 5,990,385 ; US 5,639,947,5,959,177) et d'interféron (US
4,956,282) ont par exemple été décrits dans les plantes.

Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans les exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments

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d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al ou dans Sambrook et al 1989.

Exemples
Exemple 1
Isolement et identification du gène SGS3 d'Arabidopsis @
Le mutant SGS3 (affecté dans le gène SGS3) a été obtenu à partir du même protocole expérimental que celui ayant permis l'isolement des mutants sgsl et sgs2 (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757, 1998). La lignée de départ était la lignée L1. L1est une lignée transgénique obtenue par transformation de plantes de l'écotype Columbia par la construction 23b (Elmayan et Vaucheret, Plant J. 9 :787-797, La lignée Ll ne comporte qu'un seul locus transgénique. L'activité glucuronidase dans la lignée L1 est de 4000 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de proteines totales dans les premiers jours du développement. Cette activité décroît ensuite très rapidement pour devenir inférieure à 5 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de proteines totales 11jours après la germination. L'inactivation de l'expression du transgène 35S-uidA est post-transcriptionnelle, ainsi que l'ont demontré les expériences de "run-on" mettant en évidence une forte transcription du transgène 35S-uidA dans les plantes L1 montrant une très faible activité GUS (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757,
1998). Pour l'obtention de plantes mutantes de la lignée L1, 3000 graines de la lignée L1 ont été imbibées 16 heures dans une solution d'EMS (ethyl methanesulfonate) à 0,4%. Les graines ont ensuite été semées et les plantes obtenues ont été cultivées en serre jusqu'à obtenir des graines d'autofécondation. Celles-ci ont été à nouveau semées en serre et dans les plantes obtenues, l'activité GUS a été mesurée 1 mois après la germination. Les plantes présentant une activité élevée à ce stade ont été à la fois croisées avec des plantes de l'écotype Columbia (pour vérifier que le locus transgénique reste sensible à l'inactivation post-transcriptionnelle), rétrocroisées avec la lignée LI (pour évaluer l'état de récessivité vs dominance des mutations obtenues) et croisées entre elles (pour classer les différents mutants obtenus en groupe de complémentation, chaque groupe définissant un gène). 6 mutants indépendants sgs3 ont ainsi été isolés. Ces 6 mutations sont récessives. L'activité
GUS dans ces 6 lignées mutantes, 1 mois après germination, est comprise entre 2500 et
3500 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de proteines totales..

L'activité GUS dans ces lignées mutantes, 1 mois après germination, est comprise entre 2500 et 3500 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de protéines totales. Pour confirmer que les mutations sgs3 affectent l'expression du transgène 35S-
GUS au niveau transcriptionnel, l'activité GUS, l'accumulation de l'ARNm et le taux de transcription ont été mesurés par des tests fluorimétriques, par l'analyse de blots d'ARNm et par des expériences de "run-on". L'activité GUS est multipliée par un facteur de 300 dans les mutants sgs2 par rapport à la lignée L1alors que l'accumulation de l'ARNm est

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multipliée par un facteur de 250. Le taux de transcription n'est que multiplié par un facteur de 2. 6 par rapport à la lignée LI. Pour vérifier que les mutations sgs33 protégeaient de l'inactivation post-transcriptionnelle d'un autre gène que le gène uidA, un des mutants sgs3 (nommé sgs3-2) a été croisée avec la lignée 2a3 (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757, 1998). La lignée 2a3 est une lignée transgénique d'Arabidopsis thaliana résultant de la transformation d'une plante de l'écotype Columbia par la construction 2a (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757, 1998) contenant la partie transcrite du gène NIA2 d'Arabidopsis codant la nitrate reductase sous le contrôle du promoteur 35S et le gène de résistance à l'hygromycine hpt. Toutes les plantes de la lignée 2a3 homozygotes pour la construction 2a présentent une inactivation post-transcriptionnelle des gènes Nia2 (transgéniques et endogènes) conduisant à la chlorose de la plante puis à sa mort. Lorsque le locus transgénique 2a3 est à l'état hétérozygote, seule une partie des plantes subissent l'inactivation post-transcriptionnelle. Le stade à laquelle se met en place cette inactivation est variable d'une plante à l'autre. Chez certaines plantes l'inactivation est suffisamment tardive pour permettre la production de pollen et de graines. Les plantes hybrides issues du croisement entre le mutant sgs3-2 et la lignée 2a3 ont été cultivées en serre et les graines d'autofécondation ont été récoltées. Celles-ci ont été semées en serre et les plantes obtenues ne présentant pas de chlorose ont été conservées pour récolter leur graines d'autofécondation. Nous avons alors semé les différents lots de graines sur un milieu gélosé contenant 20mg/1 d'hygromycine. Parmi ceux-ci, certains ne donnaient que des plantes résistantes à l'hygromycine et ne montrant aucun signe de chlorose tout au long de leur développement. Parmi ces lignées résistantes à l'inactivation post-transcriptionnelle des gènes de nitrate reductase, certaines étaient également homozygotes pour la construction 23b. Nous avons également montré que les plantes de toutes ces lignées présentaient une activité GUS élevée tout au long de leur développement. Ces résultats montrent donc que la mutation sgs3, non seulement protège de l'inactivation post- transcriptionnelle du transgène 35S-uidA mais également des transgènes et gènes endogènes NIA2. Certaines de ces lignées résistantes à l'inactivation post- transcriptionnelle des gènes de nitrate reductase et homozygote pour le locus 2a3 ne possédaient plus la construction 23b. Ces plantes ont été nommées SGS3-2 2a3.

Afin de déterminer le rôle biologique du gène correspondant aux mutations sgs3, des mutant sgs3-1 ont été inoculées avec le virus de la mosaique du concombre (CMV) souche
I17F. Sur les plantes sauvages, l'infection par cette souche virale conduit à des plantes dont le développement est plus lent et altérée : de la rosette plus petites, hampe florale longue mais très souple, fertilité réduite mais non nulle. Chez les mutants sgs3-l, l'infection par cette souche virale conduit à une altération accrue du développement : les plantes ont un port particulièrement buissonant, les feuilles de la rosette sont petites et vrillées, la hampe florale atteint en fin de développement une taille de l'ordre de 5 cm, les plantes sont complètement stériles. Ces expériences montrent donc que le gène

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correspondant aux mutations sgs3 permet de limiter les effets négatifs sur le développement causés par l'infection du virus CMV.

Deux mutants sgs3-1 et sgs3-2 ont été croisées avec des plantes de l'écotype Landsberg. Sur ces plantes hybrides (FI) résultant de ces croisements, les graines d'autofécondation ont été récoltées. Ces graines ont été semées in vitro sur un milieu gélosé contenant 50 mg/l de kanamycine afin de sélectionner les plantes (F2) possédant le transgène 23b. Ces plantes résistantes à la kanamycine ont été repiquées et cultivées en serre. L'activité GUS dans ces plantes a été mesurée à différents stades de leur développement. Seules les plantes présentant une activité GUS élevée tout au long du développement (et donc homozygote pour la mutation sgs3) ont été conservées et les graines d'autofécondation ont été récoltées. 120 lignées F2 homozygotes pour la mutation sgs3-1 (lignées F2-1) et 90 lignées F2 homozygotes pour la mutation sgs3-2 (lignées F2-2) ont été ainsi obtenues. Les graines d'autofécondation de chacune de ces lignées ont été semées en serre et pour chaque lignée un pool de plantes a été récolté afin d'en extraire l'ADN. Ces ADN ont été utilisés pour localiser les mutations sgs3 sur le génome d'Arabidopsis. La localisation initiale a été réalisé grâce aux lignées F2-1. Les lignées F2- 2 nous ont ensuite permis de vérifier que la mutation sgs3-2 était localisée dans la même région du génome que la mutation sgs3-l. Ces analyses ont montré que les mutations sgs3 étaient situées entre les marqueurs moléculaires 13H2L et 3B3D. Le polymorphisme correspondant au marqueur moléculaire 13H2L a été révélé par l'hybridation (de type Southern blot) de l'ADN total de plantes d'Arabidopsis, digéré par l'enzyme de restriction HindIII, par un fragment d'ADN radioactif correspondant à l'extrémité gauche du chromosome artificiel de levure (YAC) 13H2 (sonde 13H2L). Le polymorphisme correspondant au marqueur moléculaire 3B3D a été révélé par l'hybridation (de type
Southern blot) de l'ADN total de plantes d'Arabidopsis, digéré par l'enzyme de restriction HindIII, par un fragment d'ADN radioactif correspondant à l'extrémité droit du YAC 3B3 (sonde 3B3).

Par hybridation moléculaire de type Southern sur une membrane sur laquelle a été transférée l'ADN d'une banque de chromosome artificiel de bactéries (BAC IGF) par les fragment d'ADN radioactif correspondant aux sondes 13H2L et 3B3D, nous avons pu déterminer que ces 2 fragments d'ADN hybridaient sur un même BAC : le BAC F20I20.

Ces résultats montrent donc que les mutations sgs3-1 et sgs3-2 affectaient une séquence d'ADN comprise dans le BAC F20I20.

De l'ADN du BAC F20I20 a ensuite été purifié. Il a été partiellement digéré par l'enzyme de restriction Sau3AI. Les fragments d'ADN résultant ont été clonés au site
BamHI de l'ADN de transfert du plasmide binaire (permettant la transformation de plantes via Agrobacterium) pBin+. Les plasmides résultant ont été introduit dans E. coli puis dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens C58pMP90. Les souches bactériennes résultantes ont été utilisées pour transformer des plantes des lignées sgs3-2 2a3. La souche bactérienne 356 a permis d'obtenir 20 lignées transgéniques. Parmi ces 20 lignées, 19 ont

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montré des signes de chlorose identiques à ceux observés sur la lignée 2a3. Sur 3 de ces plantes nous avons pu montré par hybridation de type northern en utilisant comme sonde le gène NIA2 d'Arabidopsis thaliana, que cette chlorose résultait de la non accumulation des transcrits des gènes de nitrate réductase (transgéniques et endogènes) et donc était due à l'inactivation post-transcriptionnelle des gènes de nitrate réductase. Parmi ces 19 plantes, 2 ont donné des graines d'autofécondation. Les plantes issues de ces graines, cultivées en serre, ont également montré des signes de chlorose.

La séquence d'ADN inséré au site BamHI du plasmide pBin+ et ayant conduit à l'isolement de la souche bactérienne 356 a été déterminée. Des sous-clones du clone 356 ont été réalisés dans le vecteur pBin+ et la même lignée sgs3-2 2a3 a été transformée par ces sous-clones afin de déterminer ceux capables de restaurer la fonction du gène SGS3. Le plus petit sous-clone capable de restaurer cette fonction constitue le gène SGS3 tel qu'il est decrit dans ce brevet. Par analyse informatique l'ORF de SGS3 a pu être prédite. La séquence du cDNA contenant l'ORF du gène SGS3 et donc la position des séquences promotrices, terminatrices et introniques de SGS3 ont été vérifiées après avoir isolé et cloné cette séquence. Pour l'isoler nous avons d'abord réalisé une réaction de reversetranscription à partir d'ARN total d'Arabidopsis thaliana. Puis nous avons réalisé une réaction de PCR sur ce pool de cDNA à l'aide du couple de primers p356AD' AAAATGAGTTCTAGGGCTGGTCC) et P356Y' (GTCTCAATCATCTTCATTGTGAAGGCC). Ces primers sont situés aux 2 extrémités de l'ORF de SGS3. Ce produit de PCR a été cloné et séquence.

En utilisant le logiciel BLAST aucune homologie significative n'a pu être trouvée entre la séquence SGS3 (en nucléotides ou en acides aminés) et une quelconque séquence présente dans les bases de données.

Exemple 2
Analyse des mutants sgs3
La séquence du gène SGS3 a été déterminée dans 5 mutants sgs3. Une réaction de
PCR a été effectuée sur l'ADN génomique de ces 5 mutants en utilisant les primers p356AD' et P356Y' (voir exemple 1). Cette réaction permet l'amplification de tout le gène SGS3. Le fragment amplifié grâce à cette réaction de PCR a été séquence.

Cinq mutations ponctuelles distinctes ont ainsi été identifiés chez les différents mutants sgs3. Ces mutations correspondent à quatre codons stop et un changement d'acide aminé. Les différentes mutations observés chez les mutants sgs3 sont représentés dans la figure 1. L'acide aminé marqué en gras indique la position de la mutation dans le polypeptide SGS3. * indique la présence d'un codon stop et () indique un nouvel acide aminé substitué à l'acide aminé marqué en gras touché par la mutation.

Exemple 3

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Construction de cassettes d'expression pour la surexpression et l'inhibition de SGS3
On réalise d'abord une réaction de type PCR sur de l'ADN complémentaire d'Arabidopsis thaliana en utilisant comme amorces les oligonucléotidiques suivants : p356AD' : AAAATGAGTTCTAGGGCTGGTCC P356Y' : GTCTCAATCATCTTCATTGTGAAGGCC
La séquence nucléotidique ainsi obtenue est ensuite traitée avec l'enzyme klenow pour générer aux extrémités de la séquence amplifiée des extrémités franches . Puis la séquence est clonée entre le promoteur 35S et le terminateur du virus de la mosaïque du chou-fleur au site SmaI du vecteur pRT 100.

Pour la surexpression de SGS3 on sélectionne les clones tels que la séquence correspondant à p356AD' se situe près du promoteur 35S. Pour l'inhibition de SGS3 on sélectionne les clones tels que la séquence correspondant à p356Y' se situe près du promoteur 35S. Cette construction Assgs3 permet l'expression d'un ARNm anti-sens de l'ARNm de SGS3.

Exemple 4
Transformation des plantes
Les cassettes d'expression construites tel qu'il est décrit ci-dessus sont ensuite introduites dans un vecteur binaire pour permettre leur introduction via Agrobacterium tumefaciens dans les plantes. Le vecteur binaire utilisé est le plasmide pBIN+ (Van Engelen et al., Transgenic Research 4,288-290, 1995). Ceci est réalisé en digérant les constructions obtenues ci-dessus par l'enzyme SphI (qui libère les cassettes d'expression) et en liguant le produit de cette digestion au plasmide pBIN+ digéré par l'enzyme SphI.

Claims (25)

1. Revendications 1) Polynucléotide comprenant un gène SGS3 de plante.
2. 2) Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 1; b) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide de la

   SEQ ID NO.1 ; c) un polynucléotide homologue à 90% au polynucléotide de la SEQ ID NO. 1; d) un fragment d'au moins 20 nucléotides d'un polynucléotide tel que défini en a), b) ou c).
3. 3) Polynucléotide comprenant la séquence codante d'un gène SGS3 de plante.
4. 4) Polynucléotide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les polynucléotides suivants: a) le polynucléotide de la SEQ ID NO. 2 ; b) un polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective à un polynucléotide de la SEQ ID N0.2; c) un polynucléotide homologue à 90% à un polynucléotide de la SEQ ID NO 2 ; d) un fragment d'au moins 20 nucléotides d'un polynucléotide tel que défini en a), b) ou c).
5. 5) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide de la SEQ ID NO. 3 ou pour un fragment d'au moins 15acides aminés d'un polypeptide de la SEQ ID NO. 3.
6. 6) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide antisens de la séquence codante d'un gène SGS3 de plante.
7. 7) Polynucléotide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide antisens de la séquence codante du gène SGS3 de la SEQ ID NO. 2.
8. 8) Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend le promoteur d'un gène SGS3 de plante.
9. 9) Polynucléotide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend le polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la

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   SEQ ID NO. 1 ou un fragment biologiquement actif du polynucléotide dont la séquence est comprise entre la position 1 et la position 695 de la SEQ ID NO. 1.
10. 10) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription : a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; b) un polynucléotide selon l'une des revendications 1-5; c) une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
11. 11) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription : a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte; b) un polynucléotide antisens selon l'une des revendications 6 ou 7 ; c) une séquence terminatrice dans ledit organisme hôte.
12. 12) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend dans le sens de la transcription : a) un promoteur selon l'une des revendications 8 ou 9; b) un polynucléotide codant pour un polypeptide hétérologue; c) une séquence terminatrice dans les cellules végétales ou les plantes.

    10-12.
13. 13) Vecteur d'expression ou de transformation comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 1-9 et/ou une cassette d'expression selon l'une des revendications
14. 14) Procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales ou des plantes, par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 9 et/ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 10-12 et/ ou un vecteur selon la revendication 13.
15. 15) Procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on transforme ladite plante avec ledit gène hétérologue; b) on inhibe l'expression du gène SGS3 dans ladite plante.
16. 16) Procédé selon la revendication 15caractérisé en ce que l'étape b) comprend la transformation de ladite plante avec un polynucléotide selon l'une des revendications 6 et 7 ou avec une cassette d'expression selon la revendication 11.

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17. 17) Procédé pour exprimer un gène hétérologue dans une plante caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on transforme ladite plante avec ledit gène hétérologue; b) on inactive le gène SGS3 dans ladite plante.
18. 18) Organisme hôte transformé comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 9 et/ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 10-

    12 et/ou un vecteur selon la revendication 13 .
19. 19) Organisme hôte selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène hétérologue codant pour un peptide ou une protéine d'intérêt.
20. 20) Organisme hôte selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons ou les cellules végétales et les plantes.
21. 21) Organisme hôte selon la revendication 20, caractérisé en ce que les plantes sont choisies parmi les plantes monocotylédones ou dicotylédones, en particulier des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, plus particulièrement le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton.
22. 22) Organisme hôte caractérisé en ce qu'il comprend un gène SGS3 de plante inactivé.
23. 23) Organisme hôte selon la revendication 22 caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les plantes monocotylédones ou dicotylédones, en particulier des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, plus particulièrement le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton
24. 24) Polypeptide SGS3 caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi les polypeptides suivants: a) le polypeptide de la SEQ ID NO. 3, b) un polypeptide homologue à 90% au polypeptide de la SEQ ID NO. 3 ; c) un fragment d'au moins 15acides aminés d'un polypeptide tel que défini en a) ou b).
25. 25) Utilisation d'un fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 pour l'identification du gène SGS3 ou de mutants du gène SGS3 dans les plantes.