FI102545B - Menetelmä ksylitolin sekä runsaasti ksylitolia sisältävien tuotteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

102545

Menetelmä ksylitolin sekä runsaasti ksylitolia sisältävien tuotteiden valmistamiseksi Förfarande för framställning av xylitol och produkter med hög xylitolhalt 5

Keksintö kohdistuu menetelmään ksylitolin sekä runsaasti ksylitolia sisältävien tuotteiden valmistamiseksi.

10

Alalla tunnetaan ksylitolin valmistaminen hydraamalla katalyyttisesti kiteistä D-ksyloosia tai runsaasti D-ksyloosia sisältäviä siirappeja. Kiteistä ksyloosia tai runsaasti ksyloosia sisältäviä siirappeja saadaan puolestaan esimerkiksi sellaisista kasvikunnasta peräisin olevista raaka-aineista kuten koivupuusta, maissin-15 tähkistä, jyvien kuorista tai manteleista.

Kun nämä raaka-aineet alistetaan happamaan hydrolyysiin erittäin rajuissa lämpötila- ja paineolosuhteissa, niin ksylaanit, jotka ovat D-ksyloosin polymeerejä, saadaan hajoamaan ksyloosiksi, jonka olennainen käyttömuoto on juuri 20 ksylitolin valmistaminen hydraamalla.

Tähän menetelmään liittyy kuitenkin lukuisia haittoja, joista merkittävimpinä • > # ’: voidaan mainita seuraavat: » * · « « « 25 - raaka-aineen pieni ksylaanipitoisuus, joka johtaa pieneen ksylitolisaantoon (8- 15 % käytetyn raaka-aineen painosta laskien) sekä sivutuotteiden huomattavien määrien muodostumiseen, joiden sivutuotteiden hyödyntäminen on : ' " : vaikeata tai mahdotonta, ja joiden hävittäminen jätteenä on osoittautunut : V ympäristöä voimakkaasti saastuttavaksi, 30 - ksyloosin ohella myös muiden sokereiden, eli glukoosista, mannoosista, galaktoosista ja arabinoosista koostuvaan ryhmään kuuluvien sokereiden läsnäolo raaka-aineiden hydrolysaateissa, jotka muut sokerit muuttuvat hydrattaessa vastaavasti sorbitoliksi, mannitoliksi, galaktitoliksi ja arabitoliksi, 2 102545 joiden fysikaaliset ominaisuudet ovat lähellä ksylitolin vastaavia ominaisuuksia, minkä seurauksena ksylitolin erottaminen on hyvin vaikeata; samoin galaktitolin, jota esiintyy tavallisesti näistä kasviraaka-aineista hydraamalla saaduissa hydrolysaateissa, ja joka kiteytyy yhtäaikaa ksylitolin kanssa siirap-5 peja väkevöitäessä, läsnäolo on epätoivottavaa, mikäli ksylitoli on tarkoitettu elintarvikkeisiin, koska mainittu galaktitoli saa aikaan harmaakaihia.

Ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 099 311, jossa kuvataan menetelmä D-arabitolin valmistamiseksi D-glukoosia fermentoimalla, mainitaan, että D-10 arabitoli on tärkeä lähtöaine D-ksyloosin valmistamiseksi D-ksyluloosin kautta; tässä julkaisussa ei esitetä kuitenkaan lainkaan niitä menettelytapoja, joilla D-ksyluloosi voitaisiin muuntaa D-ksyloosiksi, ksylitolista puhumattakaan.

Samoin vuonna 1972 japanilaisessa patenttijulkaisussa JP 47-13707 on ehdotettu, 15 että ksylitolia valmistettaisiin välivaiheena D-ksyloosia käyttämättä hydraamalla suoraan D-ksyluloosia, jota on saatu D-arabitolin aerobisella fermentoinnilla, jota D-arabitolia on puolestaan saatu edellä mainitussa ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 009 331 kuvatulla menetelmällä. Tämän menetelmän haittana on se, että mainittu hydraus tuottaa vain 50 % ksylitolia, joka sisältää epäpuhtaute-20 na saman määrän D-arabitolia, joka tekee ksylitolin kiteyttämisen mahdottomaksi, koska sitä on läsnä näin suurina määrinä. Näin ollen tällä menetelmällä ei kyetä valmistamaan ksylitolia siten, että sen puhtaus ja saanto olisivat hyvät. Itse asiassa ainoastaan D-ksyloosista ja sen optisesta isomeeristä, L-ksyloosista, • · · v ; saadaan katalyyttisella hydrauksella 100-prosenttisesti ksylitolia.

25

Samoin stereospesifisellä hydrauksella on yritetty tuottaa D-ksyluloosista ksylitolia hyvinä saantoina, ja jokin aika sitten on todettu (J. Ferm. Technol., voi. 66, • · · :...· no. 1, 33-36, 1988), että ksylitolia kyetään tuottamaan 75 %:n saannolla Ον ksyluloosista lähtien. Tämä stereospesifinen pelkistyminen tai hydraus saadaan 30 kuitenkin toteutumaan vain siten, että D-ksyluloosin 2 % liuosta käsitellään 24 tunnin aian immobilisoiduilla Mycobacterium smegmatis-lajin mikro-organismeil-la. Näin ollen edellä esitetyn perusteella on selvää, ettei tätä menetelmää voida käyttää teollisesti johtuen siitä, että 3 102545 - aika, joka tarvitaan D-ksyluloosin muuntumiseksi ksylitoliksi, on liian pitkä, - käytetyt pitoisuudet ovat liian pieniä, ja - käytettävät mykobakteerit aiheuttavat toksisuusongelmia, koska ne ovat ihmisessä patogeenisiä mikro-organismeja.

5

Samoin tiedetään, että Hochster ja Watson (National Research Council no. 3105 Ottawa, Kanada) ovat esimerkiksi toteuttaneet D-ksyluloosin entsymaattisen iso-meroinnin D-ksyloosiksi, mutta nämä tutkijat eivät ole kuitenkaan eristäneen D-ksyloosia täten saadusta isomeroidusta seoksesta, eivätkä he ole myöskään 10 ehdottaneet sen käyttämistä ksylitolin valmistamiseen. Tämä D-ksyluloosin isomeroituminen D-ksyloosiksi tapahtuu itse asiassa aina vain osittain, ja mainittu isomeroiminen toteutettiin sellaisissa lämpötila-ja etenkin pitoisuusolo-suhteissa, jotka tekevät menetelmän täysin sopimattomaksi teolliseen käyttöön.

15 Lisäksi Ohmomo ja hänen työtoverinsa ovat esittäneet, että erittäin runsaasti ksyloosia sisältävää siirappia saadaan isomeroimalla arabitolista saatua ksylu-loosisiirappia, mutta he eivät ole kuvanneet ksylitolin valmistamista tästä siirapista lähtemällä. Heidän mielenkiintonsa näyttää kohdistuneen pelkästään ksyloosin valmistukseen, joten he ovat menetelleet siten, että ksyloosipitoisuus 20 on saatu mahdollisimman suureksi isomeroimalla ksyluloosia hyvin pieninä kuiva-ainepitoisuuksina, eli 50 g/1, aktivoivien ionien suurten määrien läsnäollessa ja hyvin suuressa, lähes 9 ollessa pH-arvossa. Nämä kaikki olosuhteet ovat teolliseen menetelmään sopimattomia, koska näin suuret laimennokset edellyt- • · v · tävät valtavien tilavuuksien käsittelemistä, koska aktivoivat ionit ovat epäpuh- 25 tauksia, jotka on poistettava isomeroinnin jälkeen, ja etenkin koska tässä isomeroinnissa käytetty pH, jolla päästään suuriin ksyloosipitoisuuksiin, aiheuttaa värillisten hajoamis- ja epimeroitumistuotteiden muodostumista, joita • · · :’ tuotteita ei kyetä poistamaan isomeroidusta siirapista, minkä johdosta lopullinen • « katalyyttinen hydraus, jota mainitut tutkijat eivät ole tarkastelleetkaan, on 30 mahdoton.

Näin ollen teollisuuden käyttöön tarvitaan edelleen menetelmä, jolla ksylitolia kyettäisiin valmistamaan teollisesti D-ksyluloosista lähtien riittävän puhtaana ja riittävän suurina saantoina sellaisissa olosuhteissa, jotka eivät vaaranna terveyttä, 4 102545 jota ksyluloosia itseään ei saada kuin vain pieninä, noin 40 %:n saantoina D-glukoosista lähtien ja käyttäen välivaiheena D-arabitolia.

Keksinnön tavoitteena on siis erityisesti saada aikaan menetelmä ksylitolin 5 valmistamiseksi D-ksyluloosista, jota saadaan puolestaan D-glukoosista välivaiheena toimivan D-arabitolin kautta, tämän menetelmän tuottaessa ksylitolia niin suurina saantoina ja niin puhtaana, että tätä monivaiheista, D-glukoosista lopullista tuotetta tuottavaa menetelmää voitaisiin soveltaa teollisesti.

10 Oheisessa keksinnössä onnistuttiin löytämään ratkaisu tähän yli 20 vuotta esillä olleeseen ongelmaan tekemällä se havainto, että erittäin puhdasta ksylitolia kyettiin saamaan edullisissa taloudellisissa olosuhteissa hydraamalla katalyyttises-ti D-ksyluloosisiirappia, joka oli tätä ennen alistettu isomeroivaan entsyymi-käsittelyyn.

15 Näin ollen keksinnön mukainen menetelmä ksylitolin sekä runsaasti ksylitolia sisältävien tuotteiden valmistamiseksi on tunnettu siitä, että siinä - D-ksyluloosisiirappi isomeroidaan entsymaattisesti D-ksyloosia ja D-ksyluloo-20 siä sisältäväksi siirapiksi, minkä jälkeen ksyloosia poistamatta - tämä siirappi hydrataan katalyyttisesti, jolloin saadaan runsaasti ksylitolia sisältävä siirappi, • · * • · josta runsaasti ksylitolia sisältävästä siirapista joko poistetaan vettä tai se 25 käsitellään kromatografisesti tai josta siirapista ksylitoli erotetaan kiteyttämällä.

D-ksyluloosia voidaan saada sinänsä tunnetulla tavalla, erityisesti hapettamalla • · · mikrobiologisesti D-arabitolia, mikä onkin D-ksyluloosin edullinen valmistus- • · menetelmä, jota D-arabitolia saadaan D-glukoosin aerobisella fermentoinnilla. 30

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukainen menetelmä ksylitolin valmistamiseksi on tunnettu siitä, että lähtöaineena toimiva D-ksyluloosi valmistetaan seuraavilla peräkkäisillä vaiheilla, joissa: 5 102545 - D-glukoosisiirappia fermentoidaan aerobisesti Pichia-lajin osmofiilisella mikro-organismilla, joka muuntaa D-glukoosin D-arabitoliksi, - D-arabitolisiirappia fermentoidaan aerobisesti Acetobacter-, Gluconobakter-tai Klebsiella-lajin mikro-organismilla, joka tuottaa alkoholidehydrogenaasia, 5 joka lukenee muuntamaan D-arabitolin D-ksyluloosiksi, jolloin saadaan runsaasti D-ksyluloosia sisältävää siirappia.

Glukoosin aerobinen fermentaatio voidaan korvata muunnoksella, jossa glukoosi muunnetaan hapettamalla glukonihapoksi, joka voidaan dekarboksyloida kal-10 siumsuolanaan niinkutsutulla RUFFrin menetelmällä, jolloin saadaan D-ara-binoosia, kuten amerikkalaisessa patenttijulkaisussa 3 755 294 on esitetty. Sitten D-arabinoosi hydrataan sinänsä tunnetulla tavalla D-arabitolin aikaansaamiseksi.

Ilmeisestä monimutkaisuudestaan huolimatta keksinnön mukaisella menetelmäl-15 lä, sen vaiheiden erityisellä yhdistelmällä, saadaan ksylitolia saantoina, jotka ovat yli 25 % ja jopa 40 % lähtöaineena käytetystä D-glukoosista laskien, joka D-glukoosi on puolestaan yleisesti esiintyvä ja kohtuuhintainen raaka-aine.

Tekniikan nykytason mukaisiin menetelmiin verrattuna 20 - käytetyt lähtöainemäärät ja - läsnäolevien epäpuhtauksien määärä sekä ksylitolin valmistuksessa syntynei- :: den sivutuotteiden tilavuus • · • ♦ · ♦ « .

25 on saatu selvästi pienemmiksi.

Muista eduista voidaan mainita • · · * · • · · - ettei raaka-aineen eli D-glukoosin saanto-ongelmia ole; 30 - että tätä raaka-ainetta voidaan käsitellä tavanomaisilla laitteistoilla, joiden ei täydy kestää erittäin suuria lämpötiloja, tai paineita eikä syövyttäviä väliaineita; - ettei saatu ksylitoli sisällä galaktoosia, jolloin sitä voidaan käyttää elintarvikkeissa.

6 102545

Oheinen hakija on lisäksi todennut, että edellä kuvatun ksylitolin valmistusmenetelmän suorituskykyä voidaan vielä parantaa täysin odottamattomasti siten, että ksylitolin kiteytyksestä saadut, runsaasti ksylitolia sekä myös runsaasti arabitolia sisältävät emävedet fermentoidaan uudestaan tämän saman, alkoholi-5 dehydrogenaasia tuottavan mikro-organismin avulla. Hakija on todennut, että tällainen fermentoitu siirappi, joka sisältää runsaasti D-ksyluloosia, mutta joka sisältää myös huomattavan osuuden muuttumattomana pysyvää ksylitolia, voidaan isomeroida vaikeuksitta ksyloosi-isomeraasilla runsaasti D-ksyloosia ja ksylitolia sisältäväksi siirapiksi toisin kuin jokin aika ilmestyneessä julkaisussa 10 Izumori ja Tuzaki, J. Ferment. Technol., voi. 66, no. 1, 33-36 (1988), on esitetty. Tässä julkaisussa on tehty se johtopäätös, että ksylitoli toimii ksyloosi-isomeraa-sin kilpailevana inhibiittorina.

Izumorin ja Tuzakin päätelmien perusteella ksylitolin pelkän läsnäolon isomeroi-15 tavissa D-ksyluloosisiirapeissa tulisi vaikuttaa hyvin haitallisesti entsymaattiseen isomeroitumisreaktioon.

Isomeroitu, runsaasti D-ksyloosia, ksylitolia ja vähemmän D-ksyluloosia sisältävä siirappi voidaan hydrata uudestaan runsaasti ksylitolia sisältävän siirapin saami-20 seksi, josta siirapista ksylitoli saadaan talteen vaivattomasti puhtaassa, kiteisessä muodossaan.

Vähemmän puhdasta ksylitolia voidaan myös saada fraktioimalla hydrattu • · v siirappi esimerkiksi sellaisella kromatografisella menetelmällä, joka on kuvattu 25 ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 344 514. Tämän kromatografisen frakti-oinnin jälkeen toteutetaan vedenpoisto tai kiteytys. Mainitun siirapin fraktioiminen on helppoa, sillä toisin kuin mitä mainitussa patenttijulkaisussa esitetään I·· ;. hydrattujen puuhydrolysaattien fraktioinnista, keksinnön mukainen menetelmä ei • * :.: tuota mannitolia eikä galaktitolia, jotka vaikeuttaisivat tätä fraktiointia. Kiteytyk- 30 sen emävedet tai runsaasti D-arabitolia sisältävä kromatografinen fraktio • · kierrätetään edullisesti takaisin D-arabitolin muuntamiseksi D-ksyluloosiksi.

Tällä tavalla meneteltäessä tuloksena on D-arabitolin lähes täydellinen muuntuminen ksylitoliksi, saannon ollessa täysin odottamattomasti lähes 100 %, otta 7 102545 matta kuitenkaan huomioon niitä väistämättömiä häviöitä, jotka johtuvat tällaisessa menetelmässä edullisista tai välttämättömistä, välivaiheena toteutetuista puhdistuksista ja väkevöinneistä.

5 Keksintö on ymmärrettävissä paremmin seuraavan kuvauksen, keksintöä rajoittamattomien esimerkkien sekä liitteenä olevan piirustuksen avulla, mainitun kuvauksen, piirustuksen ja mainittujen esimerkkien, jotka täydentävät toisiaan, liittyessä edullisiin, keksintöä rajoittamattomiin suoritusmuotoihin.

10 Mainitussa piirustuksessa kuvio 1 esittää kaavamaisesti keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamista; kuviot 2 ja 3 esittävät kaavamaisesti mainitun menetelmän kahta edullista 15 suoritusmuotoa.

Kuvio 1 esittää kaavamaisesti: - vaihetta M.,, jossa D-ksyluloosisiirappi isomeroidaan entsymaattisesti runsaasti 20 D-ksyloosia sisältäväksi siirapiksi, - vaihetta M2, jossa tämä runsaasti D-ksyloosia sisältävä siirappi hydrataan katalyyttisesti runsaasti ksylitolia sisältäväksi siirapiksi, ;... - vaihetta M3, jossa ksylitoli otetaan talteen tästä runsaasti ksylitolia sisältävästä • · v siirapista kiteyttämällä, jolla talteenotolla saadaan ksylitolia M4:n mukaisesti 25 sekä emävedet Ms:n mukaisesti.

Kuvio 2 esittää kaavamaisesti: ··· « ··· • · - vaihetta F,, jossa D-glukoosisiirappi fermentoidaan aerobisesti Pichia-lajin » · 30 osmofiilisella mikro-organismilla, joka muuntaa D-glukoosin D-arabitoliksi, - vaihetta F2, jossa D-arabitoli fermentoidaan aerobisesti alkoholidehydrogenaa-sia tuottavalla Acetobacter-lajin mikro-organismilla, joka muuntaa D-arabito-lin D-ksyluloosiksi, sekä - kuvion 1 mukaisia vaiheita M1t M2, M3, M4 ja M5.

8 102545

Kuvio 3 esittää kaavamaisesti: - kuvion 2 mukaisia peräkkäisiä vaiheita F1} F2, M„ M2, M3, M4 ja M5, - vaiheessa M3 ksylitolia kiteytettäessä saatujen emävesien käsittelyä uusilla 5 peräkkäisillä vaiheilla F2, M„ M2, M3, M4 ja Ms P:n mukaisesti vaiheeseen F2 kierrättämisen jälkeen.

Glukoosin fermentoimiseen voidaan käyttää viljelyalustaa, jolla on seuraava koostumus: 10 - dekstroosi 150-200 g/1 - orgaaninen typpi 2-4 g/1 (Nx6,25) (maissin liotuslientä tai hiivauutetta) - KH2P04 1-3 g/1 15 - MgS04.7H20 1-2 g/1 ja joka laitetaan fermentoriin, steriloidaan ja siihen siirrostetaan noin 10 % viljelmää, joka on saatu kasvattamalla 24 tunnin ajan Pichia-lajin mikro-organismia, esimerkiksi Pichia Ohmeri-kantaa no. 20209, joka on talletettu kantakokoel-20 maan ATCC (tai Pichia farinosa-kantaa), käyttämällä kasvatukseen esimerkiksi sellaista elatusalustaa, jolla on seuraava koostumus: : -glukoosi 50 g/1 : V - hiivauute 10 g/1 25 - KH2P04 3 g/1 - MgS04.7H20 1 g/1.

Fermentoiminen toteutetaan noin 30 eC:n lämpötilassa 80-100 tumiin ajan :Y ilmastaen alustaa nopeudella, joka vastaa 1-1,5 tilavuutta ilmaa viljelmän 30 tilavuutta kohden minuutissa, pH-arvon ollessa alueella 4-6, edullisesti noin 4,5, säilyttäen se edullisesti ammoniakin avulla, jolloin arabitolipitoisuudeksi saadaan yleensä 65-90 g/1, tämän arabitolin muodostaessa 70-85 % viljelyalustassa läsnäolevista sokereista tämän fermentoinnin päättyessä, läsnäolevien sokeriepä-puhtauksien ollessa erityisesti ksylitolia, jota muodostuu samanaikaisesti arabito- 9 102545

Iin kanssa, sekä fermentoitumatonta glukoosia.

Arabitolisaanto käytetystä glukoosista laskien on noin 40-50 %.

5 Sitten fermentorin koko sisältö (runsaasti arabitolia sisältävä fermentointiliemi) voidaan steriloida mikro-organismien tuhoamiseksi, minkä jälkeen alustaan lisätään jälleen (noin 10 %) siirrosteeksi Acetobacter suboxydans-viljelmää.

Saattaa olla edullista puhdistaa runsaasti arabitolia sisältävä fermentointialusta 10 sentrifugoimalla tai suodattamalla ennen asetobakteerin siirrostamista siihen.

Lisäksi tätä puhdistamista voidaan täydentää suolanpoistolla, värinpoistolla sekä väkevöinnillä, jonka avulla D-arabitoli voidaan kiteyttää siten, että päästään lähes 98 %:n puhtauteen ja noin 40 %:n saantoon käytetystä glukoosista laskien. 15

Edellisessä vaiheessa saatu D-arabitoli voidaan fermentoida edullisesti alueella 65-220 g/1 olevana pitoisuutena orgaanista typpeä ja mineraalisuoloja sisältävässä viljelyalustassa, joita ravinteita voidaan lisätä alustaan sitä enemmän, mitä paremmin arabitoli on puhdistettu. Alan asiantuntija kykenee määrittämään vai-20 vattomasti nämä sopivat määrät, jotka ovat sellaisia, että alusta saadaan sisältämään: / · ·. - orgaaninen typpi 1-2 g/1 -kh2po4 1 g/1 25 - MgS04.7H20 1 g/1.

Esiviljelmä on edullisesti Acetobacter suboxydans-viljelmä, joka on saatu • · .·’· viljelemällä tätä mikro-organismia noin 20 tunnin ajan alustassa, jonka koostu- • · mus on seuraava: • * · · 30 ‘ - arabitoli 50 g/1 ,; ; - sorbitoli 2 g/1 :... - hiivauute 2 g/1 - KH2P04 0,2 g/1 10 102545 - MgS04-7H20 0,2 g/1 - CaC03 5 g/1.

D-arabitolin fermentointi toteutetaan alueella 20-40 °C olevassa lämpötilassa 5 ilmastaen nopeudella, joka vastaa 1-1,5 tilavuutta ilmaa viljelmän tilavuutta kohden minuutissa, pH-arvon ollessa alueella 4,0-6,0 yleensä sellaisen ajanjakson ajan, jonka pituus on 24-48 tuntia, ja jonka päättyessä 95 % viljelyalustassa läsnäolleesta D-arabitolista on muuttunut käytännöllisesti katsoen kvantitatiivisesti D-ksyluloosiksi. On edullista, ettei fermentointia jatketa tätä kauempaa, 10 koska tällöin muodostuisi sokereiden tai niiden johdannaisten hajoamis- tai vaihtoreaktiotuotteita, joiden kerääntyminen saattaisi häiritä myöhempiä vaiheita.

Oheisen keksinnön mukaisesti ksylitolin kiteytyksestä saatavat emävedet voidaan 15 myös edullisesti fermentoida asetobakteereita käyttäen, koska ne sisältävät runsaasti D-arabitolia.

Todetaan, ettei ksylitolin läsnäolo suurena määränä arabitoliin nähden häiritse tätä fermentointia, kunhan vain arabitolin ja ksylitolin yhteinen pitoisuus pysyy 20 pienempänä kuin 220 g/1.

Tässä tapauksessa asetobakteeri hapettaa pelkästään D-arabitolin D-ksyluloosik- . ; . si, ksylitolin hapettumatta ksyluloosiksi vaan sen pysyessä muuttumattomana, • · · mikäli fermentointi pysäytetään, kun D-arabitolin osuus läsäolevista sokereista 25 on enää vain 1-5 %.

. · · ·. Tällaisellaasetobakteerikäsittelylläsaatujenfermentointiliemiensokerikoostumus « .·.· vaihtelee ja riippuu arabitolin puhtaudesta. Liemissä läsnäoleva ksylitoli ei fermentoidu eikä muunnu kuvatuissa olosuhteissa.

30

Fermentointiliemi voidaan puhdistaa sinänsä tunnetulla tavalla suodattamalla, •. · . poistamalla väri aktiivihiilellä ja poistamalla suolat, minkä jälkeen se voidaan väkevöidä ennen isomerointivaiheeseen johtamista.

11 102545

Mainittu puhdistaminen saattaa olla välttämätöntä, mikäli isomerointi toteutetaan jatkuvana immobilisoidun entsyymin avulla tulppavirtareaktorissa; tämä puhdistaminen on tarpeetonta silloin, kun isomerointi toteutetaan epäjatkuvana panosoperaationa vapaata entsyymiä käyttäen.

5

Isomerointivaiheessa voidaan käyttää sellaista kaupallisesti saatavaa glukoosi-isomeraasia, jota käytetään runsaasti fruktoosia sisältävien maissisiirappien valmistamiseen, ja joista voidaan mainita 10 - yhtiön Suomen Sokeri nimellä SPEZYME markkinoima entsyymi; - entsyymi, jota voidaan saada oheiselle hakijalle myönnetyn ranskalaisen patenttijulkaisun FR 2 353 562 mukaisesti.

Käytetty entsyymimäärä on edullisesti sellainen, että reaktion tasapaino saavute-15 taan ajanjaksossa, jonka pituus on 4 minuutista 48 tuntiin, aina käytetystä jatkuvasta tai epäjatkuvasta tekniikasta riipuen; entsyymiä suojaavan aineen, esimerkiksi natriumbisulfiitin ja/tai magnesiumsuolan läsnäolo on toivottavaa.

Isomerointi toteutetaan alueella 40-80 °C olevassa lämpötilassa ja edullisesti 20 alueella 6,0-8,5 olevassa pH-arvossa.

Yleensä isomerointivaiheen parametrit valitaan siten, että noin 50-75 % isome- .... roitavassa siirapissa läsnäolevasta D-ksyluloosista muuttuu D-ksyloosiksi.

• · « 25 Isomeroinnin päättyessä isomeroidun siirapin sokerikoostumus riippuu luonnollisestikin isomeroitavan siirapin koostumuksesta. Se sisältää sitä vähemmän ... ksyloosia, mitä enemmän isomeroitava siirappi sisälsi ksylitolia.

• · • · • ·

Yllättäen ollaan todettu, ettei glukoosifermentaatiossa samanaikaisesti arabi tolin • « · · 30 kanssa muodostuneen ksylitolin läsnäolo, joka johtuu keksinnön edullisessa [ suoritusmuodossa kuitenkin olennaisesti emävesien kierrättämisestä asetobaktee- reiden avulla toteutettavaan mikrobiologiseen hapetusvaiheeseen, vaikuta glu-koosi-isomeraasin toimintaan, mikä nähdään siitä, että D-ksyluloosin suurin mahdollinen konversio D-ksyloosiksi on yhtä suuri (noin 75 %) kuin aikaisem 12 102545 min saavutettu konversio puhdasta ksyloosia isomeroitaessa, mikä on täysin yllättävää, kuten edellä on jo esitetty.

Isomeroinnin jälkeen saatu, runsaasti D-ksyloosia sisältävä siirappi puhdistetaan 5 poistamalla siitä suolat, minkä jälkeen se hydrataan katalyyttisesti käyttäen katalyyttina ruteniumia tai Raney-nikkeliä.

Hydrausvaihe toteutetaan edullisesti käyttämällä katalyyttina Raney-nikkeliä, yli 20 baarin, edullisesti alueella 40-70 bar olevassa vetypaineessa, alueella 100-150 10 eC olevassa lämpötilassa, pitoisuuden ollessa 20-60 %. Hydraamista jatketaan niin kauan, kunnes pelkistyvien sokereiden pitoisuus hydratussa siirapissa on alle 2 %, edullisesti alle 1 % ja etenkin alle 0,5 % (pelkistyvien sokereien pitoisuus määritetään dekstroosipainoekvivalenttina kuiva-aineesta).

15 Sitten täten saatu hydrattu, erittäin runsaasti ksylitolia sisältävä siirappi suodatetaan katalyytin poistamiseksi, minkä jälkeen siitä poistetaan suolat.

Tämän hydratun siirapin ksylitolipitoisuus, joka riippuu hydrattavan siirapin koostumuksesta, on yleensä yli 80 % ja se voi olla yli 90 %.

20 Tästä siirapista voidaan poistaa vesi ja sitä voidaan käyttää sellaisenaan teknisissä sovellutuksissa.

• · · • ·

Puhtaampaa tuotetta voidaan saada fraktioimalla tämä siirappi kromatografisesti 25 esimerkiksi ranskalaisen patenttijulkaisun FR 2 344 515 mukaisesti; täten saadusta tuotteesta poistetaan vesi tai se kiteytetään.

··· .·.· Puhtaan ksylitolin saamiseksi mainittu siirappi väkevöidään, minkä jälkeen se • · • · jäähdytetään ksylitolin kiteyttämiseksi, ja tämä kiteyttäminen toteutetaan yhteen 30 tai useampaan kertaan.

Siirappi väkevöidään edullisesti siten, että sen kuiva-ainepitoisuus saadaan noin arvoon 84 %, ja tämä kuiva-ainepitoisuus voi olla sitä pienempi, mitä enemmän siirappi sisältää ksylitolia. Sitten väkevöity ksylitolisiirappi jäähdytetään hitaasti 13 102545 sen jälkeen, kun siihen on lisätty ksylitolia olevia kidealkioita. Kidealkioita voidaan myös lisätä ksylitolisiirapin väkevöinnin aikana. Siirappi jäähdytetään edullisesti noin 20 °C:n lämpötilaan samalla sitä hitaasti sekoittaen.

Kiteytyksen päätyttyä, mikä tapahtuu yleensä 20-90 tunnin pituisen ajanjakson 5 kuluttua, täten saatu kiteytynyt massa lingotaan ja ksylitolikiteet pestään ja kuivataan.

Tämän ksylitolin puhtaus on yleensä yli 97 %.

10 Runsaasti sekä ksylitolia että myöskin arabitolia sisältävät kiteytyksen emävedet saadaan ehtymään yhdellä tai useammalla kiteytyksellä siten, että niiden ksylito-lipitoisuus voi olla niinkin alhainen kuin 50 % tai jopa vain 45 %.

Keksinnön mukaisen edullisen suoritusmuodon mukaisesti nämä emävedet 15 johdetaan takaisin mikrobiologiseen hapetusvaiheeseen, entsymaattiseen isome-rointivaiheeseen, katalyyttiseen hydrausvaiheeseen ja kiteytysvaiheeseen.

Ksylitoli voidaan myös ottaa niistä talteen kromatografisella menetelmällä.

20 Esimerkki 1 D-ksyluloosisiirappi, jota saatiin D-glukoosista D-arabitolin kautta kaksinkertai- ... sella fermentaatiolla, D-arabitolia välillä kiteyttämättä, puhdistettiin suodatta- 1^1 maila sekä poistamalla siitä väri ja suolat, minkä jälkeen se väkevöitiin siten, 25 että sen kuiva-ainepitoisuudeksi saatiin 2 %.

,*·· Tämän siirapin koostumus oli seuraava: • · · < · • « » · • · - D-arabitoli 1 % I M t 30 - D-ksyluloosi 95 % - D-ksylitoli 3 % - muut 1 %.

Siirappi johdettiin 65 C°:n lämpötilassa immobilisoitua glukoosi-isomeraasia 14 102545 (SPEZYME) sisältävän kolonnin läpi sen jälkeen, kun sen pH oli asetettu arvoon 7,7 natriumkarbonaatilla, ja sen jälkeen, kun siihen oli lisätty 0,4 g/1 natriumbisulfiittia ja 1 g/1 magnesiumkloridia.

5 Siirappia johdettiin kolonnin läpi nopeudella 3 tilavuutta siirappia/kolonnin tilavuus/tunti.

Tällä isomerointireaktiolla saatiin isomeroitu siirappi, jolla oli seuraava koostumus: 10 - D-arabitoli 1 % - D-ksyluloosi 25 % - D-ksyloosi 70 % - D-ksylitoli 3 % 15 - muut 1 %.

Yllättäen voitiin todeta, ettei glukoosin fermentointivaiheessa samanaikaisesti arabitolin kanssa muodostuneen ksylitolin, joka pysyi muuttumattomana fermen-toitaessa arabitoli ksyluloosiksi, läsnäolo häirinnyt isomerointireaktiota, sillä 20 saatu ksyloosimäärä siirapissa ennen isomerointia läsnäolleeseen ksyluloosiin nähden oli lähes 75 % eli yhtäsuuri kuin aikaisemmin puhdasta ksyloosia isomeroimalla saatu suhteellinen määrä.

Tästä runsaasti ksyloosia sisältäneestä siirapista poistettiin suolat ja sitten se 25 hydrattiin 50 baarin vetypaineessa Raney-nikkelin läsnäollessa 120 eC:n lämpöti- ... lassa. 3 tuntia kestäneen hydrauksen jälkeen pelkistyvien sokereiden osuus * · siirapissa oli 0,1 %.

• · 4 • · • ·

Siirapin koostumus oli seuraava: 30 - D-arabitoli 13,5 % - ksylitoli 85,5 % - muut 1 %.

15 102545 Tästä siirapista poistettiin suolat ja se väkevöitiin siten, että kuiva-ainepitoisuudeksi saatiin 84 %, ja se jäähdytettiin 30 tunnin aikana 60 °C:sta 25 eC:een samalla hitaasti sekoittaen sen jälkeen, kun siihen oli lisätty ksylitolikiteitä.

5 Saatu kiteytynyt massa lingottiin ja pestiin, jolloin saatiin puhdasta kiteistä ksylitolia 50 %:n saannolla käytetyn ksyluloosisiirapin kuivapainosta laskien.

Kiteytyksen emävedet väkevöitiin uudestaan siten, että niiden kuiva-ainepitoisuudeksi saatiin 86 %, ja ne johdettiin uudestaan kiteytykseen. Niistä saatiin toinen 10 erä puhdasta kiteistä ksylitolia, minkä ansiosta kiteytyksen saannoksi saatiin 70 %.

Toisen kiteytyksen jälkeen emävesien koostumus oli seuraava: 15 - D-arabitoli 45 % - ksylitoli 52 % - muut 3 %.

Tällä tavalla saatiin kiteistä ksylitolia 28 %:n saannolla käytetystä glukoosista 20 laskien.

Esimerkki 2

Fermentoriin, jonka kokonaiskapasiteetti on 10 m3, laitettiin: 25 ... - 1200 kg kiteistä dekstroosi-monohydraattia, ♦ · ΓΙ - 16 kg hiivauutetta, - 8 kg yhdistettä KH2P04, 8 kg yhdistettä MgS04»7H20.

30

Sen jälkeen, kun viljelyalusta oli steriloitu ja jäähdytetty 30 eC:n lämpötilaan, fermentoriin siirrostettiin 800 1 edeltäkäsin viljelemällä saatua, 24 tunnin ikäistä Pichia Ohmeri-viljelmää (ATCC 20209), joka on esimerkiksi kuvattu ranskalaisessa patenttijulkaisussa FR 2 009 331.

16 102545

Viljelyalustaa ilmastettiin koko sen ajanjakson ajan, jolloin glukoosia muunnettiin arabitoliksi, eli 90 tunnin ajan nopeudella 130 Nm3 tunnissa, säätäen pH arvoon 4,5 ammoniakkia lisäämällä.

5 Tällä tavalla saatu fermentointiliemi suodatettiin mikro-organismien erottamisek si, ja sitten siitä poistettiin väri aktiivihiilellä ja suolat ioninvaihtohartseilla käyttäen ensin vahvaa kationihartsia ja sitten vahvaa anionihartsia.

Saadulla värittömällä hartsilla oli seuraava koostumus: 10 - arabitoli 95 % - ksylitoli 3 % - glukoosi 1 % - muut 1 %.

15 Tätä puhdistettua siirappia väkevöitiin haihdutus-kiteytyslaitteessa siten, että saatiin D-arabitolikiteiden paksu massa, minkä jälkeen nämä kiteet lingottiin ja pestiin.

20 Emävedet väkevöitiin uudestaan toisen D-arabitolierän saamiseksi niistä, ja D-arabitolia saatiin valkoisina kiteinä, joiden puhtaus oli 99 %, saannon ollessa 35 % käytetystä glukoosista laskien.

Fermentoriin, jonka tilavuus oli 10 m3, lisättiin 800 kg edellisestä vaiheesta 25 saatuja D-arabitolikiteitä sekä 800 kg esimerkistä 1 saatujen ksylitoliemävesien kuiva-ainetta, minkä jälkeen fermentoriin lisättiin: • · · • » • · ’* - 16 kg hiivauutetta, - 8 kg KH2P04, ·:·*.' 30 - 8 kg MgS04.7H20 - 6800 litraa vettä.

Tämän viljelyalustan sokerikoostumus oli seuraava: 17 102545 - arabitoli 72,5 % - ksylitoli 26 % - muut 1,5 %.

5 Steriloinnin ja jäähdyttämisen jälkeen 600 1 edeltäkäsin viljelemällä saatua, 24 tunnin ikäistä Acetobacter suboxydans-viljelmää, joka oli saatu viljelemällä alustassa, jonka koostumus oli seuraava: - arabitoli 50 g/1 10 - sorbitoli 2 g/1 - hiivauute 2 g/1 - KH2P04 0,2 g/1 - MgS04.7H20 0,2 g/1.

15 Sen jälkeen, kun alustaa oli fermentoitu 24 tunnin ajan ilmastaen nopeudella 1 tilavuus ilmaa/tilavuus/tunti, fermentorin lämpötila nostettiin 60 °C:een, siihen lisättiin natriumbisulfiittia ja pH asetettiin arvoon 7,7 natriumkarbonaatilla. Sitten siihen lisättiin 16 litraa yhtiön Gist Brocades markkinoimaa nestemäistä glukoosi-isomeraasia, jonka aktiivisuudeksi saatiin 4000 kansainvälistä yksik-20 köä/ml. Isomeroinnin jatkuttua näissä olosuhteissa 6 tunnin ajan viljelyalustan koostumus, joka oli ennen isomerointia seuraava: ·' - ksyluloosi 71,5 % - ksylitoli 27 % 25 - muut 1,5 % • · · oli vakiintunut isomeroinnin jälkeen seuraavaksi: • · • · - ksyluloosi 18,6 % "·" 30 - ksyloosi 52,9 % - ksylitoli 27 % - muut 1,5 %.

Voidaan siis todeta, etteivät erittäin suuret ksylitolipitoisuudet eivätkä fermen- 18 102545 tointiepäpuhtaudet olleet häirinneet ksyluloosin isomerointia ksyloosiksi, koska muuntumisasteeksi saatiin lähes 75 %.

Tämä siirappi suodatettiin, siitä poistettiin väri ja suolat, minkä jälkeen se 5 väkevöitiin siten, että kuiva-ainepitoisuudeksi saatiin 40 %, ja hydrattiin esimerkin 1 mukaisissa olosuhteissa.

Tällöin saatiin siirappi, jonka koostumus oli seuraava: 10 - ksylitoli 89,2 % - arabitoli 9,3 % - muut 1,5 %.

Tämä siirappi voitiin kiteyttää helposti esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä.

15

Esimerkki 3

Esimerkissä 1 ksylitolin toisesta kiteytyksestä saadut emävedet laimennettiin siten, että niiden kuiva-ainepitoisuudeksi saatiin 200 g/1, minkä jälkeen niihin 20 lisättiin hiivauutetta ja mineraalisuoloja esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

Emävedet fermentoitiin Acetobacter suboxydans-bakteerilla esimerkissä 2 kuvatuissa olosuhteissa, minkä jälkeen saatiin viljelyalusta, jolla oli seuraava sokerikoostumus: 25 - ksyluloosi 43,7 % *;·; - ksylitoli 53 % « · *·' . - muut 3,3 %.

• · · · '·“ 30 Tämän viljelyalustan isomerointi toteutettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla, jolloin saatiin isomeroitu liemi, jolla oli seuraava sokerikoostumus: - ksyloosi 32,4 % - ksyluloosi 11,3 % 102545 19 - ksylitoli 53 % - muut 3,3 %.

Jälleen kerran voidaan todeta, että täysin yllättävällä tavalla ksylitolin, joka oli 5 määrällisesti huomattavin komponentti isomeroitavassa liemessä, läsnäolo ei häirinnyt D-ksyluloosin isomerointia D-ksyloosiksi.

Esimerkin 1 mukaisissa olosuhteissa toteutettua hydrausta varten isomeroitu liemi suodatettiin ja siitä poistettiin väri sekä suolat, minkä jälkeen se väkevöi-10 tiin siten, että kuiva-ainepitoisuudeksi saatiin 40 %.

Täten saadulla hydratulla siirapilla oli seuraava koostumus: - ksylitoli 91 % 15 - arabitoli 5,7 % - muut 3,3 %.

Kolmella kiteytyksellä kiteytettävästä siirapista saatiin poistetuksi 80 % sen sisältämästä kuiva-aineesta puhtaana ja kiteytyneenä ksylitolina, jolloin esimer-20 kissä 1 saavutettu 28 %:n saanto nousi 37 %:iin kiteistä ksylitolia käytetystä glukoosista laskien.

Näissä esimerkeissä esitettyjen numeroarvojen perusteella todetaan, että keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan kiteistä ksylitolia D-ksyluloosista ja näin 25 ollen D-glukoosista sellaisella saannolla, jota ei saavuteta yhdelläkään ksylu- ... loosireitiin perustuvalla menetelmällä, tämän saannon ollessa lisäksi paljon suu- » · V: rempi kuin ne saannot, joihin päästään kasvikunnasta saatavien, ksylaaneja • · \ . sisältävien raaka-aineiden hydrolyysilla.

• · · · 30

Claims (8)

1. Menetelmä ksylitolin sekä runsaasti ksylitolia sisältävien tuotteiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että siinä 5 D-ksyluloosisiirappi isomeroidaan entsymaattisesti D-ksyloosia ja D-ksylu-loosia sisältäväksi siirapiksi, minkä jälkeen ksyloosia poistamatta tämä siirappi hydrataan katalyyttisesti, jolloin saadaan runsaasti ksylitolia sisältävä siirappi, 10 josta runsaasti ksylitolia sisältävästä siirapista joko poistetaan vettä tai se käsitellään kromatografisesti tai josta siirapista ksylitoli erotetaan kiteyttämällä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtö- 15 aineena käytettävä D-ksyluloosisiirappi saadaan fermentoimalla aerobisesti D-arabi-tolia.

·;·; 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtö- * ·'; ’ aineena käytettävä D-arabitoli saadaan fermentoimalla aerobisesti D-glukoosia.

!!! 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että D-arabitoli saadaan hydraamalla D-arabinoosia. • · • · · • t ·

5. Menetelmä ksylitolin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää • · · 25 * · • · · • « < I.! - vaiheen, jossa D-arabitoli muunnetaan mikrobiologisesti D-ksyluloosiksi • · ’·’ käyttäen alkoholidehydrogenaasia tuottavia mikro-organismeja, • · · - vaiheen, jossa edellisestä vaiheesta saatu D-ksyluloosi muunnetaan entsy- ' maattisesti D-ksyloosiksi glukoosi-isomeraasin avulla, 30. vaiheen, jossa edellisestä vaiheesta saatu D-ksyloosisiirappi hydrataan kata lyyttisesti runsaasti ksylitolia sisältäväksi siirapiksi, Äl 102545 vaiheen, jossa ksylitoli otetaan talteen kiteyttämällä edellisestä vaiheesta saadusta, runsaasti ksylitolia sisältävästä siirapista, ja nämä kiteet erotetaan emävesistään.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä ksylitolin valmistamiseksi, tun nettu siitä, että D-arabitolia saadaan muuntamalla mikrobiologisesti D-glukoosia osmofiilisten Pichia-suvun hiivojen avulla.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emävedet, 10 joista on poistettu kiteistä ksylitolia, kierrätetään takaisin vaiheeseen, jossa D- arabitoli muunnetaan mikrobiologisesti D-ksyluloosiksi.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineena käytetään emävesiä, joista on poistettu kiteistä ksylitolia. 15 • 1 · I I • · • · · • · · • 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · t · • « · • I I • 102545