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ES2985240T3 - Conjugados de saponina - Google Patents

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ES2985240T3
ES2985240T3 ES19817677T ES19817677T ES2985240T3 ES 2985240 T3 ES2985240 T3 ES 2985240T3 ES 19817677 T ES19817677 T ES 19817677T ES 19817677 T ES19817677 T ES 19817677T ES 2985240 T3 ES2985240 T3 ES 2985240T3
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ES
Spain
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saponin
monoclonal antibody
antibody
effector portion
effector
Prior art date
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Active
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ES19817677T
Other languages
English (en)
Inventor
Ruben Postel
Hendrik Fuchs
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Sapreme Technologies BV
Original Assignee
Sapreme Technologies BV
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a una fracción efectora capaz de inducir un efecto intracelular cuando está presente en el interior de una célula de mamífero, comprendiendo la fracción efectora una carga útil conjugada con al menos una saponina. La invención también se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende la fracción efectora según la invención, o un conjugado ligando-fármaco que comprende la fracción efectora de la invención, comprendiendo la fracción efectora saponina acoplada covalentemente. La invención también se refiere a una combinación terapéutica que comprende: (a) la fracción efectora de la invención, que comprende al menos una saponina, y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable; y (b) un conjugado anticuerpo-fármaco o un conjugado ligando-fármaco, y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la fracción efectora de la invención o el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención o el conjugado ligando-fármaco de la invención, que comprende al menos una saponina unida covalentemente a la molécula efectora, y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención también se refiere a la fracción efectora de la invención o el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención o la combinación terapéutica de la invención o el conjugado ligando-fármaco de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento. Finalmente, la invención también se refiere a la fracción efectora de la invención o el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención o la combinación terapéutica de la invención o el conjugado ligando-fármaco de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer o una enfermedad autoinmune. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de saponina
CAMPO TÉCNICO
[0001] La presente invención se refiere a una porción efectora capaz de inducir un efecto intracelular cuando está presente dentro de una célula de mamífero, donde la porción efectora está conjugada con al menos una saponina. La presente invención se refiere a una porción efectora capaz de inducir un efecto intracelular cuando está presente dentro de una célula de mamífero. La invención también se refiere a un conjugado anticuerpofármaco que comprende la porción efectora según la invención, o un conjugado ligando-fármaco que comprende la porción efectora de la invención, donde la porción efectora comprende saponina unida de manera covalente. La invención también se refiere a una combinación terapéutica que comprende: (a) la porción efectora de la invención, que comprende al menos una saponina, y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico; y (b) un conjugado anticuerpo-fármaco o un conjugado ligando-fármaco, y opcionalmente un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la porción efectora de la invención o el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención o el conjugado ligando-fármaco de la invención, que comprende al menos una saponina unida de manera covalente a la molécula efectora y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. La invención también se refiere a la porción efectora de la invención o al conjugado anticuerpofármaco de la invención o a la combinación terapéutica de la invención o al conjugado ligando-fármaco de la invención o a la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones.
ANTECEDENTES
[0002] En muchas ocasiones, las moléculas con actividad biológica terapéutica son adecuadas en teoría para su aplicación como fármaco terapéutico eficaz para el tratamiento de una enfermedad tal como un cáncer en pacientes humanos que lo necesiten. Un ejemplo típico son porciones biológicamente activas de moléculas pequeñas. Sin embargo, muchas, si no todas, de las moléculas y productos terapéuticos potenciales de tipo fármaco utilizados en la actualidad en la clínica tienen al menos una de una plétora de limitaciones e inconvenientes. Cuando se administran a un cuerpo humano, las moléculas terapéuticamente activas pueden ejercer efectos no deseados (fuera de la diana), además de la actividad biológica dirigida a un aspecto subyacente a una enfermedad o problema de salud que se desea tratar. Tales efectos fuera de la diana son indeseados y corren el riesgo de inducir efectos secundarios de la molécula administrada que ponen en riesgo la salud o incluso la vida. Es la aparición de tales efectos adversos la que provoca que muchos compuestos de tipo fármaco y restos terapéuticos fallen en los ensayos clínicos de fase III o incluso en los ensayos clínicos de fase IV (seguimiento después de la comercialización). Por lo tanto, existe un fuerte deseo de proporcionar moléculas de fármaco, tales como agentes terapéuticos de moléculas pequeñas, en las que el efecto terapéutico de la molécula de fármaco sea, por ejemplo, (1) altamente específico para un factor biológico o proceso biológico que desencadena la enfermedad, (2) sea suficientemente seguro, (3) sea suficientemente eficaz, (4) esté suficientemente dirigido a la célula enferma con poca o ninguna actividad fuera de la diana en células no enfermas, (5) tenga un modo de acción suficientemente oportuno (por ejemplo, la molécula de fármaco administrada debería alcanzar el sitio diana en el paciente humano dentro de un cierto periodo de tiempo y debería permanecer en el sitio diana durante un cierto periodo de tiempo), y/o (6) tenga una actividad terapéutica de larga duración en el cuerpo del paciente, entre otros. Desafortunadamente, hasta la fecha no existen agentes terapéuticos “ideales” con muchas o incluso todas las características beneficiosas descritas anteriormente en el presente documento a disposición de los pacientes, a pesar de una investigación ya duradera e intensiva y a pesar del impresionante progreso realizado en varias áreas de las dificultades e inconvenientes encontrados y abordados de manera individual.
[0003] La quimioterapia es una de las opciones terapéuticas más importantes para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, a menudo se asocia a una ventana terapéutica baja porque no tiene especificidad hacia células cancerosas sobre las células en división en el tejido sano. La invención de anticuerpos monoclonales ofrece la posibilidad de explotar sus propiedades de unión específica como mecanismo para la administración dirigida de agentes citotóxicos a células cancerosas, a la vez que se preservan las células normales. Esto puede conseguirse mediante la conjugación química de efectores citotóxicos (también conocidos como cargas útiles u ojivas) con anticuerpos para crear conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). Típicamente, se usan cargas útiles muy potentes, como la emtansina (DM1), que tienen un índice terapéutico limitado (una relación que compara la dosis tóxica con la dosis eficaz) en sus formas no conjugadas. La conjugación de DM1 a trastuzumab (adotrastuzumab emtansina), también conocido como Kadcycla, mejora la dosis tolerable de DM1 a al menos el doble en monos. En las últimas décadas se han realizado grandes esfuerzos e inversiones para desarrollar ADC terapéuticos. Sin embargo, sigue siendo un reto llevar los ADC a la práctica clínica, a pesar de los prometedores datos preclínicos. El primer ADC aprobado para uso clínico fue gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg, dirigido a CD33, Pfizer/Wyeth) para la leucemia mielógena aguda (LMA) recidivada en el año 2000. Sin embargo, Mylotarg se retiró del mercado a petición de la Administración Federal de Fármacos (FDA) de EE. UU. debido a una serie de preocupaciones entre las que se incluía su perfil de seguridad. Se descubrió que las muertes de pacientes tratados con Mylotarg eran más frecuentes que las de los pacientes tratados con quimioterapia convencional. El Mylotarg se admitió en el mercado de nuevo en 2017 con una dosis recomendada inferior, un programa diferente en combinación con quimioterapia o por sí mismo, y una nueva población de pacientes. Hasta la fecha, solo se han aprobado cinco ADC para uso clínico y, mientras tanto, se ha detenido el desarrollo clínico de aproximadamente cincuenta y cinco ADC. Sin embargo, el interés sigue siendo alto y en la actualidad aproximadamente ochenta ADC aún están en desarrollo clínico en casi seiscientos ensayos clínicos.
[0004] A pesar del potencial del uso de cargas útiles tóxicas que normalmente no son toleradas por los pacientes, un índice terapéutico bajo (una relación que compara la dosis tóxica con la dosis eficaz) es un problema importante que tiene que ver con la interrupción de muchos ADC en el desarrollo clínico, que puede estar causado por varios mecanismos tales como la toxicidad fuera de la diana en células normales, el desarrollo de resistencia contra los agentes citotóxicos y la liberación prematura de fármacos en la circulación. Una revisión sistemática por la FDA de los ADC observó que los perfiles de toxicidad de la mayoría de los ADC podrían clasificarse de acuerdo con la carga útil utilizada, pero no el anticuerpo utilizado, lo que sugiere que la toxicidad la determina principalmente la liberación prematura de la carga útil. De los aproximadamente cincuenta y cinco ADC cuyo desarrollo se interrumpió, se estima que en al menos veintitrés de ellos se debió a un índice terapéutico deficiente. Por ejemplo, el desarrollo de un conjugado de trastuzumab tesirina (ADCT-502, dirigido a HER-2, ADC Therapeutics) se interrumpió recientemente debido a un índice terapéutico estrecho, posiblemente debido a un efecto en la diana pero fuera del tejido en el tejido pulmonar que expresa niveles considerables de HER2. Además, varios ADC en ensayos de fase 3 se han interrumpido debido a la ausencia de un criterio de evaluación principal. Por ejemplo, recientemente se han detenido los ensayos de fase 3 de un conjugado de depatuxizumab mafodotina (ABT-414, dirigido a EGFR, AbbVie) testado en pacientes con glioblastoma recién diagnosticado, y de un conjugado de mirvetuximab soravtansina (IMGN853, dirigido al receptor de folato alfa (FRa), ImmunoGen) testado en pacientes con cáncer de ovario resistente al platino, sin mostrar ningún beneficio para la supervivencia. Es importante observar que la dosis usada clínicamente de algunos ADC puede no ser suficiente para su actividad anticancerígena completa. Por ejemplo, ado-trastuzumab emtansina tiene una DMT de 3,6 mg/kg en seres humanos. En modelos preclínicos de cáncer de mama, ado-trastuzumab emtansina indujo una regresión tumoral a concentraciones de dosis de o por encima de 3 mg/kg, pero se observó una eficacia más potente a 15 mg/kg. Esto sugiere que, a la dosis administrada clínicamente, ado-trastuzumab emtansina puede no ejercer su efecto antitumoral potencial máximo.
[0005] Los ADC se componen principalmente de un anticuerpo, un resto citotóxico tal como una carga útil y una porción conectora. Se han propuesto y llevado a cabo varias estrategias novedosas en el diseño y desarrollo de nuevos ADC para superar los problemas existentes, actuando sobre cada uno de los componentes de los ADC. Por ejemplo, mediante la identificación y validación de dianas antigénicas adecuadas para el componente de anticuerpo, la selección de antígenos con altos niveles de expresión en el tumor y poca o ninguna expresión en tejidos normales, de antígenos presentes en la superficie celular para ser accesibles a los ADC circulantes, y antígenos que permitan la internalización de los ADC en la célula después de la unión; y mecanismos alternativos de actividad; el diseño y optimización de porciones conectaras que mejoren la solubilidad y la relación de fármaco a anticuerpo (DAR) de los ADC y superen la resistencia inducida por proteínas que pueden transportar el agente quimioterapéutico fuera de las células; la mejora de la DAR mediante la inclusión de más cargas útiles, la selección y la optimización de anticuerpos para mejorar la homogeneidad y la capacidad de desarrollo del anticuerpo. Además del desarrollo tecnológico de los ADC, también se están utilizando nuevas estrategias clínicas y traduccionales para maximizar el índice terapéutico, como el cambio de los programas de administración a través de dosis fraccionadas; la realización de estudios de biodistribución; la inclusión de biomarcadores para optimizar la selección de pacientes, la captura temprana de señales de respuesta y la vigilancia de la duración y profundidad de la respuesta y la transmisión de información a estudios de combinación.
[0006] Un ejemplo de ADC con potencial clínico son los ADC como brentuximab vedotina, inotuzumab ozogamicina, moxetumomab pasudotox y polatuzumab vedotina, que se evalúan como una opción de tratamiento para las neoplasias linfoides y el mieloma múltiple. Polatuzumab vedotina, que se une a CD79b en linfocitos B (malignos), y pinatuzumab vedotina, que se une a CD22, se probaron en ensayos clínicos en los que cada uno de los ADC se combinó con rituximab coadministrado, un anticuerpo monoclonal que se une a CD20, y no se proporcionó ninguna carga útil [Mouse Biotechnology, MolB. Yu y D. Liu, Antibody-drug conjugates in clinical trials for lymphoid malignancies and multiple myeloma; Journal of Hematology & Oncology (2019) 12:94]. Las combinaciones de anticuerpos monoclonales como estos ejemplos todavía son un enfoque adicional e intentan llegar a la "bala mágica" que combine muchas o incluso todas las características deseadas mencionadas anteriormente de los ADC.
[0007] Mientras tanto, en las últimas décadas, están en desarrollo agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos terapéuticos pueden basarse en ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos antisentido (ASO, AON) y ARN interferente pequeño (ARNip), microARN y aptámeros de ADN y ARN, para enfoques tales como terapia génica, interferencia de ARN (iARN). Muchos de ellos comparten la misma base fundamental de acción por inhibición de la expresión de ADN o ARN, evitando de este modo la expresión de proteínas anormales relacionadas con la enfermedad. El mayor número de ensayos clínicos se está llevando a cabo en el campo de la terapia génica, con casi 2600 ensayos clínicos en curso o completados en todo el mundo, pero con solo aproximadamente un 4 % entrando en la fase 3. Esto va seguido de ensayos clínicos con ASO. De manera similar a los ADC, a pesar del gran número de técnicas que se exploran, los ácidos nucleicos terapéuticos comparten dos problemas principales durante el desarrollo clínico: la administración en las células y los efectos no deseados fuera de la diana. Por ejemplo, los ASO tales como ácido peptidonucleico (APN), oligómero de morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA) y ácido nucleico con puente (BNA), se están investigando como una estrategia atractiva para inhibir específicamente genes diana y especialmente aquellos genes en los que es difícil actuar con inhibidores de moléculas pequeñas o anticuerpos neutralizantes. Actualmente, la eficacia de diferentes ASO se está estudiando en muchas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica, y también en varias fases del cáncer. La aplicación de ASO como agentes terapéuticos potenciales requiere métodos seguros y eficaces para su administración al citoplasma y/o al núcleo de las células y tejidos diana. Aunque se ha demostrado la relevancia clínica de los ASO, la captación celular ineficaz, tantoin vitrocomoin vivo,limita la eficacia de los ASO y ha sido una barrera para el desarrollo terapéutico. La captación celular puede ser < 2 % de la dosis, dando como resultado una concentración de ASO demasiado baja en el sitio activo para un resultado eficaz y sostenido. Esto requiere, en consecuencia, un aumento de la dosis administrada, que induce efectos fuera de la diana. Los efectos secundarios más comunes son la activación de la cascada del complemento, la inhibición de la cascada de coagulación y la estimulación del sistema inmunitario mediada por receptores de tipo toll.
[0008] Los agentes quimioterapéuticos suelen ser moléculas pequeñas; sin embargo, su eficacia se ve dificultada por la toxicidad secundaria grave fuera de la diana, así como por su pobre solubilidad, eliminación rápida y exposición tumoral limitada. Los conjugados de estructura base-fármaco de moléculas pequeñas tales como conjugados polímero-fármaco (PDC) son construcciones macromoleculares con actividad farmacológica que comprenden una o más moléculas de un fármaco de moléculas pequeñas unida(s) a una estructura base portadora (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)).
[0009] Dicho principio conjugado ha llamado mucho la atención y ha estado en investigación durante varias décadas. La mayoría de los conjugados de fármacos de moléculas pequeñas en desarrollo preclínico o clínico son para indicaciones oncológicas. Sin embargo, hasta la fecha solo se ha aprobado un fármaco no relacionado con el cáncer (Movantik, un conjugado de oligómero de PEG de la naloxona, un antagonista de opioides, AstraZeneca) para el estreñimiento inducido por opioides en pacientes con dolor crónico en 2014, que es una indicación no oncológica. El traslado de la aplicación de conjugados fármaco-estructura base al tratamiento de sujetos humanos ha tenido poco éxito clínico hasta la fecha. Por ejemplo, PK1, un copolímero de (N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA) doxorrubicina; desarrollado por Pharmacia, Pfizer) mostró gran actividad anti-cáncer tanto en tumores sólidos como en leucemia en modelos murinos, y estuvo en investigación clínica para indicaciones oncológicas. A pesar de que demostró una reducción significativa de la toxicidad no específica y una farmacocinética mejorada en el ser humano, las mejoras en la eficacia contra el cáncer resultaron ser marginales en los pacientes y, como consecuencia, se interrumpió el subsiguiente desarrollo de PK1.
[0010] El fracaso de los conjugados de estructura base-fármaco de moléculas pequeñas se atribuye al menos parcialmente a su escasa acumulación en el sitio del tumor. Por ejemplo, mientras que en modelos murinos PK1 mostró una acumulación 45-250 veces mayor en el tumor que en tejidos sanos (hígado, riñón, pulmón, bazo y corazón), la acumulación en el tumor solo se observó en un pequeño subconjunto de pacientes en el ensayo clínico.
[0011] Una solución potencial a los problemas mencionados anteriormente es la aplicación de sistemas de nanopartículas para la administración de fármacos, tales como liposomas. Los liposomas son vesículas con forma de esfera que consisten en una o más bicapas de fosfolípidos, que se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se dispersan en agua. Las características de anfifilicidad de los fosfolípidos les proporcionan propiedades de autoensamblaje, emulsionantes y características humectantes, y estas propiedades pueden emplearse en el diseño de nuevos fármacos y nuevos sistemas de administración de fármacos. El fármaco encapsulado en un sistema de administración liposomal puede tener varias ventajas sobre una administración directa del fármaco, tal como una mejora y un control sobre la farmacocinética y la farmacodinamia, una propiedad de direccionamiento tisular, una menor toxicidad y una actividad farmacológica mejorada. Un ejemplo de tal éxito es la forma encapsulada en liposomas de la doxorrubicina, un agente quimioterapéutico de moléculas pequeñas (Doxil: una forma encapsulada en liposomas pegilados de doxorrubicina; Myocet: una doxorrubicina liposomal no pegilada), que se ha aprobado para uso clínico.
[0012] En el documento US 2004/242502 A1 se describen derivados de saponina para su uso con ácidos nucleicos que inducen una respuesta inmune cuando se administran a animales y seres humanos. Las saponinas comprenden (a) un núcleo de aglicona de saponina, donde el núcleo de aglicona está unido covalentemente a una o más cadenas de oligosacáridos; (b) una cadena catiónica con carga positiva y, opcionalmente, (c) una cadena lipófila natural o sintética.
[0013] Sigue siendo necesario encontrar una solución que permita terapias con fármacos tales como terapias antitumorales, aplicables para un uso no sistémico cuando se desee, en las que el fármaco tenga, por ejemplo, un perfil de seguridad aceptable, poca actividad fuera de la diana, suficiente eficacia, una tasa de aclaramiento suficientemente baja del cuerpo del paciente, etc.
RESUMEN
[0014] Para una forma de realización de la presente invención, un primer objetivo es proporcionar un compuesto biológicamente activo mejorado o una composición que comprenda dicho compuesto biológicamente activo mejorado.
[0015] Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención es proporcionar una solución al problema de la no especificidad que se encuentra cuando se administran compuestos terapéuticamente activos de moléculas pequeñas a un paciente humano que lo necesita. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención es proporcionar una solución al problema de los fármacos con especificidad no óptima para un factor biológico o proceso biológico que produce una enfermedad. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención es proporcionar una solución al problema de características de seguridad insuficientes de los fármacos actuales, al administrarlos a pacientes humanos que lo necesitan. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención es proporcionar una solución al problema de que los fármacos actuales sean menos eficaces de lo deseado al administrarlos a pacientes humanos que lo necesitan. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención es proporcionar una solución al problema de que los fármacos actuales no se dirijan suficientemente a la célula enferma, con poca o ninguna actividad fuera de la diana en células no enfermas, al administrarlos a pacientes humanos que lo necesitan. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención es proporcionar una solución al problema de que los fármacos actuales no tengan un modo de acción suficientemente oportuno (por ejemplo, la molécula de fármaco administrada debe alcanzar el sitio diana en el paciente humano dentro de un cierto periodo de tiempo y debe permanecer en el sitio diana durante un cierto periodo de tiempo), al administrarlos a pacientes humanos que lo necesitan. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención es proporcionar una solución al problema de que los fármacos actuales no tengan actividad terapéutica de larga duración en el cuerpo del paciente, al administrarlos a pacientes humanos que lo necesitan.
[0016] Al menos uno de los objetivos anteriores de las formas de realización de la invención se logra al proporcionar una porción efectora capaz de inducir un efecto intracelular cuando está presente dentro de una célula de mamífero, estando la porción efectora conjugada con al menos una saponina, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción efectora a través de al menos una porción conectora, o está unida de manera covalente directamente a dicha porción efectora.
[0017] La presente invención se describirá con respecto a formas de realización particulares, pero la invención no se limita a las mismas, sino únicamente por las reivindicaciones. Las formas de realización de la invención descritas en el presente documento pueden funcionar en combinación y cooperación, a menos que se especifique lo contrario.
[0018] Un aspecto de la invención se refiere a una porción efectora, como se define en las reivindicaciones, capaz de inducir un efecto intracelular cuando está presente dentro de una célula de mamífero, estando la porción efectora conjugada con al menos una saponina, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción efectora a través de al menos una porción conectora, o está unida de manera covalente directamente a dicha porción efectora.
[0019] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende la porción efectora según la invención, o un conjugado ligando-fármaco que comprende la porción efectora de la invención, donde la porción efectora comprende saponina unida de manera covalente. La porción efectora de la invención es un conjugado que comprende al menos una saponina y al menos una molécula efectora, unidas covalentemente entre sí, ya sea directamente o a través de al menos una porción conectora, que comprende opcionalmente una porción conectora escindible y, opcionalmente, a través de una estructura base oligomérica o polimérica a la que se unen covalentemente la al menos una saponina y/o la al menos una porción efectora.
[0020] Un aspecto de la invención se refiere a una combinación terapéutica que comprende: (a) la porción efectora de la invención, que comprende al menos una saponina y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico; y (b) un conjugado anticuerpo-fármaco o un conjugado ligando-fármaco y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
[0021] Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la porción efectora de la invención o el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención o el conjugado ligando-fármaco de la invención, que comprende al menos una saponina unida de manera covalente a la molécula efectora y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
[0022] Un aspecto de la invención se refiere a la porción efectora de la invención o al conjugado anticuerpofármaco de la invención o a la combinación terapéutica de la invención o al conjugado ligando-fármaco de la invención o a la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento.
[0023] Un aspecto de la invención se refiere a la porción efectora de la invención o a conjugado anticuerpofármaco de la invención o a la combinación terapéutica de la invención o al conjugado ligando-fármaco de la invención o a la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer o de una enfermedad autoinmunitaria.
DEFINICIONES
[0024] El término "porción conectora" tiene su significado científico habitual, y en el presente documento se refiere a un resto químico o un tramo lineal de restos de aminoácidos complejados a través de enlaces peptídicos, que une una molécula o un átomo a otra molécula, por ejemplo, a un ligando o a una molécula efectora o a una estructura base. Típicamente, la porción conectora comprende una cadena de átomos unidos por enlaces químicos. En la presente divulgación puede usarse cualquier molécula conectora o tecnología de porción conectora conocida en la técnica. Cuando se indica, la porción conectora es una porción conectora para la unión covalente de moléculas a través de un grupo químico en dicha molécula adecuado para formar un enlace o unión covalente con la porción conectora. La porción conectora puede ser una porción conectora no escindible, por ejemplo, la porción conectora es estable en condiciones fisiológicas. La porción conectora puede ser una porción conectora escindible, por ejemplo, una porción conectora que se puede escindir, en presencia de una enzima o en un intervalo o valor de pH particular, o en condiciones fisiológicas tales como condiciones intracelulares en los endosomas tales como los endosomas tardíos y los lisosomas de las células de mamífero, tales como las células humanas. Las porciones conectoras ejemplares que pueden usarse en el contexto de la presente divulgación incluyen hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH), succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP) y hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio (HATU).
[0025] El término "porción conectora trifuncional" tiene su significado científico habitual, y en el presente documento se refiere a una porción conectora que une tres moléculas a través de un grupo químico en cada una de las tres moléculas. Los expertos en la materia son capaces de diseñar dichas porciones conectoras trifuncionales, basándose en la presente divulgación y el conocimiento general común. Dicha porción conectora trifuncional puede poseer, por ejemplo, un grupo maleimido que se puede usar para la conjugación con ligandos dirigidos que tienen grupos tiol para realizar una reacción tiol-eno. Además, la porción conectora trifuncional podría presentar un grupo dibenzociclooctino (DBCO) para realizar la denominada cicloadición alquino-azida promovida por tensión (SPAAC, química clic) con una saponina portadora de azido. Finalmente, la porción conectora trifuncional podría obtener un tercer grupo funcional tal como un grupo trans-cicloocteno (TCO) para realizar la denominada reacción de Diels-Alder con demanda electrónica inversa (IEDDA) con una molécula efectora portadora de tetrazina (Tz). Los expertos apreciarán que los grupos químicos de la porción conectora trifuncional pueden ser los tres iguales, o diferentes, o la porción conectora puede comprender dos de los mismos grupos químicos para unir una molécula a la porción conectora trifuncional. Los enlaces formados entre la porción conectora trifuncional pueden ser covalentes o no covalentes, y se prefieren los enlaces covalentes. Los enlaces formados entre la porción conectora trifuncional y la una o dos o tres moléculas unidas a través de grupos químicos respectivos pueden ser enlaces escindibles (lábiles), tales como escindibles en condiciones ácidas dentro de células tales como endosomas y lisosomas de células de mamífero tales como células humanas, o pueden ser enlaces no escindibles. Por supuesto, la porción conectora trifuncional puede abarcar uno o dos grupos químicos para formar enlaces covalentes, mientras que los dos o un grupo(s) químico(s) adicional(es), respectivamente, son/es para formar un enlace no covalente. Por supuesto, la porción conectora trifuncional puede abarcar uno o dos grupos químicos para formar enlaces escindibles mientras que los dos o un grupo(s) químico(s) adicional(es), respectivamente, son/es para formar un enlace no escindible.
[0026] El término "escindible", tal como se usa en el término "porción conectora escindible" o "enlace escindible”, tiene su significado científico habitual, y en este documento se refiere a que se escinde en condiciones ácidas, condiciones reductoras, condiciones enzimáticas o condiciones inducidas por la luz. Por ejemplo, una porción conectora escindible puede escindirse en condiciones ácidas, preferiblemente dicha porción conectora escindible se somete a escisiónin vivoen condiciones ácidas como las presentes en los endosomas y/o lisosomas de células de mamífero, preferiblemente células humanas, preferiblemente a pH 4,0 - 6,5, y más preferiblemente a pH < 5,5. Como otro ejemplo, una porción conectora escindible puede someterse a escisión por una enzima, por ejemplo, por catepsina. Además, un ejemplo de un enlace covalente escindible en condiciones reductoras es un puente disulfuro.
[0027] Los términos "oligómero" y "polímero" en el contexto de una estructura base oligomérica o polimérica tienen su significado científico habitual. Un polímero se refiere en este documento a una sustancia que tiene una estructura molecular formada principal o completamente a partir de un gran número de unidades iguales o similares unidas entre sí; un oligómero se refiere en este documento a un polímero cuyas moléculas consisten en relativamente pocas unidades que se repiten. Por ejemplo, una estructura que comprende 5-10 o menos unidades iguales o similares puede denominarse una estructura oligomérica, mientras que una estructura que comprende 10-50 unidades monoméricas o más puede denominarse una estructura polimérica, mientras que una estructura de 10 unidades monoméricas puede denominarse oligomérica o polimérica.
[0028] El término "sitio de unión" tiene su significado científico habitual, y en el presente documento se refiere a una región o un epítopo de una molécula, por ejemplo, una proteína, ADN o ARN, a la que puede unirse otra molécula.
[0029] El término "estructura base" tiene su significado científico habitual, y en el presente documento se refiere a un modelo oligomérico o polimérico o un vehículo o una base (molécula base o estructura de base), a la que una o más moléculas, por ejemplo, molécula de ligando, saponina de la invención, glucósido, molécula efectora, pueden unirse covalentemente, ya sea directamente o a través de una porción conectora, tal como una porción conectora escindible. Una estructura base puede tener una formación estructuralmente ordenada, tal como un polímero, oligómero, dendrímero, polímero dendronizado u oligómero dendronizado o tener una estructura polimérica ensamblada, tal como un hidrogel, microgel, nanogel, micela polimérica estabilizada o liposoma, pero excluye estructuras que están compuestas de ensamblajes no covalentes de monómeros tales como mezclas de colesterol/fosfolípido. Una estructura base puede comprender una estructura polimérica u oligomérica, tal como poli u oligo(aminas), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina); o estructuras tales como polietilenglicol, poli u oligo(ésteres), tales como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido; o poli(dextrina), poli u oligosacáridos, tales como ciclodextrina o polidextrosa; o estructuras tales como poli u oligoaminoácidos naturales y/o artificiales tales como poli-lisina o un péptido o una proteína, oligo- o polímeros de ADN, polímeros de ARN estabilizados o polímeros de APN (ácido peptidonucleico). Preferiblemente, las estructuras poliméricas u oligoméricas son biocompatibles, donde biocompatibles significa que la estructura polimérica u oligomérica no muestra una toxicidad aguda o crónica sustancial en organismos y puede excretarse tal cual o degradarse completamente hasta formar compuestos excretables y/o fisiológicos por el metabolismo del cuerpo.
[0030] El término "ligando" tiene su significado científico habitual, y en el presente documento se refiere a cualquier molécula o moléculas que pueden unirse selectivamente a una molécula de la superficie de células diana o receptor de la superficie de células diana expresado en células diana, por ejemplo, células cancerosas diana o células autoinmunitarias diana. El ligando puede unirse a un epítopo comprendido por receptores u otros antígenos en las células diana. Preferiblemente, los ligandos de unión a células son anticuerpos.
[0031] El término "anticuerpo" como se usa en el presente documento se usa en el sentido más amplio, que puede referirse a una inmunoglobulina (Ig) definida como una proteína que pertenece a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas), o un fragmento de unión funcional o dominio de unión de una inmunoglobulina. En el contexto de la presente invención, un "fragmento de unión" o un "dominio de unión" de una inmunoglobulina se define como un fragmento o dominio de unión a antígeno u otro derivado de una inmunoglobulina original que esencialmente mantiene la actividad de unión a antígeno de dicha inmunoglobulina original. Los fragmentos funcionales y dominios funcionales son anticuerpos en el sentido de la presente invención incluso si su afinidad por el antígeno es menor que la de la inmunoglobulina original. Los "fragmentos y dominios funcionales" según la invención incluyen fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fab, scFv, dsFv, anticuerpo de dominio único (sdAb), IgG monovalente, scFv-Fc, IgG reducida (rlgG), minicuerpo, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, proteínas de fusión de Fc, nanocuerpos, dominios V variables tales como VHH, Vh y otros tipos de antígeno que reconocen fragmentos y dominios de inmunoglobulina. Los fragmentos y dominios pueden manipularse para minimizar o eliminar completamente las interacciones disulfuro intermoleculares que ocurren entre los dominios CH1 y CL. Los fragmentos y dominios funcionales ofrecen la ventaja de una mayor penetración tumoral debido a su menor tamaño. Además, el fragmento o dominio funcional puede distribuirse de manera más uniforme por toda la masa tumoral en comparación con la inmunoglobulina completa.
[0032] Los anticuerpos (inmunoglobulinas) de la presente invención pueden ser bi- o multifuncionales. Por ejemplo, un anticuerpo bifuncional tiene un brazo que tiene una especificidad por un receptor o antígeno, mientras que el otro brazo reconoce un receptor o antígeno diferente. Alternativamente, cada brazo del anticuerpo bifuncional puede tener especificidad por un epítopo diferente del mismo receptor o antígeno de la célula diana.
[0033] Los anticuerpos (inmunoglobulinas) de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos con superficie acondicionada, anticuerpos antiidiotipo, anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos híbridos de rata/ratón, anticuerpos de llama, anticuerpos de llama que se componen solo de cadenas pesadas, anticuerpos que se componen solo de cadenas pesadas y anticuerpos veterinarios. Preferiblemente, el anticuerpo (inmunoglobulina) de la presente invención es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos con superficie acondicionada, quiméricos, humanizados y completamente humanos también son más preferidos porque son menos propensos a causar inmunogenicidad en seres humanos. Los anticuerpos del ADC de la presente invención se unen preferiblemente de manera específica a un antígeno expresado en la superficie de una célula cancerosa, una célula autoinmunitaria, una célula enferma, una célula aberrante, mientras que dejan cualquier célula sana esencialmente inalterada (por ejemplo, al no unirse a tal célula normal, o al unirse en menor grado en cuanto a número y/o afinidad a tal célula sana).
[0034] Los anticuerpos específicos que pueden usarse para los ADC de la presente invención incluyen anticuerpo monoclonal anti-HER2 tal como trastuzumab y pertuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD20 tal como rituximab, ofatumumab, tositumomab e ibritumomab, anticuerpo monoclonal anti-CA125 tal como oregovomab, anticuerpo monoclonal anti-EpCAM (17-1A) tal como edrecolomab, anticuerpo monoclonal anti-EGFR tal como cetuximab, panitumumab y nimotuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD30 tal como brentuximab, anticuerpo monoclonal anti-CD33 tal como gemtuzumab y huMy9-6, anticuerpo monoclonal antiintegrina vascular alfa-v beta-3 tal como etaracizumab, anticuerpo monoclonal anti-CD52 tal como alemtuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD22 tal como epratuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CEA tal como labetuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD44v6 tal como bivatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-FAP tal como sibrotuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD19 tal como huB4, anticuerpo monoclonal anti-CanAg tal como huC242, anticuerpo monoclonal anti-CD56 tal como huN901, anticuerpo monoclonal anti-CD38 tal como daratumumab, anticuerpo monoclonal anti-CA6 tal como DS6, anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR tal como cixitumumab y 3B7, anticuerpo monoclonal anti-integrina tal como CNTO 95 y anticuerpo monoclonal antisindecano-1 tal como B-B4. Una forma de realización es el conjugado proteína-toxina de Stemline: ELZONRIS™ (tagraxofusp SL-401) - ELZONRIS es una nueva terapia dirigida que está dirigida al receptor a de interleucina-3 (IL-3) (CD123), una diana presente en una amplia gama de neoplasias malignas.
[0035] Cualquier otra molécula distinta de los anticuerpos que se una a un receptor celular o antígeno de una célula diana también se puede usar como ligando de unión celular para los conjugados ligando-fármaco de la presente invención y los ligandos provistos de saponina unida de manera covalente según la invención. Estos ligandos incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, moléculas pequeñas. Algunos ejemplos de estos ligandos no anticuerpos son interferones (por ejemplo IFN-a, IFN-p, e IFN-y), transferrinas, lectinas, factores de crecimiento epidérmico (EGF) y dominios similares a EGF, péptidos liberadores de gastrina (GRP), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento transformantes (TGF), factor de crecimiento de vaccinia (VGF), insulina y factores de crecimiento similares a insulina (IGF, por ejemplo IGF-1 e IGF-2), otras hormonas adecuadas tales como hormonas liberadoras de tirotropina (TRH), hormonas estimuladoras de melanocitos (MSH), hormonas esteroideas (por ejemplo, estrógeno y andrógeno), somatostatina, linfocinas (por ejemplo IL-2, IL-3, IL-4, e IL-6), factores estimuladores de colonias (CSF, por ejemplo, G-CSF, M-CSF y GM-CSF), bombesina, gastrina, Arg-Gly-Asp o RGD, aptámeros (por ejemplo, AS-l4l1, GBI-10, aptámeros de ARN contra glucoproteínas del VIH), moléculas pequeñas (por ejemplo, folato, anisamida, ácido fenilborónico), vitaminas (por ejemplo, vitamina D), hidratos de carbono (por ejemplo, ácido hialurónico, galactosa).
[0036] Una "molécula efectora" o "porción efectora" o "carga útil" tiene su significado científico habitual y en el contexto de esta divulgación es cualquier sustancia que afecte al metabolismo de una célula por interacción con una diana de molécula efectora intracelular, en donde esta diana de molécula efectora es cualquier molécula o estructura de dentro de las células, excluyendo el lumen de los compartimentos y vesículas de la ruta endocítica y de reciclaje pero incluyendo las membranas de estos compartimentos y vesículas. Dichas estructuras de dentro de las células incluyen, por lo tanto, el núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos, el retículo endoplasmático, el aparato de Golgi, otras vesículas de transporte, la parte interna de la membrana plasmática y el citosol. Según las reivindicaciones, la porción efectora comprende o consiste en al menos un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ácido xeno-nucleico.
[0037] Una molécula efectora o una porción efectora que es un polinucleótido puede ser, por ejemplo, un polinucleótido que comprende información codificante, tal como un gen o un marco de lectura abierto que codifica una proteína. También puede comprender información reguladora, por ejemplo, regiones promotoras o de unión a elementos reguladores, o secuencias que codifican microARN. Dicho polinucleótido puede comprender ácidos nucleicos naturales y artificiales. Los ácidos nucleicos artificiales incluyen, por ejemplo, ácido peptidonucleico (APN), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico glicólico (GNA) y ácido treosa nucleico (TNA). Cada uno de estos se distingue del ADN o ARN de origen natural por cambios en la estructura principal de la molécula. Algunos ejemplos de nucleótidos como moléculas efectoras son, por ejemplo, ADN: ADN monocatenario (por ejemplo, ADN para adenina fosforibosiltransferasa); ADN bicatenario lineal (por ejemplo, gen del factor de coagulación IX); ADN bicatenario circular (por ejemplo, plásmidos); ARN: ARNm (por ejemplo, nucleasas de moléculas efectoras TAL), ARNt, ARNr, ARNip, miARN, ARN antisentido; oligonucleótidos antisentido (ASO, AON, por ejemplo, APN, PMO, LNA y BNA).
[0038] El término "proteináceo", usado en, por ejemplo, "molécula proteinácea", se refiere a moléculas que comprenden al menos una cadena de restos de aminoácidos que pueden obtenerse como un producto de expresión a partir de un único ARNm. Dicha molécula o toxina puede comprender además cualquier modificación postraduccional, un carbohidrato tal como un carbohidrato unido a N u O, puentes disulfuro, fosforilaciones, sulfataciones, etc., como resultado de cualquier modificación postraduccional, y/o puede comprender además cualquier otra modificación tal como las resultantes de modificaciones químicas (por ejemplo, unión de porciones efectoras, saponina, estructuras base, ligandos, etc., directamente, por ejemplo, una cadena lateral de aminoácidos, o a través de al menos una porción conectara (covalentemente) unida a la molécula para modificar químicamente la molécula proteinácea, y unida químicamente (covalentemente) a la molécula proteinácea). El término "proteináceo" también abarca e incluye ensamblajes de dichas moléculas, por ejemplo, homodímeros, heterotrímeros, heterohexámeros o ensamblajes complejos tales como ribosomas.
[0039] Los términos "específico" y "específicamente", en el contexto de, por ejemplo, "unión específica" y "receptor o diana molecular específicamente presente o expresado en la superficie de una célula tumoral" y similares, tienen su significado científico normal conocido en la técnica, y en el presente documento se refieren, por ejemplo, a una interacción de unión de una primera molécula con una segunda molécula que se produce con una afinidad más alta con respecto a cualquier unión putativa de la primera molécula a una molécula adicional diferente de la segunda molécula, o, por ejemplo, a la expresión o expresión en un grado más alto cuando, por ejemplo, se tiene en cuenta el número de receptores o dianas moleculares, de un receptor de la superficie celular o diana molecular en la superficie de un primer tipo de célula tal como una célula tumoral, célula autoinmunitaria, célula enferma, célula aberrante, con respecto al grado de expresión del mismo receptor o diana molecular en un segundo tipo de célula tal como una célula sana, etc., donde la expresión en el segundo tipo de célula puede estar completamente ausente o ser muy baja, con respecto a cualquier grado de expresión en la célula tumoral, etc. Además, el término "específico", por ejemplo, en "unión específica", tiene su significado científico normal conocido en la técnica, y en el presente documento tiene el significado de indicar una molécula que puede tener una interacción con otra molécula con una afinidad de unión más alta que las interacciones de fondo entre moléculas. De manera similar, el término "especificidad" se refiere a una interacción, por ejemplo, entre dos moléculas o entre una célula y una molécula, que tiene una afinidad de unión mayor que las interacciones de fondo entre moléculas. Las moléculas de unión, tales como las inmunoglobulinas, se unen a través de su sitio de unión, tal como regiones variables de inmunoglobulina de la inmunoglobulina, a sitios de unión en moléculas, tales como epítopos, receptores de la superficie celular, etc., con una afinidad de unión mayor que las interacciones de fondo entre moléculas. En el contexto de la invención, las interacciones de fondo son típicamente interacciones con una afinidad inferior a una Kd de 10E-4 M. De manera similar, "dominios de unión específica" son dominios que se unen preferentemente a sitios de unión en moléculas, tales como epítopos, receptores de la superficie celular, etc., con una afinidad de unión mayor que las interacciones de fondo entre moléculas. En el contexto de la invención, las "interacciones de fondo" son típicamente interacciones con una afinidad inferior a una K<d>de 10E-4 M. Preferiblemente, los dominios de unión específica se unen con una afinidad superior a una Kd de aproximadamente 10E-5 M.
[0040] El término "unión" se define como interacciones entre moléculas que pueden distinguirse de las interacciones de fondo.
[0041] A lo largo de la memoria descriptiva, el término "fragmento" se refiere a una secuencia de aminoácidos que forma parte de un dominio proteico o que construye un dominio proteico intacto. Los fragmentos de unión según la invención deben tener especificidad de unión para la diana respectiva, tal como un receptor de la superficie celular, por ejemplo, en la superficie de una célula enferma tal como una célula tumoral.
[0042] El término "ADC" o "conjugado anticuerpo-fármaco" tiene su significado científico habitual conocido por los expertos, y en el presente documento se refiere a una clase de fármacos biofarmacéuticos diseñados como una terapia dirigida para tratar, por ejemplo, el cáncer. A diferencia de la quimioterapia, los ADC están destinados a actuar sobre células tumorales y matarlas a la vez que preservan las células sanas. Los ADC están compuestos por un anticuerpo unido a una carga útil o fármaco citotóxico (anticancerígeno) biológicamente activo. Los ADC combinan las capacidades de direccionamiento de los anticuerpos monoclonales con la capacidad de destrucción del cáncer de los fármacos citotóxicos. Se diseñan con la intención de discriminar entre células sanas y tejido enfermo, como las células tumorales de un tumor.
[0043] El término "Saponinum album" tiene su significado normal y en el presente documento se refiere a una mezcla de saponinas producidas por Merck KGaA (Darmstadt, Alemania) que contiene saponinas deGypsophila paniculatayGypsophila arostii,conteniendo SA1657 y principalmente SA1641.
[0044] El término "Quillajasaponin" tiene su significado normal y en el presente documento se refiere a la fracción de saponina de Quillaja saponaria y, por lo tanto, la fuente para todas las otras saponinas de QS, que contienen principalmente QS-18 y QS-21.
[0045] "QS-21" o "QS21" tiene su significado científico habitual y en el presente documento se refiere a una mezcla de QS-21 A-apio (-63 %), QS-21 A-xilo (-32 %), QS-21 B-apio (-3,3 %) y QS-21 B-xilo (-1,7 %).
[0046] De manera similar, "QS-21A" tiene su significado científico habitual y en el presente documento se refiere a una mezcla de QS-21 A-apio (-65 %) y QS-21 A-xilo (-35 %).
[0047] De manera similar, "QS-21B" tiene su significado científico habitual y en el presente documento se refiere a una mezcla de QS-21 B-apio (-65 %) y QS-21 B-xilo (-35 %).
[0048] El término "Quil-A" se refiere a un extracto semipurificado de Quillaja saponaria disponible en el mercado y contiene cantidades variables de más de 50 saponinas distintas, muchas de las cuales incorporan la subestructura triterpeno-trisacárido Gal-(1^2)-[Xyl-(1^-3)]-GlcA- en el grupo C-3beta-OH encontrado en QS-7, QS-17, QS18 y QS-21. Las saponinas encontradas en Quil-A se enumeran en van Setten (1995), Tabla2/Dirk C. van Setten, Gerrit van de Werken, Gijsbert Zomer Gideon F. A. Kersten, Glycosyl Compositions and Structural Characteristics of the Potential Immuno-adjuvant Active Saponins in the Quillaja saponaria Molina Extract Quil A, RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY, VOL. 9, 660-666 (1995)]. Quil-A y también Quillajasaponin son fracciones de saponinas de Quillaja saponaria y ambas contienen una gran variedad de saponinas diferentes con contenido que coincide en gran medida. Las dos fracciones difieren en su composición específica, ya que las dos fracciones se obtienen mediante procedimientos de purificación diferentes.
[0049] El término "QS1861" y el término "QS1862" se refieren a api QS-7 y QS-7. QS1861 tiene una masa molecular de 1861 Dalton, QS1862 tiene una masa molecular de 1862 Dalton. QS1862 se describe en Fleck et al. (2019) en la Tabla 1, fila n.° 28 [Juliane Deise Fleck, Andresa Heemann Betti, Francini Pereira da Silva, Eduardo Artur Troian, Cristina Olivaro, Fernando Ferreira & Simone Gasparin Verza, Saponins from Quillaja saponaria and Quillaja brasiliensis: Specifical Chemical Characteristics and Biological Activities, Molecules 2019, 24, 171; doi:10.3390/molecules 24010171]. La estructura descrita es la variante api QS1862 de QS-7. La masa molecular es de 1862 Dalton, ya que esta masa es la masa formal que incluye el protón en el ácido glucurónico. A pH neutro, la molécula se desprotona. Cuando se mide en espectrometría de masas en modo de ion negativo, la masa medida es de 1861 Dalton.
[0050] Los términos primero, segundo, tercero en la descripción y en las reivindicaciones se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Los términos son intercambiables en circunstancias apropiadas. Las formas de realización de la invención pueden aplicarse en secuencias distintas de las descritas o ilustradas en la presente memoria.
[0051] Además, las diversas formas de realización, aunque se haga referencia a ellas como "preferidas" o "por ejemplo" o "en particular", deben interpretarse como maneras ejemplares en las que la invención puede implementarse en lugar de limitar el alcance de la invención.
[0052] El término "que comprende", usado en las reivindicaciones, no debe interpretarse como restringido a los elementos o pasos enumerados a continuación; no excluye otros elementos o pasos. Debe interpretarse como que especifica la presencia de las características, números enteros, pasos o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, pasos o componentes distintos, o grupos de estos. Por lo tanto, el alcance de la expresión "una composición farmacéutica que comprende A y B" no debe limitarse a una composición farmacéutica que consiste solo en los componentes A y B, sino que, con respecto a la presente invención, los únicos componentes enumerados de la composición farmacéutica son A y B, y además la reivindicación debe interpretarse como que incluye equivalentes de esos componentes. De manera similar, el alcance de la expresión "un método que comprende el paso A y el paso B" no debe limitarse a un método que consiste únicamente en los pasos A y B, sino que, con respecto a la presente invención, los únicos pasos enumerados del método son A y B, y además debe interpretarse que la reivindicación incluye equivalentes de esos pasos.
[0053] Además, la referencia a una característica mediante el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que estén presentes más de una de las características, como por ejemplo un componente, excipiente, saponina, etc., a menos que el contexto requiera claramente que haya una y solo una de las características. El artículo indefinido "un" o "una" significa por lo tanto normalmente "al menos un/a”.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0054]
Fig1: Actividad de silenciamiento génico de HSP27BNA de HSP27BNA, HSP27BNA-SO1861 y HSP27BNA-dendrón-(SO1861 )4 en líneas celulares de cáncer A431.
Fig 2:A.Espectro de MALDI-TOF-MS de BSA-SO1861.B.Espectro de MALDI-TOF-MS de BSA.
Fig 3:A.Espectro de H-RMN de SO1861.B.Espectro de H-RMN del conjugado SO1861-EMCH ((EMCH = hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico).
Fig 4: Fig. 4:A.Espectro de MALDI-TOF-Ms del conjugado SO1861-EMCH.B.Espectro de MALDI-TOF-MS del conjugado SO1861-EMCH-mercaptoetanol.
Fig 5: Fig 5:A.Esquema de síntesis de SO1861-EMCH.B.Espectro de MALDI-TOF-MS de SO1861 en modo reflector negativo. TFA: ácido trifluoroacético, r.t.: temperatura ambiente, h: horas, y MW: peso molecular.C.Espectro de MALDI-TOF-MS de SO1861-EMCH en modo reflector negativo. TFA: ácido trifluoroacético, r.t.: temperatura ambiente, h: horas, y MW: peso molecular.
Fig 6: Esquema de reacción de síntesis de Dendrón(-L-SO1861)4.
Fig 7: Esquema de reacción de síntesis de Dendrón(-L-SO1861)8.
Fig 8:A.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM.B.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-SO1861 con 5SO1861 unido por PAMAM.C.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-SO1861 con 13SO1861 unido por PAMAM.D.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-SO1861 51 SO1861 unido por PAMAM.
Fig 9:A.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-SO1861 con 5 equivalentes de alimentación de SO1861-EMCH.B.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-SO1861 con 30 equivalentes de alimentación de SO1861-EMCH.
Fig 10: Espectros de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 (NC = enlace estable ("no escindible"). Fig. 11:A.Esquema de reacción de la tiolación de PAMAM usando el reactivo de tiolación 2-iminotiolano.B.
Espectro de MALDI-TOF-MS de PAMAM nativo.C.Espectro de MALDI-TOF-MS de PAMAM-(SH)<16>tiolado.
D.Espectro de MALDI-TOF-MS de PAMAM-(SH)<65>tiolado.E.Espectro de MALDI-TOF-MS de PAMAM-(SH)<108>tiolado.
Fig. 12:A.Esquema de reacción de la PEGilación de PAMAM usando el reactivo de pegilación mPEG<2k>-NHS.
B.Espectro de MALDI-TOF-MS de PAMAM nativo.C. Espectro de MALDI-TOF-<m>S de PAMAM-(mPEG<2k>)<3>pegilado.DEspectro de MALDI-TOF-MS de PAMAM-(mPEG<2k>)<8>pegilado.E.Espectro de MALDI-TOF-MS de PAMAM-(mPEG<2k>)<18>pegilado.
Fig. 13:A.Esquema de reacción de Cy3-PAMAM-NC-SO1 861 - Dibenzociclooctino (DBCO).B.Espectro de MALDI-TOF MS de Cy3-PAMAM-NC-SO1861-dibenzociclooctino (DBCO).C.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-(SO1861)<5>-DBCO.D.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-(SO1861)<27>-DBCO.
Fig. 14:A.Esquema de reacción de diantina-EGF-Alexa488.B.Esquema de reacción de diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-Ns.C.Espectro de MALDI-TOF-MS de diantina-EGF. D. Espectro de MALDI-TOF-MS de diantina-EGF-Alexa488.E.Espectro de MALDI-TOF-MS de diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-N<3>.
Fig. 15:A.Esquema de reaccion de diantina-Alexa488.B.Esquema de reacción de diantina-Alexa488-SS-PEG-N<3>.C.Espectro de MALDI-TOF-MS de diantina.D.Espectro de MALDI-TOF-MS de diantina-Alexa488.
E.Espectro de MALDI-TOF-MS de diantina-Alexa488-SS-PEG-N<3>.
Fig 16: Imágenes de fluorescencia de gel de SDS-PAGE realizadas en un sistema de obtención de imágenes VersaDoc. M = marcador, P = Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO, D = diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-N<3>, C1 = Cy3-PAMAM-(SO1861)5-Diantina-EGF-Alexa488, C2 = Cy3-PAMAM-NC-SO1861-Diantina-EGF-Alexa488, y C3 = Cy3-PAMAM-(SO1861 )27-Diantina-EGF-Alexa488.
Fig 17:A.Esquema de síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 mediante aminación reductora.B.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 sintetizado mediante aminación reductora con 10SO1861 por PAMAM.C.Espectro de MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 sintetizado mediante aminación reductora con 30SO1861 por PAMAM.
Fig. 18:A.Espectro de Ma LDI-TOF-MS del péptido nativo.B.Espectro de MALDI-TOF-MS del conjugado péptido-SO1861.
Fig 19: Estructura de SO1861 con grupos químicos resaltados para la conjugación de saponinas potenciadoras del escape endosomal a una estructura polimérica. Los grupos resaltados son aldehído (círculo con línea continua), ácido carboxílico (círculo con línea discontinua), alqueno (pentágono con línea discontinua) y alcohol (recuadro con línea discontinua).
Fig 20:A.Representación esquemática de la producción de saponinas potenciadoras del escape endosomal "listas para conjugar" estables.B.Representación esquemática de la producción de saponinas potenciadoras del escape endosomal "listas para conjugar" escindibles.
Fig. 21: Fig 26: Hidrólisis del enlace hidrazona de SO1861-EMCH en condiciones ácidas.
Fig. 22:A.Estructura molecular estándar del conjugado SO-1861-EMCH. El grupo maleimida está marcado con un círculo.B.Modelo 3D de conjugado SO1861-EMCH. El grupo maleimida está marcado con un círculo. Fig. 23:A.Espectro de MALDI-TOF-MS de SO1861-EMCH antes de la hidrólisis en solución de HCl a pH 3. B. Espectro de MALDI-TOF-MS de SO1861-EMCH después de hidrólisis en solución de HCl a pH 3.
Fig 24: Esquema de reacción de la conjugación de SO1861-EMCH con cualquier estructura polimérica portadora de amina.
Fig. 25:A.Esquema de reacción de la conjugación de SO1861-EMCH con un dendrímero G5 de poliamidoamina (PAMAM) marcado con colorante de cianina 3.B.Esquema de reacción de conjugación de SO1861-HATU (HATU = 3-óxido hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio) con un dendrímero G5 de poliamidoamina (PAMAM) marcado con colorante de cianina 3.
Fig 26: Estructura molecular de dendrón G4 con grupos amino protegidos.
Fig 27: Esquema de síntesis para la generación de estructuras base basadas en dendrón.
Fig 28:A.Esquema de reacción para marcaje parcial de colorantes y desprotección del dendrón G4.B.
Espectro de MALDI-TOF-MS de dendrón G4 desprotegido y parcialmente marcado con colorante.
Fig. 29:A.Espectro de MALDI-TOF-MS de estructura base dendrón G4-SO1861 con 22 equivalentes de alimentación de SO1861-EMCH.B.Espectro de MALDI-TOF-MS de estructura base dendrón G4-SO1861 con 10 equivalentes de alimentación de SO1861-EMCH.C.Espectro de MALDI-TOF-MS de estructura base dendrón G4-SO1861 con 3 equivalentes de alimentación de SO1861-EMCH.
Fig. 30:A.Expresión en la superficie celular de EGFR determinada por análisis FACS de células HeLa.B.
Viabilidad celular de células HeLa tratadas con SO1861 diantina-EGF (Dia-EGF), SO1861 diantina-EGF cloroquina 500 nM, SO1861 diantina-EGF PAMAM 500 nM, SO1861 diantina-EGF dendrón 667 nM.
C.Viabilidad celular de células HeLa tratadas con SO1861 diantina-EGF, SO1861 diantina-EGF cloroquina 500 nM, SO1861 diantina-EGF PAMAM 500 nM, SO1861 diantina-EGF PAMAM-(SH)<16>500 nMSO1861 diantina-EGF PAMAM-(SH)<65>500 nMSO1861 diantina-EGF PAMAM-(SH)<ios>500 nM.
D.Viabilidad celular de células HeLa tratadas con SO1861 diantina-EGF, SO1861 diantina-EGF cloroquina 500 nM, SO1861 diantina-EGF PAMAM 500 nM, SO1861 diantina-EGF PAMAM-(mPEG)<s>SO1861 500 nM diantina-EGF PAMAM-(mPEG^SO1861 500 nM diantina-EGF PAMAM-(mPEG)<1s>500 nM.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0055] Para que una molécula bioactiva funcione, la molécula debe poder interactuar con su diana, por ejemplo, en el suero sanguíneo, en el exterior de la superficie celular o dentro de una célula o un orgánulo. La fracción activa de casi todas las toxinas dirigidas con base proteica, por ejemplo, debe entrar en el citosol de la célula diana para mediar su efecto modulador de la diana. En muchas constelaciones, la toxina sigue siendo ineficaz, ya que (1) la porción de direccionamiento está poco internalizada y permanece unida al exterior de las células, (2) se recicla de nuevo en la superficie celular después de la internalización o (3) se transporta a los endolisosomas, donde se degrada. Aunque estos problemas fundamentales se conocen desde hace décadas y se han investigado más de 500 toxinas dirigidas en las últimas décadas, los problemas aún no se han resuelto y, hasta la fecha, solo una toxina proteica dirigida a anticuerpos, moxetumomab pasudotox-tdfk (LUMOXITI®, AstraZeneca Pharmaceuticals LP), ha sido aprobada por la FDA para la leucemia de células pilosas en recaída o refractaria. Otros ADC aprobados son Elzonris, Ontak.
[0056] Para superar estos problemas, se han descrito muchas estrategias que incluyen métodos para redirigir las toxinas a los complejos de transporte de la membrana celular endógena de la vía biosintética en el retículo endoplásmico y técnicas para interrumpir o debilitar la integridad de la membrana de los endosomas, es decir, los compartimentos de la vía endocítica de una célula, facilitando así el escape endosomal. Esto comprende el uso de aminas lisosomotrópicas, ionóforos carboxílicos, antagonistas de los canales de calcio, diversos péptidos de penetración celular de origen viral, bacteriano, vegetal, animal, humano y sintético, otras moléculas orgánicas y técnicas inducidas por luz. Aunque la eficacia de las toxinas dirigidas se suele incrementar en cultivo celular cien o mil veces o, en casos excepcionales, más de un millón de veces, el requisito de coadministrar potenciadores del escape endosomal con otras sustancias conlleva nuevos problemas que incluyen efectos secundarios adicionales, pérdida de la especificidad por la diana, dificultades para determinar la ventana terapéutica y las variaciones dependientes del tipo de célula.
[0057] Todas las estrategias, incluyendo las técnicas fisicoquímicas, requieren moléculas potenciadoras que interactúen de forma más o menos directa con las membranas y comprendan esencialmente pequeñas moléculas químicas, metabolitos secundarios, péptidos y proteínas. Una característica común de todas estas sustancias es que de por sí no se dirigen a células específicas y se distribuyen con otra cinética distinta de las toxinas dirigidas. Este es uno de los principales inconvenientes de los enfoques actuales.
[0058] La presente invención se describirá con respecto a formas de realización particulares, pero la invención no se limita a las mismas, sino únicamente a las reivindicaciones. Las formas de realización de la invención descritas en este documento pueden funcionar en combinación y cooperación, a menos que se especifique lo contrario.
[0059] Un aspecto de la invención se refiere a una porción efectora como se define en las reivindicaciones que es capaz de inducir un efecto intracelular cuando está presente dentro de una célula de mamífero, donde la porción efectora está conjugada con al menos una saponina, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción efectora a través de al menos una porción conectora, o está unida de manera covalente directamente a dicha porción efectora.
[0060] Los inventores han establecido que la ventana terapéutica de un conjugado de una saponina y una porción efectora aumenta cuando se administra a un mamífero (ratón) que tiene un tumor al que se administra el conjugado, donde dicho conjugado comprende al menos una saponina unida de manera covalente. El conjugado de la invención tiene al menos una saponina unida a este, covalentemente, preferiblemente a través de una porción conectora escindible. La saponina aumenta la eficacia terapéutica de la porción efectora unida a la saponina, probablemente potenciando el escape endosomal de la porción efectora al citosol, donde se desea la actividad de la porción efectora. De esta manera, ya a una dosis menor que la dosis convencional de la porción efectora, cuando forma parte de un conjugado, tal como un ADC o un AOC, se establece un efecto terapéutico bajo la influencia de la presencia de la(s) saponina(s) comprendida(s) por el conjugado de la invención, que junta de este modo la(s) saponina(s) y las porciones efectoras cerca, en y/o dentro de la célula diana. La célula diana es, por ejemplo, una célula enferma tal como una célula tumoral o una célula autoinmunitaria o un linfocito B relacionado con una enfermedad de los linfocitos B, etc. La porción efectora es, por ejemplo, un oligonucleótido tal como un BNA antisentido que forma parte de un AOC, según la invención.
[0061] La porción efectora de la invención comprende o consiste en al menos un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado de uno o más de un vector, un gen, un transgén que induce la apoptosis celular, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótido antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN de minicírculo, ácido nucleico peptídico (APN), oligómero morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente 2'-O,4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treosa nucleico (TNA), o un derivado de estos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27.
[0062] Para sorpresa de los inventores, un conjugado de BNA antisentido tal como para silenciar la expresión del gen HSP27, y una saponina tal como SO1861, covalentemente unidos entre sí, silencian de manera eficaz la expresión de HSP27 en células tumorales que crecen/se dividen rápidamente, tales como células de la línea celular de cáncer A431 de ratón, en comparación con el control. El conjugado BNA-saponina dio como resultado una expresión de HSP27 aproximadamente tres veces menor en células, en comparación con la expresión de HSP27 en células expuestas a la misma concentración del BNA libre no conjugado en ausencia de saponina. Véase también la Figura 1 de los Ejemplos. Por lo tanto, poner en contacto células tumorales con un oligonucleótido antisentido tal como BNA antisentido da como resultado un silenciamiento génico que se mejora o potencia cuando la saponina tal como SO1861 se une covalentemente al oligonucleótido. Con ello, se amplía la ventana terapéutica con respecto al oligonucleótido, ya que ahora puede obtenerse el mismo efecto de silenciamiento génico en las células tumorales con una dosis tres veces menor del BNA antisentido cuando se aplica un conjugado de BNA y saponina según la invención.
[0063] Según la invención, la al menos una saponina es una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-deshidrooleanano con un grupo aldehído en posición C-23 y que comprende opcionalmente un grupo ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina.
[0064] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la al menos una saponina es una sola saponina específica o es una mezcla de dos o más saponinas diferentes.
[0065] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la saponina es una o más de las saponinas de la Tabla A1 o el Esquema I, SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, Quillajasaponin, Saponinum album, QS-18, Quil-A, Gyp1, gipsósido A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, o cualquiera de sus estereómeros y/o cualquier combinación de los mismos, preferiblemente la saponina es SO1861 y/o GE1741 y/o SA1641 y/o QS-21 y/o saponina con un núcleo de aglicona del ácido quillaico, un sustituyente carbohidrato Gal-(1^2)-[Xyl-(1^-3)]-GlcA en el grupo C-3beta-OH y un sustituyente carbohidrato Glc-(1^3)-Xyl-(1^4)-Rha-(1^2)-[Xyl-(1^3)-4-OAc-Qui-(1^4)]-Fuc en el grupo C-28-OH, y/o es ácido 3-O-beta-D-galactopiranosil-(1^2)-[beta-D-xilopiranosil-(1^3)]-beta-D-glucuronopiranosil quillaico 28-O-beta-D-glucopiranosil-(1^3)-beta-D-xilopiranosil-(1^4)-alfa-L-ramnopiranosil-(1^2)-[beta-D-xilopiranosil-(1^3)-4-OAc-beta-D-quinovopiranosil-(1^4)]-beta-D-fucopiranósido, más preferiblemente la saponina es SO1861 y/o QS-21.
[0066] Sorprendentemente, los inventores ahora demuestran que una fracción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria, que comprende QS-21 y los miembros de su familia QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, QS-18 y Quil-A, también muestra la capacidad de potenciar un efecto biológicoin vitrode, por ejemplo, un ácido nucleico unido a un anticuerpo monoclonal o una toxina proteica unida a un anticuerpo monoclonal, cuando se administra a células tumorales de una especie de mamífero (ser humano) en forma de un conjugado covalente que comprende un anticuerpo monoclonal y el al menos un glucósido tal como QS-21, y las saponinas que son miembros de su familia abarcadas por dicha preparación de QS-21 (por ejemplo, fracción soluble en agua de Quillaja saponaria), en el presente documento la molécula efectora y el glucósido, por ejemplo, la fracción de saponina de Quillaja saponaria, QS-21, SO1861, SA1641, GE1741, se unen covalentemente a, por ejemplo, moléculas proteicas directamente o a través de una porción conectora o a través de una estructura base polimérica u oligomérica, ya sea directamente o a través de al menos una porción conectora. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, la estimulación o potenciación observada de, por ejemplo, la reducción mediada por BNA antisentido de la expresión de HSP27 de células tumorales (silenciamiento génico de HSP27) en presencia de saponinas derivadas de Quillaja saponariain vitro(también) puede referirse a la activación del inflamasomas en la célula tumoral por las saponinas, dando como resultado, por ejemplo, la piroptosis de células tumorales. Los inventores establecieron que un anticuerpo conjugado con, por ejemplo, BNA o diantina o saporina antisentido no ejercía actividad anti células tumoralesin vitroo mejoraba la actividad anti células tumorales al ponerse en contacto con células en ensayos celulares de base biológica, cuando estaba en presencia de saponina unida a un anticuerpo de direccionamiento, y dirigida a las mismas células (tumorales), mientras que, en ausencia de la saponina, no se observó tal actividad hacia la célula tumoral.
[0067] QS-21, y también la fracción de saponinas solubles en agua que comprende QS-21 de Quillaja saponaria, se conoce ya desde hace mucho tiempo y se ha aplicado mucho con anterioridad por sus capacidades inmunopotenciadoras, por ejemplo, como adyuvante en, por ejemplo, vacunas de subunidades. Por ejemplo, QS21 se aplica en dos ensayos clínicos de fase III con pacientes humanos, que se vacunaron con una vacuna de subunidades mezclada con un adyuvante que comprende QS-21 (Glaxo-Smith-Kline, ensayo MAGRIT, estudio DERMA), donde la subunidad era proteína MAGE-A3, que se expresa y presenta específicamente por células tumorales. Las vacunaciones antitumorales, potenciadas con QS-21, tenían como objetivo la extensión de la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con cáncer (melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas). Además, QS-21 se ha probado como un adyuvante en ensayos clínicos para desarrollar un tratamiento de vacunas anti-cáncer, para vacunas para la infección por VIH-1, en el desarrollo de una vacuna contra la hepatitis B, y para el desarrollo de vacunas anti-malaria usando QS-21 que comprende los adyuvantes AS01 y AS02 de Glaxo-Smith-Kline. Estudios previos revelaron una respuesta inmune provocada contra péptidos MAGE-A3 presentados en la superficie de células cancerosas, bajo la influencia del adyuvante que comprende saponina QS-21 (AS15; GSK). Para sorpresa de los inventores, la fracción de saponina de Quillaja saponaria y, por tanto, probablemente QS-21 (como parte de la fracción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria) potencia la actividad anti células tumorales de, por ejemplo, una carga útil tal como una toxina proteica (diantina), unida a la segunda molécula proteica (por ejemplo, el ligando EGF).
[0068] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la saponina es una saponina bisdesmosídica que tiene una masa molecular de al menos 1500 Dalton y que comprende un triterpeno de tipo oleanano que contiene un grupo aldehído en la posición C-23 y opcionalmente un grupo hidroxilo en la posición C-16, con una primera cadena lateral de carbohidrato ramificada en la posición C-3, donde la primera cadena lateral de carbohidrato ramificada contiene opcionalmente ácido glucurónico, donde la saponina contiene un grupo éster con una segunda cadena lateral de carbohidrato ramificada en la posición C-28, donde la segunda cadena de carbohidrato ramificada comprende preferiblemente al menos cuatro unidades de carbohidrato y opcionalmente contiene al menos un residuo acetilo tal como dos residuos acetilo y/u opcionalmente comprende uno o más desoxicarbohidratos y/o quinovosa y/o glucosa y/o ácido 4-metoxicinámico y/o comprende opcionalmente ácido 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico y/o que comprende opcionalmente ácido 5-O-[5-O-Rha-(1^-2)-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metiloctanoico unido a un carbohidrato a través de un enlace éster, o donde la al menos una saponina es QS-21 o cualquiera o más de QS-21A, qs-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21 B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS-18, QS1861, QS1861 protonada (QS1862), Quil-A.
[0069] Los inventores demuestran que un anticuerpo monoclonal dirigido a células tumorales provisto de BNA antisentido unido covalentemente tal como BNA(HSP27), y puesto en contacto con las células tumorales junto con un anticuerpo con saponina unida (por ejemplo, SO1861, QS-21), con tanto el BNA como la saponina unidos al anticuerpo respectivo (por ejemplo, cetuximab) a través de un enlace escindible, es capaz de silenciar HSP27in vivoen tumores, en comparación con el control y en comparación con un AOC solo, sin presencia de un anticuerpo con saponina unida. La co-administración de un a Dc o un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido (AOC), tal como un conjugado de anticuerpo-BNA, con un anticuerpo con saponina unida dota así al ADC o AOC de actividad anti-células tumorales no observada con solo el ADC o solo el AOC a la misma dosis. Cabe destacar que el AOC y el anticuerpo monoclonal con saponina unida de manera covalente aumentan la expresión de HSP27 en células tumorales, cuando se administran a ratones portadores de tumores por separado en grupos separados de ratones, en comparación con un grupo de control (vehículo administrado, solo). Solo la coadministración del AOC que comprende la porción efectora y un anticuerpo con saponina unida de manera covalente muestra una expresión reducida de HSP27 en comparación con los controles. El BNA antisentido (HSP27) fue BNA con la secuencia de oligonucleótidos de ácido nucleico 5'-GGCacagccagtgGCG-3' según Zhang et al. (2011) [J. ImmunolY Zhang, Z Qu, S Kim, V Shi, B Liao1, P Kraft, R Bandaru, Y Wu, LM Greenberger y ID Horak, Downmodulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA) -based antisense oligonucleotides without transfection, Gene Therapy (2011) 18, 326-333]. Cabe destacar que, hasta donde saben los inventores, el BNA está diseñado para su aplicación como un ácido nucleico libre. Los inventores son ahora los primeros en demostrar que el BNA antisentido puede unirse de manera covalente a través de una porción conectora (no) escindible a un ligando o un anticuerpo, de manera que la actividad de silenciamiento génico se mantienein vitroy, lo que es más importante,in vivoen las células tumorales de un animal portador de tumores. Este enfoque consistente en proporcionar AOC basados en BNA abre nuevas formas de administrar BNA dirigidos a pacientes (de cáncer) humanos que lo necesiten.
[0070] Los inventores describen en el presente documento que la unión covalente de saponinas tales como saponinas en la fracción soluble en agua de Quillaja saponaria,QS-21, SA1641, SO1861, Tabla A1, Esquema I, por ejemplo, a un oligonucleótido antisentido tal como un BNA, o por ejemplo a una molécula proteica, tal como a través de una porción conectora trifuncional, por ejemplo, la porción conectora trifuncional del Esquema II, o a través de una estructura oligomérica o polimérica de una estructura base que comprende saponinas unidas covalentemente, da como resultado una toxicidad celular mejorada ejercida por la porción efectora tal como una toxina, comprendida por la porción efectora de la invención, bajo la influencia de la saponina unida de manera covalente en la porción efectora de la invención.
[0071] Según la invención, típicamente la saponina es una saponina enumerada en la Tabla A1, Esquema I. Se ha demostrado que es beneficioso para la actividad de la saponina, por ejemplo, para la actividad potenciadora del escape endosomal dentro de las células cuando se tiene en cuenta la entrada en la célula y la acumulación dentro del citosol de una porción efectora de la invención que comprende saponina unida, que la saponina se acople covalentemente a la carga útil comprendida por la porción efectora (por ejemplo, un<b>N<a>) que implica un enlace hidrazona, y/o un enlace hidrazida, y/o un puente disulfuro. Tales tipos de enlaces se escinden fácilmente en condiciones ácidas dentro de endosomas y lisosomas (tardíos) de células de mamífero, por ejemplo, células humanas, y/o en condiciones reductoras. Alternativamente, los inventores también demuestran que la unión covalente de la saponina a la carga útil comprendida por la porción efectora de la invención a través de un enlace que no es fácilmente escindible en las condiciones fisiológicas dentro de las células, por ejemplo, endosomas (tardíos), lisosomas, citosol, también es beneficioso para potenciar la actividad de la saponina sobre el efecto biológico de, por ejemplo, una porción efectora tal como un ácido nucleico (por ejemplo, HSP27 de silenciamiento de BNA) y una toxina proteinácea tal como saporina. A lo largo de la solicitud, incluyendo las reivindicaciones, el término "porción conectora escindible", "enlace escindible", etc., también se denomina "porción conectora lábil" ("L") y "enlace lábil", por ejemplo en el contexto de la escisión de tal enlace o porción conectora en el endosoma (tardío) y/o lisosoma cuando se hace referencia a un conjugado de la invención, por ejemplo, una porción efectora tal como BNA-SO1861, o un conjugado oligonucleótido antisentido-saponina (siendo la saponina cualquiera de las saponinas en la Tabla A1, Esquema I), que comprende opcionalmente una estructura base con saponinas unidas a una carga útil a través de una porción conectora y/o a través de la estructura base a través de enlaces hidrazona o puentes disulfuro. Por ejemplo, los inventores mostraron el silenciamiento génico de HSP27in vivoen tumores humanos en ratones. Los ratones portadores de tumores se trataron con un anticuerpo que consistía en anticuerpo monoclonal con saponina unida al mismo a través de una porción conectora lábil (enlace hidrazona) según la invención, mientras que una porción diferente del mismo anticuerpo comprendía BNA antisentido unido para silenciar el gen HSP27 en las células tumorales, unido covalentemente al anticuerpo monoclonal (siendo el mismo tipo de anticuerpo que el primer anticuerpo monoclonal) a través de un puente disulfuro. Es decir, sin desear ceñirse a ninguna teoría, el enlace hidrazona y el puente disulfuro se escinden en los endosomas y/o lisosomas (tardíos) de las células tumorales diana que expresan el epítopo en la molécula de superficie celular diana, en este caso el EGFR, en la superficie celular, una vez que la combinación terapéutica de la invención se internaliza por, por ejemplo, endocitosis. La escisión de los enlaces contribuye probablemente a la actividad potenciadora del escape endosomal de la saponina cuando se tiene en cuenta la entrada del BNA del endosoma y/o lisosoma en el citosol, aunque tal escisión no es una necesidad para observar el efecto de silenciamiento génico de la combinación del conjugado cetuximab-SO1861 y el conjugado cetuximab-BNA de la invención.
[0072] Los expertos apreciarán que una porción conectora trifuncional es una estructura base de la invención adecuada para unir covalentemente uno, dos o tres restos de saponina. Para la porción conectora trifuncional se prefiere la unión covalente de uno o dos restos de saponina. El segundo y/o tercer sitio de unión es adecuado, por ejemplo, para la unión covalente de una carga útil, de manera que se proporciona una porción efectora de la invención. Además, el segundo o tercer sitio de unión de la porción conectora trifuncional es adecuado para la unión covalente de una inmunoglobulina tal como un anticuerpo monoclonal, preferiblemente una molécula específica de células tumorales, más preferiblemente un receptor de células tumorales que se expresa específicamente (sobre) en la superficie de la célula tumoral. De manera similar, la inmunoglobulina, o cualquier fragmento(s) y/o dominio(s) de la misma que abarque(n) la especificidad de unión de la inmunoglobulina es adecuada para unirse a una molécula de superficie celular tal como un receptor, que se expresa en la superficie de una célula autoinmunitaria. La porción conectora trifuncional comprende entonces una saponina unida de manera covalente y una carga útil unida de manera covalente, con lo que se proporciona la porción efectora de la invención, y además un anticuerpo unido covalentemente, por ejemplo, para dirigir la porción efectora a una célula seleccionada tal como una célula tumoral que expresa el sitio de unión específico para células tumorales para el anticuerpo unido, por ejemplo, un receptor de células tumorales específico. Por tanto, en una forma de realización, la porción efectora de la invención comprende la porción conectora trifuncional, donde dicha porción conectora comprende o consiste en una saponina unida de manera covalente y una porción efectora, por ejemplo, QS-21, SO1861 y por ejemplo, BNA antisentido, y el anticuerpo unido covalentemente para la unión (específica) a una célula tumoral, una célula autoinmunitaria, una célula enferma, una célula aberrante, una célula no sana, una enfermedad de células B.
[0073] Como ejemplo, BNAoligo, oligo de BNA antisentido que se dirige al transcrito de ARNm de la diana tumoral (aumentado en células cancerosas), proteína de choque térmico 27 (HSP27BNA) se conjugó con SO1861-EMCH (HSP27BNA-L-SO1861) o dendrón(-L-SO1861)4 (HSP27BNA-dendrón(-L-SO1861)4) y se coadministró a una línea celular de cáncer A431, según la invención. Como se ha dicho, para sorpresa de los inventores, un conjugado de BNA antisentido tal como para silenciar la expresión del gen HSP27, y una saponina tal como SO1861, unidos covalentemente entre sí, silencian eficazmente la expresión de HSP27 en células tumorales que crecen/se dividen rápidamente, tales como células de la línea celular de cáncer A431 de ratón, en comparación con el control. La conjugación de manera covalente de cualquiera de las saponinas de la invención con un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido antisentido, por ejemplo, un BNA tal como un BNA antisentido, da como resultado una eficacia de silenciamiento génico aumentada a la misma dosis de BNA cuando se compara con BNA libre en ausencia de saponina conjugada y en ausencia de saponina libre. El conjugado BNA-saponina dio como resultado una expresión de HSP27 aproximadamente tres veces menor en células, en comparación con la expresión de HSP27 en células expuestas a la misma concentración del BNA libre no conjugado en ausencia de saponina. Véase también la Figura 1 de los Ejemplos. Por tanto, poner en contacto células tumorales con un oligonucleótido antisentido tal como BNA antisentido da como resultado un silenciamiento génico que se mejora o potencia cuando la saponina tal como SO1861 se une covalentemente al oligonucleótido. Con ello, se amplía la ventana terapéutica con respecto al oligonucleótido, ya que ahora puede obtenerse el mismo efecto de silenciamiento génico en las células tumorales con una dosis tres veces menor del BNA antisentido cuando se aplica un conjugado de BNA y saponina según la invención. Los inventores establecieron que el conjugado de BNA con una saponina es más eficaz cuando se tiene en cuenta el silenciamiento génico que la actividad de silenciamiento génico obtenible con BNA libre administrado a las células. Además, los inventores establecieron que el conjugado de BNA con cuatro saponinas es cada vez más eficaz cuando se tiene en cuenta el silenciamiento génico y cuando se compara con la actividad de silenciamiento génico obtenible con BNA libre administrado a las células. Es decir, un silenciamiento génico mejorado con BNA(-saponina)4 es incluso mayor que un silenciamiento génico mejorado obtenible con BNA-saponina, según la invención. La(s) porción(es) conectora(s) es/son porciones conectaras escindibles.
[0074] El alcance de la invención se define en las reivindicaciones. Según las reivindicaciones, la al menos una saponina está unida de manera covalente incluyendo un enlace hidrazona a la porción efectora a través de al menos una porción conectora, o está unida de manera covalente directamente a la porción efectora.
[0075] Las porciones conectaras descritas en el presente documento que no comprenden un enlace hidrazona no están cubiertas por las reivindicaciones y solo sirven como referencia.
[0076] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la al menos una porción conectora comprende al menos una porción conectora no escindible y/o al menos una porción conectora escindible, en donde opcionalmente dicha porción conectora escindible se somete a escisión en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por la luz, y preferiblemente la porción conectora escindible comprende un enlace escindible seleccionado de entre un enlace hidrazona y un enlace hidrazida sometido a escisión en condiciones ácidas, y/o un enlace susceptible a proteólisis, por ejemplo proteólisis por catepsina B, y/o un enlace susceptible a escisión en condiciones reductoras, tal como un puente disulfuro.
[0077] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la al menos una porción conectora comprende al menos una porción conectora escindible que se somete a escisiónin vivoen condiciones ácidas como las presentes en endosomas y/o en lisosomas de células de mamíferos, preferiblemente de células humanas, preferiblemente a pH 4,0 - 6,5, y más preferiblemente a pH < 5,5.
[0078] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción efectora a través de al menos una porción conectora, en donde la porción conectora es o comprende una estructura base que comprende una estructura polimérica u oligomérica y un grupo químico para la unión covalente de la estructura base a la porción efectora.
[0079] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base a través de un enlace escindible.
[0080] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde el enlace escindible se somete a escisión en cualquiera de condiciones ácidas, condiciones reductoras, condiciones enzimáticas y condiciones inducidas por la luz, más preferiblemente el enlace escindible es un enlace hidrazona o un enlace hidrazida sometido a escisión en condiciones ácidas, y/o es un enlace susceptible a proteólisis, por ejemplo proteólisis por catepsina B, y/o es un enlace susceptible a escisión en condiciones reductoras, tal como un puente disulfuro.
[0081] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde el enlace escindible se somete a escisiónin vivoen condiciones ácidas como las presentes en los endosomas y/o en los lisosomas de células de mamíferos, preferiblemente de células humanas, preferiblemente a pH 4,0 - 6,5, y más preferiblemente a pH < 5,5.
[0082] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base a través de un enlace imina, un enlace hidrazona, un enlace hidrazida, un enlace oxima, un enlace 1,3-dioxolano, un puente disulfuro, un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace peptídico y/o un enlace éster, preferiblemente a través de al menos una porción conectora, preferiblemente un enlace amida, un enlace hidrazida, un enlace tioéter y/o un enlace hidrazona.
[0083] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base, implicando en el enlace covalente el grupo aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina, cuando está presente, siendo el enlace covalente preferiblemente un enlace imina o un enlace hidrazona o un enlace amida o un enlace tioéter o un puente disulfuro, y/o implicando en el enlace covalente el grupo ácido glucurónico en el sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la al menos una saponina, cuando está presente, en donde preferiblemente el enlace covalente es un enlace amida o un puente disulfuro o un enlace tioéter.
[0084] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde el grupo aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción conectora hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, porción conectora que está unida covalentemente a través de un enlace tioéter a un grupo sulfhidrilo en la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
[0085] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde el grupo ácido glucurónico en el sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción conectora hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio, porción conectora que está unida covalentemente a través de un enlace amida a un grupo amina en la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base, tal como un grupo amina de una lisina o un extremo N terminal de la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base.
[0086] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde el grupo químico de la estructura base, para la unión covalente de la estructura base a la porción efectora, es un grupo de química clic, preferiblemente seleccionado de una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, más preferiblemente el grupo de química clic es una azida.
[0087] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base comprende un polímero lineal, ramificado y/o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado, un ADN, un polipéptido, polilisina, un polietilenglicol, o un ensamblaje de estas estructuras poliméricas u oligoméricas, donde dicho ensamblaje se construye preferiblemente por reticulación covalente.
[0088] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la al menos una saponina es un número definido de saponinas o un intervalo definido de saponinas, preferiblemente 1-128 saponinas o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 o 128 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, tal como 7, 9, 12 saponinas.
[0089] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, en donde la porción efectora comprende más de una saponina, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 o 1-100 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, tal como 7, 9, 12 saponinas, unidas de manera covalente directamente a un residuo de aminoácido de la porción efectora, preferiblemente a una cisteína y/o a una lisina, y/o unidas covalentemente a través de al menos una porción conectora y/o a través de al menos una porción conectora escindible y/o a través de al menos una estructura base polimérica u oligomérica de cualquiera de las reivindicaciones 14-23, preferiblemente 1-8 de tales estructuras base o 2-4 de tales estructuras base, en donde 1-32 saponinas, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16 o 32 saponinas, están unidas covalentemente a la al menos una estructura base.
[0090] Los inventores han establecido que la administración de oligonucleótidos libres tal como BNA antisentido a los ratones no era muy eficaz cuando se tenía en cuenta el silenciamiento génico en células tumorales (de crecimiento rápido). Sorprendentemente, los inventores han establecido ahora que se puede lograr una actividad antitumoral beneficiosa en diversos bioensayos basados en células de mamíferoin vitroal tratar a los animales con conjugados según la invención, que comprenden opcionalmente una estructura base según la invención tal como un dendrón G4. La estructura base es, por ejemplo, una porción conectora trifuncional con al menos una saponina unida de manera covalente (por ejemplo, SO1861, QS-21) a través de un enlace escindible o no escindible, y/o con una porción efectora unida covalentemente (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido, que silencia el BNA (HSP27) a través de un enlace no escindible o un enlace escindible, o la estructura base es un dendrón, tal como un dendrón al que, por ejemplo, se pueden unir cuatro restos, tales como cuatro moléculas de saponina, o un dendrón para unir, por ejemplo, dos saponinas y dos moléculas efectoras. Se hace referencia a la sección de Ejemplos, donde se ejemplifican porciones conectoras y estructuras base según la invención, que muestran actividad anti células tumoralesin vitrocuando se tiene en cuenta el silenciamiento génico ejercido por, por ejemplo, BNA(HSP27) antisentido, por lo tanto, cuando se tiene en cuenta el silenciamiento génico en la célula tumoral.
[0091] Con la expresión "mejorar o potenciar un efecto de una porción efectora" se quiere decir que la saponina, según la invención, aumenta la eficacia funcional de esa porción efectora (por ejemplo, el índice terapéutico de una toxina o un fármaco o un oligonucleótido tal como un BNA; la eficacia metabólica de un modificador en procesos biotecnológicos; la eficacia de transfección de genes en experimentos de investigación en cultivos celulares), preferiblemente al permitir o mejorar su unión a la diana. La aceleración, prolongación o potenciación de respuestas inmunitarias específicas de antígeno preferiblemente no se incluyen. La eficacia terapéutica incluye un efecto terapéutico más fuerte, preferiblemente con una dosis más baja y/o con menos efectos secundarios. "Mejorar un efecto de una porción efectora" también puede significar que una porción efectora, que no podía usarse debido a la falta de efecto (y que, por ejemplo, no se sabía que es una porción efectora), se vuelve eficaz cuando se usa en combinación con la presente invención. Cualquier otro efecto, que sea beneficioso o deseado y que pueda atribuirse a la combinación de la fracción efectora y la segunda o tercera molécula proteinácea, como se proporciona por la invención, se considera "un efecto mejorado". En una forma de realización, la estructura base que comprende saponina(s) unida(s) y comprendida(s) por la porción efectora potencia un efecto de la carga útil/porción efectora, donde dicho efecto es planeado y/o deseado.
[0092] Se pueden formular varias características preferidas para potenciadores del escape endosomal comprendidos por la porción efectora, es decir, la saponina, según la invención: (1) preferiblemente no son tóxicos y no invocan una respuesta inmune, (2) preferiblemente no median en la captación citosólica de la porción efectora en células fuera de la diana, (3) su presencia en el sitio de acción está preferiblemente sincronizada con la presencia de la porción efectora, (4) preferiblemente son biodegradables o excretables y (5) preferiblemente no interfieren sustancialmente con procesos biológicos del organismo no relacionados con la actividad biológica de la molécula efectora con la que se combina el potenciador del escape endosomal, por ejemplo, no interaccionan con hormonas. Los ejemplos de saponinas de la invención que cumplen los criterios mencionados anteriormente, al menos en cierto grado, son las saponinas triterpénicas bisdesmosídicas tales como SO1861, SA1641, QS-21, GE1741 y las saponinas de la Tabla A1, Esquema I.
[0093] Para explicar la invención con más detalle, se describe el proceso de absorción celular de sustancias (aunque los inventores no desean estar limitados por ninguna teoría) y la terminología usada en esta invención. La absorción de sustancias extracelulares, tales como la porción efectora de la invención, en una célula mediante gemación de vesículas se denomina endocitosis. Dicha gemación de vesículas puede caracterizarse por (1) absorción de ligando dependiente de receptor mediada por la proteína citosólica clatrina, (2) absorción de balsa lipídica mediada por la proteína caveolina de unión a colesterol, (3) absorción de líquido no específica (pinocitosis) o (4) absorción de partículas no específica (fagocitosis). Todos los tipos de endocitosis se desarrollan en los siguientes procesos celulares de transporte de vesículas y clasificación de sustancias denominados rutas endocíticas. Las rutas endocíticas son complejas y no se entienden completamente. Sin desear ceñirse a teoría alguna, se pueden formar orgánulosde novoy madurar en el siguiente orgánulo a lo largo de la ruta endocítica. Sin embargo, la hipótesis actual es que las rutas endocíticas implican compartimentos estables que están conectados por tráfico vesicular. Un compartimento es un orgánulo de membrana multifuncional complejo que está especializado para un conjunto particular de funciones esenciales para la célula. Se considera que las vesículas son orgánulos transitorios, de composición más sencilla, y se definen como contenedores encerrados en membranas que se formande novopor gemación a partir de un compartimento preexistente. A diferencia de los compartimentos, las vesículas pueden sufrir maduración, que es una serie fisiológicamente irreversible de cambios bioquímicos. Los endosomas tempranos y los endosomas tardíos representan compartimentos estables en la ruta endocítica, mientras que las vesículas endocíticas primarias, fagosomas, cuerpos multivesiculares (también llamados vesículas portadoras de endosomas), gránulos secretores e incluso lisosomas representan vesículas. La vesícula endocítica, que surge en la membrana plasmática, más prominentemente de los hoyos recubiertos con clatrina, se fusiona primero con el endosoma temprano, que es un compartimento de clasificación principal de aproximadamente pH 6,5. Una gran parte de la carga y las membranas internalizadas se reciclan de nuevo a la membrana plasmática a través de vesículas de reciclaje (ruta de reciclaje). Los componentes que deben degradarse se transportan al endosoma tardío ácido (pH inferior a 6) a través de cuerpos multivesiculares. Los lisosomas son vesículas que pueden almacenar enzimas lisosómicas maduras y suministrarlas a un compartimento endosomal tardío cuando sea necesario. El orgánulo resultante se denomina orgánulo híbrido o endolisosoma. Los lisosomas brotan del orgánulo híbrido en un proceso denominado reformación de lisosomas. Los endosomas tardíos, los lisosomas y los orgánulos híbridos son orgánulos extremadamente dinámicos, y la distinción entre ellos suele ser difícil. La degradación de una molécula endocitosada se produce dentro de un endolisosoma o lisosoma. El escape endosomal es la liberación activa o pasiva de una sustancia desde la luz interna de cualquier tipo de compartimento o vesícula a partir de la vía endocítica, preferiblemente a partir de endocitosis mediada por clatrina, o vía de reciclaje al citosol. El escape endosomal incluye, por tanto, la liberación de endosomas, endolisosomas o lisosomas, incluyendo sus orgánulos intermedios e híbridos.
[0094] A menos que se indique específicamente lo contrario y en particular cuando se hace referencia al mecanismo de escape endosomal de la saponina, según la invención, siempre que se use la palabra "endosoma" o "escape endosomal" en la presente memoria también se incluye el endolisosoma y el lisosoma, y el escape del endolisosoma y del lisosoma, respectivamente. Después de entrar en el citosol, dicha sustancia podría desplazarse a otras unidades celulares tal como el núcleo.
[0095] En términos formales, un glucósido es cualquier molécula en la que un grupo azúcar está unido a través de su carbono anomérico a otro grupo a través de un enlace glucosídico. Las moléculas de glucósido, tales como las saponinas, en el contexto de la invención son moléculas que, además, son capaces de potenciar el efecto de una porción efectora, sin desear ceñirse a ninguna teoría, en particular al facilitar el escape endosomal de la porción efectora. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, las saponinas, tales como las enumeradas en la Tabla A1 y en el Esquema I y las ejemplificadas en las diversas formas de realización, interactúan con las membranas de los compartimentos y vesículas de la vía endocítica y de reciclaje y las hacen permeables para dichas porciones efectoras, dando como resultado un aumento del escape endosomal. Con la expresión "la estructura base es capaz de aumentar el escape endosomal de la porción efectora" se entiende que la al menos una saponina (molécula de glucósido), que se acopla a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base, es capaz de mejorar el escape endosomal de una carga útil comprendida por una porción efectora de la invención cuando ambas moléculas están dentro de un endosoma, por ejemplo, un endosoma tardío, opcional y preferiblemente después de que la al menos una saponina se libere de la porción efectora, tal como de una porción conectora o estructura polimérica u oligomérica comprendida por dicha porción efectora, por ejemplo, por escisión de un enlace escindible entre la al menos una saponina y la carga útil (por ejemplo, a través de una estructura polimérica u oligomérica de una estructura base y/o a través de una porción conectora). Aunque un enlace entre la al menos una saponina según la invención y la carga útil comprendida por la porción efectora de la invención, opcionalmente a través de una porción conectora o una estructura base, puede ser un "enlace estable", eso no significa que tal enlace no pueda escindirse en los endosomas mediante, por ejemplo, enzimas. Por ejemplo, la saponina, opcionalmente junto con una porción conectora o una parte de la estructura oligomérica o polimérica de una estructura base, puede escindirse del fragmento de porción conectora restante o de la estructura oligomérica o polimérica. Podría ser, por ejemplo, que una proteasa corte una porción conectora (proteico) o una estructura polimérica proteica, por ejemplo, albúmina, liberando de este modo la al menos una saponina. Sin embargo, se prefiere que la saponina se libere en una forma activa, preferiblemente en la forma original que tenía antes de (prepararse para) unirse a la carga útil comprendida por la porción efectora de la invención, opcionalmente a través de una porción conectora y/o una estructura base oligomérica o polimérica; por tanto, la saponina tiene su estructura natural después de tal escisión o la saponina tiene (parte de) un grupo químico o porción conectora unido a la misma, después de tal escisión, mientras que la actividad biológica del glucósido (actividad biológica de la saponina), por ejemplo, actividad potenciadora del escape endosomal/lisosomal hacia una carga útil presente en el mismo endosoma o lisosoma, se mantiene o restaura después de dicha escisión del enlace entre la saponina y, por ejemplo, la carga útil o una molécula portadora comprendida por la porción efectora de la invención, que comprende opcionalmente una porción conectora y/o una estructura base de la invención. Con respecto a la presente invención, el término "estable" con respecto a enlaces entre, por ejemplo, saponinas y residuos de aminoácidos de la carga útil, una porción conectora, estructuras poliméricas u oligoméricas (de la estructura base), ligandos, inmunoglobulinas (monoclonales) o dominios de unión o fragmentos de los mismos, y/o efectores adicionales (porciones efectoras, moléculas efectoras), significa que el enlace no se rompe fácilmente o al menos no está diseñado para romperse fácilmente, por ejemplo, por diferencias de pH, concentraciones de sal o luz UV, condiciones reductoras. Con respecto a la presente invención, el término "escindible" con respecto a enlaces entre, por ejemplo, saponinas y la carga útil comprendida por la porción efectora de la invención, porciones conectoras, residuos de aminoácidos, estructuras poliméricas u oligoméricas de la estructura base, ligandos, anticuerpos y/u otros efectores, significa que el enlace está diseñado para romperse fácilmente, por ejemplo, por diferencias de pH, concentraciones de sal, en condiciones reductoras y similares. Los expertos en la materia conocen bien tales enlaces escindibles y cómo prepararlos.
[0096] Antes de la presente invención, uno de los principales obstáculos de introducir ADC y AOC en el mercado era la pequeña ventana terapéutica: una dosis terapéuticamente eficaz de un ADC o un AOC va acompañada de efectos secundarios (inaceptables), lo que dificulta el desarrollo e implicación en el tratamiento de pacientes con los ADC. Mediante la aplicación de la porción efectora de la invención como un producto semiacabado para la fabricación de un conjugado ADC-saponina o un conjugado AOC-saponina, ahora es posible guiar una o múltiples moléculas de glucósido (saponina) hasta una célula (diana), junto con el ADC que lleva una carga útil o junto con un anticuerpo (monoclonal) conjugado con un oligonucleótido tal como un BNA según la invención, por lo que el anticuerpo está provisto de una porción efectora unida de manera covalente de la invención que comprende saponina unida de manera covalente de la invención. En particular, antes no era posible guiar específicamente una porción efectora de una carga útil comprendida por la porción efectora de la invención y un número o intervalo particular (predefinido, controlable) de moléculas de glucósido (saponinas) por carga útil al mismo tiempo hasta el citosol de las células, tal como a través de la ruta endocítica de una célula. Ahora, la porción efectora de la invención puede unirse de manera covalente a un anticuerpo monoclonal para unirse a un epítopo específico de célula aberrante tal como un receptor de células tumorales que está específicamente expuesto en la superficie de dicha célula tumoral, de manera que la porción efectora de la invención se aplica como un producto semiacabado para proporcionar un conjugado ADC-saponina o un conjugado AOC-saponina, según la invención.
[0097] Una solución proporcionada por la invención comprende la unión covalente de al menos una saponina a una carga útil, proporcionando con ello una porción efectora de la invención. Una solución adicional proporcionada por la invención comprende (primero) polimerizar las saponinas usando una estructura base oligomérica o polimérica, y proporcionar a la carga útil comprendida por la porción efectora de la invención un grupo de saponinas unidas covalentemente, lo que permite la re-monomerización de saponina o saponinas en el sitio intracelular donde se desea el modo de acción de la saponina, por ejemplo, después de la endocitosis. "Polimeriza" en este contexto significa la conjugación múltiple reversible y/o irreversible de moléculas de saponina a la molécula de carga útil, ya sea a través de una porción conectora, o directamente o a través de una estructura polimérica u oligomérica para formar una estructura base o la conjugación múltiple reversible y/o irreversible de saponinas (modificadas), formando de este modo una estructura polimérica u oligomérica para formar una estructura base. "Re-monomerización" en este contexto significa la escisión de las saponinas de la molécula de carga útil (por ejemplo, un BNA antisentido), de la porción conectora que une la(s) saponina(s) a la molécula de carga útil en la porción efectora de la invención o de la estructura base, por ejemplo después de la endocitosis, y la recuperación del estado químico (nativo) de las saponinas no unidas, saponinas no unidas que pueden comprender o no grupos químicos adicionales tales como un grupo químico para unir la saponina a una porción conectora, un residuo de aminoácido de la carga útil o a la estructura base, y/o una porción conectora (química) unida a un grupo químico de la saponina tal como un grupo aldehído o grupo ácido carboxílico. Debido a la química compleja de las saponinas, por ejemplo, la "polimerización" de las saponinas en una estructura base u otra porción conectora de unión y su "re-monomerización" en una ubicación deseada, tal como intracelularmente, por ejemplo, después de la endocitosis, fue una tarea difícil. En particular, las reacciones químicas usadas para proporcionar las porciones conectoras y la estructura base que comprende glucósidos unidos covalentemente para la unión covalente a la carga útil, por ejemplo, saponinas triterpenoides (polimerización de los glucósidos), normalmente se producen en disolventes orgánicos sin agua, pero las saponinas y, por ejemplo, los polímeros biocompatibles aplicados como estructura base para soportar saponinas unidas son moléculas solubles en agua.
[0098] Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se prefiere sincronizar la presencia de ambas, la al menos una saponina, y la porción efectora, preferiblemente un oligonucleótido, en compartimentos o vesículas de la ruta endocítica de la célula diana, por ejemplo, una célula tumoral o una célula autoinmunitaria. Con, por ejemplo, BNA y saponina libre, la sincronización de la presencia de las moléculas en los endosomas tardíos con el fin de obtener los efectos sinérgicosin vivono se puede obtener de manera beneficiosa. En un aspecto, la invención resuelve preferiblemente al menos el siguiente problema con respecto a la combinación de la porción efectora comprendida por el conjugado de la invención y las saponinas comprendidas por el conjugado de la invención: sin desear ceñirse a ninguna teoría, el único grupo químico razonable dentro de, por ejemplo, las saponinas, que puede usarse para la unión retenible (covalente), en particular individual y escindible, se requiere para la actividad de escape endosomal. Con toda probabilidad, las restricciones conocidas son la razón por la que las saponinas no se han usado en combinación con sustancias farmacéuticamente activas en investigaciones clínicas distintas de la aplicación de saponinas en regímenes de vacunación en los que estaba implicado el uso de una sustancia adyuvante inmunopotenciadora, aunque el sorprendente efecto potenciador del escape endosómico de, por ejemplo, las saponinas enumeradas en la Tabla A1 y el Esquema I se conoce desde hace más de 10 años. Por ejemplo, proporcionar un conjugado de la invención con una estructura base conjugada covalentemente resuelve estas dificultades, al menos en parte. Sorprendentemente, las saponinas aplicadas previamente por su actividad inmunopotenciadora en el contexto de la vacunación que implica saponinas como componente adyuvante ahora también son adecuadas para la unión (covalente) a ADC o AOC de la invención, para la actividad antitumoralin vitroein vivo.
[0099] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende la porción efectora según la invención, o un conjugado ligando-fármaco que comprende la porción efectora de la invención, donde la porción efectora comprende la saponina unida de manera covalente. La porción efectora de la invención es un conjugado que comprende al menos una saponina y al menos una molécula efectora, unidas covalentemente entre sí, ya sea directamente o a través de al menos una porción conectora, que comprende opcionalmente una porción conectora escindible, y opcionalmente a través de una estructura base oligomérica o polimérica a la que están unidas covalentemente la al menos una saponina y/o la al menos una porción efectora.
[0100] Una forma de realización es el conjugado anticuerpo-fármaco o el conjugado ligando-fármaco de la invención, donde el anticuerpo puede unirse a cualquiera de CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, EfrinaA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente CD71, HER2, EGFR, y/o donde el anticuerpo del conjugado anticuerpo-fármaco es o comprende cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD71 OKT-9 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, herceptina, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD38 OKT-10, un anticuerpo de la Tabla A2 o la Tabla A3 o la Tabla A4, preferiblemetne cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión al receptor específico de células tumorales del mismo y/o al menos un dominio de unión al receptor específico de células tumorales del mismo, y/o en donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudoxox y Polatuzumab vedotina y un conjugado anticuerpo-fármaco de la Tabla A2 y la Tabla A3, y/o en donde el conjugado ligando-fármaco comprende o consiste en al menos un ligando no proteico y/o al menos un ligando proteico para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina.
[0101] Un aspecto de la invención se refiere a una combinación terapéutica que comprende: (a) la porción efectora de la invención, que comprende al menos una saponina, y opcionalmente un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico; y (b) un conjugado anticuerpo-fármaco o un conjugado ligando-fármaco, y opcionalmente un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
[0102] Una forma de realización es la combinación terapéutica de la invención, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco puede unirse a cualquiera de los receptores de células tumorales CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA,<c>D44<v>6, FAP, EGF-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, H<e>R2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L receptor, PSMA, CanAg, integrina alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrinaA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, C<t>L<a>4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente CD71, HER2, EGFR, y/o en donde el anticuerpo del conjugado anticuerpo-fármaco es o comprende cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD71 OKT-9 del tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, herceptina, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD38 OKT-10, un anticuerpo de la Tabla A2 o la Tabla A3 o la Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión al receptor específico de células tumorales del mismo y/o al menos un dominio de unión al receptor específico de células tumorales del mismo, y/o en donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudoxox y Polatuzumab vedotina y un conjugado anticuerpo-fármaco de la Tabla A2 y la Tabla A3, y/o en donde el conjugado ligando-fármaco comprende o consiste en al menos un ligando no proteico y/o al menos un ligando proteico para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina.
[0103] Una porción efectora útil en la presente invención se basa preferiblemente en el escape endosomal tardío para ejercer su efecto. Se prefiere además que un conjugado de la invención que comprende porción efectora -saponina unidas comprenda una estructura base funcionalizada conjugada covalentemente, es decir, una estructura base que comprende porcion(es) efector(as) unida(s) covalentemente para suministrar la estructura base que comprende la(s) porción(es) efector(as) unidas(s) a una célula diana tal como una célula tumoral o una célula autoinmunitaria, junto con la saponina unida de manera covalente.
[0104] El término “ligando” tal como se utiliza en esta invención tiene su significado habitual y preferiblemente significa una molécula o estructura que es capaz de unirse a otra molécula o estructura de la superficie celular de una célula diana, donde dicha molécula o estructura de la superficie celular puede endocitarse y preferiblemente está ausente o es menos prominente en células no diana. Preferiblemente, dicha molécula o estructura de la superficie celular se endocitosa constitutivamente. Más preferiblemente, un ligando en esta invención induce la endocitosis de dicha molécula o estructura de la superficie celular de células diana después de unirse a dicha molécula o estructura. Este es, por ejemplo, el caso para el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR), presente en la superficie de una variedad de células cancerosas. Algunos ejemplos de moléculas o estructuras de la superficie celular de células diana que son endocitadas constitutivamente son, por ejemplo, la claudina 1 o las glucoprotteínas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II. Un ligando puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un factor de crecimiento o una citocina. En, por ejemplo, una estructura base funcionalizada que comprende una molécula portadora que comprende un ligando y una porción efectora de la invención, el ligando o el anticuerpo monoclonal guía la porción efectora con la saponina unida a esta, y la estructura base a las células diana. Después de la internalización, la al menos una saponina comprendida por la porción efectora de la invención, media en el escape endosomal de la porción efectora. La saponina es típicamente una saponina enumerada en la Tabla A1 y el Esquema I, y preferiblemente la saponina es SO1861 y/o QS-21, y/o SA1641 y/o GE1741.
[0105] Una carga útil, y una molécula efectora, o porción efectora de la invención, en el contexto de esta invención es cualquier sustancia que afecte al metabolismo de una célula por interacción con una molécula efectora intracelular diana, en donde esta molécula efectora diana es cualquier molécula o estructura dentro de las células excluyendo el lumen de los compartimentos y vesículas de la ruta endocítica y de reciclaje pero incluyendo las membranas de estos compartimentos y vesículas. Dichas estructuras dentro de las células incluyen, por tanto, el núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos, el retículo endoplasmático, el aparato de Golgi, otras vesículas de transporte, la parte interna de la membrana plasmática y el citosol. La administración citosólica de una carga útil o una porción efectora en el contexto de la invención significa preferiblemente que la carga útil o la porción efectora es capaz de escapar del endosoma (y/o lisosoma), que, como se ha definido previamente, también incluye escapar del endolisosoma y el lisosoma, y es preferiblemente capaz de alcanzar la carga útil o la porción efectora diana como se describe en el presente documento. La presente divulgación también abarca un nuevo tipo de molécula, denominada estructura base, que sirve para llevar tanto una carga útil como al menos una saponina, o una porción efectora de la invención, en un endosoma al mismo tiempo en una relación predefinida, cuando la porción efectora comprende la carga útil y la saponina. Dentro del contexto de la presente invención, la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base es una formación estructuralmente ordenada tal como un polímero, oligómero, dendrímero, polímero dendronizado u oligómero dendronizado o es una estructura polimérica ensamblada tal como un hidrogel, microgel, nanogel, micela polimérica estabilizada o liposoma, pero excluye estructuras que están compuestas de ensamblajes no covalentes de monómeros tales como mezclas de colesterol/fosfolípido. Los términos "polímero, oligómero, dendrímero, polímero dendronizado u oligómero dendronizado" tienen su significado habitual. En particular, un polímero es una sustancia que tiene una estructura molecular formada principal o completamente por un gran número de unidades iguales o similares unidas entre sí y un oligómero es un polímero cuyas moléculas consisten en relativamente pocas unidades que se repiten. No hay consenso sobre un punto de corte específico para "muchos" y "pocos" como se usa en la definición anterior de polímero y oligómero, respectivamente. Sin embargo, como la estructura base puede comprender una estructura polimérica u oligomérica, o ambas, el intervalo completo de números de unidades similares unidas entre sí se aplica a tal estructura, es decir, de 2 unidades monoméricas a 100 unidades monoméricas, 1000 unidades monoméricas, y más. Una estructura que comprende 5 o menos, por ejemplo, puede denominarse una estructura oligomérica, mientras que una estructura que comprende 50 unidades monoméricas puede denominarse una estructura polimérica. Una estructura de 10 unidades monoméricas puede denominarse oligomérica o polimérica. Una estructura base, como se define en el presente documento, comprende además al menos una saponina de la invención. Una estructura base incluye preferiblemente una estructura polimérica u oligomérica tal como poli u oligo(aminas), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina), y estructuras biocompatibles tales como polietilenglicol, poli u oligo(ésteres), tales como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido, y poli(dextrina), poli u oligosacáridos, tales como ciclodextrina o polidextrosa, y poli u oligoaminoácidos, tales como poli-lisina o un péptido o una proteína, u oligo o polímeros de ADN. Una estructura polimérica ensamblada como se define en el presente documento comprende al menos una estructura base y, opcionalmente, otras estructuras poliméricas u oligoméricas individuales. Otras estructuras poliméricas u oligoméricas individuales de dicho ensamblaje pueden ser (a) estructuras base (que comprenden de este modo al menos una saponina de la invención), (b) estructuras base funcionalizadas (que comprenden de este modo al menos una saponina, y un ligando, anticuerpo, etc., (c) estructuras poliméricas u oligoméricas sin una saponina de la invención (véase la Tabla A1, por ejemplo), sin un ligando, anticuerpo, etc. Una estructura polimérica ensamblada funcionalizada es una estructura polimérica ensamblada que contiene (a) al menos una estructura base funcionalizada o (b) al menos una estructura base y al menos una estructura polimérica que comprende al menos un ligando, anticuerpo, etc. Las estructuras poliméricas u oligoméricas dentro de una estructura polimérica ensamblada que no comprende ninguna de las moléculas mencionadas anteriormente (es decir, no hay saponinas, ninguna primera molécula proteica tal como ligandos, anticuerpos) se añaden en particular como componentes estructurales de las estructuras ensambladas, que ayudan a construir o estabilizar la estructura ensamblada ("similar a pegamento").Sin desear ceñirse a ninguna teoría, el entorno ácido parece ser un requisito previo para la acción sinérgica entre la saponina y la porción efectora.
[0106] Preferiblemente, la porción efectora, cuyo efecto es potenciado por las saponinas unidas a ella, se separa de la saponina y/o, por ejemplo, un anticuerpo, cuando se endocita. Esto puede conseguirse mediante un enlace escindible que se rompe, por ejemplo, en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por la luz.
[0107] Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la porción efectora de la invención o el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención o el conjugado ligando-fármaco de la invención, que comprende al menos una saponina unida de manera covalente a la molécula efectora y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
[0108] Un aspecto de la invención se refiere a la porción efectora de la invención o al conjugado anticuerpofármaco de la invención o a la combinación terapéutica de la invención o al conjugado ligando-fármaco de la invención o a la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento.
[0109] Un aspecto de la invención se refiere a la porción efectora de la invención o al conjugado anticuerpofármaco de la invención o a la combinación terapéutica de la invención o al conjugado ligando-fármaco de la invención o a la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria.
[0110] Los inventores describen en el presente documento que la unión covalente de saponinas tales como saponinas de la fracción soluble en agua de Quillaja saponaria,QS-21, SA1641, SO1861, Tabla A1, Esquema I, a una porción efectora tal como un oligonucleótido, por ejemplo, un BNA antisentido, tal como a través de una porción conectora trifuncional, por ejemplo, la porción conectora trifuncional del Esquema II, o a través de una estructura oligomérica o polimérica de una estructura base, tal como un dendrón, por ejemplo, un dendrón G4, que comprende saponinas unidas covalentemente, da como resultado una toxicidad celular mejorada ejercida por la porción efectora tal como una toxina y preferiblemente un oligonucleótido antisentido tal como un BNA antisentido, comprendido por el conjugado, bajo la influencia de la saponina unida de manera covalente en el conjugado, es decir, la porción efectora de la invención. En particular, la porción efectora de la invención es un oligonucleótido antisentido conjugado covalentemente con un dendrón, que tiene múltiples saponinas unidas covalentemente a él, tal como 2, 4, 8, 16 saponinas, preferiblemente 4 saponinas.
[0111] Una forma de realización es el conjugado de la invención que comprende la porción efectora y una saponina que comprende una o varias o todas las características estructurales indicadas de la saponina de Estructura A en el Esquema I, la saponina de estructura A denominada saponina con una estructura 'ideal' cuando potencia la actividad de escape endosomal hacia una porción efectora presente en el endosoma de una célula en contacto con el conjugado de la invención, y/o una saponina seleccionada de cualquiera o más de las saponinas adicionales del Esquema I:
ESQUEMA I (continuación)
ESQUEMA I (continuación)
ESQUEMA I (continuación)
ESQUEMA I continuación
[0112] Según la invención, una saponina, unida a la porción efectora comprendida por el conjugado de la invención, que tiene la estructura "ideal" con el fin de potenciar el escape endosomal de una molécula efectora comprendida por el conjugado de la invención, es una saponina bisdesmosídica de acuerdo con la Estructura A del Esquema I, que tiene una masa molecular de al menos 1500 Dalton y que comprende un triterpeno de tipo oleanano que contiene un grupo aldehído en la posición C-23 y opcionalmente un grupo hidroxilo en la posición C-16, con una primera cadena lateral de carbohidrato ramificada en la posición C-3, primera cadena lateral de carbohidrato ramificada que contiene opcionalmente ácido glucurónico, en donde la saponina contiene un grupo éster con una segunda cadena lateral de carbohidrato ramificada en la posición C-28, segunda cadena de carbohidrato ramificada que comprende preferiblemente al menos cuatro unidades carbohidrato, que contiene opcionalmente al menos un residuo acetilo tal como dos residuos acetilo y/o que comprende opcionalmente desoxicarbohidratos y/o que comprende opcionalmente quinovosa y/o que comprende opcionalmente glucosa y/o que comprende opcionalmente ácido 4-metoxicinámico y/o que comprende opcionalmente ácido 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico y/o que comprende opcionalmente ácido 5-O-[5-O-Rha-(1^-2)-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico unido a un carbohidrato por un enlace éster.
[0113] SO1861 es diferente de la "estructura ideal" mostrada en el Esquema I, Estructura A, solo en que tiene un solo residuo acetilo en la quinovosa y una xilosa adicional. La "estructura ideal" de una saponina para potenciar el escape endosomal de una molécula efectora o porción efectora, tal como un oligonucleótido antisentido tal como un BNA, es una saponina que tiene preferiblemente la Estructura A del Esquema I, y las saponinas que muestran la actividad potenciadora del escape endosomal tienen una o más de las características estructurales mostradas en la Estructura A del Esquema I. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, los inventores creen que la Estructura A del Esquema I representa una "saponina ideal" (y no una saponina que solo cumple los requisitos mínimos) para la actividad potenciadora del escape endosomal, lo que significa que no todas las estructuras (grupos químicos) pueden o deben estar presentes en cada saponina con al menos suficiente actividad potenciadora del escape endosomal para favorecer la acumulación de la porción efectora en el citosol, y lo que significa que algunas saponinas pueden tener otros elementos de estructura tales como cadenas de acilo, y/o para otras saponinas que muestran actividad potenciadora del escape endosomal, los azúcares pueden ser diferentes de los azúcares presentados en el Esquema I. Por ejemplo, la saponina QS-21 y algunas de las saponinas de la fracción soluble en agua de Quillaja saponaria (saponinas de Quillaja; Quil-A) difieren en la modificación de hidratos de carbono en C-28 cuando se tiene en cuenta la estructura ideal de la Estructura A del Esquema I: presencia de una cadena de acilo en QS-21, por ejemplo. En la fracción soluble en agua de Quillaja saponaria, las saponinas tales como QS-7, QS1862, son similares a la Estructura A ideal, y son similares a SO1861.
[0114] Una forma de realización es la porción efectora de la invención, que comprende la porción conectora trifuncional oligomérica como la estructura central de la estructura base, de acuerdo con el Esquema II:
donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura base de porción conectora trifuncional a través de una porción conectora de hidrazona lábil y escindible (sensible a ácidos) y/o a través de un enlace que comprende maleimida, mientras que la unión de la estructura base a la porción efectora, tal como un oligonucleótido, se establece a través de una porción conectora de hidrazona lábil y escindible (sensible a ácidos) y/o a través de un enlace que comprende maleimida con cisteínas en el sitio de unión, formando con ello la Estructura B:
tal como 1, 2, 3 o 4 cisteínas, de modo que 1-4 estructuras base están unidas covalentemente a una única porción efectora.
TABLA A2- ADC que se investigaron previamente en el entorno clínico humano y posteriormente se retiraron de l inv i in líni iinl
TABLA A3 - ADC que alcanzaron el desarrollo clínico de fase III
Nombre del Indicación Etapa de Última Razón de la suspensión
Tabla A5: RIP de ori en ve etal * ; ; ; ; ; ; ; ;;; [0115] Como se ha dicho anteriormente, la al menos una saponina que está comprendida por la porción efectora según la invención aumenta la eficacia de al menos las porciones efectoras actuales y nuevas como se define en esta invención. Los efectos secundarios potenciales disminuirán debido a la disminución de la dosis de la porción efectora comprendida por el conjugado formado con la saponina, sin disminuir la eficacia. Por lo tanto, la invención proporciona una porción efectora según la invención para su uso en medicina o para su uso como un medicamento. Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a una porción efectora de la invención, para su uso como un medicamento. También se proporciona el uso de una porción efectora según la invención para fabricar un medicamento. Especialmente los medicamentos contra el cáncer, y en particular los medicamentos quimioterapéuticos clásicos, son notorios por sus efectos secundarios. Debido a la sincronización en el tiempo y el lugar tanto de la carga útil comprendida por la porción efectora como de la saponina comprendida por la porción efectora, puesto que la carga útil y la saponina están unidas covalentemente, una composición terapéutica según la invención es especialmente valiosa para su uso como medicamento, en particular para su uso en un método de tratamiento del cáncer. La invención proporciona así una composición terapéutica que comprende una porción efectora según la invención para su uso en un método para tratar el cáncer. La invención también proporciona una composición terapéutica que comprende una porción efectora según la invención para su uso en un método para tratar trastornos adquiridos o hereditarios, en particular trastornos monogénicos. La composición terapéutica comprende así la porción efectora, por ejemplo, una carga útil tal como un oligonucleótido antisentido. Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a una composición terapéutica que comprende una porción efectora según la invención, en donde la carga útil comprende una saponina unida de manera covalente, para su uso en un método para el tratamiento de un cáncer o una enfermedad autoinmunitaria. ;[0116] La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes de la presente invención de ninguna manera. ;EJEMPLOS;Ejemplo 1;Materiales y métodos;[0117] Se usaron los siguientes productos químicos adquiridos: metanol (MeOH, LiChrosolv, Merck), hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH, 95 %, TCI Chemicals), ácido trifluoroacético (TFA, 99,8 %, Carl Roth), 2-mercaptoetanol (98 %, Sigma-Aldrich), poli(amidoamina) (dendrímero PAMAM, núcleo de etilendiamina, solución de generación 5.0, Sigma-Aldrich), ácido cianina 3 carboxílico (Cy3-COOH, 95 %, Lumiprobe), hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio, N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]piridin-1-ilmetilen]-N-metilmetanaminio (HATU, 97 %, Sigma-Aldrich), fracción V de albúmina de suero bovino (BSA, Carl Roth), dimetilsulfóxido (DMSO, 99 %, Carl Roth), clorhidrato de 2-linotiolano (98 %, Sigma-Aldrich), rodamina b (RhodB, 95 %, Merck), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS, Gibco), ácido clorhídrico (HCl, 37 %, Merck), NHS-PEG<13>- DBCO (Click Chemistry Tools), Alexa Fluor™ 488 5-TFP (Thermo-Fischer), azido-PEG3-SS-NHS (Conju-Probe), cianoborohidruro de sodio (NaCNBH<3>95 %, Sigma-Aldrich), persulfato de amonio (APS, 98 %, Sigma-Aldrich), N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TMEDA, 99 %, Sigma-Aldrich), péptido personalizado SESDDAMFCDAMDESDSK (95 %, PeptideSynthetics), azido-dPEG<12>- NHS (95 %, Quanta Biodesign), PFd-G4-Azida-NH-BOC Dendrón (dendrón G4, 95 %, Polymer Factory), Cianina5-DBCO (Cy5-DBCO, 95 %, Lumiprobe), Cloroformo (CHCh 99,5 %, Sigma),filtros centrífugos de 0,5 ml Amicon Ultra (mWc O de 3 kDa, Sigma), mPEG-SCM (mPEG<2>k-NHS, 95,6 %, Creative PEG Works), filtros centrífugos de 15 ml Amicon Ultra(10 kDa MWCO, Sigma). ;MALDI-TOF-MS;[0118] Se registraron espectros MALDI-TOF en un espectrómetro de masas MALDI-Mass Spectrometer (Bruker Ultrafex III). Por lo general, la muestra disuelta en agua MilliQ en un rango nanomolar a micromolar se depositó en la diana (MTP 384 placa de acero pulido TF, Bruker Daltons) usando super-DHB (99 %, Fluka) o ácido sinapínico (SA, 99 %, Sigma-Aldrich) como matriz disuelta en acetonitrilo (con análisis por MADLI-TOF-MS, Sigma)/TFA al 0,1 % (7:3 v/v) mediante el método de gotas secas. PepMix (estándar de calibración de péptidos, Bruker Daltons) o ProteMass (estándar de calibración de proteínas, Sigma-Aldrich) sirvieron como estándares de calibración. El modo RP se refiere al modo reflector positivo. El modo RN se refiere al modo reflector negativo. El modo LP se refiere al modo lineal positivo. ;H-RMN;[0119] El análisis de<1>H RMN se realizó usando un espectrómetro de RMN Bruker de 400 MHz. La preparación de la muestra, en la que se habían disuelto 2 mg de muestra en 0,8 ml de metanol-Ü<4>(99 %, Deutero), se realizó 24 h antes de la medición. ;Cromatografía de exclusión por tamaño;[0120] La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizó con Sephadex G 25 Superfine de GE Healthcare y en columnas PD10 preempaquetadas (GE Healthcare, Sephadex G 25 M). El material se activó mediante hinchamiento en el eluyente respectivo antes de realizar la cromatografía. ;Diálisis;[0121] Se utilizaron membranas de celulosa regenerada: MWCO = 1 y 2 kDa (Spectra/Por) y MWCO = 12-14 kDa (Cari Roth) para realizar la diálisis. Normalmente, la diálisis se realizó durante 24 h con 1 L de disolvente, que se cambió después de las primeras<6>h del proceso. ;Síntesis de SO1861-EMCH;[0122] Se colocaron SO1861 de Saponaria officinalis L (59 mg, 31,7 pMol) y EMCH (301 mg,<888>pMol) en un matraz redondo con agitador y se disolvieron en 13 ml de metanol. Se añadió TFA (400 pl, cat.) a la solución y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un agitador magnético RCT B (IKA Labortechnik). Después de agitación durante 3 h, la mezcla se diluyó con agua MilliQ o PBS y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ o PBS utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, la solución se liofilizó para obtener un polvo blanco. Rendimiento 62,4 mg (95 %). Las alícuotas secas se utilizaron adicionalmente para la caracterización mediante<1>H-RMN y MALDI-TOF-MS. ;[0123]<1>H-RMN (400 MHz, metanol-Ü<4>(Figura 3A, SO1861):5= 0,50-5,50 (m, triterpenoide de saponina y protones de la cadena principal del azúcar), 9,43 (<1>H, s, protón aldehido de la saponina, Ha). ;[0124]<1>H-RMN (400 MHz, m e ta n o ^ ) (Figura 3 B. SO1861-EMCH, tratamiento con PBS):5= 0,50-5,50 (m, triterpenoide de saponina y protones de la cadena principal del azúcar), 6,79 (2 H, s, protones de maleimida, Hc), 7,62-7,68 (1 H, m, protón de hidrazona, Hb). ;[0125] MALDI-TOF-MS (modo RP) (Figura 4 A): m/z 2124 Da ([M K]+, saponina-EMCH),m/z2109 Da ([M K]+, SO1861-EMCH),m/z2094 Da ([M Na]+, SO1861-EMCH). ;[0126] MALDI-TOF-MS (modo RN) (Figura 5C): m/z2275 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2244 Da ([M-<h>]-, conjugado de saponina-EMCH), 2222 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2178 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2144 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2122 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2092 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2070 Da ([M-H]-, SO1861-EMCH), 2038 Da ([M-H]-, SO1832-EMCH), 1936 Da ([M-H]', SO1730-EMCH), 1861 Da ([M-H]', SO1861). ;Síntesis de BSA-SO1861;[0127] Se añadió 2-iminotiolano (231 pg, 1,1 pMol) disuelto en 47 pL de PBS a una solución de BSA-RhodB (10 mg, 0,15 pMol) en 200 pL de PBS y la mezcla se agitó durante 40 min a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 40 min, la mezcla de reacción se pasó inmediatamente a través de una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml) y se añadió SO1861-EMCH (1 mg, 0,5 pMol) disuelto en 100 pL de PBS a la fracción de BSA-SH recogida. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, el BSA-SO1861 se concentró mediante filtración centrífuga a 4000 r.p.m. (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado. ;[0128] MALDI-TOF-MS (Figura 2 A) (modo LP):m/z74.2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 4 SO1861 unidas), 72,2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 3 SO1861 unidas), 70,2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 2 SO1861 unidas), 37,0 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 4 SO1861 unidas), 35,9 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 3 SO1861 unidas), 34,7 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 2 SO1861 unidas). ;Resultados;[0129] Se obtuvo una primera prueba de concepto para la conjugación de SO1861-EMCH a una proteína (ejemplo de un efector proteico potencial) mediante el uso de la amina de albúmina de suero bovino (BSA). Después de la conjugación, la espectrometría de masas obtuvo los picos correspondientes de BSA-SO1861 am/z70, ~72 y ~74 kDa (Figura 2A). En comparación con la masa detectada de BSA conm/z<66>kDa (Figura 2B), las masas obtenidas de BSA-SO1861 corresponden a una mezcla de conjugados BSA-SO1861 que consisten en 2, 3 y 4 moléculas de SO1861 por BSA. Esto muestra que las moléculas de SO1861 pueden conjugarse de manera eficaz con efectores potenciales de proteínas. ;Ejemplo 2;Materiales y métodos;Síntesis de dendrón(-L-SO1861)4 (Figura 6);Intermedio 1: ;(((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo;[0130] Se disolvieron ácido<6>-azidohexanoico (0,943 g, 6,00 mmol), EDCI.HCl (1,21 g, 6,30 mmol) y Oxyma Pure (0,938 g, 6,60 mmol) en DMF (10,0 ml) y la mezcla se agitó durante 5 min. A continuación, se añadió una solución de (azanodiilbis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo (1,82 g, 6,00 mmol) en DMF (5,00 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 5 horas, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (50 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (50 ml), una solución saturada de bicarbonato de sodio (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con Na<2>SO<4>, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografíaflash(gradiente de acetato de etilo-heptano, 10:90 aumentando hasta 100:0) para dar el compuesto del título (2,67 g, 100 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 98 %. ;LRMS (m/z): 287/343/465 [M-155/M-99/M 23]1+ ;T.r. LC-MS (min): 2,022A ;Intermedio 2: ;Dihidrocloruro de N,N-bis(2-aminoetil)-6-azidohexanamida;[0131] Se añadió HCl en isopropanol (5-6 N, 20,0 ml, 110 mmol) a (((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo (<2 , 66>g,<6 ,00>mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el producto crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo (1,49 g, 79 %) como un sólido blanco. ;LRMS (m/z): 243 [M 1]1+ ;Intermedio 3: ;((5S,5'S)-((((6-azidohexanoM)azanodiM)bis(etano-2,1-diN))bis(azanodiN))bis(6-oxohexano-6,1,5-triil))tetracarbamato de tetra-tert-butilo;[0132] A una solución de diclorhidrato de N,N-bis (2-aminoetil)-6-azidohexanamida (1,19 g, 3,76 mmol) en DMF (30,0 ml) y DIPEA (2,62 ml, 15,1 mmol) se le añadió Boc-Lys(Boc)-ONp (3,69 g, 7,90 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (100 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (100 ml) y una solución saturada de bicarbonato de sodio (5 x 100 ml), se secó con Na<2>SO<4>, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografíaflash(DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100:0 aumentando hasta 0:100) para dar el producto del título (3,07 g, 91 %) como un sólido ligeramente amarillento. Pureza basada en LC-MS 94 %. ;LRMS (m/z): 800/900/922 [M-99/M 1/M 23]1+ ;T.r. LC-MS (min): 2.172A ;Intermedio 4 ;3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo;[0133] 4-Se disolvieron trifluoroacetato de nitrofenilo (5,17 g, 22,0 mmol) y ácido 3-(acetiltio)propiónico (2,96 g, 20,0 mmol) en DCM (50,0 ml). A continuación, se añadió DIPEA (6,97 ml, 40,0 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (50 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (50 ml), una solución saturada de bicarbonato de sodio (5 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con Na<2>SO<4>, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografíaflash(DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100:0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (4,90 g, 91 %) como un sólido ligeramente amarillento. Pureza basada en LC-MS 99 %. ;LRMS (m/z): 292 [M 23]1+ ;T.r. LC-MS (min): 1,942A ;Intermedio 5: ;tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida;[0134] Se disolvió ((5S,5'S)-((((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))bis(azanodiil))bis(6-oxohexano-6,1,5-triil))tetracarbamato de tetra-tert-butilo (1,80 g, 2,00 mmol) en HCl en isopropanol (5-6 N, 50,0 ml, 275 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo como un sólido blanco. ;LRMS (m/z): 250 [M 2]2+, 500 [M 1]1+. ;Intermedio<6>: ;(2S)-2,6-bis[3-(acetMsulfaml)propanamido]-N-[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]hexanamida;[0135] A una solución de tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida (1,29 g, 2,00 mmol) en DMF (30 ml) y DIPEA (3,48 ml, 20,0 mmol) se le añadió 3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo (2,26 g, 8,40 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante el fin de semana . La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en DCM/metanol (95: 5, v/v, 100 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (100 ml), una solución de hidróxido de sodio 1 N (3 x 100 ml) y salmuera (100 ml), se secó con Na<2>SO<4>, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografíaflash(DCM-metanol/DCM (1/9, v/v)(gradiente de 100:0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (1,33 g, 65 %) como un sólido blanco. En la LC-MS se encontró una impureza (15 %) con valores m/z correspondientes al producto con un grupo tioacetato desprotegido. La impureza se formó durante o después del tratamiento. Pureza basada en LC-MS 85 %. ;LRMS (m/z): 510 [M 2]2+, 1019/1041 [M 1/M 23]1+ ;T.r. LC-MS (min): 1,862B ;[01361 Intermedio 7: ;Formiato de N,N'-((9S,19S)-14-(6-aminohexanoil)-1-mercapto-9-(3-mercaptopropanamido)-3,10,18-trioxo-4,11,14,17-tetraazatricosano-19,23-diil) bis(3-mercaptopropanamida);[0137] Se disolvió la estructura base 2 (102 mg, 0,100 mmol) en metanol (1,00 ml). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (0,440 ml, 0,440 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (0,500 ml, 0,500 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y se coevaporó con metanol (2 x 10 ml). El residuo se disolvió en una mezcla de metanol/agua (9: 1, v/v, 1,00 ml) y la solución resultante se sometió a MP-LC preparativa<.2>Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (75,6 mg, 87 %) como un aceite pegajoso incoloro. Pureza basada en LC-MS 96 %. ;LRMS (m/z): 513 [M 2]2+, 825 [M 1]1+ ;T.r. LC-MS (min): 1,422A ;Intermedio<8>: ;Dendrón(-LSO1861)4-amina;[0138] Se disolvió formato de N,N'-((9S,19S)-14-(6-aminohexanoil)-1-mercapto-9-(3-mercaptopropanamido)-3,10,18-trioxo-4,11,14,17-tetraazatricosano-19,23-diil)bis(3-mercaptopropanamida) (2,73 mg, 3,13 pMol) en una mezcla de NH<4>HCO<3>20 mM con TCEP/acetonitrilo 0,5 mM (3: 1, v/v, 3,00 ml). A continuación, se añadió SO1861-EMCH (29,2 mg, 0,014 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 1,5 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.3B Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (12,3 mg, 43 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 97 %. ;LRMS (m/z): 1517 [M-<6>]6-, 1821 [M-5]5-2276 [M-4]<4>;T.r. LC-MS (min): 4,395A ;Intermedio 9: ;Dendrón(-L-SO1861)4-azida;[0139] Se disolvió dendrón(SO1861)<4>-amina (6,81 mg, 0,748 pMol) y 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (2,90 mg, 7,48 pMol) en DMF (1,00 ml ). A continuación, se añadió DIPEA (1,302 |_il, 7,48 pMol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa<.30>Las fracciones correspondientes al producto se agruparon inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (5,86 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 90 %. ;LRMS (m/z): 2344 [M-4<]4>;T.r. LC-MS (min): 4,785B ;Intermedio 10: ;Dendrón(-LSO1861)4-maleimida1;[0140] Se disolvió dendrón(SO1861)<4>-amina (8,12 mg, 0,891 pMol) y 2,5-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de dioxopirrolidin-1-ilo (3,94 mg, 8,91 pMol) en DMF (1,00 ml). A continuación, se añadió DIPEA (1,55 pl, 8,91 pMol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.<30>Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (6,76 mg, 80 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS<66>%. ;LRMS (m/z): 2358 [M-4]4-T.r. LC-MS (min): 2,136C ;Intermedio 11: ;Dendrón(-LSO1861 )4-maleimida2;[0141] Se disolvió la estructura base 2 (5,10 mg, 5,00 pMol) en metanol (100 pl). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (22,0 pl, 22,0 pMol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (25,0 pL, 25,0 pMol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y se coevaporó con metanol (2 x 5 ml). El residuo resultante se disolvió en una mezcla de NH<4>HCO<3>20 mM con TCEP/acetonitrilo 0,5 mM (3:1, v/v, 3,242 ml). De esta solución, directamente, se añadieron 1000 pl a SO1861-EMCH (14,4 mg, 6,94 pMol, 4,5 equiv. En comparación con la estructura base) y la mezcla se agitó durante<1>min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se liofilizó durante la noche. Al residuo resultante se añadieron 3-(2-(2-(3-(2,5-dioxo-2h-pirrol-1(5h)-il)propanamido)etoxi)etoxi)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (5,84 mg, 0,014 mmol) y DMF (1,00 ml). A continuación, se añadió DIPeA (2,39 pl, 0,014 mmol) y la suspensión se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.3C Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (10,9 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 80 %. ;LRMS (m/z): 2354 [M-4]<4>;T.r. LC-MS (min): 4,165B ;Síntesis de dendrón(-L-SO1861)8 (Figura 7);Intermedio 1: ;N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2],6-bis({[(tertbutoxi)carbonil]amino})hexanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis({[(tertbutoxi)carbonil]amino})hexanamido]pentil]carbamoil}-5-{[(tert-butoxi)carbonil]amino}pentil]carbamato de tert-butilo;[0142] Se disolvió tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida (964 mg, 1,50 mmol ) en DMF (25,0 ml) y trietilamina (2,08 ml, 15,0 mmol). A continuación, se añadió Boc-Lys(Boc)-ONp (3,36 g, 7,18 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografíaflash(DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100:0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (2,71 g, 100 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 97 %. ;LRMS (m/z): 807 [M-198]2+ ;T.r. LC-MS (min): 2,352B ;Intermedio 2: ;Octahidrocloruro de (2S, 2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-diamino-10-(6-azidohexanoil)-15-((S)-2,6-diaminohexanamido)-6,14,21-trioxo-7,10,13,20-tetraazahexacosano-1,5-diil)bis(2,6-diaminohexanamida)[0143] El intermedio 1 (2,71 g, 1,50 mmol) se disolvió en HCl en isopropanol (5-6 N, 25,0 ml, 138 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo como un sólido blanco. ;LRMS (m/z): 203/254 [M-200/M+4]4+, 338 [M+3]3+, 507 [M+2]2+, 1012 [M+1]1+ ;Intermedio 3: ;(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]-N-[(1S)-1-{[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]hexanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]hexanamido]pentil]hexanamida;[0144] Se añadió DMF (20,0 ml), trietilamina (320 jl, 2,30 mmol) y 3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo (595 mg,<2 , 21>mmol) a octahidrocloruro de (2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-diamino-10-(6-azidohexanoil)-15-((S)-2,6-diaminohexanamido)-6,14,21-trioxo-7,10,13,20-tetraazahexacosan-1,5-diil)bis(2,6-diaminohexanamida) (300 mg, 0,230 mmol). La suspensión resultante se sonicó a 60 °C durante 30 min y se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó realizando primero cromatografíaflash(DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100: 0 aumentando a 0:100), seguido de MP-LC preparativa<2>para dar el producto del título (70 mg, 15 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 100 %. ;LRMS (m/z): 685 [M 3]3+ ;T.r. LC-MS (min): 1,912A ;Intermedio 4: ;Formiato de (2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-amino-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido))hexanamido]hexanamidoetil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido)hexanamido]pentil]-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido)hexanamida;[0145] La estructura base 4 (10,0 mg, 4,87 jMol) se disolvió en metanol (200 jl). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (42,9 jl, 0,043 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (24,4 jl, 0,024 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, la mezcla de reacción se diluyó con agua (1 ml) y se sometió directamente a MP-LC preparativa<.2>Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (4,02 mg, 48 %) como un sólido blanco esponjoso. ;LRMS (m/z): 564 [M 3]3+, 846 [M 2]2+ T.r. ;LC-MS (min): 1,542C ;Intermedio 5: ;Dendrón(-L-SO1861)8-amina;[0146] La estructura base 5 (0,52 mg, 0,299 jMol) y SO1861-EMCH (29,2 mg, 0,014 mmol) se disolvieron en una mezcla de NH<4>HCO<3>20 mM con TCEP/acetonitrilo 0,5 mM (3: 1, v/v, 1,00 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió TCEP (0,30 mg, 1,05 |jMol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min. A continuación, la mezcla se sometió directamente a LC-MS preparativa.<38>Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (2,17 mg, 40 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 97 %. ;LRMS (m/z): 2282 [M-<8>]8-, 2607 [M-7]7-T.r. LC-MS (min): 4,415A ;Conjugación de SO1861-oligonucleótido de BNA;[0147] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (1,10 mg, 0,187 jMol) en NH<4>HCO<3>20 mM con TCEP 1,0 mM (500 jl) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (14000 xg durante 30 min). La solución del residuo se diluyó con NH<4>HCO<3>20 mM con TCEP 1,0 mM (500 |_il) y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución de residuo se diluyó con NH<4>HCO<3>20 mM/ acetonitrilo (3:1, v/v, 1,00 ml) y la mezcla resultante se añadió a SO1861-EMCH (3,54 mg, 0,375 pMol). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.4* Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (1,25 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 1561 [M-5]<5>Í951 [M-4]<4>
T.r. LC-MS (min): 2,466B
Conjugación de dendrón(SO1861)4-oligonudeótido de BNA
[0148] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (1,1 mg, 0,187 pMol) en NH<4>HCO<3>20 mM con TCEP 1,0 mM (500 |_il) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (14000 xg durante 30 min). La solución del residuo se diluyó con NH<4>HCO<3>20 mM con TCEP 1,0 mM (500 pl) y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH<4>HCO<3>20 mM/ acetonitrilo (3: 1, v/v, 1,0 ml) y la mezcla resultante se añadió a dendrón(SO1861)4-maleimida1 (3,54 mg, 0,375 pMol). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.4A Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (1,25 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 94 %
LRMS (m/z): 1896 [M-8]8-, 2167 [M-7]7-T.r. LC-MS (min): 3,776B
Cultivo celular
[0149] Se sembraron células en DMEM (PAN-Biotech GmbH) complementado con suero bovino fetal al 10 % (PAN-Biotech GmbH) y penicilina/estreptomicina al 1 % (PAN-Biotech GmbH), en una placa de 96 pocillos a 5 000 c/p en 100 pl/pocillo y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO<2>. Al día siguiente se prepararon muestras en DMEM y se trataron las células.
Silenciamiento génico
[0150] El aislamiento del ARN y el análisis de Qpcr se realizaron de acuerdo con procedimientos y protocolos estándar. Cebadores de HSP27: F: R:
Oligonucleótido de HSP27BNA
[0151] Se adquirieron oligonucleótidos de HSP27BNA(-tiol) (secuencia 5'-GGCacagccagtgGCG-3') (Zhang et al., 2011) en Bio-synthesis Inc. (Lewisville, Texas)
Resultados
[0152] BNAoligo, oligonucleótido de BNA antisentido que se dirige al transcrito de ARNm de la diana cancerosa (regulado positivamente en células cancerosas), proteína de choque térmico 27 (HSP27BNA), se conjugó con SO1861-EMCH (HSP27BNA-L-SO1861) o dendrón (-L-SO1861)<4>(HSP27BNA-dendrón(-L-SO1<8 6 1>)<4>) y se coadministró a una línea celular de cáncer A431, según la invención. Como lectura, se determinó el silenciamiento génico del ARNm de HSP27 en células A431. Esto reveló que el tratamiento con HSP27BNA-L-SO1861 dio como resultado una mejora de la actividad de silenciamiento génico de HSP27 en comparación con HSP27BNA solo, mientras que la actividad de HSP27BNA-dendrón(-L-SO1861)<4>(4 moléculas de SO1861/BNA) es incluso más fuerte (3 veces) en comparación con la actividad de silenciamiento génico de HSP27BNA solo (Figura 1). Esto muestra que la conjugación de 1 o más moléculas de SO1861 mejora la actividad de silenciamiento génico del oligonucleótido terapéutico de BNA debido a la potenciación del escape endosomal mediado por SO1861 y la administración citoplásmica del BNA antisentido.
Ejemplo 3
Materiales
[0153] Se usaron los siguientes productos químicos adquiridos: metanol (MeOH, LiChrosolv, Merck), hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH, 95 %, TCI Chemicals), ácido trifluoroacético (TFA, 99,8 %, Carl Roth), 2-mercaptoetanol (98 %, Sigma-Aldrich), poli(amidoamina) (dendrímero PAMAM, núcleo de etilendiamina, generación de solución 5,0, Sigma-Aldrich), cianina 3 ácido carboxílico (Cy3-COOH, 95 %, Lumiprobe), hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio, N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]piridin-1-ilmetilen]-N-metilmetanaminio (HATU, 97 %, Sigma-Aldrich), fracción V de albúmina de suero bovino (BSA, Carl Roth), dimetilsulfóxido (DMSO, 99 %, Carl Roth), clorhidrato de 2-linotiolano (98 %, Sigma-Aldrich), rodamina b (RhodB, 95 %, Merck), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS, Gibco), ácido clorhídrico (HCl, 37 %, Merck), NHS-PEG<13>- DBCO (Click Chemistry Tools), Alexa Fluor™ 488 5-TFP (Thermo-Fischer), azido-PEG3-SS-NHS (Conju-Probe), cianoborohidruro de sodio (NaCNBH<3>, 95 %, Sigma-Aldrich), persulfato de amonio (APS, 98 %, Sigma-Aldrich), N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TMEDA, 99 %, Sigma-Aldrich), péptido personalizado SESDDAMFCDAMDESDSK (95 %, PeptideSynthetics), azido-dPEG<12>- NHS (95 %, Quanta Biodesign), PFd-G4-Azida-NH-BOC dendrón (dendrón G4, 95 %, Polymer Factory), Cianina5-DBCO (Cy5-DBCO, 95 %, Lumiprobe), Cloroformo (CHCl<3>, 99,5 %, Sigma), filtros centrífugos Amicon Ultra de 0,5 ml (mWCo de 3 kDa, Sigma), mPEG-SCM (mPEG<2>k-NHS, 95,6 %, Creative PEG Works), filtros centrífugos Amicon Ultra de 15 ml (10 kDa MWCO, Sigma).
Métodos
MALDI-TOF-MS
[0154] Se registraron espectros MALDI-TOF en un espectrómetro de masas MALDI (Bruker Ultrafex III). Por lo general, la muestra disuelta en agua MilliQ en un rango nanomolar a micromolar se depositó en la diana (MTP 384 placa de acero pulido TF, Bruker Daltons) usando super-DHB (99 %, Fluka) o ácido sinapínico (SA, 99 %, Sigma-Aldrich) como matriz disuelta en acetonitrilo (evaluado por MADLI-TOF-MS, Sigma)/TFA al 0,1 % (7:3 v/v) mediante el método de gotas secas. PepMix (estándar de calibración de péptidos, Bruker Daltons) o ProteMass (estándar de calibración de proteínas, Sigma-Aldrich) sirvieron como estándares de calibración. El modo RP se refiere al modo reflector positivo. El modo RN se refiere al modo reflector negativo. El modo LP se refiere al modo lineal positivo.
H-RMN
[0155] El análisis de 1H-RMN se realizó usando un espectrómetro de RMN Bruker de 400 MHz. La preparación de la muestra, en la que se habían disuelto 2 mg de muestra en 0,8 ml de metanol-Ü<4>(99 %, Deutero), se realizó 24 h antes de la medición.
UV-Vis
[0156] Las mediciones de UV-Vis se realizaron en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 en el rango espectral de 200-750 nM.
Cromatografía de exclusión por tamaño
[0157] La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizó con Sephadex G 25 Superfine de GE Healthcare y en columnas PD10 preempaquetadas (GE Healthcare, Sephadex G 25 M). El material se activó mediante hinchamiento en el eluyente respectivo antes de realizar la cromatografía.
Diálisis
[0158] Se utilizaron membranas de celulosa regenerada: MWCO = 1 y 2 kDa (Spectra/Por) y MWCO = 12-14 kDa (Carl Roth) para realizar la diálisis. Normalmente, la diálisis se realizó durante 24 h con 1 L de disolvente, que se cambió después de las primeras<6>h del proceso.
Liofilización
[0159] La liofilización se realizó en un Alpha 1-2 LD plus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH). Normalmente, las muestras se congelaron con nitrógeno líquido y se colocaron en el liofilizador a alto vacío.Síntesis de SO1861-EMCH
[0160] Se colocaron SO1861 de Saponaria officinalis L (59 mg, 31,7 pMol) y EMCH (301 mg,<888>pMol) en un matraz redondo con agitador y se disolvieron en 13 ml de metanol. Se añadió TFA (400 |_il, cat.) a la solución y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un agitador magnético RCT B (IKA Labortechnik). Después de agitación durante 3 h, la mezcla se diluyó con agua MilliQ o PBS y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ o PBS utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, la solución se liofilizó para obtener un polvo blanco. Rendimiento 62,4 mg (95 %). Las alícuotas secas se utilizaron adicionalmente para la caracterización mediante 1H-RMN y MALDI-TOF-MS.
[0161]<1>H-RMN (400 MHz, metanol-D<4>) (Figura 3 A, SO1861):5 =0,50-5,50 (m, triterpenoide de saponina y protones del esqueleto de azúcar), 9,43 (1H, s, protón de aldehído de saponina, Ha).
[0162]<1>H-RMN (400 MHz, metanol-D^ (Figura 3B. SO1861-EMCH, tratratamiento del crudo de reacción con PBS):5= 0,50-5,50 (m, triterpenoide de saponina y protones del esqueleto de azúcar), 6,79 (2 H, s, protones de maleimida, HC), 7,62-7,68 (1 H, m, protón de hidrazona, HB).
MALDI-TOF-MS (modo RP) (Figura 4 A):miz2124 Da ([M K]+, saponina-EMCH), m/z 2109 Da ([M K] , SO1861-EMCH),miz2094 Da ([M Na]+, SO1861-EMCH)
[0163] MALDI-TOF-MS (modo RN) (Figura 5C): m/z2275 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2244 Da ([M-h ]-, conjugado de saponina-EMCH), 2222 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2178 Da ([M-H]-, conjugado saponina-EMCH), 2144 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2122 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2092 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2070 Da ([M-H]-, SO1861-EMCH), 2038 Da ([M-H]-, SO1832-EMCH), 1936 Da ([M-H]', SO1730-EMCH), 1861 Da ([M-H]', SO1861).
Cy3-PAMAM
[0164] Se colocaron pL 720 de PAMAM disuelta en metanol (30 mg, 1,04 pMoL) en un matraz redondo de 250 ml y se extrajo el metanol mediante un evaporador rotatorio (20 mbar, 60 °C). La PAMAM restante se disolvió en 9 ml de DMSO. Se añadió HATU (7,6 mg, 20 pMol) disuelto en 0,5 ml de D<m>SO a una solución de Cy3-COOH (0,6 mg, 1,2 pMol) en DMSO y la mezcla se agitó durante 1 h a 800 r.p.m. a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 1 h, se añadió la solución de HATU-Cy3 a la solución de PAMAM en agitación y la mezcla de reacción se agitó durante 12 h a temperatura ambiente. Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por<6>) con un MWCO de 2 kDa. Después de la diálisis, el volumen de la solución de conjugado se redujo mediante un evaporador rotatorio (20 mbar, 60 °C) y la solución de conjugado concentrada se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml). La primera fracción se recogió y liofilizó para obtener el conjugado rosa viscoso PAMAM-Cy3. La formación del conjugado PAMAM-Cy3 se confirmó mediante cromatografía en capa fina (metanol/agua, v/v<1>:<1>) y la aparición de una banda más rápida en una columna superfina Sephadex G 25. Rendimiento 21,3 mg (63 %). La relación molar de colorante por PAMAM determinada por espectrofotometría UV-Vis fue de 0,43.
[0165] MALDI-TOF-MS (Figura<8>A) (modo LP):miz28,0 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM).
Síntesis de Cy3-PAMAM-SO1861
[0166] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)<5>. Se añadió 2-iminotiolano<(1>mg, 6,7 pMol) disuelto en 250 pL de agua MilliQ a una solución de PAMAM-Cy3 (0,5 mg, 17 nMol) en 125 pL de agua MilliQ y la mezcla se agitó durante 40 min a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 40 min, la mezcla de reacción se pasó inmediatamente por una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml) y se añadió SO1861-EMCH (176 pg, 85 nMol) disuelto en 40 pL de agua MilliQ a la fracción de Cy3-PAMAM-SH recogida. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución Cy3-PAMAM-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m. (15 °C) a través de filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,5 mg (75 %).
[0167] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en las Figuras<8>B-D y la Figura 9. MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-(SO1861)6 (Figura<8>B) (modo LP):miz38,4 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-SO1861), 17,9 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-SO1861).
[0168] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)<5>, Cy3-PAMAM-(SO1861)13, Cy3-PAMAM-(SO1861)51 y Cy3-PAMAM-(SO1861)27, se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes de los materiales de partida 2-iminotiolano y SO1861-EMCH. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 1.
Tabla 1. Parámetro de reaccón ara la síntesis de C 3-PAMAM-SO1861.
Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861
[0169] Cy3-PAMAM (0,5 mg, 18 nMol), SO1861 (2,3 mg, 1,24 pMol) y HATU (64,6 mg, 170 pMol) se disolvieron por separado en 200 pL de DMSO. Las soluciones de SO1861 y HATU se mezclaron y agitaron durante 20 min a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 20 min, se añadió solución Cy3-PAMAM a la solución SO1861-HATU en agitación y se dejó agitar la mezcla de reacción durante 12 h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4 000 r.p.m. (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado de Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17 se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,77 mg (69 %).
[0170] MALDI-TOF-MS (Figura 10) (modo LP):miz 62.3kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861), 35,7 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861).
Tiolación de PAMAM
[0171] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para la relación más alta de PAMAM a 2-iminotiolano. A una solución de PAMAM (333 pg, 12,8 nMol) disuelta en 30 pL de metanol se añadió 2-iminotiolano (0,53 mg, 3,84 pMol) disuelto en 128 pL de agua MilliQ. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se lavó 4 veces con agua MilliQ mediante filtración centrífuga usando filtros centrífugos Amicon Ultra (MWCO de 3 kDa) a 15 °C y 13500 r.p.m. Después del lavado, la muestra se liofilizó para obtener un sólido blanco. No se determinó el rendimiento.
[0172] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en la Figura 11. MALDI-TOF-MS de PAMAM-(SH)<108>(Figura 11 C) (modo LP):miz41,5 kDa ([M H]+, PAMAM-[SH]<10>s).
[0173] La síntesis de otros conjugados de PAMAM-iminotiolano se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes del material de partida 2-iminotiolano. Para la reacción de partida de 2-iminotiolano más baja, se utilizó Cy3-PAMAM.
[0174] Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 2.
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PEGilación de PAMAM
[0175] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para la relación más baja de PAMAM a mPEG<2>k. A una solución de PAMAM (333 pg, 12,8 nMol) disuelta en 10 pL de DMSO se añadió mPEG<2>k-NHS (0,268 mg, 128 nMol) disuelto en 13 pL de DMSO. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MiNiQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MiNiQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por<6>) con un MWCO de 2 kDa. Después de la diálisis, el lote se concentró mediante filtración centrífuga usando filtros centrífugos Amicon Ultra de 15 ml (MWCO de 10 kDa). El lote concentrado se pasó a través de una columna de exclusión por tamaño PD10 seguido de liofilización para obtener un polvo esponjoso blanco. No se determinó el rendimiento.
[0176] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en la Figura 12. MALDI-TOF-MS de PAMAM-(mPEG<2>k<)3>(Figura 12 C) (modo LP):m/z33,46 kDa ([M H]+, PAMAM-[mPEG<2>k]<3>).
[0177 La síntesis de otros conjugados de PAMAM-mPEG<2>k se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes del material de partida mPEG<2>k-NHS. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 3.
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Síntesis de Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO
[0178] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10. Cy3-PAMAM-(SO<18 6 1>)27 (0,41 mg, 4,71 nMol) se liofilizó y se disolvió en<100>pL de DMSO. Se añadió éster de DBCO-PEG<13>-NHS (0,197 mg, 188 nMol) disuelto en DMSO a la solución de Cy3-PAMAM-SO1861 y la mezcla se agitó a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 3 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m. (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,1 mg (22 %).
[0179] MALDI-TOF-MS (Figura 13 D) (modo LP):m/z92.5 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO), 53,0 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO).
[0180] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)5-(DBCO)sB y Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10 se realizó mediante la metodología descrita anteriormente. Los respectivos equivalentes del material de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 4.
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Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO
[0181] Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17 (0,3 mg, 4,8 nMol) se liofilizó y se disolvió en 100 pL de DMSO. Se añadió éster de DBCO-PEG<13>-NHS (0,202 mg, 194 nMol) disuelto en DMSO a la solución Cy3-PAMAM-NC-SO1861 y la mezcla se agitó a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 3 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m. (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,1 mg (22 %). La espectrometría de masas indica la conjugación de 30 restos de DbCO por molécula de PAMAM.
[0182] MALDI-TOF-MS (Figura 13 B) (modo LP):m/z93,2 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861 -DBCO), 49,6 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO).
Expresión de EGFdiantina y diantina
[0183] Se transformó ADN plasmídico (His-diantina-EGF-pET11d o His-diantina-pETI 1d) [20] en Escherichia coli NiCo21 (DE3) químicamente competente (New England Biolabs®, Inc.) y se cultivó en 3 ml de caldo de lisogenia complementado con 50 pg/ml de ampicilina a 37 °C durante 5 h a 200 r.p.m. Estas bacterias se usaron para inocular 500 ml de caldo de lisogenia suplementado con 50 pg/ml de ampicilina para cultivarlo durante la noche a 37 °C. Posteriormente, el volumen del cultivo se aumentó hasta 2 L y las bacterias se cultivaron hasta una densidad óptica (A600) de 0,9. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Las células se cultivaron adicionalmente durante 3 horas a 37 °C y 200 r.p.m. Después de la centrifugación (5 min, 5000 g, 4 °C), los sedimentos celulares se resuspendieron en<20>ml de solución salina tamponada con fosfato (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) con Ca2+ y Mg2+, pH 7,4) y se almacenaron a -20 °C. Después de la descongelación, las proteínas se liberaron mediante un dispositivo de ultrasonido (Branson Sonifier 250, G. Heinemann). La solución se centrifugó (15800 x g, 30 min, 4 °C) y se ajustó a una concentración de imidazol de 20 mM. La construcción contenía una etiqueta de histidina N-terminal y se purificó mediante cromatografía en ácido nitrilotriacético de níquel (Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Alemania). Después de eluir con imidazol (20-250 mM), los eluatos se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (12 %). Las fracciones que contenían diantina-EGF o diantina se dializaron con 2 l de tampón de dominio de unión a quitina (tris(hidroximetil)-aminometano/HCl 20 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,1 %, pH 8,0) a 4 °C. La purificación adicional mediante cromatografía de afinidad en columna de quitina sirvió para eliminar proteínas bacterianas con actividad de unión a agarosa Ni-NTA. Después de la elución con tampón de dominio de unión a quitina, las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE (12 %). Las fracciones que contenían diantina-EGF o diantina se dializaron con 5 L de PBS a 4 °C. Las proteínas purificadas se concentraron mediante dispositivos de filtro centrífugo Amicon (10 kDa, Millipore, Eschborn, Alemania). La concentración de proteína se determinó mediante un ensayo de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, EE. UU.).
Síntesis de Diantina-EGF-Alexa488
[0184] Se colocó una solución de diantina-EGF (240 pg, 6,7 nMol) en PBS en un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa y se centrifugó tres veces a 4000 r.p.m. y 4 °C durante 30 min. Después de cada ciclo, el filtro Amicon se volvió a llenar con tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9. Después del tercer ciclo de centrifugación, el volumen se redujo a 0,5 ml mediante centrifugación. La solución de carbonato de sodio de diantina-EGF se colocó en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió Alexa Fluor ™ 4885-TFP (50 pg, 56 nMol) disuelto en 10 pl de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 80 min. Después de la agitación, la mezcla se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño Sephadex G25 M (GE Healthcare, columna PD10). El conjugado diantina-EGF-Alexa488 se almacenó en solución en tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9 en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 210 pg (85 %).
[0185] MALDI-TOF-MS (Figura 14 D) (modo LP):m/z36.8 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488),m/z33.6 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488), 18,8 kDa ([M H]2+, diantina-EGF-Alexa488), 16,6 kDa ([M H]2+, diantina-EGF-Alexa488).
Síntesis de Diantina-Alexa488
[0186] Se colocó una solución de diantina (184 pg, 6,2 nMol) en PBS en un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa y se centrifugó tres veces a 4000 r.p.m. y 4 °C durante 30 min. Después de cada ciclo, el filtro Amicon se volvió a llenar con tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9. Después del tercer ciclo de centrifugación, el volumen se redujo a 0,5 ml mediante centrifugación. La solución de carbonato sódico y diantina se colocó en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió Alexa Fluor ™ 4885-TFP (16,7 pg, 19 nMol) disuelto en 3,5 pl de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 80 min. Después de la agitación, la mezcla se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño Sephadex G25 M (GE Healthcare, columna PD 10). El conjugado de diantina-Alexa488 se almacenó en solución en tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9 en el frigorífico y se tomaron alícuotas para análisis. Rendimiento: no determinado MALDI-TOF-MS (Figura 15 D) (modo LP):m/z30,7 kDa ([M H]+, Diantina-Alexa488).
Síntesis de diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N<3>y diantina-EGF-Alexa488-PEGi<2>-Na
[0187] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N<3>. Se colocó una solución de carbonato de sodio de Diantina-EGF-Alexa488 (70 pg, 1,9 nMol) en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió azido-PEG<3>-S-S-NHS (120 pg, 272 nMol) disuelto en 9 pL de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m. y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 12 h. Después de la agitación, la mezcla de reacción se diluyó con PBS y se lavó con PBS mediante filtración centrífuga a 4000 r.p.m. y 4 °C usando un filtro Amicon Ultra 15 con un m Wc O de 3 kDa.
[0188] Rendimiento: 54 pg (70 %).
[0189] MALDI-TOF-MS (Figura 14 E) (modo LP):miz40,8 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N<3>), m/z37,5kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N<3>).
[0190] La síntesis de diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N<3>y diantina-EGF-Alexa488-PEGi<2>-N<3>se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en la porción conectara azido-PEG utilizada. La respectiva porción conectara azido-PEG, sus equivalentes de adición y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 5.
Tabla 5. Parámetros^ de reacción ara la síntesis de diantina-EGF-Alexa488-PEG-N
Diantina-Alexa488-S-S-PEG-N3
[0191] Se colocó una solución de carbonato de sodio de Diantina-Alexa488 (24,5 pg, 0,8 nMol) en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió azido-PEG<3>-S-S-NHS (34 pg, 78 nMol) disuelto en 9 pL de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m. y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 12 h. Después de la agitación, la mezcla de reacción se diluyó con PBS y se lavó con PBS mediante filtración centrífuga a 4 000 r.p.m. y 4 °C usando un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa.
[0192] Rendimiento: 10,3 pg (39 %).
[0193] MALDI-TOF-MS (Figura 15 E) (modo LP):m/z32,9 kDa ([M H]+, Diantina-Alexa488-S-S-PEG-N3).
Síntesis del conjugado Cy3-PAMAM-Saponina-Toxina
[0194] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO. Se mezcló una solución de Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO (17 pg, 0,184 nMol) en agua MilliQ con una solución de diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG3-N3 (3,6 pg, 0,089 nMol) en PBS en un tubo de reacción de 1,5 ml y la mezcla de reacción se agitó a 800 r.p.m. y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 2 h. Después de la agitación, se tomaron pequeñas alícuotas para analizarlas mediante SDS-PAGE y obtener imágenes de fluorescencia en un sistema de imágenes Molecular Imager® VersaDoc™ MP 4000 (Bio-Rad) (Figura 16).
[0195] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)5-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-(SO1861)27-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-Diantina-Alexa488 y Cy3-PAMAM-NC-(So1861)17-Diantina-EGF-Alexa488 se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en el lote de PAMAM-saponina-DBCO usado, el lote de toxina azido usada y sus equivalentes de adición. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida se destacan en la Tabla<6>.
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Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 mediante aminación reductora
[0196] Cy3-PAMAM (0,19 mg, 13 nMol) y SO1861 (0,73 mg, 0,39 pMol) se disolvieron por separado en 200 pL de tampón de acetato 0,1 M a pH 5. Las soluciones de SO1861 y Cy3-PAMAM se mezclaron y agitaron durante 20 min a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 20 min, se añadió NaCNBH<3>(5 mg, 81 pMol) a la solución de reacción con agitación y la mezcla de reacción se dejó agitar durante 12 h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m. (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado [0197] MALDI-TOF-MS (Figura 17 B, C) (modo LP):miz88,7 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861), 49,2 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861).
[0198] La síntesis de Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)30 y Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)<10>, se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en el tiempo después del cual el agente reductor NaCNBH<3>se añadió al lote de reacción. El momento de la adición de NaCNBH<3>y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 7.
Tabla 7. Parámetros de reacción de síntesis de C 3-PAMAM-NC-SO1861 mediante aminación reductora.
Acoplamiento de péptidos y SO1861-EMCH
[0199] El péptido personalizado con la secuencia SESDDAMFCDAMDESDSK (0,6 mg, 0,3 pMol) y SO1861-EMCH (0,8 mg, 0,39 pMol) se disolvieron por separado en 200 pl de PBS. Las soluciones de SO1861-EMCH y de péptidos se mezclaron y agitaron durante<12>h a 800 r.p.m. y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación, se extrajeron pequeñas alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado MALDI-TOF-MS (Figura 18 B) (modo RN):miz 4.05kDa ([M H]-, péptido-SO1861), 3,92 kDa ([M H]-, péptido-SO1730), 1,98 kDa ([M H]-, péptido), 1,86 kDa ([M H]-, SO1861).
Resultados
[0200] Teniendo en cuenta los grupos químicos disponibles para las reacciones de conjugación con la molécula SO1861, se han identificado cuatro grupos químicos: los alcoholes y dioles de los residuos de azúcar, el grupo aldehído del esqueleto triterpenoide, el ácido carboxílico de uno de los residuos de azúcar (ácido glucurónico) y el grupo alqueno del esqueleto triterpenoide, como se destaca en la Figura 19.
[0201] En vista de los pros y los contras de cada grupo químico identificado (Tabla<8>), los grupos aldehído y alcohol son los más adecuados para reacciones de conjugación reversibles, mientras que el alqueno y el ácido carboxílico (ácido glucurónico) son los grupos más adecuados para reacciones de conjugación irreversiblesiestables. El grupo aldehído dentro de la estructura de la molécula de SO1861, sin embargo, es el más adecuado para reacciones de conjugación reversibles, en comparación con los alcoholes. Por un lado, porque solo hay un aldehído presente en la estructura que permite reacciones quimioselectivas. Por otro lado, debido a que el aldehído puede realizar reacciones de conjugación reversibles con una variedad de grupos químicos tales como aminas, hidrazidas e hidroxilaminas, formando restos que se pueden escindir con ácidos como iminas, hidrazonas y oximas. Este factor permite una libertad de elección sobre el grupo químico para la reacción de conjugación reversible deseada. Por el contrario, los alcoholes son buenos candidatos para la reacción de conjugación reversible a través de la formación de acétales y cetales, pero carecen de quimioselectividad, ya que están presentes en una gran cantidad en la estructura glucosídica.
[0202] Para la formación de un enlace irreversible y estable, el ácido carboxílico es el más adecuado, ya que puede formar amidas y ésteres con las herramientas habituales utilizadas en la química de péptidos (por ejemplo, reacción con aminas mediante la formación de amidas mediadas por carbodiimidas).
T l. r f n i n l n i ni l r r i n n i n nin .
[0203] Así, para el desarrollo de una saponina potenciadora del escape endosomal (como SO1861) se ha establecido una metodología que permite la generación de saponinas no escindibles y escindibles 'listas para conjugar' (Figura 20) utilizando los grupos químicos más adecuados presentes en SO1861.
[0204] Para producir saponinas no escindibles "listas para conjugar", el grupo carboxílico de SO1861 se activa mediante un reactivo utilizado en la química de acoplamiento de péptidos para generar un éster activo (por ejemplo, hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio, HATU). El éster activo resultante de SO1861 es capaz de reaccionar con aminas formando conjugados estables unidos a amida (Figura 20 A).
[0205] Para producir saponinas escindibles "listas para conjugar", el grupo aldehído de SO1861 se hace reaccionar con una porción conectora EMCH (hidrazida del ácido £-maleimidocaproico). El grupo hidrazida de EMCH forma un enlace hidrazona escindible en medio ácido con el aldehído de SO1861. Al mismo tiempo, la porción conectora EMCH presenta un grupo maleimida que es reactivo con tiol (grupo sulfhidrilo) y, por tanto, puede conjugarse con tioles (Figura 20 B).
[0206] El grupo maleimida de SO1861-EMCH realiza una reacción de adición de Michael rápida y específica con tioles y estructuras poliméricas que llevan tiol cuando se lleva a cabo en un rango de pH de 6,5 a 7,5 (Figura 20 B). Además, el enlace hidrazona sensible en medio ácido entre SO1861 y EMCH se puede utilizar para realizar la liberación de saponina desde una estructura base en un ambiente ácido (Figura 21). Por tanto, la porción conectora EMCH satisface tanto la necesidad de una estrategia de escisión por pH como de una estrategia de conjugación a una estructura polimérica.
[0207] Con respecto a la longitud ideal del espaciador EMCH para la conjugación a una estructura polimérica, la simulación por ordenador (PerkinElmer, ChemBio3D, Ver. 13.0.0.3015) muestra que el grupo maleimida de SO1861-EMCH está ubicado en la periferia de la molécula y, por lo tanto, debe ser accesible para estructuras polimérica que lleven tiol (Figura 22).
[0208] Para sintetizar SO1861-EMCH, se ha desarrollado una estrategia que permite la conversión del grupo aldehído de la SO1861 a EMCH (Figura 5 A). El conjugado SO1861-EMCH se aisló y caracterizó con éxito mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (véase la sección de materiales y métodos, Figura 3B) y espectrometría de masas con ionización con analizador de tiempo de vuelo/desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) como se muestra en la Figura 5 B y 5 C, y en la Figura 4 A.
[0209] Para evaluar la hidrólisis dependiente del pH del enlace hidrazona, se disolvió SO1861-EMCH en una solución de HCl a pH 3 y se registraron los espectros MALDI-TOF-MS en dos puntos diferentes en el tiempo (Figura 23). Como se muestra en la Figura 23 A y 23 B, una clara tendencia decreciente del pico enm/z2070 Da que corresponde a SO1861-EMCH es visible en la Figura 23 B. Dado que la SO1861 se genera durante la hidrólisis, se registró un aumento del pico en m/z 1861 Da que acompañó la tendencia decreciente en m/z 2070 Da. Estos resultados demuestran que el enlace de hidrazona responde a la hidrólisis y se escinde incluso si está unido a SO1861.
[0210] Para conjugar SO1861-EMCH a una estructura polimérica, las aminas accesibles de la estructura polimérica se convierten en tioles con la ayuda del agente 2-iminotiolano. Los tioles libres generados sobre la estructura polimérica actúan entonces como nucleófilos para la adición de tioleno de tipo Michael al grupo maleimida de SO1861-EMCH (Figura 24). Esta metodología desarrollada es adecuada para la conjugación de SO1861-EMCH a cualquier estructura polimérica disponible que obtenga grupos amina accesibles, y permite además un control sobre el número de moléculas de SO1861 conjugadas en función de la estructura polimérica, respectivamente.
[0211] La prueba de concepto para la conjugación de 'saponinas listas para conjugar' a una estructura polimérica se obtuvo mediante el uso del dendrímero poli(amidoamina) de 5a generación (G5) que lleva amina (PAMAM con colorante rojo fluorescente unido covalentemente (Cy3)). Se utilizó PAMAM-Cy3 como estructura polimérica para la conjugación tanto con SO1861-EMCH como con SO1861-HATU y sirvió como modelo para la conjugación de SO1861 con una estructura polimérica (Figura 25).
[0212] Todos los grupos amina accesibles de Cy3-PAMAM se convirtieron en tioles usando un exceso de 3 veces de 2-iminotiolano por aminas Cy3-PAMAM seguido de la reacción con SO1861-EMCH. Se utilizaron tres equivalentes de adición diferentes (5, 20 y 57) de SO1861-EMCH para los tres lotes de reacción. Después de la reacción, las masas registradas de los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 en MALDI-TOF-MS muestran un incremento de las masas correspondientes al aumentar la cantidad añadida de SO1861-EMCH (Figura<8>). Las tres cantidades de adición diferentes correspondieron a una masa obtenidade m/z38,4 kDa,m/z53,9 kDa ym/z133,8 kDa para los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 que corresponden a<6>, 13 y 51 moléculas de SO1861 unidas por dendrímero PAMAM, como se muestra en la Figura<8>B-D.
[0213] En otra reacción, solo un cierto número de aminas PAMAM se convirtieron en tioles antes de la reacción con SO1861-EMCH. En este documento, se utilizaron dos equivalentes de adición diferentes de 2-iminotiolano<(8>y 32) y dos equivalentes de adición diferentes de SO1861-EMCH (5 y 30), respectivamente. Después de la reacción, los espectros respectivos de los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 en MALDI-TOF-MS muestran picos enm/z37,7 kDa (5 equivalentes de adición de SO1861-EMCH) y enm/z87,0 kDa (30 equivalentes de adición de SO1861-EMCH) como se muestra en la Figura 9. Las masas obtenidas enm/z37,7 kDa ym/z87,0 kDa corresponden a conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 con 5 y 30 moléculas de SO1861 unidas, y demuestran que con este método se conjugaron casi todos los SO1861-EMCH alimentados.
[0214] Para la generación de un conjugado de saponina no escindible según el pH, se activó el ácido carboxílico de SO1861 con HATU y luego se hizo reaccionar con las aminas de Cy3-PAMAM formando una amida estable con respecto al pH unida entre Cy3-PAMAM y SO1861. La masa resultante del conjugado se detectó mediante MALDI-TOF-MS con una masa dem/z62,3 kDa que corresponde al conjugado Cy3-PAMAM-NC-SO1861 (NC = no escindible) con 17,5 de moléculas SO1861 unidas por PAMAM (Figura 25 B, Figura 10).
[0215] A continuación, las estructuras base conjugadas con saponina se conjugaron con puntos de enlace para una posible conjugación con terapias dirigidas (por ejemplo, toxinas dirigidas) a través de la denominada cicloadición de alquino-azida promovida por tensión anular (SPAAC, química clic) para obtener una estructura base funcionalizada. Para esta reacción, Cy3-PAMAM-SO1861 (Figura 36 C, D) y Cy3-PAMAM-NC-SO1861 (Figura 13 B) se conjugaron a una porción enlazadora NHS-PEG<13>-DBCO heterobifuncional que generó un alquino deformado en la superficie de los conjugados (Figura 13 A). El resto NHS (N hidroxisuccinimida) de la porción conectora reaccionó con las aminas restantes de los conjugados PAMAM-saponina formando un enlace amida entre la estructura base y la porción conectora. El resto de DBCO (dibenzociclooctina) resultante en los conjugados es capaz de realizar S<p>A<a>C con las azidas correspondientes en las terapias dirigidas.
[0216] La diantina-EGF sirvió como una toxina dirigida modelo y la diantina sirvió como una toxina no dirigida. Ambas toxinas se marcaron con Alexa Fluor™ 488 usando el derivado de tetrafluorofenil éster (TFP) del tinte. Las proteínas marcadas con tinte se conjugaron luego a una porción conectora NHS-SS-PEG<3>-azida heterobifuncional para obtener el resto químico correspondiente para la SPAAC a los conjugados PAMAM-saponina. Las mediciones de Maldi-TOF-MS mostraron que se unieron una molécula de Alexa Fluor™ 488 y 9 moléculas de NHS-SS-PEG3-azida por molécula de diantina-EGF (Figura 14, Figura 15). Además, la diantina-EGF marcada con Alexa Fluor ™488 se conjugó con una porción conectora de NHS-PEG<12>-azida heterobifuncional que carecía del puente disulfuro y, por tanto, generaría una construcción no escindible por toxina.
[0217] Los conjugados Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO y Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO se hicieron reaccionar con azido-toxinas marcadas con Alexa Fluor 488 para realizar una cicloadición de alquino-azida promovida por tensión anular. La conjugación entre los agentes reactivos se indicó mediante electroforesis en gel y la colocalización de las señales fluorescentes de Cy3, que solo se adhiere al polímero PAMAM, y Alexa Fluor™ 488, que solo se adhiere a las toxinas, en un gel de poliacrilamida después de la electroforesis en gel (Figura 16).
[0218] Como estructura polimérica alternativa al dendrímero PAMAM, se utilizó un dendrón G4 (PFd-G4-Azide-NH-BOC, Polymer Factory) con 16 grupos terminales amino funcionales y un grupo azido en el punto focal para la conjugación con SO1861 (Figura 26). La ventaja de usar un dendrón en lugar de un dendrímero es el punto focal que muestra la estructura del dendrón. Este punto focal permite la conjugación directa a una toxina dirigida sin la necesidad de su modificación posterior con funciones clic ortogonales (Figura 27). Como se muestra en la Figura 27, el dendrón se sometió a la misma metodología que se describe para el dendrímero PAMAM. Brevemente, después del marcaje y desprotección parcial con colorante (Figura 28), los grupos amino del dendrón se convirtieron en tioles usando el reactivo tiolante 2-iminotiolano seguido de conjugación con SO1861-EMCH. Para la conjugación con SO1861-EMCH se utilizaron tres equivalentes de adición diferentes de SO1861-EMCH. Los conjugados dendrón-SO1861 se analizaron mediante MALDI-TOF-MS. Como era de esperar, las especies conjugadas de 1 y 2 moléculas de SO1861 por molécula de dendrón se obtuvieron cuando se utilizaron equivalentes de adición bajos de SO1861-EMCH de 3 y 10 (Figura 29 B, C). Se obtuvieron especies conjugadas de dendrón-SO1861 más altas de hasta 9 moléculas de SO1861 por dendrón (Figura 29 A) cuando se utilizó una alimentación equivalente de 22 moléculas de SO1861-EMCH por molécula de dendrón. En experimentos adicionales, el dendrón funcionalizado con saponina se conjugará con toxinas dirigidas sobre su punto focal para producir una estructura base funcionalizada, y se evaluará biológicamente.
[0219] Para evaluar más otras metodologías de conjugación de SO1861 a una estructura polimérica, se utilizó la vía de aminación reductora. Para ello, el grupo aldehído de SO1861 se conjugó directamente con aminas PAMAM formando un enlace imina. La formación del enlace imina fue seguida de un paso de aminación reductora mediante la adición del agente reductor cianoborohidruro de sodio formando un enlace amina estable al pH entre SO1861 y PAMAM (Figura 17 A). De manera similar al enfoque EMCH y HATU, esta metodología permite un control sobre el número de saponinas conjugadas por polímero, como se muestra en la Figura 17 B, C. En este caso, se produjeron conjugados PAMAM-saponina que obtuvieron un número de 10 (Figura 17 B) y 30 (Figura 17 C) moléculas de SO1861 por PAMAM.
Ejemplo 4
Ensayo de viabilidad celular
[0220] Se sembraron células HeLa en DMEM (PAN-Biotech GmbH) complementado con suero bovino fetal al 10 % (PAN-Biotech GmbH) y penicilina/estreptomicina al 1 % (PAN-Biotech GmbH), en una placa de 96 pocillos a 5<000>c/p en<100>pl/pocillo y se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO<2>. Al día siguiente, se prepararon muestras de solución madre concentradas 20x de las muestras de PAMAM, conjugados de PAMAM, dendrón G4 (preparado en el Ejemplo 3) o cloroquina (Sigma Aldrich) en DMEM. El medio se retiró de la placa de cultivo celular y se reemplazó por 160 pl de medio de cultivo, seguido de la adición de<10>pl de muestra/pocillo (de las reservas concentradas 20x) y una incubación de 45 min a 37 °C. Durante esta incubación se preparó la curva de concentración de SO1861. La solución madre maestra de SO1861 se calentó durante 10 min a 50 °C, mientras se agitaba a 1250 r.p.m, seguido de sonicación durante 15 segundos y un breve recalentamiento a 50 °C durante 1 min, mientras se agitaba a 1250 r.p.m. Posteriormente, se preparó una dilución en serie de SO1861 en PBS. La curva de concentración de SO1861 se preparó como una solución madre concentrada 10x, a partir de la cual se añadieron 20 pl/pocillo. Después de una incubación de 15 min a 37 °C, se añadieron 10 pl de diantina-EGF/pocillo (preparada en el Ejemplo 2) diluidos en DMEM a 30 pM) o DMEM que contenía una cantidad igual de PBS, para obtener una concentración final de diantina-EGF de 1,5 pM así como la SO1861 indicada y las diferentes estructuras poliméricas o concentraciones de cloroquina en un volumen final de<200>pl/pocillo.
[0221] Después del tratamiento, las células se incubaron durante 72 h a 37 °C antes de determinar la viabilidad celular mediante un ensayo MTS, realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Prolieration Assay, Promega). En resumen, la solución de MTS se diluyó 20x en DMEM sin rojo fenol (PAN-Biotech GmbH) complementado con FBS al 10 %. Las células se lavaron una vez con 200 pl de PBS/pocillo, después de lo cual se añadieron 100 pl/pocillo de solución diluida de MTS. La placa se incubó durante aproximadamente 20-30 minutos a 37 °C. Posteriormente, la DO a 492 nm se midió en un lector de placas Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Scientific). Para la cuantificación, la señal de fondo de los pocillos con "solo medio" se restó de todos los demás pocillos, antes de calcular el porcentaje de viabilidad celular de las células tratadas/no tratadas, dividiendo la señal corregida de fondo de los pocillos tratados por la señal corregida de fondo de los pocillos no tratados (x<100>).
Análisis FACS
[0222] Se sembraron células HeLa en DMEM (PAN-Biotech GmbH) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (PAN-Biotech GmbH) y penicilina/estreptomicina al 1 % (PAN-Biotech GmbH), a 500000 c/placa en placas de 10 cm y se incubaron durante 48 horas (5%CO<2>, 37 °C), hasta alcanzar una confluencia del 90 %. A continuación, las células se tripsinizaron (TryplE Express, Gibco Thermo Scientific) en células individuales. 0,75 x 10<6>células se transfirieron a un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugaron (1400 r.p.m, 3 min). El sobrenadante se descartó dejando sumergido el sedimento celular. El sedimento se disoció golpeando suavemente el tubo Falcon en un agitador de vórtice y las células se lavaron con 4 ml de PBS frío (sin Mg2+ y Ca2+, 2 % FBS). Después de lavar, las células se resuspendieron en 3 ml de PBS frío (sin Mg2+ y Ca2+, FBS al 2 %) y dividido en partes iguales en 3 tubos FACS de fondo redondo (1 ml/tubo). Las células se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en 200 pL de PBS frío (Mg2+ y Ca2+ libre, FBS al 2 %) o 200 pl de solución de anticuerpo; que contenía 5 pL de anticuerpo en 195 pL de PBS frío (sin Mg2+ y Ca2+, 2 % FbS). Se usó IgG1 de ratón APC, K Isotype Ctrl FC (n.° 400122, Biolegend) como control de isotipo, y se usó APC anti-EGFR humano (n. ° 352906, Biolegend) para teñir el receptor de EGFR. Las muestras se incubaron durante 30 min a 4 °C en un mezclador de tubo de rodillo. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con PBS frío (sin Mg2+ y Ca2+, FBS al 2 %) y se fijaron durante 20 min a temperatura ambiente utilizando una solución de PFA al 2 % en PBS. Las células se lavaron 2 veces con PBS frío y se resuspendieron en 250-350 pl de PBS frío para el análisis FACS. Las muestras se analizaron con un sistema de citometría de flujo BD FACSCanto Il (BD Biosciences) y el software FlowJo.Resultados
[0223] Previamente se ha descrito que los grupos amino en estructuras poliméricas que contienen amina tales como PAMAM y PEI (polietilenimina) son capaces de bloquear la acidificación de los endosomas a través de su capacidad intrínseca de regulación de la concentración de H+. Puesto que las propiedades potenciadoras del escape endosomal de SO1861 sólo están expuestas a pH endosomal bajo (< pH 5), la estructura base o estructura base funcionalizada no debe contener grupos químicos que sean capaces de interferir en la acidificación de los endosomas y bloquear así la actividad de SO1861.
[0224] Se analizaron las estructuras poliméricas que contienen amina de una PAMAM G5 (128 aminas primarias y aproximadamente 126 aminas terciarias) y 4G-dendrón (16 aminas primarias), con el fin de determinar si estas moléculas inhiben la capacidad de mejora del escape endosomal de SO1861. Se realizaron experimentos de coadministración de PAMAM (nativa o tiolada) o dendrón (nativo) en combinación con diantina-EGF y diversas concentraciones de SO1861 en células HeLa. Como control para la inhibición de la acidificación endosómica se utilizó cloroquina.
[0225] Las células HeLa muestran suficientes cantidades de EGFR en la superficie celular (Figura 30 A). Se observa que tanto la PAMAM "nativa" como la cloroquina inhiben el escape endosomal mediado por SO1861 de la toxina dirigida y la subsiguiente muerte celular en las células Hela (Figura 30 B). PAMAM a 500 nM inhibe incluso en la misma medida que la cloroquina, un inhibidor de la acidificación endosomal, mientras que el dendrón 667 nM no tiene ningún efecto. Para abordar aún más si la actividad inhibidora de la PAMAM 'nativa' se debe a la disponibilidad de grupos amino de la PAMAM, los grupos amino primarios de PAMAM se tiolaron parcialmente mediante reacción con 2-iminotiolano (Figura 11), lo que resultó en 16 de 128 (Figura 11 C), 65/128 (Figura 11 D) y 108/128 (Figura 11 E) aminas primarias bloqueadas. Se observa que la tiolación de 65 y 108 aminas primarias supera la inhibición del escape endosomal mediado por SO1861, mientras que la tiolación de hasta 16 grupos de aminas todavía muestra los efectos inhibidores del escape endosomal mediado por SO1861 de la toxina dirigida (Figura 30 C). Los grupos amino primarios de PAMAM también se pegilaron parcialmente mediante una reacción con mPEG2k-NHS (Figura 12), lo que resultó en 3 de 128 (Figura 12 C), 8/128 (Figura 12 D) y 18/128 (Figura 12 E) aminas primarias bloqueadas. El bloqueo de solo 3 aminas primarias mediante PEGilación ya es suficiente para revertir la inhibición del escape endosomal mediado por SO1861 (Figura 11 D). El efecto de protección de la PEGilación probablemente se extiende más allá del pequeño número de aminas que se convierten, ya que se sabe que la PEGilación introduce una capa de hidratación que puede proteger a una molécula completa, si se alcanza un nivel suficiente.
[0226] Estos resultados demuestran que la presencia de un cierto número de grupos amino libres en estructuras poliméricas, tales como PAMAM, puede bloquear la acidificación endosomal y, así, inhibir la actividad de escape endosomal de SO1861 u otros glucósidos. Cuando el número de grupos amino es menor, como se muestra para el dendrón G4, o si los grupos amino se han protegido, como por tiolación o PEGilación, el efecto inhibidor se invierte.
Ejemplo A - Mezcla de saponinas de Quillaja saponaria que comprenden QS-21, con actividad potenciadora del escape endosomal/lisosomal
[0227] En el Esquema I se muestra la estructura molecular común de una serie de saponinas QS-21 (en parte adaptadas de: Conradio Pederbos, Laercio Pol-Fachin, Ramon Pons, Cilaine V. Teixeira Hugo Verli, Atomic Model and Micelle Dynamics of QS-21 Saponin, Molecules 2014, 19, 3744-3760). Una mezcla de saponinas solubles en agua obtenidas de Quillaja saponaria (Sigma-Aldrich, producto N.° S4521; Roth, artículo N.° 6857; InvivoGen, producto 'Quil-A') se puede aplicar en la porción efectora que comprende al menos una saponina según la invención, o en un conjugado, composición, combinación de la invención que potencia el escape endosomal/lisosomal, basándose en las propiedades que potencian el escape endosomal/lisosomal de al menos una saponina individual presente en la mezcla, por ejemplo, QS-21, o basándose en una combinación de dos o más de las saponinas comprendidas por la mezcla, tales como QS-21 y QS-7.
[0228] Los inventores demostraron que la mezcla de saponinas de Quillaja saponariaa una dosis de 2,5 microgramos/ml era capaz de potenciar el escape endosomal de diantina, cuando se testaba con células tumorales de mamífero en un bioensayo basado en células. La porción efectora expuesta a las células fue diantina unida covalentemente al ligando EGF: EGF-diantina. Las células analizadas fueron líneas celulares tumorales HeLa para saponinas libres, y A431, MDA-MB-468, CaSki y A2058 para analizar las saponinas de Quillaja saponaria cuando estaban unidas covalentemente a cetuximab.
REFERENCIAS
[0229]
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Porción efectora capaz de inducir un efecto intracelular cuando está presente dentro de una célula de mamífero, estando la porción efectora conjugada con al menos una saponina, en donde la al menos una saponina es una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-deshidrooleanano con un grupo aldehído en la posición C-23, en donde la al menos una saponina está unida de manera covalente, estando involucrado un enlace hidrazona, a la porción efectora a través de la al menos una porción conectora, o está unida de manera covalente directamente a dicha porción efectora, en donde la porción efectora comprende o consiste en al menos un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ácido xenonucleico.
2. Porción efectora de la reivindicación 1, donde la saponina es SO1861 y/o QS-21.
3. Porción efectora de la reivindicación 1 o 2, en donde la porción efectora se selecciona de uno cualquiera o más de un vector, un gen, un transgén inductor de suicidio celular, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótido antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN de minicírculo, ácido peptidonucleico (APN), oligómero morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente con 2'-O,4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (GNA) y ácido treosa nucleico (TNA).
4. Porción efectora de la reivindicación 1 o 2, en donde la porción efectora es un BNA, por ejemplo, un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27.
5. Porción efectora de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la al menos una saponina comprende un grupo ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo beta-OH C-3 de la saponina.
<6>. Porción efectora de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la al menos una saponina es una sola saponina específica o es una mezcla de dos o más saponinas diferentes.
7. Porción efectora de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción efectora a través de al menos una porción conectora, donde la al menos una porción conectora comprende al menos una porción conectora escindible, donde la porción conectora escindible comprende un enlace hidrazona.
<8>. Porción efectora de la reivindicación 7, donde la porción conectora es hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH).
9. Porción efectora de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción efectora a través de al menos una porción conectora, en donde la porción conectora es o comprende una estructura base que comprende una estructura polimérica u oligomérica y un grupo químico para la unión covalente de la estructura base a la porción efectora, en donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base a través del grupo aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina, donde el enlace covalente es un enlace hidrazona.
10. Porción efectora según la reivindicación 9, en donde el grupo aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina está unida de manera covalente a la porción conectora hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, porción conectora que está unida covalentemente a través de un enlace tioéter a un grupo sulfhidrilo de la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
11. Porción efectora según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en donde el grupo químico de la estructura base, para la unión covalente de la estructura base a la porción efectora, es un grupo de química clic, preferiblemente seleccionado de una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, más preferiblemente el grupo de química clic es una azida.
12. Porción efectora según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base comprende un polímero lineal, ramificado y/o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado, un ADN, un polipéptido, poli-lisina, un polietilenglicol, o un ensamblaje de estas estructuras poliméricas u oligoméricas, donde dicho ensamblaje se construye preferiblemente mediante reticulación covalente.
13. Porción efectora según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la al menos una saponina es un número definido de saponinas o un intervalo definido de saponinas, preferiblemente 1-128 saponinas o al menos 2, 3, 4, 5,<6>,<8>, 10, 16, 32, 64 o 128 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, tal como 7, 9, 12 saponinas.
14. Conjugado anticuerpo-fármaco que comprende la porción efectora conjugada con la al menos una saponina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, o un conjugado ligando-fármaco que comprende la porción efectora conjugada con la al menos una saponina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
15. Conjugado anticuerpo-fármaco o conjugado ligando-fármaco de la reivindicación 14, donde el anticuerpo puede unirse a cualquiera de CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3,<h>E<r>2, EGFR, C<d>20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina alfaV, CA<6>, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrinaA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM<6>, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente CD71, HER2, EGFR, y/o en donde el anticuerpo del conjugado anticuerpo-fármaco es o comprende cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD71 OKT-9 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, herceptina, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD38 OKT-10 o anticuerpo monoclonal anti-HER2 tal como trastuzumab y pertuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD20 tal como rituximab, ofatumumab, tositumomab e ibritumomab, anticuerpo monoclonal anti-CA125 tal como oregovomab, anticuerpo monoclonal anti-EpCAM (17-1A) tal como edrecolomab, anticuerpo monoclonal anti-EGFR tal como cetuximab, panitumumab y nimotuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD30 tal como brentuximab, anticuerpo monoclonal anti-CD33 tal como gemtuzumab y huMy9-6, anticuerpo monoclonal antiintegrina vascular alfa-v beta-3 tal como etaracizumab, anticuerpo monoclonal anti-CD52 tal como alemtuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD22 tal como epratuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CEA tal como labetuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD44v6 tal como bivatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-FAP tal como sibrotuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD19 tal como huB4, anticuerpo monoclonal anti-CanAg tal como huC242, anticuerpo monoclonal anti-CD56 tal como huN901, anticuerpo monoclonal anti-CD38 tal como daratumumab, anticuerpo monoclonal anti-CA<6>tal como DS<6>, anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR tal como cixutumumab y 3B7, anticuerpo monoclonal anti-integrina tal como CNTO 95, anticuerpo monoclonal antisindecano-1 tal como B-B4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión al receptor específico de células tumorales del mismo y/o al menos un dominio de unión al receptor específico de células tumorales del mismo, y/o en donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox y Polatuzumab vedotina, y/o en donde el conjugado ligando-fármaco comprende o consiste en al menos un ligando no proteico y/o al menos un ligando proteico para unirse a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina.
16. Combinación terapéutica que comprende:
(a) la porción efectora conjugada con la al menos una saponina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico; y
(b) un conjugado anticuerpo-fármaco o un conjugado ligando-fármaco y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
17. Combinación terapéutica según la reivindicación 16, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco puede unirse a cualquiera de los receptores de células tumorales CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-<i>R, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGF<r>,<c>D20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L receptor, PSMA, CanAg, integrina alfaV, CA<6>, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrinaA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM<6>, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente CD71, HER2, EGFR, y/o en donde el anticuerpo del conjugado anticuerpofármaco es o comprende cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD71 OKT-9 del tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, herceptina, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD38 OKT-10, o anticuerpo monoclonal anti-HER2 tal como trastuzumab y pertuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD20 tal como rituximab, ofatumumab, tositumomab e ibritumomab, anticuerpo monoclonal anti-CA125 tal como oregovomab, anticuerpo monoclonal anti-EpCAM (17-1A) tal como edrecolomab, anticuerpo monoclonal anti-EGFR tal como cetuximab, panitumumab y nimotuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD30 tal como brentuximab, anticuerpo monoclonal anti-CD33 tal como gemtuzumab y huMy9-6, anticuerpo monoclonal anti-integrina vascular alfa-v beta-3 tal como etaracizumab, anticuerpo monoclonal anti-CD52 tal como alemtuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD22 tal como epratuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CEA tal como labetuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD44v6 tal como bivatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-FAP tal como sibrotuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD19 tal como huB4, anticuerpo monoclonal anti-CanAg tal como huC242, anticuerpo monoclonal anti-CD56 tal como huN901, anticuerpo monoclonal anti-CD38 tal como daratumumab, anticuerpo monoclonal anti-CA<6>tal como DS<6>, anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR tal como cixutumumab y 3B7, anticuerpo monoclonal anti-integrina tal como CNTO 95, anticuerpo monoclonal antisindecano-1 tal como B-B4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión al receptor específico de células tumorales del mismo y/o al menos un dominio de unión al receptor específico de células tumorales del mismo, y/o en donde el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende uno cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox y Polatuzumab vedotina, y/o en donde el conjugado ligando-fármaco comprende o consiste en al menos un ligando no proteico y/o al menos un ligando proteico para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina.
18. Composición farmacéutica que comprende la porción efectora conjugada con la al menos una saponina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o el conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 14 o 15 o el conjugado ligando-fármaco de la reivindicación 14 o 15 y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
19. Conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 14 o 15 o combinación terapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 16-18 o conjugado ligando-fármaco de la reivindicación 14 o 15 o composición farmacéutica de la reivindicación 18, para su uso como medicamento.
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