ES2985036T3

ES2985036T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2985036T3
Application number: ES21214663T
Authority: ES
Inventors: Lee Adam Wheeler; Judy Lieberman; Adi Gilboa-Geffen
Original assignee: Boston Childrens Hospital
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2024-11-04
Anticipated expiration: 2035-08-28
Also published as: EP3185910A4; US11180762B2; AU2015308721A1; AU2015308721B2; CA2959386A1; EP4043567B1; JP2017526367A; EP4043567C0; EP4043567A1; CN120591279A; WO2016033472A1; CA2959386C; US10385343B2; US20170275629A1; EP3185910A1; CN107106704A; KR20170070022A; US20190309297A1

Abstract

En este documento se describen métodos y composiciones relacionados con el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer de mama, utilizando, por ejemplo, moléculas de quimera de aptámero-ARNi. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer

Descripción detallada

Campo técnico

La invención se refiere a moléculas quiméricas que comprenden una molécula de unión a EpCAM o EphA2 y un dominio de ácido nucleico inhibidor que inhibe la expresión del gen MCL1, y a dichas moléculas quiméricas y composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas quiméricas para su uso en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer epitelial.

Antecedentes

Se ha explorado el RNA de interferencia (RNAi) para su uso terapéutico en la reducción de la expresión génica en el hígado. Sin embargo, el hígado es único porque es fácil de transfectar con moléculas de RNAi. La administración de RNAs pequeños y la inactivación génica resultante en otros tejidos continúa siendo ineficiente y, en última instancia, ineficaz. En particular, el bloqueo de ruta de administración es un obstáculo principal para aprovechar el RNAi para el tratamiento del cáncer.

Compendio

Tal y como se describe en la presente memoria, los inventores han desarrollado nuevas moléculas de aptámero-siRNA quiméricas (AsiCs). Estos marcadores de células cancerosas objetivo de AsiC dirigen el RNAsi específicamente a las células cancerosas, aumentando la eficacia de la administración y la eficacia terapéutica mientras se reduce el potencial de los efectos secundarios.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula quimérica que comprende un dominio aptámero de unión a un marcador de cáncer y un dominio de ácido nucleico inhibidor que inhibe la expresión del gen MCL1, en donde el marcador de cáncer es EpCAM o EphA2.

En algunas realizaciones, la molécula es una quimera aptámero-siRNA (AsiC). En algunas realizaciones, el dominio aptámero de unión al marcador de cáncer comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el dominio aptámero de unión al marcador de cáncer consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 33.

En algunas realizaciones, el extremo 3'-terminal de la molécula comprende dTdT. En algunas realizaciones, la molécula comprende al menos una 2'-F pirimidina.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula quimérica que comprende un dominio aptámero de unión al marcador de cáncer y un dominio de ácido nucleico inhibidor que inhibe la expresión del gen MCL1, en donde el marcador de cáncer es EpCAM o EphA2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición comprende al menos dos moléculas quiméricas como se describe en la presente memoria en donde las moléculas quiméricas tienen diferentes dominios aptámero y/o dominios de ácido nucleico inhibitorios. En algunas realizaciones, los diferentes dominios aptámero o de ácido nucleico inhibidor reconocen diferentes objetivos. En algunas realizaciones, los diferentes dominios aptámero o de ácido nucleico inhibidor tienen diferentes secuencias y reconocen el mismo objetivo.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula quimérica que comprende un dominio aptámero de unión al marcador de cáncer y un dominio de ácido nucleico inhibidor que inhibe la expresión del gen MCL1, en donde el marcador de cáncer es EpCAM o EphA2, o una composición farmacéutica que comprende una molécula quimérica que comprende un dominio aptámero de unión al marcador de cáncer y un dominio de ácido nucleico inhibidor que inhibe la expresión del gen MCL1, en donde el marcador de cáncer es EpCAM o EphA2, para su uso en un método para el tratamiento del cáncer, comprendiendo el método administrar la molécula quimérica y/o composición. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer epitelial o cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo. En algunas realizaciones, la administración es subcutánea. En algunas realizaciones, al sujeto se le administra además un tratamiento adicional contra el cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento contra el cáncer es paclitaxel.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1H demuestran que el aptámero de EpCAM se dirige específicamente a células de cáncer de mama Basal A. Diseño de EpCAM-AsiC, que contiene un aptámero de EpCAM y un siRNA dePLK1(cadena sentido descrita como SEQ ID NO: 1 y cadena antisentido descrita como SEQ ID NO: 2) (Figura 1C). La línea celular epitelial de cáncer de mama (BPLER) sobreexpresa la proteína EpCAM en comparación con la línea celular epitelial de mama normal (BPE) (Figuras 1A-1B). La EpCAM-AsiC dirigida a GFP fue marcada con Alexa647 o Cy3 en el extremo 3'-terminal de la cadena de siRNA antisentido y se incubó con células BPLER y BPE. La absorción se evaluó 24 horas después mediante citometría de flujo (Figura 1D). Los datos son representativos de 3 experimentos independientes. La EpCAM-AsiC marcada con Cy3 y Alexa647 se absorbió mediante MB468 y BPLER (células EpCAM+) respectivamente y no mediante BPE (EpCAM-). Se muestra el MFI de cada pico. Para probar el silenciamiento génico, se trataron BPLER y BPE con EpCAM-AsiC dirigida a GFP (4 pM) y se compararon con controles de transfección usando Dharmafect y GFP-siRNA (100 nM). La inactivación se evaluó mediante citometría de flujo 72 horas después de la incubación. Los controles se simularon y se trataron solo con Dhrmafect (lípido).(n= 4) (Figura 1D). EpCAM-AsiC dirigida a AKT1 inactiva selectivamente la expresión de mRNA de AKT1 (Figura 1E) y proteína (Figura 1F) en líneas celulares de cáncer de mama basal A y luminal y no en fibroblastos basales B o humanos (hFb). La transfección con siRNA dirigido a AKT1 induce la inactivación génica en todas las líneas celulares, mientras que el tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a GFP no afecta a los niveles de mRNA y proteína de AKT1 (*p<0,05, p<0,01). Gráficos de la proteína de AKT1 y la inactivación génica que comparan el efecto de EpCAM-AsiC con la transfección de siRNA. La inactivación inducida por EpCAM-AsiC se correlaciona con la expresión de EpCAM (Figura 1E-H).(n= 3; media ± SEM normalizada a la simulación; *P < 0,05, **P < 0,01, prueba t de 2 colas).

Las Figuras 2A-2E demuestran que EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente la proliferación celular en células de cáncer de mama Basal A. El efecto de EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 sobre la proliferación celular se probó en 10 líneas celulares de cáncer de mama representativas de líneas celulares basales A, B y luminales usando el ensayo cell-titer-glo (CTG). EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 disminuyó la proliferación celular tanto en líneas celulares basal A como luminal, mientras que no tuvo efecto sobre las células basal B (Figuras 2A, 2C). Se observó una correlación entre los niveles de expresión de EpCAM y la viabilidad celular (Figura 2B). Se co-cultivaron células basal A (EpCAM+GFP-) con células BPE (EpCAM-GFP+) y se trataron con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 o no se trataron. El co-cultivo sin tratar mostró una proporción similar de células después del tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1, la proporción de células EpCAM+ disminuyó y la de células EpCAM- aumentó. En un gráfico de citometría de flujo representativo (Figura 2D), la cuantificación del experimento analizó la proporción de células GFP+/GFP- en 4 líneas celulares diferentes (Figura 2E). (n=4, *p<0,05, p<0,01).

Las Figuras 3A-3D demuestran que el tejido de TNBC humano absorbe específicamente aptámeros de Cy3-EpCAM. Diseño experimental; a Cy3-EpCAM-AsiC dirigida aGFP,se añadieron Alexa647-siRNA-GFP o Alexa647-col-siRNA-GFP (2 pM de cada uno) a explantes de cáncer de mama y de control y se incubaron durante 24 h antes de digerir el tejido con colagenasa a una suspensión de células individuales y analizarlo mediante citometría de flujo (Figura 3A). Las biopsias tumorales sobreexpresan EpCAM y citoqueratina, un marcador de células epiteliales (Figura 3B). Los histogramas representativos de uno de los tres experimentos independientes muestran que el siRNA y el col-siRNA penetraron tanto en el tumor como en el tejido sano con una eficacia similar, mientras que EpCAM-AsiC se absorbió selectivamente por la biopsia de tejido tumoral y no por la muestra de tejido de control sano (Figura 3C). El experimento de absorción se repitió en tumores de tres pacientes diferentes, cada biopsia recibida se probó 3 veces para cada tratamiento. Un compendio de los tres pacientes (Figura 3D). (n=3, simulado, EpCAM gris, rojo *P < 0,05, **P < 0,005, prueba t de CD4-AsiC frente a tratamiento simulado).

Las Figuras 4A-4C demuestran que EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente la iniciación tumoral en células de cáncer de mama Basal A. Los ensayos de colonias de líneas celulares de cáncer de mama se trataron con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 o GFP (4 uM) o paclitaxel (100 nM) durante 24 h y se cultivaron durante 8 días en medio sin fármaco. El tratamiento con paclitaxel disminuyó la formación de colonias en todas las líneas celulares mientras que el tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 sólo eliminó la formación de colonias en células luminales (MCF7) y basales A (HCC1954), el tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a GFP no tuvo ningún efecto (Figura 4A). El ensayo se repitió en 3 líneas celulares más y los resultados fueron reproducibles (Figura 4B). El ensayo de formación de esferas indicó resultados similares, EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 disminuyó el número de esferas solo en células basales A y luminales y no tuvo efecto sobre células basales B (Figura 4C). Se trataron células MB468-luc durante 24 h con EpCAM-AsiC dirigida a GFP o PLK1 y se inyectaron s.c. al flanco de ratones nude. Se obtuvieron imágenes de los ratones cada 5 días durante 20 días. Los ratones no tratados y los ratones tratados con EpCAM-AsiC dirigida a GFP mostraron un aumento en la iniciación tumoral mientras que los ratones inyectados con células pretratadas con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 no tuvieron iniciación tumoral.

Las Figuras 5A-5C demuestran la absorción selectiva de Alexa750-EpCAM-AsiCs en tumores EpCAM+. La Figura 5A representa la configuración experimental; se inyectó a ratones nude células MB468-luc (flanco izquierdo) y MB231-luc-mCherry (flanco derecho), 5 días después de la inyección se inyectó s.c. EpCAM-AsiC marcado con Alexa750 dirigida a GFP (0,5 mg/kg) en el área del cuello. Se tomaron imágenes de los ratones inmediatamente después de la inyección y otra vez después de 24, 48 horas y 5 días. La EpCAM-AsiC marcada con Alexa750 dirigida a GFP se co localizó con el tumor de luciferasa en el tumor MB468-luc (EpCAM+) y no en el tumor MB231 -luc-mCherry (EpCAM-). El análisis de 7 ratones indica un aumento significativo de Alexa750 en tumores MB468 (EpCAM+) (Figura 5B). La Figura 5C representa un gráfico de las tasas de absorción de Alexa750.

Las Figuras 6A-6B demuestran que la EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente el crecimiento tumoral en células de cáncer de mama Basal A. La Figura 6A representa el diseño experimental. Ratones nude inyectados con células MB231-luc-mCherry (5x105) o células MB468-luc (5x106) se trataron con 5 mg/kg de EpCAM AsiC dirigida a PLK1 o GFP cada 72 h o se dejaron sin tratar. Figura 6B: los tumores MB468-luc tratados con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 se redujeron de tamaño tan pronto como 6 días después del tratamiento y en muchos ratones desaparecieron completamente después de 14 días. Los tumores no tratados tanto EpCAM+ como EpCAM- aumentaron de tamaño durante los 14 días.

La Figura 7 demuestra que EpCAM AsiCs son estables en suero humano y de ratón. EpCAM-AsiCs deeGFPsintetizados usando 2'-fluoro-pirimidinas, siRNAs deeGFPconjugados con colesterol estabilizados químicamente (colsiRNA) o siRNAs deeGFPno modificados se incubaron con un volumen igual de suero humano o de ratón. Se retiraron alícuotas a intervalos regulares y se resuspendieron en tampón de carga de gel y se almacenaron a -80°C antes de la electroforesis en geles PAGE desnaturalizantes. Se muestra la intensidad promedio (+S.E.M) de las bandas de 2 experimentos independientes cuantificadas mediante densitometría después de la tinción.

Las Figuras 8A-8B demuestran que la inyección de EpCAM AsiCs no estimula la inmunidad innata en ratones. Los ratones se inyectaron sc con EpCAM-AsiCs deeGFP(5 mg/kg, n=3) o ip con poli(I:C) (5 o 50 mg/kg (n=2/dosis). Figura 8A: Las muestras de suero, recogidas al inicio y 6 y 16 h después del tratamiento se evaluaron para IFNp, IL-6 e IP-10 mediante inmunoensayo múltiple. * p<0,05. ** p<0,01, *** p<0,001, en comparación con el inicio. Figura 8B: la expresión de mRNA de genes inducidos por citocinas e IFN, en relación congapdhse ensayó mediante qRT-PCR en esplenocitos totales recogidos 16 h después del tratamiento. ** p<0,01, en comparación con no tratados (NT, n=3).

La Figura 9 representa una tabla de secuencias. (SEQ ID NOS 1-2 y 23-32, respectivamente, en orden de aparición).

Las Figuras 10A-10B representan quimeras de aptámero-siRNA (AsiC). La Figura 10A representa un diagrama de la AsiC (aptámero unido covalentemente a una cadena de un siRNA) que reconoce específicamente un receptor de superficie de células cancerosas, que se endocitosa y después se libera al citosol, donde se procesa como pre-miRNAs endógenos para inactivar un gen objetivo. Las barras indican los 2 obstáculos de administración - absorción y liberación celular desde endosomas al citosol donde se localizan Dicer y el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). La Figura 10B representa el diseño de EpCAM AsiC dirigida a PLK1. (cadena sentido descrita como SEQ ID NO: 1 y cadena antisentido descrita como SEQ ID NO: 2).

Las Figuras 11A-11D demuestran que la inactivación de EpCAM-AsiC y el efecto antitumoral se correlacionan con los niveles de EpCAM e inhiben las T-ICs epiteliales de tumores de mama. Figuras 11A-11B: Experimento representativo (Figura 11A) e inactivación de AKT1 en comparación con EpCAM-AsiC con transfección de siRNA de lípido (Figura 11B). Figura 11C: Efecto antiproliferativo de EpCAM-AsiCs que inactiva PLK1 solo en líneas celulares EpCAM+. D EpCAM-AsiCs de PLK1 inhiben la formación de colonias en HCC1143 de MCF luminal y TNBC basal-A, pero no en células MB231 basal B mesenquimales.

Las Figuras 12A-12B demuestran la identificación de un aptámero de EphA2 funcional. Figura 12A: La incubación de células MB231 basal B EphA2+ con aptámero de EphA2 (EphA2apt) conduce a la degradación de EphA2 y una disminución transitoria en Akt activa (pAkt). Figura 12B: Las células de cáncer de mama EphA2+ incubadas durante 2 h con EphA2apt (0 a 100 nM), pero no el aptámero de no unión control (ctl), muestran EphA2 reducido. La adición de Efrina A se usó como control positivo para la degradación de EphA2.

Las Figuras 13A-13C: EpCAM-AsiCs inactivan la proteína GFP (Figura 13A) y mRNA de AKT1 (Figuras 13B-13C) solo en líneas celulares EpCAM+, pero no en línea celular epitelial de mama inmortalizada (BPE) o TNBC basal B mesenquimal o fibroblastos humanos. Un siRNA transfectado es no específico en su inactivación. *, P<0,05

La Figura 14. Se incubaron biopsias de tejido de mama normal y tumor de TNBC basal-A del mismo sujeto con EpCAM-AsiC marcado con Cy3 y se analizaron suspensiones de células individuales 3 días después para determinar la absorción por citometría de flujo. Los siRNA desnudos no fueron absorbidos por ninguno de los dos, los siRNAs conjugados con colesterol fueron absorbidos por igual, pero las EpCAM-AsiCs fueron absorbidas específicamente por el tumor. Los tejidos representativos se muestran a la izquierda.

Las Figuras 15A-15C. El tratamiento de líneas de cáncer de mama EpCAM+, pero no EpCAM-, con EpCAM-AsiCs de PLK1 inhibe la función de colonias (Figuras 15A, 15B) y mamosferas (Figura 15C), en ensayos in vitro de la función de T-IC.

La Figura 16 demuestra que el tratamiento ex vivo de células MB468 con EpCAM-AsiCs de PLK1 eliminaba su capacidad para formar tumores en ratones nude. Se implantó un número igual de células viables el día después del tratamiento.

Las Figuras 17A-17B demuestran que EpCAM-AsiCs se absorben selectivamente en tumores de TNBC EpCAM+, pero no EpCAM-. La Figura 17A representa el esquema experimental. La Figura 17B representa la concentración de EpCAM-AsiCs en tumores extirpados en el sacrificio.

Las Figuras 18A-18B demuestran que EpCAM-AsiCs de PLK1 provocó la regresión tumoral completa de xenoinjertos de TNBC EpCAM+, pero no tuvo efecto sobre xenoinjertos de EpCAM-basal-B. La Figura 18A representa el diseño experimental. La obtención de imágenes de la actividad de luciferasa de los tumores del flanco izquierdo y derecho se realizó secuencialmente durante 2 semanas. La Figura 18B representa un gráfico del tamaño del tumor mediante la actividad de la luciferasa. Todos los tumores EpCAM+ en ratones tratados con AsiCs de PLK1 remitieron rápidamente, mientras que los otros tumores continuaron creciendo.

Las Figuras 19A-19C demuestran que los genes de dependencia basal incluyen 4 genes del complejo de espliceosoma tri-snRNP (PFPF8, PRPF38A, RBM22 , USP39), 2 genes de exportación nuclear (NUP205, Ra N) y un gen cinetocoro (NDC80). La Figura 19A representa la viabilidad celular, 3 días después de la inactivación, normalizada para siRNA de control. La Figura 19B representa la formación de colonias evaluada mediante el cultivo en placas de células viables 2 días después de la inactivación. La Figura 19C representa la activación de caspasa 2 días después de que la inactivación sea específica para MB468 y no se produzca en células BPE.

La Figura 20 representa algunos diseños posibles de EpCAM-AsiCs multimerizados para mejorar la endocitosis. En estos diseños, las cadenas sentido y antisentido podrían intercambiarse y los enlazadores podrían variarse.

Las Figuras 21A-21D demuestran que el aptámero de EpCAM se dirige específicamente a células de cáncer de mama Basal A. La Figura 21A representa el diseño de EpCAM-AsiC, que contiene un aptámero de EpCAM y un siRNA dePLK1(cadena sentido descrita como SEQ ID NO: 1 y cadena antisentido descrita como SEQ ID NO: 2). La Figura 21B representa gráficos que demuestran que la línea celular epitelial de cáncer de mama (BPLER) sobreexpresa la proteína EpCAM en comparación con la línea celular epitelial de mama normal (BPE). La EpCAM-AsiC dirigida a GFP se marcó con Alexa647 o Cy3 en el extremo 3'-terminal de la cadena antisentido de siRNA y se incubó con células BPLER y BPE. La absorción se evaluó 24 horas después mediante citometría de flujo (Figura 21C). Los datos son representativos de 3 experimentos independientes. La EpCAM-AsiC marcada con Cy3 y Alexa647 se absorbió por MB468 y BPLER (células EpCAM+) respectivamente y no por BPE (EpCAM-). Se muestra el MFI de cada pico (simulado, gris). La Figura 21D representa gráficos de experimentos en donde, para probar el silenciamiento génico, BPLER y BPE se trataron con EpCAM-AsiC dirigida a GFP (4 pM) y se compararon con controles de transfección usando Dharmafect y GFP-siRNA (100 nM). La inactivación se evaluó mediante citometría de flujo 72 horas después de la incubación. Los controles fueron simulados y tratamiento solo con Dhrmafect (lípido).(n= 4).

La Figura 22 representa gráficos que demuestran que los aptámeros de EpCAM no se unen a EpCAM de ratón. Los niveles de ESA de ratón (EpCAM) se determinaron usando citometría de flujo con un anticuerpo mCD326. La célula 4T1, una línea celular epitelial de cáncer de mama de ratón presentó altos niveles de expresión de EpCAM. Tanto RAW (línea celular monocítica de ratón) como MB468 (línea celular basal A humana) mostraron un aumento en la expresión de EpCAM pero mucho menor que las células 4T1. Una línea celular de cáncer mesenquimal de ratón (67NR) mostró un aumento mínimo en la expresión de EpCAM. Los experimentos de absorción demostraron que el aptámero de EpCAM no era absorbido ni por las células 4T1 ni 67NR.

La Figura 23 representa gráficos que demuestran que EpCAM se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer de mama basal A y luminal pero no basal B. Gráficos FACS representativos de 8 líneas celulares de cáncer de mama diferentes, probando los niveles de expresión de EpCAM mediante citometría de flujo usando un anticuerpo hEpCAM. EpCAM se sobreexpresa en todas las líneas celulares basal A y luminales y no en basal B (simulado, EpCAM gris sombreado, negro)

Las Figuras 24A-24F demuestran que EpCAM AsiC silencia específicamente la expresión génica en células de cáncer de mama Basal A. EpCAM-AsiC dirigida a AKT1 inactiva selectivamente la expresión del mRNA de AKT1 (Figura 24A) y de proteínas (Figuras 24B, 24C) en líneas celulares de cáncer de mama basal A y luminal y no en fibroblastos basal B o humanos (hFb). La transfección con siRNA dirigido a AKT1 induce la inactivación génica en todas las líneas celulares, mientras que el tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a GFP no afecta a los niveles de mRNA y proteína de AKT1 (*p<0,05, p<0,01). Gráficos de la proteína AKT1 y la inactivación génica que comparan el efecto de EpCAM-AsiC con la transfección de siRNA. La inactivación inducida por EpCAM-AsiC se correlaciona con la expresión de EpCAM (Figura 24D, 24E).(n= 3; media ± SEM normalizada a la simulación; *P < 0,05, **P < 0,01, prueba t de 2 colas). La Figura 24F representa los resultados del análisis de citometría de flujo.

Las Figuras 25A-25E demuestran que el tejido de TNBC humano absorbe específicamente aptámeros de Cy3-EpCAM. La Figura 25A representa el diseño experimental; Cy3-EpCAM-AsiC dirigidaa GFP,se añadieron Alexa647-siRNA-GFP o Alexa647-col-siRNA-GFP (2 pM de cada uno) a explantes de cáncer de mama y de control y se incubaron durante 24 h antes de digerir el tejido con colagenasa a una suspensión de células individuales y analizarlo mediante citometría de flujo. La Figura 25B representa gráficos que demuestran que biopsias de tumores sobreexpresan EpCAM y citoqueratina, un marcador de células epiteliales. La Figura 25C representa histogramas representativos de uno de los tres experimentos independientes que muestran que el siRNA y el col-siRNA penetraron tanto en el tumor como en el tejido sano con una eficacia similar, mientras que EpCAM-AsiC se absorbió selectivamente por la biopsia de tejido tumoral y no por la muestra de tejido de control sano. El experimento de absorción se repitió en tumores de tres pacientes diferentes, cada biopsia recibida se probó 3 veces para cada tratamiento. La Figura 25D representa tumores representativos. Un compendio de los tres pacientes se representa en la Figura 25E. (n=3, *P < 0,05, **P < 0,005, prueba t de CD4-AsiC frente a tratamiento simulado).

La Figura 26 representa gráficos que demuestran que EpCAM-AsiC es absorbida por biopsias tanto sanas como de cáncer de colon. Cy3-EpCAM-AsiC dirigida aGFP,se añadieron Alexa647-siRNA-GFP o Alexa647-col-siRNA-GFP (2 pM de cada uno) a explantes de cáncer de colon y de control y se incubaron durante 24 h antes de digerir los tejidos con colagenasa a una suspensión de células individuales y analizarlos mediante citometría de flujo. Los histogramas representativos muestran que EpCAM-AsiC, siRNA y col-siRNA penetraron tanto en el tejido tumoral como en el tejido sano con una eficacia similar.

Las Figuras 27A-27D demuestran que EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente la proliferación celular en células de cáncer de mama Basal A. El efecto de EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 sobre la proliferación celular se probó en 10 líneas celulares de cáncer de mama representativas de líneas celulares basales A, B y luminales usando el ensayo cell-titer-glo (CTG). EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 disminuyó la proliferación celular tanto en líneas celulares basal A como luminales, mientras que no tiene efecto sobre las células basal B (Figura 27A). Se observó una correlación entre los niveles de expresión de EpCAM y la viabilidad celular (Figura 27B). Se co-cultivaron células basal A (EpCAM+GFP-) con células BPE (EpCAM-GFP+) y se trataron con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 o no se trataron. El co-cultivo sin tratar mostró una proporción similar de células después del tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1, la proporción de células EpCAM+ disminuyó y la de células EpCAM- aumentó. La Figura 27C representa gráficos representativos de citometría de flujo, y la Figura 27D representa un gráfico de la cuantificación del experimento analizado de la proporción de células GFP+/GFP- en 4 líneas celulares diferentes. (n=4, *p<0,05, p<0,01).

La Figura 28 representa un gráfico que demuestra que la disminución específica en la viabilidad celular en líneas celulares de cáncer de mama Basal A es dependiente de PLK1. Se trataron diez líneas celulares de cáncer de mama diferentes que representaban células basales A, B y luminales con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 o solo el aptámero de EpCAM y se compararon con controles no tratados. Ninguna de las líneas celulares tratadas con aptámero de EpCAM mostró una disminución en la viabilidad celular, mientras que las líneas celulares basal A y luminales mostraron una disminución en la viabilidad celular después del tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1.

Las Figuras 29A-29C demuestran que EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente la iniciación tumoral en células de cáncer de mama Basal A. Las pruebas de colonias de líneas celulares de cáncer de mama se trataron con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 o GFP (4 uM) o paclitaxel (100 nM) durante 24 h y se cultivaron durante 8 días en medio sin fármaco. El tratamiento con paclitaxel disminuyó la formación de colonias en todas las líneas celulares mientras que el tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 solo eliminó la formación de colonias en células luminales (MCF7) y basal A (HCC1954), el tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a GFP no tuvo ningún efecto. La Figura 29A representa imágenes de los resultados del ensayo. El ensayo se repitió en 3 líneas celulares más y los resultados fueron reproducibles, como se demuestra en el gráfico representado en la Figura 29B. La Figura 29C representa un gráfico que demuestra que el ensayo de formación de esferas indicó resultados similares, EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 disminuyó el número de esferas solo en células basal A y luminales y no tuvo efecto sobre las células basal B. Se trataron células MB468-luc durante 24 h con EpCAM-AsiC dirigida a GFP o PLK1 y se inyectaron s.c. al flanco de ratones nude. Se obtuvieron imágenes de los ratones cada 5 días durante 20 días. Los ratones no tratados y los ratones tratados con EpCAM-AsiC dirigida a GFP mostraron un aumento en la iniciación tumoral mientras que los ratones inyectados con células pretratadas con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 no tuvieron iniciación tumoral.

Las Figuras 30A-30B demuestran que EpCAM AsiC es estable en suero humano y de ratón durante 36 horas. EpCAM-AsiC dirigida a GFP sintetizado usando 2'-fluoro-pirimidinas, GFP-siRNAs conjugados con colesterol de 21-mer químicamente estabilizados (col-siRNA) y GFP-siRNA de 21 -mer no modificados, cada uno en 100 ul de PBS, que se añadieron a 100 pl de suero humano o de ratón. A intervalos regulares, se retiraron 20 pl, y se resuspendieron en tampón de carga de gel y se congelaron a -80°C antes de someterse a electroforesis en un gel de PAGE desnaturalizante. La Figura 30A representa geles de PAGE representativos y la Figura 30B representa gráficos de la intensidad promedio (+S.E.M) de bandas de dos experimentos independientes analizados por densitometría. Tanto el siRNA conjugado con colesterol estabilizado como el EpCAM-AsiC son estables durante las 36 h del experimento.

Las Figuras 31A-31B demuestran la absorción selectiva de Alexa750-EpCAM-AsiCs en tumores EpCAM+. La Figura 31A representa la configuración experimental; se inyectó a ratones nude células MB468-luc (flanco izquierdo) y MB231-luc-mCherry (flanco derecho), 5 días después de la inyección se inyectaron s.c. EpCAM-AsiC dirigida a GFP marcado con Alexa750 (0,5 mg/kg) en el área del cuello. Se tomaron imágenes de los ratones inmediatamente después de la inyección y otra vez después de 24, 48 horas y 5 días. EpCAM-AsiC dirigida a GFP marcada con Alexa750 se co-localizo con el tumor de luciferasa en el tumor MB468-luc (EpCAM+) y no en el tumor MB231-luc-mCherry (EpCAM-). La Figura 31B representa un gráfico de análisis de 7 ratones que indica un aumento significativo de Alexa750 en tumores MB468 (EpCAM+). En el día 5, los tumores se retiraron y visualizaron para validar que EpCAM-AsiC dirigida a GFP marcada con Alexa750 entraba en los tumores. El nivel aumentado de Alexa750 se correlaciona negativamente con los niveles de mCherry. (n=8, *P < 0,05, pruebatde células EpCAM+ frente a EpCAM-).

Las Figuras 32A-32B demuestran que EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente el crecimiento tumoral en células de cáncer de mama Basal A. La Figura 32A representa la configuración experimental; ratones nude inyectados con células MB231 -luc-mCherry (5x105) o células MB468-luc (5x106) se trataron con 5 mg/kg de EpCAM AsiC dirigida a PLK1 o GFP cada 72 h o se dejaron sin tratar. Se obtuvieron imágenes de los ratones usando el sistema de obtención de imágenes IVIS Spectra cada 72 h durante 14 días. La Figura 32B representa un gráfico que demuestra que los tumores MB468-luc tratados con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 se redujeron en tamaño tan pronto como 6 días después del tratamiento y en muchos ratones desaparecieron completamente después de 14 días. Los tumores no tratados tanto EpCAM+ como EpCAM- aumentaron en tamaño durante los 14 días.

La Figura 33 representa gráficos del crecimiento tumoral que demuestran que los tumores MB468 revierten sólo después del tratamiento con EpCAM-AsiC de PLK1. Los ratones con tumores MB468 se trataron sc con 5 mg/kg de RNA 2x/semana comenzando cuando los tumores se volvieron palpables. Se analizaron muestras tratadas de EpCAMAsiC de PLK1, SpCAM-AsiC de GFP, aptámero de EpCAM, siRNA de PLK1 y muestras tratadas de manera simulada tal y como se indica.

La Figura 34 demuestra que el siRNA de PLK1 se asocia con Argonaute (AGO) en células tratadas con EpCAM-AsiCs de PLK1. Se lisaron células MB-468, tratadas con EPCAM-AsiC o siRNA de PLK1 durante 2 días, y los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo pan-AGO o control de isotipo IgG. La cantidad de siRNA de PLK1 en los inmunoprecipitados se cuantificó mediante qRT-PCR Taqman, presentada como log2 medio con SEM, con respecto a miR-16. **, P < 0,01 mediante la prueba t de Student con respecto a las células tratadas con siRNA. ND, no detectable. Se encontró siRNA de PLK1 en el RISC después del tratamiento con EpCAM-AsiCs de PLK1. Sin embargo, la inmunoprecipitación con Ago no empobreció significativamente los siRNAs de PLK1 del sobrenadante. Esto es probablemente porque la mayoría de los RNAs que son absorbidos por las células no son liberados de los endosomas al citosol (A. Wittrup et al., Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology 2015, en prensa).

La Figura 35 demuestra que EpCAM AsiC dePLKsuprime el crecimiento tumoral de MCF10CA1a (CA1a). El panel superior representa el esquema experimental. En este experimento, las AsiCs se inyectaron sc en el flanco cerca del tumor, pero no en el tumor. El panel inferior representa un gráfico de Log2 del flujo de fotones luminiscentes totales de los tumores (N = 4); *,P<,05 mediante la prueba t de Student.

Descripción detallada

Los inventores han demostrado la eficacia sorprendente de AsiCs (moléculas quiméricas aptámero-siRNA) en el tratamiento del cáncer. Las AsiC descritas en la presente memoria utilizan un aptámero que dirige la molécula quimérica específicamente a células cancerosas, proporcionando una supresión eficaz y específica del gen objetivo del siRNA.

En particular, los aptámeros descritos en la presente memoria, por ejemplo, los que se dirigen a EpCAM y EphA2, permiten la terapia para dirigirse a células iniciadoras de tumores (también denominadas células madre cancerosas). Estas células son responsables no sólo del inicio, la recaída y la metástasis tumorales, sino que también son relativamente resistentes a la terapia citotóxica convencional. Por lo tanto, las composiciones y métodos descritos en la presente memoria permiten el tratamiento eficaz de la patología subyacente de una manera que las terapias existentes no logran. El éxito de las AsiCs descritas en la presente memoria es particularmente sorprendente en que el direccionamiento directo de EpCAM con anticuerpos se ha investigado previamente y se ha descubierto que carece de eficacia.

Además, se demuestra que las AsiC descritas en la presente memoria son sorprendentemente eficaces en el tratamiento de cánceres epiteliales, por ejemplo, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo (TNBC)). No existen terapias dirigidas actuales para TNBC y qué tratamientos están disponibles típicamente dan como resultado metástasis en 3 años, conduciendo a muerte. Las AsiC descritas en la presente memoria demostraron una inactivación génica eficaz específicamente en células de TNBC luminales y basal A en comparación con células sanas, suprimieron la formación de colonias y mamosferasin vitroy anularon el inicio del tumorex vivo.El tratamiento in vitro con las AsiCs dio como resultado la administración dirigida de la regresión terapéutica y rápida del tumor.

En un aspecto, se describe en la presente memoria una molécula quimérica que comprende un dominio de unión a un marcador de cáncer y un dominio de ácido nucleico inhibidor. Tal y como se usa en la presente memoria, "dominio de unión a un marcador de cáncer" se refiere a un dominio y/o molécula que puede unirse específicamente a una molécula más altamente expresada en la superficie de una célula cancerosa en comparación con una célula sana del mismo tipo (un marcador de cáncer). En algunas realizaciones, el marcador de cáncer puede ser una proteína y/o polipéptido. Según la invención, el marcador de cáncer se selecciona de EpCAM o EphA2. Según la invención, el dominio de unión al marcador de cáncer es un aptámero.

Tal y como se usa en la presente memoria, "EpCAM" o "molécula de adhesión de células epiteliales" se refiere a una glicoproteína transmembrana que media la adhesión célula-célula homotípica independiente de Ca2+ en células epiteliales. Las secuencias para EpCAM son conocidas para una variedad de especies, por ejemplo, EpCAM humana (véase, por ejemplo, NCBI Gene ID: 4072; secuencia de proteínas: NCBI Ref Seq: NPJD02345.2).

Tal y como se usa en la presente memoria, "EphA2" o "receptor A2 de EPH" se refiere a un receptor de proteínatirosina quinasa de tipo efirina. EphA2 se une a ligandos de efrina-A y permite la entrada de herpesvirus asociados al sarcoma de Kaposi en células huésped. Las secuencias para EphA2 se conocen para una variedad de especies, por ejemplo, EphA2 humano (véase, por ejemplo, NCBI Gene ID: 1969; secuencia de proteínas: NCBI Ref Seq: NP_004422.2).

Tal y como se usa en la presente memoria, "dominio de ácido nucleico inhibidor" se refiere a un dominio que comprende un ácido nucleico inhibidor. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor puede ser un siRNA.

El dominio de ácido nucleico inhibidor puede inhibir, por ejemplo, puede dirigir, la expresión de un producto génico que está regulado positivamente en una célula cancerosa y/o la expresión de un gen que es necesario para el crecimiento y/o la supervivencia celular. El dominio de ácido nucleico inhibidor puede inhibir la expresión de un gen seleccionado de Plk1 (por ejemplo, "quinasa 1 tipo polo"; NCBI Gene ID: 5347); MCL1 (por ejemplo, leucemia de células mieloides 1;<n>C<b>I Gene ID: 4170); EphA2 (NCBI Gene ID: 1969); PsmA2 (por ejemplo, subunidad alfa 2 del proteasoma; NCBI Gene ID: 5683); MSI1 (por ejemplo, proteína de unión a RNA de musashi 1; NCBI Gene ID: 4440); BMI1 (por ejemplo, inserción 1 de Mo-MLV de linfoma B, NCBI Gene ID: 648); XBP1 (proteína de unión a X-boxn 1; NCBI Gene ID: 7494); PRPF8 (por ejemplo, factor de procesamiento de pre-mRNA 8 ; n Cb I Gene ID: 10594), PFPF38A (por ejemplo, factor de procesamiento de pre-mRNA 38A; NCBI Gene ID: 84950), RBM22 (por ejemplo, proteína del motivo de unión a RNA 22; NCBI Gene ID: 55696), USP39 (por ejemplo, peptidasa específica de ubiquitina 39; NCBI Gene ID: 10713); RAN (por ejemplo, proteína nuclear relacionada con ras; NCBI Gene ID: 5901); NUP205 (por ejemplo, nucleoporina 205kDa; NCBI Gene ID: 23165) y NDC80 (por ejemplo, componente de complejo cinetocoro NDC80; NCBI Gene ID: 10403). Según la invención, el dominio de ácido nucleico inhibidor inhibe la expresión del gen MCL1. Las secuencias de estos genes, por ejemplo, los mRNAs humanos, se obtienen fácilmente de la base de datos de NCBI y pueden usarse por un experto en la técnica para diseñar ácidos nucleicos inhibidores. Además, en la presente memoria se proporcionan dominios de ácido nucleico inhibidores ejemplares, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, una composición como se describe en la presente memoria puede comprender un dominio de unión a un marcador de cáncer que comprende un aptámero y un dominio de ácido nucleico inhibidor que comprende un siRNA, por ejemplo, la composición puede comprender una quimera de aptámero-siRNA (AsiC).

La invención proporciona una molécula quimérica que comprende un dominio aptámero de unión a un marcador de cáncer y un dominio de ácido nucleico inhibidor que inhibe la expresión del gen MCL1, en donde el marcador de cáncer es EpCAM o EphA2, o una composición farmacéutica que comprende una molécula quimérica que comprende un dominio aptámero de unión a un marcador de cáncer y un dominio de ácido nucleico inhibidor que inhibe la expresión del gen MCL1, en donde el marcador de cáncer es EpCAM o EphA2, para su uso en un método para el tratamiento del cáncer, comprendiendo el método administrar la molécula quimérica o composición a un sujeto que tiene o se le ha diagnosticado que tiene cáncer. Los sujetos que tienen cáncer pueden ser identificados por un médico usando los métodos actuales de diagnóstico del cáncer. Los síntomas y/o complicaciones del cáncer que caracterizan estas afecciones y ayudan en el diagnóstico son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, en el caso del cáncer de mama, un bulto o masa en el tejido de la mama, hinchazón de todo o parte de una mama, irritación de la piel, goteo de la mama, dolor en la mama o pezón, retracción del pezón, enrojecimiento, escamazación o irritación de la mama o pezón, y descarga del pezón. Las pruebas que pueden ayudar en un diagnóstico de, por ejemplo, cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a, mamogramas, rayos X, MRI, ultrasonidos, ductograma, una biopsia y lavado ductal. Un historial familiar de cáncer o exposición a factores de riesgo para el cáncer (por ejemplo, humo, radiación, contaminantes, mutación de BRCA1, etc.) también puede ayudar a determinar si es probable que un sujeto tenga cáncer o a realizar un diagnóstico de cáncer.

Los términos "neoplasia maligna", "afección maligna", "cáncer" o "tumor", tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a un crecimiento incontrolado de células que interfiere con el funcionamiento normal de los órganos y sistemas corporales.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cáncer" se refiere generalmente a una clase de enfermedades o afecciones en donde las células anormales se dividen sin control y pueden invadir tejidos cercanos. Las células cancerosas también pueden extenderse a otras partes del cuerpo a través de la sangre y los sistemas linfáticos.

Una "célula cancerosa" o "célula tumoral" se refiere a una célula individual de un crecimiento o tejido canceroso. Un tumor se refiere generalmente a una hinchazón o lesión formada por un crecimiento anormal de células, que puede ser benigno, premaligno o maligno. La mayoría de las células cancerosas forman tumores, pero algunas, por ejemplo, leucemia, no forman necesariamente tumores. Para aquellas células cancerosas que forman tumores, los términos cáncer (célula) y tumor (célula) se usan indistintamente.

Un sujeto que tiene un cáncer o un tumor es un sujeto que tiene células cancerosas objetivamente medibles presentes en el cuerpo del sujeto. En esta definición se incluyen cánceres malignos, activamente proliferativos, así como tumores o micrometástasis potencialmente latentes. Los cánceres que migran desde su localización original y siembran otros órganos vitales pueden conducir finalmente a la muerte del sujeto a través del deterioro funcional de los órganos afectados. Los cánceres hemopoyéticos, tales como leucemia, son capaces de competir por los compartimentos hemopoyéticos normales en un sujeto, conduciendo de ese modo a fallo hemopoyético (en forma de anemia, trombocitopenia y neutropenia) causando finalmente la muerte.

Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, carcinoma de células basales, cáncer del tracto biliar; cáncer de vejiga; cáncer óseo; cáncer de cerebro y CNS; cáncer de mama; cáncer del peritoneo; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon y recto; cáncer de tejido conectivo; cáncer del sistema digestivo; cáncer endometrial; cáncer de esófago; cáncer ocular; cáncer de cabeza y cuello; cáncer gástrico (incluyendo cáncer gastrointestinal); glioblastoma (GBM); carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial.; cáncer de riñón o renal; cáncer de laringe; leucemia; cáncer hepático; cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón); linfoma incluyendo linfoma de Hodgkin y no Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de cavidad oral (por ejemplo, labios, lengua, boca y faringe); cáncer de ovario; cáncer pancreático; cáncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer rectal; cáncer del sistema respiratorio; carcinoma de glándula salival; sarcoma; cáncer de piel; cáncer de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer de tiroides; cáncer uterino o endometrial; cáncer del sistema urinario; cáncer de la vulva; así como otros carcinomas y sarcomas; así como linfoma de células B (incluyendo linfoma no Hodgkin (NHL) de bajo grado/folicular); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células pequeñas no escindidas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con AIDS; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células Hairy; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y síndrome de Meigs. En algunas realizaciones, el cáncer puede ser cáncer epitelial. En algunas realizaciones, el cáncer puede ser cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer puede ser cáncer de mama triple negativo.

Una "célula cancerosa" es una célula cancerosa, pre-cancerosa o transformada, o bienin vivo, ex vivo,o en cultivo de tejidos, que tiene cambios fenotípicos espontáneos o inducidos que no implican necesariamente la absorción de nuevo material genético. Aunque la transformación puede surgir de la infección con un virus transformante y la incorporación de un nuevo ácido nucleico genómico, o la absorción de ácido nucleico exógeno, también puede surgir espontáneamente o después de la exposición a un carcinógeno, mutando de este modo un gen endógeno. La transformación/cáncer está asociada con, por ejemplo, cambios morfológicos, inmortalización de células, control del crecimiento aberrante, formación de foci, independencia de anclaje, malignidad, pérdida de inhibición por contacto y limitación de densidad del crecimiento, factor de crecimiento o independencia del suero, marcadores específicos de tumor, invasión o metástasis, y crecimiento tumoral en huéspedes animales adecuados tales como ratones nude.Véase, por ejemplo.,Freshney, CULTURE ANIMAL CELLS: MANUAL BASIC TECH. (3rd ed., 1994).

Las moléculas y composiciones descritas en la presente memoria para su uso en un método para el tratamiento del cáncer, pueden administrarse a un sujeto que tiene o se ha diagnosticado que tiene cáncer. En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria comprenden administrar una cantidad eficaz de composiciones descritas en la presente memoria, a un sujeto con el fin de aliviar un síntoma de un cáncer. Tal y como se usa en la presente memoria, "aliviar un síntoma de un cáncer" es mejorar cualquier afección o síntoma asociado con el cáncer. En comparación con un control equivalente sin tratar, dicha reducción es de al menos el 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, 99% o más, medida mediante cualquier técnica estándar. Los expertos en la técnica conocen una variedad de medios para administrar las composiciones descritas en la presente memoria a sujetos. Dichos métodos pueden incluir, pero no limitarse a, la administración oral, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, por vía aérea (aerosol), pulmonar, cutánea, tópica, por inyección o intratumoral. La administración puede ser local o sistémica. En algunas realizaciones, la administración es subcutánea. En algunas realizaciones, la administración de una AsiC como se describe en la presente memoria es subcutánea.

El término "cantidad eficaz" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a la cantidad de una composición necesaria para aliviar al menos uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, y se refiere a una cantidad suficiente de composición farmacológica para proporcionar el efecto deseado. Por lo tanto, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para proporcionar un efecto anticanceroso particular cuando se administra a un sujeto típico. Una cantidad eficaz tal y como se usa en la presente memoria, en diversos contextos, también incluiría una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de una enfermedad de síntomas (por ejemplo, pero sin limitarse a, ralentizar la progresión de un síntoma de la enfermedad) o revertir un síntoma de la enfermedad. Por lo tanto, en general no es posible especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, un experto en la materia puede determinar una "cantidad eficaz" apropiada usando solo experimentación rutinaria.

Las cantidades eficaces, toxicidad y eficacia terapéutica pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren las composiciones y los métodos que muestran grandes índices terapéuticos. Una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Además, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración de una composición) que alcanza una inhibición de síntomas semimáxima) como se determina en cultivo celular, o en un modelo animal apropiado. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los efectos de cualquier dosificación particular pueden monitorizarse mediante un bioensayo adecuado, por ejemplo, ensayo para el tamaño tumoral, entre otros. La dosificación puede ser determinada por un médico y ajustada, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento.

En algunas realizaciones, la tecnología descrita en la presente memoria se refiere a una composición farmacéutica como se describe en la presente memoria, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, soluciones tampón acuosas, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de dichos vehículos y diluyentes es bien conocido en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol (PEG); (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones tamponadas con pH; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; (22) agentes de carga, tales como polipéptidos y aminoácidos (23) componente sérico, tal como albúmina sérica, HDL y LDL; (22) alcoholes de C2-C12, tales como etanol; y (23) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. También pueden estar presentes en la formulación agentes humectantes, agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes. Los términos tales como "excipiente", "vehículo", "vehículo farmacéuticamente aceptable" o similares se usan indistintamente en la presente memoria. En algunas realizaciones, el vehículo inhibe la degradación del principio activo, por ejemplo, como se describe en la presente memoria.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica tal y como se describe en la presente memoria puede ser una forma de dosificación parenteral. Puesto que la administración de formas de dosificación parenterales típicamente evita las defensas naturales del paciente contra contaminantes, las formas de dosificación parenterales son preferiblemente estériles o capaces de esterilizarse antes de la administración a un paciente. Los ejemplos de formas de dosificación parenterales incluyen, pero no se limitan a, soluciones listas para inyección, productos secos listos para disolverse o suspenderse en un vehículo farmacéuticamente aceptable para inyección, suspensiones listas para inyección y emulsiones. Además, pueden prepararse formas de dosificación parenteral de liberación controlada para la administración de un paciente, que incluyen, pero sin limitarse a, formas de dosificación y descarga de dosis de tipo DUROS®.

Los vehículos adecuados que pueden usarse para proporcionar formas de dosificación parenterales tal y como se describe en la presente memoria son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, sin limitación: agua estéril; agua para inyección USP; solución salina; solución de glucosa; vehículos acuosos tales como, pero sin estar limitados a, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, e inyección de Ringer lactato; vehículos miscibles en agua tales como, pero sin limitación, alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol; y vehículos no acuosos tales como, pero no limitados a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo. Los compuestos que alteran o modifican la solubilidad de una sal farmacéuticamente aceptable también pueden incorporarse en las formas de dosificación parenteral de la divulgación, incluyendo formas de dosificación parenteral convencional y de liberación controlada.

Las composiciones farmacéuticas también pueden formularse para que sean adecuadas para la administración oral, por ejemplo como formas de dosificación discretas, tales como, pero sin limitarse a, comprimidos (incluyendo sin limitación comprimidos ranurados o recubiertos), píldoras, comprimidos oblongos, cápsulas, comprimidos masticables, paquetes de polvo, sellos, trociscos, obleas, pulverizaciones en aerosol o líquidos, tales como pero sin limitarse a, jarabes, elixires, soluciones o suspensiones en un líquido acuoso, un líquido no acuoso, una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. Dichas composiciones contienen una cantidad predeterminada de la sal farmacéuticamente aceptable de los compuestos descritos, y pueden prepararse por métodos farmacéuticos bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, en general, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. 2005).

Las formas de dosificación convencionales proporcionan generalmente una liberación rápida o inmediata del fármaco desde la formulación. Dependiendo de la farmacología y farmacocinética del fármaco, el uso de formas de dosificación convencionales puede conducir a grandes fluctuaciones en las concentraciones del fármaco en la sangre y otros tejidos de un paciente. Estas fluctuaciones pueden afectar a varios parámetros, tales como frecuencia de la dosis, inicio de la acción, duración de la eficacia, mantenimiento de los niveles terapéuticos en sangre, toxicidad, efectos secundarios y similares. De manera ventajosa, las formulaciones de liberación controlada pueden usarse para controlar el inicio de la acción de un fármaco, la duración de la acción, los niveles plasmáticos dentro de la ventana terapéutica y los niveles sanguíneos máximos. En particular, pueden usarse formas o formulaciones de dosificación de liberación controlada o prolongada para garantizar que se logra la máxima eficacia de un fármaco mientras se minimizan los efectos adversos potenciales y problemas de seguridad, que pueden producirse tanto desde la sub dosificación de un fármaco (es decir, que están por debajo de los niveles terapéuticos mínimos) así como que exceden el nivel de toxicidad del fármaco. En algunas realizaciones, la composición puede administrarse en una formulación de liberación sostenida.

Los productos farmacéuticos de liberación controlada tienen un objetivo común de mejorar la terapia farmacológica con respecto a la lograda por sus homólogos de liberación no controlada. Idealmente, el uso de una preparación de liberación controlada diseñada óptimamente en el tratamiento médico se caracteriza por un mínimo de sustancia farmacológica que se emplea para curar o controlar la afección en una cantidad mínima de tiempo. Las ventajas de las formulaciones de liberación controlada incluyen: 1) actividad extendida del fármaco; 2) frecuencia de dosificación reducida; 3) cumplimiento del paciente aumentado; 4) uso de menos fármaco total; 5) reducción en los efectos secundarios locales o sistémicos; 6) minimización de la acumulación de fármaco; 7) reducción de las fluctuaciones del nivel sanguíneo; 8) mejora en la eficacia del tratamiento; 9) reducción de la potenciación o pérdida de la actividad del fármaco; y 10) mejora en la velocidad de control de enfermedades o afecciones. Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, PA: 2000).

La mayoría de las formulaciones de liberación controlada se diseñan para liberar inicialmente una cantidad de fármaco (principio activo) que produce rápidamente el efecto terapéutico deseado, y liberar gradual y continuamente otras cantidades de fármaco para mantener este nivel de efecto terapéutico o profiláctico durante un periodo de tiempo prolongado. Para mantener este nivel constante de fármaco en el cuerpo, el fármaco debe liberarse de la forma de dosificación a una velocidad que sustituirá la cantidad de fármaco que se metaboliza y se excreta del cuerpo. La liberación controlada de un principio activo puede estimularse mediante diversas condiciones que incluyen, pero no se limitan a, pH, fuerza iónica, presión osmótica, temperatura, enzimas, agua y otras condiciones fisiológicas o compuestos.

Una variedad de formas de dosificación, formulaciones y dispositivos de liberación controlada o prolongada conocidos se pueden adaptar para su uso con las sales y composiciones de la divulgación. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en los documentos de Patente U.S. Pat. Nos.: 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,63 9,476; 5,354,556; 5,733,566; y 6,365,185 B1. Estas formas de dosificación pueden usarse para proporcionar una liberación lenta o controlada de uno o más principios activos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa, otras matrices poliméricas, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos (tales como OROS® (Alza Corporation, Mountain View, Calif, USA)), o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables.

En una realización de la molécula quimérica o composición que comprende la molécula quimérica para su uso en un método para el tratamiento contra el cáncer, el método puede comprender además administrar un segundo agente y/o tratamiento al sujeto, por ejemplo, como parte de una terapia combinatoria. Los ejemplos no limitantes de un segundo agente y/o tratamiento pueden incluir radioterapia, cirugía, gemcitabina, cisplastino, paclitaxel, carboplatino, bortezomib, AMG479, vorinostat, rituximab, temozolomida, rapamicina, ABT-737, PI-103; agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietiilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, predinimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enedinos (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma11 y caliqueamicina omegaI1 (véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; tal como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos enedinos de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICIN® doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcellomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostaronona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; moridanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; Complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenúazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® Paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® formulación de nanopartículas de paclitaxel modificada genéticamente con albúmina, libre de Cremofor (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL) y TAXOTERE® doxetaxel (RhonePoulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; GEMZAR® gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE™, vinorelbina; novantrona; teniposide; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11) (incluyendo el régimen de tratamiento de irinotecán con 5-FU y leucovorina); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatino, incluyendo el régimen de tratamiento de oxaliplatino (FOLFOX); Lapatinib (Tykerb™); inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva®) y VEGF-A que reducen la proliferación celular y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de uno cualquiera de los anteriores.

Además, los métodos de tratamiento pueden incluir además el uso de radiación o radioterapia. Además, los métodos de tratamiento pueden incluir además el uso de tratamientos quirúrgicos.

En algunas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, una molécula quimérica como se describe en la presente memoria puede administrarse en combinación con un taxano (por ejemplo, docetaxel o paclitaxel). En algunas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, una molécula quimérica como se describe en la presente memoria puede administrarse en combinación con paclitaxel. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, una AsiC como se describe en la presente memoria puede administrarse en combinación con un taxano. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los aspectos descritos en la presente memoria, una AsiC como se describe en la presente memoria puede administrarse en combinación con paclitaxel.

En determinadas realizaciones, una dosis eficaz de una composición como se describe en la presente memoria puede administrarse a un paciente una vez. En determinadas realizaciones, una dosis eficaz de una composición puede administrarse a un paciente repetidamente. Para la administración sistémica, a los sujetos se les puede administrar una cantidad terapéutica de una composición que comprende tal como, por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg o más.

En algunas realizaciones, después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse de manera menos frecuente. Por ejemplo, después del tratamiento cada dos semanas durante tres meses, el tratamiento puede repetirse una vez al mes, durante seis meses o un año o más. El tratamiento según los métodos descritos en la presente memoria puede reducir los niveles de un marcador o síntoma de una afección, por ejemplo, en al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % o más.

La dosificación de una composición tal y como se describe en la presente memoria puede ser determinada por un médico y ajustada, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Con respecto a la duración y frecuencia del tratamiento, es típico para los médicos expertos monitorizar sujetos para determinar cuándo el tratamiento está proporcionando beneficio terapéutico, y determinar si aumentar o disminuir la dosificación, aumentar o disminuir la frecuencia de administración, interrumpir el tratamiento, reanudar el tratamiento, o realizar otras alteraciones en el régimen de tratamiento. El programa de dosificación puede variar de una vez a la semana a diariamente dependiendo de varios factores clínicos, tales como la sensibilidad del sujeto a la composición. La dosificación o cantidad de activación deseada se puede administrar de una vez o dividirse en subdosis, por ejemplo, 2-4 subdosis y administrarse durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a intervalos apropiados a lo largo del día u otro programa apropiado. En algunas realizaciones, la administración puede ser crónica, por ejemplo, una o más dosis y/o tratamientos diarios durante un período de semanas o meses. Los ejemplos de programas de dosificación y/o tratamiento son la administración diaria, dos veces al día, tres veces al día o cuatro o más veces al día durante un período de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses o más. Una composición puede administrarse durante un período de tiempo, tal como durante un período de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos o 25 minutos.

Por conveniencia, el significado de algunos términos y frases usados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas, se proporcionan a continuación. A menos que se indique lo contrario, o esté implícito en el contexto, los siguientes términos y frases incluyen los significados proporcionados a continuación. Las definiciones se proporcionan para ayudar a describir realizaciones particulares, y no pretenden limitar la invención reivindicada, porque el alcance de la invención está limitado solo por las reivindicaciones. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Si hay una discrepancia aparente entre el uso de un término en la técnica y su definición proporcionada en la presente memoria, prevalecerá la definición proporcionada dentro de la memoria descriptiva.

Por conveniencia, determinados términos empleados en la presente memoria, en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se recogen en la presente memoria.

Los términos "disminuir", "reducido", "reducción" o "inhibir" se usan todos en la presente memoria para significar una disminución de una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, "reducir", "reducción" o "disminuir" o "inhibir" significa típicamente una disminución de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia (por ejemplo, la ausencia de un tratamiento dado) y puede incluir, por ejemplo, una disminución de al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o más. Tal y como se usa en la presente memoria, "reducción" o "inhibición" no abarca una inhibición o reducción completa en comparación con un nivel de referencia. La "inhibición completa" es una inhibición del 100 % en comparación con un nivel de referencia. Una disminución puede ser preferiblemente hasta un nivel aceptado dentro del intervalo de normalidad para un individuo sin un trastorno dado.

Los términos "aumentado", "aumentar", "potenciar" o "activar" se usan todos en la presente memoria para significar un aumento de una cantidad estáticamente significativa. En algunas realizaciones, los términos "aumentado", "aumentar", "potenciar" o "activar" pueden significar un aumento de al menos el 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un aumento de al menos aproximadamente el 20 %, o al menos aproximadamente el 30 %, o al menos aproximadamente el 40 %, o al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 60 %, o al menos aproximadamente el 70 %, o al menos aproximadamente el 80 %, o al menos aproximadamente el 90 % o hasta e incluyendo un 100 % de aumento o cualquier aumento entre el 10-100 % en comparación con un nivel de referencia, o al menos aproximadamente unas 2 veces, o al menos aproximadamente unas 3 veces, o al menos aproximadamente unas 4 veces, o al menos aproximadamente unas 5 veces o al menos aproximadamente un aumento de 10 veces, o cualquier aumento entre 2 veces y 10 veces o más en comparación con un nivel de referencia.

En el contexto de un marcador o síntoma, un "aumento" es un aumento estadísticamente significativo en dicho nivel.

Tal y como se usa en la presente memoria, un "sujeto" significa un ser humano o animal. Normalmente, el animal es un vertebrado tal como un primate, roedor, animal doméstico o animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cinomólogos, monos araña y macacos, por ejemplo, Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervo, bisonte, búfalos, especies felinas, por ejemplo, gato doméstico, especies caninas, por ejemplo, perro, zorro, lobo, especies aviares, por ejemplo, pollo, emú, avestruz y peces, por ejemplo, trucha, pez gato y salmón. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano. Los términos "individuo", "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente en la presente memoria.

Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca, pero no se limita a estos ejemplos. Los mamíferos distintos de los humanos pueden usarse ventajosamente como sujetos que representan modelos animales de cáncer. Un sujeto puede ser hombre o mujer.

Un sujeto puede ser uno que ha sido diagnosticado previamente con o identificado como que padece o que tiene una afección que necesita tratamiento (por ejemplo, cáncer) o una o más complicaciones relacionadas con dicha afección, y opcionalmente, ya ha experimentado tratamiento para el cáncer o la una o más complicaciones relacionadas con el cáncer. Alternativamente, un sujeto también puede ser uno que no ha sido diagnosticado previamente como que tiene cáncer o una o más complicaciones relacionadas con el cáncer. Por ejemplo, un sujeto puede ser uno que muestre uno o más factores de riesgo para el cáncer o una o más complicaciones relacionadas con el cáncer o un sujeto que no muestre factores de riesgo.

Un "sujeto que necesita" de tratamiento para una afección particular puede ser un sujeto que tiene esa afección, diagnosticado como que tiene esa afección, o en riesgo de desarrollar esa afección.

Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente memoria para designar una serie de restos de aminoácidos, conectados entre sí mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de restos adyacentes. Los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a un polímero de aminoácidos, incluyendo aminoácidos modificados (por ejemplo, fosforilados, glicados, glicosilados, etc.) y análogos de aminoácidos, independientemente de su tamaño o función. "Proteína" y "polipéptido" se usan a menudo en referencia a polipéptidos relativamente grandes, mientras que el término "péptido" se usa a menudo en referencia a polipéptidos pequeños, pero el uso de estos términos en la técnica se solapa. Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente memoria cuando se refieren a un producto génico y fragmentos del mismo. Por lo tanto, los polipéptidos o proteínas ejemplares incluyen productos génicos, proteínas de origen natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes, fragmentos y análogos de los anteriores.

Como se usa en la presente memoria, el término "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula, preferiblemente una molécula polimérica, que incorpora unidades de ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico o un análogo de los mismos. El ácido nucleico puede ser tanto monocatenario como bicatenario.

Un ácido nucleico monocatenario puede ser una cadena de ácido nucleico de un DNA bicatenario desnaturalizado.

Alternativamente, puede ser un ácido nucleico monocatenario no derivado de ningún DNA bicatenario. En un aspecto, el ácido nucleico puede ser DNA. En otro aspecto, el ácido nucleico puede ser RNA. Las moléculas de ácido nucleico adecuadas son DNA, incluyendo DNA genómico o cDNA. Otras moléculas de ácido nucleico adecuadas son RNA, incluyendo mRNA.

Los inhibidores de la expresión de un gen dado pueden ser un ácido nucleico inhibidor u oligonucleótido inhibidor. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor es un RNA inhibidor (iRNA). En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor es un DNA inhibidor (iDNA). Se ha demostrado que las moléculas de RNA bicatenario (dsRNA) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como RNA de interferencia (RNAi). Los ácidos nucleicos inhibidores descritos en la presente memoria pueden incluir una cadena de RNA o DNA (la cadena antisentido) que tiene una región que tiene 30 nucleótidos o menos de longitud, es decir, 8-30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, región que es sustancialmente complementaria a al menos parte de una forma precursora o madura de un transcrito de un gen objetivo. El uso de estos oligonucleótidos inhibidores permite la degradación dirigida del gen objetivo, dando como resultado una expresión y/o actividad disminuidas del gen objetivo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "oligonucleótido inhibidor", "ácido nucleico inhibidor" o "oligonucleótido antisentido" (ASO) se refiere a un agente que contiene un oligonucleótido, por ejemplo, una molécula de DNA o RNA que media la escisión dirigida de un transcrito de RNA. En una realización, un oligonucleótido inhibidor tal y como se describe en la presente memoria efectúa la inhibición de la expresión y/o actividad de un gen objetivo. Los ácidos nucleicos inhibidores útiles en los presentes métodos y composiciones incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de RNA de interferencia monocatenario o bicatenario (RNAi) tales como compuestos de siRNA, bases modificadas/ácidos nucleicos bloqueados (LNAs), antagomirs, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) y otros compuestos oligoméricos o miméticos de oligonucleótidos que hibridan con al menos una porción del ácido nucleico objetivo y modulan su función. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos inhibidores incluyen RNA antisentido, DNA antisentido, oligonucleótidos antisentido quiméricos, oligonucleótidos antisentido que comprenden enlaces modificados, RNA de interferencia (RNAi), RNA de interferencia corto (siRNA); un micro, RNA de interferencia (miRNA); un RNA pequeño temporal (stRNA); o un RNA en horquilla corto (shRNA); activación génica inducida por RNA pequeño (RNAa); RNAs de activación pequeño (saRNAs), o combinaciones de los mismos. Para una descripción adicional con respecto a los ácidos nucleicos inhibidores, véase por favor los documentos de Patente US2010/0317718 (oligos antisentido); US2010/0249052 (ácido ribonucleico bicatenario (dsRNA)); US2009/0181914 y US2010/0234451 (LNAs); US2007/0191294 (análogos de siRNA); US2008/0249039 (siRNA modificado); y WO2010/129746 y WO2010/040112 (ácidos nucleicos inhibidores).

En determinadas realizaciones, poner en contacto una célula con el inhibidor (por ejemplo, un oligonucleótido inhibidor) da como resultado una disminución en el nivel de RNA objetivo en una célula en al menos aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 99%, hasta e incluyendo el 100% del nivel de mRNA objetivo encontrado en la célula sin la presencia del oligonucleótido inhibidor.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "iRNA" se refiere a un agente que contiene RNA como ese término se define en la presente memoria, y que media la escisión dirigida de un transcrito de RNA a través de una vía del complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). En una realización, un iRNA tal y como se describe en la presente memoria efectúa la inhibición de la expresión y/o actividad del gen objetivo. En un aspecto, un agente de RNA de interferencia incluye un RNA monocatenario que interacciona con una secuencia de RNA objetivo para dirigir la escisión del RNA objetivo. Sin desear estar ligado por la teoría, el RNA bicatenario largo introducido en células vegetales y de invertebrados se descompone en siRNA mediante una endonucleasa de tipo III conocida como Dicer (Sharp et al, Genes Dev. 2001, 15:485). Dicer, una enzima similar a ribonucleasa-NI, procesa el dsRNA en RNAs de interferencia cortos de 19-23 pares de bases con salientes característicos de dos bases en 3’ (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Los siRNAs se incorporan después en un complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) en donde una o más helicasas desenrollan el dúplex de siRNA, permitiendo que la cadena antisentido complementaria guíe el reconocimiento del objetivo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Tras la unión al mRNA objetivo apropiado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden el objetivo para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Por lo tanto, en un aspecto, un agente de RNA de interferencia se refiere a un RNA bicatenario que promueve la formación de un complejo RISC que comprende una única cadena de RNA que guía el complejo para la escisión en la región objetivo de un transcrito objetivo para efectuar el silenciamiento del gen objetivo.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido inhibidor puede ser un ácido nucleico bicatenario (por ejemplo, un dsRNA). Un ácido nucleico bicatenario incluye dos cadenas de ácido nucleico que son suficientemente complementarias para hibridarse para formar una estructura dúplex en condiciones en las que se usará el ácido nucleico bicatenario. Una cadena de un ácido nucleico bicatenario (la cadena antisentido) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria, y generalmente totalmente complementaria, a una secuencia objetivo. La secuencia objetivo puede derivarse de la secuencia de un mRNA y/o el miRNA maduro formado durante la expresión del gen objetivo. La otra cadena (la cadena sentido) incluye una región que es complementaria a la cadena antisentido, de manera que las dos cadenas se hibridan y forman una estructura dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. Generalmente, la estructura dúplex tiene entre 8 y 30 inclusive, más generalmente entre 18 y 25 inclusive, aún más generalmente entre 19 y 24 inclusive, y lo más generalmente entre 19 y 21 pares de bases de longitud, inclusive. De manera similar, la región de complementariedad con la secuencia objetivo tiene entre 8 y 30 inclusive, más generalmente entre 18 y 25 inclusive, aún más generalmente entre 19 y 24 inclusive, y lo más generalmente entre 19 y 21 nucleótidos de longitud, inclusive. En algunas realizaciones, el dsRNA tiene entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, inclusive, y en otras realizaciones, el dsRNA tiene entre 25 y 30 nucleótidos de longitud, inclusive. Como reconocerá el experto habitual, la región objetivo de un RNA objetivo para la escisión será lo más a menudo parte de una molécula de RNA más grande, a menudo una molécula de mRNA. Cuando sea relevante, una "parte" de un mRNA y/o miRNA objetivo es una secuencia contigua de un mRNA objetivo de longitud suficiente para ser un sustrato para la escisión dirigida antisentido (por ejemplo, escisión a través de una vía de RISC). Los ácidos nucleicos bicatenarios que tienen dúplex tan cortos como 8 pares de bases pueden, en algunas circunstancias, mediar la escisión de RNA dirigida antisentido. Lo más a menudo, un objetivo tendrá al menos 15 nucleótidos de longitud, preferiblemente 15-30 nucleótidos de longitud.

Un experto en la técnica también reconocerá que la región dúplex es una porción funcional principal de un ácido nucleico inhibidor bicatenario, por ejemplo, una región dúplex de 8 a 36, por ejemplo, 15-30 pares de bases. Por lo tanto, en una realización, hasta el punto de que se procese para dar un dúplex funcional de, por ejemplo, 15-30 pares de bases que se dirige a un RNA deseado para la escisión, una molécula de ácido nucleico inhibidor o complejo de moléculas de ácido nucleico inhibidor que tienen una región dúplex mayor de 30 pares de bases es un ácido nucleico bicatenario. Por lo tanto, un experto en la materia reconocerá que en una realización, después, un miRNA es un dsRNA. En otra realización, un dsRNA no es un miRNA de origen natural. En otra realización, un agente de ácido nucleico inhibidor útil para dirigir la expresión del gen objetivo no se genera en la célula objetivo mediante la escisión de una molécula de ácido nucleico bicatenario más grande.

Aunque una secuencia objetivo tiene generalmente una longitud de 15-30 nucleótidos, existe una amplia variación en la idoneidad de secuencias particulares en este intervalo para dirigir la escisión de cualquier RNA objetivo dado. Cuando miRNAs están dirigidos, la secuencia objetivo puede ser tan corta como 8 nucleótidos, incluyendo la región "semilla" (por ejemplo, 2-8 nucleótidos)). Diversos paquetes de software y las directrices expuestas en la presente memoria proporcionan la guía para la identificación de secuencias objetivo óptimas para cualquier objetivo génico dado, pero también puede tomarse un enfoque empírico en donde una "ventana" o "máscara" de un tamaño dado (como ejemplo no limitante, 21 nucleótidos) se coloca literalmente o figurativamente (incluyendo, por ejemplo, in silico) en la secuencia de RNA objetivo para identificar secuencias en el intervalo de tamaño que pueden servir como secuencias objetivo. Moviendo la "ventana" de secuencia progresivamente un nucleótido anterior o posterior de una localización inicial de la secuencia objetivo, se puede identificar la siguiente secuencia objetivo potencial, hasta que se identifica el conjunto completo de posibles secuencias para cualquier tamaño objetivo seleccionado. Este proceso, acoplado con la síntesis sistemática y el ensayo de las secuencias identificadas (usando ensayos como se describe en la presente memoria o como se conoce en la técnica) para identificar aquellas secuencias que se realizan óptimamente puede identificar aquellas secuencias de RNA que, cuando se dirigen con un agente de ácido nucleico inhibidor, median la mejor inhibición de la expresión del gen objetivo.

Un ácido nucleico inhibidor bicatenario como se describe en la presente memoria puede incluir además uno o más salientes de nucleótidos monocatenarios. El ácido nucleico inhibidor bicatenario puede sintetizarse mediante métodos estándar conocidos en la técnica como se analiza adicionalmente más adelante, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de DNA automatizado, tal como están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. En una realización, la cadena antisentido de un ácido nucleico inhibidor bicatenario tiene un saliente de 1-10 nucleótidos en el extremo 3'-terminal y/o el extremo 5'-terminal. En una realización, la cadena sentido de un ácido nucleico inhibidor bicatenario tiene un saliente de 1-10 nucleótidos en el extremo 3'-terminal y/o el extremo 5'-terminal. En una realización, al menos un extremo de un ácido nucleico inhibidor bicatenario tiene un saliente de nucleótidos monocatenario de 1 a 4, generalmente 1 o 2 nucleótidos. Los ácidos nucleicos inhibidores bicatenarios que tienen al menos un saliente de nucleótido tienen propiedades inhibidoras inesperadamente superiores con respecto a sus homólogos de extremos romos.

En otra realización, uno o más de los nucleótidos en el saliente se sustituye con un nucleósido tiofosfato.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "saliente de nucleótido" se refiere a al menos un nucleótido no emparejado que sobresale de la estructura dúplex de un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un dsRNA. Por ejemplo, cuando un extremo 3'-terminal de una cadena de un ácido nucleico inhibidor bicatenario se extiende más allá del extremo 5'-terminal de la otra cadena, o viceversa, existe un saliente de nucleótido. Un ácido nucleico inhibidor bicatenario puede comprender un saliente de al menos un nucleótido; alternativamente, el saliente puede comprender al menos dos nucleótidos, al menos tres nucleótidos, al menos cuatro nucleótidos, al menos cinco nucleótidos o más. Un saliente de nucleótido puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, incluyendo un desoxinucleótido/nucleósido. El saliente(s) puede estar en la cadena sentido, la cadena antisentido o cualquier combinación de las mismas. Además, el nucleótido(s) de un saliente puede estar presente en el extremo 5'-terminal, el extremo 3'-terminal o ambos extremos tanto de una cadena antisentido como sentido de un ácido nucleico inhibidor bicatenario.

Los términos "romo" o "extremo romo" tal y como se usan en la presente memoria con respecto a un ácido nucleico inhibidor bicatenario significan que no hay nucleótidos no emparejados o análogos de nucleótidos en un extremo terminal dado de un dsRNA, es decir, sin saliente de nucleótidos. Uno o ambos extremos de un ácido nucleico inhibidor bicatenario pueden ser romos. Cuando ambos extremos de un ácido nucleico inhibidor bicatenario son romos, se dice que el ácido nucleico inhibidor bicatenario es de extremos romos. Para ser claro, un ácido nucleico inhibidor bicatenario de "extremos romos" es un ácido nucleico inhibidor bicatenario que está romo en ambos extremos, es decir, sin saliente de nucleótidos en ningún extremo de la molécula. Lo más a menudo, dicha molécula será bicatenaria en toda su longitud.

En este aspecto, una de las dos cadenas es complementaria a la otra de las dos cadenas, siendo una de las cadenas sustancialmente complementaria a una secuencia de un precursor del gen objetivo o miRNA maduro. Como tal, en este aspecto, un ácido nucleico inhibidor bicatenario incluirá dos oligonucleótidos, donde un oligonucleótido se describe como la cadena sentido y el segundo oligonucleótido se describe como la cadena antisentido correspondiente de la cadena sentido. Como se describe en otra parte en la presente memoria y como se conoce en la técnica, las secuencias complementarias de un ácido nucleico inhibidor bicatenario también pueden estar contenidas como regiones auto-complementarias de una única molécula de ácido nucleico, en lugar de estar en oligonucleótidos separados.

El experto en la materia sabe bien que el ácido nucleico inhibidor que tiene una estructura duplex de entre 20 y 23, pero específicamente 21, pares de bases se ha proclamado como particularmente eficaz en la inducción de inhibición mediada por antisentido (Elbashir et al., EMBO 2001, 20: 6877-6888).). Sin embargo, otros han encontrado que los ácidos nucleicos inhibidores más cortos o más largos también pueden ser eficaces.

Además, se contempla que para cualquier secuencia identificada, podría conseguirse una optimización adicional añadiendo o retirando sistemáticamente nucleótidos para generar secuencias más largas o más cortas y ensayando aquellas secuencias generadas al recorrer una ventana del tamaño más largo o más corto hacia arriba o hacia abajo del RNA objetivo desde ese punto. De nuevo, acoplar este enfoque para generar nuevos objetivos candidatos con el ensayo de la eficacia de los ácidos nucleicos inhibidores basándose en esas secuencias objetivo en un ensayo de inhibición tal y como se conoce en la técnica o como se describe en la presente memoria puede conducir a mejoras adicionales en la eficacia de inhibición. Además, dichas secuencias optimizadas pueden ajustarse mediante, por ejemplo, la introducción de nucleótidos modificados tal y como se describe en la presente memoria o tal y como se conoce en la técnica, la adición o los cambios en el saliente, u otras modificaciones tal y como se conoce en la técnica y/o se discuten en la presente memoria para optimizar más la molécula (por ejemplo, aumentando la estabilidad sérica o la semivida circulante, aumentando la estabilidad térmica, potenciando el suministro transmembrana, dirigiéndose a una localización o tipo celular particular, aumentando la interacción con enzimas de la vía de silenciamiento, aumentando la liberación de endosomas, etc.) como inhibidor de la expresión.

Un ácido nucleico inhibidor como se describe en la presente memoria puede contener uno o más emparejamientos erróneos para la secuencia objetivo. En una realización, un ácido nucleico inhibidor como se describe en la presente memoria no contiene más de 3 emparejamientos erróneos. Si la cadena antisentido del ácido nucleico inhibidor contiene emparejamientos erróneos con una secuencia objetivo, es preferible que el área de emparejamientos erróneos no esté localizada en el centro de la región de complementariedad. Si la cadena antisentido del ácido nucleico inhibidor contiene emparejamientos erróneos con la secuencia objetivo, es preferible que el emparejamiento erróneo esté restringido para estar dentro de los últimos 5 nucleótidos desde el extremo 5' o 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una cadena del agente del ácido nucleico inhibidor de 23 nucleótidos que es complementaria a una región del gen objetivo o un precursor del mismo, la cadena generalmente no contiene ningún emparejamiento erróneo dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos en la presente memoria o los métodos conocidos en la técnica pueden usarse para determinar si un ácido nucleico inhibidor que contiene un emparejamiento erróneo con una secuencia objetivo es eficaz para inhibir la expresión del gen objetivo. La consideración de la eficacia de los ácidos nucleicos inhibidores con emparejamientos erróneos en la inhibición de la expresión del gen objetivo es importante, especialmente si se sabe que la región particular de complementariedad en el gen objetivo tiene variación de secuencia polimórfica dentro de la población.

En otra realización más, el ácido nucleico de un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un dsRNA, se modifica químicamente para potenciar la estabilidad u otras características beneficiosas. Los ácidos nucleicos presentados en la invención pueden sintetizarse y/o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, USA. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, (a) modificaciones de los extremos, por ejemplo, modificaciones en los extremos 5'-terminales (fosforilación, conjugación, enlaces invertidos, etc.) modificaciones en los extremos 3'-terminales (conjugación, nucleótidos de DNA, enlaces invertidos, etc.), (b) modificaciones de las bases, por ejemplo, sustitución con bases estabilizantes, bases desestabilizantes o bases que emparejan bases con un repertorio expandido de parejas, eliminación de bases (nucleótidos abásicos) o bases conjugadas, (c) modificaciones del azúcar (por ejemplo, en la posición 2' o la posición 4') o sustitución del azúcar, así como (d) modificaciones de la estructura, incluyendo modificación o sustitución de los enlaces fosfodiéster. Los ejemplos específicos de compuestos de ácido nucleico útiles en las realizaciones descritas en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a ácidos nucleicos que contienen estructuras modificadas o sin enlaces internucleosídicos naturales. Los ácidos nucleicos que tienen estructuras modificadas incluyen, entre otros, aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura. Para los fines de esta memoria descriptiva, y como a veces se hace referencia en la técnica, los ácidos nucleicos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal internucleosídica también pueden considerarse oligonucleósidos. En realizaciones particulares, el ácido nucleico modificado tendrá un átomo de fósforo en su estructura internucleosídica.

Las estructuras modificadas pueden incluir, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros fosfonatos de alquilo incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo fosforamidato de 3'-amino y fosforamidatos de aminoalquilo, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos de estos unidos 2'-5' y aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares de unidades de nucleósido adyacentes se unen de 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Los documentos de Patentes representativos de U.S. que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, U.S. Pat. Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6,239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; y US Pat RE39464.

Las estructuras modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras que están formadas por enlaces internucleosídicos alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomos mixtos y enlaces internucleosídicos alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras que contienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenoimino y metilenohidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.

Las documentos de Patente de U.S. representativos que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, U.S. Pat. Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; y, 5,677,439.

En otros miméticos de ácidos nucleicos adecuados o contemplados para su uso en ácidos nucleicos inhibidores, tanto el azúcar como el enlace internucleosídico, es decir, la estructura, de las unidades de nucleótidos se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Uno de dichos compuestos oligoméricos, un mimético de ácido nucleico que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina como un ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos de PNA, la estructura de azúcar de un ácido nucleico se sustituye con una estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina. Las nucleobases se conservan y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura. Los documentos de Patente de U.S. representativos que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a, U.S. Pat. Nos. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262. Pueden encontrarse enseñanzas adicionales de compuestos de PNA, por ejemplo, en Nielsen et al., Science, 1991,254, 1497-1500.

Algunas realizaciones presentadas en la invención incluyen ácidos nucleicos con estructuras de fosforotioato y oligonucleósidos con estructuras de heteroátomos, y en particular -CH2-NH-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[conocido como metileno (metilimino) o estructura MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-C<h>2- y -N(CH3)-CH2-CH2-[en donde la estructura nativa de fosfodiéster está representada como -O-P-O-CH2-] de la referencia anterior del documento de Patente U.S. Pat. No. 5,489,677 y las estructuras de amida de los anteriormente mencionados documentos de Patente U.S. Pat. No. 5,602,240. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos inhibidores presentados en la presente memoria tienen estructuras de esqueleto de morfolino de los documentos de Patente mencionados anteriormente U.S. Pat. No. 5,034,506.

Los ácidos nucleicos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ácidos nucleicos inhibidores presentados en la presente memoria pueden incluir uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de C1 a C10 o alquenilo y alquinilo de C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Las modificaciones adecuadas ejemplares incluyen O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otras realizaciones, los dsRNA incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior de C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de RNA, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ácido nucleico inhibidor, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ácido nucleico inhibidor, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunas realizaciones, la modificación incluye un 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación ejemplar es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos más adelante en la presente memoria, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2, también descrito en los ejemplos más adelante en la presente memoria.

Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones en el ácido nucleico de un ácido nucleico inhibidor, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en dsRNAs unidos en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los ácidos nucleicos inhibidores también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Los documentos de Patente de U.S. representativos que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, U.S. Pat. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920, algunas de las cuales son propiedad común de la presente solicitud.

Un ácido nucleico inhibidor también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente como "base"). Tal y como se usa en la presente memoria, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2- tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-daazaadenina y 3-desazaguanina y 3- desazaadenina. Otras nucleobases incluyen las descritas en el documento de Patente U.S. Pat. No. 3,687,808, las descritas en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Chem. Wiley-VCH, 2008; las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. Chem. John Wiley & Sons, 1990, las descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y las descritas por Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos presentados en la invención. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278) y son sustituciones de bases ejemplares, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2'-O-metoxietilo.

Los documentos de Patente de U.S. representativos que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero no se limitan a, las indicadas anteriormente en el documento de Patente U.S. Pat. No. 3,687,808, así como los documentos de Patente U.S. Pat. Nos. 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; y 7,495,088 y U.S. Pat. No. 5,750,692.

El ácido nucleico de un ácido nucleico inhibidor también puede modificarse para incluir uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene un resto de ribosa modificado en donde el resto de ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. Esta estructura "bloquea" eficazmente la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha demostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los siRNAs aumenta la estabilidad del siRNA en suero y reduce los efectos fuera del objetivo (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12):3185-3193).

Los documentos de Patente de U.S. representativos que enseñan la preparación de nucleótidos de ácido nucleico bloqueados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: U.S. Pat. Nos. 6,268,490; 6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; y 7,399,845.

Otra modificación del ácido nucleico de un ácido nucleico inhibidor presentado en la invención implica unir químicamente al ácido nucleico uno o más ligandos, restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular, propiedades farmacocinéticas o absorción celular del ácido nucleico inhibidor. Dichos restos incluyen, pero no se limitan a, restos lipídicos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), un tioéter, por ejemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533-538), una cadena alifática, por ejemplo dodecanodiol o restos undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FE<b>S Lett., 1990, 259:327-330; Visnarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecilrac-glicerol o trietil-amonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777-3783), una cadena de poliamina o de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), o ácido adamantano acetico (Manoharan al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), o un resto octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).

En una realización, un ligando altera la distribución, dirección o vida útil de un agente de ácido nucleico inhibidor en donde se incorpora. En realizaciones preferidas, un ligando proporciona una afinidad potenciada por un objetivo seleccionado, por ejemplo, molécula, célula o tipo celular, compartimento, por ejemplo, un compartimento celular u de órgano, tejido, órgano o región del cuerpo, tal como, por ejemplo, en comparación con una especie en donde no existe dicho ligando. Los ligandos preferidos no participarán en el emparejamiento dúplex en un ácido nucleico duplex.

Los ligandos pueden incluir una sustancia de origen natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL) o globulina); carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen polilisina (PLL), ácido poli L aspártico, ácido poli L glutámico, copolímero de estirenoanhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicolada), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, dendrímero poliamina, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa helicoidal.

Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, por ejemplo, un agente de direccionamiento celular o tisular, por ejemplo, una lectina, glucoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico tal como un hepatocito o un macrófago, entre otros. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A tensioactiva, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina o un péptido RGD o mimético de péptido RGD.

Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes intercalantes (por ejemplo acridinas), reticuladores (por ejemplo psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, sapfirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (por ejemplo, EDTA), moléculas lipófilas, por ejemplo colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O-(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo, o fenoxazina y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores del transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, grupos imidazol, conjugados acridina-imidazol, complejos de Eu3+ de tetraazamacrocycles), dinitrofenilo, HRP o AP

Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas, o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico tal como un hepatocito o macrófago. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente o fucosa multivalente.

El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la absorción del agente de ácido nucleico inhibidor en la célula, por ejemplo, alterando el citoesqueleto de la célula, por ejemplo, alterando los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.

En algunas realizaciones, un ligando unido a un ácido nucleico inhibidor tal y como se describe en la presente memoria actúa como un modulador farmacocinético (PK). Tal y como se usa en la presente memoria, un "modulador PK" se refiere a un modulador farmacocinético. Los moduladores PK incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteías, PEG, vitaminas, etc. Los moduladores PK ejemplares incluyen, pero no se limitan a, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilgliceridos, diacilgliceridos, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También se sabe que los oligonucleótidos que comprenden varios enlaces fosforotioato se unen a la proteína del suero, por tanto, los oligonucleótidos cortos, por ejemplo, oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples enlaces fosforotioato en la estructura también son susceptibles a la presente invención como ligandos (por ejemplo, como ligandos moduladores PK). Además, los aptámeros que se unen a componentes séricos (por ejemplo, proteínas del suero) también son adecuados para su uso como ligandos moduladores PK en las realizaciones descritas en la presente memoria.

Para fármacos macromoleculares y moléculas de fármaco hidrófilas, que no pueden atravesar fácilmente las membranas de bicapa, se cree que el atrapamiento en compartimentos endosomales/lisosomales de la célula es el mayor obstáculo para la administración eficaz a su sitio de acción. Se han ideado varios enfoques y estrategias para abordar este problema. Para formulaciones liposomales, el uso de lípidos fusogénicos en la formulación ha sido el enfoque más común (Singh, R. S., Goncalves, C. et al. (2004). On the Gene Delivery Efficacies of pH-Sensitive Cationic Lipids via Endosomal Protonation. A Chemical Biology Investigation. Chem. Biol. 11, 713-723.). Otros componentes, que muestran actividad endosomolítica sensible al pH a través de protonación y/o cambios conformacionales inducidos por el pH, incluyen polímeros y péptidos cargados. Se pueden encontrar ejemplos en Hoffman, A. S., Stayton, P. S. et al. (2002). Design of “Smart” polymers that can direct intracelular drug delivery. Polymers Adv. Technol. 13, 992 999; Kakudo, Chaki, T., S. et al. (2004). Transferrin-Modified Liposomes Equipped with a pH-Sensitive Fusogenic Peptide: An Artificial Viral-like Delivery System. Biochemistry 436, 5618-5628; Yesine, M. A. and Leroux, J. C. (2004). Membrane-destabilizing polyanions: interaction with lipid bilayers and endosomal escape of biomacromolecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 999-1021; Oliveira, S., van Rooy, I. et al. (2007). Fusogenic peptides enhance endosomal escape improving inhibitory nucleic acid-induced silencing of oncogenes. Int. J. Pharm. 331, 211-4. Generalmente se han usado en el contexto de sistemas de administración de fármacos, tales como liposomas o lipoplejos. Para la administración mediada por receptor de folato usando formulaciones liposomales, por ejemplo, se ha incorporado un péptido fusogénico sensible al pH en los liposomas y se ha demostrado que potencia la actividad a través de la mejora de la descarga del fármaco durante el proceso de absorción (Turk, M. J., Reddy, J. A. et al. (2002). La caracterización de un nuevo péptido sensible al pH que potencia la liberación del fármaco a partir de liposomas dirigidos a folato a pHs endosomales se describe en Biochim. Biophys. Acta 1559, 56-68).

En determinadas realizaciones, los componentes endosomolíticos pueden ser péptidos polianiónicos o peptidomiméticos que muestran una actividad de membrana dependiente del pH y/o fusogenicidad. Un peptidomimético puede ser una cadena similar a una proteína pequeña diseñada para imitar un péptido. Un peptidomimético puede surgir de la modificación de un péptido existente con el fin de alterar las propiedades de la molécula, o la síntesis de una molécula similar a un péptido usando aminoácidos no naturales o sus análogos. En determinadas realizaciones, tienen estabilidad y/o actividad biológica mejoradas cuando se comparan con un péptido. En determinadas realizaciones, el componente endosomolítico asume su conformación activa a un pH endosomal (por ejemplo, pH 5-6). La conformación "activa" es aquella conformación en donde el componente endosomolítico promueve la lisis del endosoma y/o el transporte de la composición modular de la invención, o cualquiera de sus componentes (por ejemplo, un ácido nucleico), desde el endosoma al citoplasma de la célula.

Los componentes endosomolíticos ejemplares incluyen el péptido GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), el péptido EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586), y sus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). En determinadas realizaciones, el componente endosomolítico puede contener un grupo químico (por ejemplo, un aminoácido) que sufrirá un cambio en la carga o protonación en respuesta a un cambio en el pH. El componente endosomolítico puede ser lineal o ramificado. Las secuencias primarias ejemplares de componentes endosomollíticos incluyen H2N-(AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC)-CO2H (SEQ ID NO: 16); H2N-(AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC)-CO2H (SEQ ID NO: 17); y H2N-(ALEALAEALEALAEA)-CONH2 (SEQ ID NO: 18).

En determinadas realizaciones, se puede incorporar más de un componente endosomolítico en el agente de ácido nucleico inhibidor de la invención. En algunas realizaciones, esto implicará incorporar más de uno del mismo componente endosomolítico en el agente de ácido nucleico inhibidor. En otras realizaciones, esto implicará incorporar dos o más componentes endosomollíticos diferentes en un agente de ácido nucleico inhibidor.

Estos componentes endosomoléticos pueden mediar en el escape endosomal, por ejemplo, cambiando la conformación al pH endosomal. En determinadas realizaciones, los componentes endosomolíticos pueden existir en una conformación de bobina aleatoria a pH neutro y reorganizarse en una hélice anfipática a pH endosomal. Como consecuencia de esta transición conformacional, estos péptidos pueden insertarse en la membrana lipídica del endosoma, provocando el escape de los contenidos endosomales en el citoplasma. Debido a que la transición conformacional es dependiente del pH, los componentes endosomolíticos pueden presentar poca o ninguna actividad fusogénica mientras circulan en la sangre (pH ~7,4). “Actividad fusogénica”, como se usa en la presente memoria, se define como aquella actividad que resulta en la alteración de una membrana lipídica por el componente endosomolítico. Un ejemplo de actividad fusogénica es la alteración de la membrana endosomal por el componente endosomolítico, que conduce a lisis endosomal o escape y transporte de uno o más componentes de la composición modular de la invención (por ejemplo, el ácido nucleico) desde el endosoma en el citoplasma.

Los componentes endosomolíticos adecuados pueden ser probados e identificados por un experto en la materia. Por ejemplo, la capacidad de un compuesto para responder a, por ejemplo, cambios de la carga dependiendo del entorno de pH puede ensayarse mediante métodos rutinarios, por ejemplo, en un ensayo celular. En determinadas realizaciones, un compuesto de prueba se combina con o se pone en contacto con una célula, y se deja que la célula internalice el compuesto de prueba, por ejemplo, mediante endocitosis. A continuación, se puede preparar una preparación de endosomas a partir de las células en contacto y la preparación de endosomas en comparación con una preparación de endosomas a partir de células de control. Un cambio, por ejemplo, una disminución, en la fracción de endosomas de la célula en contacto frente a la célula control indica que el compuesto de prueba puede funcionar como un agente fusogénico. Alternativamente, la célula en contacto y la célula de control pueden evaluarse, por ejemplo, mediante microscopía, por ejemplo, mediante microscopía óptica o electrónica, para determinar una diferencia en la población de endosomas en las células. El compuesto de prueba y/o los endosomas pueden marcarse, por ejemplo, para cuantificar el escape endosomal.

En otro tipo de ensayo, un agente de ácido nucleico inhibidor descrito en la presente memoria se construye usando uno o más agentes fusogénicos de prueba o putativos. El agente de ácido nucleico inhibidor puede marcarse para una visualización fácil. La capacidad del componente endosomolítico para promover el escape endosomal, una vez que el agente de ácido nucleico inhibidor es absorbido por la célula, se puede evaluar, por ejemplo, mediante la preparación de una preparación de endosoma, o mediante técnicas de microscopía, que permiten la visualización del agente de ácido nucleico inhibidor marcado en el citoplasma de la célula. En determinadas otras realizaciones, la inhibición de la expresión génica, o cualquier otro parámetro fisiológico, puede usarse como un marcador sustituto para el escape endosomal.

En otras realizaciones, se puede usar espectroscopia de dicroísmo circular para identificar compuestos que muestran una transición estructural dependiente del pH. También se puede realizar un ensayo de dos etapas, en donde un primer ensayo evalúa la capacidad de un compuesto de prueba solo para responder a cambios en el pH, y un segundo ensayo evalúa la capacidad de una composición modular que incluye el compuesto de prueba para responder a cambios en el pH.

En una realización de los aspectos descritos en la presente memoria, un ligando o conjugado es un lípido o molécula basada en lípidos. Dicho lípido o molécula basada en lípidos se une preferiblemente a una proteína sérica, por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido objetivo, por ejemplo, un tejido objetivo no renal del cuerpo. También se pueden usar como ligandos otras moléculas que pueden unirse a HSA. Por ejemplo, puede usarse neproxina o aspirina. Un lípido o ligando basado en lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o el transporte a una célula o membrana celular objetivo, y/o (c) usarse para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo, HSA.

En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación celular helicoidal. Preferiblemente, dicho agente es anfipático. Un agente ejemplar es un péptido tal como tat o antennapedia. Si el agente es un péptido, puede modificarse, incluyendo un peptidilmimético, invertómeros, enlaces no peptídicos o pseudo-peptídicos, y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfa-helicoidal, que tiene preferiblemente una fase lipófila y una lipofóbica.

Los péptidos adecuados para su uso con la presente invención pueden ser un péptido natural, por ejemplo, tat o péptido de antennopedia, un péptido sintético o un peptidomimético. Además, el péptido puede ser un péptido modificado, por ejemplo, el péptido puede comprender enlaces no peptídicos o pseudo-peptídicos y D-aminoácidos. Un peptidomimético (también denominado en la presente memoria oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. La unión de péptidos y peptidomiméticos a agentes de ácido nucleico inhibidor puede afectar a la distribución farmacocinética del ácido nucleico inhibidor, tal como mediante la potenciación del reconocimiento y absorción celular. El resto peptídico o peptidomimético puede tener aproximadamente 5-50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.

Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (por ejemplo, que consiste principalmente en Tyr, Trp o Phe). El resto peptídico puede ser un péptido dendrímero, péptido restringido o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba (MTS). Un péptido que contiene MTS hidrófoba ejemplar es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 19). Un análogo de RfGF (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos ALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 20)) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto de direccionamiento. El resto peptídico puede ser un péptido de "administración", que puede portar grandes moléculas polares incluyendo péptidos, oligonucleótidos y proteínas a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha encontrado que las secuencias de la proteína Tat del HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID No: 21)) y la proteína Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID No: 22)) son capaces de funcionar como péptidos de administración. Un péptido o peptidomimético puede estar codificado por una secuencia aleatoria de DNA, tal como un péptido identificado a partir de una biblioteca de presentación en fagos, o una biblioteca combinatoria de una-perla-un-compuesto (OBOC) (Lam et al, Nature, 354: 82-84, 1991). Preferiblemente, el péptido o peptidomimético anclado a un agente de dsRNA mediante una unidad monomérica incorporada es un péptido dirigido a células tal como un péptido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) o mimético de RGD. Un resto peptídico puede variar en longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos peptídicos pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar la estabilidad o las propiedades conformacionales directas. Se puede utilizar una cualquiera de las modificaciones estructurales descritas a continuación.

Un "péptido de permeación celular" es capaz de permear una célula, por ejemplo, una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido que permea células microbianas puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (por ejemplo, LL-37 o Ceropina P1), un péptido que contiene enlaces disulfuro (por ejemplo, a-defensina, p-defensina o bactenecina), o un péptido que contiene solo uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo, PR-39 o indolicidina). Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS). Por ejemplo, un péptido de permeación celular puede ser un péptido anfipático bipartito, tal como MPG, que se deriva del dominio peptídico de fusión de gp41 de HIV-1 y la NLS del antígeno T grande de SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids. Res. 31: 2717-2724, 2003).

En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de ácido nucleico inhibidores descritos en la presente memoria comprenden además conjugados de carbohidratos. Los conjugados de carbohidratos son ventajosos para la administración in vivo de ácidos nucleicos, así como composiciones adecuadas para uso terapéutico in vivo, como se describe en la presente memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, "carbohidrato" se refiere a un compuesto que es un carbohidrato per se constituido por una o más unidades de monosacárido que tienen al menos 6 átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos) con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono; o un compuesto que tiene como parte del mismo un resto de carbohidrato constituido por una o más unidades de monosacárido que tienen cada una al menos seis átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono. Los carbohidratos representativos incluyen los azúcares (mono-, di-, tri- y oligosacáridos que contienen de aproximadamente 4-9 unidades de monosacárido), y polisacáridos tales como almidones, glucógeno, celulosa y gomas de polisacáridos. Monosacáridos específicos incluyen azúcares de C5 y superiores (preferiblemente C5-C8); di- y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o tres unidades de monosacárido (preferiblemente C5-C8). En algunas realizaciones, el conjugado de carbohidrato comprende además otro ligando tal como, pero sin limitarse a, modulador PK, ligando endosomolítico y péptido de permeación celular.

En algunas realizaciones, los conjugados descritos en la presente memoria pueden unirse al oligonucleótido de ácido nucleico inhibidor con diversos enlazadores que pueden ser escindibles o no escindibles. El término "enlazador" o "grupo enlazante" significa un resto orgánico que conecta dos partes de un compuesto. Los enlazadores comprenden típicamente un enlace directo o un átomo tal como oxígeno o azufre, una unidad tal como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH o una cadena de átomos, tal como, pero sin limitarse a, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquenilo, heteroarilalquinilo, heterociclilalquilo, heterociclilalquenilo, heterociclilalquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilarilalquilo, alquilarilalquenilo, alquilarilalquinilo, alquenilarilalquilo, alquenilarilalquenilo, alquenilarilalquinilo, alquinilarilalquilo, alquinilarilalquenilo, alquinilarilalquinilo, alquilheteroarilalquilo, alquilheteroarilalquenilo, alquilheteroarilalquinilo, alquenilheteroarilalquilo, alquenilheteroarilalquenilo, alquenilheteroarilalquinilo, alquinilheteroarilalquilo, alquinilheteroarilalquenilo, alquinilheteroarilalquinilo, alquilheterociclilalquilo, alquilheterociclilalquenilo, alkylhererocyclylalkynyl alquenilheterociclilalquilo, alquenilheterociclilalquenilo, alquenilheterociclilalquinilo, alquinilheterociclilalquilo, alquinilheterociclilalquenilo, alquinilheterociclilalquinilo, alquilarilo, alquenilarilo, alquinilarilo, alquilheteroarilo, alquenilheteroarilo, alquinilhereroarilo, en donde uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, heterocíclico sustituido o no sustituido; donde R8 es hidrógeno, acilo, alifático o alifático sustituido. En una realización, el enlazador tiene entre 1-24 átomos, preferiblemente 4-24 átomos, preferiblemente 6-18 átomos, más preferiblemente 8-18 átomos, y lo más preferiblemente 8-16 átomos.

Un grupo enlazante escindible es uno que es suficientemente estable fuera de la célula, pero que tras la entrada en una célula objetivo se escinde para liberar las dos partes que el enlazador mantiene unidas. En una realización preferida, el grupo enlazante escindible se escinde al menos 10 veces o más, preferiblemente al menos 100 veces más rápido en la célula objetivo o en una primera condición de referencia (que puede, por ejemplo, seleccionarse para imitar o representar condiciones intracelulares) que en la sangre de un sujeto, o en una segunda condición de referencia (que puede, por ejemplo, seleccionarse para imitar o representar condiciones encontradas en la sangre o suero).

Los grupos enlazantes escindibles son susceptibles a agentes de escisión, por ejemplo, pH, potencial redox o la presencia de moléculas degradativas. Generalmente, los agentes de escisión son más prevalentes o se encuentran a niveles o actividades más altas dentro de las células que en el suero o la sangre. Los ejemplos de dichos agentes degradativos incluyen: agentes redox que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad de sustrato, incluyendo, por ejemplo, enzimas oxidantes o reductoras o agentes reductores tales como mercaptanos, presentes en células, que pueden degradar un grupo enlazante escindible por rédox mediante reducción; esterasas; endosomas o agentes que pueden crear un entorno ácido, por ejemplo, aquellos que dan como resultado un pH de cinco o menor; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo enlazante escindible por ácido actuando como un ácido general, peptidasas (que pueden ser específicas de sustrato) y fosfatasas.

Un grupo enlazante escindible, tal como un enlace disulfuro puede ser susceptible al pH. El pH del suero humano es 7,4, mientras que el pH intracelular promedio es ligeramente inferior, variando de aproximadamente 7,1 -7,3. Los endosomas tienen un pH más ácido, en el intervalo de 5,5-6,0, y los lisosomas tienen un pH incluso más ácido de aproximadamente 5,0. Algunos enlazadores tendrán un grupo enlazante escindible que se escinde a un pH preferido, liberando de este modo el lípido catiónico del ligando dentro de la célula, o en el compartimento deseado de la célula.

Un enlazador puede incluir un grupo enlazante escindible que es escindible por una enzima particular. El tipo de grupo enlazante escindible incorporado en un enlazador puede depender de la célula a la que se dirige. Otros ejemplos de grupos enlazantes escindibles incluyen, pero no se limitan a, grupos enlazantes escindibles por redox (por ejemplo, un grupo con enlace disulfuro (-S-S-)), grupos enlazantes escindibles basados en fosfato, grupos enlazantes escindibles basados en éster y grupos enlazantes escindibles basados en péptidos. Los documentos de Patente de EE. UU. representativos que enseñan la preparación de conjugados de RNA incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. n.os 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696;5599923;5599928 y 5688941;6294664; 6320017; 6576752;6783931;6900297;7037646.

En general, la idoneidad de un grupo enlazante escindible candidato puede evaluarse ensayando la capacidad de un agente (o condición) degradativo para escindir el grupo enlazante candidato. También será deseable analizar también la capacidad del grupo enlazante escindible candidato para resistir la escisión en la sangre o cuando esté en contacto con otro tejido no objetivo. Por lo tanto, se puede determinar la susceptibilidad relativa a la escisión entre una primera y una segunda condición, donde la primera se selecciona para ser indicativa de la escisión en una célula objetivo y la segunda se selecciona para ser indicativa de la escisión en otros tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo, sangre o suero. Las evaluaciones pueden llevarse a cabo en sistemas libres de células, en células, en cultivo celular, en cultivo de órganos o tejidos, o en animales completos. Puede ser útil realizar evaluaciones iniciales en condiciones libres de células o de cultivo y confirmarlas mediante evaluaciones adicionales en animales completos. En realizaciones preferidas, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos 2, 4, 10 o 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones intracelulares) en comparación con sangre o suero (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones extracelulares).

No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se modifiquen uniformemente, y de hecho se puede incorporar más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente en un único compuesto o incluso en un único nucleósido dentro de un ácido nucleico inhibidor. La presente invención también incluye compuestos de ácido nucleico inhibidores que son compuestos quiméricos. Los compuestos de ácido nucleico inhibidores "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos de ácido nucleico inhibidores, por ejemplo, dsRNA, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de dsRNA. Estos ácidos nucleicos inhibidores contienen típicamente al menos una región en donde el ácido nucleico está modificado para conferir al ácido nucleico inhibidor una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, una mayor absorción celular y/o una mayor afinidad de unión por el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del ácido nucleico inhibidor puede servir como un sustrato para enzimas capaces de escindir RNA:DNA o RNA:híbridos de RNA. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de RNA de un dúplex RNA:DNA. La activación de la RNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión del objetivo de RNA, potenciando de este modo en gran medida la eficacia de la inhibición de la expresión génica por ácidos nucleicos inhibidores. Por consiguiente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con ácidos nucleicos inhibidores más cortos cuando se usan ácidos nucleicos inhibidores quiméricos, en comparación con, por ejemplo, fosforotioato deoxi dsRNAs que hibridan con la misma región objetivo. La escisión del objetivo de RNA puede detectarse de manera rutinaria mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en la técnica.

En determinados casos, el ácido nucleico de un ácido nucleico inhibidor puede modificarse por un grupo no ligando. Se han conjugado varias moléculas no ligandos a ácidos nucleicos inhibidores con el fin de potenciar la actividad, distribución celular o absorción celular del ácido nucleico inhibidor, y están disponibles en la bibliografía científica procedimientos para realizar dichas conjugaciones. Dichos restos no ligandos han incluido restos lipídicos, tales como colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, por ejemplo dodecanodiol o restos undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svisnarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una cadena de poliamina o de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), o un resto octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Los documentos de Patentes de U.S. representativos que enseñan la preparación de dichos conjugados de ácido nucleico se han enumerado anteriormente. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de un ácido nucleico que lleva un amino-enlazador en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino se hace reaccionar después con la molécula que se conjuga usando reactivos de acoplamiento o activación apropiados. La reacción de conjugación se puede realizar con el ácido nucleico todavía unido al soporte sólido o después de la escisión del ácido nucleico, en fase de solución. La purificación del conjugado de ácido nucleico por HPLC típicamente proporciona el conjugado puro.

El término "aptámero" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de unirse a una molécula objetivo, tal como un polipéptido. Por ejemplo, un aptámero de la invención puede unirse específicamente a una molécula objetivo, o a una molécula en una ruta de señalización que modula la expresión y/o actividad de una molécula objetivo. La generación y uso terapéutico de aptámeros están bien establecidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento de Patente U.S. Pat. No. 5,475,096.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "unión específica" se refiere a una interacción química entre dos moléculas, compuestos, células y/o partículas en donde la primera entidad se une a la segunda entidad objetivo con mayor especificidad y afinidad que la que se une a una tercera entidad que no es objetivo. En algunas realizaciones, la unión específica puede referirse a una afinidad de la primera entidad por la segunda entidad objetivo que es al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces o mayor que la afinidad por la tercera entidad no objetivo. Un reactivo específico para un objetivo dado es uno que muestra una unión específica para ese objetivo en las condiciones del ensayo que se está utilizando.

Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "tratar", "tratamiento", "que trata" o "mejora" se refieren a tratamientos terapéuticos, en donde el objetivo es invertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresión o gravedad de una afección asociada con una enfermedad o trastorno, por ejemplo, cáncer. El término "que trata" incluye que reduce o alivia al menos un efecto o síntoma adverso de una afección, enfermedad o trastorno asociado con un cáncer. El tratamiento es generalmente "eficaz" si se reducen uno o más síntomas o marcadores clínicos. Alternativamente, el tratamiento es "eficaz" si la progresión de una enfermedad se reduce o se detiene. Es decir, "tratamiento" incluye no solo la mejora de los síntomas o marcadores, sino también el cese, o al menos la ralentización, del progreso o del empeoramiento de los síntomas en comparación con lo que se esperaría en ausencia de tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de uno o más síntoma(s), disminución de la extensión de la enfermedad, estado de la enfermedad estabilizado (decir, no empeoramiento), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, remisión (ya sea parcial o total) y/o disminución de la mortalidad, ya sea detectable o indetectable. El término "tratamiento" de una enfermedad también incluye proporcionar alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluyendo tratamiento paliativo).

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "composición farmacéutica" se refiere al principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un vehículo comúnmente usado en la industria farmacéutica. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente memoria para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, en consonancia con una relación beneficio/riesgo razonable.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "administración", se refiere a la colocación de un compuesto como se describe en la presente memoria en un sujeto mediante un método o vía que da como resultado la administración al menos parcial del agente en un sitio deseado. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos descritos en la presente memoria pueden administrarse por cualquier vía apropiada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto.

El término "estadísticamente significativo" o "significativamente" se refiere a la significación estadística y generalmente significa una diferencia de dos desviaciones estándar (2SD) o mayor.

Aparte de en los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usados en la presente memoria deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente", cuando se usa con respecto a los porcentajes, puede significar ±1 %.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a composiciones, métodos y componente(s) respectivos de los mismos, que son esenciales para el método o composición, pero abierto a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

El término "que consiste en" se refiere a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos como se describe en la presente memoria, que son exclusivos de cualquier elemento no citado en esa descripción de la realización.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a aquellos elementos necesarios para una realización dada. El término permite la presencia de elementos que no afectan materialmente a la característica(s) básica y novedosa o funcional de esa realización.

Los términos singulares "un", "una", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria pueden usarse en la práctica o prueba de esta divulgación, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. La abreviatura, "e.g.", se deriva de la Latin exempli gratia, y se usa en la presente memoria para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto, la abreviatura "e.g." es sinónima del término "por ejemplo".

Las definiciones de términos comunes en biología celular y biología molecular se pueden encontrar en "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th edition, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910 19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) y Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds.

A menos que se indique lo contrario, la presente invención se realizó usando procedimientos estándar, como se describe, por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., N.Y., USA (1995); o Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.

152, S. L. Berger y A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), y Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, vol.

57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1 st edition, 1998).

Otros términos se definen en la presente memoria dentro de la descripción de los diversos aspectos de la invención.

Todas las patentes y otras publicaciones; incluyendo referencias bibliográficas, patentes emitidas, solicitudes de patente publicadas y solicitudes de patente en tramitación junto con la presente; citadas a lo largo de esta solicitud son con el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones que podrían usarse en relación con la tecnología descrita en la presente memoria. Estas publicaciones se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a antedatar dicha divulgación en virtud de la invención anterior o por cualquier otra razón. Todas las afirmaciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto al contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o contenidos de estos documentos.

La descripción de las realizaciones de la divulgación no pretende ser exhaustiva o limitar la divulgación a la forma precisa divulgada. Aunque las realizaciones específicas de, y los ejemplos para, la divulgación se describen en la presente memoria con fines ilustrativos, son posibles diversas modificaciones equivalentes dentro del alcance de la divulgación, como reconocerán los expertos en la técnica relevante. Por ejemplo, aunque las etapas o funciones del método se presentan en un orden dado, las realizaciones alternativas pueden realizar funciones en un orden diferente, o las funciones pueden realizarse de manera sustancialmente simultánea. Las enseñanzas de la divulgación proporcionada en la presente memoria pueden aplicarse a otros procedimientos o métodos según sea apropiado. Las diversas realizaciones descritas en la presente memoria pueden combinarse para proporcionar realizaciones adicionales. Los aspectos de la divulgación pueden modificarse, si es necesario, para emplear las composiciones, funciones y conceptos de las referencias y aplicaciones anteriores para proporcionar aún más realizaciones de la divulgación. Estos y otros cambios se pueden hacer a la divulgación a la luz de la descripción detallada. Se pretende que todas estas modificaciones estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Los elementos específicos de una cualquiera de las realizaciones anteriores pueden combinarse o sustituirse por elementos en otras realizaciones. Además, aunque las ventajas asociadas con ciertas realizaciones de la divulgación se han descrito en el contexto de estas realizaciones, otras realizaciones también pueden mostrar dichas ventajas, y no todas las realizaciones necesitan mostrar necesariamente dichas ventajas para caer dentro del alcance de la divulgación.

La tecnología descrita en la presente memoria se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que de ninguna manera deben interpretarse como limitantes adicionales.

Ejemplos

Ejemplo 1: La inactivación génica por quimeras de aptámero de EpCAM-siRNA inhibe los cánceres de mama triple negativos de tipo basal y sus células iniciadoras de tumores

Se necesitan estrategias terapéuticas eficaces para la administración de siRNA in vivo para inactivar genes en células fuera del hígado para aprovechar RNA de interferencia para el tratamiento contra el cáncer. EpCAM es un antígeno asociado a tumor altamente expresado en cánceres epiteliales comunes y sus células iniciadoras de tumores (T-IC, también conocidas como células madre cancerosas). Se demuestra en la presente memoria que las quimeras aptámero-siRNA (AsiC, un aptámero de EpCAM unido a una cadena sentido de siRNA e hibridada con la cadena antisentido de siRNA) se absorben selectivamente e inactivan la expresión génica en células cancerosas EpCAM+ in vitro y en tejidos de biopsia de cáncer humano. Las EpCAM-AsiCs de PLK1 inhiben la formación de colonias y mamosferas (ensayos de TIC in vitro) y la iniciación tumoral por líneas celulares de cáncer de mama triple negativo (TNBC) luminal y basal-A de EpCAM+, pero no TNBCs basales-B mesenquimales de EpCAM-, en ratones nude. Las EpCAM-AsiCs administradas por vía subcutánea se concentran en tumores EpCAM+ Her2+ y TNBC y suprimen su crecimiento. Por tanto, EpCAM-AsiCs proporcionan un enfoque atractivo para el tratamiento del cáncer epitelial.

Introducción

El RNA de interferencia (RNAi) ofrece la oportunidad de tratar la enfermedad inactivando los genes que provocan la enfermedad.1 Ensayos clínicos recientes de fase temprana han mostrado una inactivación vigorosa (75-95%), sostenida (que dura varias semanas o hasta varios meses) y segura de una cantidad de objetivos génicos en el hígado usando siRNAs encapsulados con nanopartículas lipídicas o conjugados con GalNAc.2-5 El hígado, el órgano filtrante principal del cuerpo, atrapa partículas y, por lo tanto, es relativamente fácil de transfectar. Sin embargo, el principal obstáculo para aprovechar el RNAi para el tratamiento de la mayoría de las enfermedades aún no se ha resuelto, es decir, la administración eficiente de RNAs pequeños y la inactivación génica en células más allá del hígado. En particular, el bloqueo de la vía de administración es un obstáculo principal para aprovechar el RNAi para el tratamiento contra el cáncer.6

Los cánceres de mama triple negativos (TNBC), un grupo heterogéneo de cánceres poco diferenciados definidos por la falta de expresión de estrógenos, progesterona y receptores Her2, tiene el peor pronóstico de cualquier subtipo de cáncer de mama.7-9 La mayoría de los TNBCs tienen propiedades epiteliales y se clasifican como de tipo basal o pertenecen al subtipo basal-A, aunque una minoría considerable son mesenquimales (subtipo basal-B). El TNBC afecta a mujeres más jóvenes y es el subtipo asociado con las mutaciones genéticasBRCA1.No se dispone de terapia dirigida. Aunque la mayoría de los pacientes con TNBC responden a la quimioterapia, en 3 años aproximadamente un tercio desarrollan metástasis y finalmente mueren. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques.

En la presente memoria se describe una plataforma flexible dirigida para la inactivación génica y el tratamiento de TNBCs de tipo basal que también podría ser adecuada para la terapia contra la mayoría de los cánceres comunes (epiteliales). Se administran RNAs de interferencia pequeños (siRNA) en células cancerosas epiteliales uniéndolos a un aptámero de RNA que se une a EpCAM, el primer antígeno tumoral descrito, un receptor de superficie celular sobreexpresado en cánceres epiteliales, incluyendo TNBCs de tipo basal. Los siRNAs unidos a aptámero, conocidos como quimeras aptámero-siRNA (AsiC), se han usado en modelos animales pequeños para tratar el cáncer de próstata y prevenir la infección por HIV.10-18 Se elige EpCAM para dirigirse a TNBC de tipo basal porque EpCAM se expresa altamente en cánceres epiteliales. Se identificó previamente un aptámero de EpCAM de alta afinidad. {Shigdar, 2011 #17903} EpCAM también marca células iniciadoras de tumores (T-ICs, también conocidas como células madre cancerosas).20-27 Se cree que estas células son responsables no sólo de la iniciación de tumores, sino que también son relativamente resistentes a la terapia citotóxica convencional y se cree que son responsables de la recaída y metástasis tumorales. El diseño de terapias para eliminar las T-ICs es un objetivo importante no cumplido de la investigación del cáncer.28

En epitelios normales, EpCAM se expresa sólo débilmente en uniones gap basolaterales, donde puede no ser accesible a fármacos.29 En los cánceres epiteliales no sólo es más abundante (en órdenes de magnitud), sino que también se distribuye a lo largo de la membrana celular. La unión de EpCAM promueve la adhesión y potencia la proliferación celular y la invasividad. La escisión proteolítica de EpCAM libera un fragmento intracelular que aumenta la transcripción de factores de células madre.3031 Las propiedades oncogénicas de EpCAM pueden hacer difícil que las células tumorales desarrollen resistencia modulando negativamente EpCAM. En un estudio, aproximadamente 2/3 de las TNBCs, presumiblemente el subtipo basal-A, se tiñeron fuertemente para EpCAM.25 El número de células circulantes EpCAM+ está relacionado con un mal pronóstico del cáncer de mama.32-36 Un anticuerpo de EpCAM se ha evaluado clínicamente para cánceres epiteliales, pero tenía una eficacia limitada por sí mismo.37-39 La expresión de EpCAM identifica células tumorales circulantes en un método aprobado por la FDA para monitorizar el tratamiento de cáncer de mama, colon y próstata metastásico 32-36. Además, aproximadamente el 97% de los cánceres de mama humanos y prácticamente el 100% de otros cánceres epiteliales comunes, incluyendo pulmón, colon, páncreas y próstata, se tiñen de manera brillante para EpCAM, lo que sugiere que la plataforma desarrollada en la presente memoria podría adaptarse para la terapia basada en RNAi de cánceres comunes.

Se demuestra en la presente memoria que todas las líneas celulares epiteliales de cáncer de mama analizadas se tiñeron brillantemente para EpCAM, mientras que las células epiteliales de mama normales inmortalizadas, fibroblastos y líneas celulares tumorales mesenquimales no lo hicieron. EpCAM-AsiCs provocó la inactivación génica dirigida en células cancerosas TNBC luminales y basal-A y tejidos de cáncer de mama humano in vitro, pero no en células epiteliales normales, células tumorales mesenquimales o tejidos de mama humanos normales. La inactivación fue proporcional a la expresión de EpCAM. Además, la inactivación mediada por EpCAM-AsiC dePLK1,un gen necesario para la mitosis suprimióin vitrolos ensayos funcionales de T-IC (formación de colonias y mamosferas) de líneas epiteliales de cáncer de mama. El tratamiento ex vivo abolió específicamente la iniciación tumoral. EpCAM-AsiCs dePLK1inyectado subcutáneamente fueron absorbidos específicamente por xenoinjertos ortotópicos de cáncer de mama triple negativo (TNBC) basal-A de EpCAM+ de pronóstico deficiente de cánceres de mama basal-A y Her2 y provocaron una regresión tumoral rápida.

EpCAM se expresa altamente en líneas celulares epiteliales de cáncer de mama

En primer lugar, se examinó la expresión de EpCAM en líneas celulares de cáncer de mama. Basándose en los datos de expresión génica en the Cancer Cell Line Encyclopedia40, el mRNA de EpCAM se expresa altamente en líneas celulares de cáncer de mama TNBC basal-A y luminal, pero poco en TNBCs basal-B (mesenquimales) (Figura 1A). La tinción de EpCAM de superficie, evaluada mediante citometría de flujo, fue 2-3 logaritmos más brillante en todas las líneas celulares luminal y de tipo basal analizadas, que en epitelios normales inmortalizados con hTERT (BPE)41, fibroblastos o TNBCs mesenquimales (Figura 1B). Por lo tanto, EpCAM se expresa altamente en líneas celulares epiteliales de cáncer de mama en comparación con células normales o tumores mesenquimales.

EpCAM-AsiCs inactivan selectivamente la expresión génica en células de cáncer de mama EpCAM+

Un aptámero de 19 nucleótidos (nt) que se une a EpCAM humana con afinidad 12 nM19 se identificó mediante SELEX.4243 No se une a EpCAM de ratón (datos no mostrados). Se diseñó y sintetizó una cantidad de EpCAM-AsiCs que unía la cadena sentido o antisentido del siRNA al extremo 3'-terminal del aptámero mediante varios enlazadores con sustituciones de 2'-fluoropirimidina y salientes de 3'-dTdT para potenciar la estabilidad in vivo, evitar la inactivación fuera del objetivo de genes parcialmente complementarios que portan secuencias similares, y limitar la estimulación innata del receptor inmunitario. Para ensayar la administración de RNA, la inactivación génica y los efectos antitumorales, se incorporaron siRNAs a la inactivacióneGFP(como un gen marcador útil);AKT1,un gen endógeno expresado en todas las líneas celulares estudiadas, cuya inactivación no es letal; yPLK1,una cinasa necesaria para la mitosis, cuya inactivación es letal (Figura 9). La AsiC que se comportó mejor en estudios de respuesta a la dosis de la inactivación génica unió el aptámero de EpCAM de 19 nt a la cadena sentido (inactiva) del siRNA a través de un enlazador U-U-U (Figura 1C). La EpCAM-AsiC se produjo hibridando la cadena larga de ~42-44 nt sintetizada químicamente (aptámero de 19 nt enlazador cadena sentido de siRNA de 20-22 nt) con una cadena antisentido de siRNA de 20-22 nt. Sintetizadas comercialmente con 2'-fluoropirimidinas {Jackson, 2003 #11353;Scacheri 2004 #11912;Jackson 2006 #13758;Wheeler 2011 #17906}, son resistentes a la RNasa y muy estables en suero humano (T1/2 >> 36 h, Figura 7) y no desencadenan inmunidad innata cuando se inyectan in vivo en ratones portadores de tumores (Figura 7).

Para verificar la absorción selectiva por células tumorales EpCAM+, se usó microscopía de fluorescencia confocal para comparar la internalización del aptámero de EpCAM, marcado fluorescentemente en el extremo 5'-terminal con Cy3, en células TNBC MDA-MB-468 de EpCAM+ y Bp E, células epiteliales de mama inmortalizadas EpCAMdim (datos no mostrados). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, debido a que las AsiCs contienen solo un aptámero, no reticulan el receptor que reconocen. Como consecuencia, la internalización celular es lenta ya que probablemente ocurre a través del reciclaje del receptor, en lugar del proceso más rápido de endocitosis inducida por activación.

Sólo las células MDA-MB-468 absorbieron el aptámero. La absorción se detectó claramente a las 22 horas, pero aumentó mucho después de 43 horas. Para ensayar si EpCAM-AsiCs son absorbidas específicamente por líneas celulares brillantes de EpCAM, el extremo 3'-terminal de la cadena antisentido de la AsiC se marcó fluorescentemente. BPLER de EpCAM+, una línea celular de TNBC basal-A transformada a partir de BPE por transfección con TERT humano, región temprana de SV40 y H-RASV12, absorbió Alexa-647-EpCAM-AsiCs cuando se analizó después de una incubación de 24 horas, pero las células BPE no lo hicieron (Figura 1D). Estudios previos han mostrado que AsiCs se procesan dentro de las células mediante Dicer para liberar el siRNA del aptámero (10, 12, 15). Para verificar que el siRNA liberado fue absorbido por el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC), se utilizó qRT-PCR para amplificar ese siRNA de PLK1 inmunoprecipitado con Ago cuando las células MDA-MB-468 se incubaron con EpCAM-AsiCs de PLK1 (Figura 33). Ningún siRNA de PLK1 se unió a Ago cuando las mismas células se incubaron con siRNAs de PLK1.

Las células TNBCs absorbieron Alexa-467-EpCAM-AsiCs, pero no se detectó absorción en las células BPE (Figura 1E). Después, para evaluar si la inactivación génica era específica de tumores EpCAM+, se comparó la inactivación deeGFPen estas mismas líneas celulares, que expresan de manera estableeGFP,mediante EpCAM-AsiCs deeGFPy transfección de lípidos de siRNAs deeGFP(Figura 1D). Aunque transfección de los siRNAs deeGFPinactivaron la expresión génica de manera equivalente en BPE y BPLER, la incubación con EpCAM-AsiCs en ausencia de cualquier lípido de transfección inactivaron selectivamente la expresión solo en BPLER. La inactivación de AsiC fue uniforme y comparable a la lograda con la transfección de lípidos. Después, se comparó la inactivación específica del gen endógenoAKT1por AsiCs deAKT1y transfectado con siRNAs deAKT1en 6 líneas celulares de cáncer de mama en comparación con fibroblastos humanos normales (Figura 1E).AKT1se inactivó selectivamente mediante el EpCAM-AsiCs dirigida aAKT1sólo en TNBCs luminal y basal-A de EpCAMbrillante, pero no en TNBCs basal B mesenquimal, fibroblastos o células BPE (datos no mostrados). Como se esperaba, AsiCs dirigida aeGFPno tuvo efecto sobre los niveles de AKT1 y la transfección de siRNAs deAKT1inactivaron de manera comparable la expresión en todas las líneas celulares estudiadas. Además, la inactivación de EpCAM-AsiC deAKT1se correlacionó fuertemente con la expresión de EpCAM (Figura 1G). Se obtuvieron resultados similares cuando se analizó la proteína AKT1 mediante citometría de flujo en células transfectadas teñidas (Figura 1G, 1H). Por lo tanto, la inactivación in vitro por EpCAM-AsiCs es eficaz y específica para células tumorales EpCAMbrillante.

EpCAM-AsiCs de PLK1 destruye selectivamente las células tumorales EpCAMbrillante in vitro

Para explorar si EpCAM-AsiCs se podría usar como agentes antitumorales en cáncer de mama, se examinó mediante el ensayo CellTiterGlo el efecto de AsiCs dirigida contraPLK1,una cinasa necesaria para la mitosis, sobre la supervivencia de 10 líneas celulares de cáncer de mama que incluían 5 TNBCs basales-A, 2 líneas celulares luminales y 3 TNBCs basales-B. EpCAM-AsiCs dirigida aPLK1,pero no AsiCs de control dirigida contraeGFP,disminuyó la proliferación celular en las líneas celulares basal-A y luminal, pero no inhibió las células basal-B (Figura 2A). La transfección de lípidos de siRNAs dePLK1suprimió el crecimiento de todas las líneas celulares. El efecto antiproliferativo se correlacionó fuertemente con la expresión de EpCAM (Figura 2B). La reducción en células EpCAM+ viables después de la inactivación se debió a la inducción de apoptosis, se evaluó mediante tinción con anexina V-yoduro de propidio y activación de caspasa (datos no mostrados). Para determinar si la unión del aptámero de EpCAM contribuía al efecto antiproliferativo de EpCAM-AsiC, se comparó la supervivencia de células que se trataron con EpCAM-AsiC dePLK1con células tratadas con el aptámero por sí mismas (Figura 2C). El aptámero por sí mismo no tuvo un efecto reproducible sobre la supervivencia de ninguna línea celular de cáncer de mama, posiblemente porque como un agente monomérico no reticula el receptor de EpCAM para alterar la señalización de EpCAM. Por lo tanto, la EpCAM-AsiC dePLK1confirma su efecto antitumoral específico sobre células de cáncer de mama EpCAM+ mediante la inactivación génica.

Para determinar si EpCAM-AsiCs se dirigen específicamente a células EpCAM+ cuando se mezclan con células epiteliales no transformadas EpCAMdim, se incubaron co-cultivos de células TNBC de GFP- y células BPE de GFP+ con EpCAM-AsiCs dePLK1o medio y se usó fluorescencia de GFP para medir su supervivencia relativa mediante citometría de flujo 3 días después (Figura 2D, 2E). EpCAM-AsiCs dirigida aPLK1redujo en gran medida la proporción de células tumorales basal-A de EpCAM+ supervivientes, pero no tuvo efecto sobre la supervivencia de una línea de células basal-B de EpCAM-. Por lo tanto, las EpCAM-AsiCs dePLK1son selectivamente citotóxicas para las células tumorales EpCAM+ cuando se mezclan con células normales.

EpCAM-AsiCs se concentran en muestras de biopsia de tumor de mama EpCAM+

Después se examinó si EpCAM-AsiCs se concentran en tumores de mama humanos en relación con muestras de mama normales dentro de tejidos intactos. Se cortaron biopsias de tejido normal y tumor de mama emparejados de 3 pacientes con cáncer de mama en cubos con bordes de ~3 mm y se colocaron en placas de Petri. Las células de muestra tumoral fueron todas EpCAMbrillante y las células tisulares normales fueron EpCAMdim (Figura 3A). Se añadieron Alexa647-siRNA marcadas fluorescentemente (no se esperaba que fueran absorbidas por tejido normal o tumor), siRNAs conjugados con Alexa647-colesterol (col-siRNAs, que se esperaba que fueran absorbidos por ambos), o Cy3-EpCAM-AsiCs al medio de cultivo y los tejidos se incubaron durante 24 h antes de la recogida. La señal de Cy3 de AsiC, que pudo visualizarse a simple vista, se concentró sólo en las muestras tumorales y no se detectó en tejido normal (Figura 3B). Para cuantificar la absorción de RNA, se realizó un análisis de citometría de flujo en suspensiones de células individuales lavadas de las muestras de tejido (pareja de tejido normal-tumoral representativo (Figura 3C), media ± SD de biopsias por triplicado de 3 muestras muestras emparejadas de tejido normal-tumor de mama de EpCAMbrillante (Figura 3D)). EpCAM-AsiC fueron significativamente absorbidas por el tumor pero no por el tejido normal, mientras que no la absorbieron el siRNA no conjugado ni las absorbieron el col-siRNA en cierta medida. Por lo tanto, dentro del tejido intacto, EpCAM-AsiCs se administran selectivamente a tumores EpCAMbrillante en relación a tejido normal.

EpCAM-AsiCs de PLK1 inhiben las T-ICs de tumores EpCAM+

Se eligió EpCAM para dirigirse en parte porque EpCAM marca T-ICs y las células iniciadoras de metástasis (M-IC). 20.2226.2731 Para investigar si EpCAM-AsiCs inhiben las T-ICs, comparamos la formación de colonias y mamosferas (ensayos sustitutos funcionales de T-IC) después del tratamiento simulado, el tratamiento con paclitaxel o con EpCAM-AsiCs contraeGFPoPLK1.EpCAM-AsiCs dePLK1inhibió más fuertemente la formación de colonias y mamosferas de TNBCs basal A de EpCAM+ y líneas celulares luminales que paclitaxel, pero fueron inactivos contra TNBCs basal B de EpCAM- (Figuras 4A-C). La inhibición de T-IC fue específica, ya que AsiCs deeGFPno tuvo efecto. La incubación con EpCAM-AsiCs dePLK1,pero no AsiCs deeGFP,también redujo la proporción de células con el fenotipo de T-ICs, es decir los números de células CD44+CD24bajo/- y ALDH+ específicamente en líneas celulares de cáncer de mama basal-A y luminal (datos no mostrados). Para evaluar el efecto de EpCAM-AsiCs sobre la iniciación tumoral, se trataron células MB468 de EpCAM+ que expresaban de manera estable luciferasa durante la noche con medio EpCAM-AsiCs dePLK1oeGFPy después se implantaron sc números iguales de células viables en ratones nude. EpCAM-AsiCs dePLK1bloqueó completamente la formación de tumores evaluada mediante luminiscencia de células tumorales in vivo (datos no mostrados). En contraste, un tratamiento similar de las células MB436 basal B no tuvo efecto sobre la iniciación del tumor (datos no mostrados). Por lo tanto, EpCAM-AsiCs dePLK1inhiben los ensayos de T-IC in vitro y la iniciación tumoral selectivamente para cánceres de mama EpCAM+.

EpCAM-AsiCs administradas por vía subcutánea son absorbidas selectivamente por TNBCs de EpCAM+ distantes

Para ser clínicamente útil, EpCAM-AsiCs necesitan ser absorbidas por células tumorales diseminadas. La inyección intravenosa de EpCAM-AsiCs fluorescentes en la vena de la cola de ratones no condujo a una acumulación significativa de AsiC dentro de tumores subcutáneos implantados en los flancos de ratones nude (datos no mostrados), probablemente porque su tamaño (~ 25 kDa) está por debajo del umbral para la filtración renal y se excretan rápidamente. La unión a polietilenglicol aumentó enormemente la semivida circulante, la acumulación tumoral y el efecto terapéutico antitumoral de PSMA-AsiCs en un modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer de próstata.11 Sin embargo, para ver si esta modificación podría evitarse, examinamos mediante obtención de imágenes de epifluorescencia de animales vivos si la inyección sc de EpCAM-AsiCs deeGFPmarcada con Alexa750 en el surco del cuello de 7 ratones condujeron a la acumulación en TNBCs de MB468 de EpCAM+ y MB231 de EpCAM- distantes implantadas sc en cada flanco (Figura 5A, 5B). En el día de la inyección, EpCAM-AsiCs se concentraron sólo en el tumor EpCAM+ y persistieron allí durante al menos 4 días. Las EpCAM-AsiCs se detectaron alrededor del sitio de inyección el día 2, pero sólo se encontraron dentro del tumor EpCAM+ el día 4.

EpCAM AsiCs de PLK1 provocan la regresión de los xenoinjertos de cáncer de mama TNBC basal-A y Her2

Debido a que EpCAM-AsiCs inyectados sc se concentraron en tumores EpCAM+ distantes, se observó a continuación si la inyección sc de EpCAM-AsiCs dePLK1podrían inhibir selectivamente el crecimiento de un tumor xenoinjertado con TNBC de EpCAM+. Se implantaron células MB468-luc de EpCAM+ en Matrigel en un flanco de un ratón nude y se implantaron células MB231-luc-mCherry de EpCAM- en el flanco opuesto. Una vez que la señal de luciferasa de ambos tumores se detectó claramente por encima del fondo, grupos de 5-6 ratones se trataron de manera simulada o se inyectaron sc con 5 mg/kg de EpCAM-AsiCs dirigidas aPLK1oeGFPcada 3 días durante 2 semanas. El crecimiento tumoral se siguió por luminiscencia. Todos los tumores EpCAM+ rápidamente remitieron completamente sólo en ratones que recibieron AsiCs dirigida aPLK1(Figura 6A, 6B). Los tumores EpCAM+ en ratones tratados con AsiCs dirigidas aeGFPy todos los tumores EpCAM- continuaron creciendo. Este experimento se repitió con resultados similares después de la inyección de AsiCs dePLK1.Los tumores también continuaron creciendo sin cambios significativos en grupos adicionales de ratones de control tratados con solo el aptámero de EpCAM o siRNA dePLK1(datos no mostrados) y en ratones que portan MCF10A-CA1a de Her2+ (Figura 34). Por lo tanto EpCAM-AsiCs de PLK1 inyectadas sc muestran actividad antitumoral específica contra TNBCs basal-A y xenoinjertos humanos de EpCAM+.

Discusión

La terapia dirigida hasta ahora se ha basado en el uso de anticuerpos o inhibidores específicos de tumores para quinasas oncogénicas. Ninguno de los anteriores ha demostrado que un AsiC no conjugado pueda tener potentes efectos antitumorales o que las AsiCs puedan administrarse sc. Actualmente no existe una terapia dirigida para TNBC o para T-ICs. El desarrollo de una terapia dirigida para TNBC y el desarrollo de formas de eliminación de las T-ICs son objetivos no satisfechos importantes de la investigación del cáncer.

Se demuestra en la presente memoria que EpCAM-AsiCs se puede usar para inactivar genes selectivamente en células epiteliales de cáncer de mama y sus células madre, preservando las células epiteliales normales y el estroma, para provocar la regresión tumoral y suprimir la iniciación tumoral. En un modelo de xenoinjerto de TNBC muy agresivo, las EpCAM-AsiCs provocaron una regresión tumoral completa después de solo 3 inyecciones. Esta es una plataforma flexible para la terapia dirigida, potencialmente para todos los cánceres epiteliales comunes, que expresan de manera uniforme altos niveles de EpCAM.

Aunque en la presente memoria se usó EpCAM-AsiCs dirigida a PLK1, el siRNA puede variarse para inactivar cualquier gen de dependencia tumoral que se adaptaría al subtipo de tumor o las características moleculares de un tumor de un paciente individual. Los mezclas de AsiC dirigidas a más de un gen serían ideales para la terapia contra el cáncer para disminuir las posibilidades de desarrollar resistencia a fármacos. La terapia dirigida contra el cáncer hasta ahora se ha basado en el uso de anticuerpos específicos de tumores o inhibidores de moléculas pequeñas para quinasas oncogénicas. El uso de EpCAM como ligando de AsiC y el desarrollo de terapia con RNAi para dirigirse a células madre cancerosas es novedoso. Ninguno de los anteriores ha demostrado que una AsiC no conjugado pueda tener potentes efectos antitumorales o que las AsiC puedan administrarse sc. Además, estudios preliminares de CD4-AsiCs administradas sc en ratones humanizados mostraron una fuerte inactivación en células CD4 en el bazo y ganglios linfáticos distantes, lo que sugiere que también se podrían administrar sc AsiCs dirigidas a receptores en células localizadas en otra parte del cuerpo. Actualmente no existe una terapia dirigida para TNBC o para T-ICs. La administración dirigida tiene la ventaja de una dosificación reducida y una toxicidad reducida para las células espectadoras.

El principal obstáculo para aprovechar el RNAi para el cáncer es administrar RNAs pequeños en células diseminadas. En la presente memoria se describe el uso de AsiCs para superar este obstáculo. En la presente memoria se describe una nueva clase de fármacos anticancerosos potentes. Las AsiCs son una plataforma flexible que puede dirigirse a diferentes receptores de la superficie celular e inactivar cualquier gen o combinación de genes. {Burnett, 2012 #18447;Zhou, 2011 #18448;Thiel, 2010 #18445} Cambiando el aptámero, la plataforma de AsiCs puede abordar el bloqueo de la vía de administración que ha frustrado la aplicación de la terapia basada en RNAi a la mayoría de las enfermedades. Este enfoque es ideal para la terapia personalizada contra el cáncer, ya que la elección de los genes a dirigir puede ajustarse dependiendo de las características moleculares de un tumor. Además, las mezclas de RNA pueden inactivar múltiples genes de una vez para anticipar y superar la resistencia a fármacos. Las AsiCs son el método más atractivo para la inactivación génica fuera del hígado. Son mejores que los métodos complicados de liberación de RNAs liposomales, nanopartículas o conjugados, porque son una entidad química única que es estable en la sangre, fácil de fabricar, no inmunogénica, capaz de penetrar fácilmente en los tejidos y no están atrapados en los órganos de filtración.

Un objetivo importante de investigación del cáncer es eliminar las T-ICs (células madre cancerosas). Las T-ICs son relativamente resistentes a la quimioterapia y se cree que son responsables de la recaída y metástasis tumorales. {Federici, 2011 #19371} Las AsiCs descritas en la presente memoria se dirigen a las T-ICs (epiteliales) con alta eficiencia. Como tales, pueden eliminar esta subpoblación agresiva dentro de tumores en riesgo de enfermedad progresiva (véanse Figuras 6A, 6B).

El pequeño tamaño del aptámero de EpCAM usado en la presente memoria es ideal para un fármaco de AsiC, ya que los RNAs <60 nt pueden sintetizarse eficazmente.

Además de su uso terapéutico potencial, EpCAM-AsiCs también son una potente herramienta de investigaciónin vivopara identificar los genes de dependencia de tumores y T-ICs para definir nuevos objetivos farmacológicos. En principio, las quimeras de aptámeros podrían diseñarse para administrar no solo siRNAs sino también miméticos de miRNA o antagómeros, oligonucleótidos antisentido que funcionan mediante otros mecanismos además de RNAi, o incluso mRNAs más largos o RNA no codificantes (50, 51). También podrían diseñarse para incorporar más de un aptámero, múltiples siRNAs, o incluso toxinas o fármacos anticancerígenos de molécula pequeña.

Su pequeño tamaño es ideal para un fármaco de AsiC, ya que los RNAs < 60 nt pueden sintetizarse de manera eficaz. No solo se dirige el siRNA al tumor, sino que también se pueden elegir los objetivos farmacológicos para atacar los tacones de Aquiles del tumor al inactivar los genes de dependencia tumoral. Esta flexibilidad puede usarse para terapia personalizada contra el cáncer que se dirige a las vulnerabilidades moleculares de un cáncer de paciente individual.

Material y métodos

Cultivo celular.Se cultivaron células BPE y BPLER humanas en medio WIT (Stemgent). Se transdujeron MB468 con un indicador de luciferasa. Todas las otras líneas celulares humanas se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en MEM (MCF7, BT474), 5A de McCoy (SKBR3), RPMI1640 (HCC1806, HCC1143, HCC1937, HCC1954, HCC1187, MB468, T47D) o D<m>E<m>(MB231,<b>T549, MB436) suplementados todos con FBS al 10%, L-glutamina 1 mM y penicilina/estreptomicina (Gibco) a menos que se indique lo contrario. Se cultivaron células de cáncer de mama de ratón 4T1 en DMEM con FBS al 10%. Para la obtención de imágenes in vivo, se usaron células MB468 que expresaban de manera estable luciferasa de luciérnaga (MB468-luc) y se seleccionaron células MB231 que expresaban de manera estable luciferasa de luciérnaga y mCherry (MB231-luc-mCherry) después de la infección con lentivirus pLV-FlucmCherry-Puro (proporcionado por Andrew Kung, Columbia University). Las células MB231 se seleccionaron con puromicina.

Para el tratamiento de absorción y silenciamiento, las células se sembraron a baja densidad (10000 células/pocillo en placas de 96 pocillos) y se trataron inmediatamente. Todos los tratamientos con AsiC y siRNA se realizaron en medio OptiMEM o WIT. La viabilidad celular se evaluó mediante CellTiter-Glo (Promega) o mediante tinción con azul de tripano en placas de 96 pocillos.

Para el ensayo de formación de colonias, se trataron 1000 células viables durante 6 h en placas de 96 pocillos de fondo redondo y después se transfirieron a placas de 10 cm en medio que contenía suero. El medio se sustituyó cada 3 días. Después de 8-14 días, las células se fijaron en metanol (-20°C) y se tiñeron con violeta cristal. Para el ensayo de formación de esferas, se trataron 1000/ml de células viables durante 6 h en placas de 96 pocillos de fondo redondo y después se cultivaron en suspensión en DMEM/F12 1:1 libre de suero (Invitrogen), suplementado con EGF (20 ng/ml, BD Biosciences), B27 (1:50, Invitrogen), albúmina de suero bovino al 0,4% (Sigma) y 4 pg/ml de insulina (Sigma). Las esferas se contaron después de 1 o 2 semanas.

Transfección de siRNA.Las células se transfectaron con Dharmafect I según el protocolo del fabricante. Véase la Figura 9 para todas las secuencias de siRNA.

Citometría de flujo.Para la citometría de flujo, las células se tiñeron como se ha descrito previamente (Yu, F. et al (2007). let-7 Regulates Self Renewal and Tumorigenicity of Breast Cancer Cells. Cell 131, 1109-1123.), brevemente, se realizó una inmunotinción directa de EpCAM y AKT1 usando diluciones 1:50 de hAb durante 30-60 minutos a 4°C (BioLegend/BD). Las células se tiñeron en PBS que contenía FCS al 0,5%, EDTA 1 mM y HEPES 25 mM. Las muestras se lavaron dos veces en el mismo tampón. Los datos se adquirieron usando FACS-Canto II (BD Biosciences). Los análisis se realizaron por triplicado y se contaron 10000 sucesos regulados/muestra. Todos los análisis de datos se realizaron usando FlowJo (Treestar Inc.).

Análisis de RNA.El análisis de qRT-PCR se realizó como se ha descrito (Petrocca, F., et al. (2008). Los microRNAs regulados por E2F1 alteran la detención del ciclo celular dependiente de TGFbeta y la apoptosis en el cáncer gástrico. Cancer Cell 13, 272-286). Brevemente, el RNA total se extrajo con Trizol (Invitrogen) y el cDNA se preparó a partir de 1000 ng de RNA total usando el kit Thermoscript RT (Invitrogen) según SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) del fabricante y un ciclador térmico BioRad C1000 (Biorad). Los valores relativos de CT se normalizaron a GAPDH y se convirtieron a una escala lineal.

Digestión con colagenasa de tejido de mama humano.Se recibieron biopsias de cáncer de mama o colon y control frescas del banco de tejidos UMASS, las muestras se cortaron en muestras de 3x3x3 mm y se colocaron en una placa de 96 pocillos con 100 ul de RPMI. Las muestras se trataron con Alexa647-siRNA-GFP, Alexa647-col-siRNA-GFP o Cy3-AsiC-GFP durante 24 horas. Las muestras se fotografiaron y digirieron. Se reunieron tres muestras de cada tratamiento y se pusieron en 10 ml de RPMI que contenía 1 mg/ml de colagenasa II (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a 37°C con agitación. Las muestras se rompieron en un disociador MACS suave (Miltenyi) usando el programa de bazo durante 30 minutos a 37°C tanto antes como después de la digestión con colagenasa. Las suspensiones celulares se pasaron a través de un filtro celular de 70 pm (BD Falcon), se lavaron con 30 ml de RPMI y se tiñeron para citometría de flujo.

Experimentos con animales.Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Harvard Medical School y Boston Children’s Hospital Animal Care and Use Committee. Los ratones nude se adquirieron en Jackson Laboratory.

Experimentos in vivo. Para los estudios de iniciación tumoral, ratones Nu/J hembra de 8 semanas de edad (Stock # 002019, Jackson Laboratories) se inyectaron por vía subcutánea con células MB468-luc (5x106) pretratadas durante 24 h con EpCAM-AsiC-GFP, EpCAM-AsiC-PLK1 o no tratadas. Las células se tripsinizaron con Tryple Express (Invitrogen), se re-suspendieron en medio WIT y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco. Después de la inyección intraperitoneal de 150 mg/kg de D-luciferina (Caliper Life Sciences) se tomaron imágenes luminiscentes de todo el cuerpo cada 5 días durante un total de 20 días usando el sistema IVIS Spectra (Caliper Life Sciences).

Para los experimentos de absorción de AsiC, células MB468-luc (5x106) y MB231-luc-mCherry (5x105) tripsinizadas con Tryple Express (Invitrogen), se re-suspendieron en una solución 1:1 de WIT-Matrigel y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones Nu/J hembra de 8 semanas de edad (Stock # 002019, Jackson Laboratories). El tamaño de los tumores se analizó diariamente usando el sistema IVIS Spectra (Caliper Life Sciences). Después de 5 días, los tumores eran claramente visibles y los ratones se inyectaron por vía subcutánea en el área del cuello con Alexa750-EpCAM-AsiC-GFP (0,5 mg/kg). La localización del AsiC comparado con el tumor se probó cada 48 h durante 7 días.

Para los estudios de inhibición tumoral, células MB468-luc (5x106) y MB231-luc-mCherry (5x105) tripsinizadas con Tryple Express (Invitrogen), se re-suspendieron en una solución 1:1 de WIT-Matrigel e se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones Nu/J hembra de 8 semanas de edad (Stock # 002019, Jackson Laboratories). El tamaño de los tumores se analizó diariamente usando el sistema IVIS Spectra, después de 5 días los tumores eran claramente visibles. Los ratones portadores de tumores de tamaño comparable se aleatorizaron en 5 grupos y se trataron con 5 mg/kg de EpCAM-AsiC-PLK1, EpCAM-AsiC-GFP, aptámero de EpCAM, siRNA-PLK1 o no tratados. Los ratones se trataron cada 72 h durante 14 días.

Todas las imágenes se analizaron usando Living Image® Software (Caliper Life Sciences).

Análisis estadístico.Se usaron las pruebas t de Student, calculadas usando Microsoft Excel, para analizar la significación entre las muestras tratadas y los controles, donde el tipo de prueba se fijó a una distribución de una cola y una varianza igual de dos muestras. Para evaluar la estimulación inmune innata, se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni usando el software GraphPad Prizm 4 (GraphPad Software, San Diego, CA). P<0,05 se consideró significativo.

Medición de la estimulación inmune innata.Los ratones se inyectaron sc con EpCAM-AsiCs deeGFP(5 mg/kg) o ip con Poly(I:C) (5 o 50 mg/kg). Las muestras de suero, recogidas al inicio y 6 y 16 h después del tratamiento se almacenaron a -80°C antes de medir IFNp, IL-6 e IP-10 usando el inmunoensayo ProcartaPlex Multiplex (Affymetrix/eBioscience, San Diego, CA). Los bazos, recogidos en el sacrificio 16 h después del tratamiento, se almacenaron en RNAlater (Qiagen) antes de extraer el RNA usando TRIZOL (Invitrogen) con el gentleMACS Dissociator (MACS Miltenyi Biotec, San Diego, CA). Se sintetizó el cDNA usando Superscript III y hexámeros aleatorios (Invitrogen) y se realizó la PCR usando SsoFast EvaGreen Supermix y un Sistema de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) usando los siguientes cebadores:

Gapdhdirecto: 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3' (SEQ ID NO: 4),

Gapdhinverso: 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3' (SEQ ID NO: 5),

ifnbdirecto: 5'-CTGGAGCAGCTGAATGGAAAG-3' (SEQ ID NO: 6),

ifnbinverso: 5'- CTTGAAGTCCGCCCTGTAGGT-3' (SEC ID NO 7),

il-6directo: 5'-TGCCTTCATTTATCCCTTGAA-3' (SEQ ID NO: 8),

il-6inversa: 5'-TTACTACATTCAGCCAAAAAGCAC-3' (SEQ ID NO: 9),

ip-10directo: 5'-GCTGCCGTCATTTTCTGC-3' (SEQ ID NO: 10),

ip-10inverso: 5'-TCTCACTGGCCCGTCATC-3' (SEQ ID NO: 11),

oas-1directo: 5'-GGAGGTTGCAGTGCCAACGAAG-3' (SEQ ID NO: 12),

oas-1inverso: 5'-TGGAAGGGAGGCAGGGCATAAC-3' (SEQ ID NO: 13),

sta tldirecto: 5'-TTTGCCCAGACTCGAGCTCCTG-3' (SEQ ID NO: 14),

stat1inverso: 5'-GGGTGCAGGTTCGGGATTCAAC-3' (SEQ ID NO: 15).

EpCAM se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer de mama basal A y luminal pero no en basal B (datos no mostrados). Se realizó FACS con 8 líneas celulares de cáncer de mama diferentes, probando los niveles de expresión de EpCAM mediante citometría de flujo usando un anticuerpo hEpCAM. EpCAM se sobreexpresa en todas las líneas celulares basal A y luminales y no en la basal B.

La disminución específica en la viabilidad celular en líneas celulares de cáncer de mama Basal A es dependiente de PLK1. Se trataron diez líneas celulares de cáncer de mama diferentes que representaban células basal A, B y luminales con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 o solo el aptámero de EpCAM y se compararon con controles no tratados. Ninguna de las líneas celulares tratadas con aptámero de EpCAM mostró una disminución en la viabilidad celular, mientras que las líneas celulares basal A y luminales mostraron una disminución en la viabilidad celular después del tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 (datos no mostrados).

Las EpCAM-AsiC son absorbidas por biopsias tanto sanas como de cáncer de colon.Cy3-EpCAM-AsiCdirigida aGFP,Alexa647-siRNA-GFP o Alexa647-col-siRNA-GFP (2 pM de cada uno) se añadieron a explantes de cáncer de colon y de control y se incubaron durante 24 h antes de digerir los tejidos con colagenasa a una suspensión de células individuales y analizarlos por citometría de flujo. EpCAM-AsiC, siRNA y col-siRNA penetraron tanto en el tumor como en el tejido sano con una eficacia similar. En el día 5, los tumores se retiraron y visualizaron para validar que EpCAM-AsiC dirigida a GFP marcada con Alexa750 entraba en los tumores. El nivel aumentado de Alexa750 se correlaciona negativamente con los niveles de mCherry (n=8, *P < 0,05, Ensayo-f de células EpCAM+ frente a EpCAM-) (datos no mostrados).

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Ejemplo 2

En la presente memoria se describe el desarrollo de la administración de siRNA dirigida (quimeras de aptámero-siRNA (AsiC)) que usan RNAs quiméricos compuestos de un RNA estructurado, denominado aptámero, seleccionado para la unión de alta afinidad a una proteína de la superficie celular, que está unida covalentemente a un siRNA. Estas AsiCs son absorbidas por células que expresan un receptor que reconoce el aptámero y son procesadas dentro de las células para liberar el siRNA activo. Esta es una plataforma flexible que puede modificarse para dirigirse a diferentes células mediante el direccionamiento de receptores de superficie celular específicos y puede diseñarse para inactivar cualquier gen o combinación de genes.

El aptámero se seleccionó por su unión de alta afinidad a EpCAM humana (CD326 o ESA) que se expresa en todas las células epiteliales, pero se expresa mucho más en cánceres epiteliales, incluyendo cánceres de mama poco diferenciados, tales como TNBC de tipo basal. Todos los cánceres comunes (pulmón, páncreas, próstata, mama y colon) tienen una alta expresión de EpCAM y pueden ser potencialmente dirigidos.

En la presente memoria se demuestra que las células epiteliales de cáncer de mama, pero no las células epiteliales mesenquimales o normales, absorben selectivamente EpCAM-AsiCs y experimentan inactivación génica in vitro. Además, el grado de inactivación se correlaciona fuertemente con los niveles de EpCAM. La inactivación de PLK1, un gen necesario para la mitosis, usando EpCAM-AsiCs elimina el crecimiento de la línea celular cancerosa y las propiedades de las células madre incluyendo la formación de colonias y mamosferas y la iniciación tumoral en xenoinjertos. Esta plataforma puede usarse para eliminar células cancerosas y las células madre cancerosas malignas dentro de los tumores epiteliales.

Las EpCAM-AsiCs pueden administrarse específicamente a tumores de tipo basal e inhibir el crecimiento tumoral. Estas AsiCs también pueden ser una herramienta de investigación poderosa para identificar los genes de los que dependen las células T-IC, que podrían ser buenos objetivos para fármacos convencionales o fármacos basados en RNAi.

Ejemplo 3

Un mecanismo ubicuo para regular la expresión génica se denomina RNA de interferencia. Utiliza RNAs pequeños que llevan una secuencia complementaria corta para bloquear la traducción de información genética en proteínas. Aprovechar este proceso endógeno ofrece la posibilidad excitante de tratar la enfermedad al inactivar la expresión de genes que provocan la enfermedad. El principal obstáculo es la administración de RNAs pequeños en las células, donde se encuentra la maquinaria del RNA de interferencia. En el último año, estudios clínicos preliminares han mostrado resultados muy prometedores sin toxicidad significativa en algunas enfermedades provocadas por la expresión génica aberrante en el hígado. Sin embargo, la administración al hígado, un órgano que atrapa partículas en la sangre, es más fácil de lograr que la administración de fármacos a células tumorales metastásicas. En la presente memoria se describe una estrategia para dirigir los RNAs a células epiteliales de cáncer que es especialmente buena para dirigir el tipo más agresivo de cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo (TNBC). Además, también se dirige a la subpoblación más maligna en la mayoría de los cánceres de mama, que se denominan células madre cancerosas. Estas células son resistentes a los fármacos de quimioterapia y se cree que son responsables de la recurrencia del tumor y la metástasis. Un objetivo importante de la investigación actual del cáncer es sustituir los fármacos de quimioterapia citotóxicos que son tóxicos tanto para las células cancerosas como para las células que se dividen normalmente (tales como las células formadoras de sangre y las células que recubren el intestino) con agentes que tienen una actividad selectiva contra el tumor, especialmente contra las células madre cancerosas dentro del tumor.

La terapia dirigida para un tipo de cáncer de mama (Her2+) ha revolucionado el tratamiento y mejorado significativamente la supervivencia. Actualmente no existe ninguna terapia dirigida para TNBC o para células madre de cáncer de mama.

En la presente memoria se describen datos que demuestran que los RNAs que unen un RNA de interferencia a un RNA estructurado (aptámero) que reconoce una proteína de la superficie celular pueden inactivar la expresión génica en células de cáncer de mama agresivas. Los aptámeros que se unen a proteínas altamente expresadas en células madre de cáncer de mama y la mayoría de las células TNBC pueden inactivar las proteínas necesarias para la división o supervivencia de células cancerosas específicamente en el subtipo más común de TNBC. Estos RNAs pueden ensayarse, por ejemplo, tanto en cultivo tisular como en modelos de ratón de TNBC. En la presente memoria se describe una plataforma para aprovechar los fármacos basados en RNA para tratar el cáncer de mama de mal pronóstico y demostrar su eficacia en un modelo de ratón.

Aplicabilidad final para tratar el cáncer de mama (qué pacientes, cómo ayudarlos, aplicaciones/beneficios/riesgos clínicos, tiempo proyectado para el resultado relacionado con el paciente). Las proteínas que esta terapia puede dirigir se expresan en todas las células epiteliales de cáncer, pero se expresan más fuertemente en las células de cáncer menos diferenciadas, y por lo tanto más malignas. Este enfoque podría usarse para tratar no sólo la mayoría de los cánceres epiteliales de mama (y la mayoría de las células de cáncer de mama son epiteliales), sino que también tiene el potencial de tratar los cánceres comunes, incluyendo colon, pulmón, páncreas y próstata. Nuestro objetivo está en el cáncer de mama de pronóstico más agresivo y más malo, TNBC, que incide preferiblemente en mujeres jóvenes y mujeres de poblaciones minoritarias. Este enfoque permite una nueva plataforma para la terapia del cáncer de mama. Cualquier gen que provoque o promueva cáncer, o combinaciones de genes, podría ser inactivado, haciendo esta estrategia ideal para era venideras de la terapia personalizada del cáncer en donde cada terapia del paciente se personalizará según las características moleculares de su tumor individual.

Además, si un tumor no responde o se vuelve resistente, la mezcla de genes objetivo podría ajustarse con destreza. Debido a que las células epiteliales normales expresan niveles bajos de las proteínas usadas para el direccionamiento, puede haber cierta absorción y toxicidad para las células epiteliales normales, que se evalúa en la presente memoria. Sin embargo, la plataforma es flexible de modo que la carga de siRNA terapéutica puede elegirse para destruir las células tumorales con una toxicidad mínima para las células normales.

En la presente memoria se describen el diseño y ensayos en modelos de TNBC de ratón de varias moléculas capaces de provocar la inactivación génica específica de tumor y la supresión tumoral.

No existe una terapia dirigida para TNBC o para subpoblaciones de células iniciadoras de tumores altamente malignos dentro de cánceres de mama.

El cáncer de mama triple negativo (TNBC) tiene el peor pronóstico de cáncer de mama. 1 -4 No hay terapia dirigida, y las TNBCs a menudo recaen. En la presente memoria se describe el desarrollo de fármacos basados en RNA pequeños que inactivan genes de dependencia tumoral en TNBCs de tipo basal (o basal-A). En principio, el RNA de interferencia (ARNi) puede aprovecharse para inactivar los genes que provocan enfermedad para tratar cualquier enfermedad. 5-9 Sin embargo, convertir RNA pequeños en fármacos es un desafío. Ensayos clínicos recientes de Fase I y II han mostrado una inactivación génica dramática y duradera en el hígado (~80-95%, que dura casi un mes después de una única inyección) sin toxicidad significativa. 10-16 El descubrimiento del potencial de inactivación génica para tratar el cáncer, sin embargo, necesita un método robusto para administrar RNAs en células cancerosas diseminadas, que los RNAs dirigidos al hígado no pueden hacerlo. 7 Una terapia ideal inactivarían selectivamente genes en células cancerosas, preservando las células normales para minimizar la toxicidad. 17

Las AsiCs están compuestas por un aptámero de RNA (un RNA estructurado con alta afinidad por un receptor) 18, 19 unido covalentemente a un siRNA (Figuras 10A-10B).

En la presente memoria se describe el uso de una AsiC para inactivar genes en cánceres epiteliales usando un aptámero de EpCAM. 37 EpCAM, el primer antígeno tumoral descrito, se expresa altamente en todos los cánceres epiteliales comunes. 38-45 En cánceres epiteliales de mama, EpCAM es ~400 veces más abundante que en tejido de mama normal. 46 EpCAM39, 45, 47-53 también se expresa altamente en la mayoría de las células iniciadoras de tumores cancerosos epiteliales (T-IC, también conocidas como células madre cancerosas). 39,45,47-53

El aptámero de EpCAM tiene alta afinidad (12 nM) y es corto (19 nt), que es ideal para un fármaco de AsiC, ya que los RNA <60 nt pueden sintetizarse de manera económica y eficaz. Las EpCAM-AsiCs consisten en una cadena larga de 42-44 nt (aptámero de 19 nt enlazador de 3 nt cadena sentido de siRNA de 20-22 nt) hibridada con una cadena antisentido de siRNA (activa) de 20-22 nt (Figura 10B). Se sintetizan comercialmente con 2'-fluoropirimidinas, que potencian la estabilidad sérica (T1/2 >3d) y bloquean el reconocimiento inmunitario innato. 28, 54-56

El direccionamiento de EpCAM puede provocar la inactivación génica selectiva en TNBCs de tipo basal, en relación con epitelios normales. La inactivación selectiva reducirá tanto la dosis de fármaco como la toxicidad tisular normal. En epitelios normales, EpCAM solo se expresa en uniones gap basolaterales, donde puede no ser accesible. En los cánceres epiteliales, es tanto más abundante como distribuida a lo largo de toda la membrana celular. EpCAM promueve la adhesión, y también potencia la proliferación e invasividad. La escisión proteolítica de EpCAM libera un fragmento intracelular que aumenta la transcripción de factores de células madre. Las propiedades oncogénicas de EpCAM pueden hacer difícil que las células tumorales desarrollen resistencia modulando negativamente EpCAM. El número de células circulantes EpCAM+ está relacionado con un mal pronóstico en el cáncer de mama. De hecho, enumerar las células EpCAM+ circulantes es la base de un método aprobado por la FDA para monitorizar el tratamiento de cáncer de mama, colon y próstata metastásico. En nuestros estudios, 9 de 9 líneas celulares TNBC basal A y de cáncer de mama luminal fueron fuertemente EpCAM+, mientras que una línea epitelial normal de cáncer de mama y TNBCs mesenquimales tuvieron cerca de los niveles de inicio (Figura 1B). Por tanto, la mayoría de las TNBCs de tipo basal y los cánceres de mama luminales probablemente serán dirigido por EpCAM-AsiCs. En datos preliminares, EpCAM-AsiCs inactivaron selectivamente la expresión en líneas celulares de cáncer de mama y colon EpCAM+ pero no en células epiteliales normales o células tumorales mesenquimatosas; la inactivación fue uniforme y comparable a la transfección de lípidos, pero la transfección de lípidos inactivó uniformemente la expresión génica en todas las líneas. (Figura 3A-3C)

La inactivación de AKT1 y la inhibición de la proliferación celular por EpCAM-AsiCs contra PLK1, una quinasa necesaria para la mitosis, se correlacionaron con los niveles de EpCAM. Cuando se mezclaron células epiteliales transformadas normales (BPE) 57 con líneas celulares epiteliales de TNBC, AsiCs de EpCAM- provocaron la muerte celular sensible a PLK1 sólo en las células tumorales, preservando las células BPE (no mostrado). Además, cuando las biopsias de tumores y las biopsias de tejidos normales se co-incubaron con AsiCs fluorescentes, solo los tumores absorbieron las AsiCs y fluorescieron (no mostrado). Estos resultados sugieren que EpCAM-AsiCs son específicas para células tumorales epiteliales en comparación con epitelios normales.

EpCAM marca también T-ICs. 40, 45, 58 Un objetivo importante de la investigación del cáncer es desarrollar una vía para dirigir las T-ICs. Aunque la hipótesis de las células madre es controvertida y puede no aplicarse a todos los cánceres, hay buenas evidencias de que los cánceres de mama contienen una subpoblación de T-IC. 59-82 Las T-ICs son relativamente resistentes a la quimioterapia y también se cree que son responsables de la recaída del tumor y la metástasis. Las AsiCs descritas en la presente memoria se diseñan para dirigir a las T-ICs (epiteliales) con alta eficacia. Como tales, pueden ser adecuadas para eliminar esta subpoblación agresiva dentro de pacientes en riesgo de recaída. Para investigar si EpCAM-AsiCs inhiben las T-ICs de TNBC, se compararon la formación de mamosfera y colonias (sustitutos in vitro de la función de T-IC) de células tumorales de mama que se trataron de manera simulada o se trataron con EpCAM-AsiCs contra eGFP o PLK1. EpCAM-AsiCs de PLK1, pero no AsiCs de GFP de control, eliminaron la formación de mamosfera y colonias de líneas celulares de TNBC de tipo basal y luminal de mama (Figura 11D). Las EpCAM-AsiCs de PLK1 también redujeron las células CD44+ CD24bajo y Aldefluor+ (no mostrado). Es importante destacar que el tratamiento con EpCAM-AsiCs de PLK1 eliminó la iniciación tumoral por TNBCs de tipo basal, pero, como se esperaba, no tuvo efecto sobre la iniciación tumoral de TNBC basal B (datos no mostrados). Las líneas celulares que expresan luciferasa se trataron de manera simulada o se trataron durante la noche con AsiCs antes de la implantación ortotópica en la almohadilla adiposa mamaria.

Las AsiCs dirigidas a EphA2, importantes en la señalización del receptor de EGF, también se contemplan en la presente memoria 83-92. EphA2 se expresa en líneas celulares de TNBC epiteliales y mesenquimales (basal-A y basal-B, respectivamente), incluyendo sus T-ICs, pero menos que EpCAM y solo débilmente en otros cánceres de mama. La inhibición de EphA2 reduce el crecimiento tumoral y la angiogénesis en múltiples modelos de cáncer. Además, EphA2 es accesible selectivamente en células cancerosas, pero no en células normales.

También se contemplan en la presente memoria AsiCs de reacción cruzada ratón-humano, que serán valiosas para el desarrollo futuro de fármacos, ya que permitirán evaluar la toxicidad y la eficacia en modelos de tumores de ratón espontáneos.

Las AsiCs dirigidas a EphA2 pueden producir RNAs de funcionamiento dual que inhiben tanto la señalización de EphA2 como la proliferación celular y los genes de inactivación.

Las AsiCs son ideales para la terapia personalizada del cáncer, ya que los genes dirigidos para la inactivación pueden ajustarse a las características moleculares de un tumor. Además, pueden ensamblarse mezclas de RNAs para inactivar múltiples genes a la vez para terapia combinatoria para anticipar y superar la resistencia a fármacos. AsiCs no solo dirigen el fármaco al tumor, sino que los siRNAs también se pueden elegir para atacar los talones de Aquiles específicos del tumor. Los siRNAs también proporcionan una oportunidad única para dirigir genes "intoxicares". Los AsiCs que inactivan los genes de dependencia tumoral, necesarios para la supervivencia tumoral, pero no de células normales, deberían tener toxicidad reducida. Para identificar las dependencias genéticas de las TNBCs de tipo basal que se pudieron inactivar, se realizó una prueba de mortalidad de siRNA de todo el genoma que comparaba 2 líneas celulares de TNBC - células BPLER de tipo basal y HMLER mioepiteliales, 10 células epiteliales de mama humanas transformadas con los mismos oncogenes en diferentes medios. 57, 93

Aunque esencialmente isogénico, las BPLER son altamente malignas y están enriquecidas para las T-ICs, formando tumores en ratones nude con sólo 50 células, mientras que las HMLER necesitan >105 células para iniciar tumores. La selección identificó 154 genes de los que dependió BPLER, pero no HMLER. Los genes del proteasoma estaban altamente enriquecidos (P < 10-14). La expresión génica de dependencia de BPLER se correlacionó con un pronóstico malo en cáncer de mama, pero no de pulmón o colon. Debido a que las TNBCs son heterogéneas 1, 3, 4, 94, para identificar dependencias compartidas en las TNBCs de tipo basal, se realizó otra selección para ensayar 17 líneas celulares de cáncer de mama para su dependencia en los 154 genes de dependencia de BPLER (no publicados). Aunque muchas de las dependencias de BPLER se compartieron con solo un subconjunto de líneas celulares de TNBC de tipo basal, el proteasoma, MCL1, algunos genes de corte y empalme y algunos otros genes nuevos se pusieron de manifiesto porque prácticamente todas (al menos 8 de 9) líneas de TNBC de tipo basal eran dependientes de estos genes, pero las células normales no lo eran. Como se predijo la selección, el inhibidor del proteasoma bortezomib a la vez mató las TNBC basales A y también bloqueó la función de T-IC, evaluado mediante la formación de colonias y mamosferas, de nuevo principalmente de manera selectiva en TNBCs de tipo basal. La breve exposición a bortezomib también inhibió la formación de colonias y la inhibición tumoral de una línea de TNBC epitelial de ratón. Bortezomib inhibió fuertemente el crecimiento tumoral de múltiples líneas basal-A humanas y TNBC primarias que surgieron espontáneamente en ratones Tp53+/-, pero no en líneas celulares basal-B o luminales. Bortezomib también bloqueó la colonización de pulmón metastásico de células TNBC inyectadas por vía IV. Sin embargo, bortezomib no penetra bien en tumores sólidos. La dosis máxima tolerada fue necesaria para inhibir la actividad del proteasoma y suprimir los tumores. Aunque la penetración tumoral puede mejorar con inhibidores del proteasoma en el desarrollo, la inactivación génica del proteasoma podría proporcionar una inhibición del proteasoma más sostenida y eficaz.

EpCAM- y EphA2-AsiCs pueden usarse para la inactivación génica dirigida para tratar cánceres de TNBC de tipo basal, preservando las células normales y eliminando las T-ICs dentro de ellas. Puede haber alguna absorción en células epiteliales normales que expresen débilmente EpCAM o EphA2, pero la inactivación génica se concentrará en células tumorales brillantes de ligando aptámero.

Se puede determinar qué subtipos de cáncer de mama se dirigen a EpCAM- y EphA2-AsiCs y determinar cómo el nivel de ligando aptámero afecta al silenciamiento génico. También se puede evaluar la absorción/inactivación en tejidos cancerosos frente al epitelio normal. Se puede comparar EpCAM-AsiCs con EphA2-AsiCs para determinar la eficacia para provocar la inactivación en TNBCs de tipo basal. Se puede determinar si EpCAM-AsiCs y EphA2-AsiCs pueden dirigirse a T-ICs para inhibir la iniciación tumoral.

Los estudios farmacocinéticos (PK)/farmacodinámicos (PD) de EpCAM- y EphA2-AsiCs se pueden realizar usando la obtención de imágenes de animales vivos de ratones xenoinjertados con TNBC ortotópicos. Las muestras de tejido y los animales tratados pueden examinarse para determinar la toxicidad y la activación inmune innata, y las AsiCs se modificarán químicamente si es necesario para mejorar la PK/PD o reducir la toxicidad. Como prueba de principio, se evaluará el efecto antitumoral de la inactivación de PLK1. La supresión de genes de dependencia de TNBC basal-A recientemente identificados, tales como genes de MCL1 y proteasoma se puede lograr según los métodos descritos en la presente memoria.

En la presente memoria se contemplan:

aptámeros reactivos de especies cruzadas que reconocen EpCAM y EphA2 y se internalizan selectivamente en TNBCs basal-A frente a células epiteliales normales

la verificación de la absorción selectiva, el silenciamiento génico y el efecto citotóxico in vitro de AsiCs dirigidas a TNBC en líneas celulares de cáncer de mama frente a células epiteliales normales, la determinación de los subtipos de líneas celulares de cáncer de mama que transfectan y la evaluación de su potencial para transfectar y eliminar T-ICs de mama

la evaluación de la administración sistémica y la concentración tumoral in vivo, definición de PK y PD y dosis máximamente tolerada de AsiCs dirigidas a TNBC, y la evaluación del efecto antitumoral de AsiCs dirigidas a TNBC optimizadas que inactivan PLK1 y genes de dependencia de TNBC de tipo basal en modelos de líneas celulares de TNBC humanas de cáncer primario y metastásico en ratones

Selección de aptámeros dirigidos a TNBC. Los aptámeros que se unen a un objetivo elegido se identifican mediante selección iterativa de bibliotecas combinatorias de secuencias de ácidos nucleicos de gran complejidad (típicamente 1012-1014 secuencias distintas) mediante un proceso denominado SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment). 95, 96 En el método clásico, la biblioteca de RNA se incuba con la proteína objetivo y los RNAs que se unen se separan y amplifican para generar un conjunto de RNAs de unión. Estos se aplican otra vez en múltiples ciclos para generar agrupaciones de RNA de alta afinidad cada vez más enriquecidas. La identificación de las secuencias que emergen después de múltiples rondas de SELEX se llevó a cabo previamente mediante clonación y secuenciación <100 secuencias individuales.

Aunque esto a menudo proporcionaba un número suficiente de secuencias ganadoras para identificar aptámeros, el número de secuencias que se analizaron era bastante pequeño en comparación con la complejidad de la secuencia de conjuntos de oligonucleótidos evolucionados. Con muchos ciclos de selección, algunas secuencias de aptámeros eficaces que no se amplifican eficazmente pueden agotarse y perderse. Los métodos de secuenciación profunda de última generación y la bioinformática pueden permitir la evaluación de más secuencias dentro de los grupos de secuencias SELEX de ciclo temprano para identificar las secuencias de aptámeros ganadoras en rondas de selección tempranas, reduciendo así el tiempo y los recursos necesarios para completar la identificación de aptámeros de alta afinidad. 30, 97-104

Una propiedad importante de los aptámeros útiles para la incorporación en AsiCs es la internalización eficiente en las células. Algunos ligandos de proteínas de la superficie celular se internalizan eficazmente después de unirse a sus proteínas objetivo de la superficie celular, mientras que otros no. Otra estrategia ("toggle SELEX") selecciona aptámeros de reactividad cruzada que reconocen el mismo ligando de diferentes especies, un atributo útil para el desarrollo preclínico. Alternando los ciclos entre la selección con ligandos proteicos ortólogos (por ejemplo, formas de ratón y humanas), es posible enriquecer con aptámeros reactivos de especies cruzadas. 105

Estas técnicas SELEX pueden permitir la identificación de aptámeros reactivos de especies cruzadas de alta afinidad para EpCAM y EphA2 que se internalizan en TNBCs de tipo basal humanas (y de ratón), pero no en una línea celular epitelial inmortalizada normal. Para seleccionar aptámeros adicionales de EpCAM y EphA2 que tienen actividad antagonista y/o reconocen de forma cruzada el antígeno de ratón correspondiente (el aptámero de EpCAM publicado no reconoce EpCAM de ratón (datos no mostrados)), se puede alternar entre proteínas objetivo recombinantes purificadas humanas y de ratón disponibles comercialmente, comenzando con una biblioteca de 1012 secuencias de RNA que contienen 2'-fluoropirimidinas. Esta biblioteca de oligonucleótidos de 51 nt de longitud se diseña con una región aleatoria de 20 nucleótidos flanqueada por regiones constantes de secuencia conocida para la amplificación por PCR en cada ronda de selección. Se utilizarán los métodos descritos previamente para seleccionar los RNAs de alta afinidad que se unen a proteínas inmovilizadas marcadas en el extremo C-terminal. 37 (Esto deja la región N-terminal expuesta para facilitar la selección de aptámeros que reconocen el dominio extracelular). Se puede usar una proteína de control marcada para aclarar previamente la biblioteca de aptámeros de RNA para eliminar aglutinantes no específicos. Pueden realizarse 7-10 rondas iterativas de SELEX para enriquecer aptámeros específicos. El enriquecimiento después de cada ronda se puede monitorizar mediante resonancia de plasmón superficial. Los conjuntos enriquecidos que muestran unión específica pueden secuenciarse usando secuenciación de alto rendimiento. Las secuencias pueden elegirse para validación experimental usando análisis bioinformático de las secuencias de la biblioteca enriquecida como se describe. 97, 98,106

Las 10-15 secuencias superiores de la secuenciación de alto rendimiento y el análisis bioinformático se pueden evaluar mediante resonancia de plasmón superficial para evaluar las afinidades de unión relativas como se describe, 99,106 usando los aptámeros humanos previamente caracterizados para su comparación.

Un enfoque alternativo para identificar aptámeros de alta afinidad con reactividad cruzada es la internalización celular SELEX, selección de manera positiva en células 293T transfectadas para expresar EpCAM humana o de ratón y aclarar previamente células que expresan una proteína de control. La capacidad de los 5 aptámeros de mayor afinidad para internalizarse en células EpCAM/EphA2+ se comparará con los aptámeros seleccionados previamente mediante qRT-PCR y citometría de flujo (usando aptámeros marcados fluorescentemente) como se describió previamente. 37 Estos aptámeros también pueden evaluarse para determinar su capacidad para inhibir específicamente la proliferación de líneas celulares tumorales. Los aptámeros con esta propiedad pueden ser antagonistas de receptores, que se verificarán examinando su efecto sobre la señalización celular. Dada la alta homología entre los dominios extracelulares de EphA2 humano y de ratón (> 90% de identidad; > 90% de homología estructural), la identificación de aptámeros que reaccionan de forma cruzada con EphA2 humana y de ratón puede ser tan simple como probar los aptámeros ya seleccionados para reactividad cruzada contra ratón. El conjunto existente de 20 aptámeros de EphA2 humana puede por lo tanto evaluarse primero para determinar la capacidad para unirse a EphA2 de ratón. Alternativamente, se puede seguir el enfoque descrito anteriormente. Para algunos de los aptámeros superiores, pueden sintetizarse secuencias truncadas (que carecen de cualquiera o ambas de las secuencias del adaptador de bibliotecas) para definir la secuencia mínima necesaria para la unión.

Se pueden identificar aptámeros de ~20-35 nt de longitud para cada ligando, que se pueden diseñar en AsiCs susceptibles de síntesis química.

Evaluación in vitro de AsiCs dirigidas a TNBC y su actividad contra T-Ics. Se puede definir qué subtipos de cáncer de mama se transfectan eficazmente con AsiCs dirigidas a TNBC y evaluar si la inactivación tumoral es específica con respecto a las células de tejido normales, primero en líneas celulares y después en 10 muestras de tumor para verificar que los resultados para líneas celulares se traducen en 10 tejidos. También se puede evaluar el potencial de AsiCs dirigidas a TNBC para transfectar y dirigirse a T-ICs de mama.

Diseño de AsiC y prueba iniciales. Los aptámeros más atractivos identificados anteriormente (priorizados basándose en consideraciones de afinidad, selectividad de unión y expresión en cáncer de mal pronóstico frente a células normales, truncamiento a longitud más corta, la importancia del ligando en la oncogénesis y comportamiento de células madre, antagonismo de receptores y reactividad cruzada de especies) pueden diseñarse en AsiCs mediante unión a siRNAs dirigidos a eGFP, AKT1 y PLK1 (frente a siRNAs mezclados de control) que se han usado para las EpCAM-AsiCs iniciales tal y como se describió anteriormente en la presente memoria.

Se generaron previamente líneas celulares de NBC de tipo basal que expresaban de manera estable EGFP desestabilizado (d1) (proteína T1/2 de ~1 h) usando lentivirus. La expresión de GFP puede cuantificarse fácilmente mediante flujo y obtención de imágenes, y su inactivación no tiene consecuencias biológicas. El T1/2 corto permite la detección rápida y sensible de la inactivación. AKT1, que se expresa en todas las células, es un buen gen endógeno a estudiar, ya que su inactivación no afecta mucho a la viabilidad celular.

PLK1 se usa por su efecto antitumoral porque su inactivación es citotóxica para las células en división. En la presente memoria se describe la inactivación génica robusta y reproducible con EpCAM-AsiCs dirigida a cada uno de estos genes. Las AsiCs se sintetizarán químicamente con 2'-fluoropirimidinas para la estabilidad e inhibición del reconocimiento inmune innato y los residuos dT en sus extremos 3'-terminales para proteger contra la digestión con exonucleasa. Las 2 cadenas se hibridarán para generar el RNA final (Figura 10A-10B). Estos AsiCs pueden evaluarse y compararse con la EpCAM-AsiC original (como control positivo) y asiCs de CD4- o PSMA- (como control negativo) en experimentos de respuesta a la dosis in vitro para la absorción de AsiC (usando fluoróforos tales como AF-647 (que no afecta la actividad de AsiC) conjugado con el extremo 3'-terminal de la cadena corta), inactivación génica y crecimiento y supervivencia reducidos de la línea celular tumoral. La absorción selectiva, la inactivación génica y el efecto antitumoral en unas pocas líneas celulares de TNBC basal A humanas (MB468, HCC1937, BPLER frente a células epiteliales inmortalizadas) se pueden cuantificar mediante citometría de flujo; citometría de flujo y qRT-PCR; y tinción con Cell-TiterGlo y anexina-PI, respectivamente. Estos experimentos pueden permitir la selección de una cantidad de las AsiCs de mejor rendimiento que reconocen EpCAM y EphA2.

Tipos de cáncer de mama sensibles a AsiCs dirigidas a TNBC. Se puede determinar qué tipos de cáncer de mama se pueden transfectar con las AsiCs seleccionadas y cómo la inactivación génica específica está en tumores con respecto a células epiteliales normales. Se puede evaluar la inactivación in vitro por las AsiCs seleccionadas en 20 líneas celulares de cáncer de mama humano que representan los subtipos comunes de cáncer de mama, pero están ponderadas hacia TNBC (14 líneas de TNBC, más un muestreo de líneas celulares luminal y Her2+). 93 La expresión del ligando aptámero, absorción de AsiC marcado fluorescentemente y silenciamiento génico se pueden comparar con BPE57 y líneas de fibroblastos como controles negativos. Este gran panel de líneas celulares puede permitir la evaluación de cómo los niveles de EpCAM y EphA2 en la superficie celular influyen en la absorción de RNA y el silenciamiento génico y si hay un umbral de expresión necesario para la inactivación eficaz. Un experimento de respuesta a la dosis puede permitir la verificación de que la alta afinidad de los aptámeros se conserva en la AsiC. La especificidad de la absorción (frente a la "adherencia" no específica) se verificará usando lavado con ácido para eliminar los aptámeros débilmente adheridos y mostrando que la unión es competitiva por los aptámeros no marcados y eliminados cuando las células son tripsinizadas antes del tratamiento. La transfección mediada por AsiC se comparará con la transfección de lípidos como control positivo y con siRNA desnudo como control negativo. La inactivación se evaluará mediante citometría de flujo y qRT-PCR después de 5 días, el tiempo óptimo para la inactivación mediada por AsiC. Se espera que la absorción y el silenciamiento génico se correlacionen con los niveles de ligando aptámero. Para verificar que la especificidad por las células tumorales se mantiene en mezclas de células epiteliales de mama no transformadas con ligando+ y ligandim/-, se puede comparar la absorción de AsiC fluorescente, la inactivación génica y la supervivencia cuando PLK1 es el gen objetivo en mezclas de células tumorales que expresan diferentes niveles de ligando aptámero con diferentes números de células BPE de GFP+.

Absorben las células epiteliales primarias de cáncer de mama preferiblemente AsiCs dirigidas a TNBC y muestran inactivación con respecto a las células epiteliales normales en explantes de tejido? Para evaluar la absorción y la inactivación del tumor primario y anticipar la posible toxicidad para las células de tejido normales, se puede evaluar después la transfección in situ y la inactivación génica en explantes de 10 cánceres de mama luminales, Her2+ y TNBC y tejido normal circundante. Se pueden analizar muestras de ~25 tumores para proporcionar una búsqueda exhaustiva de subtipos de tumores comunes. La tipificación tumoral puede confirmarse mediante histología y tinción de inmunohistoquímica (IHC) para ER, PR, Her2 y E-caderina. Si el aptámero reconoce el ligando de ratón, también se puede evaluar la posible toxicidad para epitelios normales usando tumor/tejidos normales de ratón. Se pueden comparar tejidos normales que no tienen una gran fuente competitiva de células tumorales con tejidos que contienen células tumorales. Esto podría ser importante para anticiparse a la toxicidad en situaciones en donde se administran AsiCs a pacientes con carga tumoral baja/indetectable después de la terapia o cirugía. Estos experimentos también pueden permitir la evaluación de si la inactivación para 10 tumores es comparable a la de las líneas celulares, si la arquitectura del tejido afecta a la absorción/inactivación en células tumorales y cómo de bien se transfectan los subtipos de tumores diferentes. Se contempla en la presente memoria que los cánceres epiteliales de mama experimentarán una inactivación génica eficaz, pero no las células epiteliales normales.

Las biopsias, cortadas en piezas de ~3 x 3 x 3 mm3, se pueden transfectar en pocillos de microtitulación, que deben imitar la absorción in vivo después de la infusión SQ o IV. Los siRNAs encapsulados con lipofectamina y los siRNA conjugados con colesterol son ambos eficaces en la inactivación génica de células epiteliales normales en la mucosa del tracto genital escamoso y columnar polarizado 108, 109, mientras que los siRNAs desnudos no se absorben. Se esperan resultados similares con estos controles en tejido epitelial de mama normal. En paralelo, se puede analizar la inactivación de 10 células digeridas con colagenasa para comparar la inactivación con lo que se logra en tejido y con líneas celulares de cáncer. En primer lugar, se pueden verificar estos controles usando siRNAs para dirigirse a genes epiteliales, que previamente se han desactivado (tales como E-caderina, citoqueratina (CK)-5 (un buen marcador de células basales) y 14, y nectina-1) 93,108,109, cuya expresión se puede seguir fácilmente por IHC, microscopía de fluorescencia (FM) o citometría de flujo de células aisladas. La tinción del gen objetivo puede correlacionarse con la tinción de marcadores fenotípicos y siRNAs marcados fluorescentemente para determinar qué tipos celulares se dirigen. El anticuerpo Pan-CK puede distinguir las células epiteliales (normales y tumorales) del estroma. Es de particular interés la administración y la inactivación de CK5 en células madre de tejido basal poco frecuentes, ya que EpCAM-AsiCs puede dirigirse a estas células y conducir potencialmente a la disminución de células madre de tejido normal. La toxicidad e inflamación del tejido se evaluarán mediante tinción con H&E de secciones de tejido y ensayos de qRT-PCR para interferones de Tipo I y citoquinas inflamatorias (IL-1, IL-6, TNF-!). Modificaciones químicas adicionales de la secuencia de RNA (además de 2'-fluoropririmidinas) se introducirán para eliminar la inflamación potencialmente dañina si se detecta.

Pueden las AsiCs dirigidas a TNBC dirigirse a las células que inician el tumor de mama? Elegimos EpCAM y EphA2 como objetivos de aptámero debido en parte a su potencial para transfectar T-ICs. Las T-ICs de mama no se definen de manera única por marcadores fenotípicos (y de hecho pueden ser heterogéneos 93, 110-113), haciendo los experimentos desafiantes, ya que las T-ICs se definen funcionalmente por su capacidad para iniciar tumores en pequeños números que pueden trasplantarse en serie. La tinción para CD44, CD24, EpCAM, CD133, CD49f o ALDH1 en diferentes combinaciones enriquece las T-ICs. 59, 72, 78, 114-121 Diferentes protocolos definen subconjuntos superpuestos, pero no idénticos, de T-ICs potenciales. Sin desear estar limitado por la teoría, se contempla en la presente memoria que EpCAM- y EphA2-AsiCs serán absorbidas y provocarán el silenciamiento génico en las T-ICs y se pueden usar para la terapia dirigida para eliminar o aumentar la capacidad de las T-ICs dentro de los tumores.

Para analizar la absorción de AsiC y el silenciamiento génico en subpoblaciones de T-IC, puede usarse citometría de flujo multicolor de EpCAM, EphA2, CD44 y CD24 en un panel de líneas de cáncer de mama (TNBCs luminales, Her2+, basales-A y B) para identificar qué líneas celulares de mama tienen poblaciones de T-IC putativas que contienen células que se tiñen brillantemente para EpCAM y/o EphA2. También se puede examinar la tinción para EpCAM/EphA2 de las mamosferas y las células Aldefluor+ 121, 123-125 generadas a partir de estas líneas celulares. Se pueden seleccionar ~4-5 líneas con la expresión de EpCAM/EphA2 más brillante/más uniforme dentro de las T-ICs como las líneas celulares más atractivas para estudiar en este objeto secundario y poder producir variantes estables que expresan (d1)GFP. Estas líneas celulares, así como sus mamosferas y subpoblación Aldefluor+, pueden incubarse con AsiCs marcadas con AF647 (y como control negativo, PSMA-AsiCs no dirigidas) que portan siRNAs de GFP. La absorción de AsiC se evaluará mediante fluorescencia de AF-647 junto con tinción para EpCAM o EphA2, CD44 y CD24 y Aldefluor. Las AsiCs pueden ser absorbidas por células EpCAM+ o EphA2+ CD44+ CD24-/dim Aldefluor+. Para evaluar la inactivación génica en células con fenotipo T-IC, se puede monitorizar la expresión de GFP en la población de T-IC y las células restantes mediante citometría de flujo y qRT-PCR después del tratamiento con eGFP o AsiCs que llevan siRNA de control. También se puede evaluar la inactivación de PLK1 y AKT1 endógenos.

Estos experimentos pueden indicar si T-ICs en diferentes subtipos de cáncer de mama son dirigidas por EpCAM/EphA2-AsiCs. Experimentos posteriores se centrarán en las líneas celulares en donde se tiene >80% de inactivación en poblaciones enriquecidas en T-IC. Si la inactivación es ineficaz, se pueden modificar las condiciones de transfección (cantidad de AsiC, número de células, volumen, etc). Después, se puede evaluar si las AsiCs inhiben la formación de mamosfera y colonias, reducen las subpoblaciones que expresan CD44 y ALDH1, y el tamaño de la población secundaria. Además de inactivar PLK1, se puede diseñar y evaluar AsiCs contra unos pocos genes adicionales de los que dependen las T-ICs de mama para la autorrenovación o mantenimiento de la multipotencia. Las T-ICs de TNBC de tipo basal son sensibles selectivamente a la inhibición del proteasoma. 93

Por lo tanto, se puede evaluar la inactivación de un componente del proteasoma (PSMA2) y potencialmente otros genes de dependencia de T-IC selectivos (tales como MSI1 (Musashi), una proteína de unión a RNA en T-ICs de mama que regula la señalización de Wnt y Notch 126-130 o BMI1, un componente policomb necesario para la autorrenovación de células madre 131-134). Después de verificar que estos genes se expresan y se inactivan en células de mamosferas, se pueden tratar tanto células adherentes como mamosferas con AsiCs dirigidas a PLK1, MSI1, BMI1 o PSMA2 o con AsiCs dirigidas a eGFP como control negativo y medir el tamaño de las subpoblaciones de T-IC después de 5-7 días mediante tinción con CD44, CD24, EpCAM, CD133, CD49f y ALDH1. También se puede medir la proporción de células que desprenden colorantes de moléculas pequeñas (la "población secundaria"). Estos experimentos pueden complementarse mediante ensayos funcionales que cuantifican la frecuencia de células formadoras de colonias y mamosferas. La sustitución en serie puede evaluar si se inhibe la capacidad de propagar de manera continua T-ICs como esferas. Se contempla en la presente memoria que la inactivación de PLK1, MSI1, BMI1 o PSMA2 puede reducir los números de T-IC, la proliferación y la función en las T-ICs de algunas líneas celulares, pero diferentes genes pueden ser más activos para diferentes líneas celulares de mama. Por ejemplo, la inhibición del proteasoma eliminó las T-ICs en TNBCs de tipo basal, pero solo en 1 de 3 líneas celulares de TNBC mesenquimales y no en tumores no de TNBC más diferenciados. 93

Los enfoques de la inactivación que suprimen T-IC pueden investigarse adicionalmente mediante experimentos que usan inhibidores químicos cuando están disponibles (tales como bortezomib) o examinando si la inactivación de otros genes en la misma ruta (tal como NOTCH1, p-catenina o WNT1 para MSI1) también tiene actividad anti-T-IC. Después, se puede determinar si la exposición ex vivo a corto plazo de líneas de TNBC de tipo basal a AsiCs inhibe la iniciación tumoral de TNBC como la medida final de la inhibición de la capacidad de T-IC, usando AsiCs que parecen prometedores in vitro. Se evaluará la viabilidad de las líneas celulares, tratadas durante la noche con las AsiCs elegidas (y como controles negativos las AsiCs que usan aptámero de PSMA o contienen siRNA de eGFP). Después de verificar que la exposición de siRNA a corto plazo no afecta a la viabilidad, las células tratadas ex vivo se inyectarán en un intervalo de números de células ortotópicamente en ratones NOD/scid/"c-/- (NSG) (estos ratones tienen la absorción más alta para la implantación del tumor). El tratamiento con bortezomib durante 24 h (en este momento ~40 % de las células todavía son viables) puede servir como control positivo.

Evaluación in vivo de AsiCs dirigidas a TNBC

Unas pocas de las AsiCs que funcionan mejor pueden evaluarse después in vivo usando ratones nude que llevan xenoinjertos de almohadilla adiposa de mama de una línea ligando aptámero TNBC basal-A, tal como MB468 o HCC1187, por un lado, en comparación con la línea celular de cáncer de mama-ligando, tal como MB231 basal B, por el otro (-5-8 ratones/gp para obtener estadísticas reproducibles basadas en nuestra experiencia con estos modelos). Para la obtención de imágenes in vivo, ya se han realizado líneas celulares luminiscentes/fluorescentes estables mediante infección con lentivirus que expresan luciferasa y mCherry.

Administración sistémica e inactivación en células tumorales. Debido a que las AsiCs no modificadas son pequeñas (~30 kDa), cuando se inyectan IV o IP, se eliminan rápidamente por filtración renal. El polietilenglicol (PEG) de 20 kDa puede unirse al extremo 5'-terminal de la cadena inactiva (pasajera) del siRNA. 21 Los PSMA-AsiCs PEGilados inyectados por vía IV se concentraron en tumores subcutáneos; la PEGilación extendió el T1/2 circulante de las AsiCs inyectadas desde <35 min hasta >>30 h, aumentó la durabilidad del silenciamiento génico a ~5 días y redujo la dosis inhibidora tumoral eficaz 8 veces a 250 pmol x 5 inyecciones. También se encontró (no mostrado) que la inyección SQ de 5 mg/kg de CD4-AsiCs no modificadas provocó la inactivación específica sistémica en células CD4+ en el bazo y ganglios linfáticos proximales y distales de ratones humanizados. Por lo tanto, se pueden comparar los niveles de AsiC después de la administración IV y SQ de los constructos de AsiC originales y PEG-AsiCs mediante obtención de imágenes in vivo usando AsiCs acopladas a AF-790 y el espectro de IVIS y mediante el ensayo Taqman de la cadena activa en muestras de sangre, orina, hígado y tumor. Las muestras pueden analizarse durante 5 días con recolección de muestras frecuente el primer día. Las secciones de tejido pueden evaluarse para determinar el daño tisular y la sangre puede analizarse para determinar la toxicidad hematológica, hepática y renal mediante recuentos sanguíneos y químicas séricas. La toxicidad asociada con la inducción de la inmunidad innata o la inflamación puede evaluarse mediante ensayos ELISA de interferones séricos y citoquinas inflamatorias. Se pueden calcular el T1/2 circulante y la proporción del fármaco inyectado que se localiza en el tumor de EpCAM+. Basándose en nuestros experimentos preliminares con administración SQ e IV de los CD4-AsiCs y la experiencia in vivo con el PSMA-AsiC 9,21,25, se contempla en la presente memoria, sin desear estar limitado por la teoría, que las AsiCs no PEGiladas se excretarán rápidamente después de la administración IV, pero que las EpCAM-AsiC SQ y PEG-AsiCs IV tendrán una localización más favorable para los xenoinjertos tumorales.

La inactivación de mCherry y PLK1 después de una única inyección de AsiC en un intervalo de concentraciones puede evaluarse mediante formación de imágenes in vivo y mediante citometría de flujo, FM y qRT-PCR de muestras tumorales recogidas 4, 7 y 12 días después del tratamiento. Estos experimentos pueden proporcionar estimaciones de la dosis eficaz necesaria para la inactivación génica máxima del tumor del 50, 75 y 90% (ED50, ED75, ED90) y para la durabilidad de la inactivación en el tumor (cuantificada como T-KD50 = tiempo para que la expresión del tumor vuelva a la mitad del control a partir de la inactivación máxima). Estos parámetros pueden determinarse para cada constructo. También se puede determinar la dosis máxima tolerada (MTD) para los constructos de PLK1. La PK/PD inadecuada o los signos de estimulación inmune innata nos llevarán a ajustar las modificaciones químicas (añadiendo 2'-OMe ribosas a algunos residuos) o añadir polímeros de PEG más largos para mejorar estos parámetros usando procedimientos directos.

Efecto antitumoral. Se puede ensayar mediante la obtención de imágenes in vivo como son de eficaces las mejores AsiCs dirigidas a TNBC frente a tumores basal A implantados en las almohadillas adiposas mamarias o inyectados IV (como un modelo de metástasis) en ratones nude. Se puede comenzar dirigiendo PLK1 como prueba de principio. 21, 107 Se pueden inyectar PLK1-AsiCs SQ y/o IV en grupos de 8 ratones (tamaño de grupo elegido para la significación estadística basándose en experimentos previos) que llevan un tumor de almohadilla adiposa de TNBC basal-A usando programas de dosificación elegidos basándose en los resultados de PK/PD. Los ratones pueden tratarse tan pronto como los tumores se vuelven palpables. Se compararán los efectos sobre un tumor ligando+ y ligando- representativo. Los ratones control pueden tratarse con PBS o siRNA desnudos, AsiCs que llevan un siRNA mezclado y PSMA-AsiCs de PLK1. El tamaño del tumor se puede cuantificar mediante la obtención de imágenes y calibradores. Si el efecto antitumoral es subóptimo, el régimen de dosificación puede ajustarse al régimen máximo tolerado.

También se puede comparar el efecto de la inactivación de PLK1 y la quimioterapia estándar de atención, administrada sola y en combinación para anticipar estudios clínicos potenciales. Si hay regresión tumoral completa, se pueden evaluar dosis disminuidas. También se pueden evaluar regímenes eficaces en ratones a los que se han implantado unas pocas otras líneas de TNBC basal A para verificar la generalidad de la respuesta antitumoral. También se puede evaluar el tratamiento con AsiC después de inyectar células tumorales IV para determinar la eficacia contra metástasis distales. En el momento del sacrificio, los ratones pueden sacrificarse y las almohadillas adiposas mamarias pueden inspeccionarse para determinar el tumor microscópico o macroscópico residual mediante FM, H&E e IHC. También se puede evaluar la expresión de EpCAM/EphA2 en células tumorales residuales para determinar si se puede haber desarrollado resistencia tumoral como consecuencia de la regulación negativa del ligando aptámeros. Los ratones tratados también pueden observarse en cuanto a signos clínicos de toxicidad y en el momento del sacrificio pueden examinarse cuidadosamente en cuanto a toxicidad en el intestino y la médula ósea, mediante recuentos de sangre y examen patológico de intestino, médula ósea y bazo. Las AsiCs diseñados con los aptámeros de reacción cruzada se pueden usar para evaluar la toxicidad epitelial normal. Usando nuestro mejor diseño de AsiC, después puede comenzarse a comparar la inactivación de PLK1 con la inactivación de genes de dependencia de TNBC (tales como PSMA2 o MCL1) identificados en nuestra selección de siRNA 93 probado solo o en combinación con PLK1.

Referencias citadas

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Ejemplo 4

El RNA de interferencia (RNAi) ofrece la oportunidad excitante de tratar la enfermedad inactivando los genes causantes de la enfermedad. Ensayos clínicos recientes en fase temprana han mostrado una inactivación génica prometedora y sostenida y/o un beneficio clínico en una cantidad de enfermedades provocadas por la expresión génica aberrante en el hígado. El principal obstáculo para aprovechar el RNAi para el tratamiento del cáncer es la administración de RNAs pequeños a células cancerosas diseminadas. La mayoría de las células epiteliales cancerosas y las células iniciadoras de tumores (T-IC) dentro de ellas expresan altamente EpCAM, el primer antígeno tumoral descrito. Todas las líneas celulares epiteliales de cáncer de mama que se probaron tiñen de manera brillante para EpCAM, mientras que las células epiteliales normales inmortalizadas de mama y los fibroblastos no lo hacen. La inactivación génica dirigida en células epiteliales cancerosas in vitro se puede lograr usando RNAs quiméricos compuestos de un RNA estructurado, llamado aptámero, seleccionado para la unión de alta afinidad a EpCAM, que se une covalentemente a un siRNA. Estas quimeras aptámero de EpCAM-siRNA (AsiC) son absorbidas por las células EpCAM+ y provocan selectivamente la inactivación génica en células epiteliales de cáncer de mama, pero no en células epiteliales normales. Además, la inactivación de PLK1 con EpCAM-AsiCs suprime la formación de colonias y mamosferas de líneas epiteliales de cáncer de mama, ensayos in vitro de potencial iniciador de tumores e iniciación de tumores.

Las EpCAM-AsiCs de PLK1 inyectadas por vía subcutánea se absorben específicamente por xenoinjertos ortotópicos de cáncer de mama triple negativo (TNBC) basal-A de EpCAM+ y provocan una regresión tumoral rápida. El TNBC tiene el peor pronóstico de cualquier cáncer de mama y no hay terapia dirigida para el mismo. Se contempla específicamente en la presente memoria que las EpCAM-AsiCs se puedan usar para la inactivación génica dirigida para tratar cánceres epiteliales de TNBC (de tipo basal), preservando las células normales, y eliminando las T-ICs dentro de ellas. Se puede definir qué subtipos de cáncer de mama pueden ser dirigidos por EpCAM-AsiCs y determinar cómo el nivel de EpCAM afecta a la absorción y al silenciamiento génico. La absorción/inactivación relativa en células cancerosas que expresan EpCAM y epitelio normal puede evaluarse en explantes de tejido de cáncer de mama humano. También se puede determinar si EpCAM-AsiCs puede dirigirse a T-ICs de mama para interrumpir la iniciación tumoral.

Las características similares a las de un fármaco de EpCAM-AsiCs pueden optimizarse. EpCAM-AsiCs se puede optimizar para la absorción celular, la liberación endosomal, la administración sistémica y la inactivación génica in vivo. La farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) de la absorción de EpCAM-AsiC y el silenciamiento génico y la supresión tumoral pueden evaluarse usando la obtención de imágenes de animales vivos en modelos de xenoinjerto de líneas celulares de TNBC. Como prueba de principio, puede evaluarse el efecto antitumoral de la inactivación de PLK1, que es necesaria para la proliferación celular. Además, la inactivación de nuevos objetivos génicos identificados en una selección de siRNA de genoma completo para determinar dependencias genéticas de TNBC se evaluará en modelos de xenoinjerto de ratón. Se puede usar una EpCAM-AsiC optimizada y el conocimiento de su PK, PD y posible toxicidad, en experimentos para toxicidad adicional y otros estudios preclínicos.

En la presente memoria se describe el desarrollo de quimeras de aptámero de EpCAM-siRNA como un método dirigido a la inactivación génica dirigida en cáncer de mama triple negativo de tipo basal y otros cánceres epiteliales y las células iniciadoras de tumores dentro de ellos. Actualmente no existe una terapia dirigida para los cánceres de mama triple negativos, que recaen con frecuencia, o para subpoblaciones de células iniciadoras de tumores altamente malignos dentro de los cánceres de mama, que pueden ser responsables de algunos casos de resistencia a fármacos y recaídas. Estos RNAs proporcionan una plataforma versátil y flexible para fármacos basados en RNA para tratar cánceres de mama de mal pronóstico.

Ejemplo 5

Se demuestra en la presente memoria que (1) el aptámero de EpCAM por sí mismo no afecta al crecimiento o viabilidad celular de líneas celulares de tumor de mama de EpCAM+ (no mostradas); (2) cuando se mezclan biopsias de mama normales con tejidos de tumor de mama humano TNCB de EpCAM+ in vitro, las EpCAM-AsiCs fluorescentes solo se concentran en el tumor (Figura 14); (3) tratamiento de células TNBC luminales y basal-A de EpCAM+, pero no de TNBCs mesenquimales, con EpCAM-AsiCs de PLK1 bloquea ensayos in vitro de células iniciadoras de tumores (TIC, formación de colonias y mamosferas) e iniciación tumoral in vivo (Figura 15A-15C y 16); (4) las EpCAM-AsiCs inyectadas por vía subcutánea (sc) se concentran en tumores EpCAM+ en ratones que portan TNBCs de EpCAM+ y EpCAM- en cualquier flanco, localizados distantemente del sitio de inyección (Figuras 17A-18B); y (5) lo más importante, la inyección sc de EpCAM-AsiCs de PLK1 conduce a la regresión completa de xenoinjertos de TNBC basal-A palpables (Figuras 18A-18B). Además (6) una nueva selección de siRNA identificó nuevas dependencias genéticas compartidas de TNBCs basal-A para la inactivación de EpCAM-AsiC (Figura 19).

Sin desear estar ligados por la teoría, las T-ICs son heterogéneas y plásticas en la expresión génica epitelial/mesenquimal. Aunque las características mesenquimales pueden facilitar la invasión inicial de tejido, la formación de metástasis clínicamente significativas (colonización) puede necesitar propiedades epiteliales. La administración de siRNA mediada por EpCAM bloquea eficazmente la iniciación tumoral, pero solo para cánceres de mama epiteliales (TNBC basal-A, luminal).

La alta afinidad del aptámero de EpCAM y nuestra absorción, inactivación génica y experimentos de proliferación en poblaciones uniformes y mixtas de células muestran un direccionamiento específico a células EpCAM+. Las células epiteliales normales y los fibroblastos no son dirigidos. Son convincentes los nuevos datos que muestran que las biopsias de mama humana normal no absorben EpCAM-AsiCs.

El cáncer de mama triple negativo (TNBC), un grupo diverso de cánceres altamente malignos que no expresan los receptores de estrógeno, progesterona y Her2, tiene el peor pronóstico del cáncer de mama. No existe una terapia dirigida para las TNBCs, que a menudo recaen después de la terapia citotóxica. En la presente memoria se describe una plataforma para la terapia de inactivación génica para TNBC de tipo basal, usando RNA de interferencia dirigido específicamente (RNAi). El ARNi puede inactivar selectivamente genes causantes de enfermedades. Sin embargo, realizar el potencial terapéutico de la inactivación génica para tratar el cáncer necesita un método robusto para administrar RNAs en células cancerosas diseminadas. Existen 2 cuellos de botella - obtener RNAs a través de la membrana celular y desde endosomas al citoplasma de la célula objetivo donde se asienta la maquinaria de RNAi. Una terapia ideal inactivaría selectivamente genes en células cancerosas, preservando a la vez las células más normales para minimizar la toxicidad.

En la presente memoria se describe la inactivación de genes en TNBCs de tipo basal (la mayoría de TNBCs) con RNAs quiméricos que usan un aptámero (un ácido nucleico estructurado seleccionado para la unión de alta afinidad a una molécula objetivo contra EpCAM (también conocido como CD326 o ESA)"+, el primer antígeno tumoral descrito. EpCAM se expresa altamente en cánceres epiteliales de mama (incluyendo TNBC de tipo basal) - en promedio 400 veces más que en tejido de mama normal. También se expresa altamente en otros cánceres epiteliales y es un marcador de "células madre cancerosas" (también denominadas células iniciadoras de tumores (T-IC)). Las quimeras aptámero-siRNA (AsiC) unen covalentemente un aptámero de direccionamiento a un siRNA (Figura 10B). Dicer escinde el siRNA del aptámero dentro de las células.

Las células epiteliales de cáncer de mama, pero no las células epiteliales mesenquimales o normales, absorben selectivamente EpCAM-AsiCs y experimentan inactivación génica in vitro. Además, la inactivación se correlaciona fuertemente con los niveles de EpCAM. La inactivación de PLK1, un gen necesario para la mitosis, usando EpCAM-AsiCs elimina la formación de colonias y mamosferas (ensayos in vitro que se correlacionan con la autorrenovación y la iniciación tumoral) y la iniciación tumoral in vivo, lo que sugiere que EpCAM-AsiCs podría usarse para dirigirse a T-ICs. La inyección sc de EpCAM-AsiCs de PLK1 provocó la regresión completa de los xenoinjertos de TNBC de EpCAM+, pero no tuvo efecto sobre las TNBCs mesenquimales de EpCAM-.

Se describe en la presente memoria que EpCAM-AsiCs se puede usar para la inactivación génica dirigida para tratar cánceres de TNBC de tipo basal, preservando las células normales y eliminando las T-ICs dentro de ellas. Aparte de su administración selectiva a células objetivo, las AsiCs tienen ventajas importantes para el tratamiento del cáncer en comparación con la administración de RNA mediante nanopartículas, liposomas o proteínas de unión a RNA - (1) evitan la captura y concentración hepática y pulmonar en tumores; (2) como una única molécula de RNA son más simples y baratas de fabricar que los fármacos multicomponente; (3) prácticamente no tienen toxicidad y no estimulan la inmunidad innata o la inflamación o provocan efectos importantes fuera del objetivo; (4) debido a que no provocan anticuerpos, pueden usarse repetidamente; (5) son estables en suero y otros fluidos corporales.

Se puede definir qué subtipos de cáncer de mama pueden ser dirigidos por EpCAM-AsiCs y determinar cómo el nivel de EpCAM afecta a la absorción y al silenciamiento génico. Se puede evaluar la absorción/inactivación relativa en tejidos cancerosos frente al epitelio normal. También se puede determinar si EpCAM-AsiCs puede dirigirse a T-ICs de mama para inhibir la iniciación tumoral. Un objetivo importante es optimizar EpCAM-AsiCs para la absorción, liberación endosomal, administración sistémica e inactivación in vivo. La farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) de la absorción de EpCAM-AsiC, el silenciamiento génico y la supresión tumoral se evaluarán mediante obtención de imágenes de animales vivos en xenoinjertos ortotópicos de TNBC. Como prueba de principio, puede evaluarse el efecto antitumoral de la inactivación de PLK1, que se necesita para la proliferación celular. Se puede evaluar la inactivación de otros genes identificados en una selección de RNAi de genoma completo como dependencias genéticas de TNBC de tipo basal. En la presente memoria se describe el desarrollo de EpCAM-AsiC optimizadas y el conocimiento de su PK, PD y la posible toxicidad e identificación de nuevos genes de dependencia de TNBC de tipo basal para dirigirse.

En la presente memoria se describe: la verificación de la actividad selectiva de EpCAM-AsiC en cánceres epiteliales de mama en comparación con epitelios normales y se evalúa el potencial de EpCAM-AsiCs para transfectar y eliminar las T-ICs de mama (es decir, células madre cancerosas); optimización de EpCAM-AsiC para transfectar e inactivar genes en células epiteliales de TNBC in vitro y para la administración sistémica y la concentración tumoral in vivo, y definir PK y PD y la dosis máximamente tolerada; evaluación del efecto antitumoral de EpCAM-AsiC optimizadas que se dirigen a PLK1 y nuevos genes de dependencia de TNBC de tipo basal en modelos de TNBC epiteliales humanas de cáncer primario y metastásico en ratones

Aunque la mayoría de los pacientes con TNBC responden a la quimioterapia, dentro de los 3 años aproximadamente un tercio desarrollan metástasis y finalmente mueren. Por lo tanto, necesitamos nuevos enfoques. Los TNBCs son tumores heterogéneos, poco diferenciados que pueden necesitar ser tratados por subtipo o con terapia individualizada.

1, 3, 4, 72 La mayoría de los TNBCs son de tipo basal o pertenecen al subtipo basal-A. En la presente memoria se describe una plataforma flexible dirigida para tratar TNBCs de tipo basal que es adecuada para terapia personalizada. No solo el fármaco se dirigirá al tumor, sino que los objetivos del fármaco también se pueden elegir para atacar los talones de Aquiles del tumor al inactivar los genes de dependencia del tumor. Este enfoque actual administra RNAs de interferencia pequeños (siRNA) en células de cáncer epitelial uniéndolas a un aptámero de RNA que se une a EpCAM (Figura 10B), un receptor de superficie celular sobreexpresado en cánceres epiteliales, incluyendo TNBCs de tipo basal. EpCAM se expresa altamente en cánceres epiteliales y sus T-Ics.

El direccionamiento de EpCAM puede provocar la inactivación génica selectiva en TNBCs de tipo basal, pero no en epitelios normales. La inactivación selectiva reducirá tanto la dosis de fármaco como reducirá la toxicidad tisular.

Como se describe en la presente memoria, 9 de 9 líneas de cáncer de mama TNBC basal A y luminales eran fuertemente EpCAM+, mientras que una línea celular epitelial de mama normal, fibroblastos y TNBCs mesenquimal tenían cerca del fondo de EpCAM (Figura 1B). Por tanto, prácticamente todos los TNBCs de tipo basal (y probablemente los cánceres de mama luminales) serán dirigidos por EpCAM-AsiCs. Además, puesto que ~100% de los cánceres epiteliales, incluyendo pulmón, colon, páncreas y próstata, se tiñen de manera brillante para EpCAM, esta plataforma también podría usarse para la terapia basada en RNAi de cánceres comunes.

Cuando se encontró RNAi en mamíferos, se proclamaron los RNAs pequeños como la siguiente clase de fármaco nuevo. Los investigadores pronto se dieron cuenta de que conseguir que el RNAi funcione como fármaco no era simple. Sin embargo, después de abordar el principal obstáculo para la terapia de RNA (absorción celular), existe un nuevo optimismo sobre los fármacos basados en RNAi. Estudios recientes de fase I/II han mostrado una inactivación génica del 80-95% en hipercolesterolemia, amiloidosis relacionada con transtiretina, hepatitis C, hemofilia y metástasis hepática, provocada por expresión génica hepática aberrante. Sin embargo, la aplicación de RNAi para la terapia contra el cáncer es todavía un sueño. El principal obstáculo para aprovechar el RNAi para el cáncer es administrar RNAs pequeños en células diseminadas. En la presente memoria se describen métodos y composiciones que superan este problema, por ejemplo, mediante el uso de AsiCs.

AsiCs son una plataforma flexible que puede dirigirse a diferentes receptores de la superficie celular e inactivar cualquier gen o combinación de genes. Cambiando el aptámero, la plataforma AsiC puede abordar el bloqueo de la ruta de administración que ha frustrado la aplicación de la terapia basada en RNAi a la mayoría de las enfermedades. Este enfoque es ideal para la terapia personalizada del cáncer, ya que la elección de los genes a dirigir puede ajustarse dependiendo de las características moleculares del tumor. Además, las mezclas de RNA pueden inactivar múltiples genes de una vez para anticipar y superar la resistencia a fármacos.

En la presente memoria se describe el desarrollo de una EpCAM-AsiC optimizada con PK/PD bien definida.

Un objetivo importante de la investigación contra el cáncer es eliminar las T-ICs (células madre cancerosas). Las T-ICs son relativamente resistentes a la quimioterapia y se cree que son responsables de la recaída del tumor y la metástasis Las AsiCs descritas en la presente memoria se diseñan para dirigirse a las T-ICs (epiteliales) con alta eficiencia. Como tales, pueden eliminar esta subpoblación agresiva dentro de tumores en riesgo de enfermedad progresiva (véase la Figura 16).

Además de su uso terapéutico potencial, las EpCAM-AsiCs también puede ser una herramienta de investigación in vivo potente para identificar los genes de dependencia de tumores y T-ICs para definir nuevos objetivos farmacológicos.

En la presente memoria se describe una nueva terapia dirigida para cánceres epiteliales, y las T-ICs dentro de ellos por direccionamiento de EpCAM, un antígeno tumoral ampliamente sobreexpresado en cánceres epiteliales y sus T-ICs. La terapia dirigida hasta ahora se ha basado en el uso de anticuerpos o inhibidores específicos de tumores para quinasas oncogénicas. Ninguno de los anteriores ha demostrado que una AsiC no conjugada pueda tener potentes efectos antitumorales o que las AsiCs puedan administrarse sc. Actualmente no existe una terapia dirigida para TNBC o para T-ICs. El desarrollo de una terapia dirigida para TNBC y el desarrollo de formas para eliminar las T-ICs son objetivos no satisfechos importantes de la investigación contra el cáncer.

Los métodos descritos en la presente memoria se dirigen de 2 maneras - el aptámero administra específicamente el RNA terapéutico a células tumorales, mientras que los genes elegidos para la inactivación se pueden seleccionar basándose en las dependencias moleculares específicas del tumor objetivo. Mediante el ensayo de inactivación in vivo, se puede demostrar que las TNBCs de tipo basal y sus T-ICs dependen selectivamente del proteasoma, MCL1 y el complejo de corte y empalme U4/U6-U5 de tri-snRNP. Este trabajo puede identificar un nuevo conjunto de objetivos farmacológicos, adecuados tanto para fármacos convencionales como basados en RNAi.

El tráfico de siRNA en células transfectadas puede examinarse y cada etapa de procesamiento de RNA en células puede optimizarse sistemáticamente para mejorar las características farmacológicas de un siRNA.

CD4-AsiCs inactiva de forma duradera la expresión génica en linfocitos T CD4+ y macrófagos e inhibe la transmisión de HIV a ratones humanizados. CD4-AsiCs suprimía específicamente la expresión génica en células T CD4+ y macrófagos en explantes de tejido cervicovaginal humano polarizado y en el tracto genital femenino de ratones humanizados. Debido a que son monoméricos y no reaccionan de manera cruzada con el receptor, CD4-AsiCs no activaron las células objetivo. Tampoco estimularon la inmunidad innata. La aplicación intravaginal de sólo 80 pmol de CD4-AsiCs dirigidos contra genes de HIV y/o CCR5 a ratones humanizados bloqueó completamente la transmisión sexual de HIV. La inactivación génica mediada por RNAi in vivo duró varias semanas. La transmisión se bloqueó mediante CD4-AsiCs de CCR5 aplicados 2 días antes de la estimulación. También se produjo una protección significativa, pero incompleta, cuando la exposición se retrasó durante 4 o 6 días. Las CD4-AsiCs dirigidas a gag/vif proporcionaron protección cuando se administraron después de la exposición. Por lo tanto, las CD4-AsiCs son prometedoras para su uso en un microbicida para el HIV.

La protección contra la transmisión del HIV requiere la inactivación local en el tracto genital. Sin embargo, la administración sistémica es más desafiante y se necesita para el cáncer. Debido a que las AsiCs son lo suficientemente pequeñas como para ser filtradas por el riñón, se eliminan rápidamente y no provocan el silenciamiento génico de manera eficaz. En algunas realizaciones, el polietilenglicol (PEG) puede unirse al extremo 5'-terminal de la cadena inactiva (pasajera) del siRNA. PEG-AsiCs inyectado iv se concentró en tumores sc. La PEGilación extendió el T1/2 circulante de AsiC inyectada ip desde <35 min hasta >>30 h, aumentó la durabilidad del silenciamiento génico a ~5 días y redujo la dosis necesaria 8 veces. La inyección sc de CD4-AsiCs no modificadas provocó una inactivación génica de ~80% específicamente en células CD4+ en el bazo, ganglios linfáticos proximales y distales de ratones humanizados (no mostrados). La inyección sc de EpCAM-AsiCs condujo de manera similar a una concentración/inactivación específica en tumores EpCAM+ (véase más adelante).

EpCAM-AsiCs inactiva selectivamente la expresión génica en células cancerosas EpCAM+. Las EpCAM-AsiCs tienen una cadena larga de ~42-44 nt (aptámero de 19 nt enlazador cadena de siRNA de 20-22 nt) hibridada con una cadena de siRNA complementaria de 20-22 nt (Figura 10B). Sintetizados comercialmente con 2'-fluoropirimidinas, son resistentes a RNasa (T1/2 > 3 días en suero, datos no mostrados) y no desencadenan inmunidad innata. 37,91-93

La EpCAM de superficie fue alta en todas las líneas celulares luminales y de tipo basal analizadas, pero próximas a la base en epitelios normales inmortalizados con hTERT (BPE) 94, fibroblastos y TNBCs mesenquimales (Figura 1B). Varios de una gran cantidad de diseños probados (con las cadenas sentido y antisentido intercambiadas y varios enlazadores) inactivaron la expresión génica específicamente en líneas celulares EpCAM+, pero el diseño más efectivo se muestra en la Figura 10B. La inactivación génica de eGFP y AKT1 por EpCAM-AsiCs fue uniforme y selectiva para las células EpCAM+ y tan eficaz como la transfección de lípidos de siRNA, que no fue selectiva (Figura 13A-13C). En 8 líneas celulares de cáncer de mama, la inactivación de AKT1 y la inhibición de la proliferación celular por EpCAM-AsiCs de PLK1 se correlacionaron fuertemente con los niveles de EpCAM (Figuras 11B-11C). El aptámero de EpCAM por sí mismo no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular (no mostrado). Cuando las células BPE de EpCAM- se mezclaron con líneas celulares epiteliales de TNBC, EpCAM-AsiCs inactivaron AKT1 y provocaron la muerte celular sensible a PLK1 solo en células tumorales, preservando las células epiteliales normales (no mostradas). La proporción de células tumorales supervivientes disminuyó 7 veces después de 3 días. Cuando se añadieron AsiCs fluorescentes, siRNAs conjugados con colesterol (col-siRNA, absorbido por epitelios normales) o siRNAs desnudos a muestras de biopsia de mama normal y tumor, las EpCAM-AsiCs se concentraron sólo en los tumores (Figura 14). Por lo tanto, EpCAM-AsiCs son específicas para células tumorales epiteliales.

Las EpCAM-AsiCs inhiben las T-ICs de tumores EpCAM+. Se eligió EpCAM para dirigirse en parte debido a que EpCAM marca las T-ICs y las células iniciadoras de metástasis (M-IC). Para investigar si EpCAM-AsiCs inhiben las T-ICs, comparamos la formación de colonias y mamosferas (sustitutos funcionales de T-IC) después del tratamiento simulado, el tratamiento con paclitaxel o con EpCAM-AsiCs contra eGFP o PLK1. Las EpCAM-AsiCs de PLK1 inhibieron más fuertemente la formación de colonias y mamosferas de múltiples TNBCs de tipo basal de EpCAM+ y una línea celular luminal que el paclitaxel, pero fue inactivo contra TNBCs de tipo basal-B de EpCAM- (Figura 15A-15C). Para evaluar el efecto de EpCAM-AsiC sobre la iniciación tumoral, se implantaron sc células MB468 de luc+ de EpCAM+ y MB231 de EpCAM- viables, tratadas durante la noche con medio o se implantaron EpCAM-AsiCs de PLK1 o GFP en ratones nude. Las EpCAM-AsiCs de PLK1 bloqueaban la formación de tumores, pero sólo en tumores EpCAM+ (Figura 16 y datos no mostrados). Por lo tanto, EpCAM-AsiCs inhiben la iniciación tumoral en cánceres de mama EpCAM+.

Las EpCAM-Asi son absorbidas selectivamente por los TNBCs de EpCAM+ y provocan la regresión tumoral. Para investigar la utilidad clínica potencial de las EpCAM-AsiCs, en primer lugar se examinó la administración de EpCAM-AsiCs marcados con Alexa750 inyectados sc en el surco del cuello de ratones que portaban TNBCs de EpCAM+ y EpCAM- en cada flanco (Figura 17A-17B). Las EpCAM-AsiCs se concentraron sólo en el tumor EpCAM+. Los ratones que portaban tumores bilaterales se trataron de manera simulada o se inyectaron bisemanalmente con EpCAM-AsiCs de PLK1 o GFP y el crecimiento tumoral se siguió por luminiscencia. Los tumores EpCAM+ rápidamente remitieron por completo sólo en ratones que recibieron las AsiCs dirigidas a PLK1 (Figura 18A-18B). Este experimento se repitió con grupos de control adicionales, el aptámero de EpCAM por sí solo o siRNA de PLK1, ninguno de los cuales tenía ninguna actividad antitumoral (datos no mostrados). Por lo tanto, las EpCAM-AsiCs inyectadas sc muestran actividad antitumoral específica contra TNBCs basal-A.

Obtención de imágenes de células vivas de la absorción del siRNA, liberación endosomal y silenciamiento génico. Se usó un microscopio confocal de disco giratorio optimizado capaz de detección de molécula individual para detectar la señal citosólica débil de los RNAs fluorescentes liberados, que no era antes posible. Se tomaron imágenes de células HeLa incubadas con lipoplejos de Alexa647-siRNA cada 3 s. Los endosomas tardíos que contenían RNA liberaron una pequeña fracción de su RNA de carga, que se difundió rápidamente para llenar el citosol (datos no mostrados). La liberación se produjo durante un estrecho marco de tiempo, ~15-20 min después de la endocitosis. ~ 104 siRNA se liberaron en un suceso típico. En células HeLa, que expresan de manera estable eGFP-d1, los siRNAs de GFP provocaron que la expresión de GFP disminuyera rápidamente después de la liberación endosomal con un T1/2 de ~2,5 h. Solo se necesitaron ~1000 siRNAs citosólicos para un silenciamiento génico eficaz. La liberación desencadenó la autofagia, que secuestró el RNA que contenía el endosoma dentro de una doble membrana autofágica. Después de eso no se produjo liberación.

Aplicamos este método para estudiar la absorción/liberación de EpCAM-AsiCs marcadas con Cy3, comparando los TNBCs de MB468 de EpCAM+ con células EpCAM-BPE. La absorción y la liberación fueron despreciables en BPE, pero un corte claro en MB468. Este método de obtención de imágenes y nuestra comprensión del tráfico de siRNA se puede usar para optimizar el diseño de EpCAM-AsiC para mejorar la liberación endosomal y la inactivación.

Identificación de genes de dependencia de TNBC de tipo basal (BDGs). Para identificar las dependencias genéticas de los TNBCs de tipo basal que EpCAM-AsiCs podrían dirigirse, se realizó una selección de letalidad de siRNA de genoma completo comparando las células BPLER de tipo basal y HMLER mioepiteliales, células epiteliales de mama primarias humanas transformadas con los mismos oncogenes en diferentes medios. Aunque esencialmente isogénico, los BPLER son altamente malignos y están enriquecidos en T-ICs, formando tumores en ratones nude con sólo 50 células, mientras que las HMLER requieren >105 células para iniciar tumores. La selección identificó 154 genes de los que dependió BPLER, pero no HMLER. Los genes del proteasoma estaban altamente enriquecidos (P < 10-14). La expresión de genes de dependencia de BPLER se correlacionó con un pronóstico malo en cáncer de mama, pero no de pulmón o colon. La sensibilidad al inhibidor del proteasoma fue una característica compartida de los TNBCs basal-A y se correlacionó con la dependencia de MCL1. Las células epiteliales de mama normales, líneas de cáncer de mama luminal y líneas de TNBC mesenquimales no dependen del proteasoma o MCL1. La inhibición del proteasoma no sólo destruye las TNBCs basal A, sino que también bloquea la función de las T-IC mediante ensayos de colonias y mamosferas, de nuevo principalmente de manera selectiva en las TNBCs de tipo basal. La breve exposición a bortezomib también inhibió la iniciación tumoral de una línea de TNBC de tipo basal de ratón.

A continuación, se probó si la inhibición del proteasoma inhibía el crecimiento de tumores TNBC de tipo basal en ratones. Bortezomib no penetra bien en tumores sólidos, lo que ha limitado su uso clínico. La dosis iv máxima tolerada (MTD) fue necesaria para inhibir la actividad del proteasoma en tumores sc. El tratamiento con la MTD inhibió fuertemente el crecimiento tumoral de 3 líneas celulares de TNBC basal A humanas y 1 de ratón y 10 TNBCs que surgieron espontáneamente en ratones Tp53+/-, pero no fueron activas contra líneas celulares basal B o luminales. Se obtuvieron resultados similares con carfilzomib. Bortezomib también bloqueó la colonización pulmonar de células TNBC de ratón inyectadas iv. Por lo tanto, el proteasoma se necesita selectivamente para el crecimiento de TNBC epiteliales, iniciación tumoral y metástasis. Aunque la penetración tumoral y la PD pueden mejorar con inhibidores del proteasoma más nuevos, la inactivación génica del proteasoma podría proporcionar una inhibición del proteasoma más eficaz.

Debido a que las TNBCs son heterogéneas 1,3,4,72, se volvieron a seleccionar los 154 genes de dependencia de BPLER en 4 líneas de cáncer humano TNBC basal-A y 3 luminales. Nuestro objetivo fue identificar dependencias compartidas adicionales de líneas celulares de TNBC de tipo basal como objetivos potenciales de EpCAM-AsiC. Solo 21 de los 154 genes de dependencia de BPLER redujeron la viabilidad en al menos 2 veces en 3 de 4 líneas celulares basal-A analizadas. Estos BDGs putativos se agrupan en 4 grupos funcionales - 4 genes del proteasoma y MCL1 (validados previamente), 10 genes implicados en el corte y empalme del RNA, 2 genes implicados en la mitosis y 2 genes necesarios para la exportación nuclear. Se volvieron a analizar 20 de los 21 genes de BDGs usando un nuevo conjunto de siRNAs y se volvieron a confirmar 14 genes (los otros "éxitos" pueden haber sido secundarios a efectos fuera del objetivo o su inactivación podría haber sido insuficiente para provocar letalidad). Cabe destacar que 9 de 10 genes de corte y empalme reconfirmaron. Incluyeron 4 miembros del complejo U4/U6-U5 de tri-snRNP, PRPF8, PFPF38A, RBM22, USP39. Otros éxitos compartidos interesantes fueron la proteína G de exportación nuclear de RAN y la nucleoporina NUP205 y NDC80, un componente cinetocoro que ancla el cinetocoro al huso mitótico. (USP39 también se necesita para el punto de control del huso mitótico).

Se sabe que los TNBCs son particularmente susceptibles a agentes antimitóticos. USP39 se sobreexpresa en células de cáncer de mama frente a tejido de mama normal y la inactivación de USP39 inhibió la proliferación y formación de colonias de células MCF7 luminales. Además, en pez cebra, la mutación de USP39 conduce a defectos de corte y empalme de genes supresores de tumores como rb1 y p21. Para explorar el efecto terapéutico de la inhibición de corte y empalme en TNBCs de tipo basal, silenciamos los 4 BDGs del complejo tri-snRNP de espliceosoma (PRPF8, PRPF38A, RBM22, USP39) en 6 líneas celulares de tipo basal y en células MCF7 luminales (Figura 19). La inactivación de PRPF8, PRPF38A o RBM22 activó caspasa-3 y fue letal para 6 de 6 líneas celulares de tipo basal, pero no para MCF7; la inactivación de USP39 destruyó 3 de 6 líneas celulares de tipo basal. Las proteínas del espliceosoma fueron frecuentemente reguladas positivamente en líneas celulares de cáncer de mama de todos los subtipos. La viabilidad de las 6 líneas celulares de tipo basal, pero no de las células MCF7, se redujo al menos 2 veces mediante la inactivación del gen del cinetocoro mitótico NDC80 o de los genes de exportación nuclear RAN o NUP205. Además, la inactivación de cada uno de los genes del complejo tri-snRNP, RAN, NUP205 o NDC80 bloqueó la formación de colonias (un sustituto del potencial de T-IC) en 3 de 3 líneas celulares de TNBC de tipo basal

EpCAM-AsiCs puede provocar la inactivación génica dirigida en tumores EpCAM+ y las T-ICs dentro de ellos. Aunque puede haber alguna absorción en células epiteliales normales que expresen débilmente EpCAM, la inactivación génica se concentrará en células tumorales con EpCAMbrillantes, especialmente en T-ICs. Se pueden optimizar EpCAM-AsiCs, tal y como se describe en la presente memoria, para PK/PD favorable para suprimir el crecimiento tumoral y la metástasis de TNBCs de tipo basal con toxicidad aceptable en modelos de ratón.

EpCAM-AsiCs dirigidas a eGFP, AKT1 y PLK1 se usan en la presente memoria como modelos para evaluar la inactivación génica y optimizar el diseño de AsiC. Las líneas celulares que expresan de manera estable (d1)EGFP desestabilizada, con una proteína T1/2 de ~1 h, pueden generarse usando lentivirus. La expresión de GFP puede cuantificarse fácilmente mediante flujo y obtención de imágenes, y su inactivación no tiene consecuencias biológicas. El T1/2 corto permite la detección rápida y sensible de la inactivación. La AKT1, que se expresa en todas las células que se ensayan, es un buen gen endógeno para estudiar, ya que su inactivación en TNBCs no afecta mucho a la viabilidad celular. La PLK1 se usa como prueba de concepto para su efecto antitumoral porque su inactivación es citotóxica para todas las células en división. Previamente se demostró que la inactivación de PLK1 usando una estrategia de administración diferente suprimió drásticamente el cáncer de mama Her2+ en ratones. En una selección reciente, PLK1 fue único entre los genes de quinasa debido a que su inactivación eliminó las T-ICs de mama. Hemos logrado una inactivación génica robusta y reproducible con EpCAM-AsiCs dirigidas a cada uno de estos genes.

EpCAM-AsiCs se pueden adquirir, por ejemplo, como RNAs no-GMP de TriLink o NITTO Avecia. Cada cadena de EpCAM-AsiC se sintetizó con 2'-fluoropirimidinas y los residuos dT en sus extremos 3'-terminal para proteger contra la digestión con exonucleasa y después se hibridó para generar el RNA final (Figura 10B). Como se optimiza el AsiC, se pueden sustituir y probar otras modificaciones químicas para determinar si confieren una actividad mejorada. El aptámero solo y AsiCs que llevan un siRNA no dirigido pueden servir como controles. Algunos de las EpCAM-AsiCs de eGFP también pueden hibridarse con una cadena antisentido modificada en el extremo 3'-terminal con un fluoróforo (que no afecta la actividad de AsiC (no mostrado)) para cuantificar la absorción y el tráfico de AsiC dentro de las células e in vivo.

Inactivación específica de EpCAM-AsiC en cánceres epiteliales de mama y T-ICs de cáncer de mama frente a células epiteliales normales. Se puede determinar qué subtipos de cáncer de mama se transfectan con EpCAM-AsiCs y evaluar si la inactivación del tumor es específica de las células cancerosas, primero en líneas celulares y después en 10 tejidos tumorales para verificar que los resultados para las líneas celulares se traducen a los tejidos in situ. Debido a que EpCAM-AsiCs también podría transfectar células madre de tejido normales, la inactivación y la toxicidad para estas células basales raras se evaluarán en los experimentos con tejido. También se puede evaluar el potencial de EpCAM-AsiCs para transfectar y dirigirse a T-ICs de mama.

Tipos de cáncer de mama que responden a EpCAM-AsiCs. En primer lugar se necesita saber qué tipos de cáncer de mama pueden transfectarse con EpCAM-AsiCs y cómo es la inactivación génica específica en los tumores en relación con las células epiteliales normales. Se extienden nuestros estudios previos (Figura 13A-13C y 11B-11C) evaluando la inactivación in vitro en un panel de 20 líneas celulares de cáncer de mama humano que representan los subtipos comunes de cáncer de mama, pero que se ponderan hacia TNBC (14 líneas de TNBC, más un muestreo de líneas celulares luminal y Her2+). 95 La expresión de EpCAM, la absorción de AsiC marcado con Cy3 y el silenciamiento génico en líneas tumorales se pueden comparar con la de BPE94 y fibroblastos. Este gran panel tumoral nos permitirá evaluar cómo los niveles de EpCAM en la superficie celular influyen en el silenciamiento génico y si hay un umbral de expresión de EpCAM para la inactivación eficaz. También se puede verificar en un experimento de respuesta a la dosis usando unas pocas líneas celulares de EpCAM+ que la alta afinidad de unión indicada del aptámero de EpCAM se conserva en el AsiC. La especificidad de la absorción (frente a la "adherencia" no específica) puede verificarse usando lavado con ácido para eliminar los aptámeros débilmente adheridos y mostrando que la unión es competitiva por aptámeros no marcados y eliminada cuando las células son tripsinizadas antes del tratamiento. La transfección mediada por EpCAM-AsiC puede compararse con la transfección de lípidos y los siRNA desnudos como controles. La inactivación se evaluará mediante citometría de flujo y qRT-PCR después de 5 días, el tiempo óptimo para la inactivación mediada por AsiC. Se espera que la absorción y el silenciamiento génico se correlacionen con los niveles de EpCAM. Para verificar que la especificidad para las células EpCAM+ se mantiene en mezclas de células epiteliales de mama no transformadas de EpCAM+ y EpCAMdim, se puede comparar la absorción de EpCAM-AsiC fluorescente, la inactivación génica y la supervivencia cuando PLK1 es el objetivo génico en mezclas de células tumorales que expresan diferentes niveles de EpCAM (MFI que varía entre 100-1000) con diferentes números de células BPE de<g>F<p>+.

Se absorben preferiblemente las células epiteliales de cáncer de mama EpCAM-Asi y muestran la inactivación en relación con células epiteliales normales en explantes de tejido? Para evaluar la inactivación del tumor primario y anticipar la posible toxicidad para las células de tejido normales, se puede evaluar la transfección in situ y la inactivación génica en explantes de 10 cánceres de mama luminal, Her2+ y TNBC y tejido normal circundante de muestras de mastectomía. Las muestras de ~25 tumores pueden analizarse para proporcionar una búsqueda exhaustiva de los subtipos de tumores. La tipificación tumoral puede confirmarse mediante histología y tinción de IHC para ER, PR, Her2, E-caderina. Se pueden comparar tejidos normales que no tienen una gran fuente competitiva de células EpCAM+ con tejidos que contienen células tumorales. Esto podría ser importante para anticipar la toxicidad en situaciones en donde se administran AsiCs a pacientes con carga tumoral baja/indetectable después de la terapia o cirugía. Estos experimentos pueden permitir la evaluación de si la inactivación para 10 tumores es comparable a la de las líneas celulares, si la arquitectura del tejido afecta a la absorción/inactivación en células tumorales y cómo de bien se transfectan los subtipos de tumores diferentes.

Basándose en los datos presentados en la presente memoria, por ejemplo, la Figura 14, se contempla en la presente memoria que los cánceres epiteliales de mama, pero no las células epiteliales normales, pueden experimentar una inactivación génica eficaz. Los tejidos cortados en muestras de ~3x3x3 mm3 pueden transfectarse en solución Optimem en pocillos de microtitulación. El siRNA lipoplexado y los col-siRNAs tanto de los genes de inactivación en epitelios normales del tracto genital columnar como escamoso, mientras que los siRNAs desnudos no se recogen. En primer lugar, se pueden verificar estos controles usando siRNAs para dirigirse a genes epiteliales, que previamente se han inactivado (tales como E-caderina, claudina3, citoqueratina (CK)-5 (un buen marcador de células basales) y nectina-1), cuya expresión se puede seguir fácilmente mediante IHC, microscopía de fluorescencia (FM) o citometría de flujo de células separadas. La tinción del producto génico objetivo puede correlacionarse con la tinción de marcadores fenotípicos y siRNAs fluorescentes para determinar qué tipos celulares dentro del tejido son dirigidos. El anticuerpo Pan-CK puede usarse para distinguir células epiteliales (normales y tumorales) del estroma. También se puede comparar la inactivación de 10 células digeridas con colagenasa con la inactivación de tejido. Sin desear estar limitado por la teoría, se puede evaluar la administración y la inactivación de CK5 en células madre de tejido basal poco frecuentes, ya que EpCAM-AsiCs pueden dirigirse a estas células y conducir potencialmente a la toxicidad. Debido a que la toxicidad para el tracto GI a menudo es limitante de la dosis para los fármacos contra el cáncer, se pueden repetir estos estudios usando muestras de tumor de colon para determinar si las células de cáncer de colon, epitelios intestinales normales y células madre de criptas intestinales están transfectadas. Estos experimentos pueden proporcionar datos útiles con respecto a la toxicidad clínica y la elección de genes para la inactivación, es decir, podríamos inactivar genes de dependencia del cáncer que no son esenciales para las células madre normales, si las células madre del tejido se transfectan eficazmente. (Las células hematopoyéticas no expresan EpCAM, por lo que no se espera toxicidad hematológica).

Se pueden usar EpCAM-AsiCs para dirigirse a células iniciadoras de tumores de mama? Una razón por la que elegimos EpCAM como objetivo de aptámero es su potencial para transfectar T-ICs ("células madre cancerosas"). Las T-ICs son resistentes a fármacos y se cree que son responsables del inicio, la recaída y la metástasis tumorales. Las T-ICs de mama no se definen de manera única por el fenotipo, haciendo que los experimentos sean desafiantes, ya que las T-ICs se definen funcionalmente por su capacidad para iniciar tumores que pueden trasplantarse en serie. La tinción para CD44, CD24, EpCAM, CD133, CD49f o<a>L<d>H1 en diferentes combinaciones enriquece las T-ICs.

49,61,67,107-111

Diferentes protocolos definen subconjuntos superpuestos, pero no idénticos, de T-ICs potenciales. Las T-ICs son heterogéneas y muestran plasticidad en sus características epiteliales frente a mesenquimales (y de hecho pueden tener algunas características de ambos estados). 28, 95, 112-118. Algunas T-ICs de mama son mesenquimales y no expresan EpCAM. Sin embargo, existe una evidencia creciente de que la capacidad de las TNBCs de tipo basal para colonizar tejidos distantes y formar metástasis macroscópicas - probablemente la función clínicamente más importante de las T-ICs - depende de las propiedades epiteliales. Además, nuestros nuevos datos (Figura 15A-15C y 16) sobre el efecto de EpCAM-AsiCs sobre la función de T-ICs y la iniciación tumoral indican que EpCAM-AsiCs tienen una actividad anti-T-IC para TNBCs basal-A. Se plantea la hipótesis de que las T-ICs de TNBC de tipo basal absorben EpCAM-Asi y pueden usarse para la terapia dirigida para paralizar la capacidad de T-IC dentro de ellas.

Para analizar la absorción de EpCAM-AsiC y el silenciamiento génico en T-ICs, en primer lugar se puede teñir un panel de líneas de cáncer de mama con EpCAM, CD44 y CD24 para identificar líneas celulares de mama cuyas poblaciones de T-IC putativas contienen células que se tiñen de manera brillante para EpCAM. También se puede examinar la tinción de EpCAM de las mamosferas y las células Aldefluor+ 111,123,124 generadas a partir de estas líneas celulares. Se pueden seleccionar ~4-5 líneas con la expresión de EpCAM más uniforme dentro de las T-ICs como las líneas celulares más atractivas para estudiar en este objetivo secundario (y como controles, 1-2 líneas celulares basal-B cuyas T-ICs podrían carecer de tinción con EpCAM) y pueden producir variantes estables que expresan eGFP. Estas líneas celulares, y sus mamosferas y subpoblación Aldefluor+, pueden incubarse con EpCAM-AsiCs de eGFP fluorescente (y como control, PSMA-AsiCs no dirigido). La absorción de AsiC puede evaluarse junto con tinción con EpCAM, CD44 y CD24 y Aldefluor. Las AsiCs deben ser absorbidas por las celulas EpCAM+ CD44+ CD24-/dim Aldefluor+. Para evaluar la inactivación génica en células con fenotipo T-IC, se puede monitorizar GFP en la población de T-IC y las células restantes después del tratamiento con eGFP o AsiCs que llevan siRNA de control mediante citometría de flujo y qRT-PCR (de poblaciones Aldefluor+ o mamosfere). También se puede evaluar la inactivación de PLK1 y AKT1 endógenos. Estos experimentos nos pueden decir si T-ICs en diferentes subtipos de cáncer de mama son dirigidas por EpCAM-AsiCs. Después, se evalúa si las AsiCs inhiben la formación de mamosfera y de colonias, reducen las subpoblaciones fenotípicas de T-IC o la población secundaria.

También se puede diseñar y evaluar AsiCs contra genes adicionales necesarios para la autorrenovación o la multipotencia. Debido a que las T-ICs de TNBC de tipo basal son sensibles a la inhibición del proteasoma, se puede evaluar la inactivación de un componente del proteasoma (PSMA2). Otros genes potenciales de dependencia de T-IC que se evaluarán son MSI1, un gen altamente expresado en T-ICs de mama que regula la señalización de Wnt y Notch 125-129, BMI1, un componente policomb necesario para la autorrenovación 130-133, y posiblemente unos pocos BDGs nuevos identificados en nuestra selección reciente de siRNA (Figura 19). La inactivación de MSI1 disminuye los marcadores de células madre y la formación de mamosferas en células MCF7 y T47D.129

Después de verificar que estos genes se expresan y se inactivan en células de mamosferas, se pueden tratar tanto células adherentes como mamosferas con AsiCs dirigidas a estos genes o eGFP como un control negativo y medir el tamaño de las subpoblaciones de T-IC después de 5-7 días mediante tinción para CD44, CD24, EpCAM, CD133, CD49f y ALDH1. También se puede medir la proporción de células que desprenden colorantes de moléculas pequeñas (la "población secundaria"). Estos experimentos pueden complementarse mediante ensayos funcionales que cuantifican las células formadoras de colonias y mamosferas. La sustitución en serie puede investigar si se inhibe la propagación de T-ICs como esferas.

La inactivación de PLK1, MSI1, BMI1 o PSMA2 puede reducir el número de T-IC, la proliferación y la función en algunos subtipos de cáncer de mama, pero diferentes genes pueden ser más activos para diferentes líneas celulares de mama (es decir, la inhibición del proteasoma eliminó las T-ICs en TNBCs de tipo basal, pero no en tumores no TNBC y en solo 1 de 3 TNBCs basal-B 95). Los enfoques de inactivación que suprimen T-IC pueden investigarse adicionalmente mediante experimentos que usan inhibidores químicos disponibles y/o inactivando otros genes en la misma vía (tales como NOTCH1, p-catenina o WNT1 para MSI1). El efecto sobre T-ICs de EpCAM-AsiCs se puede comparar con el aptámero de EpCAM por sí mismo y el anticuerpo de EpCAM, adecatumumab (Amgen).

Después, se determina si la exposición ex vivo a corto plazo de líneas de TNBC de tipo basal a EpCAM-AsiCs inhibe la iniciación tumoral como la medida final de la inhibición de T-IC. Las AsiCs más prometedoras se pueden ensayar in vivo. Las líneas celulares, tratadas durante la noche con AsiCs (y como controles negativos AsiCs que usan aptámero de PSMA o contienen siRNA de eGFP), se pueden evaluar para la viabilidad. Después de verificar que la exposición a siRNA a corto plazo no afecta a la viabilidad, las células tratadas ex vivo se inyectarán en un intervalo de números de células ortotópicamente en ratones NOD/scid/!c-/- (NSG) (estos ratones tienen la toma más alta para la implantación del tumor). El tratamiento previo con bortezomib, que redujo la iniciación tumoral en TNBC de tipo basal"), o adecatumumab, serán controles.

Optimizar las EpCAM-AsiCs. Para mejorar las características farmacológicas de EpCAM-AsiC se puede optimizar cada etapa de inactivación génica in vitro y de administración in vivo. También se puede modificar la química de EpCAM-AsiCs (si es necesario) para minimizar los efectos fuera del objetivo.

En estudios previos y en trabajos publicados, la concentración de AsiC necesaria para la inactivación óptima in vitro es ~1-4 gM, muchas veces mayor que las concentraciones ~ 100 nM (o menores) usadas para la transfección de lípidos. Para la inactivación, EpCAM-AsiCs siguen las siguientes etapas: (1) unión al receptor celular, (2) endocitosis, (3) liberación endosomal, (4) procesamiento con Dicer, (5) incorporación en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC), y (6) escisión de mRNA objetivo. Se puede optimizar sistemáticamente cada etapa, centrándose en las etapas (2) y (3), donde se espera obtener las mayores ganancias de eficacia. Las variables de diseño de AsiC son el aptámero de EpCAM, cuya afinidad afecta a las etapas 1 y 2; la secuencia del enlazador entre el aptámero y el siRNA, que controla la etapa 4; la secuencia del siRNA, que controla la etapa 6. Además, cada residuo usado para la síntesis química de bloques de construcción de fosforamidita puede modificarse químicamente para reducir la digestión con nucleasas, la supresión fuera del objetivo de secuencias parcialmente complementarias, la unión y estimulación de sensores de RNA inmunitario innato y la mejora de la absorción celular y la PK in vivo. Las modificaciones químicas más comunes son la sustitución de S por O en la estructura de fosfato (para producir enlaces fosforotioato (PS) resistentes a RNasa y sustituyendo 2'-F, 2'-O-metilo (2'OMe) o 2'-O-metoxietilo (2'MOE) por el 2'-OH en la ribosa. Las modificaciones de PS, 2'-F y 2'-OMe son bien toleradas en los ensayos clínicos y, por lo tanto, se concentran en ellos. La 2'-OMe se produce de manera natural en rRNA y tRNA y, por lo tanto, es segura, y la 2'-F también se tolera bien; los nucleótidos muy modificados con PS son pegajosos (y provocan la unión a proteínas séricas, lo que puede mejorar el T1/2 circulante) y puede provocar efectos secundarios no deseados; los PS-RNAs ligeramente modificados no son tóxicos. Las modificaciones químicas pueden tanto inhibir como mejorar el silenciamiento génico en las etapas 5 y 6. Esto puede ser un proceso iterativo; como las modificaciones se realizan en una etapa, los candidatos modificados más atractivos pueden optimizarse para otras etapas, trazando lecciones aprendidas de candidatos previos. Se puede verificar que las AsiCs modificadas elegidas para desarrollo adicional no estimulan la inmunidad innata o dan como resultado toxicidad celular. Si lo hacen, se pueden modificar aún más nuestros diseños para evitar estos problemas.

Optimizar la inactivación in vitro

(1) Unión a EpCAM. El aptámero de EpCAM tiene una afinidad de 12 nM, Puede verificarse que esta afinidad se conserva en EpCAM-AsiC. Si la AsiC tiene menor afinidad que el aptámero, se puede usar interferometria de bio-capa (OctetRED System, ICCB-Longwood Core) con EpCAM recombinante para comparar la afinidad del aptámero y AsiC. Si la AsiC tiene menor afinidad de unión, puede no plegarse adecuadamente. Para potenciar el plegamiento en la conformación deseada, se puede intentar cambiar el tipo y la longitud del enlazador entre el aptámero y la cadena sentido de AsiC (es decir, se pueden incorporar conectores de más de 3C o espaciadores de trietilen o hexaetilenglicol).

(2) Endocitosis. La AsiC monomérica se absorbe lentamente mediante reciclaje constitutivo del receptor. Esta etapa puede optimizarse mediante reticulación del receptor para desencadenar endocitosis activa, que requiere la multimerización de aptámeros. La multimerización de aptámeros (con o sin siRNA unidos) puede aumentar la avidez de unión (aumentando la valencia) o convertir un aptámero que no provoca señalización en un reactivo agonista. Los aptámeros pueden multimerizarse usando estreptavidina (SA) para unir aptámeros biotinilados (Bi) y siRNAs; extendiendo el aptámero con un adaptador que se une a un oligonucleótido organizativo que contiene múltiples secuencias complementarias conectadas por un enlazador flexible; o extendiendo el aptámero con secuencias adaptadoras complementarias para producir un dímero. Se centraron en diseños de todo el RNA, que no inducen anticuerpos. Algunos de los diseños que se pueden probar se muestran en la Figura 20 (también se pueden probar constructos con cadenas sentido y antisentido intercambiadas).

Los experimentos de respuesta a dosis y transcurso de tiempo compararán constructos multiméricos marcados fluorescentemente con AsiC monomérico para evaluar el grado y rapidez de absorción y la inactivación de GFP mediante citometría de flujo y obtención de imágenes de células vivas (datos no mostrados). Si la endocitosis se potencia por multimerización, pero la inactivación no mejora, se puede usar transferencia Northern para seguir la escisión de Dicer y determinar si se produce la cadena antisentido esperada (véase más adelante). Si no, se puede alterar el diseño de los enlazadores, por ejemplo alargando la región dúplex de 21 a 27 nt, de modo que la AsiC multimerizada es un buen sustrato de Dicer(&) y verificar que el extremo 5'-terminal del producto de Dicer se origina en la base prevista. La multimerización debería reducir la concentración de AsiC necesaria para la inactivación muchas veces. Sin embargo, la multimerización podría provocar la señalización de EpCAM no deseada y promover la proliferación de células tumorales. Se puede verificar que este no es el caso usando constructos multimerizados dirigidos a eGFP. Una característica atractiva de la multimerización es que podría unir múltiples siRNAs diferentes en una única molécula de RNA para la inactivación génica combinatoria para producir un "mezcla" de cáncer.

Si ninguno de estos multímeros funciona, se pueden ensayar AsiCs monoméricos que contienen secuencias complementarias que permiten que los RNAs se autoensamblen en pequeñas nanopartículas o la estrategia SA-Bi, usando mutantes de SA menos inmunoestimuladores.

(3) Liberación endosomal. Aunque se estima que se necesitan menos de 1000 moléculas de siRNA citosólico para la inactivación (no mostrado), sólo un pequeño porcentaje de siRNAs en liposomas endocitosados se liberan en el citosol. La liberación endosomal de EpCAM-AsiC puede evaluarse mediante la obtención de imágenes de células vivas para medir la eficacia de la liberación citosólica de AsiCs endocitosados. Si esto indica una liberación endosomal menor que la deseada, entonces la mejora de la liberación debe reducir sustancialmente la dosis de fármaco. La preincubación y endocitosis de un péptido catiónico anfipático (melitina) o polímero (butil vinil éter) que está enmascarado de manera reversible, puede potenciar el escape de siRNA al citosol. Enmascaramiento significa que a pH neutro el péptido o polímero no está cargado y no interactúa con la membrana plasmática y la daña, sino que al pH endosomal negativo, se genera una molécula catiónica que daña la membrana endosomal y libera oligonucleótidos co-endocitosados. La inyección iv de estos polímeros enmascarados en las 2 horas posteriores a la administración de siRNA potenció la inactivación de hepatocitos por los col-siRNAs hasta 500 veces en ratones y primates no humanos.

En primer lugar, se puede determinar mediante videomicroscopía de células vivas si la transfección previa de polímeros catiónicos enmascarados facilita la administración citosólica de EpCAM-AsiC (y siRNA lipoplexado) y la inactivación de eGFP in vitro. También se puede investigar si incubar EpCAM-AsiCs con péptidos/polímeros básicos también puede determinar si la inhibición de la acidificación endosomal usando bafilomicina A o concanamicina altera la liberación y la inactivación citoplásmica de EpCAM-AsiC, como predice la teoría de la esponja de protones. Si estos experimentos confirman la teoría de la esponja de protones, se pueden investigar estrategias para alterar EpCAM-AsiCs. Estas incluyen la conjugación covalente (a través de enlaces disulfuro invertidos espontáneamente en el entorno reductor del citosol) de la cadena sentido o antisentido a péptidos penetrantes de células, incluyendo poliargininas de diferentes tamaños, protamina 152, melitina, transportán o penetratina y la conjugación de la cadena sentido de AsiC a éster butílico y aminovinílico o la unión de la cadena sentido a fosfosperminas de diferentes longitudes. Se puede verificar que estas modificaciones no alteran la solubilidad, dan como resultado citotoxicidad o estimulación inmunitaria innata o interfieren con el direccionamiento específico a EpCAM.

Procesamiento con Dicer, incorporación de RISC, escisión de mRNA objetivo. Después, se toma el 2-3 EpCAM-AsiCs superior, con el diseño inicial como control, y se examina si la función de siRNA puede optimizarse. Las transferencias Northern, sondadas para las partes sentido, antisentido y aptámero de EpCAM-AsiC, pueden analizar los productos de EpCAM-AsiC dentro de las células. Su migración se puede comparar con la de las cadenas sentido y antisentido sintetizadas, aptámero y EpCAM-AsiC de longitud completa. Si Dicer escinde la AsiC como se esperaba, se pueden recuperar los RNAs que migran como las cadenas sentido y antisentido (así como EpCAM-AsiCs no procesadas de endosomas y una banda del tamaño del aptámero unido a su enlazador). (La dependencia de Dicer se puede verificar usando células HCT116 que expresan Dicer hipomórfico). Si los RNAs intracelulares no son del tamaño esperado, se pueden clonar para determinar dónde corta Dicer. Si las bandas no se cortan o no están donde se desea, se puede rediseñar el enlazador y la región bicatenaria para producir la escisión deseada. También se puede investigar la sustitución del enlazador UUU por enlazadores alternativos o combinaciones de enlazadores, sustituyendo o añadiendo uno o más enlazadores de 3C o espaciadores de trietilen o hexaetilenglicol, para potenciar el procesamiento intracelular al siRNA. También se puede investigar si un diseño independiente de Dicer en donde el aptámero está unido covalentemente a la cadena sentido o antisentido del siRNA por un enlace disulfuro, reducido espontáneamente en el citosol, conduce a una inactivación más eficaz.

Una vez que hemos demostrado que se produce la cadena antisentido apropiada, a continuación se puede comparar la incorporación de la cadena antisentido en el RISC. La transferencia Northern y la PCR Taqman cuantificarán cuánta cadena activa de entrada en lisados de células completas se extrae con anticuerpo pan-Ago (2A8). La unión a Ago, el T1/2 del siRNA en el RISC y la inactivación del gen objetivo están influenciados por modificaciones químicas de las cadenas sentido y antisentido. Las modificaciones químicas específicas de 2'-F y 2'-OMe en ambas cadenas dispuestas en posiciones y secuencias patentadas pueden aumentar la inactivación en 50 veces y los enlaces PS en los extremos aumentan en gran medida la duración de la inactivación génica. Se puede diseñar un pequeño conjunto de AsiCs que llevan diferentes modificaciones covalentes de las porciones de siRNA de la AsiC y analizar su efecto sobre la inactivación de eGFP, AKT1 y PLK1

Las EpCAM-AsiCs dirigidas a genes adicionales que se evalúan in vivo pueden diseñarse con las secuencias de siRNA más activas y las mejores modificaciones químicas. Un pequeño grupo de secuencias de siRNA para probar la inactivación (sin aptámeros, por transfección) puede identificarse mediante algoritmos web. Los siRNA más eficientes (actividad pM), que también tienen bajas temperaturas de fusión predichas (Tm), se pueden usar, ya que estos se procesan mejor. Si se necesita usar secuencias con Tms superiores, se puede añadir un emparejamiento erróneo en el extremo 3'-terminal de la cadena sentido para promover el desenrollado del siRNA y la incorporación de la cadena activa en el RISC.

Eliminar los efectos fuera del objetivo y la toxicidad. Estos experimentos se pueden realizar con las AsiCs originales y las mejor optimizadas. La falta de toxicidad de las diversas AsiCs que codifican el siRNA de eGFP (cuya inactivación no debería afectar a la viabilidad) se puede evaluar formalmente mediante el ensayo Cell Titer-Glo de las líneas de TNBC incubadas con AsiC. Basándose en el trabajo anterior, no se espera una viabilidad significativamente reducida. La transfección de lípidos se usará como control para la administración de RNA citotóxico. Finalmente, podemos verificar que cada una de las AsiCs no es inmunoestimuladora mediante qRT-PCR, realizado 6 y 24 h después de la incubación con AsiC, para amplificar un panel de genes de respuesta inmune inflamatoria e innata (IFNB, IFNG, IL1, IL8, IL10, OAS1, STAT1, IP10). qRT-PCR es el ensayo más sensible para la inmunoestimulación y se eligen tiempos que capturan la respuesta máxima. Las células tratadas con poli(I:C) pueden servir como controles positivos y las células tratadas de manera simulada serán controles negativos. Si cualquier AsiC es inmunoestimulante (una secuencia y propiedad dependiente de la concentración), se puede evaluar si modificaciones químicas adicionales, que reducen la unión del sensor inmunitario innato, eliminan la estimulación inmunitaria sin comprometer la inactivación génica. Una modificación con 2'-F o 2'-OMe del segundo residuo del producto de escisión de AsiC completa o de Dicer puede lograr este objetivo.

Dado que la CD4-AsiC no es inmunoestimuladora en nuestros estudios preliminares y las AsiC optimizadas son activas a concentraciones muy reducidas (y los efectos fuera de objetivo son dependientes de la concentración), la estimulación inmune innata es poco probable, pero si se detecta, puede suprimirse fácilmente mediante modificación química. Junto con los estudios de explantes de tejido, también se puede examinar la histología tisular cuidadosamente para la alteración de la arquitectura del tejido epitelial y la necrosis celular.

Optimizar la concentración tumoral y definir PK/PD Después se evalúa y mejora el T1/2 sistémico y el direccionamiento al tumor en ratones portadores de tumor. Se puede centrar en el diseño de AsiC original y algunos de los constructos optimizados in vitro (como se identifican). Se puede usar qRT-PCR para medir el T1/2 circulante y la distribución tisular, la obtención de imágenes in vivo de la AsiC fluorescente para observar la localización tumoral y el silenciamiento de mCherry de células tumorales (no se usa GFP debido a la autofluorescencia de fondo) como una lectura del silenciamiento génico. Los estudios de PK/PD de EpCAM-AsiC pueden facilitarse con nuestra experiencia reciente con la obtención de imágenes in vivo (Figura 16, 17A-17B Y 18A-18B, datos no mostrados). Estos experimentos pueden usar ratones nude que llevan xenoinjertos de almohadillas adiposas mamarias de transfectantes estables de Luciferasa-mCherry que se han generado de líneas de TNBC basal-A de EpCAM+, tales como MB468 o HCC1187, en comparación con una línea celular de TNBC basal B mesenquimal de EpCAM-, tal como MB231. Se tiene un plásmido de expresión para estas etiquetas y se usa infección por lentivirus para producir transfectantes estables. ~5-8 ratones/gp se usarán para obtener significación estadística basándose en los datos preliminares en estos modelos. En primer lugar, se puede comparar la concentración en sangre y tumor después de la administración iv y sc del constructo de AsiC original y los constructos optimizados para la inactivación in vitro. Los ratones pueden examinarse frecuentemente para determinar signos clínicos de toxicidad. Las muestras pueden analizarse durante 5 días con recolección de muestras frecuente el primer día. En cada punto de tiempo, la sangre y la orina pueden recogerse y analizarse mediante un ensayo Taqman para determinar la cadena antisentido. Los órganos tumorales y de muestra pueden recogerse en menos puntos de tiempo de animales sacrificados. La sangre puede analizarse para determinar la toxicidad hematológica, hepática y renal mediante recuentos sanguíneos y químicas séricas. Se pueden calcular el T1/2 circulante y la proporción del fármaco inyectado que se localiza en el tumor de EpCAM+. Sin desear estar ligados por la teoría, basándose en los experimentos preliminares con administración sc e iv de las CD4-AsiCs y la experiencia in vivo con la PSMA-AsiC, se espera que la mayoría de estas EpCAM-AsiCs se excreten rápidamente después de la administración iv, pero que las EpCAM-AsiCs inyectadas sc se concentrarán en xenoinjertos tumorales. Los constructos multimerizados más grandes (Figura 20) podrían resistir la filtración renal y tener una mejor concentración tumoral cuando se dan iv. Los resultados de PK sc e iv se compararán con la inactivación de mCherry después de una única inyección de EpCAM-AsiC en un intervalo de concentraciones, evaluada tanto mediante formación de imágenes in vivo (usando el espectro IVIS) como mediante citometría de flujo, FM y qRT-PCR de muestras tumorales recogidas 4, 7 y 12 días después del tratamiento. Estos experimentos pueden proporcionar estimaciones de la dosis eficaz necesaria para la inactivación génica máxima del tumor del 50, 75 y 90% (ED50, ED75, ED90) y para la durabilidad de la inactivación en el tumor (cuantificada como T-KD50 = tiempo para que la expresión del tumor vuelva a la mitad del control a partir de la inactivación máxima). Estos parámetros pueden determinarse para cada constructo elegido.

Después, se evalúan las formas de mejorar el T1/2 circulante. Estas incluyen aumentar el tamaño de la AsiC (es decir, mediante conjugación con PEG comparando unos pocos tamaños, tales como 10, 20 y 30 kD, evitando polímeros que se sabe que son tóxicos, tales como PEI) y aumentar la unión a proteínas séricas para reducir la filtración renal (es decir, mediante conjugación con colesterol, que se une a LDL158.159 sérico o añadiendo una cola de diacilo para promover la unión a albúmina sérica. Se evitan estrategias que producen partículas o agregados ya que éstos tendrán una penetración tumoral más pobre y pueden quedar atrapados en el hígado. La unión de PEG al extremo 5'-terminal del aptámero, el extremo 3'-terminal del siRNA inactivo o el extremo 3'-terminal de la cadena activa no debe interferir con RNAi. La evaluación de PK/PD/toxicidad in vivo se puede realizar como anteriormente, usando la AsiC no conjugada como un control positivo (y prueba de referencia) y el siRNA conjugado (sin el aptámero) como un control negativo. Dos o tres de los constructos que tienen la ED75 o ED90 más baja y la T-KD50 más larga para GFP se ensayarán de nuevo usando EpCAM-AsiC de PLK1 para determinar los parámetros de PK/PD correspondientes, para ayudar a diseñar el régimen de dosificación para experimentos de eficacia antitumoral. También se puede determinar la dosis máxima tolerada (MTD) para estos constructos de PLK1.

Efecto antitumoral de EpCAM-AsiCs contra TNBCs de tipo basal. Nuestro objetivo final es probar las EpCAM-AsiCs contra tumores y metástasis de la almohadilla adiposa mamaria ortotópica. Se pueden usar ratones nude a menos que los tumores no crezcan o crezcan lentamente, en cuyo caso se cambiarán a ratones NSG. La obtención de imágenes de animales vivos puede realizarse usando un espectro IVIS, sensible a fluorescencia multicolor y bioluminiscencia. Estos experimentos pueden evaluar 2-3 de las mejores EpCAM-AsiCs identificadas.

Actividad de EpCAM-AsiCs de PLK1 contra xenoinjertos ortotópicos. Se puede comenzar dirigiendo PLK1/ unos pocos diseños de EpCAM-AsiC de PLK1, optimizados como se ha descrito anteriormente, se pueden inyectar sc y/o iv en grupos de 5-8 ratones (tamaño elegido de cálculos de potencia basados en experimentos previos en donde este tamaño de grupo dio resultados estadísticamente significativos) usando dosis y programas de dosificación/vía de inyección elegidos basados en los resultados de PK/PD anteriores. Por ejemplo, si la ED90 está muy por debajo de la MTD, un experimento inicial podría investigar la administración de 2ED90 cada T-KD50/2 días. Los ratones pueden tratarse inicialmente tan pronto como sus tumores se vuelven palpables, pero en experimentos posteriores puede investigarse si los tumores más grandes de diámetros fijos retroceden después de múltiples administraciones. Se compararán ratones portadores de tumores basal A de EpCAM+ (MB468, HC1187, BPl Er ) y basal B de EpCAM-(MB231) representativos. Para algunos experimentos, se pueden tratar ratones que llevan estos tumores en cada flanco, pero estos pueden necesitar más ratones debido a variaciones intra-animales en los tamaños de los tumores. Los ratones de control pueden tratarse con PBS o siRNAs desnudos, el aptámero de EpCAM por sí mismo, EpCAM-AsiCs que llevan secuencias de siRNA desordenadas y PSMA-AsiCs de PLK1. En algunos experimentos, se puede comparar el tratamiento con EpCAM-AsiC con adecatumumab o paclitaxel. El tamaño del tumor se cuantificará mediante mediciones de luminiscencia y calibre q3d. Los ratones tratados también pueden pesarse y observarse en cuanto a signos clínicos de toxicidad y en el momento del sacrificio pueden examinarse cuidadosamente en cuanto a toxicidad en el intestino y la médula ósea mediante recuentos sanguíneos y examen patológico de intestino, médula ósea y bazo. Las diferencias entre los grupos pueden evaluarse mediante ANOVA de una vía con correcciones para comparaciones múltiples según sea necesario. Para las AsiCs que son eficaces, también se puede examinar el efecto inmediato del tratamiento para evaluar el mecanismo de la actividad antitumoral y verificar que las AsiCs no están activando las respuestas inmunitarias innatas. Los ratones portadores de tumor pueden sacrificarse 1 -3 días después de una única inyección terapéutica o de control y los tumores pueden teñirse para caspasas activadas para determinar si la muerte es por apoptosis y por H&E para buscar husos mitóticos para seguir el efecto esperado de la inactivación de PLK1. Los interferones séricos y las citocinas proinflamatorias se pueden evaluar mediante ELISA multiplexado, y el bazo y las células tumorales se analizan mediante qRT-PCR para los mRNAs correspondientes. Si no hay efecto antitumoral o el efecto antitumoral es subóptimo, el régimen de dosificación se puede ajustar a la MTD. Si el efecto antitumoral es completo (regresión tumoral completa), entonces se pueden evaluar dosis disminuidas y/o tumores más grandes al inicio de la terapia. Cuando los ratones de control se sacrifican debido a que los tumores no tratados han alcanzado el tamaño permitido, los ratones tratados pueden sacrificarse e inspeccionarse las almohadillas adiposas mamarias para determinar el tumor microscópico o macroscópico residual mediante FM, H&E e IHC. Las células tumorales residuales también se pueden evaluar para la expresión de EpCAM para determinar si la resistencia tumoral, si se produce, se puede haber desarrollado como consecuencia de la regulación negativa de EpCAM. Si no se observan células tumorales residuales, se puede realizar un experimento adicional para determinar si los tumores están erradicados - los ratones se tratarán durante 1-2 semanas después de que la medición de luciferasa haya vuelto a los niveles de base, y después se pueden observar los ratones durante 1-2 meses fuera del tratamiento para ver si los tumores vuelven a crecer o aparece metástasis. El régimen(s) más eficaz para TNBCs basal-A también se puede evaluar contra otros subtipos de cáncer de mama (luminal, Her2+) que esperamos que se dirija a EpCAM.

Actividad de EpCAM-AsiC de PLK1 contra tumores metastásicos. Para evaluar la eficacia de EpCAM-AsiCs contra células cancerosas metastásicas, se puede evaluar EpCAM-AsiC de PLK1 contra líneas celulares de TNBC basal-A inyectadas por vía intravenosa en ratones NSG, que tienen la mejor absorción tumoral. Se puede comenzar a tratar ratones tan pronto como los pulmones se convierten en luciferasa+ después de la inyección en la vena de la cola de TNBCs basal-A (o basal-B como control). La dosificación del tratamiento puede usar el programa y modo de administración eficaces determinados anteriormente para tumores primarios. Se pueden obtener imágenes de los ratones q3d. Los controles pueden reducirse a un grupo tratado de manera simulada y grupos tratados con paclitaxel o una EpCAM-AsiC que contiene un siRNA no dirigido. Cuando los ratones de control necesitan sacrificarse, se pueden obtener imágenes de todos los grupos. Los pulmones, hígados y cerebros pueden diseccionarse, pesarse, obtenerse imágenes para cuantificar la carga tumoral, las secciones pueden analizarse mediante H&E y teñirse para EpCAM, y un pulmón de cada animal se analizará mediante qRT-PCR para determinar la expresión relativa de Gapdh humano/de ratón para cuantificar la carga tumoral independientemente. Si los ratones tratados con EpCAM-AsiCs de PLK1 están completamente protegidos de metástasis o muestran una ventaja significativa en comparación con los grupos de control, se puede determinar si los ratones con mayores cargas metastásicas también están protegidos retrasando el inicio del tratamiento hasta que la carga tumoral sea mayor.

También se puede comparar el régimen iv más eficaz con el régimen sc más eficaz identificado anteriormente para el tratamiento de tumores ortotópicos, ya que la liberación/inactivación del RNA en sitios metastásicos podría diferir de los sitios de tumores primarios. También se puede usar este modelo de metástasis para evaluar la inactivación in vivo de los genes BDG de nuestra selección y los genes identificados anteriormente en la presente memoria como necesarios para la iniciación tumoral ex vivo, ya que se cree que la capacidad de M-IC se correlaciona con la función de T-IC.

Actividad de EpCAM-AsiCs dirigida a los genes BDF. A continuación, se puede comparar la inactivación de PLK1 con la inactivación de genes de dependencia de TNBC identificados en nuestra selección de siRNA o en la bibliografía (tal como XBP1). Estos experimentos in vivo para cada objetivo génico elegido pueden implicar (1) identificar siRNAs activos para cada gen y evaluar el efecto de la inactivación sobre la proliferación celular y la función de T-IC in vitro; (2) diseñar y ensayar in vitro AsiCs para inactivar el gen específico; (3) evaluar el efecto de la inactivación génica sobre la proliferación in vitro y la función de T-IC en una variedad de líneas celulares de cáncer de mama; y (4) verificar la falta de estimulación inmunitaria fuera del objetivo de AsiC individual. Los genes que se comportan mejor in vitro pueden avanzarse a pruebas in vivo en modelos ortotópicos y metastásicos como se ha descrito anteriormente para PLK1. En estos experimentos se pueden comparar ratones no tratados con ratones tratados con EpCAM-AsiCs dirigidas al gen específico o PLK1. Si hay un fármaco inhibidor específico para un objetivo génico particular (es decir, bortezomib/carfilzomib para el proteasoma), también puede tratarse un grupo de ratones de control con el fármaco para comparación. Los genes ejemplares para dichos experimentos son genes de proteasoma y genes MCL1, del complejo U4/U6-U5 de tri-snRNP 96, 97, XBP1 y el gen cinetocoro NDC80. Los AsiCs que tienen la mejor actividad in vivo por sí mismos también se evaluarán en combinaciones con AsiCs de PLK1 y entre sí. Dado que la sensibilidad al inhibidor del proteasoma se correlaciona fuertemente con la dependencia de MCL1 in vitro (no mostrado), se plantea la hipótesis de que el gen del proteasoma y la inactivación de MCL1 sean sinérgicos. La sinergia de diferentes combinaciones de AsiC y AsiC/fármaco puede probarse formalmente mediante el método de isobolograma usando diferentes combinaciones de dosis de RNA o combinaciones con fármacos inhibidores relevantes. En particular, se determinará si combinar EpCAM-AsiCs con fármacos estándar de cuidado, tales como paclitaxel, es sinérgico con el constructo original.

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Ejemplo 6

Material y métodos

Cultivo celular

Se cultivaron células BPE y BPLER humanas en medio WIT (Stemgent). Se transdujeron MB468 con un indicador de luciferasa. Todas las otras líneas celulares humanas se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en MEM (MCF7, BT474), 5A (SKBR3) de McCoy, RMPI1640 (HCC1806, HCC1143, HCC1937, HCC1954, HCC1187, MB468, T47D) o DMEM (MB231, BT549, MB436) suplementados todos con FBS al 10%, L-glutamina 1 mM y penicilina/estreptomicina (Gibco) a menos que se indique lo contrario. Se cultivaron células de cáncer de mama de ratón 4T1 en DMEM con FBS al 10%. Para la obtención de imágenes in vivo, se usaron células MB468 que expresaban de manera estable luciferasa de luciérnaga (MB468-luc) y se seleccionaron células MB231 que expresaban de manera estable luciferasa de luciérnaga y mCherry (MB231 -luc-mCherry) después de la infección con lentivirus pLV-Fluc-mCherry-Puro. Las células MB231 se seleccionaron con puromicina.

Para el tratamiento de absorción y silenciamiento, las células se sembraron en placas a baja densidad (10000 células/pocillo en placas de 96 pocillos) y se trataron inmediatamente. Todos los tratamientos con AsiC y siRNA se realizaron en medio OptiMEM o WIT. La viabilidad celular se evaluó mediante CellTiter-Glo (Promega) o mediante tinción con azul de tripano en placas de 96 pocillos.

Para el ensayo de formación de colonias, se trataron 1000 células viables durante 6 h en placas de 96 pocillos de fondo redondo y después se transfirieron a placas de 10 cm en medio que contenía suero. El medio se sustituyó cada 3 días. Después de 8-14 días, las células se fijaron en metanol (-20oC) y se tiñeron con violeta cristal. Para el ensayo de formación de esferas, se trataron 1000 células viables /ml durante 6 h en placas de 96 pocillos de fondo redondo y después se cultivaron en suspensión en DMEM/F12 1:1 libre de suero (Invitrogen), suplementado con EGF (20 ng/ml, BD Biosciences), B27 (1:50, Invitrogen), albúmina de suero bovino al 0,4% (Sigma) y 4 gg/ml de insulina (Sigma). Las esferas se contaron después de 1 o 2 semanas.

Transfección de siRNALas células se transfectaron con Dharmafect I según el protocolo del fabricante. Véase más adelante en la presente memoria para todas las secuencias de siRNA.

Citometría de flujo.Para la citometría de flujo, las células se tiñeron como se ha descrito previamente (Yu, F. et al (2007). let-7 Regulates Self Renovation and Tumorigenicity of Breast Cancer Cells. Cell 131,1109-1123), en resumen, se realizó inmunotinción directa de EpCAM y AKT1 usando diluciones 1:50 de hAb durante 30-60 minutos a 4°C (BioLegend/BD). Las células se tiñeron en PBS que contenía FCS al 0,5%, EDTA 1 mM y HEPES 25 mM. Las muestras se lavaron dos veces en el mismo tampón. Los datos se adquirieron usando FACS-Canto II (BD Biosciences). Los análisis se realizaron por triplicado y se contaron 10000 sucesos/muestra regulados. Todos los análisis de datos se realizaron usando FlowJo (Treestar Inc.).

Análisis de RNA.El análisis de qRT-PCR se realizó como se ha descrito (Petrocca, F., et al. (2008). E2F1-regulated microRNAs impair TGFbeta-dependent cell- cycle arrest and apoptosis in gastric cancer. Cancer Cell 13, 272-286). En resumen, el RNA total se extrajo con Trizol (Invitrogen) y el cDNA se preparó a partir de 1000 ng de RNA total usando el kit Thermoscript RT (Invitrogen) según la SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) del fabricante y un ciclador térmico BioRad C1000 Thermal Cycler (Biorad). Los valores relativos de CT se normalizaron a GAPDH y se convirtieron a una escala lineal.

Digestión con colagenasa de tejido de mama humano.Se recibieron biopsias de cáncer de mama o colon y control frescas del UMASS Tissue Bank, las muestras se cortaron en muestras de 3x3x3 mm y se colocaron en una placa de 96 pocillos con 100 ul de RPMI. Las muestras se trataron con Alexa647-siRNA-GFP, Alexa647-col-siRNA-GFP o Cy3-AsiC-GFP durante 24 horas. Las muestras se fotografiaron y digirieron. Se reunieron tres muestras de cada tratamiento y se pusieron en 10 ml de RPMI que contenía 1 mg/ml de colagenasa II (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a 37°C con agitación. Las muestras se rompieron en un disociador de gentleMACS (Miltenyi) usando el programa del bazo durante 30 minutos a 37°C tanto antes como después de la digestión con colagenasa. Las suspensiones celulares se pasaron a través de un filtro celular de 70 |jm (BD Falcon), se lavaron con 30 ml de RPMI y se tiñeron para citometría de flujo.

Experimentos con animalesTodos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Harvard Medical School y del Children’s Hospital Animal Care and Use Committee. Los ratones nude se adquirieron en Jackson Laboratory.

Experimentos in vivo.Para los estudios de iniciación tumoral, ratones Nu/J hembra de 8 semanas de edad (Stock # 002019, Jackson Laboratories) se inyectaron por vía subcutánea con MB468-luc (5x106) células tratadas previamente durante 24 h con EpCAM-AsiC-GFP, EpCAM-AsiC-PLK1 o no tratadas. Las células se tripsinizaron con Tryple Express (Invitrogen), se re-suspendieron en medio WIT y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco. Después de la inyección intraperitoneal de 150 mg/kg de D-luciferina (Caliper Life Sciences) se obtuvieron imágenes luminiscentes de todo el cuerpo cada 5 días durante un total de 20 días usando el sistema IVIS Spectra (Caliper Life Sciences).

Para los experimentos de absorción de AsiC, células MB468-luc (5x106) y MB231 -luc-mCherry (5x105) se tripsinizaron con Tryple Express (Invitrogen) se re-suspendieron en una solución 1:1 de WIT-Matrigel y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones Nu/J hembra de 8 semanas de edad (Stock # 002019, Jackson Laboratories). El tamaño de los tumores se analizó diariamente usando el sistema IVIS Spectra (Caliper Life Sciences). Después de 5 días, los tumores eran claramente visibles y los ratones se inyectaron por vía subcutánea en el área del cuello con Alexa750-EpCAM-AsiC-GFP (0,5 mg/kg). La localización de la AsiC en comparación con el tumor se probó cada 48 h durante 7 días.

Para estudios de inhibición tumoral, células MB468-luc (5x106) y MB231-luc-mCherry (5x105) tripsinizadas con Tryple Express (Invitrogen), se re-suspendieron en una solución 1:1 de WIT-Matrigel y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones Nu/J hembra de 8 semanas de edad (Stock # 002019, Jackson Laboratories). El tamaño de los tumores se analizó diariamente usando el IVIS Spectra, después de 5 días los tumores eran claramente visibles. Los ratones portadores de tumores de tamaño comparable se aleatorizaron en 5 grupos y se trataron con 5 mg/kg de EpCAM-AsiC-PLK1, EpCAM-AsiC-GFP, aptámero de EpCAM, siRNA-PLK1 o no tratados. Los ratones se trataron cada 72 h durante 14 días.

Todas las imágenes se analizaron usando el software Imagen Viva® Software (Caliper Life Sciences).

Análisis estadísticoSe usaron las pruebas t de Student, calculadas usando Microsoft Excel, para analizar la significación entre las muestras tratadas y los controles, donde el tipo de prueba se fijó a una distribución de una cola y una varianza igual de dos muestras.

Resultados:

EpCAM-AsiC se dirige específicamente a células de cáncer de mama basal A

Se seleccionó un aptámero de EpCAM mediante Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) para la unión a EpCAM humana. El aptámero optimizado tiene solo 19 nucleótidos (nt) de longitud y se une a EpCAM humana con afinidad 12 nM (Shigdar S. et. al. RNA aptamer against a cancer stem cell marker epithelial cell adhesion molecule affinity Cancer Sci. 2011 May; 102(5):991-8).No se une a EpCAM de ratón (Figura 22). Su corta longitud es ideal para un fármaco de AsiC, ya que los RNAs de ~60 nt o menos de longitud pueden sintetizarse químicamente de manera económica y eficaz. Las EpCAM-AsiCs que se diseñaron consisten en una cadena más larga de 42-44 nt (aptámero de 19 nt enlazador de 3 nt cadena sentido (inactiva) de 20-22 nt del siRNA), que se hibrida con una cadena de siRNA antisentido (activa) de 20-22 nt (Figura 21A). Ambas cadenas se sintetizaron comercialmente con sustituciones de 2'-fluoropirimidina, que confieren estabilidad mejorada en suero y otros fluidos corporales (T1/2 >>3 días) y previenen la estimulación de sensores de RNA inmunitario innato. En primer lugar, se evaluaron los niveles de superficie celular de EpCAM mediante citometría de flujo en un panel de líneas celulares de mama humano (Tabla 2, Figura 23). EpCAM se expresó altamente para todas las líneas celulares de cáncer basal A y luminal probadas, pero no por líneas celulares de cáncer basal B. La tinción con EpCAM de células epiteliales humanas normales (BPE) estaba próxima a la base, mientras que su derivado transformado BPLER tenía tinción con EpCAM brillante (Figura 21B). Varios de una gran cantidad de diseños probados (con las cadenas sentido y antisentido intercambiadas y varios enlazadores) inactivaron la expresión génica en líneas celulares EpCAM+, pero no EpCAM-, pero el diseño que funcionó mejor en experimentos de respuesta a la dosis se muestra en la Figura 21A. Para ensayar si EpCAM-AsiC será absorbida específicamente por líneas celulares EpCAM+ se marcó el extremo 3'-terminal de la cadena antisentido del AsiC con Alexa647. La línea celular de TNBC basal A de BPLER sobreexpresa EpCAM, mientras que BPE, una línea celular epitelial de mama de control, no lo hace (Figura 21B). Tanto la célula BPLER como la BPE se trataron con Alexa647-EpCAM-AsiC dirigida a GFP, solo la BPLER mostró absorción de la AsiC (Figura 21C). Además se validó la absorción selectiva de EpCAM-AsiC, tratando células MDA-MB-468 de EpCAM+ y controles de BPE con aptámero de EpCAM marcado con Cy3 (el aptámero de 19nt se marcó con Cy3 en el extremo 5'-terminal). Después de 22 y 43 horas, se observó claramente la absorción selectiva de AsiC en células EpCAM+ (datos no mostrados). Para entender la capacidad de EpCAM-AsiC para desencadenar selectivamente la inactivación génica, elegimos líneas celulares BPLER y BPE que sobreexpresan de manera estable GFP. Las células se trataron con EpCAM-AsiCs dirigido a GFP o se transfectaron con GFP-siRNA como control positivo (Figura 21D). Aunque la transfección con GFP-siRNA inactivó la expresión génica de manera equivalente en BPE y BPLER, EpCAM-AsiCs inactivó selectivamente la expresión en BPLER sin ningún lípido; la inactivación fue uniforme y comparable a la lograda con la transfección de lípidos.

Estos resultados indican claramente que EpCAM-AsiC es absorbida selectivamente por células EpCAM+ y puede inducir la inactivación génica específicamente en estas células EpCAM+. También se muestra que el uso de diferentes fluoróforos (Alexa647 o Cy3) en diferentes localizaciones (5' del aptámero o 3' de la cadena antisentido) no afectaba a la absorción específica.

La inactivación específica de mRNA y proteínas se analizó adicionalmente en 8 líneas celulares de cáncer de mama diferentes. En la presente memoria se muestra que las líneas celulares basal A y luminales que sobreexpresan EpCAM mostraron niveles disminuidos de mRNA y proteína de AKT1 después del tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a AKT1. La transfección con siRNA de AKT1 tuvo un efecto de inactivación similar en todas las líneas celulares, mientras que el uso de EpCAM-AsiC dirigida a GFP como control no afectó a ninguna de las líneas celulares (Figura 24A, 24B). Hubo una clara correlación entre el nivel de expresión de EpCAM y el efecto de inactivación tanto a nivel de mRNA como de proteína (Figura 24D, 24E).

Determinar si el tejido epitelial de cáncer de mama humano puede absorber específicamente EpCAM-AsiC en comparación con el tejido humano sano. Se sometieron a prueba biopsias de cáncer de mama epitelial humano y tejido de control sano del mismo paciente. Las muestras se trataron durante 24 h con Alexa647-siRNA-GFP, Alexa647-col-siRNA-GFP o Cy3-EpCAM-AsiC-GFP (Figura 25A). Las muestras de tumores humanos muestran un nivel de EpCAM más alto, así como niveles de citoqueratina más altos, un marcador de células epiteliales (Figura 25B). El siRNA y el col-siRNA marcados penetraron tanto en el tejido tumoral como en el tejido sano con una eficacia similar, mientras que la EpCAM-AsiC fue absorbida selectivamente por el tejido tumoral y no por la muestra de tejido de control sano (Figura 25C, 25D). El experimento de absorción se repitió en tumores de tres pacientes diferentes, cada biopsia recibida se probó 3 veces para cada tratamiento. Un compendio de los tres pacientes (Figura 25E). Se probaron biopsias de cáncer de colon y se compararon con muestras sanas coincidentes, tanto las muestras sanas como de colon tumoral fueron capaces de absorber Cy3-EpCAM-AsiC-GFP (Figura 26)

EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente la proliferación celular en células de cáncer de mama BasalA

Para entender si EpCAM-AsiC puede dirigirse específicamente a células de cáncer de mama basal A y luminal e inhibir la proliferación, se diseñó una EpCAM-AsiC dirigida a PLK1. PLK1 es un desencadenante conocido para la transición G2/M. El efecto de EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 sobre la proliferación celular se ensayó en 10 células de cáncer de mama representativas de líneas celulares basal A, B y luminales. La EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 disminuyó la proliferación celular tanto en líneas celulares basal A como luminales, mientras que no tuvo efecto sobre las células Basal B (Figura 27A). Se observó una correlación entre los niveles de expresión de EpCAM y la viabilidad celular (Figura 27B). Para entender si EpCAM-AsiC se dirigirá específicamente a células EpCAM+ en una población de células mixtas, se co-cultivaron células HCC1937 (EpCAM+GFP-) con células BPE (EpCAM-GFP+) y se trataron con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 o no se trataron. El co-cultivo no tratado mostró una relación similar de células (41 % de BPE y 59 % de HCC1937). Después del tratamiento con EpCAM-AsiC dirigido a PLK1, la relación de células EpCAM+ disminuyó al 17% y las células EpCAM- aumentó al 83%, lo que indica que EpCAM-AsiC suprime específicamente la proliferación en células EpCAM+. El co-cultivo se repitió con otras líneas celulares basal A (MB468 y HCC1143) y se obtuvieron resultados similares. Cuando las células BPE se cultivaron en un co-cultivo con células basal B (MB231), la relación entre las células BPE y MB231 permaneció igual independientemente del tratamiento con EpCAM-AsiC (66% de BPE y 33% de MB231 en co-cultivo no tratado y 61% de Bp E y 38% de MB231 después del tratamiento con EpCAM-AsiC) (Figura 27C, 27D).

Para determinar si el efecto de supresión de EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 sobre la viabilidad celular en células basal A se desencadena por la unión del aptámero de EpCAM al receptor de EpCAM o por el silenciamiento de PLK1, se trató la célula con el aptámero de EpCAM y se comparó con la de EpCAM-AsiC dirigida a PLK1. La EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 suprimió la viabilidad celular en líneas celulares basal A y luminales mientras que el aptámero de EpCAM no afectó la viabilidad celular en ninguna de las líneas celulares (Figura 28).

Uno de los objetivos fue entender si EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 podría utilizarse para dirigirse a T-ICs dentro de un tumor. Para examinar si podría ser activo no sólo contra el volumen de células dentro de las células basal-A y luminal, sino también contra las T-ICs dentro de ellas, se trataron líneas celulares basal-A, B y luminal con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 durante 24 horas y se analizó el efecto sobre la formación de colonias y esferas in vitro. Las líneas celulares basal A y luminales que forman colonias cuando se siembran en placas a densidad clonal (HCC1937, HCC1954, HCC1806 y MCF7) perdieron la capacidad de formar colonias después del tratamiento con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1, mientras que los clones resistentes surgieron después del tratamiento con paclitaxel (Figura 29A-29B). Por el contrario, la exposición a EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 no afectó a la formación de colonias de células basal B (MB231 y BT549), mientras que el paclitaxel tuvo un efecto similar al de las células basal A y luminales, reduciendo la formación de colonias pero todavía surgieron invariablemente clones resistentes. Asimismo, entre las líneas celulares de cáncer de mama que forman esferas en condiciones no adherentes, paclitaxel, redujo la formación de esferas en todas (Figura 29C), mientras que EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 inhibió específicamente la formación de esferas en basal A y luminal. Para examinar si el tratamiento previo con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 inhibirá o retrasará la iniciación tumoral in vivo, se trató las células MB-468-luc con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1, GFP o no tratada durante 24 h y se inyectaron las células en el flanco de ratones nude. Usando el sistema de obtención de imágenes de Spectra IVIS se siguió el crecimiento tumoral cada 5 días durante 20 días. Las células tratadas previamente con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 no mostraron ningún signo de un tumor después de 20 días mientras que las células no tratadas o las células tratadas previamente con EpCAM-AsiC dirigida a GFP presentaron tumores después de 5 días y el tamaño del tumor creció durante los 20 días (Figura 29D).

EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente la iniciación y el crecimiento tumoral en células de cáncer de mama Basal A

Se pudo demostrar que EpCAM-AsiC puede dirigirse específicamente a células EpCAM+ in vitro, para entender si esta capacidad se conserva in vivo, se probó en primer lugar la estabilidad de EpCAM-AsiC en suero de ratón y humano a lo largo del tiempo. Se observó que EpCAM-AsiC es estable durante al menos 36 h tanto en suero de ratón como humano (Figuras 30A-30B). Se inyectaron ratones nude tanto con células MB468-luc como MB231-luc-mCherry en flancos opuestos. Después de 5 días, cuando los tumores eran claramente visibles usando el sistema de obtención de imágenes IVIS Spectra, se inyectó a los ratones s.c. (en el área del cuello, lo más lejos posible de la vista de inyección de células tumorales) con 0,5 mg/kg de EpCAM-AsiC marcada con Alexa750 dirigida a GFP. Se obtuvieron imágenes de los ratones inmediatamente después de la inyección y otra vez después de 24, 48 h y 5 días para seguir la localización de AsiC. La EpCAM-AsiC dirigida a GFP marcada con Alexa750 se localizó claramente en el tumor MB468-luc (EpCAM+) y no en el tumor MB231-luc-mCherry (EpCAM-) (Figura 31A). El análisis de 7 ratones indica un aumento significativo de Alexa750 en tumores MB468 (EpCAM+) (Figura 31B). En el día 5, los tumores se retiraron y visualizaron para validar que la EpCAM-AsiC dirigida a GFP marcada con Alexa750 entraba en los tumores. El nivel aumentado de Alexa750 se correlacionó negativamente con los niveles de mCherry (datos no mostrados)

Los datos de viabilidad celular e iniciación tumoral indican que EpCAM AsiC dirigida a PLK1 inhibe específicamente el crecimiento tumoral en células de cáncer de mama Basal A. Para probar esta hipótesis, se inyectaron ratones nude con células basal B EpCAM- (células MB231-luc-mCherry) o células basal A EpCAM+ (células MB468-luc). Una vez que los tumores eran claramente visibles por el sistema de obtención de imágenes IVIS, los ratones se trataron con 5 mg/kg de EpCAM AsiC dirigida a PLK1 o GFP cada 72 h durante 14 días o se dejaron sin tratar. Se obtuvieron imágenes de los ratones usando el sistema de obtención de imágenes IVIS Spectra cada 72 h durante 14 días. Los tumores MB468-luc tratados con EpCAM-AsiC dirigida a PLK1 se contrajeron en tamaño tan pronto como 6 días después del tratamiento y en muchos ratones desaparecieron completamente después de 14 días, mientras que los tumores MB231 -luc-mCherry permanecieron sin cambios. Se cree que EpCAM-AsiC tuvo algún efecto incluso aunque estuviera dirigido a GFP ya que el tumor basal A tratado con AsiC de GFP no aumentó de tamaño tanto como los ratones control no tratados. El tratamiento con EpCAM-Asic dirigida a GFP suprime el crecimiento tumoral en tumores tanto EpCAM+ como EpCAM- pero no elimina los tumores. Los tumores no tratados tanto EpCAM+ como EpCAM-aumentaron de tamaño durante los 14 días (Figura 32A-32B).

Tabla 1: Secuencias de EpCAM-AsiC

Tabla 2: Intensidad de fluorescencia media (MFI) de EpCAM de líneas celulares de mama humanas

Ejemplo 7

Los cánceres de mama triple negativos tienen el peor pronóstico de cualquier subtipo de cáncer de mama y no hay terapia de TNBC dirigida. Los TNBCs tienen el fenotipo asociado con células iniciadoras de tumores (T-IC), también conocidas como células madre cancerosas. Las T-ICs son resistentes a la quimioterapia y se cree que son responsables de la recaída y metástasis tumorales.

EpCAM se expresa en uniones gap a bajos niveles en células epiteliales normales, pero se expresa mucho más (100 1000 veces mayor) a lo largo de la membrana de prácticamente todos los cánceres epiteliales y es un marcador de TI-Cs conocido.

En la presente memoria se describe una estrategia para la terapia de inactivación génica para TNBCs de tipo basal. Como se describe en la presente memoria, la plataforma quimera de aptámero-siRNA (AsiC) se adapta para transfectar células epiteliales de cáncer de mama mientras que también se dirigen a células iniciadoras de tumores de mama (T-IC). El aptámero se une a EpCAM, altamente expresado en células cancerosas y células madre cancerosas. Como prueba de concepto, el siRNA se dirige a una quinasa necesaria para la mitosis en todas las células (PLK1). Como se demuestra en la presente memoria, las EpCAM-AsiCs son estables en seres humanos y ratones. Las EpCAM-AsiCs pueden sintetizarse químicamente con 2'-F pirimidinas y dTdT en los extremos 3'-terminales, lo que las hace resistentes a RNasas y poco probable que estimule la inmunidad innata.

Las células se trataron con EpCAM-AsiC 4 mM durante 5 días y se detectó el silenciamiento de la proteína AKT1 específica por AKT1 -AsiC mediante citometría de flujo (Figura 24F).

Los tumores MB468 revierten sólo después del tratamiento con EpCAM-AsiC de PLK1. Los ratones con tumores sc MB468 se trataron con 5 mg/kg de RNA 2x/semana comenzando cuando los tumores se volvieron palpables. Se analizaron las muestras tratadas de EpCAM-AsiC de PLK1, SpCAM-AsiC de GFP, aptámero de EpCAM, siRNA de PLK1 y muestras tratadas de manera simulada (Figura 33).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula quimérica que comprende un dominio aptámero de unión a un marcador de cáncer y un dominio de ácido nucleico inhibidor que inhibe la expresión del gen MCL1, en donde el marcador de cáncer es EpCAM o EphA2.

2. La molécula de la reivindicación 1, en donde la molécula es una quimera de aptámero-siRNA (AsiC).

3. La molécula de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio aptámero de unión al marcador de cáncer comprende o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 33.

4. La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el extremo 3'-terminal de la molécula comprende dTdT.

5. La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la molécula comprende al menos una 2'-F pirimidina.

6. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición de la reivindicación 6, que comprende al menos dos moléculas quiméricas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde las moléculas quiméricas tienen diferentes dominios aptámeros o dominios de ácido nucleico inhibidores.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde diferentes dominios aptámero o de ácido nucleico inhibidor reconocen diferentes objetivos.

9. La composición de la reivindicación 7, en donde diferentes dominios aptámero o de ácido nucleico inhibidor tienen diferentes secuencias y reconocen el mismo objetivo.

10. Una molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9 para su uso en un método para el tratamiento contra el cáncer, comprendiendo el método administrar la molécula o composición.

11. La molécula o composición para el uso de la reivindicación 10, en donde el cáncer es un cáncer epitelial o cáncer de mama.

12. La molécula o composición para el uso de la reivindicación 11, en donde el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo.

13. La molécula o composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde la administración es subcutánea.

14. La molécula o composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde al sujeto se le administra además un tratamiento adicional contra el cáncer.

15. La molécula o composición para el uso de la reivindicación 14, en donde el tratamiento contra el cáncer es paclitaxel.