ES2969734T3 - Composiciones y métodos para tratar una infección activa por Mycobacterium tuberculosis - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para tratar una infección tuberculosa activa y a métodos y composiciones para mejorar la eficacia de regímenes de quimioterapia contra una infección tuberculosa activa. La presente divulgación se refiere a métodos para tratar una infección activa por M. tuberculosis o una infección activa resultante de la reactivación de una infección latente en un mamífero y a métodos para mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia contra la infección activa por M. tuberculosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para tratar una infección activa por Mycobacterium tuberculosis

Antecedentes

Campo técnico

La presente descripción se refiere a métodos y composiciones para tratar una infección activa primaria porM. tuberculosiso una infección activa resultante de la reactivación de una infección latente en un mamífero y a métodos y composiciones para mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia contra la infección activa porM.tuberculosis.

Descripción de la técnica relacionada

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa crónica causada por la infección conMycobacterium Tuberculosisy otras especies deMycobacterium.La TB es una enfermedad pandémica grave en los países en desarrollo, así como un problema creciente en las áreas desarrolladas del mundo, que se cobra entre 1,7 y 2 millones de vidas anualmente. Aunque la infección puede ser asintomática durante un período de tiempo considerable, la enfermedad se manifiesta más comúnmente como una inflamación aguda de los pulmones, lo que da como resultado fiebre y una tos no productiva. Si no se trata, típicamente se producen complicaciones graves y la muerte. El aumento de la TB resistente a múltiples fármacos (MDR-TB) aumenta aún más esta amenaza (Dye, Nat Rev Microbiol 2009;7:81-7).

La progresión de una infección porM. tuberculosisse produce esencialmente en 3 fases. Durante la fase aguda o activa, las bacterias proliferan o se multiplican activamente a una tasa exponencial, logarítmica o semilogarítmica en los órganos, hasta que la respuesta inmunitaria aumenta hasta el punto en el que puede controlar la infección, tras lo cual los picos de carga bacteriana comienzan a disminuir. Aunque el mecanismo no se comprende completamente, se cree que los linfocitos T CD4+ sensibilizados en colaboración con el interferón gamma (IFN-gamma, y-IFN) median en el control de la infección. Una vez que la respuesta inmunitaria activa reduce la carga bacteriana y la mantiene en un nivel estable y bajo, se establece una fase latente. Anteriormente, los estudios informaron que durante la latencia, laM. tuberculosispasa de multiplicarse activamente a un estado latente, volviéndose esencialmente no replicante y permaneciendo dentro del granuloma. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que incluso en la latencia, etapa de infección caracterizada por un número bajo y constante de bacterias, al menos parte de la población bacteriana permanece en un estado de metabolismo activo. (Talaat y col. 2007, J of Bact 189, 4265-74).

Por lo tanto, estas bacterias sobreviven, mantienen un metabolismo activo y se replican mínimamente ante una fuerte respuesta inmunitaria. Por lo tanto, en el individuo infectado, durante la latencia existe un equilibrio entre las bacterias que no se replican (que pueden ser muy difíciles de detectar para el sistema inmunitario, ya que están ubicadas intracelularmente) y las bacterias que se replican lentamente. En algunos casos, la infección latente entra en reactivación, donde las bacterias latentes comienzan a replicarse de nuevo aunque a tasas algo más bajas que las de la infección inicial. Se ha sugerido que la transición de laM. tuberculosisde la infección primaria a la latencia va acompañada de cambios en la expresión génica (Honer zu Bentrup, 2001). También es probable que se produzcan cambios en la especificidad para antígeno de la respuesta inmunitaria, ya que la bacteria modula la expresión génica durante su transición de la replicación activa a la latencia. La naturaleza completa de la respuesta inmunitaria que controla la infección latente y los factores que conducen a la reactivación son en gran medida desconocidos. Sin embargo, existe alguna evidencia de un cambio en los tipos de células dominantes responsables. Si bien las células T CD4 son esenciales y suficientes para el control de la infección durante la fase aguda, los estudios sugieren que las respuestas de las células T CD8 son más importantes en la fase latente. Las bacterias en esta etapa típicamente no son el objetivo de la mayoría de las vacunas preventivas que actualmente están en desarrollo en el campo de la TB, como lo ejemplifica la falta de actividad de las vacunas preventivas clásicas cuando se dan a animales de experimentación con infección latente (Turner y col. 2000 Infect Immun. 68:6:3674-9.).

Aunque la TB generalmente puede controlarse usando una terapia prolongada con antibióticos, dicho tratamiento no es suficiente para prevenir la propagación de la enfermedad. Los individuos infectados pueden ser asintomáticos, pero contagiosos, durante algún tiempo. La práctica clínica actual para la TB latente (asintomática y no contagiosa) consiste en tratar con isoniazida u otro antibiótico durante 6 a 9 meses o, alternativamente, con rifampicina durante 4 meses. La TB activa se trata con una combinación de 4 medicamentos durante 6 a 8 semanas, tiempo durante el cual se cree que la mayoría de los bacilos se destruyen, seguida de dos fármacos durante un total de 6 a 9 meses. La duración del tratamiento depende del número de dosis administradas cada semana. Además, aunque el cumplimiento con el régimen de tratamiento es fundamental, el comportamiento del paciente es difícil de controlar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento debido a los efectos secundarios o a la duración extrema del tratamiento (6-9 meses), lo que, según los estudios, puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de resistencia a fármacos. El documento US-A-2010/129391 describe evidencias experimentales, según las cuales, en la prevención y profilaxis de infecciones activas por Mycobacterium tuberculosis, la inyección de una vacuna con el adyuvante GLA que comprende antígenos de proteína Rv1813, Rv2608 y Rv3620 deM. tuberculosisen combinación con una quimioterapia prolonga la vida de los ratones infectados.

El documento WO-A-2012/038367, así como Liang y col., 2011 (Y. Liang y col.: “Treatment of Multi-Drug-Resistant Tuberculosis in Mice with DNA Vaccines Alone or in Combination with Chemotherapeutic Drugs” , 2011, Scandinavian Journal of Immunology, 74: 42-46) describe el uso médico de una vacuna de ADN basada en adenovirus que permite la expresión de al menos una proteína antigénica deM. tuberculosis,en combinación con el agente quimioterapéutico contra laMycobacterium tuberculosis,para el tratamiento de la tuberculosis activa o tuberculosis resistente a múltiples fármacos.

Bertholet y col., 2010 (Bertholet S. y col.: “A Defined Tuberculosis Vaccine Candidate Boosts BCG and Protects Against Multidrug Resistant Mycobacterium tuberculosis” , 2010, Science Translational Medicine, American Association for the Advancement of Science, 2: 64-71) ya informa los resultados experimentales obtenidos en el tratamiento preventivo de las infecciones porM. tuberculosisusando una composición que comprende GLA-SE como adyuvante e ID93, que es una proteína de fusión que comprende los antígenos Rv3619, Rv1813, Rv3620 y Rv2608 como en la presente solicitud.

Para controlar la diseminación de la tuberculosis, tanto la vacunación profiláctica efectiva como el diagnóstico temprano preciso de la enfermedad activa, seguidos de regímenes terapéuticos más eficaces que incluyen vacunas terapéuticas y agentes quimioterapéuticos rentables y aceptados por el paciente son de suma importancia. Actualmente, la vacunación profiláctica con bacterias vivas como el bacilo de Calmette-Gueerin (BCG), una cepa avirulenta deM. bovis,es el método más eficaz para inducir una inmunidad protectora. Sin embargo, la seguridad y eficacia del BCG es una fuente de controversia, y algunos países, tales como los Estados Unidos, no vacunan al público en general con este agente. El desarrollo de adyuvantes moleculares, combinados con proteínas recombinantes seleccionadas, ha permitido el desarrollo de una nueva generación de vacunas que pueden usarse profilácticamente así como terapéuticamente para tratar, así como prevenir, enfermedades infecciosas. Ver, p. ej., el documento EP 2457926. Lo que se necesita es una vacuna terapéutica que sea eficaz para estimular una respuesta inmunitaria contra la enfermedad de TB activa incluso frente a una alta carga bacteriana, con el fin de proporcionar un complemento a los agentes quimioterapéuticos para reducir la duración del tratamiento, eliminar los bacilos, limitar la patología pulmonar asociada a la enfermedad y, potencialmente, limitar la propagación de la tuberculosis resistente a múltiples fármacos.

Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevos regímenes terapéuticos más eficaces para las infecciones activas porM. tuberculosis,que aumenten la adherencia al tratamiento, reduciendo el tiempo de tratamiento, con el fin de disminuir la transmisión de la TB.

Breve resumen

La presente descripción se refiere a métodos para tratar una infección activa porM. tuberculosiso una infección activa resultante de la reactivación de una infección latente en un mamífero, y a métodos para mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia contra la infección activa porM. tuberculosis.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o a diagnósticoin vivose refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para tratar el cuerpo humano o de un animal mediante terapia o para el diagnósticoin vivo.

La presente descripción se basa en el sorprendente descubrimiento de que una infección activa porM. tuberculosispuede tratarse eficazmente mediante un régimen de tratamiento que comprende una composición terapéutica de Mtb, tal como una vacuna terapéutica de Mtb, y un agente quimioterapéutico eficaz contra una infección porM. tuberculosis,como se establece en las reivindicaciones, acortando de este modo el tiempo de quimioterapia requerido para la protección, reduciendo la carga bacteriana y/o prolongando la supervivencia. Además, sorprendentemente, los inventores han descubierto que la composición terapéutica de Mtb cuando se administra durante una infección activa de TB como complemento a la terapia con antibióticos puede producir una respuesta inmunitaria beneficiosa contra elM. tuberculosisque mejora la eficacia de un régimen quimioterapéutico para la enfermedad de TB. Los inventores descubrieron además que la administración de una composición terapéutica de Mtb, tal como una vacuna terapéutica, durante una infección activa de TB, conjuntamente con un agente quimioterapéutico eficaz contra una infección porM. tuberculosis,estimuló una respuesta significativamente más fuerte, de alta calidad (polifuncional) y duradera de las células T CD4+ de tipo T<h>1.

Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona un método para tratar una infección activa por tuberculosis en un mamífero, comprendiendo el método la etapa de administrar a un mamífero que tiene una infección activa causada por tuberculosis (p. ej.,M. tuberculosis)un agente de quimioterapia y una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna terapéutica en donde la vacuna comprende una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión según lo descrito en la reivindicación 1, y un adyuvante.

Se entenderá en este método y los relacionados de la descripción que al menos una etapa de administración de la vacuna terapéutica, típicamente la etapa inicial de administración de la vacuna terapéutica, tendrá lugar cuando el mamífero esté infectado activamente conM. tuberculosisy/o presente al menos un síntoma clínico o un resultado de ensayo positivo asociado con una infección activa. También se entenderá que los métodos de la presente descripción pueden comprender además etapas adicionales de administración de la misma u otra vacuna terapéutica de la presente descripción en uno o más puntos temporales adicionales de allí en adelante, independientemente de si la infección activa o los síntomas de la misma todavía están presentes en el mamífero, e independientemente de si un resultado de ensayo asociado con la infección activa sigue siendo positivo, con el fin de mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia. También se entenderá que los métodos de la presente descripción pueden incluir la administración de la vacuna terapéutica sola o junto con otros agentes y, como tal, la vacuna terapéutica puede ser uno de una pluralidad de componentes de tratamiento como parte de un régimen de tratamiento terapéutico más amplio. Por consiguiente, los métodos de la presente descripción mejoran ventajosamente la eficacia de un régimen de tratamiento de quimioterapia para el tratamiento de una infección activa por tuberculosis.

En algunas realizaciones, la vacuna terapéutica comprende un polipéptido de fusión que comprende una combinación de los antígenos Rv1813, Rv3620 y Rv2608 de una especie deMycobacterium,en donde Rv1813 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 5, Rv3620 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 6, y Rv2608 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 7, y los antígenos se unen covalentemente.

En algunas realizaciones, la vacuna terapéutica comprende un polipéptido de fusión que comprende una combinación de los antígenos Rv1813, Rv3620, Rv2608 y Rv3619 de una especie deMycobacterium,en donde Rv1813 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 5, Rv3620 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 6, Rv2608 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 7, y Rv3619 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 8, y los antígenos se unen covalentemente.

En algunas realizaciones, la vacuna terapéutica comprende un polipéptido de fusión seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la Id. de sec. n.°: 1; un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la Id. de sec. n.°: 2; o un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la Id. de sec. n.°: 3 o Id. de sec. n.°: 4.

En una realización específica, la vacuna terapéutica comprende el polipéptido de fusión ID93, que comprende los antígenos Rv2608, Rv3619, Rv3620 y Rv1813.

En otra realización específica, la vacuna terapéutica comprende el polipéptido de fusión ID93, que comprende los antígenos Rv2608, Rv3619, Rv3620 y Rv1813, en donde las secuencias de los antígenos son delM. tuberculosis.En una realización más específica, el polipéptido de fusión ID93 comprende una secuencia establecida en la Id. de sec. n.°: 1.

En la presente memoria se proporciona además un método para tratar una infección activa por tuberculosis en un mamífero, comprendiendo el método la etapa de administrar a un mamífero que tiene una infección activa por tuberculosis una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna terapéutica junto con uno o más agentes quimioterapéuticos, en donde la vacuna comprende una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de fusión aislado, en donde el polipéptido de fusión comprende una combinación de los antígenos Rv3620 y Rv2608 de una especie de Mycobacterium de un complejo de tuberculosis, y los antígenos se unen covalentemente.

En la presente memoria se proporciona además un método para tratar una infección activa por tuberculosis en un mamífero, comprendiendo el método la etapa de administrar a un mamífero que tiene una infección activa por tuberculosis una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna terapéutica junto con uno o más agentes quimioterapéuticos, en donde la vacuna comprende una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de fusión aislado, en donde el polipéptido de fusión comprende una combinación de los antígenos Rv1813, Rv3620 y Rv2608 de una especie de Mycobacterium de un complejo de tuberculosis, y los antígenos se unen covalentemente.

En determinadas realizaciones, la infección activa que se tratará según los métodos descritos es una infección activa que causa un síntoma clínico de TB activa en el mamífero, seleccionado del grupo que consiste en debilidad, fiebre, escalofríos, pérdida de peso, anorexia y sudores nocturnos. En otras realizaciones, la infección activa causa un síntoma clínico de síntomas de TB pulmonar en el mamífero, seleccionado del grupo que consiste en tos persistente, moco espeso, dolor torácico y hemoptisis. En otras realizaciones más, la infección activa se caracteriza por la presencia de bacterias Mtb que proliferan, se reproducen, se expanden o se multiplican activamente a una tasa exponencial, logarítmica o semilogarítmica en un órgano del mamífero. En otras realizaciones más específicas, la infección activa se identifica mediante un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de tinción de ácido-alcohol resistencia (AFS); un ensayo de cultivo bacteriano, tal como el ensayo BACTEC MGIT 960; una prueba IGR, tal como la prueba QFT®-Gold o la QFT®-Gold In-tube, o la prueba T SPOT™.TB; una prueba cutánea, tal como la TST, prueba cutánea de la tuberculina (TST) de Mantoux; y tinción intracelular de citocinas de sangre completa o PBMC aisladas después de la estimulación con antígeno.

Será evidente que, en algunas realizaciones, la infección activa será una infección activa primaria porM.tuberculosis,mientras que en otras se deberá a la reactivación de una infección latente porM.tuberculosis.En algunas realizaciones, el mamífero se infectará con una cepa resistente a múltiples fármacos (MDR) deM. tuberculosis.En otras realizaciones, el mamífero se habrá inmunizado previamente contra el bacilo de Calmette-Guerin (BCG).

Determinadas realizaciones de los métodos descritos incluyen la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos eficaces en el tratamiento de una infección porM. tuberculosis,tal como isoniazida y/o rifampicina. En algunas situaciones, primero se administra al mamífero uno o más agentes quimioterapéuticos durante un período de tiempo y, a continuación, se le administra la vacuna terapéutica. En otras situaciones, primero se administra al mamífero la vacuna terapéutica y, a continuación, se le administra uno o más agentes quimioterapéuticos durante un período de tiempo. En otras situaciones más, la administración del uno o más agentes quimioterapéuticos y la vacuna terapéutica se inicia al mismo tiempo. Además, se entenderá que cuando se ponen en práctica los métodos descritos puede ser conveniente administrar la composición farmacéutica y/o la vacuna terapéutica al mamífero en múltiples ocasiones, p. ej., en uno o más momentos posteriores a la primera administración.

En algunas realizaciones, la vacuna terapéutica comprende además un adyuvante. En algunas realizaciones, el adyuvante usado en la vacuna terapéutica es un adyuvante GLA, tal como un adyuvante GLA que tiene la siguiente estructura:

en donde R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11>-C<20>; y R<2>y R<4>son alquilo C<12>-C<20>o alquilo C<9>-C<20>.

En una realización más específica, cuando se usa un GLA que tiene la estructura anterior, R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11-14>; y R<2>y R<4>son alquilo C<12-15>. En una realización aún más específica, el GLA de la estructura anterior es aquel en el cual R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11>; y R<2>y R<4>son alquilo C<13>. En una realización aún más específica, el GLA de la estructura anterior es aquel en el cual R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>.

En otro aspecto, las composiciones se emplean en métodos para reducir el curso temporal de la quimioterapia en una infección activa por tuberculosis en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administración a un mamífero con una infección activa porMycobacterium tuberculosisde una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna terapéutica como se describe en la presente memoria, p. ej., que comprende una proteína o polipéptido de fusión, o un fragmento inmunogénico de los mismos, de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis y un adyuvante, conjuntamente con uno o más agentes quimioterapéuticos eficaces contra una infección porM. tuberculosis,reduciendo de este modo el curso temporal de la quimioterapia contra una infección porM. tuberculosis.En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para reducir el curso temporal de la quimioterapia contra una infección activa por tuberculosis, comprendiendo el método administrar a un mamífero que tiene una infección activa por tuberculosis una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna terapéutica junto con la quimioterapia, en donde la vacuna comprende una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de fusión aislado, en donde el polipéptido de fusión comprende (a) una combinación de los antígenos Rv1813, Rv3620 y Rv2608 de una especie de Mycobacterium de un complejo de tuberculosis y los antígenos se unen covalentemente, o (b) una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con la combinación de antígenos, y en donde la vacuna induce una respuesta inmunitaria contra la tuberculosis, proporcionando de este modo una reducción del curso temporal de la quimioterapia contra una infección activa por tuberculosis. En algunos aspectos, el curso temporal de la terapia se acorta a aproximadamente 3, 4, 5, 6 o 7 meses,p. ej.,no más de aproximadamente 3, 4, 5, 6 o 7 meses. Al acortar el curso temporal de la quimioterapia contra la infección porM. tuberculosis,los presentes métodos también son eficaces para mejorar la adherencia de un individuo al tratamiento que recibe para una infección porM. tuberculosisde manera que pueda completar todo el curso de tratamiento.

En un aspecto adicional, las composiciones se emplean en métodos para estimular una respuesta polifuncional y duradera de las células T CD4<+>de tipo T<h>1 en una infección activa por tuberculosis en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administración a un mamífero con una infección activa porMycobacterium tuberculosisde una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna terapéutica como se describe en la presente memoria, p. ej., que comprende una proteína de fusión o un fragmento inmunogénico de la misma de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis y un adyuvante, conjuntamente con uno o más agentes quimioterapéuticos eficaces contra una infección porM. tuberculosis,estimulando de este modo una respuesta polifuncional y duradera de las células T CD4<+>de tipo T<h>1. Al acortar el curso temporal de la quimioterapia contra la infección porM. tuberculosis,los presentes métodos también son eficaces para mejorar la adherencia de un individuo al tratamiento que recibe para una infección activa porM. tuberculosisde manera que complete todo el curso de tratamiento.

En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, un mamífero puede ser un ser humano.

Breve descripción de los dibujos

El documento de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujo(s) en color tras la solicitud y el pago de la tarifa necesaria.

La Figura 1 muestra la carga bacteriana y la supervivencia de ratones SWR/J y C57BL/6 infectados conMycobacterium tuberculosis(Mtb) y tratados con antibióticos. Los ratones SWR/J y C57BL/6 se infectaron con un aerosol de dosis baja (50-100 bacterias) (LDA) de la cepa H37Rv de Mtb (ATCC, n.° 27294). (Figura 1A) El número de bacterias viables en los pulmones (5 ratones/grupo) se determinó 15, 30 y 100 días después de la infección. Los símbolos indican la media /- la desviación estándar. (Figura 1B) La supervivencia de los ratones SWR/J y C57BL/6 se monitorizó en animales (8 ratones/grupo) infectados con Mtb H37Rv y tratados de forma simulada o tratados con un régimen de antibióticos de 90 días (Rx 90 d) que consistió en INH y RIF, administrados en los días 30-120. (Figura 1C) Los ratones SWR/J se infectaron con un LDA de Mtb H37Rv y se trataron con antibióticos durante 30, 60 o 90 días, comenzando el día 15 (Rx 30 d, 60 d, 90 d) o el día 30 (Rx 90 d (30)). Se muestra la supervivencia de los ratones SWR/J (7 ratones/grupo). (Figura 1D) El número de bacterias viables en los pulmones de los animales (5 ratones/grupo) tratados de forma simulada o tratados con un régimen de INH/RIF de 90 días (R x 90 d) administrado en los días 30-120, se determinó 30, 60, 90, 120 y 150 días después de la infección. *P <0,05 (ANOVA unidireccional, seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunnett o la prueba de rango logarítmico) se considera significativo. Se muestra un representante de dos experimentos. ;;La Figura 2 muestra los recuentos de unidades formadoras de colonias y la supervivencia de ratones SWR/J infectados con un LDA de Mtb y tratados con antibióticos e ID93/GLA-SE. Los ratones SWR/J se infectaron con LDA de Mtb (día 0). Quince días después (día 15) los ratones se trataron de forma simulada o se trataron con antibióticos durante 90 días (Rx 90 d). Un subconjunto de ratones tratados con antibióticos en cada grupo también se inmunizó 3 veces con ID93/GLA-SE, con 3 semanas de separación entre una y otra, ya sea durante el tratamiento terapéutico (DTT; días 15, 36, 57) o después del tratamiento terapéutico (PTT; días 107, 128, 149) con los antibióticos. (Figura 2A) Esquema de experimentos de inmunoterapia. (Figura 2B) El número de bacterias viables en los pulmones de los animales (6 o 7 ratones/grupo) se determinó 177 días después de la infección. *P <0,05 se considera significativo. (Figura 2C) La protección se evaluó monitorizando las muertes de los animales (9 o 10 ratones/grupo) causadas por Mtb con el tiempo. Se muestra un representante de cuatro experimentos. P <0,05 (prueba de rango logarítmico) se considera significativo.

La Figura 3 muestra la supervivencia de los ratones SWR/J infectados con Mtb y tratados con la vacuna ID93/GLA-SE y la reducción de la quimioterapia con antibióticos. Los ratones SWR/J se infectaron con un LDA de Mtb H37Rv. Quince días después, los ratones se trataron durante 60 o 90 días con antibióticos (Rx 60 d y Rx 90, respectivamente). Una vez completado el régimen de antibióticos de 60 días, los ratones se inmunizaron 3 veces con ID93/GLA-SE, con 3 semanas de separación entre una y otra. (Figura 3A) La protección se evaluó monitorizando las muertes de los animales (7 ratones/grupo) causadas por Mtb con el tiempo. P <0,05 (prueba de rango logarítmico) se considera significativo. (Figuras 3B-3M) Evaluación histopatológica de tejidos pulmonares después de la exposición con Mtb H37Rv. Las respuestas inflamatorias y la formación de granuloma (g) se muestran en las secciones H&E (Figuras 3B-3I) y se evaluó la presencia de BAAR (flechas) (Figuras 3J-3M). (Figuras 3B, 3F, 3J) Ratones tratados de forma simulada, día 106; (Figuras 3C, 3J y 3K) Terapia con antibióticos durante 90 días, día 106; (Figuras 3D, 3H, 3L) Terapia con antibióticos durante 90 días ID93/GLA-SE, día 241; (Figuras 3E, 3I y 3M) Terapia con antibióticos durante 60 días ID93/GLA-SE, día 295. Los datos mostrados son representativos de 5 ratones/grupo. Se muestra un representante de tres experimentos.

La Figura 4 muestra respuestas de citocinas específicas para ID93 en ratones SWR después de la inmunoterapia. Se infectaron ratones SWR con un Mtb H37Rv mediante LDA y se trataron durante 90 días con antibióticos solos o con antibióticos, seguidos de 3 inmunizaciones con ID93/GLA-SE, con 3 semanas de separación entre cada una. (Figura 4A) Perfil de citocinas de los esplenocitos estimulados con ID93 recuperados a los días 177 o 241 después de la infección. Las células se incubaron durante 24 horas en presencia de antígeno o medio de control y los sobrenadantes se recogieron y analizaron mediante una matriz de perlas múltiplex para determinar IFN-<y>, IL-2, TNF, IL-5, IL-10, IL-13 e IL-17. Los diagramas de caja muestran la mediana y el rango intercuartil después de la sustracción del fondo. Valores de P de la prueba de sumas de rangos de Wilcoxon. (Figuras 4B-4D) Tinción intracelular de citocinas para determinar las respuestas de las células T específicas para ID93 a los 149 y 177 días después de la infección. Las células se estimularon con ID93 o medio de control en presencia de brefeldina A durante 8-12 horas, se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD3, CD4, CD8, CD44, IFN-y, IL-2 y TNF. (Figuras 4B y 4C) Los paneles muestran el esquema de selección y separación de células para el análisis por FACS. (Figura 4D) Los diagramas de caja en el panel inferior muestran la mediana y el rango intercuartil después de la sustracción del fondo. Valores de P de la prueba de sumas de rangos de Wilcoxon. Se muestra un representante de dos experimentos.

La Figura 5 muestra la supervivencia, los parámetros clínicos y la carga bacteriana de primates no humanos (NHP) infectados con Mtb y tratados con antibióticos y ID93+GLA/GLA-SE. Se inocularon macacos cynomolgus por vía intratraqueal con 1000 UFC deM. tuberculosisvirulento (Cepa Erdman). Se dejó que la infección continuara durante 60 días, después de lo cual recibieron un tratamiento de 30 días con antibióticos INH/RIF administrados por sonda nasogástrica, o una solución salina (tratamiento simulado). Se les inyectó a los monos (7 por grupo) ID93/GLA-SE (Rx ID93/GLA-SE), administrado 3 veces con una separación de 2 semanas entre una y otra, o no recibieron tratamiento adicional (tratamiento simulado, Rx). (Figura 5A) Esquema del experimento de inmunoterapia con NHP. (Figura 5B) Se monitorizó la supervivencia durante 50 semanas después de la exposición. (Figura 5C) Los cambios de CYR también se evaluaron mensualmente durante 50 semanas después de la exposición. (Figura 5D) En la necropsia, las bacterias se cuantificaron mediante el recuento de la carga bacteriana (UFC) en los pulmones de los monos. (Figura 5E) Aspecto histológico de las secciones teñidas con H&E de tejidos pulmonares recolectados de NHP.

La Figura 6 muestra los recuentos de UFC pulmonares en log10 después de (Figura 6A) 6 semanas y (Figura 6B) 12 semanas de tratamiento.

La Figura 7 muestra el crecimiento bacteriano después de la finalización de la terapia.

Descripción detallada

Como se describe en la presente memoria, la presente descripción se refiere generalmente a composiciones y métodos para tratar la infección activa de TB usando vacunas terapéuticas para la TB en combinación con agentes quimioterapéuticos anti-TB, que pueden conducir a tiempos de tratamiento más cortos, aclaramiento de los bacilos de Tb y, potencialmente, a limitar la propagación de la TB resistente a múltiples fármacos. La invención se expone en las reivindicaciones.

Las composiciones de vacuna terapéutica descritas actualmente comprenden generalmente al menos dos polipéptidos heterólogos de una especie deMycobacteriumdel complejo detuberculosis.Una especie deMycobacteriumdel complejo detuberculosisincluye aquellas especies tradicionalmente consideradas como las causantes de la enfermedad tuberculosis, así como las especies ambientales y oportunistas deMycobacteriumque causan la tuberculosis y enfermedades pulmonares en pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes con SIDA, p. ej.,Mycobacterium tuberculosis (Mtb), Mycobacterium bovis o Mycobacterium africanum, BCG, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium celatum, Mycobacterium genavense, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium simiae, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium scrofulaceum(ver, p. ej., Harrison's Principles of Internal Medicine, volumen 1, págs. 1004-1014 y 1019-1020). En una realización preferida, la especie deMycobacteriumque se pretende prevenir, tratar o diagnosticar según la invención es elMycobacterium tuberculosis(Mtb). Las secuencias de antígenos de la especie deMycobacteriumson fácilmente disponibles. Por ejemplo, las secuencias de laMycobacterium tuberculosisse pueden encontrar en Cole y col., Nature 393:537 (1998) y se pueden encontrar en sitios web tales como los mantenidos por Wellcomer Trayst, el Instituto Sanger y el Instituto Pasteur.

En determinadas realizaciones, la vacuna terapéutica comprende un polinucleótido de fusión, polipéptido de fusión o una composición, como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0129391.

Por ejemplo, en determinadas realizaciones específicas, la vacuna terapéutica comprende un polipéptido o proteína de fusión aislado, o un polinucleótido que codifica el mismo, que comprende una combinación de dos o más antígenos de laMycobacterium tuberculosisunidos covalentemente, o fragmentos inmunogénicos de los mismos, en donde los antígenos se seleccionan del grupo que consiste en Rv0164, Rv0496, Rv2608, Rv3020, Rv3478, Rv3619, Rv3620, Rv1738, Rv1813, Rv3810, Rv2389, Rv2866, Rv3876, Rv0054, Rv0410, Rv0655, Rv0831, Rv1009, Rv1099, Rv1240, Rv1288, Rv1410, Rv1569, Rv1789, Rv1818, Rv1860, Rv1886, Rv1908, Rv2220, Rv2032, Rv2623, Rv2875, Rv3044, Rv3310, Rv3881, Rv0577, Rv1626, Rv0733, Rv2520, Rv1253, Rv1980, Rv3628, Rv1884, Rv3872, Rv3873, Rv151 1 y Rv3875, y antígenos que tienen al menos el 90 % de identidad con cualquiera de las secuencias anteriores, como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0129391.

La vacuna terapéutica reivindicada comprende un polipéptido de fusión aislado que comprende una combinación de los antígenos Rv1813, Rv3620 y Rv2608 de una especie de Mycobacterium de un complejo de tuberculosis, y los antígenos se unen covalentemente. En algunas realizaciones, la vacuna terapéutica comprende un polipéptido de fusión que comprende una combinación de los antígenos de Mycobacterium Rv2608, Rv3619, Rv3620 y Rv1813. En algunas realizaciones, los antígenos de Mycobacterium Rv2608, Rv3619, Rv3620 y Rv1813 son los antígenos deM. tuberculosisRv2608, Rv3619, Rv3620 y Rv1813. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende una secuencia establecida en la Id. de sec. n.°: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende una secuencia establecida en la Id. de sec. n.°: 2. En algunas realizaciones, la vacuna terapéutica comprende un polipéptido de fusión que comprende una combinación de antígenos de Mycobacterium Rv2608, Rv3620 y Rv1813. En algunas realizaciones, los antígenos de Mycobacterium Rv2608, Rv3620 y Rv1813 son los antígenos deM. tuberculosisRv2608, Rv3620 y Rv1813. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende una secuencia establecida en la Id. de sec. n.°: 3 o 4. En algunas realizaciones, el antígeno Rv1813 comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°:5. En algunas realizaciones, el antígeno Rv3620 comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°:6. En algunas realizaciones, el antígeno Rv2608 comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°:7. En algunas realizaciones, el antígeno Rv3619 comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°:8. Un experto en la técnica entendería que pueden eliminarse uno o más aminoácidos del extremo N-terminal (tales como las secuencias señal).

En una realización más específica, la vacuna terapéutica comprende la proteína de fusión ID93, o un polinucleótido que codifica la misma, que comprende cuatro antígenos que pertenecen a familias de proteínas de Mtb asociadas con la virulencia (Rv2608, Rv3619, Rv3620) o la latencia (Rv1813), como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0129391.

En algunas realizaciones específicas, una proteína de fusión, p. ej., una proteína de fusión ID93, se formula como una vacuna. En realizaciones específicas adicionales, una vacuna terapéutica comprende una emulsión de aceite en agua estable (SE) y GLA un agonista sintético de TLR-4 (GLA) como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2008/0131466. Como entenderá un experto en la técnica, en algunas realizaciones la vacuna terapéutica comprende un polipéptido aislado, un polipéptido o fragmento de fusión aislado (p. ej., una porción antigénica/inmunogénica) de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis conocido en la técnica. Los polipéptidos de Mtb de la descripción, fragmentos antigénicos/inmunogénicos de los mismos y otras variantes pueden prepararse usando técnicas convencionales recombinantes y/o sintéticas.

La terapia se administra con uno o más agentes quimioterapéuticos eficaces contra una infección porM. tuberculosis.Los ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, amikacina, ácido aminosalicílico, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, kanamicina, pirazinamida, rifamicinas (es decir, rifampicina, rifapentina y rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina y fluoroquinolonas. La determinación de dicha quimioterapia queda a criterio del médico tratante, que usará las combinaciones de fármacos preferidas. Los agentes quimioterapéuticos “ de primera línea” usados para tratar una infección por M.tuberculosisque no es resistente a fármacos incluyen isoniazida, rifampicina, etambutol, estreptomicina y pirazinamida. Los agentes quimioterapéuticos “ de segunda línea” usados para tratar una infección porM. tuberculosisque ha demostrado resistencia a uno o más fármacos de “ primera línea” , incluyen, pero no se limitan a, ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, amikacina, kanamicina y capreomicina.

En algunas realizaciones, se administra una vacuna terapéutica a un mamífero con TB activa antes, simultáneamente o después de la administración del uno o más agentes quimioterapéuticos eficaces contra una infección porM. tuberculosis.En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra simultáneamente, al mismo tiempo. Alternativamente, un agente quimioterapéutico se administra dentro de minutos, tales como aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 minutos, horas, tales como aproximadamente 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 horas, o incluso días, tales como aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días. En algunas realizaciones, un agente quimioterapéutico se administra aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas antes de la vacuna terapéutica. En una realización, se administra una molécula de ácido nucleico o proteína de fusión aproximadamente 2 semanas después de comenzar la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos. El uno o más agentes quimioterapéuticos se administran generalmente durante un período de tiempo, por ejemplo, durante aproximadamente 1, 2, 3 o 4 semanas, o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6 u 8 meses, o aproximadamente 1 año o más.

En algunas realizaciones, una primera administración a un mamífero que tiene una infección de TB activa de una composición terapéutica para estimular una respuesta inmunitaria que comprende una molécula de ácido nucleico, polipéptido de fusión o vacuna va seguida de una o más administraciones posteriores de un ácido nucleico, polipéptido de fusión o vacuna. Por ejemplo, una primera administración con una molécula de ácido nucleico o polipéptido de fusión va seguida de una o más administraciones posteriores de una molécula de ácido nucleico o proteína de fusión. En una realización, una primera administración con una molécula de ácido nucleico o polipéptido de fusión va seguida de una o más administraciones posteriores de un polipéptido de fusión. En una realización, una primera administración con una molécula de ácido nucleico o polipéptido de fusión va seguida de una o más administraciones posteriores de una molécula de ácido nucleico. Usualmente, la primera o la segunda administración o las administraciones posteriores se proporcionan con una separación aproximada de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas, o hasta con una separación aproximada de 4, 5 o 6 meses entre una y otra. Administraciones adicionales se proporcionan con una separación aproximada de 6 meses, o tan larga como 1, 2, 3, 4 o 5 años entre una y otra.

En otro aspecto, las composiciones se emplean en métodos para reducir o acortar el curso temporal de la quimioterapia contra una infección porM. tuberculosis,comprendiendo el método administrar a un mamífero ya infectado con Mycobacterium tuberculosis uno o más agentes quimioterapéuticos eficaces contra una infección porM. tuberculosisy una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de fusión, p. ej., ID93, o un fragmento inmunogénico del mismo, procedente de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis y un adyuvante, en donde dicho polipéptido de fusión ID93 induce una respuesta inmunitaria contra laM. tuberculosis,permitiendo de este modo reducir o acortar el curso temporal de la quimioterapia contra una infección porM. tuberculosis.Por lo general, la administración de una molécula de ácido nucleico, polipéptido de fusión o vacuna permitirá un tratamiento quimioterapéutico eficaz contra una infección porM. tuberculosisen un plazo de 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses o menos.

Las composiciones y los métodos de la presente descripción se administran generalmente a seres humanos, pero son eficaces en otros mamíferos, incluidos mamíferos domésticos (es decir, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, cobayas, hámsteres, chinchillas) y mamíferos agrícolas (es decir, vacas, cerdos, ovejas, cabras, caballos).

Definiciones

En la presente descripción, el término “ aproximadamente” y la expresión “ que consiste esencialmente en” significan ±20 % del intervalo, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario. Como se usa en el presente documento, debe entenderse que los términos “ un” y “ una” se refieren a “ uno o más” de los componentes enumerados. Debe entenderse que el uso de una conjunción de alternancia (p. ej., “ o” ) es para indicar uno/a, ambos/as o cualquier combinación de las alternativas. Como se usa en el presente documento, los términos “ incluir” , “tener” y “ comprender” se usan como sinónimos, pretendiendo interpretarse dichos términos y variantes de los mismos como no limitativos.

Un “ agente quimioterapéutico” , “ agentes quimioterapéuticos” o “ régimen de quimioterapia” es un fármaco o combinación de fármacos usados para tratar o en el tratamiento de pacientes infectados o expuestos a cualquier especie deM. tuberculosis,e incluye, pero no se limita a, amikacina, ácido aminosalicílico, capreomicina, cicloserina, etambutol, etonamida, isoniazida (INH), kanamicina, pirazinamida, rifamicinas (es decir, rifampicina, rifapentina y rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina y fluoroquinolonas y otros derivados, análogos o biosimilares en la técnica. Los agentes quimioterapéuticos “ de primera línea” son agentes quimioterapéuticos usados para tratar una infección porM.tuberculosisque no es resistente a fármacos, e incluyen, pero no se limitan a, isoniazida, rifampicina, etambutol, estreptomicina y pirazinamida y otros derivados, análogos o biosimilares en la técnica. Los agentes quimioterapéuticos “ de segunda línea” usados para tratar una infección porM. tuberculosisque ha demostrado resistencia a los fármacos, a uno o más fármacos de “ primera línea” , incluyen, sin limitación, ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, amikacina, kanamicina y capreomicina y otros derivados, análogos o biosimilares en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, “ mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia” se refiere a acortar la duración de la terapia requerida para lograr un resultado clínico deseable, reducir el número de los diferentes agentes quimioterapéuticos requeridos para lograr un resultado clínico deseable, reducir la dosificación de los agentes quimioterapéuticos requeridos para lograr un resultado clínico deseable, disminuir la patología del huésped u órganos huésped asociados con una infección clínica activa, mejorar la viabilidad del huésped u órganos de un huésped tratado con los métodos, reducir el desarrollo o la incidencia de cepas de MDR-TB y/o aumentar la adherencia del paciente a los regímenes de quimioterapia.

Una “ composición terapéutica contra la Mtb” , como se usa en la presente memoria, se refiere a una composición o composiciones capaces de provocar una respuesta inmunitaria beneficiosa contra laM. tuberculosiscuando se administra a un huésped con una infección activa de TB. Una “ respuesta inmunitaria beneficiosa” es aquella que reduce los signos o síntomas de la enfermedad activa de TB, reduce los recuentos de bacilos, reduce la patología asociada con la enfermedad activa de TB, genera un perfil de citocinas apropiado asociado con la resolución de la enfermedad, expande las células T CD4+ y CD8+ específicas para antígeno, o mejora la eficacia de los regímenes de quimioterapia. Las composiciones terapéuticas contra la Mtb de la descripción incluyen, sin limitación, polinucleótidos que codifican polipéptidos, polipéptidos, fragmentos antigénicos, péptidos administrados en formulaciones farmacéuticamente aceptables mediante métodos conocidos en la técnica, e incluyen formulaciones de vacuna.

Un “ huésped” , “ sujeto” , “ paciente” , “ mamífero” o “ individuo” se usan en la presente memoria indistintamente.

“ M. tuberculosis”,“ Mtb” ,“ Mycobacterium tuberculosis” , “ bacterias” , “ bacteria” , “bacilo” ,como se usan en la presente memoria, se refieren todos a las bacterias responsables de causar la enfermedad de TB en un mamífero.

Una infección porM. tuberculosis“ resistente a fármacos” se refiere a una infección porM. tuberculosisen donde la cepa infectante no se mantiene estática ni es destruida por (es resistente a) uno o más de los agentes quimioterapéuticos llamados de “ primera línea” eficaces en el tratamiento de una infección porM. tuberculosis(p. ej., isoniazida, rifampicina, etambutol, estreptomicina y pirazinamida).

Una infección porM. tuberculosis“ resistente a múltiples fármacos” , “ MDR-TB” se refiere a una infección porM. tuberculosisen donde la cepa infectante es resistente a dos o más de los agentes quimioterapéuticos “ de primera línea” eficaces en el tratamiento de una infección por M.tuberculosis.Infecciones por M.tuberculosisresistentes a múltiples fármacos, como se usa en la presente memoria, también se refieren a “tuberculosis extremadamente resistente a fármacos” (“XDR-TB” ), tal como la definió El Grupo de Trabajo para la Salud Global en octubre de 2006, como una TB resistente a múltiples fármacos con resistencia a una cualquiera de las fluoroquinolonas (FQ) y al menos uno de los fármacos inyectables tales como kanamicina, amikacina y capreomicina.

“Tuberculosis activa” , “ TB activa” , “ enfermedad de TB” , “ TB” o “ infección activa” , como se usa en la presente memoria, se refieren a una enfermedad, afección o estado en un mamífero (p. ej., un primate tal como un ser humano) en el que las bacterias Mtb se multiplican activamente e invaden órganos del mamífero y provocan síntomas o están a punto de provocar signos, síntomas u otras manifestaciones clínicas, más comúnmente en los pulmones (TB pulmonar activa), o posiblemente debido a una infección inicial del huésped. Los síntomas clínicos de la TB activa pueden incluir debilidad, fatiga, fiebre, escalofríos, pérdida de peso, pérdida de apetito, anorexia o sudores nocturnos. Los síntomas de la TB activa pulmonar incluyen tos persistente durante varias semanas (p. ej., al menos 3 semanas), moco espeso, dolor torácico y hemoptisis. “ Tuberculosis de reactivación” , como se usa en la presente memoria, se refiere a la TB activa que se desarrolla en un individuo que tiene LTBI y en el que la activación de focos de infección latentes da como resultado la multiplicación activa de bacterias Mtb. “ Multiplicarse activamente” , como se usa en la presente memoria, se refiere a bacterias Mtb que proliferan, se reproducen, se expanden o se multiplican activamente a una tasa exponencial, logarítmica o semilogarítmica en los órganos de un huésped infectado. En determinadas realizaciones, un mamífero infectado (p. ej., un ser humano) tiene un sistema inmunitario suprimido. La supresión inmunitaria puede deberse a la edad (p. ej., muy jóvenes o mayores) o debido a otros factores (p. ej., abuso de sustancias, trasplante de órganos) u otras afecciones tales como otra infección (p. ej., infección por VIH), diabetes (p. ej., diabetes mellitus), silicosis, cáncer de cabeza y cuello, leucemia, enfermedad de Hodgkin, enfermedad renal, bajo peso corporal, tratamiento con corticosteroides o tratamientos para la artritis (p. ej., artritis reumatoide) o enfermedad de Crohn, o similares.

Las pruebas para determinar la presencia de TB o afección activa causada por la multiplicación activa de bacterias Mtb son conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, tinción de ácido-alcohol resistencia (AFS) y examen microscópico directo de esputo, lavado broncoalveolar, derrame pleural, biopsia de tejido, derrame de líquido cerebral; cultivo bacteriano tal como el BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.); pruebas IGR que incluyen el QFT®-Gold, o QFT®-Gold In-tube, T SPOT™.TB, pruebas cutáneas tal como la TST, prueba cutánea de la tuberculina (TST) de Mantoux; y tinción intracelular de citocinas de sangre completa o PBMC aisladas después de la estimulación con antígeno.

“ Infección tuberculosa latente” , “ LTBI” , “ latencia” o “ enfermedad latente” , “ infección latente” , como se usa en la presente memoria, se refieren a una infección porM. Tuberculosis(MTB) que ha sido contenida por el sistema inmunitario del huésped, lo que da como resultado una latencia que se caracteriza por un número bajo y constante de bacterias, pero que también puede contener al menos una parte de la población bacteriana que permanece en un estado de metabolismo activo, incluida la reproducción en un estado de mantenimiento estacionario. La infección de TB latente se determina clínicamente mediante una TST o IGRA positivas sin signos, síntomas o evidencia radiográfica de enfermedad activa de TB. Los mamíferos con infección latente no “ contagian” y no pueden diseminar la enfermedad debido a los recuentos bacterianos muy bajos asociados con infecciones latentes. La infección de tuberculosis latente (LTBI) se trata con un medicamento o medicamentos para matar las bacterias latentes. El tratamiento de LTBI reduce en gran medida el riesgo de que la infección progrese a la tuberculosis (TB) activa más tarde en la vida (es decir, se da para prevenir la reactivación).

“ Especies de Mycobacterium del complejo de tuberculosis” incluye aquellas especies que tradicionalmente se consideran causantes de la enfermedad tuberculosis, así como las especies ambientales y oportunistas de Mycobacterium que causan tuberculosis y enfermedad pulmonar en pacientes inmunocomprometidos, como los pacientes con SIDA, p. ej., M.tuberculosis,M. bovis o M. africanum, BCG, M. avium, M. intracellular, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum, y M. scrofulaceum (ver, p. ej., Harrison's Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, págs. 953-966 (16a ed., Braunwald, y col., eds., 2005).

“Tuberculosis primaria progresiva” , como se usa en la presente memoria, se refiere a una enfermedad de TB que se desarrolla dentro de los primeros años después de la exposición inicial y la infección con Mtb, debido a la falla del sistema inmunitario del huésped para contener adecuadamente la infección inicial.

Un “ método de tratamiento” , como se describe en la presente memoria, se refiere generalmente a un método para tratar una infección activa por tuberculosis en un mamífero usando una vacuna terapéutica junto con un régimen de tratamiento quimioterapéutico. Se entenderá en este método y los relacionados de la descripción que al menos una etapa de administración de la vacuna terapéutica, típicamente la etapa inicial de administración de la vacuna terapéutica, tendrá lugar cuando el mamífero esté infectado activamente conM. tuberculosisy/o presente al menos un síntoma clínico o un resultado de ensayo positivo asociado con una infección activa. También se entenderá que los métodos de la presente descripción pueden comprender además etapas adicionales de administración de la misma u otra vacuna terapéutica de la presente descripción en uno o más puntos temporales adicionales de allí en adelante, independientemente de si la infección activa o los síntomas de la misma todavía están presentes en el mamífero, e independientemente de si un resultado de ensayo asociado con la infección activa sigue siendo positivo, con el fin de mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia. También se entenderá que los métodos de la presente descripción pueden incluir la administración de la vacuna terapéutica sola o junto con otros agentes y, como tal, la vacuna terapéutica puede ser uno de una pluralidad de componentes de tratamiento como parte de un régimen de tratamiento terapéutico más amplio. Por consiguiente, los métodos de la presente descripción mejoran ventajosamente la eficacia de un régimen de tratamiento de quimioterapia para el tratamiento de una infección activa por tuberculosis.

Composiciones polipeptídicas

Como se indica, la presente descripción, en un aspecto, proporciona polipéptidos deMycobacteriumaislados, como se describe en la presente memoria, que incluyen polipéptidos de fusión y composiciones que contienen los mismos, y su uso en combinación con agentes quimioterapéuticas para tratar infecciones activas de TB. En general, un polipéptido de la descripción será un polipéptido aislado y puede ser un fragmento (p. ej., una porción antigénica/inmunogénica) de una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, o puede comprender una secuencia de aminoácidos completa descrita en la presente memoria. Los polipéptidos de la descripción, fragmentos antigénicos/inmunogénicos de los mismos y otras variantes pueden prepararse usando técnicas convencionales recombinantes y/o sintéticas.

En determinadas realizaciones, los polipéptidos de la descripción son antigénicos/inmunogénicos, es decir, reaccionan de forma detectable dentro de un inmunoensayo (tal como un ensayo ELISA o de estimulación de células T) con antisueros y/o células T de un sujeto infectado. La exploración de la actividad inmunogénica se puede realizar usando técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, dichas exploraciones se pueden realizar usando métodos tales como los descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En un ejemplo ilustrativo, se puede inmobilizar un polipéptido sobre un soporte sólido y ponerlo en contacto con el suero del paciente para permitir que los anticuerpos dentro del suero se unan al polipéptido inmovilizado. A continuación, se puede eliminar el suero no unido y detectar los anticuerpos unidos usando, por ejemplo, proteína A marcada con I125.

Como reconocerá el experto en la técnica, las porciones inmunogénicas de los polipéptidos descritos en la presente memoria también se incluyen en la presente descripción. Una “ porción inmunogénica” , como se usa en la presente memoria, es un fragmento de un polipéptido inmunogénico de la descripción que de por sí es inmunológicamente reactivo (es decir, se une específicamente) con los receptores de antígeno de superficie de células B y/o T que reconocen el polipéptido. Las porciones inmunogénicas pueden identificarse generalmente usando técnicas bien conocidas, tales como las resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3ra ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y referencias citadas en la misma. Dichas técnicas incluyen exploración de polipéptidos para determinar la capacidad de reaccionar con anticuerpos, antisueros y/o líneas o clones de células T específicos para antígeno. Como se usa en la presente memoria, los antisueros y anticuerpos son “ específicos para antígeno” si se unen específicamente a un antígeno (es decir, reaccionan con la proteína en un inmunoensayo y no reaccionan de forma detectable con proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos pueden prepararse como se describe en la presente memoria, y usando técnicas bien conocidas.

En una realización particular, una porción antigénica/inmunogénica de un polipéptido de la presente descripción es una porción que reacciona con antisueros y/o células T a un nivel que no es sustancialmente menor que la reactividad del polipéptido de longitud completa (p. ej., en un ensayo de ELISA y/o de reactividad de células T). Preferiblemente, el nivel de actividad inmunogénica de la porción antigénica/inmunogénica es al menos aproximadamente el 50 %, preferiblemente al menos aproximadamente el 70 % y lo más preferiblemente mayor que aproximadamente el 90 % de la inmunogenicidad para el polipéptido de longitud completa. En algunos casos, se identificarán porciones inmunogénicas preferidas que tengan un nivel de actividad inmunogénica mayor que la del correspondiente polipéptido de longitud completa, p. ej., que tiene una actividad inmunogénica similar o mayor que aproximadamente el 100 % o el 150 % o más.

Una composición polipeptídica de la descripción también puede comprender uno o más polipéptidos que son inmunológicamente reactivos con células T y/o anticuerpos generados contra un polipéptido de la descripción, particularmente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, o contra un fragmento inmunogénico o variante del mismo.

En otra realización de la descripción, se proporcionan polipéptidos que comprenden uno o más polipéptidos que son capaces de generar células T y/o anticuerpos que son inmunológicamente reactivos con uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria, o uno o más polipéptidos codificados por secuencias de polinucleótido contiguas contenidas en las secuencias de polinucleótido descritas en la presente memoria, o fragmentos inmunogénicos o variantes de los mismos, o con una o más secuencias de polinucleótido que se hibridan con una o más de estas secuencias en condiciones de rigurosidad moderada a alta.

La presente descripción también proporciona fragmentos polipeptídicos, incluidos fragmentos antigénicos/inmunogénicos, que comprenden al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50 o 100 aminoácidos contiguos, o más, incluyendo todas las longitudes intermedias, de una composición polipeptídica establecida en la presente memoria, o aquellas codificadas por una secuencia de polinucleótido establecida en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona variantes de las composiciones polipeptídicas descritas en la presente memoria. Las variantes de polipéptido (p. ej., cualquiera de los antígenos y polipéptidos de fusión descritos en la presente memoria) generalmente abarcadas por la presente descripción exhibirán típicamente al menos aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de identidad (determinada según se describe a continuación), a lo largo de su longitud, con una secuencia de polipéptido establecida en la presente memoria.

Una “variante” de polipéptido, como se usa el término en la presente memoria, es un polipéptido que típicamente difiere de un polipéptido descrito específicamente en la presente memoria en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ser naturales o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias de polipéptido anteriores de la descripción y evaluando su actividad inmunogénica como se describe en la presente memoria usando cualquiera de una serie de técnicas bien conocidas en la técnica.

Por ejemplo, ciertas variantes ilustrativas de los polipéptidos de la descripción incluyen aquellas en las que se han eliminado una o más porciones, tales como una secuencia líder o dominio transmembrana del extremo N-terminal. Otras variantes ilustrativas incluyen variantes en las que se ha eliminado una pequeña porción (p. ej., aproximadamente 1-30 aminoácidos) del extremo N y/o C-terminal de una proteína madura.

En muchos casos, una variante contendrá sustituciones conservadoras. Una “ sustitución conservadora” es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal manera que un experto en la técnica de la química del péptido esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente sin cambios. Como se describió anteriormente, pueden realizarse modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente descripción y seguir obteniendo una molécula funcional que codifica un polipéptido variante o derivado con características deseables, p. ej., con características inmunogénicas. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear un equivalente, o incluso una variante o porción inmunogénica mejorada de un polipéptido de la descripción, un experto en la materia cambiará típicamente uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante según la tabla A.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Dado que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, ciertas sustituciones de secuencia de aminoácidos pueden realizarse en una secuencia de proteína y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN subyacente, y aun así obtener una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, se contempla que pueden realizarse diversos cambios en las secuencias de péptido de las composiciones descritas, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos, sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

Tabla A

Aminoácidos Codones

Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína Cys C GGC UGU

Ácido aspártico Asp D GAC GAU

Ácido glutámico Glu E GAA GAG

Fenilalanina Phe F UUC UUU

Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina His H CAC CAU

Isoleucina Ile I AUA AUC AUU

Lisina Lys K AAA AAG

Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG

Asparagina Asn N AAC AAU

Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina Gln Q CAA CAG

Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano Trp W UGG

Tirosina Tyr Y UAC UAU

Al hacer tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982,

Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y aún producir una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de 0,2, prefiriéndose particularmente aquellos dentro de ± 1, e incluso más particularmente se prefiere aquellos dentro de ±0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente basándose en la hidrofobicidad.

Como se detalla en la patente estadounidense n.° 4.554.101, los siguientes valores de hidrofobicidad se han asignado a residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ±1); glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofobicidad similar y aún obtener una proteína biológicamente equivalente y, en particular, una proteína inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofobicidad están dentro de ±2, prefiriéndose particularmente aquellos dentro de ±1, y prefiriéndose incluso más particularmente aquellos dentro de 0,5.

Como se describió anteriormente, las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofobicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ilustrativas que toman en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Además, cualquier polinucleótido puede modificarse adicionalmente para aumentar la estabilidadin vivo.Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de fosforotioato u O-metilo en 2' en lugar de enlaces fosfodiesterasa en la cadena principal; y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wybutosina, así como acetil-, metil-, tio- y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse además basándose en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofobicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofobicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante también puede, o alternativamente, contener cambios no conservadores. En una realización preferida, los polipéptidos variante difieren de una secuencia nativa por sustitución, deleción o adición de cinco aminoácidos o menos. Las variantes también pueden (o alternativamente) modificarse mediante, por ejemplo, la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido.

Como se señaló anteriormente, los polipéptidos pueden comprender una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que cotraduccionalmente o postraduccionalmente dirige la transferencia de la proteína. El polipéptido también puede conjugarse con un conector u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (p. ej., poli-His), o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una región Fc de inmunoglobulina.

Cuando se comparan secuencias de polipéptido, se dice que dos secuencias son “ idénticas” si la secuencia de aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para determinar una correspondencia máxima, como se describe a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente comparando las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación” , como se usa en la presente memoria, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, usualmente 30 a aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima.

La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse usando el programa Megalign en el conjunto de software de bioinformática Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parámetros predeterminados. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, págs.

345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes págs. 626-645 Methods in Enzymology vol.

183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983) Proc. Nat'l Acad., Sci. EE. UU.

80:726-730.

Alternativamente, la alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, mediante el algoritmo de alineación de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante los métodos de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. BL<a>S<t>y BLAST 2.0 pueden usarse, por ejemplo, con los parámetros descritos en la presente memoria, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los polinucleótidos y polipéptidos de la descripción. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Para las secuencias de aminoácidos, se puede usar una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae en la cantidad X con respecto a su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa cae a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o se llega al final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación.

En un enfoque preferido, el “ porcentaje de identidad de secuencia” se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) del 20 por ciento o menos, usualmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones preferidas de la descripción, se proporcionan polipéptidos de fusión deMycobacterium tuberculosisy polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión. Los polipéptidos de fusión y las proteínas de fusión se refieren a un polipéptido que tiene al menos dos polipéptidos heterólogos de una especie deMycobacterium,tales como polipéptidos deMycobacterium tuberculosis,unidos covalentemente, ya sea directamente o a través de un conector de aminoácidos. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión se unen típicamente desde el extremo C-terminal al N-terminal, aunque también pueden unirse desde el extremo C-terminal al C-terminal, desde el extremo N-terminal al N-terminal o desde el extremo N-terminal al C-terminal. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Los polipéptidos de fusión o proteínas de fusión también pueden incluir variantes modificadas de forma conservadora, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias, homólogos entre especies y fragmentos inmunogénicos de los antígenos que forman la proteína de fusión. Los antígenos de laMycobacterium tuberculosisse describen en Cole y col., Nature 393:537 (1998), que describe el genoma completo de laMycobacterium tuberculosis.Los antígenos de otras especies deMycobacteriumque corresponden alMycobacterium tuberculosisse pueden identificar, p. ej., usando algoritmos de comparación de secuencia, como se describe en la presente memoria, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica, p. ej., ensayos de hibridación y ensayos de unión de anticuerpos.

Los polipéptidos de fusión de la descripción comprenden generalmente al menos dos polipéptidos antigénicos, como se describe en la presente memoria, y pueden comprender además otras secuencias no relacionadas, tales como una secuencia que ayuda a proporcionar epítopos T auxiliares (un compañero de fusión inmunológico), preferiblemente epítopos T auxiliares reconocidos por humanos, o que ayuda a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) con rendimientos mayores que los de la proteína recombinante nativa. Ciertas parejas de fusión preferidas son parejas de fusión inmunológicas y que aumentan la expresión. Se pueden seleccionar otras parejas de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína se dirija a los compartimentos intracelulares deseados. Otras parejas de fusión adicionales incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína.

Las proteínas de fusión generalmente se pueden preparar usando técnicas estándar. Preferiblemente, una proteína de fusión se expresa como una proteína recombinante. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptídicos de una fusión deseada pueden ensamblarse por separado y ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se liga, con o sin un conector peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico para que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto permite la traducción en una única proteína de fusión que conserva la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.

Puede emplearse una secuencia conectora peptídica para separar el primer y el segundo componente polipeptídico por una distancia suficiente para garantizar el plegamiento de cada polipéptido en sus estructuras secundaria y terciaria, si se desea. Dicha secuencia conectora peptídica se incorpora en la proteína de fusión usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Se pueden seleccionar ciertas secuencias conectoras peptídicas basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interactuar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias peptídicas preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, también pueden usarse en la secuencia conectora. Las secuencias de aminoácidos útiles como conectores incluyen las descritas en Marata y col., Gene 40:39 46 (1985); Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 83:8258 8262 (1986); Pat. de EE. UU. n.° 4.935.233 y la Pat. de EE.U U. n.° 4.751.180. La secuencia conectora puede tener generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. No se requieren secuencias conectoras cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos del extremo N-terminal no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.

Las secuencias de ADN ligadas se unen operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN se ubican solo en 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. Similarmente, los codones de parada requeridos para finalizar la traducción y las señales de terminación de la transcripción solo están presentes en 3' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.

Dentro de las realizaciones preferidas, una pareja de fusión inmunológica para usar en un polipéptido de fusión de la descripción se deriva de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gramnegativa Haemophilus influenzae tipo B (documento WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (p. ej., los primeros 100 110 aminoácidos del extremo N-terminal) y un derivado de proteína D puede lipidarse. Dentro de determinadas realizaciones preferidas, los primeros 109 residuos de una pareja de fusión de lipoproteína D se incluyen en el extremo N-terminal para proporcionar al polipéptido epítopos de células T exógenos adicionales y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando de este modo como un potenciador de la expresión). La cola lipídica asegura una presentación óptima del antígeno por parte de las células presentadoras de antígeno. Otras parejas de fusión incluyen la proteína no estructural del virus influenzae, NS 1 (hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos del extremo N-terminal, aunque pueden usarse diferentes fragmentos que incluyen epítopos T auxiliares.

En otra realización, una pareja de fusión inmunológica comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (preferiblemente una porción del extremo C-terminal). LYTA se deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gen 43:265-292 (1986)). LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la cadena principal del peptidoglicano. El dominio del extremo C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad por la colina o algunos análogos de colina, tales como el DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYT<a>en el extremo amino terminal (ver Biotechnology 10:795-798 (1992). Dentro de una realización preferida, se puede incorporar una porción de repetición de LYTA en una proteína de fusión. Se encuentra una porción de repetición en la región del extremo C-terminal que comienza en el residuo 178. Una porción de repetición particularmente preferida incorpora los residuos 188-305.

En general, se aíslan polipéptidos y polipéptidos de fusión (así como sus polinucleótidos codificantes). Un polipéptido o polinucleótido “ aislado” es aquel que se elimina de su entorno original. Por ejemplo, una proteína natural se aísla si se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipéptidos son al menos aproximadamente un 90 % puros, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % puros y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 99 % puros. Se considera que un polinucleótido se aísla si, por ejemplo, se clona en un vector que no forma parte del entorno natural.

Composiciones de polinucleótido

La presente descripción, en otro aspecto, también proporciona polinucleótidos aislados, particularmente aquellos que codifican polipéptidos de fusión de esta descripción (p. ej., ID93), así como también composiciones que comprenden dichos polinucleótidos. Como se usa en la presente memoria, los términos “ADN” y “ polinucleótido” y “ ácido nucleico” se refieren a una molécula de ADN que se ha aislado y está libre del ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias codificantes, pero está sustancialmente aislado o purificado y libre del ADN genómico total de la especie de la que se obtiene el segmento de ADN. Dentro de los términos “ segmento de ADN” y “ polinucleótido” se incluyen segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, y también vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus y similares.

Como entenderán los expertos en la técnica, las secuencias de polinucleótido de esta descripción pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extragenómicas y codificadas por plásmidos y segmentos génicos diseñados por ingeniería más pequeños que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos, péptidos y similares. Dichos segmentos pueden aislarse de forma natural o modificarse sintéticamente por la mano del hombre.

Como reconocerá el experto en la técnica, los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente descripción, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, unirse a otras moléculas y/o materiales de soporte. Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un antígeno deMycobacteriumo una porción del mismo) o puede comprender una variante, o un equivalente funcional biológico o antigénico de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótido pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente a continuación, preferiblemente de tal manera que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no disminuya, en relación con la proteína nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en la presente memoria. El término “variantes” también abarca genes homólogos de origen xenogénico.

En realizaciones adicionales, la presente descripción proporciona polinucleótidos aislados que comprenden diversas longitudes de tramos contiguos de secuencia idénticos o complementarios a una o más de las secuencias descritas en la presente memoria. Por ejemplo, la presente descripción proporciona polinucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 o 1000 o más nucleótidos contiguos de una o más de las secuencias descritas en la presente memoria así como todas las longitudes intermedias entre ellas. Se entenderá fácilmente que “ longitudes intermedias” , en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tales como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los números enteros hasta 200500; 500 1000, y similares.

Los polinucleótidos de la presente descripción, o fragmentos de los mismos, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes y similares, de tal manera que su longitud general puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se pueda emplear un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferiblemente condicionada a la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante previsto.

Además, los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótido que codifican un polipéptido como se describe en la presente memoria. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótido de cualquier gen nativo. No obstante, la presente descripción contempla específicamente los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones, por ejemplo, polinucleótidos que se optimizan para la selección de codones humanos y/o primates. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótido proporcionadas en la presente memoria están dentro del alcance de la presente descripción. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no es necesario, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse usando técnicas estándar (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias de bases de datos).

Los polinucleótidos deMycobacteriumy las fusiones de estos pueden prepararse, manipularse y/o expresarse usando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la técnica.

Por ejemplo, las secuencias de polinucleótido o fragmentos de las mismas que codifican polipéptidos de la descripción, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas, pueden usarse en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de un polipéptido en células huésped apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido determinado.

Como entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias de nucleótido que codifican polipéptidos que poseen codones de origen no natural. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped procariota o eucariota particular pueden seleccionarse para aumentar la tasa de expresión de proteína o para producir un transcrito de ARN recombinante que tiene propiedades deseables, tales como una vida media más larga que la de un transcrito generado a partir de la secuencia natural.

Además, las secuencias de polinucleótido de la presente descripción pueden diseñarse por ingeniería usando métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican polipéptidos por una variedad de razones, que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento, la expresión y/o la inmunogenicidad del producto génico.

Para expresar un polipéptido deseado, se puede insertar una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido, o un equivalente funcional, en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinantein vitro,técnicas sintéticas y recombinación genéticain vivo.Tales técnicas se describen en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (1989). Se conoce una variedad de sistemas de vector/huésped de expresión y se pueden utilizar para contener y expresar secuencias de polinucleótido. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinante; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (p. ej., baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (p. ej., plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales.

Los “ elementos de control” o “ secuencias reguladoras” presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector (potenciadores, promotores, regiones no traducidas en 5' y 3') que interactúan con proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su resistencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y del huésped utilizado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluidos promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, CA) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares. En los sistemas celulares de mamíferos, generalmente se prefieren los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, los vectores basados en SV40 o EBV pueden usarse ventajosamente con un marcador seleccionable apropiado.

En los sistemas bacterianos, se puede seleccionar un número de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades, se pueden usar vectores que dirijan la expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, los vectores multifuncionales de clonación y expresión de E. coli tales como PBLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia que codifica el polipéptido de interés puede ligarse en el vector en marco con secuencias para la Met aminoterminal y los 7 residuos posteriores de beta-galactosidasa de manera que se produzca una proteína híbrida; los vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503 5509 (1989)); y similares. Los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también pueden usarse para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción en perlas de glutatión-agarosa, seguida de elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en tales sistemas pueden diseñarse para incluir sitios de escisión de heparina, trombina o proteasa del factor XA de manera que el polipéptido clonado de interés pueda liberarse del resto de GST a voluntad.

En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, puede usarse una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, ver Ausubel y col. (supra) y Grant y col., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987).

En los casos en los que se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de secuencias que codifican polipéptidos puede ser impulsada por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, los promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV pueden usarse solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Alternativamente, pueden usarse promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi y col., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie y col., Science 224:838-843 (1984); y Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estas construcciones pueden introducirse en células vegetales mediante transformación directa de ADN o transfección mediada por patógenos. Dichas técnicas se describen en varias revisiones generalmente disponibles (ver, p. ej., Hobbs en McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, págs. 191-196 (1992)).

También se puede usar un sistema de insectos para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en un sistema de este tipo, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica el polipéptido inactivará el gen de la polihedrina y producirá un virus recombinante que carece de la proteína de cubierta. Los virus recombinantes se pueden usar para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:3224-3227 (1994)).

En las células huésped de mamíferos, generalmente se dispone de varios sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de interés pueden ligarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede usarse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células huésped infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81:3655-3659 (1984)). Además, pueden usarse potenciadores de transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células huésped de mamífero.

También se pueden usar señales de iniciación específicas para lograr una traducción más eficiente de secuencias que codifican un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican el polipéptido, su codón de iniciación y las secuencias aguas arriba se insertan en el vector de expresión apropiado, puede que no sean necesarias señales de control transcripcional o traduccional adicionales. Sin embargo, en los casos en los que solo se inserta la secuencia codificante, o una porción de la misma, deben proporcionarse señales de control de traducción exógenas que incluyan el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en el marco de lectura correcto para garantizar la traducción de toda la inserción. Los elementos de traducción y los codones de iniciación exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular particular que se usa, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf. y col., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

Además, una cepa de células huésped puede seleccionarse por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. También puede usarse el procesamiento postraduccional que escinde una forma “ prepro” de la proteína para facilitar la correcta inserción, plegamiento y/o función. Se pueden seleccionar diferentes células huésped tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales, para garantizar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña.

Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes, generalmente se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable un polinucleótido de interés pueden transformarse usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector separado. Después de la introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de forma estable pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.

Se puede usar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos incluyen, pero no se limitan a, los genes de timidina quinasa (Wigler y col., Cell 11:223-232 (1977)) y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22:817-823 (1990)) del virus del herpes simple que pueden emplearse en células de tk o células de aprt, respectivamente. Además, se puede usar la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base para la selección; por ejemplo, dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77:3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos, neomicina y G-418 (Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y a la fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:8047-51 (1988)). El uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas, beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, que se usan ampliamente no solo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes y col., Methods Mol. Biol. 55: 121-131 (1995)).

En la técnica se conoce una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Estos y otros ensayos se describen, entre otros, en Hampton y col., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) y Madox y col., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983).

Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación que pueden usarse en diversos ensayos de ácido nucleico y aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen oligormarcaje, traducción de mellas, marcaje final o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias, o cualquier porción de las mismas, pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores se conocen en la técnica, están disponibles comercialmente y pueden usarse para sintetizar sondas de ARNin vitromediante la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo usando una variedad de kits disponibles comercialmente. Las moléculas indicadoras o marcadores adecuados que pueden usarse incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Las células huésped transformadas con una secuencia de polinucleótido de interés pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o contenerse intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como entenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos de la descripción pueden diseñarse para contener secuencias señal que dirigen la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular procariota o eucariota. Se pueden usar otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican un polipéptido de interés a la secuencia de nucleótido que codifica un dominio polipeptídico, lo que facilitará la purificación de proteínas solubles.

Además de los métodos de producción recombinante, los polipéptidos de la descripción, y fragmentos de los mismos, pueden producirse mediante síntesis directa de péptidos usando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc.

85:2149-2154 (1963)). La síntesis de proteínas puede realizarse usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos modelo 43 1 A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). Alternativamente, varios fragmentos pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa.

Composiciones farmacéuticas y de vacuna

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a formulaciones de uno o más del polinucleótido, polipéptido u otras composiciones descritas en la presente memoria en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para la administración a una célula o un animal, ya sea solos o en combinación con una o más realizaciones de terapia. Dichas composiciones farmacéuticas son particularmente preferidas para usar como vacunas cuando se formulan con un sistema inmunoestimulante/adyuvante adecuado. Las composiciones también son adecuadas para usar en un contexto de diagnóstico.

También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la descripción también pueden administrarse en combinación con otros agentes, tales como, p. ej., otras proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no hay límite para otros componentes que también pueden incluirse, siempre que los agentes adicionales no afecten significativamente de manera adversa los objetivos según la descripción.

En determinadas realizaciones preferidas, las composiciones de la descripción se usan como vacunas y se formulan en combinación con uno o más inmunoestimulantes. Un inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que mejore o potencie una respuesta inmunitaria (mediada por anticuerpos y/o células) a un antígeno exógeno. Los ejemplos de inmunoestimulantes incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables (p. ej., galactida poliláctica) y liposomas (en los que se incorpora el compuesto; ver, p. ej., Fullerton, Pat. de EE. UU. n.° 4.235.877). La preparación de vacuna se describe generalmente en, por ejemplo, Powell & Newman, eds., Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach) (1995).

Cualquiera de una variedad de inmunoestimulantes puede emplearse en las vacunas de esta descripción. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. Muchos adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de respuestas inmunitarias, tal como lípido A (natural o sintético), Bordetella pertussis o especies de Mycobacterium o proteínas derivadas de Mycobacterium. Los adyuvantes adecuados están disponibles comercialmente como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 y derivados del mismo (SmithKline Beecham, Filadelfia, Pa.); CWS, TDM, Leif, sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. Las citocinas, tales como GM-CSF o interleucina-2, -7 o -12, también pueden usarse como adyuvantes.

Otros adyuvantes ilustrativos útiles en el contexto de la descripción incluyen agonistas del receptor tipo Toll, tales como agonistas de TLR7, agonistas de TLR7/8 y similares. Otros adyuvantes ilustrativos adicionales incluyen imiquimod, gardiquimod, resiquimod y compuestos relacionados.

Ciertas vacunas preferidas emplean sistemas adyuvantes diseñados para inducir una respuesta inmunitaria predominantemente del tipo Th1. Los niveles elevados de citocinas de tipo Th1 (p. ej., IFN-<y>, TNF-ap, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células a un antígeno administrado. Por el contrario, niveles elevados de citocinas de tipo Th2 (p. ej., IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales. Después de la aplicación de una vacuna tal como se proporciona en la presente memoria, un paciente soportará una respuesta inmunitaria que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. Dentro de una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citocinas de tipo Th1 aumentará en mayor medida que el nivel de citocinas de tipo Th2. Los niveles de estas citocinas pueden evaluarse fácilmente usando ensayos estándar. Para una revisión de las familias de citocinas, ver Mossman & Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989).

Ciertos adyuvantes para usar en la provocación de una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPLTM), junto con una sal de aluminio (Pat. de EE. UU. n.°s 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034; y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente de Th1. Dichos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y Pat. de EE. UU. n.°s 6.008.200 y 5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también se describen, por ejemplo, en Sato y col., Science 273:352 (1996). Otro adyuvante ilustrativo comprende una saponina, tal como Quil A, o derivados de la misma, que incluyen QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framgham, Mass.); Escin; Digitonin; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones ilustrativas incluyen más de una saponina en las combinaciones de adyuvantes de la presente descripción, por ejemplo combinaciones de al menos dos del siguiente grupo que comprende QS21, QS7, Quil A, pescina o digitonina.

En otras realizaciones, el adyuvante es un adyuvante de glucopiranosil lípido A (GLA), como se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2008/0131466. Por ejemplo, en una realización, el adyuvante de GLA usado en el contexto de la presente descripción tiene la siguiente estructura:

En una realización más específica, el GLA tiene la fórmula expuesta anteriormente, en donde R<1>, R<3>, R5 y R6 son alquilo C<11-14>; y R<2>y R<4>son alquilo C<12-15>.

En una realización más específica, el GLA tiene la fórmula expuesta anteriormente, en donde R<1>, R<3>, R5 y R6 son alquilo C<11>; y R<2>y R<4>son alquilo C<13>.

En algunas realizaciones, el adyuvante es un adyuvante de GLA (p. ej., sintético) que tiene la siguiente estructura:

En determinadas realizaciones de la estructura de GLA anterior, R<1>, R<3>, R<5>y<6>son alquilo C<11>-C<20>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>-C<20>. En una realización más específica, R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11>; y R<2>y R<4>son alquilo C<13>. En otra realización más específica, R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<10>; y R<2>y R<4>son alquilo C<8>. En determinadas realizaciones de la estructura de GLA anterior, R<1>, R<3>, R<5>y<6>son alquilo C<11>-C<20>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>-C<20>. En determinadas realizaciones, R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>.

En determinadas realizaciones, el adyuvante es un adyuvante de GLA (p. ej., sintético) que tiene la siguiente estructura:

En determinadas realizaciones de la estructura de GLA anterior, R<1>, R<3>, R<5>y<6>son alquilo C<11>-C<20>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>-C<20>. En determinadas realizaciones, R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>.

En determinadas realizaciones, el adyuvante es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:

En determinadas realizaciones de la estructura de GLA anterior, R<1>, R<3>, R<5>y<6>son alquilo C<11>-C<20>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>-C<20>. En determinadas realizaciones, R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>.

En determinadas realizaciones, el adyuvante es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:

En determinadas realizaciones de la estructura de GLA anterior, R<1>, R<3>, R<5>y<6>son alquilo C<11>-C<20>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>-C<20>. En determinadas realizaciones, R<1>, R<3>, R<5>y R<6>son alquilo C<11>; y R<2>y R<4>son alquilo C<9>.

En determinadas realizaciones, el adyuvante es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:

En determinadas realizaciones, el adyuvante es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:

En determinadas realizaciones, el adyuvante es un adyuvante de GLA sintético que tiene la siguiente estructura:

En una realización particular, el sistema adyuvante incluye la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación de los adyuvantes QS21 y 3D-MPLTM, como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde el QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Otra formulación adyuvante que emplea los adyuvantes QS21, 3D-MPLTM y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

Otro sistema adyuvante mejorado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina como se describe en el documento WO 00/09159. Otros adyuvantes ilustrativos incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, CA, Estados Unidos), ISCOMS (C<s>L), MF-59 (Chiron), adyuvantes de la serie SBAS (p. ej., SBAS-2, AS2', AS2", SBAS-4 o SBAS6, disponible en SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox, RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) y otros 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGP), tales como los descritos en las patentes estadounidenses n.° 6.113.918 y 6.355.257 y adyuvantes de éter de polioxietileno tales como los descritos en el documento WO 99/52549A1.

Las composiciones de la descripción también pueden comprender, o alternativamente, células T específicas para un antígeno de Mycobacterium. Dichas células pueden prepararse generalmente in vitro o ex vivo, usando procedimientos estándar. Por ejemplo, las células T pueden aislarse de la médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica de un paciente. Alternativamente, las células T pueden derivarse de seres humanos relacionados o no relacionados, mamíferos no humanos, líneas celulares o cultivos.

Las células T pueden estimularse con un polipéptido de la descripción, polinucleótido que codifica dicho polipéptido y/o una célula presentadora de antígeno (ApC) que expresa dicho polipéptido. Dicha estimulación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la generación de células T que son específicas para el polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido o polinucleótido se presenta dentro de un vehículo de administración, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T específicas.

Se considera que las células T son específicas para un polipéptido de la descripción si las células T proliferan específicamente, secretan citocinas o destruyen las células diana que están recubiertas con el polipéptido o expresan un gen que codifica el polipéptido. La especificidad de las células T puede evaluarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas estándar. Por ejemplo, en un ensayo de liberación de cromo o en un ensayo de proliferación, un índice de estimulación de más del doble de aumento en lisis y/o proliferación, comparado con controles negativos, indica especificidad de células T. Dichos ensayos pueden realizarse, por ejemplo, tal como se describe en Chen y col., Cancer Res. 54:1065-1070 (1994)). Alternativamente, la detección de la proliferación de células T puede realizarse mediante una diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de células T puede detectarse determinando un aumento en la tasa de síntesis de ADN (p. ej., mediante marcaje por pulsos de cultivos de células T con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada en el ADN). El contacto con un polipéptido de la descripción (100 ng/ml-100 pg/ml, preferiblemente 200 ng/ml-25 pg/ml) durante 3-7 días debería dar como resultado un aumento de al menos dos veces en la proliferación de las células T. El contacto como se describió anteriormente durante 2-3 horas debería dar como resultado la activación de las células T, medida usando ensayos estándar de citocinas, en los que un aumento del doble en el nivel de liberación de citocinas (p. ej., TNF o IFN-y) es indicativo de la activación de células T (ver Coligan y col., Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)). Las células T que se han activado en respuesta a un polipéptido, polinucleótido o una APC que expresa un polipéptido pueden ser c D4+ y/o CD8+. Las células T específicas para proteínas pueden expandirse usando técnicas estándar. En realizaciones preferidas, las células T se derivan de un paciente, un donante relacionado o un donante no relacionado, y se administran al paciente después de la estimulación y expansión.

En las composiciones farmacéuticas de la descripción, la formulación de excipientes y soluciones portadoras farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los expertos en la técnica, como lo es el desarrollo de dosificaciones y regímenes de tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente memoria en una variedad de regímenes de tratamiento, que incluyen, p. ej., administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular.

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden administrarse a un sujeto mediante administración oral. Como tal, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o pueden encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.

En ciertas circunstancias será conveniente administrar las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria por vía parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal como se describe, por ejemplo, en la Pat. de EE. UU. n.° 5.543.158; Pat. de EE. UU. n.° 5.641.515 y Pat. de EE. UU. n.° 5.399.363. Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (Pat. de EE. UU. n.° 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en que exista la capacidad de usarse en jeringas. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención contra la acción de los microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente, si es necesario, y el diluyente líquido primero debe hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril que puede emplearse será conocido por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (ver, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, l5 a edición, págs. 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosis dependiendo del estado del sujeto que se trata. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para cada sujeto. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad y seguridad general y pureza según lo exigen las normas de la Oficina de Productos biológicos de la FDA.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los otros varios ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguidos de una esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo previamente filtrada estéril.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden formularse en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las sales que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación posológica y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas tales como soluciones inyectables, cápsulas liberadoras de fármacos y similares.

Como se usa en la presente memoria, “vehículo” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. A menos que algún medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

La frase “ farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa alérgica o similar cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo se entiende bien en la técnica. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por pulverización intranasal, inhalación y/u otros vehículos de administración en aerosol. Se han descrito métodos para administrar genes, polinucleótidos y composiciones peptídicas directamente a los pulmones mediante aerosoles nasales, p. ej., en la Pat. de EE. UU. n.° 5.756.353 y la Pat. de EE. UU. n.° 5.804.212. Asimismo, la administración de fármacos usando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga y col., 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Pat. de EE. UU. n.° 5.725.871) también es bien conocida en las técnicas farmacéuticas. Asimismo, la administración transmucosa de fármacos en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la pat. de EE. UU. n.° 5.780.045.

En determinadas realizaciones, la administración puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares, para la introducción de las composiciones de la presente descripción en células huésped adecuadas. En particular, las composiciones de la presente descripción pueden formularse para administrarse encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similares. La formulación y el uso de dichos vehículos de administración se pueden llevar a cabo usando técnicas conocidas y convencionales.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1

Desarrollo del modelo de ratón SWR/J de recidiva de TB y reactivación de una infección de TB activa.

Se adquirieron ratones hembra SWR/J y C57BL/6 de la misma edad (4-6 semanas) de Jackson y Charles River Laboratories, respectivamente. Los ratones se infectaron con un aerosol de dosis baja (LDA) (50-100 bacterias) de Mtb H37Rv (ATCC, n.° 35718) usando una cámara de aerosol de la UW-Madison. El número de bacilos presentes en ratones con una infección activa y el número de bacterias viables en los pulmones (5 ratones/grupo) se determinaron 15, 30 y 100 días después de la infección mediante métodos conocidos en la técnica. Los símbolos indican la media /- la desviación estándar. Cepas SWR/J y C57BL/6 con una infección activa de TB, los ratones se infectaron con Mtb H37Rv tal como se describe (8 ratones/grupo), y se monitorizó la supervivencia. Para evaluar el efecto de la quimioterapia en el modelo, quince días después de la infección, un subconjunto de ratones comenzó a recibir un tratamiento farmacológico de isoniazida (INH) (a 85 mg/l de agua potable) y rifampicina (RIF) (a 50 mg/l de agua potable) administrados durante 30, 60 o 90 días consecutivos (Rx 30 d, Rx 60 d, Rx 90 d). Un grupo adicional de ratones comenzó a recibir un tratamiento farmacológico de isoniazida (INH) (a 85 mg/l de agua potable) y rifampicina (RIF) (a 50 mg/l de agua potable) (denominados colectivamente en la presente memoria tratamiento quimioterapéutico) 30 días después de la infección, y se les administró durante 90 días de forma continua. Se estima que los ratones hembras beben entre 0,15 y 0,37 ml/g (Bachmanov AA y col., 2002). Las concentraciones inhibidoras mínimas para Mtb H37Rv son 0,25 pM para RIF y 1,0 pM para INH.

A diferencia de los ratones C57BL/6 (Russell, y col., 2010), y de acuerdo con observaciones anteriores (Baldwin y col., J of Immunology 2012), los ratones SWR/J no lograron realizar la transición a un estado crónico después de la infección por Mtb, como lo indica el aumento de los títulos virales en el SWR/J, en comparación con los ratones C57BL/6 (Figura 1A), y son representativos de un modelo de infección activa por Mtb. Los ratones SWR/J tratados de forma simulada sucumbieron a la infección letal por Mtb con una mediana de tiempo de supervivencia (MST) de 116,5 días, mientras que los ratones tratados con quimioterapia (RIF/INH) durante 90 días tuvieron una MST de 247,5 días (P <0,001; prueba de rango logarítmico) en comparación con los ratones C57BL/6 tratados de forma simulada o con quimioterapia (Figura 1B).

Para determinar la longitud óptima del tratamiento quimioterapéutico en los ratones SWR/J, los animales comenzaron un tratamiento con RIF/INH el día 15 después de la infección durante 30, 60 o 90 días, o un grupo adicional comenzó a recibir quimioterapia el día 30 después de la exposición durante 90 días. Se monitorizaron las curvas de supervivencia. Se observaron diferencias significativas en la supervivencia y las UFC de pulmón recuperables entre los animales que se trataron de forma simulada o con fármacos durante 30 (P <0,0005; prueba de rango logarítmico), 60 (P <0,05; prueba de rango logarítmico) o 90 días (P <0,005; prueba de rango logarítmico) (Figura 1C). El cambio del inicio de la quimioterapia de 15 a 30 días después de la infección no alteró significativamente la eficacia del tratamiento a largo plazo (P >0,50; prueba de rango logarítmico) (Figura 1C). Si bien 60 o 90 días de quimioterapia fueron suficientes para disminuir el número de bacterias pulmonares viables por debajo del límite de detección (Figura 1D), estos regímenes de tratamiento fueron insuficientes para lograr el aclaramiento de la Mtb en ratones SWR/J.

Ejemplo 2

Evaluación de la eficacia terapéutica de la vacuna para la TB ID93 quimioterapia en el modelo de ratón SWR/J de recaída de TB y reactivación de una infección de TB activa.

Las proteínas de fusión de vacuna para la TB ID83 e ID93 o sus antígenos componentes formulados con el antagonista de TLR4 GLA-SE han demostrado previamente que proporcionan protección profiláctica contra la TB en modelos de ratón y cobaya cuando se administran en tres dosis (Baldwin, y col., 2009, Bertholet, y col., 2010). La vacuna ID93/GLA-SE se analizó en el modelo SWR/J de infección activa para determinar si esta formulación proporcionaría un beneficio inmunoterapéutico medido por la reducción de UFC o una mejor supervivencia. Los ratones SWR/J (6 o 7 ratones por grupo) se infectaron con LDA de Mtb como se describe en el Ejemplo 1. Quince días después (día 15) los ratones se trataron de forma simulada o se trataron con antibióticos durante 90 días (Rx 90 d). También se inmunizó un subconjunto de ratones tratados con antibióticos en cada grupo. Los ratones se inmunizaron 3 veces, con 3 semanas de separación entre una y otra, con 8 pg de proteína ID93 formulada con 20 pg de GLA-SE ya sea durante (DTT; días 15, 36, 57) o después del tratamiento terapéutico (PTT; días 107, 128, 149) con los antibióticos. La eficacia terapéutica se determinó mediante el seguimiento de la supervivencia a lo largo del tiempo y mediante la siembra de homogeneizados de pulmón como se describió anteriormente (Bertholet y col., 2008). La vacuna ID93/GLA-SE administrada terapéuticamente al modelo SWR/J de infección activa de TB aumentó la frecuencia de supervivencia después de la infección (P <0,01).

En comparación con la quimioterapia (Rx) sola (-•-), la inmunización con la vacuna ID93/GLA-SE como un complemento de la quimioterapia (-■-) redujo aún más las UFC en 0,643 log 10 (P <0,05) (Figura 2B). No se observaron diferencias en las UFC de pulmón entre los grupos a los que se les administró adyuvante GLA-SE solo más quimioterapia (Rx GLA-SE (-H-)), en comparación con la quimioterapia sola Rx (-•-) (P >0,05) (Figura 2B). Además, hubo una diferencia significativa entre la eficacia posexposición inducida por el grupo Rx ID93/GLA-SE y el grupo Rx GLA-SE (4,419 ±0,17 frente a 4,938 ±0,16 log 10, P <0,05), lo que demuestra que el efecto bactericida complementario observado en estos estudios depende del antígeno.

La administración de la vacuna como un complemento inmunoterapéutico para la quimioterapia después de (PTT) o durante (DTT) 90 días de tratamiento con quimioterapia previno la muerte en el 52 % y el 67 % de ratones infectados con Mtb, respectivamente (P <0,0001) (Figura 2C).

Ejemplo 3

La administración de la vacuna terapéutica de ID93/GLA-SE como un complemento para la quimioterapia reduce la duración de la terapia farmacológica requerida para prolongar la supervivencia en una infección activa de TB.

Se realizaron experimentos adicionales en el modelo de ratón SWR/J de recaída de TB y de reactivación de una infección de TB activa para evaluar si la administración de la vacuna terapéutica de ID93/GLA-SE podría reducir la duración de la terapia farmacológica requerida para prolongar la supervivencia en una infección activa de TB. Los ratones SWR/J se infectaron con un LDA de Mtb H37Rv. Quince días después, los ratones se trataron durante 60 o 90 días con antibióticos como se describió anteriormente (Rx 60 d y Rx 90, respectivamente). Una vez completado el régimen de antibióticos de 60 días, los ratones se inmunizaron 3 veces, con 3 semanas de separación entre una y otra, con 8 pg de proteína ID93 formulada con 20 pg de GLA-SE (Rx 60 d ID93/GLA-SE; los días 77, 98, 119). La protección se evaluó mediante el monitoreo de las muertes de los animales (7 ratones/grupo) causadas por la Mtb a lo largo del tiempo (P <0,05 [prueba de rango logarítmico] se considera significativo). (B-M) Evaluación histopatológica de tejidos pulmonares después del desafío con Mtb H37Rv. Las respuestas inflamatorias y la formación de granuloma (g) se muestran en las secciones H&E (B-I) y se evaluó la presencia de BAAR (flechas) (JM). (B, F, J) Ratones tratados de forma simulada, día 106; (C, J y K) terapia con antibióticos durante 90 días, día 106; (D, H, L) terapia con antibióticos durante 90 días ID93/GLA-SE, día 241; (E, I y M) terapia con antibióticos durante 60 días ID93/GLA-SE, día 295. Los datos mostrados son representativos de 5 ratones/grupo.

Mientras que el 40 % de los animales que recibieron 90 días de quimioterapia sola (Rx 90 d; -▲-) sobrevivieron a la infección por Mtb (MST 214 días), el 100 % de los animales que recibieron inmunoterapia con vacuna después de 60 días de quimioterapia (-•-) sobrevivieron durante al menos 250 días (P <0,05) (Figura 3A). Estos estudios demuestran que la inmunoterapia con vacuna podría reducir la duración de la terapia farmacológica en al menos un tercio y, al mismo tiempo, prevenir la muerte durante un período prolongado después de suspender la quimioterapia.

Para determinar si los antibióticos combinados con ID93/GLA-SE redujeron la patología pulmonar de la TB, se tomaron secciones de ratones tratados de forma simulada, tratados con Rx y tratados con Rx ID93/GLA-SET para el análisis histológico (los hallazgos histológicos se presentan en la Tabla 1 (a continuación) y la Figura 3B-M.

Tabla 1. Efectos de la inmunoterapia con ID93/GLA-SE sobre la patología pulmonar de SWR/J infectado por Mtb.

Grupoa<Grado de>Pulmón BAAR

lesiónranuloma Diagnóstico

(%)bpulmonar0G

-Nódulos de - Neumonía alveolar e intersticial 3-4 macrófagos histiocítica, de moderada a marcada; Tratamiento lescentes, con bronconeumonía lobular granulomatosa. simulado (Día 106) Moderado a 40-100 6-30 coa

marcado células gigantes

sincitiales - Numerosos BAAR en lesiones

- Sin granulomas

nodulares, pocos - Neumonía alveolar e intersticial<leve a>macrófagos histiocítica, de leve a moderada.

Rxd (Día 106)<0-2>

moderada0-40 <1

- Resolución de - BAAR mínimos en lesiones lesiones grandes

- Neumonía alveolar e intersticial - No hay histiocítica, marcada.

granulomas

histiocíticos

Rxd (Día 241,295) 4 Marcado 41-100 <30

significativos, ni - Muchos BAAR en lesiones macrófagos

sincitiales

Grupoa<Grado de Pulmón BAAR>

lesión (%)b pulmonar0c Granuloma Diagnóstico

- Granulomas

histiocíticos con - Neumonía alveolar e intersticial macrófagos histiocítica, leve a moderada.

Rxd ID93/GLA-SEf <6 sincitiales

(Día 241) m<2L>od<de>e<v>r<e>ad<df>a<11-40>

- Varios pequeños

agregados - Pocos o ningún BAAR en las lesiones linfoides densos

- Granulomas

histiocíticos con

macrófagos - Neumonía alveolar e intersticial Rxe ID93/GLA- 1-3 Mínimo a 040 sincitiales histiocítica, mínima a moderada.

<1-6

SEf (Día 295) moderado 0-40 - Infiltración

mínima,

multifocal, de

linfocitos - Pocos BAAR en lesiones

aLos datos son representativos de 3-5 animales por grupo

bPorcentaje de tejido pulmonar implicado: Mínimo (grado 1 o <10 %); Leve (grado 2 o 11-20 %); Moderado (grado 3 o 21-40 %); Marcado (grado 4 o 41-41-100 %)

cNúmero de bacterias ácido alcohol resistentes (BAAR)/campo de alta potencia (HPF), 600x

Quimioterapia de 90 días con INH/RIF iniciada 15 días después de la infección por Mtb

Quimioterapia de 60 días con INH/RIF iniciada 15 días después de la infección por Mtb

f Los ratones se inmunizaron 3 veces, con 3 semanas de separación entre una y otra, después de la administración del tratamiento de quimioterapia.

Los pulmones de los ratones tratados de forma simulada tenían edema alveolar difuso (Figura 3B, F) con afectación de grado 3-4 (40-100 %) del parénquima pulmonar que aparece muy inflamado y necrótico como se informó anteriormente [29, 38], con numerosos bacilos ácido-alcohol resistentes (>30/600x campo de alta potencia (HPF) (Figura 3J). Las secciones de pulmón de la quimioterapia sola (Rx 90 d) mostraron una resolución obvia de lesiones inflamatorias (Figura 3 C, G) con solo escasos bacilos (<1/HPF) (Figura 3 K; Tabla 1). En el día 241, los pulmones de los ratones Rx 90 d ID93/GLA-SE tenían numerosas granulomas (Figura D, H) y pocos bacilos (<6 organismos/HPF, 600x) (Figura 3 L; Tabla 1). En el día 295, los pulmones de los ratones tratados con antibióticos 60 d e inmunizados con ID93/GLA-SE no mostraron lesiones significativas (Figura 3 E, I; Tabla 1) y mostraron pocos bacilos (Figura 3 M).

Los datos demuestran que la vacuna ID93/GLA-SE administrada junto con antibióticos podría usarse para acortar los regímenes de quimioterapia estándar en las infecciones activas de TB (Figura 3A).

Ejemplo 4

Respuestas inmunitarias en ratones SWR/J que recibieron quimioterapia sola o quimioterapia más la vacuna ID93/GLA-SE.

Perfil de citocinas de esplenocitos estimulados con ID93

Los ratones SWR/J se infectaron con un LDA de Mtb H37Rv y se trataron durante 90 días con antibióticos solos o con antibióticos seguidos de tres inmunizaciones con ID93/GLA-SE con 3 semanas de separación entre una y otra, como se describe en el Ejemplo 2. Los perfiles de citocinas de los sobrenadantes de esplenocitos estimulados con ID93 (día 177 o 241 después de la infección) se analizaron después de la incubación por 24 horas en presencia de antígeno o medio solo mediante matriz de perlas múltiples para detectar IFN-<y>, IL-2, TNF, IL-5, IL-10, IL-13 e IL-17. Los diagramas de caja muestran la mediana y el rango intercuartil después de la sustracción del fondo. Valores de P de la prueba de sumas de rangos de Wilcoxon.

Tinción intracelular de citocinas para medir las respuestas de células T específicas para ID93 en los días 149 y 177 después de la infección.

Las células se estimularon con ID93 o el medio control en presencia de brefeldina A durante 8-12 horas, se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD3, CD4, CD8, CD44, IFN-y, IL-2 y TNF y se analizaron mediante FACS. (B y C) Los paneles muestran el esquema de selección y separación de células para el análisis mediante FACS. (D) Los gráficos de cajas en el panel inferior muestran la mediana y el intervalo intercuartil después de la sustracción del fondo. Valores de P de la prueba de sumas de rangos de Wilcoxon. En respuesta a la reestimulación in vitro con ID93, un subconjunto de citocinas que representan grupos funcionales de citocinas proinflamatorias, así como de TH1 y TH2, se reguló significativamente al alza (Figura 4A). El TNF, un mediador soluble de la inmunidad específica para Mtb en individuos infectados, se reguló significativamente al alza en el día 241 en el grupo inmunizado con ID93/GLASE (P <0,05). Además, se detectaron respuestas de<I F N - y ,>IL-2 e IL-17 específicas para ID93, que eran significativamente mayores en animales vacunados en comparación con los animales no vacunados. No se detectó ninguna diferencia significativa en la concentración de la citocina IL-5 de tipo TH2, pero se midieron las respuestas significativas de IL-10 e IL-13 específicas para ID93 en el día 241.

Las células TH1 CD4+ polifuncionales se han descrito recientemente como una correlación de protección contra la Leishmania major, y se han implicado en la limitación de la progresión de la enfermedad en la TB humana [39, 40]. Por lo tanto, se examinaron las frecuencias de células T CD4+ y CD8+ que producen<I F N - y ,>IL-2 y TNF para determinar el fenotipo de respuestas de células T específicas para ID93 (Figura 4B-D; S2B). Se observaron frecuencias más altas de células T CD4+ doble positivas IPN-Y+ TNP+ y triple positivas polifuncionales específicas para ID93 en ratones que recibieron inmunoterapia complementaria en comparación con los ratones que recibieron solo quimioterapia (P <0,05), (Figura 4B-D). Se observó una alta respuesta de fondo del TNF específico para ID93 en los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+, lo que probablemente se debió a una mayor activación inmunitaria debido a una infección por Mtb en curso en estos animales. Aunque las respuestas específicas para ID93 en las células T CD8+ fueron de menor magnitud que las observadas en el compartimento CD4+, hubo frecuencias significativamente mayores de células T CD8+ doble positivas (IPN-Y+ TNE+) y triple positivas (IFN-y+ IL-2+ TNF+) en ratones que recibieron la vacuna complementaria de ID93/GLA-SE. En conjunto, estos datos muestran que, si bien hay muchos antígenos presentes después de la infección por Mtb que podrían cebarse potencialmente y reforzarse continuamente, ID93/GLA-SE administrado conjuntamente con los antibióticos fue exitosa para estimular una respuesta de células T CD4+ de tipo TH1 significativamente más fuerte, de alta calidad (polifuncional) y duradera.

Ejemplo 5

ID93/GLA-SE como complemento al tratamiento con antibióticos en macacos cynomolgus.

Para demostrar la seguridad de ID93/GLA-SE cuando se administra como complemento a antibióticos en NHP, se administraron a macacos tres dosis de la vacuna después de un mes de antibióticos RIF/INH (Figura 5A). Las reacciones del sitio de inyección fueron mínimas, con no más que eritema y edema apenas perceptibles (rango 0-1 según la escala de Draize), y no hubo cambios significativos en el peso corporal y la temperatura (datos no mostrados). Los 7 (100 %) de los NHP inmunizados con Rx ID93/GLA-SE sobrevivieron hasta el último punto temporal de evaluación, mientras que 6 NHP (85,7 %) en el grupo de antibióticos solos y 3 NHP (42,8 %, P = 0,44) en el grupo tratado de forma simulada sobrevivieron hasta este punto (Figura 5B). En cuatro monos tratados con Rx ID93/GLA-SE no se observaron cambios radiológicos o la infección por Mtb se resolvió antes del final del experimento (como lo demuestran los infiltrados pulmonares en radiografías de tórax previamente positivas), mientras que en ninguno de los macacos que recibieron Rx solo o se trataron de forma simulada se resolvió la infección por Mtb y la radiografía de tórax se mantuvo positiva (Figura 5C). El cuarenta por ciento de los macacos tratados con Rx ID93/GLA-SE respondieron significativamente a la inmunoterapia complementaria al mostrar diferencias cuantitativas en los números de bacterias Mtb en comparación con el grupo con Rx solo; (p <0,05) (Figura 5D). Curiosamente, los macacos Rx ID93/GLA-SE que tenían recuentos de UFC más bajos también tuvieron radiografías de tórax negativas al final del experimento. También se encontró una correlación histopatológica entre la asignación de grupo y la presencia de tejido enfermo, donde los animales que recibieron ID93/GLA-SE contenían los órganos más sanos y el grupo con solución salina tenía los órganos más enfermos (p = 0,003) (Figura 5E). En general, estos resultados demostraron que la vacuna ID93/GLA-SE fue bien tolerada como un agente inmunoterapéutico después de la exposición en macacos cynomolgus.

Ejemplo 6

Respuestas inmunitarias en ratones BALB/c que recibieron quimioterapia sola o quimioterapia más la vacuna ID83/GLA-SE.

Se infectaron ratones BALB/c hembras de seis semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA) conM. tuberculosisH37Rv, usando el sistema de exposición por inhalación (Glas-Col, Terre Haute, IN) y un caldo de cultivo en fase logarítmica (densidad óptica a 600 nm de 1,0) diluido 10 veces en caldo 7H9 con el objetivo de implantar 2,5-3,0 UFC log 10 en los pulmones. Se preparó M.tuberculosisH37Rv a partir de células subcultivadas de ratón, se congelaron en alícuotas y se subcultivaron en el caldo Middlebrook 7H9 con ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa (OADC) al 10 % (Fisher, Pittsburgh, PA) y Tween 80 al 0,05 % antes de la infección. Se sacrificaron cinco ratones 1 día después de la infección para confirmar el número de bacterias implantadas. Los ratones restantes se asignaron al azar a los grupos de tratamiento indicados en la Tabla 2. El tratamiento con rifampicina (R), isoniazida (H) y pirazinamida (Z), colectivamente RHZ, comenzó 26 días después de la infección el día 0. Rifampicina e isoniazida (Sigma, St. Louis, MO) se disolvieron por separado en agua destilada a 1 mg/ml para producir la solución de dosificación. Se disolvió pirazinamida (Fisher Scientific, Suwanee, GA) en agua destilada a 15 mg/ml para producir la solución de dosificación. Las soluciones se prepararon y se dividieron en alícuotas semanalmente y se mantuvieron a 4 °C antes del uso. Cuatro grupos de control recibieron vehículo farmacéutico (agua) adyuvante GLA-SE, vehículo farmacológico vacuna ID83, RHZ vehículo de vacuna (solución salina) y RHZ adyuvante GLA-SE. El grupo de prueba recibió RHZ vacuna ID83. Se administraron RHZ y vehículo farmacéutico 5 días por semana, mediante sonda nasogástrica, durante 12 semanas. Se administró R o vehículo al menos 1 hora antes de HZ o vehículo para evitar interacciones farmacocinéticas entre fármacos descritas previamente que limitan la absorción de R.

La ID83 se formuló como una emulsión de aceite en agua estable con GLA (GLA-SE) mezclando 4 ml de mezcla de vacuna con 2 ml de GLA-SE (0,040 mg/ml, aceite al 4 %), 0,1 ml de ID83 (0,2 mg/ml) y 1,9 ml de solución salina (NaCl). La preparación de vacuna se agitó con vórtex brevemente antes de usar. Se administraron 100 pl de vacuna por vía subcutánea. Las dosis inyectadas fueron: 2 pg de GLA-SE /-0,5 pg de ID83.

La vacunación de ratones infectados comenzó 6 semanas después de la infección (2 semanas después del inicio del tratamiento con RHZ). Se administraron tres dosis de vacuna o controles (solo solución salina o adyuvante) por vía subcutánea en 100 microlitros a intervalos de 3 semanas (es decir, después de 2, 5 y 8 semanas de tratamiento). La vacuna contenía 2 microgramos de adyuvante GLA-SE y 0,5 microgramos de ID83. Los controles incluyeron solo solución salina y solo adyuvante. Se rotó el sitio de inyección.

Tabla 2. Esquema experimental

Evaluación patológica.Se tomaron fotografías de pulmones representativos después de 72 horas de incubación en PBS estéril, y antes de la homogeneización para cultivos cuantitativos, para registrar la apariencia macroscópica de las lesiones pulmonares. El otro pulmón se lavó y se colocó en una solución de formalina tamponada neutra al 10 %. Estos pulmones se embebieron en parafina, se seccionaron, se fijaron en portaobjetos de vidrio y se tiñeron con H&E y una tinción de ácido-alcohol resistencia para el examen histopatológico.

Evaluación histopatológica.Los recuentos de CFU (x) se transformaron logarítmicamente como (x 1) antes del análisis. Las medias de los grupos se compararon mediante análisis de varianza unidireccional con la prueba posterior de Bonferroni.

Resultados

Recuentos de UFC de pulmón durante el tratamiento.El recuento medio (±DE) de UFC de pulmón en log10 al día 26 fue de 2,78 ±0,21. El recuento medio de UFC al inicio del tratamiento (D0) fue de 7,60 ±0,23. Después de 6 semanas de tratamiento, los recuentos de UFC de pulmón disminuyeron en aproximadamente 0,9 log10 en los grupos de vehículo adyuvante y vehículo vacuna, mientras que los recuentos de UFC en los grupos de RHZ solución salina, RHZ adyuvante y RHZ vacuna cayeron en 4,27, 4,19 y 4,44 log 10, respectivamente (Figura 6A). Después de 12 semanas de tratamiento, los recuentos de UFC en los grupos tratados con vehículo farmacológico fueron en gran medida estables, mientras que 3 de 5, 2 de 4 y 4 de 5 ratones tratados con antibióticos solos (RHZ solución salina), antibiótico más adyuvante TLR4 (RHZ adyuvante) y antibióticos vacuna ID83 (RHZ vacuna), respectivamente, dieron negativo en el cultivo (Figura 6).

Recuentos de UFC de pulmón después de la finalización del tratamiento.Después de 5 semanas de seguimiento posterior al cese de cualquier tratamiento, 4 de 5 ratones en cada grupo dieron positivo en los cultivos de pulmón (Tabla 3 a continuación). Los recuentos medios de UFC de pulmón en log10 en los grupos RHZ solución salina, RHZ adyuvante y RHZ vacuna fueron 1,14 ±1,14, 0,72 ±0,49 y 0,63 ±0,42, respectivamente. Excluyendo los ratones que dieron negativo en el cultivo, los recuentos de UFC fueron 1,42 ±1,09, 0,90 ±0,32 y 0,78 ±0,27, respectivamente. Después de 10 semanas de seguimiento, solo 1 de 5 ratones en el grupo de RHZ vacuna dio positivo en el cultivo, en comparación con 3 de 5 ratones en los grupos RHZ adyuvante y RHZ solución salina. Excluyendo los ratones que dieron negativo en el cultivo, los recuentos medios de UFC de pulmón en log 10 en los grupos RHZ solución salina, RHZ adyuvante y RHZ vacuna fueron 1,82 ±1,85, 1,37 ±1,56 y 0,75 ±1,68, respectivamente. Diez semanas después de la finalización del tratamiento (Figura 7), los recuentos de UFC en los tres animales que dieron positivo en los cultivos de pulmón en ambos grupos tratados con RHZ solución salina o RHZ adyuvante solo mostraron un recrecimiento bacteriano logarítmico, mientras que el único animal que dio positivo en el cultivo de pulmón en el grupo RHZ vacuna mostró un recrecimiento bacteriano que se redujo en comparación con los otros dos grupos.

Si bien el estudio no fue sustentado por una significación estadística en términos de recuentos de UFC, estos datos demostraron que el tratamiento de una infección activa por tuberculosis según los métodos de la invención da como resultado una mejora duradera en un signo o síntoma de tuberculosis y proporciona un acortamiento de la duración de la quimioterapia en comparación con la sola terapia farmacológica con antibióticos.

Tabla 3. Porcentaje (proporción) de ratones que dieron positivo en los cultivos después de 12 semanas de tratamiento seguido de 5 o 10 semanas de seguimiento

La invención está limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Secuencias de aminoácidos ilustrativas

Polipéptido de fusión ID93 con etiqueta de His opcional (Id. de sec. n.°: 1)

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQ LGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSE1AGLP1PP11HYGAIAYAPSG ASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKWSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWAC NELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNML HGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASV TTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAAN LLG

QNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIG NANIGFGNRGDANIGIGN1GDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLWGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLP NIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVWFGTSQSATIATFE MRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLN VFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGWQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYD RTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

Polipéptido de fusión ID93 (Id. de sec. n.°:2)

MTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQA AGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKC GDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGR FEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQAS QQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAA SPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQ DVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIG DRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLWGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYT ATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVWFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDEL SFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIA LPPDLASGWQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVD WAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

Polipéptido de fusión ID83 con etiqueta de His opcional (Id. de sec. n.°:3)

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVAL EKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDM AGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQE QASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMT RAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQI WAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGI GNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLWGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHP GYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPG LDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHS GLIALPPDLASGWQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLF PDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

Polipéptido de fusión ID83 (Id. de sec. n.°:4)

HLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYN GSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQ NISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARI FAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQA RLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPI QEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNG QIGFGKPANPDVLWGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDV SVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVWFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSI PQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGWQPVSSPDVLTTYIL LPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALS GLGLPPPWQPALPRLFST

Rv1813 (Id. de sec. n.°:5)

MITNLRRRTAMAAAGLGAALGLGILLVPTVDAHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPA RAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACN

Rv3620 (Id. de sec. n.°:6)

MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGV RDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS

Rv2608 (Id. de sec. n.°:7)

MNFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWL NTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFG YHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIG NTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLWGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPS QFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVWFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNP NRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASG WQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAAD LQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLF

Rv3619 (Id. de sec. n.°:8)

MTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGR NFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWA

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES i.Una vacuna que comprende una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de fusión, en donde el polipéptido de fusión: (a) comprende una combinación de antígeno Rv1813, Rv3620 y Rv2608 de una especie de Mycobacterium, en donde Rv1813 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 5, Rv3620 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 6, y Rv2608 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 7, y los antígenos se unen covalentemente, o; (b) comprende una combinación de los antígenos Rv1813, Rv3620, Rv2608 y Rv3619 de una especie de Mycobacterium, en donde Rv1813 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 5, Rv3620 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 6, Rv2608 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 7, y Rv3619 comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de sec. n.°: 8, y los antígenos se unen covalentemente; o, (c) se selecciona de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la Id. de sec. n.°: 1; un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la Id. de sec. n.°:2; o un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la Id. de sec. n.°: 3 o la Id. de sec. n.°: 4; en donde la vacuna comprende un adyuvante, para usar en un método de terapia para una infección activa por tuberculosis en un mamífero, en donde la infección activa por tuberculosis secaracteriza porla bacteria MTB, que prolifera, se reproduce, se expande o se multiplica activamente a una velocidad exponencial, logarítmica o semilogarítmica en un órgano del mamífero, y en donde dicha terapia se realiza junto con uno o más agentes quimioterapéuticos eficaces contra una infección porM.tuberculosis.
2. 2. Una vacuna para usar según la reivindicación 1, en donde la vacuna induce una respuesta inmunitaria contra la tuberculosis y en donde la terapia reduce el curso temporal de la quimioterapia contra la infección activa por tuberculosis.
3. 3. Una vacuna para usar según la reivindicación 2, en donde el curso temporal de la quimioterapia se acorta a no más de 3 meses, 5 meses o 7 meses.
4. 4. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la infección activa por tuberculosis se asocia con un síntoma clínico de debilidad, fatiga, fiebre, escalofríos, pérdida de peso, pérdida de apetito, anorexia, sudores nocturnos o cualquier combinación de los mismos.
5. 5. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la infección activa por tuberculosis es una infección primaria activa por M.tuberculosis,una infección de tuberculosis de reactivación, una infección activa de TB pulmonar o una infección porM. tuberculosisresistente a múltiples fármacos (MDR).
6. 6. Una vacuna para usar según la reivindicación 5, en donde la infección activa por tuberculosis pulmonar se asocia con un síntoma clínico de tos persistente, moco espeso, dolor de pecho, hemoptisis o cualquier combinación de los mismos.
7. 7. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la infección activa por tuberculosis se identifica mediante un ensayo seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de tinción de ácido-alcohol resistencia (AFS); un ensayo de cultivo bacteriano; una prueba IGR; una prueba cutánea; y tinción intracelular de citocinas de sangre completa o PBMC aisladas después de la estimulación con antígeno.
8. 8. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el mamífero se inmunizó previamente con el bacilo de Calmette-Guerin (BCG).
9. 9. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más agentes quimioterapéuticos es amikacina, ácido aminosalicílico, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, kanamicina, pirazinamida, rifamicinas, estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina y fluoroquinolonas, o una combinación de las mismas.
10. 10. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde: al mamífero primero se le administra uno o más agentes quimioterapéuticos durante un período de tiempo y, posteriormente, se le administra la vacuna terapéutica; primero se administra al mamífero la vacuna terapéutica y, posteriormente, se le administra uno o más agentes quimioterapéuticos durante un período de tiempo; o la administración del uno o más agentes quimioterapéuticos y la vacuna terapéutica es simultánea. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el adyuvante es GLA, que tiene la siguiente estructura:

    en donde R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C20; y R2 y R4 son alquilo C9-C20. Una vacuna para usar según la reivindicación 11, en donde: R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C14; y R2 y R4 son alquilo C12-15; R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11; y R2 y R4 son alquilo C13; R1, R3, R5 y R6 son alquilo C11; y R2 y R4 son alquilo C9. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el mamífero es un ser humano. Una vacuna para usar según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al mamífero se le administra la vacuna terapéutica en uno o más momentos posteriores a la administración inicial, en donde una infección de tuberculosis que permanece en el mamífero en el uno o más momentos posteriores puede o puede no ser una infección activa por tuberculosis.