CN104812404A

CN104812404A - 用于治疗活动性结核分枝杆菌感染的组合物和方法

Info

Publication number: CN104812404A
Application number: CN201380051732.7A
Authority: CN
Inventors: S·G·里德; R·N·科勒
Original assignee: Infectious Disease Research Institute Inc
Current assignee: Access to Advanced Health Institute
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2015-07-29
Also published as: US20200038498A1; RU2659149C2; EP4299138A2; JP2015525784A; PT2879701T; WO2014042780A1; RU2015107435A; BR112015002483A2; HUE065746T2; EP2879701A1; EP4299138A3; ZA201501242B; ES2969734T3; EP2879701A4; US11369672B2; MX385774B; US20150182612A1; MX2015001557A; ZA201702091B; HRP20240164T1

Abstract

本公开内容涉及用于治疗活动性结核感染的方法和组合物及用于改善化学疗法方案针对活动性结核感染的功效的方法和组合物。本公开内容涉及在哺乳动物中治疗活动性结核分枝杆菌感染或源自潜伏性感染再活化的活动性感染的方法及改善化学疗法方案针对活动性结核分枝杆菌感染的功效的方法。

Description

用于治疗活动性结核分枝杆菌感染的组合物和方法

对相关专利申请的交叉引用

本申请要求2012年8月3日提交的美国临时申请流水号61/679,612，和2013年3月15日提交的美国临时申请流水号61/791,213的优先权权益，通过提及将它们全部完整收入本文。

ASCII文本文件上序列表的提交

ASCII文本文件上的以下提交的内容通过提及完整收入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：712192000940SeqList.txt，记录日期：2013年7月31日，大小：36KB)。

发明领域

本公开内容涉及用于治疗哺乳动物中的原发性活动性结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染或源自潜伏性感染再活化的活动性感染的方法和组合物及用于改善化学疗法方案针对活动性结核分枝杆菌感染的功效的方法和组合物。

发明背景

结核病(tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌和其它分枝杆菌物种感染引起的慢性传染病。TB在发展中国家是一种主要的流行性疾病，以及在世界上的发达地区是一项日益增加的问题，每年夺取170-200万生命。虽然感染可以为无症状达相当长的时间段，但是疾病最常表现为急性肺炎症，这导致发热和非排痰性咳嗽。若不治疗，则通常导致严重的并发症和死亡。多药抗性TB(MDR-TB)的增加进一步加剧此威胁(Dye,Nat Rev Microbiol2009；7:81-7)。

结核分枝杆菌感染的过程基本上经过3个阶段。在急性或活动性阶段期间，细菌在器官中以指数，对数，或半对数速率增殖或活跃倍增，直至免疫应答升高至其能控制感染的点，于是细菌负荷达到峰值，并且开始下降。虽然没有完全了解机制，但是认为敏化的CD4⁺T淋巴细胞与干扰素γ(IFN-γ，γ-IFN)协作介导对感染的控制。一旦主动免疫应答降低细菌负荷并在控制中将其维持于稳定且较低的水平，潜伏阶段得到建立。先前，多项研究报告了在潜伏期期间，结核分枝杆菌从活跃倍增转为潜伏，基本上变为非复制的并且仍然在肉芽肿内部。然而，最近的研究已经证明了即使在潜伏期(以恒定的低细菌数目为特征的感染阶段)中，细菌群体的至少一部分仍然处于活跃代谢的状态(Talaat等2007,J of Bact 189,4265-74)。

因此，这些细菌在面对强免疫应答时存活，维持活跃代谢，并且最小程度上复制。因此，在潜伏期期间在受感染的个体中，存在有非复制的细菌(其可以是免疫系统非常难以检出的，因为它们在胞内定位)和缓慢复制的细菌之前的平衡。在一些病例中，潜伏性感染进入再活化，其中休眠的细菌再次开始复制，尽管以稍微低于初始感染的速率。已经提出了结核分枝杆菌从原发性感染至潜伏期的转变伴随着基因表达的变化(Honer zu Bentrup,2001)。还可能的是，由于细菌在其从活跃复制至休眠期的转变期间调控基因表达，发生免疫应答的抗原特异性的变化。控制潜伏性感染的免疫应答和导致再活化的因素的全部性质在很大程度上是未知的。然而，存在有优势细胞类型转变负有责任的一些证据。虽然CD4T细胞在急性阶段期间对于控制感染是必需且足够的，但是研究提示了CD8T细胞应答在潜伏阶段中是更重要的。此阶段中的细菌通常不被目前在TB领域中开发中的大多数预防性疫苗靶向，如通过在对潜伏性感染的实验动物给予经典的预防性疫苗时缺乏活性例示的(Turner等2000Infect Immun.68:6:3674-9)。

虽然一般可以使用延长的抗生素疗法控制TB，但是此类治疗不足以阻止疾病的传播。受感染的个体在一段时间可以是无症状的，但传染性的。目前针对潜伏性TB(无症状且非传染性的)的临床实践是用异烟肼或其它抗生素治疗6至9个月，或者用利福平治疗4个月。将活动性TB用4种药物的组合治疗6至8周，期间认为大多数杆菌被杀死，接着用两种药物治疗总共6至9个月的持续时间。治疗的持续时间取决于每周给予的剂量数目。另外，虽然治疗方案的顺从性是至关重要的，但是患者行为难以监测。一些患者由于治疗的副作用或极端持续时间(6-9个月)而没有完成治疗过程，研究已经显示了这可以导致无效的治疗和药物抗性的形成。

为了控制结核病的传播，有效的防范性疫苗接种和活动性疾病的精确早期诊断及随后更为有效的治疗方案(包括治疗性疫苗和划算且患者接受的化疗剂两者)具有极大的重要性。目前，用活细菌诸如卡介苗(BCG)(一种牛分枝杆菌(M.bovis)无毒株)的防范性疫苗接种是一种用于诱导保护性免疫的最有效方法。然而，BCG的安全性和功效是论争的源头，并且一些国家(诸如美国)不用此药剂对公众进行疫苗接种。与选择的重组蛋白组合的分子佐剂的开发已经实现新一代疫苗的开发，所述疫苗可以防范性及治疗性使用以治疗及预防传染病。见例如EP 2457926。需要的是如下的治疗性疫苗，其即使在面对高细菌负荷时有效刺激针对活动性TB疾病的免疫应答以对化疗剂提供辅助，从而缩短治疗时间，清除杆菌，限制与疾病有关的肺病理学，并且潜在限制MDR-TB的传播。

如此，迫切需要针对活动性结核分枝杆菌感染的新的更有效的治疗性方案，其通过缩短治疗时间提高治疗顺从性以降低TB传播。

发明概述

本公开内容涉及治疗哺乳动物中的活动性结核分枝杆菌感染或源自潜伏性感染再活化的活动性感染的方法及改善化学疗法方案针对活动性结核分枝杆菌感染的功效的方法。

本公开内容基于令人惊讶的发现，即通过包含治疗性Mtb组合物，诸如治疗性Mtb疫苗和有效针对结核分枝杆菌感染的化疗剂的治疗方案，能有效治疗活动性结核分枝杆菌感染，由此缩短保护需要的化学治疗时间，降低细菌负荷，和/或延长存活。此外，令人惊讶地，发明人已经发现了在活动性TB感染期间作为抗生素疗法的辅助投递时，治疗性Mtb组合物能产生有益的针对结核分枝杆菌的免疫应答，其改善化学治疗方案针对TB疾病的功效。发明人进一步发现了在活动性TB感染期间作为有效针对结核分枝杆菌感染的化疗剂的辅助施用治疗性Mtb组合物(诸如治疗性疫苗)刺激显著更有力的，高质量的(多功能性)，且持久的T_H1型CD4⁺T细胞应答。

因此，在一方面，提供了用于治疗哺乳动物中的活动性结核感染的方法，所述方法包括如下的步骤：对具有活动性结核(例如结核分枝杆菌)感染的哺乳动物施用化疗剂和免疫学有效量的治疗性疫苗，其中所述疫苗包含药物组合物，该药物组合物包含来自结核复合物中分枝杆菌物种的Mtb抗原或其免疫原性片段和佐剂。

在本公开内容的此方法及相关方法中会理解，施用治疗性疫苗的至少一个步骤，通常施用治疗性疫苗的初始步骤会在哺乳动物感染有结核分枝杆菌活动性和/或展现出与活动性感染有关的至少一种临床症状或阳性测定结果时发生。还会理解，本公开内容的方法可以进一步包括如下的别的步骤：在此后的一个或多个别的时间点时施用本公开内容的相同或另一种治疗性疫苗，无论活动性感染或其症状是否仍然存在于哺乳动物中，且无论与活动性感染有关的测定结果是否仍然呈阳性，以改善化学疗法方案的功效。还会理解，本公开内容的方法可以包括单独或与其它药剂联合施用治疗性疫苗，因而治疗性疫苗可以是多种治疗成分之一作为更宽的治疗性处理方案的一部分。因而，有利地，本公开内容的方法改善化学疗法治疗方案用于治疗活动性结核感染的功效。

在某些实施方案中，治疗性疫苗包含分离的融合多肽，所述分离的融合多肽包含两种或更多种共价连接的结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段的组合，其中所述抗原选自下组：Rv0164，Rv0496，Rv2608，Rv3020，Rv3478，Rv3619，Rv3620，Rv1738，Rv1813，Rv3810，Rv2389，Rv2866，Rv3876，Rv0054，Rv0410，Rv0655，Rv0831，Rv1009，Rv1099，Rv1240，Rv1288，Rv1410，Rv1569，Rv1789，Rv1818，Rv1860，Rv1886，Rv1908，Rv2220，Rv2032，Rv2623，Rv2875，Rv3044，Rv3310，Rv3881，Rv0577，Rv1626，Rv0733，Rv2520，Rv1253，Rv1980，Rv3628，Rv1884，Rv3872，Rv3873，Rv1511和Rv3875，和与任何前述序列具有至少90％同一性的抗原。

在一个具体的实施方案中，治疗性疫苗包含ID93融合多肽，其包含抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。

在另一个具体的实施方案中，治疗性疫苗包含ID93融合多肽，其包含抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813，其中抗原的序列来自结核分枝杆菌。在一个更具体的实施方案中，ID93融合多肽包含SEQ ID NO:1中所列的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

本文中还提供了用于治疗哺乳动物中的活动性结核感染的方法，所述方法包括如下的步骤，即与一种或多种化疗剂联合对具有活动性结核感染的哺乳动物施用免疫学有效量的治疗性疫苗，其中所述疫苗包含药物组合物，该药物组合物包含分离的融合多肽，其中所述融合多肽包含(a)来自结核复合物中分枝杆菌物种的抗原Rv3620和Rv2608的组合，并且所述抗原是共价连接的，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。

本文中还提供了用于治疗哺乳动物中的活动性结核感染的方法，所述方法包括如下的步骤，即与一种或多种化疗剂联合对具有活动性结核感染的哺乳动物施用免疫学有效量的治疗性疫苗，其中疫苗包含药物组合物，该药物组合物包含分离的融合多肽，其中所述融合多肽包含(a)来自结核复合物中分枝杆菌物种的抗原Rv1813，Rv3620，和Rv2608的组合，并且所述抗原是共价连接的，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。

在某些实施方案中，要依照公开的方法治疗的活动性感染是引起哺乳动物中活动性TB的临床症状的活动性感染，所述临床症状选自下组：虚弱，发热，寒意，重量减轻，食欲减退和盗汗。在其它实施方案中，活动性感染引起哺乳动物中肺TB症状的临床症状，其选自下组：持续性咳嗽(persistentcough)，稠粘液(thick mucus)，胸痛(chest pain)和咯血(hemoptysis)。在还有其它实施方案中，活动性感染以Mtb细菌为特征，所述Mtb细菌在哺乳动物器官中以指数，对数，或半对数速率增殖，繁殖，扩充或活跃倍增。在其它更具体的实施方案中，活动性感染是使用选自下组的测定法鉴定的：抗酸染色(AFS)测定法；细菌培养测定法，诸如BACTEC MGIT 960测定法；IGR测试，诸如-Gold测试或-Gold In-tube T SPOT^TM TB测试；皮肤测试，诸如TST Mantoux皮肤测试(TST)；和抗原刺激后全血或分离的PBMC的胞内细胞因子染色。

会显而易见的是，在一些实施方案中，活动性感染会是结核分枝杆菌的活动性原发性感染，而在其它实施方案中，它会源自结核分枝杆菌的潜伏性感染的再活化。在一些实施方案中，哺乳动物会感染有结核分枝杆菌的多药抗性(MDR)株。在其它实施方案中，哺乳动物会先前免疫接种了卡介苗(BCG)。

公开的方法的某些实施方案包括施用一种或多种有效治疗结核分枝杆菌感染的化疗剂，诸如异烟肼(isoniazid)和/或利福平(rifampin)。在一些情况中，首先在一段时间里对哺乳动物施用一种或多种化疗剂，然后施用治疗性疫苗。在其它情况中，首先对哺乳动物施用治疗性疫苗，然后在一段时间里施用一种或多种化疗剂。在还有其它情况中，在相同时间时启动一种或多种化疗剂和治疗性疫苗的施用。此外，会理解，在实施公开的方法时，可以期望在多个时机对哺乳动物施用药物组合物和/或治疗性疫苗，例如在第一次施用后的一个或多个随后的时间。

在一些实施方案中，治疗性疫苗进一步包含佐剂。在一些实施方案中，在治疗性疫苗中使用的佐剂是GLA佐剂，诸如具有以下结构的GLA佐剂：

其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烃基；且R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烃基或C₉-C₂₀烃基。

在一个更具体的实施方案中，在使用具有上述结构的GLA时，R¹，R³，R⁵和R⁶是C_11-14烃基；且R²和R⁴是C_12-15烃基。在一个甚至更具体的实施方案中，上述结构的GLA是如下的，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₁₃烃基。在一个甚至更具体的实施方案中，上述结构的GLA是如下的，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₉烃基。

在另一个方面，在用于在受试者中缩短化学疗法在活动性结核感染中的时间过程的方法中采用组合物，所述方法包括如下的步骤，即作为一种或多种有效针对结核分枝杆菌感染的化疗剂的辅助对具有活动性结核分枝杆菌感染的哺乳动物施用免疫学有效量的如本文中描述的治疗性疫苗，例如其包含来自结核复合物中分枝杆菌物种的融合蛋白或多肽或其免疫原性片段和佐剂，由此缩短化学疗法针对结核分枝杆菌感染的时间过程。在另一个方面，本文中提供了用于缩短化学疗法针对活动性结核感染的时间过程的方法，所述方法包括与化学疗法联合对具有活动性结核感染的哺乳动物施用免疫学有效量的治疗性疫苗，其中所述疫苗包含药物组合物，其包含分离的融合多肽，其中所述融合多肽包含(a)来自结核复合物中分枝杆菌物种的抗原Rv1813，Rv3620，和Rv2608的组合，并且所述抗原是共价连接的，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列，且其中疫苗诱导针对结核病的免疫应答，由此提供化学疗法针对活动性结核感染的缩短的时间过程。在一些方面，疗法的时间过程缩短至约3，4，5，6，或7个月，例如不超过约3，4，5，6或7个月。通过缩短化学疗法针对结核分枝杆菌感染的时间过程，本方法还有效增强正在治疗活动性结核分枝杆菌感染的个体在完成整个治疗过程中的顺从性。

在又一个方面，在用于在受试者中在活动性结核感染中刺激多功能性，持久的T_H1型CD4⁺T细胞应答的方法中采用组合物，所述方法包括如下的步骤，即作为一种或多种有效针对结核分枝杆菌感染的化疗剂的辅助对具有活动性结核分枝杆菌感染的哺乳动物施用免疫学有效量的如本文中描述的治疗性疫苗，例如其包含来自结核复合物中分枝杆菌物种的融合蛋白或其免疫原性片段和佐剂，由此刺激多功能性，持久的T_H1型CD4⁺T细胞应答。通过缩短化学疗法针对结核分枝杆菌感染的时间过程，本方法还有效增强正在治疗活动性结核分枝杆菌感染的个体在完成整个治疗过程中的顺从性。

在任何前述实施方案中，哺乳动物可以是人。

附图简述

专利或申请文件含有至少一幅以颜色制成的图。具有颜色附图的本专利或专利申请公开文本的拷贝会在请求并支付必要费用后由政府机关提供。

图1显示了用结核分枝杆菌(Mtb)感染并用抗生素处理的SWR/J和C57BL/6小鼠的细菌负荷和存活。用Mtb H37Rv(ATCC#27294)的低剂量(50-100个细菌)气雾剂(LDA)感染SWR/J和C57BL/6小鼠。(图1A)在感染后15，30和100天测定肺(5只小鼠/组)中的活细菌数目。符号标示均值+/-标准偏差。(图1B)在用Mtb H37Rv感染并假处理或用90天抗生素方案(Rx 90d)处理的动物(8只小鼠/组)中监测SWR/J和C57BL/6小鼠的存活，所述90天抗生素方案由在第30-120天施用INH和RIF组成。(图1C)将SWR/J小鼠用MtbH37Rv的LDA感染，并在第15天(Rx 30d，60d，90d)或第30天(Rx 90d(30))开始用30，60或90天抗生素处理。显示了SWR/J小鼠(7只小鼠/组)的存活。(图1D)感染后30，60，90，120和150天测定假处理或用90天INH/RIF方案(在第30-120天施用)(Rx 90d)处理的动物(5只小鼠/组)的肺中的活细菌数目。认为*P<0.05(单因素ANOVA，接着是Dunnett氏多重比较检验或时序检验)是显著的。显示两项实验的1个代表。

图2显示了用Mtb的LDA感染并用抗生素和ID93/GLA-SE处理的SWR/J小鼠的菌落形成单位计数和存活。将SWR/J小鼠用Mtb的LDA感染(第0天)。15天后(第15天)，将小鼠假处理或用抗生素处理90天(Rx 90d)。还将每组中的抗生素处理小鼠的一个子集用ID93/GLA-SE在抗生素治疗性处理期间(DTT；第15天，第36天，第57天)或之后(PTT；第107天，第128天，第149天)相隔3周免疫接种3次。(图2A)免疫疗法实验的方案。(图2B)在感染后177天测定动物(6或7只小鼠/组)的肺中的活细菌数目。认为*P<0.05是显著的。(图2C)通过随时间监测由Mtb引起的动物死亡(9或10只小鼠/组)评估保护。显示了4项实验的1个代表。认为P<0.05(时序检验)是显著的。

图3显示了用Mtb感染并用ID93/GLA-SE疫苗和缩短的抗生素化学疗法处理的SWR/J小鼠的存活。用Mtb H37Rv的LDA感染SWR/J小鼠。15天后，将小鼠用抗生素处理60或90天(分别为Rx 60d和Rx 90d)。在完成60天抗生素方案后，将小鼠用ID93/GLA-SE相隔3周免疫接种3次。(图3A)通过随时间监测由Mtb引起的动物死亡(7只动物/组)评估保护。认为P<0.05(时序检验)是显著的。(图3B-3M)用Mtb H37Rv攻击后肺组织的组织病理学评估。在H&E切片中显示炎性应答和肉芽肿(g)形成(图3B-3I)，并且评估AFB(箭)的存在(图3J-3M)。(图3B，3F，3J)假处理小鼠，第106天；(图3C，3J和3K)90天抗生素疗法，第106天；(图3D，3H，3L)90天抗生素疗法+ID93/GLA-SE，第241天；(图3E，3I和3M)60天抗生素疗法+ID93/GLA-SE，第295天。显示的数据代表5只小鼠/组。显示了3项实验的1个代表。

图4显示了免疫疗法后SWR小鼠中的ID93特异性细胞因子应答。将SWR小鼠用LDA Mtb H37Rv感染，并用单独的90天抗生素或抗生素及随后相隔3周用ID93/GLA-SE免疫接种3次处理。(图4A)在感染后第177天或第241天回收的用ID93刺激的脾细胞的细胞因子概况。将细胞在存在抗原或培养基对照的情况中温育24小时，收集上清液，并通过多重珠测定法分析IFN-γ，IL-2，TNF，IL-5，IL-10，IL-13，和IL-17。框图显示了背景扣除后的中值和四分位距。P值来自Wilcoxon秩和检验。(图4B-4D)感染后第149天和第177天时ID93特异性T细胞应答的胞内细胞因子染色。将细胞在存在布雷菲尔德菌素(brefeldin)A的情况中用ID93或培养基对照刺激8-12小时，用缀合有荧光染料的针对CD3，CD4，CD8，CD44，IFN-γ，IL-2和TNF的抗体染色。(图4B和4C)小图显示了FACS分析的门控方案。(图4D)下部小图中的框图显示了背景扣除后的中值和四分位距。P值来自Wilcoxon秩和检验。显示了2项实验的1个代表。

图5显示了用Mtb感染并用抗生素和ID93/GLA-SE处理的非人灵长类(NHP)的存活，临床参数和细菌负荷。用1000个CFU的有毒力的结核分枝杆菌(埃尔德曼(Erdman)株)气管内接种猕猴。容许感染进行60天，接着用30天通过管饲法递送的INH/RIF抗生素或盐水(假)处理。给猴(每组7只)注射ID93/GLA-SE(相隔2周施用3次)(Rx+ID93/GLA-SE)，或者其不接受进一步的处理(假，Rx)。(图5A)NHP免疫疗法实验的方案。(图5B)暴露后对存活监测50周。(图5C)暴露后还每月评估CYR变化达50周。(图5D)在尸检时，通过对猴肺中的细菌学负荷(CFU)计数来量化细菌。(图5E)从NHP收获的肺组织的H&E染色切片的组织学外观。

图6显示了处理(图6A)6周和(图6B)12周后的肺log₁₀CFU计数。

图7显示了疗法结束后的细菌生长。

发明详述

如本文中描述的，本公开内容一般涉及与抗TB化疗剂组合使用治疗性TB疫苗治疗活动性TB感染的组合物和方法，其可以导致缩短的治疗时间，TB杆菌的清除，和潜在限制MDR-TB的传播。

一般而言，本发明的治疗性疫苗组合物包含结核复合物中分枝杆菌物种的至少两种异源多肽。结核复合物中分枝杆菌物种包括那些在传统上认为引起疾病结核病的物种，及在免疫受损患者(诸如AIDS患者)中引起结核病和肺疾病的分枝杆菌环境和机会性物种，例如结核分枝杆菌(Mtb)，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，或非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)，BCG，鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)，胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)，隐藏分枝杆菌(Mycobacterium celatum)，日内瓦分枝杆菌(Mycobacterium genavense)，嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilum)，堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)，猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)，母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)，偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)，和瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)(见例如Harrison’sPrinciples of Internal Medicine,第1卷，第1004-1014页和第1019-1020页)。在一个优选的实施方案中，要依照本发明预防，治疗或诊断的分枝杆菌物种是结核分枝杆菌(Mtb)。来自分枝杆菌物种的抗原的序列是容易地可得到的。例如，结核分枝杆菌序列可以参见Cole等,Nature 393:537(1998)，并且可以在网站(诸如由维康基金会(Wellcome Trust)，桑格研究院(Sanger Institute)和巴斯德研究所(Institut Pasteur)维护的网站)上找到。

在某些实施方案中，治疗性疫苗包含融合多核苷酸，融合多肽，或组合物，如记载于美国专利申请公开文本No.2010/0129391(通过提及将其完整内容明确收入本文)。

例如，在某些具体的实施方案中，治疗性疫苗包含分离的融合多肽或蛋白质，或其编码多核苷酸，其包含两种或更多种共价连接的结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段的组合，其中所述抗原选自下组：Rv0164，Rv0496，Rv2608，Rv3020，Rv3478，Rv3619，Rv3620，Rv1738，Rv1813，Rv3810，Rv2389，Rv2866，Rv3876，Rv0054，Rv0410，Rv0655，Rv0831，Rv1009，Rv1099，Rv1240，Rv1288，Rv1410，Rv1569，Rv1789，Rv1818，Rv1860，Rv1886，Rv1908，Rv2220，Rv2032，Rv2623，Rv2875，Rv3044，Rv3310，Rv3881，Rv0577，Rv1626，Rv0733，Rv2520，Rv1253，Rv1980，Rv3628，Rv1884，Rv3872，Rv3873，Rv1511和Rv3875，和与任何前述序列具有至少90％同一性的抗原，如记载于美国专利申请公开文本No.2010/0129391的。

在一些实施方案中，治疗性疫苗包含分离的融合多肽，其包含(a)来自结核复合物中分枝杆菌物种的抗原Rv3620和Rv2608的组合，并且所述抗原是共价连接的，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，治疗性疫苗包含分离的融合多肽，其包含(a)来自结核复合物中分枝杆菌物种的抗原Rv1813，Rv3620，和Rv2608的组合，并且所述抗原是共价连接的，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，治疗性疫苗包含融合多肽，其包含分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813的组合，或与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813是结核分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。在一些实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO:1中所列的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO:2中所列的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，治疗性疫苗包含融合多肽，其包含分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813的组合，或与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813是结核分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813。在一些实施方案中，融合多肽包含SEQ ID NO:3或4中所列的序列，或与SEQ ID NO:3或4具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，抗原Rv1813包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原Rv3620包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原Rv2608包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原Rv3619包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。本领域技术人员会理解，可以去除一个或多个N端氨基酸(诸如信号序列)。

在一个更具体的实施方案中，治疗性疫苗包含ID93融合蛋白，或其编码多核苷酸，其包含4种属于与毒力(Rv2608，Rv3619，Rv3620)或潜伏(Rv1813)有关的Mtb蛋白家族的抗原，如记载于美国专利申请公开文本No.2010/0129391(通过提及将其完整内容明确收入本文)。

在一些具体的进一步实施方案中，将融合蛋白(例如ID93融合蛋白)配制为疫苗。在进一步具体的实施方案中，治疗性疫苗包含稳定的水包油乳剂(SE)和GLA，即一种合成的TLR-4激动剂(GLA)，如记载于美国专利申请公开文本No.2008/0131466的(通过提及将其完整内容明确收入本文)。本领域普通技术人员会理解，在一些实施方案中，治疗性疫苗包含来自本领域中已知的结核复合物中分枝杆菌物种的分离的多肽，分离的融合多肽或片段(例如抗原性/免疫原性部分)。可以使用常规的重组和/或合成技术制备本公开内容的Mtb多肽，其抗原性/免疫原性片段，和其它变体。

在一些实施方案中，与一种或多种有效针对结核分枝杆菌感染的化疗剂一起施用核酸分子或融合蛋白。此类化疗剂的例子包括但不限于阿米卡星(amikacin)，氨基水杨酸(aminosalicylic acid)，卷曲霉素(capreomycin)，环丝氨酸(cycloserine)，乙胺丁醇(ethambutol)，乙硫异烟胺(ethionamide)，异烟肼(isoniazid)，卡那霉素(kanamycin)，吡嗪酰胺(pyrazinamide)，利福霉素(rifamycin)(即利福平(rifampin)，利福喷汀(rifapentine)和利福布丁(rifabutin))，链霉素(streptomycin)，氧氟沙星(ofloxacin)，环丙沙星(ciprofloxacin)，克拉霉素(clarithromycin)，阿奇霉素(azithromycin)和氟喹诺酮(fluoroquinolone)。根据治疗内科医生的判断确定此类化学疗法，使用优选的药物组合。用于治疗不是药物抗性的结核分枝杆菌感染的“一线”化疗剂包括异烟肼，利福平，乙胺丁醇，链霉素和吡嗪酰胺。用于治疗已经表明对一种或多种“一线”药物的药物抗性的结核分枝杆菌感染的“二线”化疗剂包括但不限于氧氟沙星，环丙沙星，乙硫异烟胺，氨基水杨酸，环丝氨酸，阿米卡星，卡那霉素和卷曲霉素。

在一些实施方案中，在施用一种或多种有效针对结核分枝杆菌感染的化疗剂之前，同时，或之后对具有活动性TB的哺乳动物施用治疗性疫苗。在一些实施方案中，同时(即在相同时间)施用化疗剂。或者，在几分钟诸如约1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50分钟，几小时诸如约1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21小时，或甚至几天诸如约1，2，3，4，5，或6天内施用化疗剂。在一些实施方案中，在治疗性疫苗前约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12周施用化疗剂。在一个实施方案中，在开始施用一种或多种化疗剂后约2周施用核酸分子或融合蛋白。一般地，在一段时间里施用一种或多种化疗剂，例如约1，2，3，或4周，或约2，3，4，5，6或8个月，或约1年或更长。

在一些实施方案中，在具有活动性TB感染的哺乳动物中用于刺激免疫应答的包含核酸分子，融合多肽，或疫苗的治疗性组合物的首次施用继之以核酸，融合多肽，或疫苗的一次或多次后续施用。例如，核酸分子或融合多肽的首次施用继之以核酸分子或融合蛋白的一次或多次后续施用。在一个实施方案中，核酸分子或融合多肽的首次施用继之以融合多肽的一次或多次后续施用。在一个实施方案中，核酸分子或融合多肽的首次施用继之以核酸分子的一次或多次后续施用。通常，相隔约2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12周，或相隔长达约4，5，或6个月给予第一次或第二次或后续施用。相隔约6个月，或相隔长达1，2，3，4或5年给予进一步的施用。

在另一个方面，在用于降低或缩短化学疗法针对结核分枝杆菌感染的时间过程的方法中采用组合物，所述方法包括对已经感染有结核分枝杆菌的哺乳动物施用一种或多种有效针对结核分枝杆菌感染的化疗剂和免疫学有效量的药物组合物，其包含来自结核复合物中分枝杆菌物种的融合多肽(例如ID93)或其免疫原性片段和佐剂，其中所述ID93融合多肽诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答，由此容许降低或缩短化学疗法针对结核分枝杆菌感染的时间过程。通常，核酸分子，融合多肽，或疫苗的施用会容许6个月，5个月，4个月，3个月，或更少时间内针对结核分枝杆菌感染的有效化学治疗性处理。

本公开内容的组合物和方法通常对人施用，但是在其它哺乳动物，包括家养哺乳动物(即犬，猫，家兔，大鼠，小鼠，豚鼠，仓鼠，毛丝鼠(chinchillas))和农业哺乳动物(即母牛，猪，绵羊，山羊，马)中是有效的。

定义

在本说明书中，术语“约”和“基本上由…组成”意指指定范围，数值或结构的±20％，除非另外指示。应当理解，如本文中使用的，术语“一个”和“一种”指“一个/种或多个/种”列举的组分。备选(例如“或”)的使用应当理解为意指备选的一个，两个，或其任何组合。如本文中使用的，术语“包括”，“具有”和“包含”同义使用，该术语及其变型意图解释为非限制性的。

“化学治疗”，“化疗剂”或“化学疗法方案”是用于治疗感染或暴露于结核分枝杆菌的任何物种的患者或在其治疗中的药物或药物组合，并且包括但不限于阿米卡星，氨基水杨酸，卷曲霉素，环丝氨酸，乙胺丁醇，乙硫异烟胺，异烟肼(INH)，卡那霉素，吡嗪酰胺，利福霉素(即利福平，利福喷汀和利福布丁)，链霉素，氧氟沙星，环丙沙星，克拉霉素，阿奇霉素和氟喹诺酮及本领域中的其它衍生物类似物或生物仿制药。“一线”化疗剂是用于治疗不是药物抗性的结核分枝杆菌感染的化疗剂，并且包括但不限于异烟肼，利福平，乙胺丁醇，链霉素和吡嗪酰胺及本领域中的其它衍生物类似物或生物仿制药。用于治疗已经表明对一种或多种“一线”药物的药物抗性的结核分枝杆菌感染的“二线”化疗剂包括但不限于氧氟沙星，环丙沙星，乙硫异烟胺，氨基水杨酸，环丝氨酸，阿米卡星，卡那霉素和卷曲霉素及本领域中的其它衍生物类似物或生物仿制药。

如本文中使用的，“改善化学疗法方案的功效”指缩短实现期望的临床结果需要的治疗持续时间，降低实现期望的临床结果需要的不同化疗剂的数目，降低实现期望的临床结果需要的化疗剂的剂量，降低与活动性临床感染有关的宿主或宿主器官的病理学，改善通过方法治疗的宿主或宿主器官的存活力，降低MDR-TB株的形成或发生和/或提高患者对化学疗法方案的顺从性。

如本文中使用的，“治疗性Mtb组合物”指能够在对具有活动性TB感染的宿主施用时引发有益的针对结核分枝杆菌的免疫应答的组合物。“有益的免疫应答”指减轻活动性TB疾病的体征或症状，降低杆菌计数，降低与活动性TB疾病有关的病理学，引发与疾病消退有关的合适细胞因子概况，扩充抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞，或改善化学疗法方案的功效的免疫应答。公开的治疗性Mtb组合物包括但不限于通过本领域中已知的方法在药学可接受配制剂中投递的编码多肽的多核苷酸，多肽，抗原性片段，肽，并且包括疫苗配制剂。

“宿主”，“受试者”，“患者”，“哺乳动物”或“个体”在本文中均可互换使用。

如本文中使用的，“结核分枝杆菌”，“Mtb”，“细菌”，“杆菌”均指造成引起哺乳动物中的TB疾病的细菌。

“药物抗性”结核分枝杆菌感染指如下的结核分枝杆菌感染，其中感染菌株不被一种或多种有效治疗结核分枝杆菌感染的所谓的“前线”化疗剂(例如异烟肼，利福平，乙胺丁醇，链霉素和吡嗪酰胺)保持抑制(static)或杀死(对其有抗性)。

“多药抗性”，“MDR-TB”结核分枝杆菌感染指如下的结核分枝杆菌感染，其中感染菌株对两种或更多种有效治疗结核分枝杆菌感染的“前线”化疗剂有抗性。如本文中使用的，多药抗性结核分枝杆菌感染还指“广泛药物抗性结核病”(“XDR-TB”)，如在2006年10月被世界卫生组织全球工作组(World Health Global task Force)定义为对任何一种氟喹诺酮类(FQ)和至少一种可注射药物诸如卡那霉素，阿米卡星，和卷曲霉素具有抗性的多药抗性TB。

如本文中使用的，“活动性结核病”，“活动性TB”，“TB疾病”，“TB”或“活动性感染”指哺乳动物(例如灵长类诸如人)中的如下疾病，状况或状态，其中Mtb细菌活跃倍增并且侵入哺乳动物的器官，并且引起症状或将要引起体征，症状或其它临床表现，最常在肺中(肺活动性TB)或者可以是由于宿主的最初感染所致的。活动性TB的临床症状可以包括虚弱，疲劳，发热，寒意，重量减轻，食欲丧失，厌食，或盗汗。肺活动性TB症状包括持续几周(例如至少3周)的咳嗽，稠粘液，胸痛，和咯血。如本文中使用的，“再活化结核病”指在具有LTBI的个体中形成并且其中感染的休眠病灶的活化导致活跃倍增的Mtb细菌的活动性TB。如本文中使用的，“活跃倍增”指在受感染宿主的器官中以指数，对数，或半对数速率增殖，繁殖，扩充或活跃倍增的Mtb细菌。在某些实施方案中，受感染的哺乳动物(例如人)具有受抑制的免疫系统。免疫抑制可以是由于年龄(例如非常年轻或年老)或者由于其它因素(例如物质滥用，器官移植)或其它状况，诸如另一种感染(例如HIV感染)，多尿症(例如糖尿病)，硅肺(silicosis)，头和颈癌，白血病，何杰金(Hodgkin)氏病，肾病，较低的体重，皮质类固醇治疗，或关节炎(例如类风湿性关节炎)或克罗恩(Crohn)氏病的治疗，等等。

用于测定由活跃倍增的Mtb细菌引起的活动性TB或状况的存在的测试是本领域中已知的，并且包括但不限于抗酸染色(AFS)和痰，支气管肺泡灌洗液，胸腔积液，组织活检，脑脊液流出物的直接显微检查；细菌培养，诸如BACTEC MGIT 960(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)；IGR测试，包括-Gold，或-Gold In-tube T SPOT^TM TB，皮肤测试，诸如TST曼托(Mantoux)皮肤测试(TST)；和抗原刺激后全血或分离的PBMC的胞内细胞因子染色。

如本文中使用的，“潜伏性结核感染”，“LTBI”，“潜伏”，或“潜伏性疾病”，“休眠感染”指如下的结核分枝杆菌(MTB)感染，它已经为宿主免疫系统遏制，导致潜伏，所述潜伏以恒定的低细菌数目为特征，但是还可以含有细菌群体中的至少一部分保持为活跃代谢状态，包括以稳定维持状态繁殖。潜伏性TB感染在没有活动性TB疾病的体征，症状或射线照片证据的情况中在临床上通过阳性TST或IGRA确定。潜伏性感染的哺乳动物不是“传染性的”，并且由于与潜伏性感染有关的非常低的细菌计数而不能传播疾病。用一种或多种药物治疗潜伏性结核感染(LTBI)以杀死休眠的细菌。治疗LTBI大大降低感染后来在生命中进展至活动性结核病(TB)的风险(即其为了预防再活化而给予)。

“结核复合物中分枝杆菌物种”包括那些在传统上认为引起疾病结核病的物种，及在免疫受损患者(诸如AIDS患者)中引起结核病和肺疾病的分枝杆菌环境和机会性物种，例如结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，或非洲分枝杆菌，BCG，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，隐藏分枝杆菌，日内瓦分枝杆菌，嗜血分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，猿分枝杆菌，母牛分枝杆菌，偶发分枝杆菌，和瘰疬分枝杆菌(见例如Harrison’s Principles of Internal Medicine,第150章，第953页-第966页(第16版,Braunwald等编,2005))。

如本文中使用的，“进行性原发性结核病(Progressive PrimaryTuberculosis)”指在最初暴露于Mtb及被Mtb感染后前几年内由于宿主免疫系统不能充分遏制初始感染而形成的TB疾病。

如本文中公开的，“治疗方法”一般指与化学治疗性处理方案联合使用治疗性疫苗治疗哺乳动物中的活动性结核感染的方法。会理解，在本公开内容的此方法和相关方法中，施用治疗性疫苗的至少一个步骤(通常是施用治疗性疫苗的初始步骤)会在哺乳动物活动性感染有结核分枝杆菌和/或展现出与活动性感染有关的至少一种临床症状或阳性测定结果时发生。还会理解，本公开内容的方法可以进一步包括如下的别的步骤：在此后的一个或多个别的时间点时施用本公开内容的相同或另一种治疗性疫苗，无论活动性感染或其症状是否仍然存在于哺乳动物中，且无论与活动性感染有关的测定结果是否仍然呈阳性，以改善化学疗法方案的功效。还会理解，本公开内容的方法可以包括单独或与其它药剂联合施用治疗性疫苗，因而治疗性疫苗可以是多种治疗成分之一，作为更宽的治疗性处理方案的一部分。因而，有利地，本公开内容的方法改善化学疗法治疗方案用于治疗活动性结核感染的功效。

多肽组合物

如记录的，在一个方面，本公开内容提供了如本文中描述的分离的分枝杆菌多肽，包括融合多肽，和含有它的组合物，及其与化疗剂组合用于治疗活动性TB感染的用途。一般地，本公开内容的多肽会是分离的多肽，并且可以是来自本文中公开的氨基酸序列的片段(例如抗原性/免疫原性部分)，或者可以包含本文中公开的整个氨基酸序列。可以使用常规重组和/或合成技术来制备本公开内容的多肽，其抗原性/免疫原性片段，和其它变体。

在某些实施方案中，本公开内容的多肽是抗原性的/免疫原性的，即它们在免疫测定法(诸如ELISA或T细胞刺激测定法)内与来自受感染受试者的抗血清和/或T细胞发生可检测反应。可以使用熟练技术人员公知的技术实施免疫原性活性的筛选。例如，可以使用诸如那些记载于Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988的方法等方法实施此类筛选。在一个例示性的例子中，可以将多肽在固体支持物上固定化，并与患者血清接触以容许血清内的抗体结合固定化的多肽。然后，可以去除未结合的血清，并使用例如¹²⁵I标记的蛋白A检测结合的抗体。

如熟练技术人员会认可的，本公开内容还涵盖本文中公开的多肽的免疫原性部分。如本文中使用的，“免疫原性部分”指本公开内容的免疫原性多肽的如下片段，其自身与识别多肽的B细胞和/或T细胞表面抗原受体有免疫学反应性(即特异性结合)。一般可以使用公知的技术，诸如Paul,FundamentalImmunology,第3版,243-247(Raven Press,1993)及其中引用的参考文献中汇总的那些技术鉴定免疫原性部分。此类技术包括对多肽筛选与抗原特异性抗体，抗血清和/或T细胞系或克隆起反应的能力。如本文中使用的，若抗血清和抗体特异性结合抗原(即，它们在免疫测定法中与蛋白质起反应，并且与无关蛋白质的反应检测不到)，则它们是“抗原特异性的”。可以如本文中描述的那样，并且使用公知的技术制备此类抗血清和抗体。

在一个具体的实施方案中，本公开内容的多肽的抗原性/免疫原性部分是以没有实质性小于全长多肽的反应性的水平与抗血清和/或T细胞起反应的部分(例如在ELISA和/或T细胞反应性测定法中)。优选地，抗原性/免疫原性部分的免疫原性活性的水平是全长多肽的免疫原性的至少约50％，优选至少约70％，且最优选大于约90％。在一些情况中，会鉴定优选的免疫原性部分，其具有比相应全长多肽大的免疫原性活性水平，例如具有相似或大于约100％或150％或更多的免疫原性活性。

本公开内容的多肽组合物也可以包含一种或多种与针对本公开内容的多肽(特别是具有本文中公开的氨基酸序列的多肽)或针对其免疫原性片段或变体生成的T细胞和/或抗体有免疫学反应性的多肽。

在本公开内容的另一个实施方案中，提供了如下的多肽，其包含一种或多种能够引发T细胞和/或抗体的多肽，所述T细胞和/或抗体与本文中描述的一种或多种多肽或由本文中公开的多核苷酸序列中含有的连续多核苷酸序列或在中等至高严格性条件下与这些序列中的一种或多种杂交的一种或多种多核苷酸序列编码的一种或多种多肽有免疫学反应性，或其免疫原性片段或变体。

本公开内容还提供了多肽片段，包括抗原性/免疫原性片段，其包含本文中所列的多肽组合物或由本文中所列的多核苷酸序列编码的多肽组合物的至少约5，10，15，20，25，50，或100个连续氨基酸，或更多，包括所有中间长度。

在另一个方面，本公开内容提供了本文中描述的多肽组合物的变体。本公开内容一般涵盖的多肽变体(例如本文中描述的任何抗原和融合多肽)通常会沿着其长度与本文中所列的多肽序列展现出至少约70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多的同一性(如下文描述的那样测定)。

多肽“变体”在该术语在本文中使用时指通常与本文中明确公开的多肽相差一处或多处替代，删除，添加和/或插入的多肽。此类变体可以是天然存在的或者可以是合成生成的，例如使用本领域中公知的许多技术之任一种通过修饰本公开内容的上述多肽序列中的一种或多种并评估其免疫原性活性，如本文中描述的那些进行。

例如，本公开内容的多肽的某些例示性变体包括已经去除一个或多个部分(诸如N端前导序列或跨膜域)的变体。其它例示性变体包括已经自成熟蛋白的N和/或C端去除小部分(例如约1-30个氨基酸)的变体。

在许多情况中，变体会含有保守替代。“保守替代”指如下的替代，即将一个氨基酸用具有相似特性的另一个氨基酸替代，使得肽化学领域的技术人员会预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。如上文描述的，可以对本公开内容的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍然获得编码具有期望特征(例如具有免疫原性特征)的变体或衍生物多肽的功能性分子。在期望改变多肽的氨基酸序列以创建本公开内容的多肽的等同物或甚至改良的免疫原性变体或部分时，本领域技术人员通常会依照表A改变编码DNA序列的一个或多个密码子。

例如，可以在没有与诸如例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点等结构的相互作用性结合能力的可察觉损失的情况中用某些氨基酸替换蛋白质结构中的其它氨基酸。由于限定蛋白质生物学功能活性的正是蛋白质的相互作用能力和性质，可以对蛋白质序列以及当然其根本的DNA编码序列进行某些氨基酸序列替代，并且仍然获得具有类似特性的蛋白质。如此，涵盖的是，可以在其生物学效用或活性没有可察觉损失的情况中对公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列进行各种改变。

表A

在进行此类改变中，可以考虑氨基酸的水疗指数(hydropathic index)。本领域中一般理解水疗氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用生物学功能中的重要性(Kyte和Doolittle,1982，通过提及将其收入本文)。公认的是，氨基酸的相对水疗特征促成所得蛋白质的二级结构，其继而限定蛋白质与其它分子(例如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等)的相互作用。每种氨基酸已经基于其疏水性和电荷特征分配水疗指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些数值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本领域中已知某些氨基酸可以用具有相似水疗指数或得分的其它氨基酸替代，并且仍然得到具有相似生物学活性的蛋白质，即仍然获得生物学功能等同蛋白质。在进行此类改变中，水疗指数在±2内的氨基酸的替代是优选的，水疗指数在±1内的氨基酸的替代是特别优选的，且水疗指数在±0.5内的氨基酸的替代是甚至更特别优选的。本领域中还理解，可以基于亲水性有效进行类似氨基酸的替代。

如美国专利4,554,101中详述的，已经将下列亲水性数值(hydrophilicityvalue)分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解，可以用一种氨基酸替代具有相似亲水性数值的另一种，并且仍然获得生物学等同的且特别是免疫学等同的蛋白质。在此类改变中，亲水性数值在±2内的氨基酸的替代是优选的，亲水性数值在±1内的氨基酸的替代是特别优选的，且亲水性数值在±0.5内的氨基酸的替代是甚至更特别优选的。

因此，如上文概述的，氨基酸替代一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性，亲水性，电荷，大小，等等。考虑各种前述特征的例示性替代是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬氨酸；及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。

另外，可以进一步修饰任何多核苷酸以提高体内稳定性。可能的修饰包括但不限于在5’和/或3’端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯连接；和/或包括非传统的碱基，诸如肌苷(inosine)，Q核苷(queosine)和怀丁苷(wybutosine)，及腺苷，胞苷，鸟苷，胸苷和尿苷的乙酰基，甲基，硫代和其它修饰形式。

可以进一步基于残基的极性，电荷，溶解度，疏水性，亲水性和/或两亲性性质的相似性进行氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有不带电荷的极性头基且具有相似亲水性数值的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守变化的其它组的氨基酸包括：(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。变体还可以或备选含有非保守变化。在一个优选的实施方案中，变体多肽与天然序列相差5个氨基酸或更少的替代，删除或添加。还(或备选)可以例如通过删除或添加对多肽的免疫原性，二级结构和水疗性质具有最小影响的氨基酸来修饰变体。

如上文记录的，多肽可以包含在蛋白质的N端末端的信号(或前导)序列，其以共翻译或翻译后方式指导蛋白质的转移。也可以将多肽与接头或其它序列缀合以易于多肽的合成，纯化或鉴定(例如polyHis)或者增强多肽对固体支持物的结合。例如，可以将多肽与免疫球蛋白Fc区缀合。

在比较多肽序列时，若两种序列中的氨基酸序列在为了最大对应性而比对时是相同的，则说两种序列是“同一的”，如下文描述的。通常通过在比较窗里比较序列以鉴定及比较序列相似性的局部区域来实施两种序列间的比较。如本文中使用的，“比较窗”指至少约20个连续位置，通常30至约75个，40至约50个的区段，其中可以在将两种序列最佳比对后将序列与相同数目的连续位置的参照序列比较。

可以使用Lasergene生物信息学软件包(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中的Megalign程序使用缺省参数进行序列的最佳比对以进行比较。此程序包括以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model ofevolutionary change in proteins–Matrices for detecting distant relationships.InDayhoff,M.O.(编)Atlas of Protein Sequence and Structure,NationalBiomedical Research Foundation,Washington DC,第5卷,增刊3,第345-358页；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes,第626-645页,Methods in Enzymology,第183卷,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy–the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.(1983)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 80:726-730。

或者，可以通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同一性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin遗传学软件包,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA)，或者通过检查进行序列的最佳比对以进行比较。

适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个优选的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别记载于Altschul等(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。可以使用BLAST和BLAST 2.0(例如以本文中描述的参数)来测定本公开内容的多核苷酸和多肽的百分比序列同一性。公众可经由国家生物技术信息中心得到用于实施BLAST分析的软件。对于氨基酸序列，可以使用评分矩阵计算积累得分。每个方向的词命中的延伸在如下情况时停止：积累比对得分自其最大实现值下降数量X；积累得分由于积累一个或多个负评分残基比对而变为0或以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W，T和X决定比对的灵敏度和速度。

在一个优选的方法中，通过在至少20个位置的比较窗里比较两种最佳比对的序列来测定“序列同一性百分比”，其中为了两种序列的最佳比对，与参照序列(其不包含添加或删除)相比，多肽序列在比较窗中的部分可以包含20％或更小，通常5至15％，或10至12％的添加或删除(即缺口)。如下计算百分比，即测定这两种序列中出现相同氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以参照序列中的位置总数(即窗大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。

在本公开内容的某些优选的实施方案中，提供了结核分枝杆菌融合多肽，和编码融合多肽的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白指如下的多肽，其具有直接或经由氨基酸接头共价连接的至少两种异源分枝杆菌物种多肽，诸如结核分枝杆菌多肽。形成融合蛋白的多肽通常以C端至N端连接，尽管它们也可以以C端至C端，N端至N端，或N端至C端连接。融合蛋白的多肽可以为任何次序。融合多肽或融合蛋白也可以包括构成融合蛋白的抗原的保守修饰变体，多态性变体，等位基因，突变体，亚序列，物种间同系物，和免疫原性片段。结核分枝杆菌抗原记载于Cole等,Nature 393:537(1998)，其披露了整个结核分枝杆菌基因组。可以例如使用序列比较算法(如本文中描述的)或本领域技术人员已知的其它方法(例如杂交测定法和抗体结合测定法)鉴定与结核分枝杆菌抗原对应的来自其它分枝杆菌物种的抗原。

本公开内容的融合多肽一般包含如本文中描述的至少两种抗原性多肽，并且可以进一步包含其它无关序列，诸如帮助提供T辅助表位(免疫学融合配偶体)，优选地受人识别的T辅助表位的序列，或者帮助以比天然重组蛋白更高的产量表达蛋白质的序列(表达增强子)。某些优选的融合配偶体既是免疫学的又是表达增强性的融合配偶体。其它融合配偶体可以选择为使得提高蛋白质的溶解度或者使蛋白质能够被靶向至期望的胞内区室。还有又一些融合配偶体包含亲和标签，其促进蛋白质的纯化。

一般地，可以使用标准技术制备融合蛋白。优选地，以重组蛋白表达融合蛋白。例如，可以将编码期望融合物的多肽组分的DNA序列分开装配，并连接入合适的表达载体中。用或不用肽接头将编码一种多肽组分的DNA序列的3’端与编码第二种多肽组分的DNA序列的5’端连接，从而序列的阅读框是同步的。这容许翻译成保留这两种组分多肽的生物学活性的单一融合蛋白。

若想要的话，可以采用肽接头序列将第一和第二多肽组分分开一定的距离，其足以确保每种多肽折叠成其二级和三级结构。可以使用本领域中公知的标准技术将此类肽接头序列掺入融合蛋白中。可以基于下列因素选择某些肽接头序列：(1)其采取柔性延伸构象的能力；(2)其不能采取能与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)能与多肽功能性表位起反应的疏水性或带电荷的残基的缺乏。优选的肽接头序列含有Gly，Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸(诸如Thr和Ala)也可以在接头序列中使用。可以有用地作为接头采用的氨基酸序列包括那些在Maratea等,Gene 40:39-46(1985)；Murphy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262(1986)；美国专利No.4,935,233和美国专利No.4,751,180中披露的。接头序列的长度一般可以是1至约50个氨基酸。在第一和第二多肽具有非必要N端氨基酸区时不需要接头序列，所述非必要N端氨基酸区可以用于分开功能域并且防止空间干扰。

将连接后的DNA序列与合适的转录或翻译调节元件可操作连接。负责DNA表达的调节元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5’。类似地，结束翻译需要的终止密码子和转录终止信号仅存在于编码第二多肽的DNA序列的3’。

在优选的实施方案内，供本公开内容的融合多肽中使用的免疫学融合配偶体衍生自蛋白D，即革兰氏阴性细菌乙型流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza B)的一种表面蛋白(WO 91/18926)。优选地，蛋白D衍生物包含蛋白质的大致前三分之一(例如N端的前100-110个氨基酸)，并且蛋白D衍生物可以是脂质化的。在某些优选的实施方案内，在N端上包含脂蛋白D融合配偶体的前109个残基以给多肽提供额外的外源T细胞表位及提高大肠杆菌中的表达水平(如此发挥表达增强子的功能)。脂质尾部确保抗原对抗原呈递细胞的最佳呈递。其它融合配偶体包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。通常，使用N端81个氨基酸，尽管可以使用包含T辅助表位的不同片段。

在另一个实施方案中，免疫学融合配偶体包含自称为LYTA的蛋白或其部分(优选C端部分)衍生的氨基酸序列。LYTA衍生自肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)，其合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；Gene 43:265-292(1986))。LYTA是一种特异性降解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LYTA蛋白的C端域负责对胆碱或一些胆碱类似物诸如DEAE的亲和力。已经利用此特性开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。已经描述了在氨基端含有C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化(见Biotechnology 10:795-798(1992))。在一个优选的实施方案内，可以将LYTA的重复部分掺入融合蛋白中。重复部分存在于残基178处开始的C端区中。一种特别优选的重复部分掺入残基188-305。

一般地，多肽和融合多肽(及其编码多核苷酸)是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是自其初始环境取出的。例如，若天然存在的蛋白质自天然系统中的一些或所有共存材料分出，则其是分离的。优选地，此类多肽是至少约90％纯的，更优选至少约95％纯的，且最优选至少约99％纯的。如果例如将多核苷酸克隆入并非天然环境一部分的载体中，那么认为其是分离的。

多核苷酸组合物

在另一个方面，本公开内容还提供了分离的多核苷酸，特别是编码本公开内容的融合多肽(例如ID93)的分离的多核苷酸，及包含此类多核苷酸的组合物。如本文中使用的，术语“DNA”和“多核苷酸”和“核酸”指已经分离，不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。因此，编码多肽的DNA区段指含有一种或多种编码序列，但基本上自获得DNA区段的物种的总基因组DNA分离出来或纯化出来的DNA区段。术语“DNA区段”和“多核苷酸”内包括DNA区段及此类区段的更小片段，以及还有重组载体，包括例如质粒，粘粒，噬菌粒，噬菌体，病毒，等等。

如本领域技术人员会理解的，本公开内容的多核苷酸序列可以包括表达或可以适应表达蛋白质，多肽，肽等的基因组序列，基因组外的和质粒编码的序列和更小的工程化基因区段。此类区段可以是天然分离的，或者人工合成修饰的。

如熟练技术人员会认可的，多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组，cDNA或合成的)或RNA分子。别的编码或非编码序列可以但不需要存在于本公开内容的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不需要与其它分子和/或支持材料连接。多核苷酸可以包含天然序列(即编码分枝杆菌抗原或其部分的内源序列)或者可以包含此类序列的变体，或生物学或抗原性功能性等同物。多核苷酸变体可以含有一处或多处替代，添加，删除和/或插入，如下文进一步描述的，优选使得编码多肽的免疫原性相对于天然蛋白质没有降低。一般可以评估对编码多肽的免疫原性的影响，如本文中描述的。术语“变体”还涵盖异种起源的同源基因。

在其它实施方案中，本公开内容提供了如下的分离的多核苷酸，其包含与本文中公开的一种或多种序列同一或互补的序列的各种长度的连续延伸。例如，本公开内容提供了如下的多核苷酸，其包含本文中公开的一种或多种序列的至少约15，20，30，40，50，75，100，150，200，300，400，500或1000或更多个连续核苷酸及其间的所有中间长度。会容易理解，“中间长度”在此背景中意指引用数值间的任何长度，诸如16，17，18，19，等等；21，22，23，等等；30，31，32，等等；50，51，52，53，等等；100，101，102，103，等等；150，151，152，153，等等；包括通过200-500；500-1,000，等等的所有整数。

不管编码序列自身的长度如何，本公开内容的多核苷酸或其片段可以与其它DNA序列(诸如启动子，多聚腺苷酸化信号，额外的限制酶位点，多克隆位点，其它编码区段等)组合，使得其总体长度可以相当大地变化。因此，涵盖的是，可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选受易于制备和在意图的重组DNA方案中使用限制。

此外，本领域普通技术人员会领会，由于遗传密码的简并性，存在有编码如本文中描述的多肽的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些携带与任何天然基因的核苷酸序列的最小程度同源性。不过，由于密码子选择差异而变化的多核苷酸是本公开内容明确涵盖的，例如针对人和/或灵长类密码子选择经过优化的多核苷酸。此外，包含本文中提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本公开内容的范围内。等位基因是由于一处或多处突变(诸如核苷酸的删除，添加和/或替代)而改变的内源基因。所得的mRNA和蛋白质可以但不需要具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(诸如杂交，扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。

可以使用本领域中已知且可用的多种完善建立的技术之任一种制备，操作和/或表达分枝杆菌多核苷酸及其融合物。

例如，可以在重组DNA分子中使用编码本公开内容的多肽或其融合蛋白或功能等同物的多核苷酸序列或其片段以指导多肽在合适宿主细胞中的表达。由于遗传密码的固有简并性，可以生成编码基本上相同或功能上等同的氨基酸序列的其它DNA序列，并且可以使用这些序列来克隆和表达给定的多肽。

如本领域技术人员会理解的，在一些情况中，可能有利的是生成拥有非天然存在密码子的多肽编码核苷酸序列。例如，可以选择特定原核或真核宿主偏爱的密码子以提高蛋白质表达的速率或者生成具有期望特性(诸如比自天然存在序列生成的转录物的半衰期更长的半衰期)的重组RNA转录物。

此外，可以使用本领域中公知的方法工程化改造本公开内容的多核苷酸序列以改变多肽编码序列，这出于多种原因，包括但不限于修饰基因产物的克隆，加工，表达和/或免疫原性的改变。

为了表达期望的多肽，可以将编码多肽或功能等同物的核苷酸序列插入合适的表达载体，即含有插入编码序列转录和翻译必需的元件的载体。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建表达载体，该表达载体含有编码感兴趣多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术，和体内遗传重组。此类技术记载于Sambrook等,MolecularCloning,A Laboratory Manual(1989)，及Ausubel等,Current Protocols inMolecular Biology(1989)。多种表达载体/宿主系统是已知的，并且可以用于容纳及表达多核苷酸序列。这些包括但不限于微生物，诸如用重组噬菌体，质粒，或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。

表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非翻译区，即增强子，启动子，5’和3’非翻译区，它们与宿主细胞蛋白相互作用以实施转录和翻译。此类元件可以在其强度和特异性上有所变化。根据利用的载体系统和宿主，可以使用许多合适的转录和翻译元件，包括组成性和诱导型启动子。例如，在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，诸如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,La Jolla,Calif.)或PSPORT1质粒(GibcoBRL,Gaithersburg,Md.)的杂合lacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子一般是优选的。若必需生成含有多个拷贝的编码多肽的序列的细胞系，则基于SV40或EBV的载体可以与合适的选择标志一起有利使用。

在细菌系统中，许多表达载体可以基于表达多肽意图的用途选择。例如，在需要较大数量时，可以使用指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，诸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可以将编码感兴趣多肽的序列连接入载体，符合β-半乳糖苷酶的氨基端Met和随后7个残基的序列的读码框，从而生成杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.264:5503-5509(1989))等等。也可以使用pGEX载体(Promega,Madison,Wis.)以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白表达外来多肽。一般地，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附至谷胱甘肽-琼脂糖珠，接着在存在游离的谷胱甘肽的情况中洗脱自裂解的细胞容易地纯化出来。在此类系统中生成的蛋白质可以设计为包含肝素，凝血酶，或因子XA蛋白酶切割位点，从而可以自GST模块随意释放克隆的感兴趣多肽。

在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用许多含有组成性或诱导型启动子诸如α因子，醇氧化酶，和PGH的载体。对于综述，见Ausubel等(见上文)和Grant等,Methods Enzymol.153:516-544(1987)。

在使用植物表达载体的情况中，编码多肽的序列的表达可以由多种启动子之任一种驱动。例如，病毒启动子诸如CaMV的35S和19S启动子可以单独或与来自TMV的Ω前导序列组合使用(Takamatsu,EMBO J.6:307-311(1987))。或者，可以使用植物启动子诸如RUBISCO的小亚基或热休克启动子(Coruzzi等,EMBO J.3:1671-1680(1984)；Broglie等,Science 224:838-843(1984)；及Winter等,Results Probl.Cell Differ.17:85-105(1991))。可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体导入植物细胞中。此类技术记载于许多一般可得的综述(见例如Hobbs in McGraw Hill,Yearbook of Scienceand Technology,第191-196页(1992))。

也可以使用昆虫系统来表达感兴趣多肽。例如，在一种此类系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外来基因。可以将编码多肽的序列克隆入病毒的非必需区，诸如多角体蛋白基因，并且置于多角体蛋白启动子的控制下。多肽编码序列的成功插入会使多角体蛋白基因无活性，并且生成缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后，可以使用重组病毒感染例如可以表达感兴趣多肽的草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫(Engelhard等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:3224-3227(1994))。

在哺乳动物宿主细胞中，许多基于病毒的表达系统一般是可用的。例如，在使用腺病毒作为表达载体的情况中，可以将编码感兴趣多肽的序列连接入由晚期启动子和三元前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。可以使用在病毒基因组的非必需E1或E3区中的插入来获得活病毒，其能够在受感染的宿主细胞中表达多肽(Logan和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3655-3659(1984))。另外，可以使用转录增强子(诸如劳斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)增强子)来提高哺乳动物宿主细胞中的表达。

也可以使用特定的启动信号来实现编码感兴趣多肽的序列的更有效翻译。此类信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。在将编码多肽的序列，其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体中的情况中，可能不需要别的转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其部分的情况中，应当提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应当在正确的阅读框中以确保整个插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是各种起源的，即天然的和合成的两者。可以通过纳入适合于使用的特定细胞系统的增强子(诸如记载于文献(Scharf等,Results Probl.Cell Differ.20:125-162(1994))中的增强子)增强表达的效率。

另外，可以对宿主细胞株选择其调控插入序列表达或以期望方式加工表达蛋白质的能力。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂质化，和酰化。也可以使用切割蛋白质的“前原”形式的翻译后加工来促进正确插入，折叠和/或功能。可以选择对于此类翻译后活性而言具有特定的细胞机器和特征性的机制的不同宿主细胞(诸如CHO，HeLa，MDCK，HEK293，和W138)以确保对外来蛋白质的正确修饰和加工。

对于重组蛋白的长期，高产量生成，稳定表达一般是优选的。例如，可以使用表达载体转化稳定表达感兴趣多核苷酸的细胞系，所述表达载体可以在同一载体上或在分开的载体上含有病毒复制起点和/或内源表达元件和选择标志基因。在导入载体后，可以容许细胞在滋养培养基中生长1-2天，之后将它们转换成选择培养基。选择标志的目的是赋予针对选择的抗性，并且其存在容许成功表达导入序列的细胞的生长和回收。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化细胞的抗性克隆。

可以使用许多选择系统来回收经转化的细胞系。这些包括但不限于可以分别在tk^-或aprt^-细胞中采用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,Cell11:223-232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等,Cell 22:817-823(1990))基因。还有，可以使用抗代谢物，抗生素或除草剂抗性作为选择基础；例如，赋予针对甲氨蝶呤的抗性的dhfr(Wigler等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3567-70(1980))；赋予针对氨基糖苷，新霉素和G-418的抗性的npt(ColbereGarapin等,J.Mol.Biol.150:1-14(1981))；和分别赋予针对氯磺隆(chlorsulfuron)和膦丝菌素乙酰转移酶的抗性的als或pat(Murry,见上文)。已经描述了别的选择基因，例如trpB(其容许细胞利用吲哚替换色氨酸)，或hisD(其容许细胞利用组氨醇(histinol)替换组氨酸)(Hartman和Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8047-51(1988))。可见标志物的使用已经获得普及，此类标志物如花色素苷，β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物GUS，和萤光素酶及其底物萤光素，不仅广泛用于鉴定转化体，而且还用于量化可归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白质表达的量(Rhodes等,Methods Mol.Biol.55:121-131(1995))。

使用对产物特异性的多克隆或单克隆抗体检测及测量多核苷酸编码的产物的表达的多种方案是本领域中已知的。例子包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射性免疫测定法(RIA)，和荧光活化细胞分选(FACS)。这些和其它测定法记载于Hampton等,Serological Methods,a Laboratory Manual(1990)及Maddox等,J.Exp.Med.158:1211-1216(1983)，等等。

极其多种标记物和缀合技术是本领域技术人员已知的，并且可以在多种核酸和氨基酸测定法中使用。用于生成经标记的杂交或PCR探针以检测与多核苷酸相关的序列的手段包括使用经标记的核苷酸进行的寡聚物标记，切口平移，末端标记或PCR扩增。或者，可以将序列或其任何部分克隆入载体中以生成mRNA探针。此类载体是本领域中已知的，是商品化的，并且可以用于通过添加合适的RNA聚合酶(诸如T7，T3，或SP6)和经标记的核苷酸在体外合成RNA探针。可以使用多种商品化试剂盒进行这些规程。可以使用的合适的报告分子或标记物包括放射性核素，酶，荧光剂，化学发光剂，或生色剂及底物，辅因子，抑制剂，磁珠，等等。

可以在适合于自细胞培养物表达和回收蛋白质的条件下培养用感兴趣多核苷酸序列转化的宿主细胞。根据使用的序列和/或载体，由重组细胞生成的蛋白质可以分泌或在胞内容纳。如本领域技术人员会理解的，含有本公开内容的多核苷酸的表达载体可以设计为含有信号序列，其指导编码的多肽分泌穿过原核或真核细胞膜。可以使用其它重组构建来将编码感兴趣多肽的序列与编码会促进可溶性蛋白质纯化的多肽域的核苷酸序列连接。

在重组生成方法外，可以使用固相技术通过直接肽合成来生成本公开内容的多肽及其片段(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。可以使用手动技术或者通过自动化实施蛋白质合成。可以例如使用AppliedBiosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动化合成。或者，可以分开化学合成各个片段，并使用化学方法组合以生成全长分子。

药物组合物和疫苗组合物

在另一个方面，本公开内容关注药学可接受或生理学可接受溶液中的本文中公开的一种或多种多核苷酸，多肽或其它组合物的配制剂，其用于单独地或与一种或多种其它疗法形态组合地对细胞或动物施用。此类药物组合物在用合适的免疫刺激剂/佐剂系统配制时作为疫苗使用是特别优选的。组合物还适合于在诊断背景中使用。

还会理解，若想要的话，本公开内容的组合物也可以与其它药剂(诸如例如其它蛋白质或多肽或各种药学活性剂)组合施用。对还可以包括的其它组分实际上没有限制，只要别的药剂不对依照本公开内容的目标引起显著的不利作用。

在某些优选的实施方案中，将本公开内容的组合物作为疫苗使用，并且与一种或多种免疫刺激剂组合配制。免疫刺激剂可以是增强或加强针对外源抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的例子包括佐剂，生物可降解微球体(例如聚乳交酯(polylactic galactide))和脂质体(其中掺入化合物；见例如Fullerton,美国专利No.4,235,877)。疫苗制备一般记载于例如Powell和Newman编,Vaccine Design(亚基和佐剂方法)(1995)。

可以在本公开内容的疫苗中采用多种免疫刺激剂之任一种。例如，可以包含佐剂。许多佐剂含有设计为保护抗原免于快速代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答的刺激剂，诸如脂质A(天然的或合成的)，百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或分枝杆菌物种或分枝杆菌衍生的蛋白质。合适的佐剂是可购得的，如例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)；Merck佐剂65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2及其衍生物(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.)；CWS，TDM，Leif，铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙，铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈(polyphosphazene)；生物可降解微球体；单磷酰脂质A和Quil A。细胞因子(诸如GM-CSF或白介素-2，-7，或-12)也可以作为佐剂使用。

可用于本公开内容的背景的其它例示性佐剂包括Toll样受体激动剂，诸如TLR7激动剂，TLR7/8激动剂，等等。还有其它例示性佐剂包括咪喹莫特(imiquimod)，Gardiquimod，瑞喹莫德(resiquimod)，和相关化合物。

某些优选的疫苗采用设计为诱导主要为Th1型的免疫应答的佐剂系统。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ，TNF-αβ，IL-2和IL-12)趋向于有利于诱导细胞介导的针对施用抗原的免疫应答。比较而言，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)趋向于有利于诱导体液免疫应答。在应用如本文中提供的疫苗后，患者会支持包括Th1和Th2型应答的免疫应答。在一个优选的实施方案(其中应答主要是Th1型的)内，Th1型细胞因子的水平会以比Th2型细胞因子的水平更大的程度升高。可以使用标准测定法容易地评估这些细胞因子的水平。关于细胞因子家族的综述，见Mossman和Coffman,Ann.Rev.Immunol.7:145-173(1989)。

在引发主要为Th1型应答中使用的某些佐剂包括例如单磷酰脂质A(优选3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL^TM))与铝盐一起的组合(美国专利No.4,436,727；4,877,611；4,866,034；及4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也诱导主要是Th1的应答。此类寡核苷酸是公知的，并且记载于例如WO 96/02555，WO 99/33488和美国专利No.6,008,200和5,856,462。免疫刺激性DNA序列也由例如Sato等,Science 273:352(1996)描述。另一种例示性佐剂包含皂角苷，诸如Quil A，或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.,Framingham,Mass.)；七叶树皂角素(Escin)；洋地黄皂苷(Digitonin)；或石头花(Gypsophila)或藜麦(Chenopodium quinoa)皂角苷。其它例示性配制剂在本公开内容的佐剂组合中包括超过一种皂角苷，例如下组的至少两种的组合：QS21，QS7，Quil A，β-七叶树皂角素，或洋地黄皂苷。

在其它实施方案中，佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(glucopyranosyl lipid A,GLA)佐剂，如记载于美国专利申请公开文本No.2008/0131466的，通过提及将其公开内容完整收入本文。例如，在一个实施方案中，本公开内容的背景中使用的GLA佐剂具有以下结构：

其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烃基；且R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烃基。

在一个更具体的实施方案中，GLA具有上文列出的式，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C_11-14烃基；且R²和R⁴是C_12-15烃基。

在一个更具体的实施方案中，GLA具有上文列出的式，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₁₃烃基。

在一些实施方案中，佐剂是具有以下结构的GLA佐剂(例如合成的)：

在上述GLA结构的某些实施方案中，R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烃基；且R²和R⁴是C₉-C₂₀烃基。在一个更具体的实施方案中，R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₁₃烃基。在另一个更具体的实施方案中，R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₀烃基；且R²和R⁴是C₈烃基。在上述GLA结构的某些实施方案中，R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烃基；且R²和R⁴是C₉-C₂₀烃基。在某些实施方案中，R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₉烃基。

在某些实施方案中，佐剂是具有以下结构的GLA佐剂(例如合成的)：

在上述GLA结构的某些实施方案中，R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烃基；且R²和R⁴是C₉-C₂₀烃基。在某些实施方案中，R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₉烃基。

在某些实施方案中，佐剂是具有以下结构的合成GLA佐剂：

在一个具体的实施方案中，佐剂系统包括单磷酰脂质A和皂角苷衍生物的组合，诸如QS21和3D-MPL^TM佐剂的组合，如记载于WO 94/00153的，或反应原性较小的组合物，其中QS21用胆固醇淬灭，如记载于WO 96/33739的。其它配制剂包含水包油乳剂和生育酚。在水包油乳剂中采用QS21，3D-MPL^TM佐剂和生育酚的另一种佐剂配制剂记载于WO 95/17210。

另一种增强型佐剂系统牵涉含有CpG的寡核苷酸和皂角苷衍生物的组合，如WO 00/09159中披露的。其它例示性佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic,France)，SAF(Chiron,Calif.,United States)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，SBAS佐剂系列(例如SBAS-2，AS2’，AS2”，SBAS-4，或SBAS6，可购自SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium)，Detox，RC-529(Corixa,Hamilton,Mont.)和其它氨基烃基氨基葡糖苷4-磷酸(AGP)，诸如那些记载于悬而未决的美国专利申请流水号08/853,826和09/074,720的，通过提及将其公开内容完整收入本文，和聚氧乙烯醚佐剂，诸如那些记载于WO 99/52549 A1的。

本公开内容的组合物还可以或备选包含对分枝杆菌抗原特异性的T细胞。一般可以使用标准规程在体外或离体制备此类细胞。例如，可以自患者的骨髓，外周血，或骨髓或外周血的级分分离T细胞。或者，可以自相关或无关人，非人哺乳动物，细胞系或培养物衍生T细胞。

可以用本公开内容的多肽，编码此类多肽的多核苷酸，和/或表达此类多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。在一定条件下将此类刺激实施一定时间，所述条件和时间足以容许生成对多肽特异性的T细胞。优选地，多肽或多核苷酸存在于投递媒介物(诸如微球体内)以促进特异性T细胞的生成。

若T细胞特异性增殖，分泌细胞因子或杀死包被有多肽或表达编码多肽的基因的靶细胞，则认为T细胞对本公开内容的多肽是特异性的。可以使用多种标准技术之任一种评估T细胞特异性。例如，在铬释放测定法或增殖测定法内，与阴性对照相比在裂解和/或增殖方面升高超过两倍的刺激指数指示T细胞特异性。可以如例如Chen等,Cancer Res.54:1065-1070(1994)所述实施此类测定法。或者，可以通过多种已知技术实现T细胞增殖的检测。例如，可以通过测量升高的DNA合成速率来检测T细胞增殖(例如通过用氚化胸苷脉冲标记T细胞培养物，并测量掺入DNA中的氚化胸苷的量)。与本公开内容的多肽(100ng/ml-100μg/ml，优选200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天应当导致T细胞增殖升高至少两倍。如上所述接触2-3小时应当导致T细胞活化，如使用标准细胞因子测定法测量的，其中细胞因子释放(例如TNF或IFN-γ)水平升高两倍指示T细胞活化(见Coligan等,Current Protocols in Immunology,第1卷(1998))。已经响应多肽，多核苷酸或表达多肽的APC而活化的T细胞可以是CD4⁺和/或CD8⁺的。可以使用标准技术扩充蛋白质特异性T细胞。在优选的实施方案内，自患者，相关供体或无关供体衍生T细胞，并且在刺激和扩充后对患者施用。

在本公开内容的药物组合物中，药学可接受赋形剂和载体溶液的配制是本领域普通技术人员公知的，正如为在多种治疗方案中使用本文中描述的具体组合物而进行的合适剂量给药和治疗方案的开发，包括例如口服，胃肠外，静脉内，鼻内，和肌肉内施用和配制剂。

在某些应用中，可以经由口服施用对受试者投递本文中公开的药物组合物。因此，可以用惰性稀释剂或用可同化的可食用的载体配制这些组合物，或者可以将它们封装在硬或软壳明胶胶囊中，或者可以将它们压制成片剂，或者可以将它们直接掺入饮食食物。

在某些情况中，会期望胃肠外，静脉内，肌肉内，或甚至腹膜内投递本文中公开的药物组合物，如记载于例如美国专利No.5,543,158；美国专利No.5,641,515和美国专利No.5,399,363(通过提及明确将每篇完整收入本文)。可以在水中与表面活性剂(诸如羟丙纤维素)适当混合来制备作为游离碱或药理学可接受盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油，液体聚乙二醇，及其混合物中及在油中制备分散体。在贮存和使用的普通条件下，这些制备物含有防腐剂以阻止微生物生长。

适合于可注射使用的药用形式包括无菌水性溶液或分散体和用于临场制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利No.5,466,468，通过提及明确将其完整收入本文)。在所有情况中，形式必须是无菌的，并且流动程度必须达到存在容易的可注射性。它在制备和贮存的条件下必须是稳定的，并且必须针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用提供防护。载体可以是含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇，等)的溶剂或分散介质，其合适的混合物，和/或植物油。例如，可以通过使用涂层(诸如卵磷脂)，在分散体的情况中通过维持需要的粒度及通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，山梨酸，硫柳汞，等等)促进针对微生物作用的防护。在许多情况中，会优选包含等张剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)带来可注射组合物的吸收延长。

对于水性溶液中的胃肠外施用，例如溶液在必要时应当适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些具体的水性溶液尤其适合于静脉内，肌肉内，皮下和腹膜内施用。在此背景中，鉴于本公开内容，可以采用的无菌水性介质会是本领域技术人员已知的。例如，可以在1ml等张NaCl溶液中溶解一个剂量，并且添加至1000ml皮下输液流体或在建议的输注部位注射(见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。剂量的少许变化必然会随所治疗的受试者的状况而发生。在任何情况中，负责施用的人会确定适合于受试者个体的剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足无菌性，致热原性，和一般安全性和纯度标准，如FDA生物制品标准办公室要求的。

可以如下制备无菌可注射溶液，即将需要量的活性化合物掺入根据需要具有上文列举的各种其它成分的合适溶剂中，接着过滤除菌。一般地，如下制备分散体，即将各种经灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中，该无菌媒介物含有基础分散介质和需要的来自上文所列的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，它们自其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何别的期望成分的粉末。

可以将本文中公开的组合物配制成中性或盐形式。药学可接受盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成)和与无机酸(诸如例如氢氯酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等)形成的。也可以自无机碱(诸如例如氢氧化钠，钾，铵，钙，或铁)和有机碱(诸如异丙胺，三甲胺，组氨酸，普鲁卡因等)衍生与游离羧基基团形成的盐。在配制后，会以与剂量配制剂相容的方式及以诸如治疗有效的量施用溶液。以多种剂量形式(诸如可注射溶液，药物释放胶囊等等)容易地施用配制剂。

如本文中使用的，“载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，媒介物，涂层，稀释剂，抗细菌剂和抗真菌剂，等张剂和吸收延迟剂，缓冲剂，载体溶液，悬浮液，胶体等等。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中公知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，涵盖其在治疗性组合物中的使用。也可以将补充性活性成分掺入组合物中。

短语“药学可接受”指在对人施用时不产生过敏或类似不利反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备是本领域中充分理解的。通常，此类组合物以可注射物(作为液体溶液或悬浮液)制备；也可以制备适合于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式。也可以将制备物乳化。

在某些实施方案中，可以通过鼻内喷雾，吸入，和/或其它气雾剂投递媒介物投递药物组合物。用于经由鼻气雾剂喷雾直接对肺投递基因，多核苷酸，和肽组合物的方法已经记载于例如美国专利No.5,756,353及美国专利No.5,804,212(通过提及明确将每篇完整收入本文)。同样地，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等,1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利No.5,725,871，通过提及明确将每篇完整收入本文)投递药物也是药物领域中公知的。同样地，聚四氟乙烯支持物基质形式的透粘膜药物投递记载于美国专利No.5,780,045(通过提及将其完整内容明确收入本文)。

在某些实施方案中，可以通过使用脂质体，纳米胶囊，微粒，微球体，液体颗粒，囊泡等发生投递，用于将本公开内容的组合物导入合适的宿主细胞中。具体地，可以配制本公开内容的组合物以进行投递，包囊在液体颗粒，脂质体，囊泡，纳米球体，纳米颗粒等中。可以使用已知且常规的技术实施此类投递媒介物的配制和使用。

例示性的实施方案

1.一种用于治疗哺乳动物中的活动性结核感染的方法，所述方法包括对具有活动性结核感染的哺乳动物施用化疗剂和免疫学有效量的治疗性疫苗的步骤，其中所述疫苗包含含有来自结核复合物中分枝杆菌物种的Mtb抗原或其免疫原性片段的药物组合物。

2.实施方案1的方法，其中所述治疗性疫苗包含分离的融合多肽，其包含两种或更多种共价连接的结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段的组合，其中所述抗原选自下组：Rv0164，Rv0496，Rv2608，Rv3020，Rv3478，Rv3619，Rv3620，Rv1738，Rv1813，Rv3810，Rv2389，Rv2866，Rv3876，Rv0054，Rv0410，Rv0655，Rv0831，Rv1009，Rv1099，Rv1240，Rv1288，Rv1410，Rv1569，Rv1789，Rv1818，Rv1860，Rv1886，Rv1908，Rv2220，Rv2032，Rv2623，Rv2875，Rv3044，Rv3310，Rv3881，Rv0577，Rv1626，Rv0733，Rv2520，Rv1253，Rv1980，Rv3628，Rv1884，Rv3872，Rv3873，Rv1511和Rv3875，和与任何前述序列具有至少90％同一性的抗原。

3.实施方案1的方法，其中所述治疗性疫苗包含ID93融合多肽，其中所述ID93融合多肽包含分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。

4.实施方案3的方法，其中所述分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813是结核分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。

5.实施方案3的方法，其中所述ID93融合多肽包含SEQ ID NO:1中所列的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

6.实施方案1的方法，其中所述活动性结核感染与虚弱，疲劳，发热，寒意，重量减轻，食欲丧失，厌食，盗汗，或其任何组合的临床症状有关。

7.实施方案1的方法，其中所述活动性结核感染是肺活动性TB感染。

8.实施方案7的方法，其中所述肺活动性结核感染与持续性咳嗽，稠粘液，胸痛，咯血，或其任何组合的临床症状有关。

9.实施方案1的方法，其中所述活动性结核感染以Mtb细菌为特征，所述Mtb细菌在哺乳动物的器官中以指数，对数，或半对数速率增殖，繁殖，扩充或活跃倍增。

10.实施方案1的方法，其中所述活动性结核感染是使用选自下组的测定法鉴定的：抗酸染色(AFS)测定法；细菌培养测定法，诸如BACTEC MGIT 960测定法；IGR测试，诸如-Gold测试或-Gold In-tube T SPOT^TM TB测试；皮肤测试，诸如TST Mantoux皮肤测试(TST)；和抗原刺激后全血或分离的PBMC的胞内细胞因子染色。

11.实施方案1的方法，其中所述活动性结核感染是结核分枝杆菌的活动性原发性感染。

12.实施方案1的方法，其中所述活动性结核感染是再活化结核感染。

13.实施方案1的方法，其中所述哺乳动物感染有多药抗性(MDR)结核分枝杆菌。

14.实施方案1的方法，其中所述哺乳动物先前免疫接种了卡介苗(BCG)。

15.实施方案1的方法，其中所述哺乳动物是人。

16.实施方案1的方法，其进一步包括施用一种或多种有效治疗结核分枝杆菌感染的化疗剂。

17.实施方案16的方法，其中所述一种或多种化疗剂是异烟肼，利福平，或其组合。

18.实施方案16的方法，其中首先在一段时间里对所述哺乳动物施用一种或多种化疗剂，随后施用治疗性疫苗。

19.实施方案16的方法，其中首先对所述哺乳动物施用治疗性疫苗，随后在一段时间里施用一种或多种化疗剂。

20.实施方案16的方法，其中所述一种或多种化疗剂和所述治疗性疫苗的施用是同时的。

21.实施方案1的方法，其进一步包括随后一次或多次对所述哺乳动物施用所述治疗性疫苗，其中在所述随后一次或多次时在所述哺乳动物中保留的结核感染可以是或不是活动性结核感染。

22.实施方案1的方法，其中所述疫苗进一步包含佐剂。

23.实施方案22的方法，其中所述佐剂是GLA，其具有如下的结构：

24.实施方案23的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C_11-14烃基；且R²和R⁴是C_12-15烃基。

25.实施方案23的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₁₃烃基。

26.一种用于缩短化学疗法针对活动性结核感染的时间过程的方法，所述方法包括对具有活动性结核感染的哺乳动物施用一种或多种有效针对结核分枝杆菌的化疗剂和免疫学有效量的治疗性疫苗，其中所述疫苗包含含有来自结核复合物中分枝杆菌物种的融合多肽或其免疫原性片段的药物组合物，且其中所述融合多肽诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答，由此提供化学疗法针对活动性结核分枝杆菌感染的缩短的时间过程。

27.实施方案26的方法，其中所述融合多肽包含两种或更多种共价连接的结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段的组合，其中所述抗原选自下组：Rv0164，Rv0496，Rv2608，Rv3020，Rv3478，Rv3619，Rv3620，Rv1738，Rv1813，Rv3810，Rv2389，Rv2866，Rv3876，Rv0054，Rv0410，Rv0655，Rv0831，Rv1009，Rv1099，Rv1240，Rv1288，Rv1410，Rv1569，Rv1789，Rv1818，Rv1860，Rv1886，Rv1908，Rv2220，Rv2032，Rv2623，Rv2875，Rv3044，Rv3310，Rv3881，Rv0577，Rv1626，Rv0733，Rv2520，Rv1253，Rv1980，Rv3628，Rv1884，Rv3872，Rv3873，Rv1511和Rv3875，和与任何前述序列具有至少90％同一性的抗原。

28.实施方案27的方法，其中所述融合多肽包含ID93融合多肽，其包含抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。

29.实施方案28的方法，其中所述ID93融合多肽包含SEQ ID NO:1中所列的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

30.实施方案26的方法，其中化学疗法的时间过程缩短至不超过约3个月，约5个月，或约7个月。

31.实施方案26的方法，其中所述疫苗进一步包含佐剂。

32.实施方案31的方法，其中所述佐剂是GLA，其具有如下的结构：

33.实施方案32的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C_11-14烃基；且R²和R⁴是C₁₂-₁₅烃基。

34.实施方案32的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₁₃烃基。

35.一种用于治疗诊断有活动性结核感染的患者的方法，所述方法包括对患者施用化疗剂和免疫学有效量的治疗性疫苗，其中所述疫苗包含药物组合物，其包含来自结核复合物中分枝杆菌物种的Mtb抗原或其免疫原性片段。

36.实施方案35的方法，其中所述患者是人。

37.实施方案35的方法，其中所述治疗性疫苗包含分离的融合多肽，其包含两种或更多种共价连接的结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段的组合，其中所述抗原选自下组：Rv0164，Rv0496，Rv2608，Rv3020，Rv3478，Rv3619，Rv3620，Rv1738，Rv1813，Rv3810，Rv2389，Rv2866，Rv3876，Rv0054，Rv0410，Rv0655，Rv0831，Rv1009，Rv1099，Rv1240，Rv1288，Rv1410，Rv1569，Rv1789，Rv1818，Rv1860，Rv1886，Rv1908，Rv2220，Rv2032，Rv2623，Rv2875，Rv3044，Rv3310，Rv3881，Rv0577，Rv1626，Rv0733，Rv2520，Rv1253，Rv1980，Rv3628，Rv1884，Rv3872，Rv3873，Rv1511和Rv3875，和与任何前述序列具有至少90％同一性的抗原。

38.实施方案35的方法，其中所述治疗性疫苗包含ID93融合多肽，其中所述ID93融合多肽包含分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。

39.实施方案38的方法，其中所述分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813是结核分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。

40.实施方案38的方法，其中所述ID93融合多肽包含SEQ ID NO:1中所列的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

41.实施方案35的方法，其中所述活动性结核感染与虚弱，疲劳，发热，寒意，重量减轻，食欲丧失，厌食，盗汗，或其任何组合的临床症状有关。

42.实施方案35的方法，其中所述活动性结核感染是肺活动性TB感染。

43.实施方案42的方法，其中所述肺活动性结核感染与持续性咳嗽，稠粘液，胸痛，咯血，或其任何组合的临床症状有关。

44.实施方案35的方法，其中所述活动性结核感染以Mtb细菌为特征，所述Mtb细菌在患者的器官中以指数，对数，或半对数速率增殖，繁殖，扩充或活跃倍增。

45.实施方案35的方法，其中所述活动性结核感染是使用选自下组的测定法鉴定的：抗酸染色(AFS)测定法；细菌培养测定法，诸如BACTEC MGIT960测定法；IGR测试，诸如-Gold测试或-Gold In-tube T SPOT^TMTB测试；皮肤测试，诸如TST Mantoux皮肤测试(TST)；和抗原刺激后全血或分离的PBMC的胞内细胞因子染色。

46.实施方案35的方法，其中所述活动性结核感染是结核分枝杆菌的活动性原发性感染。

47.实施方案35的方法，其中所述活动性结核感染是再活化结核感染。

48.实施方案35的方法，其中所述患者感染有多药抗性(MDR)结核分枝杆菌。

49.实施方案35的方法，其中所述患者先前免疫接种了卡介苗(BCG)。

50.实施方案35的方法，其中所述患者是哺乳动物。

51.实施方案35的方法，其进一步包括施用一种或多种有效治疗结核分枝杆菌感染的化疗剂。

52.实施方案51的方法，其中所述一种或多种化疗剂是异烟肼，利福平，或其组合。

53.实施方案51的方法，其中首先在一段时间里对所述患者施用一种或多种化疗剂，随后施用治疗性疫苗。

54.实施方案51的方法，其中首先对所述患者施用治疗性疫苗，随后在一段时间里施用一种或多种化疗剂。

55.实施方案51的方法，其中所述一种或多种化疗剂和所述治疗性疫苗的施用是同时的。

56.实施方案35的方法，其进一步包括随后一次或多次对所述患者施用所述治疗性疫苗，其中在所述随后一次或多次时在所述患者中保留的结核感染可以是或不是活动性结核感染。

57.实施方案35的方法，其中所述疫苗进一步包含佐剂。

58.实施方案57的方法，其中所述佐剂是GLA，其具有如下的结构：

59.实施方案58的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C_11-14烃基；且R²和R⁴是C_12-15烃基。

60.实施方案58的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₁₃烃基。

提供以下实施例作为例示而不作为限制。

实施例1：活动性TB感染的TB复发和再活化的SWR/J小鼠模型的开发

雌性，年龄匹配(4-6周)的SWR/J和C57BL/6小鼠分别购自Jackson andCharles River Laboratories。使用UW-Madison气雾剂室用Mtb H37Rv(ATCC#35718)的低剂量(50-100个细菌)气雾剂(LDA)感染小鼠。在感染后15，30和100天通过本领域中已知的方法测定具有活动性感染的小鼠中存在的杆菌数目，即肺中的活细菌数目(5只小鼠/组)。符号标示均值+/-标准偏差。具有活动性TB感染的SWR/J和C57BL/6品系，将小鼠如描述的那样用MtbH37Rv感染(8只小鼠/组)，并且监测存活。为了了解化疗剂对模型的影响，感染后15天，对小鼠的一个子集开始施用连续30，60或90天(Rx 30d，Rx 60d，Rx 90d)的异烟肼(INH)(以85mg/L饮用水)和利福平(RIF)(以50mg/L饮用水)的药物方案。对小鼠的另一组在感染后30天时开始施用连续90天的异烟肼(INH)(以85mg/L饮用水)和利福平(RIF)(以50mg/L饮用水)(本文中统称为化疗剂处理)的药物方案。估计雌性小鼠饮用0.15-0.37mL/g(BachmanovAA等,2002)。Mtb H37Rv的最小抑制浓度是0.25μM(对于RIF)和1.0μM(对于INH)。

与C57BL/6小鼠(Russell等,2010)形成对比，且与先前的观察结果(Baldwin等,J of Immunology 2012)一致，SWR/J小鼠在Mtb感染后不能转变成慢性状态，如根据与C57BL/6小鼠相比SWR/J中增加中的病毒滴度指示的(图1A)，并且代表活动性MTB感染的模型。与假处理或化疗剂处理的C57/BL/6小鼠相比，假处理的SWR/J小鼠屈从于致死性Mtb感染，其中中值存活时间(MST)为116.5天，而用化疗剂(RIF/INH)处理90天的那些小鼠具有247.5天的MST(P<0.001；时序检验)(图1B)。

为了测定SWR/J小鼠中化疗剂处理的最佳长度，感染后第15天开始用RIF/INH对动物处理30，60，或90天或者接受化学疗法的另一组在暴露后第30天开始处理90天。监测存活曲线。观察到假处理或药物处理30(P<0.0005；时序检验)，60(P<0.05；时序检验)或90(P<0.005；时序检验)天的动物间存活和可回收的肺CFU的显著差异(图1C)。将化学疗法的启动从感染后15天改变至30天没有显著改变治疗的长期功效(P>0.50；时序检验)(图1C)。虽然60或90天的化学疗法足以将活的肺细菌数目减少得低于检测限(图1D)，但是这些治疗方案不足以实现SWR/J小鼠中Mtb的清除。

实施例2：在活动性TB感染的TB复发和再活化的SWR/J小鼠模型中评估TB疫苗ID93+化学疗法的治疗功效

先前已经证明了与TLR4拮抗剂GLA-SE一起配制的TB疫苗融合蛋白ID83和ID93或其组分抗原在以三剂施用时在小鼠和豚鼠模型中提供针对TB的预防性保护(Baldwin等,2009；Bertholet等,2010)。在活动性感染的SWR/J模型中测试ID93/GLA-SE疫苗以测定此配制剂是否会提供免疫治疗性益处，如通过CFU的降低或改善的存活测量的。将SWR/J小鼠(每组6或7只小鼠)用Mtb的LDA感染，如实施例1中描述的。15天后(第15天)，将小鼠假处理或用抗生素处理90天(Rx 90d)。还对每组中抗生素处理的小鼠的一个子集免疫接种。在抗生素治疗性处理期间(DTT；第15天，第36天，第57天)或之后(PTT；第107天，第128天，第149天)用与20μg GLA-SE一起配制的8μg ID93蛋白将小鼠免疫接种3次，相隔3周。通过随时间追踪存活并且通过铺板肺匀浆物测定治疗功效，如先前描述的(Bertholet等,2008)。活动性TB感染的SWR/J小鼠模型中治疗性施用的ID93/GLA-SE疫苗(--)提高感染后的存活频率(P<0.01)。

与单独的化学疗法(Rx)(-●-)相比，作为化学疗法的辅助用ID93/GLA-SE疫苗免疫接种(-■-)将CFU进一步降低0.643log10(P<0.05)(图2B)。与单独的化学疗法Rx(-●-)相比，在施用单独的GLA-SE佐剂加化学疗法(Rx+GLA-SE)的组间没有观察到肺CFU的差异(P>0.05)(图2B)。此外，由Rx+ID93/GLA-SE和Rx+GLA-SE组诱导的暴露后功效间存在有显著的差异(4.419±0.17对4.938±0.16log10,P<0.05)，这证明了这些研究中观察到的附加杀细菌效果是抗原依赖性的。

在90天化学疗法治疗之后(PTT)或期间(DTT)作为化学疗法的免疫治疗辅助施用疫苗分别在52％和67％Mtb感染小鼠中预防死亡(P<0.0001)(图2C)。

实施例3：作为化学疗法的辅助施用治疗性ID93/GLA-SE疫苗缩短延长活动性TB感染中的存活需要的药物疗法持续时间

在活动性TB感染的TB复发和再活化的SWR/J小鼠模型中实施别的实验以评估治疗性ID93/GLA-SE疫苗的施用是否能缩短延长活动性TB感染中的存活需要的药物疗法持续时间。用Mtb H37Rv的LDA感染SWR/J小鼠。15天后，将小鼠用抗生素处理60或90天，如先前描述的(分别为Rx 60d和Rx 90d)。在完成60天抗生素方案后，用与20μg GLA-SE一起配制的8μg ID93蛋白将小鼠免疫接种3次，相隔3周(Rx 60d+ID93/GLA-SE；第77天，第98天，第119天)。通过随时间监测由Mtb引起的动物死亡(7只小鼠/组)评估保护(认为P<0.05(时序检验)是显著的)。(B-M)用Mtb H37Rv攻击后肺组织的组织病理学评估。H&E切片中显示了炎性应答和肉芽肿(g)形成(B-I)，并且评估AFB(箭)的存在(J-M)。(B,F,J)假处理的小鼠，第106天；(C,J和K)90天抗生素疗法，第106天；(D,H,L)90天抗生素疗法+ID93/GLA-SE，第241天；(E,I和M)60天抗生素疗法+ID93/GLA-SE，第295天。显示的数据代表5只小鼠/组。

40％的接受90天单独化学疗法的动物(Rx90d；-▲-)在Mtb感染后存活(MST 214天)，而100％的在60天化学疗法后接受疫苗免疫疗法的动物(-●-)存活至少250天(P<0.05)(图3A)。这些研究证明了疫苗免疫疗法能将药物疗法的持续时间缩短至少1/3，同时在撤消化学疗法后预防死亡达延长的时段。

为了测定与ID93/GLA-SE组合的抗生素是否降低TB肺病理学，采集来自假，Rx，和Rx+ID93/GLA-SE处理的小鼠的切片以进行组织学分析(组织学发现呈现于表1(下文)和图3B-M中)。

表1：ID93/GLA-SE免疫疗法对Mtb感染的SWR/J的肺病理学的影响

^a数据代表每组3-5只动物

^b牵涉的肺组织的百分比：最小(等级1或<10％)；轻度(等级2或11-20％)；中度(等级3或21-40％)；明显(等级4或41-100％)

^c抗酸细菌(AFB)的数目/高倍视野(HPF)，600倍

^dMtb感染后15天启动90天INH/RIF化学疗法

^eMtb感染后15天启动60天INH/RIF化学疗法

^f施用化学疗法处理后将小鼠免疫接种3次，相隔3周。

假处理的小鼠的肺具有弥散性肺泡水肿(图3B，F)及表现为极大地发炎和坏死的肺实质的等级3-4(40-100％)累及，如先前报告的[29,38]，具有大量抗酸杆菌(>30/600倍高倍视野(HPF))(图3J)。单独的化学疗法(Rx90d)组的肺切片显示炎性损伤的明显消退(图3C，G)，仅具有稀少的杆菌(<1/HPF)(图3K；表1)。在第241天时，Rx 90d+ID93/GLA-SE小鼠的肺具有许多肉芽肿(图D，H)和少数杆菌(<6个生物体/HPF，600倍)(图3L；表1)。在第295天时，用60d抗生素处理且用ID93/GLA-SE免疫的小鼠的肺显示无显著损伤(图3E,I；表1)和少数杆菌(图3M)。

数据证明了与抗生素联合施用ID93/GLA-SE疫苗能用来缩短活动性TB感染中的标准化学疗法方案(图3A)。

实施例4：接受单独的化学疗法或化学疗法加ID93/GLA-SE疫苗接种的SWR/J小鼠中的免疫应答

经ID93刺激的脾细胞的细胞因子概况

将SWR/J小鼠用LDA Mtb H37Rv感染，并用90天单独的抗生素或抗生素及随后相隔3周用ID93/GLA-SE免疫接种三次处理，如实施例2中描述的。通过针对IFN-γ，IL-2，TNF，IL-5，IL-10，IL-13，和IL-17的多重珠阵列在存在抗原或仅培养基的情况中温育24小时后分析来自经ID93刺激的脾细胞的上清液的细胞因子概况(感染后第177天或241天)。框图显示了背景扣除后的中值和四分位距。P值来自Wilcoxon秩和检验。

感染后第149天和第177天时针对ID93特异性T细胞应答的胞内细胞因子染色。

将细胞在存在布雷菲尔德菌素A的情况中用ID93或培养基对照刺激8-12小时，用缀合有荧光染料的针对CD3，CD4，CD8，CD44，IFN-γ，IL-2和TNF的抗体染色，并通过FACS分析。(B和C)小图显示了用于FACS分析的门控方案。(D)下部小图中的框图显示了背景扣除后的中值和四分位距。P值来自Wilcoxon秩和检验。响应ID93的体外再刺激，代表促炎性及T_H1和T_H2功能组的细胞因子子集是显著上调的(图4A)。TNF(受感染的个体中Mtb特异性免疫的一种可溶性介质)在第241天时在用ID93/GLA-SE免疫接种的组中是显著上调的(P<0.05)。另外，检测出ID93特异性IFN-γ，IL-2，和IL-17应答，其与未接种疫苗的动物相比在接种疫苗的动物中是显著更高的。没有检出TH2型IL-5细胞因子浓度的显著差异，但是在第241天时测量到显著的ID93特异性IL-10和IL-13应答。

最近已经将多功能性CD4⁺T_H1细胞描述为针对硕大利什曼原虫(Leishmania major)的保护的关联物，并且已经牵涉限制人TB的疾病进展[39,40]。如此，检查生成IFN-γ，IL-2和TNF的CD4⁺和CD8⁺T细胞的频率以测定ID93特异性T细胞应答的表型(图4B-D；S2B)。与仅接受化学疗法的小鼠相比，在接受辅助性免疫疗法的小鼠中观察到ID93特异性多功能性三重阳性和IFN-γ⁺TNF⁺双重阳性CD4⁺T细胞的更高频率(P<0.05)(图4B-D)。观察到CD4⁺和CD8⁺T细胞子集两者中ID93特异性TNF的高背景应答，其可能是由于这些动物中正在进行的Mtb感染的升高的免疫活化所致。虽然CD8⁺T细胞中的ID93特异性应答在幅度上比那些在CD4⁺区室中观察到的应答低，在接受辅助性ID93/GLA-SE疫苗接种的小鼠存在有双重(IFN-γ⁺TNF⁺)和三重阳性(IFN-γ⁺IL-2⁺TNF⁺)CD8⁺T细胞的显著更高频率。这些数据共同显示尽管Mtb感染后存在有可以潜在引发和连续加强的许多抗原，但是作为抗生素的辅助施用的ID93/GLA-SE成功刺激显著更强力的，高质量(多功能性)的且持久的T_H1型抗ID93CD4⁺T细胞应答。

实施例5：在猕猴中ID93/GLA-SE作为抗生素处理的辅助

为了证明ID93/GLA-SE在NHP中作为抗生素的辅助施用时的安全性，在1个月RIF/INH抗生素后给猕猴施用三剂疫苗(图5A)。注射部位反应是最小限度的，仅仅具有刚能察觉的红斑和水肿(Draize量表范围0–1)，并且没有显著的体重和体温变化(数据未显示)。所有7只(100％)Rx+ID93/GLA-SE免疫接种的NHP存活至评估的最后一个时间点，而仅抗生素组中的6只NHP(85.7％)和假处理组中的3只NHP(42.8％，P＝0.44)存活至此点(图5B)。4只用Rx+ID93/GLA-SE处理的猴在实验结束前没有放射线学变化或消退Mtb感染(如通过先前阳性胸部X射线上肺浸润物证明的)，而接受单独的Rx或假处理的猕猴无一消退其Mtb感染，并且将胸部X射线保持为阳性(图5C)。根据与单独的Rx组相比时显示Mtb细菌数目的定量差异，40％的用Rx+ID93/GLA-SE处理的猕猴显著响应辅助性免疫疗法(P<0.05)(图5D)。有趣的是，具有更低CFU计数的Rx+ID93/GLA-SE猕猴在实验结束时也具有阴性胸部X-射线。根据组织病理学在组分配和疾病组织的存在之间也有关联，其中接受ID93/GLA-SE的动物含有几乎健康的器官，而盐水组具有最多的患病器官(p＝0.003)(图5E)。总体上，这些结果证明了ID93/GLA-SE疫苗在猕猴中作为暴露后免疫治疗剂是耐受良好的。

实施例6：接受单独的化学疗法或化学疗法加ID83/GLA-SE疫苗接种的BALB/c小鼠中的免疫应答

使用吸入暴露系统(Glas-Col,Terre Haute,IN)和目的为在肺中植入2.5-3.0个log10CFU而在7H9培养基中以10稀释的对数期培养物(600nm的光密度为1.0)，用结核分枝杆菌H37Rv感染6周龄雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver,Wilmington,MA)。如下制备结核分枝杆菌H37Rv，即用小鼠传代，以等分试样冷冻，并且在感染前在具有10％油酸-清蛋白-右旋糖-过氧化氢酶(OADC)(Fisher,Pittsburgh,PA)和0.05％Tween 80的Middlebrook 7H9培养基中传代培养。感染后1天处死5只小鼠以确认植入的细菌数目。将剩余的小鼠随机化至表2中指定的处理组。利福平(R)，异烟肼(H)和吡嗪酰胺(Z)的处理(统称RHZ)在感染后26天在第0天开始。将利福平和异烟肼(Sigma,St.Louis,MO)在蒸馏水中以1mg/ml分开稀释以生成剂量给药溶液。将吡嗪酰胺(FisherScientific,Suwanee,GA)在蒸馏水中以15mg/ml稀释以生成剂量给药溶液。每周制备溶液并且等份取样，并且在使用前保持于4℃。4个对照组接受药物媒介物(水)+GLA-SE佐剂，药物媒介物+ID83疫苗，RHZ+疫苗媒介物(盐水)，和RHZ+GLA-SE佐剂。测试组接受RHZ+ID83疫苗。通过管饲法每周5天施用RHZ和药物媒介物持续12周。在HZ或媒介物前至少1小时施用R或媒介物以避免先前描述的限制R吸收的药动学药物-药物相互作用。

将ID83配制为以GLA(GLA-SE)为佐剂的稳定水包油乳剂，即通过混合2ml GLA-SE(0.040mg/ml，4％油)，0.1ml ID83(0.2mg/ml)和1.9ml盐水(NaCl)制备4ml疫苗混合物。在使用前将疫苗制备物短暂涡旋振荡。皮下施用100μl疫苗。注射剂量是：2μg GLA-SE+/-0.5μg ID83。

在感染后6周(治疗RHZ启动后2周)开始受感染动物的疫苗接种。以3周时间间隔(即在处理2，5和8周后)在100微升中皮下施用三剂疫苗或对照(仅盐水或佐剂)。疫苗含有2微克GLA-SE佐剂和0.5微克ID83。对照包含仅盐水和仅佐剂。轮换注射部位。

表2：实验方案

媒介物是水；佐剂是GLA-SE；疫苗是ID83+GLA-SE

**第12+5周和第12+10周指示12周处理加上5和10周没有任何处理的随访后的时间点。

病理学评估。在无菌PBS中温育72小时后，且在均质化以进行定量培养前拍摄代表性肺的照片，以记录肺损伤的宏观外观。清洗另一个肺，并放置在10％中性缓冲福尔马林溶液中。将这些肺在石蜡中包埋，切片，在玻璃载玻片上固定，并用H&E和抗酸染料染色以检查组织病理学。

组织病理学评估。在分析前将CFU计数(x)对数转化为(x+1)。用Bonferroni氏事后检验通过单因素方差分析比较组均值。

结果

处理期间的肺CFU计数。D-26时的均值(±SD)肺log10CFU计数是2.78±0.21。处理开始(D0)时的均值CFU计数是7.60±0.23。在处理6周后，肺CFU计数在媒介物+佐剂和媒介物+疫苗组中下降约0.9个log10，而RHZ+盐水，RHZ+佐剂和RHZ+疫苗组中的CFU计数分别下落4.27，4.19和4.44个log10(图6A)。在处理12周后，药物媒介物处理组中的CFU计数很大程度上是稳定的，而用单独的抗生素(RHZ+盐水)处理的5只小鼠中的3只，用抗生素加TLR4佐剂(RHZ+佐剂)处理的4只小鼠中的2只，和用抗生素加ID83疫苗(RHZ+疫苗)处理的5只小鼠中的4只呈培养物阴性(图6)。

处理完成后的肺CFU计数。在停止任何处理后的5周随访后，每组中的5只小鼠中的4只具有阳性肺培养物(下文表3)。RHZ+盐水，RHZ+佐剂和RHZ+疫苗组中的均值肺log10CFU计数分别是1.14±1.14，0.72±0.49和0.63±0.42。排除培养物阴性小鼠，CFU计数分别是1.42±1.09，0.90±0.32，和0.78±0.27。在10周随访后，与RHZ+佐剂和RHZ+盐水组的5只小鼠中的3只相比，RHZ+疫苗组的5只小鼠中仅1只具有阳性培养物。排除培养物阴性小鼠，RHZ+盐水，RHZ+佐剂和RHZ+疫苗组中的均值肺log10CFU计数分别是1.82±1.85，1.37±1.56和0.75±1.68。在终止处理后10周时(图7)，用单独的RHZ+盐水或RHZ+佐剂处理的这两组中具有阳性肺培养物的三只动物中的CFU计数展现出对数细菌再生长，而RHZ+疫苗组中具有阳性肺培养物的唯一动物与其它两组相比展现出降低的细菌再生长。

虽然研究就CFU计数而言在统计学显著性方面不是有力的，但是这些数据证明了依照本发明的方法治疗活动性结核病导致结核病的体征或症状的持久改善，并且与单独的抗生素药物疗法相比提供化学疗法持续时间的缩短。

表3：12周处理及随后5或10周随访后具有阳性培养物的小鼠的百分比(比例)

通过提及将本说明书中提及和/或申请数据表中列出的所有上述美国专利，美国专利申请公开文本，美国专利申请，外国专利，外国专利申请和非专利出版物完整收入本文。

根据上述内容，应当领会虽然为了例示的目的已经在本文中描述了本发明的具体实施方案，可以在不偏离本发明的精神和范围的前提下做出各种修改。因而，除非根据所附权利要求书，本发明不受限制。

例示性的氨基酸序列

具有任选His标签的ID93融合多肽(SEQ ID NO：1)

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

ID93融合多肽(SEQ ID NO：2)

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具有任选His标签的ID83融合多肽(SEQ ID NO：3)

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

ID83融合多肽(SEQ ID NO：4)

HLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST

Rv1813(SEQ ID NO：5)

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Rv3620(SEQ ID NO：6)MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS

Rv2608(SEQ ID NO：7)

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Rv3619(SEQ ID NO：8)

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Claims

1.一种用于治疗哺乳动物中的活动性结核感染的方法，所述方法包括与一种或多种化疗剂一起对具有活动性结核感染的哺乳动物施用免疫学有效量的治疗性疫苗的步骤，其中所述疫苗包含含有分离的融合多肽的药物组合物，其中所述融合多肽包含(a)来自结核复合物中分枝杆菌物种的抗原Rv1813，Rv3620，和Rv2608的组合，并且所述抗原是共价连接的，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。

2.权利要求1的方法，其中所述治疗性疫苗包含融合多肽，所述融合多肽包含(a)分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813的组合，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。

3.权利要求2的方法，其中所述分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。

4.权利要求3的方法，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:1中所列的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

5.权利要求3的方法，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

6.权利要求1的方法，其中所述治疗性疫苗包含融合多肽，所述融合多肽包含(a)分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813的组合，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。

7.权利要求6的方法，其中所述分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813是结核分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813。

8.权利要求6的方法，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的序列。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述活动性结核感染是结核分枝杆菌的活动性原发性感染。

10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述活动性结核感染是再活化结核感染。

11.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述活动性结核感染与虚弱，疲劳，发热，寒意，重量减轻，食欲丧失，厌食，盗汗，或其任何组合的临床症状有关。

12.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述活动性结核感染是肺活动性TB感染。

13.权利要求12的方法，其中所述肺活动性结核感染与持续性咳嗽，稠粘液，胸痛，咯血，或其任何组合的临床症状有关。

14.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述活动性结核感染以Mtb细菌为特征，所述Mtb细菌在哺乳动物的器官中以指数，对数，或半对数速率增殖，繁殖，扩充或活跃倍增。

15.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述活动性结核感染是使用选自下组的测定法鉴定的：抗酸染色(AFS)测定法；细菌培养测定法；IGR测试；皮肤测试；和抗原刺激后全血或分离的PBMC的胞内细胞因子染色。

16.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述哺乳动物感染有多药抗性(MDR)结核分枝杆菌。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述哺乳动物先前免疫接种了卡介苗(BCG)。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述一种或多种化疗剂是异烟肼(isoniazid)，利福平(rifampin)，或其组合。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中首先在一段时间里对所述哺乳动物施用一种或多种化疗剂，随后施用治疗性疫苗。

21.权利要求1-19中任一项的方法，其中首先对所述哺乳动物施用治疗性疫苗，随后在一段时间里施用一种或多种化疗剂。

22.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述一种或多种化疗剂和所述治疗性疫苗的施用是同时的。

23.权利要求1-22中任一项的方法，其进一步包括随后一次或多次对所述哺乳动物施用所述治疗性疫苗，其中在所述随后一次或多次时在所述哺乳动物中保留的结核感染可以是或不是活动性结核感染。

24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述疫苗进一步包含佐剂。

25.权利要求24的方法，其中所述佐剂是GLA，其具有如下的结构：

其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烃基；且R²和R⁴是C₉-C₂₀烃基。

26.权利要求25的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C_11-14烃基；且R²和R⁴是C_12-15烃基。

27.权利要求25的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₁₃烃基。

28.权利要求25的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₉烃基。

29.一种用于缩短化学疗法针对活动性结核感染的时间过程的方法，所述方法包括与所述化学疗法一起对具有活动性结核感染的哺乳动物施用免疫学有效量的治疗性疫苗，其中所述疫苗包含含有分离的融合多肽的药物组合物，其中所述融合多肽包含(a)来自结核复合物中分枝杆菌物种的抗原Rv1813，Rv3620，和Rv2608的组合，并且所述抗原是共价连接的，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列；且其中所述疫苗诱导针对结核的免疫应答，由此提供化学疗法针对活动性结核感染的缩短的时间过程。

30.权利要求29的方法，其中所述治疗性疫苗包含融合多肽，所述融合多肽包含(a)分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813的组合，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。

31.权利要求30的方法，其中所述分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813是结核分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3619，Rv3620和Rv1813。

32.权利要求31的方法，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:1中所列的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

33.权利要求31的方法，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:2中所列的序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

34.权利要求29的方法，其中所述治疗性疫苗包含融合多肽，所述融合多肽包含(a)分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813的组合，或(b)与所述抗原组合具有至少90％同一性的序列。

35.权利要求34的方法，其中所述分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813是结核分枝杆菌抗原Rv2608，Rv3620和Rv1813。

36.权利要求35的方法，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4中所列的序列，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的序列。

37.权利要求29-36中任一项的方法，其中所述化学疗法的时间过程缩短至不超过约3个月，约5个月，或约7个月。

38.权利要求29-37中任一项的方法，其中所述疫苗进一步包含佐剂。

39.权利要求38的方法，其中所述佐剂是GLA，其具有如下的结构：

40.权利要求39的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C_11-14烃基；且R²和R⁴是C_12-15烃基。

41.权利要求39的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₁₃烃基。

42.权利要求40的方法，其中R¹，R³，R⁵和R⁶是C₁₁烃基；且R²和R⁴是C₉烃基。