ES2924287T3

ES2924287T3 - Conjugados de ADN-células

Info

Publication number: ES2924287T3
Application number: ES10762440T
Authority: ES
Inventors: Shih-Chia Hsiao; Matthew Francis; Carolyn Bertozzi; Richard Mathies; Ravi Chandra; Erik Douglas; Amy Twite; Nicholas Toriello; Hiroaki Onoe
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 2009-04-08
Filing date: 2010-04-08
Publication date: 2022-10-05
Anticipated expiration: 2030-04-08
Also published as: JP2012523569A; US9327036B2; CN102575228A; US9969970B2; US20160319238A1; WO2010118235A1; EP2417249B1; US20120142088A1; JP5964746B2; CN113186149A; JP2016168062A; CA2757884C; CN107326002A; CA2757884A1; EP2417249A1; EP2417249A4

Abstract

La presente invención proporciona conjugados de ADN y células uniendo el ADN a un grupo funcional nativo en la superficie celular. Las células pueden estar sin paredes celulares o pueden tener paredes celulares. Las células modificadas pueden unirse a la superficie de un sustrato y usarse en ensayos o biorreactores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados de ADN-células

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el contrato No. DE-AC02-05CH11231 otorgado por el U.S. Department of Energy y respaldado por el Programa de Nanoscale Science, Engineering, and Technology (NSET) del Department of Energy, and the Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, bajo las concesiones Nos. HG003329 y R01 GM072700 otorgados por los National Institutes of Health, y bajo la concesión de National Institutes of Health Molecular Biophysics Training No. T32GM 08295. El Gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Referencia a un "Listado de secuencias", una tabla o un apéndice de lista de programas de ordenador presentado en un disco compacto

NO APLICA

Antecedentes de la invención

Por lo general, los péptidos se han utilizado en matrices basadas en células para capturar células para su estudio. Las superficies están impresas con péptidos "RGD" diseñados para unirse a las integrinas en la superficie de una célula, pero este sistema no funciona con células que no tienen integrinas, tal como las células no adherentes (por ejemplo, leucocitos, linfocitos) y no permite patrones definidos controlados con diferentes tipos de células juntas en la misma plataforma. El sistema RGD tiene la gran desventaja de iniciar la diferenciación celular, cambiando así la célula antes de que se analice, porque las integrinas son los receptores que están involucrados en el control de la diferenciación y también las actividades que siguen después de la unión de las integrinas que se relacionan con la diferenciación. (Véase Du, X. P. et al., Cell 1991, 65, 409-416; Xiong, J. P. et al., Science 2002, 296, 151-155.)

La unión no covalente indirecta se demuestra con un sistema de unión proteína-proteína en donde el ADN se une indirectamente a las células mediante un enlace no covalente a través de una interacción anticuerpo-ligando. (Bailey RC et al. J Am Chem Soc. 200721 de febrero; 129 (7): 1959-67) Un anticuerpo específico para un ligando objetivo en una célula se conjuga con ADN. El enlace no covalente entre el anticuerpo y el ligando se basa en enlaces de hidrógeno, típicos de las interacciones proteína-proteína. Los oligómeros de ADN monocatenario (ADNmc) en anticuerpos específicos para ligandos de la superficie celular se unen a células que tienen esos ligandos y las células, a su vez, se anclan a superficies que tienen oligómeros complementarios de ADNmc que se unen a la cadena asociada en la célula para capturar la célula.

La unión covalente indirecta de cadenas sintéticas de ADN monocatenario (ADNmc) a las superficies de las células vivas se demostró por primera vez utilizando la ingeniería de oligosacáridos metabólicos por Chandra, R.A. et al. Angew. Chem.-Int. Edit. 2006, 45, 896-901. La covalencia indirecta se realizó a través de manipuladores químicos específicos (azidas) que se introdujeron en los ácidos siálicos de la superficie celular obtenidos después de tratar las células con N-azidoacetilmanosamina peracetilada (Ac4ManNAz) (tomando 3 días) antes de la introducción del ADN. Luego, los conjugados de fosfina-ADNmc se unieron covalentemente al mango de azida para formar un enlace amida (una reacción de ligación de Staudinger, E. Saxon, et al. Science 2000, 287) entre el azido-azúcar y el ADN. Las azidas instaladas dentro de los glicoconjugados de la superficie celular mediante el metabolismo de un azidoazúcar sintético pueden reaccionar con una triarilfosfina biotinilada para producir muchos aductos estables de la superficie celular. Sin embargo, el enfoque metabólico covalente tarda varios días en preparar las células para la unión del ADN, y la alteración de los azúcares de la superficie celular tiene efectos metabólicos en la célula que la modifican antes de que se tenga la oportunidad de analizarla. Se limita además a ciertas células de mamíferos que poseen ácido siálico en su superficie y, por lo tanto, no se puede usar para bacterias, células vegetales, hongos o muchas otras células animales.

Erik S Douglas et al. describen en "Lab on a Chip", Issue 11, 2007, ADN unido covalentemente a la superficie celular de células Jurkat y CHO, y ADN manchado en portaobjetos de vidrio utilizados para estudios de unión con células conjugadas con ADN.

La unión no covalente a través de anticuerpos y ligandos en las superficies celulares también activará las células y, por lo tanto, las perturbará antes de que pueda comenzar el análisis, y también tenderá a ser más débil y "reversible" en comparación con una unión covalente. Además, el mecanismo del anticuerpo requiere la prevalencia del ligando en la célula y la ingeniería de un anticuerpo específico para el ligando para fijar suficiente ADN en la superficie celular.

Se han realizado uniones no covalentes a través de interacciones de ligandos con un anticuerpo en la superficie celular donde el anticuerpo lleva una cadena de ADN de unión a proteínas. (Bailey RC et al. J Am Chem Soc. 2007 21 de febrero; 129 (7): 1959-67). Ambos métodos tienen la desventaja inmediata de activar la célula que buscan capturar para su estudio, transformando así el objeto de interés en algo diferente antes de que pueda ser analizado. Superar los inconvenientes de estos primeros sistemas de unión del ADN en las superficies celulares podría transformar este campo naciente recién descrito y ofrecer herramientas y manipulaciones valiosas que antes no eran posibles.

Breve resumen de la invención

La invención es tal como se define en las reivindicaciones concedidas. En una realización, la presente invención proporciona una composición que comprende: una célula, en donde la célula tiene una membrana que comprende un grupo funcional que es nativo de la membrana celular, en donde el grupo funcional nativo comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico y triptófano, y en donde la célula no tiene pared celular; y una fracción de ácido nucleico que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en un oligonucleótido, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido nucleico peptídico (PNA) y un aptámero, en donde la fracción de ácido nucleico activado comprende un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), en donde la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente al grupo funcional nativo.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para preparar una composición de una célula y una fracción de ácido nucleico que comprende: poner en contacto la célula con una fracción de ácido nucleico que tiene un grupo que tiene reactividad aumentada con uno o más grupos funcionales nativos en una membrana de la célula, en donde la membrana celular comprende el grupo funcional nativo que es nativo de la membrana celular, en donde el grupo funcional nativo que tiene una mayor reactividad comprende un éster de NHS, y el grupo funcional nativo comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico y triptófano y en donde la célula no tiene pared celular, de manera que la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente al grupo funcional que es nativo de la membrana celular.

Además, se describe una composición que tiene una célula, en donde la célula tiene una pared celular y una fracción de ácido nucleico, en donde la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente a la célula.

Además, se describe un método para preparar un conjugado de una célula y una fracción de ácido nucleico, poniendo en contacto la célula con una fracción de ácido nucleico activado, en donde la célula incluye una pared celular, de modo que la fracción de ácido nucleico se une a la célula.

En otra realización, la presente invención proporciona un dispositivo que comprende una célula que tiene una membrana celular que comprende un grupo funcional que es nativo de la membrana celular y está unido covalentemente a una primera fracción de ácido nucleico, en donde el grupo funcional nativo comprende un aminoácido seleccionado de la grupo que consiste en lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico y triptófano, y la primera fracción de ácido nucleico activado comprende un éster de NHS; y una superficie de sustrato que comprende una segunda fracción de ácido nucleico complementario a la primera fracción de ácido nucleico, de modo que la célula se une a la superficie del sustrato mediante la formación de un dúplex de ácido nucleico de la primera y segunda fracción de ácido nucleico, en donde la célula no tiene paredes

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Unión covalente de ADNmc a las superficies celulares, (a) Primero se hizo reaccionar el ADN monocatenario tiolado con NHS-PEG-maleimida en PBS a temperatura ambiente para formar el conjugado NHS-ADN. A continuación, esta solución se incubó con suspensiones de células vivas en PBS a temperatura ambiente durante 30 min. Después de la unión de las cadenas de ADN, las células se devolvieron a los medios de cultivo. (b, c) Las células Jurkat se expusieron a soluciones de NHS-ADN de concentraciones variables como se describe en (a). A continuación, se añadió el complemento de la cadena fluorescente y se cuantificó el nivel de modificación celular mediante citometría de flujo. Se podrían instalar hasta 120,000 cadenas de ADN en cada célula. (d) Un esquema de un método para modelar células en una superficie.

Figura 2. Inmovilización de células de una manera específica de secuencia de ADN. (a) Células que llevan la secuencia de ADN C2 unida a manchas complementarias (secuencia M2) en una micromatriz de ADN (tamaño de mancha = 60 |jm). Las manchas vecinas con secuencia no complementaria M1 permanecieron desocupadas. (b) El mismo sustrato de micromatriz se expuso a una suspensión mixta de células Jurkat y MDA que portaban las secuencias C2 y C1, respectivamente. Las células Jurkat se tiñeron con Cell-Tracker Green y las células MDA se tiñeron con Cell-tracker Blue. (c) MCF-7 y (d) las células MDA también se unieron a las superficies recubiertas de ADN de una manera rápida, estable y específica de secuencia. Se observó una clara delimitación entre las regiones recubiertas de ADN y las no recubiertas. Las imágenes de contraste de fase se muestran después de 2 h de incubación. (e) MCF-7 y (f) las células MDA se habían propagado y proliferado después de 36 h, pero aún estaban confinadas al área impresa con ADN.

Figura 3. Modificación directa del ADN y captura de células primarias. (a) Los glóbulos rojos humanos se unieron de la misma manera que las células Jurkat en una mancha de ADN y parecían ser morfológicamente idénticos inmediatamente después de la unión. La tinción con azul de tripán indicó que las membranas permanecieron intactas. (b) Las células T auxiliares CD4+ de ratón recubiertas de ADN se unieron mediante manchas recubiertas con ADN complementario. Después de 3 minutos de exposición, se puede ver un límite claro entre las regiones impresas y no impresas del portaobjetos. (c) Patrones de ADN a microescala hechos por fotolitografía y microfabricación. Las cadenas de ADNmc conjugadas con fluoresceína se modelaron en el sustrato para permitir la visualización. (d) Las células T primarias de ratón se capturaron en los mismos patrones de ADN. (e) Producción de IL-2 de células T inmovilizadas con ADN y células T libres, según lo determinado por ELISA. ConA = concanavalina A. PMA = acetato de meristilo de forbol. CSA = ciclosporina A.

Figura 4. Captura y diferenciación de células de mioblastos primarios. (a,b) Los patrones de ADN en portaobjetos de vidrio dictan las áreas en las que se unen las células. (c) Las células de mioblastos no muestran signos de diferenciación inmediatamente después de la captura (mostrado), o después de 1 día cuando se mantienen en medios de crecimiento. (d) Los miotubos se forman tras la adición de medios de diferenciación. La foto fue tomada cinco días después de que se hizo el cambio. (e) Después de 6 días de incubación en medios de diferenciación, los mioblastos con patrones circulares forman miotubos arqueados que se alinean con el borde. (f) Después de 6 días, los miocitos en arreglos rectangulares forman miotubos que están alineados con el eje largo de los patrones. Para los patrones lineales, la mayoría de los miocitos (g) se alinean dentro de los 20° del ángulo límite del patrón y (h) se encuentran a mitad de camino entre los bordes.

Figura 5. Espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de las reacciones de modificación del ADN. Se encontró que un compuesto de amina modelo reaccionaba con el éster de NHS, verificando la formación de amidas en las superficies celulares.

Figura 6. Viabilidad de células Jurkat modificadas con NHS-ADN. A) Se combinó una solución de células recubiertas de ADN (20 bases cada una) con las cadenas complementarias. En varios momentos, se contó visualmente el número total de células (curva azul). La muestra de control (curva naranja) consistía en células Jurkat no modificadas cultivadas en ausencia de ADN añadido. B) Para evaluar la viabilidad después de la unión, las células modificadas con ADN se inmovilizaron en portaobjetos de vidrio que contenían el complemento de cadena. Después de la inmovilización durante 24 h y 48 h, las células se incubaron con una solución de anexina V-FITC (barras verdes) y PI (barras rojas). Las células se evaluaron dentro de 1 h usando microscopía de fluorescencia. Las células libres eran muestras de control que carecían de ADN superficial y no estaban unidas a los portaobjetos.

Figura 7. Se tomaron imágenes de las células MCF-7 y MDA inmovilizadas después de 2, 12, 24, 36 horas.

Figura 8. Los mioblastos se incubaron en medios de cultivo durante 3 días. A) Los mioblastos se sembraron en placas recubiertas de colágeno. B) Los mioblastos se hicieron reaccionar con NHS-ADN y se unieron a la superficie de una manera específica de secuencia.

Figura 9. Los mioblastos se incubaron en medios de fusión después de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 días y se sembraron en placas recubiertas de colágeno o reaccionaron con NHS-ADN y se unieron a la superficie de una manera específica de secuencia.

Figura 10. Análisis de la alineación de miotubos en un patrón definido. Se midió la distancia (línea roja) y los ángulos entre los miotubos y el borde más cercano. Todas las medidas de distancia se realizaron desde el punto medio de los tubos. La línea verde indica la distancia total entre los bordes del patrón.

Figura 11. Fabricación de la matriz de microelectrodos bifuncionales para la monitorización de una sola célula. (A) Los electrodos de oro se modelan en una oblea de vidrio mediante fotolitografía y despegue. Luego se deposita una capa aislante de 7 pm de Parileno-c sobre los electrodos y se cubre con una capa de 100 nm de aluminio evaporado. (B) El fotoprotector se modela en la capa de aluminio, que luego se graba y se usa como una máscara de grabado para el aislamiento de parileno. (C) La capa sensora de óxido de iridio se deposita en la superficie del electrodo y luego se trata con un aldehído silano para la unión del ADN de captura modificado con amina. (D) Finalmente, la capa de aluminio se disuelve en una base fuerte, dejando solo el ADN de captura en la superficie del sensor. Las células que llevan la cadena complementaria unida a la superficie se introducen y capturan directa y específicamente en el sensor. (E) Las células se tratan con ADN monocatenario (5'-CCCTAGAGTGAGTCGTATGA-3') que lleva un grupo funcional éster de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) terminal, que se une a aminas primarias en la superficie celular. Este etiquetado de código de barras de ADN funcionaliza la célula para la captura dirigida por ADN en el dispositivo. (F) Esquema del dispositivo de microfluidos. Los electrodos están encerrados por un canal PDMS, formando el dispositivo de microfluidos.

Figura 12. Datos de calibración para la matriz de microelectrodos bifuncionales. (A) Grabación de calibración típica para un sensor de óxido de iridio modificado con ADN que utiliza tampones estándar de pH 4, 5 y 7. El voltaje se mide en relación con un electrodo de referencia Ag/AgCl. (B) Gráfico de la medición estándar de voltaje frente a pH con una pendiente de -68.5 mV/unidad de pH y R2=0.99995.

Figura 13. Captura de células en la matriz de microelectrodos bifuncionales. Micrografía fluorescente de células Jurkat no adherentes individuales con un código de barras de ADN unido a la superficie unido a la cadena complementaria en el electrodo sensor. Las áreas de los electrodos están delineadas en blanco. Barra = 40 pm. Recuadro: Vista ampliada de una sola célula Jurkat en un electrodo, con iluminación oblicua adicional para revelar el área del electrodo.

Figura 14. Acidificación de una sola célula medida con la matriz de microelectrodos bifuncionales. (A) Datos compuestos representativos de Jurkat único y acidificación de células T primaria medidos en muestras homogéneas conocidas. (B) Jurkat único y células T primarias capturadas de una mezcla y monitorizadas simultáneamente durante un lapso de 10 minutos en la matriz. (C) Histograma de acidificación de células individuales en muestras de tipo conocido durante 10 min. Se observa que las células Jurkat tienen una tasa de acidificación significativamente más alta (P < 0.0002) que las células T primarias en medios poco tamponados.

Figura 15. Estimulación de células únicas medida por la matriz de microelectrodos bifuncionales. Las células Jurkat exhiben una acidificación inicial normal durante los primeros 13 minutos, luego se agregan 125 pL de rotenona 10 pM en medios poco tamponados al reservorio de salida del canal donde se difunde en el canal en segundos. La rotenona inhibe la cadena de transporte de electrones mitocondriales, provocando un aumento de la tasa de excreción de ácido láctico y, por lo tanto, una mayor tasa de acidificación.

Figura 16. Unión covalente de biomoléculas a voladizos y superficies celulares.

a) Después de la oxidación de la superficie utilizando un plasma de oxígeno, los grupos funcionales aldehido se introdujeron en voladizos de nitruro de silicio mediante depósito químico de vapor (CVD).

b) Se introdujeron soluciones de IgG anti-CD3 o ConA que contenían borohidruro de sodio sobre superficies en voladizo recubiertas de aldehido en una cámara húmeda (IgG = inmunoglobulina G). La modificación del ADN se logró sumergiendo los voladizos en una solución de ADNmc funcionalizada con amina a 100 °C durante 30 min y la posterior exposición a una solución de borohidruro de sodio.

c) Se usó ingeniería metabólica para introducir grupos azida en las superficies celulares mediante tratamiento con N-azidoacetilmanosamina peracetilada (Ac4ManNAz). Los ADNmc funcionalizados con fosfina se sintetizaron y se unieron covalentemente al exterior de las células mediante ligación de Staudinger.

Figura 17. Comparación de métodos de adhesión basados en biomoléculas. a) Las tasas de crecimiento de células en masa se determinaron primero en presencia de las moléculas de adhesión. Se combinó una suspensión de células Jurkat con ConA o IgG anti-CD3, y se combinó una solución de células recubiertas de ADN con las cadenas de ADN complementarias. En diversos puntos de tiempo se contó el número total de células. La muestra de control se cultivó en ausencia de cualquier molécula de adhesión. b) Para evaluar la eficacia de la captura celular, se aplicaron soluciones de ADNmc marcado con FITC 20 pM, ConA marcado con FITC 20 pM e IgG anti-CD3 marcado con FITC 6 pM a portaobjetos de vidrio recubiertos con aldehído, y las biomoléculas se unieron por aminación reductiva. Se introdujeron luego soluciones que contienen 1 * 107 células Jurkat mL-1 en los portaobjetos resultantes. Las muestras se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente y luego se lavaron con dos porciones de solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la evaluación. c) Para evaluar la viabilidad celular, las células se inmovilizaron en portaobjetos de aldehído recubiertos con ADN, ConA e IgG anti-CD3. Después de la inmovilización durante 24 y 48 h, las células se incubaron con una solución de anexina V-FITC (barras negras) y PI (barras grises). Las células se evaluaron dentro de 1 h por microscopía de fluorescencia. * Las células inmovilizadas con ConA y anticuerpo que se tiñeron parcialmente con anexina se contaron como células que experimentaban apoptosis. NB representa muestras de control que no estaban unidas a las superficies. Las barras de error representan una desviación estándar.

Figura 18. Medición AFM de la fuerza de desadhesión. A) Seis trazos de muestra para una sola célula se muestran en tonos de gris, con el trazo promedio mostrado en negro. A distancia cero, la célula está en pleno contacto con el voladizo, que aplica una fuerza positiva. A medida que aumenta la distancia, el voladizo se aleja de la superficie del portaobjetos de vidrio, lo que hace que el enlace entre la célula y el voladizo se rompa y dé como resultado una región sin contacto de fuerza cero. La fuerza de d-adhesión se calculó como la diferencia entre el mínimo de la curva y la región horizontal sin contacto. B) Las fuerzas de adhesión se midieron a diferentes velocidades de retracción (15.7 y 8.2 pm/s) y fuerzas de contacto (400 y 200 pN) para los sistemas de ADN, ConA y anticuerpos. Los datos se obtuvieron midiendo los eventos de desadhesión del tamaño en más de cuatro células diferentes. Las barras de error representan una desviación estándar.

Figura 19. Modelado de células vivas dip-pen. a) Al unir una cadena de ADN más corta (13 bases) a un voladizo y una cadena más larga (20 bases) al portaobjetos de vidrio, el instrumento AFM puede transportar una sola célula viva e imprimirla directamente en la ubicación deseada en el portaobjetos de vidrio. b-d) Este proceso se muestra paso a paso para la formación de un solo patrón de células.

Figura 20. Descripción general del ensayo de silenciamiento génico de una sola célula. Las células Jurkat se cultivan y se marcan en la superficie, se captura una sola célula en una almohadilla de destino mediante la formación de dúplex de ADN y se genera un perfil de expresión de RT-PCR. (A) Las células bajo condiciones normales de crecimiento exhiben una alta expresión homogénea de GAPDH (células verdes) en comparación con un ARNr 18S de control. (B) Las células tratadas con ARNip dirigido a GAPDH exhiben niveles variables de silenciamiento de ARNm.

Figura 21. Disposición de dispositivos microfluídicos. Esquema que muestra la mitad del dispositivo (2 de los 4 sistemas completos) para el perfil de expresión génica de una sola célula. El microdispositivo de vidrio-PDMS-vidriovidrio de 4 capas contiene 4 regiones distintas. La primera región en la parte superior es una bomba de 3 válvulas. La región del reactor consiste en una almohadilla de captura de células de oro definida fotolitográficamente en el centro de una cámara de reacción de 200 nL junto con RTD y un calentador microfabricado para ciclos térmicos. La región de captura por afinidad comprende una cámara de retención y una cámara de captura por afinidad (amarillo). Finalmente, los amplicones liberados térmicamente se analizan en el canal de separación CE (rojo). Cada dispositivo contiene 4 sistemas direccionables de forma independiente que permiten el análisis de 4 células individuales en paralelo. Todos los canales están grabados a una profundidad de 20 |jm

Figura 22. Esquema de los pasos bioquímicos realizados en el microdispositivo integrado de expresión génica. (Superior) El análisis se completa en <75 min. (Más bajo) (A) Representación del funcionamiento del microsistema de expresión génica unicelular. (B) Primero, las células funcionalizadas con un oligonucleótido de base 20 en su membrana celular se hacen fluir al reactor. (C) Se captura una sola célula en una almohadilla de orro de tamaño limitado de 25 * 25 jm 2 cuando el ADNmc en su exterior se une a la cadena de captura complementaria inmovilizada en la almohadilla de oro. (D) La célula inmovilizada se somete a lisis por congelación y descongelación y el ARNm se transcribe de forma inversa en una cadena estable de ADNc (15 min). La amplificación por PCR (30 ciclos) se completa en 25 min. (E) Los fragmentos amplificados y la mezcla de RT-PCR sin reaccionar se bombean desde el reactor a la cámara de retención y se conducen electroforéticamente desde los depósitos de residuos (W) a los depósitos de cátodo (C). (F) Los fragmentos de interés con complementariedad con la sonda de captura por afinidad se concentran e inmovilizan en la entrada de la cámara de captura creando un tapón de captura purificado. (G) Finalmente, los productos se liberan térmicamente a 80 °C desde el gel de captura por afinidad y se separan electroforéticamente a medida que migran hacia el ánodo (A). Los amplicones marcados con fluorescencia se detectan mediante fluorescencia confocal para determinar su cantidad e identidad

Figura 23. Expresión génica y silenciamiento a nivel unicelular. (A) Electroferogramas de expresión génica representativos de células Jurkat individuales. Una sola célula de tipo salvaje con cebadores dirigidos a GAPDH (200 pb) y 18S ARNr (247 pb) genera 2 picos fuertes que migran a los 160 s y 185 s, respectivamente. Una sola célula sometida a electroporación con ARNsi dirigido al ARNm de GAPDH muestra solo un pico único para el ARNr 18S. (B) Expresión génica de GAPDH para células Jurkat tratadas con ARNip de GAPDH en relación con células normales no tratadas. La expresión de GAPDH se ha normalizado a un ARNr 18S de control para comparar. Los experimentos de 8 células individuales muestran niveles de ARNm de GAPDH al 0, 5, 50, 1, 48, 0, 5 y 0 % de las células Jurkat normalmente no tratadas. Sin embargo, una medida a granel representativa de 50 células muestra una expresión de GAPDH del 21 ± 4 %. Cuando no se captura ninguna célula en la almohadilla, no hay amplificación. De manera similar, un control de PCR sin transcriptasa inversa no muestra amplificación. (C) El histograma del número de eventos para las células tratadas con ARNip muestra que hay 2 poblaciones distintas de células cuyos niveles de expresión son muy distintos del promedio de la población.

Figura 24. Se muestra la modificación de doble superficie de las tapas para la administración dirigida. Para la modificación de la superficie interior, una mutación N87C de la proteína de cubierta MS2 permite la alquilación específica del sitio. En estos lugares se pueden instalar hasta 180 moléculas de carga. Para la modificación de la superficie exterior, el aptámero se modifica primero con un grupo fenilendiamina. Una mutación T19paF en la cápside permite la unión del ^aDⁿmodificado a la superficie exterior de MS2 por reacción de acoplamiento oxidativo mediada por NaIO4.

Figura 25. Análisis de la unión del ADN a la superficie exterior de MS2. (a) Los conjugados de MS2-ADN se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie. Los carriles 1-7 se hicieron reaccionar con la cadena A. El carril 8 muestra la reacción con la cadena B. (b) un ensayo de cambio de gel confirmó la competencia del ADN para el apareamiento de bases después de la conjugación con MS2. El carril 10 incluye la secuencia complementaria a la cadena A con 20 bases de adenina adicionales para aumentar el cambio electroforético, mientras que el carril 9 no tiene ADN adicional añadido. Las imágenes de micrografía electrónica de transmisión (c) y el análisis de dispersión de luz dinámica (d) mostraron cápsides intactas después de la conjugación de ADN. Además, DLS mostró un aumento significativo en el diámetro tras la conjugación de la cadena A, así como un aumento adicional en el diámetro tras la adición de la secuencia complementaria de 20 bases a la cadena A (sin el saliente adicional de 20 bases). La escala en la imagen TEM representa 100 nm.

Figura 26. El direccionamiento celular y la captación con cápsides marcadas con apatamer (a) el direccionamiento celular se confirmó mediante citometría de flujo. Solo las cápsides de MS2 modificadas con la cadena B unida a las células Jurkat (azul). Las cápsides que no se modificaron en el exterior y las cápsides modificadas con la cadena C (verde y amarillo respectivamente) muestran una colocalización de las cápsides marcadas con B con endosomas marcados con LDL (b), pero no con endosomas marcados con transferrina (c). Las barras de escala representan 3 jm.

La Figura 27 muestra la instalación de la unión de carga interior de aptámeros dirigidos a células al exterior viral. El esquema representa el proceso básico que involucra al virus: el virus está recubierto con un aptámero de oligonucleótidos en un carbohidrato, el virus contiene carga (hasta 180 moléculas); en virtud de la especificidad del aptámero por una proteína de superficie celular en la superficie de una célula diana viva, el aptámero se une a la proteína receptora e internaliza o suministra de otro modo su contenido a esa célula.

La Figura 28 muestra imágenes de células que han sido modeladas usando los presentes métodos y una breve explicación del papel del organismo en una célula de combustible H2 alimentada por energía solar sinérgica (en un chip). La Figura 28A muestra Synechocystis PCC6803 (cianobacteria), C. reinhardtii (algas), R. rubrum y la Figura 28B muestra A. vinelandii. Las células están modeladas en grandes manchas de ADNmc, por lo que en las imágenes solo se muestra una curvatura parcial del patrón.

La Figura 29 muestra imágenes de modelados de E. coli (A) muestra E. coli modelados 20 * etiquetados con superposición FITC DIC; (B) y (C) muestran imágenes de patrones E. coli (sin etiqueta fluorescente) y patrón de micromatriz de Synechocystis (etiquetado con FITC)) 20* (arriba) y 10* (abajo). Hay fluorescencia de fondo, pero las células se identifican por su textura.

La Figura 30 muestra un esquema de capas de patrones de Synechocystis PCC6803 (cianobacteria), A. vinelandii y R. rubrum sobre un sustrato de vidrio para uso en un dispositivo de célula de combustible.

La figura 31 muestra los conjugados de ADN-célula de células de mamíferos preparados por la presente invención por reacción con un grupo funcional nativo de lisina en la superficie celular e inmovilizados en un portaobjetos de microscopio de vidrio modificado con la cadena de ADN complementaria, lo que demuestra la formación del conjugado de célula de ADN.

La Figura 32 muestra los conjugados de ADN-célula de células no mamíferas preparados por la presente invención inmovilizados en un portaobjetos de microscopio de vidrio modificado con la cadena de ADN complementaria, demostrando la formación del conjugado de células de ADN.

La Figura 33 muestra los conjugados de ADN-célula de células de mamíferos preparados por la presente invención por reacción con un grupo funcional nativo de ácido aspártico o ácido glutámico en la superficie celular e inmovilizados en un portaobjetos de microscopio de vidrio modificado con la cadena de ADN complementaria, lo que demuestra la formación de el conjugado ADN-célula.

Descripción detallada de la invención

I. Generalidades

La presente invención proporciona el primer ejemplo de un conjugado de ADN celular preparado mediante la unión covalente del ADN a la célula a través de un grupo funcional nativo en la superficie celular, sin necesidad de ingeniería metabólica. Para las células de mamíferos y otras células sin paredes celulares, el ADN se une covalentemente directamente a los aminoácidos en la superficie de la célula, como las aminas de lisina. Para las células vegetales y otras células con paredes celulares, los azúcares en la superficie de la célula primero se modifican, por ejemplo, por oxidación para formar un aldehído o una cetona, y luego se modifican con el ADN.

Los métodos anteriores para formar conjugados de ADN-célula requerían el uso de ingeniería metabólica, es decir, alimentar una célula con un azúcar modificado apropiadamente, tal como un azúcar funcionalizado con azida, que era metabolizado por la célula y expresado en la superficie celular. A continuación, el ADN se conjugó con el azúcar modificado con azida. Este método tiene varios inconvenientes que limitan tanto la utilidad como el ámbito de aplicación. Por ejemplo, la ingeniería metabólica requiere varios días para producir una célula con una cantidad suficiente de azúcar funcionalizado con azida en la superficie celular. El tipo de células que se pueden modificar también está limitado, excluyendo las células primarias que tienen una importante utilidad de diagnóstico. Finalmente, la ingeniería metabólica modifica necesariamente la estructura y propiedades de la célula.

La presente invención supera las dificultades inherentes al proceso de ingeniería metabólica de azida utilizando los grupos funcionales nativos ya presentes en la superficie celular. Usando una secuencia de ADN activada, tal como el ADN modificado con un éster de NHS, el ADN puede unirse covalentemente a la amina de un grupo lisina en la superficie celular de una célula sin pared celular. Este proceso dura varias horas como máximo. La simplicidad del proceso permite la modificación de células primarias, así como de células madre. Para las células con paredes celulares, los azúcares nativos en la superficie celular se modifican primero, tal como por oxidación para formar aldehídos y cetonas que luego reaccionan con una secuencia de ADN activada, tal como con un grupo aminooxi. Los métodos y conjugados de ADN-célula de la presente invención representan un avance sustancial en los métodos de ensayo y detección de células.

La capacidad de modelar células en superficies proporciona una nueva plataforma para diversos estudios y aplicaciones, por ejemplo, el estudio de la biología celular, el control de la diferenciación de células madre y la ingeniería de nuevos tejidos. Típicamente, las matrices basadas en células se forman imprimiendo superficies de interés con péptidos "RGD" que están diseñados para unirse a las integrinas en la superficie celular. Si bien este enfoque se ha adoptado ampliamente para la inmovilización de muchos tipos de células, no se puede utilizar para capturar células no adherentes (tal como los leucocitos) o para unir varios tipos de células a características de matriz únicas. También puede causar cambios no deseados en la diferenciación celular o en el comportamiento porque involucra a los mismos receptores de superficie que están involucrados en el control de estos procesos.

Para eludir estas limitaciones, algunos de los inventores informaron previamente sobre la captura de células vivas a través de la hibridación de cadenas de ADN sintéticas unidas covalentemente a sus membranas plasmáticas a superficies impresas con secuencias complementarias. Chandra, R. A.; Douglas, E. S.; Mathies, R. A.; Bertozzi, C. R.; Francis, M. B. Angew. Chem.-Int. Edit. 2006, 45, 896-901. Además de permitir modelar múltiples tipos de células en un solo sustrato, el método ofrecía las importantes ventajas de la reutilización y la capacidad de ajuste del sustrato. Lo que es más importante, este enfoque se ha utilizado para capturar células no adherentes además de las adherentes, y se ha demostrado que las células experimentan cambios mínimos en el comportamiento como resultado de la inmovilización a través de este proceso independiente del receptor. En informes anteriores, también se ha demostrado la utilidad de este método para la formación de patrones celulares complejos.

Las cadenas de ADN utilizadas en estudios anteriores se instalaron en los glicanos de la superficie celular a través de un proceso de dos pasos. Primero, las células se alimentaron con un derivado de manosa que contenía azida durante 1-3 días. Este azúcar se metabolizó posteriormente y se incorporó a los glucanos de la superficie celular que contienen ácido siálico. Luego, el ADN se direccionó a la funcionalidad azida usando una ligadura de Staudinger. Si bien es efectivo, este protocolo es más apropiado para líneas celulares de mamíferos cultivadas, ya que requiere varios días de exposición para instalar una cantidad suficiente de grupos azida.

Para ampliar la generalidad del método de adhesión basado en ADN, la presente invención proporciona un método mejorado para la instalación directa de ácidos nucleicos en prácticamente cualquier superficie celular. Con referencia ahora a la Figura 1, en una realización, un ácido nucleico monocatenario activado o funcionalizado se hace reaccionar primero con un enlazador químico en una solución tampón para formar un conjugado de enlazador-ácido nucleico. La célula o la superficie celular se expone a la solución tampón durante un período de tiempo específico para permitir que la reacción prosiga para unir el ácido nucleico a través del conector químico a la superficie celular. Después de la unión del ácido nucleico a las células, las células se devuelven al medio de cultivo. Se pueden usar concentraciones variables del ácido nucleico como se describe y cuantifica en la Figura 1a. En un ejemplo, se hace reaccionar un oligonucleótido con un enlazador químico en una solución tampón neutra para conjugar el oligonucleótido con el enlazador químico, luego las células se incuban con la solución tampón que contiene el conjugado enlazadoroligonucleótido durante 30 minutos para permitir la modificación y unión de el conjugado oligonucleótido-enlazador a la superficie de la célula.

La modificación celular típicamente procede a través de la formación de un enlace covalente entre el enlazador y un aminoácido en la superficie celular. En algunas realizaciones, la superficie celular puede ser la membrana celular de células vivas de cualquier origen, incluidas células animales, vegetales, de algas o bacterianas. En algunas realizaciones, el enlace covalente es un enlace amida o un enlace éster. En algunas realizaciones, el oligonucleótido es monocatenario. En otras realizaciones, el aminoácido se selecciona de lisina, cisteína, tirosina, serina, aspartato, glutamato y triptófano.

En células tales como células vegetales con paredes celulares que no forman parte de la invención, el enlace puede ser una hidrazona, una oxima o una amina, entre otros, donde dicha unión se produce mediante oxidación con peryodato seguida de formación de hidrazona, oxima o amina. En una realización, un carbohidrato en la célula se oxida para generar un grupo funcional aldehído, luego el aldehído se hace reaccionar con el conjugado de oligonucleótido-enlazador para la modificación celular directa de la superficie de la célula vegetal.

Este procedimiento puede llevarse a cabo, por ejemplo, en menos de 1 hora y conduce a niveles equivalentes de funcionalización de la superficie celular con cualquier secuencia de oligonucleótidos de interés. El presente método se puede aplicar a diversos métodos, incluida la captura de células individuales para el análisis de RT-PCR, la unión de células vivas a un sustrato sólido para la medición de la fuerza o técnicas de patrones celulares. En los ejemplos, se demuestra el uso de este nuevo método de etiquetado para la captura de glóbulos rojos, células T primarias y mioblastos, que son todos tipos de células que son difíciles de modelar con otros métodos. Esta nueva técnica amplía en gran medida el alcance de la estrategia de adhesión basada en el ADN y es lo suficientemente sencilla como para usarse en laboratorios que no se especializan en síntesis orgánica.

Por lo tanto, en una realización, la invención es una composición que incluye una membrana celular con un oligonucleótido unido directamente de forma covalente. La membrana celular puede ser una célula entera intacta, comprendiendo la composición una célula entera con un oligonucleótido unido directamente de forma covalente. Se pueden unir múltiples oligonucleótidos a una sola célula. La célula puede ser una célula viva. La célula puede ser cualquier célula, tal como una célula eucariota, incluyendo una célula animal o una célula no animal. Que la célula o la membrana celular se modifique "directamente" significa que la membrana celular (superficie celular, fuera de la célula) no se modifica ni cambia antes de la unión del oligonucleótido. Específicamente, debido a que la unión es a un constituyente en la superficie celular, significa directamente que el constituyente al que se une el oligonucleótido no se modifica antes de la unión covalente con el oligonucleótido. Todos los métodos anteriores modifican primero una fracción en la superficie celular, antes de unir el oligonucleótido.

Por unión covalente se entiende que se forma un nuevo enlace covalente entre las dos moléculas que se conectan entre sí. Los enlaces son típicamente un enlace amida o éster, pero pueden ser cualquier enlace que sirva para el propósito de unión entre el oligonucleótido y una fracción en la superficie celular (tal como una proteína, un aminoácido o un carbohidrato u otra entidad de la superficie celular).

La presente invención facilita la modificación directa de las superficies celulares con conjugados NHS-ADN en un proceso rápido y eficiente, lo que permite que prácticamente cualquier célula de mamífero se modele en superficies que contienen ADN complementario en menos de 1 hora. La técnica específica descrita aquí demuestra la capacidad de usar varios tipos de células que generalmente son incompatibles con las técnicas anteriores de direccionamiento de integrinas, incluidos los glóbulos rojos, las células T primarias y los mioblastos. El procedimiento de inmovilización no activó las células T primarias, en contraste con los métodos basados en anticuerpos y lectina informados anteriormente. En estos estudios, las células de mioblastos se modelaron con alta eficiencia y permanecieron indiferenciadas después de la unión a la superficie. Al cambiar a medios de diferenciación, se formaron miotubos en el centro de las áreas estampadas con un excelente grado de alineación de los bordes. La disponibilidad de este nuevo protocolo amplía en gran medida la aplicabilidad de la estrategia de unión basada en el ADN para la generación de tejidos artificiales y la incorporación de células vivas en la configuración del dispositivo.

II. Definiciones

"Célula" se refiere a la unidad funcional básica de la vida e incluye tanto células procariotas como eucariotas. Las células se caracterizan por tener un interior que tiene el núcleo o nucleoide, y una membrana celular (superficie celular). Las células también pueden tener una pared celular. Las células sin pared celular incluyen células eucariotas, células de mamífero y células madre. Las células con pared celular incluyen células procarióticas y células vegetales. Otras células son útiles en la presente invención.

"Grupo funcional nativo" se refiere a los grupos funcionales que son nativos de la superficie de una célula, como aminoácidos y azúcares, y que reaccionan con la fracción de ácido nucleico para formar los conjugados de la presente invención. Los aminoácidos incluyen lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico y triptófano. Son útiles otros aminoácidos, como los que se describen a continuación. Los azúcares también son nativos de las superficies celulares e incluyen manosa, galactosa y ácido siálico, así como los que se describen a continuación. Los grupos funcionales nativos pueden reaccionar con los restos de ácido nucleico sin modificar, o pueden modificarse para hacerlos más reactivos.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos sintéticos y de origen natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina.

"Análogos de aminoácidos" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural.

Los "aminoácidos no naturales" no están codificados por el código genético y pueden, pero no necesariamente, tener la misma estructura básica que un aminoácido natural. Los aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, ácido azetidinacarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisbutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina terciaria, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico, tioprolina, aminofenilalanina, hidroxitirosina y aminotirosina.

Miméticos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido natural.

En el presente documento, se puede hacer referencia a los aminoácidos mediante los símbolos de tres letras comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Asimismo, se puede hacer referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

Las "variantes modificadas de forma conservadora" se aplican tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, "variantes modificadas de forma conservadora" se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todo el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en donde un codón especifica una alanina, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico del presente documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para el triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en el codificado secuencia es una "variante modificada de forma conservadora" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar (/.e., hidrófobo, hidrofílico, cargado positivamente, neutro, cargado negativamente). Los aminoácidos hidrófobos ejemplificados incluyen valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina y triptófano. Los aminoácidos aromáticos ejemplificados incluyen fenilalanina, tirosina y triptófano. Los aminoácidos alifáticos ejemplificados incluyen serina y treonina. Los aminoácidos básicos ejemplificados incluyen lisina, arginina e histidina. Los ejemplos de aminoácidos con cadenas laterales de carboxilato incluyen aspartato y glutamato. Ejemplos de aminoácidos con cadenas laterales de carboxamida incluyen asparagina y glutamina. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Tales variantes modificadas de forma conservadora se suman y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos entre especies y los alelos de la invención.

Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

"Azúcar" se refiere a un sacárido, tal como un monosacárido, un disacárido, un oligosacárido o un polisacárido. Los monosacáridos incluyen, pero no se limitan a, glucosa, ribosa, fructosa, ácido siálico, manosa y galactosa. Los disacáridos incluyen, pero no se limitan a, sacarosa y lactosa. Los polisacáridos incluyen, pero no se limitan a, celulosa, hemicelulosa y lignocelulosa o almidón. Otros sacáridos son útiles en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término "poner en contacto" se refiere al proceso de poner en contacto al menos dos especies distintas de manera que puedan reaccionar. Debe apreciarse, sin embargo, que el producto de reacción resultante puede producirse directamente a partir de una reacción entre los reactivos añadidos o a partir de un intermedio de uno o más de los reactivos añadidos que pueden producirse en la mezcla de reacción.

"Fracción de ácido nucleico" se refiere a un grupo que contiene una pluralidad de nucleótidos o ácidos nucleicos. Ejemplos de fracciones de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA), ácido nucleico treosa (TNA), ADN monocatenario (ADNmc), ácido 2'-fluorodesoxirribonucleico, aptámero y otros.

"Fracción de ácido nucleico activado" se refiere a una fracción de ácido nucleico que tiene un grupo que tiene una mayor reactividad con uno o más grupos funcionales nativos. Por ejemplo, cuando el grupo funcional nativo es una amina en lisina, el grupo activado es un éster activado tal como un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS-éster). El éster activado se puede unir directamente a la porción de ácido nucleico de la fracción de ácido nucleico activado, o se puede unir a través de un conector. Cuando el grupo funcional nativo es cisteína, el grupo activado puede ser una maleimida. Otros ésteres activados y grupos activados son útiles para la fracción de ácido nucleico activado. La tirosina se puede modificar usando sales de diazonio, iminas y especies de alil-paladio. El triptófano se puede modificar usando metalocarbenoides e iminas. Los aminoácidos N-terminales se pueden modificar a través de la transaminación, y la serina y la treonina N-terminales se pueden oxidar para producir aldehídos usando peryodato de sodio.

"Grupo funcional nativo modificado" se refiere a un grupo funcional nativo modificado para unir la fracción de ácido nucleico a la superficie celular. El grupo funcional nativo se puede modificar en una variedad de métodos, excepto por ingeniería metabólica. Por ejemplo, cuando el funcional nativo es un azúcar, el azúcar se puede oxidar usando un agente modificador o un agente oxidante adecuado, tal como peryodato de sodio. Cuando el grupo funcional nativo es un azúcar y el agente modificador es un agente oxidante como el peryodato de sodio, el grupo funcional nativo modificado puede ser un aldehído o una cetona.

"Superficie de sustrato" se refiere a cualquier material que se pueda derivar para incluir una fracción de ácido nucleico. Ejemplos de materiales para la superficie del sustrato incluyen, pero no se limitan a, vidrio (incluido el vidrio de poro controlado), polímeros (por ejemplo, poliestireno, poliuretano, copolímero de poliestireno-divinilbenceno), caucho de silicona, cuarzo, látex, un metal de transición derivable, materiales magnéticos, dióxido de silicio, nitruro de silicio, arseniuro de galio y derivados de los mismos. Excepto por los sitios reactivos en la superficie, los materiales son generalmente resistentes a la variedad de condiciones de reacción química a las que pueden estar sujetos.

III. Conjugados de ADN-célula

La presente invención proporciona conjugados de ADN-célula y métodos para preparar los conjugados.

A. Conjugados de células sin paredes celulares

La presente invención proporciona conjugados de fracciones de ácido nucleico y células sin paredes celulares. Los conjugados se forman mediante la unión covalente de la fracción de ácido nucleico a la superficie celular a través de un grupo funcional nativo en la superficie celular. Las células utilizadas en los conjugados de la presente invención pueden ser cualquier célula y no requieren ingeniería metabólica para introducir el grupo funcional para conjugar la fracción de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un conjugado de una célula y una fracción de ácido nucleico, en donde la célula tiene una superficie que incluye un grupo funcional nativo, la célula no tiene pared celular y la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente al grupo funcional nativo.

Las células útiles en la presente invención incluyen cualquier tipo de célula. Las células son células sin pared celular. Las células (y las membranas celulares para el mismo uso) que se pueden usar para la unión de la fracción de ácido nucleico pueden ser cualquier célula eucariota que incluye todas las células animales, células vegetales, células de algas, células bacterianas y células fúngicas. La siguiente es una lista no exhaustiva de células que pueden usarse en las composiciones, dispositivos y métodos de esta invención. La lista pretende incluir muchas células y tipos de células, pero no pretende limitar las células que se pueden usar en la invención. Más bien, estas células y tipos de células son ejemplares e ilustrativos. Tanto las células vivas como las células muertas y las líneas celulares pueden usarse en la invención. Es probable que las células vivas proporcionen la información más analítica y útil, y debido a que las células vivas se pueden usar en la invención sin activarse a través de la modificación de la superficie celular, se pueden estudiar sus propiedades nativas o casi nativas en sistemas y dispositivos artificiales usando las herramientas provistas e inherentes a la invención.

La siguiente es una lista no limitativa de células. Los tipos de células humanas de la sangre y del sistema inmunitario incluyen: linfoides: Célula B, célula T (célula T citotóxica, célula T asesina natural, célula T reguladora, célula T auxiliar), mieloide de célula asesina natural: granulocitos (granulocitos basófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos neutrófilos/neutrófilos hipersegmentados), monocitos/macrófagos, células de glóbulos rojos (reticulocitos), mastocitos, trombocitos/megacariocitos, células dendríticas. El sistema endocrino incluye tiroides (célula epitelial tiroidea, célula parafolicular), paratiroides (célula principal paratiroidea, célula oxífila), suprarrenal (célula cromafínica), células pineales (pinealocitos). Las células del sistema nervioso son las células gliales (Astrocitos, Microglia), célula neurosecretora magnocelular, célula estrellada, célula de Boettcher y la pituitaria (gonadotropo, corticotropo, tirotropo, somatotropo, lactotropo). Las células del sistema respiratorio incluyen neumocito (neumocito tipo I, neumocito tipo II), célula de Clara, célula caliciforme, célula del polvo. Las células del sistema circulatorio incluyen miocardiocito, pericito. Las células del sistema digestivo incluyen el estómago (célula principal gástrica, célula parietal), célula caliciforme, célula de Paneth, células G, células D, células ECL, células I, células K, células S. Células enteroendocrinas, células enterocromafines, células APUD, hígado (hepatocito, célula de Kupffer), cartílago/hueso/músculo. El hueso del sistema tegumentario: Osteoblasto, osteocito, osteoclasto, dientes (cementoblasto, ameloblasto) cartílago: Condroblasto, condrocitos piel/pelo: Tricocito, queratinocito, melanocito (célula nevus), músculo: Miocito, otro: Adipocitos, fibroblastos, células tendinosas. El sistema urinario incluye podocitos, células yuxtaglomerulares, células mesangiales intraglomerulares/células mesangiales extraglomerulares, células del borde en cepillo del túbulo proximal del riñón, células de la mácula densa. El sistema reproductivo Incluye masculino (espermatozoide no humano, célula de Sertoli, célula de Leydig), femenino (óvulo). Las células epiteliales queratinizantes incluyen queratinocitos epidérmicos (células epidérmicas que se diferencian), células basales epidérmicas (células madre), queratinocitos de las uñas de las manos y de los pies, células basales del lecho ungueal (células madre), células del eje del cabello medular, células del eje del cabello cortical, células del eje del cabello cuticular, Célula de la vaina de la raíz del cabello cuticular, Célula de la vaina de la raíz del cabello de la capa de Huxley, Célula de la vaina de la raíz del cabello de la capa de Henle, Célula de la vaina de la raíz del cabello externa, Célula de la matriz del cabello (célula madre), Célula epitelial de barrera estratificada húmeda, Célula epitelial superficial del epitelio escamoso estratificado de córnea, lengua, cavidad oral, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, células basales (células madre) del epitelio de la córnea, lengua, cavidad oral, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, células del epitelio urinario (revestimiento de la vejiga urinaria y conductos urinarios), células epiteliales secretoras exocrinas, células mucosas de las glándulas salivales (secreción rica en polisacáridos), células serosas de las glándulas salivales (secreción rica en enzimas glicoproteicas), células de la glándula de Von Ebner en la lengua (lava las papilas gustativas), Célula de la glándula mamaria (secreción de leche), Célula de la glándula lagrimal (secreción de lágrimas), Célula de la glándula ceruminosa en el oído (secreción de cera), Célula oscura de la glándula sudorípara ecrina (secreción de glicoproteína), Célula de la glándula sudorípara ecrina clara celular (secreción de moléculas pequeñas). Célula de la glándula sudorípara apocrina (secreción odorífera, sensible a las hormonas sexuales), Célula de la glándula de Moll en el párpado (glándula sudorípara especializada), Célula de la glándula sebácea (secreción de sebo rica en lípidos), Célula de la glándula de Bowman en la nariz (lava el epitelio olfativo), Glándula de Brunner célula del duodeno (enzimas y moco alcalino), célula de la vesícula seminal (secreta componentes del líquido seminal, incluida la fructosa para los espermatozoides nadadores), célula de la glándula prostética (secreta componentes del líquido seminal), célula de la glándula bulbouretral (secreción de moco), célula de la glándula de Bartolino (secreción de lubricante vaginal), Célula de la glándula de Littre (secreción de moco), Célula del endometrio del útero (secreción de carbohidratos), Célula caliciforme aislada de las vías respiratorias y digestivas (secreción de moco), Célula mucosa del revestimiento del estómago (secreción de moco), Célula zimógena de la glándula gástrica (secreción de pepsinógeno), Célula oxíntica de la glándula gástrica (secreción de ácido clorhídrico), Célula acinar pancreática (secreción de bicarbonato y enzimas digestivas), Célula de Paneth del intestino delgado (secreción de lisozima), Neumocito tipo II de pulmón (secreción de surfactante), Célula de Clara de pulmón, Células secretoras de hormonas, Células de la hipófisis anterior, Somatotropos, Lactotropos, Tirotropos, Gonadotropos, Corticotropos, Célula pituitaria intermedia, secretora de hormona estimulante de melanocitos, Células neurosecretoras magnocelulares, secretoras de oxitocina, secretoras de vasopresina, Células intestinales y del tracto respiratorio, secretoras de serotonina. secretoras de endorfina, secretoras de somatostatina, secretoras de gastrina, secretoras de secretina, secretoras de colecistoquinina, secretoras de insulina, secretoras de glucagón, secretoras de bombesina, células de la glándula tiroides, células epiteliales de la tiroides, células parafoliculares, células de las glándulas paratiroides, células principales de las paratiroides, células oxífilas, células de las glándulas suprarrenales, células cromafines, secretoras de hormonas esteroides (mineralcorticoides y glucocorticoides), células de Leydig de los testículos que secretan testosterona, células de la teca interna del folículo ovárico que secretan estrógeno, células del cuerpo lúteo del folículo ovárico roto que secretan progesterona, células luteínicas de la granulosa, células luteínicas de la teca, células yuxtaglomerulares (secreción de renina), célula de la mácula densa del riñón, células de metabolismo y almacenamiento, células de función de barrera (pulmón, intestino, glándulas exocrinas y tracto urogenital), riñón, neumocito tipo I (revestimiento del espacio aéreo del pulmón), célula del conducto pancreático (célula centroacinar), Célula del conducto no estriado (de glándula sudorípara, glándula salival, glándula mamaria, etc.), célula del conducto (de vesícula seminal, glándula de próstata, etc.), Células epiteliales que revisten cavidades corporales internas cerradas, Células ciliadas con función propulsora, Células de secreción de matriz extracelular, Células contráctiles, Células del músculo esquelético, células madre, células del músculo cardíaco, células sanguíneas y del sistema inmunitario, eritrocitos (glóbulos rojos), megacariocitos (precursores de plaquetas), monocitos, macrófagos del tejido conjuntivo (varios tipos), células epidérmicas de Langerhans, osteoclastos (en el hueso), Célula dendrítica (en tejidos linfoides), Célula microglial (en el sistema nervioso central), Granulocitos neutrófilos, Granulocitos eosinófilos, Granulocitos basófilos, Mastocitos, Células T auxiliares, Células T supresoras, Células T citotóxicas, Células T asesinas naturales, Células B, Células asesinas naturales, reticulocito, células madre y progenitores comprometidos para la sangre y el sistema inmunitario (diversos tipos), células madre pluripotentes, células madre no humanas totipotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, sistema nervioso, células transductoras sensoriales, Células de neuronas autónomas, células de soporte de órganos sensoriales y neuronas periféricas, neuronas del sistema nervioso central y células gliales, células de la lente, células pigmentarias, melanocitos, células epiteliales pigmentadas de la retina, células germinales no humanas, Oogonio/ovocito no humano, espermátide, espermatocito no humano, célula de espermatogonio no humano (célula madre para espermatocito), espermatozoide no humano, células nodrizas, célula del folículo ovárico, célula de Sertoli (en testículo), célula epitelial del timo, células intersticiales, o células renales intersticiales.

Las células pueden ser células sanas o células enfermas. Por ejemplo, las células pueden ser de una condición cancerosa tal como cáncer epitelial o carcinoma, incluyendo pero no limitado a, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma del colon, carcinoma pancreático, carcinoma de pulmón, carcinoma de piel (melanoma), carcinoma de esófago, etc.) o la célula de origen putativo (carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales y carcinoma de pulmón de células pequeñas, etc.). Otras células cancerosas incluyen cánceres mioepiteliales, sarcomas, gliomas, linfomas, leucemias, carcinoides y cualquier otro tipo de cáncer. Se pueden usar células en otros estados o condiciones del tejido, incluidas, pero no limitadas a, condiciones autoinmunes, condiciones relacionadas con el sistema inmunitario (por ejemplo, alergias, probable respuesta inmunitaria a la exposición), células representativas de afecciones que contribuyen o muestran resistencia a los tratamientos estándar, susceptibilidad o predisposición a una afección (por ejemplo, susceptibilidad a diabetes, afecciones de la tiroides, accidente cerebrovascular, afecciones cardiovasculares o calidad, función y degeneración del hígado, etc.).

En algunas realizaciones, la célula es una célula primaria. En otras realizaciones, la célula es una célula de mamífero. En algunas otras realizaciones, la célula es una célula madre.

La superficie celular puede incluir cualquier grupo funcional nativo adecuado, tal como aminoácidos y azúcares. En algunas realizaciones, el grupo funcional nativo puede ser un aminoácido tal como lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico o triptófano. En otras realizaciones, el grupo funcional nativo es lisina. En algunas otras realizaciones, el grupo funcional nativo puede ser una serina o treonina N-terminal.

La fracción de ácido nucleico puede ser cualquier fracción de ácido nucleico adecuada que tenga un ácido nucleico o un nucleótido. Ejemplos de fracciones de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA), ácido nucleico treosa (TNA), ADN monocatenario (ADNmc), aptámero y otros. Otras fracciones de ácido nucleico incluyen ácidos nucleicos fluorados.

En otra realización, las fracciones de ácido nucleico de la invención son ácidos nucleicos y también polímeros de nucleótidos. El término "ácido nucleico" u "oligonucleótido" se puede usar indistintamente y pretende incluir biopolímeros de nucleótidos de ADN o ARN, incluidos los ácidos nucleicos que son monocatenarios, bicatenarios, triples, ramificados o no ramificados, o formados por una escalera de oligonucleótidos cortos parcialmente hibridantes, ácidos nucleicos que tienen una estructura secundaria y/o nucleótidos naturales o no naturales.

En una realización, un oligonucleótido monocatenario brinda la oportunidad de unir la célula mediante hibridación a su cadena complementaria en otra célula, una superficie de sustrato o un dispositivo.

La longitud del oligonucleótido monocatenario utilizado para unirse a la superficie celular puede oscilar entre aproximadamente 4 nucleótidos y aproximadamente 200 nucleótidos. Generalmente, una longitud de entre aproximadamente 12 nucleótidos y 40 nucleótidos es óptima para la hibridación. Las cadenas de alrededor de 20 a alrededor de 25 nucleótidos se utilizan a menudo con fines de hibridación.

El número de fracciones de ácido nucleico que se unen a la superficie celular puede ser superior a aproximadamente 100,000 por célula. En algunas realizaciones, el número de fracciones de ácido nucleico puede ser una fracción de ácido nucleico hasta aproximadamente 10,000, aproximadamente 30,000 o aproximadamente 50,000. El número de fracciones de ácido nucleico necesarios puede variar en función de factores tales como la aplicación y/o el tipo de célula. En la Figura 1b, se mostró que se instalaron hasta 120,000 cadenas de ADN en cada célula.

En una realización, la fracción de ácido nucleico es un aptámero. Los aptámeros son moléculas de ácido oligonucleico que pueden adoptar una estructura tridimensional y unirse a una molécula diana específica. Los aptámeros generalmente se crean seleccionándolos de un gran grupo de secuencias aleatorias, pero también existen aptámeros naturales en ribointerruptores. Los aptámeros se pueden utilizar tanto para la investigación básica como con fines clínicos como fármacos macromoleculares. Los aptámeros se pueden combinar con ribozimas para autoescindirse en presencia de su molécula objetivo. Estas moléculas compuestas tienen aplicaciones adicionales de investigación, industriales y clínicas. Los aptámeros de ADN o ARN son cadenas cortas de fracciones de ácido nucleico. Los aptámeros son especies de ácidos nucleicos que se han diseñado a través de rondas repetidas de selección in vitro o, de manera equivalente, SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) para unirse a diversos objetivos moleculares, tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos e incluso células, tejidos y organismos. Los aptámeros son útiles en aplicaciones biotecnológicas y terapéuticas, ya que ofrecen propiedades de reconocimiento molecular que rivalizan con las biomoléculas de uso común, los anticuerpos. Además de su reconocimiento discriminado, los aptámeros ofrecen ventajas sobre los anticuerpos, ya que pueden diseñarse completamente en un tubo de ensayo, se producen fácilmente mediante síntesis química, poseen propiedades de almacenamiento deseables y provocan poca o ninguna inmunogenicidad en aplicaciones terapéuticas. La selección de aptámeros incluye un elemento regulador genético basado en ácidos nucleicos llamado ribointerruptor que posee propiedades de reconocimiento molecular similares a las de los aptámeros fabricados artificialmente. Este tipo de aptámero es un nuevo modo de regulación genética.

Un concepto de aptámeros inteligentes y ligandos inteligentes descubre aptámeros con equilibrio predefinido (Kd), constantes de velocidad (kinactivo, kactivo) y parámetros termodinámicos (AH, AS) de interacción aptámero-objetivo. La electroforesis capilar cinética selecciona los aptámeros. Los aptámeros no modificados se eliminan rápidamente del torrente sanguíneo, con una vida media de minutos a horas, principalmente debido a la degradación de la nucleasa y la eliminación del cuerpo por los riñones, como resultado del peso molecular inherentemente bajo del aptámero. Las aplicaciones de aptámeros no modificados actualmente se enfocan en el tratamiento de condiciones transitorias tales como la coagulación de la sangre o en el tratamiento de órganos tales como el ojo donde es posible la administración local. Este aclaramiento rápido puede ser una ventaja en aplicaciones tales como imágenes de diagnóstico in vivo. Un ejemplo es un aptámero de unión a tenascina en desarrollo para imágenes de cáncer. Varias modificaciones, tales como pirimidinas sustituidas con flúor en 2', enlace de polietilenglicol (PEG), etc. (ambos se utilizan en Macugen, un aptámero aprobado por la FDA) están disponibles para los científicos con las que aumentar la vida media de aptámeros fácilmente a la escala de tiempo del día o incluso de la semana.

Además del desarrollo de terapias basadas en aptámeros, muchos investigadores han estado desarrollando técnicas de diagnóstico para el perfilado de proteínas de células enteras llamadas proteómica, y diagnósticos médicos para distinguir entre estado de enfermedad y estado saludable. Como recurso para toda la selección in vitro, la base de datos de aptámeros cataloga todos los experimentos publicados. Esto se encuentra en línea en aptamer.icmb.utexas.edu/. AptaBiD o Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery es una tecnología para el descubrimiento de biomarcadores. AptaBiD se basa en la generación de varios ciclos de aptámeros o un grupo de aptámeros para dianas moleculares diferenciales en las células, lo que facilita la detección exponencial de biomarcadores. Implica tres grandes etapas: (i) selección diferencial de múltiples rondas de aptámeros para biomarcador de células diana; (ii) aislamiento basado en aptámeros de biomarcadores de células diana; y (iii) identificación por espectrometría de masas de biomarcadores. La característica importante de la tecnología AptaBiD es que produce sondas de afinidad sintéticas (aptámeros) simultáneamente con el descubrimiento de biomarcadores. En AptaBiD, se desarrollan aptámeros para biomarcadores de superficie celular en su estado y conformación nativos. Además de facilitar la identificación de biomarcadores, estos aptámeros se pueden usar directamente para el aislamiento celular, la visualización celular y el seguimiento de células in vivo. También se pueden usar para modular las actividades de los receptores celulares y administrar diferentes agentes (por ejemplo, ARNip y fármacos) en las células.

Las afinidades y selectividades de los aptámeros pueden rivalizar con las de los anticuerpos. En la presente invención, los aptámeros pueden modificarse fácilmente de forma específica del sitio durante la síntesis química o enzimática para incorporar informadores, enlazadores u otras fracciones particulares. Además, las estructuras secundarias del aptámero se pueden diseñar para que sufran cambios conformacionales dependientes del analito, lo que, junto con la capacidad de colocar agentes químicos específicamente, permite varios esquemas de transducción de señales posibles, independientemente de si la modalidad de detección es óptica, electroquímica o basada en masa.

En otra realización, la fracción de ácido nucleico es una secuencia de ácido oligonucleico que se puede utilizar como secuencia de identificación, secuencia de código de barras, sonda, secuencia de captura para hibridación, secuencia de reconocimiento, secuencia de control de la expresión génica, secuencia génica, potenciadores, y/o secuencias que incorporan o se derivan de enzimas, proteínas u otras secuencias de origen natural.

En una realización, las secuencias de fracciones de ácido nucleico unidas a la célula son las mismas. En otra realización, las secuencias de fracciones de ácido nucleico unidas a la célula pueden ser diferentes. Esto permitiría la unión de fracciones de ácido nucleico para múltiples usos. Por ejemplo, una fracción de ácido nucleico de captura para la captura de la célula en una ubicación particular y secuencias de hibridación o activadas para lograr una actividad o utilidad específica.

En algunas realizaciones, la fracción de ácido nucleico puede ser un oligonucleótido, ADN, ARN, PNA o un aptámero. En otras realizaciones, la fracción de ácido nucleico puede ser ADN monocatenario (ADNmc). En algunas otras realizaciones, la fracción de ácido nucleico puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 ácidos nucleicos. En aún otras realizaciones, la fracción de ácido nucleico puede ser un aptámero.

La fracción de ácido nucleico de la presente invención también puede incluir un enlazador. En otra realización, se usa un conector químico para el sistema de unión celular para unir el oligonucleótido a la superficie celular. Con referencia ahora a la Figura 1A, el enlazador facilita la unión a una fracción celular en la superficie celular tal como un aminoácido, carbohidrato u otra fracción de la superficie celular. En una realización, el enlazador es una fracción que puede unirse directamente al aminoácido en la célula sin modificar primero el aminoácido (o carbohidrato u otra fracción en la superficie celular). El enlazador químico se coloca en un extremo del oligonucleótido que se va a unir. En una realización, la formación de un enlace con un aminoácido en la proteína de la superficie celular por el enlazador químico altera su carácter y se forma un enlace covalente entre el aminoácido y el oligonucleótido de ácido nucleico a través del enlazador químico. En algunas realizaciones, el enlace formado es un enlace amida o éster. Por lo tanto, en el proceso de unión al aminoácido, el conector químico cambiará típicamente su carácter para formar la amida, el éster u otro enlace, y la fracción de la superficie celular también se adaptará para convertirse en parte del enlace covalente.

Un éster de N-hidrosuccinimida (NHS) es un enlazador químico, formado por la reacción de un carboxilato con NHS en presencia de carbodiimida. Los reactivos que contienen éster de NHS o sulfo-NHS reaccionan con nucleófilos con liberación del grupo saliente NHS o sulfo-NHS para formar un producto acilado. La reacción de tales ésteres con un grupo sulfhidrilo o hidroxilo forma enlaces éster o enlaces éster sulfohidrilo. Ambos enlaces pueden potencialmente hidrolizarse en ambientes acuosos o intercambiarse con aminas vecinas para formar enlaces amida y un grupo saliente NHS.

En otra realización, el enlazador químico es un agente de entrecruzamiento heterobifuncional. El agente de entrecruzamiento heterobifuncional es un NHS-PEOⁿ-Maleimida. Los reactivos de NHS-PEOⁿ-maleimida son agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales con éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) y grupos maleimida que permiten la conjugación covalente de moléculas que contienen amina y sulfhidrilo.

En otra realización, los reticuladores que tienen espaciadores de polietilenglicol (PEG), también denominado polietilenóxido (PEO), son alternativas convenientes a los reactivos con brazos espaciadores puramente de hidrocarburo. Los espaciadores de PEG mejoran la solubilidad en agua del reactivo y el conjugado, reducen el potencial de agregación del conjugado y aumentan la flexibilidad del entrecruzamiento, lo que da como resultado una respuesta inmunogénica reducida al propio espaciador. A diferencia de los reactivos de PEG típicos que contienen mezclas heterogéneas de diferentes longitudes de cadena de PEG, estos reactivos de PEO son compuestos homogéneos de peso molecular y longitud de brazo espaciador definidos, lo que proporciona una mayor precisión en la optimización y caracterización de las aplicaciones de reticulación. Por ejemplo, se usó éster de succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)-hexaetilenglicol] en los ejemplos para preparar una solución madre disolviendo 5 mg de NHS-PEO⁶-maleimida (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL 61105).

En otra realización, la presencia de ácido siálico y EDC o clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (una carbomida utilizada para conjugar sustancias biológicas que contienen carboxilatos y aminas), un NHS -maleimida puede conjugarse con un sulfohidrilo-oligonucleótido y reaccionó con un aminoácido para formar un enlace éster en la superficie celular.

Los aminoácidos posibles para formar la amida, el éster u otro enlace con el conector en el oligonucleótido incluyen lisina, cisteína, aspartamato, glutamato, tirosina, triptófano y serina. Generalmente, la lisina, la cisteína, el aspartamato, el glutamato y la tirosina forman enlaces amida con un oligonucleótido NHS, y la serina formará un enlace éster con un oligonucleótido NHS. Otros enlazadores pueden formar diferentes enlaces. Por ejemplo, se pueden usar reactivos que incluyen maleimida, disulfuro y el proceso de acilación para formar un enlace covalente directo con una cisteína en una proteína de la superficie celular. El acoplamiento de amida se puede usar en un aspartamato y glutamato para formar una unión amida. El acoplamiento, la acilación y la alquilación de diazonio se pueden usar en una tirosina en la superficie celular para formar un enlace de unión amida. Es posible que cualquiera de los aminoácidos (20 aminoácidos o cualquier aminoácido no natural) pueda usarse para formar el enlace covalente directo que es la unión del oligonucleótido con la superficie celular. Los 20 aminoácidos son isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina (aminoácidos esenciales), y alanina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamato, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina, los aminoácidos no esenciales, y también arginina e histidina.

En general, se describe que cualquier molécula de afinidad útil en la técnica anterior, en combinación con un ligando conocido para proporcionar el reconocimiento específico de una sustancia detectable, encontrará utilidad en la unión de grupos de ácido nucleico. Los ejemplos de tales moléculas biológicas que luego se pueden unir a estos grupos funcionales incluyen moléculas enlazadoras que tienen un asociado de unión conocido, o molécula de afinidad, incluyen pero no se limitan a, polisacáridos, lectinas, selectinas, ácidos nucleicos (tanto monoméricos como oligoméricos), proteínas, enzimas, lípidos, anticuerpos y moléculas pequeñas tale como azúcares, péptidos, aptámeros, fármacos y ligandos.

La unión es covalente. Un agente de entrecruzamiento bifuncional útil para la invención comprendería dos grupos reactivos diferentes capaces de acoplarse a dos dianas funcionales diferentes tales como péptidos, proteínas, macromoléculas, nanocristales semiconductores o sustrato. Los dos grupos reactivos pueden ser iguales o diferentes e incluyen, pero no se limitan a, grupos reactivos tales como tiol, carboxilato, carbonilo, amina, hidroxilo, aldehído, cetona, hidrógeno activo, éster, sulfhidrilo o fracciones fotorreactivas. Por ejemplo, en una realización, un agente de entrecruzamiento puede tener un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol en los extremos funcionales. Otros ejemplos de agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales que se pueden usar como agentes de enlace en la invención incluyen, pero no se limitan a:

agentes de entrecruzamiento reactivos con amina reactivos con sulfhidrilo.

agentes de entrecruzamiento reactivos con carbonilo reactivos con sulfhidrilo.

agentes de entrecruzamiento reactivos con amina fotorreactivos

agentes de entrecruzamiento reactivos con sulfhidrilo fotorreactivos

agentes de entrecruzamiento reactivos con carbonilo fotorreactivos.

agentes de entrecruzamiento reactivos con carboxilato fotorreactivos

agentes de entrecruzamiento reactivos con arginina fotorreactivos

A continuación se muestra una lista de categorías en las que generalmente encajan los agentes de entrecruzamiento. La lista es ejemplar y no debe considerarse exhaustiva de los tipos de agentes de entrecruzamiento que pueden ser útiles para la invención. Para cada categoría, es decir, a qué grupo funcional se dirigen estos químicos, hay algunas subcategorías, porque un grupo reactivo es capaz de reaccionar con varios grupos funcionales.

La mayoría de los agentes de entrecruzamiento con grupos reactivos se pueden clasificar en términos generales en las siguientes categorías:

1. Reactivo con amina: el agente de entrecruzamiento se acopla a una molécula que contiene amina (NH2).

2. Reactivo con Tiol: el agente de entrecruzamiento se acopla a una molécula que contiene sulfhidrilo (SH)

3. Reactivo con carboxilato: el agente de entrecruzamiento se acopla a una molécula que contiene ácido carboxílico (COOH).

4. Reactivo con hidroxilo: el agente de entrecruzamiento se acopla a una molécula que contiene hidroxilo (-OH).

5. Reactivo con aldehído y cetona: el agente de entrecruzamiento se acopla a un aldehído (-CHO) o cetona (R2CO) que contiene la molécula.

6. Reactivo con hidrógeno activo.

7. Foto-reactivo.

Más específicamente, los productos químicos que entran en estas categorías incluyen, pero no se limitan a, los que contienen:

1. Isotiocianatos, isocianatos, acilazidas, ésteres de NHS, cloruros de sulfonilo, aldehídos y glioxales, epóxidos y oxiranos, carbonatos, agentes arilantes, imidoésteres, carbodiimidas, anhídridos, alquinos.

2. Derivados de haloacetilo y haluros de alquilo, maleimidas, aziridinas, derivados de acriloilo, agentes arilantes, reactivos de intercambio tiol-disulfuros

3. Diazoalcanos y compuestos de diazoacetilo, tal como carbonildiimidazoles y carbodiimidas

4. Epóxidos y oxiranos, carbonildiimidazol, oxidación con peryodato, carbonato de N,N'-disuccinimidilo o cloroformiato de N-hidroxilsuccimidilo, oxidación enzimática, halógenos de alquilo, isocianatos

5. Derivados de hidrazina para la formación de bases de Schiff o aminación por reducción

6. Derivados de diazonio para reacciones de condensación y yodación de mannich

7. Arilazidas y arilazidas halogenadas, benzofenonas, compuestos diazoicos, derivados de la diazirina

Para cada una de estas subcategorías hay muchos ejemplos de productos químicos. Todos estos productos químicos y la lista anterior de subcategorías se describen en la técnica anterior, pero muchos se pueden encontrar en "Bioconjugate Techniques" por Greg T Hermanson, Academic Press, San Diego, 1996.

La elección de la solución tampón en donde se lleva a cabo la conjugación y la unión a las células depende de la elección del enlazador químico o agente de entrecruzamiento y del mantenimiento de las condiciones de crecimiento de las células (es decir, para prevenir la lisis celular). En una realización preferida, el rango de la solución tampón es de pH 6-8 y no debe contener los mismos grupos funcionales usados en el enlazador químico para reaccionar con el ácido nucleico monocatenario. Un pH de 7.2 es el pH medio, pero el pH no tiene por qué ser neutro, sino que depende de la compatibilidad con la reacción química y las condiciones celulares.

En una realización, la solución tampón es una solución tampón de fosfato de pH neutro de modo que se puede usar un éster de N-hidrosuccinimida (NHS) (por ejemplo, NHS-PEO-maleimida) como enlazador químico. La reacción generalmente se lleva a cabo en condiciones que permitan la conjugación del enlazador químico y el ácido nucleico y la posterior unión a la célula o a la superficie celular. En algunas realizaciones en las que se usa un agente de entrecruzamiento de éster de NHS y una solución tampón de fosfato, las reacciones se llevan a cabo a pH neutro (por ejemplo, pH 7.2) y a temperatura ambiente durante un período de tiempo específico (por ejemplo, 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 o más minutos).

En algunas realizaciones, el conjugado incluye una célula de mamífero que tiene lisina en la superficie celular y un ADN monocatenario unido covalentemente a la lisina a través de una amida.

Los conjugados de la presente invención se pueden preparar por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En general, el método implica unir el ADN al grupo funcional nativo de una célula en donde la célula no está modificada, pero aislando la célula de otro material biológico que pueda interferir con el paso de conjugación. Puede usarse cualquier técnica de bioconjugación, como las descritas anteriormente en Hermanson.

En algunas realizaciones, la presente invención incluye un método para preparar un conjugado de una célula y una fracción de ácido nucleico, poniendo en contacto la célula con una fracción de ácido nucleico activado, en donde la célula tiene una superficie que incluye un grupo funcional nativo y en donde la célula no tiene pared celular, de modo que la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente al grupo funcional nativo.

La fracción de ácido nucleico activado incluye un enlazador, como se describe anteriormente. En algunas realizaciones, la fracción de ácido nucleico activado incluye un éster activado. En otras realizaciones, el método para preparar los conjugados incluye poner en contacto una célula de mamífero con una fracción de ácido nucleico activado, en donde el grupo funcional nativo incluye lisina y la fracción de ácido nucleico activado incluye un éster de NHS, de modo que la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente al grupo funcional nativo mediante la formación de enlaces amida.

B. Conjugados de células con paredes celulares (que no forman parte de la presente invención)

También se describen conjugados de fracciones de ácido nucleico y células con paredes celulares, así como métodos de preparación. Se describe un conjugado de una célula que tiene una pared celular y una fracción de ácido nucleico en donde la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente a la célula. La fracción de ácido nucleico está unida covalentemente a la superficie celular.

El grupo funcional nativo puede ser cualquier grupo funcional nativo adecuado, tal como un aminoácido o un azúcar. Los azúcares útiles para enlazarse a la fracción de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, glucosa, ribosa, fructosa, ácido siálico, mañosa, galactosa, sacarosa, lactosa y otros. Otros azúcares incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.

La unión de oligonucleótidos a las superficies celulares se puede lograr con células vegetales, células bacterianas, hongos, levaduras, algas y arqueas. En este caso, la unión requiere primero una modificación de una molécula de carbohidrato en la superficie celular y, luego, la unión de un enlazador de oligonucleótidos a la fracción modificada. La principal diferencia entre las células animales y las células vegetales es que las células vegetales tienen paredes celulares, por lo que requieren modificación antes de la unión del oligonucleótido. La unión de los oligonucleótidos se puede lograr mediante la oxidación con peryodato seguida de la formación de hidrazona. Se puede modificar un carbohidrato en la célula vegetal en lugar de modificar una proteína como en otras realizaciones usando células de mamíferos o animales. En el presente ejemplo, el carbohidrato de azúcar se oxida para generar un aldehído funcional (o una cetona). Luego se hace reaccionar un aldehído o una cetona con hidrizido-ADN sintético para formar un enlace covalente llamado hidrazona.

Más generalmente, la composición comprende un oligonucleótido conjugado con un conector químico, el conector unido covalentemente a una superficie exterior de la célula. La unión o enlace es generalmente una hidrazona, una oxima o una amina. El método para formar el enlace entre el oligonucleótido y el carbohidrato de la superficie celular incluye modificar el carbohidrato de la superficie celular no animal para formar un aldehído o una cetona. El proceso de esta formación puede incluir oxidación de peryodato. Luego, el aldehído o la cetona se pone en contacto con un oligonucleótido que tiene un grupo funcional que reacciona para formar un enlace covalente. El enlace covalente puede ser una hidrazona, una oxima o un enlace de amina entre el conector en el oligonucleótido y el carbohidrato en la superficie de la célula. Generalmente, el enlace con estos enlaces está en un carbohidrato en la superficie celular. La reacción se puede realizar con una célula no animal o una célula animal, preferiblemente con células no animales tales como plantas, levaduras, bacterias y algas y otros organismos unicelulares. En algunas realizaciones, la célula es una célula vegetal.

El grupo funcional nativo incluye un grupo funcional nativo modificado. Como se describió anteriormente, el grupo funcional nativo puede ser un azúcar que tiene un grupo 1,2-diol que se oxida para formar aldehídos o cetonas. El grupo funcional nativo modificado incluye un azúcar oxidado. Alternativamente, el grupo funcional nativo modificado incluye ácido siálico, manosa, glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina o N-acetilmanosamina.

También se describe un método para preparar los conjugados de una fracción de ácido nucleico y una célula con pared celular. Como se describió anteriormente, el método puede incluir un proceso de dos pasos de modificar primero el grupo funcional nativo de la célula que tiene una pared celular, seguido de la conjugación de la fracción de ácido nucleico al grupo funcional nativo modificado.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para preparar un conjugado de una célula y una fracción de ácido nucleico, que incluye poner en contacto la célula con una fracción de ácido nucleico activado en donde la célula tiene una pared celular, de modo que la fracción de ácido nucleico se une a la célula. La fracción de ácido nucleico activado puede incluir cualquier grupo activado adecuado para permitir la conjugación de la fracción de ácido nucleico con la célula, como se describe anteriormente. La fracción de ácido nucleico activado incluye un aminooxi, una hidrazida, una hidrazina, una semicarbazida, una tiosemicarbazida o una amina. Alternativamente, la fracción de ácido nucleico activado puede incluir cisteína para formar tiazolidinas o serina para formar oxazolidinas. Otros métodos para conjugar la fracción de ácido nucleico y la célula se describen en Hermanson (véase arriba).

El método de preparación del conjugado con una célula que tiene paredes celulares también incluye el paso de modificar el grupo funcional nativo. En algunas realizaciones, el método para preparar el conjugado de una fracción de ácido nucleico y una célula con paredes celulares incluye poner en contacto el grupo funcional nativo con un agente modificador para preparar un grupo funcional nativo modificado, de modo que la fracción de ácido nucleico se une covalentemente a el grupo funcional nativo modificado.

El agente modificador puede ser cualquier agente adecuado para preparar el grupo funcional nativo modificado. Por ejemplo, el agente modificador incluye, pero no se limita a, un agente oxidante. En algunas realizaciones, el agente modificador incluye un agente oxidante. Los agentes oxidantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, peryodato de sodio. El agente oxidante incluye peryodato de sodio. Alternativamente, el grupo funcional nativo modificado incluye un azúcar oxidado. Alternativamente, el grupo funcional nativo modificado incluye un ácido siálico oxidado. Alternativamente, el grupo funcional nativo modificado incluye un grupo aldehído.

IV. Dispositivos

La presente invención también proporciona superficies de sustrato y dispositivos que incluyen los conjugados de la presente invención. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un dispositivo que incluye una célula que tiene una superficie celular que incluye un grupo funcional nativo unido covalentemente a una primera fracción de ácido nucleico. El dispositivo también incluye una superficie de sustrato que incluye una segunda fracción de ácido nucleico complementario a la primera fracción de ácido nucleico, de modo que la célula se une a la superficie del sustrato mediante la formación de un dúplex de ácido nucleico de la primera y segunda fracciones de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la célula es una célula animal.

La superficie del sustrato puede ser de cualquier material adecuado. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen, pero no se limitan a, vidrio (incluido el vidrio de poro controlado), polímeros (por ejemplo, poliestireno, poliuretano, copolímero de poliestireno-divinilbenceno), caucho de silicona, cuarzo, látex, un metal de transición derivable, materiales magnéticos, dióxido de silicio, nitruro de silicio, arseniuro de galio y derivados de los mismos. La superficie del sustrato también puede tener cualquier geometría de superficie adecuada, incluidas, pero no limitadas a plana, curva y esférica.

En algunas realizaciones, la superficie del sustrato es plana. En otras realizaciones, la superficie del sustrato es esférica.

En algunas realizaciones, el dispositivo también incluye canales para fluidos. En otras realizaciones, los canales son microcanales. En algunas otras realizaciones, los canales son nanocanales.

En algunas realizaciones, el dispositivo incluye un sensor. En otras realizaciones, el sensor incluye un nanosensor. En algunas otras realizaciones, el sensor incluye un electrodo. En todavía otras realizaciones, el sensor incluye un sensor piezoeléctrico. En aún otras realizaciones, el dispositivo está adaptado para microscopía de fuerza atómica.

En algunas realizaciones, el dispositivo está adaptado para el análisis bioquímico o electroquímico de la célula. En otras realizaciones, el análisis bioquímico incluye análisis genómico. En algunas otras realizaciones, el dispositivo también incluye un componente seleccionado de un calentador microfabricado, un sensor de temperatura, cámaras de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o canales de separación electroforética capilar. En todavía otras realizaciones, el dispositivo es capaz de generar un perfil transcripcional de la célula.

En algunas realizaciones, el dispositivo también incluye un biorreactor.

En otra realización, la presente invención proporciona una plataforma para observar y detectar procesos que pueden estudiarse a través de la captura de células mediante la unión de oligonucleótidos, tales como la cicatrización de heridas, la regeneración de tejidos, la infección, la reactividad o la capacidad de respuesta a los fármacos de prueba, el cribado de fármacos en general y expresión génica en respuesta a estímulos. La presente invención también proporciona métodos y sistemas sintéticos que permiten que se estudien o detecten varios estados y condiciones humanas (por ejemplo, enfermo y normal) a través de la captura de células mediante la unión de oligonucleótidos. Por ejemplo, la unión de oligonucleótidos a las células también se puede aplicar en la práctica del diagnóstico de una enfermedad mediante la detección de un marcador de la superficie celular de la enfermedad mediante la detección de la hibridación del marcador de la superficie celular con un oligonucleótido de captura.

Las células que tienen cadenas de oligonucleótidos unidas en su superficie se pueden hibridar o fusionar entre sí en tres dimensiones, tal como un fluido o un gel. Muchas aplicaciones de esta tecnología son posibles. Se puede usar un andamio o malla tridimensional para modelar muchas más células de las que se pueden mostrar en una superficie plana. Por lo tanto, en una realización, una malla, un material a granel poroso o un andamio se pueden modificar para mostrar oligonucleótidos unidos a la superficie de modo que las células modificadas usando los presentes métodos se puedan mostrar o capturar en la superficie. Estas superficies se pueden utilizar para estudiar la genética, el envejecimiento y la respuesta a fármacos o para la ingeniería metabólica y la producción y recolección de subproductos celulares.

Por ejemplo, las células se pueden usar para estudiar la regeneración de tejidos, tal como la regeneración de tejido miocárdico, en donde un número crítico de células forma una unidad de latido tras la acumulación del número suficiente de células. Cualquier tejido puede “crecer” potencialmente utilizando una matriz de fijación de células sembradas para generar una red de células que interactúan. La dinámica y los productos de dichos agregados celulares y tejidos simulados pueden estudiarse y controlarse. Por ejemplo, la diferenciación y el almacenamiento de células madre pueden facilitarse utilizando el sistema de unión celular. Por ejemplo, las células madre adultas y las células madre pluripotentes inducidas pueden evitar la diferenciación o guiarse a un estado diferenciado como un tipo de célula deseado. Pueden generarse tejidos artificiales para reemplazar tejidos perdidos, dañados o enfermos en animales, incluidos los seres humanos. La regeneración del tejido neural y espinal puede efectuarse en el entorno adecuado in vitro o in vivo. Para guiar o estudiar las células en un sistema de este tipo, se puede colocar un sensor dentro de las células o sobre una superficie en contacto con las células.

El sistema de unión celular se puede usar con fines de administración, usando la célula con oligonucleótidos unidos para administrar otras moléculas de la superficie celular tales como aptámeros, moléculas reguladoras de genes, moléculas de control de la expresión génica, genes para el control de la expresión génica. El sistema de unión celular también se puede usar para suministrar a otra célula el contenido de la célula que tiene los oligonucleótidos unidos. Por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos, peptidomiméticos, vectores que tienen ADN para la expresión génica, moléculas de ARN de interferencia tales como ARN inhibidor pequeño o ARN de horquilla corta y otras moléculas administrables. Un aptámero en la superficie de la célula puede unirse a un receptor de internalización y la célula se internaliza con su contenido. En general, una célula que tiene en su superficie un oligonucleótido que es un aptámero adaptado para unirse a una proteína proporcionará el mecanismo de suministro hacia o dentro de otra célula viva. El aptámero en sí puede comprender un ácido nucleico adaptado para actuar dentro de la célula, tal como un oligonucleótido para la expresión en la célula, un ARN de interferencia (tal como un ARNip, un ARNhc o un microARN) o una baliza molecular tal como un ácido nucleico. que tiene un marcador adaptado para unirse a una secuencia específica en la célula y proporcionar detección óptica de esa secuencia o gen representado por esa secuencia. Los ácidos nucleicos pueden potenciar la expresión génica, controlar la expresión génica, bloquear la expresión génica o modificar la expresión génica, entre otras actividades de modificación genómica.

En otra realizacion, la invencion proporciona métodos para patrones específicos de secuencia o captura de células en un sustrato y métodos de cribado. Por ejemplo, una célula o muestra de células se puede incubar con tampón de fosfato PBS pH 7.2 y el enlazador durante varios minutos a varias horas como se describe en los ejemplos para unir el oligonucleótido monocatenario a la superficie celular, lo que da como resultado una célula modificada en su superficie con un oligonucleótido. Se puede preparar una superficie de sustrato que tenga una secuencia (por ejemplo, una secuencia de captura de ADNmc) unida a la superficie del sustrato. En una realización, el oligonucleótido monocatenario unido a la célula es complementario a la secuencia de captura de ADNmc unida al sustrato de manera que cuando se permite que la célula entre en contacto con el sustrato, las dos secuencias se hibridan, inmovilizando así la célula al sustrato.

Por lo tanto, en otra realización, la presente invención proporciona además dispositivos que presentan células inmovilizadas en una superficie usando los presentes métodos de modificación de células. En una realización, los dispositivos de esta invención pueden ser sensores modelados en micromatrices o patrones similares a micromatrices. En otra realización, la célula o la membrana celular con oligonucleótidos unidos se puede usar en un dispositivo para analizar la célula u otros fines. En algunas realizaciones, el dispositivo tendrá oligonucleótidos complementarios en su superficie para hibridar con un oligonucleótido unido a una célula usando los presentes métodos. El dispositivo puede tener cualquier forma útil, por ejemplo plana o esférica. Puede tener canales para fluidos (es decir, microcanales o nanocanales). El dispositivo puede incluir un sensor, tal como un nanosensor, un electrodo o un electrodo piezoeléctrico. El dispositivo se puede adaptar para microscopía de fuerza atómica, análisis bioquímico de la célula o análisis genómico. El dispositivo puede tener componentes adicionales tales como un calentador, un sensor de temperatura y componentes tales como cámaras de PCR y canales de separación electroforética capilar para generar un perfil transcripcional de la célula, entre otros posibles procesos. El dispositivo puede comprender además un biorreactor. El dispositivo puede comprender un componente seleccionado de un calentador microfabricado, un sensor de temperatura, cámaras de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y canales de separación electroforética capilar.

En una realización, para la detección del evento de hibridación, el oligonucleótido unido a la célula o el oligonucleótido complementario o el oligonucleótido de captura en el dispositivo se marca dependiendo del dispositivo. Por ejemplo, si la etiqueta se agrega con la mezcla de amplificación, el ADNc está en la cadena molde mientras que las sondas están en la cadena en sentido (a menos que sean controles negativos). El marcador es típicamente fluorescente, aunque ocasionalmente se usan radiomarcadores y similares. El etiquetado puede ser directo o indirecto. El marcaje indirecto requiere una etapa de acoplamiento que puede ocurrir antes o después de la hibridación. Si el marcaje se produce antes de la hibridación, se pueden emplear nucleótidos de hibridación (por ejemplo, en matrices de dos canales) marcados con tintes tales como tintes aminoalil-UTP y NHS aminorreactivos (tal como tintes de cianina). El grupo aminoalilo es un grupo amina típicamente en un conector largo unido a la nucleobase, que reacciona con un tinte reactivo. En algunas realizaciones, los nucleótidos modificados (típicamente una mezcla de 1 aaUTP: 4 TTP) se agregan enzimáticamente a una tasa más baja en comparación con los nucleótidos normales, lo que generalmente da como resultado 1 cada 60 bases, según se mide con un espectrofotómetro. A continuación, el aaADN se purifica con una columna, por ejemplo, utilizando una solución que contiene tampón Tris fosfato que contiene grupos amina.

Las micromatrices se pueden fabricar utilizando una variedad de tecnologías, incluida la impresión con alfileres de punta fina en portaobjetos de vidrio, fotolitografía con máscaras prefabricadas, fotolitografía con dispositivos de microespejos dinámicos, impresión por inyección de tinta o electroquímica en matrices de microelectrodos. En las micromatrices de manchas, las sondas son oligonucleótidos, ADNc o pequeños fragmentos de productos de PCR que corresponden a ARNm. Las sondas se sintetizan antes del depósito sobre la superficie de la matriz y luego se "manchan" sobre el vidrio. Un enfoque común utiliza una matriz de alfileres o agujas finas controladas por un brazo robótico que se sumerge en pocillos que contienen sondas de ADN y luego deposita cada sonda en ubicaciones designadas en la superficie de la matriz. La "cuadrícula" de sondas resultante representa los perfiles de ácido nucleico de las sondas preparadas y está lista para recibir "dianas" de ADNc o ARNc complementarias derivadas de muestras experimentales o clínicas.

En una realización, las sondas de oligonucleótidos en estas micromatrices de oligonucleótidos son secuencias cortas diseñadas para emparejar partes de la secuencia de marcos de lectura abiertos conocidos o predichos. En una matriz de este tipo, el oligonucleótido dispuesto en el sustrato se puede producir imprimiendo secuencias de oligonucleótidos cortas diseñadas para representar un solo gen o una familia de variantes de empalme de genes sintetizando esta secuencia directamente en la superficie de la matriz en lugar de depositar secuencias intactas. Las secuencias pueden ser más largas (sondas de 60 mer tales como el diseño de Agilent) o más cortas (sondas de 25 mer producidas por Affymetrix) según el propósito deseado; las sondas más largas son más específicas para los genes diana individuales, las sondas más cortas pueden ser manchadas con mayor densidad en toda la matriz y son más económicas de fabricar. Una técnica utilizada para producir matrices de oligonucleótidos incluye la síntesis fotolitográfica (Agilent y Affymetrix) en un sustrato de sílice donde se utiliza luz y agentes de enmascaramiento sensibles a la luz y para "construir" una secuencia de un nucleótido a la vez en toda la matriz. Cada sonda aplicable se "desenmascara" selectivamente antes de bañar la matriz en una solución de un solo nucleótido, luego tiene lugar una reacción de enmascaramiento y el siguiente conjunto de sondas se desenmascara en preparación para una exposición de nucleótido diferente. Después de muchas repeticiones, las secuencias de cada sonda se construyen por completo. Más recientemente, Maskless Array Synthesis de NimbleGen Systems ha combinado flexibilidad con un gran número de sondas.

Las micromatrices de dos colores o las micromatrices de dos canales típicamente se hibridan con ADNc preparado a partir de dos muestras para comparar (por ejemplo, tejido enfermo versus tejido sano o células enfermas frente a células sanas) y que se marcan con dos fluoróforos diferentes. Los tintes fluorescentes comúnmente utilizados para el marcaje de ADNc incluyen Cy3, que tiene una longitud de onda de emisión de fluorescencia de 570 nm (que corresponde a la parte verde del espectro de luz), y Cy5 con una longitud de onda de emisión de fluorescencia de 670 nm (que corresponde a la parte roja de espectro de luz). Las dos muestras de ADNc marcadas con Cy se mezclan y se hibridan en una sola micromatriz que luego se escanea en un escáner de micromatrices para visualizar la fluorescencia de los dos fluoróforos después de la excitación con un rayo láser de una longitud de onda definida. A continuación, las intensidades relativas de cada fluoróforo se pueden usar en un análisis basado en proporciones para identificar genes sobrerregulador y subregulados.

Las presentes modificaciones de célula pueden hacerse a las células y usarse en aplicaciones, métodos y dispositivos de microfluidos. Los presentes métodos de modificación de la superficie celular permiten la captura e inmovilización de una única célula sobre una superficie, lo que permite actuar sobre la célula de diversas formas. Por ejemplo, en una realización específica, se puede fabricar un dispositivo microfluídico integrado como el descrito en el Ejemplo 4 y descrito en Toriello, et al, Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105, 20173-20178, 23 de diciembre de 2008;105(51):20173-8. Epub 15 de diciembre de 2008. Este microdispositivo integrado fue desarrollado para el análisis de la expresión génica en células individuales. La amplificación por PCR de transcripción inversa de una sola célula está habilitada por la inmovilización y captura de una sola célula en la superficie de este microdispositivo integrado.

Por lo tanto, en una realización, los presentes métodos permiten estructuras microfluídicas que presentan células inmovilizadas utilizando las presentes modificaciones celulares directas. Tales estructuras microfluídicas pueden incluir sistemas microneumáticos, es decir, microsistemas para el manejo de fluidos fuera del chip (bombas de líquido, válvulas de gas, etc.) y estructuras microfluídicas para el manejo en el chip de volúmenes de nanolitros y picolitros para su uso en diversos procedimientos de biología molecular, tal como para análisis enzimático (por ejemplo, ensayos de glucosa y lactato), análisis de ADN (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación de alto rendimiento) y proteómica.

Tales dispositivos de microfluidos están destinados a integrar operaciones de ensayo tales como la detección, así como el pretratamiento de muestras y la preparación de muestras en un solo chip. Un área de aplicación emergente para los biochips es la patología clínica, especialmente el diagnóstico inmediato de enfermedades en el punto de atención. Además, los dispositivos basados en microfluidos, capaces de realizar muestreos continuos y análisis en tiempo real de muestras de aire/agua en busca de toxinas bioquímicas y otros patógenos peligrosos, pueden servir como biosensores (por ejemplo, una "alarma de biohumo") para una alerta temprana.

En otra realización, los microfluidos para usar con células que tienen oligonucleótidos unidos por el presente método incluyen tecnologías de flujo continúo basadas en la manipulación del flujo de líquido continuo a través de canales microfabricados. El accionamiento del flujo de líquido se implementa mediante fuentes de presión externas, bombas mecánicas externas, microbombas mecánicas integradas o mediante mecanismos electrocinéticos. La operación de microfluidos de flujo continuo es el enfoque principal porque es fácil de implementar y menos sensible a los problemas de ensuciamiento de proteínas. Los dispositivos de flujo continuo son adecuados para muchas aplicaciones bioquímicas simples y bien definidas, y para ciertas tareas tales como la separación química, pero son menos adecuados para tareas que requieren un alto grado de flexibilidad o manipulaciones de fluidos complicadas. Las capacidades de monitorización de procesos en sistemas de flujo continuo se pueden lograr con sensores de flujo de microfluidos altamente sensibles basados en tecnología MEMS que ofrecen resoluciones de hasta el rango de nanolitros.

Otras realizaciones incluyen, pero no se limitan a, alternativas microfluídicas digitales (basadas en gotas) a los sistemas de flujo continuo de canal cerrado anteriores que incluyen novedosas estructuras abiertas, donde se manipulan gotas discretas controlables de forma independiente sobre un sustrato.

Además de micromatrices, otra realización comprende biochips diseñados para electroforesis bidimensional, análisis de transcriptoma, amplificación por PCR, etc. Otras aplicaciones incluyen diversas aplicaciones de electroforesis y cromatografía líquida para proteínas y ADN, separación de células, en particular separación de células sanguíneas, análisis de proteínas, manipulación y análisis de células, incluido el análisis de viabilidad celular y la captura de microorganismos.

En otra realización, los presentes métodos de modificación directa de células permiten un dispositivo para la formación de imágenes, la manipulación y el diseño de células individuales. Por ejemplo, las células se pueden analizar o modelar usando un microscopio de fuerza atómica (AFM) o un microscopio de fuerza de barrido (SFM). Por lo tanto, en una realización, un dispositivo tal como un voladizo AFM como se describe en Hsiao SC et al., DNA-coated AFM cantilevers for the investigation of cell adhesion and the patterning of live cells, Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(44):8473-7, 16 de septiembre de 2008 Epub, y también se describe en el Ejemplo 8. Las ventajas que aporta la tecnología incorporada en la invención a un dispositivo AFM es la capacidad de colocar células con precisión usando voladizos AFM para análisis y manipulación. Tanto AFM como SFM son microscopios de sonda de barrido de muy alta resolución, con una resolución demostrada de fracciones de nanómetro, más de 1000 veces mejor que el límite de difracción óptica.

La capacidad de someter una célula viva entera a un AFM utilizando el sistema de unión de oligonucleótidos de la invención brinda la oportunidad de analizar específicamente múltiples tipos de células, simultáneamente y, de hecho, de analizar una sola célula con mayor fidelidad porque se mantiene y controla de forma segura desde su anclaje de oligonucleótidos. Por ejemplo, otra aplicación importante de AFM (además de la obtención de imágenes) es la espectroscopia de fuerza, la medición de curvas de fuerza-distancia. Para este método, la punta del AFM se extiende hacia la superficie y se retrae de ella mientras se controla la desviación estática del voladizo en función del desplazamiento piezoeléctrico. Estas medidas se han utilizado para medir contactos a nanoescala, enlaces atómicos, fuerzas de Van der Waals y fuerzas de Casimir, fuerzas de disolución en líquidos y fuerzas de ruptura y estiramiento de moléculas individuales. Las fuerzas del orden de unos pocos pico-Newtons ahora se pueden medir de forma rutinaria con una resolución de distancia vertical mejor que 0.1 nanómetros.

La micro y nanotecnología se están aplicando al análisis químico, la monitorización ambiental, el diagnóstico médico y la celómica y los microrreactores para productos farmacéuticos. Se espera que la investigación en sistemas de laboratorio en un chip (LOC) se extienda también hacia la reducción de escala de las estructuras de manejo de fluidos, mediante el uso de nanotecnología. Los canales de tamaño nanométrico y submicrométrico, los laberintos de ADN, la detección y el análisis de células individuales y los nanosensores podrían volverse viables y permitir nuevas formas de interacción con especies biológicas y moléculas grandes. La presente invención contribuye a hacer posibles estos sistemas para células enteras. Los sistemas LOC pueden realizar PCR en tiempo real, facilitar ensayos bioquímicos, inmunoensayos, detectar bacterias, virus y cánceres basados en reacciones antígeno-anticuerpo, dielectroforesis para detectar células cancerosas y bacterias, preparación de muestras de sangre, romper células para extraer ADN, análisis celular, en cribado de canales.

La tecnología de "lab-on-a-chip" pronto puede convertirse en una parte importante de los esfuerzos para mejorar la salud global, particularmente a través del desarrollo de dispositivos de prueba en el punto de atención. En países con pocos recursos de atención médica, las enfermedades infecciosas que serían tratables en una nación desarrollada suelen ser mortales. En algunos casos, las clínicas de salud deficientes tienen los medicamentos para tratar una determinada enfermedad, pero carecen de las herramientas de diagnóstico para identificar a los pacientes que deben recibir los medicamentos. Muchos investigadores creen que la tecnología LOC puede ser la clave para nuevos y potentes instrumentos de diagnóstico. El objetivo de estos investigadores es crear chips de microfluidos que permitan a los proveedores de atención médica en clínicas mal equipadas realizar pruebas de diagnóstico tales como inmunoensayos y ensayos de ácido nucleico sin apoyo de laboratorio. Se ha diseñado, fabricado y caracterizado un innovador polímero "lab-on-a-chip" (LOC) para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de transcripción inversa (RT) para el diagnóstico clínico de pruebas en el punto de atención (POCT). Además, también se ha desarrollado y utilizado un analizador portátil que consiste en un sistema de control de temperatura basado en infrarrojos (IR) sin contacto para el proceso de RT-PCR y un sistema de detección óptica para la detección en chip, para monitorizar el LOC de RT-PCR.

En otra realización, se ha construido un microsistema de análisis genómico completamente integrado que incluye calentadores microfabricados, sensores de temperatura y cámaras de PCR conectadas directamente a canales de separación electroforética capilar. En el Ejemplo 6, se describe un bioprocesador microfluídico integrado para el análisis de la expresión génica de una sola célula y también se describe en Toriello et al., "Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis", PNAS, 23 de diciembre de 2008 vol. 105 no. 5120173-20178, en línea el 16/09/08. El dispositivo es un paso importante hacia un microprocesador genómico microfabricado para su uso en análisis forense y diagnóstico médico molecular en el punto de atención. Ya sea que las células se muestren en un dispositivo o estén conectadas entre sí, el análisis de la expresión génica se puede determinar midiendo los niveles de ARNm con múltiples técnicas que incluyen micromatrices, secuenciación de etiquetas de secuencia de ADNc expresadas (EST), análisis en serie de secuenciación de etiquetas de expresión génica (SAGE), secuenciación de firmas masivamente paralelas (MPSS) o varias aplicaciones de hibridación in situ multiplexada. Todas estas técnicas son extremadamente propensas al ruido y/o sujetas a sesgos en la medición biológica, y un área importante de investigación en biología computacional involucra el desarrollo de herramientas estadísticas para separar la señal del ruido en estudios de expresión génica de alto rendimiento. Dichos estudios a menudo se usan para determinar los genes implicados en un trastorno: uno podría comparar datos de micromatrices de células epiteliales cancerosas con datos de células no cancerosas para determinar las transcripciones que están sobrerreguladas y subreguladas en una población particular de células cancerosas.

El análisis de la regulación también puede ocurrir en estas células unidas a oligonucleótidos: la regulación es la orquestación compleja de eventos que comienzan con una señal extracelular tal como una hormona y conducen a un aumento o disminución en la actividad de una o más proteínas. Se han aplicado técnicas bioinformáticas para explorar varios pasos en este proceso. Por ejemplo, el análisis de promotores implica la identificación y el estudio de motivos de secuencia en el ADN que rodea la región codificante de un gen. Estos motivos influyen en la medida en que esa región se transcribe en ARNm. Los datos de expresión se pueden utilizar para inferir la regulación de genes: uno podría comparar datos de micromatrices de una amplia variedad de estados de un organismo para formular hipótesis sobre los genes involucrados en cada estado. En un organismo unicelular, uno podría comparar etapas del ciclo celular, junto con varias condiciones de estrés (golpe de calor, inanición, etc.). Luego, se pueden aplicar algoritmos de agolpamiento a esos datos de expresión para determinar qué genes se expresan conjuntamente. Por ejemplo, las regiones corriente arriba (promotores) de genes coexpresados pueden buscarse elementos reguladores sobrerrepresentados.

En otra realización, las células actualmente modificadas con un oligonucleótido adjunto se usan o se integran en un dispositivo sensor que mide una cantidad física y la convierte en una señal que puede ser leída por un observador o por un instrumento. Por ejemplo, el análisis de la expresión de proteínas también se puede realizar con estas composiciones y sistemas. Las micromatrices de proteínas y la espectrometría de masas (MS) de alto rendimiento (HT) pueden proporcionar una instantánea de las proteínas presentes en una célula. La bioinformática está muy involucrada en dar sentido a los datos de micromatrices de proteínas y HT MS; el primer enfoque se enfrenta a problemas similares a los de las micromatrices direccionadas al ARNm, el segundo implica el problema de comparar grandes cantidades de datos de masa con las masas predichas de las bases de datos de secuencias de proteínas, y se detectan los complicados análisis estadístico de muestras en las que se detectan múltiples pero incompletos péptidos de cada proteína.

El análisis de mutaciones en el cáncer, o cualquier otra enfermedad o condición, puede realizarse mediante estos sistemas utilizando las células capturadas con oligonucleótidos. En el cáncer, los genomas de las células afectadas se reorganizan de formas complejas o incluso impredecibles. Los esfuerzos de secuenciación masiva se utilizan para identificar mutaciones puntuales previamente desconocidas en una variedad de genes en el cáncer. Los bioinformáticos continúan produciendo sistemas automatizados especializados para administrar el gran volumen de datos de secuencias producidos, y crean nuevos algoritmos y software para comparar los resultados de la secuenciación con la creciente colección de secuencias del genoma humano y polimorfismos de la línea germinal. Se emplean nuevas tecnologías de detección física, tales como micromatrices de oligonucleótidos para identificar ganancias y pérdidas cromosómicas (llamada hibridación genómica comparativa) y matrices de polimorfismos de un solo nucleótido para detectar mutaciones puntuales conocidas. Estos métodos de detección miden simultáneamente varios cientos de miles de sitios en todo el genoma y, cuando se utilizan con un alto rendimiento para medir miles de muestras, generan terabytes de datos por experimento. Una vez más, las cantidades masivas y los nuevos tipos de datos generan nuevas oportunidades para los bioinformáticos. A menudo se encuentra que los datos contienen una variabilidad considerable, o ruido, y, por lo tanto, se están desarrollando métodos de análisis de punto de cambio y modelo oculto de Markov para inferir cambios reales en el número de copias. En la rama estructural de la bioinformática, la homología se utiliza para determinar qué partes de una proteína son importantes en la formación de estructuras y la interacción con otras proteínas. En una técnica llamada modelado de homología, esta información se utiliza para predecir la estructura de una proteína una vez que se conoce la estructura de una proteína homóloga. Actualmente, esta sigue siendo la única forma de predecir estructuras de proteínas de manera confiable.

Se puede realizar una genómica comparativa con los sistemas de la invención. El núcleo del análisis comparativo del genoma es el establecimiento de la correspondencia entre genes (análisis de ortología) u otras características genómicas en diferentes organismos. Son estos mapas intergenómicos los que permiten rastrear los procesos evolutivos responsables de la divergencia de dos genomas. Una multitud de eventos evolutivos que actúan en varios niveles organizacionales dan forma a la evolución del genoma. En el nivel más bajo, las mutaciones puntuales afectan a los nucleótidos individuales. En un nivel superior, los grandes segmentos cromosómicos sufren duplicación, transferencia lateral, inversión, transposición, eliminación e inserción. En última instancia, los genomas enteros están involucrados en procesos de hibridación, poliploidización y endosimbiosis, que a menudo conducen a una rápida especiación. La complejidad de la evolución del genoma plantea muchos desafíos emocionantes para los desarrolladores de modelos matemáticos y algoritmos, que recurren a un espectro de técnicas algorítmicas, estadísticas y matemáticas, que van desde algoritmos exactos, heurísticos, de parámetros fijos y de aproximación para problemas basados en modelos de parsimonia hasta algoritmos de Monte Carlo basados en Cadenas de Markov para el análisis bayesiano de problemas basados en modelos probabilísticos.

Las células y los sistemas se pueden usar para hacer pronósticos y diagnósticos de pacientes. Los genomas individuales se pueden genotipar y analizar utilizando los dispositivos habilitados por modificación celular directa. Por ejemplo, una etapa de genotipado puede tener muchos enfoques experimentales diferentes, incluidos los chips de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) (típicamente, el 0.02 % del genoma) o la secuenciación parcial o completa del genoma. Una vez que se conocen los genotipos, existen muchas herramientas de análisis bioinformático que pueden comparar genomas individuales y encontrar asociaciones de enfermedades entre genes y loci.

En otra realización, las células actualmente modificadas se usan en un dispositivo o sistema de biorreactor para facilitar la bioactividad en una célula o entre varias moléculas y, en general, dan como resultado un producto terminado o algún otro resultado deseado, tal como una bioactividad (por ejemplo, metabolismo, producción de energía, señales eléctricas, catabolismo, apoptosis, crecimiento, diferenciación, proliferación, etc.). Por ejemplo, el metabolismo de una célula se puede estudiar en estos sistemas. Un biorreactor puede referirse a cualquier dispositivo o sistema que admita un entorno biológicamente activo.

Los avances científicos en biomateriales, células madre, factores de crecimiento y diferenciación y entornos biomiméticos han creado oportunidades únicas para fabricar tejidos en el laboratorio a partir de combinaciones de matrices extracelulares diseñadas ("andamios"), células y moléculas biológicamente activas. En otra realización, los presentes métodos de modificación celular permiten unir o colocar células en otras superficies destinadas a hacer crecer células o tejidos en el contexto del cultivo celular. Por ejemplo, las células que tienen oligonucleótidos monocatenarios unidos por un enlace covalente a su superficie se pueden hibridar con una cadena complementaria en una célula vecina o en una superficie, lo que proporciona los medios para unir las células entre sí y/o con una superficie para la generación y el estudio de células, tejidos y órganos. Los desarrollos poderosos en el campo multidisciplinario de la ingeniería de tejidos han producido un conjunto novedoso de piezas de reemplazo de tejidos y estrategias de implementación que encontrarán uso en los presentes métodos. En una realización, las células modificadas con un oligonucleótido unido pueden implantarse o "sembrarse" en una estructura artificial capaz de soportar la formación de tejido tridimensional. Los materiales a granel, cánulas, andamios, que a menudo son críticos, tanto ex vivo como in vivo, para recapitular el entorno in vivo y permitir que las células influyan en sus propios microambientes, pueden modificarse para permitir la unión celular usando los presentes métodos.

En una realización, se modifica un organismo unicelular fotosintético usando los presentes métodos y se une un oligonucleótido. Los organismos propuestos incluyen, pero no se limitan a, fotosintéticos: C. reinhardtii (algas), Synechocystis PCC 6803 (cianobacterias), R. rubrum (anaerobios gram negativos); heterótrofos: C. pasteurianum (fijador de nitrógeno), Azotobacter sp. (propuesto para tener la tasa de respiración más alta de cualquier organismo). (véase Melis et al, citado en otra parte de este documento).

En una realización, se modifican las algas y se une un oligonucleótido. Las algas pueden ser especialmente adecuadas porque pueden crecer rápidamente y pueden tener un alto porcentaje de lípidos o aceites. Pueden duplicar su masa varias veces al día y producir al menos 15 veces más aceite por acre que alternativas tales como la colza, la palma, la soja o la jatrofa. Debido a la falta de necesidad de agua limpia, el cultivo de algas también es más rentable que muchos otros cultivos y produce mucha menos presión sobre los recursos de agua dulce. También se puede cultivar sin desplazar los cultivos alimentarios. El sistema de unión de oligonucleótidos permite el control de la colocación de una célula de planta, bacteria o alga en una superficie, por ejemplo, una superficie inclinada para maximizar la exposición a la luz solar.

En otra realización, las células actualmente modificadas con un oligonucleótido unido pueden usarse en una célula de combustible u otro dispositivo de conversión electroquímica. Produce electricidad a partir de combustible (en el lado del ánodo) y un oxidante (en el lado del cátodo), que reaccionan en presencia de un electrolito. Los reactivos fluyen hacia la célula y los productos de reacción salen de ella, mientras que el electrolito permanece dentro. Las células de combustible pueden funcionar de forma prácticamente continua siempre que se mantengan los flujos necesarios. Las células de combustible se diferencian de las baterías de células electroquímicas en que consumen reactivos de una fuente externa, que deben reponerse: un sistema termodinámicamente abierto. Por el contrario, las baterías almacenan energía eléctrica químicamente y, por lo tanto, representan un sistema termodinámicamente cerrado. Son posibles muchas combinaciones de combustible y oxidante. Una célula de hidrógeno utiliza hidrógeno como combustible y oxígeno (generalmente del aire) como oxidante. Otros combustibles incluyen hidrocarburos y alcoholes. Otros oxidantes incluyen cloro y dióxido de cloro.

Las células solares vivas se pueden crear usando las algas verdes Chlamydomonas reinhardtii para la generación de electricidad microbiana como se describe en Rosenbaum, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2005) 68: 753-756. Las células de combustible microbianas de dos cámaras se describen en Wang et al, Electrochimica Acta 54 (2009) 1109-1114. Las células de combustible microbianas fototróficas (MFC) autosostenidas se describen en He et al, Environ. Sci. Technol. 2009, 43, 1648-1654 en donde se logró la producción de electricidad a partir de MFC fototróficos de sedimentos autosostenidos utilizando una comunidad microbiana mixta de microorganismos fotosintéticos y bacterias hetertróficas. La electricidad se generó constantemente a partir de estos MFC sin aporte de compuestos orgánicos o nutrientes. Kjeang et al (Journal of Power Sources 158 (2006) 1-12) describen patrones de enzimas estratégicas para células de combustible microbianas para optimizar un combustible combinado y canales de oxidantes en un conjunto de células de combustible no compartimentado con enzimas separadas modeladas en el dispositivo en relación con las tasas de renovación individuales. Ringeisen et al. J. of Power Sources 165(2007) 591-597 describe un MFC en miniatura construido usando usando Shewanella (DSP10) oneidensis que permanece activo en ambientes anaeróbicos y aeróbicos. Estudios anteriores demostraron que los electrones de esta bacteria se han utilizado para reducir metales en presencia de oxígeno. La bacteria se usó en los dispositivos como especie electroquímica activa en la cámara del ánodo. El documento señala que los sensores para los sistemas de vigilancia submarina requieren como fuente de energía ideal una pequeña (sigilosa, que no domine en tamaño en comparación con el dispositivo que alimenta) que pueda funcionar en un entorno aeróbico (es decir, en una columna de agua cerca de la superficie del agua), proporcionando energía continua (sin problemas de recarga o vida útil) y que no requieren altos niveles de radiación solar (por lo tanto, funcionan bajo la superficie y durante la noche, etc.). La bacteria seleccionada para el estudio por este grupo brinda la oportunidad de comunicación RF para una red de sensores porque no tiene que estar en un entorno anaeróbico para el ánodo y, por lo tanto, puede funcionar en entornos de luz en la superficie del agua. También se informa que las células de combustible microbianas en los diseños actuales pueden hacerse más robustas si funcionan con energía solar, y la energía posible en tales sistemas depende de la naturaleza de la fuente de nitrógeno y la disponibilidad de luz. En sistemas cuidadosamente diseñados, los sistemas de procesamiento de una combinación de nitrógeno (por ejemplo, de sedimentos, aguas residuales o desechos agrícolas) pueden alimentarse con energía solar para alimentar las células de procesamiento de nitrógeno del sistema (véase Cho et al, J. Applied Microbiology 104 (2008) 640) con el resultado de producir más electricidad y una mayor longevidad del sistema.

Por lo tanto, los dispositivos que utilizan los sistemas de unión de oligonucleótidos de la invención pueden fabricarse tales como, por ejemplo, dispositivos de células de combustible que utilizan las células no animales modificadas con oligonucleótidos de la invención y otros principios consistentes con la invención. Por ejemplo, las células de combustible que producen hidrógeno pueden fabricarse usando células vegetales modificadas. Por lo general, las células vegetales se pueden modelar de modo que los productores de hidrógeno y los eliminadores de oxígeno se combinen en un arreglo óptimo para la producción de energía. Los dispositivos pueden ser planos o esféricos, o proporcionar cualquier superficie óptima para la captación y procesamiento de la energía solar y pueden comprender un sensor. También se pueden fabricar dispositivos para estudiar o utilizar con fines energéticos células vegetales, bacterianas o de algas. El dispositivo puede usarse además para almacenar energía. El dispositivo puede comprender un sensor o puede ser un biorreactor. Los sistemas basados en algas pueden ser la base para procesos de producción de hidrógeno biológicos integrados sostenibles y comercialmente viables utilizando producción de H2 fotosintético por algas verdes, la región visible del espectro solar acoplada a la producción de H2 por bacterias fotosintéticas anoxigénicas que utilizan la región infrarroja cercana de la luz solar. La acumulación de biomasa en el curso de la fotosíntesis por los dos organismos se utiliza posteriormente en fermentaciones anaeróbicas oscuras para producción adicional de H2. Los ácidos orgánicos pequeños se acumulan como subproducto de la fermentación anaeróbica oscura, y estos pueden servir como sustrato para respaldar una mayor producción de hidrógeno por parte de las algas verdes y las bacterias fotosintéticas. La base de tal producción de H2 integrado es la fotosíntesis oxigénica de algas verdes unicelulares (por ejemplo Chlamydomonas reinhardtii), un proceso que utiliza la energía de la luz solar para convertir agua, dióxido de carbono y otros nutrientes inorgánicos en los componentes básicos de la vida. (véase A. Melis y M.R. Melnicki, International J. of Hydrogen Energy 31 (2006) 1563-1573).

Otros sistemas fotosintéticos fotovoltaicos basados en células no animales a los que se pueden aplicar las herramientas de esta invención incluyen Dickson et al. International J. Hydrogen Energy, 34 (2009) 204-215 que describe el uso de Synechocystis sp. PCC 6803 para formar un sol-gel de sílice. Esta tecnología puede aplicarse directamente a la alimentación de pequeños dispositivos electrónicos. Sui et al. J. de Microelectromechanical systems vol. 17, no. 65, diciembre de 2008 describe una célula de combustible microbiana (MFC) de polidimetilsiloxano (PDMS) microfabricada con electrodos de micropilar embebidos. Este MFC se caracteriza por una estructura flexible y biocompatible adecuada para la implantación en el cuerpo como fuente potencial de energía para dispositivos bioMEMS implantados. Song et al, describen una célula de combustible de membrana electrolítica de polímero microfluídico (PEM) que utiliza polidimetilsiloxano (PDMS) para un dispositivo bioMEMS, que puede usarse para alimentar dispositivos electrónicos portátiles y otros dispositivos MEMS miniaturizados. El trabajo descrito por Song et al, modela una membrana de Nafion de espesor submicrónico sobre un sustrato de vidrio utilizando un microcanal PDMS unido de forma reversible para generar una membrana ioneselectiva entre los electrodos de la célula de combustible, en lugar de intercalar una fina lámina de Nafion. Debido a la flexibilidad del material PDMS, la membrana Nafion se puede sellar entre el chip PDMS y el sustrato de vidrio mediante la unión de plasma de oxígeno. Los patrones de superficie se pueden integrar a la perfección en un flujo de proceso de microfabricación estándar y formar una célula de combustible microfluídica PEM sin la engorrosa sujeción de las capas y los riesgos inherentes de fuga debido a una sujeción ineficaz. Como mínimo, la construcción de este dispositivo hace posible la construcción de matrices masivamente paralelas de células de combustible microfluídicas. El modelado de células se puede facilitar utilizando los métodos de fijación de células de la presente invención.

En otra realización, las superficies celulares que se modifican usando la presente técnica de modificación son superficies similares a membranas celulares tales como las proteínas de cubierta de virus, fagos y otras superficies o estructuras biomoleculares autoensambladas. El ejemplo 9 demuestra que las cápsides virales o de fagos modificadas con los presentes métodos de modificación celular para conjugar un aptámero de ADN a la superficie, permite la creación de vehículos multivalentes dirigidos a células. Por lo tanto, los presentes métodos de modificación celular directa pueden usarse en la modificación de muchas superficies monoméricas o biomoleculares para cualquier número de aplicaciones que requieran la unión directa de un ácido nucleico u oligonucleótido.

V. Kits

La presente invención también proporciona kits que tienen una fracción de ácido nucleico activado adecuado para formar un conjugado de ácido nucleico-célula de la presente invención, y una superficie de sustrato que tiene una fracción de ácido nucleico complementario. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una fracción de ácido nucleico activado adecuado para el enlace covalente con un grupo funcional nativo de una superficie celular y una superficie de sustrato que incluye una fracción de ácido nucleico complementario a la fracción de ácido nucleico activado. La fracción de ácido nucleico activado puede ser un polvo o estar en una solución. El kit también puede incluir soluciones tampón conocidas por los expertos en la técnica y otras soluciones para formar el conjugado de ácido nucleico-célula y luego unir el conjugado de ácido nucleico-célula a la superficie del sustrato a través de la fracción de ácido nucleico en la superficie del sustrato.

Los componentes de los kits se describen con más detalle anteriormente. La superficie del sustrato puede incluir cualquier material adecuado, incluidos, pero no limitados a, portaobjetos de microscopio de vidrio, cubreobjetos, placas de cultivo de tejidos o placas de pocillos. La superficie del sustrato se puede preimprimir con fracciones de ácido nucleico en ubicaciones específicas. Los kits pueden incluir otros componentes, como soluciones de fijación para las células, soluciones de agentes de detección, soluciones de agentes de tinción celular, soluciones tampón, etc. Otras soluciones pueden incluir las propias fracciones de ácido nucleico y soluciones y reactivos para unir las fracciones ácido nucleico a las células.

VI. Ejemplos

Ejemplo 1. Conjugación de ADN a una célula sin pared celular a través de un grupo funcional nativo de lisina

Todos los reactivos de cultivo celular se obtuvieron de Gibco/Invitrogen Corp (Carlsbad, CA) a menos que se indique otra cosa. El cultivo celular se llevó a cabo usando técnicas estándar. Las células Jurkat se cultivaron en matraces de cultivo T-25 (Corning, EE. UU.) en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (FBS, HyClone) y penicilina/estreptomicina al 1 % (P/S, Sigma). Las células MCF-7 se cultivaron en DMEM complementado con un 1 % de aminoácidos no esenciales y un 10 % de suero bovino fetal, más un 1 % de penicilina/estreptomicina. Las células MDA-MB-231 se cultivaron en las mismas condiciones que las células MCF-7, pero sin aminoácidos no esenciales.

Las micrografías de fluorescencia se adquirieron usando un microscopio invertido Axiovert 200M (ZEISS) con conjuntos de filtros de fluorescencia para DAPI/Hoechst, fluoroscein/fluo-3 y rodamina. La absorción ultravioleta de los diferentes oligonucleótidos se determinó a 260 nm en un espectrofotómetro UV/vis de doble haz UVIKON 933 (Kontron Instruments, Reino Unido).

Síntesis de conjugados NHS-ADN. Para los estudios de adhesión celular, se diseñaron tres pares de oligonucleótidos complementarios de manera que fueran idénticos en la composición general y difirieran solo en la secuencia. También se calculó que cada par de secuencias poseía temperaturas de fusión comparables (55 °C) y estructuras secundarias mínimas.

Las identidades de secuencia fueron las siguientes:

C1: 5'-GTA ACG ATC CAG CTG TCA CT-3'

M1: 5'-AGT GAC AGC TGG ATC GTT AC-3'

C2: 5'-TCA TAC GAC TCA CTC TAG GG-3'

M2: 5'-CCC TAG AGT GAG TCG TAT GA-3'

C3: 5'-ACT GAC TGA CTG ACT GAC TG-3'

M3: 5'-CAG TCA GTC AGT CAG TCA GT-3'

Los oligonucleótidos se obtuvieron de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) con grupos tiol instalados en el extremo 5'. Las muestras (2 mg en 80 j L) se combinaron con 320 j L de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 10 mM y 400 |jL de tampón TE 1x (Tris 10 mM con EDTA 1 mM, llevado a pH 7.5 con HCl) y se almacenaron congelados a -20 °C hasta su uso. La NHS-PEO⁶-maleimida (éster de succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)-hexaetilenglicol]) se adquirió de Pierce. Se preparó una solución madre disolviendo 5 mg de NHS-PEO⁶-maleimida en 1 mL de DMSO (Sigma). Se almacenaron alícuotas de esta solución (20 j L cada una) a -20 °C hasta su uso.

La modificación del ADN se logró pasando una solución descongelada de 5'-tiol ADNmc (30 jl, 0.39 mM) a través de una columna de exclusión por tamaño NAP-5 (GE Healthcare). Luego, el eluyente se expuso a 20 j L de solución de NHS-PEO⁶-Maleimida a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, la reacción se purificó pasándola a través de una segunda columna nAP-5 que se equilibró previamente con una solución de PBS (pH 7.2). La concentración de ADN en el eluyente de la columna se verificó mediante espectroscopia UV-vis. La solución resultante se aplicó luego a muestras de células vivas.

Para confirmar la naturaleza de la modificación química, se prepararon y caracterizaron modelos de los conjugados de oligonucleótidos. Para ello, se saturaron 0.5 mL de DMF con 6-amino-N-(4-aminofenetil) hexanamida y se añadieron a 1 mL de la solución de reacción obtenida tras la purificación con NAP-5. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, los conjugados de oligonucleótidos se analizaron usando MALDI-TOF MS. Las masas observadas estaban dentro del 0.090 % de los valores esperados.

La modificación de células vivas y la cuantificación de moléculas de ADN unidas se logró de la siguiente manera: Inmediatamente antes de la modificación, se lavó una muestra de 5x106 células Jurkat con tampón PBS tres veces para eliminar las proteínas del medio de cultivo. A continuación, las células se expusieron a soluciones de ADN-NHS (cadena C3, concentraciones finales de 3 ^jM a 54 ^jM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del aislamiento mediante centrifugación, las células se devolvieron al medio de cultivo o se marcaron con complementos de ADN fluorescente como se describe a continuación.

Con el fin de cuantificar el número de moléculas de ADN superficiales, se incubaron porciones de las células modificadas con soluciones de 10 pL de cadenas de ADN complementarias marcadas con FITC a 0 °C durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con solución de PBS y se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 1 % antes del análisis. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Las mediciones de fluorescencia se calibraron utilizando perlas fluorescentes de densidad de fluoróforo conocida. Las mediciones de fluorescencia se compararon con las correspondientes a las células de control que carecían de modificación de ADN y las células reaccionaron con secuencias de ADN no coincidentes.

La figura 31 muestra los conjugados de ADN-célula preparados por el método anterior que se unen a la superficie del sustrato modificada con cadenas de ADN complementarias, lo que demuestra la formación del conjugado de ADN-células.

Ejemplo 2. Conjugación de ADN a una célula sin pared celular a través de un grupo funcional nativo de ácido aspártico 0 ácido glutámico

El ADN se ha conjugado con células utilizando la química de acoplamiento EDC mediante el siguiente procedimiento: 1. Tomar 5 millones de células y lavarlas con 10 mL de PBS dos veces.

2. Disolver 0.366 g de EDC en 19.06 mL de PBS.

3. Agregar 0.452 g de NHS a la solución de EDC.

4. Asegurar de que el pH esté alrededor de 7. (Normalmente lo son)

5. Tomar 1 mL de esta solución de EDC/NHS, añadida con 200 uL de ADNmc de amina 80 uM (en 1 * SSC).

6. Incubar a ta durante 30 min a 1 h.

7. Lavar con 10 mL de 1 S/PBS tres veces.

8. Resuspender a 50 a 100 uL 1 S/PBS, y listo para ser aplicado a los portaobjetos.

Ejemplo 3. Conjugación de ADN a grupo funcional nativo de azúcar oxidado

Oxidación de dioles expuestos en la superficie (lipopolisacárido, ácido lipoteicoico, etc.) en células con paredes celulares. Enjuagar células (105-107) en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) mediante centrifugación. Suspender las células en 2 mL 0.5-5 mM NaIO4 en DPBS y colocar a 37°C con agitación orbital durante 20 min. Se necesitan concentraciones más bajas de peryodato para eucariotas como algas y levaduras. Neutralizar peryodato con 1 mL de glucosa 0.1 M en DPBS. Centrifugar las células y lavar 2 * 1 mL de DPBS, 1 * 1 mL de tampón MOPS de pH 6 (véase más abajo).

Unión de ADNmc modificado con hidrazida a dioles expuestos a la superficie oxidada. Suspender las células en 800 pl de tampón MOPS de pH 6 (NaCl 0.5 M, ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico 0.1 M, 18.2 MQ H2O, ajustar el pH a 6.0) anilina 10 mM ~ 35 pM hidrazida ADNmc (adquirido de Integrated DNA Technologies). Permitir que las células reaccionen a temperatura ambiente durante 1 a 18 horas, dependiendo de la concentración de dioles superficiales, con agitación suave. Girar las células y enjuagar con DPBS

La figura 32 muestra los conjugados de ADN-célula preparados mediante el método anterior que se unen a la superficie del sustrato modificada con una cadena de ADN complementaria, lo que demuestra la formación del conjugado de ADN-célula.

Ejemplo 4. Dispositivos

El protocolo general para la unión de cadenas de ADN a las células y para su inmovilización en superficies impresas con ADN fue el siguiente: Inmediatamente antes de la modificación, se lavó una muestra de 5x106 células Jurkat con tampón PBS tres veces para eliminar las proteínas del medio de cultivo. Después del enjuague final, se añadió más PBS para llevar el volumen a 5 mL (1 x 106 células/mL). A continuación, la suspensión celular se hizo reaccionar con 1 mL de solución de NHS-ADN (11.7 pM) sintetizada y purificada a partir de 30 pl de 5'-tiol ADNmc (secuencia C2). La mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se lavó tres veces con PBS que contenía FBS al 1%. A continuación, las células se resuspendieron en 0.5 mL de PBS que contenía FBS al 1%. Para imprimir las superficies de vidrio, se utilizó una solución de 20 pM de ADNmc funcionalizado con amina 5' en tampón de citrato de sodio salino 3x (SSC: citrato de sodio 45 mM, NaCl 450 mM, pH 7.0) para la preparación de la muestra. Las soluciones de ADN se depositaron en portaobjetos de vidrio funcionalizados con aldehído (SCHOTT Nexterion, Louisville, KY) mediante pipeteo manual o mediante el uso de un sistema robótico de impresión de micromatrices en el Laboratorio Genómico Funcional de UC Berkeley. El ADN manchado se inmovilizó y los portaobjetos se pasivaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la impresión, los portaobjetos se secaron bajo una corriente de N2y almacenado en la oscuridad bajo una atmósfera seca. Los portaobjetos estampados se usaban normalmente en el plazo de un mes.

El microdiseño de los portaobjetos de vidrio se logró utilizando fotolitografía junto con una técnica de despegue de aluminio, y se describirá con todo detalle en otra parte. Para estudios con un tipo de célula, todas las células se marcaron con la secuencia C2. Los portaobjetos se modelaron con la secuencia de ADN complementaria, M2 a menos que se indique otra cosa. Se introdujeron soluciones de células modificadas con ADN en cada superficie y se incubaron durante 3-5 minutos sin agitación. A continuación, los dispositivos se lavaron dos veces con PBS que contenía FBS al 1 %. Se recopilaron conjuntos de datos replicados seleccionando tres regiones del dispositivo al azar antes del lavado. Cada ubicación fue fotografiada, lavada y luego visualizada nuevamente.

La evaluación de la viabilidad celular se realizó de la siguiente manera: Se sembraron células Jurkat recubiertas con la cadena C2 en una placa de Petri de 1 mL con medio de crecimiento normal y se añadió ADN de la cadena M2 a la solución a una concentración de 2 pM. Se cultivaron células Jurkat no modificadas en condiciones idénticas como control. Se contaron las células en cada una de las cuatro muestras utilizando un hemocitómetro a las 24, 48 y 72 horas. La viabilidad celular se controló añadiendo azul de tripano.

El grado de apoptosis de las células unidas a la superficie se determinó mediante tinción con anexina V/yoduro de propidio (BD Biosciences). Después de la inmovilización en los portaobjetos por ADN, las células se incubaron en medios normales a 37 °C durante 24 horas. Se incubó una muestra de células Jurkat no unidas (que carecían de cadenas de ADN en la superficie) en las mismas condiciones que un control. Se preparó una solución que consistía en 900 pL de tampón de unión 1X, 30 pL de solución madre de anexina V-FITC y 3o pL de solución madre de PI. Después de 24 horas, se aplicaron 100 pL de esta solución a los portaobjetos durante 15 min a temperatura ambiente. Se tomaron imágenes de las células mediante microscopía de fluorescencia y se contó el número de células no viables después de una hora.

La inmovilización de las líneas celulares adherentes sobre superficies modeladas se logró de la siguiente manera: Se obtuvieron de la ATCC dos líneas celulares de cáncer de mama, MCF-7 y MDA-MB-231. Las células se separaron de las placas de cultivo con EDTA 1 mM sin tripsina y las soluciones celulares se lavaron tres veces con PBS. Una porción de 5 mL de la solución celular (1*10® célula/mL) se hizo reaccionar con 1 mL de solución de NHS-ADN sintetizada a partir de 30 pl de 5'-tiol ADNmc (secuencia C2) como se describe anteriormente. La mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se lavó tres veces con PBS que contenía FBS al 1%. A continuación, las células se resuspendieron en 0.5 mL de PBS que contenía FBS al 1%. La solución de células se introdujo en portaobjetos de vidrio modelados con la secuencia de ADN complementaria M2 y las muestras se incubaron durante 5 minutos. A continuación, los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS que contenía FBS al 1%. Después de la inmovilización en portaobjetos mediante hibridación de ADN, las células se incubaron en sus medios normales y se observaron durante 36 horas. Se recopilaron conjuntos de datos replicados fotografiando tres regiones superficiales diferentes a intervalos de 12 horas.

La confirmación de la especificidad de secuencia de la inmovilización celular se realizó de la siguiente manera: Se prepararon células Jurkat modificadas con ADN y células MDA incubando cada población celular con ADN-NHS (secuencia C2 o C1, respectivamente) en PBS durante 30 minutos como se describe anteriormente. Para facilitar la diferenciación visual de las células, el citosol de cada población se marcó con tinciones de células vivas CellTracker BlueTM o CellTracker GreenTM. Después de enjuagar, se mezclaron cantidades iguales de cada población, se introdujeron en micromatrices de ADN micromanchadas que llevaban la secuencia M2 o M1 (construidas como antes) y se incubaron durante 5 minutos. A continuación, la micromatriz se lavó dos veces con PBS que contenía FBS al 1 % y se observó con un microscopio de fluorescencia.

La inmovilización de glóbulos rojos humanos se logró de la siguiente manera: Se obtuvieron muestras frescas de glóbulos rojos de una muestra de sangre de un ser humano sano y se almacenaron en una solución de ácido cítrico al 1% a temperatura ambiente. Las células se usaron en 1 hora. La solución celular se lavó tres veces con PBS y luego se incubó en la solución NHS-ADNmc durante 30 minutos para permitir la modificación de las superficies celulares. A continuación, la suspensión de células se lavó tres veces con una solución de FBS/PBS al 1 % antes de aplicarla a portaobjetos de vidrio que portaban las cadenas complementarias de ADNmc. Después de la unión de las células, los portaobjetos de vidrio se lavaron con FBS/PBS al 1 % para eliminar las células no unidas y se observaron con un microscopio óptico. Las células se incubaron en FBS/PBS al 1 % después de la inmovilización y se examinó su viabilidad después de 3 horas usando tinción con azul de tripano.

El modelado de células T CD4+ primarias y el ensayo de producción de IL-2 se realizó de la siguiente manera: Las células T CD4+ primarias (obtenidas en colaboración con el laboratorio de Jay T. Groves, UC Berkeley) se recolectaron de ratones y se cultivaron en las condiciones indicadas antes de su uso. A continuación, las células T primarias se modificaron utilizando el protocolo NHS-ADN y se expusieron a diferentes patrones de ADN impresos mediante manchado o fotolitografía, como se ha descrito anteriormente. Los portaobjetos de vidrio con células inmovilizadas con ADN se lavaron con FBS/PBS al 1 % para eliminar las células no unidas y se observaron al microscopio.

La producción de IL-2 de células T primarias inmovilizadas con dúplex de ADN se examinó mediante ELISA. Una población de 2*105 de células T primarias se modificaron con cadenas de ADN y se inmovilizaron en una serie de portaobjetos (1 cm2) que lleva la secuencia complementaria. A continuación, estas muestras se dividieron en tres porciones. La primera muestra se incubó en medios de crecimiento de células T normales sin reactivos adicionales. La segunda muestra se trató con PHA (1 pg/mL) y PMA (50 ng/mL). La tercera muestra se trató con ConA (1 pg/mL), PMA (50 ng/mL) y CSA (pg/mL). Se prepararon muestras análogas de células T libres sin ADN de superficie como controles. Todas las muestras de células se incubaron a 37 °C durante 20 h y luego se centrifugaron. Se extrajeron porciones de los medios de cultivo (1 mL) de cada población de células y se analizó la producción de IL-2 utilizando un kit de prueba ELISA de interleucina-2 de ratón (Thermo Scientific).

El modelado de mioblastos primarios se logró de la siguiente manera: Se recolectaron mioblastos primarios (obtenidos en colaboración con el laboratorio de Randall Lee, UCSF) de ratones y se purificaron de acuerdo con un protocolo publicado como se describe en Huang, N. F.; Patel, S.; Thakar, R. G.; Wu, J.; Hsiao, B. S.; Chu, B.; Lee, R. J.; Li, S. Nano Lett. 2006, 6, 537-542. En resumen, se logró un crecimiento celular normal en medio de Ham F-10 (Invitrogen) con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (FBS, HyClone), bGF al 1 % (Invitrogen) y penicilina/estreptomicina al 1 % (P/S, Sigma). Inmediatamente antes de la modificación de la superficie, las células se separaron con EDTA 1 mM sin tripsina. Las suspensiones de células resultantes se enjuagaron con PBS tres veces. Una porción de 5 mL de la solución celular (1x10® célula/mL) se hizo reaccionar con 1 mL de solución de NHS-ADN. La mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego las células se lavaron tres veces con PBS que contenía FBS al 1%. Las superficies se modelaron con la secuencia de ADN complementaria mediante manchado o fotolitografía, y se incubaron con PBS que contenía FBS al 1 % a temperatura ambiente durante 1 h. La solución celular se introdujo en los portaobjetos y se incubó durante 5 minutos. A continuación, los dispositivos se lavaron tres veces con PBS que contenía ^fB^sal 1 %. Después de la inmovilización, las células se incubaron en medios de cultivo o medios de fusión (DMEM (Invitrogen) que contenía suero de caballo al 5 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (P/S, Sigma)) a 37 °C durante 14 días. Los mioblastos no unidos se cultivaron en condiciones idénticas como control. Se registraron imágenes y películas de todas las muestras de células cada 24 horas.

Ejemplo 5: Código de barras de ADN

Se desarrolla un microdispositivo para la captura dirigida por código de barras de ADN de células individuales en una matriz de microelectrodos sensibles al pH para el análisis metabólico. Las células se modifican con ADN monocatenario unido a la membrana, y la cadena complementaria unida en el área del sensor de los microelectrodos de pH de óxido de iridio dentro de un canal microfluídico dirige la captura específica de una sola célula. Esta matriz de microelectrodos bifuncionales se demuestra para el control del pH y la diferenciación de células T primarias y células de linfoma T Jurkat. Las células Jurkat individuales exhibieron una tasa de acidificación extracelular de 11 mili-pH/min, mientras que las células T primarias exhibieron solo 2 mili-pH/min. Este sistema se puede utilizar para capturar específicamente células no adherentes y para discriminar entre células sanas y cancerosas visualmente similares en un conjunto heterogéneo en función de sus propiedades metabólicas alteradas. La matriz de microelectrodos bifuncionales demostrada aquí muestra cómo los dispositivos fabricados usando la composición de esta invención tienen la capacidad de capturar células de forma selectiva y medir su actividad eléctrica y metabólica. Usando la captura de código de barras de ADN, tanto las células adherentes como las naturalmente no adherentes se pueden estudiar en el mismo dispositivo. Además, las células así capturadas no se activan. El formato de matriz permite la discriminación directa entre las células de una mezcla, revelando la variación en las propiedades de una sola célula y cómo esa célula contribuye al conjunto. Los puntos de medición electroquímicos controlados de una sola célula utilizan una interfaz de célula a nanoescala para permitir el análisis subcelular múltiplex de la actividad celular.

La captura controlada de células individuales en dispositivos de microfluidos es esencial para el desarrollo de microdispositivos integrados para el análisis de células individuales. Con escalas de tamaño y volumen comparables a las de las células individuales, los dispositivos de microfluidos proporcionan una poderosa herramienta para el control del microambiente celular. Se ha demostrado que el uso de ADN de superficie celular diseñado (códigos de barras de adhesión celular) es capaz de capturar células, la captura anterior de ADN de células no se pudo usar para realizar análisis de expresión génica de una sola célula en un chip de microfluidos, y tener ese análisis de genes representante de una célula no activada. Los dispositivos de esta invención tienen la nueva capacidad de emplear la captura de células de código de barras de ADN para poblar una matriz de microelectrodos sensibles al pH con células no activadas (nativas). El sistema permite la captura rápida, selectiva y reversible de células individuales no adherentes (antes imposible), así como de células adherentes, en la superficie del sensor de pH. Este sistema bifuncional permite un control preciso en tiempo real del metabolismo de una sola célula basado en el principio de que la acidificación extracelular es proporcional al uso total de energía. En estos experimentos se demuestra que esta tecnología puede identificar células cancerosas con alta actividad metabólica, lo que convierte al dispositivo en una potencial herramienta de diagnóstico y pronóstico para el tratamiento del cáncer. Además, debido a que el sistema se puede adaptar para que sea extremadamente selectivo y específico sobre las células estudiadas y estas células se pueden colocar en ubicaciones precisas en la superficie del dispositivo, el sistema es ideal para aplicaciones conocidas como análisis y tratamiento específicos del paciente para cualquier enfermedad, incluidas por supuesto cáncer.

El trabajo anterior ha demostrado los aspectos individuales de la captura de células individuales y el control del pH en sistemas de microfluidos. Se ha demostrado una variedad de métodos para la captura de células individuales en matriz, que incluyen trampas físicas y energéticas y adhesión bioquímica. Las células de este trabajo anterior no se capturaron con ADN, sino que se restringieron físicamente mediante barreras en el entorno del dispositivo. Si bien se podría usar un pocillo de captura restrictivo simple o una trampa de microfluidos para aislar las células sobre un sensor, se ha demostrado que el acceso a medios frescos y la capacidad de eliminar los productos de desecho son importantes para la función celular normal. La colocación de células de alta precisión también es importante para monitorizar la actividad si se van a usar electrodos a escala subcelular. El sistema de unión de oligonucleótidos de la presente invención permite tanto la captura independientemente de las barreras físicas en el dispositivo como la alimentación y el lavado de las células sin riesgo de perderlas en el proceso.

El uso de la acidificación extracelular es una herramienta valiosa en el análisis cuantitativo de la actividad celular. Un ejemplo clave es el Microfisiómetro Citosensor, que ha sido ampliamente utilizado para medir la acidificación de poblaciones de células a granel (10⁴- 10⁶células por 3 ul de muestra) como una forma de cuantificar el metabolismo. Este sistema se ha utilizado para una serie de aplicaciones, incluida la detección de la activación del receptor acoplado a proteína G (quimiocina), actividad de neurotrofina, canales iónicos controlados por ligando y la unión de ligandos a receptores de tirosina quinasa. También se ha utilizado para identificar ligandos para receptores huérfanos. Otros dispositivos también han empleado electrodos de pH para medir la actividad celular hasta el nivel de una sola célula. El trabajo descrito en Gees et al. Biomed. Microdevices, 2008, 10, 347-354 recientemente demostró un dispositivo para la medición en chip de las tasas de acidificación de miocitos cardíacos individuales mediante confinamiento físico. En el sistema Ges, se aislaron miocitos individuales en el volumen de detección apretando físicamente los extremos de un canal PDMS. Si bien este sistema representa un paso importante en la monitorización de una sola célula, la técnica de aislamiento celular no permite la captura controlada en los electrodos del sensor, lo cual es necesario para la monitorización simultánea de múltiples analitos de células individuales en el mismo entorno controlado. La presente invención proporciona estas importantes ventajas.

Los dispositivos descritos aquí brindan integración directa de la técnica de captura de células basada en oligonucleótidos con sensores que están en la misma escala de tamaño de las células individuales, lo que permite un análisis celular nunca antes logrado en un sistema de electrodos bifuncionales. Una matriz de microelectrodos de pH de óxido de iridio estampados litográficamente está encerrado dentro de un canal de microfluidos. El ^aDⁿmonocatenario se une a la superficie de óxido de iridio utilizando un conector de silano, lo que le da al sensor la capacidad de capturar células que contienen ADN complementario mientras conserva su sensibilidad de detección. Aquí usamos este sistema para medir la acidificación extracelular resultante del metabolismo de las células T no adherentes, y se demuestra que la sensibilidad del pH es suficiente para discriminar entre las células T primarias sanas y las células T Jurkat cancerosas que tienen un metabolismo más alto. Nuestros resultados demuestran la actividad metabólica diferenciable de células individuales sanas y transformadas del mismo tipo básico, lo que podría permitir la identificación de células tumorales circulantes (CTC) dentro de una muestra heterogénea. La novedosa combinación de captura de células dirigida por ADN y monitorización electroquímica en un electrodo bifuncional ofrece una nueva plataforma para el análisis de células individuales.

La fabricación del sensor de electrodo se logra de la siguiente manera: Los electrodos (Au de 40 nm de espesor con una capa de adhesión de Cr de 20 nm) se modelaron en obleas de vidrio de Borofloat de 1.1 mm de espesor utilizando un despegue fotolitográfico estándar, como se describió anteriormente (Fig. 11). Se depositó una capa de parileno-c de 7 |jm de espesor sobre la oblea utilizando un sistema de depósito de parileno Labcoter 2 de Specialty Coating Systems, y se midió con un perfilómetro AlphaStep IQ. Se evaporó una capa de aluminio de 100 nm en el dispositivo y luego se grabó litográficamente con el grabador de aluminio de Air Products con surfactante durante 30 s a 60 °C (Fig. 11A, 11B). La máscara de grabado para la capa de aluminio era una película fotorresistente Shipley 1818 de 1 jm de espesor modelada fotolitográficamente. Luego, la capa de aluminio se usó como una máscara para grabar el parileno subyacente usando plasma de oxígeno (60 sccm O², 100 W, 60 minutos).

Después de quitar el aislamiento de parileno del área del sensor, los sensores se electrodepositaron con una capa de óxido de iridio siguiendo el protocolo de Yamanaka et al. En resumen, la solución de depósito de iridio se preparó como sigue. Se añadieron 37.5 g de IrCl⁴a 75 mL de agua desionizada y se agitó durante 90 min. A continuación, se añadieron 125 mg de ácido oxálico y la solución se agitó durante 3 h. Finalmente, el pH de la solución se ajustó a 11 usando K²CO³. La solución inicialmente era de color amarillo claro, se volvió azul claro y finalmente azul oscuro en el transcurso de varias semanas. La solución de depósito fue estable durante al menos seis meses después de la preparación. El depósito de óxido de iridio se realizó usando un potenciostato CHI 660 en modo de ciclo de voltaje. Se utilizaron 240 ciclos de 0.7 V (0.25 s) y -0.5 V (0.25 s), en una configuración de tres electrodos utilizando una referencia de calomelanos saturados y un contraelectrodo de platino.

Después del depósito, los dispositivos se limpiaron con plasma durante 1 min y se modificaron con trimetoxisililpropanal mediante depósito de vapor a 60 °C durante 60 min. A continuación, se depositó sobre los dispositivos ADNmc modificado con amina (80 jM en solución salina tamponada con fosfato) y se unió usando aminación reductiva como se describió previamente (Fig. 11C). Después del depósito de ADN, la capa protectora de aluminio se disolvió mediante tratamiento con NaOH 0.1 M a temperatura ambiente con agitación durante 20 min, dejando el ADN de captura solo en la superficie del sensor (Fig. 11D).

La preparación del dispositivo de microfluidos se realiza de la siguiente manera: Los canales de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) se prepararon utilizando Dow Corning Sylgard 184 con SU-8 o moldes de poliestireno. Los canales tenían 5 mm de ancho, 15 mm de largo y 600 jm de altura. Se perforó una entrada fluídica compatible con un tubo de teflón de calibre 20 usando una aguja de punta roma de calibre 18, y se perforó un depósito de salida de 5 mm de diámetro en el otro extremo. Los canales de PDMS se limpiaron con un sistema UV/ozono durante 10 min y se aplicaron al dispositivo. Los canales se llenaron con agua desionizada durante 1 h para permitir la hidratación de la capa de óxido de iridio, luego se calibró la respuesta de pH de los electrodos utilizando tampones estándar de pH 4, 5, 7 y 10. El canal se mantuvo a 37 °C utilizando una platina de aluminio calentada con un calentador de poliimida MinCO y un controlador de temperatura Cole-Parmer DigiSense PID.

La preparación y el marcaje de las células se realiza de la siguiente manera: Las células Jurkat se cultivaron en medios RPMI-1640 con suero fetal bovino (FBS) al 10 % y solución de penicilina-estreptomicina al 1 %. Las células cultivadas se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO², y se divdieron 1:10 cada 2-3 días. Los experimentos de acidificación celular se realizaron en bases de medios con bajo tampón personalizados en medio de Eagle modificado por Dulbecco, que contenía D-glucosa 25 mM, KCl 5.3 mM y NaCl 110.34 mM, más FBS al 1 % y penicilina/estreptomicina. Finalmente, se ajustó el pH del medio a 7.45 utilizando NaOH 0.1 M. Las células se aislaron de ratones y se prepararon como se describió anteriormente (véase A.L .DeMond, K.D. Mossman, T. Starr, M.L. Dustin y J.T. Groves, Biophys. J., 2008, 94, 3286-3292).

El marcaje de la superficie celular con ADNmc se logró usando un conjugado NHS-ADN que modifica covalentemente las aminas primarias en la superficie celular (Figura 11E), como se describe anteriormente. En resumen, las células se incubaron en una solución de NHS-ADN 120 pM en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego se lavaron tres veces para eliminar cualquier ADN no unido. La captura de células específicas del código de barras se probó con portaobjetos de micromatrices de ADN manchado como se informó anteriormente (véase douglas et al. Lab Chip, 2007, 7, 1442-1448).

La monitorización metabólica se realizó de la siguiente manera: Las células se suspendieron a una concentración de 10⁶/mL, y la suspensión se hizo fluir en el dispositivo de microfluidos. Las suspensiones celulares se introdujeron en el canal utilizando jeringas de 1 mL con tubos de teflón. Cuando las células Jurkat y T primarias se monitorizaron simultáneamente, se marcaron con tintes CellTracker Green y Red, respectivamente, como se describió anteriormente y se mezclaron en una relación igual. Después de una incubación de 5 min para permitir la captura de células basadas en ADN, las células no unidas se enjuagaron (5 ul/min durante 3 min) con el medio con bajo contenido de tampón. Después del enjuague, la respuesta del pH se controló electroquímicamente durante 10 min. Después de este registro, las células se liberaron de los electrodos calentando el dispositivo a 55 °C y aplicando un enjuague fuerte (200 uL/min) con los medios de bajo tamponamiento. Una vez enjuagado y permitido volver a 37 °C, el dispositivo podría recargarse con células. Esto permitió realizar múltiples mediciones con una sola preparación celular.

Las mediciones de voltaje se registraron entre el electrodo de óxido de iridio y un electrodo de referencia FLEXREF Ag/AgCl distante de World Precision Instruments. Se usó un electrodo de óxido de iridio idéntico fuera del área de la célula para compensar cualquier desviación del sensor. Los electrodos sensores se conectaron a una tarjeta de adquisición de datos PCI-603 IE de National Instruments con conversión de analógico a digital de 16 bits. Las señales digitalizadas se monitorizaron utilizando un Labview VI personalizado, muestreando en multiplex a 3 hz. Las señales de voltaje se procesaron con un filtro Loess al 1% utilizando el software Peak Fit para reducir el ruido.

Antes del análisis metabólico, los electrodos se caracterizaron utilizando tampones de pH estándar (Fig. 12). Se descubrió que estos electrodos modificados con ADN conservan su sensibilidad al pH, con un rendimiento comparable al de los sensores de óxido de iridio no modificados. La respuesta del electrodo fue estable y rápida, respondiendo a un cambio de 1 unidad de pH en menos de 500 ms. La respuesta de pH de los electrodos fue típicamente -68.5 mV por unidad de pH, con una respuesta lineal en el rango de pH de 4 a 10. El rango típico para las mediciones de acidificación celular es de aproximadamente 6.5 a 7.5, por lo que este sensor es muy adecuado para las mediciones. La magnitud de la respuesta observada está en línea con el rango de -60 a -80 mV/pH de otros sensores de óxido de iridio hidratado demostrados anteriormente. La reacción en el electrodo que proporciona la sensibilidad al pH ha sido descrita por Olthuis et al. El rango de sensibilidad de -60 a -80 mV/pH depende del estado de oxidación de la película de óxido de iridio depositada por diversas técnicas electroquímicas. Olthuis proporcionó la reacción en el electrodo que proporciona la sensibilidad.

2Ir(OH)²O ^-+ H²O === Ir²O(OH)^aO^3-+ 3H⁺+ 2e^‘

La integración de una sonda de ADN de captura por afinidad con los microelectrodos de pH en el chip bifuncional de matriz de microelectrodos proporciona una plataforma para el control directo de la acidificación extracelular de las células que normalmente no son adherentes. El sistema también proporciona seguimiento de las células que no están activadas por el sistema de unión de oligonucleótidos, ya sean células adherentes o no adherentes. Como se ve en la Figura 13, el microelectrodo bifuncional limitador de tamaño permite la captura de una sola célula directamente en el sensor. La matriz de microelectrodos bifuncionales se probó midiendo la acidificación extracelular de Jurkat y las células T primarias. Primero, las células Jurkat y T primarias fueron capturadas y monitorizadas por separado en la matriz para establecer la funcionalidad del sensor y la diferencia en la acidificación de una sola célula entre los dos tipos de células. La Figura 14A muestra datos de acidificación de células individuales durante un período de 10 min. Las células Jurkat mostraron una tasa de acidificación extracelular de 11.5 ± 3.3 mili-pH/min, mientras que las células T primarias exhibieron 1.61 ± 1.5 mili-pH/min (s.d., n = 9 cada una). Esta diferencia también se confirmó con mediciones de acidificación de la población celular a granel (~10⁶/mL de células en medio bajo en tampón a 37 °C).

Para demostrar la capacidad de distinguir diferentes células en una población mixta, se controlaron simultáneamente en la matriz células individuales de una mezcla de células Jurkat y T primarias que portaban el mismo código de barras de adhesión celular. La Figura 14B muestra datos de acidificación de células mixtas en la matriz durante 10 min. La diferencia en las tasas de acidificación medidas siguió la misma tendencia que las muestras separadas y permitió la discriminación entre las dos células visualmente similares (Figura 14B). Las células Jurkat tenían una tasa de acidificación de 10.1 ± 2.3 mili-pH/min, y las células T sanas tenían 2.41 ± 2.54 mili-pH/min (s.d., n = 5 cada una).

La figura 14C presenta un gráfico de barras de las tasas de acidificación durante varios ensayos utilizando poblaciones de células conocidas en la matriz. Para las células Jurkat, la tasa de acidificación media fue de 11.5 ± 3.2 mili-pH/min, mientras que las células T primarias exhibieron una tasa de 1.62 ± 1.31 mili-pH/min. La diferencia es claramente significativa con un valor de prueba T de P<0.0002. Aunque las células Jurkat eran ligeramente más grandes que las células T primarias (normalmente, 12 pm frente a 10 pm de diámetro), la diferencia de tamaño no es lo suficientemente grande como para explicar la diferencia de acidificación.

Para demostrar la capacidad de medir la respuesta de células individuales a la estimulación exógena, las células Jurkat se trataron con rotenona mientras se capturaban en la matriz de microelectrodos bifuncionales (Fig. 15). Se esperaría que la incubación con rotenona interfiera con la cadena de transporte de electrones mitocondrial, lo que hace que las células pasen a la fermentación con ácido láctico para completar el ciclo glucolítico. La excreción resultante de ácido láctico debería aumentar la tasa de acidificación en el entorno celular. En el experimento, las células capturadas se incubaron primero en condiciones normales para establecer una tasa de acidificación de referencia (~8.8 mili-pH/min) bajo metabolismo aeróbico. Después de 13 min, se añadió rotenona 10 pM al canal, lo que resultó en un aumento de tres veces en la tasa de acidificación (~27.7 mili-pH/min) en 1 minuto. Controles de células a granel, en las que las células Jurkat se trataron con rotenona 1 pM en medios con bajo contenido de tampón (~106 células/mL a 37 °C), demostraron consistentemente más del doble de acidificación durante 60 min en comparación con células idénticas no tratadas. La observación de este cambio metabólico proporciona una demostración importante de la capacidad de esta técnica para controlar las respuestas a agentes exógenos, tal como la unión del receptor al ligando, a nivel de una sola célula.

La matriz de microelectrodos bifuncionales desarrollada aquí combina las dos funciones importantes de captura selectiva de células y monitorización metabólica de células individuales en un formato de matriz. En trabajos anteriores, Castellarnau et al. utilizaron dielectroforesis para localizar suspensiones de bacterias de alta concentración cerca de un sensor de pH ISFET y midieron la acidificación de las células en presencia de glucosa. Si bien esta técnica se adecuaba bien a la medición de la respuesta masiva, carece de la capacidad de resolver la actividad única de las células individuales. El sistema de pH de células cardíacas individuales de Ges et al. proporciona la capacidad de monitorizar células adherentes grandes, pero el desplazamiento de volumen causado por el sellado del canal dificulta la dirección de la unión celular. La captura de código de barras de ADN ofrece la ventaja de la captura dirigida de células adherentes y no adherentes de forma natural, tal como las células T y B, y la ventaja adicional de analizar células que no se activan mediante el método de unión de oligonucleótidos. Esta captura controlada proporciona una plataforma para el sondeo óptico y/o eléctrico con resolución espacial y la medición de la actividad en la superficie celular.

Los datos de acidificación muestran que las células individuales no adherentes continúan comportándose normalmente después del tratamiento con captura de ADN y unión al electrodo. Si bien es probable que cualquier técnica de captura tenga algún efecto en la célula, los códigos de barras de adhesión celular eluden los receptores naturales de la superficie celular que a menudo se usan para la captura basada en integrinas o anticuerpos y, por lo tanto, deben evitar la activación de esas vías de señalización conocidas. Tanto para las células Jurkat como para las T primarias, las tasas de acidificación extracelular medidas son comparables a las tasas de acidificación de células individuales informadas por Ges et al., pero la mayor sensibilidad de nuestra técnica de microelectrodos funcionalizados permite la discriminación entre los dos tipos de células.

Estos resultados de una sola célula muestran que la diferencia entre la actividad metabólica de las células primarias no transformadas y las células T cancerosas inmortalizadas se puede detectar a nivel de una sola célula. Se ha demostrado la capacidad de distinguir electroquímicamente entre células individuales visualmente similares del mismo tipo básico utilizando esta diferencia metabólica. Esta metodología podría usarse para identificar células tumorales circulantes individuales por su actividad metabólica distintiva, yendo más allá de la simple captura basada en anticuerpos. También podría usarse para diferenciar entre células cancerosas de diferente potencial metastásico. La monitorización de una sola célula dentro de tal mezcla permitiría la detección de diferencias en la respuesta al fármaco con base en el estado de progresión u origen del cáncer de la célula.

El formato de matriz con su extensión obvia para incluir más elementos permite la comparación directa de la actividad individual de muchas células bajo las mismas condiciones con poder suficiente para caracterizar la variación del conjunto. La construcción de una matriz de electrodos nanofabricada podría producir un mapa de análisis electroquímico de una superficie celular con alta resolución espacial. El perfilado estático de la superficie celular se ha demostrado previamente mediante microscopía electroquímica de barrido, pero una matriz de nanoelectrodos podría transformar esto de un proceso en serie a uno paralelo y proporcionar resolución temporal también en células vivas.

El sistema es capaz de aumentar el número de analitos detectados desde una sola célula y tiene la capacidad de aumentar la complejidad del sistema de análisis en general. El sistema de microfisiómetro de citosensor mencionado anteriormente para el control de células a granel se modificó para medir simultáneamente los niveles de glucosa, lactato y oxígeno, además de las capacidades de medición de pH estándar. Los sensores selectivos de analitos micro o nanofabricados también podrían agregarse al sistema para una profundidad analítica adicional, incluida la detección de múltiples analitos en una sola célula. Thayer et al. utilizaron una combinación de fluoróforos sensibles al calcio y control eléctrico para monitorizar el flujo de calcio en neuronas individuales durante el registro de pinzamiento de parche. El dispositivo multicapa de PDMS/vidrio se modifica fácilmente para permitir mediciones eléctricas y de fluorescencia simultáneas. Si bien las sondas fluorescentes a menudo sufren fotoblanqueo, la técnica aquí incorporada podría usarse para rastrear la actividad metabólica de una sola célula durante horas o días, revelando cualquier cambio a medida que la célula avanza a lo largo de su ciclo de vida.

La captura de células basada en código de barras de ADN brinda la capacidad de diseñar la unión entre células individuales, lo que permite la construcción y el análisis de sistemas discretos de células de varios tipos en un electrodo. Por ejemplo, una sola neurona podría vincularse utilizando ADN a una sola célula muscular para permitir el análisis de la formación y operación sináptica neuromuscular de una sola célula. Además, el tejido artificial se puede diseñar mediante la unión de célula a célula con hibridación de oligonucleótidos. Los sensores se pueden colocar en o cerca del sistema para registrar cambios metabólicos, eléctricos o de otro tipo en el sistema.

Ejemplo 6: Bioprocesador de microfluidos

El análisis de una sola célula es un enfoque poderoso para comprender los cambios en la expresión génica dentro de una población de células isogénicas. Las técnicas tradicionales de análisis de la expresión génica, como las micromatrices y el análisis en serie de la expresión génica, no son lo suficientemente sensibles para analizar los cambios a nivel de una sola célula y solo informan sobre el comportamiento promedio del conjunto de un gran número de células. Recientemente, se han desarrollado una variedad de técnicas altamente sensibles y especializadas para sondear la expresión génica en células individuales. Aunque muchos de estos enfoques ofrecen la ventaja de la monitorización en tiempo real, los protocolos requeridos son laboriosos, a menudo requieren ingeniería celular y tienen capacidades de multiplexación limitadas.

Las tecnologías y los métodos de microfluidos recientemente desarrollados permiten el análisis de una sola célula en un formato que se puede escalar a un gran número de células. Los dispositivos de microfluidos presentan una plataforma poderosa para sondear células individuales porque la longitud intrínseca (1-100 pm) y las escalas de volumen (picolitros-nanolitros) están cerca del tamaño y el volumen de las células individuales (“ 1 pL). La mayor ventaja que ofrece la microfluídica es la capacidad de integrar todos los pasos de procesamiento en un solo dispositivo, lo que elimina la contaminación de la muestra y la pérdida de producto, lo que impediría el análisis sensible, reproducible y cuantitativo de una sola célula.

Los 3 pasos que deben integrarse en un microdispositivo para realizar un análisis de expresión génica de una sola célula son la selección y localización de células, la reacción enzimática y la detección cuantitativa del analito de interés. Aunque muchos sistemas de microfluidos han demostrado 1 o 2 de estos elementos, la integración exitosa de los 3 es extremadamente desafiante. Los primeros sistemas de microfluidos acoplaron con éxito cámaras de PCR a canales de separación de electroforesis capilar (CE). Los microsistemas integrados recientes han demostrado un aumento significativo en la sensibilidad de detección, el manejo de muestras crudas y el paralelismo masivo. A pesar de estos avances, ningún dispositivo de microfluidos integrado ha combinado con éxito los 3 pasos en una sola plataforma para medir los cambios en la expresión génica directamente de células individuales. El obstáculo fundamental ha sido la transferencia eficiente del analito entre cada paso de procesamiento de nanolitros.

Para hacer frente a este desafío, se desarrolló un dispositivo de microfluidos integrado con todos los elementos necesarios para el perfil de expresión génica de una sola célula y se usó para realizar un estudio de silenciamiento de genes de una sola célula (Figura 20). Las células se funcionalizan con un oligonucleótido de 20 bases en su superficie para permitir la captura en una almohadilla de oro mediante hibridación de ADN. El análisis de expresión génica multiplex a partir del ARNm de GAPDH y el ARNr 18S de control se realiza en 2 poblaciones celulares. La primera población celular consiste en células de linfocitos T Jurkat no tratadas cultivadas en condiciones normales que exhiben una alta expresión homogénea de ambos genes diana (Fig. 20A). La segunda población celular se trata con ARNsi dirigido al ARNm de GAPDH (Fig. 20B). El grado en que se silencia el ARNm de GAPDH en células individuales se prueba en relación con el control de ARNr 18S.

El microdispositivo de expresión génica contiene 4 sistemas de análisis en matriz direccionables de forma independiente en una oblea de vidrio de 100 mm de diámetro (Figura 21). Cada uno de los microsistemas idénticos contiene 4 regiones distintas que están integradas para permitir la máxima eficiencia de transferencia entre los pasos de procesamiento. La primera región es una bomba de 3 válvulas para mover material desde la entrada de la muestra a través de la región del reactor. En la región del reactor, las células individuales se capturan, se lisan y el ARNm de interés se transcribe de forma inversa y se amplifica mediante RT-PCR. La región de captura por afinidad comprende una cámara de retención que actúa como depósito y una cámara de captura donde los amplicones se inmovilizan, purifican y concentran en una matriz de gel de captura por afinidad. Finalmente, el sistema contiene un canal de separación CE para la separación y cuantificación de productos basada en el tamaño.

El análisis completo desde la captura de una sola célula hasta la separación y detección de CE se realiza en <75 min como se describe en la Fig. 22A Primero, las células Jurkat se funcionalizan con un oligonucleótido de 20 bases (Fig. 226). Las células Jurkat se cultivan con un azúcar de N-azidoacetilmanosamina peracetilada sintética (Ac4ManNAz) que es metabolizado por la célula y da como resultado la presentación de grupos azido en la superficie de las células. El ADNmc modificado con fosfina se hace reaccionar con el grupo azido a través de la ligadura de Staudinger, generando una población de células funcionalizadas con “ 270000 moléculas de ADNmc por célula.

En otra realización, las moléculas de ADNmc se pueden unir a las células Jurkat usando los presentes métodos como se describe en el Ejemplo 1 como sigue: Inmediatamente antes de la modificación, una muestra de 5*10® células Jurkat se lavan con tampón PBS tres veces para eliminar las proteínas del medio de cultivo. Después del enjuague final, se agrega PBS adicional para llevar el volumen a 5 mL (1 * 10® célula/mL). A continuación, la suspensión celular se hace reaccionar con 1 mL de solución de NHS-ADN (11.7 ^jM) sintetizada y purificada a partir de 30 j l de 5'-tiol ADNmc. La mezcla se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se lava tres veces con PBS que contiene 1% de FBS. A continuación, las células se resuspenden en 0.5 mL de PBS que contiene FBS al 1 %.

Dentro del reactor, la cadena complementaria de 20 bases de ADN de captura modificado con tiol se inmoviliza en una almohadilla de oro con límite de tamaño de 25 * 25 jm 2 definida fotolitográficamente con un enlace de oro-tiol Las células fluyen hacia el reactor y se inmovilizan en la almohadilla de oro mediante hibridación de ADN. El tamaño de la almohadilla asegura que solo se unirá 1 célula. En informes anteriores, hemos demostrado que la combinación de ingeniería metabólica y unión basada en ADN conduce a una activación celular significativamente menor que los métodos basados en anticuerpos o lectina. Por lo tanto, aunque se esperaría que cualquier método de unión tuviera algún efecto sobre el comportamiento celular, el método basado en el ADN minimiza estos efectos.

Después de lavar las células residuales no capturadas fuera del reactor, la célula capturada se prepara para el análisis (Fig. 22C). Después de una lisis rápida de congelación y descongelación de 30 s, el ARNm objetivo se transcribe de manera inversa en una cadena de ADNc estable durante una incubación de 15 minutos a 42 °C. Luego, se completan 30 ciclos de amplificación por PCR en el mismo reactor de 200 nL en 25 min. Todos los productos de RT-PCR luego se transfieren cuantitativamente desde el reactor al canal de separación para el análisis de tamaño. Los fragmentos amplificados y la mezcla de RT-PCR sin reaccionar se bombean desde el reactor a la cámara de retención y se conducen electroforéticamente desde los desechos hasta el depósito del cátodo. Los fragmentos de interés con complementariedad con la sonda de captura por afinidad se concentran cuantitativamente y se inmovilizan en la entrada de la cámara de captura, creando un tapón de captura purificado. La matriz de captura por afinidad comprende un gel de poliacrilamida lineal (LPA) copolimerizado con dos sondas de captura de oligonucleótidos de 20 bases complementarias a los fragmentos de interés (20 ^jM). Este proceso de captura utiliza invasión de hélice específica de secuencia para inmovilizar los amplicones de dsDNA. Las sondas de captura son complementarias a las secuencias de 23 y 47 bases del final de los amplicones de ARNr GAPDH y 18S, respectivamente. Al colocar las sondas en el interior de los sitios de cebado, el gel de captura también actúa como una matriz de purificación para eliminar los cebadores marcados con FAM de alta molaridad que no reaccionaron. Finalmente, los productos purificados y concentrados se liberan térmicamente a 80 °C desde el gel de captura por afinidad, se separan electroforéticamente y se cuantifican mediante detección de fluorescencia confocal (datos no mostrados).

El sistema integrado de análisis de expresión génica de microfluidos produce datos cuantitativos sobre el silenciamiento génico de células individuales. Como era de esperar, las células Jurkat sin tratar muestran una expresión normal de ARNm de GAPDH y ARNr de 18S (Figura 23A). El electroferograma representativo muestra 2 picos fuertes que migran a los 1®0s y 185 s para los objetivos de ARNr GAPDH de 200 pb y 18S de 247 pb, respectivamente (Fig. 23). Además, el uso de la matriz de captura para inmovilizar los fragmentos de interés elimina todos los cebadores que no reaccionaron de la separación, lo que nos permite observar amplicones grandes y pequeños sin interferencias. Una sola célula Jurkat sometida a electroporación con ARNip dirigido al ARNm de GAPDH produce solo un pico único para 18S ARNr a los 185 s. Los experimentos de una sola célula de 8 células individuales muestran la expresión del ARNm de GAPDH al 0, 5, 50, 1, 48, 0, 5 y 0 % de las células Jurkat no tratadas (Figura 23B). Este análisis indica que las células individuales caen en poblaciones con silenciamiento moderado (“ 50%) o completo (“ 0%). Estas mediciones de una sola célula difieren fundamentalmente de una medición a granel realizada en 50 células Jurkat en las mismas condiciones donde la expresión de GAPDH se reduce a 21 ± 4% (N = 4) de su valor original. Por lo tanto, el promedio del conjunto medido para el silenciamiento de genes enmascara la diversidad estocástica de la respuesta celular individual. Un ensayo de control en donde no se capturan células en la almohadilla no presenta productos, lo que verifica que no haya contaminación remanente en el sistema. De manera similar, un control de ^pC^rsin transcriptasa inversa no muestra amplificación, lo que garantiza que la plantilla de amplificación sea ARN y no ADN.

Para garantizar que la variación en el comportamiento de silenciamiento no sea una función simple de la cantidad de ARNip introducido durante el proceso de electroporación, las células se trataron con un ARNip marcado con fluorescencia. Las células cultivadas en condiciones normales mostraron una captación promedio del ARNip marcado con Cy3 de 17 ± 2 unidades relativas de fluorescencia (rfu) (Tabla S1) con 4 de 30 células que aparecen en un nivel ligeramente elevado de 22 rfu. Si la variabilidad de la electroporación fuera la causa de las 2 poblaciones celulares, se esperaría que el 13 % de las células se caracterizaran como completamente silenciadas y el 87 % como moderadamente silenciadas. El análisis de expresión génica de una sola célula realizado en el dispositivo de microfluidos muestra la tendencia opuesta (Figura 23B).

Tabla S1. Datos tabulados a partir de experimento de electroporación de ARNip de una sola célula

Célula No. Mínimo Máximo Diferencia, rfu

1 ^m 41 15

2 25 42 17

J m fs

4 25 m t i

s 25 42' 17

£ 25 48 23

7 ^m 40 14

i 25 40 15

^§ 25 41 te

10 25 44 18

11 .25 43 18

_U 25 41 _m

o 24 30 15

14 ²⁴ 40 15

15 24 42 10:

!£ 24 ^m 22

17 24 42 18

ia 24 42 18

10 25 42 17

20 25 44 19

21 2G 43 17

^{12 m} 42' t f

23 .25 44 10

» ^m 40 14

25 24 40 18

26 24 30 15

27 24 Jt- 2:2

28 21 37 18

22 44 2:2

^m 23 40 17

Promedio: 17.2

SDfc: 2.4

Las células se sometieron a electroporación con ARNip

marcado con Cy3 y crecieron en condiciones normales y se

obtuvieron imágenes con epifluoresencia. Se interroga cada

celda y se registra el valor máximo de intensidad de píxel.

Además, se registra un valor mínimo justo fuera de cada

celda para la normalización. La captación promedio es de

17.2 ± 2.4 unidades de frecuencia relativa (rfu). La captación

máxima es de 23 rfu y la mínima de 15 rfu.

Además, se secuenció el gen GAPDH para examinar si la población de células que experimenta un silenciamiento moderado surge de un polimorfismo heterocigótico en el dominio de unión a ARNip. Se encontró que la secuencia no tenía mutación. El resultado de la secuenciación de la unión del ARNip de GAPDH mostró que la secuencia esperada (5'-AAA GTT GTC ATG GAT GAC C-3') se encontró en las células Jurkat, lo que sugiere que las 2 poblaciones de células no son el resultado de un polimorfismo en el dominio vinculante. Por lo tanto, las 2 poblaciones de células reveladas aquí no son un resultado trivial del suministro de ARNip, la variación genética o la viabilidad celular.

La aparición de 2 poblaciones celulares distintas con diferentes niveles de silenciamiento génico ha sido detectada por Liu YP, Dambaeva SV, Dovzhenko OV, Garthwaite MA, Golos TG. Stable plasmid-based siRNA silencing of gene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 2005;14:487-492. Las mediciones de la producción mejorada de proteína fluorescente verde en células madre embrionarias humanas (hESC) han mostrado una respuesta de todo o nada al tratamiento con ARNip, pero no se caracterizó el mecanismo subyacente. Nuestro sistema demuestra la capacidad única de realizar análisis cuantitativos de transcripción, revelando que aunque el 80 % de las células exhibieron la inhibición completa esperada, el 20 % exhibió una inhibición del 50 %. Esto sugiere la presencia de una biestabilidad genética o fenotípica o un interruptor que controla la degradación del ARNip, bloquea su unión a la diana o inhibe la degradación de la transcripción. De estos, solo los 2 últimos mecanismos proporcionarían una explicación no trivial para el nivel de inhibición del 50%. Ahora se requiere un estudio más exhaustivo para verificar la tendencia de expresión bifásica observada aquí y explorar su origen mecanicista. Debido a que la fabricación de estructuras altamente paralelas es una de las ventajas clave de nuestro enfoque, escalar hasta 96 analizadores proporcionaría el rendimiento necesario para este tipo de estudio.

Nuestra capacidad para realizar una amplificación de RT-PCR de 1 paso en nuestro microdispositivo de expresión con solo 30 ciclos de PCR en un solo reactor es el resultado directo de una integración eficiente. En primer lugar, el uso de vidrio en lugar de materiales poliméricos porosos impide la absorción del producto. En segundo lugar, la alta conductividad térmica del vidrio permite ciclos térmicos rápidos y una mayor eficiencia de reacción. En tercer lugar, el uso de válvulas y bombas neumáticas permite la transferencia eficiente de material de bolo de nanolitros. Finalmente, el proceso de captura por afinidad, purificación y concentración permite el análisis cuantitativo de todos los productos generados, una mejora dramática sobre el uso de un inyector cruzado tradicional o un inyector de presión hidrodinámica, que solo permite una pequeña porción (<1%) de los productos a analizar. Estos atributos ventajosos de nuestro dispositivo integrado señalan el camino a una amplia variedad de estudios bioanalíticos sobre las propiedades y el comportamiento de células individuales.

Aquí, hemos realizado mediciones unicelulares sobre la variación de la inactivación del ARNm como resultado del tratamiento con ARNip. Este ensayo sugiere una eficiencia única de eliminación de genes bifásicos en células individuales que estaba enmascarada por mediciones a granel. Debido a que el paso de análisis utiliza una separación basada en el tamaño, las capacidades multiplex están determinadas por la cantidad de productos que se pueden generar y analizar, lo que sugiere que la expresión de 5 a 10 objetivos podría estudiarse en paralelo. Al acoplar este microdispositivo con la microdisección de captura láser, la naturaleza heterogénea de los tumores podría investigarse a nivel de una sola célula. También debería ser posible realizar un análisis cuantitativo unicelular de los efectos del tratamiento con ARNip en la expresión en hESC cuando el direccionamiento de ARNm Oct4 se utiliza para desencadenar la diferenciación en células similares a trofoblastos. Además, con baase en nuestra detección anterior de <11 moléculas de ARNm por reactor, nuestro dispositivo de microfluidos puede, en última instancia, permitir estudios de expresión de células individuales a nivel de transcripción única, una vez que los procesos mejorados de captura, purificación e inyección de productos estén completamente habilitados e integrados. En general, nuestro enfoque ofrece muchas perspectivas interesantes para revelar la variación estocástica en la expresión génica que subyace al promedio del conjunto.

Materiales y métodos. Fabricación de bioprocesadores. El protocolo de fabricación es similar al utilizado en microdispositivos de amplificación de ácido nucleico anteriores, Toriello NM, Liu CN, Mathies RA. Multichannel reverse transcription-polymerase chain reaction microdevice for rapid gene expression and biomarker analysis. Anal Chem.

2006;78:7997-8003. En resumen, para formar la oblea del colector neumático, los asientos de válvula y los canales de accionamiento se definieron fotolitográficamente y se grabaron a una profundidad de 38 pm en una oblea de vidrio de 100 mm de Borofloat de 0.5 mm de espesor. Se taladraron orificios de acceso a la activación de la válvula y se cortó el colector en tiras reutilizables de 9 mm * 6 cm. Las válvulas de elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) extraíbles se formaron activando ambos lados de la membrana PDMS de 254 pm con un limpiador de ozono UV durante 1.5 minutos para mejorar la unión del vidrio PDMS y luego intercalando la membrana entre el colector y las obleas del canal unido.

La oblea del reactor/canal se fabricó sobre una oblea de vidrio de Borofloat de 0.5 mm de espesor. Los canales fluídicos para el bombeo se definieron fotolitográficamente en el lado frontal y se grabaron a una profundidad de 38 pm. Las cámaras de reacción, retención y captura junto con los canales de separación se definieron fotolitográficamente en la parte posterior y se grabaron a una profundidad de 20 pm. Los depósitos de electroforesis, los orificios de acceso de detección de temperatura de resistencia (RTD) y los orificios de paso de la válvula se perforaron con diamante. Para formar la oblea RTD, se modeló fotolitográficamente una oblea de vidrio de Borofloat de 0.5 mm de espesor con depósito por pulverización con 200 A de Ti y 2000 A de Pt (Ti/Pt; pulverización por UHV) y se grabó con agua regia a 90 °C para formar los 30 -elementos RTD de pm de ancho y cables de 300 pm de ancho. La oblea de canal/reactor perforado se alineó y unió térmicamente a la oblea RTD mediante el uso de un horno de vacío programable a 655 °C durante 6 horas.

Para formar el calentador modular extraíble, se depositó por pulverización una oblea de vidrio de Borofloat de 0.5 mm de espesor con 2200 A de Ti/Pt. Los cables del calentador se formaron electrochapando 6 pm de oro sobre áreas definidas fotolitográficamente. Los elementos calentadores resistivos serpenteantes de Ti/Pt que conectan los cables de oro se formaron mediante grabado anisotrópico de Ti/Pt expuesto fotolitográficamente en un molino de iones.

Preparación de células Jurkat. Se cultivaron células Jurkat de linfocitos T en frascos de 50 mL (Nalge-Nunc International) durante 48 h en 10 mL de medio (RPMI medio 1640; Invitrogen) que contenía penicilina/estreptomicina al 1% (P/S al 1%; Invitrogen) y 25 pM Ac4ManNAz resultando en la visualización de ácidos N-azidoacetilsiálicos en los glicanos de la superficie celular. Durante las primeras 24 h de crecimiento, las células se cultivaron con FBS al 10 % (JR Scientific). Las células Jurkat se lavaron y se incubaron en medio empobrecido en suero que contenía 25 pM de Ac4ManNAz durante 24 h adicionales para la sincronización. Se prepararon células Jurkat funcionalizadas con ADN fresco 1 h antes del análisis. Las células se lavaron dos veces con 5 mL de PBS (Ambion) que contenía FBS al 1 % y se hicieron reaccionar con ADNmc modificado con fosfina 125 pM (5'-phos-GTA ACG ATC CAG CTG TCA CT-3') en FBS al 1 %/PBS durante 1 h a 37 °C. Luego, las células se enjuagaron 3 veces con 5 mL de una solución de FBS/PBS al 1 % antes de introducirlas en el dispositivo de microfluidos.

Tratamiento con ARNsi. Para los estudios de silenciamiento génico, se sometieron a electroporación 150,000 células Jurkat con 2.5 pg de ARNip GAPDH de doble cadena (en sentido, 5'-GGU CAU CCA UGA CAA CUU UdTdT-3'; Ambion). Las células se suspendieron en 75 pL de tampón de electroporación siPORT (AM1629; Ambion) y se realizó un solo pulso en una cubeta de 1 mm (Bio-Rad) durante 250 ps a 250 V. Luego, las células se cultivaron y prepararon de la misma manera que la descrita en la sección anterior de preparación de células Jurkat. Para los estudios de control negativo, las células se sometieron a electroporación con 150 pmol de ARNip marcado con Cy3 que no se une al ARNm.

Mezcla de RT-PCR. La RT-PCR de ARN multiplex se realizó en transcritos de ARNr GAPDH y 18S directamente de células Jurkat. Una mezcla de reacción de RT de 25 pL comprende un kit Cell-to-cDNA II [4 unidades de transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV), 0.4 unidades de inhibidor de RNasa, 0.1 pM de dNTP, 1x tampón de RT (Ambion)], 0.08 unidad de platino Taq polimerasa (Invitrogen), junto con cebadores directos e inversos de 800 nM para el gen GAPDH y cebadores directos e inversos de 20 nM para el objetivo 18S ARNr. Los cebadores GAPDH directo (5'-AGG GCT GCT TTT AAC TCT GG-3') e inverso (5-FAM-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3') generan un amplicón de 200 pb. Los cebadores 18S ARNr directo (5'-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AAG-3) e inverso (5'-FAM-Cg C TCC CAA GAT CCA ACT AC-3') generan un amplicón de 247 pb. Los controles sin RT y sin plantilla se realizaron en el microdispositivo eliminando las células Mo-MLV RT y Jurkat de la mezcla de reacción, respectivamente.

Síntesis de matrices. Se sintetiza un gel de captura por afinidad de ADN mediante la copolimerización de LPA con 2 oligonucleótidos de captura modificados con 5'-acridita. La matriz de captura por afinidad se sintetiza a 4 °C burbujeando una solución de 2 mL que contiene 6 % p/vol de acrilamida, 1 * TTE y 40 nmol de los 2 oligonucleótidos modificados con acridita (IDT) durante 2 h con argón seguido de adición de persulfato de amonio al 0.015 % p/vol (APS; Fisher Scientific) y tetrametiletilendiamina (TEMED; Fisher Scientific). La matriz de captura por afinidad contiene sondas de captura para GAPDH (5'-Acry-ATC ^cC^aTCA CCA TCT TCC ^aG-3', T^m= 54.2; sal monovalente 50 mM, 20 pM) y 18S ARNr (5'-Acry-GCA GCC GCG GTA ATT CCA GC-3', T^m= 61.9; sal monovalente 50 mM, 20 pM). El oligonucleótido de captura de GAPDH es complementario a una secuencia de 20 bases en el amplicón de 200 pb, 23 bases desde el terminal 5' marcado con FAM. El oligonucleótido de captura de ARNr 18S es complementario a una secuencia de 20 bases en el amplicón de 247 pb, 60 bases desde el terminal 5' marcado con FAM

Preparación de reactores. La superficie de vidrio se deriva con polidimetilacrilamida (PDMA) utilizando un protocolo de recubrimiento de Hjerten modificado para evitar la adhesión celular no específica. Primero, la superficie de vidrio del reactor se desprotona incubando con NaOH 1 M durante 1 hora. La solución de NaOH se reemplaza con una solución al 0.6% (vol/vol) de (Y-metacriloxipropil)trimetoxisilano (y, Sigma) en 3.5 pH H2O. La solución y bifuncional prepara la superficie de vidrio para la nucleación del polímero de acrilamida. Durante la incubación de la solución y, se disuelven 250 pL de dimetilacrilamida en 4.75 mL de H2O y se sometió a burbujeo con Ar durante 1 h. Después del sometimiento a burbujeo de Ar, se agregaron secuencialmente 100 pL de alcohol isopropílico (IPA), 20 pL de TEMED y 25 pL de APS al 10 % (vol/vol) a la solución de acrilamida para formar PDMA lineal. La solución ^yse retira del canal y la solución de PDMA se incuba en el canal durante 1 h. Luego se enjuaga el canal y se seca con acetonitrilo.

A continuación, la almohadilla de oro de 25 pm * 25 pm definida fotolitográficamente en el centro de la cámara de reacción se funcionaliza con ADNmc incubando durante 1 h con Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, 200 pM; Invitrogen) tiol-ADN desprotegido (5'-tiol-AGT GAC AGC TGG ATC GTT AC-3', 20 pM). Luego, la cámara se enjuaga y se seca para eliminar el ADN no unido.

Secuencia de carga de gel. El dispositivo se prepara para la captura y separación por afinidad mediante el tratamiento de los canales de separación, las cámaras de retención y las cámaras de captura con un recubrimiento dinámico diluido en metanol durante 1 min (1:1; DEH-100; The Gel Company) para suprimir el flujo electroosmótico. La matriz de captura de afinidad multiplex (20 pM, 6 %, amarillo) se carga desde cada depósito de cátodo (C) hasta el cruce del canal de separación a temperatura ambiente. Luego se carga la matriz de separación (roja) desde el ánodo central (A) más allá de la cámara de captura hasta la cruz de carga de la muestra. Con todas las válvulas abiertas, el resto del sistema se hidrata añadiendo 3 pL de agua libre de ARNasa en los puertos de muestra y aplicando vacío en los depósitos de residuos (W). A continuación, el microdispositivo se coloca en un escenario de temperatura controlada a 44 °C. Se descargan 2 pL adicionales de agua a través del sistema para eliminar el gel expandido térmicamente de la cruz de carga de la muestra.

Operación del bioprocesador. Como se muestra en la Figura 22, la operación del microdispositivo comienza con la preparación de la cámara de reacción para la captura de células. Las células modificadas para contener ADNmc en su superficie se suspendieron en la mezcla de reacción y se incorporaron a la reacción mediante vacío. Cuando una célula fluye sobre la almohadilla de captura de células de oro, se produce la hibridación del ADN entre el ADNmc en la superficie de la célula y el ADNmc complementario inmovilizado en la almohadilla de oro. Para maximizar la eficiencia de captura, la captura de células mediada por ADN se realizó durante 15 min. Las células no capturadas se eliminaron por lavado del sistema y se eliminaron en el puerto de desechos, y las válvulas se cerraron para el ciclo térmico. Durante este estudio, los 4 reactores se utilizaron en paralelo. Esto permitió el análisis simultáneo de 4 células individuales. Después de la captura, se registra la morfología de cada célula para garantizar que ha permanecido viable. El tiempo total de recopilación de datos para los estudios de una sola célula fue de 1 mes.

La lisis por congelación-descongelación y el ciclo térmico de RT-PCR de 1 paso se realizaron en un solo reactor de 200 nL. Se colocó un trozo de hielo seco sobre las cámaras de reacción de los 4 reactores durante 30 s para congelar y descongelar la célula Jurkat capturada. La lisis por congelación y descongelación se utilizó en esta RT-PCR de 1 paso para evitar la activación prematura no deseada de Hot Start Taq polimerasa, para evitar la desnaturalización de la enzima transcriptasa inversa y para minimizar la degradación del ARN por las ARNasas. A continuación, se realizó una síntesis lineal de ADNc de 15 minutos a partir del RNA de las células a 42 °C mediante el uso de cebadores complementarios a los transcritos de RNA de interés (GAPDH y 18S ARNr). Después de la síntesis de ADNc, el Mo-MLV RT se desnaturalizó y el platino Taq polimerasa se activó a 95 °C durante 60 s seguido de 30 ciclos de PCR a 95 °C durante 5 s, 47 °C durante 20 s y 72 °C durante 25 s. Debido a las rápidas tasas de calentamiento y enfriamiento (>15 °C s-1), cada ciclo de PCR se completa en 50 s y el tiempo total de reacción es de 46 min.

Después del ciclo térmico, se realizó la captura por afinidad, la purificación y la concentración de los productos de interés. El contenido del reactor se bombeó a la cámara de retención mediante un ciclo de bombeo de 5 etapas. Se usó un accionamiento de 350 ms con cada paso, lo que resultó en un volumen sistólico de 30 nL. Se usó un retraso de 23 s entre cada ciclo de bombeo para permitir suficiente tiempo para que el analito migre a la región de captura y para evitar la acumulación de analito en la cámara de retención. Un campo constante de 100 V/cm entre los depósitos de residuos (W) y cátodo (C) impulsa electroforéticamente el analito hacia la cámara de captura. Los analitos complementarios a la sonda de captura se hibridaron en la entrada de la cámara de captura, creando un tapón de muestra. El campo eléctrico entre los desechos y el cátodo se mantuvo hasta que los reactivos de PCR residuales (exceso de cebador, sales y tampón) se lavaron en el depósito del cátodo, lo que resultó en un tapón de muestra de amplicón purificado. Se utilizaron treinta ciclos de bombeo, lo que dio como resultado un tiempo total de captura y lavado de 12.2 min. Una vez completado el proceso de captura, la temperatura de todo el dispositivo se elevó a 80 °C para liberar térmicamente los fragmentos de ADN capturados del gel de captura por afinidad, y la muestra se separó con un campo de 150 V/cm entre el cátodo y el ánodo. Los productos marcados con FAM separados electroforéticamente de los 4 carriles se detectaron mediante el uso de fluorescencia inducida por láser con el escáner confocal rotatorio de Berkeley (Shi YN, et al. Radial capillary array electrophoresis microplate and scanner for highperformance nucleic acid analysis. Anal Chem. 1999;71:5354-5361). Todo el proceso de captura y liberación se realizó en una etapa de temperatura controlada en el escáner para evitar gradientes térmicos.

Ejemplo 7: Modelado de células de algas o bacterias individuales para biorreactores o células de combustible

Usando los principios de la invención aplicados a la unión de oligonucleótidos en células no animales a través de un aldehído o cetona en un carbohidrato, se puede estudiar y optimizar la eficiencia de producción de hidrógeno. La captura de oligonucleótidos y su unión a un dispositivo permiten la creación de enzimas y células modeladas en un chip. En el sistema, la conversión de gas hidrógeno en electricidad mide la producción de hidrógeno. La medición de la producción directa de hidrógeno a través de la generación actual es ventajosa debido a la sensibilidad potencialmente mayor a la producción de hidrógeno en comparación con las mediciones convencionales (consulte las lecturas de GC del espacio de cabeza de cultivo). La ventaja de la invención para dichos estudios y accionamientos incluye la conexión y el control implícitos con la ubicación precisa de las células en el dispositivo, que la célula de combustible puede luego ser reutilizable, y también una mayor eficiencia en la utilización de energía solar y de carbono. Por ejemplo, un dispositivo de célula de combustible autosuficiente se puede construir utilizando capas modeladas de diferentes células fotosintéticas, donde las células absorben la luz solar en partes no superpuestas del espectro solar, y también incorporan capas alternas de organismos fijadores de nitrógeno que se alimentan y utilizan la biomasa creada por las células fotosintéticas en capas adyacentes. Cuando se agota, la célula de combustible que tiene las células unidas por hibridación de oligonucleótidos se puede calentar, los oligonucleótidos se deshibridan y las células muertas se eliminan por lavado. La superficie se enjuaga con células modificadas frescas que se vuelven a unir a los oligonucleótidos complementarios en la superficie del dispositivo. Sin embargo, los dispositivos sol-gel que tienen células embebidas en sol-gel se descartan y no se pueden reutilizar de la misma manera, pero esta rotación puede ser adecuada para su aplicación direccionada.

El patrón optimizado de células bacterianas y de algas se logra usando células suspendidas en NaIO45 mM en DPBS durante 20 minutos, a 37 grados centígrados. Después de enjuagar con DPBS, las células se resuspenden en anilina 10 mM en tampón MOPS de pH 6.0 y ADN enlazador I 35 pM (de IDT, el enlazador I es un enlazador de hidrazida) durante 2 horas. Las células se enjuagan, incuban o centrifugan (1 % de FBS) para obtener ADN con patrón complementario durante varios minutos. Además de otras ventajas ya mencionadas, cuando se utilizan células capturadas con oligonucleótidos y se exponen a la luz solar como fuente de energía para la producción de electricidad en biorreactores, bioactividades, metabólicas y células de combustible, y otros usos similares, la invención brinda la oportunidad de organizar las células en una monocapa o múltiples capas, teniendo cada célula acceso directo a la fuente de combustible solar. A su vez, esto permite la oportunidad de emplear luz de menor intensidad.

Otros experimentos y usos del sistema son optimizar un diseño para una célula de combustible de hidrógeno con membrana de intercambio de protones en un chip. Además, se debe usar polímero poroso para evitar el envenenamiento del platino/paladio por bases nitrogenadas y desechos celulares. Para determinar las eficiencias de producción de hidrógeno en permutaciones de dicho sistema, se mide la corriente generada por unidad de tiempo.

La eficiencia de producción de hidrógeno de diferentes combinaciones de microorganismos fotosintéticos y no fotosintéticos se puede estudiar en el camino hacia el aumento de la eficiencia del sistema. Los parámetros tales como los patrones de los organismos en el dispositivo, la exposición a la luz y las combinaciones específicas de organismos en los patrones se pueden variar para optimizar la eficiencia. Por ejemplo, un sistema de producción de hidrógeno de tres organismos propuesto por el laboratorio de Melis (dos fotoautótrofos que absorben diferentes regiones de la radiación solar y un heterótrofo que toma la biomasa creada por la fotosíntesis y la convierte en pequeños ácidos orgánicos que los fotosintéticos necesitan para el crecimiento autotrófico) puede ser adoptado. Los organismos propuestos incluyen, pero no se limitan a, fotosintéticos: C. reinhardtii (algas), Synechocystis PCC 6803 (cianobacterias), R. rubrum (anaerobios gram negativos); heterótrofos: C. pasteurianum (fijador de nitrógeno), Azotobacter sp. (propuesto por tener la tasa de respiración más alta de cualquier organismo). (véase Melis et al, citado en otra parte de este documento).

En otra realización, el dispositivo de célula de combustible comprende un cátodo al aire libre en lugar de una reducción a base de solución en el cátodo, y un ánodo modelado con bacterias directamente sobre el ánodo. Esto se hará recubriendo el ánodo con LPA (poliacrilamida lineal) modificada con estreptavidina (disponible a través de Invitrogen). El recubrimiento también actuará para proteger al Pt del envenenamiento por desechos nitrogenados de las células. El ADN modificado con 5'-biotina se modelará en los electrodos revestidos con LPA utilizando un patrón de litografía de despegue de aluminio. Entonces, primero se fabricará la base del electrodo de vidrio, luego se modelará el ADN en los electrodos, finalmente se modelará el patrón de las células en el electrodo y se unirá la parte superior del PDMS. Constantemente habrá un flujo muy lento de medios hacia la célula porque la producción de hidrógeno es mayor durante la fase de crecimiento logarítmico y cuando los nutrientes son abundantes. El dispositivo se iluminará y la producción de hidrógeno fotosintético se puede medir, por ejemplo, mediante una caída de voltaje sobre una resistencia con algún tipo de polarización colocada en la célula.

En un dispositivo de célula de combustible, el gas hidrógeno se nucleará en el electrodo de Pt y, como ocurre con la mayoría de los diseños de células de combustible, los electrones se eliminarán, convirtiendo inmediatamente el hidrógeno producido por las células en electricidad.

Otro aspecto interesante de la creación de patrones es el uso del ADN para diseñar las células una encima de la otra para su uso en un dispositivo de célula de combustible. Con referencia ahora a la Figura 30, se pueden modelar varias células una encima de otra en una micromatriz de ADN. Cada célula está etiquetada con un fluoróforo diferente, excepto las cianobacterias. Synechocystis, que se autofluorece en rojo. En la Figura 30 se muestra un esquema de las células y qué fluoróforo están marcados. La ventaja es que la orientación espacial de la célula absorbente de oxígeno (A. vinelandii) intercalado entre las dos células fotosintéticas será potencialmente útil para mantener bajas las concentraciones de oxígeno en la vecindad local de las células fotosintéticas. Dado que la fotosíntesis genera oxígeno (al menos en el caso de las algas y las cianobacterias) como subproducto y las enzimas que producen hidrógeno son inhibidas por el oxígeno, tener las células fotosintéticas unidas a una célula con un metabolismo increíblemente alto significa que la concentración local de oxígeno siempre debe ser bajo y la producción de hidrógeno será sostenida. Actualmente, Synechocystis no le va bien en la producción de H2 a largo plazo debido a la inhibición de oxígeno de sus enzimas hidrogenasas. Los experimentos anticipados actualmente deberían mostrar que se pueden cultivar las células juntas (tales como cocultivos de A. vinelandii y Synechocystis, Un cocultivo de vinelandii y R rubrum, o los tres cultivados juntos) y muestran que estos cultivos tienen una evolución amable de hidrógeno y concentraciones más bajas de oxígeno presente que si las células se cultivaran solas.

La concentración de gas O2 y H2 se puede medir mediante cromatografía de gases. Al construir el dispositivo, se puede probar usando un tipo de célula (por ejemplo, R. rubrum) para demostrar que puede funcionar como una célula de combustible de hidrógeno. El experimento final investigará cómo los patrones bidimensionales y tridimensionales afectarán la salida eléctrica (sinónimo de producción de H2) de la célula cuando se utilizan 2 o más combinaciones de tipos de células.

Las cadenas utilizadas para modificar cada célula no complementan ninguna otra cadena en las otras células o vidrio para asegurar que las células tengan el patrón correcto. Los mismos oligonucleótidos usados en los ejemplos anteriores (M1/C1, M2/C2, M3/C3) y otras dos secuencias complementarias Z2 (5' CACACACACACACACACACA 3') y zc2 (5' TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG 3') pueden usarse para modelar estas células sobre el sustrato de vidrio. Las células están modeladas una capa a la vez. Las células se oxidan en peryodato de sodio 5 mM y luego se incuban en ~35 |jM de hidrazida-ADN a pH 6 en tampón MOPS (ácido N-morfilino propano sulfónico) (téngase en cuenta que MOPS se está utilizando en este experimento fuera de su rango normal de tampón). Después de lavar las células, se unen de forma reversible a un pocillo de PDMS sobre el sustrato de vidrio previamente modificado con ADN. El pocillo se llena con una solución celular, se centrifuga a 3000 rpm durante 5 min, se enjuaga con PBS y se repite con los siguientes dos o tres tipos de células secuencialmente. El ADN no debe deshibridarse en estas condiciones, lo que permite que las células se modelen como se muestra en la Figura 30. Los tipos de célula elegidos no se limitan a los que se muestran, sino que se pueden agregar múltiples capas de células con patrón utilizando los métodos presentes.

Por ejemplo, con referencia ahora a la Figura 30, el vidrio se puede modificar con oligonucleótido M2. La capa de células de Synechocystis se unen al sustrato de vidrio a través del oligonucleótido C1. Esta capa de Synechocystis luego se modifica con el oligonucleótido C2. Las células de A. vinelandii se modifican con oligonucleótido M2 y se unen a la primera capa de Synechocystis a través de la hibridación M2/C2. La capa dos de células de A. vinelandii se modifican con M2 y C3, y la tercera capa de células de R. rubrum se modifican con M3 y luego hibridan con el oligonucleótido M2 y unen la tercera capa a la segunda capa de células.

El modelado debe llevarse a cabo en condiciones estériles y luego colocar el patrón en un medio en donde puedan crecer todas las células y en un vial con una pequeña cantidad de espacio de cabeza. La producción de H2 podría monitorizarse tomando muestras de este espacio de cabeza a lo largo del tiempo y monitorizando la actividad. El sistema requerirá un medio en donde puedan vivir los tres o dos tipos de células, o la cantidad que sea, y una fuente de luz, tal como la luz solar o una bombilla fluorescente o de tungsteno, es suficiente. En el dispositivo, se proporciona un flujo lento de medios dentro y fuera de la cámara donde las células se modelan en el electrodo. No se necesitará gas para mantener el sistema. Sin embargo, se usará gas nitrógeno para someter a burbujeo el sistema cuando arranque la célula de combustible para crear un ambiente anaeróbico.

Puede usarse cualquier medio que contenga las mismas concentraciones de nutrientes necesarias en el medio individual de cada célula pero en el volumen de un medio. Por ejemplo, Synechocystis utiliza un medio llamado BG11 y A. vinelandii vive en el medio de Burk por lo que se hace un medio de cocultivo que contiene todos los ingredientes nutrientes en 1 L de BG11 y 1 L de medio de Burk pero en un solo volumen (1 L), proporcionando así una mayor concentración de nutrientes por litro en comparación con los medios individuales. R. rubrum utiliza un medio ORMERODs para que cuando un cultivo de los tres organismos tenga todos los ingredientes (menos el fosfato para el tamponamiento) para 1 L de cada cultivo en 1 L de medio de cocultivo haciendo tres medios en un medio rico en nutrientes. La receta del tampón de fosfato del medio de Burk se puede utilizar para optimizar la concentración de fosfato.

El dispositivo funcionaría para alimentar cosas que están afuera constantemente. Cuando las células mueren, el dispositivo se calienta, el ADN se deshibrida, las células muertas se lavan y se introducen células nuevas para reemplazar las viejas. El dispositivo también podría actuar como una batería o una adición a la red eléctrica. En teoría, muchos de los dispositivos podrían conectarse en serie para alimentar potencialmente vehículos o podrían actuar como sinónimos de los paneles solares de silicio.

Ejemplo 8: Modelado de AFM

Las fuerzas que rigen la adhesión célula-célula son de vital importancia para muchos procesos biológicos, incluida la diferenciación celular, el crecimiento de tejidos, la tumorigénesis y el funcionamiento adecuado de la respuesta inmunitaria de los vertebrados. Las fortalezas de estas interacciones se caracterizan típicamente a través de la unión de células vivas individuales a sondas que son capaces de medir la fuerza, tal como las micropipetas de succión. Más recientemente, se han aplicado pinzas ópticas para capturar células individuales y medir estas fuerzas con gran precisión, pero esta técnica se limita a aplicar fuerzas en el rango de piconewton. La microscopía de fuerza atómica (AFM) proporciona una alternativa atractiva a estos métodos, porque es capaz de cuantificar fuerzas en el rango de piconewton a nanonewton, y esta técnica se ha utilizado para medir las propiedades mecánicas de células individuales vivas y para estudiar las fuerzas de adhesión en el nivel unicelular. Se han logrado varias medidas de adhesión fundamentales al recubrir voladizos de AFM con fibronectina o lectinas que se unen a fracciones de carbohidratos en la superficie celular, pero especialmente en el último caso, se ha informado que las moléculas de unión celular tienen un grado de citotoxicidad que puede influir en las propiedades celulares que se están evaluando. Por lo tanto, si bien estos estudios destacan la utilidad de AFM para la medición de las interacciones entre el receptor y el ligando de la célula, se necesitará un conjunto ampliado de métodos de unión en voladizo para el estudio de las interacciones entre células en escalas de tiempo muy variables.

Para abordar esta necesidad, se han comparado tres métodos mediados por biomoléculas para la unión de células vivas a voladizos de AFM, con énfasis en la viabilidad celular, la fuerza de adhesión y la reutilización de la sonda que puede lograr cada técnica. Estos estudios han indicado que la unión celular mediante el uso de cadenas de ADN complementarias tiene la menor influencia sobre la viabilidad y no parece activar las vías de señalización celular. Este método también ofrece una fuerza de adhesión superior en general, pero este parámetro se puede atenuar para permitir que las células se transfieran de una superficie a otra. Se pudo demostrar este concepto recogiendo células libres y colocándolas en posiciones exactas sobre un sustrato que contenía cadenas de ADN con regiones complementarias más largas. Este modelado de células vivas "dip-pen" demuestra la reutilización del método de adhesión celular mediado por ADN y podría resultar útil para la construcción de mezclas complejas de células con relaciones espaciales bien definidas.

Para permitir la comparación de varias estrategias de unión, se unieron tres biomoléculas diferentes (ADN, concanavalina A (ConA) y un anticuerpo) a voladizos AFM de nitruro de silicio para el anclaje celular. Para todos los métodos de unión, la capa delgada de óxido de silicio en la superficie de trabajo se cubrió con grupos aldehído como se describe en la Figura 16a. Las superficies producidas utilizando estos pasos se caracterizaron por mediciones de ángulo de contacto.

El ADN funcionalizado con amina se unió a los grupos aldehido mediante aminación reductiva (Figura 16b). Primero, el voladizo recubierto de aldehído se sumergió en una solución de ADN monocatenario funcionalizado con amina (ADNmc) y luego se calentó para promover la formación de imina. Después de enfriar a temperatura ambiente, se usó una solución acuosa de borohidruro de sodio para reducir las iminas a enlaces de amina no hidrolizables. Este paso también sirvió para reducir cualquier grupo funcional aldehído sin reaccionar a alcoholes. Mediante el acoplamiento de cadenas de ADN funcionalizadas con amina en 5' que llevan isotiocianato de fluoresceína (FITC) en el extremo 3', se pudo verificar la presencia de las cadenas mediante imágenes de fluorescencia.

En esfuerzos anteriores, las proteínas se han unido a las puntas de AFM a través de la adsorción no específica y mediante el entrecruzamiento de glutaraldehído con grupos amino introducidos en la superficie de la punta. Para permitir enlaces más bien definidos (y así realizar una unión celular más homogénea), se eligió usar la estrategia de aminación reductiva simple que se usó para las cadenas de ADN amino. Los residuos de lisina de la superficie en ConA y los anticuerpos anti-CD3 humanos (anti-CD3) se hicieron reaccionar con los grupos funcionales aldehído en las superficies en voladizo (Figura 16b), pero se usó una concentración más baja de agente reductor (66 ^jM) para minimizar la reducción de enlaces disulfuro que se requieren para mantener la estructura terciaria de la proteína. Las concentraciones de las proteínas (20 j M ConA y 6 j M anti-CD3) utilizadas en las reacciones se alcanzan fácilmente utilizando muestras disponibles en el mercado. Como se describió anteriormente para el ADN, se usaron muestras de ConA y anti-CD3 marcadas con FTIC en algunos experimentos para verificar la unión de biomoléculas usando microscopía de fluorescencia. Se detectaron niveles similares de fluorescencia para cada uno.

Para la unión covalente de ADN, lectinas y anticuerpos a voladizos, se usaron los siguientes métodos. Para los estudios de adhesión celular mediada por a Dn , se diseñó un par de secuencias de oligonucleótidos complementarias (A/A'). Las identidades de secuencia fueron las siguientes:

A: 5'-TCA TAC GAC TCA CTC TAG GG-3'

A': 5'-CCC TAG AGT GAG TCG TAT GA-3'

Se sumergió un voladizo recubierto con aldehído (MLCT-NONM) en una solución 20 j M de ADNmc funcionalizado con 5'-amina en solución salina/tampón de citrato de sodio 3X (citrato de sodio 45 mM, NaCl 450 mM, pH 7.0) durante 15 min, se calentó en un horno a 100 °C durante 30 min, y luego se lavó con solución de SDS al 0.2 % y agua destilada (1 min cada uno). El voladizo resultante se empapó en una solución fresca de 0.1 g de NaBH4 en 10 mL de etanol y 30 mL de solución de PBS durante 15 min, y luego se lavó con solución de SDS al 0.2 % y agua (1 min cada uno). El voladizo se secó bajo N2 y se almacenó en un ambiente de baja humedad hasta su uso. El voladizo recubierto de ADNmc se caracterizó mediante el acoplamiento de 5'-amino ADNmc (cadena A) marcado con 3'-FITC a la superficie del voladizo recubierta de aldehído, seguido de imágenes con un microscopio de fluorescencia.

La concanavalina A y los anticuerpos monoclonales IgG anti-CD3 también se acoplaron a una superficie en voladizo recubierta de aldehído (MLCT-AUNM) mediante un procedimiento de animación reductiva. Se expuso un voladizo recubierto con aldehído a una solución de 20 ^jM (Con A) o 1 mg/mL (Anti-CD3) de la proteína en una solución tampón de PBS de pH 7.0 que contenía NaBH4 66 ^jM en una cámara húmeda durante 2 h. Luego, el voladizo se lavó con exceso de PBS y agua, y se almacenó en una solución de PBS puro a 4 °C hasta su uso.

Para preparar células vivas con ADNmc en sus superficies, primero se introdujeron grupos funcionales de azida en glicoproteínas embebidas en la membrana plasmática, como se describió anteriormente [ Zabzdyr JL, Lillard SJ. Measurement of single-cell gene expression using capillary electrophoresis. Anal Chem. 2001;73:5771-5775]. Se añadió W-a-azidoacetilmanosamina peracetilada (Ac4ManNAz) a las células, que luego metabolizaron y exhibieron la azida en sus superficies (Figura 16c). El ADNmc modificado con triarilfosfina se preparó mediante la reacción de ADNmc modificado con 5'-amina con un éster de fosfina y pentafluorofenilo (PFP). A continuación, este reactivo se usó para marcar los grupos azida de la superficie celular mediante ligación de Staudinger, lo que produjo enlaces amida estables. Los experimentos de citometría de flujo han verificado previamente la capacidad de los conjugados de fosfina-ADN para ligarse a superficies celulares modificadas con azida. Aunque se esperaría que muchos tipos de células fueran compatibles con este sistema (y se han explorado previamente usando el método de adhesión basado en el ADN), se eligieron células Jurkat no adherentes para estos estudios porque no secretan su propia matriz extracelular. Por lo tanto, todos los eventos de adhesión celular surgen únicamente de las biomoléculas en sus superficies.

En otros estudios, para preparar células vivas que tengan ADNmc en sus superficies, se puede llevar a cabo el protocolo general para la unión de cadenas de ADN a las células. Inmediatamente antes de la modificación, una muestra de 5*106 células Jurkat se lavan con tampón PBS tres veces para eliminar las proteínas del medio de cultivo. Después del enjuague final, se agrega PBS adicional para llevar el volumen a 5 mL (1 * 106 célula/mL). A continuación, la suspensión celular se hace reaccionar con 1 mL de solución de NHS-ADN (11.7 j M) sintetizada y purificada a partir de 30 j l de 5'-tiol ADNmc (secuencia C2). La mezcla se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se lava tres veces con PBS que contiene 1% de ^fB^s. A continuación, las células se resuspenden en 0.5 mL de PBS que contiene FBS al 1%.

Los efectos de las moléculas de adhesión sobre la viabilidad de las células se evaluaron utilizando dos métodos diferentes. Primero, las suspensiones de células Jurkat no modificadas se complementaron con ConA o anticuerpos anti-CD3, y las soluciones de células recubiertas de ADN se complementaron con la secuencia complementaria. La figura 17a muestra las curvas de crecimiento de las células resultantes durante un período de tres días. La propagación de las células modificadas con ADN fue la misma que la de las células no modificadas, pero las células tratadas con anti-CD3 mostraron un crecimiento retardado. Las células recubiertas con ConA se agregaron y ya no estaban vivas después de 12 h. Cambios en la morfología celular inducidos por biomoléculas solubles. Las células Jurkat se cultivaron en medio normal (Control), las células Jurkat modificadas con ADN se cultivaron en presencia de ADN 2 pM y las células Jurkat no modificadas se cultivaron en presencia de ConA 2 pM o Anti-CD3 0.1 mg/mL. Las células resultantes se examinaron bajo un microscopio óptico después de un período de 12 h. La apariencia de las células prácticamente no cambió en presencia de ADN, pero las células cultivadas en presencia de ConA y Anti-CD3 exhibieron agregación y otros cambios morfológicos.

Como segundo método de comparación, las tres moléculas de adhesión celular se recubrieron sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con aldehído disponibles comercialmente utilizando los mismos procedimientos de aminación reductiva descritos anteriormente. Mediante inspección visual, las tres superficies pudieron lograr una unión celular eficiente (Figura 17b), pero solo las células conjugadas con ADN aparecieron morfológicamente sin cambios después de 48 h. Las células inmovilizadas con ConA y anti-CD3 exhibieron cambios significativos durante este período de tiempo, probablemente debido al entrecruzamiento de sus receptores de superficie. La viabilidad de las células inmovilizadas en la superficie se determinó después de 24 y 48 h mediante tinción con anexina V y yoduro de propidio (PI). Para las células con ADN inmovilizado, el bajo porcentaje de células apoptóticas y necróticas fue similar al de las células no modificadas (Figura 17c). Sin embargo, las células inmovilizadas con ConA y anti-CD3 mostraron un número significativamente mayor de células apoptóticas en comparación con las muestras de control. Por lo tanto, las moléculas de ADN parecen hibridarse solo con sus asociados complementarios y deberían tener mucho menos potencial para alterar la fisiología general de las células en los experimentos de medición de fuerza.

Las células vivas fueron capturadas fácilmente por puntas de AFM que contenían las tres biomoléculas. Esta captura se logró simplemente tocando la membrana celular con los voladizos, con tiempos de contacto tan cortos como cinco segundos, lo que resultó en la transferencia de las células a las puntas de AFM. No se capturaron células con puntas que carecían de las biomoléculas apropiadas.

El ensayo para determinar la fuerza de la unión en voladizo se diseñó de tal manera que las adherencias entre la célula y el voladizo fueran menores en número y, por lo tanto, más débiles en general que las adherencias basadas en ADN entre una célula y el portaobjetos de vidrio funcionalizado de forma complementaria. Debido a esta disposición, se esperaría que la interacción célula-voladizo se rompiera primero, produciendo la fuerza de la interacción que puede lograr una concentración relativamente baja de biomoléculas. La ruptura de la interacción célula-voladizo antes de la interacción célula-superficie se verificó mediante observación visual durante los experimentos. La fuerza de desadhesión se midió para cada método de unión utilizando dos tasas de retracción diferentes y dos fuerzas de contacto diferentes (Figura 18a). La fuerza de desadhesión medida aumentó con la fuerza de contacto y la tasa de retracción en todos los métodos de fijación, según lo predicho por el modelo de Bell. El método de unión ConA arrojó eventos de unión de fuerza cero en el 12 % de las mediciones de desadhesión. Dichos eventos no se observaron en los casos de ADN y anticuerpos.

Se observó una distribución significativa de fuerzas para los tres métodos de fijación; sin embargo, bajo todos los parámetros experimentales, el método de ADN mostró la adhesión promedio más fuerte, seguido por la unión de anticuerpos y luego ConA (Figura 18b). Como experimento de control, también se demistró que la eficiencia de captura de ConA y anti-CD3 no se ve afectada por la presencia de cadenas de ADN introducidas en la superficie celular. Cabe señalar que las fuerzas de desadhesión generales determinadas para cada estrategia de unión dependen tanto del número de enlaces como de las tasas de retracción y, por lo tanto, no reflejan las fuerzas absolutas de las interacciones biomoleculares individuales. A modo de comparación, la fuerza requerida para separar un dúplex de ADN típico de 20 pb se ha determinado previamente en 38-50 pN, lo que sugiere que en nuestros experimentos se realizan aproximadamente 20-25 enlaces individuales entre la célula y el voladizo si se asumen las fuerzas de interacción. ser simplemente aditivo, aunque múltiples enlaces paralelos pueden exhibir un comportamiento de escala más complicado. Un razonamiento similar sugeriría que están involucradas unas diez interacciones ConA-manosa (a 47 pN cada una) y 12 interacciones anticuerpo-antígeno (a 49 pN cada una). Se están realizando experimentos para determinar el número de enlaces involucrados en cada evento de adhesión para determinar estos efectos con mayor precisión. Sin embargo, los resultados actuales muestran que el método de hibridación de ADN conduce a la unión más sólida en condiciones de preparación típicas, aunque es probable que la fuerza de cada enlace individual sea menor que la de las otras biomoléculas.

La fuerza de la interacción entre la célula y el voladizo se puede ajustar variando el número de cadenas que interactúan y la longitud de las regiones complementarias, y la reversibilidad de la hibridación del ADN también permite que las puntas se utilicen muchas veces. Ambas ventajas nos permitieron usar las puntas de AFM para organizar las células una a la vez en patrones. En un informe reciente, se demostró que las cadenas de ADN individuales se pueden mover de un lugar a otro en un sustrato impreso, lo que permite imprimir tintes de moléculas pequeñas de manera similar.

Para ello, se aplicó al voladizo una solución 5 pM de una cadena más corta de ADN (13 bases) y se acopló al portaobjetos una solución 80 pM de una cadena más larga (20 bases). Las células Jurkat recubiertas de ^aDⁿse incubaron en medios independientes de CO2 y aplicados al lado sin recubrimiento del portaobjetos de vidrio bajo un instrumento AFM. A continuación, se bajó el voladizo hasta que estuvo en contacto con la célula durante diez segundos con una fuerza de contacto de 400 pN. Luego se retrajo el voladizo y se confirmó visualmente la fijación de la célula al voladizo. Luego, las células adheridas se movieron al lado recubierto de ADN con una tasa máxima de 1 mm s-1. Se bajó el voladizo hasta que entró en contacto con el portaobjetos y se permitió que la célula interactuara con el sustrato durante diez segundos con una fuerza de contacto de 400 pN. Luego se retrajo el voladizo, después de lo cual la célula permaneció unida al portaobjetos de vidrio. Al aplicar este método de impresión, a las células se les puede dar una coordenada (X,y) para colocarlos con precisión en un sustrato 2D (Figura 19). Se encontró que las células permanecían viables después del modelado.

En resumen, se ha descrito el desarrollo de un método de adhesión versátil basado en ADN para el estudio de las interacciones célula-célula por AFM. Las ventajas clave de esta plataforma incluyen la reutilización de la punta, la capacidad de ajuste de la fuerza de interacción y el uso de enlaces químicos bien definidos. De las tres estrategias de unión basadas en biomoléculas que se utilizaron, el método de ADN demostró ser superior en términos de viabilidad celular después de la unión. El uso de AFM para formar patrones precisos y programables de células individuales proporciona una herramienta útil para comprender la influencia de las interacciones vecinas en la diferenciación y regulación celular. En un informe anterior, se demostró que se pueden preparar patrones complejos mediante el autoensamblaje de células recubiertas de ADN en superficies impresas con oligonucleótidos complementarios. El método de dip-pen de AFM descrito en este documento proporciona un complemento útil para esta técnica que puede lograr la resolución más alta necesaria para crear e interrogar grupos que consisten en múltiples tipos de células. Actualmente se está utilizando este método para dilucidar los mecanismos de adhesión fundamentales involucrados en la metástasis del cáncer, la formación de sinapsis inmune y la comunicación celular.

Ejemplo 9: Cápsides virales

Modificación de cápsides virales para vehículos multivalentes de administración direccionada.

Los vehículos de administración multivalentes y direccionados ofrecen una gran promesa para la administración de fármacos y el diagnóstico por imágenes. En estas aplicaciones se han utilizado con considerable éxito varios andamios centrales, incluidos polímeros, dendrímeros, nanopartículas inorgánicas y liposomas. En términos de vectores basados en biomoléculas, también se han desarrollado jaulas de choque térmico y cápsides virales diseñadas para albergar moléculas de fármacos en su interior. Para cada uno de estos tipos de portadores, una consideración de importancia crítica es la instalación de grupos de unión a receptores que permitan la asociación selectiva de los portadores con tipos de tejidos específicos. Las estrategias moleculares más comunes para este propósito han involucrado ácido fólico, cobalamina, carbohidratos, péptidos y anticuerpos, y aptámeros de ácidos nucleicos. La rica diversidad química de estas moléculas, sumada al deseo de adjuntar múltiples copias de cada una a andamios de composición variable, exige reacciones químicas que sean exquisitamente tolerantes a los grupos funcionales y se desarrollen en condiciones fisiológicas.

Se ha avanzado en un número cada vez mayor de reacciones de acoplamiento quimioselectivas para el marcaje de biomoléculas de tamaño completo. Todos los métodos informados tienen sus fortalezas particulares y usos ideales, y con la adición de cada técnica, han surgido nuevas posibilidades para la generación de estructuras complejas que comprenden múltiples componentes biomoleculares. Para agregar a esta lista, se ha informado una reacción de acoplamiento oxidativo altamente eficiente que ocurre entre anilinas y fenilendiaminas en presencia de peryodato de sodio acuoso. Esta reacción ha mostrado una quimioselectividad excepcional hasta la fecha y procede rápidamente a concentraciones micromolares y pH neutro. En este informe, se aplicó este método para adjuntar 20-60 copias de aptámeros de ADN a la superficie de las cápsides virales sin genoma. Los ensamblajes multivalentes resultantes se unen a los receptores de tirosina quinasa en la superficie de las células Jurkat y se someten a endocitosis con facilidad. Finalmente, se muestra que esta química se puede combinar con otros métodos de bioconjugación que podrían instalar moléculas de fármacos funcionales dentro de los transportadores. La capacidad de la estrategia de acoplamiento oxidativo para preparar estas estructuras heterobiomoleculares es un buen augurio para su uso en la preparación de muchos tipos diferentes de vehículos de administración.

El bacteriófago MS2 proporciona un andamio fácilmente disponible para la construcción de agentes de administración direccionados. El recubrimiento proteico de este virus consiste en 180 monómeros de secuencia idéntica que están dispuestos en una estructura esférica hueca. El monómero de la proteína de la cubierta puede expresarse y autoensamblarse fácilmente en E. coli, produciendo estructuras robustas, no tóxicas y biodegradables que están libres de genoma. Véase Carrico, Z. M.; Romanini, D. W.; Mehl, R. A.; Francis, M. B. Chem. Commun. 2008, 1205-1207. Dado que las cápsides de MS2 poseen treinta y dos poros que permiten el acceso al interior de la cápside, se puede lograr una modificación selectiva tanto en la superficie interior como en la exterior mediante reacciones de bioconjugación ortogonal. (Hooker, J. M.; Kovacs, E. W.; Francis, M. B. Journal of the American Chemical Society.

2004, 126, 3718-3719; Kovacs, E. W.; Hooker, J. M.; Romanini, D. W.; Holder, P. G.; Berry, K. E.; Francis, M. B. Bioconjugate Chemistry. 2007, 18, 1140-1147). En informes anteriores, se ha demostrado que la química basada en tirosina se puede utilizar para instalar trazadores PET F-18 (Hooker, J. M.; O'Neil, J. P.; Romanini, D. W.; Taylor, S. E.; Francis, M. Molecular Imaging and Biology. 2008, 10, 182-191) y agentes de potenciamiento de contraste de resonancia magnética basados en Gd (Hooker, J. M.; Datta, A.; Botta, M.; Raymond, K. N.; Francis, M. B. Nano Letters.

2007, 7, 2207-2210; Datta, A.; Hooker, J. M.; Botta, M.; Francis, M. B.; Aime, S.; Raymond, K. N. Journal of the American Chemical Society. 2008, 130, 2546-2552) para permitir su uso en aplicaciones de generación de imágenes.

Para dotar a las cápsides de capacidades de direccionamiento específicos, se ha desarrollado un método sintético eficiente para unir aptámeros de ácido nucleico a sus superficies. Usando el proceso SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial), las secuencias de aptámeros pueden evolucionar para unirse prácticamente a cualquier objetivo, (Tuerk, C.; Gold, L. Science. 1990, 249, 505-510; Ellington, A. D.; Szostak, J. W. Nature. 1990, 346, 818-822) y una vez identificada la composición, se pueden obtener fácilmente mediante técnicas de síntesis en fase sólida automatizadas. Su síntesis también es susceptible de la introducción de estructuras modificadas que pueden mejorar la estabilidad o impartir una funcionalidad novedosa. Además, los aptámeros a menudo pueden igualar o incluso superar la especificidad y afinidad de los anticuerpos, con la conveniencia adicional de un tamaño más pequeño. Estas cualidades los convierten en herramientas atractivas para el desarrollo de terapias dirigidas y plataformas de imágenes con capacidades de direccionamiento muy variadas.

Para instalar aptámeros de oligonucleótidos en la superficie de las cápsides de MS2, se seleccionó una estrategia de acoplamiento oxidativo mediada por NaIO4 previamente informada. Este método implica el acoplamiento quimioselectivo de una fracción de N,N-dietil-N'-acilfenilendiamina a una anilina en presencia de NaIO4. En estudios anteriores, se ha utilizado peryodato de sodio para oxidar el 1,2-diol en el extremo 3' del ARN para introducir funcionalidades de aldehído, pero no se observó que degradara la cadena de ARN. Aunque esta observación sugiere que los aptámeros basados en ARN podrían usarse con nuestro método, se eligió continuar con el ADN debido a su mayor estabilidad frente a la hidrólisis durante los pasos de aislamiento y manipulación. Los asociados de acoplamiento de anilina se pueden introducir en la superficie exterior de las cápsides de MS2 mediante modificación química directa o mediante la introducción de un aminoácido no natural, p-aminofenilalanina (paF), en la posición 19 de la proteína de cubierta de MS2 utilizando el sistema de supresión del codón de terminación ámbar. (Carrico, Z. M.; Romanini, D. W.; Mehl, R. A.; Francis, M. B. Chem. Commun.2008, 1205-1207). Usando la última ruta, se ha informado anteriormente que la estrategia de acoplamiento oxidativo puede introducir más de 100 copias de cadenas peptídicas que llevan grupos fenilendiamina. Para este informe, nuevamente se usó el método de supresión para producir cápsides que llevan la mutación T19paF (MS2-paF19), proporcionando así 180 grupos de anilina para el acoplamiento a la superficie exterior. En este caso, sin embargo, también se introdujo una mutación N87C para proporcionar 180 grupos sulfhidrilo en la superficie interior para la instalación de carga. El mutante doble MS2-paF19-N87C resultante se obtuvo con un rendimiento de 10 mg/l de cultivo.

Para desarrollar las condiciones de reacción, una secuencia de ADN de 20 bases, cadena A, fue seleccionada por primera vez. Partiendo de una versión terminada en amina de esta secuencia, la fracción de N,N-dietil-N-acilfenilendiamina se introdujo fácilmente mediante acilación con un precursor que contenía éster de NHS. A continuación, las condiciones de reacción se seleccionaron variando las concentraciones de ADN reaccionante, peryodato de sodio y tiempo de reacción (Figura 25). El acoplamiento de ADN óptimo se logró usando 10-20 equivalentes (200-400 j M) del conjugado de ADN en relación con la proteína de cubierta MS2-paF19 (20 j M, basada en monómero) y 250 equivalentes de peryodato (5 mM) a temperatura ambiente durante 1 h. Se observó un aumento adicional en la eficiencia de acoplamiento cuando la reacción se realizó a concentraciones más altas de cloruro de sodio, lo que probablemente se deba a la capacidad de la mayor fuerza iónica para proteger la acumulación de densidad de carga negativa en la superficie de la cápside a medida que se une más a Dn . Para la cadena A, SDS-PAGE y tinción con Coomassie, seguida de densitometría óptica, indicaron que el 32% de los monómeros de la cápside se habían modificado con una sola cadena de ADN, lo que corresponde a 55 cadenas en cada cápside intacta. Las secuencias más largas mostraron una conversión ligeramente menor, muy probablemente debido al aumento de los efectos estéricos, así como a la repulsión electrostática. Después de la reacción, las cápsides modificadas podrían separarse del exceso de ADN usando cromatografía de exclusión por tamaño o concentradores centrífugos con cortes de peso molecular de 100 kDa. Como nota técnica, se debe tener cuidado de eliminar todo el glicerol, etilenglicol u otros dioles vecinales de las muestras para evitar que reaccionen con el peryodato.

Como se muestra en la Figura 25c,d, las cápsides resultantes permanecieron intactas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión de luz dinámica (DLS). La DLS mostró un aumento de 10.5 ± 0.7 nm en el diámetro hidrodinámico tras la conjugación de la cadena A con las cápsides. Cuando se introdujo la cadena complementaria, el diámetro aumentó en 3.9 ± 1.0 nm adicionales, lo que sugiere que el ADN aún era capaz de aparearse con las bases de Watson-Crick-Franklin cuando se conjugaba con el exterior de la cápside. La capacidad de emparejar bases también proporciona una buena evidencia de que las cadenas de ADN son estables en todas las condiciones de acoplamiento oxidativo. Usando monómeros de la cápside desnaturalizados, el emparejamiento de bases del ADN conjugado se confirmó adicionalmente mediante SDS-PAGE usando un ensayo de cambio de gel (Figura 25b).

Para la funcionalización de la superficie interior de MS2, se eligió la bioconjugación de cisteína estándar. MS2 contiene dos cisteínas nativas que han demostrado ser inaccesibles en condiciones normales de bioconjugación de maleimida. Por lo tanto, un doble mutante (MS2-paF 19-N87C) se expresó para introducir una cisteína en la superficie interior. Se mostró la reactividad del mutante de cisteína, donde MS2 se marca con fluorescencia en presencia de Alexa Fluor 488 maleimida (AF488). Además, MALDI-TOF MS muestra una conversión casi cuantitativa al producto modificado individualmente. Las cápsides de MS2-paF19 que carecen de la mutación de cisteína no mostraron incorporación de tinte en condiciones idénticas.

Para terminar de sintetizar el vehículo de administración que se muestra en la Figura 24, un aptámero de ADN de 41 nucleótidos que se direcciona a un marcador de superficie celular específico en las células Jurkat (cadena B) fue elegido como el grupo objetivo exterior. La cadena B, anteriormente informada como sgc8c, se aisló utilizando un proceso celular-SELEX y se determinó que su pareja de unión era la proteína tirosina quinasa 7 (PTK7). La PTK7 es una proteína transmembrana que está presente en la superficie de las células de leucemia Jurkat T, así como en muchas otras líneas celulares de leucemia, y se ha propuesto como un biomarcador potencial para la leucemia linfoblástica aguda de células T. Usando la estrategia de acoplamiento oxidativo, 20-40 copias de cadena B marcada con dietil fenilendiamina se unieron a cada cápside, según lo determinado por SDS-PAGE y análisis de densitometría (Figura 25a, carril 8). Para detectar las cápsides en ensayos de unión celular, el interior se modificó con cromóforos AF488 como se describe anteriormente antes de la unión del ADN.

Se probó la especificidad de direccionamiento de estas cápsides incubándolas con células Jurkat a 37 °C durante 30 60 min en medios de cultivo. El análisis posterior mediante citometría de flujo reveló que las muestras de células expuestas a las cápsides de MS2 que portan la cadena B (11 nM en cápsides) mostraron un aumento significativo en la intensidad de fluorescencia media en comparación con la autofluorescencia celular de fondo, Figura 26a. Para los controles negativos, se sintetizaron cápsides modificadas con AF488 sin modificación exterior (AF488-MS2), así como modificadas con una cadena de 41 nt de una secuencia aleatoria (C). Ambas cápsides de control no dieron lugar a un aumento en la intensidad de fluorescencia media, lo que confirma el papel de la secuencia de aptámero específica en la unión celular.

Habiendo validado el direccionamiento de B-cápsides en experimentos de citometría de flujo, se investigó la internalización celular de las cápsides modificadas con microscopía confocal. Después de la incubación durante 30 60 min a 37 °C con células Jurkat, la presencia de cápsides marcadas con cadena B podría detectarse como puntos fluorescentes brillantes dentro de las células, Figura 3b. Los experimentos de tinción conjunta con marcadores endocíticos fluorescentes indicaron que cápsides marcadas con B colocalizan con partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL), pero no con transferrina. Si bien tanto la transferrina como la LDL son marcadores endocíticos conocidos, circulan a través de diferentes vías una vez dentro de la célula. Se ha demostrado que la transferrina indica endosomas que se dirigen de regreso a la superficie a través de la vía de reciclaje, mientras que las vesículas asociadas con LDL eventualmente se dirigen a los lisosomas. En combinación con la especificidad de orientación del aptámero a-PTK7, el destino lisosomal de B-cápsides es alentador para la administración de fármacos dirigidos de profármacos lábiles a los ácidos que se liberarían preferentemente tras la acidificación lisosomal.

Para cualquier composición de vehículo de administración, la unión de agentes de direccionamiento biomoleculares desprotegidos probablemente será de importancia clave para lograr la especificidad tisular. Este informe demuestra la utilidad de una reacción de acoplamiento oxidativo quimioselectivo para este propósito. En principio, el vehículo basado en MS2 descrito en este documento ahora puede dirigirse a cualquier receptor para el que se haya determinado un aptámero de unión. A los efectos de la formación de imágenes de diagnóstico, puede que no sea necesario que las cápsides estén internalizadas; sin embargo, se prevé que la captación observada sea muy beneficiosa para las aplicaciones de administración de fármacos. En los experimentos actuales, se agregaron medicamentos contra el cáncer a estos transportadores, así como radionúclidos y agentes de contraste que se pueden usar para determinar la ubicación de los marcadores celulares in vivo.

Procedimientos Generales y Materiales. A menos que se indique otra cosa, todos los productos químicos y solventes eran de grado analítico y se usaron tal como se recibieron de fuentes comerciales. La cromatografía de capa fina (TLC) analítica se realizó en placas de gel de sílice 60-F254 de 0.25 mm de reactivo EM con visualización mediante irradiación ultravioleta (UV) a 254 nm o tinción con permanganato de potasio. Todos los disolventes orgánicos se eliminaron bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. El diclorometano (CH2Cl2) se destiló en atmósfera de nitrógeno a partir de hidruro de calcio. El agua (dd-H2O) utilizada en procedimientos biológicos o como disolvente de reacción se desionizó mediante un sistema de purificación NANOpure (Barnstead, EE. UU.). Se preparó éster succinimidílico del ácido 4-(4-dietilamino-fenilcarbamoil)-butírico usando el método informado anteriormente. 1 Todos los oligonucleótidos se obtuvieron de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Las muestras se purificaron mediante HPLC de fase inversa o columnas de filtración en gel NAP-5 (GE Healthcare). Las muestras se liofilizaron utilizando un LAB CONCO Freezone 4.5 (Lab Conco). Los oligonucleótidos liofilizados se resuspendieron en el tampón apropiado y la concentración se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm. Todos los reactivos de cultivo celular se obtuvieron de Gibco/Invitrogen Corp (Carlsbad, CA) a menos que se indique otra cosa. El cultivo celular se llevó a cabo usando técnicas estándar. Las células Jurkat se cultivaron en matraces de cultivo T-25 (Corning, EE. UU.) en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (FBS, HyClone) y penicilina/estreptomicina al 1 % (P/S, Sigma).

Instrumentación y análisis RMN de muestras Los espectros de 1H y 13C se midieron con un espectrómetro Bruker AVQ-400 (400 MHz). Los desplazamientos químicos se informan como 6 en unidades de partes por millón (ppm) en relación con el cloroformo-d (67.26, s). Las multiplicidades se informan de la siguiente manera: s (singlete), d (doblete), t (triplete), q (cuarteto), dd (doblete de dobletes), p (pentete), m (multiplete), br (ampliado) o app (aparente). Las constantes de acoplamiento se informan como un valor J en Hertz (Hz). El número de protones (n) para una resonancia dada se indica nH y se basa en valores de integración espectral.

Espectrometría de masas. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción-ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) se realizó en un sistema Voyager-DETM (PerSeptive Biosystems, EE. UU.). Antes del análisis MALDI-TOF MS, las muestras se desalinizaron utilizando puntas de pipeta C18 ZipTip® (Millipore, EE. UU.). Las muestras de oligonucleótidos se cocristalizaron usando una solución de ácido 3-hidroxipicolínico:citrato de amonio (45 mg/mL:5 mg/mL en 4.5:5.5 MeCN:ddH2O). Para la espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS), los conjugados de oligonucleótidos se analizaron usando un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap XL equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) Ion Max (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Las soluciones de muestra se infundieron en la sonda ESI a una tasa de flujo de 5 pL/min utilizando una bomba de jeringa. Los voltajes aplicados a la óptica iónica se ajustaron automáticamente para una desolvatación y transmisión óptimas de los iones de interés utilizando el software Tune Plus (versión 2.4, Thermo). Los espectros de masas se registraron en el modo de iones negativos en el rango m/z = 500 a 2000 por un período de dos minutos. Los espectros de masas se procesaron usando el software Xcalibur (versión 4.1, Thermo) y las distribuciones de estado de carga medidas se desconvolucionaron usando el software ProMass (versión 2.5 SR-1, Novatia, Monmouth Junction, NJ). Antes del análisis ESI-MS, los oligonucleótidos se prepararon como se describió anteriormente. 2 Se encontró que todos los datos de MS para oligonucleótidos y muestras de proteínas estaban dentro del 0.1 % de los valores esperados.

Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La HPLC se realizó en un sistema HPLC Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, EE. UU.). El análisis de muestras para todos los experimentos de HPLC se logró con un detector de matriz de diodos en línea (DAD). Tanto la HPLC analítica como la preparativa de oligonucleótidos en fase inversa se realizaron utilizando una fase estacionaria C18 y un gradiente de MeCN/acetato de trietilamonio 100 mM (TEAA, pH = 7.0).

Análisis en gel. Para el análisis de proteínas, se llevó a cabo electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en un aparato Mini-Protean de Bio-Rad (Hercules, CA), siguiendo el protocolo de Laemmli. 3 Todas las muestras de electroforesis de proteínas se calentaron durante 10 minutos a 100 °C en presencia de 1,4-ditiotreitol (DTT) para garantizar la reducción de los enlaces disulfuro. Los geles se corrieron durante 5 minutos a 30 V y de 70 a 90 minutos a 120 V para permitir una buena separación de las bandas. Se aplicaron marcadores comercialmente disponibles (Bio-Rad) a al menos un carril de cada gel para la asignación de masas moleculares aparentes. La visualización de las bandas de proteína se logró mediante tinción con Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Para los conjugados de proteínas fluorescentes, la visualización se realizó con retroiluminación UV. La formación de imágenes en gel se realizó en un sistema EpiChem3 Darkroom (UVP, EE. UU.).

Dispersión dinámica de la luz. Las mediciones de DLS se obtuvieron con un Zetasizer Nano ZS de Malvern Instruments, cortesía de Jean Fréchet. Los gráficos de datos y las desviaciones estándar se calculan a partir de un promedio de tres mediciones, cada una de las cuales consiste en 10 ejecuciones de 45 segundos cada una. Los datos de medición se presentan como un gráfico de intensidad, que pondera las dimensiones más grandes por un factor de 106 más que las dimensiones más pequeñas. Muestras tomadas en tampón fosfato 10 mM pH 7.0.

Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). Las imágenes TEM se obtuvieron en el UCBerkeley Electron Microscope Lab utilizando un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai 12 con un voltaje de aceleración de 100 kV. Las rejillas TEM se prepararon cargando rejillas de malla de cobre con soporte de formvar recubiertas de carbono con plasma de argón (40 mA a 0.1 mbar durante 30 s) en un Cressington 108 Auto Sputter Coater. Las muestras de proteínas se prepararon para el análisis TEM pipeteando muestras de 5 pL en estas rejillas y permitiéndoles equilibrarse durante 3 minutos. Luego, las muestras se filtraron con papel de filtro y se enjuagaron con ddH2O. A continuación, las rejillas se expusieron a 5 pl de una solución acuosa de acetato de uranilo al 1 % (p/v) durante 90 s como tinción negativa. Después de eliminar el exceso de tinción, se dejó secar la rejilla al aire.

Procedimiento General Experimental para la adición de fenilendiamina a oligonucleótidos. Se adquirieron oligonucleótidos de ADN que contenían una amina primaria en el extremo 5'. Una reacción típica es la siguiente: El ADN a una concentración de 300 pM se hace reaccionar con éster succinimidílico del ácido 4-(4-dietilaminofenilcarbamoil)-butírico (60-120 eq) en una solución 1:1 de DMF y tampón de fosfato 50 mM pH 8.0. La mezcla de reacción se agita brevemente y luego se deja reaccionar a ta durante 2 h. Se pueden usar RPHPLC o columnas de filtración en gel comercialmente disponibles para purificar la molécula pequeña de ADN, siguiendo el protocolo proporcionado comercialmente. Después de la purificación, el ADN se liofiliza y luego se vuelve a suspender en el tampón deseado. La concentración se determina midiendo la absorbancia a 260 nm. Las identidades de secuencia de A, B y C son las siguientes:

A: 5'-TCATACGACTCACTCTAGGGA-3'

B: 5'-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3'

C: 5'-CCCTAGAGTGAGTCGTATGACCCTAGAGTGAGTCGTATGAA-3'

Procedimiento General para la conjugación de ADN a MS2. Un tubo eppendorf se carga con MS2-paF19 o MS2-paF19-N87C (20 pM), oligonucleótido que contiene fenilendiamina (200-400 pM) y NaIO4 (5 mM). La reacción se lleva a cabo en tampón fosfato 50 mM pH 7.0 que contiene NaCl 150 mM. La reacción se somete a vórtex brevemente y se

Claims

REIVINDICACIONES

I. Una composición que comprende: una célula, en donde la célula tiene una membrana que comprende un grupo funcional que es nativo de la membrana celular, en donde el grupo funcional nativo comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico y triptófano, y en donde la célula no tiene pared celular; y una fracción de ácido nucleico que comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en un oligonucleótido, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácido nucleico peptídico (PNA) y un aptámero, en donde la fracción de ácido nucleico activado comprende un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), en donde la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente al grupo funcional nativo.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la célula es una célula primaria.
3. La composición de la reivindicación 1, en donde la célula es una célula de mamífero.
4. La composición de la reivindicación 1, en donde la célula es una célula madre.
5. La composición de la reivindicación 1, en donde la fracción de ácido nucleico comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 ácidos nucleicos.
6. La composición de la reivindicación 1, en donde la fracción de ácido nucleico comprende un enlazador.
7. La composición de la reivindicación 1, que comprende una célula de mamífero que comprende lisina en la membrana celular; y un ácido desoxinucleico monocatenario unido covalentemente a la lisina a través de una amida.
8. Un método para preparar una composición de una célula y una fracción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende: poner en contacto la célula con una fracción de ácido nucleico que tiene un grupo que tiene reactividad aumentada con uno o más grupos funcionales nativos en una membrana de la célula, en donde la membrana celular comprende el grupo funcional nativo que es nativo de la membrana celular, en donde el grupo funcional nativo que tiene mayor reactividad comprende un éster de NHS, y el grupo funcional nativo comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico y triptófano y en donde la célula no tiene pared celular, de tal manera que la fracción de ácido nucleico está unida covalentemente al grupo funcional que es nativo de la membrana celular.
9. El método de la reivindicación 8, que comprende: poner en contacto una célula de mamífero con una fracción de ácido nucleico activado, en donde el grupo funcional nativo comprende lisina, de tal manera que la fracción de ácido nucleico se une covalentemente al grupo funcional nativo mediante la formación de enlaces amida.
10. Un dispositivo que comprende: una célula que tiene una membrana celular que comprende un grupo funcional nativo de la membrana celular y unido covalentemente a una primera fracción de ácido nucleico, en donde el grupo funcional nativo comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico y triptófano, y la primera fracción de ácido nucleico activado comprende un éster de NHS; y una superficie de sustrato que comprende una segunda fracción de ácido nucleico complementaria a la primera fracción de ácido nucleico, de tal manera que la célula se une a la superficie del sustrato mediante la formación de un dúplex de ácido nucleico de la primera y segunda fracciones de ácido nucleico, en donde la célula no tiene pared.

I I . Un kit que comprende: una fracción de ácido nucleico activado que tiene un grupo que tiene una reactividad aumentada con uno o más grupos funcionales nativos en una membrana celular adecuada para el enlace covalente a un grupo funcional nativo de la membrana celular de una célula que no tiene pared celular, en donde el grupo funcional nativo comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, cisteína, tirosina, treonina, serina, ácido aspártico, ácido glutámico y triptófano, y la primera fracción de ácido nucleico comprende un éster de NHS; soluciones y reactivos para unir las fracciones de ácido nucleico a las células y una superficie de sustrato que comprende una fracción de ácido nucleico complementaria a la fracción de ácido nucleico.