ES2906229T3 - Microorganismo productor de O-acetil-homoserina, y método para producir O-acetil-homoserina mediante el uso de este - Google Patents

Abstract

Un polipéptido modificado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que tiene la actividad de exportar O- acetilhomoserina, en donde al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina en la posición 30, leucina en la posición 95 y fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con otro aminoácido, en donde el polipéptido modificado tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo productor de O-acetil-homoserina, y método para producir O-acetil-homoserina mediante el uso de este

Campo técnico

La presente descripción se relaciona con una proteína que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina y una nueva proteína modificada de esta, un microorganismo capaz de producir O-acetilhomoserina con expresión mejorada de la proteína y un método para producir O-acetilhomoserina mediante el uso del microorganismo.

Antecedentes de la técnica

La metionina, que puede producirse mediante síntesis química y biológica, se usa como materia prima para la síntesis de infusiones y medicamentos, así como también para la síntesis de piensos y aditivos alimentarios. Recientemente, se describió un proceso de dos etapas para producir L-metionina a partir de un precursor de L-metionina, que se produce a través de la fermentación, por una reacción de conversión enzimática (Publicación de Patente Internacional Núm. WO 2008/013432). La publicación de patente internacional núm. w O 2008/013432 describe que la O-succinilhomoserina y la O-acetilhomoserina pueden usarse como precursores de metionina en el proceso de dos etapas, y es muy importante producir precursores de metionina con alto rendimiento para la producción económica a gran escala de metionina.

La LeuE se conoce como una proteína de exportación de leucina. Como una de las proteínas pertenecientes a la familia de proteínas de salida de homoserina/homoserina lactona (RhtB), LeuE es una proteína presente en la membrana interna y se conoce que tiene la función de exportar leucina y sus análogos como una proteína de transporte putativa no caracterizada.

En la técnica anterior relacionada con la LeuE, se conoce que puede producirse un nucleósido de purina o un nucleótido de purina mediante el mejoramiento de una secuencia de aminoácidos del gen leuE (yeaS) o una secuencia de aminoácidos modificada de este, y la cantidad de producción de aminoácidos puede incrementarse. Adicionalmente, se conoce una leuE modificada que tiene la actividad de exportar cisteína.

El documento WO 2014/145334 A1 (OPX BIOTECHNOLOGIES INC [EE. UU.]) 18 de septiembre de 2014 (2014-09­ 18) describe la proteína LeuE (también llamada YEAS) de Escherichia coli.

BASE DE DATOS UniProt [En línea] 3 de septiembre de 2014 (2014-09-03), "SubName: Full=Leucine export protein LeuE {ECO:0000313|EMBL:KDM91107.1};" XP002785581. obtenido de núm. de acceso de EBI UNIPROT:A0A066RTU4 Base de datos núm. A0A066RTU4 describe la secuencia de una proteína de exportación de leucina bacteriana LeuE (Photobacterium galatheae) que tiene una metionina en la posición 1, una valina en la posición 95 y una leucina en la posición 165.

BASE DE DATOS de Proteínas NCBI [En línea] 31 de enero de 2014 (2014-01-31) "leucine export protein LeuE [Providencia stuartii MRSN 2154]", XP002785582, obtenido del núm. de acceso de NCBI AFH92508 Número de acceso a la base de datos GenBank: AFH92508.1 describe la secuencia de una proteína de exportación de leucina bacteriana LeuE (Providencia stuartii MRSN 2154) que tiene una metionina en la posición 1 y una tirosina en la posición 30.

BASE DE DATOS de Geneseq [En línea] 9 de julio de 2009 (2009-07-09), "Environmental stress related sequence, SEQ ID 8934.", XP002785583, obtenido de núm. de acceso EBI GSN:A^w F72241 núm. de acceso a la base de datos AWF72241 describe una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 100 % en toda su longitud con la SEQ ID NO: 4 de la presente solicitud (es decir, comienza con ATG y codifica la SEQ ID NO: 2). La SEQ ID NO: 4 no codifica una secuencia que tenga modificaciones en cualquiera de las posiciones 30, 95, 165 con respecto a SEQ ID NO: 1.

El documento WO 2008/013432 A1 (CJ CORP [KR]; KIM SO-YOUNG [KR]; CHO KWANG-MYUNG [KR]; SHIN YONG-UK [K] 31 de enero de 2008(2008-01-31) describe las cepas de E. coli que producen O-acetilhomoserina y L-metionina. Se describe además la eliminación de los genes metB y thrB para aumentar la producción de metionina. Además se describe en la presente descripción la conversión enzimática de O-acetilhomoserina en metionina con metil mercaptano y O-acetilhomoserina sulfhidrilasa.

El documento EP 2657 250 A2 (CJ CHEILJEDANG CORP [KR]) 30 de octubre de 2013 (2013-10-30) describe las cepas de E. coli que producen O-acetilhomoserina, y describe además la actividad de mejoramiento de la homoserina acetiltransferasa (metA) y de la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd) en estas cepas.

El documento EP 2 336 347 A1 (AJINOMOTO KK [JP]) 22 de junio de 2011 (2011-06-22) describe una proteína YeaS de E. coli caracterizada por la SEQ ID NO: 40.

Descripción

Problema técnico

Los inventores de la presente descripción han realizado muchos esfuerzos para incrementar la producción de O-acetilhomoserina y, como resultado, han descubierto una proteína que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina y una proteína modificada de esta, y de esta manera se completa la presente descripción.

Solución técnica

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Un objetivo de la presente descripción es proporcionar un polipéptido que tenga la actividad de exportar O-acetilhomoserina.

Otro objetivo de la presente descripción es proporcionar un polinucleótido que codifica el polipéptido.

Aún otro objetivo de la presente descripción es proporcionar un microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina, en el que se incluye o se sobreexpresa un polipéptido que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina.

Aún otro objetivo de la presente descripción es proporcionar un método para producir O- acetilhomoserina, que incluye: cultivar un microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina en un medio; y recuperar O-acetilhomoserina del microorganismo cultivado o del medio de cultivo.

Aún otro objetivo de la presente descripción es proporcionar un método para producir L-metionina, que incluye: cultivar el microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina en un medio; y convertir la O-acetilhomoserina en L-metionina mediante el tratamiento del microorganismo cultivado o el medio de cultivo o la O-acetilhomoserina recuperada del microorganismo cultivado o el medio de cultivo con metil mercaptano y una enzima convertidora de metionina.

Efectos ventajosos de la invención

El microorganismo de la presente descripción que incluye una LeuE o LeuE modificada, que son proteínas de la membrana interna, tiene una actividad mejorada de exportación de O-acetilhomoserina y, por lo tanto, puede mejorarse la eficiencia de producción de O-acetilhomoserina. En consecuencia, el microorganismo de la presente descripción puede usarse para la producción eficaz de O-acetilhomoserina. Adicionalmente, la O-acetilhomoserina producida con alta eficiencia puede usarse para la producción económica a gran escala de L-metionina.

Mejor Modo

Para lograr los objetivos anteriores, la presente invención proporciona un polipéptido modificado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina, en donde al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina en la posición 30, la leucina en la posición 95 y la fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con otro aminoácido, en donde el polipéptido modificado tiene una identidad de secuencia de al menos 70 % con la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 1.

Como se usa en la presente descripción, el término "O-acetilhomoserina", que es un material intermedio específico en la ruta de biosíntesis de metionina de los microorganismos, se refiere a un derivado acetilado de L-homoserina. Se conoce que la O-acetilhomoserina se produce mediante la reacción de homoserina y acetil-CoA catalizada por homoserina acetiltransferasa, y tiene la fórmula de C6H11NO4.

Como se usa en la presente descripción, el término "péptido que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina" se refiere a un polipéptido que tiene la función de exportar O-acetilhomoserina en una célula de un microorganismo al exterior de la célula. Específicamente, el péptido puede referirse a una proteína LeuE que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina y una proteína modificada de esta, pero el péptido no se limita particularmente a ella siempre que tenga la actividad de exportar O-acetilhomoserina.

Como se usa en la presente descripción, con respecto a los transportadores de aminoácidos, el término "LeuE", que es una proteína que pertenece a la familia de proteínas de salida de homoserina/homoserina lactona (RhtB), se refiere a una proteína presente en la membrana interna, pero no se conoce su función exacta. A este respecto, los inventores de la presente descripción confirmaron en primer lugar que LeuE exporta específicamente O-acetilhomoserina.

La LeuE puede ser una proteína obtenida de un microorganismo del género Escherichia, y específicamente la LeuE se obtiene de E. coli, pero cualquier LeuE que tenga la actividad de exportar O-acetilhomoserina puede incluirse en el alcance de la presente descripción sin limitación con respecto al origen del microorganismo.

Específicamente, el péptido que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Adicionalmente, el péptido puede ser una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina sustancialmente igual o equivalente a la de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, mientras que tiene una homología de al menos 70 %, específicamente al menos el 80 %, y más específicamente al menos el 90 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Alternativamente, el péptido puede ser una secuencia de aminoácidos que tenga tal homología donde haya eliminación, modificación, sustitución o adición en parte de la secuencia de aminoácidos que tenga la actividad de exportar O-acetilhomoserina sustancialmente igual o equivalente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y es obvio que este péptido también pertenece al alcance de la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido modificado" del polipéptido que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina se refiere a un polipéptido que tiene una actividad mejorada de exportar O-acetilhomoserina en comparación con el polipéptido nativo de tipo salvaje o el polipéptido no modificado. Específicamente, el polipéptido modificado es un péptido que tiene una actividad mejorada de exportación de O-acetilhomoserina en comparación con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 1 debido a una modificación de al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Por ejemplo, el polipéptido modificado puede ser un polipéptido en el que al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina en la posición 30, leucina en la posición 95 y fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 es sustituido por otro aminoácido. Específicamente, el polipéptido modificado puede ser un polipéptido en el que la fenilalanina en la posición 30 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de alanina, triptófano, leucina, valina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico, histidina, isoleucina, prolina, tirosina, glutamina, lisina, ácido glutámico, cisteína, treonina y arginina; la leucina en la posición 95 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de valina, fenilalanina, alanina, glicina, treonina, asparagina, ácido aspártico, histidina, isoleucina, serina, prolina, tirosina, glutamina, lisina, ácido glutámico, cisteína, triptófano y arginina; o fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de alanina, triptófano, leucina, valina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico, histidina, isoleucina, prolina, tirosina, glutamina, lisina, ácido glutámico, cisteína, treonina y arginina. Más específicamente, el polipéptido modificado puede ser un polipéptido en el que la fenilalanina en la posición 30 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de alanina, triptófano, leucina, valina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico e histidina; la leucina en la posición 95 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de valina, fenilalanina, alanina, glicina, treonina, asparagina, ácido aspártico e histidina; o la fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de alanina, triptófano, leucina, valina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico e histidina. Incluso más específicamente, el polipéptido modificado puede ser un polipéptido en el que la valina en la posición 1 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye además con metionina. Incluso más específicamente, el polipéptido modificado puede ser un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133, 134, 137, 138, 141 o 142. Específicamente, el polipéptido modificado puede ser una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad mejorada de exportación de O-acetilhomoserina sustancialmente igual o equivalente a la de la secuencia de aminoácidos del polipéptido modificado, mientras que tiene una homología de al menos el 70 %, específicamente al menos el 80 %, y más específicamente al menos el 90 % de las secuencias de aminoácidos anteriores. Alternativamente, en una secuencia de aminoácidos que tenga dicha homología y que tenga una actividad mejorada de exportación de O -acetilhomoserina sustancialmente igual o equivalente a la de la secuencia de aminoácidos del polipéptido modificado, la secuencia de aminoácidos puede ser una en la que haya eliminación, modificación, sustitución o adición en parte de la secuencia de aminoácidos. El polipéptido es un ejemplo de un polipéptido modificado del polipéptido con actividad mejorada de exportación de O-acetilhomoserina en comparación con el polipéptido nativo de tipo salvaje o el polipéptido no modificado, pero el polipéptido no se limita a ello. Como se usa en la presente descripción, el término "estado nativo natural o estado no modificado" se refiere a un estado en el que no se ha logrado la introducción del polipéptido correspondiente o la introducción de la modificación de la actividad en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere al grado de identidad entre nucleótidos o residuos de aminoácidos de dos secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos de un gen que codifica una proteína determinada después de alinearlos para que coincidan al máximo entre sí para una región particular de comparación. Cuando la homología es suficientemente alta, los productos de expresión del gen correspondiente pueden tener una actividad igual o similar. El porcentaje de la identidad de la secuencia puede determinarse mediante el uso de un programa de comparación de secuencias conocidos (por ejemplo, BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign (DNASTAR Inc), etc.).

Un aspecto de la presente descripción proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina. En la presente descripción, el polipéptido que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina es el mismo que se explicó anteriormente.

Por ejemplo, el polinucleótido puede ser la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 135, 136, 139, 140, 143 o 144 pero la secuencia de nucleótidos no se limita a la misma. Adicionalmente, con respecto al polinucleótido, la secuencia de nucleótidos y las secuencias de nucleótidos modificados de esta que codifican la misma secuencia de aminoácidos también se incluyen en la presente descripción basada en la degeneración de codones. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede modificarse para tener un codón óptimo en dependencia del microorganismo que se use.

Específicamente, la secuencia de nucleótidos puede ser una que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina sustancialmente igual o equivalente a la de las secuencias de nucleótidos anteriores, mientras que tenga una homología de al menos 70 %, específicamente al menos 80 %, y más específicamente al menos el 90 % de las secuencias de aminoácidos anteriores. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia capaz de hibridar con una sonda, que puede prepararse a partir de una secuencia de gen conocida (por ejemplo, una secuencia complementaria a todas o parte de las secuencias de nucleótidos anteriores), en condiciones restrictivas para codificar una proteína que tiene la actividad de exportación de O-acetilhomoserina. Como se usa en la presente descripción, el término "condición restrictiva" se refiere a una condición en la que se forma el llamado híbrido específico mientras que no se forma un híbrido no específico. Por ejemplo, las condiciones restrictivas pueden incluir una condición en la que genes que tienen una alta homología o identidad (por ejemplo, 80 % o más, específicamente 90 % o más, más específicamente 95 % o más, incluso más específicamente 97 % o más, e incluso más específicamente el 99 % o más) pueden hibridar entre ellos, mientras que los genes que tienen una menor homología o identidad con estos no pueden hibridar entre sí; o condiciones para la hibridación de tipo Southern convencional (es decir, condiciones para lavado una vez, y específicamente dos o tres veces, a una concentración de sal y temperatura correspondientes a 60 °C, 1*SSC y SDS al 0,1 %; específicamente por debajo de 60 °C, 0,1xSsC y SDS al 0,1 %; y más específicamente por debajo de 68 °C, 0,1xSSC y SDS al 0,1 %) (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)). La sonda usada para la hibridación puede ser opcionalmente una parte de la secuencia de nucleótidos complementaria a las secuencias de nucleótidos anteriores. Dicha sonda puede prepararse por medio de la PCR mediante el uso de un oligonucleótido preparado basado en una secuencia conocida como cebador y un fragmento de gen que contiene dicha secuencia de nucleótidos como plantilla. Por ejemplo, como sonda, puede usarse un fragmento génico de aproximadamente 300 pb. Más específicamente, cuando se usa como sonda un fragmento génico de aproximadamente 300 pb, las condiciones de 50 °C, 2x SSC y 0,1 % SDS se enumeran como condiciones de lavado para la hibridación.

Los genes usados en la presente descripción, las secuencias de proteínas y las secuencias de promotores que codifican pueden obtenerse de una base de datos conocida (por ejemplo, GenBank de NCBI), pero no se limitan a ellos.

Un aspecto de la presente descripción se relaciona con un microorganismo en el que se incluye o se sobreexpresa el polipéptido que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina o un polipéptido modificado de este. Específicamente, la invención se relaciona con un microorganismo del género Escherichia que produce -acetilhomoserina O, en donde un polipéptido modificado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 que tiene la actividad de la exportación de O-acetilhomoserina se comprende o se sobreexpresa, en donde el polipéptido modificado tiene sustituciones de al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina en la posición 30, leucina en la posición 95 y fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

El polipéptido que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina y el polipéptido modificado de este son los mismos que se han explicado anteriormente.

Como se usa en la presente descripción, el término "microorganismo que produce O-acetilhomoserina" se refiere a un microorganismo capaz de producir O-acetilhomoserina en el microorganismo y exportarlo a un medio. La actividad de producción de O-acetilhomoserina puede proporcionarse o mejorarse mediante mutaciones naturales o artificiales o mejora de especies. Específicamente, pueden incluirse aquellos microorganismos productores de O-acetilhomoserina independientemente de su origen microbiano, siempre que puedan producir O-acetilhomoserina. En una modalidad, el microorganismo puede ser uno perteneciente al género Escherichia, y más específicamente, Escherichia coli.

Mientras tanto, en la presente descripción, los microorganismos que producen O-acetilhomoserina pueden ser un microorganismo modificado en el que se introduce adicionalmente una modificación conocida con respecto a mecanismos relacionados, tales como las rutas relacionadas con la biosíntesis de homoserina y los mecanismos relacionados con la exportación de O-acetilhomoserina, etc. como para mejorar la productividad de O-acetilhomoserina aparte de la LeuE.

Otra modalidad específica de la presente descripción puede relacionarse con el microorganismo productor de O-acetilhomoserina en el que, adicionalmente, se inactiva la actividad de la cistationina sintasa. Específicamente, el microorganismo puede ser uno en el que el gen que codifica la cistationina sintasa (metB) se elimina o su expresión se debilita en comparación con la de un microorganismo no modificado, pero no se limita a ello. La secuencia de aminoácidos del gen metB puede obtenerse de una base de datos conocida y puede incluirse sin limitación cualquier secuencia de aminoácidos que tenga la actividad de la cistationina sintasa (por ejemplo, una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5). La proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 puede ser una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6, pero no se limita a ella.

Adicionalmente, aún otra modalidad específica de la presente descripción puede relacionarse con el microorganismo que produce O-acetilhomoserina en el que, adicionalmente, se inactiva la actividad de la homoserina quinasa. Específicamente, el microorganismo puede ser uno en el que la actividad de la homoserina quinasa se reduce en comparación con su actividad endógena de un microorganismo no modificado o se elimina. Por ejemplo, el microorganismo puede ser uno en el que el gen (thrB) que codifica la homoserina quinasa se une a un promotor más débil en comparación con un promotor nativo, o se modifica o elimina para tener una actividad débil, pero el promotor no se limita a ello. La secuencia de aminoácidos del gen thrB puede obtenerse de una base de datos conocida y puede incluirse sin limitación cualquier secuencia de aminoácidos que tenga la actividad de la homoserina quinasa (por ejemplo, una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7). La proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 puede ser una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, pero no se limita a ella.

Como se usa en la presente descripción, el término "inactivación" de la proteína se refiere a un caso en el que la actividad de la proteína de un microorganismo se reduce en comparación con la actividad enzimática que posee el microorganismo en una proteína nativa de tipo salvaje o proteína no modificada; un caso en el que la proteína no se expresa en absoluto; o un caso en el que la proteína se expresa pero no presenta actividad. La inactivación es un concepto que incluye un caso en el que la actividad de la propia enzima se reduce o elimina en comparación con la actividad de la enzima que poseía originalmente el microorganismo debido a la modificación, etc. del gen que codifica la enzima; un caso en el que todo el nivel de actividad de la enzima en una célula se reduce o elimina en comparación con la actividad de la enzima que poseía originalmente la cepa de tipo salvaje del microorganismo debido a la inhibición de la expresión o traducción del gen que codifica la enzima; un caso en el que se elimina una parte o la totalidad del gen; y una combinación de estos; pero la inactivación no se limita a ello.

La inactivación de una enzima puede lograrse mediante la aplicación de varios métodos bien conocidos en la materia. Los ejemplos de los métodos pueden incluir un método de sustitución del gen que codifica la enzima en el cromosoma con un gen modificado para reducir la actividad de la enzima, incluido el caso en que se elimina la actividad de la enzima; un método para introducir una modificación en la secuencia de control de la expresión del gen que codifica la enzima en el cromosoma; un método para sustituir la secuencia de control de la expresión del gen que codifica la enzima con una secuencia que tiene actividad débil o nula; un método para eliminar parte o la totalidad del gen que codifica la enzima en el cromosoma; un método para introducir un oligonucleótido no codificante (por ejemplo, ARN no codificante) que se une de forma complementaria a un transcrito del gen en el cromosoma, de esta manera se inhibe la traducción del ARNm a la enzima; un método para incorporar artificialmente una secuencia complementaria a la secuencia SD en la parte superior de la secuencia SD del gen que codifica la enzima, de esta manera se forma una estructura secundaria, de esta manera se hace imposible la unión del ribosoma a la misma; un método para incorporar un promotor al extremo 3' del marco de lectura abierto (ORF) para inducir una transcripción inversa (ingeniería de transcripción inversa (RTE)), etc., y también una combinación de estos, pero los métodos no se limitan particularmente a los mismos.

El método de modificación de la secuencia de control de la expresión puede realizarse mediante la inducción de una modificación de la secuencia de control de la expresión por eliminación, inserción, sustitución conservativa o no conservativa, o una combinación de estas en la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de control de la expresión para debilitar la actividad de la secuencia de control de la expresión; o mediante la sustitución por un ácido nucleico que tenga una actividad más débil. La secuencia de control de la expresión puede incluir un promotor, una secuencia operadora, una secuencia que codifica una región de unión al ribosoma y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción, pero no se limita a ellas.

Además, la secuencia del gen en el cromosoma puede modificarse mediante la inducción de una modificación en la secuencia por eliminación, inserción, sustitución conservativa o no conservativa, o una combinación de estos en la secuencia del gen para debilitar aún más la actividad enzimática; o mediante la sustitución con una secuencia del gen que se mejoró para tener una actividad más débil o una secuencia del gen que se mejoró para no tener actividad, pero el método no se limita a ello.

Además, el método de eliminación de una parte o de la totalidad de un gen que codifica una enzima puede realizarse mediante la sustitución del polinucleótido que codifica la proteína objetivo endógena dentro del cromosoma con un polinucleótido o gen marcador que tiene una eliminación parcial en la secuencia de ácido nucleico mediante el uso de un vector para inserción cromosómica dentro de una cepa bacteriana. En una modalidad ilustrativa del método de eliminación de una parte o de la totalidad de un gen, puede usarse un método para eliminar un gen mediante recombinación homóloga, pero el método no se limita a ello.

Como se usa en la presente descripción, el término "parte" puede variar en dependencia de los tipos de polinucleótidos, y puede referirse específicamente a entre 1 y 300, más específicamente a entre 1 y 100, y aún más específicamente a entre 1 y 50, pero no se limita particularmente a ello.

Como se usa en la presente descripción, el término "recombinación homóloga" se refiere a la recombinación genética que se produce a través del entrecruzamiento en los loci de la cadena genética que tienen una homología mutua.

Además, aún otra modalidad específica de la presente descripción puede relacionarse con el microorganismo que produce O-acetilhomoserina en el que, adicionalmente, la actividad de la homoserina acetiltransferasa se mejora en comparación con la de un microorganismo no modificado. Específicamente, el microorganismo puede ser uno en el que se mejora la actividad de la homoserina acetiltransferasa en comparación con la de un microorganismo no modificado y, particularmente, puede ser uno en el que se introduce un gen metA modificado que codifica la homoserina acetiltransferasa con actividad mejorada. El gen metA modificado puede ser un gen que codifique uno en el que el aminoácido 111 de la homoserina acetiltransferasa se sustituya por ácido glutámico y el aminoácido 112 de la homoserina acetiltransferasa se sustituya por histidina, pero no se limita a ello. El gen metA modificado puede incluir, sin limitación, cualquier secuencia de aminoácidos que tenga una actividad mejorada de la homoserina acetiltransferasa en comparación con la de su tipo salvaje, y por ejemplo, puede ser una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Las modalidades de la preparación del gen metA modificado y el uso de este, una cepa que tiene actividad mejorada de homoserina acetiltransferasa, etc. se describen en la Patente Coreana núm. 10-1335841.

Adicionalmente, aún otra modalidad específica de la presente descripción puede relacionarse con un microorganismo que produce O-acetilhomoserina que pertenece al género Escherichia en el que, adicionalmente, la actividad de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, la transhidrogenasa de nucleótidos de piridina o una combinación de estas se mejora en comparación con la de un microorganismo no modificado.

Adicionalmente, aún otra modalidad específica de la presente descripción puede relacionarse con un microorganismo que produce O-acetilhomoserina en el que, adicionalmente, la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, la aspartato aminotransferasa o una combinación de estas se mejora en comparación con la de un microorganismo no modificado. Como se usa en la presente descripción, el término "mejora" se refiere al mejoramiento del nivel de actividad de una proteína que posee una proteína mediante la mejora de la actividad de una proteína que no se limita siempre que pueda mejorar cada proteína en comparación con la proteína nativa de tipo salvaje o proteína no modificada, como en la mejora de la actividad de una proteína objetivo. La mejora puede realizarse mediante un método seleccionado del grupo que consiste de i) un método para aumentar el número de copias de un polinucleótido que codifica cada proteína, ii) un método para introducir una modificación en la secuencia de control de la expresión para aumentar la expresión del polinucleótido, iii) un método para modificar la secuencia de polinucleótidos en el cromosoma para el mejoramiento de la actividad de cada proteína, y iv) una combinación de estos. Específicamente, la mejora puede realizarse mediante un método seleccionado del grupo que consiste de un método para insertar un polinucleótido que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica cada proteína en el cromosoma, un método para introducir el polinucleótido en un microorganismo después de introducirlo en un sistema de vector, un método para introducir un promotor con actividad mejorada en una región cadena arriba de la secuencia de nucleótidos que codifica cada proteína o introducir cada proteína con una modificación en su promotor, un método para modificar la secuencia de nucleótidos en la región 5'-UTR y un método para introducir una secuencia de nucleótidos modificada de la secuencia de nucleótidos que codifica cada proteína, pero los métodos de mejora no se limitan a ellos.

Aún otro aspecto de la presente descripción se relaciona con un método para producir O-acetilhomoserina que incluye el cultivo del microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina en un medio.

Específicamente, el método anterior se relaciona con un método para producir O-acetilhomoserina que incluye cultivar el microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina en un medio y recuperar O-acetilhomoserina del microorganismo cultivado o del medio de cultivo.

Como se usa en la presente descripción, el término "cultivo" se refiere al crecimiento de un microorganismo en un entorno adecuadamente ajustado. En la presente descripción, el proceso de cultivo puede realizarse mediante el uso de un medio adecuado y condiciones de cultivo bien conocidas en la materia. El proceso de cultivo puede ajustarse fácilmente para que lo use un experto en la materia de acuerdo con la cepa que se seleccione. El cultivo puede realizarse en un proceso por lotes, cultivo continuo, cultivo por lotes de búsqueda, etc. que se conoce en la materia, pero no se limita particularmente a ello. El medio y otras condiciones de cultivo usados para cultivar el microorganismo de la presente descripción pueden no limitarse particularmente, pero puede usarse cualquier medio usado convencionalmente para el cultivo de microorganismos del género Escherichia. Específicamente, el microorganismo de la presente descripción puede cultivarse en condiciones aeróbicas en un medio común que contenga fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y fósforo, compuestos inorgánicos, aminoácidos y/o vitaminas, etc., mientras que se ajusta la temperatura, el pH, etc.

En la presente descripción, las fuentes de carbono pueden incluir carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, sorbitol, etc.; alcoholes tales como alcohol de azúcar, glicerol, etc.; ácidos orgánicos tales como ácido pirúvico, ácido láctico, ácido cítrico, etc.; aminoácidos tales como ácido glutámico, metionina, lisina, etc., pero las fuentes de carbono no se limitan a ellos. Adicionalmente, pueden usarse nutrientes orgánicos naturales tales como hidrolizado de almidón, melaza, melaza de caña negra, salvado de arroz, mandioca, bagazo de caña de azúcar, licor de maceración de maíz, etc. Específicamente, pueden usarse carbohidratos tales como glucosa y melaza pretratada esterilizada (es decir, melaza convertida en azúcar reductor), y adicionalmente, pueden usarse sin limitación varias fuentes de carbono en una cantidad adecuada. Estas fuentes de carbono pueden usarse solas o en una combinación de al menos dos tipos.

Los ejemplos de fuentes de nitrógeno pueden incluir fuentes de nitrógeno inorgánico (por ejemplo, amoniaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio, nitrato de amonio, etc.); aminoácidos (ácido glutámico, metionina, glutamina, etc.); y fuentes de nitrógeno orgánico (por ejemplo, peptona, amina N-Z, extracto de carne, extracto de levadura, extracto de malta, licor de maceración de maíz, hidrolizado de caseína, pescado o producto de su descomposición, torta de soja desgrasada o producto de su descomposición, etc.). Las fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o en una combinación de al menos dos tipos, pero no se limitan a ellas.

Los ejemplos de las fuentes de fósforo pueden incluir fosfato monopotásico, fosfato dipotásico y sus correspondientes sales que contienen sodio. Los ejemplos de compuestos inorgánicos a usar pueden incluir cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de hierro, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de manganeso, carbonato de calcio, etc. Adicionalmente, pueden incluirse aminoácidos, vitaminas y/o precursores adecuados, pero no se limitan a ellos. Estos medios o precursores pueden añadirse en un proceso de cultivo por lotes o en un proceso de cultivo continuo a un cultivo, pero no se limitan a ellos.

Durante el período de cultivo en la presente descripción, el pH de un cultivo puede ajustarse mediante la adición de un compuesto como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoniaco, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, etc. al cultivo de forma adecuada. Adicionalmente, durante el periodo de cultivo, puede añadirse un agente antiespumante, como éster de poliglicol de ácido graso, para evitar la generación de espuma. Adicionalmente, para mantener el estado aeróbico del cultivo, puede inyectarse oxígeno o un gas que contenga oxígeno en el cultivo, mientras que para mantener los estados anaeróbicos y microaeróbicos del cultivo, puede inyectarse nitrógeno, hidrógeno o gas de dióxido de carbono sin la inyección de aire.

La temperatura de cultivo puede ser normalmente de 27 °C a 37 °C, y específicamente de 30 °C a 35 °C, pero la temperatura de cultivo no se limita a ello. Adicionalmente, el cultivo puede continuarse hasta que pueda obtenerse la producción de material(es) deseado(s), y específicamente durante 10 horas a 100 horas, pero no se limita a ello. La recuperación de O-acetilhomoserina puede realizarse mediante el uso del método de cultivo de un microorganismo de la presente descripción. Por ejemplo, la O-acetilhomoserina objetivo puede recuperarse de un cultivo mediante el uso de un método adecuado conocido en la materia (por ejemplo, un cultivo de tipo discontinuo, cultivo continuo o cultivo discontinuo alimentado, etc.). Por ejemplo, pueden usarse métodos tales como centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio de aniones, cristalización, HPLC, etc., y adicionalmente, puede usarse un método combinado de métodos adecuados conocidos en la materia.

El proceso de recuperación puede incluir un proceso de separación y/o un proceso de purificación.

Un aspecto de la presente descripción se relaciona con un método para producir L-metionina, que incluye cultivar el microorganismo del género Escherichia productor de O-acetilhomoserina en un medio; y convertir la O-acetilhomoserina en L-metionina mediante el tratamiento del microorganismo cultivado o el medio de cultivo o la O-acetilhomoserina recuperada del microorganismo cultivado o el medio de cultivo con metil mercaptano y una enzima convertidora de metionina.

Por ejemplo, la metionina puede producirse a partir de O-acetilhomoserina, que se recupera de un cultivo de un microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina en un medio, mediante un proceso de dos etapas (Patente coreana núm. 10-0905381).

El proceso de dos etapas incluye un proceso de producción de L-metionina y un ácido orgánico mediante una reacción enzimática que usa una enzima que tiene la actividad de convertir O-acetilhomoserina en metionina mediante el uso de O-acetilhomoserina y metil mercaptano como sustratos o una cepa que contiene la enzima. La enzima convertidora de metionina incluye todas las enzimas que convierten la O-acetilhomoserina en metionina, y particularmente la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, pero no se limita a ella.

Específicamente, la O-acetilhomoserina sulfhidrolasa a usar puede obtenerse de cepas microbianas pertenecientes al género Leptospira, al género Chromobacterium y al género Hyphomonas, y más específicamente, una obtenida de cepas microbianas pertenecientes al género Leptospira meyeri, Pseudomonas aurogenosa, Hyphomonas neptunium y Chromobacterium violaceum.

La reacción anterior se muestra más abajo:

CH3SH O-acetil-L-homoserina <=> acetato metionina

Dicho proceso adicional de producción de metionina se describe en la Patente Coreana núm. 10-0905381, y la descripción completa de la patente puede incluirse como referencia para la presente descripción.

Descripción detallada de la invención

De aquí en adelante, la presente descripción se describirá en detalle a través de modalidades ilustrativas. Sin embargo, estas modalidades ilustrativas se proporcionan solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente descripción.

Ejemplo de Referencia 1: Preparación de cepas que producen O-acetilhomoserina

1-1. Eliminación del gen metB en E. coli de tipo salvaje

Para producir cepas productoras de O-acetilhomoserina, se usó E. coli, que es un microorganismo representativo entre los microorganismos del género Escherichia. Para este propósito, se usó E. coli K12 W3110 (ATCC 27325), un tipo salvaje de E. coli, que se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Se preparó una cepa que tiene defectos en el gen metB (SEQ ID NO: 6) que codifica la cistationina gamma sintasa y el gen thrB (SEQ ID NO: 8) que codifica la homoserina quinasa en la cepa E. coli K12 W3110. La cepa así preparada que producía O-acetilhomoserina se denominó W3-BT. Una modalidad con respecto a las cepas en las que los genes metB y thrB han sido eliminados se describen en la Patente Coreana núm. 10-0905381 o en la Publicación de Patente Internacional WO 2008/013432 (véase en particular, los Ejemplos 1-1 y 1-2 de la Patente Coreana núm. 10­ 0905381), y la especificación completa de la patente puede incluirse aquí como referencia para la presente descripción.

1-2. Preparación de cepa a la cual se le ha introducido el gen metA modificado que tiene actividad de homoserina acetiltransferasa

Para mejorar la actividad de homoserina acetiltransferasa en la cepa obtenida en el Ejemplo de Referencia 1-1, se intentó introducir el gen metA modificado (SEQ ID NO: 10) que codifica homoserina acetiltransferasa con actividad mejorada en la cepa. En un intento de preparar dicha cepa, se preparó un plásmido pCL_Pcj1_metA (EH) mediante el método descrito en los Ejemplos 1 y 3 de la Patente Coreana núm.10-1335841.

A continuación, para preparar un casete de reemplazo como una forma de sustituir el gen metA modificado preparado anteriormente mediante su introducción en la cepa, se realizó una PCR mediante el uso del vector pKD3 como plantilla junto con cebadores de SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. Específicamente, la PCR se realizó repetidamente durante un total de 30 ciclos, en los que se realizó la desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la hibridación a 55 °C durante 30 segundos y la extensión a 72 °C durante 2 minutos.

Para la porción de metA (EH) del casete de sustitución, se realizó la PCR mediante el uso de pCL-Pcj1-metA (EH) como plantilla junto con los cebadores de la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20, mientras que, para la porción de metA de tipo salvaje, se usaron los cebadores de la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, y de esta manera se obtuvieron los respectivos productos de la PCR. Sobre la base de 3 productos de PCR, se preparó el casete de reemplazo metA (Eh ) que contenía un marcador de cloranfenicol mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 22, y se introdujo por electroporación en la cepa W3-BT, que se transformó con el vector pKD46, que se preparó en el Ejemplo de Referencia 1-1.

Las cepas que se confirmaron que habían sido introducidas por el proceso anterior se transformaron de nuevo con el vector pCP20 y se cultivaron en medio LB. La cepa en la que se eliminó el marcador de cloranfenicol y el gen metA se reemplazó con metA (EH) se denominó W3-BTA.

Una modalidad con respecto a la cepa con actividad mejorada de homoserina acetiltransferasa, etc. se describe en la Patente Coreana núm. 10-1335841 o Publicación de Patente Internacional WO 2012/087039, y la descripción completa de la patente puede incluirse en la presente descripción como referencia para la presente descripción. 1-3. Preparación de la cepa que incluye 2 copias de los genes ppc, aspC y asd

Para aumentar la productividad de O-acetilhomoserina de la cepa W3-BTA preparada en el Ejemplo de Referencia 1-2, se introdujo una estrategia conocida para el mejoramiento de la ruta biosintética. Se intentó preparar cepas en las que los genes, que se asocian con la fosfoenolpiruvato carboxilasa implicada en la biosíntesis de oxaloacetato a partir de fosfoenolpiruvato, la aspartato aminotransferasa implicada en la biosíntesis de aspartato a partir de oxaloacetato, y la aspartato-semialdehído deshidrogenasa implicada en la biosíntesis de homoserina a partir del fosfato de p-aspartil se amplificaron a 2 copias, es decir, los genes de ppc, aspC y asd se amplificaron a 2 copias. Para la preparación de las cepas, se prepararon los plásmidos pSG-2ppc, pSG-2aspC y pSG-2asd mediante el método descrito en los Ejemplos 1-1 a 1-3 de la Patente Coreana núm. 10-1117012, los plásmidos anteriores se introdujeron en la cepa W3-BTA, y la cepa en la que los 3 genes diferentes se amplificaron secuencialmente a 2 copias se preparó mediante el método descrito en el Ejemplo 1-5 de la patente coreana. La cepa así preparada se denominó W3-BTA2PCD (= WCJM).

Una modalidad con respecto a la cepa con actividad mejorada de fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa y aspartato-semialdehído deshidrogenasa, etc., se describe en Patente Coreana núm. 10-0905381 o Publicación de Patente Internacional WO 2008/013432, y la descripción completa de la patente puede incluirse en la presente descripción como referencia para la presente descripción.

1-4. Experimento de cultivo en matraz

Para ensayar la cantidad de producción de O -acetilhomoserina en las cepas preparadas en los Ejemplos de Referencia 1-2 y 1-3, se realizó un cultivo en matraz Erlenmeyer. Las cepas W3l10, W3-BTA y WCJM se sembraron en medio LB y se cultivaron a 33 °C durante la noche. Se sembraron colonias individuales en 3 ml de medio LB y se incubaron a 33 °C durante 5 horas, se diluyeron 200 veces en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 25 ml de medio para producir O-acetilhomoserina y se incubaron nuevamente a 33 °C a 200 rpm durante 30 horas, y la cantidad de producción de O-acetilhomoserina se confirmó mediante el análisis de HPLC. La composición del medio usado se resume en la Tabla 1 más abajo.

[Tabla 1] m i i n l m i l m r z r - tilhomoserina

La cantidad de producción de O-acetilhomoserina se confirmó mediante el análisis de HPLC después de cultivar durante 30 horas mediante el uso del medio anterior, y los resultados se resumen en la Tabla 2 más abajo.

[Tabla 2 Producción de O-acetilhomoserina mediante el cultivo en matraz

Como puede verse en la Tabla 2 anterior, la O-acetilhomoserina no se produjo en absoluto en la cepa de tipo salvaje W3110, sin embargo, la cepa W3-BTA produjo O-acetilhomoserina (O-AH) a una concentración de 0,9 g/l, y la cepa WCJM con una ruta biosintética mejorada produjo O-acetilhomoserina (O-AH) a una concentración de 1,2 g/l.

Ejemplo 1: Selección de proteínas de membrana que aumentan la productividad de O-acetilhomoserina

Los inventores de la presente descripción intentaron utilizar la LeuE (SEQ ID NO: 1) obtenida de Escherichia coli, que se describió como una proteína de membrana pero no se ha descrito con respecto a la actividad de exportar O-acetilhomoserina y producir O- acetilhomoserina, para la producción de O-acetilhomoserina.

Para mejorar el gen leuE en la cepa, se clonó el gen leuE mediante el uso de un sitio de restricción Sma I del vector pCL.

En primer lugar, para preparar el gen leuE, se realizó la PCR durante un total de 30 ciclos mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NOS: 11 y 12, en los que se realizó la desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la hibridación a 55 °C durante 30 segundos, y extensión a 68 °C durante 1 minuto. El producto de PCR resultante se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0 % y el ADN se purificó a partir de la banda de 800 pb. El ADN purificado se trató con la enzima de restricción Sma I a 37 °C durante la noche y, después de una purificación adicional, el gen leuE y el vector pCL se clonaron mediante el uso de ligasa T4. Después de transformar E. coli DH5 mediante el uso del plásmido clonado, los E. coli DH5 transformados se seleccionaron en medio de placa LB que contenía espectinomicina (50 |jg/ml) para obtener el plásmido. El plásmido así preparado se introdujo en las cepas W3-BTA y WCJM, que son cepas productoras de O-acetilhomoserina. Se nombraron como W3-BTA/pCL-leuE y WCJM/pCL-leuE, respectivamente, y se realizó una evaluación en matraz sobre su productividad de O-acetilhomoserina.

Adicionalmente, como grupos de control, el vector vacío pCL1920 se introdujo en las cepas W3-BTA y WCJM con el mismo método que se describió anteriormente, y se denominó W3-BTA/pCL1920 y WCJM pCL1920, respectivamente, y se realizó una evaluación en matraz de su productividad de O-acetilhomoserina.

Específicamente, cada cepa se sembró en medio sólido LB y se cultivó durante la noche en una incubadora a 33 °C. Una única colonia de la cepa cultivada durante la noche en medio de placa LB se sembró en 3 ml de medio LB y se incubó a 33 °C durante 5 horas, se diluyó 200 veces en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 25 ml de medio para producir O-acetilhomoserina, y se incubó de nuevo a 33 °C a 200 rpm durante 30 horas, y la cantidad de producción de O-acetilhomoserina se confirmó mediante el análisis de HPLC. Los resultados se resumen en la Tabla 3 más abajo.

[Ta l M i i n l r i n - ilh m rin m i n l li n matraz

Como puede verse en la Tabla 3 anterior, la cepa WCJM a la cual se le ha introducido el plásmido leuE mostró una OD más baja en comparación con la cepa de control a la cual se le ha introducido el vector vacío, y la cepa WCJM además mostró un mayor consumo de glucosa. Sin embargo, la cepa WCJM produjo O-acetilhomoserina a una concentración de 1,5 g/l, y esto no pudo confirmar que el aumento de la producción de O-acetilhomoserina se debiera a la introducción de la leuE de tipo salvaje. Sin embargo, los resultados de ser capaz de controlar la OD y aumentar la tasa de consumo de glucosa confirmaron la potencial actividad exportadora de la cepa. En consecuencia, se hizo un intento de seleccionar cepas modificadas que tuvieran una actividad mejorada de exportación de O-acetilhomoserina en comparación con la cepa de tipo salvaje a través del modelado estructural. Ejemplo 2: Preparación de plásmido con modificación del codón de inicio de leuE y evaluación de la productividad de O-acetil homoserina

Se conoce que el codón de inicio de leuE de tipo salvaje es GTG, que codifica valina, un aminoácido. Para confirmar el efecto mejorado de la proteína leuE mediante el cambio del codón de inicio a ATG (es decir, un codón que codifica metionina), se realizó un experimento para cambiar el codón de inicio basado en el plásmido preparado en el Ejemplo 1. Específicamente, el primer aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituyó con metionina para mejorar la actividad de exportación de O-acetilhomoserina. Más específicamente, se preparó una modificación leuE(ATG). Para preparar la modificación leuE(ATG), se usaron los cebadores de SEQ iD NO: 145 y SEQ ID NO: 146, y se preparó un gen leuE(ATG) modificado mediante mutagénesis específica del sitio (kit de mutagénesis dirigida al sitio, Stratagene, EE. UU.). El plásmido de tipo salvaje existente se denominó WT, y el plásmido de la variante del codón de iniciación se denominó WT_ATG, y el plásmido así preparado se introdujo en la cepa WCJM y se realizó la evaluación en matraz sobre su productividad de O-acetilhomoserina.

Específicamente, cada cepa se sembró en medio sólido LB y se cultivó durante la noche en una incubadora a 33 °C. La cepa cultivada durante la noche en medio de placa LB se sembró en 25 ml de medio de titulación y se incubó a 33 °C a 200 rpm durante 40 horas. Los resultados se resumen en la Tabla 4 más abajo.

T l 4 M i i n l r i n - ilh m rin m i n l li n m r z

Como puede verse en la Tabla 4 anterior, la cepa a la cual se le ha introducido el plásmido pCL-leuE WT(ATG) que tiene la modificación del codón de inicio mostró una OD más baja en comparación con la cepa de tipo salvaje, pero mostró un consumo de glucosa más rápido. La cepa a la cual se le ha introducido el plásmido pCL-leuE WT(ATG) que tiene la modificación del codón de inicio produjo O-acetilhomoserina a una concentración de 2,6 g/l, lo que supone un aumento de la productividad de hasta un 173 % en comparación con la cepa tipo salvaje.

Ejemplo 3: Preparación de plásmido modificado con leuE y evaluación de la productividad de O-acetilhomoserina 3-1. Preparación de plásmido modificado con leuE

Se realizaron experimentos para preparar cada uno de los tres polipéptidos modificados que se esperaba que tuvieran una actividad de exportación más fuerte en comparación con leuE de tipo salvaje basada en dos tipos de plásmidos, es decir, los plásmido pCL-leuE WT y pCL-leuE WT(ATG) preparados en los Ejemplos 1 y 2. Específicamente, las posiciones de la modificación leuE se seleccionaron a través del modelado de estructuras para mejorar la actividad de exportación de O-acetilhomoserina, y los aminoácidos en las posiciones 30, 95, y 165 en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1 y 2 se sustituyeron con diferentes aminoácidos, respectivamente. Más específicamente, se prepararon modificaciones L95V, F30A y F165A. Para la preparación de la modificación L95V, se usaron cebadores de SEQ ID NOS: 13 y 14; para la modificación de F30A, se usaron cebadores de SEQ ID NOS: 25 y 26; y para la modificación de F165A, se usaron cebadores de SEQ ID NOS: 27 y 28. Los genes leuE modificados se prepararon mediante el uso de un kit de mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene, EE. UU.) junto con cada uno de los conjuntos de cebadores descritos anteriormente. Basado en el plásmido WT de tipo salvaje existente, el plásmido L95V modificado se denominó WT_M3; el plásmido F30A modificado como Wt_M4 y el plásmido F165A modificado como WT_M6, respectivamente. Adicionalmente, basado en el plásmido con una modificación codón de inicio (es decir, WT(ATG)), el plásmido modificado L95V fue nombrado como WT(ATG)_M3, el F30A plásmido modificado como WT(ATG)_M4, y el plásmido F165A modificado como WT(ATG)_M6, respectivamente. Los plásmidos modificados así preparados se introdujeron en la cepa WCJM para evaluar la productividad de O-acetilhomoserina en un matraz.

Específicamente, cada cepa se sembró en un medio de placa LB y se cultivó en una incubadora a 33 °C durante la noche. La cepa cultivada durante la noche en medio sólido LB se inoculó en 25 ml del medio de titulación y a continuación, se cultivó en una incubadora a 33 °C a 200 rpm durante 40 horas. Los resultados se muestran en la Tabla 5 más abajo.

T l M i i n l r i n - ilh m rin m i n l li n m r z

Como puede verse en la Tabla 5 anterior, las 3 cepas a las cuales se le han introducido el plásmido modificado con leuE mostraron una disminución en la OD en comparación con la del tipo salvaje, pero las 3 cepas mostraron un consumo de glucosa más rápido en comparación con la del tipo salvaje, y en particular, la cepa WT(ATG)_M6 mostró producir O-acetilhomoserina a una concentración de 4,9 g/l, lo que mostró la mayor productividad de O-acetilhomoserina. En consecuencia, se confirmó que las 3 cepas modificadas de la presente descripción presentaban una productividad mejorada de O-acetilhomoserina. Adicionalmente, se confirmó que cuando se aumentó la cantidad de expresión de proteína modificando el codón de inicio de leuE, se incrementó aún más la productividad de O-acetilhomoserina.

3-2. Preparación de genes de rutas de biosíntesis y plásmidos modificados

Para maximizar la productividad de la O-acetilhomoserina, se preparó un plásmido capaz de mejorar la ruta biosintética de la homoserina. Para la clonación de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, la transhidrogenasa de nucleótidos de piridina, y la LeuE de tipo salvaje y la LeuE modificada en el vector pCL, se introdujeron primero los genes asd y pntAB en el vector pCL.

Primero, en la obtención de los genes asd y pntAB, se realizó la PCR por un total de 30 ciclos, en los cuales se realizó desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, y extensión a 68 °C durante 3 minutos, mediante el uso de cebadores de SEQ ID NOS: 15 y 16 para el gen asd y cebadores de SEQ ID NOS: 17 y 18 para el gen pntAB. Los productos de la PCR resultantes se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0 % y se purificaron los ADN obtenidos de las bandas de 1,4 kb (asd) y 3 kb (pntAB) respectivamente.

Los dos genes purificados se ligaron mediante el uso de la PCR de extensión solapada (una técnica en la que las partes superpuestas de dos genes se ligan primero sin usar ningún cebador y a continuación, se amplifican mediante el uso de los cebadores en ambos extremos). Las condiciones para la PCR de extensión solapada fueron: realizar la PCR descrita anteriormente durante 10 ciclos y a continuación, añadir los cebadores de SEQ ID NOS: 15 y 18 y realizar la PCR durante 20 ciclos. Como resultado, se prepararon fragmentos combinados de genes asdpntAB y se purificaron mediante electroforesis. Los fragmentos purificados y el vector pCL se trataron con Sma I a 37 °C durante la noche, se purificaron y el plásmido pCL-asd-pntAB se preparó mediante el uso de ligasa T4.

El gen leuE se clonó en el plásmido así preparado. En la clonación, específicamente, para obtener el gen leuE, se realizó la PCR durante un total de 30 ciclos, en los cuales se realizó desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, y extensión a 68 °C durante 1 minuto, mediante el uso de cebadores de SEQ ID NO: 29 y 30.

El producto de PCR resultante se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0 % y se purificó el ADN obtenido a partir de 800 pb. El ADN purificado y el vector pCL se trataron con Kpn I a 37 °C durante la noche, se purificaron y se clonaron el gen leuE y el vector pCL-asd-pntAB. Los plásmidos clonados se transformaron en E. coli DH5a, y la E. coli DH5a transformada se seleccionó en medio de placa LB que contenía espectinomicina (50 |jg/ml) y los plásmidos se obtuvieron a partir de ahí. Los plásmidos así preparados se introdujeron en la cepa WCJM, que es una cepa que produce O-acetilhomoserina, y se realizó una evaluación en matraz con respecto a su productividad de O-acetilhomoserina. Los plásmidos así preparados fueron un total de 4 tipos y se usaron las cepas de tipo salvaje y 3 modificadas preparadas en el Ejemplo 2-1. Los 4 tipos de plásmidos se introdujeron en la cepa WCJM mediante electroporación y se realizó una evaluación en matraz de la misma manera que en el Ejemplo 3-1. Los resultados se muestran en la Tabla 6-1 más abajo.

T l M i i n l r i n - ilh m rin m i n l li n m r z

Como puede verse en la Tabla 6 anterior, como resultado de la mejora simultánea de la ruta de biosíntesis y de la modificación de la leuE, la productividad de la O-acetilhomoserina aumentó aún más. En particular, en el caso de la cepa en la que se introdujo el plásmido pCL-asd-pntAB-leuE WT_M6, la OD disminuyó en comparación con la cepa de tipo salvaje, pero la cepa mostró un consumo de glucosa más rápido y produjo O-acetilhomoserina a una concentración de 5,9 g/l, la más alta entre las cepas.

Ejemplo 4: Preparación de la modificación leuE por mutagénesis saturada y evaluación de la productividad de O-acetilhomoserina

4-1. Preparación de cepas con modificación leuE por mutagénesis saturada y evaluación de estas

Se prepararon modificaciones mediante mutagénesis saturada para producir diferentes tipos de sustituciones de aminoácidos de las variantes de 3 leuE, que habían mostrado una alta productividad de O-acetilhomoserina. Los aminoácidos sustituidos se prepararon mediante el uso de 17 tipos de mutación M3, mutación M4 y mutación M6, respectivamente, mediante el uso de los plásmidos preparados en el Ejemplo 2 como plantillas. Los resultados se muestran en la Tabla 7 más abajo.

T l

Específicamente, los genes modificados con leuE se prepararon mediante la realización de un kit de mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene, EE. UU.) mediante el uso de los cebadores que se muestran en la Tabla 7 anterior. El plásmido se introdujo en la cepa WCJM y el matraz se evaluó de la misma manera que en el Ejemplo 3-1. Los resultados se muestran en la Tabla 8 más abajo.

[Tabla 8] Medición de la producción de O-acetilhomoserina mediante el cultivo en matraz

Como puede verse en la Tabla 8 anterior, como resultado de la evaluación de cada una de las cepas modificadas, hubo una ligera diferencia en la tasa de consumo de glucosa y OD. Sin embargo, se encontró que todas las cepas modificadas anteriores tenían una mayor cantidad de producción de O-acetilhomoserina en comparación con las cepas WCJM/pCL1920 y WCJM/pCL-leuE WT usadas como grupo de control.

4-2. Preparación de la cepa con modificación mejorada de leuE en la cepa con alto rendimiento de O-acetilhomoserina y evaluación de su productividad de O-acetilhomoserina

Se describe un método para producir una cepa capaz de producir O-acetilhomoserina mediante el uso de una cepa capaz de producir treonina a través de la mutación NTG obtenida del W3110 de tipo salvaje (Publicación de Patente Internacional núm. WO 2012/087039). En particular, la cepa así preparada que produce O-acetilhomoserina con alto rendimiento se depositó en el Centro de Conservación de Microorganismos de Corea con el número de Acceso KCCM11146P.

Se intentó determinar si la productividad de O-acetilhomoserina puede mejorarse adicionalmente mediante la introducción del gen leuE y las cepas modificadas de este basadas en la cepa anterior.

Específicamente, el gen leuE y las 3 cepas modificadas de este se introdujeron mediante electroporación. Las cepas introducidas se denominaron KCCM11146P/pCL1920, KCCM11146P/pCL-leuE WT, KCCM11146P/pCL-leuE M3, KCCM11146P/pCL-leuE M4 y KCCM11146P/pCL-leuE M6, respectivamente. Para medir la productividad de O-acetilhomoserina del gen leuE y las 3 cepas modificadas de este, se realizó una evaluación del cultivo en matraz. Específicamente, el medio LB se inoculó con 4 tipos de las cepas anteriores y se incubó durante la noche a 33 °C. A continuación, las colonias individuales se inocularon en 3 ml de medio lB y se cultivaron nuevamente a 33 °C durante 5 horas, se diluyeron 200 veces en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 25 ml de medio para producir O-acetilhomoserina y se incubaron nuevamente a 33 °C a 200 rpm durante 30 horas, y la cantidad de producción de O-acetilhomoserina se confirmó mediante el análisis de HPLC. Los resultados del experimento se resumen en la Tabla 9 más abajo.

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Como puede verse en la Tabla 9, se confirmó que la cepa que se preparó mediante la introducción de sólo el pCL1920 en la cepa KCCM11146P produjo 14,2 g/l de O-acetilhomoserina, y la cepa leuE WT también mostró un aumento en la cantidad de producción de O-acetilhomoserina en comparación con la cepa original. Adicionalmente, las 3 cepas modificadas mostraron una disminución de la OD, mientras que la cepa M4 mostró el mayor rendimiento de producción de O-acetilhomoserina (19,2 g/l). Las cepas M4 y M6 mostraron un aumento en la cantidad de producción de O-acetilhomoserina.

Los inventores de la presente descripción confirmaron que la producción de O-acetilhomoserina aumentó en las "cepas KCCM11146P/pCL-leuE M3, M4 y M6", que son cepas de M3, M4 y M6 modificadas con 3 leuE que basada en la cepa KCCM11146P. Como resultado, nombraron las cepas como "CA05-4009", "CA05-4010" y "CA05-4011", y se depositaron en la KCCM el 15 de diciembre de 2014, con los Números de Acceso KCCM11645P, KCCM11646P y KCCM11647P, respectivamente.

Ejemplo 5: Producción de L-metionina mediante el uso de la solución de cultivo de O-acetilhomoserina producida y de la transferasa

Se realizó un experimento para producir L-metionina mediante el uso de la solución de cultivo de O-acetilhomoserina obtenida en el Ejemplo 4 y O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, que es una enzima que convierte la O-acetilhomoserina en metionina.

Se preparó O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, una enzima convertidora, mediante el método que se proporciona en el ejemplo 1-2 de la Patente Coreana núm. 10-1250651, y se midió la cantidad de L-metionina que se produjo por una reacción de conversión mediante el uso del método que se proporciona en el Ejemplo 3 de la Patente Coreana núm.

10-1250651. Para la O-acetilhomoserina usada como sustrato, se usó la solución de cultivo de KCCM11146P-pCL-leuE M4 (concentración de O-AH; 19,2 g/l) obtenida en el Ejemplo 4 de la presente descripción, y la concentración de la L-metionina producida a partir de esta se muestra en la Tabla 10 más abajo.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido modificado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina, en donde al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina en la posición 30, leucina en la posición 95 y fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con otro aminoácido, en donde el polipéptido modificado tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fenilalanina en la posición 30 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de alanina, triptófano, leucina, valina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico e histidina; la leucina en la posición 95 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de valina, fenilalanina, alanina, glicina, treonina, asparagina, ácido aspártico e histidina; o la fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de alanina, triptófano, leucina, valina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico e histidina.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la valina en la posición 1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye además con metionina.

4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 133, 134, 137, 138, 141 y 142.

5. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina.

6. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NOS: 135, 136, 139, 140, 143 y 144.

7. Un microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina, en donde se comprende o se sobreexpresa un polipéptido modificado de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que tiene la actividad de exportar O-acetilhomoserina,

en donde el polipéptido modificado tiene sustituciones de al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina en la posición 30, leucina en la posición 95 y fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

8. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde, con respecto al polipéptido modificado, la fenilalanina en la posición 30 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye por cualquiera seleccionado del grupo que consiste de alanina, triptófano, leucina, valina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico e histidina; la leucina en la posición 95 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de valina, fenilalanina, alanina, glicina, treonina, asparagina, ácido aspártico e histidina; o la fenilalanina en la posición 165 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con cualquiera seleccionado del grupo que consiste de alanina, triptófano, leucina, valina, glicina, serina, asparagina, ácido aspártico e histidina.

9. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde, con respecto al polipéptido modificado, la valina en la posición 1 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye además con metionina.

10. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el microorganismo del género Escherichia es Escherichia coli.

11. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde, adicionalmente, se inactiva la actividad de la cistationina sintasa, o

en donde, adicionalmente, se inactiva la actividad de la homoserina quinasa, o

en donde, adicionalmente, la actividad de la homoserina acetiltransferasa se mejora en comparación con la de un microorganismo no modificado, o

en donde, adicionalmente, las actividades de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, la transhidrogenasa de nucleótidos de piridina o una combinación de estas se mejoran en comparación con las de un microorganismo no modificado.

12. Un método para producir O-acetilhomoserina, que comprende:

cultivar el microorganismo del género Escherichia productor de O-acetilhomoserina de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en un medio; y

recuperar la O-acetilhomoserina del microorganismo cultivado o del medio de cultivo.

13. Un método para producir L-metionina, que comprende:

cultivar el microorganismo del género Escherichia productor de O-acetilhomoserina de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en un medio; y

convertir la O-acetilhomoserina en L-metionina mediante el tratamiento del microorganismo cultivado o el medio de cultivo o la O-acetilhomoserina recuperada del microorganismo cultivado o el medio de cultivo con metil mercaptano y una enzima convertidora de metionina,

en donde la enzima convertidora de metionina es, opcionalmente, O-acetilhomoserina sulfhidrilasa.