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ES2864657T3 - Nuevas proteínas insecticidas quiméricas tóxicas para plagas de lepidópteros o inhibidoras de las mismas - Google Patents

Nuevas proteínas insecticidas quiméricas tóxicas para plagas de lepidópteros o inhibidoras de las mismas Download PDF

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ES2864657T3
ES2864657T3 ES15797725T ES15797725T ES2864657T3 ES 2864657 T3 ES2864657 T3 ES 2864657T3 ES 15797725 T ES15797725 T ES 15797725T ES 15797725 T ES15797725 T ES 15797725T ES 2864657 T3 ES2864657 T3 ES 2864657T3
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Crystal L Dart
Leigh H English
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Victor M Guzov
Arlene R Howe
Jay P Morgenstern
James K Roberts
Sara A Salvador
Jinling Wang
Stanislaw Flasinski
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Abstract

Una proteína insecticida quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 28, en la que la proteína insecticida quimérica presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Lepidoptera.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevas proteínas insecticidas quiméricas tóxicas para plagas de lepidópteros o inhibidoras de las mismas Campo de la invención
La invención se refiere generalmente al campo de proteínas inhibidoras de insectos. Se desvela en la presente solicitud una clase nueva de proteínas insecticidas quiméricas que presentan actividad inhibidora de insectos contra plagas relevantes desde el punto de vista agrícola de semillas y plantas de cultivo. En particular, la clase desvelada de proteínas presenta actividad insecticida contra el orden de plagas de insectos lepidópteros. Se proporcionan plantas, partes de plantas y semillas que contienen una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una o más de las proteínas toxinas desveladas.
Antecedentes de la invención
Mejorar el rendimiento de cultivo de plantas significativas desde el punto de vista agrícola, que incluyen, entre otras, maíz, soja, caña de azúcar, arroz, trigo, hortalizas y algodón, se ha vuelto cada vez más importante. Además de la creciente necesidad de productos agrícolas para alimentar, vestir y proporcionar energía a una población humana en aumento, se predice que los efectos relacionados con el clima y la presión de la creciente población para usar la tierra para fines distintos de las prácticas agrícolas reducirán la cantidad de tierra cultivable disponible para la labranza. Estos factores han llevado a pronósticos desalentadores respecto a la seguridad alimentaria, particularmente en ausencia de mejoras importantes en la biotecnología vegetal y las prácticas agronómicas. A la vista de estas presiones, las mejoras sostenibles desde el punto de vista ambiental en la tecnología, las técnicas agrícolas y el control de plagas son herramientas vitales para expandir la producción de cultivos en la cantidad limitada de tierra cultivable disponible para la labranza.
Los insectos, particularmente los insectos del orden Lepidoptera, se consideran una causa principal de daño a los campos de cultivo, lo cual reduce los rendimientos de los cultivos en las áreas infestadas. Las especies de plagas de lepidópteros que tienen un efecto negativo sobre la agricultura incluyen, pero sin limitación, al gusano cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), guardama de la remolacha (Spodoptera exigua), gusano de las crucíferas (Mamestra configurata), gusano cortador grasiento (Agrotis Ípsilon), gusano falso medidor (Trichoplusia ni), lagarta verde (Chrysodeixis includens), oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), gusano verde de la soja (Hypena scabra), gusano bellotero del tabaco (Heliothis virescens), gusano trozador (Agrotis subterranea), oruga militar verdadera (Pseudaletia unipuncta), gusano cortador pálido del oeste (Agrotis orthogonia), taladro del maíz (Ostrinia nubilalis), gusano de la naranja navel (Amyelois transitella), gusano de la raíz del maíz (Crambus caliginosellus), gusano tejedor del césped (Herpetogramma licarsisalis), palomilla de la cabezuela (Homoeosoma electellum), barrenador menor del tallo del maíz (Elasmopalpus lignosellus), polilla del manzano (Cydia pomonella), polilla de la uva (Endopiza viteana), polilla oriental del melocotonero (Grapholita molesta), polilla de la yema del girasol (Suleima helianthana), palomilla de las coles (Plutella xylostella), gusano rosado (Pectinophora gossypiella), taladrador purpura del arroz (Sesamia inferens), polilla gitana (Lymantria dispar), gusano medidor de la hoja del algodonero (Alabama argillacea), enrollador de hojas de frutales (Archips argyrospila), arrollador de los brotes (Archips rosana), barrenador del arroz o barrenador del tallo de arroz (Chilo suppressalis), enrollador de las hojas de arroz (Cnaphalocrocis medinalis), gusano de la raíz del maíz (Crambus caliginosellus), oruga del césped (Crambus teterrellus), barrenador del maíz (Diatraea grandiosella), barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), oruga espinosa (Earias insulana), gusano moteado (Earias vittella), gusano cogollero (Helicoverpa armigera), gusano elotero, gusano del fruto o gusano de algodón (Helicoverpa zea), gusano tejedor del césped (Herpetogramma licarsisalis), polilla del racimo de la vid (Lobesia botrana), minador de hojas de los cítricos (Phyllocnistis citrella), oruga de la col (Pieris brassicae), mariposa blanca de la col o blanquita de la col (Pieris rapae), rosquilla negra o gusano negro (Spodoptera litura) y gusano minador del tomate (Tuta absoluta).
Históricamente, se dependía de la aplicación intensiva de insecticidas químicos sintéticos como agente de control de plagas en la agricultura. Las preocupaciones por el medioambiente y la salud humana, además de los problemas de nuevas resistencias, estimularon la investigación y desarrollo de pesticidas biológicos. Este esfuerzo de investigación llevó al descubrimiento y uso progresivo de diversas especies microbianas entomopatógenas, entre ellas bacterias.
El paradigma del control biológico cambió cuando se descubrió y se desarrolló el potencial de las bacterias entomopatógenas, especialmente las bacterias que pertenecen al género Bacillus, como un agente de control de plagas biológicas. Se han usado cepas de la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) como fuente de proteínas insecticidas, dado que se descubrió que las cepas de Bt presentan una toxicidad elevada contra insectos específicos. Se sabe que las cepas de Bt producen delta-endotoxinas que están localizadas dentro de cuerpos de inclusión cristalinos paraesporales al comienzo de la esporulación y durante la fase de crecimiento estacionario (por ejemplo, las proteínas Cry), y también se sabe que producen proteínas insecticidas secretadas. Cuando son ingeridas por un insecto susceptible, las delta-endotoxinas, así como las toxinas secretadas, ejercen sus efectos en la superficie del epitelio del intestino medio, rompiendo la membrana celular, lo cual lleva a la ruptura y muerte de las células. Los genes que codifican proteínas insecticidas también se han identificado en especies bacterianas que no son Bt, entre ellas otros Bacillus y una diversidad de otras especies bacterianas, tales como Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus ("Ls", conocida anteriormente como Bacillus sphaericus) y Paenibacillus popilliae.
Las toxinas proteicas insecticidas solubles secretadas y cristalinas son altamente específicas para sus hospedadores y han obtenido una aceptación mundial como alternativas a los insecticidas químicos. Por ejemplo, las proteínas toxina insecticidas se han empleado en diversas aplicaciones agrícolas para proteger plantas importantes desde el punto de vista agrícola de infestaciones de insectos, disminuir la necesidad de aplicaciones de pesticidas químicos y aumentar los rendimientos. Las proteínas toxina insecticidas se utilizan para controlar plagas importantes desde el punto de vista agrícola mediante procedimientos mecánicos, tales como pulverización para dispersar formulaciones microbianas que contienen diversas cepas bacterianas sobre la superficie de plantas, y mediante el uso de técnicas de transformación genética para producir plantas y semillas transgénicas que expresan proteínas toxinas insecticidas.
El uso de plantas transgénicas que expresan proteínas insecticidas se ha adoptado a nivel mundial. Por ejemplo, en 2012, se plantaron 26,1 millones de hectáreas con cultivos transgénicos que expresan toxinas de Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. Informe de ISAAA N.° 44). El uso mundial de cultivos transgénicos protegidos contra insectos y la cantidad limitada de proteínas insecticidas utilizadas en esos cultivos ha creado una presión de selección para alelos de insectos existentes que imparten resistencia a las proteínas insecticidas utilizadas actualmente.
El desarrollo de resistencia en las plagas diana a las proteínas insecticidas crea una necesidad continua de descubrir y desarrollar nuevas formas de proteínas insecticidas que sean útiles en el manejo del aumento de la resistencia de insectos a cultivos transgénicos que expresan proteínas insecticidas. Las proteínas insecticidas nuevas con eficacia mejorada y que presenten un control sobre un amplio espectro de especies de insecto susceptibles reducirá la cantidad de insectos sobrevivientes que puedan desarrollar alelos de resistencia. Además, el uso en una planta de dos o más proteínas insecticidas transgénicas tóxicas para la misma plaga de insectos y que presente modos diferentes de acción reduce la probabilidad de resistencia en cualquier especie de insecto diana individual.
Por consiguiente, existe una necesidad crucial de identificar proteínas insecticidas adicionales con propiedades insecticidas mejoradas, tales como eficacia contra un amplio espectro de especies de plagas de insectos diana y modos diferentes de acción en comparación con las toxinas empleadas actualmente en las prácticas agrícolas. Para satisfacer esta necesidad, la presente invención desvela proteínas insecticidas quiméricas Cry1 nuevas que presentan actividad contra especies de plagas de lepidópteros diana importantes.
Se conoce en la técnica que los miembros de la familia de proteínas cristalinas Cry1 presentan bioactividad contra plagas de lepidópteros. La forma precursora de las proteínas cristalinas Cry 1 consiste en dos segmentos de tamaño aproximadamente igual. La porción carboxi-terminal de la proteína precursora, conocida como segmento de protoxina, estabiliza la formación de cristales y no presenta actividad insecticida. La mitad del amino-terminal de la proteína precursora comprende el segmento de toxina de la proteína Cry1 y, basándose en el alineamiento de secuencias conservadas o sustancialmente conservadas dentro de los miembros de la familia Cry1, puede subdividirse adicionalmente en tres dominios estructurales, el dominio I, el dominio II y el dominio III. El dominio I comprende aproximadamente el primer tercio del segmento de toxina activa y se demostró que es esencial para la formación de canales. Los dominios II y III han sido ambos implicados en la unión al receptor y la especificidad de especie de insecto, dependiendo del insecto y de la proteína insecticida que se esté examinando.
La probabilidad de crear de manera arbitraria una proteína quimérica con propiedades potenciadas a partir de la distribución de las estructuras de dominio de las numerosas proteínas insecticidas naturales conocidas en la técnica es pequeña. Esto es el resultado de la naturaleza compleja de la estructura, la oligomerización y la activación (incluyendo el procesamiento proteolítico correcto del precursor quimérico, si se expresa en tal forma) de la proteína, necesarias para liberar un segmento de proteína insecticida. Solo mediante una selección cuidadosa de protoxinas y dianas específicas dentro de cada proteína parental para la creación de una estructura quimérica se pueden construir toxinas insecticidas quiméricas funcionales que presenten una actividad insecticida mejorada en comparación con las proteínas parentales de las que proceden las quimeras. Se conoce en la técnica que el reensamblaje de los dominios de protoxina y de toxina I, lI y III de cualesquiera dos o más toxinas que son diferentes entre sí, a menudo da como resultado la construcción de proteínas que presentan una formación cristalina defectuosa o la falta total de cualquier actividad insecticida detectable dirigida a una especie de plaga de insectos diana preferida. Solamente mediante ensayo y error se diseñan quimeras insecticidas eficaces, e incluso entonces el experto en la materia no está seguro de que logrará una quimera que presente una actividad insecticida que sea equivalente o esté mejorada en comparación con cualquier proteína toxina parental individual de la cual puedan proceder los dominios de toxina o protoxina constituyentes. Por ejemplo, la bibliografía informa numerosos ejemplos de la construcción o ensamblaje de proteínas quiméricas a partir de dos o más precursores de proteína cristalina. Véase, por ejemplo, Jacqueline S. Knight, y col. "A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains." J. Economic Entomology, 97 (6) (2004): 1805-1813; Bosch y col. (patente de Estados Unidos n.° 6.204.246); Malvar y Gilmer (patente de Estados Unidos n.° 6.017.534). Algunos estudios sugieren que la mutagénesis aleatoria y la selección de toxinas Cry utilizando técnicas de presentación en fagos y barajado de ADN deben utilizarse para modificar las proteínas Cry (Lucena y col. "Molecular Approaches to Mejorate the Insecticidal Activity of Bacillus thuringiensis Cry Toxins." Toxins, 6 (2014): 2393-2423). En cada uno de estos ejemplos, muchas de las quimeras resultantes no presentaron propiedades insecticidas o de formación de cristales que fueran equivalentes o mejoradas en comparación con las proteínas precursoras de la cuales procedían los componentes de las quimeras.
Sumario de la invención
Se proporcionan moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican proteínas insecticidas quiméricas tóxicas para especies de lepidópteros de plagas vegetales. Cada una de las proteínas insecticidas quiméricas puede utilizarse sola o en combinación entre sí y con otras proteínas insecticidas y agentes inhibidores de insectos en formulaciones y en la planta; proporcionando así alternativas a las proteínas insecticidas y productos químicos insecticidas actualmente en uso en los sistemas agrícolas.
En determinadas realizaciones, se desvela en el presente documento una proteína insecticida quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de la SEQ ID NO: 28. Esta proteína insecticida quimérica presenta actividad inhibidora contra una especie de insectos del orden Lepidoptera.
En otra realización, un polinucleótido que codifica una proteína insecticida quimérica que presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Lepidoptera, en el que el polinucleótido está unido operativamente a un promotor heterólogo y la proteína insecticida quimérica comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 28. Un polinucleótido que codifica una proteína insecticida quimérica que presenta actividad inhibidora contra una especie de insectos del orden Lepidoptera, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que se expone en la SEQ ID NO: 27; o codifica la proteína insecticida quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 28.
En otras realizaciones, en el presente documento se desvela una célula hospedadora que comprende el polinucleótido que codifica una proteína insecticida quimérica que presenta actividad inhibidora contra una especie de insectos del orden Lepidoptera, en el que dicho polinucleótido comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27, en la que la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en una célula hospedadora bacteriana y una célula hospedadora vegetal.
Otras realizaciones desveladas en el presente documento incluyen composiciones inhibidoras de insectos que comprenden una proteína insecticida quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 28. En determinadas realizaciones, la composición inhibidora de insectos comprende además al menos un agente inhibidor de insectos distinto de la proteína insecticida quimérica.
En otra realización más, en el presente documento se desvela una semilla que comprende una cantidad eficaz inhibidora de insectos de: una proteína insecticida quimérica que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 28; o un polinucleótido como se expone en la SEQ ID NO: 27.
Además, se contemplan procedimientos de control de una plaga de lepidóptero que comprenden poner en contacto la plaga de lepidóptero con una cantidad inhibidora de una proteína insecticida quimérica de la invención.
En otra realización, en el presente documento se desvela una célula vegetal, planta o parte de planta transgénica que comprende una proteína insecticida quimérica, en la que: la proteína insecticida quimérica comprende la SEQ ID NO: 28 y presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden de los lepidópteros. Además, se contemplan procedimiento de control de una plaga de lepidóptero que comprenden exponer la plaga a esta célula vegetal, planta o parte de planta transgénica, en la que dicha célula vegetal, planta o parte de planta expresa una cantidad inhibidora de lepidópteros de la proteína insecticida quimérica.
Además, se contemplan en el presente documento moléculas de polinucleótidos recombinantes que codifican una proteína insecticida quimérica, que comprenden una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27.
Otra molécula de ácido nucleico recombinante contemplada en el presente documento comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un segmento de polinucleótido que codifica una proteína insecticida quimérica que presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Lepidoptera, en la que la proteína insecticida quimérica comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 28.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC1100 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC1100 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC1100 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de TIC1100.
La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC860 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC860 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de TIC860.
La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC867 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 9 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC867 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de TIC867.
La SEQ ID NO: 11 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC867_20 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 12 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC867_20 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos de TIC867_20.
La SEQ ID NO: 14 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC867_21 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC867_21 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de TIC867_21.
La SEQ ID NO: 17 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC867_22 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 18 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC867_22 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoácidos de TIC867_22.
La SEQ ID NO: 20 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC867_23 para la expresión en la célula vegetal.
La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de TIC867_23.
La SEQ ID NO: 22 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC867_24 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de TIC867_24.
La SEQ ID NO: 24 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC867_24 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos de TIC867_25.
La SEQ ID NO: 26 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC868 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 27 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC868 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos de TIC868.
La SEQ ID NO: 29 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC868_9 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos de TIC868_9.
La SEQ ID NO: 31 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC868_10 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 32 es una secuencia de ADN sintética para la expresión en la célula vegetal que codifica la variante de TIC868, TIC868_10.
La SEQ ID NO: 33 es la secuencia de aminoácidos de TIC868_10.
La SEQ ID NO: 34 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC868_11 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 35 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC868_11 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 36 es la secuencia de aminoácidos de TIC868_11.
La SEQ ID NO: 37 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC868_12 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 38 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC868_12 para la expresión en la célula vegetal.
La SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoácidos de TIC868_12.
La SEQ ID NO: 40 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC868_13 para la expresión en la célula vegetal.
La SEQ ID NO: 41 es la secuencia de aminoácidos de TIC868_13.
La SEQ ID NO: 42 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC868_14 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 43 es la secuencia de aminoácidos de TIC868_14.
La SEQ ID NO: 44 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC868_15 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 45 es la secuencia de aminoácidos de TIC868_15.
La SEQ ID NO: 46 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC86829 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 47 es la secuencia de aminoácidos de TIC868_29.
La SEQ ID NO: 48 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC869 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 49 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC869 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 50 es la secuencia de aminoácidos de TIC869.
La SEQ ID NO: 51 es una secuencia de ADN recombinante que codifica TIC836 utilizada para la expresión en una célula bacteriana.
La SEQ ID NO: 52 es una secuencia de ADN sintética que codifica TIC836 para la expresión en una célula vegetal.
La SEQ ID NO: 53 es la secuencia de aminoácidos de TIC836.
Descripción detallada de la invención
El problema en la técnica del control de plagas agrícolas puede caracterizarse como la necesidad de nuevas proteínas insecticidas que sean eficaces contra plagas diana, que presenten un espectro amplio de toxicidad contra especies de plagas diana, que tenga la capacidad de expresarse en plantas sin provocar problemas agronómicos no deseados y que proporcionen un modo alternativo de acción en comparación con las toxinas actuales que se utilizan comercialmente en plantas. Se desvelan en el presente documento nuevas proteínas insecticidas quiméricas, y se aborda cada una de estas necesidades, particularmente contra un amplio espectro de plagas de insectos lepidópteros.
Para evitar el desarrollo o sortear la resistencia de insectos contra las proteínas insecticidas utilizadas actualmente, para el control de lepidópteros se necesitan nuevas proteínas insecticidas con modos de acción (MDA) diferentes, así como un espectro y eficacia amplios. Una forma de abordar esta necesidad es descubrir nuevas proteínas insecticidas a partir de fuentes biológicas distintas, preferentemente de bacterias, hongos o plantas. Otra estrategia es intercambiar segmentos entre diversas proteínas de Bt que presenten similitudes estructurales para crear proteínas de Bt quiméricas nuevas que tengan propiedades inhibidoras de insectos. Se conoce en la técnica que la probabilidad de crear una proteína quimérica con propiedades potenciadas a partir de la redistribución de estructuras de dominio de las numerosas proteínas cristalinas insecticidas naturales conocidas en la técnica es pequeña. Véase, por ejemplo, Jacqueline S. Knight, y col. "A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains.” J. Economic Entomology, 97 (6) (2004): 1805-1813.
Se desvelan en el presente documento secuencias de moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican nuevas proteínas insecticidas quiméricas. Estas proteínas insecticidas abordan la necesidad continua en la técnica de diseñar técnicamente proteínas insecticidas tóxicas adicionales con propiedades insecticidas mejoradas, tales como una eficacia aumentada contra un amplio espectro de especies de plagas de insectos diana y modos de acción diferentes. Los miembros de este grupo de proteínas, que incluye las proteínas de ejemplo descritas en el presente documento, presentan actividad insecticida contra especies de plagas de insectos lepidópteros.
El término "segmento” o "fragmento” se utiliza en la presente solicitud para describir secuencias consecutivas de aminoácidos o de ácido nucleico que son más cortas que la secuencia completa de aminoácidos o de ácido nucleico que describe una proteína insecticida quimérica desvelada. Un segmento o fragmento que presenta una actividad inhibidora de insectos también se desvela en la presente solicitud si el alineamiento de tal segmento o fragmento con la sección correspondiente de la proteína insecticida quimérica da como resultado una identidad de secuencia de aminoácidos de cualquier fracción porcentual de aproximadamente el 65 a aproximadamente el 100 por ciento entre el segmento o fragmento y la sección correspondiente de la proteína insecticida quimérica.
La referencia en la presente solicitud a los términos y expresiones "activo” o "actividad”, "actividad pesticida” o "pesticida”, o "actividad insecticida”, "inhibidor de insectos” o "insecticida” se refiere a la eficacia de un agente tóxico, tal como una proteína insecticida, para inhibir (inhibir el crecimiento, la alimentación, fecundidad o viabilidad), suprimir (suprimir el crecimiento, alimentación, fecundidad o viabilidad), controlar (controlar la infestación de plagas, controlar las actividades de alimentación de las plagas en un cultivo en particular que contiene una cantidad eficaz de la proteína insecticida) o matar (producir la morbilidad, mortalidad o la fecundidad reducida de) una plaga. Se pretende que estos términos incluyan el resultado de proporcionar una cantidad eficaz como pesticida de una proteína insecticida a una plaga, donde la exposición de la plaga a la proteína insecticida da como resultado la morbilidad, mortalidad, fecundidad reducida o retraso del desarrollo. Estos términos también incluyen la repulsión de la plaga de la planta, un tejido de planta, una parte de planta, semillas, células vegetales o de una ubicación geográfica en particular donde la planta puede estar creciendo, como resultado de proporcionar una cantidad eficaz como pesticida de la proteína insecticida en o sobre la planta. En general, la actividad insecticida se refiere a la capacidad de una proteína insecticida de ser eficaz para inhibir el crecimiento, desarrollo, viabilidad, comportamiento de alimentación, comportamiento de apareamiento, fecundidad o cualquier disminución medible en los efectos adversos provocados por un insecto que se alimenta de esa proteína, fragmento de proteína, segmento de proteína o polinucleótido, de una plaga diana particular, inclusive, pero sin limitación, insectos del orden Lepidoptera. La proteína insecticida puede ser producida por la planta o puede aplicarse a la planta o al entorno dentro de la ubicación donde se encuentra la planta. Los términos "bioactividad”, "eficaz”, "efectivo” o variaciones de los mismos también son términos intercambiables utilizados en la presente solicitud para describir los efectos de las proteínas insecticidas quiméricas de la presente invención sobre plagas de insectos diana.
Una cantidad eficaz como insecticida de un agente tóxico, cuando se proporciona a la dieta de una plaga diana, presenta actividad pesticida cuando el agente tóxico entra en contacto con la plaga. Un agente tóxico puede ser una proteína insecticida o uno o más agentes químicos conocidos en la técnica. Los agentes químicos insecticidas y los agentes proteicos insecticidas pueden utilizarse solos o en combinaciones entre sí. Los agentes químicos incluyen, pero sin limitación, moléculas de ARNbc que se dirigen a genes específicos para la supresión en una plaga diana, organocloruros, organofosfatos, carbamatos, piretroides, neonicotinoides y rianoides. Los agentes proteicos insecticidas incluyen las proteínas insecticidas quiméricas expuestas en la presente solicitud, así como otros agentes tóxicos proteináceos que incluyen los que se dirigen a especies de plagas de lepidópteros, así como toxinas proteicas que se utilizan para controlar otras plagas vegetales, tales como proteínas Cry disponibles en la técnica para su uso para el control de especies de coleópteros, tisanópteros, hemípteros y homópteros.
Se pretende que la referencia a una plaga, particularmente una plaga de una planta de cultivo signifique plagas de insectos de plantas de cultivo, particularmente las plagas de insectos lepidópteros que se controlan mediante las proteínas insecticidas quiméricas desveladas. Sin embargo, la referencia a una plaga también puede incluir plagas de insectos coleópteros, hemípteros y homópteros de plantas, así como nematodos y hongos cuando los agentes tóxicos que se dirigen a estas plagas colocalizan o se presentan junto con la proteína insecticida quimérica, o una proteína que sea del 65 a alrededor del 100 por ciento idéntica a la proteína insecticida quimérica.
Las proteínas insecticidas quiméricas desveladas en el presente documento presentan actividad insecticida contra plagas de insectos de especies de insectos lepidópteros, incluyendo adultos, pupas, larvas y neonatos, así como especies de insectos hemípteros, incluyendo adultos y ninfas. Los insectos del orden Lepidoptera incluyen, pero sin limitación, cogolleros, cortadores, medidores y polillas de la familia Noctuidae, por ejemplo, gusano cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), guardama de la remolacha (Spodoptera exigua), gusano de las crucíferas (Mamestra configurata), gusano cortador grasiento (Agrotis Ípsilon), gusano falso medidor (Trichoplusia ni), lagarta verde (Pseudoplusia includens), oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), gusano verde de la soja (Hypena scabra), gusano bellotero del tabaco (Heliothis virescens), gusano trozador (Agrotis subterranea), oruga militar verdadera (Pseudaletia unipuncta), gusano cortador pálido del oeste (Agrotis orthogonia); barrenadores, bichos canasto, tejedores, gusanos de las piñas, gusanos de la col y esqueletizadores de la familia Pyralidae, por ejemplo, taladro del maíz (Ostrinia nubilalis), gusano de la naranja navel (Amyelois transitella), gusano de la raíz del maíz (Crambus caliginosellus), gusano tejedor del césped (Herpetogramma licarsisalis), palomilla de la cabezuela (Homoeosoma electellum), barrenador menor del tallo del maíz (Elasmopalpus lignosellus); enrolladores de hojas, gusanos belloteros, gusanos de las semillas y gusanos de las frutas de la familia Tortricidae por ejemplo, polilla del manzano (Cydia pomonella), polilla de la uva (Endopiza viteana), polilla oriental del melocotonero (Grapholita molesta), polilla de la yema del girasol (Suleima helianthana) y muchos otros lepidópteros económicamente importantes, por ejemplo, palomilla de las coles (Plutella xylostella), gusano rosado (Pectinophora gossypiella) y polilla gitana (Lymantria dispar). Otras plagas de insectos del orden Lepidoptera incluyen, por ejemplo, Alabama argillacea (gusano medidor de la hoja del algodonero), Archips argyrospila (enrollador de hojas de frutales), Archips rosana (enrollador de los brotes) y otras especies de Archips, Chilo suppressalis (barrenador del arroz o barrenador del tallo del arroz), Cnaphalocrocis medinalis (enrollador de las hojas de arroz), Crambus caliginosellus (gusano de la raíz del maíz), Crambus teterrellus (oruga del césped), Diatraea grandiosella (barrenador del maíz), Diatraea saccharalis (barrenador de la caña de azúcar), Earias insulana (oruga espinosa), Earias vittella (gusano moteado), Helicoverpa armigera (gusano cogollero), Helicoverpa zea (gusano elotero o gusano del fruto), Heliothis virescens (gusano bellotero del tabaco), Herpetogramma licarsisalis (gusano tejedor del césped), Lobesia botrana (polilla del racimo de la vid), Phyllocnistis citrella (minador de hojas de los cítricos), Pieris brassicae (oruga de la col), Pieris rapae (mariposa blanca de la col o blanquita de la col), Plutella xylostella (palomilla de las coles), Spodoptera exigua (gusano soldado de la remolacha), Spodoptera litura (rosquilla negra o gusano negro) y Tuta absoluta (gusano minador del tomate).
Se pretende que la referencia en la presente solicitud a una "molécula aislada de ADN”, o una frase o término equivalente, signifique que la molécula de ADN es una que está presente sola o en combinación con otras composiciones, pero no está en su entorno natural. Por ejemplo, los elementos de ácido nucleico, tales como una secuencia codificante, una secuencia intrónica, una secuencia líder no traducida, una secuencia promotora, una secuencia de terminación transcripcional y similares, que se encuentran naturalmente dentro del a Dn del genoma de un organismo no se consideran "aislados”, siempre y cuando el elemento esté dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en la que se encuentra naturalmente. Sin embargo, cada uno de estos elementos y subpartes de estos elementos podrían estar "aislados” dentro del ámbito de la divulgación, siempre que el elemento no esté dentro del genoma del organismo ni en la ubicación dentro del genoma en la cual se encuentra naturalmente. De manera similar, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida o cualquier variante insecticida de origen natural de la proteína podría ser una secuencia de nucleótidos aislada siempre que la secuencia de nucleótidos no esté dentro del ADN de la bacteria en la cual la secuencia que codifica la proteína se encuentra naturalmente. Una secuencia sintética de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína insecticida de origen natural se podría considerar aislada a los fines de la presente divulgación. A los fines de la presente divulgación, cualquier secuencia transgénica de nucleótidos, es decir, la secuencia de nucleótidos del ADN insertado en el genoma de las células de una planta o bacteria, o presente en un vector extracromosómico, se podría considerar una secuencia aislada de nucleótidos ya sea que esté presente dentro del plásmido o estructura similar utilizada para transformar las células, dentro del genoma de la planta o bacteria, o presente en cantidades detectables en tejidos, progenie, muestras biológicas o productos de materia prima procedentes de la planta o bacteria.
Como se describe adicionalmente en los Ejemplos, a través de un esfuerzo de quimeragénesis, se construyeron aproximadamente ochocientos cuarenta y cuatro (844) secuencias de nucleótidos que codifican proteínas insecticidas quiméricas a partir de dominios de protoxina y toxina de toxinas insecticidas conocidas (denominadas en el presente documento como las "proteínas parentales”) y se expresaron y analizaron en un bioensayo para la actividad en lepidópteros. Una cantidad pequeña de las proteínas insecticidas quiméricas construidas presentó una actividad contra lepidópteros mejorada o un espectro de lepidópteros potenciado en comparación con las proteínas parentales de las cuales sus componentes de toxina se obtuvieron.
Estas proteínas insecticidas quiméricas nuevas con actividad contra lepidópteros mejorada o un espectro de lepidópteros potenciado se construyeron a partir de los siguientes dominios de toxina y protoxina de proteína insecticida parental: CryIAh (Dominio I), Cry1Bb1 (Dominios I y II), Cry 1Be2 (Dominios I y II), Cry1Ja1 (Dominios I y II), Cry1Fa1 (Dominios I y II), Cry1Ac (Dominio II y protoxina), Cry1Ca (Dominio III y protoxina), Cry1Ka (Dominio III y protoxina), CryIJx (Dominio III), Cry1Ab (Dominio III), Cry1Ab3 (protoxina), Cry1Da1 (protoxina), Cry4 (protoxina), Cry9 (protoxina), Cry1Be (protoxina) y Cry1Ka (protoxina).
Específicamente, las proteínas insecticidas quiméricas con actividad contra lepidópteros mejorada o un espectro de lepidópteros potenciado, comprenden las siguientes combinaciones de dominio y protoxina: TIC1100/SEQ ID NO: 4 (Dominio I-Cry1Ah, Dominio II-CryIAc, Dominio III-Cry1Ca, Protoxina-CryIAc), TIC860/SEQ ID NO: 7 (Dominio I-Cry1Bb1, Dominio II-Cry1BB1, Dominio III- Cry1Ca, Protoxina- CryIAc), TIC867/SEQ ID NO: 10 (Dominio I- CryIBe2, Dominio II- CryIBe2, Dominio III-Cry1Ka, Protoxina- CryIAb3), TIC868/SEQ ID NO: 28 (Dominio I- CryIBe2, Dominio II-Cry1Be2 y Dominio III- Cry1Ca, Protoxina- Cry1Ab3), TIC869/SEQ ID NO: 50 (Dominio I-Cry1Ja1, Dominio II-Cry1Ja1, Dominio III- Cry1Jx, Protoxina-Cry1Ab3) y TIC836/SEQ ID NO: 53 (Dominio I-Cry1Fa1, Dominio II-Cry1Fa1, Dominio III- Cry1Ab, Protoxina-Cry1Ac).
Las variantes en las cuales se introdujeron sustituciones de aminoácidos o dominios alternativos de protoxina también se construyeron para las proteínas insecticidas quiméricas TIC867 y TIC868. Específicamente, estas variantes de TIC867 y TIC868 comprenden las siguientes sustituciones de aminoácidos o dominios de protoxina alternativos: TIC867_20/SEQ ID NO: 13 (dominio de protoxina alternativo Cry1Da1), TIC867_21/SEQ ID NO: 16 (dominio de protoxina alternativo Cry4), TIC867_22/SEQ ID NO: 19 (dominio de protoxina alternativo Cry9), T iC867_23/s Eq ID NO: 21 (dominio de protoxina alternativo Cry1Be), TIC867_24/SEQ ID NO: 23 (dominio de protoxina alternativo CryIKa), TIC867_25/SEQ ID NO: 25 (dominio de protoxina alternativo CryIKa), TIC868_9/SEQ ID NO: 30 (modificación de aminoácidos N240S_Y343Q_N349T), TIC868_10/SEQ ID NO: 33 (dominio de protoxina alternativo Cry1Da1), TIC868_11/SEQ ID NO: 36 (dominio de protoxina alternativo Cry4), TIC868_12/SEQ ID NO: 39 (dominio de protoxina alternativo Cry 9), TIC868_13/SEQ ID NO: 41 (dominio de protoxina alternativo Cry1Be), TlC868_14/SEQ ID NO: 43 (dominio de protoxina alternativo CryIKa), TIC868_15/SEQ ID NO: 45 (dominio de protoxina alternativo Cry1Ca), y TIC868_29/SEQ ID NO: 47 (modificación de aminoácidos Q136Y_Y343Q_N349T).
Como se demuestra en los Ejemplos, cada una de estas variantes de TIC867 y TIC868 alteró la actividad contra lepidópteros y/o redujo el espectro de actividad de lepidópteros de la proteína insecticida quimérica parental, indicando así que el dominio de protoxina alternativo y las sustituciones de aminoácidos tuvieron una consecuencia directa sobre la actividad insecticida y el espectro de las proteínas insecticidas quiméricas TIC867 y TIC868.
Muchas de las proteínas insecticidas quiméricas demostraron actividad insecticida contra múltiples especies de plagas de insectos lepidópteros. Específicamente, las nuevas proteínas insecticidas quiméricas desveladas en la presente solicitud presentaron actividad contra una o más de las siguientes plagas de insectos lepidópteros, oruga de las leguminosas (VBC, forma siglada de Velvet bean Caterpillar, Anticarsia gemmatalis), barrenador de la caña de azúcar (SCB, forma siglada de Sugarcane borer, Diatraea saccharalis), barrenador menor del tallo del maíz (LSCB, forma siglada de Lesser cornstalk borer, Elasmopalpus lignosellus), gusano elotero (CEW, forma siglada de Corn earworm, Helicoverpa zea), gusano de la vaina de la soja (SPW, forma siglada de Soybean pod worm, Helicoverpa zea), gusano de algodón (CBW, forma siglada Cotton bollworm, de Helicoverpa zea), gusano bellotero del tabaco (TBW, forma siglada de Tobacco budworm, Heliothis virescens), lagarta verde (SBL, forma siglada de Soybean looper, Chrysodeixis includens), gusano soldado africano (BLAW, forma siglada de Black armyworm, Spodoptera cosmioides), gusano meridional (SAW, forma siglada de Southern armyworm, Spodoptera eridania), gusano cogollero del maíz (FAW, forma siglada de Fall armyworm, Spodoptera frugiperda), guardama de la remolacha (BAW, forma siglada de Beet armyworm, Spodoptera exigua), gusano cogollero (OBW, forma siglada de Old World bollworm, Helicoverpa armigera), rosquilla negra (OLW, forma siglada de Oriental leafworm, Spodoptera litura), gusano rosado (PBW, forma siglada de Pink bollworm, Pectinophora gossypiella), barrenador del maíz (SWCB, forma siglada de Southwestern Corn Borer, Diatraea grandiosella), gusano moteado (SBW, forma siglada de Spotted bollworm, Earias vitella), gusano cogollero (SABW, forma siglada de American bollworm, Helicoverpa gelotopeon) y oruga medidora (SFL, forma siglada de Sunflower looper, Rachiplusia nu). Por lo tanto, las proteínas de ejemplo descritas en la presente solicitud se relacionan mediante la función común y presentan actividad insecticida contra plagas de insectos de especies de insectos de Lepidoptera, incluyendo adultos, larvas y pupas.
Las proteínas que se asemejan a proteínas insecticidas quiméricas pueden identificarse mediante comparación entre sí, utilizando diversos algoritmos informáticos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las identidades de secuencia de aminoácidos de proteínas relacionadas con las proteínas insecticidas quiméricas pueden analizarse utilizando un alineamiento Clustal W utilizando los siguientes parámetros predeterminados: Matriz de peso: blosum, penalización por abertura de hueco: 10,0, Penalización por extensión de hueco: 0,05, Huecos hidrófilos: Activado, Restos hidrófilos: GPSNDQERK, Penalizaciones por huecos específicos de restos: Activado (Thompson, y col. (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). El porcentaje de identidad de aminoácidos se calcula adicionalmente mediante el producto de 100% multiplicado por (identidades de aminoácidos/longitud de la proteína objeto). También están disponibles en la técnica otros algoritmos de alineamiento, estos proporcionan resultados similares a los obtenidos utilizando el alineamiento Clustal W y se contemplan en la presente solicitud.
Se pretende que una proteína de consulta que presente actividad inhibidora de insectos se desvele en la presente solicitud si el alineamiento de tal proteína de consulta con las proteínas insecticidas quiméricas objeto expuestas en las SEQ ID NO: 4, 7, 10, 13, 16, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 33, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 50 y 53 y dan como resultado una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o aproximadamente el 100% (o cualquier fracción porcentual es este intervalo) entre la proteína de consulta y la objeto.
Como se describe adicionalmente en los Ejemplos de la presente solicitud, las secuencias sintéticas o artificiales que codifican las proteínas insecticidas quiméricas se diseñaron para su uso en plantas. Las secuencias sintéticas de nucleótidos de ejemplo que se diseñaron para su uso en plantas se exponen en las SEQ ID NO: 2 y 3 (TIC1100), SEQ ID NO: 6 (TIC860), SEQ ID NO: 9 (TIC867), SEQ ID NO: 12 (TIC867_20), SEQ ID NO: 15 (TIC867_21), SEQ ID NO: 18 (TIC867_22), SEQ ID NO: 20 (TIC867_23), SEQ ID NO: 22 (TIC867_24), SEQ ID NO: 24 (TIC867_25), SEQ ID NO: 27 (TIC868), SEQ ID NO: 29 (TIC868_9), SEQ ID NO: 32 (TIC868_10), SEQ ID NO: 35 (TIC868_11), SEQ ID NO: 38 (TIC868_12), SEQ ID NO: 40 (TIC868_13), SEQ ID NO: 42 (TIC868_14), SEQ ID NO: 44 (TIC868_15), SEQ ID NO: 46 (TIC868_29), SEQ ID NO: 49 (TIC869) y SEQ ID NO: 52 (TIC836).
Para la expresión en células vegetales, las proteínas insecticidas quiméricas pueden expresarse para residir en el citosol o dirigirse a diversos orgánulos de la célula vegetal. Por ejemplo, dirigir una proteína al cloroplasto puede dar como resultado un aumento en los niveles de proteína expresada en una planta transgénica, a la vez que previene la aparición de fenotipos inespecíficos. El direccionamiento también puede dar como resultado una eficacia de resistencia a las plagas aumentada en el evento transgénico. Un péptido diana o péptido de tránsito es una cadena peptídica corta (3-70 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte de una proteína a una región específica en la célula, incluyendo el núcleo, mitocondria, retículo endoplásmico (RE), cloroplasto, apoplasto, peroxisoma y membrana plasmática. Algunos péptidos diana se escinden de la proteína mediante peptidasas de señal luego de transportar las proteínas. Para dirigirse al cloroplasto, las proteínas contienen péptidos de tránsito que tienen alrededor de 40-50 aminoácidos. Para descripciones del uso de péptidos de tránsito a cloroplastos, véanse las patentes de Estados Unidos n.° 5.188.642 y 5.728.925. Muchas de las proteínas localizadas en cloroplastos se expresan a partir de genes nucleares como precursores y se dirigen al cloroplasto mediante un péptido de tránsito a cloroplastos (CTP, forma siglada de chloroplast transit peptide). Los ejemplos de tales proteínas de cloroplasto aisladas incluyen, pero sin limitación, las asociadas con la subunidad pequeña (SSU, forma siglada de small subunit) de ribulosa-1,5,-bisfosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, la proteína I y proteína II del complejo captador de luz, tiorredoxina F, enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS, forma siglada de enolpyruvyl shikimate phosphate synthase), y los péptidos de tránsito descritos en la patente de Estados Unidos n.° 7.193.133. Se ha demostrado in vivo e in vitro que las proteínas que no son de cloroplasto pueden direccionarse al cloroplasto mediante el uso de fusiones de proteínas con un CTP heterólogo, y que el CTP es suficiente para dirigir una proteína hacia al cloroplasto. Se ha observado que la incorporación de un péptido de tránsito a cloroplastos adecuado, tal como CTP de EPSPS (CTP2) de Arabidopsis thaliana (véase, Klee y col., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) o CTP de EPSPS (CTP4) de Petunia hybrida (véase della-Cioppa y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986) dirige secuencias de la proteína EPSPS heterólogas a los cloroplastos en plantas transgénicas (véanse las patentes de Estados Unidos n.° 5.627.061; 5.633.435 y 5.312.910; y documentos EP 0218571; EP 189707; EP 508909 y EP 924299). Para dirigir las proteínas insecticidas quiméricas hacia el cloroplasto, una secuencia que codifica un péptido de tránsito a cloroplastos se coloca 5' unido operativamente y en marco de una secuencia codificante sintética que codifica la proteína insecticida quimérica que se diseñó para la expresión óptima en células vegetales.
Los vectores y casetes de expresión que contienen estas secuencias de nucleótidos artificiales o sintéticas se construyeron e introdujeron en células vegetales de maíz, algodón y soja, en conformidad con procedimientos y técnicas de transformación que son conocidas en la técnica. Las células transformadas se regeneraron en plantas transformadas, que se observó que expresaban la proteína insecticida quimérica. Para probar la actividad pesticida, se realizaron bioensayos en presencia de larvas de plagas de lepidópteros utilizando discos de hojas de plantas obtenidos de las plantas transformadas. Se contemplan composiciones de moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican proteínas insecticidas quiméricas. Por ejemplo, las proteínas insecticidas quiméricas pueden expresarse con construcciones de ADN recombinante en las cuales una molécula de polinucleótido con un ORF que codifica una proteína insecticida quimérica está unida operativamente a elementos de expresión genética, tal como un promotor, y cualquier otro elemento regulador necesario para la expresión en el sistema para el cual está destinada la construcción. Los ejemplos no limitantes incluyen un promotor funcional vegetal unido operativamente a las secuencias sintéticas que codifican la proteína insecticida quimérica para la expresión de la proteína insecticida quimérica en plantas o un promotor funcional de Bt unido operativamente a una secuencia que codifica una proteína insecticida quimérica para la expresión de la proteína en una bacteria Bt u otra especie de Bacillus. Otros elementos pueden estar unidos operativamente a las secuencias que codifican proteínas insecticidas quiméricas, incluyendo, pero sin limitación, potenciadores, intrones, líderes no traducidos, etiquetas de inmovilización de proteínas codificadas (etiqueta de HIS), péptidos de translocación (es decir, péptidos de tránsito a plástidos, péptidos señal), secuencias de polipéptidos para enzimas de modificación postraduccional, sitios de unión al ribosoma y sitios de direccionamiento de ARNi.
Las moléculas de polinucleótidos recombinantes de ejemplo proporcionadas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, un promotor heterólogo unido operativamente a un polinucleótido, tal como las SEQ ID NO: 1, 2,
3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 51 y 52, que codifica el polipéptido o proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 4 (TIC1100), 7 (TIC860), 10 (TIC867), 13 (TIC867_20), 16 (TIC867_21), 19 (TIC867_22), 21 (TIC867_23), 23 (TIC867_24), 25 (TIC867_25), 28 (TIC868), 30 (TIC868_9), 33 (TIC868_10), 36 (TIC868_11), 39 (TIC867_12), 41 (TIC867_13), 43 (TIC867_14), 45 (TIC867_15), 47 (TIC867_29), 50 (TIC869) y 53 (TIC836). Un promotor heterólogo también puede estar unido operativamente a secuencias codificantes de ADN sintéticas que codifican una proteína insecticida quimérica dirigida a plástidos y una proteína insecticida quimérica no dirigida. Se contempla que los codones de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína insecticida quimérica desvelada en el presente documento pueden sustituirse por codones sinónimos (conocido en técnica como sustitución silenciosa).
Una construcción o molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia que codifica una proteína insecticida quimérica puede comprender además una región de ADN que codifique uno o más agentes tóxicos que pueden configurarse para expresarse o coexpresarse de forma conjunta con una secuencia de ADN que codifica una proteína insecticida quimérica, una proteína distinta de una proteína insecticida quimérica, una molécula de ARNdc inhibidora de insectos o una proteína auxiliar. Las proteínas auxiliares incluyen, pero sin limitación, cofactores, enzimas, compañeros de unión u otros agentes que actúan contribuyendo a la eficacia de un agente inhibidor de insectos, por ejemplo, al contribuir a su expresión, al influir en su estabilidad en plantas, al optimizar la energía libre para la oligomerización, al incrementar su toxicidad y al aumentar su espectro de actividad. Una proteína auxiliar puede, por ejemplo, facilitar la captación de uno o más agentes inhibidores de insectos o potenciar los efectos tóxicos del agente tóxico.
Una molécula o construcción de ADN recombinante puede ensamblarse de forma que todas las proteínas o moléculas de ARNbc se expresen a partir de un promotor o que cada proteína o molécula de ARNdc esté bajo el control de promotores distintos, o una combinación de los mismos. Las proteínas de la presente invención pueden expresarse a partir de un sistema de expresión multigénico en el cual una proteína insecticida quimérica se expresa a partir de un segmento de nucleótidos común que también contiene otros promotores y marcos de lectura abiertos, dependiendo del tipo de sistema de expresión seleccionado. Por ejemplo, un sistema de expresión multigénico bacteriano puede utilizar un único promotor para dirigir la expresión de marcos de lectura abiertos unidos de forma múltiple/en tándem del interior de un único operón (es decir, expresión policistrónica). En otro ejemplo, un sistema de expresión multigénico vegetal puede utilizar casetes de expresión no unidos de forma múltiple, expresando cada uno una proteína distinta u otro agente tóxico, tal como una o más moléculas de ARNbc.
Las moléculas de ácido nucleico recombinante o construcciones de ADN recombinante que comprenden una secuencia que codifica una proteína quimérica insecticida pueden suministrarse a las células hospedadoras mediante vectores, por ejemplo, un plásmido, baculovirus, cromosoma sintético, virión, cósmido, fagómido, fago o vector vírico. Dichos vectores pueden utilizarse para lograr la expresión estable o transitoria de una secuencia que codifica una proteína insecticida quimérica en una célula hospedadora, o la expresión posterior del polipéptido codificado. Un polinucleótido recombinante exógeno o construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia que codifica una proteína insecticida quimérica y que se introduce en una célula hospedadora se denomina en el presente documento "transgén”.
Se proporcionan en el presente documento bacterias transgénicas, células vegetales transgénicas, plantas transgénicas y partes de plantas transgénicas que contienen un polinucleótido que codifica una o más de las proteínas insecticidas quiméricas. La expresión "célula bacteriana” o "bacteria” puede incluir, pero sin limitación, una célula de Agrobacterium, una de Bacillus, una de Escherichia, una de Salmonella, una de Pseudomonas o una de Rhizobium. La expresión "célula vegetal” o "planta” puede incluir, pero sin limitación, una célula dicotiledónea o una célula monocotiledónea. Las plantas y células vegetales contempladas incluyen, pero sin limitación, una célula vegetal o planta de alfalfa, banana, cebada, judías, brócoli, col, Brassica, zanahoria, yuca, ricino, coliflor, apio, garbanzo, col china, cítrico, coco, café, maíz, trébol, algodón, una cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berenjena, eucalipto, lino, ajo, uva, lúpulo, puerro, lechuga, pino taeda, mijo, melones, nuez, avena, aceituna, cebolla, ornamental, palma, pastos, guisante, maní, pimiento, guandú, pino, patata, álamo, zapallo, pino de Monterrey, rábano, semilla de colza, arroz, portainjertos, centeno, cártamo, arbusto, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, mazorca, liquidámbar, boniato, pasto varilla, té, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía y trigo. En determinadas realizaciones, se proporcionan plantas transgénicas y partes de plantas transgénicas regeneradas a partir de una célula vegetal transgénica. En determinadas realizaciones, las plantas transgénicas pueden obtenerse a partir de una semilla transgénica al cortar, quebrar, moler o disociar de otra forma la parte de la planta. En determinadas realizaciones, la parte de la planta puede ser una semilla, una cápsula, una hoja, una flor, un tallo, una raíz o cualquier porción de los mismos, o una porción no regenerable de una parte de planta transgénica. Como se usa en este contexto, una porción "no regenerable" de una parte de planta transgénica es una porción que no puede inducirse para formar una planta completa o que no puede inducirse para formar una planta completa que sea capaz de reproducción sexual y/o asexuada. En determinadas realizaciones, una porción no regenerable de una parte de planta es una porción de una semilla, cápsula, hoja, flor, tallo o raíz transgénica.
Se proporcionan procedimientos para fabricar plantas transgénicas que comprenden cantidades inhibidoras de Lepidoptera de una proteína insecticida quimérica. Dichas plantas pueden fabricarse mediante la introducción de un polinucleótido que codifica las proteínas insecticidas quiméricas proporcionadas en la presente solicitud en una célula vegetal y la selección de una planta obtenida de dicha célula vegetal que expresa una cantidad inhibidora de Lepidoptera o de insectos de la proteína insecticida quimérica. Las plantas pueden obtenerse de las células vegetales mediante regeneración, semillas, polen o técnicas de transformación de meristema. Se conocen en la técnica procedimientos de transformación de plantas. Por ejemplo, en las publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos 2009/0138985A1 (soja), 2008/0280361A1 (soja), 2009/0142837A1 (maíz), 2008/0282432 (algodón) y 2008/0256667 (algodón) se describe la transformación mediada por Agrobacterium.
Las plantas que expresan las proteínas insecticidas quiméricas pueden cruzarse mediante mejora génica con eventos transgénicos que expresan otras proteínas insecticidas y/o que expresan otros rasgos transgénicos, tales como otros rasgos de control de insectos, genes de tolerancia a herbicidas, genes que confieren rasgos de tolerancia al estrés o de rendimiento y similares, o tales rasgos pueden combinarse en un único vector, de forma que estos rasgos estén todos ligados.
También se desvelan en la presente solicitud productos vegetales procesados, en los que el producto procesado comprende una cantidad detectable de una proteína insecticida quimérica, un segmento inhibidor de insectos o un fragmento de los mismos, o cualquier porción distinguible de los mismos. En determinadas realizaciones, el producto procesado se selecciona del grupo que consiste en partes de plantas, biomasa vegetal, aceite, alimento, azúcar, pienso, harina, copos, salvado, hebras, vainas, semillas y semillas procesadas. En determinadas realizaciones, el producto procesado no es regenerable. El producto vegetal puede comprender materias primas u otros productos comerciales procedentes de una planta transgénica o parte de planta transgénica, en que las materias primas u otros productos pueden rastrearse a través del comercio mediante la detección de segmentos de nucleótidos o de ARN expresado o proteínas que codifican o comprenden porciones distintivas de una proteína insecticida quimérica.
También se desvelan en la presente solicitud procedimientos para controlar insectos, en particular infestaciones por Lepidoptera de plantas de cultivo, con las proteínas insecticidas quiméricas. Dichos procedimientos pueden comprender cultivar una planta que comprende una cantidad inhibidora de Lepidoptera o de insectos de la proteína insecticida quimérica. En determinadas realizaciones, tales procedimientos pueden comprender además uno o más de: (i) aplicar cualquier composición que comprende o codifica una proteína insecticida quimérica a una planta o semilla que da lugar a una planta; y (ii) transformar una planta o una célula vegetal que da lugar a una planta con un polinucleótido que codifica una proteína insecticida quimérica. En general, se contempla que las proteínas insecticidas quiméricas puedan proporcionarse en una composición, proporcionarse en un microorganismo o proporcionarse en una planta transgénica, para conferir una actividad inhibidora de insectos contra insectos lepidópteros.
En determinadas realizaciones, la proteína insecticida quimérica es el principio activo desde un punto de vista insecticida de una composición inhibidora de insectos preparada mediante el cultivo de Bacillus recombinante o de cualquier otra célula bacteriana recombinante transformada para expresar una proteína insecticida quimérica en condiciones adecuadas para la expresión. Dicha composición puede prepararse mediante desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de tales células recombinantes que expresan/producen la proteína insecticida quimérica. Dicho procedimiento puede dar como resultado un extracto, suspensión celular, homogenato celular, lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular o sedimento celular de Bacillus o de otra célula bacteriana entomopatógena. Al obtener la proteína insecticida quimérica producida de esta forma, una composición que incluye la proteína insecticida quimérica puede incluir células bacterianas, esporas bacterianas y cuerpos de inclusión paraesporales, y pueden formularse para diversos usos, entre ellos como productos de pulverización de inhibidores de insectos agrícolas, o como formulaciones inhibidoras de insectos en bioensayos de dieta.
La formulación o compuesto mencionado anteriormente puede comprender además un vehículo aceptable desde el punto de vista agrícola, tal como un cebo, polvo, polvillo, bolita, gránulo, pulverización, emulsión, una suspensión coloidal, una solución acuosa, una espora de Bacillus o una preparación cristalina, o un tratamiento de semillas. El compuesto o formulación puede comprender además una célula vegetal, tejido vegetal, semilla o planta recombinante transformada para expresar una o más de las proteínas; o una bacteria transformada para expresar una o más de las proteínas. Dependiendo del nivel de inhibición inhibidora de insectos o insecticida inherente al polipéptido recombinante y del nivel de compuesto o formulación a aplicar a una planta o ensayo de dieta, el compuesto o formulación puede incluir diversas cantidades en peso del polipéptido recombinante, por ejemplo, del 0,0001 % al 0,001 %, al 0,01 %, al 1 %, al 99 % en peso del polipéptido recombinante.
En una realización, para reducir la probabilidad del desarrollo de resistencias, una composición inhibidora de insectos o planta transgénica que comprende una proteína insecticida quimérica puede comprender además al menos un agente tóxico adicional que presente actividad inhibidora de insectos contra las mismas especies de insectos lepidópteros, pero que sea distinto de la proteína insecticida quimérica. Los posibles agentes tóxicos adicionales para tal composición incluyen una proteína inhibidora de insectos y una molécula de ARNbc inhibidora de insectos. Un ejemplo para el uso de tales secuencias de ribonucleótidos para controlar plagas de insectos se describe en Baum y col. (publicación de patente de Estados Unidos 2006/0021087 A1). Dicho polipéptido (o polipéptidos) adicional para el control de plagas de lepidópteros pueden seleccionarse del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, tal como, pero sin limitación, CrylA (patente de Estados Unidos n.° 5.880.275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, CrylB (publicación de patente de Estados Unidos N.° 10/525.318), CrylC (patente de Estados Unidos n.° 6.033.874), Cry1D, Cry1E, Cry1F y quimeras de Cry1A/F (patentes de Estados Unidos n.° 7.070.982; 6.962.705 y 6.713.063 ), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, CrylL, Cry2A, Cry2Ab (patente de Estados Unidos n.° 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834,TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, AND AXMI-045 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0104259 A1), AXMI-134 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0167264 A1), AXMI-150 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0160231 A1), AXMI-184 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209 (publicación de patente de Estados Unidos 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0196175 A1), AXMI-238 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0033363 A1), AXMI-270 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0223598 A1), AXMI-345 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0373195 A1), DIG-3 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0219570 A1), DIG-5 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0317569 A1), DIG-11 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0319093 A1), AfIP-1A y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0033361 A1), AfIP-1B y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), Pput_1063 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), Pput_1064 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0007292 A1), GS-135 y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012- 0233726 A1), GS153 y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012-0192310 A1), GS154 y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012-0192310 A1), GS155 y derivados del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012-0192310 A1), la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2012-0167259 A1, la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2012-0047606 A1, la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2011-0154536 A1, la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2011-0112013 A1, las SEQ ID NO: 2 y 4 y derivados de las mismas como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2010-0192256 A1, la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2010-0077507 A1, la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2010-0077508 A1, la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2009-0313721 A1, la SEQ ID NO: 2 o 4 y derivados de las mismas como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2010-0269221 A1, las SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.772.465 (B2), CF161_0085 y derivados del mismo como se describe en el documento WO2014/008054 A2, proteínas tóxicas para lepidópteros y sus derivados como se describe en las publicaciones de patente de Estados Unidos US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 y US2012-0117690 A1; la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en el documento US7510878(B2), la SEQ ID NO: 2 y derivados de la misma como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7812129(B1), y similares.
En otras realizaciones, una composición inhibidora de insectos o planta transgénica puede comprender además al menos un agente tóxico adicional que presente actividad inhibidora de insectos para una plaga de insectos que no es inhibida por las proteínas insecticidas quiméricas de la presente invención (tales como plagas de coleópteros, hemípteros y homópteros), para ampliar el espectro de la inhibición de insectos obtenido.
Dichos agentes tóxicos adicionales para el control de plagas de coleópteros pueden seleccionarse del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, tal como, pero sin limitación, Cry3Bb (patente de Estados Unidos n.° 6.501.009), variantes de CryIC, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0167264 A1) AXMI-184 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0004176 A1), AXMI-205 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0298538 A1), axmi207 (publicación de patente de Estados Unidos 2013- 0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (publicación de patente de Estados Unidos 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0196175 A1), AXMI-279 (publicación de patente de Estados Unidos 2014-0223599 A1), AXMI-R1 y variantes del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0319092 A1), eHIPs (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2010/0017914), IP3 y variantes del mismo (publicación de patente de Estados Unidos 2012-0210462 A1) y u>-Hexatoxina-Hv1a (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US2014-0366227 A1).
Dichos agentes tóxicos adicionales para el control de plagas de hemípteros pueden seleccionarse del grupo que consiste en proteínas activas para hemípteros tales como, pero sin limitación, TIC1415 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0097735 A1), TlC807 (patente de Estados Unidos n.° 8609936), TIC834 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0269060 A1), AXMI-036 (publicación de patente de Estados Unidos 2010-0137216 A1) y AXMI-171 (publicación de patente de Estados Unidos 2013-0055469 A1). Pueden encontrarse polipéptidos adicionales para el control de plagas de insectos coleópteros, lepidópteros y hemípteros en el sitio de internet de la nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis mantenido por Neil Crickmore (en internet, en btnomenclature.info).
Las secuencias que codifican proteínas insecticidas quiméricas y las secuencias que tienen una identidad porcentual substancial con las proteínas insecticidas quiméricas pueden identificarse utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la materia, tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación térmica e hibridación. Por ejemplo, las proteínas insecticidas quiméricas pueden utilizarse para producir anticuerpos que se unan específicamente a proteínas relacionadas, y pueden utilizarse para cribar y hallar otras proteínas que se relacionen de forma estrecha.
Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas insecticidas quiméricas pueden utilizarse como sondas y cebadores para el cribado para identificar otros miembros de la clase utilizando procedimientos de amplificación por ciclo térmico o isotérmica e hibridación. Por ejemplo, pueden utilizarse oligonucleótidos procedentes de secuencias como se expone en la SEQ ID NO: 2 para determinar la presencia o ausencia de un transgén quimérico insecticida en una muestra de ácido desoxirribonucleico obtenida de un producto de materia prima. Dada la sensibilidad de determinados procedimientos de detección de ácidos nucleicos que emplean oligonucleótidos, se espera que los oligonucleótidos obtenidos procedentes de secuencias como se expone en cualquiera de la SEQ ID NO: 2 puedan utilizarse para detectar la proteína insecticida quimérica respectiva en productos de materia prima procedentes de fuentes agrupadas en que solamente una fracción del producto de materia prima procede de una planta transgénica que contiene cualquiera de la SEQ ID NO: 2.
EJEMPLOS EJEMPLO 1
Creación y clonación de secuencias codificantes de nuevas proteínas insecticidas quiméricas activas para lepidópteros
Este Ejemplo ilustra la creación de las nuevas proteínas insecticidas quiméricas y la clonación y expresión de las proteínas insecticidas quiméricas.
Las secuencias de ácido nucleico recombinante se construyeron a partir de genes conocidos de proteína Cry para producir secuencias polinucleotídicas que codifican nuevas proteínas insecticidas quiméricas. Las secuencias polinucleotídicas resultantes se clonaron en un vector plasmídico de expresión de Bacillus thuringiensis (Bt). Después de la confirmación de la secuencia de polinucleótidos, el plásmido de expresión se transformó en Bt y se expresó. Las preparaciones de las proteínas quiméricas nuevas expresadas se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad contra diversas plagas de lepidópteros.
Se produjeron y se analizaron en bioensayos muchas secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas insecticidas quiméricas. No todas las proteínas insecticidas quiméricas demostraron actividad. Solo se seleccionaron algunas de las proteínas insecticidas quiméricas basándose en su actividad para lepidópteros específicos demostrada en bioensayos. También se produjeron variantes de aminoácidos en que se introdujeron sustituciones de aminoácidos, o dominios de protoxina alternativos, basándose en las proteínas insecticidas quiméricas originales TIC867 y TIC868. Los componentes de las proteínas insecticidas quiméricas (dominios I, II y III y la protoxina) de la presente invención se presentan en la Tabla 1. También se presentan las sustituciones de aminoácidos en las variantes de TIC868 con respecto a la secuencia proteica original de TIC868.
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continuación
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EJEMPLO 2
Las nuevas proteínas insecticidas quiméricas demuestran actividad contra plagas de lepidópteros
Este Ejemplo ilustra el análisis de las proteínas insecticidas quiméricas descritas en el Ejemplo 1 y la actividad para lepidópteros observada para las proteínas insecticidas quiméricas.
Las secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas insecticidas quiméricas se expresaron en Bt. Las proteínas insecticidas quiméricas expresadas se sometieron a ensayo a continuación contra una diversidad de lepidópteros conocidos como plagas de maíz, caña de azúcar, soja y algodón, así como otras plantas de cultivo. Específicamente, las proteínas insecticidas se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad contra la oruga de las leguminosas (VBC, Anticarsia gemmatalis), barrenador de la caña de azúcar (SCB, Diatraea saccharalis), barrenador menor del tallo del maíz (LSCB, Elasmopalpus lignosellus), gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea), gusano bellotero del tabaco (TBW, Heliothis virescens), lagarta verde (SBL, Chrysodeixis includens), gusano soldado africano (BLAW, Spodoptera cosmioides), gusano meridional (SAW, Spodoptera eridania), gusano cogollero del maíz (FAW, Spodoptera frugiperda), guardama de la remolacha (BAW, Spodoptera exigua), gusano cogollero (OBW, Helicoverpa armigera), rosquilla negra (OLW, Spodoptera litura), gusano rosado (PBW, Pectinophora gossypiella), gusano cortador grasiento (BCW, forma siglada de Black cutworm, Agrotis ipsilon), barrenador del maíz (SWCB, Diatraea grandiosella), gusano moteado (SBW, Earias vitella) y taladro del maíz (ECB, forma siglada de European corn borer, Ostrinia nubilalis). El gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea) también se denomina gusano de la vaina de la soja (SPW) y gusano del algodón (CBW). La actividad se determinó a través de una combinación de las puntaciones de mortalidad y de retraso del desarrollo, así como de las puntuaciones de CIM50. CIM50 se refiere a una concentración de inhibición de muda, en la que tanto las larvas muertas como las larvas L1 (larvas que no mudaron a los segundos estadios) se incluyeron en la puntuación. La Tabla 2 muestra la actividad de cada proteína insecticida quimérica. Un signo '+' indica actividad observada para la plaga de insectos específica.
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Tal como puede observarse en la Tabla 2 que antecede, la mayoría de las proteínas insecticidas quiméricas presentaron actividad contra una o más especies de plagas de lepidópteros.
EJEMPLO 3
Síntesis de genes que codifican proteínas insecticidas quiméricas y expresión en plantas
Este Ejemplo ilustra la síntesis de polinucleótidos que codifican las proteínas insecticidas quiméricas para la expresión en plantas.
Se construyeron secuencias sintéticas codificantes para su uso en la expresión de las proteínas insecticidas quiméricas en plantas. Las secuencias sintéticas se diseñaron y sintetizaron de acuerdo con procedimientos descritos generalmente en la patente de Estados Unidos 5.500.365, evitando determinadas secuencias problemáticas perjudiciales, tales como secuencias de poliadenilación de plantas ricas en ATTTA y A/T, al tiempo que se conservaba la secuencia de aminoácidos de la proteína insecticida quimérica. Las secuencias de nucleótidos para estos genes que codifican las proteínas insecticidas quiméricas para su expresión en plantas se enumeran la Tabla 3.
Tabla 3. Secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas insecticidas quiméricas diseñadas para su uso en lantas.
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EJEMPLO 4
Casetes de expresión para la expresión de proteínas insecticidas quiméricas en plantas
Este Ejemplo ilustra la construcción de casetes de expresión que comprenden secuencias polinucleotídicas diseñadas para su uso en plantas que codifican proteínas insecticidas quiméricas.
Se construyó una diversidad de casetes de expresión vegetales con las secuencias polinucleotídicas que codifican las proteínas insecticidas quiméricas diseñadas para la expresión en plantas proporcionadas en la Tabla 3. Dichos casetes de expresión son útiles para la expresión transitoria en protoplastos vegetales o la transformación se células vegetales. Los casetes de expresión típicos se diseñaron con respecto a colocación permanente de la proteína dentro de la célula. Un conjunto de casetes de expresión se diseñó de forma que permitiera que la proteína se tradujera y permaneciera en el citosol. Otro conjunto de casetes de expresión se diseñó para que tuviera un péptido de tránsito contiguo a la proteína toxina, para permitir el direccionamiento a un orgánulo de la célula, tal como el cloroplasto o plástido. Todos los casetes de expresión se diseñaron para comenzar en el extremo 5' con un promotor, que puede estar compuesto por múltiples elementos promotores, elementos potenciadores u otros elementos de expresión conocidos por los expertos en la materia, unidos operativamente para estimular la expresión del transgén. La secuencia promotora habitualmente se encontraba seguida de forma contigua por una o más secuencias líder a 3' del promotor. Por lo general, se proporcionó una secuencia intrónica a 3' de la secuencia líder para mejorar la expresión del transgén. Una secuencia codificante para la toxina o el péptido de tránsito y la secuencia codificante para la toxina se ubicaban normalmente a 3' de la configuración del intrón, líder y promotor unidos operativamente. Habitualmente se proporcionó una secuencia 3'UTR a 3' de la secuencia codificante para facilitar la terminación de la transcripción y proporcionar secuencias importantes para la poliadenilación del transcrito resultante. Todos los elementos descritos anteriormente estaban unidos operativamente y se dispusieron secuencialmente, a menudo con secuencias adicionales proporcionadas para la construcción del casete de expresión.
EJEMPLO 5
Actividad para lepidópteros de las proteínas insecticidas quiméricas en maíz transformado de forma estable Este Ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por las proteínas insecticidas quiméricas contra plagas de lepidópteros cuando se expresan en plantas de maíz y se proporcionan como una dieta a la respectiva plaga de insectos del maíz.
La variedad de maíz LH244 se transformó con los vectores binarios de transformación descritos en el Ejemplo 4, utilizando un procedimiento de transformación mediada por Agrobacterium. Las células transformadas se indujeron a formar plantas mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los bioensayos que utilizan discos foliares de plantas se llevaron a cabo de forma análoga a los descritos en la patente de Estados Unidos n.° 8.344.207. Se utilizó una planta LH244 no transformada para obtener tejido a utilizar como control negativo. Se evaluaron múltiples eventos de transformación de cada vector binario contra el gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea), el gusano cogollero del maíz (FAW, Spodoptera frugiperda), el gusano cortador grasiento (BCW, Agrotis Ípsilon) y el barrenador del maíz (SWCB, Diatraea grandiosella).
El bioensayo en discos foliares se llevó a cabo en plantas transgénicas de generación Ro y Fi. Además, los puntajes de daño en la hoja se evaluaron para plantas de Fi transgénicas completas que expresaban determinadas proteínas insecticidas quiméricas infestadas con plagas de insectos lepidópteros. Los eventos de Fi transgénicos que expresaban TIC860 y TIC868 también se evaluaron en cuanto a la actividad en el campo contra FAW, CEW y SWCB. Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 4. Un signo '+' indica actividad observada para la plaga de insecto específica. Como puede observarse en la Tabla 4, la mayoría de las proteínas insecticidas quiméricas y muchas de las variantes de proteínas insecticidas quiméricas demostraron actividad contra una o más especies de plagas de lepidópteros.
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EJEMPLO 6
Actividad para lepidópteros de las proteínas insecticidas quiméricas en soja transformada de forma estable Este Ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por las proteínas insecticidas quiméricas contra plagas de lepidópteros cuando se expresan en plantas de soja y se proporcionan como dieta para la respectiva plaga de insectos.
Las secuencias codificantes para las proteínas insecticidas quiméricas seleccionadas se rediseñaron para la expresión en plantas, se clonaron en un vector binario de transformación en plantas y se utilizaron para transformar células vegetales de soja. Los vectores de transformación en plantas comprendieron un primer casete de transgén para la expresión de la proteína insecticida quimérica como se describió en el Ejemplo 4 y un segundo casete de transgén para la selección de células vegetales transformadas mediante el uso de selección de espectinomicina. En algunos casos, tal como en el caso de TIC1100, TIC860 y TIC836, se unió operativamente a la secuencia codificante insecticida quimérica una secuencia codificante de un péptido de tránsito a cloroplastos. Se llevaron a cabo ensayos con TIC1100, TIC860 y TIC836 dirigidos y no dirigidos a plástidos. La Tabla 5 muestra a continuación la proteína insecticida quimérica y la insecticida quimérica variante de TIC867 y las secuencias codificantes asociadas utilizadas para la expresión en soja transformada de forma estable.
Las células vegetales de soja se transformaron mediante el uso de los vectores binarios de transformación descritos anteriormente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Las células vegetales transformadas resultantes se indujeron a formar plantas de soja completas. Se cosechó tejido foliar y se utilizó en el bioensayo como se describe en el Ejemplo 5 o, de manera alternativa, se utilizó el tejido liofilizado en la dieta de los insectos para el bioensayo. El bioensayo se llevó a cabo contra FAW, gusano meridional (SAW, Spodoptera eridania), lagarta verde (SBL, Chrysodeixis includens), gusano elotero (SPW, Helicoverpa zea), oruga de las leguminosas (VBC, Anticarsia gemmatalis), gusano bellotero del tabaco (TBW, Heliothis virescens), gusano soldado africano (BLAW, Spodoptera cosmioides), barrenador menor del tallo del maíz brote (LSCB, Elasmopalpus lignosellus) y gusano gris del tabaco (OBW, Helicoverpa armigera).
La Tabla 5 muestra la actividad contra especies seleccionadas de lepidópteros para cada proteína insecticida en plantas de generación R0 en la que '+' indica actividad. Como puede observarse en la Tabla 5, cada una de las proteínas insecticidas quiméricas expresadas en la soja transformada de forma estable demostró actividad contra múltiples especies de lepidópteros. Cabe destacar en particular que la variante de TIC867, TIC867_23, demostró actividad contra SPW.
Tabla 5. Actividad de bioensayo de las proteínas insecticidas quiméricas a partir de tejido foliar de soja de R 0
transformada de forma estable
Figure imgf000019_0001
Se permitió que los eventos transformados seleccionados autopolinizaran y se cultivó la semilla resultante. El tejido foliar se cosechó a partir de las plantas de generación R1 y se utilizó en un bioensayo de alimentación. Las plantas R1 que expresaban TIC1100, TIC860, TIC867, TIC868, TIC869 y TIC836 se evaluaron en cuanto a la actividad contra SAW, SBL, SPW y VBC. La Tabla 6 muestra la actividad observada en estas pruebas. Un signo '+' indica actividad observada para la plaga de insectos específica. Como se demuestra en la Tabla 6, la mayoría de las proteínas insecticidas quiméricas expresadas a partir de plantas de generación R1 demostraron actividad contra una o más especies de lepidópteros.
Tabla 6. Actividad de bioensayo de proteínas insecticidas quiméricas a partir de tejido foliar de soja R 1 transformada de forma estable
Figure imgf000019_0002
continuación
Figure imgf000020_0001
La Tabla 7 demuestra los resultados de pruebas de campo llevadas a cabo en invernaderos de protección con plantas de soja de generación R1 transformadas de forma estable que expresaban TIC1100, TIC860 y TIC836. Las especies utilizadas para infestar las plantas en los invernaderos de protección incluían SAW, SBL y SPW. La resistencia se definió como menor o igual a una defoliación en las plantas de soja del quince por ciento. La resistencia observada en estos ensayos en jaulas está en consonancia con la resistencia observada en el ensayo de tejido foliar de soja de generación R1 presentada en la Tabla 6. Un signo '+' indica actividad observada para la plaga de insectos específica.
Tabla 7. Perfil de actividad de TIC1100, TIC860 y TIC836 expresados en soja de generación Ri analizada en pruebas de campo en invernadero.
Figure imgf000020_0003
Las pruebas de campo en invernaderos de protección con plantas de soja de generación R1 transformadas de forma estable que expresaban TIC867 y TIC869 también se llevaron a cabo en dos ubicaciones distintas en Argentina, Acevedo y Fontezuela. Las especies utilizadas para infestar plantas en los invernaderos de protección incluyen al gusano cogollero (SABW, Helicoverpa gelotopeon), VBC, BLAW y oruga medidora (SFL, Rachiplusia nu). La resistencia se definió como menor o igual a una defoliación en las plantas de soja del quince por ciento. La Tabla 8 muestra a continuación la resistencia observada. Un signo '+' indica actividad observada para la plaga de insectos específica. Como se demuestra en la Tabla 8, las plantas de soja transgénicas que expresaban TIC867 demostraron resistencia a BLAW y VBC. Las plantas de soja transgénicas que expresaban TIC869 demostraron resistencia a SABW, SFL, BLAW y VBC.
Tabla 8. Perfil de actividad de TIC867 y TIC869 expresados en soja de generación Ri analizada en pruebas de campo en invernadero de protección.
Figure imgf000020_0002
EJEMPLO 7
Actividad para lepidópteros de las proteínas insecticidas quiméricas en algodón transformado de forma estable
Este Ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por las proteínas insecticidas quiméricas contra plagas de lepidópteros cuando se expresan en plantas de algodón y se proporcionan como dieta para la respectiva plaga de insectos.
Las secuencias codificantes para las proteínas insecticidas quiméricas seleccionadas se rediseñaron para la expresión en plantas, se clonaron en un vector binario de transformación en plantas y se utilizaron para transformar células vegetales de algodón. Los vectores binarios resultantes fueron similares a los descritos en el Ejemplo 4 y se utilizaron para expresar TIC860 dirigido y no dirigido a plástidos (secuencia codificante: SEQ ID NO: 6; secuencia de proteína: SEQ ID NO: 7), TIC867 (secuencia codificante: SEQ ID NO: 9; secuencia de proteína: SEQ ID NO: 10), TIC868 (secuencia codificante: SEQ ID NO: 27; secuencia de proteína: SEQ ID NO: 28) y TIC867_23 (secuencia codificante: SEQ ID NO: 20; secuencia de proteína: SEQ ID NO: 23).
Las células vegetales de algodón se transformaron mediante un procedimiento de transformación mediada por Agrobacterium. Las células de algodón transformadas se indujeron a formar plantas completas. Se utilizó tejido foliar de algodón en un bioensayo como se describe en el Ejemplo 5 contra el gusano elotero (CBW, Helicoverpa zea), FAW, TBW y SBL. La Tabla 9 muestra la actividad observada contra estas especies de lepidópteros para TIC860, TIC867 y TIC868 en algodón de generación R0 transformado de forma estable, en la que '+' indica actividad. Como puede observarse en la Tabla 9, TIC860, TIC867 y TIC868 demostraron actividad contra dos o más especies de plagas de lepidópteros en algodón de generación R0 transformado de forma estable.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína insecticida quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 28, en la que la proteína insecticida quimérica presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Lepidoptera.
2. Un polinucleótido que codifica la proteína insecticida quimérica de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido está unido operativamente a un promotor heterólogo.
3. Un polinucleótido que codifica una proteína insecticida quimérica que presenta actividad inhibidora contra una especie de insecto del orden Lepidoptera, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que: a. se expone en la SEQ ID NO: 27; o
b. codifica la proteína insecticida quimérica de la reivindicación 1.
4. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3, en el que dicho polinucleótido comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27, en la que la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en una célula hospedadora bacteriana y una célula hospedadora vegetal.
5. Una composición inhibidora de insectos que comprende la proteína insecticida quimérica de la reivindicación 1.
6. La composición inhibidora de insectos de la reivindicación 5, que comprende además al menos un agente inhibidor de insectos distinto de la proteína insecticida quimérica.
7. Una semilla que comprende una cantidad inhibidora de insectos eficaz de:
a. la proteína insecticida quimérica de la reivindicación 1; o
b. el polinucleótido de la reivindicación 3.
8. Un procedimiento de control de una plaga de lepidópteros, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la plaga de lepidópteros con una cantidad inhibidora de la proteína insecticida quimérica de la reivindicación 1.
9. Una célula vegetal, planta o parte de planta transgénica que comprende la proteína insecticida quimérica de la reivindicación 1.
10. Un procedimiento de control de una plaga de lepidópteros, que comprende exponer la plaga a la célula vegetal, planta o parte de planta transgénica de la reivindicación 9, en la que dicha célula vegetal, planta o parte de planta expresa una cantidad inhibidora de lepidópteros de la proteína insecticida quimérica.
11. Una molécula de polinucleótido recombinante que codifica la proteína insecticida quimérica de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27.
12. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un segmento de polinucleótido que codifica la proteína insecticida quimérica de la reivindicación 1.
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Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA033842B1 (ru) * 2013-12-09 2019-12-02 Атеникс Корп. Гены токсинов axmi477, axmi482, axmi486 и axmi525 и способы их применения
SG11201702749RA (en) 2014-10-16 2017-05-30 Monsanto Technology Llc Novel chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests
US10487123B2 (en) 2014-10-16 2019-11-26 Monsanto Technology Llc Chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests
CA2963555C (en) 2014-10-16 2024-06-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
AU2016278142A1 (en) 2015-06-16 2017-11-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods to control insect pests
WO2017030808A1 (en) 2015-08-18 2017-02-23 Monsanto Technology Llc Novel insect inhibitory proteins
JP7297443B2 (ja) 2015-08-27 2023-06-26 モンサント テクノロジー エルエルシー 新規防虫タンパク質
US10572836B2 (en) 2015-10-15 2020-02-25 International Business Machines Corporation Automatic time interval metadata determination for business intelligence and predictive analytics
CN109312359A (zh) 2016-06-16 2019-02-05 先锋国际良种公司 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法
WO2018013333A1 (en) 2016-07-12 2018-01-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US11016730B2 (en) 2016-07-28 2021-05-25 International Business Machines Corporation Transforming a transactional data set to generate forecasting and prediction insights
US11345925B2 (en) 2016-10-21 2022-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
CN110062579B (zh) * 2016-12-12 2023-06-27 先正达参股股份有限公司 工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法
CN117024535A (zh) * 2017-01-04 2023-11-10 先正达参股股份有限公司 用于控制植物有害生物的组合物和方法
CA3049658A1 (en) * 2017-01-12 2018-07-19 Monsanto Technology Llc Pesticidal toxin proteins active against lepidopteran insects
US20200165626A1 (en) 2017-10-13 2020-05-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize
CN108148841B (zh) * 2017-12-14 2020-12-29 云南大学 氨基酸序列在用于使昆虫Dip3蛋白失活中的应用
US11492639B2 (en) 2017-12-19 2022-11-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides and uses thereof
CN116410286A (zh) * 2018-03-14 2023-07-11 先锋国际良种公司 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
EP3764798A4 (en) 2018-03-14 2021-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. PROTEIN INSECTICIDES FROM PLANTS AND PROCESSES FOR THEIR USE
EP3829286A4 (en) * 2018-07-30 2022-08-24 Monsanto Technology LLC MAIZE MON 95379 TRANSGENIC EVENT AND METHODS OF DETECTION AND USE OF THEREOF
CN109198845A (zh) * 2018-08-21 2019-01-15 广州杰赛科技股份有限公司 全自主甲面彩绘装置、方法、设备及存储介质
CA3106444A1 (en) 2018-08-29 2020-03-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for conferring pesticidal activity to plants
CN113179823A (zh) * 2020-01-14 2021-07-30 先正达生物科技（中国）有限公司 小地老虎的控制
CN113179822A (zh) * 2020-01-14 2021-07-30 先正达生物科技（中国）有限公司 棉铃虫的控制
CN111100208A (zh) * 2020-01-16 2020-05-05 黑龙江大鹏农业有限公司 一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用
WO2022125639A1 (en) 2020-12-08 2022-06-16 Monsanto Technology Llc Modified plant-associated bacteria and methods of their use
MX2023007427A (es) 2020-12-21 2023-07-03 Monsanto Technology Llc Proteinas inhibidoras de insectos novedosas.
UY39585A (es) 2020-12-23 2022-07-29 Monsanto Technology Llc Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas
CR20230292A (es) 2020-12-31 2023-11-01 Monsanto Technology Llc Novedosas proteínas inhibidoras de insectos
US20240181079A1 (en) 2021-03-26 2024-06-06 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Production of circular polyribonucleotides in a eukaryotic system
TW202305129A (zh) 2021-03-26 2023-02-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於產生環狀多核糖核苷酸之組成物及方法
WO2022204466A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Production of circular polyribonucleotides in a prokaryotic system
AR125862A1 (es) * 2021-05-21 2023-08-23 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar insectos
AU2022306570A1 (en) 2021-07-08 2024-01-18 Monsanto Technology Llc Novel insect inhibitory proteins
CN114134171B (zh) * 2021-10-29 2023-09-15 隆平生物技术(海南)有限公司 一种抑制或杀灭东方黏虫的方法及其应用
KR20240110818A (ko) 2021-11-01 2024-07-16 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 유기체를 변형하기 위한 폴리뉴클레오티드
MX2024009021A (es) 2022-01-20 2024-08-06 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Polinucleotidos para modificar organismos.
CN114507673A (zh) * 2022-01-20 2022-05-17 隆平生物技术(海南)有限公司 一种抑制或杀灭小地老虎的方法及应用
CN116063431B (zh) * 2022-09-19 2023-11-10 隆平生物技术(海南)有限公司 一种植物抗虫蛋白质及其应用
WO2024092330A1 (pt) * 2022-11-04 2024-05-10 Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária - Embrapa Proteínas inseticidas quiméricas truncadas
WO2024229403A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Endornaviral satellite rna amplification systems for plants
WO2024229351A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial secoviridae satellite rnas
WO2024229398A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial amalgavirus satellite rnas
WO2024229356A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial solemoviridae satellite rnas
WO2024229362A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc ARTIFICIAL MARTELLIVIRALES SATELLITE RNAs
WO2024229359A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial tymovirales satellite rnas
WO2024229395A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Partitiviral satellite rna amplification systems for plants
WO2024229385A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial ghabrivirales satellite rnas
WO2024229347A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Artificial tombusviridae satellite rnas
CN117144054B (zh) * 2023-10-27 2024-06-11 莱肯生物科技(海南)有限公司 一种核酸检测方法及其应用

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
EP0218571B1 (en) 1985-08-07 1993-02-03 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US5312910A (en) 1987-05-26 1994-05-17 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
DE69033816T2 (de) 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc., St. Louis Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
ATE212667T1 (de) 1990-04-26 2002-02-15 Aventis Cropscience Nv Neuer bacillusthuringsiensis stamm und sein für insektentoxin kodierendes gen
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
US5723758A (en) * 1991-09-13 1998-03-03 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis genes encoding lepidopteran-active toxins
US5262324A (en) 1991-11-06 1993-11-16 Mycogen Corporation Coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolates and genes encoding coleopteran-active toxins
US5273746A (en) 1992-01-29 1993-12-28 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates active against phthiraptera pests
US5322687A (en) 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
GB9318207D0 (en) 1993-09-02 1993-10-20 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5508264A (en) * 1994-12-06 1996-04-16 Mycogen Corporation Pesticidal compositions
US6063756A (en) * 1996-09-24 2000-05-16 Monsanto Company Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor
US6017534A (en) * 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
TR199901109T2 (xx) * 1996-11-20 1999-10-21 Ecogen, Inc Geni� spektrumlu delta-endotoksinler.
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US6218188B1 (en) * 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
US6489542B1 (en) 1998-11-04 2002-12-03 Monsanto Technology Llc Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids
US6283613B1 (en) 1999-07-29 2001-09-04 Cooper Technologies Company LED traffic light with individual LED reflectors
AU6702300A (en) * 1999-08-19 2001-03-19 Syngenta Participations Ag Hybrid insecticidal toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US6501009B1 (en) 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
CA2384967A1 (en) * 1999-09-15 2001-03-22 Monsanto Technology Llc Lepidopteran-active bacillus thuringiensis .delta.-endotoxin compositions and methods of use
AU2000269030A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-25 Monsanto Technology Llc Broad-spectrum delta-endotoxins
ATE296539T1 (de) * 2000-08-25 2005-06-15 Syngenta Participations Ag Hybriden von crystal proteinen aus bacillus thurigiensis
CN101385467B (zh) * 2001-03-30 2014-11-05 辛根塔参与股份公司 新的杀虫毒素
AR035799A1 (es) * 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
ES2203310B1 (es) 2001-12-28 2005-06-01 Universidad Publica De Navarra Nueva cepa de bacillus thuringiensis con multiples genes cry toxica contra lepidopteros plaga.
EP2360179A1 (en) * 2002-03-22 2011-08-24 Bayer BioScience N.V. Novel bacillus thuringiensis insecticidal proteins
US20060112447A1 (en) 2002-08-29 2006-05-25 Bogdanova Natalia N Nucleotide sequences encoding cry1bb proteins for enhanced expression in plants
CA2693280C (en) 2004-04-09 2017-09-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
CN101001957B (zh) 2004-06-09 2012-07-04 先锋高级育种国际公司 质体转运肽
CA2601857A1 (en) 2005-04-01 2006-10-12 Nadine Carozzi Axmi-027, axmi-036 and axmi-038, a family of delta-endotoxin genes and methods for their use
MX2008002802A (es) * 2005-08-31 2008-04-07 Monsanto Technology Llc Secuencias nucleotidicas que codifican proteinas insecticidas.
AU2012200658B2 (en) 2005-08-31 2014-01-23 Monsanto Technology Llc "Controlling insect infestation"
CN101506382A (zh) 2006-07-21 2009-08-12 先锋高级育种国际公司 鉴定新基因的方法
CL2007002135A1 (es) 2006-07-21 2008-03-14 Pioneer Hi Bred Int Acido nucleico de bacillus thuringiensis que codifican polipeptidos con actividad plaguicida; construccion de adn y celula huesped que lo comprenden; metodo de proteccion de una planta contra una plaga; polipeptidos y metodo de produccion; y composic
WO2008073877A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis crystal polypeptides, polynucleotides, and compositions thereof
BR122017015069B1 (pt) 2007-03-09 2018-07-10 Monsanto Technology Llc Aparelho para geração em alto volume de produção de tecido vegetal transformável
RU2497830C2 (ru) 2007-03-28 2013-11-10 Зингента Партисипейшнс Аг Гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
AU2008248360B2 (en) 2007-05-08 2013-05-23 Monsanto Technology Llc Methods for inducing cotton embryogenic callus
US7772465B2 (en) 2007-06-26 2010-08-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US7939325B2 (en) 2007-08-31 2011-05-10 Monsanto Technology Llc Method and apparatus for substantially isolating plant tissues
US8283524B2 (en) 2008-05-15 2012-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US8129594B2 (en) * 2008-06-11 2012-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
WO2009151748A1 (en) 2008-06-11 2009-12-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
CN102066408B (zh) 2008-06-25 2015-07-01 阿森尼克斯公司 毒素基因及其使用方法
CN102076709B (zh) 2008-07-02 2014-10-15 阿森尼克斯公司 Axmi-il5、axmi-113、axmi-005、axmi-163和axmi-184：vip3a杀虫蛋白及其使用方法
US8445749B2 (en) 2008-09-19 2013-05-21 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US20100077507A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity
MX2011006693A (es) 2008-12-22 2011-10-14 Athenix Corp Genes pesticidas de brevibacillus y metodos para su uso.
UY38535A (es) 2008-12-23 2020-11-30 Athenix Corp Gen de delta-endotoxinas axmi-004 y métodos de uso del mismo
MX2011007157A (es) 2009-01-23 2011-09-01 Pioneer Hi Bred Int Nuevo gen de bacillus thuringiensis con actividad lepidoptera.
BRPI1007915B1 (pt) 2009-02-05 2019-05-14 Athenix Corporation Genes de variante axmi-r1 delta-endotoxina, vetor, célula hospedeira microbiana, polipeptídeo recombinante e seu método de produção, composição, e métodos para controlar e matar uma população de peste de coleópteros, 5 e para protegeruma planta de uma peste
CN102421905B (zh) * 2009-02-27 2018-01-23 阿森尼克斯公司 杀虫蛋白和使用它们的方法
US20100298211A1 (en) 2009-03-11 2010-11-25 Athenix Corporation Axmi-001, axmi-002, axmi-030, axmi-035, and axmi-045: toxin genes and methods for their use
CN102459315B (zh) * 2009-04-17 2016-03-02 陶氏益农公司 Dig-3杀虫cry毒素
EP2442658A2 (en) 2009-06-16 2012-04-25 Dow AgroSciences LLC Dig-11 insecticidal cry toxins
CN102459316A (zh) 2009-06-16 2012-05-16 陶氏益农公司 Dig-5杀虫cry毒素
JP2012529911A (ja) 2009-06-16 2012-11-29 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー Ｄｉｇ−１０殺虫性ｃｒｙ毒素
CA3062192C (en) 2009-07-31 2022-05-17 Athenix Corp. Axmi204 protein with pesticidal activity and methods of use thereof
MX342640B (es) * 2009-10-02 2016-10-07 Syngenta Participations Ag Proteinas insecticidas.
BR112012011222A2 (pt) 2009-11-12 2015-09-15 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucleico isolada, contruto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição e métodos para controlar uma população de praga de lepidópteros, para matar uma praga de lepidóptero e para proteger uma planta contra uma praga
NZ601092A (en) * 2009-12-16 2014-09-26 Dow Agrosciences Llc Combined use of cry1ca and cry1fa proteins for insect resistance management
WO2011084324A2 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
BR122019005253A8 (pt) 2010-02-18 2022-07-05 Athenix Corp Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, célula hospedeira, polipeptídeo recombinante com atividade pesticida, composição, bem como métodos para o controle de uma população de pragas para matar uma praga, para a produção de um polipeptídeo com atividade pesticida, para a proteção de uma planta de uma praga, e para aumentar o rendimento em uma planta
AR080201A1 (es) 2010-02-18 2012-03-21 Athenix Corp Genes delta-endotoxinicos de bacillus thuringiensis (axmi218, axmi219, axmi220, axmi226, axmi227, axmi228, axmi229, axmi230, y axmi231), y metodos para su uso
US8802934B2 (en) 2010-08-19 2014-08-12 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
CA2821169A1 (en) 2010-12-28 2012-07-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
CA2825049A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis genes with lepidopteran activity
CN103459601A (zh) 2011-02-11 2013-12-18 先锋国际良种公司 具有对抗玉米根虫的活性的合成杀昆虫蛋白
CA2825951C (en) * 2011-02-11 2019-08-20 Monsanto Technology Llc Pesticidal nucleic acids and proteins and uses thereof
US8878007B2 (en) 2011-03-10 2014-11-04 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US9321814B2 (en) 2011-03-30 2016-04-26 Athenix Corp. AXMI238 toxin gene and methods for its use
GB201105418D0 (en) 2011-03-31 2011-05-18 Univ Durham Pesticide
CN111269921B (zh) 2011-04-07 2023-12-05 孟山都技术公司 具有对抗半翅目和/或鳞翅目昆虫的活性的昆虫抑制毒素家族
EP2737069B1 (en) 2011-07-28 2017-08-23 Athenix Corp. Axmi205 variant proteins and methods for their use
BR112014001909A2 (pt) 2011-07-28 2017-02-21 Athenix Corp gene da toxina axmi270 e métodos para a sua utilização
CN103975065B (zh) 2011-07-29 2018-08-10 阿森尼克斯公司 Axmi279杀虫基因及其使用方法
UA115236C2 (uk) 2012-03-08 2017-10-10 Атенікс Корп. Ген дельта-ендотоксину axmi345 та спосіб його застосування
NZ727213A (en) 2012-03-09 2020-03-27 Vestaron Corp Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
ES2743916T3 (es) 2012-04-06 2020-02-21 Monsanto Technology Llc Proteínas tóxicas para especies de insectos hemípteros
US9688730B2 (en) 2012-07-02 2017-06-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US9475847B2 (en) 2012-07-26 2016-10-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
KR20150060969A (ko) * 2012-10-05 2015-06-03 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 저항성 가을 거염벌레 곤충의 관리를 위한 조합에서의 Cry1Ea의 사용
SG11201702749RA (en) 2014-10-16 2017-05-30 Monsanto Technology Llc Novel chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests
US10487123B2 (en) 2014-10-16 2019-11-26 Monsanto Technology Llc Chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests

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ECSP17029551A (es) 2018-01-31
EA201892763A1 (ru) 2019-04-30

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