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ES2782002T3 - Células presentadoras de antígeno artificiales a escala nanométrica - Google Patents

Células presentadoras de antígeno artificiales a escala nanométrica Download PDF

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ES2782002T3
ES2782002T3 ES14776027T ES14776027T ES2782002T3 ES 2782002 T3 ES2782002 T3 ES 2782002T3 ES 14776027 T ES14776027 T ES 14776027T ES 14776027 T ES14776027 T ES 14776027T ES 2782002 T3 ES2782002 T3 ES 2782002T3
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aapc
nano
antigen
cell
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ES14776027T
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English (en)
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Jonathan Schneck
Mathias Oelke
Karlo Perica
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Johns Hopkins University
Original Assignee
Johns Hopkins University
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Abstract

Procedimiento in vitro de activación de células T, que comprende: incubar, en presencia de un campo magnético, una población de células T y una célula presentadora de antígeno artificial a escala nanométrica (nano-aAPC), comprendiendo la nano-aAPC: una nanopartícula paramagnética; como mínimo una molécula coestimuladora de células T sobre la superficie de la nanopartícula; y como mínimo un complejo mayor de histocompatibilidad que comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno, en el que un péptido antigénico se une a la hendidura de unión a antígeno, activando así células T específicas de antígeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Células presentadoras de antígeno artificiales a escala nanométrica
SECTOR TÉCNICO
La presente divulgación se refiere a inmunoterapia.
La Patente WO 2009/094273 da a conocer nanopartículas y micropartículas poliméricas para su utilización como células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC). Las aAPC incluyen citocinas encapsuladas y agentes de acoplamiento que acoplan de manera modular elementos funcionales incluyendo activadores de receptores de células T, moléculas coestimuladoras y moléculas de adhesión a la partícula. No se da a conocer la utilización de nanopartículas paramagnéticas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figuras 1A-C. Síntesis y caracterización de nano-aAPC de hierro-dextrano. Se sintetizaron nano-aAPC de una de dos maneras: figura 1A, acoplamiento químico directo de dímero MHC-Ig soluble (señal 1) y B7.1-Ig (señal 2) en una proporción molar de 1:1 a la superficie de una partícula recubierta con dextrano de óxido de hierro paramagnética. Figura 1B, unión de dímero MHC-Ig biotinilado (señal 1) y anticuerpo anti-CD28 biotinilado (señal 2) en una proporción molar de 1:1 a partículas recubiertas con anticuerpo antibiotina. Figura 1C, el análisis de seguimiento de nanopartículas confirma que las nano-aAPC son una mezcla monodispersa de partículas con un diámetro medio de 50-100 nm suspendidas a una concentración de 8,3 nM.
Figuras 2A-F. La proliferación inducida por nano-aAPC es específica de antígeno y dependiente de la dosis. Figura 2A, las nano-aAPC específicas de antígeno inducen la proliferación. Las células T de TCR transgénicos 2C (gris) y pMEL (blanco) proliferaron sólo cuando se incubaron con partículas recubiertas con anticuerpo antibiotina que portaban MHC/péptido relacionados, y no en presencia de partículas que portaban bien péptido no relacionado o bien MHC no relacionado. Figura 2B, la adición tanto de señal 1 como de señal 2 conduce a la expansión de células T óptima. A una dosis de 10 pl de partículas por 1*106 células T, sólo las partículas con anticuerpo antibiotina que portaban tanto MHC-Ig como anticuerpo anti-CD28 indujeron una proliferación de células T robusta. Figura 2c, proliferación de CD8+ CTL inducida por partículas LD y HD a concentraciones equivalentes a la dosis en la dilución de CFSE del día 3. La fluorescencia disminuida indica proliferación aumentada. Los volúmenes equivalentes de partículas HD inducen mayor proliferación que las partículas LD, no induciendo 0,5 ul de partículas l D casi ninguna expansión. Figura 2D, la expansión en veces en el día 7 de muestras en (A) muestra un patrón similar. La proliferación es dependiente de la dosis y 2-4 veces mayor para las partículas h D en comparación con una dosis equivalente de partículas LD. Figura 2E, dilución de CFSE del día 3 de CD8+ CTL inducida por partículas LD y HD a concentraciones equivalentes de proteína. Cuando se normalizan las dosis de partículas con respecto a concentraciones equivalentes de proteína, las partículas inducen cantidades similares de proliferación. Figura 2F, la expansión en veces en el día 7 de muestras en (C) demuestra una expansión equivalente para partículas HD y l D a una dosis equivalente de proteína. Se requiere un umbral de aproximadamente 0,5 ul de partículas LD o 0,08 ul de partículas HD para inducir una expansión detectable.
Figuras 3A-F. Caracterización funcional de células T. Figura 3A, se expandieron células T CD8+ utilizando partículas HD y LD. Las dosis de partículas se eligieron para inducir una expansión equivalente por partículas HD y LD (3,5 ul y 20 ul, respectivamente) y para inducir una expansión más robusta (20 ul de HD). Las muestras se volvieron a estimular en el día 7 y se evaluaron para determinar la función efectora mediante un ensayo de tinción de citocina intracelular. 20 ul de muestra de HD (círculos negros), 3,5 ul de muestra de HD (cuadrado relleno de negro) y 20 ul de muestras de LD (cuadrado no relleno) indujeron todas una desgranulación robusta, equivalente y dependiente de la dosis (figura 3B) medida mediante producción de CD107a y (figura 3C) IPNy. Figura 3D, fenotipo efector de memoria medido mediante tinción de proteínas de superficie CD44 y CD62L. Las células T pueden clasificarse como vírgenes (CD62Lhi, CD44lo), de memoria central (CD62Lhi, CD44hi) o de memoria efectoras (CD62Llo, CD44hi). E) el gráfico de FACS representativo muestra tres poblaciones siete días después de la estimulación con nano-aAPC. Figura 3F, se estimularon células T con 2, 10 y 50 pl de nano-aAPC de óxido de hierro LD o HD y se caracterizaron siete días después. Los gráficos de barras muestran el porcentaje de células vírgenes (sin relleno), Tcm (relleno gris) y Tem (relleno negro) generadas después de la estimulación.
Figuras 4A-B. Expansión de células T humanas específicas de antígeno a partir de precursores endógenos. Figura 4A, se incubaron PBMC con dosis crecientes de nano-aAPC de hierro-dextrano que portaban A2-M1 MHC-Ig y se evaluaron para determinar la especificidad de antígeno mediante tinción de tetrámeros antes de la estimulación (PBMC, fila superior) o después de una (fila media) o dos (fila inferior) semanas de estimulación. Los números en la parte superior izquierda representan el porcentaje de células CD8+ que eran tetrámeros+ (separadas). El tamaño de la población específica de M1 aumenta con tandas repetidas de estimulación (de arriba abajo) y dosis creciente de nano-aAPC (de izquierda a derecha). Los gráficos son representativos de los resultados de tres experimentos separados, resumidos en el panel B. Figura 4B, el porcentaje de CD8+ PBMC que se une a tetrámero M1 aumenta con la estimulación repetida y la dosis creciente de nano-aAPC (panel izquierdo). El número total de células positivas para tetrámero (panel derecho) aumenta de manera similar con las tandas de estimulación y las dosis de partículas, expandiéndose hasta 800 veces la población precursora inicial.
Figuras 5A-B. Síntesis y caracterización de nano-aAPC de puntos cuánticos. Figura 5A, se construyeron nano-aAPC de puntos cuánticos (Qdot) mediante acoplamiento mediado por avidina-biotina de dímero MHC-Ig soluble (señal 1) y anticuerpo anti-CD28 (señal 2) en una proporción de 1:1 a la superficie de una partícula de puntos cuánticos recubierta con polímero. Figura 5B, expansión de nano-aAPC de Qdot en células T CD8+ completas. La expansión en veces en el día 7 depende de la dosis y es específica de antígeno. Las partículas no relacionadas no indujeron ninguna expansión, mientras que la dosis más alta de aAPC de puntos cuánticos relacionados indujo una expansión de CTL de 14,6 veces.
Figuras 6A-B. Rechazo de tumores mediado por nano-aAPC in vivo. Figura 6A, aAPC de puntos cuánticos. Se inyectaron por vía subcutánea tumores B16 en el día 0, con inyección de células T pMEL vírgenes en el mismo día. Un día después, se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) aAPC de puntos cuánticos. Se midió el tamaño del tumor como el área de superficie (mm2) en los días indicados, mostrándose el área bajo la curva (AUC) a la derecha. Los ratones tratados con células T pMEL y aAPC de puntos cuánticos relacionadas (barras negras) tenían menos crecimiento tumoral en comparación con aquellos sin tratamiento (blanco), células T solas (gris claro) y células T aAPC de puntos cuánticos no relacionadas (a cuadros) (4 ratones por grupo). Se caracterizó la significación a lo largo de todo el experimento mediante el AUC (p<0,02) para el grupo de tratamiento en comparación con aAPC de puntos cuánticos no relacionadas. Figura 6B, aAPC de hierro-dextrano. Se inyectaron por vía intravenosa células T pMEL vírgenes en el día -7. Un día más tarde, se inyectaron i.v. o por vía subcutánea (s.c.) aAPC de puntos cuánticos en el costado derecho. Se inyectaron s.c. tumores B16 en el costado derecho en el día 0. A los ratones en las ramas de tratamiento se les administró una inyección adicional en el día 4 tras la inyección del tumor i.v. o s.c., para formar cuatro grupos de tratamiento: aAPC no relacionadas i.v. (día -6) a continuación s.c. (día 4) (a cuadros), aAPC relacionadas i.v. a continuación i.v. (gris claro), aAPC relacionadas i.v. a continuación s.c. (gris oscuro) y aAPC relacionadas s.c. a continuación s.c. (negro). Los ratones tratados con células T pMEL y aAPC de hierro-dextrano relacionadas i.v./s.c. o s.c./s.c. (cuadrados rellenos) tuvieron menos crecimiento tumoral en comparación con aAPC no relacionadas (7 ratones por grupo, * p<0,01 para el AUC).
Figura 7A. CFSE, un colorante cuya intensidad se reduce después de la proliferación de células T, muestra que las poblaciones de células T que incluyen células activadas (CD44 mixtas) proliferan en respuesta a 6 ng de estimulación basada en micro-aAPC o nano-aAPC, pero no las células con bajo contenido en CD44 vírgenes. Figura 7B. Cuando se titulan micro-aAPC y nano-aAPC a dosis que inducen expansión en veces equivalente (aproximadamente 17 veces) en células CD8+ (activadas), las nano-aAPC no pueden expandir las células T vírgenes.
Figura 8A. Diagrama esquemático de estrategia de enriquecimiento magnético para activación de células T potenciada. Se unen células precursoras de baja frecuencia a nano-aAPC que portan el antígeno específico de interés. Se enriquecen células específicas de antígeno mediante selección magnética positiva, potenciando la expansión posterior. Figura 8B. Se potencia la frecuencia de células T específicas de antígeno (eje de las y) mediante enriquecimiento magnético utilizando nano-aAPC. Figura 8C. Frecuencia aumentada de células específicas de antígeno después de siete días de expansión mediada por nano-aAPC tras el enriquecimiento. Figura 8D. Como un enfoque complementario, se activan células en un campo magnético después de la unión previa a nano-aAPC. El cultivo en un campo magnético refuerza la proliferación celular. Figura 8E. La tinción con CFSE tres días después de la activación muestra el refuerzo inducido por imanes después de 1-3 horas de activación. Figura 8F, esto conduce a expansión potenciada medida siete días después de la activación, proporcionando la estimulación magnética un refuerzo a todas las dosis consideradas.
Figuras 9A-G. Las nano-aAPC se unen a células vírgenes y activadas. Figura 9A, diagrama esquemático de síntesis de nano-aAPC acoplando dímeros MHC-Ig y anticuerpos anti-CD28 coestimuladores a nanopartículas de hierro-dextrano. Figura 9B, proliferación de células T pMEL vírgenes (izquierda) y activadas (derecha) medida mediante dilución de CFSE 3 días después de la estimulación con nano-aAPC que presentan 8 ng de Db-GP100. Controles no estimulados en gris. Figura 9C, expansión en veces de células vírgenes (rojo) y activadas (azul) siete días después de la estimulación con nano-aAPC. Las nano-aAPC que presentaban 8 ng o menos de MHC-Ig indujeron una proliferación mínima en células vírgenes (*, p < 0,01) en comparación con células T activadas. Figura 9D, disociación de nanopartículas de Kb-SIY unidas a células T 2C (semividas significativamente diferentes p<0,02 mediante la prueba de la t de Student para datos emparejados). Véase la tabla 1. Figura 9E, contactos medios de TCR-MHC realizados entre dímeros Kb-SIY (MHC-Ig) y nanopartículas de Kb-SIY (partícula) con células vírgenes (rojo) y activadas (azul) como se estima a partir de datos de disociación (p<0,05 mediante ANOVA con prueba a posteriori de Tukey, véase la tabla 1). Figura 9F, unión en equilibrio de dosis crecientes de nano-aAPC (medida mediante MHC-Ig total presentado) a células vírgenes (rojo) y activadas (azul) (p<0,0001 mediante ANOVA de dos factores). Figura 9G, un modelo de unión que explica la unión en equilibrio aumentada y la velocidad de disociación de partículas: las células vírgenes se unen a más perlas con menores contactos por perla que las células activadas.
Figuras 10A-G. Agrupamiento de aAPC y CD3e inducido por un campo magnético. Figura 10A-C, diagrama esquemático de agrupamiento inducido por imanes. Figura 10D, agregación de aAPC y CD3 inmediatamente después de la unión de nano-aAPC (tiempo 0) y después de la incubación en presencia o ausencia de un campo magnético. Las células se marcaron con anticuerpos contra LFA-1 (verde), MHC-Ig en nano-aAPC (rojo) y CD3e (magenta). Se muestran imágenes representativas para las células antes de la incubación (tiempo 0, parte superior izquierda), células incubadas con partículas no relacionadas (no relacionadas, parte superior derecha), células incubadas con nano-aAPC relacionadas (sin imán, parte inferior izquierda) y células incubadas con nano-aAPC relacionadas en un campo magnético (imán, parte inferior derecha). Figura 10E, detección de agregados mostrada para imágenes representativas a partir del grupo de tiempo 0 (las dos a la izquierda) y el grupo de imanes (las dos a la derecha). Los perfiles blancos representan los bordes de los agrupamientos de CD3 (magenta) identificados por el algoritmo. Figura 10F, área de agrupamiento promedio identificada con algoritmo de detección de agrupamientos (15 células/grupo). El grupo sin imanes tuvo agrupamientos significativamente mayores que el de tiempo 0 (*, diferencia media de 0,22 pm2) y el grupo de imanes tuvo agrupamientos significativamente mayores tanto que el de tiempo 0 (**, diferencia media de 0,46 pm2 p < 0,0001 mediante ANOVA con prueba a posteriori de Tukey) como que sin imanes (**, diferencia media de 0,24 pm2). Figura 10G, las células en el grupo sin imanes tuvieron menos agrupamientos por célula que el de tiempo 0 (*, diferencia media de 5,8 agrupamientos) y las células del grupo de imanes tuvieron menos agrupamientos por célula que el de sin imanes (**, diferencia media de 1,9 agrupamientos, p < 0,001 mediante ANOVA con prueba a posteriori de Tukey).
Figuras 11A-G. La estimulación con nano-aAPC potenciada con imanes conduce a una proliferación robusta de células T in vitro. Figura 11A, proliferación de células T pMEL mediante dilución de CFSE tres días después de la estimulación con nano-aAPC en presencia (rojo) o ausencia (negro) de un campo magnético externo de 0,2 T. Figura 11B, expansión en veces de muestras descritas en A siete días después de la estimulación. Figura 11C, células T pMEL incubadas con una dosis de 5 ng de MHC-Ig de nano-aAPC y un campo magnético de 0,2 T durante 0-24 horas. Proliferación evaluada mediante dilución de CFSE en el día 3. Figura 11D, expansión en veces de muestras de C siete días después de la estimulación (*, p<0,001 mediante ANOVA con prueba a posteriori de Tukey). Figura 11E, células T pMEL incubadas con una dosis de 5 ng de MHC-Ig de nano-aAPC y campos magnéticos de intensidad máxima creciente (0,15-0,225 T) generados por imanes de neodimio de grosor creciente durante veinticuatro horas. Figura 11F, proliferación de muestras de E siete días después de la estimulación (* mayor que sin imanes, ** mayor que imán de 0,15 T, p<0,001 mediante ANOVA con prueba a posteriori de Tukey). Figura 11G, expansión específica de antígeno de linfocitos CD8+ endógenos de ratones de tipo natural después de la estimulación con nano-aAPC de Kb-Trp2 en presencia o ausencia de un campo magnético de 0,2 T durante veinticuatro horas. Después de siete días, se tiñeron las poblaciones con dímero MHC-Ig de Kb-Trp2 relacionado (fila superior) o de Kb-SIINF no relacionado (fila inferior).
Figuras 12A-F. Expansión de células T potenciada con imanes in vivo y eficacia aumentada de inmunoterapia adoptiva. Figura 12A, diagrama esquemático de modelo de inmunoterapia adoptiva. Se estimularon células T CD44lo, CD8+ de ratones transgénicos Thy1.1+ pMEL TCR in vitro durante 24 horas en presencia o ausencia de nano-aAPC (5 ng de MHC-Ig total) y un campo magnético antes de transferirse de manera adoptiva a ratones receptores Thy1.2+ B6 de tipo natural (6 ratones por grupo). Figura 12B, frecuencias representativas de células Thy1.1 de bazos 7 días después de la transferencia y de ganglios linfáticos 21 días después de la transferencia. Figura 12C, las frecuencias de células Thy1.1+ fueron significativamente mayores en ratones a los que se les administraron células T estimuladas con nano-aAPC en un campo magnético (rojo) en comparación con nano-aAPC sin imán (gris) y sin estimulación (blanco) (p<0,001 para el efecto del tratamiento mediante ANOVA de dos factores durante 7 y 21 días). Figura 12D, células Thy1.1 totales en todos los órganos combinados en el día 7 y el día 21. Se observaron cinco veces más células en el grupo de nano-aAPC imán que en el grupo de nano-aAPC solas en el día 7 (p < 0,05 mediante prueba de la t de Student), pero no alcanzaron significación en el día 21 (p = 0,15). Figura 12E, diagrama esquemático de tratamiento de tumores establecidos con inmunoterapia adoptiva potenciada por campo magnético. Se administraron tumores s.c. en el día 0, mieloablación parcial en el día 9 y se transfirieron células T CD44lo, CD8+ pMEL estimuladas durante 24 horas con nano-aAPC (5 ng de MHC-Ig total) en un campo magnético (rojo) o nano-aAPC sin imán (negro) en el día 10. Se utilizaron grupos con células T solas (gris) y sin tratar (sin rellenar) como control (8 ratones por grupo). Figura 12F, el tratamiento con células T activadas con nano-aAPC potenciadas con imanes atenuó el crecimiento tumoral en comparación con grupos sin imán y de control (p<0,0001 para el efecto de tratamiento mediante ANOVA de dos factores). La flecha indica el punto de tiempo de transferencia adoptiva (día 10). Se censuraron los ratones si murieron o si los tumores eran mayores de 150 mm2. El tratamiento condujo a supervivencia aumentada en el grupo de células T nano-aAPC imán (p<0,001 mediante prueba de orden logarítmico de Mantel-Cox).
Figuras 13A-D. Caracterización de proteína unida a nano-aAPC y micro-aAPC mediante fluorescencia. Figura 13A, intensidad de fluorescencia media (MFI) de anticuerpo unido a nanopartículas y controles. Se incubaron partículas de nano-aAPC y micro-aAPC (del tamaño de una célula) con exceso de anticuerpo monoclonal anti-IgG1 de ratón (para MHC-Ig) y anticuerpo anti-anticuerpo conjugado con PE durante 30 minutos, y se lavaron en una columna magnética. Pudo detectarse anticuerpo fluorescente unido a partículas por encima de las muestras de fondo, incluyendo micropartículas y nanopartículas no teñidas con anticuerpo anti-IgGl (sin Ac) y partículas que no se acoplaron a la proteína y teñidas con anticuerpo anti-IgGl (blanco). Se determinó la concentración de proteína en solución mediante comparación con una curva patrón de IgG1-PE. Se muestra la fluorescencia para anticuerpo anti-IgGl y es representativa de tres experimentos. HD - alta densidad. LD - baja densidad. Figura 13B, las partículas en solución no interfieren en la fluorescencia de anticuerpos. Se tituló anticuerpo anti-IgG 1 PE soluble y se midió para determinar la fluorescencia. Se observó una emisión de fluorescencia similar cuando se midió anticuerpo soluble en presencia de micropartículas y nanopartículas de blanco. Figura 13C, el lavado en columna magnética fue suficiente para retirar el anticuerpo libre. Después de tres lavados (fracción 3), la fluorescencia no es detectable por encima del fondo. Se proporciona la fluorescencia de anticuerpo libre 0,63 ug/ml para comparación. Figura 13D, se caracterizó la concentración de nanopartículas mediante absorbancia de hierro a 405 nm. Se determinaron las concentraciones de partículas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas. Se midieron las titulaciones de nanopartículas para determinar la absorbancia y se calculó una curva patrón para determinar la concentración de partículas.
Figuras 14A-E. Proliferación de células T pMEL inducida por micro-aAPC. Figura 14A, los esplenocitos CD8+ pMEL incluyen una población de células positivas para CD44 de fenotipo de memoria (porcentaje representativo mostrado como porcentaje de CD8, parte izquierda). Se aislaron células vírgenes CD441o mediante enriquecimiento de selección negativa sin contacto con anticuerpo anti-CD44 en una columna de enriquecimiento magnético. Figura 14B, proliferación de células CD441o vírgenes (izquierda) y activadas (derecha) mediante dilución de CFSE estimuladas tres días con micro-aAPC (líneas de color azul y rojo oscuro) y nano-aAPC (líneas de color azul y rojo claro) o no estimuladas (líneas grises). Se utilizaron micro-aAPC y nano-aAPC a dosis que presentaban una cantidad total equivalente de MHC-Ig (8 ng). Los datos de nano-aAPC se reproducen a partir de la figura 1. Figura 14C, proliferación de células vírgenes (rojo) y activas (azul) siete días después de la estimulación con dosis indicadas de micro-aAPC. Figura 14D, efecto de la densidad de MHC-Ig sobre la estimulación inducida por micro-aAPC. Se normalizaron micro-aAPC de alta densidad (HD, azul) y baja densidad (LD, rojo) para el MHC-Ig total (4-16 ng). Véase la tabla 1 para la densidad. Proliferación evaluada mediante dilución de CFSE tres días después de la activación. Figura 14E, expansión en veces de muestras mostradas en la figura 14D siete días después de la activación, representativas de tres experimentos.
Figuras 15A-D. Figura 15A, unión de nanopartículas de Kb-SIY a células T 2C relacionadas. Unión a células activadas, siete días después de la activación por péptido (activadas, azul, MFI 89) en comparación con células T 2C aisladas CD441o vírgenes (vírgenes, rojo, MFI 179) y células T pMEL CD441o no relacionadas de control (unión no específica, gris, MFI 21). Se caracteriza la unión como la intensidad de fluorescencia media de partículas marcadas con Alexa 647 unidas a células. Figura 15B, expresión de TCR en superficie de células vírgenes (MFI 137) y activadas (MFI 128) medida con anticuerpo anti-TCRp fluorescente. Figura 15C, disociación de dímeros MHC-Ig de Kb-SIY a partir de células activadas (color azul oscuro) y vírgenes (color rojo oscuro). La disociación de nano-aAPC a partir de células activadas (color azul claro) y vírgenes (color rojo claro) se reproduce a partir de la figura 1 para comparación. Figura 15D, curvas de disociación de nano-aAPC unidas a células CD44-bajo vírgenes antes (rojo) y después (negro) de una hora de incubación en un campo magnético. La figura es representativa de 2 experimentos.
Figuras 16A-E. Agrupamiento y expansión de TCR por micro-aAPC en un campo magnético. Figura 16A, agregación de micro-aAPC en un campo magnético. Imágenes confocales representativas de micro-aAPC (rojo) mostradas antes (izquierda) y después (derecha) de la aplicación de un campo magnético. Figura 16B, la agregación magnética de micro-aAPC no induce la agregación de CD3. Se marcaron células con anticuerpos contra LFA-1 (verde), MHC-Ig en micro-aAPC (rojo) y CD3e (magenta). Las micro-aAPC presentaron autofluorescencia en los tres canales, particularmente en los canales rojo y magenta. Se muestran imágenes representativas para células incubadas con micro-aAPC relacionadas (sin imán), tanto sin contacto (parte superior) como en contacto (parte inferior) con micro-aAPC, y células incubadas con nano-aAPC relacionadas en un campo magnético (imán). Figura 16C, área de agrupamiento promedio y agrupamientos por célula identificados con un algoritmo de detección de agrupamientos (20 células/grupo, divididas uniformemente entre células en contacto y sin contacto con partículas). Las muestras de control incluyen células antes de la incubación (tiempo 0) y células incubadas con micropartículas no relacionadas (no relacionadas) (p>0,05 mediante ANOVA). Figura 16D, células T pMEL incubadas con una dosis de 5 ng (izquierda) y 10 ng (derecha) de MHC-Ig de micro-aAPC con (rojo) y sin (negro) un campo magnético de 0,2 T durante 3 días. Proliferación evaluada mediante dilución de CFSE en el día 4. Figura 16E, expansión en veces de células T pMEL incubadas con dosis crecientes de micro-aAPC con y sin un campo magnético de 0,2 T siete días después de la estimulación (p>0,05 mediante ANOVA de dos factores).
Figura 17. Intensidad de campo magnético generado en cultivo mediante imanes de discos de neodimio. Gráficos de densidad de intensidad de campo en cultivo tal como se estima mediante análisis de elementos finitos con el software FEMM (Finite Element Method Magnetics). Se utilizaron imanes de disco (magenta) de %”, / ” y W’ de grosor para generar campos hasta 0,225 T, 0,200 T y 0,150 T, respectivamente.
CARACTERÍSTICAS
La presente invención se refiera a un procedimiento in vitro de activación de células T tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente divulgación da a conocer una célula presentadora de antígeno artificial a escala nanométrica (nano-aAPC) que comprende una nanopartícula; como mínimo una molécula que afecta a linfocitos sobre la superficie de la nanopartícula; y, como mínimo, un complejo molecular sobre la superficie de la nanopartícula que, cuando se une a un antígeno, se engancha a un receptor de linfocitos clonotípico único, es decir, un receptor de linfocitos específico de antígeno.
La presente divulgación da a conocer una nano-aAPC que comprende una nanopartícula; como mínimo una molécula que afecta a células B sobre la superficie de la nanopartícula; y, como mínimo, un complejo molecular sobre la superficie de la nanopartícula que se engancha a inmunoglobulinas de la superficie de células B o complejos de MHC-antígeno sobre la superficie de una célula B.
La presente divulgación da a conocer una nano-aAPC que comprende una nanopartícula; como mínimo una molécula coestimuladora de células T sobre la superficie de la nanopartícula; y, como mínimo, un complejo molecular de MHC de clase I sobre la superficie de la nanopartícula. El, como mínimo, un complejo molecular de MHC de clase I comprende, como mínimo, dos proteínas de fusión. Una primera proteína de fusión comprende una primera cadena a de MHC de clase I y una primera cadena pesada de inmunoglobulina y en el que una segunda proteína de fusión comprende una segunda cadena a de MHC de clase I y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina primera y segunda se asocian para formar el complejo molecular de MHC de clase I. El complejo molecular de MHC de clase I comprende una primera hendidura de unión a péptido de MHC de clase I y una segunda hendidura de unión a péptido de MHC de clase I.
La presente divulgación da a conocer una preparación que comprende una pluralidad de nano-aAPC descritas en los tres párrafos anteriores.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de inducción de la formación de células T específicas de antígeno. El procedimiento comprende poner en contacto una preparación aislada que comprende una pluralidad de células T precursoras con, como mínimo, una primera nano-aAPC que comprende una molécula que afecta a células T y un complejo presentador de antígeno que comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno. Un antígeno se une a la hendidura de unión antigénica. De ese modo, se induce que los miembros de la pluralidad de células T precursoras formen una primera población celular que comprende células T específicas de antígeno que reconocen el antígeno. El número o porcentaje de células T específicas de antígeno en la primera población celular es mayor que el número o porcentaje de células T específicas de antígeno que se forman si se incuban células T precursoras con una nano-aAPC que comprende un anticuerpo que se une específicamente a CD3 pero no comprende un complejo presentador de antígeno.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de aumento del número o porcentaje de células T específicas de antígeno en una población de células. El procedimiento comprende incubar una primera población celular que comprende células T específicas de antígeno con, como mínimo, una primera nano-aAPC que comprende una molécula que afecta a células T y un complejo presentador de antígeno que comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno. Un antígeno se une a la hendidura de unión a antígeno. La incubación se lleva a cabo durante un periodo de tiempo suficiente para formar una segunda población celular que comprende un número o porcentaje aumentado de células T específicas de antígeno con respecto al número o porcentaje de células T específicas de antígeno en la primera población celular.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de regulación de una respuesta inmunitaria en un paciente. El procedimiento comprende administrar a un paciente una preparación que comprende (A) una pluralidad de partículas y (B) un portador farmacéuticamente aceptable. Los miembros de la pluralidad de partículas comprenden (1), como mínimo, una molécula que afecta a células T; y (2), como mínimo, un complejo presentador de antígeno. El, como mínimo, un complejo presentador de antígeno comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno. Un antígeno se une a la, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de supresión de una respuesta inmunitaria en un paciente. El procedimiento comprende administrar a un paciente una preparación que comprende (A) una pluralidad de partículas y (B) un portador farmacéuticamente aceptable. Los miembros de la pluralidad de partículas comprenden (1), como mínimo, una molécula inductora de apoptosis; y (2), como mínimo, un complejo presentador de antígeno. El, como mínimo, un complejo presentador de antígeno comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno. Un antígeno se une a la, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de aumento del número o porcentaje de células B productoras de anticuerpos en una población. El procedimiento comprende poner en contacto una preparación aislada que comprende una pluralidad de células B precursoras con, como mínimo, una primera nano-aAPC que comprende una nanopartícula; como mínimo una molécula que afecta a células B sobre la superficie de la nanopartícula; y, como mínimo, un complejo molecular sobre la superficie de la nanopartícula que se engancha a inmunoglobulinas de la superficie de células B o complejos de MHC-antígeno en la superficie de una célula B. De ese modo, se induce que los miembros de la pluralidad de células B precursoras formen una primera población celular que comprende células B productoras de anticuerpos que producen anticuerpos que se unen específicamente al péptido antigénico.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de aumento del número o porcentaje de células B productoras de anticuerpos en una población. El procedimiento comprende incubar una primera población celular que comprende células B productoras de anticuerpos con, como mínimo, una primera nano-aAPC que comprende una nanopartícula; como mínimo una molécula que afecta a células B sobre la superficie de la nanopartícula; y, como mínimo, un complejo molecular sobre la superficie de la nanopartícula que se engancha a inmunoglobulinas de la superficie de células B o complejos de MHC-antígeno en la superficie de una célula B. La incubación se lleva a cabo durante un periodo de tiempo suficiente para formar una segunda población celular que comprende un número o porcentaje aumentado de células B productoras de anticuerpos con respecto al número o porcentaje de células B productoras de anticuerpos en la primera población celular.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de aumento del número o porcentaje de células B productoras de anticuerpos en una población. El procedimiento comprende poner en contacto una preparación aislada que comprende una pluralidad de células B precursoras con una preparación de nano-aAPC. Las nano-aAPC comprenden una nanopartícula, como mínimo una molécula que afecta a células B sobre la superficie de la nanopartícula; y, como mínimo, un complejo molecular sobre la superficie de la nanopartícula que se engancha a inmunoglobulinas de la superficie de células B o complejos de MHC-antígeno en la superficie de una célula B. De ese modo, se induce que los miembros de la pluralidad de células B precursoras formen una primera población celular que comprende células B productoras de anticuerpos que producen anticuerpos que se unen específicamente al péptido antigénico.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de regulación de una respuesta inmunitaria en un paciente. El procedimiento comprende administrar a un paciente una preparación que comprende (A) una pluralidad de partículas y (B) un portador farmacéuticamente aceptable. Los miembros de la pluralidad de partículas comprenden (1), como mínimo, una molécula que afecta a células B; y (2), como mínimo, un complejo molecular que se engancha a inmunoglobulinas de la superficie de células B o complejos de MHC-antígeno en la superficie de células B.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de enriquecimiento de células T específicas de antígeno en una población de células T policlonales. El procedimiento comprende incubar la población de células T policlonales con una nano-aAPC que comprende una nanopartícula; como mínimo, una molécula que afecta a linfocitos sobre la superficie de la nanopartícula; y, como mínimo, un complejo molecular sobre la superficie de la nanopartícula que, cuando se une a un antígeno, se engancha a receptores de linfocitos específicos de antígeno. La nano-aAPC comprende un anticuerpo de reticulación o una molécula de oligomerización.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de activación de células T. El procedimiento comprende incubar, en presencia de un campo magnético, una población de células T con una nano-aAPC que comprende una molécula que afecta a células T y un complejo presentador de antígeno que comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno. La nano-aAPC es paramagnética.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de proporcionar una población de células T específicas de antígeno a un paciente que lo necesita, que comprende:
(1) poner en contacto una población aislada de células T con una pluralidad de células presentadoras de antígeno artificiales a escala nanométrica (nano-aAPC) en presencia de un campo magnético de suficiente intensidad para generar células T específicas de antígeno, en el que las nano-aAPC de la serie son nanopartículas paramagnéticas que comprenden en su superficie (i), como mínimo, una molécula que afecta a células T y (ii), como mínimo, un complejo presentador de antígeno, en el que el complejo presentador de antígeno comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno y en el que la hendidura de unión a antígeno comprende un antígeno;
(2) aislar complejos de células T específicas de antígeno unidas a nano-aAPC a partir de la población aislada de células T; y
(3) administrar los complejos al paciente.
En algunas variaciones de este procedimiento, la población aislada de células T comprende células T vírgenes. En algunas variaciones de estos procedimientos, se aíslan complejos utilizando una columna de enriquecimiento magnético, citometría de flujo o centrifugación diferencial. En algunas variaciones de este procedimiento, los complejos se administran por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en administración intravenosa, administración intraarterial, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intralinfática y administración intratumoral.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento de proporcionar una población de células T específicas de antígeno a una zona diana en un paciente que lo necesita, que comprende:
(1) administrar al paciente una pluralidad de células presentadoras de antígeno artificiales a escala nanométrica (nano-aAPC) en presencia de un campo magnético de suficiente intensidad para estimular células T específicas de antígeno, en el que las nano-aAPC de la pluralidad son paramagnéticas y comprenden en su superficie (i) una molécula que afecta a células T y (ii) un complejo presentador de antígeno, en el que el complejo presentador de antígeno comprende una hendidura de unión a antígeno, en el que la unión de un antígeno a la hendidura de unión a antígeno engancha receptores de linfocitos específicos de un único antígeno; y
(2) aplicar a la zona diana un campo magnético, en el que la zona diana comprende el antígeno que se engancha a receptores de linfocitos específicos de antígeno únicos, dirigiendo así las nano-aAPC a la zona diana.
En algunas variaciones del procedimiento descrito en el párrafo [35], se administran nano-aAPC por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en administración intravenosa, administración intraarterial, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intralinfática y administración intratumoral. En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], el, como mínimo, un complejo presentador de antígeno comprende una hendidura de unión a péptido de MHC de clase I.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], el, como mínimo, un complejo presentador de antígeno es una molécula de MHC de clase I. En algunas de estas variaciones, el, como mínimo, un complejo presentador de antígeno es un complejo molecular de MHC de clase I que comprende, como mínimo, dos proteínas de fusión, en el que una primera proteína de fusión comprende una primera cadena a de MHC de clase I y una primera cadena pesada de inmunoglobulina y en el que una segunda proteína de fusión comprende una segunda cadena a de MHC de clase I y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina, en el que las cadenas pesadas de inmunoglobulina primera y segunda se asocian para formar el complejo molecular de MHC de clase I, en el que el complejo molecular de MHC de clase I comprende una primera hendidura de unión a péptido de MHC de clase I y una segunda hendidura de unión a péptido de MHC de clase I.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], el, como mínimo, un complejo presentador de antígeno comprende una hendidura de unión a péptido de MHC de clase II. En algunas de estas variaciones, el complejo presentador de antígeno es una molécula de MHC de clase II. En algunas de estas variaciones, el complejo presentador de antígeno es un complejo molecular de MHC de clase II que comprende, como mínimo, cuatro proteínas de fusión, en el que (a) dos primeras proteínas de fusión comprenden (i) una cadena pesada de inmunoglobulina y (ii) un dominio extracelular de una cadena p de MHC de clase II; y (b) dos segundas proteínas de fusión comprenden (i) una cadena ligera de inmunoglobulina y (ii) un dominio extracelular de una cadena a de MHC de clase II, en el que las dos primeras y las dos segundas proteínas de fusión se asocian para formar el complejo molecular de MHC de clase II, en el que el dominio extracelular de la cadena p de MHC de clase II de cada primera proteína de fusión y el dominio extracelular de la cadena a de MHC de clase II de cada segunda proteína de fusión forman una hendidura de unión a péptido de MHC de clase II. En algunas de estas variaciones, la cadena pesada de inmunoglobulina comprende una región variable.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], un péptido antigénico se une a la, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno. En algunas de estas variaciones, el péptido antigénico se selecciona del grupo que consiste en un péptido de un antígeno asociado a tumor, un péptido de un autoantígeno, un péptido de un aloantígeno y un péptido de un antígeno de agente infeccioso.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], las nano-APC comprenden, como mínimo, dos complejos presentadores de antígeno. En algunas de estas variaciones, un antígeno idéntico se une a cada hendidura de unión a antígeno de los, como mínimo, dos complejos presentadores de antígeno. En otras de estas variaciones, se unen diferentes antígenos a cada hendidura de unión a antígeno de los, como mínimo, dos complejos presentadores de antígeno. En algunas variaciones, un primer complejo presentador de antígeno comprende, como mínimo, una hendidura de unión a péptido de MHC de clase I y en el que un segundo complejo presentador de antígeno comprende, como mínimo, una hendidura de unión a péptido de MHC de clase II.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], el, como mínimo, un complejo presentador de antígeno es una molécula de tipo MHC no clásica. En algunas de estas variaciones, la molécula de tipo MHC no clásica es un miembro de la familia CD1. La molécula de tipo MHC no clásica se puede seleccionar del grupo que consiste en CD1a, CD1b, CD1c, CD1d y CD1e.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], la, como mínimo, una molécula que afecta a células T es una molécula coestimuladora de células T. La molécula coestimuladora de células T se puede seleccionar del grupo que consiste en CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, un anticuerpo que se une específicamente a CD28, un anticuerpo que se une específicamente a HVEM, un anticuerpo que se une específicamente a CD40L, un anticuerpo que se une específicamente a OX40 y un anticuerpo que se une específicamente a 4-1BB.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], la, como mínimo, una molécula que afecta a células T es una molécula de adhesión.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], la molécula de adhesión se selecciona del grupo que consiste en ICAM-1 y LFA-3.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], la, como mínimo, una molécula que afecta a células T es un factor de crecimiento de células T. El factor de crecimiento de células T se puede seleccionar del grupo que consiste en una citocina y un superantígeno. La citocina se puede seleccionar del grupo que consiste en IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 e interferón gamma. El factor de crecimiento de células T se puede seleccionar del grupo que consiste en (A) un primer complejo molecular que comprende, como mínimo, dos proteínas de fusión, en el que una primera proteína de fusión comprende una primera citocina y una cadena pesada de inmunoglobulina y en el que una segunda proteína de fusión comprende una segunda citocina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina, en el que las cadenas pesadas de inmunoglobulina primera y segunda se asocian para formar el primer complejo molecular; y (B) un segundo complejo molecular que comprende, como mínimo, cuatro proteínas de fusión, en el que, (a) dos primeras proteínas de fusión comprenden (i) una cadena pesada de inmunoglobulina y (ii) una primera citocina; y (b) dos segundas proteínas de fusión comprenden (i) una cadena ligera de inmunoglobulina y (ii) una segunda citocina, en el que las dos primeras y las dos segundas proteínas de fusión se asocian para formar el segundo complejo molecular.
En algunas de las variaciones descritas anteriormente, el factor de crecimiento de células T es el primer complejo molecular. En algunas de estas variaciones, las citocinas primera y segunda son idénticas. En otras de estas variaciones, las citocinas primera y segunda son diferentes.
En algunas de las variaciones descritas anteriormente, el factor de crecimiento de células T es el segundo complejo molecular. En algunas de estas variaciones, las citocinas primera y segunda son idénticas. En otras de estas variaciones, las citocinas primera y segunda son diferentes.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], la, como mínimo, una molécula que afecta a células T es una molécula inductora de células T reguladora. La molécula inductora de células T se puede seleccionar del grupo que consiste en TGFp, IL-10, interferón-a e IL-15.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], la, como mínimo, una molécula que afecta a células T es una molécula inductora de apoptosis. La molécula inductora de apoptosis se puede seleccionar del grupo que consiste en una toxina, TNFa y ligando Fas.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], las nano-aAPC comprenden, como mínimo, dos moléculas que afectan a células T diferentes.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], la incubación se lleva a cabo a 37 °C durante de 10 minutos a 3 días.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], las células T específicas de antígeno son células T citotóxicas.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], las células T específicas de antígeno son células T cooperadoras.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], las células T específicas de antígeno son células T reguladoras.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], el paciente tiene cáncer, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa o está inmunodeprimido.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], las células T precursoras se obtienen del paciente.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], las células T precursoras se obtienen de un donante que no es el paciente.
En algunas variaciones de los procedimientos descritos en los párrafos [34] y [35], las células T específicas de antígeno se administran por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en administración intravenosa, administración intraarterial, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intralinfática y administración intratumoral.
La presente divulgación da a conocer procedimientos de utilización de nanopartículas, por ejemplo, nanopartículas magnéticas, para seleccionar como diana células en diferentes estados fisiológicos (por ejemplo, células T vírgenes frente a activadas previamente) y estimular la población celular diana. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 9C y se comenta en más detalle en los ejemplos específicos a continuación, las nano-aAPC que proporcionan una dosis de 32 ng de MHC estimulan tanto las células T vírgenes como las activadas previamente entre 20 y 30 veces en un tiempo de una semana. Sin embargo, a 8 ng o 3,2 ng de MHC, sólo se estimularon las células T activadas. Por tanto, se puede utilizar una dosis de nano-aAPC que comprende, por ejemplo, 3,2-8 ng de MHC para estimular células T activadas previamente en una población de células T sin afectar a las células T vírgenes en la población.
La presente divulgación da a conocer procedimientos de estimulación de manera diferencial de células T activadas previamente frente a células T vírgenes. En algunas variaciones, se pueden utilizar nano-aAPC que comprenden 3,2-8 ng de MHC frente a 32 ng MHC para separar la unión de nano-aAPC y el aislamiento de células T de la activación de las células T. En algunas variaciones, una población de células T se agota sustancialmente de células T activas previamente utilizando, por ejemplo, un anticuerpo para CD44, dejando una población enriquecida para células T vírgenes. Las células T vírgenes unidas a las nano-aAPC permitirán su purificación. Las células T vírgenes que comprenden las nano-aAPC unidas se pueden activar exponiendo los complejos de célula T-nano-aAPC a un campo magnético.
La presente divulgación da a conocer procedimientos de separación, caracterización y utilización como agente terapéutico para otras células incluyendo, por ejemplo, células B y células madre. La densidad de ligandos óptima sobre la superficie de una nanopartícula (o, como alternativa, la dosis de nanopartículas que comprenden tales ligandos) que activarán de manera diferencial células de una población en diferentes estados fisiológicos se determina utilizando procedimientos tales como los descritos a continuación en el ejemplo 9. Dependiendo de la población celular, el ligando puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, un péptido, un nucleótido, un hidrato de carbono, un lípido, la totalidad o una porción del ligando natural para un receptor dado (por ejemplo, EGF, PDGF), un compuesto químico (por ejemplo, una sal de cromo o un ligando sintético monovalente que se une a receptores de moléculas de inmunofilina tales como un dominio de unión a FKBP), fragmentos Fab de anticuerpo antiintegrina sencillos, péptidos de RGD y similares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La inmunoterapia incluye la activación y expansión de células inmunitarias para tratar una enfermedad. La inducción de respuestas de linfocitos (CTL) citotóxicos (CD8+) es atractiva para la terapia ya que los CTL son específicos para un antígeno o patógeno tumoral dado, se expanden varios logaritmos para producir respuestas robustas, y generan memoria a largo plazo que puede prevenir la recidiva de la enfermedad (1). Los CTL se pueden activar directamente in vivo o se pueden expandir in vitro y transferirse de manera adoptiva a un paciente (3, 4).
Las células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC), que suministran señales estimuladoras a linfocitos citotóxicos, son una potente herramienta para la inmunoterapia in vitro e in vivo. Hasta ahora, se han sintetizado aAPC basadas en partículas acoplando una proteína activadora de células T a un soporte rígido de varios micrómetros de diámetro. Por ejemplo, se desarrolla de manera previa una plataforma de expansión de células T a base de perlas de 4,5 pm de diámetro (“escala micrométrica”) del tamaño de una célula acoplando proteínas que suministran dos señales de activación de células T necesarias y suficientes (5, 6). Las señales presentes en las APC que se requieren para la activación de células T incluyen una señal 1, péptido antigénico relacionado presentado en el contexto de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que se une a TCR (7); y la señal 2, un grupo de receptores coestimuladores que modulan la respuesta de células T. En algunas realizaciones de este sistema, la señal 1 se transmite mediante un dímero MHC-inmunoglobulina quimérico cargado con péptido específico (MHC-Ig), y la señal 2 es B7.1 (el ligando natural para el receptor de células T, CD28) o un anticuerpo de activación contra CD28. Ambas proteínas se acoplan de manera química directamente a la superficie de una perla de escala micrométrica (4,5 pm) para crear una célula presentadora de antígeno artificial (aAPC).
Sin embargo, existen varios inconvenientes para las aAPC a escala micrométrica. Las perlas grandes se pueden albergar en lechos de manera capilar e inducir daño tisular cuando se inyectan por vía intravenosa. Cuando se inyectan por vía subcutánea, las perlas de tamaño micrométrico no se pueden portar fácilmente a los ganglios linfáticos en los que residen la mayoría de las células T (8, 9). Además, se conocen perlas de tamaño micrométrico que se aclaran de manera preferencial por las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial (10, 11).
La presente divulgación supera estas limitaciones proporcionando diversas aAPC a escala nanométrica (nano-aAPC). Hasta donde se sabe, esta es la primera descripción de aAPC basadas en perlas a escala nanométrica que inducen la proliferación de células T. Se han evaluado nanopartículas para la captación de antígenos o fármacos; sin embargo, las plataformas de aAPC requieren interacciones de ligando-receptor de la superficie celular específicas para producirse en la superficie de contacto nanopartícula-célula. Los estudios han sugerido que sólo las perlas mayores de 2 micrómetros de diámetro pueden inducir la proliferación de células T (16, 17); y el trabajo con partículas de tamaño más pequeño, tales como nanocristales de puntos cuánticos, se han centrado en la utilización de los reactivos para estudiar aspectos biofísicos de la interacción TCR-MHC (15). Cuando se someten a prueba directamente, un trabajo reciente demostró que las nanopartículas eran mucho menos eficaces que las microperlas en la inducción de respuestas funcionales a corto plazo, sin proliferación notificada (18).
Por lo tanto, no se esperaba que las nano-aAPC, tal como se describen en el presente documento indujeran proliferación de células T específicas de antígeno, tanto a partir de esplenocitos de ratón transgénico TCR como de células T policlonales de sangre periférica humanas. Las células T estimuladas tenían un fenotipo efector robusto, desgranulación y producción de IFNy después de una nueva exposición. Las aAPC a escala nanométricas descritas en el presente documento median también en el rechazo tumoral en un modelo de melanoma de ratón subcutáneo cuando se inyectan in vivo.
Aunque no se limitan a las realizaciones descritas en los ejemplos de realización a continuación, esos ejemplos ilustran dos realizaciones de nano-aAPC: (1) perlas paramagnéticas de hierro-dextrano biocompatibles de 50-100 nm de diámetro; y (2) nanocristales de puntos cuánticos recubiertos con avidina de menos de 20 nm de diámetro. En estas realizaciones, la señal 1 se proporciona mediante complejos péptido-MHC, y la señal 2 se proporciona mediante B7.1-Ig o anticuerpo anti-CD28.
Las nano-aAPC permiten la exploración de nuevas estrategias de inmunoterapia basadas en partículas. Como se indicó anteriormente, las aAPC a escala micrométrica son demasiado grandes como para ser transportado por los vasos linfáticos, y cuando se inyectan por vía subcutánea permanecen en el sitio de inyección. Cuando se inyectan por vía intravenosa, se albergan en lechos de manera capilar. De hecho, el mal tráfico de perlas a escala micrométrica ha impedido el estudio de dónde deben desplazarse las aAPC para una inmunoterapia óptima. Es probable que el tráfico y la biodistribución de nano-aAPC sea más eficaz que las aAPC a escala micrométrica y, por tanto, permitirán la exploración de nuevas estrategias de inmunoterapia in vivo.
Por ejemplo, dos posibles sitios en los que las aAPC pueden ser más eficaces son el ganglio linfático, en el que residen las células T vírgenes y de memoria, y el tumor en sí mismo. Las nanopartículas de aproximadamente 50-100 nm de diámetro se pueden absorber por los vasos linfáticos y se pueden transportar a los ganglios linfáticos (8, 30), obteniendo así acceso a una gran agrupación de células T. Tal como se describe en los ejemplos a continuación, la inyección subcutánea de nano-aAPC dio como resultado menos crecimiento tumoral que los controles o las perlas inyectadas por vía intravenosa. Esto apunta al drenaje de nano-aAPC del espacio extracelular a los ganglios linfáticos como un posible mecanismo para la expansión de células T in vivo óptima. Además, los vehículos de administración a escala nanométrica se acumulan de manera preferencial en los tumores a través del efecto de retención de permeabilidad potenciado debido a una vasculatura tumoral mal formada (45, 46). Suministrando una señal inmunoestimuladora in situ, las aAPC en el microentorno tumoral pueden abordar uno de los obstáculos más importantes en la inmunoterapia contra el cáncer, el microentorno inmunosupresor del tumor (47).
En algunas realizaciones, la estimulación de respuestas de células T vírgenes se puede logran agrupando nano-aAPC después de la administración a un paciente. Las dos estrategias se ilustran en el ejemplo 7, a continuación, aunque se pueden utilizar otras estrategias. En la primera estrategia, se utilizaron perlas magnéticas de nano-aAPC para enriquecer células T específicas de antígeno antitumorales antes de la estimulación. Si bien no se desea limitarse a esta explicación, se piensa que el enriquecimiento aumenta la disponibilidad de citocina y proporciona un mejor entorno para la expansión de células T in vitro. En la segunda estrategia, se incubaron perlas magnéticas de nano-aAPC y células T en un campo magnético, lo cual refuerza la activación mediada por nano-aAPC. Esta estrategia requirió el desarrollo de un sistema de cultivo in vitro basado en columnas de enriquecimiento celular disponibles en el mercado, que no se destinan a cultivo celular a corto plazo o activación inducida por imanes. También se puede lograr el agrupamiento, por ejemplo, utilizando un anticuerpo secundario o perla que “tapa” la nano-aAPC. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos de reticulación contra proteínas en la nano-aAPC o moléculas de oligomerización (por ejemplo, oligonucleótidos o anticuerpos en la superficie de la nano-aAPC) para lograr el agrupamiento.
La utilización de nano-aAPC para la expansión ex vivo de células T específicas de antígeno y células B específicas de anticuerpos, respectivamente, tiene varias ventajas importantes. Las nano-aAPC se pueden conformar previamente, tienen una actividad de presentación de antígenos o presentación de anticuerpos reproducible, y se pueden utilizar para una gran población de pacientes. La utilización de nano-aAPC simplifica y acorta de manera drástica el proceso de expansión ex vivo de células T específicas de antígeno en comparación con los procedimientos que utilizan células dendríticas, y puede inducir la expansión de células T o B precursoras hasta números adecuados para su utilización terapéutica. Además, las nano-aAPC pueden combinar el aislamiento de células T o B precursoras con la estimulación específica de antígeno en una etapa.
Los receptores de células T se internalizan después del acoplamiento (40), lo que sugiere la posibilidad de que las nano-aAPC tanto estimulen receptores de células T como suministren posteriormente la carga intracelular tal como ARNip.
Mientras que las interacciones TCR-MHC se han estudiado de manera extensa para el MHC presentado en células7 y partículas recubiertas con MHC del tamaño de una célula,8-11 las interacciones receptor-ligando en la superficie de contacto célula-nanopartícula no se han entendido bien.12 Tal como se describe a continuación y en los ejemplos específicos, la unión de nanopartículas y la activación celular son sensibles a la organización espacial de las membranas, que es particularmente importante durante la activación de células T, y se pueden utilizar campos magnéticos para manipular nanopartículas unidas a agrupamientos para potenciar la activación. Por ejemplo, la activación de células T induce un estado de agrupamiento de TCH a escala nanométrica potenciado de manera persistente13-16 y, tal como se describe a continuación, las nanopartículas son sensibles a este agrupamiento de una manera que las partículas más grandes no lo son.
Además, las interacciones de nanopartículas con agrupamientos de TCR se pueden aprovechar para potenciar la activación de receptores. La activación de células T está mediada por la agregación de proteínas de señalización,17 con “agrupamientos de señalización” de cientos de nanómetros de anchura, que se forman inicialmente en la periferia del sitio de contacto de la célula T-APC y que migra hacia el interior.18 Tal como se describe a continuación, se puede utilizar un campo magnético externo para impulsar la agregación de nano-aAPC paramagnéticas unidas a TCR, lo que da como resultado la agregación de agrupamientos de TCR y la activación potenciada de células T vírgenes.
Los campos magnéticos pueden ejercer de manera apropiada fuerzas fuertes sobre las partículas paramagnéticas, pero por lo demás son inertes biológicamente, haciendo que sean una potente herramienta para controlar el comportamiento de las partículas.19,20 En los procedimientos descritos a continuación, las células T unidas a nano-aAPC paramagnéticas se activan en presencia de un campo magnético aplicado de manera externa. Las propias nano-aAPC se magnetizan, y son atraídas tanto por la fuente del campo como por las nanopartículas cercanas en el campo,20,21 induciendo que la perla y, por tanto, la agregación de TCR refuercen la activación mediada por aAPC.
Tal como se demuestra en los ejemplos específicos a continuación, las nano-aAPC se unen más a TCR e inducen mayor activación de las células T activadas previamente en comparación con las vírgenes. Además, la aplicación de un campo magnético externo induce la agregación de nano-aAPC en células vírgenes, potenciando la proliferación de células T tanto in vitro como después de la transferencia adoptiva in vivo. De manera importante, en un modelo de inmunoterapia adoptiva de melanoma, las células T activadas por nano-aAPC en un campo magnético median en el rechazo tumoral. Por tanto, la utilización de campos magnéticos aplicados permite la activación de poblaciones de células T vírgenes, que de otro modo responden mal a la estimulación. Esto es una importante característica de la inmunoterapia ya que se ha demostrado que las células T vírgenes son más eficaces que los subtipos diferenciados para la inmunoterapia contra el cáncer,43-45 con mayor capacidad proliferativa y mayor capacidad para generar respuestas de células T a largo plazo fuertes. Por tanto, la presente divulgación da a conocer un nuevo enfoque mediante el cual las nano-aAPC se pueden acoplar a la activación de células T potenciada por campos magnéticos para aumentar el rendimiento y la actividad de células T específicas de antígeno expandidas a partir de precursores vírgenes, mejorando la terapia celular, por ejemplo, para pacientes con enfermedades infecciosas, cáncer o enfermedades autoinmunitarias, o para proporcionar protección profiláctica a pacientes inmunodeprimidos.
Nano-aAPC
A menos que se indique lo contrario, una “nano-aAPC” incluye, como mínimo, una molécula efectora de linfocitos y, como mínimo, un complejo presentador de antígeno que comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno. Opcionalmente, un antígeno se puede unir a la hendidura de unión a antígeno.
En algunas realizaciones, una nano-aAPC incluye, como mínimo, una molécula que afecta a células T y, como mínimo, un complejo presentador de antígeno que comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno. Opcionalmente, un antígeno se puede unir a la hendidura de unión a antígeno.
Se pueden utilizar nano-aAPC para estimular la formación de anticuerpos. En estas realizaciones (también denominadas en el presente documento “nano-aAPC inductoras de anticuerpos”), una nano-aAPC comprende, como mínimo, una molécula que afecta a células B (por ejemplo, ligando CD40, una citocina o un complejo molecular de citocina, descrito a continuación) y, como mínimo, un complejo molecular que se engancha a inmunoglobulinas de la superficie de células B o se engancha a complejos de MHC-antígeno sobre la superficie de una célula B.
Nanopartículas
Las nanopartículas se pueden fabricar, por ejemplo, de metales tales como hierro, níquel, aluminio, cobre, cinc, cadmio, titanio, circonio, estaño, plomo, cromo, manganeso y cobalto; óxidos metálicos y óxidos hidratados tales como óxido de aluminio, óxido de cromo, óxido de hierro, óxido de cinc y óxido de cobalto; silicatos metálicos tales como de magnesio, aluminio, cinc, plomo, cromo, cobre, hierro, cobalto y níquel; aleaciones tales como bronce, latón, acero inoxidable, etc. Las nanopartículas se pueden fabricar también de materiales no metálicos u orgánicos, tales como celulosa, cerámica, vidrio, nailon, poliestireno, caucho, plástico o látex. En algunas realizaciones, las nanopartículas comprenden una combinación de un metal y un compuesto no metálico u orgánico, por ejemplo, metales recubiertos con metacrilato o estireno y metales recubiertos con silicato. El material base se puede dopar con un agente para alterar sus propiedades físicas o químicas. Por ejemplo, los óxidos de tierras raras se pueden incluir en vidrios de aluminosilicato para crear materiales de vidrio paramagnéticos con alta densidad (ver White & Day, Key Engineering materials vol. 94-95, 181 -208, 1994) En algunas realizaciones, las nanopartículas comprenden o consisten en materiales orgánicos biodegradables, tales como celulosa, dextrano, y similares. Las partículas disponibles en el mercado adecuadas incluyen, por ejemplo, partículas de níquel (tipo 123, VM 63, 18/209A, 10/585A, 347355 y HDNP comercializados por Novamet Specialty Products, Inc., Wyckoff, NJ; 08841R comercializado por Spex, Inc.; 01509BW comercializado por Aldrich), partículas de acero inoxidable (P316L comercializado por Ametek), polvo de cinc (Aldrich), partículas de paladio (D13A17, John Matthey Elec.) y partículas de TiO2, SiO2 o MnO2 (Aldrich).
La densidad de partículas se puede seleccionar de manera que las partículas se sedimentarán de manera diferencial a través de la suspensión de muestra más rápidamente que las células. Por tanto, las partículas se componen preferentemente de material de alta densidad para facilitar la separación de las células y la manipulación de las partículas. La utilización de tales partículas permite sedimentar las partículas por gravedad para facilitar su separación de células T específicas de antígeno, precursores de células T, precursores de células B, células B u otras células.
En algunas realizaciones, una nanopartícula se recubre antes de que las proteínas se unan a su superficie. Una vez que se ha elegido una química de recubrimiento, la superficie de una nanopartícula se puede activar para permitir la unión específica de moléculas de proteínas particulares. Por tanto, los recubrimientos se pueden seleccionar con vistas a una reactividad y biocompatibilidad óptimas con diversas poblaciones de células T o B o poblaciones de células precursoras T o B. Preferentemente, cualquiera que sea la química de recubrimiento utilizada, proporciona una matriz adecuada para una química de activación adicional. Numerosos recubrimientos de este tipo se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la nanopartícula se puede recubrir con albúmina sérica humana, tris (3-mercaptopropil)-N-glicilamino)metano (Patente US 6,074,884), gelatina-aminodextranos (Patente US 5,466,609) u homopolímeros de aminoácidos o copolímeros al azar. En algunas realizaciones, se utiliza un copolímero de aminoácidos al azar que comprende poli(glutamato, lisina, tirosina) [6:3:1]; este copolímero está disponible de Sigma Chemical Co. como n.° de producto P8854. Es un polímero lineal al azar de los aminoácidos ácido glutámico, lisina y tirosina en una proporción de 6 partes de ácido glutámico, 3 partes de lisina y 1 parte de tirosina. En algunas realizaciones, se utiliza un copolímero de aminoácidos que incluye lisina y tirosina en una proporción de 4 partes de lisina por 1 parte de tirosina. En algunas realizaciones, se utiliza un copolímero de aminoácidos que incluye lisina y alanina en una proporción de 1 parte de lisina por 1 parte de alanina.
En algunas realizaciones, se recubre una nanopartícula con un polímero sintético, a continuación, se activa el polímero sintético antes de unirse a una molécula de proteína incluyendo, pero no se limita a, una molécula que afecta a las células T o B, un complejo presentador de antígeno o un complejo molecular que implica inmunoglobulinas de la superficie de las células B o complejos de MHC-antígeno en la superficie de una célula B.
En algunas realizaciones, particularmente adecuadas para superficies de níquel (especialmente partículas), se recubre una nanopartícula con sílice. Una superficie de sílice tiene varias ventajas respecto a las superficies de polímeros orgánicos más comúnmente utilizadas. Es muy uniforme, definida químicamente y estable química y térmicamente, con residuos de silanol que cubren toda la superficie y está disponible para un acoplamiento covalente estable con derivados amino o epoxi de trietoxisilanos para unir proteínas y otras biomoléculas. Los derivados de silano pueden cubrir toda la superficie, formando una monocapa de un polímero bidimensional que permite un alto grado de control sobre las interacciones específicas y no específicas en la superficie. Los procedimientos para recubrir diversos soportes sólidos con sílice se dan a conocer en la Patente US. 2,885,399; ver también Birkmeyer et a, Clin Chem. septiembre de 1987; 33(9): 1543-7. Por ejemplo, una nanopartícula se puede incubar con una solución de metasilicato de sodio, aluminato de sodio y ácido bórico para formar sílice polimerizada que se deposita sobre la superficie. Otro procedimiento de recubrimiento de sílice es mezclar silicato de sodio con la nanopartícula y bajar el pH con ácido sulfúrico a 95 °C, seguido por lavados con agua. Ver la Patente US 2,885,366; Eagerton, Ko Na 16, 46-58, 1998. Por ejemplo, las superficies de níquel se pueden recubrir dispersándolas primero en una solución de NaSO40,2 N y calentando la solución hasta 95 °C. El pH se ajusta a 10 con NaOH. A continuación, se añade silicato de sodio en ácido sulfúrico y se mezcla a 95 °C durante 0,5 horas. El soporte se lava varias veces con agua destilada. La extensión del recubrimiento se puede examinar determinando la resistencia del soporte a la digestión con ácido nítrico. El análisis ESCA para determinar la composición química de la superficie, que se basa en la dispersión de rayos X, se puede utilizar para obtener la composición elemental de una superficie de soporte, proporcionando información sobre el grado de recubrimiento y silanización de la superficie con residuos activos.
En algunas realizaciones, se proporciona una matriz de superficie en una nanopartícula “pasivando” una superficie de níquel con un recubrimiento de óxido metálico no tóxico, tal como óxido de aluminio. Otros procedimientos de recubrimiento incluyen depositar óxidos metálicos tales como el óxido de aluminio en la superficie de la nanopartícula. El óxido de aluminio es una matriz útil porque proporciona una superficie inerte con bajas propiedades de unión no específica que se puede funcionalizar para la conjugación de proteínas.
Se puede proporcionar un recubrimiento de óxido de aluminio mediante varios procedimientos, tales como el proceso sol-gel, en el que se forma una capa delgada continua de óxido de aluminio amorfo por evaporación de un sol-gel de aluminio sobre la nanopartícula, seguido por la cocción en aire para formar el óxido. Ozer et al, SPIE 3789, 77-83, 1999. En otras realizaciones, se pueden utilizar las técnicas convencionales de depósito físico en fase de vapor (Smidt, Inter Mat Rev 35, 21-27, 1990) o depósito químico en fase vapor (Koh et al, Thin Solid Films 304, 222-24, 1997). Si se utiliza una nanopartícula de níquel, el grosor de tales recubrimientos se puede controlar para proporcionar una estabilidad adecuada mientras que se minimiza la lixiviación de níquel. El éxito del sellado del níquel se puede someter a prueba mediante ensayos químicos cuantitativos de iones de níquel. Las nanopartículas se pueden incubar a diversas temperaturas en diversos tampones y líquidos biológicos, y se pueden medir los niveles de iones de níquel en estos medios.
La integridad de un recubrimiento de superficie se puede determinar mediante ensayos de lixiviación de superficie. Por ejemplo, cuando la superficie de una nanopartícula de níquel se recubre completamente por vidrio u otro metal no reactivo, la nanopartícula es resistente a la lixiviación de níquel en condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede incubar una masa conocida de nanopartículas de níquel recubiertas en ácido nítrico al 10% y se puede observar durante 24 horas. A medida que se disuelve el níquel, la solución se vuelve verde. El níquel no tratado convierte la solución en verde inmediatamente. Las nanopartículas de níquel que tienen una capa de óxido de níquel en su superficie convierten la solución en verde en aproximadamente 20 minutos. Las nanopartículas recubiertas con una capa de sílice tal como se describió anteriormente son resistentes al ácido nítrico durante más de 8 horas, lo que indica que se depositó una capa gruesa de sílice sobre la superficie. Las nanopartículas se pueden analizar también en condiciones acuosas incubando los soportes en medio de cultivo celular similar a las condiciones de cultivo utilizadas para la activación de células B o T (descrita a continuación). La cantidad de níquel lixiviado en la solución se puede medir por espectrometría de absorción atómica.
Si se desea, las nanopartículas se pueden tratar previamente antes de recubrirlas. El tratamiento previo de una nanopartícula, por ejemplo, puede esterilizar y despirogenizar el soporte, así como crear una capa de óxido en la superficie del soporte. Este tratamiento previo es particularmente beneficioso cuando se utilizan nanopartículas metálicas. En algunas realizaciones, el tratamiento previo implica calentar una nanopartícula de níquel durante aproximadamente 2-6 horas, preferentemente durante aproximadamente 5 horas, a una temperatura dentro del intervalo de aproximadamente 200-350 °C, preferentemente aproximadamente 250 °C.
Las moléculas se pueden unir directamente a las nanopartículas por adsorción o por enlace químico directo, incluyendo el enlace covalente. Ver, por ejemplo, Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, Nueva York, 1996. Una molécula en sí misma se puede activar directamente con una variedad de funcionalidades químicas, incluyendo grupos nucleófilos, grupos salientes o grupos electrófilos. Los grupos funcionales de activación incluyen haluros de alquilo y acilo, aminas, sulfhidrilos, aldehídos, enlaces insaturados, hidrazidas, isocianatos, isotiocianatos, cetonas y otros grupos que se sabe que se activan para la unión química. Como alternativa, una molécula se puede unir a una nanopartícula mediante la utilización de un reactivo de acoplamiento de molécula pequeña. Los ejemplos no limitativos de reactivos de acoplamiento incluyen carbodiimidas, maleimidas, ésteres de N-hidroxisuccinimida, biscloroetilaminas, aldehídos bifuncionales tales como glutaraldehído, cualquier hidruro y similares. En otras realizaciones, una molécula se puede acoplar a una nanopartícula a través de la unión por afinidad tal como un enlace o acoplamiento de biotina-estreptavidina, como se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, la estreptavidina se puede unir a una nanopartícula por unión covalente o no covalente, y se puede sintetizar una molécula biotinilada utilizando procedimientos que se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Hermanson, 1996.
Si se contempla la unión covalente a una nanopartícula, el soporte se puede recubrir con un polímero que contiene uno o varios restos químicos o grupos funcionales que están disponibles para la unión covalente a un reactivo adecuado, normalmente a través de un ligador. Por ejemplo, los polímeros de aminoácidos pueden tener grupos, tales como el grupo e-amino de lisina, disponibles para acoplar una molécula de forma covalente a través de ligadores apropiados. La presente divulgación contempla también colocar un segundo recubrimiento en una nanopartícula para proporcionar estos grupos funcionales.
Las químicas de activación se pueden utilizar para permitir la unión específica y estable de moléculas a la superficie de las nanopartículas. Existen numerosos procedimientos que se pueden utilizar para unir proteínas a grupos funcionales; ver Hermanson, 1996. Por ejemplo, el agente de reticulación común glutaraldehído se puede utilizar para unir grupos amina de proteínas a una superficie de nanopartículas aminadas en un proceso en dos etapas. El enlace resultante es estable hidrolíticamente. Otros procedimientos incluyen la utilización de agentes de reticulación que contienen ésteres de n-hidro-succinimida (NHS) que reaccionan con aminas en proteínas, agentes de reticulación que contienen halógenos activos que reaccionan con proteínas que contienen amina, sulfhidrilo o histidina, agentes de reticulación que contienen epóxidos que reaccionan con aminas o grupos sulfhidrilo, conjugación entre grupos maleimida y grupos sulfhidrilo, y la formación de grupos aldehído de proteínas por oxidación de peryodato de restos de azúcares colgantes seguido por aminación reductora.
En algunas realizaciones, las moléculas de proteína se unen a un recubrimiento de sílice utilizando 3-aminopropiltrietoxisilano (Weetall y Filbert, Methods Enzymol. 34, 59-72, 1974). Este compuesto forma un enlace covalente estable con una superficie de sílice y al mismo tiempo hace que la superficie sea más hidrófoba. La reacción de silanación se puede realizar en un medio acuoso de pH bajo, que se sabe que permite la formación de una monocapa con los grupos amino disponibles para la conjugación. La unión de proteínas puede ser a través del agente de acoplamiento homobifuncional glutaraldehído o por agentes heterobifuncionales tales como SMCC. Después de la unión a la proteína, los agentes de acoplamiento asociados a la superficie residual se pueden activar incubando con diversas proteínas, polímeros hidrófilos y aminoácidos. La albúmina y los polietilenglicoles son particularmente adecuados porque bloquean la unión no específica de proteínas y células a fases sólidas.
En algunas realizaciones, se utiliza la aminosilanización para activar la superficie de nanopartículas recubiertas con óxido de aluminio. Ver la Patente US 4,554,088 1985. Otro procedimiento para activar la superficie de las nanopartículas recubiertas con óxido de aluminio es adsorber un polímero fuertemente adherente, tal como un tripéptido glu-lys-tyr. El polímero tripeptídico se puede activar a través de las aminas de lisina por reacción con un agente de reticulación homobifuncional, tal como difluorodinitrobenceno, o por reacción con glutaraldehído. Las proteínas se pueden unir directamente a la superficie activada.
La unión de proteínas específicas a la superficie de una nanopartícula se puede lograr mediante el acoplamiento directo de la proteína o mediante procedimientos indirectos. Determinadas proteínas se prestan a la unión directa o la conjugación, mientras que otras proteínas o anticuerpos retienen una mejor actividad funcional cuando se acoplan a una proteína ligadora o espaciadora tal como anticuerpo anti-IgG de ratón o estreptavidina. Si se desea, se pueden utilizar ligadores o proteínas de unión.
La proporción de proteínas particulares en la misma nanopartícula se puede variar para aumentar la eficacia de la nanopartícula en la presentación de antígeno o anticuerpo. Por ejemplo, las proporciones óptimas de A2-Ig (señal 1) con respecto a anticuerpo anti-CD28 (señal 2) se pueden someter a prueba de la siguiente manera. Las nanopartículas se acoplan con A2-Ig y anticuerpo anti-CD28 en una variedad de proporciones, tales como 30:1, 10:1, 3:1, 1:1, 0,3:1; 0,1:1 y 0,03:1. La cantidad total de proteína acoplada a los soportes se mantiene constante (por ejemplo, a 150 mg/ml de partículas) o se puede variar. Debido a que las funciones efectoras, tales como la liberación y el crecimiento de citocinas, pueden tener requisitos diferentes para la señal 1 frente a la señal 2 que la activación y diferenciación de células T, estas funciones se pueden analizar por separado.
Las nanopartículas se pueden caracterizar mediante diversos ensayos analíticos para evaluar las adiciones y reacciones que tienen lugar a medida que se producen los soportes. Estos incluyen ensayos para determinar grupos funcionales, tales como aminas y aldehídos, y ensayos para determinar la unión de tipos particulares de moléculas de proteínas. Además, se pueden utilizar ensayos funcionales para evaluar la actividad biológica de las nanopartículas. La cantidad de proteína unida a la superficie de las nanopartículas se puede determinar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, la proteína unida se puede medir de manera indirecta determinando la cantidad de proteína que se elimina de la solución de reacción utilizando absorbancia a 280 nm. En esta realización, el contenido de proteína de la solución de reacción antes y después de la adición a la nanopartícula se mide por absorbancia a 280 nm y se compara. También se mide la cantidad de proteína contenida en cualquier solución de lavado y se añade a la cantidad encontrada en la solución posterior a la reacción. La diferencia es indicativa de la cantidad unida a la superficie de la nanopartícula. Este procedimiento se puede utilizar para examinar rápidamente la eficacia de unión de diferentes condiciones de reacción.
En algunas realizaciones, la cantidad de proteína unida a las nanopartículas se puede medir en un ensayo más directo mediante ensayos de unión de antígenos y anticuerpos marcados. Por ejemplo, se pueden incubar diversas concentraciones de nanopartículas conjugadas con anticuerpos con una concentración constante de antígeno marcado con HRP o anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón. Los soportes se lavan en tampón para eliminar la proteína marcada no unida. La medición de la HRP asociada al soporte utilizando sustrato OPD proporciona la concentración de proteína marcada unida. Los anticuerpos marcados con HRP se pueden obtener en el mercado o los anticuerpos se pueden marcar con HRP utilizando el procedimiento de glutaraldehído de Avrameas & Ternync, Immunochemistry 8, 1175-79, 1971.
Los procedimientos descritos anteriormente miden tanto la proteína unida de manera covalente como la unida de manera no covalente. Para distinguir entre los dos tipos de unión, las nanopartículas se pueden lavar con un fuerte caótropo, tal como clorhidrato de guanidina 6 M o urea 8 M. Estas condiciones alteran la unión no específica, y la cantidad de proteína eliminada por lavado de las nanopartículas se puede medir por absorbancia a 280 nm. La diferencia entre la cantidad total de proteína unida y la cantidad eliminada por lavado con el caótropo representa la cantidad de proteína que está fuertemente unida y es probable que se una covalentemente.
La configuración de las nanopartículas puede variar de ser de forma irregular a ser esférica y/o tener una superficie desigual o irregular a tener una superficie lisa. Las características preferentes de las nanopartículas se pueden seleccionar dependiendo de las condiciones particulares en las cuales se preparará y/o utilizará un ATR.
Las nanopartículas pueden ser de tamaño uniforme o variable. La distribución del tamaño de partícula se puede determinar de manera conveniente, por ejemplo, utilizando dispersión dinámica de luz.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 2-500 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 2-3 nm, 2-4 nm, 2-5 nm, 2-6 nm, 2-7 nm, 2-8 nm, 2-9 nm, 2-10 nm, 2-11 nm, 2-12 nm, 2-13 nm, 2-14 nm, 2-15 nm, 2-16 nm, 2-17 nm, 2-18 nm, 2-19 nm, 2-20 nm, 2-21 nm, 2-22 nm, 2-23 nm, 2-24 nm, 2-25 nm, 2-26 nm, 2-27 nm, 2-28 nm, 2-29 nm, 2- 30 nm, 3-4 nm, 3-5 nm, 3-6 nm, 3-7 nm, 3-8 nm, 3-9 nm, 3-10 nm, 3-11 nm, 3-12 nm, 3-13 nm, 3-14 nm, 3-15 nm, 3- 16 nm, 3-17 nm, 3-18 nm, 3-19 nm, 3-20 nm, 3-21 nm, 3-22 nm, 3-23 nm, 3-24 nm, 3-25 nm, 3-26 nm, 3-27 nm, nm, 3-29 nm, 3-30 nm, 4-5 nm, 4-6 nm, 4-7 nm, 4-8 nm, 4-9 nm, 4-10 nm, 4-11 nm, 4-12 nm, 4-13 nm, 4-14 nm nm, 4-16 nm, 4-17 nm, 4-18 nm, 4-19 nm, 4-20 nm, 4-21 nm, 4-22 nm, 4-23 nm 4-24 nm, 4-25 nm, 4-26 nm nm, 4-28 nm, 4-29 nm, 4-30 nm, 5-6 nm 5-7 nm, 5-8 nm, 5-9 nm, 5-10 nm, 5-11 nm, 5-12 nm, 5-13 nm nm, 5-15 nm, 5-16 nm, 5-17 nm, 5-18 nm, 5-19 nm, 5-20 nm, 5-21 nm, 5-22 nm, 5-23 nm, 5-24 nm, 5-25 nm nm, 5-27 nm, 5-28 nm, 5-29 nm, 5-30 nm, 6-7 nm, 6-8 nm, 6-9 nm, 6-10 nm, 6-11 nm, 6-12 nm, 6-13 nm nm, 6-15 nm, 6-16 nm, 6-17 nm, 6-18 nm, 6-19 nm, 6-20 nm, 6-21 nm, 6-22 nm 6-23 nm, 6-24 nm, 6-25 nm nm, 6-27 nm, 6-28 nm, 6-29 nm, 6-30 nm, 7-8 nm, 7-9 nm, 7-10 nm, 7-11 nm, 7-12 nm, 7-13 nm, 7-14 nm nm, 7-16 nm, 7-17 nm, 7-18 nm, 7-19 nm, 7-20 nm, 7-21 nm, 7-22 nm, 7-23 nm 7-24 nm, 7-25 nm, 7-26 nm nm, 7-28 nm, 7-29 nm, 7-30 nm, 8-9 nm, 8-10 nm, 8-11 nm, 8-12 nm, 8-13 nm, 8-14 nm, 8-15 nm, 8-16 nm nm, 8-18 nm, 8-19 nm, 8-20 nm, 8-21 nm, 8-22 nm, 8-23 nm, 8-24 nm, 8-25 nm, 8-26 nm, 8-27 nm, 8-28 nm nm, 8-30 nm, 9-10 nm, 9-11 nm, 9-12 nm, 9-13 nm, 9-14 nm, 9-15 nm, 9-16 nm., 9-17 nm, 9-18 nm, 9-19 nm nm, 9-21 nm, 9-22 nm, 9-23 nm, 9-24 nm, 9-25 nm, 9-26 nm, 9-27 nm, 9-28 nm, 9-29 nm, 9-30 nm, 10-11 nm nm, 10-13 nm, 10-14 nm, 10-15 nm, 10-16 nm, 10-17 nm, 10-18 nm, 10-19 nm, 10-20 nm, 10-21 nm nm, 10-23 nm, 10-24 nm, 10-25 nm, 10-26 nm, 10-27 nm, 10-28 nm, 10-29 nm, 10-30 nm, 11-12 nm nm, 11-14 nm, 11-15 nm, 11-16 nm, 11-17 nm, 11-18 nm, 11-19 nm, 11-20 nm, 11-21 nm, 11-22 nm nm, 11-24 nm, 11-25 nm, 11-26 nm, 11-27 nm, 11-28 nm, 11-29 nm, 11-30 nm, 12-13 nm, 12-14 nm nm, 12-16 nm, 12-17 nm, 12-18 nm, 12-19 nm, 12-20 nm, 12-21 nm, 12-22 nm, 12-23 nm, 12-24 nm nm, 12-26 nm, 12-27 nm, 12-28 nm, 12-29 nm, 12-30 nm, 13-14 nm, 13-15 nm, 13-16 nm, 13-17 nm nm, 13-19 nm, 13-20 nm, 13-21 nm, 13-22 nm, 13-23 nm, 13-24 nm, 13-25 nm, 13-26 nm, 13-27 nm nm, 13-29 nm, 13-30 nm, 14-15 nm, 14-16 nm, 14-17 nm, 14-18 nm, 14-19 nm, 14-20 nm, 14-21 nm nm, 14-23 nm, 14-24 nm, 14-25 nm, 14-26 nm, 14-27 nm, 14-28 nm, 14-29 nm, 14-30 nm, 15-16 nm nm, 15-18 nm, 15-19 nm, 15-20 nm, 15-21 nm, 15-22 nm, 15-23 nm, 15-24 nm, 15-25 nm, 15-26 nm nm, 15-28 nm, 15-29 nm, 15-30 nm, 16-17 nm, 16-18 nm, 16-19 nm, 16-20 nm, 16-21 nm, 16-22 nm nm, 16-24 nm, 16-25 nm, 16-26 nm, 16-27 nm, 16-28 nm, 16-29 nm, 16-30 nm, 17-18 nm, 17-19 nm nm, 17-21 nm, 17-22 nm, 17-23 nm, 17-24 nm, 17-25 nm, 17-26 nm, 17-27 nm, 17-28 nm, 17-29 nm nm, 18-19 nm, 18-20 nm, 18-21 nm, 18-22 nm, 18-23 nm, 18-24 nm, 18-25 nm, 18-26 nm, 18-27 nm nm, 18-29 nm, 18-30 nm, 19-20 nm, 19-21 nm, 19-22 nm, 19-23 nm, 19-24 nm, 19-25 nm, 19-26 nm nm, 19-28 nm, 19-29 nm, 19-30 nm, 20-21 nm, 20-22 nm, 20-23 nm, 20-24 nm, 20-25 nm, 20-26 nm nm, 20-28 nm, 20-29 nm, 20-30 nm, 21-21 nm, 21-22 nm, 21-23 nm, 21-24 nm, 21-25 nm, 21-26 nm nm, 21-28 nm, 21-29 nm, 21-30 nm, 22-23 nm, 22-24 nm, 22-25 nm, 22-26 nm, 22-27 nm, 22-28 nm nm, 22-30 nm, 23-24 nm, 23-25 nm, 23-26 nm, 23-27 nm, 23-28 nm, 23-29 nm, 23-30 nm, 24-25 nm nm, 24-27 nm, 24-28 nm, 24-29 nm, 24-30 nm, 25-26 nm, 25-27 nm, 25-28 nm, 25-29 nm, 25-30 nm 26-27 nm, 26-28 nm, 26-29 nm, 26-30 nm, 27-28 nm, 27-29 nm, 27-30 nm, 28-29 nm, 28-30 nm o 29-30 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 25-500 nm /- 5 nm, 25-500 nm /- 10 nm, 25-500 nm /- 15 nm, 25-500 nm /- 20 nm, 25-500 nm /- 25 nm, 25-500 nm /- 30 nm, 25-500 nm /- 35 nm, 25-500 nm /- 40 nm, 25-500 nm /- 45 nm o 25-500 nm /- 50 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 25-30 nm, 25-35 nm, 25-40 nm, 25-45 nm, 25-50 nm, 25-55 nm, 25-60 nm, 25-70 nm, 25-75 nm, 25-80 nm, 25-90 nm, 25-95 nm, 25-100 nm, 25-125 nm, 25-150 nm, 25-200 nm, 25-300 nm, 25-400 nm, 30-35 nm, 35-40 nm, 35-45 nm, 35-50 nm, 35-55 nm, 35-60 nm, 35-70 nm, 35-75 nm, 35-80 nm, 35-90 nm, 35-95 nm, 35-100 nm, 35-125 nm, 35-150 nm, 35-200 nm, 35-300 nm, 35-400, 35-500 nm, 40-45 nm, 35-50 nm, 45-55 nm, 45-60 nm, 45-70 nm, 45-75 nm, 45-80 nm, 45-90 nm, 45-95 nm, 45-100 nm, 45-125 nm, 45-150 nm, 45-200 nm, 45-300 nm, 45-400, 45-500 nm, 50-55 nm, 50-60 nm, 50-70 nm, 50-75 nm, 50-80 nm, 50-90 nm, 50-95 nm, 50-100 nm, 50-125 nm, 50-150 nm, 50-200 nm, 50-300 nm, 50-400, 50-500 nm, 55-60 nm, 55-70 nm, 55-75 nm, 55-80 nm, 55-90 nm, 55-95 nm, 55-100 nm, 55-125 nm, 55-150 nm, 55-200 nm, 55-300 nm, 55-400, 55-500 nm, 60-70 nm, 60-75 nm, 60-80 nm, 60-90 nm, 60-95 nm, 60-100 nm, 60-125 nm, 60-150 nm, 60-200 nm, 60-300 nm, 60-400, 60-500 nm, 65-70 nm, 65-75 nm, 65-80 nm, 65-90 nm, 65-95 nm, 65-100 nm, 65-125 nm, 65-150 nm, 65-200 nm, 65-300 nm, 65-400, 65-500 nm, 70-75 nm, 70-80 nm, 70-90 nm, 70-95 nm, 70-100 nm, 70-125 nm, 70-150 nm, 70-200 nm, 70-300 nm, 70-400, 70-500 nm, 75-80 nm, 75-90 nm, 75-95 nm, 75-100 nm, 75-125 nm, 75-150 nm, 75-200 nm, 75-300 nm, 75-400, 75-500 nm, 80-90 nm, 80-95 nm, 80-100 nm, 80-125 nm, 80-150 nm, 80-200 nm, 80-300 nm, 80-400, 80-500 nm, 85-90 nm, 85-95 nm, 85-100 nm, 85-125 nm, 85-150 nm, 85-200 nm, 85-300 nm, 85-400, 85-500 nm, 90-95 nm, 90-100 nm, 90-125 nm, 90-150 nm, 90-200 nm, 90-300 nm, 90-400, 90-500 nm, 100-125 nm, 100-150 nm, 100-200 nm, 100-300 nm, 100-400, 100-500 nm, 125-150 nm, 125-200 nm, 125-300 nm, 125-400, 125-500 nm, 150-200 nm, 150-300 nm, 150-400, 150-500 nm, 175-200 nm, 175-300 nm, 175-400, 175-500 nm, 200-300 nm, 200-400, 200-500 nm, 300-400, 300-500 nm o 400-500 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 25-30 nm /- 5 nm, 25-35 nm /- 5 nm, 25-40 nm /- 5 nm, 25-45 nm /- 5 nm, 25-50 nm /- 5 nm, 25-55 nm /- 5 nm, 25-60 nm /- 5 nm, 25-70 nm /- 5 nm, 25-75 nm /- 5 nm, 25-80 nm /- 5 nm, 25-90 nm /- 5 nm, 25-95 nm /- 5 nm, 25-100 nm /-5 nm, 25-125 nm /- 5 nm, 25-150 nm /- 5 nm, 25-200 nm /- 5 nm, 25-300 nm /- 5 nm, 25-400 nm /- 5 nm, 30-35 nm /- 5 nm, 35-40 nm /- 5 nm, 35-45 nm /- 5 nm, 35-50 nm /- 5 nm, 35-55 nm /- 5 nm, 35-60 nm /-5 nm, 35-70 nm /- 5 nm, 35-75 nm /- 5 nm, 35-80 nm /- 5 nm, 35-90 nm /- 5 nm, 35-95 nm /- 5 nm, 35-100 nm /- 5 nm, 35-125 nm /- 5 nm, 35-150 nm /- 5 nm, 35-200 nm /- 5 nm, 35-300 nm /- 5 nm, 35-400, 35-500 nm /-5 nm, 40-45 nm /- 5 nm, 35-50 nm /- 5 nm, 45-55 nm /- 5 nm, 45-60 nm /- 5 nm, 45-70 nm /- 5 nm, 45-75 nm +/- 5 nm, 45-80 nm /- 5 nm, 45-90 nm /- 5 nm, 45-95 nm /- 5 nm, 45-100 nm /- 5 nm, 45-125 nm /- 5 nm, 45-150 nm /- 5 nm, 45-200 nm /- 5 nm, 45-300 nm /- 5 nm, 45-400, 45-500 nm /- 5 nm, 50-55 nm /- 5 nm, 50-60 nm /- 5 nm, 50-70 nm /- 5 nm, 50-75 nm /- 5 nm, 50-80 nm /- 5 nm, 50-90 nm /- 5 nm, 50-95 nm /-5 nm, 50-100 nm /- 5 nm, 50-125 nm /- 5 nm, 50-150 nm /- 5 nm, 50-200 nm /- 5 nm, 50-300 nm /- 5 nm, 50-400, 50-500 nm /- 5 nm, 55-60 nm /- 5 nm, 55-70 nm /- 5 nm, 55-75 nm /- 5 nm, 55-80 nm /- 5 nm, 55-90 nm /- 5 nm, 55-95 nm /- 5 nm, 55-100 nm /- 5 nm, 55-125 nm /- 5 nm, 55-150 nm /- 5 nm, 55-200 nm /-5 nm, 55-300 nm /- 5 nm, 55-400, 55-500 nm /- 5 nm, 60-70 nm /- 5 nm, 60-75 nm /- 5 nm, 60-80 nm /- 5 nm, 60-90 nm /- 5 nm, 60-95 nm /- 5 nm, 60-100 nm /- 5 nm, 60-125 nm /- 5 nm, 60-150 nm /- 5 nm, 60-200 nm /-5 nm, 60-300 nm /- 5 nm, 60-400, 60-500 nm /- 5 nm, 65-70 nm /- 5 nm, 65-75 nm /- 5 nm, 65-80 nm /- 5 nm, 65-90 nm /- 5 nm, 65-95 nm /- 5 nm, 65-100 nm /- 5 nm, 65-125 nm /- 5 nm, 65-150 nm /- 5 nm, 65-200 nm /-5 nm, 65-300 nm /- 5 nm, 65-400, 65-500 nm /- 5 nm, 70-75 nm /- 5 nm, 70-80 nm /- 5 nm, 70-90 nm /- 5 nm, 70-95 nm /- 5 nm, 70-100 nm /- 5 nm, 70-125 nm /- 5 nm, 70-150 nm /- 5 nm, 70-200 nm /- 5 nm, 70-300 nm /- 5 nm, 70-400, 70-500 nm /- 5 nm, 75-80 nm /- 5 nm, 75-90 nm /- 5 nm, 75-95 nm /- 5 nm, 75-100 nm /-5 nm, 75-125 nm /- 5 nm, 75-150 nm /- 5 nm, 75-200 nm /- 5 nm, 75-300 nm /- 5 nm, 75-400, 75-500 nm /-5 nm, 80-90 nm /- 5 nm, 80-95 nm /- 5 nm, 80-100 nm /- 5 nm, 80-125 nm /- 5 nm, 80-150 nm /- 5 nm, 80-200 nm /- 5 nm, 80-300 nm /- 5 nm, 80-400, 80-500 nm /- 5 nm, 85-90 nm /- 5 nm, 85-95 nm /- 5 nm, 85-100 nm /- 5 nm, 85-125 nm /- 5 nm, 85-150 nm /- 5 nm, 85-200 nm /- 5 nm, 85-300 nm /- 5 nm, 85-400, 85-500 nm /- 5 nm, 90-95 nm /- 5 nm, 90-100 nm /- 5 nm, 90-125 nm /- 5 nm, 90-150 nm /- 5 nm, 90-200 nm /- 5 nm, 90-300 nm /- 5 nm, 90-400, 90-500 nm /- 5 nm, 100-125 nm /- 5 nm, 100-150 nm /- 5 nm, 100-200 nm /- 5 nm, 100-300 nm /- 5 nm, 100-400, 100-500 nm /- 5 nm, 125-150 nm /- 5 nm, 125-200 nm /- 5 nm, 125-300 nm /- 5 nm, 125-400, 125-500 nm /- 5 nm, 150-200 nm /- 5 nm, 150-300 nm /- 5 nm, 150-400, 150-500 nm /- 5 nm, 175-200 nm /- 5 nm, 175-300 nm /- 5 nm, 175-400, 175-500 nm /- 5 nm, 200-300 nm /-5 nm, 200-400, 200-500 nm /- 5 nm, 300-400, 300-500 nm /- 5 nm o 400-500 nm /- 5 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 25-30 nm /- 10 nm, 25-35 nm /- 10 nm, 25-40 nm /- 10 nm, 25-45 nm /- 10 nm, 25-100 nm /- 10 nm, 25-105 nm /- 10 nm, 25-60 nm /- 10 nm, 25-70 nm /- 10 nm, 25-75 nm /- 10 nm, 25-80 nm /- 10 nm, 25-90 nm /- 10 nm, 25-95 nm /- 10 nm, 25-100 nm /- 10 nm, 25-125 nm /- 10 nm, 25-150 nm /- 10 nm, 25-200 nm /- 10 nm, 25-300 nm /- 10 nm, 25-400 nm /- 10 nm, 30-35 nm /- 10 nm, 35-40 nm /- 10 nm, 35-45 nm /- 10 nm, 35-100 nm /- 10 nm, 35-105 nm /- 10 nm, 35-60 nm /- 10 nm, 35-70 nm /- 10 nm, 35-75 nm /- 10 nm, 35-80 nm /- 10 nm, 35-90 nm /- 10 nm, 35-95 nm /- 10 nm, 35-100 nm /- 10 nm, 35-125 nm /- 10 nm, 35-150 nm /- 10 nm, 35-200 nm /-10 nm, 35-300 nm /- 10 nm, 35-400, 35-1.000 nm /- 10 nm, 40-45 nm /- 10 nm, 35-100 nm /- 10 nm, 45-105 nm /- 10 nm, 45-60 nm /- 10 nm, 45-70 nm /- 10 nm, 45-75 nm /- 10 nm, 45-80 nm /- 10 nm, 45-90 nm /- 10 nm, 45-95 nm /- 10 nm, 45-100 nm /- 10 nm, 45-125 nm /- 10 nm, 45-150 nm /- 10 nm, 45-200 nm /- 10 nm, 45-300 nm /- 10 nm, 45-400, 45-1.000 nm /- 10 nm, 50-105 nm /- 10 nm, 50-60 nm /- 10 nm, 50-70 nm /-10 nm, 50-75 nm /- 10 nm, 50-80 nm /- 10 nm, 50-90 nm /- 10 nm, 50-95 nm /- 10 nm, 50-100 nm /- 10 nm, 50-125 nm /- 10 nm, 50-150 nm /- 10 nm, 50-200 nm /- 10 nm, 50-300 nm /- 10 nm, 50-400, 50-1.000 nm /-10 nm, 55-60 nm /- 10 nm, 55-70 nm /- 10 nm, 55-75 nm /- 10 nm, 55-80 nm /- 10 nm, 55-90 nm /- 10 nm, 55-95 nm /- 10 nm, 55-100 nm /- 10 nm, 55-125 nm /- 10 nm, 55-150 nm /- 10 nm, 55-200 nm /- 10 nm, 55-300 nm /- 10 nm, 55-400, 55-1000 nm /- 10 nm, 60-70 nm /- 10 nm, 60-75 nm /- 10 nm, 60-80 nm /- 10 nm, 60-90 nm /- 10 nm, 60-95 nm /- 10 nm, 60-100 nm /- 10 nm, 60-125 nm /- 10 nm, 60-150 nm /- 10 nm, 60-200 nm /- 10 nm, 60-300 nm /- 10 nm, 60-400, 60-1.000 nm /- 10 nm, 65-70 nm /- 10 nm, 65-75 nm /-10 nm, 65-80 nm /- 10 nm, 65-90 nm /- 10 nm, 65-95 nm /- 10 nm, 65-100 nm /- 10 nm, 65-125 nm /- 10 nm, 65-150 nm /- 10 nm, 65-200 nm /- 10 nm, 65-300 nm /- 10 nm, 65-400, 65-1.000 nm /- 10 nm, 70-75 nm /-10 nm, 70-80 nm /- 10 nm, 70-90 nm /- 10 nm, 70-95 nm /- 10 nm, 70-100 nm /- 10 nm, 70-125 nm /- 10 nm, 70-150 nm /- 10 nm, 70-200 nm /- 10 nm, 70-300 nm /- 10 nm, 70-400, 70-1.000 nm /- 10 nm, 75-80 nm /-10 nm, 75-90 nm /- 10 nm, 75-95 nm /- 10 nm, 75-100 nm /- 10 nm, 75-125 nm /- 10 nm, 75-150 nm /- 10 nm, 75-200 nm /- 10 nm, 75-300 nm /- 10 nm, 75-400, 75-1.000 nm /- 10 nm, 80-90 nm /- 10 nm, 80-95 nm /-10 nm, 80-100 nm /- 10 nm, 80-125 nm /- 10 nm, 80-150 nm /- 10 nm, 80-200 nm /- 10 nm, 80-300 nm /-10 nm, 80-400, 80-1.000 nm /- 10 nm, 85-90 nm /- 10 nm, 85-95 nm /- 10 nm, 85-100 nm /- 10 nm, 85-125 nm /- 10 nm, 85-150 nm /- 10 nm, 85-200 nm /- 10 nm, 85-300 nm /- 10 nm, 85-400, 85-1.000 nm /- 10 nm, 90-95 nm /- 10 nm, 90-100 nm /- 10 nm, 90-125 nm /- 10 nm, 90-150 nm /- 10 nm, 90-200 nm /- 10 nm, 90-300 nm /- 10 nm, 90-400, 90-1.000 nm /- 10 nm, 100-125 nm /- 10 nm, 100-150 nm /- 10 nm, 100-200 nm /-10 nm, 100-300 nm /- 10 nm, 100-400, 100-1.000 nm /- 10 nm, 125-150 nm /- 10 nm, 125-200 nm /- 10 nm, 125-300 nm /- 10 nm, 125-400, 125-1.000 nm /- 10 nm, 150-200 nm /- 10 nm, 150-300 nm /- 10 nm, 150-400, 150-1.000 nm /- 10 nm, 175-200 nm /- 10 nm, 175-300 nm /- 10 nm, 175-400, 175-1.000 nm /- 10 nm, 200-300 nm /- 10 nm, 200-400, 200-1.000 nm /- 10 nm, 300-400, 300-1000 nm /- 10 nm o 400-1.000 nm /-10 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 25-30 nm /- 15 nm, 25-35 nm /- 15 nm, 25-40 nm /- 15 nm, 25-45 nm /- 15 nm, 25-150 nm /- 15 nm, 25-155 nm /- 15 nm, 25-60 nm /- 15 nm, 25-70 nm /- 15 nm, 25-75 nm /- 15 nm, 25-80 nm /- 15 nm, 25-90 nm /- 15 nm, 25-95 nm /- 15 nm, 25-100 nm /- 15 nm, 25-125 nm /- 15 nm, 25-150 nm /- 15 nm, 25-200 nm /- 15 nm, 25-300 nm /- 15 nm, 25-400 nm /- 15 nm, 30-35 nm /- 15 nm, 35-40 nm /- 15 nm, 35-45 nm /- 15 nm, 35-150 nm /- 15 nm, 35-155 nm /- 15 nm, 35-60 nm /- 15 nm, 35-70 nm /- 15 nm, 35-75 nm /- 15 nm, 35-80 nm /- 15 nm, 35-90 nm /- 15 nm, 35-95 nm /- 15 nm, 35-100 nm /- 15 nm, 35-125 nm /- 15 nm, 35-150 nm /- 15 nm, 35-200 nm +/15 nm, 35-300 nm /- 15 nm, 35-400, 35-1.500 nm /- 15 nm, 40-45 nm /- 15 nm, 35-150 nm /- 15 nm, 45-155 nm /- 15 nm, 45-60 nm /- 15 nm, 45-70 nm /- 15 nm, 45-75 nm /- 15 nm, 45-80 nm /- 15 nm, 45-90 nm /- 15 nm, 45-95 nm /- 15 nm, 45-100 nm /- 15 nm, 45-125 nm /- 15 nm, 45-150 nm /- 15 nm, 45-200 nm /- 15 nm, 45-300 nm /- 15 nm, 45-400, 45-1.500 nm /- 15 nm, 50-155 nm /- 15 nm, 50-60 nm /- 15 nm, 50-70 nm /-15 nm, 50-75 nm /- 15 nm, 50-80 nm /- 15 nm, 50-90 nm /- 15 nm, 50-95 nm /- 15 nm, 50-100 nm /- 15 nm, 50-125 nm /- 15 nm, 50-150 nm /- 15 nm, 50-200 nm /- 15 nm, 50-300 nm /- 15 nm, 50-400, 50-1.500 nm /-15 nm, 55-60 nm /- 15 nm, 55-70 nm /- 15 nm, 55-75 nm /- 15 nm, 55-80 nm /- 15 nm, 55-90 nm /- 15 nm, 55-95 nm /- 15 nm, 55-100 nm /- 15 nm, 55-125 nm /- 15 nm, 55-150 nm /- 15 nm, 55-200 nm /- 15 nm, 55-300 nm /- 15 nm, 55-400, 55-1.500 nm /- 15 nm, 60-70 nm /- 15 nm, 60-75 nm /- 15 nm, 60-80 nm /- 15 nm, 60-90 nm /- 15 nm, 60-95 nm /- 15 nm, 60-100 nm /- 15 nm, 60-125 nm /- 15 nm, 60-150 nm /- 15 nm, 60-200 nm /- 15 nm, 60-300 nm /- 15 nm, 60-400, 60-1.500 nm /- 15 nm, 65-70 nm /- 15 nm, 65-75 nm /-15 nm, 65-80 nm /- 15 nm, 65-90 nm /- 15 nm, 65-95 nm /- 15 nm, 65-100 nm /- 15 nm, 65-125 nm /- 15 nm, 65-150 nm /- 15 nm, 65-200 nm /- 15 nm, 65-300 nm /- 15 nm, 65-400, 65-1.500 nm /- 15 nm, 70-75 nm /-15 nm, 70-80 nm /- 15 nm, 70-90 nm /- 15 nm, 70-95 nm /- 15 nm, 70-100 nm /- 15 nm, 70-125 nm /- 15 nm, 70-150 nm /- 15 nm, 70-200 nm /- 15 nm, 70-300 nm /- 15 nm, 70-400, 70-1.500 nm /- 15 nm, 75-80 nm /-15 nm, 75-90 nm /- 15 nm, 75-95 nm /- 15 nm, 75-100 nm /- 15 nm, 75-125 nm /- 15 nm, 75-150 nm /- 15 nm, 75-200 nm /- 15 nm, 75-300 nm /- 15 nm, 75-400, 75-1.500 nm /- 15 nm, 80-90 nm /- 15 nm, 80-95 nm /-15 nm, 80-100 nm /- 15 nm, 80-125 nm /- 15 nm, 80-150 nm /- 15 nm, 80-200 nm /- 15 nm, 80-300 nm /-15 nm, 80-400, 80-1.500 nm /- 15 nm, 85-90 nm /- 15 nm, 85-95 nm /- 15 nm, 85-100 nm /- 15 nm, 85-125 nm /- 15 nm, 85-150 nm /- 15 nm, 85-200 nm /- 15 nm, 85-300 nm /- 15 nm, 85-400, 85-1.500 nm /- 15 nm, 90-95 nm /- 15 nm, 90-100 nm /- 15 nm, 90-125 nm /- 15 nm, 90-150 nm /- 15 nm, 90-200 nm /- 15 nm, 90-300 nm /- 15 nm, 90-400, 90-1.500 nm /- 15 nm, 100-125 nm /- 15 nm, 100-150 nm /- 15 nm, 100-200 nm /-15 nm, 100-300 nm /- 15 nm, 100-400, 100-1.500 nm /- 15 nm, 125-150 nm /- 15 nm, 125-200 nm /- 15 nm, 125-300 nm /- 15 nm, 125-400, 125-1.500 nm /- 15 nm, 150-200 nm /- 15 nm, 150-300 nm /- 15 nm, 150-400, 150-1.500 nm /- 15 nm, 175-200 nm /- 15 nm, 175-300 nm /- 15 nm, 175-400, 175-1.500 nm /- 15 nm, 200-300 nm /- 15 nm, 200-400, 200-1.500 nm /- 15 nm, 300-400, 300-1.500 nm /- 15 nm o 400-1.500 nm /-15 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 25-30 nm /- 20 nm, 25-35 nm /- 20 nm, 25-40 nm /- 20 nm, 25-45 nm /- 20 nm, 25-200 nm /- 20 nm, 25-205 nm /- 20 nm, 25-60 nm /- 20 nm, 25-70 nm /- 20 nm, 25-75 nm /- 20 nm, 25-80 nm /- 20 nm, 25-90 nm /- 20 nm, 25-95 nm /- 20 nm, 25-100 nm /- 20 nm, 25-125 nm /- 20 nm, 25-150 nm /- 20 nm, 25-200 nm /- 20 nm, 25-300 nm /- 20 nm, 25-400 nm /- 20 nm, 30-35 nm /- 20 nm, 35-40 nm /- 20 nm, 35-45 nm /- 20 nm, 35-200 nm /- 20 nm, 35-205 nm /- 20 nm, 35-60 nm /- 20 nm, 35-70 nm /- 20 nm, 35-75 nm /- 20 nm, 35-80 nm /- 20 nm, 35-90 nm /- 20 nm, 35-95 nm /- 20 nm, 35-100 nm /- 20 nm, 35-125 nm /- 20 nm, 35-150 nm /- 20 nm, 35-200 nm /-20 nm, 35-300 nm /- 20 nm, 35-400, 35-2.000 nm /- 20 nm, 40-45 nm /- 20 nm, 35-200 nm /- 20 nm, 45-205 nm /- 20 nm, 45-60 nm /- 20 nm, 45-70 nm /- 20 nm, 45-75 nm /- 20 nm, 45-80 nm /- 20 nm, 45-90 nm /- 20 nm, 45-95 nm /- 20 nm, 45-100 nm /- 20 nm, 45-125 nm /- 20 nm, 45-150 nm /- 20 nm, 45-200 nm /- 20 nm, 45-300 nm /- 20 nm, 45-400, 45-2.000 nm /- 20 nm, 50-205 nm /- 20 nm, 50-60 nm /- 20 nm, 50-70 nm /-20 nm, 50-75 nm /- 20 nm, 50-80 nm /- 20 nm, 50-90 nm /- 20 nm, 50-95 nm /- 20 nm, 50-100 nm /- 20 nm, 50-125 nm /- 20 nm, 50-150 nm /- 20 nm, 50-200 nm /- 20 nm, 50-300 nm /- 20 nm, 50-400, 50-2.000 nm /-20 nm, 55-60 nm /- 20 nm, 55-70 nm /- 20 nm, 55-75 nm /- 20 nm, 55-80 nm /- 20 nm, 55-90 nm /- 20 nm, 55-95 nm /- 20 nm, 55-100 nm /- 20 nm, 55-125 nm /- 20 nm, 55-150 nm /- 20 nm, 55-200 nm /- 20 nm, 55-300 nm /- 20 nm, 55-400, 55-2.000 nm /- 20 nm, 60-70 nm /- 20 nm, 60-75 nm /- 20 nm, 60-80 nm /- 20 nm, 60-90 nm /- 20 nm, 60-95 nm /- 20 nm, 60-100 nm /- 20 nm, 60-125 nm /- 20 nm, 60-150 nm /- 20 nm, 60-200 nm /- 20 nm, 60-300 nm /- 20 nm, 60-400, 60-2.000 nm /- 20 nm, 65-70 nm /- 20 nm, 65-75 nm /-20 nm, 65-80 nm /- 20 nm, 65-90 nm /- 20 nm, 65-95 nm /- 20 nm, 65-100 nm /- 20 nm, 65-125 nm /- 20 nm, 65-150 nm /- 20 nm, 65-200 nm /- 20 nm, 65-300 nm /- 20 nm, 65-400, 65-2.000 nm /- 20 nm, 70-75 nm /-20 nm, 70-80 nm /- 20 nm, 70-90 nm /- 20 nm, 70-95 nm /- 20 nm, 70-100 nm /- 20 nm, 70-125 nm /- 20 nm, 70-150 nm /- 20 nm, 70-200 nm /- 20 nm, 70-300 nm /- 20 nm, 70-400, 70-2.000 nm /- 20 nm, 75-80 nm /-20 nm, 75-90 nm /- 20 nm, 75-95 nm /- 20 nm, 75-100 nm /- 20 nm, 75-125 nm /- 20 nm, 75-150 nm /- 20 nm, 75-200 nm /- 20 nm, 75-300 nm /- 20 nm, 75-400, 75-2.000 nm /- 20 nm, 80-90 nm /- 20 nm, 80-95 nm /-20 nm, 80-100 nm /- 20 nm, 80-125 nm /- 20 nm, 80-150 nm /- 20 nm, 80-200 nm /- 20 nm, 80-300 nm /-20 nm, 80-400, 80-2.000 nm /- 20 nm, 85-90 nm /- 20 nm, 85-95 nm /- 20 nm, 85-100 nm /- 20 nm, 85-125 nm /- 20 nm, 85-150 nm /- 20 nm, 85-200 nm /- 20 nm, 85-300 nm /- 20 nm, 85-400, 85-2.000 nm /- 20 nm, 90-95 nm /- 20 nm, 90-100 nm /- 20 nm, 90-125 nm /- 20 nm, 90-150 nm /- 20 nm, 90-200 nm /- 20 nm, 90-300 nm /- 20 nm, 90-400, 90-2.000 nm /- 20 nm, 100-125 nm /- 20 nm, 100-150 nm /- 20 nm, 100-200 nm /-20 nm, 100-300 nm /- 20 nm, 100-400, 100-2.000 nm /- 20 nm, 125-150 nm /- 20 nm, 125-200 nm /- 20 nm, 125-300 nm /- 20 nm, 125-400, 125-2.000 nm /- 20 nm, 150-200 nm /- 20 nm, 150-300 nm /- 20 nm, 150-400, 150-2.000 nm /- 20 nm, 175-200 nm /- 20 nm, 175-300 nm /- 20 nm, 175-400, 175-2.000 nm /- 20 nm, 200-300 nm /- 20 nm, 200-400, 200-2.000 nm /- 20 nm, 300-400, 300-2.000 nm /- 20 nm o 400-2.000 nm /-20 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 25-30 nm /- 25 nm, 25-35 nm /- 25 nm, 25-40 nm /- 25 nm, 25-45 nm /- 25 nm, 25-250 nm /- 25 nm, 25-255 nm /- 25 nm, 25-60 nm /- 25 nm, 25-70 nm /- 25 nm, 25-75 nm /- 25 nm, 25-80 nm /- 25 nm, 25-90 nm /- 25 nm, 25-95 nm /- 25 nm, 25-100 nm /- 25 nm, 25-125 nm /- 25 nm, 25-150 nm /- 25 nm, 25-200 nm /- 25 nm, 25-300 nm /- 25 nm,
Figure imgf000019_0001
125-300 nm /- 25 nm, 125-400, 125-2.500 nm /- 25 nm, 150-200 nm /- 25 nm, 150-300 nm /- 25 nm, 150-400, 150-2.500 nm /- 25 nm, 175-200 nm /- 25 nm, 175-300 nm /- 25 nm, 175-400, 175-2500 nm /- 25 nm, 200-300 nm /- 25 nm, 200-400, 200-2.500 nm /- 25 nm, 300-400, 300-2.500 nm /- 25 nm o 400-2.500 nm /-25 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 224, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 o 500 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 50 /- 5 nm, 75 /- 5 nm, 100 /- 5 nm, 125 /- 5 nm, 150 /- 5 nm, 175 /- 5 nm, 200 /- 5 nm, 225 /- 5 nm, 250 /- 5 nm, 275 /- 5 nm, 300 /-5 nm, 325 /- 5 nm, 350 /- 5 nm, 375 /- 5 nm, 400 /- 5 nm, 425 /- 5 nm, 450 /- 5 nm, 475 /- 5 nm o 500 /-5 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 50 /- 10 nm, 75 /- 10 nm, 100 /- 10 nm, 125 /- 10 nm, 150 /- 10 nm, 175 /- 10 nm, 200 /- 10 nm, 225 /- 10 nm, 250 /- 10 nm, 275 /-10 nm, 300 /- 10 nm, 325 /- 10 nm, 350 /- 10 nm, 375 /- 10 nm, 400 /- 10 nm, 425 /- 10 nm, 450 /- 10 nm, 475 /- 10 nm o 500 /- 10 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 50 /- 15 nm, 75 /- 15 nm, 100 /- 15 nm, 125 /- 15 nm, 150 /- 15 nm, 175 /- 15 nm, 200 /- 15 nm, 225 /- 15 nm, 250 /- 15 nm, 275 /-15 nm, 300 /- 15 nm, 325 /- 15 nm, 350 /- 15 nm, 375 /- 15 nm, 400 /- 15 nm, 425 /- 15 nm, 450 /- 15 nm, 475 /- 15 nm o 500 /- 15 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 50 /- 20 nm, 75 /- 20 nm, 100 /- 20 nm, 125 /- 20 nm, 150 /- 20 nm, 175 /- 20 nm, 200 /- 20 nm, 225 /- 20 nm, 250 /- 20 nm, 275 /-20 nm, 300 /- 20 nm, 325 /- 20 nm, 350 /- 20 nm, 375 /- 20 nm, 400 /- 20 nm, 425 /- 20 nm, 450 /- 20 nm, 475 /- 20 nm o 500 /- 20 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 50 /- 25 nm, 75 /- 25 nm, 100 /- 25 nm, 125 /- 25 nm, 150 /- 25 nm, 175 /- 25 nm, 200 /- 25 nm, 225 /- 25 nm, 250 /- 25 nm, 275 /-25 nm, 300 /- 25 nm, 325 /- 25 nm, 350 /- 25 nm, 375 /- 25 nm, 400 /- 25 nm, 425 /- 25 nm, 450 /- 25 nm, 475 /- 25 nm o 500 /- 25 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro de partícula medio de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 o 125 nm.
Puntos cuánticos
En algunas realizaciones, la nanopartícula es un punto cuántico. Los puntos cuánticos son nanopartículas diferenciadas que tienen propiedades similares a los semiconductores sólidos, de modo que cuando se exponen a energía electromagnética, a su vez, emiten energía. Los puntos cuánticos se pueden diseñar para que sean sensibles a la energía en la región infrarroja, el espectro visible e incluso el intervalo ultravioleta a través de cambios en el tamaño y la composición. Además, se pueden diseñar para ser fotoluminiscentes o fotovoltaicos, produciendo bien luz o bien energía, respectivamente.
Los puntos cuánticos de semiconductores coloidales se sintetizan normalmente a partir de compuestos precursores disueltos en solución y a menudo se basan en un sistema de tres componentes que comprende precursores, surfactantes orgánicos y disolventes. En un proceso típico, al calentar un medio de reacción a la temperatura deseada, los precursores se transforman químicamente en monómeros. Una vez que los monómeros alcanzan un nivel de sobresaturación lo suficientemente alto, el crecimiento de puntos cuánticos comienza a través de un proceso de nucleación. La temperatura durante el proceso de crecimiento es uno de los factores para determinar las condiciones óptimas para el crecimiento de puntos cuánticos. En general, la temperatura debe ser lo suficientemente alta como para permitir la reorganización y el apareamiento de los átomos durante el proceso de síntesis. Sin embargo, la temperatura no debe ser demasiado alta para inhibir el crecimiento de cristales. Un factor adicional, que a menudo se controla también durante el proceso de crecimiento de puntos cuánticos, es la concentración de monómeros. El proceso de crecimiento del punto cuántico a menudo se produce en dos regímenes diferentes, que son “enfocar” y “desenfocar”. A altas concentraciones de monómero, el tamaño crítico (el tamaño en el que los puntos cuánticos no crecen ni se encogen) es muy estrecho, lo que da como resultado el crecimiento de casi todas las partículas. En este régimen, las velocidades relativas de crecimiento favorecen el crecimiento de partículas más pequeñas, lo que proporciona “enfoque” y proporciona un alto grado de monodispersión con respecto al tamaño de partícula. El enfoque de tamaño se considera óptimo cuando la concentración de monómeros se mantiene de manera que el tamaño de punto cuántico promedio presente siempre sea ligeramente mayor que el tamaño crítico. Cuando la concentración de monómeros se agota durante el crecimiento, el tamaño crítico se vuelve más grande que el tamaño promedio presente, y la distribución se “desenfoca” como resultado de un proceso conocido como maduración de Ostwald.
Existen procedimientos coloidales para producir muchos puntos cuánticos binarios y ternarios semiconductores diferentes. Los ejemplos de puntos cuánticos producidos por procedimientos coloidales incluyen, pero no se limitan a, seleniuro de cadmio (CdSe), sulfuro de cadmio (CdS), arseniuro de indio (InAs) y fosfuro de indio (InP), sulfuro de teluro y cadmio (CdTeS). El número de átomos que comprende un punto cuántico puede oscilar entre 100 y 100.000, normalmente con un diámetro que oscila entre 2 y 20 nm (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2,5, 3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,5, 8,5, 9,5, 10,5, 11,5, 12,5, 13,5, 14,5, 15,5, 16,5, 17,5, 18,5, 19,5, 20,5, 2-3 nm, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-11, 2-12, 2-13, 2-14, 2-15, 2-16, 2-17, 2-18, 2-19, 2-20, 3-4, 3- 5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11, 3-12, 3-13, 3-14, 3-15, 3-16, 3-17, 3-18, 3-19, 3-20, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 4- 11, 4-12, 4-13, 4-14, 4-15, 4-16, 4-17, 4-18, 4-19, 4-20, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 5-11, 5-12, 5-13, 5-14, 5-15, 5-16, 5- 17, 5-18, 5-19, 5-20, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 6-11, 6-12, 6-13, 6-14, 6-15, 6-16, 6-17, 6-18, 6-19, 6-20, 7-8, 7-9, 7-10, 7- 11, 7-12, 7-13, 7-14, 7-15, 7-16, 7-17, 7-18, 7-19, 7-20, 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8- 19, 8-20, 9-10, 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 10-20, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 14-20, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20, 17-18, 17-19, 17-20, 18-19, 18-20, 19-20 nm).
En algunas realizaciones, los materiales de puntos cuánticos incluyen, pero no se limitan a, carbono, oro coloidal, germanio, arseniuro de indio, antimoniuro de indio, arseniuro de galio, nitruro de galio, telururo de cadmio/selenio, plomo, óxido de plomo, sulfuro de plomo, seleniuro de plomo , fosfuro de indio y galio, silicio, plata coloidal, telururo de mercurio y cadmio, hierro, óxido de hierro, cobalto, grafeno, lantano, cerio, carbonato de estroncio, manganeso, óxido de manganeso, óxido de níquel, platino, litio, titanato de litio, tántalo, cobre, paladio, molibdeno, carburo de boro, carburo de silicio, carburo de titanio, óxido de wolframio, aluminio, niobio, tulio, nitruro de aluminio, estaño, óxido de aluminio, óxido de estaño, antimonio, disprosio, praseodimio, óxido de antimonio, erbio, renio, bario, rutenio, berilio, samario, óxido de bismuto, boro, gadolinio, nitruro de boro, óxido de vanadio, estroncio, iterbio, circonio, diamante (C), silicio (Si), germanio (Ge), carburo de silicio (SiC), silicio-germanio (SiGe), antimoniuro de aluminio (AlSb), arseniuro de aluminio (AlAs), nitruro de aluminio (AlN), fosfuro de aluminio (AlP), nitruro de boro (BN), fosfuro de boro (BP), arseniuro de boro (BA), antimoniuro de galio (GaSb), arseniuro de galio (GaAs), nitruro de galio (GaN), fosfuro de galio (GaP), antimoniuro de indio (InSb), arseniuro de indio (InAs), nitruro de indio (InN), fosfuro de indio (InP), arseniuro de aluminio y galio (AlGaAs, AlxGa1-xAs), arseniuro de indio y galio (InGaAs, InxGa1-xAs), fosfuro de indio y galio (InGaP), arseniuro de aluminio e indio (AlInAs), antimoniuro de aluminio e indio (AlInSb), nitruro y arseniuro de galio (GaAsN), fosfuro y arseniuro de galio (GaAsP), nitruro de aluminio y galio (AlGaN), fosfuro de aluminio y galio (AlGaP), nitruro de indio y galio (InGaN), antimoniuro y arseniuro de indio (InAsSb), antimoniuro de indio y galio (InGaSb), fosfuro de aluminio y galio e indio (AlGaInP, también InAlGaP, InGaAlP, AlInGaP), fosfuro y arseniuro de aluminio y galio (AlGaAsp), fosfuro y arseniuro de indio y galio (InGaAsP), fosfuro y arseniuro de indio y aluminio (AlInAsP), nitruro y arseniuro de aluminio y galio (AlGaAsN), nitruro y arseniuro de indio y galio (InGaAsN), nitruro y arseniuro de aluminio e indio (InAlAsN), arseniuro y nitruro de galio y antimonio (GaAsSbN), nitruro y arseniuro y antimoniuro de galio e indio (GaInNAsSb), fosfuro de antimonio y arseniuro de galio e indio (GaInAsSbP), seleniuro de cadmio (CdSe), sulfuro de cadmio (CdS), telururo de cadmio (CdTe), óxido de cinc (ZnO), seleniuro de cinc (ZnSe), sulfuro de cinc (ZnS), telururo de cinc (ZnTe), telururo de cadmio y cinc (CdZnTe, “CZT”), telururo de cadmio y mercurio (HgCdTe), telururo de cinc y mercurio (HgZnTe), seleniuro de cinc y mercurio (HgZnSe), cloruro cuproso (CuCl), seleniuro de plomo (PbSe), sulfuro de plomo (PbS), telururo de plomo (PbTe), sulfuro de estaño (SnS), telururo de estaño (SnTe), telururo de plomo y estaño (PbSnTe), telururo de talio y estaño (Tl2SnTe5), telururo de talio y germanio (Tl2GeTe5), telururo de bismuto (B¡2Te3), fosfuro de cadmio (Cd3 PAG2), arseniuro de cadmio (Cd3As2), antimoniuro de cadmio (Cd3Sb2), fosfuro de cinc (Zn3 P2), arseniuro de cinc (Zn3As2), antimoniuro de cinc (Zn3Sb2), yoduro de plomo (II) (Pbh ), disulfuro de molibdeno (MoS2), seleniuro de galio (GaSe), sulfuro de estaño (SnS), sulfuro de bismuto (Bi2S3), seleniuro de cobre, indio y galio (CIGS), siliciuro de platino (PtSi), yoduro de bismuto (III) (BN3), yoduro de mercurio (II) (Hgh ), bromuro de talio (I) (TIBr), dióxido de titanio: anatasa (TD2), óxido de cobre (I) (Cu2O), óxido de cobre (II) (CuO), dióxido de uranio (110)2), trióxido de uranio (UO3), y similares.
En algunas realizaciones, los materiales adecuados para los puntos cuánticos de la presente invención incluyen semiconductores orgánicos que comprenden pentaceno, antraceno y rubreno. En algunas realizaciones, los materiales adecuados para los puntos cuánticos de la presente invención incluyen semiconductores magnéticos tales como arseniuro de indio dopado con manganeso y arseniuro de galio, antimoniuro de indio dopado con manganeso, óxido de indio dopado con manganeso y hierro, óxido de cinc dopado con manganeso y nitruro de aluminio dopado con cromo, dióxido de estaño dopado con hierro, óxido de cinc dopado con cobalto tipo n, dióxido de titanio dopado con cobalto (tanto rutilo como anatasa), rutilo dopado con cromo, rutilo dopado con hierro y anatasa dopada con hierro, anatasa dopada con níquel y dióxido de estaño dopado con manganeso.
Los puntos cuánticos se pueden formar utilizando una variedad de técnicas. Por ejemplo, los puntos cuánticos se pueden formar creando una región de un primer material que tiene un primer ancho de banda prohibido rodeado por un segundo material de un segundo ancho de banda prohibido, en el que el segundo ancho de banda prohibido es mayor que el primer ancho de banda prohibido. Los puntos cuánticos a modo de ejemplo producidos mediante tal proceso incluyen, pero no se limitan a, un núcleo de seleniuro de cadmio (CdSe) rodeado por una cubierta de seleniuro de cinc (ZnS).
Como alternativa, los puntos cuánticos autoensamblados se nuclean de manera espontánea en determinadas condiciones durante la epitaxia por haces moleculares (MBE) y la epitaxia metalorgánica en fase de vapor (MOVPE), cuando se cultiva un material en un sustrato al que no corresponde la red cristalina. La tensión resultante entre la capa crecida y el sustrato produce islas teñidas de manera coherente en la parte superior de una “capa humectante” bidimensional. Las islas se pueden rodear posteriormente por una cubierta para formar el punto cuántico.
Los puntos cuánticos individuales se pueden crear también a partir de electrones bidimensionales o gases de hueco presentes en pocillos cuánticos dopados remotamente o heteroestructuras de semiconductores. En este caso, se recubre una superficie con una fina capa de producto fotorresistente. A continuación, se define un patrón lateral en la resistencia mediante litografía de haces de electrones. Este patrón se puede transferir al electrón o al gas de hueco mediante grabado o depositando electrodos metálicos (proceso de despegue) que permiten la aplicación de tensiones externas entre el gas electrónico y los electrodos.
Los puntos cuánticos también se pueden formar en estructuras de pocillos cuánticos debido a las fluctuaciones de monocapa en el grosor del pocillo. Como alternativa, los puntos cuánticos se pueden producir por pirólisis por ultrasonidos de aerosoles (UAP).
En algunas realizaciones, los puntos cuánticos incluyen un núcleo semiconductor interno formado, por ejemplo, por fosfuro de indio/galio, silicio, arseniuro de galio, telururo de cadmio, seleniuro de cobre, indio y galio, nitruro de indio y galio, carbono, oro coloidal, plata coloidal o materiales orgánicos tales como heterouniones de polímero-fullereno (por ejemplo, P3HT C60), células solares de nanocristales orgánicos (por ejemplo, seleniuro de cadmio o telururo de cadmio), células sensibilizadas con colorantes (por ejemplo, colorante y óxido de titanio u óxido de nobelio), o una célula en tándem (por ejemplo, cobre-ftalocianina C60); una cubierta, formada, por ejemplo, por seleniuro de cinc u otro material adecuado; un recubrimiento, formado, por ejemplo, por lípidos PeG u otro material adecuado; y material biofuncional, formado, por ejemplo, por biotina, estreptavidina, proteínas de adhesión, vitaminas, compuestos orgánicos e inorgánicos, hidratos de carbono, aptámeros, aminoácidos, lípidos, ácido hialurónico u otras proteínas adecuadas.
Complejos presentadores de antígeno
Los complejos presentadores de antígeno comprenden una hendidura de unión a antígeno y se pueden unir a un antígeno para su presentación a una célula T o precursor de células T. Los complejos presentadores de antígeno pueden ser, por ejemplo, moléculas de MHC de clase I o de clase II, proteínas de fusión que comprenden hendiduras de unión a antígeno funcionales de moléculas de MHC de clase I o de clase II, “complejos moleculares” de MHC de clase I o de clase II (descritos a continuación), o moléculas de tipo MHC no clásicas tales como miembros de la familia de CD1 (por ejemplo, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d y CD1e).
En algunas realizaciones, los complejos presentadores de antígeno son complejos moleculares de MHC de clase I y/o MHC de clase II. Los complejos moleculares de MHC de clase I y de clase II tienen varias características útiles. Por ejemplo, son extremadamente estables y fáciles de producir, basándose en la estabilidad y eficiencia de secreción proporcionadas por la estructura principal de inmunoglobulina. Además, alterando la porción de Fc de la inmunoglobulina, se pueden proporcionar diferentes funciones biológicas a la molécula basándose en funciones biológicas proporcionadas por la porción de Fc. La sustitución de la porción de Fc de un tipo de gen de inmunoglobulina por otro está dentro de las habilidades de la técnica.
Se describen “complejos moleculares de MHC de clase I” en la Patente US 6,268,411. Los complejos moleculares de MHC de clase I se forman de una manera intacta con respecto a la conformación en los extremos de la cadena pesada de inmunoglobulinas (ver la figura 1A de la Patente US 6,268,411 para una representación esquemática). Los complejos moleculares de MHC de clase I a los que se unen péptidos antigénicos se pueden unir de manera estable a receptores de linfocitos específicos de antígeno (por ejemplo, receptores de células T).
Los complejos moleculares de MHC de clase I comprenden, como mínimo, dos proteínas de fusión. Una primera proteína de fusión comprende una primera cadena a de MHC de clase I y una primera cadena pesada de inmunoglobulina, y una segunda proteína de fusión comprende una segunda cadena a de MHC de clase I y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina primera y segunda se asocian para formar el complejo molecular de MHC de clase I, que comprende dos hendiduras de unión a péptido de MHC de clase I. La cadena pesada de inmunoglobulina puede ser la cadena pesada de una IgM, IgD, IgG1, IgG3, IgG2p, IgG2a, IgE o IgA. Preferentemente, se utiliza una cadena pesada de IgG para formar complejos moleculares de MHC de clase I. Si se desean complejos moleculares de MHC de clase I multivalentes, se pueden utilizar cadenas pesadas de IgM o IgA para proporcionar moléculas pentavalentes o tetravalentes, respectivamente. También se pueden construir complejos moleculares de MHC de clase I con otras valencias, utilizando múltiples cadenas pesadas de inmunoglobulina. La construcción de complejos moleculares de MHC de clase I se describe en detalle en la Patente US 6,268,411.
Se describen “complejos moleculares de MHC de clase II” en la Patente US 6,458,354, la Patente US 6,015,884, la Patente US 6,140,113 y la Patente US 6,448,071. Los complejos moleculares de MHC de clase II comprenden, como mínimo, cuatro proteínas de fusión. Dos primeras proteínas de fusión comprenden (i) una cadena pesada de inmunoglobulina y (ii) un dominio extracelular de una cadena p de MHC de clase II. Dos segundas proteínas de fusión comprenden (i) una cadena ligera de inmunoglobulina k o X y (ii) un dominio extracelular de una cadena a de MHC de clase II. Las dos primeras y las dos segundas proteínas de fusión se asocian para formar el complejo molecular de MHC de clase II. El dominio extracelular de la cadena p de MHC de clase II de cada primera proteína de fusión y el dominio extracelular de la cadena a de MHC de clase II de cada segunda proteína de fusión forman una hendidura de unión a péptido de MHC de clase II.
La cadena pesada de inmunoglobulina puede ser la cadena pesada de una IgM, IgD, IgG3, IgG 1, IgG2p, IgG2a, IgE o IgA. Preferentemente, se utiliza una cadena pesada de IgG 1 para formar complejos moleculares divalentes que comprenden dos hendiduras de unión a antígeno. Opcionalmente, se puede incluir una región variable de la cadena pesada. Se pueden utilizar cadenas pesadas de IgM o IgA para proporcionar complejos moleculares pentavalentes o tetravalentes, respectivamente. También se pueden construir complejos moleculares con otras valencias, utilizando múltiples cadenas de inmunoglobulina.
Las proteínas de fusión de un complejo molecular de MHC de clase II pueden comprender un ligador peptídico insertado entre una cadena de inmunoglobulina y un dominio extracelular de un polipéptido de MHC de clase II. La longitud de la secuencia de ligador puede variar, dependiendo de la flexibilidad requerida para regular el grado de unión a antígeno y reticulación de receptor. También se pueden diseñar construcciones de tal manera que los polipéptidos de MHC de clase II de dominios extracelulares se unan de manera directa y covalente a las moléculas de inmunoglobulina sin una región de ligador adicional.
Si se incluye una región de ligador, esta región contendrá preferentemente, como mínimo, 3 y no más de 30 aminoácidos. Más preferentemente, el ligador tiene aproximadamente 5 y no más de 20 aminoácidos; de la manera más preferente, el ligador tiene menos de 10 aminoácidos. Generalmente, el ligador consiste en separadores cortos de glicina/serina, pero se puede utilizar cualquier aminoácido. Un ligador preferente para conectar una cadena pesada de inmunoglobulina a un dominio extracelular de una cadena p de MHC de clase II es GLY-GLY-GLY-THR-SER-GLY (SEQ ID NO: 1). Un ligador preferente para conectar una cadena ligera de inmunoglobulina a un dominio extracelular de una cadena a de MHC de clase II es GLY-SER-LEU-GLY-GLY-SER (SEQ ID NO: 2).
Moléculas que afectan a células T
Las “moléculas que afectan a células T” son moléculas que tienen un efecto biológico sobre una célula T precursora o sobre una célula T específica de antígeno. Tales efectos biológicos incluyen, por ejemplo, la diferenciación de una célula T precursora para dar un CTL, célula T cooperadora (por ejemplo, Th1, Th2) o célula T reguladora; proliferación de células T; e inducción de apoptosis de células T. Por tanto, las moléculas que afectan a células T incluyen moléculas coestimuladoras de células T, moléculas de adhesión, factores de crecimiento de células T, moléculas inductoras de células T reguladoras y moléculas inductoras de apoptosis. En algunas realizaciones, una nano-aAPC comprende, como mínimo, una molécula de este tipo; opcionalmente, una nano-aAPC comprende, como mínimo, dos, tres o cuatro de tales moléculas, en cualquier combinación.
Las moléculas coestimuladoras de células T contribuyen a la activación de células T específicas de antígeno. Tales moléculas incluyen, pero no se limitan a, moléculas que se unen específicamente a CD28 (incluyendo anticuerpos), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, anticuerpos que se unen específicamente a HVEM, anticuerpos que se unen específicamente a CD40L, anticuerpos que se unen específicamente a OX40 y anticuerpos que se unen específicamente a 4-1BB.
Se pueden utilizar moléculas de adhesión útiles para nano-aAPC para mediar en la adhesión de las nano-aAPC a una célula T o a un precursor de células T. Las moléculas de adhesión útiles incluyen, por ejemplo, ICAM-1 y LFA-3. Los factores de crecimiento de células T afectan a la proliferación y/o diferenciación de células T. Los ejemplos de factores de crecimiento de células T incluyen citocinas (por ejemplo, interleucinas, interferones) y superantígenos. Si se desea, las citocinas pueden estar presentes en complejos moleculares que comprenden proteínas de fusión. En una realización, un complejo molecular de citocina puede comprender, como mínimo, dos proteínas de fusión: una primera proteína de fusión comprende una primera citocina y una cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda proteína de fusión comprende una segunda citocina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina primera y segunda se asocian para formar el complejo molecular de citocina. En otra realización, un complejo molecular de citocina comprende, como mínimo, cuatro proteínas de fusión: dos primeras proteínas de fusión comprenden (i) una cadena pesada de inmunoglobulina y (ii) una primera citocina y dos segundas proteínas de fusión comprenden (i) una cadena ligera de inmunoglobulina y (ii) una segunda citocina. Las dos primeras y las dos segundas proteínas de fusión se asocian para formar el complejo molecular de citocina. Las citocinas primera y segunda en cualquier tipo de complejo molecular de citocina pueden ser iguales o diferentes. Las citocinas particularmente útiles incluyen IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 e interferón gamma.
Los superantígenos son potentes mitógenos de células T. Los superantígenos estimulan la mitogénesis de células T uniéndose en primer lugar a moléculas de clase II de histocompatibilidad mayor (MHC) y a continuación como complejo binario se unen de una manera específica de Vp al receptor de antígeno de células T (TCR). Los superantígenos incluyen, pero no se limitan a, enterotoxinas bacterianas, tales como enterotoxinas de estafilococos (por ejemplo, SEA y porciones activas de la misma, dadas a conocer en la Patente US 5,859,207; superantígenos retrovirales SEB, SEC, SED y SEE (dados a conocer en la Patente US 5,519,114); exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), toxina de síndrome de choque tóxico (TSST-1) de Staphylococcus aureus, una exotoxina mitógena de estreptococos (SME) y un superantígeno de estreptococos (SSA) (dados a conocer en la Patente US 2003/0039655); y superantígenos dados a conocer en la Patente Us 2003/0036644 y en la Patente US 2003/0009015.
Las moléculas inductoras de células T reguladoras son moléculas que inducen la diferenciación y/o el mantenimiento de células T reguladoras. Tales moléculas incluyen, pero no se limitan a, TGFp, IL-10, interferón-a e IL-15. Ver, por ejemplo, la Patente US 2003/0049696, la Patente US 2002/0090724, la Patente US 2002/0090357, la Patente US 2002/0034500 y la Patente US 2003/0064067.
Las moléculas inductoras de apoptosis provocan la muerte celular. Las moléculas inductoras de apoptosis incluyen toxinas (por ejemplo, cadena A de ricina, endotoxinas de Pseudomonas mutantes, toxoide diftérico, estreptonigrina, boamicina, saporina, gelonina y proteína antiviral de fitolaca), TNFa y ligando de Fas.
Antígenos
Se puede unir una variedad de antígenos a complejos presentadores de antígeno. La naturaleza de los antígenos depende del tipo de complejo presentador de antígeno que se utiliza. Por ejemplo, se pueden unir antígenos peptídicos a hendiduras de unión a péptido de MHC de clase I y de clase II. Se pueden utilizar moléculas de tipo m Hc no clásicas para presentar antígenos no peptídicos tales como fosfolípidos, hidratos de carbono complejos y similares (por ejemplo, componentes de la membrana bacteriana tales como ácido micólico y lipoarabinomanano). “Antígenos”, tal como se utiliza en el presente documento, también incluye “péptidos antigénicos”.
Cualquier péptido que puede inducir una respuesta inmunitaria se puede unir a un complejo presentador de antígeno. Los péptidos antigénicos incluyen antígenos asociados a tumor, autoantígenos, aloantígenos y antígenos de agentes infecciosos.
Los “antígenos asociados a tumor” incluyen antígenos de tumor únicos expresados exclusivamente por el tumor a partir del cual se derivan, antígenos de tumor compartidos expresados en muchos tumores pero no en tejidos adultos normales (antígenos oncofetales) y antígenos específicos de tejido expresados también por el tejido normal a partir del cual surgió el tumor. Los antígenos asociados a tumor pueden ser, por ejemplo, antígenos embrionarios, antígenos con modificaciones anómalas tras la traducción, antígenos de diferenciación, productos de oncogenes mutados o supresores tumorales, proteínas de fusión o proteínas oncovirales.
En la técnica se conoce una variedad de antígenos asociados a tumor, y muchos de ellos están disponibles en el mercado. Los antígenos oncofetales y embrionarios incluyen antígeno carcinoembrionario y alfa-fetoproteína (habitualmente sólo se expresan altamente en embriones en desarrollo, pero con frecuencia se expresan altamente por tumores del hígado y el colon, respectivamente), MAGE-1 y MAGE-3 (expresados en melanoma, cáncer de mama y glioma), fosfatasa alcalina-sialil-Lewis X placentaria (expresada en adenocarcinoma), CA-125 y CA-19 (expresados en tumores gastrointestinales, hepáticos y ginecológicos), TAG-72 (expresado en tumores colorrectales), glicoproteína epitelial 2 (expresada en muchos carcinomas), antígeno oncofetal pancreático, 5T4 (expresado en carcinoma gástrico), receptor de alfa-fetoproteína (expresado en múltiples tipos de tumor, particularmente tumores de mama) y M2A (expresado en neoplasia de células germinales).
Los antígenos de diferenciación asociados a tumor incluyen tirosinasa (expresada en melanoma) e inmunoglobulinas de superficie particulares (expresadas en linfomas).
Los productos de genes supresores de tumor o de oncogenes mutados incluyen Ras y p53, ambos de los cuales se expresan en muchos tipos de tumor, Her-2/neu (expresado en cánceres de mama y ginecológicos), EGF-R, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, producto génico de retinoblastoma, myc (asociado con cáncer de pulmón), ras, p53, no mutante asociado con tumores de mama, MAGE-1 y MAGE-3 (asociados con melanoma, cáncer de pulmón y otros cánceres).
Las proteínas de fusión incluyen BCR-ABL, que se expresa en leucemia mieloide crónica.
Las proteínas oncovirales incluyen HPV tipo 16, E6 y E7, que se encuentran en carcinoma de cuello uterino.
Los antígenos específicos de tejido incluyen melanotransferrina y MUC1 (expresados en cánceres pancreático y de mama); CD10 (anteriormente conocido como antígeno de leucemia linfoblástica aguda común, o CALLA) o inmunoglobulina de superficie (expresada en linfomas y leucemias de células B); la cadena a del receptor de IL-2, receptor de células T, CD45R, CD4+/CD8+ (expresados en linfomas y leucemias de células T); antígeno específico de próstata y fosfatasa ácida de próstata (expresados en carcinoma de próstata); GP 100, MelanA/Mart-1, tirosinasa, gp75/marrón, BAGE y S-100 (expresados en melanoma); citoqueratinas (expresadas en diversos carcinomas); y CD19, CD20 y CD37 (expresados en linfoma).
Los antígenos asociados a tumor también incluyen antígenos de glicolípidos y glicoproteínas alterados, tales como glicoesfingolípidos que contienen ácido neuramínico (por ejemplo, GM2 y GD2, expresados en melanomas y algunos tumores cerebrales); antígenos de grupo sanguíneo, particularmente antígenos T y Tn sialilados, que pueden expresarse de manera aberrante en carcinomas; y mucinas, tales como CA-125 y CA-19-9 (expresadas en carcinomas de ovarios) o el MUC-1 glicosilado de manera insuficiente (expresado en carcinomas de mama y pancreático).
Los antígenos específicos de tejido incluyen antígeno de membrana epitelial (expresado en múltiples carcinomas epiteliales), CYf Ra 21-1 (expresado en cáncer de pulmón), Ep-CAM (expresado en pan-carcinoma), CA125 (expresado en cáncer de ovarios), inmunoglobulina monoclonal intacta o fragmentos de cadena ligera (expresados en mieloma) y la subunidad beta de
Un “autoantígeno” es un “antígeno propio” del propio organismo frente al cual el organismo produce una respuesta inmunitaria. Los autoantígenos están implicados en enfermedades autoinmunitarias tales como síndrome de Goodpasture, esclerosis múltiple, enfermedad de Graves, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis reumatoide, pénfigo vulgar, enfermedad de Addison, dermatitis herpetiforme, enfermedad celiaca y tiroiditis de Hashimoto.
Los autoantígenos relacionados con diabetes incluyen insulina, ácido glutámico descarboxilasa (GAD) y otros autoantígenos de células del islote, por ejemplo, ICA 512/IA-2 proteína tirosina fosfatasa, ICA12, ICA69, preproinsulina o un fragmento inmunológicamente activo de la misma (por ejemplo, cadena B, cadena A, péptido C de insulina o un fragmento inmunológicamente activo de los mismos), HSP60, carboxipeptidasa H, periferina, gangliósidos (por ejemplo, GM1-2, GM3) o fragmentos inmunológicamente activos de los mismos.
Los autoantígenos asociados con degeneración macular incluyen moléculas de la ruta del complemento y diversos autoantígenos de RPE, coroides y retina, vitronectina, cristalina p, calreticulina, serotransferrina, queratina, piruvato carboxilasa, C1 y villina 2.
Otros autoantígenos incluyen nucleosomas (partículas que contienen histonas y ADN); partículas de ribonucleoproteína (RNP) (que contienen ARN y proteínas que median en funciones especializadas en la partícula de RNP) y ADN bicatenario. Todavía otros autoantígenos incluyen glicoproteína de la mielina de oligodendrocitos (MOG), glicoproteína asociada a mielina (MAG), mielina/proteína básica de oligodendrocitos (MOBP), proteína específica de oligodendrocitos (Osp), proteína básica de mielina (MBP), apoproteína de proteolípidos (PLP), cerebrósido de galactosa (GalC), glicolípidos, esfingolípidos, fosfolípidos, gangliósidos y otros antígenos neuronales. Un “aloantígeno” es un producto directo o indirecto de un alelo que es detectado como un antígeno por otro miembro de la misma especie. Los productos directos de tales alelos incluyen polipéptidos codificados; los productos indirectos incluyen polisacáridos y lípidos sintetizados por enzimas codificadas por alelos. Los aloantígenos incluyen antígenos de histocompatibilidad mayores y menores (conocidos como h La en seres humanos), incluyendo antígenos de clase I y de clase II, antígenos de grupo sanguíneo tales como ABO, grupo de Lewis, antígenos en células T y B, y antígenos de monocitos/células endoteliales. Las especificidades de h La incluyen A (por ejemplo A1-A74, particularmente A1, A2, A3, A11, A23, A24, A28, A30, A33), B (por ejemplo, B1-B77, particularmente B7, B8, B35, B44, B53, B60, B62), C (por ejemplo, C1-C11), D (por ejemplo, D1-D26), DR (por ejemplo, DR1, DR2, DR3, DR4, d R7, DR8 y DR11), DQ (por ejemplo, DQ1-DQ9) y d P (por ejemplo, DP1-DP6).
Los “antígenos de agentes infecciosos” incluyen componentes de protozoos, bacterias, hongos (tanto unicelulares como multicelulares), virus, priones, parásitos intracelulares, helmintos y otros agentes infecciosos que pueden inducir una respuesta inmunitaria.
Los antígenos bacterianos incluyen antígenos de cocos gram-positivos, bacilos gram-positivos, bacterias gram-negativas, bacterias anaerobias, tales como organismos de las familias Actinomycetaceae, Bacillaceae, Bartonellaceae, Bordetellae, Captophagaceae, Corynebacteriaceae, Enterobacteriaceae, Legionellaceae, Micrococcaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae, Spirochaetaceae, Vibrionaceae y organismos de los géneros Acinetobacter, Brucella, Campylobacter, Erysipelothrix, Ewingella, Francisella, Gardnerella, Helicobacter, Levinea, Listeria, Streptobacillus y Tropheryma.
Los antígenos de agentes infecciosos protozoarios incluyen antígenos de plasmodios de la malaria, especies de Leishmania, especies de Trypanosoma y especies de Schistosoma.
Los antígenos fúngicos incluyen antígenos de Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Cryptococcus, Histoplasma, Paracoccicioides, Sporothrix, organismos del orden Mucorales, organismos que inducen coromicosis y micetoma y organismos de los géneros Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton y Malassezia.
Los antígenos de priones incluyen la sialoglicoproteína PrP 27-30 de los priones que provocan tembladera, encefalopatías espongiformes bovinas (BSE), encefalopatías espongiformes felinas, kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) e insomnio familiar letal (FFI).
Los parásitos intracelulares a partir de los cuales se pueden obtener péptidos antigénicos incluyen, pero no se limitan a, Chlamydiaceae, Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae, Rickettsiae y organismos de los géneros Coxiella y Ehrlichia.
Se pueden obtener péptidos antigénicos a partir de helmintos, tales como nematodos, trematodos o cestodos.
Los antígenos peptídicos virales incluyen, pero no se limitan a, los de adenovirus, virus del herpes simple, virus del papiloma, virus sincitial respiratorio, poxvirus, VIH, virus de la gripe y CMV. Los antígenos peptídicos virales particularmente útiles incluyen proteínas del VIH tales como proteínas gag de VIH (incluyendo, pero sin limitarse a, proteína de anclaje de membrana (MA), proteína de cápside del núcleo (CA) y proteína de nucleocápside (NC)), polimerasa de VIH, proteína de matriz de virus de la gripe (M) y proteína de nucleocápside de virus de la gripe (NP), antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg), proteína de núcleo de hepatitis B (HBcAg), proteína de hepatitis E (HBeAg), ADN polimerasa de hepatitis B, antígenos de hepatitis C y similares.
Unión de antígenos a complejos presentadores de antígeno
Se pueden unir antígenos, incluyendo péptidos antigénicos, a una hendidura de unión a antígeno de un complejo presentador de antígeno de manera activa o pasiva, tal como se describe la Patente US 6,268,411. Opcionalmente, se puede unir un péptido antigénico de manera covalente a una hendidura de unión a péptido.
Si se desea, se puede utilizar un anclaje peptídico para unir un péptido antigénico a una hendidura de unión a péptido. Por ejemplo, análisis cristalográficos de múltiples moléculas de MHC de clase I indican que el extremo amino-terminal de p2M está muy cerca, a aproximadamente 20,5 Angstroms, del extremo carboxi-terminal de un péptido antigénico que reside en la hendidura de unión a péptido de MHC. Por tanto, utilizando una secuencia de ligador relativamente corta, de aproximadamente 13 aminoácidos de longitud, se puede anclar un péptido al extremo amino-terminal de p2M. Si la secuencia es apropiada, ese péptido se unirá al surco de unión a MHC (ver la Patente US 6,268,411).
Moléculas que afectan a células B
Las “moléculas que afectan a células B” son moléculas que tienen un efecto biológico sobre una célula B o un precursor de células B, tal como inducir proliferación o formación de anticuerpos. Tales moléculas incluyen ligando CD40, así como citocinas y complejos moleculares de citocinas tal como se describió anteriormente. Dependiendo del tipo de molécula de citocina utilizada, se puede motivar que células B produzcan tipos particulares de anticuerpos. Por ejemplo, IL-4 induce la producción de IgE, mientras que IL-5 induce la producción de IgA.
Complejos moleculares para su utilización en nano-aAPC inductoras de anticuerpos
Los complejos moleculares para su utilización en nano-aAPC inductoras de anticuerpos son complejos que se enganchan a inmunoglobulinas de superficie de células B o que se enganchan a complejos de MHC-antígeno sobre la superficie de una célula B. Los complejos moleculares que se enganchan a inmunoglobulinas de superficie de células B incluyen antígenos complejados con la superficie de nano-aAPC. Los complejos moleculares que se enganchan a complejos de MHC-antígeno sobre la superficie de una B célula incluyen receptores de células T (TCR) y complejos moleculares de TCR. Las nano-aAPC inductoras de anticuerpos pueden incluir una o ambas formas (es decir, que se enganchan a inmunoglobulina de superficie de células B o que se enganchan a MHC-antígeno) de tales complejos moleculares.
Se pueden clonar TCR específicos para cualquier antígeno particular utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente US 2002/0064521. Se pueden utilizar TCR específicos de antígeno clonados como tales o se pueden utilizar para formar complejos moleculares de TCR, descritos a continuación.
Se dan a conocer “complejos moleculares de TCR” en la Patente US 6,458,354, la Patente US 6,015,884, la Patente US 6,140,113 y la Patente US 6,448,071. Los complejos moleculares de TCR comprenden, como mínimo, cuatro proteínas de fusión. Dos primeras proteínas de fusión comprenden (i) una cadena pesada de inmunoglobulina y (ii) un dominio extracelular de una cadena a de TCR. Dos segundas proteínas de fusión comprenden (i) una cadena ligera de inmunoglobulina k o X y (ii) un dominio extracelular de cadena p de TCR. Como alternativa, dos primeras proteínas de fusión comprenden (i) una cadena pesada de inmunoglobulina y (ii) un dominio extracelular de una cadena y de TCR, y dos segundas proteínas de fusión comprenden (i) una cadena ligera de inmunoglobulina k o X y (ii) un dominio extracelular de cadena 8 de TCR. Las dos primeras y las dos segundas proteínas de fusión se asocian para formar el complejo molecular de TCR. El dominio extracelular de la cadena de TCR de cada primera proteína de fusión y el dominio extracelular de la cadena de TCR de cada segunda proteína de fusión forman una hendidura de reconocimiento de antígeno.
La cadena pesada de inmunoglobulina puede ser la cadena pesada de una IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2p, IgG2a, IgE o IgA. Preferentemente, se utiliza una cadena pesada de IgG1 para formar complejos moleculares de TCR divalentes que comprenden dos hendiduras de reconocimiento de antígeno. Opcionalmente, se puede incluir una región variable de la cadena pesada. Se pueden utilizar cadenas pesadas de IgM o IgA para proporcionar complejos moleculares de TCR pentavalentes o tetravalentes, respectivamente. También se pueden construir complejos moleculares de TCR con otras valencias, utilizando múltiples cadenas de inmunoglobulina.
Las proteínas de fusión de un complejo molecular de TCR pueden comprenden un ligador peptídico insertado entre una cadena de inmunoglobulina y un dominio extracelular de un polipéptido de TCR. La longitud de la secuencia de ligador puede variar, dependiendo de la flexibilidad requerida para regular el grado de unión a antígeno y reticulación. También se pueden diseñar construcciones de tal manera que los dominios extracelulares de polipéptidos de TCR se unan de manera directa y covalente a las moléculas de inmunoglobulina sin una región de ligador adicional. Si se incluye una región de ligador, esta región contendrá preferentemente, como mínimo, 3 y no más de 30 aminoácidos. Más preferentemente, el ligador tiene aproximadamente 5 y no más de 20 aminoácidos; de la manera más preferente, el ligador tiene menos de 10 aminoácidos. Generalmente, el ligador consiste en separadores cortos de glicina/serina, pero se puede utilizar cualquier aminoácido. Un ligador preferente para conectar una cadena pesada de inmunoglobulina a un dominio extracelular de una cadena a o y de TCR es GLY-GLY-GLY-THR-s Er-GLY (SEQ ID NO: 1). Un ligador preferente para conectar una cadena ligera de inmunoglobulina a un dominio extracelular de una cadena p o 8 de TCR es GlY-SER-LEU-GLY-GLY-SER (SEQ ID NO: 2).
Procedimientos de utilización de nano-aAPC para inducir y expandir poblaciones celulares específicas. Inducción y expansión de células T específicas de antígeno
La presente divulgación proporciona procedimientos de inducción de la formación y expansión de células T específicas de antígeno, incluyendo cTl , células T cooperadoras y células T reguladoras. Estos procedimientos implican poner en contacto una preparación aislada que comprende una pluralidad de células T precursoras con nano-aAPC a las que se unen antígenos en las hendiduras de unión antigénica. La incubación de la preparación con las nano-aAPC induce células precursoras en la población para formar células T específicas de antígeno que reconocen el antígeno. Se pueden obtener células T específicas de antígeno incubando células T precursoras con nano-aAPC, tal como se describe a continuación, o se pueden obtener mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, incubación con células dendríticas, o mediante incubación con otros tipos de células presentadoras de antígeno artificiales tal como se conocen en la técnica.
Normalmente, el número o el porcentaje de células T específicas de antígeno en la primera población celular es mayor que el número o porcentaje de células T específicas de antígeno que se forman si se incuban células T precursoras con partículas que comprenden un anticuerpo que se une específicamente a CD3 pero no comprenden un complejo presentador de antígeno.
En cualquiera de las realizaciones dadas a conocer en el presente documento en las que se utilizan nano-aAPC, se puede utilizar cualquier combinación de complejos presentadores de antígeno, antígenos unidos y moléculas que afectan a células T. Por ejemplo, una nano-aAPC puede comprender una o varias moléculas coestimuladoras de células T (iguales o diferentes), una o varias moléculas inductoras de células T reguladoras (iguales o diferentes), una o varias moléculas de adhesión (iguales o diferentes) y/o uno o varios factores de crecimiento de células T (iguales o diferentes). De manera similar, una nano-aAPC puede comprender uno o varios complejos presentadores de antígeno, iguales o diferentes, a los que se puede unir cualquier combinación de antígenos. En una realización, por ejemplo, se pueden unir varios antígenos asociados a melanoma diferentes (por ejemplo, cualquiera o la totalidad de tirosinasa, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, Melan A/Mart-1, gp75/marrón, BAGE y S-100) a complejos presentadores de antígeno en una o varias nano-aAPC.
Se pueden obtener células T precursoras a partir del paciente o a partir de un donante adecuado. No se necesita que el donante sea un gemelo idéntico o ni siquiera un familiar del paciente. Sin embargo, preferentemente, el donante y el paciente comparten, como mínimo, una molécula de HLA. Se pueden obtener células T precursoras a partir de varias fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, medula ósea, tejido de ganglio linfático, tejido del bazo y tumores. Como alternativa, se pueden utilizar líneas de células T disponibles en la técnica. En una realización, se obtienen células T precursoras a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto utilizando cualquiera de varias técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como separación de Ficoll. Por ejemplo, se pueden obtener células T precursoras a partir de la sangre circulante de un individuo mediante aféresis o leucocitaféresis. El producto de aféresis contiene, normalmente, linfocitos, incluyendo células T y células T precursoras, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. Las células recogidas mediante aféresis se pueden lavar para retirar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medios apropiados para etapas de proceso posteriores. Se pueden lograr etapas de lavado mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia, tal como utilizando una centrifugadora de “flujo a través” semiautomaizada (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991) según las instrucciones del fabricante. Después del lavado, se pueden resuspender las células en una variedad de tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS libre de Ca y libre de Mg. Como alternativa, se pueden retirar los componentes no deseables de la muestra de aféresis y resuspender las células directamente en un medio de cultivo. Si se desea, se pueden aislar células T precursoras a partir de linfocitos de sangre periférica sometiendo a lisis los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™.
Opcionalmente, se puede continuar incubando una población celular que comprende células T específicas de antígeno con la misma nano-aAPC o una segunda nano-aAPC durante un periodo de tiempo suficiente para formar una segunda población celular que comprende un número aumentado de células T específicas de antígeno con respecto al número de células T específicas de antígeno en la primera población celular. Normalmente, tales incubaciones se llevan a cabo durante 3-21 días, preferentemente 7-10 días.
Las condiciones de incubación adecuadas (medio de cultivo, temperatura, etc.) incluyen las utilizadas para cultivar células T o precursores de células T, así como las conocidas en la técnica para inducir la formación de células T específicas de antígeno utilizando células presentadoras de antígeno artificiales o DC. Ver, por ejemplo, Latouche & Sadelain, Nature Biotechnol. 18, 405-09, abril de 2000; Levine et al., J. Immunol. 159, 5921-30, 1997; Maus et al., Nature Biotechnol. 20, 143-48, febrero de 2002. Ver también los ejemplos específicos, a continuación.
Para evaluar la magnitud de una señal proliferativa, se pueden marcar poblaciones de células T específicas de antígeno con CFSE y analizar para determinar la velocidad y el número de divisiones celulares. Se pueden marcar células T con CFSE después de una-dos tandas de estimulación con nano-aAPC a las que se une un antígeno. En ese punto, las células T específicas de antígeno deben representar el 2-10 % de la población celular total. Las células T específicas de antígeno se pueden detectar utilizando tinción específica de antígeno de modo que puede seguirse mediante pérdida de CFSE la velocidad y el número de divisiones de células T específicas de antígeno. A tiempos variables (por ejemplo, 12, 24, 36, 48 y 72 horas) después de la estimulación, se pueden analizar las células para determinar tanto la tinción de complejo presentador de antígeno como CFSE. Se puede utilizar la estimulación con nano-aAPC a las que no se ha unido un antígeno para determinar niveles iniciales de proliferación. Opcionalmente, se puede detectar la proliferación monitorizando la incorporación de 3H-timidina, tal como se conoce en la técnica.
Se pueden estimular cultivos durante cantidades variables de tiempo (por ejemplo, 0,5, 2, 6, 12, 36 horas así como estimulación continua) con nano-aAPC. Se puede evaluar el efecto del tiempo de estimulación en cultivos de células T específicas de antígeno altamente enriquecidos y se pueden identificar condiciones en las que se puede recuperar un gran porcentaje (por ejemplo, el 50, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98 %) de nano-aAPC con poca pérdida de células. A continuación se pueden volver a colocar células T específicas de antígeno en cultivo y analizar para determinar el crecimiento celular, velocidades de proliferación, efectos sobre la apoptosis, diversas funciones efectoras y similares, tal como se conoce en la técnica. Tales condiciones pueden variar dependiendo de la respuesta de células T específicas de antígeno deseada.
Detección de células T específicas de antígeno
Se puede someter a ensayo el efecto de nano-aAPC sobre expansión, activación y diferenciación de precursores de células T de cualquiera de varias maneras conocidas por los expertos en la materia. Se puede lograr una rápida determinación de la función utilizando un ensayo de proliferación, determinando el aumento de CTL, células T cooperadoras o células T reguladoras en un cultivo mediante detección de marcadores específicos de cada tipo de célula T. Tales marcadores se conocen en la técnica. Se pueden detectar CTL sometiendo a ensayo para determinar la producción de citocinas o para determinar la actividad citolítica utilizando ensayos de liberación de cromo.
Análisis de receptores de direccionamiento en células T específicas de antígeno inducidas/expandidas por nano-aAPC
Además de generar células T específicas de antígeno con funciones efectoras apropiadas, otro parámetro para la eficacia de células T específicas de antígeno es la expresión de receptores de direccionamiento que permiten que las células T se desplacen a sitios de patología (Sallusto et al., Nature 401, 708-12, 1999; Lanzavecchia y Sallusto, Science 290, 92-97, 2000). Se ha implicado la ausencia de receptores de direccionamiento apropiados en el establecimiento de infección crónica por CMV y EBV (Chen et al., Blood 98, 156-64, 2001). Además, una diferencia observada entre la utilización de APC profesionales y APC no profesionales para expandir células T específicas de antígeno es la expresión de receptores de direccionamiento apropiados, que pueden explicar la presencia de CTL disfuncionales in vivo (Salio et al., J. Immunol. 167, 1188-97, 2001).
Por ejemplo, se ha vinculado la eficacia de CTL efectores con el siguiente fenotipo de receptores de direccionamiento, CD62L+, CD45RO+ y CCR7-. Por tanto, se puede caracterizar una población de CTL inducidos y/o expandidos por nano-aAPC para determinar la expresión de estos receptores de direccionamiento. La expresión de receptores de direccionamiento es un rasgo complejo vinculado a las condiciones de estimulación iniciales. Supuestamente, esto se controla tanto mediante los complejos coestimuladores así como mediante el medio de citocina. Una citocina importante que se ha implicado es IL-12 (Salio et al., 2001). Tal como se comenta a continuación, las nano-aAPC ofrecen la posibilidad de variar componentes independientes de manera individual (por ejemplo, moléculas efectoras de células T y complejos presentadores de antígeno) para optimizar parámetros de desenlace biológico. Opcionalmente, pueden incluirse citocinas tales como IL-12 en los cultivos de inducción iniciales para afectar a los perfiles de receptores de direccionamiento en una población de células T específicas de antígeno.
Análisis de la velocidad de disociación en poblaciones de células T específicas de antígeno inducidas y/o expandidas
La evolución de respuestas inmunitarias secundarias se asocia con el enfoque de afinidades, tal como se determina mediante análisis de “velocidades de disociación” de TCR (Savage et al., Immunity 10, 485-92, 1999; Busch et al., J. Exp. Med. 188, 61-70, 1998; Busch y Pamer, J. Exp. Med. 189, 701-09, 1999). Una disminución de las velocidades de disociación de TCR (es decir, que tiene como resultado un aumento de la afinidad de TCR) es un parámetro que se correlaciona bien con un aumento de la capacidad para reconocer bajas cantidades de antígeno y eficacia biológica de una población de células T de interés. Se pueden optimizar las velocidades de disociación haciendo variar la magnitud y/o duración de la estimulación mediada por nano-aAPC.
Separación de células T específicas de antígeno a partir de otras células
Células T específicas de antígeno que están unidas a antígenos se pueden separar de células que no están unidas. Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica para lograr esta separación, incluyendo enriquecimiento magnético, plasmaféresis, citometría de flujo o centrifugación diferencial. En una realización, se aíslan células T mediante incubación con perlas, por ejemplo, perlas conjugadas con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28, tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas.
Si se desea, se pueden separar subpoblaciones de células T específicas de antígeno a partir de otras células que pueden estar presentes. Por ejemplo, subpoblaciones de células T específicas, tales como células T CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, se pueden aislar adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa.
Un procedimiento es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas de manera negativa. Por ejemplo, para enriquecer células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye, normalmente, anticuerpos frente a CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8.
Se pueden detectar y/o separar células T reguladoras específicas de antígeno a partir de otras células utilizando el marcador Foxp3. El periodo de tiempo puede oscilar desde 30 minutos hasta 36 horas o de 10 a 24 horas o puede ser, como mínimo, de 1,2, 3, 4, 5 o 6 horas o, como mínimo, de 24 horas. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos para aislar células T en cualquier situación en la que existen pocas células T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos de infiltración tumoral (TIL) a partir de tejido tumoral o a partir de individuos inmunocomprometidos.
inducción y expansión de células B productoras de anticuerpos
La presente divulgación también proporciona procedimientos de inducción de la formación de células B productoras de anticuerpos. Estos procedimientos implican poner en contacto una preparación aislada que comprende una pluralidad de células B precursoras con nano-aAPC inductoras de anticuerpos. La incubación de la preparación con las nano-aAPC inductoras de anticuerpos induce células precursoras en la población para formar células B productoras de anticuerpos que producen anticuerpos que reconocen específicamente el antígeno. Normalmente, el número o el porcentaje de células B productoras de anticuerpos en la primera población celular es mayor que el número o porcentaje de células productoras de anticuerpos que se forman si se incuban células B precursoras con un estímulo no específico, por ejemplo, fitohemaglutinina (PHA), lipopolisacárido (LPS) o fitolaca. En cualquiera de las realizaciones dadas a conocer en el presente documento en las que se utilizan nano-aAPC inductoras de anticuerpos, se puede utilizar cualquier combinación de moléculas que afectan a células B y complejos que se enganchan a inmunoglobulinas de superficie de células B o complejos de MHC-antígeno en una superficie de células B.
Se pueden obtener células B precursoras a partir del paciente o a partir de un donante adecuado. No se necesita que el donante y el paciente sean familiares, pero preferentemente comparten, como mínimo, una molécula de HLA. Como alternativa, se pueden utilizar líneas de células B disponibles en la técnica. En una realización, se obtienen células B precursoras a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto utilizando cualquiera de varias técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como separación de Ficoll. Por ejemplo, se pueden obtener células B precursoras a partir de la sangre circulante de un individuo mediante aféresis o leucocitaféresis, tal como se comentó anteriormente.
Se pueden cultivar células B o sus precursores utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Schultze et al., J. Clin. Invest. 100, 2757-65, 1997; von Bergwelt-Baildon et al., Blood 99, 3319-25, 2002. Tales condiciones también son adecuadas para incubar precursores de células B con nano-aAPC inductoras de anticuerpos.
Opcionalmente, una población celular que comprende células B productoras de anticuerpos se puede continuar incubando con la misma nano-aAPC inductora de anticuerpos o una segunda nano-aAPC inductora de anticuerpos durante un periodo de tiempo suficiente para formar una segunda población celular que comprende un número aumentado de células B productoras de anticuerpos con respecto al número de células B productoras de anticuerpos en la primera población celular. Normalmente, tales incubaciones se llevan a cabo durante 3-21 días, preferentemente 7-10 días.
Optimización de la duración de interacción entre nano-aAPC inductoras de anticuerpos y células B
Al igual que con la estimulación de células T comentada anteriormente, la duración de estimulación requerida para inducir o expandir poblaciones de células B productoras de anticuerpos puede diferir de la que se produce normalmente, en particular si se utiliza una superficie artificial, no biodegradable, para las nano-aAPC. Por tanto, la estimulación mediante las nano-aAPC puede durar posiblemente horas si no días. La duración de interacción entre diversas nano-aAPC inductoras de anticuerpos y células B precursoras o productoras de anticuerpos se puede determinar utilizando procedimientos similares a los comentados anteriormente para células T específicas de antígeno.
Detección de células B productoras de anticuerpos
El efecto de nano-aAPC productoras de anticuerpos sobre la expansión, activación y diferenciación de precursores de células B puede someterse a ensayo de cualquiera de varias maneras conocidas por los expertos en la materia. Se puede lograr una rápida determinación de la función utilizando un ensayo de proliferación, detectando marcadores específicos de células B o sometiendo a ensayo para detectar la producción de anticuerpos específicos.
Procedimientos de utilización de campos magnéticos y nano-aAPC para inducir y expandir poblaciones de células T específicas
La presente divulgación proporciona procedimientos de inducción de la formación y expansión de células T específicas de antígeno, incluyendo CTL, células T cooperadoras y células T reguladoras en un campo magnético. Las plataformas de nanopartículas son adecuadas para la administración in vivo y la terapia celular, ya que es menos probable, en comparación con micro-partículas, que induzcan infarto tisular o inflamación cuando se infunden conjuntamente con células,37 y las nanopartículas de hierro-dextrano, por ejemplo, están disponibles en formulaciones de calidad para GMP.
Algunas variaciones de estos procedimientos implican poner en contacto una población aislada de células T policlonales con una serie de nano-aAPC. Las nano-aAPC son paramagnéticas y comprenden en su superficie (1), como mínimo, una molécula que afecta a células T y (ii), como mínimo, un complejo presentador de antígeno. El complejo presentador de antígeno comprende una hendidura de unión a antígeno, y la hendidura de unión a antígeno comprende un antígeno. La población aislada de células T policlonales se pone en contacto con las nano-aAPC en un campo magnético de intensidad suficiente y durante un tiempo suficiente para generar una población de células T específicas de antígeno, es decir, células T específicas para el antígeno unido a la hendidura de unión a antígeno. A continuación, la población de células T específicas de antígeno unidas a nano-aAPC se puede aislar utilizando, por ejemplo, una columna de enriquecimiento magnético, citometría de flujo o centrifugación diferencial, y administrar a un paciente. En la técnica se conocen bien procedimientos de aislamiento de células utilizando enriquecimiento magnético, seguido por infusión,38,39 y cualquiera de estos procedimientos se puede utilizar en la práctica de los procedimientos dados a conocer.
Otras variaciones de los procedimientos dados a conocer implican administrar una pluralidad de nano-aAPC a un paciente, y, a continuación, aplicar un campo magnético al paciente o a una zona diana deseada del paciente (por ejemplo, un tumor o una infección localizada). En la técnica se conoce la utilización de campos magnéticos para dirigir el desplazamiento de partículas paramagnéticas y células marcadas con partícula in w'vo40-42, y cualquiera de estos procedimientos se puede utilizar para dirigir nano-aAPC a la zona diana deseada.
Procedimientos de utilización de campos magnéticos y nanopartículas para estimular de manera preferente células en un estado fisiológico particular
La presente divulgación proporciona procedimientos de utilización de nanopartículas, tales como nanopartículas magnéticas, para seleccionar como diana células en estados fisiológicos diferentes (por ejemplo, células T vírgenes frente a previamente activadas) y estimular la población celular diana. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 9C y se comenta en más detalle en los ejemplos específicos a continuación, las nano-aAPC que proporcionan una dosis de 32 ng de MHC estimulan células T tanto vírgenes como previamente activadas entre 20 y 30 veces en el transcurso de una semana. Sin embargo, a 8 ng o 3,2 ng de MHC, sólo se estimularon las células T activadas. Por tanto, se puede utilizar una dosis de nano-aAPC que comprende, por ejemplo, 3,2-8 ng de MHC para estimular células T previamente activadas en una población de células T sin afectar a células T vírgenes en la población. El efecto diferencial de nano-aAPC que comprenden 3,2-8 ng de MHC frente a 32 ng de MHC se puede utilizar para separar la unión a nano-aAPC y el aislamiento de células T a partir de la activación de las células T. Por ejemplo, una población de células T se puede agotar sustancialmente con respecto a células T previamente activas utilizando, por ejemplo, un anticuerpo frente a CD44, dejando una población enriquecida en células T vírgenes. La unión de nano-aAPC que comprenden 3,2-8 ng de MHC a esta población no activará las células T vírgenes, pero permitirá su purificación. Las células T vírgenes que comprenden las nano-aAPC unidas se pueden activar, a continuación, mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica para agregar nanopartículas. En el caso de nanopartículas magnéticas, esto se puede lograr, por ejemplo, exponiendo los complejos de células T-nano-aAPC a un campo magnético.
Se puede utilizar el mismo enfoque para separar, caracterizar y utilizar como producto terapéutico para otras células, incluyendo, a modo de ejemplo, pero sin limitación, por ejemplo, células B y células madre. La densidad de ligando óptima sobre la superficie de una nanopartícula (o, como alternativa, la dosis de nanopartículas que comprenden tales ligandos) que activará de manera diferencial células de una población en estados fisiológicos diferentes, se puede determinar utilizando procedimientos tales como los descritos a continuación en el ejemplo 9. Dependiendo de la población celular, el ligando puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, un péptido, un nucleótido, un hidrato de carbono, un lípido, la totalidad o una porción del ligando natural para un receptor dado (por ejemplo, EGF, PDGF), un producto químico (por ejemplo, una sal de cromo o un ligando sintético monovalente que se une a receptores de moléculas de inmunofilina tales como dominio de unión a FKBP), fragmentos Fab anti-integrina individuales, péptidos de RGD y similares.
Preparaciones farmacéuticas
Se pueden formular preparaciones farmacéuticas que comprenden nano-aAPC, así como células T específicas de antígeno o células B específicas de anticuerpo obtenidas utilizando tales nano-aAPC, para su inyección directa a pacientes. Tales preparaciones farmacéuticas contienen un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para administrar las composiciones a un paciente, tal como solución salina, solución salina tamponada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato) o solución de glucosa en solución salina tamponada con fosfato.
Procedimientos i nmunoterapéuticos
Vías de administración
Se pueden administrar nano-aAPC, así como células T específicas de antígeno o células B específicas de anticuerpo obtenidas utilizando nano-aAPC, a pacientes mediante cualquier vía apropiada, incluyendo administración intravenosa, administración intraarterial, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intralinfática y administración intratumoral. Los pacientes incluyen pacientes tanto humanos como veterinarios.
Procedimientos terapéuticos
Se pueden utilizar nano-aAPC para generar números terapéuticamente útiles de células T específicas de antígeno o células B productoras de anticuerpos que se pueden utilizar en procedimientos de diagnóstico y terapéuticos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente WO 01/94944; la Patente US 2002/0004041; la Patente US 5,583,031; la Patente US 2002/0119121; la Patente US 2002/0122818; la Patente US 5,635,363; la Patente US 2002/0090357; la Patente US 6,458,354; la Patente US 2002/0034500.
En particular, se pueden utilizar células T específicas de antígeno o células B productoras de anticuerpos para tratar a pacientes con enfermedades infecciosas, cáncer o enfermedades autoinmunitarias, o para proporcionar protección profiláctica a pacientes inmunodeprimidos.
Las enfermedades infecciosas que se pueden tratar incluyen las provocadas por bacterias, virus, priones, hongos, parásitos, helmintos, etc. Tales enfermedades incluyen SIDA, hepatitis, infección por c Mv y trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD). El CMV, por ejemplo, es el patógeno viral más habitual encontrado en pacientes sometidos a trasplante de órganos y es una causa principal de morbimortalidad en pacientes que se someten a trasplantes de medula ósea o de células madre de sangre periférica (Zaia, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4, 603-23, 1990). Esto se debe al estado inmunocomprometido de estos pacientes, que permite la reactivación de virus latente en pacientes seropositivos o la infección oportunista en individuos seronegativos. El tratamiento actual se centra en la utilización de compuestos antivirales tales como ganciclovir, que tienen inconvenientes, siendo el más significativo el desarrollo de cVm resistentes a fármacos. Una alternativa útil a estos tratamientos es un régimen inmunoterapéutico profiláctico que implica la generación de CTL específicos de virus derivados a partir del paciente o a partir de un donante apropiado antes del inicio del procedimiento de trasplante.
El PTLD se produce en una fracción significativa de pacientes sometidos a trasplante y resulta de la infección por virus de Epstein-Barr (EBV). Se cree que la infección por EBV está presente en aproximadamente el 90 % de la población adulta en los Estados Unidos (Anagnostopoulos y Hummel, Histopathology 29, 297-315, 1996). La replicación e infección virales activas se mantienen controladas por el sistema inmunitario, pero, como en los casos de CMV, los individuos inmunocomprometidos por terapias de trasplante pierden las poblaciones de células T de control, lo cual permite la reactivación viral. Esto representa un grave impedimento a los protocolos de trasplante. El EBV también puede estar implicado en el fomento tumoral en una variedad de cánceres hematológicos y no hematológicos. También existe una fuerte asociación entre EBV y carcinomas nasofaríngeos. Por tanto, un tratamiento profiláctico con células T específicas de EBV ofrece una alternativa excelente a las terapias actuales. Los cánceres que se pueden tratar incluyen melanoma, carcinomas, por ejemplo, de colon, duodenal, de próstata, de mama, de ovarios, ductal, hepático, pancreático, renal, endometrial, de estómago, de la mucosa oral displásica, poliposis, cáncer bucal invasivo, carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma urinario de células escamosas y de células de transición, etc.; tumores malignos neurológicos, por ejemplo, neuroblastoma, gliomas, etc.; tumores malignos hematológicos, por ejemplo, leucemia mielógena crónica, leucemia aguda infantil, linfomas no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, células T cutáneas malignas, micosis fungoide, linfoma de células T cutáneas no MF, papulosis linfomatoide, hiperplasia linfoide cutánea rica en células T, pénfigo ampolloso, lupus eritematoso discoide, liquen plano, etc.; y similares. Ver, por ejemplo, Mackensen et al., Int. J. Cancer 86, 385-92, 2000; Jonuleit et al., Int. J. Cancer 93, 243-51, 2001; Lan et al., J. Immunotherapy 24, 66-78, 2001; Meidenbauer et al., J. Immunol. 170(4), 2161-69, 2003.
Las enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar incluyen asma, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, diabetes tipo I, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, psoriasis, miastenia grave, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, pénfigo vulgar, enfermedad de Addison, dermatitis herpetiforme, enfermedad celiaca y tiroiditis de Hashimoto.
Se pueden utilizar células T cooperadoras específicas de antígeno para activar macrófagos o para activar células B para producir anticuerpos específicos que se pueden utilizar, por ejemplo, para tratar enfermedades infecciosas y cáncer. También se pueden utilizar las propias células B productoras de anticuerpos con este fin.
Se pueden utilizar células T reguladoras específicas de antígeno para lograr un efecto inmunosupresor, por ejemplo, para tratar o prevenir enfermedad de injerto contra huésped en pacientes sometidos a trasplante, o para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias, tales como las indicadas anteriormente, o alergias. Se dan a conocer utilizaciones de células T reguladoras, por ejemplo, en la Patente US 2003/0049696, la Patente US 2002/0090724, la Patente US 2002/0090357, la Patente US 2002/0034500 y la Patente US 2003/0064067. Se pueden utilizar nano-aAPC, en las que la molécula que afecta a células T es una molécula inductora de apoptosis, para suprimir respuestas inmunitarias.
Dosis
Se pueden administrar células T específicas de antígeno a pacientes en dosis que oscilan desde aproximadamente 5-10 x 106 CTL/kg de peso corporal (~7 x 108 CTL/tratamiento) hasta aproximadamente 3,3 x 109 CTL/m2 (~6 x 109 CTL/tratamiento) (Walter et al., New England Journal of Medicine 333, 1038-44, 1995; Yee et al., J Exp Med 192, 1637-44, 2000). En otras realizaciones, los pacientes pueden recibir 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 10 107, 5 x 107 108, 5 x 108, 109 , 5 x 109 o 1010 células por dosis administrada por vía intravenosa. En todavía otras realizaciones, los pacientes pueden recibir inyecciones intranodales, por ejemplo, de 8 x 106 o 12 x 106 células en un bolo de 200 pl. Las dosis de nano-aAPC incluyen 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 109, 5 x 109 o 1010 nano-aAPC por dosis.
Modelos animales
Hay varios modelos murinos disponibles para evaluar protocolos de inmunoterapia adoptiva para el tratamiento tumoral. Dos modelos son particularmente adecuados para evaluar el tratamiento de melanoma. Un modelo utiliza ratones humanos/SCID que portan una línea de melanoma humana implantada por vía subcutánea, tal como BML. En tales modelos, la transferencia de CTL específicos de Mart-1 expandidos ex vivo retrasa la aparición y/o el crecimiento del tumor. Un segundo modelo utiliza los ratones transgénicos para A2 murino y el melanoma B16 murino que se ha transfectado con una molécula de tipo HLA-A2, denominada AAD. Esta molécula, que también es la base del tipo transgénico para A2, es HLA-A2 humana en dominios alfa 1-2 fusionados con el dominio alfa 3 murino. Utilizando estos ratones transgénicos, el melanoma B16-AAD murino es sensible al rechazo a lo largo de epítopos de melanoma restringidos a A2 bien definidos derivados de tirosinasa y gp100.
Kits
Las nano-aAPC se pueden proporcionar en kits. Los recipientes adecuados para nano-aAPC incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados a partir de una variedad de materiales, incluyendo vidrio o plástico. Un recipiente puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Opcionalmente, uno o varios antígenos diferentes pueden estar unidos a las nano-aAPC o se pueden suministrar por separado.
Un kit puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. También puede contener otros materiales útiles para un usuario final, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Un kit también puede comprender una segundo o tercer recipiente con otro agente activo, por ejemplo un agente quimioterápico o un agente antiinfeccioso, o que contiene antígenos particulares que se pueden unir a complejos presentadores de antígeno de una nano-aAPC por un usuario final.
Los kits también pueden contener reactivos para evaluar el grado y la eficacia de la inducción o expansión de células T específicas de antígeno o células B productoras de anticuerpos, tales como anticuerpos contra proteínas marcadoras específicas, complejos moleculares de clase I o clase II de MHC, complejos moleculares de TCR, anticuerpos anticlonotípicos, y similares.
Un kit también puede comprender un prospecto que contiene instrucciones escritas para procedimientos de inducción de células T específicas de antígeno, expansión de células T específicas de antígeno, utilización de nano-aAPC en el kit en diversos protocolos de tratamiento. El prospecto puede ser un borrador de prospecto no aprobado o puede ser un prospecto aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) u otro organismo regulador.
EJEMPLO 1
Materiales y procedimientos para los ejemplos 2-7
Ratones y reactivos. Se mantuvieron ratones transgénicos 2C TCR Rag-/- como heterocigotos mediante cría en un trasfondo C57/BL6. Los ratones transgénicos pMEL TCR/Thy1a Rag-~ fueron un obsequio de Nicholas Restifo (National Institutes of Health, Bethesda, MD) y se mantuvieron como homocigotos. Se adquirieron ratones C57BL/6j de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Todos los ratones se mantuvieron según la junta de revisión institucional de la universidad Johns Hopkins. Se adquirieron anticuerpos monoclonales marcados de manera fluorescente de BioLegend (San Diego, CA).
Preparación de dímeros MHC-Ig. Se prepararon dímeros MHC-Ig solubles, Kb-Ig y Db-Ig, y se cargaron con péptido tal como se describe (48). En resumen, se cargaron moléculas de Kb-Ig con péptido mediante separación en condición alcalina (pH 11,5), y, a continuación, se volvieron a plegar en presencia de un exceso de 50 veces de péptido. Se separaron moléculas de Db-Ig en condiciones levemente ácidas (pH 6,5) y se volvieron a plegar en presencia de un exceso molar de 50 veces de péptido y un exceso molar de 2 veces de P2-microglobulina humana. Se cargó de manera pasiva A2-Ig humana en presencia de un exceso de péptido M1 (49). Se adquirieron péptidos “SIY” (SIYRYYGL, SEQ ID NO: 3; sintético), “SIIN” (SIINFEKL, SEQ ID NO: 4; derivado de proteína de ovoalbúmina), “GP100” (KVPRN-punto cuántico-WL, SEQ ID NO: 5; a partir de proteína GP100 de melanocitos) “ASN” (ASNENMETH, s Eq ID NO: 6; a partir de nucleoproteína de Gripe A) y “M1” (GILGFVFTL, a partir de proteína M1 de Gripe A) de Genscript (Piscataway, NJ). Se determinó la concentración de proteína tras el marcaje mediante cromatografía de líquidos de alta resolución con exclusión molecular.
Fabricación y caracterización de partículas. Se fabricaron aAPC de hierro-dextrano a escala nanométrica de una de dos maneras. Se incubaron dímero MHC-Ig biotinilado 2 |j.M y una concentración equimolar de anticuerpo anti-CD28 biotinilado con 100 pl de micropartículas de Miltenyi anti-biotina (Miltenyi Biotec) durante, como mínimo, 1 hora con agitación suave a 4 °C. Se lavó la proteína sin unir utilizando una columna de enriquecimiento magnético de MS (Miltenyi Biotec). Se midió la concentración de partículas mediante absorbancia a 405 nm utilizando un lector de placas AD340 de Beckman Coulter.
Como alternativa, se acoplaron químicamente de manera directa dímero MHC-Ig y B7.1-Ig a partículas biodegradables (Miltenyi Biotec). Se evaluó el contenido en proteína total mediante ensayo de Bradford. A menos que se mencione lo contrario, “aAPC de hierro-dextrano” se refiere a partículas acopladas químicamente de manera directa a MHC y B7.1, en vez de acoplamiento anti-biotina.
Se fabricaron aAPC de puntos cuánticos a escala nanométrica incubando dímero MHC-Ig biotinilado 5 |j.M y una concentración equimolar de anticuerpo anti-CD28 biotinilado con 100 pl de puntos cuánticos recubiertos con estreptavidina 1 |j.M (Life Technologies) durante 2 horas a 4 °C. Se lavaron los puntos cuánticos y se concentraron utilizando una membrana Sartorius Vivaspin con un valor de corte de peso molecular de 300.000. Se midió la concentración de puntos cuánticos mediante absorbancia a 405 nm utilizando un lector de placas AD340 de Beckman Coulter.
Análisis de seguimiento de nanopartículas. Se utilizó un dispositivo Nanosight LM10 equipado con una cámara CCD sensible para caracterizar aAPC de óxido de hierro mediante NTA. Se cargaron 50 pl de solución de nanopartículas diluida en la cámara de muestra, que estaba conectada a una fuente de láser de 405 nm. Se grabó una película de 60 s que contenía el seguimiento de movimiento browniano de los centroides en dispersión (partículas) utilizando software de NTA (versión 2.0). Se procesó la película utilizando los ajustes automáticos recomendados por el fabricante con ajuste manual de la ganancia, difuminación y brillo tal como se recomienda. Se diluyó la solución de nanopartículas en solución salina tamponada con fosfato para ajustar la concentración de muestra hasta 5 x 1012 partículas ml-1.
Expansión celular in vitro. Para cultivo de células de ratón, se obtuvieron células a partir de bazos de ratón homogeneizados seguido por agotamiento de RBC mediante lisis hipotónica. Se aislaron linfocitos citotóxicos utilizando un kit de aislamiento sin contacto de CD8 y columna de enriquecimiento magnético de Miltenyi Biotec (Colonia, Alemania) y, si era necesario, se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) durante 15 minutos a 37 °C, a continuación se lavaron de manera extensa. Se mezclaron un millón de células T CD8+ y partículas a las dosificaciones indicadas y se cultivaron en placas de fondo redondo de 96 pocillos durante 4-7 días en medios de RPMI completos complementados con factor de células T, un cóctel de citocinas recogido a partir de plasma humano(5). Se midió la fluorescencia de CFSE en el día 4 utilizando un citómetro de flujo BD FacsCalibur y se analizó en FlowJo (TreeStar).
Para el cultivo de células humanas, se aislaron PBMC a partir de donantes sanos positivos para HLA*0201 mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Paque PLUS siguiendo el protocolo del fabricante (GE Healthcare). Se purificaron adicionalmente células T CD8+ a partir de PBMC recientes utilizando el kit de selección negativa de células T CD8+ (Miltenyi Biotec). La pureza de células T CD8+ era superior al 95 %, tal como se determina mediante citometría de flujo. Se mezclaron tres millones de células T CD8+ y partículas a las dosificaciones indicadas y se cultivaron en placas de fondo redondo de 96 pocillos durante hasta 14 días en medios de RPMI completos complementados con factor de células T. En el día 7 después de la estimulación, se recogieron células T, se contaron y se volvieron a sembrar en placa a la misma densidad de células T:nano-aAPC. Se determinó la especificidad de antígeno utilizando tetrámeros específicos de HLA-M1, de A*0201 PE o APC (Beckman Coulter) según el protocolo del fabricante.
Tinción de citocina intracelular. Siete días después de la estimulación primaria, se evaluó la actividad funcional de células T mediante nueva exposición con esplenocitos C57Bl/6j pulsados con péptido. Se pulsaron los esplenocitos con la concentración indicada de péptido durante 2 horas a 37 °C, a continuación se lavaron. Se incubaron 200.000 células T en RPMI completo con 200.000 esplenocitos durante 4 horas en una placa de 96 pocillos de fondo redondo en presencia de 0,2 pl de GolgiPlug, 0,2 ul de GolgiStop y anticuerpo anti-CD 107a-fitC (BD Biosciences, Mountain View, CA). Se lavaron las células y se fijaron utilizando un kit de Bd Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante, a continuación se tiñeron con anticuerpo anti-IFNy PE (BioLegend). Se evaluó la tinción de citocina mediante citometría de flujo y se evaluó la frecuencia de células funcionales para citocina mediante comparación con un control no estimulado en FlowJo.
Efecto de nano-aAPC sobre el crecimiento tumoral subcutáneo in vivo. Para el experimento con aAPC de puntos cuánticos, se transfirieron de manera adoptiva 2 x 106 células T pMEL CD8+ vírgenes en ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad mediante inyección en la vena caudal, excepto por los ratones de control que no recibieron ningún tratamiento con células T o aAPC. El mismo día, se inyectaron células de melanoma B16 (2 x 105) por vía subcutánea en el costado derecho. Al día siguiente, se trataron los ratones con 20 pl de aAPC de puntos cuánticos relacionadas, 20 pl de aAPC de puntos cuánticos no relacionadas o 20 pl de PBS, con 5 ratones por grupo. Se trataron los ratones los días 3, 4 y 5 con 30.000 unidades de IL-2 intraperitoneal. Se monitorizó el crecimiento tumoral a intervalos de 2 días, utilizando calibradores digitales, hasta que el tamaño del tumor era de -200 mm2, momento en el cual se sacrificaron los animales.
Para el experimento con aAPC de hierro-dextrano, se transfirieron de manera adoptiva 2 x 106 células T pMEL CD8+ vírgenes tal como anteriormente. Cuatro días después, los ratones en el grupo de tratamiento recibieron 25 pl de nano-aAPC de HD relacionadas i.v. o s.c., con ocho ratones por grupo. Tres días después, se inyectaron aAPC por vía subcutánea (s.c.) o por vía intravenosa (i.v.). Se inyectaron células de melanoma B16 (2 x 105) por vía subcutánea cuatro días después, y se administró una segunda inyección de aAPC cuatro días después del tumor, i.v. o s.c., en el costado ipsolateral. El seguimiento del tumor y el sacrificio de los animales se realizaron tal como anteriormente.
EJEMPLO 2
Las nano-aAPC de hierro-dextrano inducen la expansión de células T
Se seleccionaron partículas de núcleo de óxido de hierro, recubiertas con dextrano, de tamaño nanométrico, producidas por Miltenyi Corporation, como una plataforma de partículas a escala nanométrica debido a su extensa caracterización y biocompatibilidad (21-23). Para producir aAPC a escala nanométrica, se acoplaron de manera covalente MHC-Ig dimérica soluble cargada con un péptido apropiado (señal 1) y proteína de fusión de B7.1-Ig quimérica (señal 2) en una proporción de 1:1 a la superficie de partícula (figura 1A). Como alternativa, se fabricaron partículas acoplando MHC-Ig biotinilada y anticuerpo anti-CD28 a una partícula de hierro-dextrano recubierta con anticuerpo anti-biotina (figura 1B).
Se confirmó que aAPC de hierro-dextrano estaban monodispersadas y tenían 50-100 nM de diámetro utilizando análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA, figura 1C). Se suspendieron partículas a una concentración de 8,3 nM (equivalente a 5 x 1012 partículas ml-1) y todos los volúmenes posteriores se refieren a partículas a esta concentración. Titulando la cantidad de proteína presente durante la reacción de acoplamiento, se sintetizaron partículas que presentaban una alta densidad (HD, 65 ug de proteína/ml de partículas) o baja densidad (LD, 16 ug de proteína/ml de partículas) de proteína tal como se mide mediante ensayo de Bradford.
Para evaluar la expansión de células T inducida por aAPC, se utilizaron dos modelos en ratón transgénico TCR: ratones 2C, que portan receptores que reconocen el péptido SIY presentado en el contexto de H2-Kb de MHC de clase I, y ratones pMEL, que reconocen un péptido derivado a partir del antígeno de diferenciación de melanoma GP100 presentado en el contexto de H2-Db de MHC de clase I. Se fabricaron cuatro tipos de partículas de hierro-dextrano acopladas a anticuerpo anti-biotina, que presentaban Kb o Db cargadas con el péptido relacionado descrito anteriormente o un péptido no relacionado (SIIN para Kb, ASN para Db). Se incubaron células T con partículas y se evaluó la proliferación siete días después. La expansión basada en partículas era específica de antígeno, ya que las células 2C sólo proliferaron en presencia de partículas de Kb-SIY, y las células pMEL sólo proliferaron en presencia de partículas de Db-GP100 (figura 2A). Además, se requirieron tanto la señal 1 como la señal 2 para la expansión óptima, y las partículas con anticuerpo anti-biotina que portaban MHC-Ig o CD28 solas no fueron tan eficaces en la inducción de proliferación de células T robusta (figura 2B).
Tanto la cantidad (24, 25) como la densidad (26, 27) de antígeno presentado por APC influyen en el comportamiento de células T aguas abajo, tal como la proliferación y muerte celular, y, por tanto, pueden ser parámetros importantes para la estimulación por aAPC. Se utilizaron partículas HD y LD para evaluar el efecto de la densidad de antígeno sobre la expansión de células T, y se titularon ambos conjuntos de partículas para evaluar el efecto de la dosis de antígeno. La proliferación se caracterizó específicamente tres días después de la estimulación utilizando el colorante vital éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). El CFSE se diluye con cada tanda de división de células T, y, por tanto, la división se manifiesta como una disminución de media vez en la fluorescencia de CFSE. Siete días después de la estimulación, se contaron las células T para caracterizar el equilibrio global entre proliferación y muerte.
Tanto las partículas HD como LD pudieron inducir proliferación de células T pMEL de una manera dependiente de la dosis (figura 2C). Tal como se mide mediante dilución de CFSE, las partículas HD indujeron la proliferación en el 79 %, 98 % y 99 % de las células para 1, 5 y 20 |j.l de partículas, respectivamente, por 1 millón de células, mientras que cantidades idénticas de partículas LD indujeron la proliferación en el 4 %, 40 % y 93 % de las células. Para el día 7, las partículas HD y LD habían inducido una expansión global de células T del orden de 5-30 veces, requiriéndose un umbral mínimo de aproximadamente 5 |j.l de partículas LD y menos de 0,5 |j.l de partículas HD para inducir la expansión (figura 2D). Tanto la proliferación de CFSE como los recuentos celulares demostraron que, a cualquier cantidad dada de partículas, las nano-aAPC HD indujeron una expansión mayor que las LD. Por ejemplo, a 5 |j.l de partículas, las partículas HD indujeron una expansión de 21 veces, mientras que las partículas LD sólo indujeron una expansión de 7 veces.
Para evaluar si la cantidad aumentada de proteína en partículas HD explicaba completamente la ventaja de proliferación, se incubaron partículas LD y HD con células T a concentraciones de proteína iguales (es decir, aproximadamente 5 veces más partículas LD a una concentración dada de HD). Una vez normalizadas las aAPC para la concentración de proteína, las partículas HD y LD indujeron una expansión similar tal como se mide mediante dilución de CFSE en el día 3 (figura 2E) o expansión global en el día 7 (figura 2F). Por ejemplo, 20 ul de partículas LD o 3,5 ul de partículas HD indujeron, ambas, proliferación en el 94 % de las células para el día 3, y una expansión de aproximadamente 17 veces después de 7 días de crecimiento. Por tanto, a las dosis y densidades de antígeno evaluadas, la expansión fue impulsada por la proteína total presentada en aAPC, y no por la dosis de partículas o densidad de proteína.
EJEMPLO 3
Las nano-aAPC inducen un fenotipo efector de células T robusto
Generar números suficientes de células T específicas de antígeno es un objetivo crítico de la inmunoterapia. Sin embargo, los CTL pueden volverse anérgicos o incluso supresores en determinadas condiciones de estimulación (28), por tanto también deben evaluarse los linfocitos expandidos para determinar su capacidad para producir citocinas efectoras críticas, tales como IFNy, y para secretar gránulos citotóxicos, tal como se indica mediante expresión en superficie del marcador de desgranulación CD107a. Para evaluar la función de CTL después de la estimulación inducida por nano-aAPC, se estimularon CTL CD8+ completos con tres concentraciones de partículas diferentes: 3,5 ul de partículas HD y 20 ul de partículas LD, lo cual presenta cantidades equivalentes de proteína y por tanto inducen una expansión equivalente de aproximadamente 10 veces, y 20 ul de partículas HD, que inducen una proliferación de aproximadamente 17 veces (figura 3A). Siete días después de la estimulación basada en partículas, se recogieron los CTL y se volvieron a exponer con esplenocitos pulsados con péptidos, y se evaluaron para determinar la respuesta funcional mediante ensayo de citocina intracelular.
Las respuestas funcionales fueron robustas y equivalentes para las tres dosis de partículas. Los CTL de todos los grupos expresaron altos niveles de CD107a, desgranulándose hasta el 90 % de las células cuando se volvieron a exponer con una dosis alta de péptido (figura 3B). De manera similar, los tres grupos presentaron altos niveles de sensibilidad a IFNy (figura 3C). Por tanto, aunque la proporción de partículas frente a células T y la densidad de proteína sobre partículas influyen en el grado de expansión de CTL, las células T resultantes presentan un fenotipo efector fuerte y similar, independientemente de la dosis de partículas.
También se evaluó el fenotipo efector midiendo la expresión de CD44 y CD62L. Después de la activación, las células T regulan por incremento CD44. Un subconjunto de células, que conservan una alta expresión de CD62L, se denominan células T de “memoria central” (Tcm) y tienen una alta capacidad proliferativa. Las células restantes, que regulan por disminución CD62L, se denominan “de memoria efectoras” (Tem), que se desplazan a los tejidos, y están sensibilizadas para respuestas efectoras robustas pero tienen menos capacidad de proliferación tras la nueva exposición. Estos fenotipos de células T se han validado para el desarrollo de memoria in vivo, pero células activadas in vitro muestran fenotipos similares y pueden servir como modelo para la formación de memoria in vivo. En la figura 3E se muestra un patrón de tinción representativo para un cultivo de células T estimuladas por nano-aAPC. Tanto las partículas HD como LD indujeron una regulación por incremento de CD44 robusta (figura 3F). Dosis inferiores de partículas generaron una proporción superior de células Tem CD62Llo CD44hi, generando 2 ul de LD y 2 ul de HD el 51 % y el 36 % de Tem, respectivamente. La proporción de células Tem disminuyó de una manera dependiente de la dosis, pero todos los cultivos examinados contenían células vírgenes, Tcm y Tem.
EJEMPLO 4
Expansión por nano-aAPC de respuestas de células T humanas endógenas
Las células T precursoras específicas de antígeno existen como poblaciones heterogéneas, de baja frecuencia, de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Por tanto, la inmunoterapia depende en última instancia de la expansión de CTL reactivas frente a antígeno a partir de una combinación policlonal de precursores endógenos. Se sintetizaron aAPC de hierro-dextrano anti-biotina que portaban el alelo A2 de HLA humano cargado con el epítopo de células T inmunodominante derivado a partir de la proteína M1 de gripe (señal 1) y anticuerpo anti-CD28 (señal 2). Se incubaron PBMC con dosis crecientes de nano-aAPC y se evaluó la expansión de células T específicas de antígeno mediante tinción de tetrámeros después de dos estimulaciones consecutivas (figura 4).
Antes de la estimulación, la frecuencia de precursor específico de M1 en la sangre periférica era baja, con el 0,4 % de PBMC CD8+ específicas (figura 4A, fila superior). La incubación con nano-aAPC durante una (fila media) o dos (fila inferior) semanas tuvo como resultado un aumento dependiente de la dosis en el porcentaje de células T específicas de antígeno. Estos datos se resumen en la figura 4B. La dosis más alta (300 ul) de nano-aAPC indujo hasta el 44 % de células T específicas de antígeno después de una semana o el 80 % después de dos semanas (panel izquierdo). Esto se asoció con un aumento dependiente de la dosis en la cantidad total de células T específicas de antígeno (panel derecho), con una expansión de hasta 150 veces después de una semana y una expansión de 800 veces después de dos semanas a la dosis más alta de partículas. Por tanto, las nano-aAPC indujeron grandes poblaciones de células T específicas de antígeno a partir de pequeñas poblaciones de precursores endógenos.
EJEMPLO 5
Nano-aAPC de punto cuántico
Para evaluar la estimulación basada en nano-aAPC a una escala incluso menor, y para demostrar que las nano-aAPC no son exclusivas de la plataforma, se obtuvieron nanocristales disponibles en el mercado, con núcleo de punto cuántico, recubiertos con avidina, de menos de 20 nm de diámetro, a partir de Life Technologies. Se unieron Db-GP100 dimérica marcada con biotina (señal 1) y anticuerpo anti-CD28 (señal 2) en una proporción molar de 1:1 a la superficie de nanocristal para formar una nano-aAPC de punto cuántico (punto cuántico) (figura 5A). Las aAPC de puntos cuánticos indujeron la expansión de células T específicas de antígeno, dependiente de la dosis, in vitro (figura 5B). A la dosis más alta evaluada, las células T se expandieron 14,6 veces después de 7 días, mientras que las células T estimuladas con aAPC de puntos cuánticos de control no relacionadas no se expandieron.
EJEMPLO 6
Las nano-aAPC sensibilizan el rechazo tumoral in vivo
Se eligió un modelo de melanoma de ratón subcutáneo para demostrar la eficacia de aAPC a escala nanométrica para la inmunoterapia cuando se inyectaron directamente in vivo. Para evaluar las aAPC de punto cuántico, se transfirieron de manera adoptiva CTL pMEL transgénicos para TCR vírgenes en ratones B6 de tipo natural, y se expusieron los ratones el mismo día a células de melanoma B16 inyectadas por vía subcutánea en el costado derecho (figura 6A, parte superior). Al día siguiente, se inyectaron a los ratones 20 ul de aAPC de puntos cuánticos relacionadas o 20 ul de aAPC de puntos cuánticos no relacionadas o PBS como control. Una única inyección de aAPC de puntos cuánticos atenuó significativamente el crecimiento tumoral (figura 6A, parte inferior). Después de 16 días, los ratones tratados con células T y aAPC de puntos cuánticos relacionadas tuvieron la menor carga tumoral, con un tamaño tumoral promedio de 22,1 mm22,3, en comparación con 111,1 mm2 /- 29,4 para ratones tratados con células T aAPC no relacionadas, 141,1 mm2 /- 9,6 para células T solas, y 133,1 mm2 /- 7,6 para ratones sin tratar. El crecimiento tumoral total a lo largo del transcurso del experimento se resumió como área bajo la curva (AUC). Los ratones tratados con aAPC de puntos cuánticos relacionadas tuvieron significativamente menos (p=0,028) crecimiento tumoral global mediante AUC (33,1 mm2 /- 7,8) que los ratones tratados con aAPC no relacionadas de control (373,6 mm2 /- 227,0).
Tal como se describió anteriormente, la capacidad de nano-aAPC para desplazarse al tumor o combinaciones de células T en ganglios linfáticos puede ser una ventaja importante de la inmunoterapia con nano-aAPC. Es probable que la vía de administración de partículas afecte al desplazamiento de perlas; por ejemplo, las perlas depositadas por vía subcutánea pueden drenarse mediante el sistema linfático a los ganglios linfáticos (30). Para someter a prueba el impacto de la vía de administración de aAPC así como la eficacia in vivo de aAPC de hierro-dextrano, se inyectaron partículas o bien por vía intravenosa o bien por vía subcutánea tres días después de la transferencia de pMEL adoptiva. Se inyectaron tumores B16 por vía subcutánea en el costado derecho cuatro días después y se administró una segunda inyección de aAPC cuatro días después del tumor, i.v. o s.c. en el costado ipsolateral. Por tanto, había tres grupos de tratamiento: ratones que recibieron dos inyecciones de perlas i.v., ratones que recibieron una inyección i.v. y una s.c., y ratones que recibieron dos inyecciones s.c. (figura 6B, parte superior). Los ratones de control a los que se les inyectaron aAPC no relacionadas recibieron una inyección i.v. y una s.c.
Los tres grupos de tratamiento tuvieron menos crecimiento tumoral que los ratones a los que se les inyectó perla de control (figura 6B, parte inferior). Después de 16 días, los ratones tratados con una inyección s.c. y una i.v. (s.c./i.v.) mostraron el mínimo crecimiento tumoral (48,0 mm2 /- 31,16), seguidos por los tratados con s.c./s.c. (73,7 mm2 /-37,44), tratados con i.v./i.v. (89,4 mm2 /- 69,5), no tratados (88,4 mm2 /- 17,8) y tratados con compuesto no relacionado (113 mm2 /- 39,4). A lo largo de todo el transcurso del experimento, los ratones tratados con s.c./i.v. (AUC 52,6 mm2 /- 29,7) y ratones s.c./s.c. (AUC 73,1 mm2 /- 36,1) mostraron significativamente menos (p<0,02) crecimiento tumoral que los ratones de control (AUC 162,7 mm2 /- 77,6). Los ratones tratados con dos inyecciones i.v. tuvieron menos tumor (AUC 103,0 /- 86,1) que el control, pero no alcanzaron el umbral de significación (p = 0. 19.. Por tanto, los ratones, como mínimo, con una dosis de nano-aAPC administrada por vía subcutánea tuvieron significativamente menos tumor que el control.
EJEMPLO 7
Estimulación de células T vírgenes
Utilizando un ensayo de velocidad de disociación de MHC-Ig biofísico, las nano-aAPC se disocian más fácilmente a partir de células T vírgenes en comparación con las activas, lo que sugiere que las nano-aAPC realizan menos contactos (8-10) con células vírgenes que con células activadas (16-20). Dado que se piensa que el agrupamiento de TCR inducido (Lillemeier et al., Nature Immunology 11, 90-96, 2010 y la reorganización de membrana (James et al., Nature 487, 64-69, 2012) impulsan la activación de células T, por tanto, no es sorprendente que las nano-aAPC sean menos eficaces en la estimulación de células T vírgenes que las micro-aAPC. A una dosis equivalente de 6 ng de MHC-Ig por 100.000 células T, las nano-aAPC estimulan poblaciones mixtas de células vírgenes y de memoria, no las células vírgenes solas, mientras que las micro-aAPC pueden estimular ambas poblaciones de manera equivalente (figura 7A). Las nano-aAPC pueden inducir la activación de células T vírgenes si la dosis de nano-partículas se aumenta seis veces (datos no mostrados). Cuando se tituló la dosis de nano-aAPC y micro-aAPC para inducir una expansión equivalente de 17 veces en células activadas, las micro-aAPC, pero no las nano-aAPC indujeron la expansión de células vírgenes a esa dosis (figura 7B).
Sin embargo, la inmunoterapia óptima con células T puede requerir la activación de células T vírgenes para evitar el agotamiento inmunitario (Besser, Clinical Cancer Research 16, 2646-55, 2010). Por lo tanto, se utilizaron dos enfoques para potenciar la activación mediada por nano-aAPC de células vírgenes. En primer lugar, se planteó la hipótesis de que el enriquecimiento de precursores específicos de antígeno aumentaría la cantidad de citocinas inmunoestimulantes tales como IL-7 e IL-15 disponibles para células T activadas, reforzando la activación mediada por aAPC. Se unieron nano-aAPC, que son paramagnéticas, a células T de tipo natural a 4 °C, a continuación se enriquecieron utilizando selección positiva en una columna magnética (figura 8A). Esto condujo a la expansión de una población de células T específicas de Kb-TRP2 siete días después de la activación (figura 8B). Se cree que esta es la primera descripción de una aAPC que puede enriquecer y activar simultáneamente células T.
En segundo lugar, se exploró la utilización del agrupamiento de perlas inducido por imanes para potenciar el agrupamiento de TCR y desencadenar la activación. A dosis bajas de nano-aAPC que no desencadenaron la expansión de células T vírgenes, la activación de células T en un campo magnético confirió una ventaja de proliferación significativa a células T pMEL (figura 8C). La activación potenciada por imanes requirió, como mínimo, 30 minutos de incubación en un campo magnético (datos no mostrados), y fue eficaz tanto con imanes de disco de neodimio como con una columna de enriquecimiento magnético comercializada por Miltenyi Biotec. Esto sugiere un procedimiento novedoso para potenciar la activación de células T, y sugiere que las nano-aAPC se pueden utilizar no sólo para activar células T directamente mediante interacciones de TCR-MHC, sino también controlando las nano-aAPC mediante imanes. Esto se basa en interacciones de TCR-partícula a esta escala, y no resulta viable con aAPC más grandes. De manera importante, las nano-aAPC deben proporcionar la señal 1, la señal 2 y un núcleo paramagnético para el refuerzo magnético, haciendo que esto sea un reactivo único y novedoso para la expansión de células T previamente vírgenes para la inmunoterapia adoptiva.
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49. Y.-L. Chiu, J. P. Schneck, M. Oelke, HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL., Journal of visualized experiments: JoVE , 1 -5 (2011).
EJEMPLO 8. Materiales y procedimientos para los ejemplos 9-13
Ratones y reactivos. Se mantuvieron ratones transgénicos 2C TCR como heterocigotos mediante cría en un trasfondo C57/BL6. Los ratones transgénicos pMEL TCR/Thy1a Rag-/- fueron un obsequio de Nicholas Restifo (National Institutes of Health, Bethesda, MD) y se mantuvieron como homocigotos. Se adquirieron ratones C57BL/6j de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Todos los ratones se mantuvieron según la junta de revisión institucional de la universidad Johns Hopkins. Se adquirieron anticuerpos monoclonales marcados de manera fluorescente de BioLegend (San Diego, CA).
Preparación de dímeros MHC-Ig y nano-aAPC. Se prepararon dímeros MHC-Ig solubles, Kb-Ig y Db-Ig, y se cargaron con péptidos tal como se describe,8 ver procedimientos complementarios. Se fabricaron nano-aAPC mediante conjugación directa de dímero MHC-Ig y anticuerpo anti-CD28 (37,51; BioLegend) a microperlas MACS (Miltenyi Biotec) tal como se describe.3 Se midió la proteína unida a nanopartículas mediante fluorescencia tal como se describe en procedimientos complementarios.
Expansión celular in vitro. Se obtuvieron células a partir de ganglios linfáticos y bazos de ratón homogeneizados seguido por lisis hipotónica de RBC. Se aislaron linfocitos citotóxicos utilizando un kit de aislamiento sin contacto de CD8 y columna de enriquecimiento magnético de Miltenyi Biotec (Colonia, Alemania). Se añadió anticuerpo frente a CD44-biotina a un cóctel primario para aislar células CD44lo vírgenes. Cuando fue aplicable, se marcaron las células con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) durante 15 minutos a 37 °C, a continuación se lavaron de manera extensa.
Se mezclaron células T CD8+ y nano-aAPC, a las dosificaciones indicadas, y se cultivaron en placas de fondo plano de 24 pocillos o de fondo redondo de 96 pocillos durante 4-7 días en medios de RPMI completo complementados con factor de células T (TF), un cóctel enriquecido en citocinas de medios acondicionados recogidos a partir de PBMC humanas estimuladas.46 Cuando se indica, se fijaron las placas de cultivo entre dos imanes de discos de neodimio N52 de entre V y % de pulgadas de longitud (K&J Magnetics, Jamison, PA). Se midió la fluorescencia de CFSE en los puntos de tiempo indicados utilizando un citómetro de flujo BD FacsCalibur y se analizaron en FlowJo (TreeStar). Se evaluó la expansión en veces mediante recuentos celulares siete días después de la estimulación. Se evaluó la expansión de células específicas de antígeno endógenas mediante tinción con dímero MHC-Ig marcado de manera fluorescente 400 nM siete días después de la activación.
Ensayos de unión de partículas. Para ensayos de unión de partículas en equilibrio, se incubaron células T CD8+ a 4 °C a una concentración de 107 células/ml en tampón de lavado de FACS (PBS FCS al 2 % azida de sodio al 0,05 %). Se mezclaron alícuotas de 30 |j.l de células con concentraciones variables de nanopartículas que portaban dímero MHC-Ig marcado de manera fluorescente durante 60-90 min. Tras el lavado, se midió la fluorescencia unida a células mediante citómetro de flujo y se calculó la MCF (fluorescencia de canal media) usando FlowJo.
Para ensayos de unión de velocidad de disociación de partículas, se unieron células y una dosis saturante de nanopartícula o dímero MHC-Ig soluble en estado estacionario tal como se describió anteriormente. Se midió la MCF en el tiempo 0, seguido por la adición de anticuerpo bloqueante 1B2 clonotípico en exceso para impedir la nueva unión. Se midió la MCF en los puntos de tiempo indicados y se calculó la velocidad de disociación eficaz para determinar la disminución exponencial en GraphPad Prism (La Jolla, CA). Se estimaron los contactos de células-partículas tal como se describe en la tabla 2.
Microscopía. Se unieron células T a nano-aAPC durante 60 minutos a 4 °C. Posteriormente se transfirieron células a una placa de 96 pocillos a 37 °C en presencia o ausencia de un campo magnético generado por imanes de discos de neodimio N52. Después de 30 minutos, las células se lavaron y se tiñeron a 4 °C con anticuerpo Alexa488 anti-LFA1, anticuerpo de PE monoclonal anti-IgG1 de ratón y anticuerpo Alexa 647 anti-CD3e. Se lavaron las muestras y se fijaron inmediatamente con paraformaldehído al 2 %. Se adquirieron imágenes en un dispositivo confocal de exploración por láser Zeiss LSM 510 META (Zeiss, Oberkochen, Alemania) a un aumento de 100x en la Johns Hopkins School of Medicine Microscopy Facility. Se determinó el tamaño de agrupamiento de CD3e utilizando un algoritmo de detección de partículas escrito en ImageJ (National Institutes of Health) utilizando el analizador de partículas incorporado.
Preparación de dímeros MHC-Ig. Se prepararon dímeros MHC-Ig solubles, Kb-Ig y Db-Ig, y se cargaron con péptido tal como se describe (Schneck, J. P.; Slansky, J. E.; O’Herrin, S. M.; Greten, T. F. Monitoring Antigen-Specific T Cells Using MHC-Ig Dimers. Curr. Protoc. Immunol. 2001, capítulo 17, unidad 17.2). En resumen, se cargaron moléculas Kb-Ig con péptido mediante separación en condición alcalina (pH 11,5), y, a continuación, se volvieron a plegar en presencia de un exceso de 50 veces de péptido. Se separaron moléculas Db-Ig en condiciones levemente ácidas (pH 6,5) y se volvieron a plegar en presencia de un exceso molar de 50 veces de péptido y un exceso molar de 2 veces de P2-microglobulina humana (Chiu, Y.-L.; Schneck, J. P.; Oelke, M. HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient Ex Vivo Expansion of Human CTL. J. Vis. Exp. 2011, 1-5). Se adquirieron péptidos SIY (SIYRYYGL, sintético; SEQ ID NO: 3), SIIN (SIINFEKL, derivado de ovoalbúmina; SEQ ID NO: 4), GP100 (KVPRNQDWL, de proteína GP100 de melanocitos; SEQ ID NO: 5) y ASN (ASNENMETH, de nucleoproteína de gripe A; SEQ ID NO: 6) de Genscript (Piscataway, NJ). Se determinó la concentración de proteína después del marcaje mediante cromatografía de líquidos de alta resolución con exclusión molecular (HPLC).
Síntesis de micro-aAPC. Se fabricaron micro-aAPC tal como se describió anteriormente (Oelke, M.; Schneck, J. P. Overview of a HLA-Ig Based “Lego-Like System” for T Cell Monitoring, Modulation and Expansion. Immunol. Res.
2010, 47, 248-56) mediante acoplamiento químico directo de proteína a microperlas magnéticas Dynal de 4,5 pm (Life Technologies, Carlsbad, CA). Para la etapa de acoplamiento inicial, se añadieron 25 pg de anticuerpo anti-biotina (Sigma, St. Louis, MO) a 100 millones de microperlas en tampón de borato de sodio 0,1 M. Después de lavar en una columna magnética, se añadieron MHC-Ig y CD28 marcados con biotina en cantidades equimolares para formar aAPC.
Análisis de seguimiento de nanopartículas. Se utilizó un dispositivo Nanosight LM10 equipado con una cámara CCD sensible para caracterizar la distribución de tamaño de nano-aAPC mediante NTA. Se cargaron 50 pl de solución de nanopartículas diluida en la cámara de muestra, que estaba conectada a una fuente de láser de 405 nm. Se grabó una película de 60 s que contenía el seguimiento de movimiento browniano de los centroides de dispersión (partículas) utilizando software de NTA (versión 2.0). Se procesó la película utilizando los ajustes automáticos recomendados por el fabricante con ajuste manual de la ganancia, difuminación y brillo tal como se recomienda. Se diluyó la solución de nanopartículas en solución salina tamponada con fosfato para ajustar la concentración de muestra hasta 5 x 1012 partículas ml-1.
Microscopía de micro-aAPC. Se incubaron células T con micro-aAPC, se centrifugaron a 1.000 RPM durante 1 minuto para empaquetar células y partículas, y se incubaron durante 60 minutos a 4 °C. Posteriormente, se transfirieron las células a una placa de 96 pocillos a 37 °C en presencia o ausencia de un campo magnético generado por imanes de disco de neodimio N52. Después de 30 minutos, se lavaron las células y se tiñeron a 4 °C con anticuerpo Alexa488 anti-LFAl, anticuerpo de PE monoclonal anti-IgG1 de ratón y Alexa 647 anti-CD3e. Se lavaron las muestras y se fijaron inmediatamente con paraformaldehído al 2 %. Se adquirieron imágenes en un dispositivo confocal de exploración por láser Zeiss LSM 510 META (Zeiss, Oberkochen, Alemania) a un aumento de 100x en la Johns Hopkins School of Medicine Microscopy Facility. Se determinó el tamaño de agrupamiento de CD3e utilizando un algoritmo de detección de partículas escrito en ImageJ (National Institutes of Health) utilizando el analizador de partículas incorporado. Se retiró manualmente la autofluorescencia de partículas para células unidas a partículas.
Efecto de nano-aAPC sobre la expansión de células T in vivo e inhibición del crecimiento tumoral subcutáneo. Se aislaron células CD44lo, CD8+, a partir de ganglios linfáticos y bazo pMEL utilizando una columna de enriquecimiento magnético y se activaron durante 24 horas en presencia o ausencia de un campo magnético tal como se describió anteriormente. Se transfirieron de manera adoptiva 1 x 106 células Thy1.1 pMEL a huéspedes de tipo natural B6 Thy1.2+ (n = 6 ratones por grupo). Se trataron los ratones tanto el mismo día como el día después de la transferencia adoptiva con 30.000 unidades de IL-2 intraperitoneal. Siete y veinte días después de la transferencia adoptiva, se sacrificaron tres ratones por grupo y se aislaron linfocitos a partir de sangre periférica, bazo y ganglios linfáticos inguinales, cervicales y axilares, y, a continuación, se tiñeron con anticuerpo anti-Thy1.1.
Se realizaron experimentos de rechazo tumoral como anteriormente, excepto porque se inyectaron 3 x 105 células de melanoma B16 por vía subcutánea diez días antes de la transferencia adoptiva de células T. Se indujo linfopenia transitoria mediante irradiación subletal (500 cGy) un día antes de la transferencia adoptiva con una fuente de Cs137 doble MSD Nordion Gammacell (Johns Hopkins Molecular Imaging Center) ya que se piensa que la linfopenia inducida por irradiación elimina las células huésped inmunosupresoras y reduce la competencia por citocinas linfotrópicas,35 y potencia significativamente el efecto de la inmunoterapia para melanoma en ensayos clínicos.36 Se monitorizó el crecimiento tumoral a intervalos de 2 días utilizando calibradores digitales, hasta que el tamaño tumoral era de -150 mm2, momento en el cual se sacrificaron los animales.
EJEMPLO 9. Las nano-aAPC estimulan de manera preferente células T activadas
La estimulación de células T requiere dos señales de activación administradas mediante APC endógenas: señal 1, un péptido antigénico relacionado presentado en el contexto de MHC que se une al TCR, y señal 2, uno de varios receptores coestimuladores que modulan las respuestas de células T.22 Se sintetizan nano-aAPC mediante acoplamiento de dímero MHC-Ig quimérico (señal 1) y anticuerpo anti-CD28 (señal 2) a nanopartículas de hierro-dextrano paramagnéticas de 50-100 nm (figura 9a), que se seleccionaron como plataforma de partículas a escala nanométrica debido a su extensa caracterización y biocompatibilidad.23 Se caracterizó el acoplamiento de proteína a partículas mediante marcaje con un anticuerpo fluorescente contra la proteína de interés (figura 13). Las nano-aAPC presentan 13 ± 3 dímeros MHC-Ig y 12 ± 5 anticuerpos anti-CD28 por partícula, para una densidad de proteína de 96 ± 10 y 92 ± 12 proteína/pm2, respectivamente (tabla 1).
Tabla 1
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La cantidad y densidad de MHC-Ig y anticuerpo anti-CD28 sobre la superficie de micro-aAPC (de tamaño celular) y nano-aAPC. Se cuantificó la proteína tal como se describió en la descripción de la figura 13, y se determinó la concentración de partículas mediante recuentos (micro-aAPC) o análisis de seguimiento de nanopartículas (nano-aAPC). Se sintetizaron partículas de alta densidad (HD) y baja densidad (LD) haciendo variar la cantidad de proteína por partícula durante la síntesis. Se sintetizaron nanopartículas de señal 1 sin anticuerpo anti-CD28.
Para comparar la estimulación de células T vírgenes frente a previamente activadas, se utilizaron esplenocitos CD8+ vírgenes agotados con respecto a CD44 aislados a partir de ratones transgénicos pMEL TCR o 2C TCR (figura 14A). Esta técnica permitió aislar las células T realmente vírgenes con especificidades antigénicas definidas, mientras que el trabajo previo de los inventores3 y el trabajo de otros24, 25 se basaron en poblaciones mixtas de células negativas para CD44 y altas con respecto a CD44, vírgenes y de memoria, encontradas en ratones transgénicos. Se generaron células activadas estimulando esplenocitos CD8+ durante siete días con péptido soluble, GP100 para células T pMEL y SIY para células T 2C.
Tres días después de la estimulación con una dosis baja de nano-aAPC que presentaban 8 ng de MHC-Ig total, las células T pMEL vírgenes no habían proliferado tal como se mide mediante CfSe (figura 9B, izquierda), un colorante vital que se diluye con cada división celular. Sin embargo, a la misma dosis, las células activadas proliferaron de manera robusta (figura 9B, derecha). La titulación de nano-aAPC mostró que las células vírgenes tenían un umbral superior para la proliferación inducida por nano-aAPC (8-10 ng de MHC-Ig total) a las células activadas (menos de 1,5 ng de MHC-Ig total) (figura 9C).
Como control para el tamaño de aAPC, se evaluó la proliferación de células T inducida por microaAPC de hierro-dextrano, de tamaño celular, de 4,5 pm de diámetro. Las micro-aAPC indujeron la proliferación de células T vírgenes a dosis inferiores (1,5-8 ng de MHC-Ig) a las nano-aAPC tal como se mide mediante dilución de CFSE en el día 3 (figura 14B), con una expansión de aproximadamente 10-20 veces en el día 7 (figura 14C).
Por tanto, mientras que las células activadas responden de manera equivalente a nano-aAPC y micro-aAPC, las células vírgenes tienen un umbral superior para la estimulación basada en nano-aAPC. Esta diferencia no estaba impulsada por diferencias en la densidad de proteína entre micro-aAPC y nano-aAPC, ya que las micro-aAPC con densidad superior (HD) y densidad inferior (LD) a las aAPC basadas en nanopartículas indujeron una proliferación idéntica cuando se normalizó para MHC-Ig total (figura 14D y figura 14E). Dado que la respuesta era sensible al tamaño de partícula, se planteó la hipótesis de que la diferencia en las respuestas se debía a diferencias en las interacciones de nanopartículas con nanoagrupamientos de TCR en células vírgenes frente a activadas.
EJEMPLO 10. Las nano-aAPC se unen a más TCR en células activadas que vírgenes
Para examinar la unión de nanopartículas a TCR, se sintetizaron nanopartículas que portaban MHC-Ig solo, retirando por tanto la contribución a la unión de anticuerpo anti-CD28. Se realizaron experimentos de unión en células T vírgenes y activadas, que se unieron a nanopartículas que portaban MHC-Ig relacionado de manera específica y con bajo fondo (figura 7A).
Se unieron nanopartículas a células T vírgenes y activadas hasta el equilibrio, seguido por la adición del anticuerpo de bloqueo 1B2 anticlonotípico para prevenir la nueva unión. Las nanopartículas mostraron una disociación más rápida a partir de células vírgenes (semivida de 531 segundos ± 149) que las células activadas (984 s ± 221) (p<0,02 mediante la prueba de la t de Student para datos emparejados) (figura 9D, tabla 2).
Tabla 2
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La media de esta distribución E[f\ = n/r. Si se supone que el dímero MHC-Ig realiza un contacto con una célula T virgen (Fahmy, T. M.; Bieler, J. G.; Edidin, M.; Schneck, J. P. Increased TCR Avidity after T Cell Activation: a Mechanism for Sensing Low-Density Antigen. Immunity 2001, 14, 135-43), entonces puede estimarse r a partir de la velocidad de disociación de MHC-Ig en células vírgenes (8,9 x 10-3). Por tanto, para cualquier condición dada, E[f] se deriva a partir de la semivida de dímero MHC-Ig o partícula en células vírgenes o activas (í/2) y se supone que r es constante. El número de contactos TCR-MHC se estima como n:
L * r
n ¡2
ln(2)
Es probable que el número verdadero de contactos sea mayor que esta estimación, ya que es probable que MHC-Ig realice más de un contacto con células vírgenes.
Pueden usarse las velocidades de disociación para estimar el número de contactos entre células y ligandos multivalentes, conduciendo más contactos a una disociación más lenta.26 Se modelizó la disociación de nanopartículas a partir de células como un proceso estocástico exponencial, usándose la disociación de dímero MHC-Ig soluble para derivar parámetros y validar el enfoque (véase la tabla 2 para detalles). Se midió la velocidad de disociación de un único contacto TCR-MHC para determinar la unión de dímero MHC-Ig soluble a células vírgenes (figura 7C), que es efectivamente monovalente.13 Tal como se esperaba, los dímeros MHC-Ig se disociaron más lentamente a partir de células activadas, conduciendo a 1,7 contactos estimados (figura 9E), de manera compatible con informes previos.13, 26
La disociación de nanopartículas a partir de células vírgenes fue significativamente más lenta que MHC-Ig libre (figura 7C) y 2 veces más lenta a partir de células activadas que vírgenes. Por tanto, se estimó que las nano-aAPC realizaron 6,8 contactos con células vírgenes, en comparación con aproximadamente el doble (12,6) en células activadas (figura 9E, tabla 2). Estos números representan el 11 % y el 22 % de dímeros MHC-Ig, respectivamente, unidos a la superficie de nano-aAPC.
Las células activadas se unieron a dos veces menos nanopartículas en equilibrio que las células vírgenes a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones de partículas (figura 9F). Esta diferencia no se debió a la expresión de receptor de células T, que era equivalente en células T vírgenes y activadas (figura 7B), lo que indica que contactos TCR-MHC aumentados por partícula conducen a menos TCR disponible, inhibiendo la unión y limitando la cantidad total de nanopartículas que se unen a un agrupamiento individual.
En conjunto, el aumento de dos veces en las nano-aAPC totales unidas y la disminución de dos veces de los contactos TCR-MHC en los que participan células vírgenes sugieren el modelo de unión mostrado esquemáticamente en la figura 9G. Las células vírgenes se unen a más nano-aAPC utilizando menos contactos de MHC debido a la pequeña escala de los agrupamientos de TCR antes del contacto célula-nanopartícula. En cambio, las células activadas se unen a menos nanopartículas porque cada partícula establece contacto con más TCR.
EJEMPLO 11. Los campos magnéticos impulsan la agregación de aAPC y TCR/CD3
Basándose en la hipótesis de que las nano-aAPC se unen a agrupamientos de TCR a escala nanométrica, se aprovechó la unión de nanopartículas para controlar la agregación de agrupamientos de TCR, y, por tanto, la activación de células T. Se utilizó un campo magnético exógeno para impulsar la agregación de nano-aAPC paramagnéticas unidas a células vírgenes. Se unieron nano-aAPC a células T vírgenes a 4 °C, a continuación se cultivaron a 37 °C entre dos imanes de disco de neodimio que generaban una intensidad de campo máxima de 0,2 T para determinar si, en un campo magnético externo, las aAPC de hierro-dextrano paramagnéticas se polarizaban magnéticamente y se atraían entre sí,27 impulsando la agregación de TCR (figuras 10A-C).
Se evaluó la formación de agrupamientos mediante microscopía confocal. Después de una hora de unión a 4 °C, se tiñeron y se fijaron las células inmediatamente (tiempo 0), o se transfirieron células a una incubadora a 37 °C durante 30 minutos en ausencia o presencia de un campo magnético. A continuación se tiñeron las células con anticuerpos contra LFA-1 (verde), una molécula de adhesión utilizada como control; CD3e (magenta), un componente de señalización asociado con TCR; y MHC-Ig (rojo), para visualizar las nano-aAPC. Finalmente, se fijaron las células y se obtuvieron imágenes de las mismas.
Antes de la incubación a 37 °C, se distribuyeron aAPC y CD3e en un patrón punteado en la membrana, distribuyéndose los agrupamientos pequeños de manera difusa a través de la superficie celular (tiempo 0, figura 10D, parte superior izquierda). LFA-1 se distribuyó de manera uniforme a través de la célula. Los patrones de tinción de LFA-1 y CD3e fueron idénticos a los del tiempo 0 después de treinta minutos de incubación con partículas de Kb-SIINF no relacionadas (no relacionado, figura 10D, parte superior derecha). En ausencia de un campo magnético, la incubación con nano-aAPC relacionadas no alteró drásticamente la distribución de LFA-1, aAPC o CD3e (sin imanes, figura 10D, parte inferior izquierda). Sin embargo, después de 30 minutos en un campo magnético, se formaron grandes agregados de nano-aAPC sobre la membrana (imanes, figura 10D, parte inferior derecha). Estos agrupamientos de nano-aAPC se localizaron conjuntamente con agrupamientos de CD3e de tamaño similar. La molécula de control LFA-1 mantuvo un patrón difuso a través de la membrana, indicando que la agregación de CD3e se debía a su asociación con aAPC.
Para caracterizar el tamaño y número de agregados inducidos por aAPC, se desarrolló un programa de identificación de partículas en ImageJ. El programa pudo identificar tanto agrupamientos puntuados difusos a partir de células al tiempo 0 (figura 10E, izquierda) como agregados más grandes inducidos por campos magnéticos (figura 10E, derecha).
La incubación en un campo magnético aumentó significativamente la agregación de TCR, más allá de la observada tras la incubación con nano-aAPC solas y condujo a agregados de complejos de CD3 más grandes en células. El área de agrupamiento media antes de la incubación a 37 °C era de 0,30 ± 0,03 pmi2, y esto no cambió después de la incubación con nano-aAPC no relacionadas (figura 10F). Las aAPC solas aumentaron el tamaño de agrupamiento hasta una media de 0,52 ± 0,06 pmi2 (p<0,001). Se potenció adicionalmente la formación de agrupamientos en un campo magnético hasta un tamaño medio de 0,73 ± 0,11 pmi2 (p<0,001 en comparación con sin imanes). El número medio de agrupamientos por célula disminuyó desde 6,5 ± 0,6 en el tiempo 0 hasta 3,0 ± 0,2 con un campo magnético (figura 10G). La velocidad de disociación de nano-aAPC después del cultivo en un campo magnético no aumentó (figura 7F), lo que sugiere que la formación de agregados no estaba asociada con un aumento de los contactos TCR/MHC, sino más bien con la agregación de nanoagrupamientos de TCR unidos a aAPC.
También se estudió el impacto de campos magnéticos externos usando micro-aAPC (figura 8A). Mientras que aplicar un campo magnético impulsó la agregación de micro-aAPC, la agregación de micro-aAPC no estaba asociada con la agregación de TCR/CD3 en células. Los agrupamientos de CD3 en células T tenían un área de 0,39 ± 0,03 |o.m2 cuando se incubaron con micro-aAPC en ausencia de un campo magnético, y de 0,37 ± 0,03 pmi2 con micro-aAPC en presencia de un campo magnético (figuras 8B-C), lo que indica que un campo magnético no potenció la formación de agrupamientos de CD3 cuando se estimularon células T con micro-aAPC. Es probable que esto se deba al gran tamaño de las micropartículas con respecto a los nanoagrupamientos de TCR.
En resumen, la agregación de nano-aAPC, pero no de micro-aAPC, inducida por un campo magnético condujo a un aumento de 2 veces en el tamaño de agregados de TCR/CD3 y una disminución de 2 veces en el número de agregados por célula. Dado que se sabe que la agregación de receptores es una señal fuerte y suficiente para la activación de células T,28 se examinó el efecto de la formación de agrupamientos de TCR inducida por imanes sobre la proliferación de células T.
EJEMPLO 12. La activación en un campo magnético potencia la proliferación de células T vírgenes Para evaluar si la activación de células T mediante nano-aAPC se potenciaba mediante cultivo en un campo magnético, se incubaron células T pMEL marcadas con CFSE con dosis crecientes de nano-aAPC de Db-GP100 y se cultivaron con o sin un campo magnético externo. Las células T vírgenes proliferaron en un campo magnético a dosis de nano-aAPC que indujeron, por lo demás, una proliferación mínima (figura 11A). Después de la incubación con nano-aAPC que portaban 5 ng de MHC-Ig, el 29 % de células en cultivo habían proliferado, en comparación con el 89 % de células en un campo magnético. La proliferación en el día 7 era hasta 4 veces mayor en comparación con controles sin imanes (figura 11B). El cultivo en un campo magnético sin nano-aAPC no condujo a proliferación de células T.
En cambio, el cultivo con micro-aAPC en un campo magnético no condujo a una expansión de células T potenciada en comparación con controles sin imanes, tal como se mide tanto mediante dilución de CFSE en el día 3 como mediante proliferación en el día 7 (figuras 8D-E).
Anteriormente se ha utilizado la formación de agrupamientos de perlas magnéticas para estudiar los efectos tanto del esfuerzo mecánico29 como de la formación de agrupamientos de receptor21, 7 en otros sistemas, y se ha sugerido una función para la activación mecánica de TCR.30, 31 Sin embargo, dado que es probable que las micro-aAPC en un campo magnético transmitan fuerzas mecánicas mayores que las nano-aAPC pero no induzcan agregación de TCR o proliferación potenciada, es probable que el efecto de proliferación potenciado por imanes observado con nano-aAPC se deba a la agregación de receptores en vez de a la “tracción” mecánica de receptores. Se evaluaron la duración e intensidad de la estimulación por campo magnético requerida para una expansión óptima mediante nano-aAPC mediante la adición y retirada de imanes de neodimio de tamaño variable. De una a tres horas en un campo magnético (figuras 11C-11D) y una intensidad de campo de 0,2 T o más (figuras 11E-3F; figura 13) impulsaron una expansión de células T de 10 veces después de una semana.
La estimulación por aAPC potenciada por campo magnético también potenció la expansión de células T específicas de antígeno a partir de poblaciones de células T endógenas, policlonales. Se sintetizaron nano-aAPC que portaban el dímero Kb-Ig cargado con el péptido Trp2, que es específico para el antígeno de melanoma Trp2. Se cultivaron esplenocitos CD8+ a partir de ratones B6 de tipo natural con una dosis limitante de aAPC y, después de siete días, se analizaron las células T específicas de antígeno. La expansión con nano-aAPC solas, a esta dosis, condujo al 0,70 % de células específicas de Trp2, tal como se determina mediante comparación de la unión a Kb-Trp2 relacionado con la unión a Kb-SIINF no relacionado (figura 11G). Sin embargo, cuando se incubaron con células T en un campo magnético, las aAPC generaron aproximadamente el 3,4 % de células T específicas de antígeno después de una única semana (figura 11G). Esto dio como resultado aproximadamente 37.000 ± 3.900 células específicas de Trp-2 generadas a partir de una combinación de 10 x 106 células precursoras en un campo magnético, en comparación con 6700 ± 630 sin un campo magnético (una diferencia de aproximadamente 5,5 veces, p<0,01 mediante prueba de la t de Student). Con frecuencias de precursores CD8 que se estima que son del orden de 10-800 por 10 millones,32 esto sugiere una expansión de 450 a 3.600 veces en cultivo con un campo magnético, comparable a la expansión de precursores de 1000 veces observada con infección viral in vivo.33 EJEMPLO 13. Activación de células T potenciada por campo magnético para inmunoterapia adoptiva La posibilidad de potenciar la estimulación de células específicas de antígeno condujo a estudiar la estimulación por aAPC potenciada por campo magnético antes de la transferencia adoptiva in vivo. Se activaron células T Thy 1.1 pMEL in vitro con aAPC en presencia o ausencia de un campo magnético y se transfirieron de manera adoptiva a ratones receptores Thy1.2+ de tipo natural (ver el diagrama esquemático de la figura 12A). Siete o veintiún días después de la transferencia adoptiva, se sacrificaron los ratones y se evaluaron para determinar las células Thy1.1 transferidas de manera adoptiva.
La estimulación potenciada por campo magnético con nano-aAPC dio como resultado la expansión robusta de la población de células T transferidas. En el día 7, el 3,1 % de las células T en el bazo eran Thy1.1+ para células T estimuladas en un campo magnético, en comparación con el 0,6 % para células estimuladas con aAPC pero sin campo magnético, y el 0,2 % para células T sin tratar solas, que no se estimularon antes de la transferencia adoptiva (p<0,01, figuras 12B-C). El porcentaje más grande de células se observó en el bazo el día 7 (figura 12C). Las células Thy1.1+ totales en todos los órganos examinados alcanzaron aproximadamente 1 x 10^para el grupo potenciado por campo magnético (figura 12D) en el día 7, en comparación con menos de 2 x 105 para el grupo sin imanes. Esta potenciación de 5 veces concordaba aproximadamente con la potenciación observada in vitro. Aunque se observaron menos células en el día 21, las células T activadas mediante aAPC en un campo magnético establecieron una población detectable en ganglios linfáticos (0,15 %), en comparación con el 0,04 % a partir de células T activadas mediante aAPC solas y el 0,01 % a partir de células que no se estimularon en absoluto (p<0,05, figuras 12B-D).
Las consecuencias funcionales de la estimulación de células T potenciada por campo magnético se estudiaron mediante tratamiento de melanoma B16, un tumor escasamente inmunógeno con un alto umbral de rechazo inmunitario.34 Se transfirieron de manera adoptiva células T pMEL a ratones que portaban tumores B16 subcutáneos establecidos diez días después de la inyección del tumor (figura 12E) y se indujo linfopenia transitoria mediante irradiación subletal (500 cGy) de ratones un día antes de la transferencia adoptiva según enfoques convencionales para inmunoterapia adoptiva.35, 36
Las células T específicas de tumor activadas mediante aAPC en un campo magnético inhibieron fuertemente el crecimiento tumoral en comparación con controles sin tratamiento, células T solas y células T estimuladas mediante aAPC sin un campo magnético (p<0,0001, efecto de tratamiento mediante ANOVA de dos factores, figura 12F). En el día 18, los ratones tratados con células T potenciadas por campo magnético tenían tumores de 8 a 10 veces más pequeños que los ratones no tratados o tratados con células T sin imanes. De manera similar, las células T potenciadas por campo magnético mejoraron significativamente la supervivencia del huésped, sobreviviendo 6/8 ratones y no teniendo 4/8 ningún tumor detectable en el día 28 tras la inyección (p<0,001, Mantel-Cox, figura 12F).
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento in vitro de activación de células T, que comprende:
incubar, en presencia de un campo magnético, una población de células T y una célula presentadora de antígeno artificial a escala nanométrica (nano-aAPC), comprendiendo la nano-aAPC:
una nanopartícula paramagnética;
como mínimo una molécula coestimuladora de células T sobre la superficie de la nanopartícula; y
como mínimo un complejo mayor de histocompatibilidad que comprende, como mínimo, una hendidura de unión a antígeno,
en el que un péptido antigénico se une a la hendidura de unión a antígeno, activando así células T específicas de antígeno.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la nanopartícula tiene desde 25 hasta 500 nm de diámetro.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o 2, en el que la población de células T se incuba en presencia de un campo magnético durante de 10 minutos a 3 días.
4. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además separar células T específicas de antígeno de células que no se unen a la nano-aAPC utilizando enriquecimiento magnético.
5. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el antígeno peptídico es un antígeno asociado a tumor.
6. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la molécula coestimuladora de células T es un anticuerpo que se une específicamente a CD28.
7. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células T activadas son células T citotóxicas.
8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la población de células T se obtiene de células mononucleares de sangre periférica, medula ósea, tejido de ganglio linfático, tejido del bazo o tejido tumoral, y en el que opcionalmente la población de células T se obtiene mediante aféresis o leucocitaféresis.
9. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la población de células T se incuba con la nano-aAPC durante de 3 a 21 días.
10. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la población de células T se incuba con la nano-aAPC durante de 7 a 10 días.
11. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el complejo mayor de histocompatibilidad comprende una primera y una segunda cadena a de MHC de clase I cada una fusionada a una cadena pesada de inmunoglobulina.
12. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el complejo mayor de histocompatibilidad comprende dos primeras proteínas de fusión que comprenden (i) una cadena pesada de inmunoglobulina y (ii) un dominio extracelular de una cadena p de MHC de clase II, y dos segundas proteínas de fusión que comprenden (i) una cadena ligera de inmunoglobulina K o X y (ii) un dominio extracelular de una cadena a de MHC de clase II.
13. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el péptido antigénico es un antígeno asociado a tumor, un péptido de un autoantígeno, un péptido de un aloantígeno o un péptido de un antígeno de agente infeccioso.
14. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la molécula coestimuladora de células T es CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-IBBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, un anticuerpo que se une específicamente a CD28, un anticuerpo que se une específicamente a HVEM, un anticuerpo que se une específicamente a CD40L, un anticuerpo que se une específicamente a OX40 o un anticuerpo que se une específicamente a 4-1BB.
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