CN109306340B - 一种高效扩增全t细胞的人工抗原递呈细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高效扩增全T细胞的人工抗原递呈细胞及其用途。具体而言，本发明的转基因人工抗原递呈细胞(1)表达T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体和细胞因子；和/或(2)基因组中稳定整合了含编码T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体细胞因子的表达框。本发明的人工抗原递呈细胞能够诱导T细胞增殖与活化，产生中枢记忆T细胞，刺激T细胞分泌IFN‑γ，提高特异性T细胞杀伤肿瘤的能力。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学、肿瘤免疫学和肿瘤免疫治疗领域，涉及一种高效扩增特异性T细胞的人工抗原递呈细胞及其用途。
背景技术
针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。与运用肿瘤疫苗进行免疫治疗相比，过继性T细胞治疗作为免疫治疗的一种重要方式，理论上具有以下优点：一是可先在体外特异性地筛选出所需功能和表现型的T细胞；二是通过在体外扩增大量的肿瘤特异性T细胞，再回输到患者体内，可有效避免肿瘤微环境产生的免疫耐受和免疫抑制性。最近的临床研究表明，利用过继性T细胞治疗晚期癌症患者，能产生积极地临床相关抗肿瘤反应。例如，针对淋巴细胞缺失的黑色素瘤患者过继性转移体外活化的肿瘤浸润淋巴细胞，再进行高剂量的IL-2治疗，可引起显著的临床反应。此外，利用抗CD19嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)转导的T细胞治疗CD19+B细胞淋巴瘤和白血病患者，可产生良好的临床效果。这些结果都表明，过继性转移大量的功能性抗肿瘤T细胞可成为治疗癌症的有效手段。
初始的T细胞在体外培养过程中，因缺乏第一信号和第二信号的共刺激，会快速衰竭。因此，如何在体外扩增足够数量的肿瘤特异性T细胞是有效地过继性T细胞治疗的关键。T细胞的活化需要TCR-CD3复合物以及共刺激分子的双信号刺激。CD3抗体可提供非特异性的第一信号，可引起T细胞TCR-CD3复合体的交联，产生活化信号，刺激T细胞活化增殖。在提供第二信号的分子中，CD28抗体已充分被证实是经由TCR/CD3激活T细胞的最重要共刺激分子。在TCR被CD3抗体预激活的细胞中，CD28抗体与配体结合后，诱导细胞内酪氨酸磷酸化，使T细胞充分活化。缺乏CD28/B7共刺激信号会导致T细胞失能，它在启动免疫应答初始阶段起着不可或缺的作用。CD28抗体还可以刺激T细胞分泌一系列细胞因子，如IL-2，IFN-γ，TNF-α，IL-4等，促进T细胞分化、增殖。
专业的抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)包括树突状细胞(dendritic cell，DC)、单核细胞和活化的B细胞等，在递呈肿瘤抗原给T细胞识别的过程中，T细胞获得的信号刺激会影响它的编程和治疗效果，自然发生的APC不能提供精准的信号刺激，进而调控T细胞分化为最适的表现型。而且，从肿瘤患者的血液中分离出同源的APC(如DC)十分麻烦，DC数量非常少，只占外周血单核细胞(Peripheral Blood MononuclearCell,PBMC)1％以下，经体外培养得到成熟的DC更少，且难以扩增，诱导产生的特异性T细胞数量较少，难以满足临床治疗的要求。
目前，扩增T细胞的方法主要有两种。一是用包被anti-CD3和anti-CD28抗体的板子激活T细胞，这种方法价格昂贵，也存在易污染以及内毒素过高等安全性隐患，此外，由于T细胞为悬浮培养细胞，在用包被抗体的板子培养过程中，悬浮的T细胞不能充分接触anti-CD3和anti-CD28抗体，导致对T细胞的信号刺激强度不够，使其不能充分扩增；二是用抗体包被的免疫磁珠(Dynabeads)刺激T细胞，比如通过在磁珠上组合抗CD3和抗CD28抗体，就能提供调节T细胞激活和扩增需要的初级和协同刺激信号，但是，同时在磁珠上负载多种抗体，抗体的包被位置，包被数量很难掌握，不能保证其均一性，而且生产出粒度适中，分散度低的高质量磁珠，需要十分复杂的工艺。
近来的研究表明，人工APC(Artificial antigen presenting cell，aAPC)能有效活化和扩增抗原特异性T细胞，效率高、可行性好。不同的aAPC可表达不同的分子产生相应的信号刺激，引起所需要的T细胞迁移和效应功能，同时能编程细胞建立持久的T细胞记忆。一种aAPC也可同时表达多种抗体和抗原，易于操控，进而满足实验需求。总之，aAPC的应用有效地提高了过继性T细胞治疗肿瘤的临床疗效。
K562细胞属于人白血病细胞系，来源于急变期的慢性髓细胞性白血病患者。K562细胞具有以下特点：一是不表达内源性的HLA Ⅰ类和Ⅱ类分子；二是容易进行基因操纵，且能稳定表达操纵的基因；三是在人体使用安全。这些特点使得K562细胞被广泛用作构建新型aAPC的骨架细胞系，并取得了较好的研究结果。例如，将CD3、CD80和CD83分子转导K562细胞系构建的aAPC/mOKT3，在不添加异源性饲养细胞的情况下，能同时促进外周血和肿瘤浸润T淋巴细胞(tumor-infiltrating T lymphocytes，TILs)的扩增。此外，研究人员利用K562细胞已制备出临床级的可共表达CD64、CD86、4-1BBL、截断的CD19和mbIL-15/IRES-EGFP分子的aAPC，能够特异性的刺激CD19 CAR-T细胞的增殖分化，利用该CD19 CAR-T细胞，正在表达CD19的淋巴恶性肿瘤患者中开展临床Ⅰ期的过继性治疗试验。
尽管已存在外源基因导入K562细胞的报道，但目前常用基因转染载体系统难以使外源基因在其细胞内高水平地表达。慢病毒载体系统等对人类及其他灵长类动物还存在安全风险。因而，在此之前，尚无基于K562细胞构建的aAPC能高效表达多种抗体的报道。
发明内容
本发明第一方面提供一种转基因人工抗原递呈细胞(aAPC)，所述aAPC：(1)表达T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、第二信号膜结合型激活性抗体和细胞因子；和/或(2)基因组中稳定整合了含编码T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、第二信号膜结合型激活性抗体和细胞因子的表达框。
在一个或多个实施方案中，所述表达框的两端均包含转座子的反向末端重复序列。
在一个或多个实施方案中，所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5和Ty。
在一个或多个实施方案中，所述转座子为piggybac。
在一个或多个实施方案中，所述aAPC为不表达人类MHC分子的的细胞；优选地，为K562细胞。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞第一信号膜结合型激活性抗体是抗CD3抗体。
在一个或多个实施方案中，所述抗CD3抗体是抗CD3单链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述第二信号膜结合型激活性抗体针对如下抗原中的一种或多种：CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、CD32、GITR、CD40L、CD64、CD80、CD83、CD86和ICOSL(B7H2,B7RP1)。
在一个或多个实施方案中，所述第二信号膜结合型激活性抗体至少包括抗CD137抗体。
在一个或多个实施方案中，所述第二信号膜结合型激活性抗体还包括抗CD28抗体。
在一个或多个实施方案中，所述第二信号膜结合型激活性抗体为单链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37和IL-38，或其胞外结构域，或与其相应的α受体的融合蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子为IL-15胞外结构域与IL15的α受体的融合蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述aAPC表达：抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD137抗体和IL15胞外结构域。
在一个或多个实施方案中，所示aAPC在细胞膜上表达IL15胞外结构域。
本发明第二方面提供如下一种或多种核酸构建体：
(1)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；
(2)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；和
(3)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制细胞因子的编码序列表达的启动子、细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体。
在一个或多个实施方案中，所述重组载体为真核表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述真核表达载体为包含PiggBac转座元件的真核表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5和Ty。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶是piggybac转座酶。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞第一信号膜结合型激活性抗体是抗CD3抗体。
在一个或多个实施方案中，所述抗CD3抗体是抗CD3单链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述第二信号膜结合型激活性抗体针对如下抗原中的一种或多种：CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、CD32、GITR、CD40L、CD64、CD80、CD83、CD86和ICOSL(B7H2,B7RP1)。
在一个或多个实施方案中，所述第二信号膜结合型激活性抗体至少包括抗CD137抗体。
在一个或多个实施方案中，所述第二信号膜结合型激活性抗体还包括抗CD28抗体。
在一个或多个实施方案中，所述第二信号膜结合型激活性抗体为单链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子选自：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37和IL-38，或其胞外结构域，或与其相应的α受体的融合蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子为IL-15胞外结构域与IL15的α受体的融合蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述控制T细胞第一信号、第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列或控制细胞因子编码序列表达的启动子是EF1α。
在一个或多个实施方案中，所述控制转座酶编码序列表达的启动子是CMV启动子。
本发明第三方面提供构建本文所述的转基因aAPC的方法，所述方法包括将以下三种表达载体转入所述aAPC中的步骤：
(1)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD28胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；
(2)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；和
(3)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制细胞因子的编码序列表达的启动子、细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体。
在一个或多个实施方案中，采用病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转中的一种或多种方法将所述三种表达载体转入所述细胞中，优选地采用电转。
本发明第四方面提供本文所述的转基因aAPC的用途，所述用途为：诱导全T细胞增殖与活化，和/或产生中枢记忆T细胞，和/或刺激T细胞分泌IFN-γ，和/或提高特异性T细胞杀伤肿瘤的能力。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞包括所有类型的T细胞，如：外周血单核细胞来源的T淋巴细胞、肿瘤浸润T淋巴细胞、CAR-T细胞等。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。
本发明第五方面提供(1)抗CD137单链抗体和/或IL15或其衍生物，(2)抗CD137单链抗体的编码序列和/或IL15或其衍生物的编码序列，和(3)抗CD137单链抗体的表达载体和/或IL15或其衍生物的表达载体在制备转基因aAPC中的应用。
附图说明
图1：重组质粒的表达框模式图。ITR为转座子末端重复序列，scFv为单链抗体，HyPB是piggybac转座酶。
图2：人工抗原递呈sh3857细胞中目的基因的PCR鉴定。
图3：人工抗原递呈sh3857细胞表面分子的流式检测。对照为非转基因的同一来源K562细胞。
图4：sh3857细胞对外周血单核细胞来源的CTL细胞的扩增作用检测。对照为CD3-CD28珠。
图5：sh3857细胞对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的扩增作用检测。对照为CD3-CD28珠。
图6A和6B：sh3857细胞刺激后的T细胞活化和记忆表型的流式检测。对照为CD3-CD28珠。
图7A和7B：sh3857细胞刺激后的T细胞抑制性表型的流式检测。对照为CD3-CD28珠。
图8：sh3857细胞刺激后的T细胞IFN-γ分泌情况的流式检测。对照为CD3-CD28珠。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列和PolyA加尾信号序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“抗原结合片段”(antigen-binding fragment,Fab)是指位于抗体分子"Y"结构的两臂末端，由高变区氨基酸序列组成，决定抗体结合抗原的特异性的肽段。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
术语“肿瘤浸润淋巴细胞”(Tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)是指从肿瘤组织中分离至体外培养扩增，达到一定数量重新输注入病人体内，能较强杀伤相应的肿瘤细胞，它是一种特异性高、杀伤作用强的的抗肿瘤免疫细胞。
“CD3”由6条肽链组成，常与TCR紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体。本文中的CD3分子指的是“CD3E”，即编码CD3ε肽链，它在NCBI GeneBank中的ID号为916，只有1个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，为NM_000733.3/NP_000724.1。
“CD28”是指人白细胞分化抗原28，又称为Tp44，它在NCBI GeneBank中的ID号为940，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_001243077.1/NP_001230006.1，NM_001243078.1/NP_001230007.1，NM_006139.3/NP_006130.1。
“CD137”是指人白细胞分化抗原137，又称为4-1BB，它在NCBI GeneBank的官方名称为TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)，ID号为3604，只有1个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，为NM_001561.5/NP_001552.2。
“IL15”是指白细胞介素15，它在NCBI GeneBank中的ID号为3600，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_000585.4/NP_000576.1，NM_172175.2/NP_751915.1。
除非另有说明，本文涉及的其它抗原均是本领域已知的抗原，其氨基酸序列为本领域所周知并可从本领域所熟知的数据库中获得。
本文涉及将表达本文所述的T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体和细胞因子的核酸构建体转入抗原递呈细胞中，以构建在表达所述抗体和细胞因子的转基因人工抗原递呈细胞，用于诱导全T细胞增殖与活化，产生中枢记忆T细胞，刺激T细胞分泌IFN-γ，和提高特异性T细胞杀伤肿瘤的能力。
合适的专业的抗原递呈细胞包括树突状细胞、单核细胞和活化的B细胞等。优选的是，本文使用的APC为不表达人类MHC分子的APC；更优选为人白血病细胞；最优选为K562细胞。
适用于本发明的T细胞第一信号膜结合型激活性抗体和T细胞第二信号膜结合型激活性抗体优选为分泌型抗体。在某些实施方案中，所述抗体为膜锚定型抗体。在某些实施方案中，所述抗体为单链抗体。单链抗体(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。
适用于本文的T细胞第一信号膜结合型激活性抗体优选是抗CD3抗体，尤其是抗CD3ε肽链的抗体。在某些实施方案中，所述抗CD3抗体是单链抗体。在某些实施方案中，所述抗CD3单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1第61-780位碱基序列所编码的氨基酸序列。
适用于本文的T细胞第二信号膜结合型激活性抗体可以是针对如下抗原中的一种或多种的抗体：CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、CD32、GITR、CD40L、CD64、CD80、CD83、CD86和ICOSL(B7H2,B7RP1)。优选地，所述T细胞第二信号膜结合型激活性抗体至少包括抗CD137抗体，优选还包括抗CD28抗体。优选地，所述T细胞第二信号膜结合型激活性抗体是单链抗体。在某些实施方案中，使用抗CD137单链抗体与抗CD28单链抗体。示例性的抗CD28单链抗体的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:2第58-783位碱基所编码的氨基酸序列；示例性的抗CD137单链抗体的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:3第61-795位碱基序列所编码的氨基酸序列。
本文中，合适的细胞因子包括但不限于白细胞介素。例如，合适的白细胞介素包括如下的一种或多种：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37和IL-38。通常，本文所述的白细胞介素包括其胞外结构域或衍生物，所述衍生物尤其包括白细胞介素的胞外结构域与相应白细胞介素的α受体所形成的融合蛋白。例如，在某些实施方案中，所述白细胞介素为IL-15的胞外结构域与IL15的α受体的融合蛋白。IL-15的胞外结构域和其α受体之间可通过常用的接头序列进行连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，IL-15及其α受体的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4第58-669位碱基序列所编码的氨基酸序列。
用于转入感兴趣抗原递呈细胞的核酸构建体通常含有T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体或细胞因子的表达框。表达框的两端优选包含转座子的反向末端重复序列。
因此，在某些实施方案中，本文的核酸构建体包括核酸构建体A、B和C：
(A)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD28胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；
(B)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；和
(C)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制细胞因子的编码序列表达的启动子、细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体。
优选的是，这些核酸构建体是表达载体，能在感兴趣的抗原递呈细胞中表达所述抗体以及细胞因子。
本文中，转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，本发明核酸构建物中的5’ITR和3’ITR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac的转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
可根据所选的感兴趣核酸序列(即待表达的抗体或细胞因子)选择相应的启动子序列。这类启动子的例子包括但不限于EF1α启动子。如CN201510021408.1所述(本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)，启动子上游还可包括增强子，如mCMV增强子、hCMV增强子和CD3e增强子中的一个、任意两个或全部三个。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7的SEQ ID NO:6所示。
可使用本领域周知的polyA加尾信号序列。在某些实施方案中，所述polyA来自SV40。在某些实施方式中，可使用CN 201510638974.7的SEQ ID NO:3所示的序列。
CD28的胞外区和跨膜区可以是本领域常用的胞外区和跨膜区序列。示例性的CD28的胞外区可由SEQ ID NO:1第781-897位碱基序列所编码；示例性的CD28的跨膜区可由SEQID NO:1第898-987位碱基序列所编码。
CD8的胞外区和跨膜区可以是本领域常用的胞外区和跨膜区序列。示例性的CD8的胞外区可由SEQ ID NO:2第784-948位碱基序列所编码；示例性的CD8的跨膜区可由SEQ IDNO:2第949-1020位碱基序列所编码。
因此，在某些实施方案中，用于在感兴趣的抗原递呈细胞中表达T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的核酸构建体A含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD28胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子；用于在感兴趣的抗原递呈细胞中表达T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的核酸构建体B含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子；用于在感兴趣的抗原递呈细胞中表达细胞因子的核酸构建体C含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、细胞因子的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子。
在某些实施方案中，所述重组表达载体采用pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体作为骨架。在其它实施方案中，所述重组表达载体采用pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体作为骨架。在某些实施方案中，本发明使用CN201510638974.7构建的pSN载体，其载体结构如该申请图1所示。
在某些实施方案中，本文的抗原递呈细胞是转基因K562细胞，所述转基因K562细胞的基因组中稳定整合了包含所述感兴趣的核酸序列的表达框。更进一步地，所述K562细胞的基因组中稳定整合了依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制感兴趣的核酸序列表达的启动子、感兴趣的核酸序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。具体而言，所述K562细胞：表达T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、第二信号膜结合型激活性抗体和细胞因子；和/或基因组中稳定整合了编码T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的表达框、编码第二信号膜结合型激活性抗体的表达框和编码细胞因子的表达框，尤其是本文各实施方案中所述的表达框。另一方面，所述K562细胞转入了本文各实施方案所述的核酸构建体A、B和C。更优选的是，转入所述K562的核酸构建体B至少包括能表达抗CD137单链抗体的核酸构建体，并优选还包括能表达抗CD28单链抗体的核酸构建体。在某些实施方案中，本文的转基因K562细胞稳定表达抗体Fc段的全长序列或其功能性片段。在某些实施方案中，本文的转基因K562细胞稳定表达抗体的重链恒定区段(如Fc)和轻链。
根据所表达的抗体和细胞因子的生物学功能，本文的转基因K562细胞具有高效诱导全T细胞增殖与活化，并产生中枢记忆T细胞的功能。在一个或多个实施方案中，所述T细胞包括所有类型的T细胞，如：外周血单核细胞来源的T淋巴细胞、肿瘤浸润T淋巴细胞和CAR-T细胞等。
可采用本领域常规的方法将本文的核酸构建体A、B和C转入感兴趣的抗原递呈细胞中，制备本申请的aAPC。这些方法包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述核酸构建物转入感兴趣的细胞中。转染时，可根据实际情况调整表达载体的用量。
因此，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本文任一实施方案所述的核酸构建体A、B和C。优选地是，所述核酸构建体B至少包括表达抗CD137单链抗体的核酸构建体，优选还包括表达抗CD28单链抗体的核酸构建体。在某些实施方案中，所述试剂盒含有：本文所述的表达抗CD3单链抗体的核酸构建体A，本文所述的表达抗CD28单链抗体的核酸构建体B，本文所述的表达抗CD137单链抗体的核酸构建体B，以及本文所述的表达IL15胞外结构域与其α受体的融合蛋白的核酸构建体C。试剂盒还可含有适用于将所述重组表达载体转染入细胞中的各种试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转染入细胞的说明书。试剂盒中，各种重组表达载体可独立包装，也可以混合物的形式包装在同一容器中。
因此，在某些实施方案中，本发明也涉及一种组合物，该组合物至少本文任一实施方案所述的核酸构建体A、核酸构建体B和核酸构建体C中的一种、任意两种或全部三种。在一个或多个实施方案中，所述组合物含有本文所述的表达抗CD3单链抗体的核酸构建体A，本文所述的表达抗CD28单链抗体的核酸构建体B，本文所述的表达抗CD137单链抗体的核酸构建体B，以及本文所述的表达IL15胞外结构域与其α受体的融合蛋白的核酸构建体C中的任意一种、任意两种或全部三种。组合物中还可含有相应的溶剂或载体。
本发明克服了目前常用基因转染载体系统对抗原递呈细胞尤其是K562细胞转染率低、介导抗体表达水平低的缺陷，使抗原递呈细胞尤其是K562细胞在细胞膜上能稳定表达多种T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、第二信号膜结合型激活性抗体和细胞因子。因此，将获得的该转基因aAPC细胞与T细胞共同培养，能高效诱导T细胞增殖与活化，并产生中枢记忆T细胞，而且具有操作简单、成本低廉、稳定性、重复性以及安全性高等优点，具有广阔的临床应用前景。
下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：重组质粒pNB328-anti-CD3TM、pNB328-anti-CD28TM、pNB328-anti-
CD137TM与pNB328-IL15TM的构建。
按SEQ ID NO:1所示anti-CD3TM编码序列(轻链信号肽-antiCD3scFv-CD28Hinge-TM)，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-anti-CD3TM。
anti-CD3TM编码序列：
按SEQ ID NO:2所示anti-CD28TM编码序列(重链信号肽-antiCD28scFv-CD8Hinge-TM)，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-anti-CD28TM。
anti-CD28TM编码序列：
其中单划线表示信号肽，虚线表示CD28scFv，双下划线CD8胞外铰链区与跨膜区。
按SEQ ID NO:3所示anti-CD137TM编码序列(轻链信号肽-antiCD137scFv-CD8Hinge-TM)，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-anti-CD137TM。
anti-CD137TM编码序列：
按SEQ ID NO:4所示IL15TM编码序列(重链信号肽-IL15-linker-IL15R-CD8Hinge-TM)，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-IL15TM。
IL15TM编码序列：
pNB328-anti-CD3TM、pNB328-anti-CD28TM、pNB328-anti-CD137TM与pNB328-IL15TM的载体模式图见图1。
实施例2：人工抗原递呈K562细胞的制备
离心收集生长状态良好的K562细胞约6×105个，生理盐水洗涤一次。按照电转试剂盒步骤，先加入电转试剂100μl(82μl+18μl)，再同时加入质粒pNB328-anti-CD3TM、pNB328-anti-CD28TM、pNB328-anti-CD137TM与pNB328-IL15TM各1.5ug，重悬细胞。将细胞悬液加入电极杯并放入Lonza 2b-Nucleofector电转仪中，选定程序进行电击后，转移到六孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞健康生长后，将电转后的K562细胞离心计数，稀释成100个/10ml，将细胞悬液以100μl/孔加入96孔板中，使每孔只有一个细胞。每隔几天观察一次，去除非单细胞群的孔，待细胞长到一定数量，将其中单克隆孔细胞扩大培养，即获得表达抗CD3单链抗体、抗CD28单链抗体、CD137单链抗体和IL-15胞外功能区域的人工K562细胞，命名为sh3857细胞。
实施例3：sh3857细胞目的基因的PCR鉴定。
选取实施例2中四个单克隆细胞株进行扩大培养，提取细胞DNA，针对anti-CD3TM编码序列设计引物W337和W336(如SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6所示)、针对anti-CD28TM编码序列设计引物CD28RTR和CD28RTL(如SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8所示)、针对anti-CD137TM编码序列设计引物RT-CD137Scfv-R和RT-CD137Scfv-L(如SEQ ID NO:9与SEQ IDNO:10所示)、针对IL15TM编码序列设计引物RT-IL-15R和RT-IL-15L(如SEQ ID NO:11与SEQID NO:12所示)，PCR扩增鉴定。反应程序为:94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。结果发现，四个单克隆细胞株扩大培养后的细胞均能扩增出与anti-CD3TM、anti-CD28TM、anti-CD137TM和IL15TM大小一致的片段，具体结果见图2。
各引物序列如下所示：
W337：ACGCGTCGACTTATCAGCCGCTGCCCTTACTCCTCA(SEQ ID NO:5)；
W336：CCGGAATTCGCCACCATGGAAGCCCCAGCT(SEQ ID NO:6)；
CD28RTR：GCTTTCCCTGGTTTCTGCT(SEQ ID NO:7)；
CD28RTL：GTCTCCATCCTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:8)；
RT-CD137Scfv-R：GCTGCTGATGGTGAGAGTGA(SEQ ID NO:9)；
RT-CD137Scfv-L：TTACTGTGCGAGGGACTATGG(SEQ ID NO:10)；
RT-IL-15R：GCAGGGCTTCCTAAAACAGA(SEQ ID NO:11)；
RT-IL-15L：GCAACTGGGGTGAACATCA(SEQ ID NO:12)。
实施例4：sh3857细胞表面分子的流式检测
选取实施例2制备得到的sh3857细胞和对照K562细胞，计数后以1×106个细胞/管分别加入4个1.5ml的EP管中，分为两组，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min,弃上清；其中一组加入2μl CD3-FITC抗人抗体(购自Jackson ImmunoResearch公司)，另一组加入2μl CD28-FITC抗人抗体(购自Jackson ImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水将细胞转移至流式管中，上机检测。实验结果发现，相对于对照细胞，sh3857细胞表面具有CD3和CD28抗体分子，具体结果如图3所示。
保留验证成功的单克隆sh3857细胞，并扩增以备后用。
实施例5：sh3857细胞对外周血单核细胞来源的CTL细胞的扩增作用检测
采用临床血细胞分离机分离患者富集外周血PBMC。采用RPMI 1640培养基两倍稀释细胞悬液，加入淋巴细胞分离液密度梯度离心，用于初步纯化PBMC。将PBMC置于六孔板中，37℃、5％CO2培养箱贴壁孵育2-4小时。收集未贴壁细胞并进行冻存，为初始T细胞。孔中留下贴壁细胞，加入含rhGM-CSF(100ng/ml)、rhIL-4(100ng/ml)的2％FBS AIM-V培养基继续培养，记为第0天。第4天补加上述细胞因子；第6天加入携带多抗原基因的Ad5型腺病毒，负载DC；第7天加入促成熟因子poly1:C 1μl/ml、IFN-γ2μl/ml，刺激DC成熟。第8天收集成熟DC，并复苏初始T细胞，进行细胞计数，将DC与初始T细胞按1:10的比例共培养，并加入细胞因子IL-2(50IU/ml)，即可诱导产生特异性T细胞。
sh3857细胞诱导T细胞增殖实验：第12天收集经DC诱导的特异性T细胞，用CFSE染色，然后按sh3857：T细胞＝1:40的比例共培养，同时加入IL-2(50IU/ml)，对照组使用CD3-CD28珠(sh3857细胞预先用40Gyγ射线照射)，记为d0。分别于d2、d4、d6进行传代，并取部分实验组和对照组细胞进行流式检测CFSE荧光强度。传代时需补加sh3857或CD3-CD28珠以及IL-2。并从d0开始，实验组和对照组的细胞每两天进行计数。
结果如图4所示。实验组(加sh3857细胞)的特异性T细胞从从第2天开始增殖，细胞的荧光强度已经出现明显的减弱，特异性T细胞出现明显的增殖峰，第4天特异性T细胞的增殖趋势更加明显，第6天进入快速增长期，最多能扩增48倍；而对照组(加CD3-CD28珠)的特异性T细胞增殖较慢，最多只能扩增12倍，且第十二天以后细胞开始逐渐凋亡，说明与加入CD3-CD28珠刺激相比，sh3857细胞能更有效地刺激特异性T细胞扩增。
实施例6：sh3857细胞对TIL细胞的扩增作用检测
sh3857细胞诱导TIL细胞增殖实验：从肝癌患者手术切除后取回的样本中分离出TIL，CFSE染色，按SH3857：TIL细胞＝1:40的比例共培养，同时加入IL-2(50IU/ml)，对照组用CD3-CD28珠(sh3857预先用40Gyγ射线照射)，记为d0。第5天之后收集实验组与对照组TIL细胞，流式检测CFSE荧光强度。
结果如图5所示。加入sh3857细胞刺激后的T细胞荧光强度不断减弱，呈现不同的增殖峰，第8天进入快速增长期，最多能扩增54倍；而对照组(加CD3-CD28珠)的特异性T细胞增殖较慢，最多只能扩增13倍，且第十二天以后细胞开始逐渐凋亡，说明与加入CD3-CD28珠刺激相比，sh3857细胞能更有效地刺激TIL细胞扩增。
实施例7：经sh3857细胞刺激后的T细胞活化、记忆和抑制性表型的流式检测。
收集实施例5所述的实验组T细胞，计数后以1×106个细胞/管分别加入9个1.5ml的EP管中，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；其中两管分别加入检测活化T细胞表型的流式抗体anti-CD137-PE和anti-CD28-PE，有1管加入检测记忆T细胞表型的流式抗体anti-CD45RO-PECy5+anti-CCR7-FITC+anti-CD62L-PE，有3管分别加入检测抑制性T细胞表型的流式抗体anti-PD1-PE、anti-LAG3-Alexa Fluor 647和anti-TIM3-PE，另外3管分别加入同型对照流式抗体IgG1-PE、IgG1-PE+IgG2a-PECy5+IgG2a-PE和IgG1Alexa Fluor 647，每种抗体2μl(均购自Jackson ImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。
实验结果发现，经sh3857细胞刺激后的T细胞，CD137的阳性率达到81.7％，CD28的阳性率达到93.5％，而经CD3-CD28珠刺激后的T细胞，CD137的阳性率只有24.2％，CD28的阳性率只有62.7％(图6A)，说明sh3857细胞刺激特异性T细胞能更好的扩增，活化T细胞占有较大比例；同时，经sh3857细胞刺激后的T细胞流式检测极高表达CD45RO(91.1％)，而对照组刺激后的T细胞流式检测CD45RO的表达量为79.9％，说明实验组产生更多的记忆T细胞，可以快速产生更强的再次免疫应答。CCR7和CD62L(L-选择素)为中心记忆T细胞的标志，本实验中实验组CCR7和CD62L的表达量为11.5％，而对照组仅有7.2％(图6B)，说明存在一定量的中心记忆T细胞，当再遇肿瘤细胞，可以迅速发挥强效的免疫应答反应。
此外，经sh3857细胞刺激后的特异性T细胞流式检测抑制性T细胞表型PD1和TIM3的阳性率分别只有9.7％和34.3％(图7A)，而对照组用CD3-CD28珠刺激后的特异性T细胞流式检测抑制性T细胞表型PD1和TIM3的阳性率分别为18.1％和47.9％(图7B)，说明经sh3857细胞刺激后的特异性T细胞的状态更好，不容易衰老。
实施例8：经sh3857细胞和CD3-CD28珠分别刺激后的T细胞IFN-γ分泌情况的流式 检测
取实施例4所述的d12实验组T细胞和对照组T细胞6孔板中的各一孔，分别加入5μl的细胞刺激混合物，置于37℃、5％CO2孵箱中4-6h。按照细胞因子检测试剂盒说明书进行固定、破膜，分装于2个1.5ml的EP管中，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；分别加入2μl流式抗体IFN-γ-PE和IgG1-PE(同型对照)，轻弹沉淀使其混合均匀。室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水将细胞转移至流式管中，上机检测。
结果如图8所示。经sh3857刺激培养的T细胞中分泌IFN-γ的特异性T细胞占有一定比例(35.3％)，而经CD3-CD28珠刺激培养的T细胞中分泌IFN-γ的特异性T细胞占有较少的比例(18.8％)，说明经sh3857细胞扩增后的特异性T细胞具有更强杀伤肿瘤的能力。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 一种高效扩增全T细胞的人工抗原递呈细胞及其用途
<130> 174393
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> anti-CD3TM编码序列
<400> 1
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 120
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 180
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 240
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 300
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 360
gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctgtgacagt ctcctcaggt 420
ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcgggt cgcaaattgt tctcacccag 480
tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 540
tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 600
atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtccctgctc acttcagggg cagtgggtct 660
gggacctctt actctctcac aatcagcggc atggaggctg aagatgctgc cacttattac 720
tgccagcagt ggagtagtaa cccattcacg ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaataaac 780
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 840
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 900
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 960
tttattattt tctgggtgag gagtaag 987
<210> 2
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> anti-CD28TM编码序列
<400> 2
atggagtttt ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taaaaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ctggatacac cttcaccagc tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180
ggacaagggc ttgagtggat tggatgtatt tatcctggaa atgtcaatac taactataat 240
gagaagttca aggacagggc caccctgacc gtagacacgt ccatcagcac agcctacatg 300
gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt tctgtacaag atcacactac 360
ggcctcgact ggaacttcga tgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 420
ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcgggt cggacatcca gatgacccag 480
tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccatgccagt 540
caaaacattt atgtttggtt aaactggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 600
ctgatctata aggcttccaa cctgcacaca ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga 660
tctgggacag atttcactct caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac 720
tactgtcaac agggtcaaac ttatccgtac acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc 780
aaattcgtgc cggtcttcct gccagcgaag cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 840
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 900
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 960
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 1020
<210> 3
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> anti-CD137TM编码序列
<400> 3
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
caggtgcaac tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 120
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat acgccagtcc 180
ccagagaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatg gtggatacgt cacctacaat 240
ccgtccctcg agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 300
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtatatt actgtgcgag ggactatggt 360
ccggggaatt atgactggta cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc 420
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcgggtcgga aattgtgttg 480
acacagtctc cagccaccct gtctttgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgcagg 540
gccagtcaga gtgttagcag ctacttagcc tggtaccaac agaaacctgg ccaggctccc 600
aggctcctca tctatgatgc atccaacagg gccactggca tcccagccag gttcagtggc 660
agtgggtctg ggacagactt cactctcacc atcagcagcc tagagcctga agattttgca 720
gtttattact gtcagcagcg tagcaactgg cctccggcgc tcactttcgg cggagggacc 780
aaggtggaga tcaaattcgt gccggtcttc ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg 840
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 900
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 960
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 1020
accctttact gc 1032
<210> 4
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15TM编码序列
<400> 4
atggagtttt ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taaaaggtgt ccagtgtaac 60
tgggtgaatg taataagtga tttgaaaaaa attgaagatc ttattcaatc tatgcatatt 120
gatgctactt tatatacgga aagtgatgtt caccccagtt gcaaagtaac agcaatgaag 180
tgctttctct tggagttaca agttatttca cttgagtccg gagatgcaag tattcatgat 240
acagtagaaa atctgatcat cctagcaaac gacagtttgt cttctaatgg gaatgtaaca 300
gaatctggat gcaaagaatg tgaggaactg gaggaaaaaa atattaaaga atttttgcag 360
agttttgtac atattgtcca aatgttcatc aacacttctg gtggaggcgg ttcaggcgga 420
ggtggcagcg gcggtggcgg gtcgatcacg tgccctcccc ccatgtccgt ggaacacgca 480
gacatctggg tcaagagcta cagcttgtac tccagggagc ggtacatttg taactctggt 540
ttcaagcgta aagccggcac gtccagcctg acggagtgcg tgttgaacaa ggccacgaat 600
gtcgcccact ggacaacccc cagtctcaaa tgcattagag acggtggagg tggaggtgga 660
ggtggaggtt tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 720
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 780
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 840
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 900
tactgc 906
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
acgcgtcgac ttatcagccg ctgcccttac tcctca 36
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ccggaattcg ccaccatgga agccccagct 30
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 7
gctttccctg gtttctgct 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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gtctccatcc tccctgtctg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gctgctgatg gtgagagtga 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
ttactgtgcg agggactatg g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
gcagggcttc ctaaaacaga 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gcaactgggg tgaacatca 19
Claims (19)
1.一种转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转基因人工抗原递呈细胞：
（1）表达T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体和细胞因子；和/或
（2）基因组中稳定整合了含编码T细胞第一信号膜结合型激活性抗体、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体和细胞因子的表达框；
其中，所述T细胞第一信号膜结合型激活性抗体是抗CD3抗体；所述T细胞第二信号膜结合型激活性抗体是抗CD28抗体和抗CD137抗体；所述细胞因子是IL-15胞外结构域与IL15的α受体的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述表达框的两端均包含转座子的反向末端重复序列。
3.如权利要求2所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，
所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty；
所述转基因人工抗原递呈细胞选自树突状细胞、单核细胞和活化的B细胞。
4.如权利要求3所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转座子为piggybac。
5.如权利要求3所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转基因人工抗原递呈细胞为不表达人类MHC分子的细胞。
6.如权利要求3所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转基因人工抗原递呈细胞为K562细胞。
7.如权利要求1所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述抗CD3抗体为抗CD3单链抗体。
8.如权利要求1所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，
所述抗CD3抗体是抗CD3ε肽链的单链抗体；和/或
所述抗CD28抗体为抗CD28单链抗体，所述抗CD137抗体为抗CD137单链抗体。
9.如权利要求8所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，
所述抗CD3抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1第61-780位碱基序列所编码的氨基酸序列；
所述抗CD28单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2第58-783位碱基序列所编码的氨基酸序列；
所述抗CD137单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3第61-795位碱基序列所编码的氨基酸序列；和
所述IL-15的胞外结构域与其α受体的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4第58-669位碱基序列所编码的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述细胞转入了以下表达载体：
（1）含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制所述T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、所述T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD28胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；
（2）含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制所述T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、所述T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；和
（3）含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制所述细胞因子的编码序列表达的启动子、所述细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体。
11.如权利要求10所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，（2）所述表达载体包括两种表达载体，分别表达抗CD28抗体和抗CD137抗体。
12.一种组合物，所述组合物含有以下核酸构建体A、B和C：
核酸构建体A，用于T细胞第一信号膜结合型激活性抗体，含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞第一信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD28胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子；
核酸构建体B，用于表达T细胞第二信号膜结合型激活性抗体，含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞第二信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；和
核酸构建体C，用于表达细胞因子，含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制细胞因子的编码序列表达的启动子、细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；
其中，所述T细胞第一信号膜结合型激活性抗体是抗CD3抗体；所述T细胞第二信号膜结合型激活性抗体是抗CD28抗体和抗CD137抗体；所述细胞因子是IL-15胞外结构域与IL15的α受体的融合蛋白；
其中，所述核酸构建体B包括2种核酸构建体，其中一种表达抗CD28抗体，另一种表达抗CD137抗体。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，
所述核酸构建体为真核表达载体；
所述转座酶为来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座酶。
14.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，
所述核酸构建体A含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、EF1α启动子、抗CD3单链抗体的编码序列、CD28胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子；
所述核酸构建体B含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、EF1α启动子、抗CD28单链抗体的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子，以及所述核酸构建体B含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、EF1α启动子、抗CD137单链抗体的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子；和
所述核酸构建体C含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、EF1α启动子、IL15胞外结构域与IL15的α受体的融合蛋白的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，
所述抗CD3单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1第61-780位碱基序列所编码的氨基酸序列；
所述抗CD28单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2第58-783位碱基序列所编码的氨基酸序列；
所述抗CD137单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3第61-795位碱基序列所编码的氨基酸序列；和
所述IL-15的胞外结构域与其α受体的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4第58-669位碱基序列所编码的氨基酸序列。
16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述核酸构建体A含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述核酸构建体B包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；所述核酸构建体C含有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
17.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求12-16中任一项所述的组合物。
18.权利要求1-11中任一项所述的转基因人工抗原递呈细胞的用途，所述用途为：诱导T细胞增殖与活化，和/或产生中枢记忆T细胞，和/或刺激T细胞分泌IFN-γ，和/或提高特异性T细胞杀伤肿瘤的能力；其中，所述用途为非治疗目的的用途。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述T细胞包括外周血单核细胞来源的T淋巴细胞、肿瘤浸润T淋巴细胞和CAR-T细胞；所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。
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