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CN112143700B - 制备过表达外源基因的免疫效应细胞的方法 - Google Patents

制备过表达外源基因的免疫效应细胞的方法 Download PDF

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CN112143700B
CN112143700B CN201910560108.9A CN201910560108A CN112143700B CN 112143700 B CN112143700 B CN 112143700B CN 201910560108 A CN201910560108 A CN 201910560108A CN 112143700 B CN112143700 B CN 112143700B
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Abstract

本发明涉及制备过表达外源基因的免疫效应细胞的方法以及培养电转细胞的方法。本发明的方法包括使用含有PI3K抑制剂的培养基培养电转得到的细胞的步骤。采用本发明的方法能提升细胞电转后的阳性率和存活率。

Description

制备过表达外源基因的免疫效应细胞的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地涉及一种制备过表达外源基因细胞的方法。
背景技术
使用表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，如CAR-T细胞的过继性细胞治疗(Adoptive Cell Therapy，ACT)用于治疗肿瘤具有永久性改变肿瘤治疗现状的潜力。这类治疗依赖于高效、稳定和安全的基因转移平台。将编码嵌合抗原受体的合成的基因转入免疫效应细胞，如T细胞内，是实现肿瘤治疗的第一步。基因转移技术主要包括病毒方法与非病毒方法。病毒方法主要包括使用逆转录病毒载体或慢病毒载体来表达CAR基因，通过包装的病毒颗粒将CAR基因导入免疫效应细胞内，并通过逆转录病毒或慢病毒自身的整合系统整合至细胞基因组上。病毒载体系统的优点在于病毒颗粒能够有效地转导免疫效应细胞，如T细胞，并且高效稳定地整合到宿主细胞基因组中。但病毒的制备生产过程成本较高，费时费力，并且为了符合临床安全标准，利用病毒系统改造的免疫效应细胞中需要表现出病毒自身无复制、低基因毒性以及低免疫源性，在回输至人体内后还需要长期监控，存在着一定的安全隐患。
电转(或电穿孔)在医学的部分领域中已经是一种成熟的方法，但其在生物技术中的应用才刚刚显现。通过瞬时向细胞或组织施加一定的高电场脉冲，在细胞膜表面瞬时形成通透，进而导致带电荷的分子进入细胞。经典的电穿孔将导致细胞的跨膜运输增强，并改变电导率。这一过程在细胞膜上的效果与电转的强度、重复、持续时间和电脉冲次数有关。人工的双分子层、细胞或组织依其自身具体的属性已经能够被若干常用的电转操作程序所通透。在基于电穿孔的转基因操作中，外源DNA通过可逆的电穿孔被引入胞内，外源基因在其新的宿主细胞内表达，并随着细胞分裂而被遗传。用电转的方法结合能够诱导稳定表达转基因的非病毒基因修饰系统，如转座子系统，是病毒载体系统外的另一种修饰免疫效应细胞的有效方法。转座子系统，如Sleeping Beauty或PiggyBac转座系统，包含有转座酶编码序列，其编码的转座酶识别两侧的重复序列并能高效介导整合至宿主细胞基因组。转座子系统结合电转已经具有广泛治疗应用的前景，并完成了达到临床级别的要求(KebriaeiP,Huls H,Jena B,Munsell M,Jackson R,et al.(2012)Infusing CD19-Directed TCells to Augment Disease Control in Patients Undergoing AutologousHematopoietic Stem-Cell Transplantation for Advanced B-LymphoidMalignancies.Human Gene Therapy 23:444–450)，其在T细胞中具有较高的效率。使用转座子系统的ACT依赖于对T细胞与肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)的电转，对此，目前市场上已经有较为成熟的商业化电转仪器及配套缓冲液(例如Lonza Nucleofactor)，近期也有使用SB转座子系统通过商业化的电转体系成功地构建CAR-T细胞的方法的报道(Jin Z,Maiti S,Huls H,Singh H,Olivares S,et al.(2011)Thehyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the geneticmodification of T cells to express a chimeric antigen receptor.Gene Therapy18:849–856；Peng PD,Cohen CJ,Yang S,Hsu C,Jones S,et al.(2009)Efficientnonviral Sleeping Beauty transposon-based TCR gene transfer to peripheralblood lymphocytes confers antigen-specific antitumor reactivity.GeneTherapy16:1042–1049)，并且该利用SB转座子体系的ACT方法已经被用于临床试验(Kebriaei P,Huls H,Jena B,Munsell M,Jackson R,et al.(2012)Infusing CD19-Directed T Cells to Augment Disease Control in Patients Undergoing AutologousHematopoietic Stem-Cell Transplantation for Advanced B-LymphoidMalignancies.Human Gene Therapy 23:444–450)。
磷脂酰肌醇3’激酶(Phosphatidyl Inositol 3’Kinase，PI3K)信号通路应答于白细胞表面表达的多种受体的激活，并负责天然免疫与获得性免疫应答。PI3K可以被TCR、共刺激受体、Fc受体、黏着分子、Toll样受体(TLR)和细胞因子受体以及化学引诱物(chemoattractant)受体如C5a、fMLP、趋化因子和S1P等激活。在T细胞中，PI3K是TCR信号通路诱导的激活所必需的，特别是当抗原亲和力不够高或共刺激信号较弱时(Okkenhaug K,Bilancio A,Emery JL,Vanhaesebroeck B.Phosphoinositide 3-kinase in T cellactivation and survival.Biochem Soc Trans.2004Apr；32(Pt 2):332-5.)。WO2015188119A1中记载了使用PI3K抑制剂(MK2206、ZSTK474)处理CAR-T细胞能够提高病毒载体法制备的CAR-T细胞表面CD62L的表达、提升CAR-T细胞的治疗活性并提升CAR-T细胞的持久性。但目前尚缺乏能够提升电转T细胞后提升阳性率和存活率的有效方法。
发明内容
本发明提供一种培养电转细胞的方法，所述方法包括使用含有PI3K抑制剂的培养基培养电转得到的细胞的步骤。
本发明还提供一种电转法制备表达外源基因的细胞的方法，所述方法包括通过电转向细胞中导入含有表达外源基因的核酸，然后用含有PI3K抑制剂的培养基培养电转了外源基因的细胞的步骤。
本发明还提供细胞培养基，所述细胞培养基添加PI3K抑制剂。
本发明还提供PI3K抑制剂在制备用于培养电转后的免疫效应细胞的培养基中的用途，在提高免疫效应细胞电转后的阳性率和存活率的用途，或在制备提升免疫效应细胞电转后的阳性率和存活率的试剂或培养基中的用途。
在本发明所述的方法、培养基和用途的一个或多个实施方案中，培养基中所述PI3K抑制剂的终浓度为0.01-5μM，优选地为0.0625-4μM、更优选地为0.25-1μM。
在本发明所述的方法、培养基和用途的一个或多个实施方案中，电转结束后，将电转的细胞转入培养基中培养0.5-5小时，优选地培养3小时，然后在所述培养基中加入所述PI3K抑制剂进行培养。
在本发明所述的方法、培养基和用途的一个或多个实施方案中，免疫效应细胞选自T细胞、TIL、NK细胞、NK T细胞、CAR-T细胞、CIK细胞、TCR-T细胞和巨噬细胞中的一种或多种；优选选自T细胞、TIL和CAR-T细胞中的一种或多种。
在本发明所述的方法、培养基和用途的一个或多个实施方案中，培养基为细胞培养基，优选为用于培养免疫效应细胞的培养基；优选选自 CTSTM无血清细胞培养基、DMEM培养基和RPMI1640培养基；更优选为CTSTM无血清细胞培养基。
在本发明所述的方法、培养基和用途的一个或多个实施方案中，培养电转的细胞0.5-5h后在所述培养基中加入所述PI3K抑制剂。
在本发明所述的方法、培养基和用途的一个或多个实施方案中，所述PI3K抑制剂选自具有下式(I)所示结构的化合物：
式中，X为N；
R1和R2各自独立选自H、C1-4烷基、卤素、氨基、C1-4烷氧基和OH；
R3为H、氨基和任选被OH或1-3个卤素取代的C1-4烷基；
R4和R5各自独立选自H和C1-4烷基；和
R6为任选被1或2个C1-4烷基取代的吗啉代。
在本发明所述的方法、培养基和用途的一个或多个实施方案中，所述PI3K抑制剂具有下式所示的结构：
在一个或多个实施方案中，本发明特别提供一种细胞培养基，其为添加了终浓度为0.01-5μM、优选地为0.0625-4μM、更优选地为0.25-1μM的PI3K抑制剂的CTSTM无血清细胞培养基；其中，所述PI3K抑制剂选自具有下式(I)所示结构的化合物：
式中，X为N；
R1和R2各自独立选自H、C1-4烷基、卤素、氨基、C1-4烷氧基和OH；
R3为H、氨基和任选被OH或1-3个卤素取代的C1-4烷基；
R4和R5各自独立选自H和C1-4烷基；和
R6为任选被1或2个C1-4烷基取代的吗啉代；
优选地，所述PI3K抑制剂具有下式所示的结构：
附图说明
图1a-1e：PBMC解冻后立即电转pNB328-meso3CAR后分别加入终浓度0μM(图1a)、0.0625μM(图1b)、0.25μM(图1c)、1μM(图1d)和4μM(图1e)的ZSTK474，并培养12天的细胞中的活细胞比例与阳性CAR-T细胞的比例。
图2：PBMC解冻后立即电转pNB328-meso3CAR后加入不同终浓度的ZSTK474的各组细胞在培养7天、10天、12天和14天的活细胞数。
图3：PBMC解冻后立即电转pNB328-meso3CAR的各组细胞中的CD4+、CD8+与CD62L+的百分比。
图4a-4f：PBMC解冻后培养3天再电转pNB328-meso3CAR后分别加入终浓度0μM(图4a)、0.0156μM(图4b)、0.0625μM(图4c)、0.25μM(图4d)、1μM(图4e)和4μM(图4f)的ZSTK474，并培养12天的细胞中的活细胞比例与阳性CAR-T细胞的比例。
图5：PBMC解冻后培养3天再电转pNB328-meso3CAR后加入不同终浓度ZSTK474的各组细胞在培养7天、10天、12天和14天的活细胞数。
图6：PBMC解冻后培养3天再电转pNB328-meso3CAR的各组细胞中的CD4+、CD8+与CD62L+的百分比。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明发现，细胞尤其是免疫效应细胞电转结束转入培养基中培养的过程中，加入PI3K抑制剂进行培养能明显提高细胞电转后的阳性率和存活率，由此完成本发明。
本文中，细胞可以是任何感兴趣的细胞，尤其是本领域常规用于电转、以表达外源基因的细胞，可以是真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(如大肠杆菌和其他细菌等)。例如，细胞可以是人的细胞。细胞的例子包括但不限于HEK293细胞、MDCK细胞和Hela细胞等。在某些实施方案中，细胞是免疫细胞，如免疫效应细胞。本文中，免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞等；免疫效应细胞指在免疫应答中参与清除异物抗原和行使效应功能的免疫细胞，包括但不限于T细胞、TIL细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR-T细胞、CIK细胞、TCR-T细胞和巨噬细胞中的一种或多种。优选地，在某些实施方案中，适用于本发明方法的免疫效应细胞选自T细胞、TIL和CAR-T细胞中的一种或多种。
本文中，PI3K抑制剂指结合并抑制PI3K的至少一种活性的核酸、肽、化合物或小的有机分子。可将PI3K蛋白分为三类：1类PI3K、2类PI3K和3类PI3K。1类PI3K以异二聚体的形式存在，所述异二聚体由四个p110催化亚基(p110α、p110β、p110δ和p110γ)之一和两个调节亚基家族之一组成。本发明的PI3K抑制剂优选靶向1类PI3K抑制剂。在一些实施方案中，PI3K抑制剂显示出针对1类PI3K抑制剂的一种或多种同种型的选择性，即，针对p110α、p110β、p110δ和p110γ或者p110α、p110β、p110δ和p110γ中的一种或多种的选择性。在另外一些实施方案中，PI3K抑制剂不呈现同种型选择性并且被认为是“pan-PI3K抑制剂”。在一些实施方案中，PI3K抑制剂将与ATP竞争结合PI3K的催化结构域。
在具体实施方案中，示例性的PI3K抑制剂抑制PI3K，其中IC50为约200nM以下、优选约100nm以下、更优选约60nM以下。更具体而言，PI3K抑制剂抑制PI3K的IC50可为约2nM至约100nm，更优选约2nM至约50nM，更优选约2nM至约15nM。
适合用于本文所述方法PI3K抑制剂的示例性实例包括但不限于，BKM120(1类PI3K抑制剂，诺华)、XL147(1类PI3K抑制剂，Exelixis)、(pan-PI3K抑制剂，GlaxoSmithKline)和PX-866(1类PI3K抑制剂；p110α、p110β和p110γ同种型，Oncothyreon)。其它示例性实例包括但不限于BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101、MK2206、ZSTK474和IPI-145。pan-PI3K抑制剂的其它示例性实例包括但不限于BEZ235、LY294002、GSK1059615和GDC-0941。在某些实施方案中，适用于本发明的PI3K抑制剂如CN104230831A所述，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。
在其他实施方案中，适用于本发明的PI3K抑制剂如CN101137382A所述，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。更优选地，本发明的PI3K抑制剂具有下式I所示的结构：
式中，X为N；
R1和R2各自独立选自H、C1-4烷基、卤素、氨基、C1-4烷氧基和OH；
R3为H、氨基和任选被OH或1-3个卤素取代的C1-4烷基；
R4和R5各自独立选自H和C1-4烷基；和
R6为任选被1或2个C1-4烷基取代的吗啉代(morpholino)。
在特别优选的实施方案中，PI3K抑制剂为ZSTK474，其结构式如下所示：
电转也称为电穿孔，用于将感兴趣的DNA导入宿主细胞中。可采用本领域周知的各种电转方法和电转试剂来实施本发明，例如，可使用LONZAI Device及其提供的电转试剂。可先按照市售电转试剂的说明书配制电转液，加入电转质粒。电转时，用含电转质粒的电转液重悬细胞，在电转仪器中进行电转。
电转质粒可以是任何感兴趣的质粒，尤其是表达嵌合抗原受体(CAR)的质粒。在本发明的一些实施方案中，电转质粒是基于PB转座子系统的载体，其含有感兴趣嵌合抗原受体的编码序列。电转质粒的量可以是本领域常规的量，例如每5×106个细胞使用3-8ug的质粒进行电转。
电转结束后，取出细胞悬液，加入预热的细胞培养基，然后在常规的条件下(如37℃、5％CO2)培养。至少培养0.5小时后，将PI3K抑制剂加入含电转细胞的该细胞培养基中。过早或过晚加入PI3K抑制剂都可能无法提高电转细胞的总数量和存活率。因此，优选的是，在培养了电转细胞8小时以内、更优选5小时以内、更优选3小时以内在培养基中加入PI3K抑制剂。例如，在某些特别优选的实施方案中，培养了电转细胞0.5-3h时加入PI3K抑制剂，优选在培养了45min到2h时加入PI3K抑制剂，更优选在培养了1-2小时时加入PI3K抑制剂。
通常，加入后培养基中PI3K抑制剂的终浓度在0.01-5μM的范围内。在优选的实施方案中，PI3K抑制剂的终浓度在0.0625-4μM的范围内，或者在0.25-1μM的范围内。
本文中，细胞培养基可以是各种适合于细胞(尤其是免疫细胞)培养的培养基，尤其是本领域常规用于培养各种电转的细胞的培养基。在某些实施方案中，所述培养基是用于培养免疫细胞的培养基，包括但不限于用于培养T细胞、TIL细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR-T细胞、CIK细胞、TCR-T细胞和巨噬细胞中的一种或多种的培养基。在某些实施方案中，所述培养基是T细胞、TIL和/或CAR-T细胞的培养基，尤其是培养电转的T细胞、TIL和/或CAR-T细胞的培养基。示例性的培养基包括但不限于CTSTM无血清细胞培养基、DMEM培养基和RPMI1640培养基中的任一种；优选地，为CTSTM无血清细胞培养基。
按照常规的培养工艺培养电转细胞后，与本领域常规的电转法相比，添加了PI3K抑制剂进行的培养能明显提高电转细胞的细胞总数和/或存活率。
因此，本发明提供一种培养电转的细胞(尤其是免疫效应细胞)的方法，所述方法包括在电转结束后，将电转的细胞转入培养基中培养了0.5-8h时，在培养基中加入本文所述的任意一种或多种PI3K抑制剂，继续进行培养。优选地，在培养基中培养了0.5-5h、0.5-3h、0.5-2h或1-2h时，加入PI3K抑制剂进行培养。
在某些实施方案中，本发明提供一种电转法制备表达外源基因的细胞(尤其是免疫效应细胞)的方法，该方法包括：
1)通过电转向细胞中导入含有表达外源基因的核酸；
2)用含有PI3K抑制剂的培养基培养1)中电转了外源基因的细胞；
优选地，其中，电转结束后在培养电转的细胞0.5-8h时、优选0.5-5h、更优选0.5-3h、更优选0.5-2h、更优选1-2h时加入PI3K抑制剂。
本发明也提供PI3K抑制剂(优选是本文所述的任意一种或多种PI3K抑制剂，更优选是上述式I所示的PI3K抑制剂，更优选是ZSTK474)在培养电转的细胞(尤其是免疫效应细胞)中的应用。
本发明还提供一种细胞培养基，该细胞培养基含有PI3K抑制剂。优选地，该细胞培养基是免疫效应细胞的培养基。因此，在某些实施方案中，本发明的细胞培养基是添加了PI3K抑制剂的用于培养免疫效应细胞的培养基，如常规用于培养T细胞、TIL细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR-T细胞、CIK细胞、TCR-T细胞和巨噬细胞中的一种或多种，尤其是常规用于培养T细胞、TIL细胞和/或CAR-T细胞的培养基。更优选地，该培养基是常规用于培养电转的免疫效应细胞的培养基。在这类培养基中添加PI3K抑制剂，用于培养电转后的免疫效应细胞，可明显提高细胞的总数和存活率。优选地，该培养基中PI3K抑制剂的终浓度在0.01-5μM的范围内，优选PI3K抑制剂的终浓度在0.0625-4μM的范围内，或者在0.25-1μM的范围内。
本发明示例性的免疫效应细胞培养基为含有PI3K抑制剂的CTSTM无血清细胞培养基、DMEM培养基或RPMI1640培养基；优选为含有PI3K抑制剂的CTSTM无血清细胞培养基；更优选为含有本文所述终浓度的PI3K抑制剂的CTSTM无血清细胞培养基；更优选为含有本文式(I)所述PI3K抑制剂中的一种或多种，尤其是含有ZSTK474的，终浓度在本文所述范围内的CTSTM无血清细胞培养基。
本发明的有益效果在于，通过使用含有PI3K抑制剂的培养基对电转后的细胞、尤其是免疫效应细胞进行培养，能够明显地降低电转后细胞的死亡率，提高细胞电转后的活细胞数量与活细胞比例。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中使用到的电转仪为购自Lonza的LONZANucleofectorTM2b。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，或按照商品说明书选择。实施例中使用到的其它方法和试剂为本领域常规的方法和试剂。未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
本发明以下实施例中所用到的T细胞均分离自成年健康供体受试者外周血。
本发明实施例中所使用的间皮素抗原为间皮素结构域III，制备方法如下：
合成序列为SEQ ID NO:1的编码包含轻链信号肽-Meso3-Fc融合蛋白DNA片段，Fc为IgG4Fc，轻链信号肽旨在使得Meso3-Fc融合蛋白能够被有效分泌到真核细胞外，方便后续纯化。在SEQ ID NO:1所示DNA序列的5’端与3’端分别连接EcoRI与XbaI的酶切位点接头后，连接到pCDNA3.4载体(常规载体，市售可得)上，构建得到过表达Meso3-Fc融合蛋白的表达载体。根据ExpiCHOTM表达系统说明书，使用ExpiCHOTM表达系统对上述融合蛋白进行过表达后，使用GE Healthcare的MabSelect亲和层析树脂按说明书操作步骤对表达产物进行纯化，即制得纯化的Meso3-Fc融合蛋白。
所获得的纯化的Meso3-Fc按本领域常规的方法在避光条件下和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行反应，反应产物经过纯水透析后获得Meso3-Fc的生物素偶联物。
本发明所使用的PI3K抑制剂ZSTK474购自abcam(货号：ab146194)。
实施例1：重组载体pNB328-meso3CAR的构建
人工合成meso3CAR的编码序列(SEQ ID NO:2)，将其装入基于PB转座子系统的载体pNB328的EcoRI和SalI酶切位点之间(pNB328的结构及序列参见CN201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)，构建的重组表达载体命名为pNB328-meso3CAR，所述Meso3CAR从5’LTR至3’LTR依次为CD8信号肽、Meso3scFv、CD8铰链区、CD8跨膜、CD28胞内结构域和CD3ζ。启动子序列和polyA加尾信号序列分别位于5’LTR和CD8信号肽序列之间以及CD3ζ和3’LTR之间。
实施例2：PBMC的制备
1)取50mL离心管，加17.5mL生理盐水，再加17.5mL血样，血样采集自健康成年人。
2)取另一支50mL离心管(内有15mL Ficoll淋巴细胞分离液)缓慢沿管壁加入1)中的血液和生理盐水混合液，然后800g，20min，升降速为1离心。
3)吸白色细胞层至另一支50mL离心管中，并加生理盐水，离心清洗1500r/min，10min，升降速9。
4)倒掉废液，不倒尽，加生理盐水，再次清洗，离心(同上)。
5)倒尽废液，加培液悬浮细胞，并加进培养瓶中。
6)贴壁2小时或过夜，用移液管轻吹，收细胞，计数，离心。如此，贴壁细胞基本为单核细胞，悬浮的基本为淋巴细胞。
7)冻存悬浮细胞，1支1×107。
实施例3：复苏后的T细胞电转制备表达MesoCAR的CAR-T细胞(MesoCAR-T)
按以下步骤电转T细胞，制备MesoCAR-T细胞：
1)实验前一天进行6孔板的抗体+抗原包被，抗原为终浓度5μg/mL的Meso3-Fc融合蛋白；抗体为终浓度5μg/mL的抗CD28抗体，4℃冰箱放置过夜。
2)AIM-V培养基37℃预热，DPBS清洗包被过夜的6孔板，清洗两次，每孔加入含有250U/mL的1mL预热的AIM-V培养基，待用；
3)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：
100μL NucleocuvetteTMStrip(μL)
NucleofectorTM溶液的体积 82
电转补充溶液 18
4)取实施例2制备并冻存的细胞，37℃化冻后立即加入含有预热AIM-V培养基的15mL离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，随后用含有2％FBS的AIM-V培养基重悬细胞，置于T-25培养瓶中37℃放置30min，收集细胞，1200rpm离心5min，重悬后计数，将细胞分为5管，每管5×106个细胞，重复离心后弃上清，生理盐水洗涤一次，重复离心后尽可能将上清洗干净。
5)向2)中配置好的电转液中按每100μL加入6μg质粒pNB328B-meso3CAR的比例进行配制，随后室温静置30min以内；
6)用5)中配置好的含质粒的电转液重悬4)中的T细胞，每管加入电转液100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA NucleofectorTM2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择U-014；
7)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至2)中含有预热AIM-V培养基的6孔板中，加入IL-2至终浓度250IU/mL，将6孔板放置到37℃、5％CO2培养箱中培养；
8)将7)中的含有电转后细胞的5个孔分为5组，每组1个孔，在37℃、5％CO2培养箱中培养3h后，向各组的孔中分别加入ZSTK474至终浓度分别为0μM、0.0625μM、0.25μM、1μM和4μM；0μM组为对照组，随后继续培养5d，分别转移至T-25培养瓶中，每个浓度组分4瓶，分别各自继续培养至7天、10天、12天和14天。对各组中的细胞通过台盼蓝染色进行活细胞计数，并对各组中电转后培养12天的细胞通过流式细胞仪分别进行阳性CAR-T细胞计数，具体步骤为：分别取5×105细胞置于1.5mL EP管中，200g离心5min，DPBS洗涤1次，重复离心后弃上清，加入100μL的DPBS重悬细胞，加入2μL间皮素抗原(即上述Meso3-Fc的生物素偶联物)4℃避光孵育30min，DPBS洗涤2次，200g离心5min，加入100ul的DPBS重悬细胞后，加入1μL的PEstreptavidin(货号554061，BD)，4℃避光孵育30min，DPBS洗涤一次，离心后弃上清，加入500μL的PBS，转移至流式管中进行流式检测)和进行CD4+、CD8+与CD62L+T细胞计数。CD4+、CD8+与CD62L+T细胞计数包括以下步骤：将CD4、CD8与CD62L的抗体(CD4抗体为CD4-FITC(货号555346，BD)，CD8抗体为CD8-APC-CyTM7(货号557760，BD)，CD62L抗体为CD62L-PE(货号560966，BD))与细胞避光孵育30分钟，孵育后再次用PBS洗涤后流式细胞仪检测CD4+、CD8+与CD62L+的细胞数。结果如图1-3所示。
图1a-1e分别为电转后分别加入0μM、0.0625μM、0.25μM、1μM和4μM的ZSTK474并培养12天后的细胞中的活细胞比例与阳性CAR-T细胞的比例。与0μM对照组相比，其他4个加入不同终浓度ZSTK474的实验组的阳性CAR-T细胞比例均在95％左右，明显高于0μM对照组的81.09％。活细胞的比例0.0625μM与0.25μM组的细胞分别为91.23％与90.75％，略高于或基本等于0μM对照组中90.65％；1μM和4μM组的活细胞的比例略低于0μM对照组，也都超过80％。
图2显示电转后加入不同浓度ZSTK474的各组细胞在培养7天、10天、12天和14天的活细胞数。图2结果表明，随着培养时间的延长，活细胞的数量逐渐增多，到第14天时活细胞的数量达到最大。在不同浓度ZSTK474的各组中，加入ZSTK474至终浓度为0.25μM时电转后培养至14天能够获得最大数量的活细胞。0.0625μM、1μM和4μM组条件下电转培养14天所获得的活细胞数略低于0.25μM，但均显著高于0μM对照组的活细胞数。
图3结果显示了各组细胞中的CD4+、CD8+与CD62L+的百分比。总体上，随着ZSTK474终浓度的提升，CD4+T细胞与CD4+CD62L+T细胞的比例均呈逐步上升的趋势；CD8+T细胞与CD8+CD62L+T细胞均呈逐步下降趋势。
图1-3的结果表明，电转后加入适量ZSTK474进行培养的CAR-T细胞在活细胞数量和CAR-T细胞阳性率上都有明显的提升，CD4+T细胞与CD4+CD62L+T细胞的百分比上升，而CD8+T细胞与CD8+CD62L+T细胞的百分比下降。
实施例4：复苏后扩增3天的T细胞电转制备表达MesoCAR的CAR-T细胞
1)细胞培养前一天进行6孔板的抗体+抗原包被，抗原为终浓度5μg/mL的Meso3-Fc融合蛋白；抗体为终浓度为5μg/mL的抗CD28抗体，4℃冰箱放置过夜。
2)AIM-V培养基37℃预热，DPBS清洗包被过夜的6孔板，清洗两次，每孔加入含有250U/mL的1mL预热的AIM-V培养基，待用。
3)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：
100μL NucleocuvetteTMStrip(μL)
NucleofectorTM溶液的体积 82
电转补充溶液 18
4)取实施例2制备并冻存的细胞，37℃化冻后用AIM-V培养基培养3天，然后加入含有预热AIM-V培养基的15mL离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，随后用含有2％FBS的AIM-V培养基重悬细胞，置于T-25培养瓶中37℃放置30min，收集细胞，1200rpm离心5min，重悬后计数，将细胞分为6管，每管5×106个细胞，重复离心后弃上清，生理盐水洗涤一次，重复离心后尽可能将上去除干净。
5)向2)中配置好的电转液中按每100μL加入质粒pNB328B-meso3CAR6μg的比例进行配制，随后室温静置30min以内。
6)用5)中配置好的含质粒的电转液重悬4)中的T细胞，每管加入电转液100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA NucleofectorTM2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择U-014。
7)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至2)中含有预热的AIM-V培养基的孔中，加入IL-2至终浓度250IU/mL，将6孔板放置到37℃、5％CO2培养箱中培养。
将7)中的含有电转后细胞的6个孔分为6组，每组1个孔，在培养3h的时间后，向各组的孔中分别加入ZSTK474至终浓度分别为0μM、0.0156μM、0.0625μM、0.25μM、1μM和4μM；0μM组为对照组，随后继续培养5天，分别转移至T-25培养瓶中，每个浓度组分4瓶，分别各自继续培养至7天、10天、12天和14天。对各组中的细胞通过台盼蓝染色进行活细胞计数，并对各组中电转后培养12天的细胞通过流式细胞仪分别进行阳性CAR-T细胞计数，具体步骤为：分别取5×105细胞置于1.5mL EP管中，200g离心5min，DPBS洗涤1次，重复离心后弃上清，加入100μL的DPBS重悬细胞，加入2μL间皮素抗原(即上述Meso3-Fc的生物素偶联物)4℃避光孵育30min，DPBS洗涤2次，200g离心5min，加入100ul的DPBS重悬细胞后，加入1μL的PEstreptavidin(货号554061，BD)，4℃避光孵育30min，DPBS洗涤一次，离心后弃上清，加入500μL的PBS，转移至流式管中进行流式检测)和进行CD4+、CD8+与CD62L+T细胞计数。CD4+、CD8+与CD62L+T细胞计数包括以下步骤：将CD4、CD8与CD62L的抗体(CD4抗体为CD4-FITC(货号555346，BD)，CD8抗体为CD8-APC-CyTM7(货号557760，BD)，CD62L抗体为CD62L-PE(货号560966，BD))与细胞避光孵育30分钟，孵育后再次用PBS洗涤后流式细胞仪检测CD4+、CD8+与CD62L+的细胞数。结果如图4-6所示。
图4a-4f分别为电转后分别加入0μM、0.0156μM、0.0625μM、0.25μM、1μM和4μM的ZSTK474并培养12天的细胞中的活细胞比例与阳性CAR-T细胞的比例。与0μM对照组相比，其他5个加入不同终浓度ZSTK474的实验组的阳性CAR-T细胞比例均显著增高，其中1μM组的CAR-T细胞阳性率高达87.92％，是对照组阳性率的2倍。活细胞的比例各实验组维持在90％左右，与0μM对照组的89.23％相比无明显改变。
图5显示电转后加入不同浓度ZSTK474的各组细胞在培养7天、10天、12天和14天的活细胞数。图5结果表明，各组中培养到电转后随着培养时间的延长，活细胞的数量逐渐增多，到第14天时活细胞的数量达到最大。在不同浓度ZSTK474的各组中，加入ZSTK474至终浓度为0.0625μM时电转后培养至14天能够获得最大数量的活细胞。0.25μM和1μM组条件下电转培养14天所获得的活细胞数略低于0.0625μM，但均显著高于0μM对照组的活细胞数。
图6结果显示了各组细胞中的CD4+、CD8+与CD62L+的百分比。总体上，随着ZSTK474终浓度的提升，CD4+T细胞与CD4+CD62L+T细胞的比例均呈逐步下降的趋势；CD8+T细胞与CD8+CD62L+T细胞均呈逐步上升趋势。
图4-6的结果表明，电转后加入适量ZSTK474进行培养的CAR-T细胞在活细胞数量和CAR-T细胞阳性率上都能有明显的提升，CD4+T细胞与CD4+CD62L+T细胞的百分比均下降，而CD8+T细胞与CD8+CD62L+T细胞的百分比均上升。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
<120> 制备过表达外源基因的免疫效应细胞的方法
<130> 194165
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
aacgggtccg aatacttcgt gaagatccag tccttcctgg gtggggcccc cacggaggat 120
ttgaaggcgc tcagtcagca gaatgtgagc atggacttgg ccacgttcat gaagctgcgg 180
acggatgcgg tgctgccgtt gactgtggct gaggtgcaga aacttctggg accccacgtg 240
gagggcctga aggcggagga gcggcaccgc ccggtgcggg actggatcct acggcagcgg 300
caggacgacc tggacacgct ggggctgggg ctacagggcg gcatccccaa cggctacctg 360
gtcctagacc tcagcatgca agaggccctc tcggagtcca aatatggtcc cccatgccca 420
ccatgcccag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 480
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 540
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 600
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 660
caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 720
cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa tga 753
<210> 2
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga gtccggggga ggcctggtcc agcctggggg atccctgaga 120
ctctcctgcg cagcctctgg attcgacctc ggtttctact tttacgcctg ttgggtccgc 180
caggctccag ggaagggcct ggagtgggtc tcatgcattt atactgctgg tagtggtagc 240
acgtactacg cgagctgggc gaaaggccga ttcaccatct ccagagacaa ttcgaagaac 300
acgctgtatc tgcaaatgaa cagtctgaga gccgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg 360
agatctactg ctaatactag aagtacttat tatcttaact tgtggggcca aggcaccctg 420
gtcaccgtct cctcaggcgg aggcggatca ggtggtggcg gatctggagg tggcggaagc 480
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 540
atcacttgcc aggccagtca gaggattagt agttacttat cctggtatca gcagaaacca 600
gggaaagttc ccaagctcct gatctatggt gcatccactc tggcatctgg ggtcccctcg 660
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 720
gaagatgttg ccacttacta ctgtcagagt tatgcttatt ttgatagtaa taattggcat 780
gctttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaaaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 840
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 900
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 960
gcgcccctgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 1020
aaacggggca gaaagaagct cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1080
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1140
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1200
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1260
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1320
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1380
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1440
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctga 1485

Claims (16)

1.一种培养电转细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使用含有PI3K抑制剂的培养基培养电转得到的细胞的步骤；其中，
培养基中所述PI3K抑制剂的终浓度为0.01-5μM；和
所述PI3K抑制剂为ZSTK474，其结构式如下所示：
；和
所述培养基为细胞培养基；和
所述细胞为T细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PI3K抑制剂的终浓度为0.0625-4μM。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PI3K抑制剂的终浓度为0.25-1μM。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括，电转结束后，将电转的细胞转入培养基中培养0.5-5小时，然后在所述培养基中加入所述PI3K抑制剂进行培养。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，电转结束后，将电转的细胞转入培养基中培养3小时，然后在所述培养基中加入所述PI3K抑制剂进行培养。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基为用于培养免疫效应细胞的培养基。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养基选自GIBCO® AIM-V® CTS™无血清细胞培养基、DMEM培养基和RPMI1640培养基中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基为GIBCO® AIM-V® CTS™无血清细胞培养基。
9.一种电转法制备表达外源基因的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
1）通过电转向细胞中导入含有表达外源基因的核酸；
2）用含有PI3K抑制剂的培养基培养步骤1）中电转了外源基因的细胞；其中，
培养基中所述PI3K抑制剂的终浓度为0.01-5μM；和
所述PI3K抑制剂为ZSTK474，其结构式如下所示：
；和
所述培养基为细胞培养基；和
所述细胞为T细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，培养电转的细胞0.5-5h后在所述培养基中加入所述PI3K抑制剂。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，培养电转的细胞3h后在所述培养基中加入所述PI3K抑制剂。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，PI3K抑制剂在培养基中的终浓度为0.0625-4μM。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，PI3K抑制剂在培养基中的终浓度为0.25-1μM。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养基为用于培养免疫效应细胞的培养基。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述培养基选自GIBCO® AIM-V® CTS™无血清细胞培养基、DMEM培养基和RPMI1640培养基。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述培养基为GIBCO®AIM-V® CTS™无血清细胞培养基。
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