CN109337872B

CN109337872B - 高效扩增car-t细胞的人工抗原递呈细胞及其用途

Info

Publication number: CN109337872B
Application number: CN201710623858.7A
Authority: CN
Inventors: 钱其军; 金华君; 游素梅; 江芏青; 孙娟娟; 李林芳
Original assignee: Shanghai Cell Therapy Research Institute; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Cell Therapy Research Institute; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2017-07-27
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2037-07-27
Also published as: CN109337872A; WO2019020089A1

Abstract

本发明涉及高效扩增CAR‑T细胞的人工抗原递呈细胞及其用途。具体而言，本申请的人工抗原递呈细胞(1)表达T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目标抗原和细胞因子；和/或(2)基因组中稳定整合了含编码T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目的抗原和细胞因子的表达框；优选地，所述表达框的两端均包含转座子的反向末端重复序列。本发明的人工抗原递呈细胞能够诱导CAR‑T细胞增殖与活化，产生中枢记忆CAR‑T细胞，刺激CAR‑T细胞分泌IFN‑γ，并提高特异性CAR‑T细胞杀伤肿瘤的能力。

Description

高效扩增CAR-T细胞的人工抗原递呈细胞及其用途

技术领域

本发明属于细胞生物学、肿瘤免疫学和肿瘤免疫治疗领域，涉及一种高效扩增CAR-T细胞的人工抗原递呈细胞及其用途。

背景技术

目前，利用嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修饰的T细胞治疗技术(CAR-T)已经成为非常热门的一种过继性T细胞治疗技术。CAR是将识别肿瘤相关抗原(TAA)的单链抗体与胞内信号域，通过铰链区相连构成的嵌合基因。将CAR基因通过基因转导/转染的技术导入患者T细胞后，使其表达CAR基因，获得的CAR-T细胞具有识别并攻击表达相应细胞表面TAA的肿瘤细胞的能力。

利用过继性T细胞治疗晚期癌症患者，能产生积极地临床相关抗肿瘤反应。最近的临床研究表明，anti-CD19CAR-T细胞可有效的治疗非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴瘤。Anti-CD16可用来治疗骨髓单核细胞白血病。此外，过继性转移CAR-T细胞也可用于其它恶性肿瘤的治疗。已知的，在实体瘤中，表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(her2)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、间皮素(mesothelin)、MUC1和IL-13Ra2等都可作为CAR-T细胞的靶抗原。其中CD19抗原广泛存在于血液性肿瘤中，EGFR和mesothelin抗原广泛存在于实体瘤中，对于这三种CAR-T细胞的研究非常普遍，有些已取得较好的效果。

然而，如何在体外扩增足够数量的肿瘤特异性CAR-T细胞是有效地过继性T细胞治疗的关键。T细胞的活化需要TCR-CD3复合物以及共刺激分子的双信号刺激。CD3抗体可提供非特异性的第一信号，可引起T细胞TCR-CD3复合体的交联，产生活化信号，刺激T细胞活化增殖。在提供第二信号的分子中，CD28抗体已充分被证实是经由TCR/CD3激活T细胞的最重要共刺激分子。在TCR被CD3抗体预激活的细胞中，CD28抗体与配体结合后，诱导细胞内酪氨酸磷酸化，使T细胞充分活化。缺乏CD28/B7共刺激信号会导致T细胞失能，它在启动免疫应答初始阶段起着不可或缺的作用。CD28抗体还可以刺激T细胞分泌一系列细胞因子，如IL-2，IFN-γ，TNF-α，IL-4等，促进T细胞分化、增殖。

专业的抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)包括树突状细胞(dendritic cell，DC)、单核细胞和活化的B细胞等，在递呈肿瘤抗原给T细胞识别的过程中，T细胞获得的信号刺激会影响它的编程和治疗效果，自然发生的APC不能提供精准的信号刺激，进而调控T细胞分化为最适的表现型。而且，从肿瘤患者的血液中分离出同源的APC(如DC)十分麻烦，DC数量非常少，只占外周血单核细胞(Peripheral Blood MononuclearCell,PBMC)1％以下，经体外培养得到成熟的DC更少，且难以扩增，诱导产生的特异性T细胞数量较少，难以满足临床治疗的要求。

目前，扩增T细胞的方法主要有两种。一是用包被anti-CD3和anti-CD28抗体的板子激活T细胞，这种方法价格昂贵，也存在易污染以及内毒素过高等安全性隐患，此外，由于T细胞为悬浮培养细胞，在用包被抗体的板子培养过程中，悬浮的T细胞不能充分接触anti-CD3和anti-CD28抗体，导致对T细胞的信号刺激强度不够，使其不能充分扩增；二是用抗体包被的免疫磁珠(Dynabeads)刺激T细胞，比如通过在磁珠上组合抗CD3和抗CD28抗体，就能提供调节T细胞激活和扩增需要的初级和协同刺激信号，但是，同时在磁珠上负载多种抗体，抗体的包被位置，包被数量很难掌握，不能保证其均一性，而且生产出粒度适中，分散度低的高质量磁珠，需要十分复杂的工艺。

近来的研究表明，人工APC(Artificial antigen presenting cell,aAPC)能有效活化和扩增抗原特异性T细胞，效率高、可行性好。不同的aAPC可表达不同的分子产生相应的信号刺激，引起所需要的T细胞迁移和效应功能，同时能编程细胞建立持久的T细胞记忆。一种aAPC也可同时表达多种抗体和抗原，易于操控，进而满足实验需求。总之，aAPC的应用有效地提高了过继性T细胞治疗肿瘤的临床疗效。

K562细胞属于人白血病细胞系，来源于急变期的慢性髓细胞性白血病患者。K562细胞具有以下特点：一是不表达内源性的HLA Ⅰ类和Ⅱ类分子；二是容易进行基因操纵，且能稳定表达操纵的基因；三是在人体使用安全。这些特点使得K562细胞被广泛用作构建新型aAPC的骨架细胞系，并取得了较好的研究结果。例如，将CD3、CD80和CD83分子转导K562细胞系构建的aAPC/mOKT3，在不添加异源性饲养细胞的情况下，能同时促进外周血和肿瘤浸润T淋巴细胞(tumor-infiltrating T lymphocytes，TILs)的扩增。此外，研究人员利用K562细胞已制备出临床级的可共表达CD64、CD86、4-1BBL、截断的CD19和mbIL-15/IRES-EGFP分子的aAPC，能够特异性的刺激CD19CAR-T细胞的增殖分化，利用该CD19CAR-T细胞，正在表达CD19的淋巴恶性肿瘤患者中开展临床Ⅰ期的过继性治疗试验。

尽管已存在外源基因导入K562细胞的报道，但目前常用基因转染载体系统难以使外源基因在其细胞内高水平地表达。慢病毒载体系统对人类及其他灵长类动物还存在安全风险。因而，在此之前，尚无基于K562细胞构建的aAPC能高效表达多种抗体的报道。

发明内容

本发明第一方面提供一种转基因人工抗原递呈细胞(aAPC)，所述aAPC：(1)表达T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目标抗原和细胞因子；和/或(2)基因组中稳定整合了含编码T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目的抗原和细胞因子的表达框。

在一个或多个实施方案中，所述表达框的两端均包含转座子的反向末端重复序列。

在一个或多个实施方案中，所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5和Ty。

在一个或多个实施方案中，所述转座子为piggybac。

在一个或多个实施方案中，所述aAPC为不表达人类MHC分子的细胞；优选地，为K562细胞。

在一个或多个实施方案中，所述目标抗原为T细胞特异性抗原。

在一个或多个实施方案中，所述T细胞特异性抗原选自：CD19、EGFR、Meso、Muc1、her2和PSMA，或其具有免疫原性的片段。

在一个或多个实施方案中，所述目标抗原选自CD19、EGFR、Meso、Muc1、her2和PSMA的胞外区和跨膜区。

在一个或多个实施方案中，所述目标抗原选自CD19的胞外区和跨膜区、EGFR的胞外区和跨膜区以及Meso。

在一个或多个实施方案中，所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体针对如下抗原中的一种或多种：CD3、CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、CD32、GITR、CD40L、CD64、CD80、CD83、CD86和ICOSL(B7H2,B7RP1)。

在一个或多个实施方案中，所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体为抗CD28抗体和抗CD137抗体的scFv。

在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括如下白介素类细胞因子或其衍生物中的一种或多种：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37和IL-38。

在一个或多个实施方案中，所述细胞因子或其衍生物为IL-15及其α受体的融合蛋白。

在一个或多个实施方案中，所述aAPC表达：CD19、抗CD28抗体、抗CD137抗体和IL15。

在一个或多个实施方案中，所述aAPC表达：EGFR、抗CD28抗体、抗CD137抗体和IL15。

在一个或多个实施方案中，所述aAPC表达：间皮素、抗CD28抗体、抗CD137抗体和IL15。

在一个或多个实施方案中，所述aAPC的细胞膜上表达CD19和抗CD28抗体。

在一个或多个实施方案中，所述aAPC的细胞膜上表达EGFR和抗CD28抗体。

在一个或多个实施方案中，所述aAPC的细胞膜上表达间皮素和抗CD28抗体。

本发明第二方面如下一种或多种核酸构建体：

(1)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、目标抗原的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；

(2)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；和

(3)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体。

在一个或多个实施方案中，所述重组载体为真核表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述真核表达载体为包含PiggBac转座元件的真核表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述转座酶是piggybac转座酶。

在一个或多个实施方案中，所述目标抗原选自CD19的胞外区和跨膜区、EGFR的胞外区和跨膜区以及Meso的胞外区和跨膜区。

在一个或多个实施方案中，所述控制转座酶编码序列表达的启动子是CMV启动子。

本发明第三方面提供构建本文所述的转基因aAPC的方法，所述方法包括将以下三种表达载体转入所述aAPC中的步骤：

(1)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、目标抗原的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的表达载体；

(2)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的表达载体；和

(3)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的表达载体。

在一个或多个实施方案中，采用病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转中的一种或多种方法将所述表达载体转入所述细胞中，优选地采用电转。

在一个或多个实施方案中，所述目标抗原、T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体和细胞因子如前文任一实施方案所述。

在一个或多个实施方案中，(2)所述表达载体包括至少包括用以在所述细胞中表达抗CD137单链抗体的表达载体。

在一个或多个实施方案中，(2)所述表达载体还包括用以在所述细胞中表达抗CD28单链抗体的表达载体。

本发明第四方面提供本文所述的转基因aAPC的用途，所述用途为：

诱导CAR-T细胞增殖与活化，和/或产生中枢记忆CAR-T细胞，和/或刺激CAR-T细胞分泌IFN-γ，和/或提高特异性CAR-T细胞杀伤肿瘤的能力。

在一个或多个实施方案中，所述CAR-T细胞包括所有类型的CAR-T细胞，如：anti-CD19CAR-T细胞、anti-EGFR CAR-T细胞、anti-Meso CAR-T细胞、anti-her2CAR-T细胞、anti-MUC1CAR-T细胞和anti-PSMA CAR-T细胞。

在一个或多个实施方案中，所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。

本发明第五方面提供(1)抗CD137单链抗体和/或IL15或其衍生物，(2)抗CD137单链抗体的编码序列和/或IL15或其衍生物的编码序列，和(3)抗CD137单链抗体的表达载体和/或IL15或其衍生物的表达载体在制备转基因aAPC中的应用。

附图说明

图1：重组质粒的表达框模式图。ITR为转座子末端重复序列，ECO为胞外区，TM为跨膜区，scFv为单链抗体可变区，HyPB是piggybac转座酶。

图2A、2B和2C：人工抗原递呈sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞表面分子的流式检测。对照为非转基因的同一来源K562细胞。

图3A、3B和3C：sh857-CD19细胞对CD19-CAR-T细胞的扩增作用检测，对照为CD28和CD19抗原共刺激；sh857-EGFR细胞对EGFR-CAR-T细胞的扩增作用检测，对照为CD28和EGFR抗原共刺激；sh857-Meso细胞对Meso-CAR-T细胞的扩增作用检测，对照为CD28和Meso抗原共刺激。

图4A、4B和4C：sh857-CD19细胞刺激后的CD19-CAR-T细胞活化表型、记忆表型和衰老表型的流式检测；对照为CD28和CD19抗原共刺激。

图5A、5B和5C：sh857-EGFR细胞刺激后的EGFR-CAR-T细胞活化表型、记忆表型和衰老表型的流式检测；对照为CD28和EGFR抗原共刺激。

图6A、6B和6C：sh857-Meso细胞刺激后的Meso-CAR-T细胞活化表型、记忆表型和衰老表型的流式检测；对照为CD28和Meso抗原共刺激。

图7A、7B和7C：sh857-CD19细胞刺激后的CD19-CAR-T细胞的IFN-γ分泌情况的流式检测，对照为CD28和CD19抗原共刺激；sh857-EGFR细胞刺激后的EGFR-CAR-T细胞的IFN-γ分泌情况的流式检测，对照为CD28和EGFR抗原共刺激；sh857-CD19细胞刺激后的Meso-CAR-T细胞的IFN-γ分泌情况的流式检测，对照为CD28和Meso抗原共刺激。

具体实施方式

下面对本发明涉及的部分术语进行解释。

术语“嵌合抗原受体”(Chimeric Antigen Receptor,CAR)是识别肿瘤细胞膜上肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的单链抗体和胞内信号域通过铰链区相连构成的嵌合基因。

术语“CAR-T细胞”是将CAR基因通过基因转导/转染的技术导入T细胞后获得的表达该CAR基因的细胞。这类细胞具有识别并攻击表达相应细胞表面TAA的肿瘤细胞的能力。

术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列和PolyA加尾信号序列。

术语“编码序列”指核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。

术语“抗原结合片段”(antigen-binding fragment，Fab)是指位于抗体分子"Y"结构的两臂末端，由高变区氨基酸序列组成，决定抗体结合抗原的特异性的肽段。

术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable，Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段，是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。

术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。

术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。

本文中，“CD28”指人白细胞分化抗原28，又称为Tp44，它在NCBI GeneBank中的ID号为940，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_001243077.1/NP_001230006.1，NM_001243078.1/NP_001230007.1，NM_006139.3/NP_006130.1。

本文中，“CD137”指人白细胞分化抗原137，又称为4-1BB，它在NCBI GeneBank的官方名称为TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)，ID号为3604，只有1个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，为NM_001561.5/NP_001552.2。

本文中，“IL15”是指白细胞介素15，它在NCBI GeneBank中的ID号为3600，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_000585.4/NP_000576.1，NM_172175.2/NP_751915.1。

除非另有说明，本文涉及的其它抗原均是本领域已知的抗原，其氨基酸序列为本领域所周知并可从本领域所熟知的数据库中获得。

本文涉及将表达本文所述的T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目标抗原和细胞因子的核酸构建体转入抗原递呈细胞中，以构建在其表面上表达T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体和目标抗原的转基因人工抗原递呈细胞，用于诱导CAR-T细胞增殖与活化，产生中枢记忆CAR-T细胞，刺激CAR-T细胞分泌IFN-γ，和/或提高特异性CAR-T细胞杀伤肿瘤的能力。

合适的专业的抗原递呈细胞包括树突状细胞、单核细胞和活化的B细胞等。优选的是，本文使用的APC为不表达人类MHC分子的APC；更优选为人白血病细胞；最优选为K562细胞。

适用于本文的目标抗原可以是任何可用在aAPC表面表达，以产生相应的信号刺激、引起感兴趣的T细胞迁移和效应功能，同时能编程细胞建立持久的T细胞记忆的抗原。优选地，这类目标抗原是T细胞特异性抗原，包括但不限于CD19、EGFR、Meso(间皮素)、Muc1、her2和PSMA，或其具有免疫原性的片段。应理解，为了诱导针对其它感兴趣抗原的CAR-T细胞增殖与活化，和/或产生针对这类感兴趣抗原的中枢记忆CAR-T细胞，和/或刺激其分泌IFN-γ，和/或提高其杀伤肿瘤的能力时，可根据不同的CAR-T细胞所针对的抗原而选择适用于本文的目标抗原或其具有免疫原性的片段。“具有免疫原性的片段”具有本文所通常理解的含义，即该片段能在体内或体外引起免疫原性。在某些实施方案中，所述能引起免疫原性的片段是抗原的胞外区和跨膜区。另外，本文中，如果没有特别说明，间皮素指锚定在膜上的间皮素片段。

在某些实施方案中，所述T细胞特异性抗原选自：CD19、EGFR、Meso、Muc1、her2和PSMA，或其具有免疫原性的片段。在某些实施方案中，所述目标抗原选自CD19的胞外区和跨膜区、EGFR的胞外区和跨膜区以及间皮素。在某些实施方案中，CD19胞外区和跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1第7－957位所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；EGFR胞外区和跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2第7－2010位所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；间皮素的氨基酸序列为SEQ ID NO:3第7－1675位所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。适用于本文的T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体分泌型抗体。在某些实施方案中，所述抗体为膜锚定型抗体。在某些实施方案中，所述抗体为单链抗体。单链抗体(scFv)是指由抗体轻链可变区(V_L区)氨基酸序列和重链可变区(V_H区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。

在某些实施方案中，所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体针对如下抗原中的一种或多种：CD3、CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、CD32、GITR、CD40L、CD64、CD80、CD83、CD86和ICOSL(B7H2,B7RP1)。优选地，所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体至少包括针对CD137的抗体，优选是针对CD137的单链抗体。优选地，所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体为抗CD28抗体的scFv和抗CD137抗体的scFv。在某些实施方案中，抗CD28抗体的scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO:4第64-783位碱基序列所编码的氨基酸序列；抗CD137抗体的scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO:5第61-795位碱基序列所编码的氨基酸序列。

本文中，合适的细胞因子包括但不限于白细胞介素。例如，合适的白细胞介素包括如下的一种或多种：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37和IL-38。通常，本文所述的白细胞介素包括其衍生物，尤其是白细胞介素与其α受体形成的融合蛋白。例如，在某些实施方案中，所述白细胞介素为IL-15与其α受体的融合蛋白。IL-15和其α受体之间可通过常用的接头序列进行连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，IL-15及其α受体的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:6第58-669位碱基序列所编码的氨基酸序列。

用于转入感兴趣抗原递呈细胞的核酸构建体通常含有T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目标抗原或细胞因子的表达框。表达框的两端优选包含转座子的反向末端重复序列。

因此，在某些实施方案中，本文的核酸构建体包括核酸构建体A、B和C：

(A)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制目标抗原的编码序列表达的启动子、目标抗原的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；

(B)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达启动子、T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体；和

(C)含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制细胞因子编码序列的表达的启动子、细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的核酸构建体。

优选的是，这些核酸构建体是表达载体，能在感兴趣的抗原递呈细胞中表达所述目标抗原、T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体以及细胞因子。

本文中，转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，本发明核酸构建物中的5’ITR和3’ITR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。

在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac的转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。

可根据所选的感兴趣核酸序列(即待表达的抗原、抗体或细胞因子)选择相应的启动子序列。这类启动子的例子包括但不限于EF1α启动子。如CN201510021408.1所述(本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)，启动子上游还可包括增强子，如mCMV增强子、hCMV增强子和CD3e增强子中的一个、任意两个或全部三个。

转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7的SEQ ID NO:6所示。

可使用本领域周知的polyA加尾信号序列。在某些实施方案中，所述polyA来自SV40。在某些实施方式中，可使用CN 201510638974.7的SEQ ID NO:3所示的序列。

CD8的胞外区和跨膜区可以是本领域常用的胞外区和跨膜区序列。示例性的CD8的胞外区可由SEQ ID NO:4第784-948位碱基序列所编码；示例性的CD8的跨膜区可由SEQ IDNO:4第949-1020位碱基序列所编码。

因此，在某些实施方案中，用于在感兴趣的抗原递呈细胞中表达目标抗原的核酸构建体A含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、CD19抗原或EGFR抗原的胞外区和跨膜区或间皮素的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子；用于在感兴趣的抗原递呈细胞中表达T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的核酸构建体B含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子；用于在感兴趣的抗原递呈细胞中表达细胞因子的核酸构建体C含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、EF1α启动子、细胞因子的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子。

在某些实施方案中，所述表达载体采用pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体作为骨架。在其它实施方案中，所述表达载体采用pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体作为骨架。在某些实施方案中，本发明使用CN 201510638974.7构建的pSN载体，其载体结构如该申请图1所示。

在某些实施方案中，本文的抗原递呈细胞是转基因K562细胞，所述转基因K562细胞的基因组中稳定整合了包含所述感兴趣的核酸序列的表达框。更进一步地，所述K562细胞的基因组中稳定整合了依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制感兴趣的核酸序列表达的启动子、感兴趣的核酸序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。具体而言，所述K562细胞：表达T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目标抗原和细胞因子；和/或基因组中稳定整合了编码T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的表达框、编码目的抗原的表达框和编码细胞因子的表达框，尤其是本文各实施方案中所述的表达框。另一方面，所述K562细胞转入了本文各实施方案所述的核酸构建体A、B和C。更优选的是，转入所述K562的核酸构建体B至少包括能表达抗CD137单链抗体的核酸构建体，并优选还包括能表达抗CD28单链抗体的核酸构建体。在某些实施方案中，本文的转基因K562细胞稳定表达抗体Fc段的全长序列或其功能性片段。在某些实施方案中，本文的转基因K562细胞稳定表达抗体的重链恒定区段(如Fc)和轻链。

根据所表达的抗体和细胞因子的生物学功能，本文的转基因细胞具有高效诱导CAR-T细胞增殖与活化，并产生中枢记忆T细胞的功能。在一个或多个实施方案中，所述CAR-T细胞包括所有类型的CAR-T细胞，如表达抗CD19单链抗体、抗EGFR单链抗体、抗间皮素单链抗体、抗her2单链抗体、抗Muc1单链抗体或抗PSMA单链抗体的CAR-T细胞。

可采用本领域常规的方法将本文的核酸构建体A、B和C转入感兴趣的抗原递呈细胞中，制备本申请的aAPC。这些方法包括但不限于病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转中的一种或多种。转染时，可根据实际情况调整表达载体的用量。

因此，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本文任一实施方案所述的核酸构建体A、B和C。优选地是，所述核酸构建体B至少包括表达抗CD137单链抗体的核酸构建体，优选还包括表达抗CD28单链抗体的核酸构建体。在某些实施方案中，所述试剂盒含有：本文所述的表达CD19胞外区和跨膜区、EGFR胞外区或跨膜区或间皮素的核酸构建体A，本文所述的表达抗CD28单链抗体的核酸构建体B，本文所述的表达抗CD137单链抗体的核酸构建体B，以及本文所述的表达IL15与其α受体的融合蛋白的核酸构建体C。试剂盒还可含有适用于将所述重组表达载体转染入细胞中的各种试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述表达载体转染入细胞的说明书。试剂盒中，四种表达载体可独立包装，也可以混合物的形式包装在同一容器中。

因此，在某些实施方案中，本发明也涉及一种组合物，该组合物至少含有四种表达载体，包括本文所述的一种核酸构建体A、两种核酸构建体C和一种核酸构建体C。在一个或多个实施方案中，所述组合物含有本文所述的表达CD19胞外区和跨膜区、EGFR胞外区或跨膜区或间皮素的核酸构建体A，本文所述的表达抗CD28单链抗体的核酸构建体B，本文所述的表达抗CD137单链抗体的核酸构建体B，以及本文所述的表达IL15与其α受体的融合蛋白的核酸构建体C。组合物中还可含有相应的溶剂或载体。

本发明克服了目前常用基因转染载体系统对抗原递呈细胞尤其是K562细胞转染率低、介导抗体表达水平低的缺陷，使抗原递呈细胞(如K562细胞)在细胞膜上能稳定表达多种T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、特异性抗原和白细胞介素及其衍生物。因此，将获得的该转基因K562细胞与CAR-T细胞共同培养，能高效诱导CAR-T细胞增殖与活化，并产生中枢记忆T细胞，而且具有操作简单、成本低廉、稳定性、重复性以及安全性高等优点，具有广阔的临床应用前景。

因此，本文还提供本文所述的转基因aAPC的用途，所述用途为：诱导CAR-T细胞增殖与活化，和/或产生中枢记忆CAR-T细胞，和/或刺激CAR-T细胞分泌IFN-γ，和/或提高特异性CAR-T细胞杀伤肿瘤的能力。优选的是，所述CAR-T细胞为用于肿瘤治疗的CAR-T细胞。本文所述的肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。

本文还提供(1)抗CD137单链抗体和/或IL15或其衍生物，(2)抗CD137单链抗体的编码序列和/或IL15或其衍生物的编码序列，和(3)抗CD137单链抗体的表达载体和/或IL15或其衍生物的表达载体在制备转基因aAPC尤其是本文所述的转基因aAPC中的应用。

下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：重组质粒pNB328-CD19TM、pNB328-EGFRTM、pNB328-MesoTM、pNB328- anti-CD28TM、pNB328-anti-CD137TM与pNB328-IL15TM的构建

按SEQ ID NO:1所示CD19ECO+TM编码序列，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-CD19TM。

CD19ECO+TM编码序列：

GAATTCATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAGGTCTCAGCTGTGACTTTGGCTTATC TGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGGTCGAC(SEQ ID NO:1)，其中波浪线表示跨膜区(TM)，下划线表示酶切位点，其余为胞外区(ECO)。

按SEQ ID NO:2所示EGFR ECO+TM编码序列，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-EGFRTM。

EGFR ECO+TM编码序列：

GAATTCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAATATGTACTACGAAAATTCCTATGCCTTAGCAGTCTTATCTAACTATGATGCAAATAAAACCGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGAAATCCTGCATGGCGCCGTGCGGTTCAGCAACAACCCTGCCCTGTGCAACGTGGAGAGCATCCAGTGGCGGGACATAGTCAGCAGTGACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTTCCAGAACCACCTGGGCAGCTGCCAAAAGTGTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAGAAACTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGCTCCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAGTGACTGCTGCCACAACCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAATTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACACCTGCCCCCCACTCATGCTCTACAACCCCACCACGTACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACAGCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGCCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTC CTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGGTCGAC(SEQ ID NO:2)，其中波浪线表示跨膜区(TM)，下划线表示酶切位点，其余为胞外区(ECO)。

按SEQ ID NO:3所示Meso编码序列委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-MesoTM。

MesoTM编码序列：

GAATTCGCCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAGTGGAGAAGACAGCCTGTCCTTCAGGCAAGAAGGCCCGCGAGATAGACGAGAGCCTCATCTTCTACAAGAAGTGGGAGCTGGAAGCCTGCGTGGATGCGGCCCTGCTGGCCACCCAGATGGACCGCGTGAACGCCATCCCCTTCACCTACGAGCAGCTGGACGTCCTAAAGCATAAACTGGATGAGCTCTACCCACAAGGTTACCCCGAGTCTGTGATCCAGCACCTGGGCTACCTCTTCCTCAAGATGAGCCCTGAGGACATTCGCAAGTGGAATGTGACGTCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCGGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGATAAGTCGAC(SEQ ID NO:3)，下划线表示酶切位点。

按SEQ ID NO:4所示anti-CD28TM编码序列委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-anti-CD28TM。

anti-CD28TM编码序列：

其中单划线表示信号肽，虚线表示CD28scFv，双下划线CD8胞外铰链区与跨膜区。

按SEQ ID NO:5所示anti-CD137TM编码序列(轻链信号肽-antiCD137scFv-CD8Hinge-TM)，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-anti-CD137TM。

anti-CD137TM编码序列：

其中单划线表示信号肽，虚线表示CD137scFv，双下划线CD8胞外铰链区与跨膜区。

按SEQ ID NO:6所示IL15TM编码序列(重链信号肽-IL15-linker-IL15R-CD8Hinge-TM)，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点，装入pNB328载体，命名为pNB328-IL15TM。

IL15TM编码序列：

其中单划线表示信号肽，虚线表示IL15LR，双下划线CD8胞外铰链区与跨膜区。

pNB328-CD19TM、pNB328-EGFRTM、pNB328-MesoTM、pNB328-anti-CD28TM、pNB328-anti-CD137TM与pNB328-IL15TM的载体模式图见图1。

实施例2：人工抗原递呈K562细胞的制备

离心收集生长状态良好的K562细胞约6×10⁵个，生理盐水洗涤一次。按照电转试剂盒步骤，先加入电转试剂100μl(82μl+18μl)，再同时加入质粒pNB328-CD19TM、pNB328-anti-CD28TM、pNB328-anti-CD137TM与pNB328-IL15TM各1.5ug，重悬细胞。将细胞悬液加入电极杯并放入Lonza 2b-Nucleofector电转仪中，选定程序进行电击后，转移到六孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。待细胞健康生长后，将电转后的K562细胞离心计数，稀释成100个/10ml，将细胞悬液以100μl/孔加入96孔板中，使每孔只有一个细胞。每隔几天观察一次，去除非单细胞群的孔，待细胞长到一定数量，将其中单克隆孔细胞扩大培养，即获得表达CD19、anti-CD28、anti-CD137抗体和IL-15胞外功能区域的人工K562细胞，命名为sh857-CD19细胞。按照同样的实验方法，同时电转质粒pNB328-EGFRTM、pNB328-anti-CD28TM、pNB328-anti-CD137TM与pNB328-IL15TM，可得到sh857-EGFR细胞；同时电转质粒pNB328-MesoTM、pNB328-anti-CD28TM、pNB328-anti-CD137TM与pNB328-IL15TM，可得到sh857-Meso细胞。

实施例3：sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞表面分子的流式检测

分别选取实施例2制备得到的sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞和对照K562细胞，计数后以1×10⁶个细胞/管分别加入8个1.5ml的EP管中，分为2组，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min，弃上清；其中一组加入2μl CD28-FITC抗人抗体(购自JacksonImmunoResearch公司)，另一组加入2μl CD19-FITC抗人抗体(购自JacksonImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水将细胞转移至流式管中，上机检测。实验结果如图2所示。相对于对照K562细胞，sh857-CD19细胞表面具有CD19和CD28抗体分子，sh857-EGFR细胞表面具有EGFR和CD28抗体分子，sh857-Meso细胞表面具有Meso和CD28抗体分子。

保留验证成功的单克隆sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞，并扩增以备后用。

实施例4：sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞分别对anti- CD19CAR-T细胞、anti-EGFR CAR-T细胞和anti-MesoCAR-T细胞的扩增作用检测

取LONZA电转液，按a：b＝0.82：0.18比例混合，将质粒与电转液混合均匀，4℃放置过夜。采用临床血细胞分离机分离患者富集外周血PBMC。采用RPMI 1640培养基两倍稀释细胞悬液，加入淋巴细胞分离液密度梯度离心，用于初步纯化PBMC。将PBMC置于六孔板中，37℃、5％CO₂培养箱贴壁孵育2-4小时。收集未贴壁细胞并进行冻存，为初始T细胞。孔中留下贴壁细胞，吹打收取细胞于两个1.5ml离心管，计数，每管取5×10⁶个细胞，编号a、b，1200rmp，离心3min，弃上清。取电转试剂盒(来自Lonza公司)，a、b管按比例加入电转液共100ul，a管加入6ug构建好的目的CAR质粒，分别为anti-CD19CAR(如SEQ ID NO:7所示，第846-1571位为抗CD19单链抗体的编码序列)、anti-EGFR CAR(如SEQ ID NO:8所示，第849-1571位为抗EGFR单链抗体的编码序列)和anti-Meso CAR(如SEQ ID NO:9所示，第849-2831位为抗间皮素单链抗体的编码序列)，重悬混匀细胞，b管加入6ug对照质粒；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中(含2％FBS的AIM-V培液)，并加入细胞因子IL-2(50IU/ml)，混匀，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞诱导CAR-T细胞增殖实验：第5天收集三种CAR-T细胞，用CFSE染色，然后按sh857-CD19：anti-CD19CAR-T细胞＝1:40的比例共培养，或sh857-EGFR：anti-EGFR CAR-T细胞＝1:40的比例共培养，或sh857-Meso：anti-Meso CAR-T细胞＝1:40的比例共培养，同时加入IL-2(50IU/ml)，对照组分别使用CD28抗体和CD19抗原、或CD28抗体和EGFR抗原、或CD28抗体和Meso抗原共刺激(sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞都预先用40Gyγ射线照射)，记为d0。第5天收集实验组与对照组细胞进行流式检测CFSE荧光强度。传代时需补加三种构建的细胞或抗原以及IL-2。

结果如图3A、3B和3C所示。三个实验组(分别加sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞)的特异性CAR-T细胞荧光强度不断减弱，呈现不同的增殖峰，而三个对照组的CAR-T细胞则逐渐凋亡，荧光强度变化较小，第8天进入快速增长期，最多均能扩增60多倍；而对照组(加CD28抗体和三种抗原)的特异性T细胞增殖较慢，最多只能扩增10倍左右，且第十天以后细胞开始逐渐凋亡，说明与加入抗原抗体刺激相比，sh857-CD19细胞、sh857-EGFR细胞和sh857-Meso细胞能分别有效地刺激anti-CD19CAR-T细胞、anti-EGFRCAR-T细胞和anti-Meso CAR-T细胞的扩增。

实施例5：分别经sh857-CD19细胞刺激后的anti-CD19CAR-T细胞、经sh857-EGFR细胞刺激后的anti-EGFR CAR-T细胞和经sh857-Meso细胞刺激后的anti-MesoCAR-T细胞的活化表型、记忆表型和抑制性表型的流式检测

分别收集实施例4所述的三种实验组CAR-T细胞和对照组CAR-T细胞，计数后以1×10⁶个细胞/管分别加入多个1.5ml的EP管中，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；每种CAR-T细胞的其中两管分别加入检测活化T细胞表型的流式抗体anti-CD137-PE和anti-CD28-PE，有1管加入检测记忆T细胞表型的流式抗体anti-CD45RO-PECy5+anti-CCR7-FITC+anti-CD62L-PE，有3管分别加入检测抑制性T细胞表型的流式抗体anti-PD1-PE、anti-LAG3-Alexa Fluor 647和anti-TIM3-PE，另外3管分别加入同型对照流式抗体IgG1-PE、IgG1-PE+IgG2a-PECy5+IgG2a-PE和IgG1Alexa Fluor 647，每种抗体2μl(均购自JacksonImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。

实验结果发现，经sh857-CD19细胞刺激后的CD19-CAR-T细胞，CD137的阳性率达到78.9％，CD28的阳性率达到99.3％，而经CD28抗体和CD19抗原共刺激后的CD19-CAR-T细胞，CD137的阳性率只有25.3％，CD28的阳性率只有50.9％(图4A)，说明经sh857-CD19细胞刺激的anti-CD19CAR-T细胞能得到更好的扩增，活化细胞占有较大比例。同时，经sh857-CD19细胞刺激后的anti-CD19CAR-T细胞流式检测极高表达CD45RO(98.3％)，而经CD28抗体和CD19抗原共刺激后的CD19-CAR-T细胞CD45RO(84.1％)，说明实验组产生更多的记忆T细胞，可以快速产生更强的再次免疫应答；CCR7和CD62L(L-选择素)为中心记忆T细胞的标志，本实验中实验组CCR7和CD62L的表达量为41.2％，对照组为13.0％(图4B)，说明实验组具有更多的中心记忆T细胞，当再遇肿瘤细胞，可以迅速发挥更强效的免疫应答反应；此外，经sh857-CD19细胞刺激后的anti-CD19CAR-T细胞流式检测抑制性T细胞表型LAG3阳性率只有9.3％，而对照组LAG3阳性率为19.6％(图4C)，说明经sh857-CD19细胞刺激后的CAR-T细胞的状态较好，不容易衰老。

同样的流式方法检测结果发现，经sh857-EGFR细胞刺激后的anti-EGFR CAR-T细胞，CD137的阳性率达到69.9％，CD28的阳性率达到99.2％，对照组经CD28抗体和EGFR抗原共刺激后的anti-EGFR CAR-T细胞，CD137的阳性率仅为26.3％，CD28的阳性率仅为65.2％(图5A)。实验组anti-EGFR CAR-T细胞流式检测极高表达CD45RO为98.7％，CCR7和CD62L的表达量为44.3％，对照组anti-EGFR CAR-T细胞流式检测CD45RO表达量为88.7％，CCR7和CD62L的表达量为24.6％(图5B)，实验组和对照组抑制性T细胞表型LAG3的阳性率分别为10.4％和17.4％(图5C)。

经sh857-Meso细胞刺激后的anti-Meso CAR-T细胞，CD137的阳性率达到60.0％，CD28的阳性率达到99.5％，对照组经CD28抗体和Meso抗原共刺激后的anti-Meso CAR-T细胞，CD137的阳性率仅为18.8％，CD28的阳性率仅为65.2％(图6A)；实验组anti-Meso CAR-T细胞流式检测极高表达CD45RO为98.7％，CCR7和CD62L的表达量为59％，对照组anti-MesoCAR-T细胞流式检测CD45RO表达量为89.6％，CCR7和CD62L的表达量为39.4％(图6B)；实验组和对照组抑制性T细胞表型LAG3的阳性率分别为5.2％和16.3％(图6C)。

这些结果说明所构建的sh857细胞刺激CAR-T细胞，能更好的促进CAR-T细胞的大量扩增，使其良好的活化，产生记性表型，且状态好，不易衰竭。

实施例6：分别经sh857-CD19细胞刺激后的anti-CD19CAR-T细胞、经sh857-EGFR细胞刺激后的anti-EGFR CAR-T细胞和经sh857-Meso细胞刺激后的anti-MesoCAR-T细胞的 IFN-γ分泌情况的流式检测

分别取实施例4所述的d8三个实验组和对照组的CAR-T细胞6孔板中的一孔，加入cell stimulation cocktail 5μl，置于37℃、5％CO₂孵箱中4-6h。按照细胞因子检测试剂盒说明书进行固定、破膜，分装于2个1.5ml的EP管中，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；分别加入2μl流式抗体IFN-γ-PE和IgG1-PE(同型对照)，轻弹沉淀使其混合均匀。室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水将细胞转移至流式管中，上机检测。

实验结果表明，经sh857-CD19细胞刺激培养的anti-CD19CAR-T细胞分泌IFN-γ的特异性T细胞比例为49.7％，经CD28抗体和CD19抗原共刺激的对照组为23.8％(图7A)；经sh857-EGFR细胞刺激培养的anti-EGFR CAR-T细胞分泌IFN-γ的特异性T细胞比例为51.9％，经CD28抗体和EGFR抗原共刺激的对照组为22.4％(图7B)；经sh857-Meso细胞刺激培养的anti-Meso CAR-T细胞分泌IFN-γ的特异性T细胞比例为29.9％，经CD28抗体和Meso抗原共刺激的对照组为16.2％(图7C)。说明经所构建的sh857细胞刺激扩增后的特异性CAR-T细胞具有更强杀伤肿瘤的能力。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 上海细胞治疗研究院

上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司

<120> 高效扩增CAR-T细胞的人工抗原递呈细胞及其用途

<130> 174392

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19胞外区和跨膜区的编码序列

<400> 1

gaattcatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc 60

aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc 120

ctcaagggga cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt 180

aaacccttct taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 240

gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag 300

ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc 360

ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac 420

aggtcctcag agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg 480

tgggccaaag accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac 540

agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg 600

tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc aggggccccc tctcctggac ccatgtgcac 660

cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat 720

atgtgggtaa tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag 780

tattattgtc accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcca 840

gtactatggc actggctgct gaggactggt ggctggaagg tctcagctgt gactttggct 900

tatctgatct tctgcctgtg ttcccttgtg ggcattcttc atcttcaaag agccctggtc 960

gac 963

<210> 2

<211> 2016

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR胞外区和跨膜区的编码序列

<400> 2

gaattcatgc gaccctccgg gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct ggctgcgctc 60

tgcccggcga gtcgggctct ggaggaaaag aaagtttgcc aaggcacgag taacaagctc 120

acgcagttgg gcacttttga agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt 180

gaggtggtcc ttgggaattt ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc 240

ttaaagacca tccaggaggt ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac agtggagcga 300

attcctttgg aaaacctgca gatcatcaga ggaaatatgt actacgaaaa ttcctatgcc 360

ttagcagtct tatctaacta tgatgcaaat aaaaccggac tgaaggagct gcccatgaga 420

aatttacagg aaatcctgca tggcgccgtg cggttcagca acaaccctgc cctgtgcaac 480

gtggagagca tccagtggcg ggacatagtc agcagtgact ttctcagcaa catgtcgatg 540

gacttccaga accacctggg cagctgccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc 600

tgctggggtg caggagagga gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag 660

tgctccgggc gctgccgtgg caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca 720

ggctgcacag gcccccggga gagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccg agacgaagcc 780

acgtgcaagg acacctgccc cccactcatg ctctacaacc ccaccacgta ccagatggat 840

gtgaaccccg agggcaaata cagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat 900

tatgtggtga cagatcacgg ctcgtgcgtc cgagcctgtg gggccgacag ctatgagatg 960

gaggaagacg gcgtccgcaa gtgtaagaag tgcgaagggc cttgccgcaa agtgtgtaac 1020

ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 1080

ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 1140

gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 1200

aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat 1260

gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt 1320

gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat 1380

ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa 1440

aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc 1500

tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg 1560

gagcccaggg actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag 1620

tgcaaccttc tggagggtga gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc 1680

cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac 1740

tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga 1800

gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac 1860

ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg 1920

aatgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg 1980

gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg gtcgac 2016

<210> 3

<211> 1680

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 间皮素的编码序列

<400> 3

gaattcgcca ccatggaagc cccagctcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60

gataccaccg gagaagtgga gaagacagcc tgtccttcag gcaagaaggc ccgcgagata 120

gacgagagcc tcatcttcta caagaagtgg gagctggaag cctgcgtgga tgcggccctg 180

ctggccaccc agatggaccg cgtgaacgcc atccccttca cctacgagca gctggacgtc 240

ctaaagcata aactggatga gctctaccca caaggttacc ccgagtctgt gatccagcac 300

ctgggctacc tcttcctcaa gatgagccct gaggacattc gcaagtggaa tgtgacgtcc 360

ctggagaccc tgaaggcttt gcttgaagtc aacaaagggc acgaaatgag tcctcaggtg 420

gccaccctga tcgaccgctt tgtgaaggga aggggccagc tagacaaaga caccctagac 480

accctgaccg ccttctaccc tgggtacctg tgctccctca gccccgagga gctgagctcc 540

gtgcccccca gcagcatctg ggcggtcagg ccccaggacc tggacacgtg tgacccaagg 600

cagctggacg tcctctatcc caaggcccgc cttgctttcc agaacatgaa cgggtccgaa 660

tacttcgtga agatccagtc cttcctgggt ggggccccca cggaggattt gaaggcgctc 720

agtcagcaga atgtgagcat ggacttggcc acgttcatga agctgcggac ggatgcggtg 780

ctgccgttga ctgtggctga ggtgcagaaa cttctgggac cccacgtgga gggcctgaag 840

gcggaggagc ggcaccgccc ggtgcgggac tggatcctac ggcagcggca ggacgacctg 900

gacacgctgg ggctggggct acagggcggc atccccaacg gctacctggt cctagacctc 960

agcatgcaag aggccctctc ggagtccaaa tatggtcccc catgcccacc atgcccagca 1020

cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 1080

atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 1140

gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1200

cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1260

gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 1320

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg 1380

cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1440

ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1500

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc 1560

gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1620

ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggtaaatg ataagtcgac 1680

<210> 4

<211> 1020

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD28TM编码序列

<400> 4

atggagtttt ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taaaaggtgt ccagtgtcag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggatacac cttcaccagc tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtggat tggatgtatt tatcctggaa atgtcaatac taactataat 240

gagaagttca aggacagggc caccctgacc gtagacacgt ccatcagcac agcctacatg 300

gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt tctgtacaag atcacactac 360

ggcctcgact ggaacttcga tgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 420

ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcgggt cggacatcca gatgacccag 480

tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccatgccagt 540

caaaacattt atgtttggtt aaactggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 600

ctgatctata aggcttccaa cctgcacaca ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga 660

tctgggacag atttcactct caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac 720

tactgtcaac agggtcaaac ttatccgtac acgttcggcg gagggaccaa ggtggagatc 780

aaattcgtgc cggtcttcct gccagcgaag cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 840

acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 900

gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 960

gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 1020

<210> 5

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD137TM编码序列

<400> 5

atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

caggtgcaac tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 120

acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat acgccagtcc 180

ccagagaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcatg gtggatacgt cacctacaat 240

ccgtccctcg agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 300

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtatatt actgtgcgag ggactatggt 360

ccggggaatt atgactggta cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc 420

tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcgggtcgga aattgtgttg 480

acacagtctc cagccaccct gtctttgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgcagg 540

gccagtcaga gtgttagcag ctacttagcc tggtaccaac agaaacctgg ccaggctccc 600

aggctcctca tctatgatgc atccaacagg gccactggca tcccagccag gttcagtggc 660

agtgggtctg ggacagactt cactctcacc atcagcagcc tagagcctga agattttgca 720

gtttattact gtcagcagcg tagcaactgg cctccggcgc tcactttcgg cggagggacc 780

aaggtggaga tcaaattcgt gccggtcttc ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg 840

ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 900

gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 960

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 1020

accctttact gc 1032

<210> 6

<211> 906

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL15TM编码序列

<400> 6

atggagtttt ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taaaaggtgt ccagtgtaac 60

tgggtgaatg taataagtga tttgaaaaaa attgaagatc ttattcaatc tatgcatatt 120

gatgctactt tatatacgga aagtgatgtt caccccagtt gcaaagtaac agcaatgaag 180

tgctttctct tggagttaca agttatttca cttgagtccg gagatgcaag tattcatgat 240

acagtagaaa atctgatcat cctagcaaac gacagtttgt cttctaatgg gaatgtaaca 300

gaatctggat gcaaagaatg tgaggaactg gaggaaaaaa atattaaaga atttttgcag 360

agttttgtac atattgtcca aatgttcatc aacacttctg gtggaggcgg ttcaggcgga 420

ggtggcagcg gcggtggcgg gtcgatcacg tgccctcccc ccatgtccgt ggaacacgca 480

gacatctggg tcaagagcta cagcttgtac tccagggagc ggtacatttg taactctggt 540

ttcaagcgta aagccggcac gtccagcctg acggagtgcg tgttgaacaa ggccacgaat 600

gtcgcccact ggacaacccc cagtctcaaa tgcattagag acggtggagg tggaggtgga 660

ggtggaggtt tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 720

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 780

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 840

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 900

tactgc 906

<210> 7

<211> 6507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD19 CAR的编码序列

<400> 7

ggcgcgcctt aaccctagaa agataatcat attgtgacgt acgttaaaga taatcatgcg 60

taaaattgac gcatgtctag aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 120

tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 180

caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaaggat ctgcgatcgc 240

tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 300

ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 360

gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 420

gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga 480

ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg 540

ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag 600

gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct 660

agactcagcc ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt 720

tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac gaattcgcca 780

ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc cacgccgcca 840

ggccggacat ccagatgaca cagactacat cctccctgtc tgcctctctg ggagacagag 900

tcaccatcag ttgcagggca agtcaggaca ttagtaaata tttaaattgg tatcagcaga 960

aaccagatgg aactgttaaa ctcctgatct accatacatc aagattacac tcaggagtcc 1020

catcaaggtt cagtggcagt gggtctggaa cagattattc tctcaccatt agcaacctgg 1080

agcaagaaga tattgccact tacttttgcc aacagggtaa tacgcttccg tacacgttcg 1140

gaggggggac taagttggaa ataacaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggcagcggcg 1200

gtggcgggtc ggaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg ccctcacaga 1260

gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt gtaagctgga 1320

ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt agtgaaacca 1380

catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac tccaagagcc 1440

aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac tactgtgcca 1500

aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca 1560

ccgtctcctc aaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt 1620

cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca 1680

cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccctggcc gggacttgtg 1740

gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaagctcc 1800

tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct 1860

gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca 1920

ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc 1980

taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg 2040

ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata 2100

agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc 2160

acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca 2220

tgcaggccct gccccctcgc tgataagtcg accagacatg ataagataca ttgatgagtt 2280

tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc 2340

tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat 2400

tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct 2460

ctacaaatgt ggtagcatgc gtcaatttta cgcagactat ctttctaggg ttaaatcgat 2520

ttagaagcag ctctggcaca tgtcgatgtt gtgctcgcgg cagatcacct tcttgcactt 2580

cttgcagctg gcgctggcct tgcggcggat cttgctgggg cagtaggtgc agtaggtgcg 2640

cttcttcatc acgggctcct cggtgctgtc gtcgctggtg ccgggcacct ccttgggcag 2700

gatgttgctg atgttgtcgc gcaggtagcg cttcagggtg ggggcctcca ggcgcttgcg 2760

catgaagctg ctggtcaggc ccatgtacag gttgcgcatg aacttcttgc ggctctgcac 2820

cttctcgccc ttgctgctca cgttgtggct gtagatgatg aagctgttga tgcaggcgat 2880

gttgatcatg ccgtacagca gggccatggg ccagcggttg gtcttgcggc tgcaggtcat 2940

cacgctgcac atctggtcca gggtgtccac gccgcccttg gtctggttgt agtacatcac 3000

catctggggc ttgccggtgc tctcgttgat gctggcgtcc tcgtcgcagc tgctcagcag 3060

gtacaccatc ttggcgggct tgggcttgta gctcaccagg gtcagggggc cgtcgaagca 3120

gaacatgctg gtgcccacgg ggcggctgcg gctgttcttc agcacctcgg ggatctcgcg 3180

cttgttgctg cgcacggtgc ccacgatggt cagcttgtag ggctcctgca gcaggttctt 3240

ggccaggggg atgctggtga accagttgtc gcaggtgatg ttgcggcagc tgccgtgcac 3300

gggcttgctc agctccttca cgtagtactc gcccaggggc acgccgttgg tctgggtgcc 3360

gcggcccagg tagggcatgc cgttgatcat gtacttggtg ccgctgtcgc acatcatcag 3420

gatcttgatg ccgtacttgc tgggcttgtt ggggatgtac acgcggaagg ggcagcggcc 3480

gcggaagccc agcagctgct cgtcgatggt caggtgggcg ccgggggtgt agttctggat 3540

gcactggtgg atgaacaggt cccagatctt gcgcacgggg gtgaacacgt cgttctcgcg 3600

cagggtgggg cggatgctct tgtcgtccat gcgcaggcag cggatcagga agtcgaagcg 3660

gtcgcggctc atcacgctca cgtacaccat gctcaggctg cggtcgaaca ggtcgtcggt 3720

gctcatgtgg ttgtccttgc gcacggcggt catcaccagg atgccgaaga aggcgtagat 3780

ctcgtcctcg ttggtgtcgc ggaaggtggc gctggtcatg ctctcgcggc gcttcaggct 3840

gatctcggcg ttggtccact tcacgatctc gctgatgatc tcgtcggtga agaacagctt 3900

gaagcacagc agggggtcgt agatgttgcg gcacatgcgg gtggggccgc gctggctgcg 3960

cacgatgttc agggcgctca cgcggctgcg gcgggtgggc ttgctggtgc tccagcagtg 4020

cttgttcttg ccgcggatgg tgcgctgggg cagggtcagg atgcggttgc tggccaggct 4080

gctgccgggc tgctcgatca cgttctgctc gtccaggatc tcgctgccgc tgctggtggg 4140

ctgcacctcg tgcacctcgt cgatgaaggc ctcctcggtg tcgctctgca cgtcgtcctc 4200

gctcacgtgg tcgctcacct cgctgtcgct gtcctcgccc accagctcgt cgtcgctctg 4260

cagcagggcg ctcaggatgt gctcgtcgtc caggctgctg ccgtccaact tgaccctctt 4320

ggcagcaggg cccatggtgg caagcttgat ctgcgttcta cggtggtcag accgaagact 4380

gcgacggtac cgacgctggt cgcgcctctt atacccacgt agaacgcagc tcagccaata 4440

gaatgagtgc caatatggaa tttccagggg aaaaccgggg cggtgttacg ttttggctgc 4500

cctttcactt cccattgacg tgtattggct cgagaacggt actttcccat taatcagcta 4560

tgggaaagta ccgtttaaag gtcacgttgc attagtttca atagcccatt gacgtcaatg 4620

gtgggaaagt acatggcgtt ttaatttaat ggctggaaaa acccaatgac tcacccctat 4680

tgaccttatg tacgtgccaa taatgggaaa aacccattga ctcaccccct attgaccttt 4740

tgtactgggc aaaacccaat ggaaagtccc tattgactca gtgtacttgg ctccaatggg 4800

actttcctgt tgattcaccc ctattgacct tatgtactgg gcaaaaccca ttggaaagtc 4860

cctaatgact cagtatattt aattaagagg gggagaccaa agggcgagac gttaaggcct 4920

cacgtgacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 4980

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 5040

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 5100

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttacgggata cctgtccgcc tttctccctt 5160

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 5220

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 5280

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 5340

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 5400

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 5460

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 5520

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 5580

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 5640

ttttggtcat gccgtctcag aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg 5700

aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct 5760

cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc 5820

ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc cattttccac catgatattc ggcaagcagg 5880

catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc cgtcgggcat gctcgccttg agcctggcga 5940

acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac 6000

cggcttccat ccgagtacgt gctctctcga tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc 6060

aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg gatactttct 6120

cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc 6180

agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga gtacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg 6240

ccagccacga tagccgcgct gcctcgtctt gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg 6300

tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc 6360

agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag 6420

aacctgcgtg caatccatct tgttcaatca taatattatt gaagcattta tcagggttcg 6480

tctcgtcccg gtctcctccc atgcatg 6507

<210> 8

<211> 6540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-EGFR CAR的编码序列

<400> 8

ggcgcgcctt aaccctagaa agataatcat attgtgacgt acgttaaaga taatcatgcg 60

taaaattgac gcatgtctag aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 120

tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 180

caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaaggat ctgcgatcgc 240

tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 300

ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 360

gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 420

gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga 480

ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg 540

ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag 600

gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct 660

agactcagcc ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt 720

tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac gaattcgcca 780

ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc cacgccgcca 840

ggccgagcga catcttgctg actcagtctc cagtcatcct gtctgtgagt ccaggagaaa 900

gagtcagttt ctcctgcagg gccagtcaga gtattggcac aaacatacac tggtatcagc 960

aaagaacaaa tggttctcca aggcttctca taaagtatgc ttctgagtct atctctggga 1020

tcccttccag gtttagtggc agtggatcag ggacagattt tactcttagc atcaacagtg 1080

tggagtctga agatattgca gattattact gtcaacaaaa taataactgg ccaaccacgt 1140

tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaag gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggcagcg 1200

gcggtggcgg gtcgcaggtg cagctgaagc agtcaggacc tggcctagtg cagccctcac 1260

agagcctgtc catcacctgc acagtctctg gtttctcatt aactaactat ggtgtacact 1320

gggttcgcca gtctccagga aagggtctgg agtggctggg agtgatatgg agtggtggaa 1380

acacagacta taatacacct ttcacatcca gactgagcat caacaaggac aattccaaga 1440

gccaagtttt ctttaaaatg aacagtctgc aatctaatga cacagccata tattactgtg 1500

ccagagccct cacctactat gattacgagt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca 1560

ctgtctcttc gttcgtgccg gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc 1620

gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt 1680

gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct 1740

acatctgggc gcccctggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc 1800

tttactgcaa ccacaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga 1860

ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact 1920

tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc 1980

agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt 2040

tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc 2100

aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg 2160

ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta 2220

cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctgataag 2280

tcgaccagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 2340

aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag 2400

ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga 2460

ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtagca tgcgtcaatt 2520

ttacgcagac tatctttcta gggttaaatc gatttagaag cagctctggc acatgtcgat 2580

gttgtgctcg cggcagatca ccttcttgca cttcttgcag ctggcgctgg ccttgcggcg 2640

gatcttgctg gggcagtagg tgcagtaggt gcgcttcttc atcacgggct cctcggtgct 2700

gtcgtcgctg gtgccgggca cctccttggg caggatgttg ctgatgttgt cgcgcaggta 2760

gcgcttcagg gtgggggcct ccaggcgctt gcgcatgaag ctgctggtca ggcccatgta 2820

caggttgcgc atgaacttct tgcggctctg caccttctcg cccttgctgc tcacgttgtg 2880

gctgtagatg atgaagctgt tgatgcaggc gatgttgatc atgccgtaca gcagggccat 2940

gggccagcgg ttggtcttgc ggctgcaggt catcacgctg cacatctggt ccagggtgtc 3000

cacgccgccc ttggtctggt tgtagtacat caccatctgg ggcttgccgg tgctctcgtt 3060

gatgctggcg tcctcgtcgc agctgctcag caggtacacc atcttggcgg gcttgggctt 3120

gtagctcacc agggtcaggg ggccgtcgaa gcagaacatg ctggtgccca cggggcggct 3180

gcggctgttc ttcagcacct cggggatctc gcgcttgttg ctgcgcacgg tgcccacgat 3240

ggtcagcttg tagggctcct gcagcaggtt cttggccagg gggatgctgg tgaaccagtt 3300

gtcgcaggtg atgttgcggc agctgccgtg cacgggcttg ctcagctcct tcacgtagta 3360

ctcgcccagg ggcacgccgt tggtctgggt gccgcggccc aggtagggca tgccgttgat 3420

catgtacttg gtgccgctgt cgcacatcat caggatcttg atgccgtact tgctgggctt 3480

gttggggatg tacacgcgga aggggcagcg gccgcggaag cccagcagct gctcgtcgat 3540

ggtcaggtgg gcgccggggg tgtagttctg gatgcactgg tggatgaaca ggtcccagat 3600

cttgcgcacg ggggtgaaca cgtcgttctc gcgcagggtg gggcggatgc tcttgtcgtc 3660

catgcgcagg cagcggatca ggaagtcgaa gcggtcgcgg ctcatcacgc tcacgtacac 3720

catgctcagg ctgcggtcga acaggtcgtc ggtgctcatg tggttgtcct tgcgcacggc 3780

ggtcatcacc aggatgccga agaaggcgta gatctcgtcc tcgttggtgt cgcggaaggt 3840

ggcgctggtc atgctctcgc ggcgcttcag gctgatctcg gcgttggtcc acttcacgat 3900

ctcgctgatg atctcgtcgg tgaagaacag cttgaagcac agcagggggt cgtagatgtt 3960

gcggcacatg cgggtggggc cgcgctggct gcgcacgatg ttcagggcgc tcacgcggct 4020

gcggcgggtg ggcttgctgg tgctccagca gtgcttgttc ttgccgcgga tggtgcgctg 4080

gggcagggtc aggatgcggt tgctggccag gctgctgccg ggctgctcga tcacgttctg 4140

ctcgtccagg atctcgctgc cgctgctggt gggctgcacc tcgtgcacct cgtcgatgaa 4200

ggcctcctcg gtgtcgctct gcacgtcgtc ctcgctcacg tggtcgctca cctcgctgtc 4260

gctgtcctcg cccaccagct cgtcgtcgct ctgcagcagg gcgctcagga tgtgctcgtc 4320

gtccaggctg ctgccgtcca acttgaccct cttggcagca gggcccatgg tggcaagctt 4380

gatctgcgtt ctacggtggt cagaccgaag actgcgacgg taccgacgct ggtcgcgcct 4440

cttataccca cgtagaacgc agctcagcca atagaatgag tgccaatatg gaatttccag 4500

gggaaaaccg gggcggtgtt acgttttggc tgccctttca cttcccattg acgtgtattg 4560

gctcgagaac ggtactttcc cattaatcag ctatgggaaa gtaccgttta aaggtcacgt 4620

tgcattagtt tcaatagccc attgacgtca atggtgggaa agtacatggc gttttaattt 4680

aatggctgga aaaacccaat gactcacccc tattgacctt atgtacgtgc caataatggg 4740

aaaaacccat tgactcaccc cctattgacc ttttgtactg ggcaaaaccc aatggaaagt 4800

ccctattgac tcagtgtact tggctccaat gggactttcc tgttgattca cccctattga 4860

ccttatgtac tgggcaaaac ccattggaaa gtccctaatg actcagtata tttaattaag 4920

agggggagac caaagggcga gacgttaagg cctcacgtga catgtgagca aaaggccagc 4980

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 5040

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 5100

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 5160

cgcttacggg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 5220

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 5280

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 5340

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 5400

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 5460

gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 5520

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 5580

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 5640

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgccgtct cagaagaact 5700

cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca 5760

cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg 5820

ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc 5880

ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct 5940

cgccgtcggg catgctcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat 6000

gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctctct 6060

cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc 6120

gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga 6180

gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt 6240

cgagtacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt 6300

cttgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct 6360

gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 6420

agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 6480

tcataatatt attgaagcat ttatcagggt tcgtctcgtc ccggtctcct cccatgcatg 6540

<210> 9

<211> 7092

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-Meso CAR的编码序列

<400> 9

ggcgcgcctt aaccctagaa agataatcat attgtgacgt acgttaaaga taatcatgcg 60

taaaattgac gcatgtctag aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 120

tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 180

caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaaggat ctgcgatcgc 240

tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 300

ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 360

gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 420

gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga 480

ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg 540

ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag 600

gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct 660

agactcagcc ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt 720

tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac gaattcgcca 780

ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc cacgccgcca 840

ggccgagcga ggtgcagctg gtggagtccg ggggaggcct ggtccagcct gggggatccc 900

tgagactctc ctgcgcagcc tctggattcg acctcggttt ctacttttac gcctgttggg 960

tccgccaggc tccagggaag ggcctggagt gggtctcatg catttatact gctggtagtg 1020

gtagcacgta ctacgcgagc tgggcgaaag gccgattcac catctccaga gacaattcga 1080

agaacacgct gtatctgcaa atgaacagtc tgagagccga ggacacggcc gtgtattact 1140

gtgcgagatc tactgctaat actagaagta cttattatct taacttgtgg ggccaaggca 1200

ccctggtcac cgtctcctca ggcggaggcg gatcaggtgg tggcggatct ggaggtggcg 1260

gaagcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtg ggagacagag 1320

tcaccatcac ttgccaggcc agtcagagga ttagtagtta cttatcctgg tatcagcaga 1380

aaccagggaa agttcccaag ctcctgatct atggtgcatc cactctggca tctggggtcc 1440

cctcgcggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagcctgc 1500

agcctgaaga tgttgccact tactactgtc agagttatgc ttattttgat agtaataatt 1560

ggcatgcttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaaga gtccaaatat ggtcccccat 1620

gcccaccatg cccagcacct cccgtggccg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac 1680

ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga 1740

gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg 1800

ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttcc agagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1860

ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1920

gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac 1980

aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 2040

gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 2100

cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 2160

acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg 2220

tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta 2280

aacccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa 2340

cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg cacagtgact 2400

acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc 2460

caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc 2520

ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg 2580

agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa 2640

ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct 2700

acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc 2760

agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc 2820

ctcgctgata agtcgaccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 2880

tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 2940

aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 3000

ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtag 3060

catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc tagggttaaa tcgatttaga agcagctctg 3120

gcacatgtcg atgttgtgct cgcggcagat caccttcttg cacttcttgc agctggcgct 3180

ggccttgcgg cggatcttgc tggggcagta ggtgcagtag gtgcgcttct tcatcacggg 3240

ctcctcggtg ctgtcgtcgc tggtgccggg cacctccttg ggcaggatgt tgctgatgtt 3300

gtcgcgcagg tagcgcttca gggtgggggc ctccaggcgc ttgcgcatga agctgctggt 3360

caggcccatg tacaggttgc gcatgaactt cttgcggctc tgcaccttct cgcccttgct 3420

gctcacgttg tggctgtaga tgatgaagct gttgatgcag gcgatgttga tcatgccgta 3480

cagcagggcc atgggccagc ggttggtctt gcggctgcag gtcatcacgc tgcacatctg 3540

gtccagggtg tccacgccgc ccttggtctg gttgtagtac atcaccatct ggggcttgcc 3600

ggtgctctcg ttgatgctgg cgtcctcgtc gcagctgctc agcaggtaca ccatcttggc 3660

gggcttgggc ttgtagctca ccagggtcag ggggccgtcg aagcagaaca tgctggtgcc 3720

cacggggcgg ctgcggctgt tcttcagcac ctcggggatc tcgcgcttgt tgctgcgcac 3780

ggtgcccacg atggtcagct tgtagggctc ctgcagcagg ttcttggcca gggggatgct 3840

ggtgaaccag ttgtcgcagg tgatgttgcg gcagctgccg tgcacgggct tgctcagctc 3900

cttcacgtag tactcgccca ggggcacgcc gttggtctgg gtgccgcggc ccaggtaggg 3960

catgccgttg atcatgtact tggtgccgct gtcgcacatc atcaggatct tgatgccgta 4020

cttgctgggc ttgttgggga tgtacacgcg gaaggggcag cggccgcgga agcccagcag 4080

ctgctcgtcg atggtcaggt gggcgccggg ggtgtagttc tggatgcact ggtggatgaa 4140

caggtcccag atcttgcgca cgggggtgaa cacgtcgttc tcgcgcaggg tggggcggat 4200

gctcttgtcg tccatgcgca ggcagcggat caggaagtcg aagcggtcgc ggctcatcac 4260

gctcacgtac accatgctca ggctgcggtc gaacaggtcg tcggtgctca tgtggttgtc 4320

cttgcgcacg gcggtcatca ccaggatgcc gaagaaggcg tagatctcgt cctcgttggt 4380

gtcgcggaag gtggcgctgg tcatgctctc gcggcgcttc aggctgatct cggcgttggt 4440

ccacttcacg atctcgctga tgatctcgtc ggtgaagaac agcttgaagc acagcagggg 4500

gtcgtagatg ttgcggcaca tgcgggtggg gccgcgctgg ctgcgcacga tgttcagggc 4560

gctcacgcgg ctgcggcggg tgggcttgct ggtgctccag cagtgcttgt tcttgccgcg 4620

gatggtgcgc tggggcaggg tcaggatgcg gttgctggcc aggctgctgc cgggctgctc 4680

gatcacgttc tgctcgtcca ggatctcgct gccgctgctg gtgggctgca cctcgtgcac 4740

ctcgtcgatg aaggcctcct cggtgtcgct ctgcacgtcg tcctcgctca cgtggtcgct 4800

cacctcgctg tcgctgtcct cgcccaccag ctcgtcgtcg ctctgcagca gggcgctcag 4860

gatgtgctcg tcgtccaggc tgctgccgtc caacttgacc ctcttggcag cagggcccat 4920

ggtggcaagc ttgatctgcg ttctacggtg gtcagaccga agactgcgac ggtaccgacg 4980

ctggtcgcgc ctcttatacc cacgtagaac gcagctcagc caatagaatg agtgccaata 5040

tggaatttcc aggggaaaac cggggcggtg ttacgttttg gctgcccttt cacttcccat 5100

tgacgtgtat tggctcgaga acggtacttt cccattaatc agctatggga aagtaccgtt 5160

taaaggtcac gttgcattag tttcaatagc ccattgacgt caatggtggg aaagtacatg 5220

gcgttttaat ttaatggctg gaaaaaccca atgactcacc cctattgacc ttatgtacgt 5280

gccaataatg ggaaaaaccc attgactcac cccctattga ccttttgtac tgggcaaaac 5340

ccaatggaaa gtccctattg actcagtgta cttggctcca atgggacttt cctgttgatt 5400

cacccctatt gaccttatgt actgggcaaa acccattgga aagtccctaa tgactcagta 5460

tatttaatta agagggggag accaaagggc gagacgttaa ggcctcacgt gacatgtgag 5520

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 5580

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 5640

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 5700

ttccgaccct gccgcttacg ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 5760

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 5820

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 5880

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 5940

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 6000

gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 6060

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 6120

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 6180

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgccgt 6240

ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga 6300

taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac 6360

gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga 6420

atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca 6480

cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg 6540

cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag 6600

tacgtgctct ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa 6660

gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt 6720

gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt 6780

cagtgacaac gtcgagtaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc 6840

gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa 6900

ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt 6960

gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc 7020

catcttgttc aatcataata ttattgaagc atttatcagg gttcgtctcg tcccggtctc 7080

ctcccatgca tg 7092

Claims

1.一种转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转基因人工抗原递呈细胞：

（1）表达T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目标抗原和细胞因子；和/或

（2）基因组中稳定整合了含编码T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体、目的抗原和细胞因子的表达框；

其中，所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体为针对CD28的抗体和针对CD137的抗体；所述细胞因子为IL-15与其α受体的融合蛋白。

2.如权利要求1所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述表达框的两端均包含转座子的反向末端重复序列。

3.如权利要求2所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，

所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty；

所述转基因人工抗原递呈细胞选自树突状细胞、单核细胞和活化的B细胞。

4.如权利要求3所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转座子为piggybac。

5.如权利要求3所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转基因人工抗原递呈细胞为不表达人类MHC分子的细胞。

6.如权利要求3所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转基因人工抗原递呈细胞为K562细胞。

7.如权利要求1所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述目标抗原为T细胞特异性抗原。

8.如权利要求7所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述目标抗原选自：CD19、EGFR、Meso、Muc1、her2和PSMA，或其具有免疫原性的片段。

9.如权利要求1所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，

所述目标抗原选自CD19的胞外区和跨膜区、EGFR的胞外区和跨膜区以及间皮素；和/或

所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体为抗CD28抗体和抗CD137抗体的scFv。

10.如权利要求9所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述CD19胞外区和跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1第7－957位所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；所述EGFR胞外区和跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2第7－2010位所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；所述间皮素的氨基酸序列为SEQ ID NO:3第7－1675位所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列；所述抗CD28抗体的scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO:4第64-783位碱基序列所编码的氨基酸序列；所述抗CD137抗体的scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO:5第61-795位碱基序列所编码的氨基酸序列；和所述IL-15与其α受体的融合蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:6第58-669位碱基序列所编码的氨基酸序列。

11.如权利要求1－10中任一项所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，

所述转基因人工抗原递呈细胞表达：CD19胞外区和跨膜区、抗CD28抗体、抗CD137抗体和IL15与其α受体的融合蛋白；

所述转基因人工抗原递呈细胞表达：EGFR胞外区和跨膜区、抗CD28抗体、抗CD137抗体和IL15与其α受体的融合蛋白；或

所述转基因人工抗原递呈细胞表达：间皮素、抗CD28抗体、抗CD137抗体和IL15与其α受体的融合蛋白。

12.如权利要求11所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述转基因人工抗原递呈细胞的细胞膜上表达CD19和抗CD28抗体，或EGFR和抗CD28抗体，或间皮素和抗CD28抗体。

13.如权利要求1所述的转基因人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述细胞转入了以下表达载体：

（1）含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列（5’ITR）、控制目标抗原的编码序列表达的启动子、目标抗原的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列（3’ITR）、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的表达载体；

（2）含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列（5’ITR）、控制所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列（3’ITR）、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的表达载体；和

（3）含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列（5’ITR）、控制所述细胞因子的编码序列表达的启动子、所述细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列（3’ITR）、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子的表达载体。

14.一种组合物，所述组合物含有以下核酸构建体A、B和C：

核酸构建体A，用于表达目标抗原，含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制目标抗原的编码序列表达的启动子、目标抗原的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子；

核酸构建体B，用于表达T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体，含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列表达的启动子、T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子；和

核酸构建体C，用于表达细胞因子，含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、控制细胞因子编码序列的表达的启动子、细胞因子的编码序列、CD8胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子；

15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，

所述核酸构建体为真核表达载体；

所述转座酶为来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座酶；

所述目标抗原如权利要求7-10中任一项所述。

16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，

所述核酸构建体A含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、EF1α启动子、CD19抗原或EGFR抗原的胞外区和跨膜区或间皮素的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子；

所述核酸构建体B含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、EF1α启动子、T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子；和

所述核酸构建体C含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列、EF1α启动子、细胞因子的编码序列、CD8的胞外区和跨膜区的编码序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列、来自piggybac转座系统的转座酶的编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的CMV启动子。

17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述CD19抗原的胞外区和跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1所示；所述EGFR抗原的胞外区和跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:2所示；所述间皮素的编码序列如SEQ ID NO:3所示；所述T细胞共刺激信号膜结合型激活性抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第64-783位碱基序列和SEQ ID NO:5第61-795位碱基序列所示；所述细胞因子的编码序列如SEQ ID NO:6第58-669位碱基序列所示；所示CD8的胞外区和跨膜区的编码序列如SEQ ID NO: 4第784-1020位碱基序列所示。

18.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求14-17中任一项所述的组合物。

19.权利要求1-13中任一项所述的转基因人工抗原递呈细胞的用途，所述用途为：诱导CAR-T细胞增殖与活化，和/或产生中枢记忆CAR-T细胞，和/或刺激CAR-T细胞分泌IFN-γ，和/或提高特异性CAR-T细胞杀伤肿瘤的能力；其中，所述用途为非治疗目的的用途。

20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述CAR-T细胞为用于肿瘤治疗的CAR-T细胞，所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。

21.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述CAR-T细胞是表达抗CD19单链抗体、抗EGFR单链抗体、抗间皮素单链抗体、抗her2单链抗体、抗Muc1单链抗体或抗PSMA单链抗体的CAR-T细胞。