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ES2725492T3 - Preparación semirrecombinante de análogos del GLP-1 - Google Patents

Preparación semirrecombinante de análogos del GLP-1 Download PDF

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ES2725492T3
ES2725492T3 ES08868214T ES08868214T ES2725492T3 ES 2725492 T3 ES2725492 T3 ES 2725492T3 ES 08868214 T ES08868214 T ES 08868214T ES 08868214 T ES08868214 T ES 08868214T ES 2725492 T3 ES2725492 T3 ES 2725492T3
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glp
xaa
precursor molecule
amino acids
analog
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ES08868214T
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English (en)
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Jesper Faergeman Lau
Asser Sloth Andersen
Paw Bloch
Jesper Lau
Patrick William Garibay
Thomas Kruse
Inga Sig Nielsen Nørby
Claus Ulrich Jessen
Caspar Christensen
Jens Christian Norrild
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
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Abstract

Un método para producir un derivado de un análogo del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de: (i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora; (ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo; (iii) acilar el grupo épsilon amino de un residuo de lisina en la molécula precursora expresada con un agente de acilación, que se activa opcionalmente, para obtener un derivado de la molécula precursora, y opcionalmente aislar dicho derivado de la molécula precursora; (iv) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos al derivado de la molécula precursora expresado; y (v) aislar el derivado resultante de un análogo del GLP-1 por medios adecuados; en donde (a) dicha etapa de acilación (iii) tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos con un pH entre 9 y 13; (b) dicha extensión N-terminal tiene una longitud de 2 o 4 aminoácidos, y (c) dicho derivado resultante de un análogo del GLP-1 es el péptido N-épsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4- Carboxi-4-(17-carboxi-heptadecanoilamino)-butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]-etoxi}etoxi)- acetil][Aib8,Arg34] GLP-1-(7-37)

Description

DESCRIPCIÓN
Preparación semirrecombinante de análogos del GLP-1
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método semirrecombinante para la preparación de análogos del GLP-1 y derivados que contienen aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal que combina el uso de técnicas de expresión recombinante y síntesis química de péptidos.
Antecedentes de la invención
El péptido 1 similar a glucagón humano (GLP-1) es una hormona de 37 residuos de aminoácidos que se encuentra implicado en la regulación del metabolismo de la glucosa en sangre, secreción gastrointestinal y el metabolismo e ingesta de alimentos. El GLP-1 se origina a partir del preproglucagón que se sintetiza entre otras en las células L en el íleon distal, en el páncreas y en el cerebro. El GLP-1 estimula la secreción de insulina de una manera dependiente de glucosa, estimula la biosíntesis de insulina, promueve el rescate de células beta, disminuye la secreción de glucagón, el vaciado gástrico y la ingesta de alimentos. El GLP-1 humano se hidroliza a GLP-1 (7-37) y GLP-1 (7-36)-amida que son ambos agentes insulinotrópicos. Se ha demostrado que las dosis farmacológicas de GLP-1 administradas a pacientes diabéticos tipo 2 aumentan significativamente los niveles de insulina circulante y reducen los niveles en plasma de glucagón. Las acciones de GLP-1 están mediadas por los receptores de GLP-1 en el páncreas, corazón, riñón, sistema nervioso central y tracto gastrointestinal. Por lo tanto, se espera que el GLP-1 se vuelva muy importante en el tratamiento de la diabetes.
Sin embargo, el GLP-1 humano nativo se inactiva rápidamente por la degradación por la enzima plasmática dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) a un metabolito de GLP-1(9-36)amida truncado, que sirve como un antagonista del receptor de GLP-1. Esto le confiere al péptido una vida media corta en circulación.
Esta vida media corta en circulación es un problema para muchos pacientes diabéticos particularmente en el segmento de diabetes tipo 2 que están sujetos a la llamada “fobia a las agujas”, es decir, un temor sustancial a inyectarse ellos mismos. En el segmento de diabetes tipo 2, la mayoría de los pacientes se tratan con agentes hipoglucémicos orales. Dado que se espera que los compuestos de GLP-1 sean un producto farmacéutico inyectable, el temor a las inyecciones puede convertirse en un obstáculo serio para el uso amplio de estos compuestos clínicamente muy prometedores.
Por lo tanto, se ha usado una variedad de enfoques y métodos diferentes para modificar la estructura de los compuestos de GLP-1 para proporcionar una mayor duración de acción in vivo. Por lo tanto, se realiza un esfuerzo considerable por ejemplo para desarrollar análogos y derivados de compuestos de GLP-1 menos susceptibles a la hidrólisis mediada por DPP-IV con el fin de reducir la velocidad de degradación por DPP-IV. Los documentos núms. WO 2006/097538, WO 2006/097536, WO 2006/037810, WO2006/005667, WO2005/058958, WO 2005/027978, WO 98/08871 y US 2001/0011071 describen varios análogos y derivados del GLP-1, que incluyen análogos de GLP que comprenden aminoácidos no proteinogénicos (es decir, aminoácidos no naturales) que pueden conferir una cierta protección contra la hidrólisis por DPP-IV.
Los polipéptidos que contienen solo aminoácidos proteinogénicos (es decir, aminoácidos naturales) tal como GLP-1 nativo, pueden producirse mediante el uso de técnicas recombinantes o mediante síntesis química. Sin embargo, los polipéptidos que contienen, además, aminoácidos no proteinogénicos tales como los análogos del GLP-1 extendidos en el extremo N-terminal, no pueden prepararse actualmente mediante las técnicas de expresión recombinante de una manera práctica y se preparan en general mediante síntesis química. El método más ampliamente usado para la síntesis de péptidos es la síntesis de péptidos en fase sólida donde los aminoácidos adecuados protegidos se incorporan de manera gradual mediante el uso de un polímero como un soporte sólido.
La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) puede ser muy eficiente en la preparación de algunos péptidos, pero el uso de aminoácidos protegidos en combinación con el uso constante de exceso de reactivos hace que este enfoque sea relativamente costoso. Además, cada prolongación de aminoácidos en una síntesis de polipéptidos en fase sólida requiere un procedimiento de lavado completo. Típicamente, la incorporación de un aminoácido implica hasta 10 etapas de lavado con solventes como NMP, DMF o DCM.
Cuando los polipéptidos, tales como agentes insulinotrópicos, análogos del GLP-1, análogos truncados del GLP-1 y derivados del GLP-1 se sintetizan mediante el uso de SPPS, la formación de estructuras secundarias durante la síntesis frecuentemente conduce a una menor eficiencia de las etapas individuales de síntesis. Como una consecuencia, los péptidos más grandes o los péptidos que contienen ciertas secuencias de aminoácidos frecuentemente se producen con baja pureza y rendimientos. Las impurezas son frecuentemente péptidos de eliminación donde faltan uno o más aminoácidos en la secuencia final. Estas impurezas pueden ser muy difíciles de separar del péptido deseado, y resulta en un producto contaminado con péptidos de eliminación.
Es el objetivo de la presente invención proporcionar un método eficiente y económico para la preparación de análogos del GLP-1 y derivados que estén protegidos de DPP-IV por tener aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal. El método combina la ventaja de la producción rentable de moléculas precursoras del GLP-1 truncadas, mediante el uso de técnicas recombinantes junto con la síntesis química de extensiones N-terminales que comprenden aminoácidos no proteinogénicos. Se logra una reducción significativa del costo de producción de los análogos o derivados del GLP-1. Los análogos y derivados del GLP-1 menos costosos son altamente convenientes para maximizar el número de pacientes cuyo tratamiento está disponible, así como también para explotar las ventajas de rutas alternativas de suministro que tienen menor biodisponibilidad que la inyección subcutánea, por ejemplo, suministro transdérmico y pulmonar.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a un método para producir un derivado de un análogo del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de: (i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora;
(ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo;
(iii) acilar el grupo épsilon amino de un residuo de lisina en la molécula precursora expresada con un agente de acilación, que se activa opcionalmente, para obtener un derivado de la molécula precursora, y opcionalmente aislar dicho derivado de la molécula precursora;
(iv) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos al derivado de la molécula precursora expresado; y
(v) aislar el derivado resultante de un análogo del GLP-1 por medios adecuados;
en donde
(a) dicha etapa de acilación (iii) tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos con un pH entre 9 y 13;
(b) dicha extensión N-terminal tiene una longitud de 2 o 4 aminoácidos, y
(c) dicho derivado resultante de un análogo del GLP-1 es el péptido N-épsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-carboxi-heptadecanoilamino)-butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]-etoxi}etoxi)-acetil][Aib8,Arg34] GLP-1-(7-37) Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el plásmido de levadura Psa273. El plásmido contiene un casete de expresión que comprende un fragmento EcoRI-Xba/ insertado en el plásmido entre el promotor de la transcripción y el terminador de la transcripción del gen TPI de S. cerevisiae. El casete de expresión codifica un producto de fusión compuesto por el líder pre-pro MFa1*, un sitio de escisión Lys-Arg para el procesamiento dibásico de la endopeptidasa Kex2, y el precursor del GLP-1 (R34)GLP-1(11-37).
La Figura 2 muestra los fragmentos de ADN NcoI-Xbal que codifican los precursores del GLP-1. La secuencia de aminoácidos del precursor del GLP-1 codificada por los fragmentos de ADN se indica en negritas. a) (R34)GLP-1(11-37); b) Ext1-(E22,R26,R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2 y c) Ext1-(E22,R26,R34,K37)GLP-1(8-37)-Ext2; d)(R34)GLP-1(9-37).
La Figura 3 muestra los fragmentos de ADN NcoI-Xbal que codifican los precursores del GLP-1 y las secuencias líderes optimizadas. (34R)GLP-1(11-37) se muestra como un ejemplo no limitante. Las letras mayúsculas indican las diferentes secuencias. Las secuencias de aminoácidos optimizadas codificadas por los fragmentos de ADN se indican en negritas. 'KR' indica un constructo con el sitio de escisión LysArg mínimo Kex2p.
La Figura 4 muestra la optimización del líder (34R)GLP-1(11-37) como un ejemplo. Optimización de P1 a P6: (A-F). Incorporación de prolina: (H, I). Incorporación de aminoácidos cargados en P7 a P11: (M-Z, K5-7, L2-4). Constructos para el procesamiento corriente abajo con DAPasa: (G, J, K, L). Los rendimientos se dan en porcentaje con relación a un (34R)GLP-1(11-37) con el líder MFalfa* y un sitio simple de escisión LysArg Kex2p.
Descripción detallada de la invención
En su aspecto más amplio la presente invención describe un método para producir análogos del GLP-1 y derivados que son DPP-IV protegidos al comprender uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal.
Por lo tanto, en un aspecto la presente invención describe un método para fabricar análogos del GLP-1 y derivados que comprenden uno o más aminoácidos no proteinogénicos, dicho método comprende las siguientes etapas:
(i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo o derivado del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora, (ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo,
(iii) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora expresada,
(iv) aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados, como se conoce en la técnica.
Los presentes inventores han desarrollado un método económico y eficiente para preparar análogos del GLP-1 y derivados que comprenden uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal. Por lo tanto, se ha descubierto que las moléculas precursoras del GLP-1 producidas de manera recombinante que contienen solamente aminoácidos proteinogénicos pueden extenderse eficientemente en el extremo N-terminal mediante el uso de un aminoácido no proteinogénico o un péptido que contiene uno o más aminoácidos no proteinogénicos, por ejemplo, mediante la reacción del precursor del análogo del GLP-1 con un derivado de ácido carboxílico, que está opcionalmente activado, del fragmento de extensión.
Más específicamente, la presente invención proporciona un método semirrecombinante para la preparación de análogos del GLP-1 y derivados que contienen uno o más aminoácidos no proteinogénicos en el extremo N-terminal, incluyendo las posiciones 7, 8, 9 y/o 10. Adicionalmente, se proporciona un método útil para derivar el £-N de un residuo de lisina en la molécula precursora del análogo del GLP-1 mediante la acilación. Por lo tanto, la presente invención combina la producción rentable de análogos del GLP-1 y derivados mediante el uso de técnicas recombinantes con la flexibilidad de la síntesis química.
En la presente descripción, los términos siguientes tienen los significados indicados:
El término "polipéptido" y "péptido" como se usa en la presente descripción significan un compuesto formado por al menos dos aminoácidos constituyentes conectados por enlaces peptídicos. Los aminoácidos constituyentes pueden ser del grupo de los aminoácidos codificados por el código genético y pueden ser aminoácidos naturales que no se codifican por el código genético, así como también aminoácidos sintéticos. Los aminoácidos naturales que no se codifican por el código genético son, por ejemplo, Y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alanina y D-glutamina. Los aminoácidos sintéticos comprenden los aminoácidos fabricados mediante síntesis química, es decir, los D-isómeros de los aminoácidos codificados por el código genético tales como D-alanina y D-leucina, Aib (ácido aaminoisobutírico), Abu (ácido a-aminobutírico), Tle (terc-butilglicina), p-alanina, ácido 3-aminometil benzoico, y ácido antranílico.
Los 22 aminoácidos proteinogénicos son: Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido Aspártico, Cisteína, Cistina, Glutamina, Ácido Glutámico, Glicina, Histidina, Hidroxiprolina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptófano, Tirosina y Valina.
Por lo tanto, un aminoácido no proteinogénico es una porción que puede incorporarse en un péptido mediante enlaces peptídicos, pero no es un aminoácido proteinogénico. Los ejemplos de aminoácidos no proteinogénicos son, pero sin limitarse a, Y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, los D-aminoácidos tales como D-alanina y D-glutamina. Los aminoácidos sintéticos no proteinogénicos comprenden aminoácidos fabricados mediante síntesis química, es decir, isómeros D de los aminoácidos codificados por el código genético tal como D-alanina y D-leucina, Aib ( ácido a-aminoisobutírico), Abu ( ácido a-aminobutírico), Tle (terc-butilglicina), ácido 3-aminometil benzoico, ácido antranílico, des-amino-Histidina, los análogos beta de aminoácidos tales como p-alanina etc., D-histidina, desaminohistidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metilhistidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina, ácido carboxílico (1-aminociclopropil), ácido carboxílico (1-aminociclobutil), ácido carboxílico (1-aminociclopentil), ácido carboxílico (1-aminociclohexilo), ácido carboxílico (1-aminocicloheptil),o ácido carboxílico (1-aminociclooctil), a-metil prolina, 1-metil histidina, 3-metil histidina, y ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-C]piridina-6-carboxílico p-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina.
El término "protegido de DPP-IV" como se usa en la presente descripción por referencia a un polipéptido significa un polipéptido que se ha modificado químicamente para hacer que dicho compuesto sea resistente a la peptidasa plasmática dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV). Se conoce que la enzima DPP-IV en plasma está implicada en la degradación de varias hormonas peptídicas, por ejemplo GLP-1, GLP-2, Exendina-4 etcétera. Por lo tanto, se hace un esfuerzo considerable para desarrollar análogos y derivados de los polipéptidos susceptibles a la hidrólisis por DPP-IV con el fin de reducir la velocidad de degradación por DPP-IV. En una modalidad un péptido protegido de DPP-IV es más resistente a DPP-IV que el GLP-1(7-37).
La resistencia de un péptido a la degradación por la DPP-IV se determina mediante el ensayo de degradación siguiente:
Se incuban alícuotas del péptido (5 nmol) a 37 °C con 1 |jl de DPP-IV purificada, correspondiente a una actividad enzimática de 5 mU durante 10-180 minutos en 100 j l de tampón trietilamina-HCl 0,1 M, pH 7,4. Las reacciones enzimáticas se terminan mediante la adición de 5 j l de ácido trifluoroacético al 10 %, y los productos de degradación peptídica se separan y cuantifican mediante el uso de análisis por HPLC. Un método para realizar este análisis es: Las mezclas se aplican sobre una columna Vydac C18 de poro ancho (poros de 30 nm, partículas de 5 jm ) de 250*4,6 mm y se eluyen a una velocidad de flujo de 1 ml/min con gradientes lineales, en etapas, de acetonitrilo en 0,1 % de ácido trifluoroacético (0 % de acetonitrilo durante 3 minutos, 0-24 % de acetonitrilo durante 17 minutos, 24­ 48 % de acetonitrilo durante 1 minuto) de acuerdo con Siegel y otros, Regul. Pept. 1999;79:93-102 y Mentlein y otros Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35. Los péptidos y sus productos de degradación pueden monitorearse mediante su absorbancia a 220 nm (enlaces peptídicos) o a 280 nm (aminoácidos aromáticos), y se cuantifican mediante la integración de las áreas de sus picos con relación a las de los estándares. La velocidad de hidrólisis de un péptido por la dipeptidil peptidasa DPP-IV se estima a tiempos de incubación que resulten en menos del 10 % de hidrólisis del péptido.
En su sentido más amplio, el término "análogo del GLP-1" como se usa en la presente descripción significa un análogo de una molécula de la familia de péptidos del glucagón o un análogo de la familia de exendinas. La familia de péptidos del glucagón está codificada por el gen de preproglucagón y abarca tres péptidos pequeños con un alto grado de homología, es decir glucagón (1-29), GLP-1 (1-37) y GLP-2 (1-33). Las exendinas son péptidos expresados en lagartos, y como el GLP-1, son insulinotrópicas. Ejemplos de exendinas son exendina-3 y exendina-4.
El término "análogo" como se usa en la presente descripción con referencia a un polipéptido significa un péptido modificado en donde uno o más residuos de aminoácidos del péptido se han sustituido por otros residuos de aminoácidos y/o en donde se han eliminado uno o más residuos de aminoácido del péptido y/o en donde se ha agregado uno o más residuos de aminoácido al péptido. Dicha adición o deleción de residuos de aminoácido puede tener lugar en el N-terminal del péptido y/o en el C-terminal del péptido. Por lo tanto un análogo del GLP-1 de acuerdo con la invención es un análogo del GLP-1 (1-37) de acuerdo con la invención en donde uno o más residuos de aminoácidos del péptido se han sustituido por otros residuos de aminoácidos y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos se han eliminado del péptido y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos se han agregado al péptido.
Para los propósitos de la presente, cualquier sustitución, deleción y/o adición de aminoácidos se refiere a la secuencia de GLP-1(7-37) humano que se incluye en la presente descripción como la SEQ ID NO: 1. Sin embargo, la numeración de los residuos de aminoácidos en el listado de secuencias siempre comienza con el núm. 1, mientras que para el presente propósito queremos, después de la práctica establecida en la técnica, comenzar con el residuo de aminoácido núm. 7 y asignarle el número 7 a este. Por lo tanto, generalmente, cualquier referencia en la presente descripción al número de posición de la secuencia de GLP-1(7-37) es a la secuencia que comienza con His en la posición 7 y termina con Gly en la posición 37.
A menudo se usa un sistema simple para describir análogos del GLP-1: por ejemplo [Arg34]GLP-1(7-37)Lys designa un análogo del GLP-1(7-37) en donde la lisina de origen natural en la posición 34 se ha sustituido con arginina y en donde una lisina se ha agregado al extremo C-terminal. Otro ejemplo [Arg34]GLP-1(11-37) designa un análogo del GLP-1 en donde la lisina de origen natural en la posición 34 se ha sustituido con arginina y los aminoácidos en las posiciones 7, 8, 9 y 10 están ausentes.
La expresión "una posición equivalente a" cuando se usa en la presente descripción para caracterizar una secuencia de g LP-1(7-37) modificada se refiere a la posición correspondiente en la secuencia de GLP-1(7-37) natural (que tiene la SEQ ID NO: 1). Las posiciones correspondientes se deducen fácilmente, por ejemplo, por escritura a mano y observación simples. En la alternativa, puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "align", que es un alineamiento de Needleman-Wunsch. El algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa de alineamiento de Myers y W. Miller en "Alignments Optimum in Linear Space" CABIOS (aplicaciones informáticas en las biociencias) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM50 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -12 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -2.
El término "derivado" como se usa en la presente descripción en relación con un péptido significa un péptido modificado químicamente o su análogo, en donde al menos un sustituyente se ha unido al péptido no modificado o su análogo, es decir, un péptido que se ha modificado covalentemente. Las modificaciones típicas son amidas, carbohidratos, grupos alquilo, grupos acilo, ésteres y similares. Un ejemplo de un derivado del GLP-1(7-37) es Ns26-(y-Glu(Na-hexadecanoil))-[Arg34, Lys26])GLP-1 (7-37).
Debe entenderse que todos los aminoácidos para los que no se indica el isómero óptico son el isómero L.
En las modalidades de la invención un máximo de 17 aminoácidos en el análogo del GLP-1 se han modificado (sustituido, eliminado, agregado o cualquiera de sus combinaciones) con relación al GLP-1(7-37) humano. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 15 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 10 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 8 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 7 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 6 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 5 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 4 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 3 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se han modificado un máximo de 2 aminoácidos en el análogo del GLP-1. En modalidades de la invención se ha modificado 1 aminoácido en el análogo del GLP-1.
En una modalidad el análogo del GLP-1 es un agente insulinotrópico.
En una modalidad el análogo del GLP-1 es un agonista del GLP-1.
El término "agonista del GLP-1" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier péptido similar al glucagón, que activa total o parcialmente el receptor del GLP-1 humano. En una modalidad preferida el "agonista del GLP-1" es cualquier péptido similar al glucagón que se une a un receptor de GLP-1,preferentemente, con una constante de afinidad (KD) o una potencia (EC50) de menos de 1 j M, por ejemplo más abajo de 100 nM según se midió por métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, el documento WO 98/08871) y exhibe actividad insulinotrópica, donde la actividad insulinotrópica puede medirse mediante ensayos in vivo o in vitro conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el agonista del GLP-1 puede administrarse a un animal y la concentración de insulina se mide en el tiempo.
En un aspecto, el análogo del GLP-1 que se va a incluir en las composiciones farmacéuticas de la presente invención es un análogo del GLP-1, en donde el análogo comprende al menos un péptido no proteinogénico.
La propiedad insulinotrópica de un compuesto puede determinarse mediante ensayos in vivo o in vitro bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un animal y monitorear la concentración de insulina en el tiempo. Los análogos insulinotrópicos de exendina-4(1-39) se refieren a las moléculas respectivas en donde uno o más de los residuos de aminoácidos se han intercambiado con otros residuos de aminoácidos y/o de los cuales uno o más residuos de aminoácidos se han eliminado y/o de los cuales uno o más residuos de aminoácidos se han agregado con la condición de que dicho análogo sea insulinotrópico o sea un profármaco de un compuesto insulinotrópico. Un ejemplo de un análogo insulinotrópico de exendina-4(1-39) es Ser2Asp3-exendina-4(1-39) en donde los residuos de aminoácidos en la posición 2 y 3 se han sustituido con serina y ácido aspártico, respectivamente (este análogo particular también se conoce en la técnica como exendina-3). Los derivados insulinotrópicos de exendina-4(1-39) y los análogos de esta son los que los expertos en la técnica consideran derivados de estos péptidos, es decir, que tienen al menos un sustituyente que no está presente en la molécula peptídica original con la condición de que dicho derivado sea insulinotrópico o sea un profármaco de un compuesto insulinotrópico. Los ejemplos de sustituyentes son amidas, carbohidratos, grupos alquilo, ésteres y sustituyentes lipofílicos. Un ejemplo de derivados insulinotrópicos de exendina-4(1-39) y análogos de esta es Tyr31-exendina-4(1-31)-amida.
Debe entenderse que todos los aminoácidos para los que no se indica el isómero óptico son el isómero L.
El término "agente insulinotrópico" como se usa en la presente descripción, significa un compuesto que es un agonista del receptor de GLP-1 humano, es decir, un compuesto que estimula la formación de AMPc en un medio adecuado que contiene el receptor de GLP-1 humano (uno de tales medios se describe más abajo). La potencia de un agente insulinotrópico se determina mediante el cálculo del valor de EC50 de la curva dosis-respuesta como se describe a continuación.
Las células de riñón de hámster bebé (BHK) que expresan el receptor del GLP-1 humano clonado (BHK- 467-12A) se cultivaron en medio DMEM con la adición de 100 lU/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, suero fetal bovino al 5 % y 0,5 mg/ml de Geneticina G-418 (Life Technologies). Las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato y se recogieron con Verseno. Las membranas plasmáticas se prepararon a partir de las células mediante homogenización con un Ultraturrax en tampón 1 (20 mM de HEPES-Na, 10 mM de e DtA, pH 7,4). El homogeneizado se centrifugó a 48 000 x g durante 15 min a 4 °C. El sedimento se suspendió por homogenización en el tampón 2 (20 mM de HEPES-Na, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4), luego se centrifugó a 48000 x g durante 15 min a 4 °C. El procedimiento de lavado se repitió una vez más. El sedimento final se suspendió en el tampón 2 y se usó inmediatamente para los ensayos o se almacenó a -80 °C.
El ensayo funcional del receptor se realizó mediante la medición del AMP cíclico (AMPc) como una respuesta a la estimulación por el agente insulinotrópico. El AMPc formado se cuantificó mediante el kit de AMPc AlphaScreen (Perkin Elmer Life Sciences). Se realizaron incubaciones en placas de microtitulación de 96 pocillos de área media en un volumen total de 50 |jl de tampón 3 (50 mM de Tris-HCl, 5 mM de HEPES, 10 mM de MgCh, pH 7,4) y con las siguientes adiciones: 1 mM de ATP, 1 jM de GTP, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 0,01 % de Tween-20, 0,1 % de BSA, 6 jg de preparación de membrana, 15 jg/ml de perlas aceptoras, 20 jg/ml de perlas donantes preincubadas previamente con 6 nM de biotinil-AMPc. Los compuestos a evaluar para la actividad agonista se disolvieron y diluyeron en el tampón 3. GTP se preparó en el momento para cada experimento. La placa se incubó en la oscuridad con agitación lenta durante tres horas a temperatura ambiente, seguido por el recuento en el instrumento Fusion (Perkin Elmer Life Sciences). Las curvas de concentración-respuesta se representaron gráficamente para los compuestos individuales y los valores estimados de EC50 mediante el uso de un modelo logístico de cuatro parámetros con Prism versión 4.0 (GraphPad, Carlsbad, CA).
El término “semirrecombinante” como se usa en la presente descripción se refiere a un método que comprende las etapas de preparar un primer fragmento peptídico tal como un primer fragmento de un análogo del GLP-1 mediante un proceso recombinante, es decir, a partir de un cultivo de células huésped, y posteriormente acoplar un segundo fragmento de un péptido al primer fragmento del péptido, en donde el segundo fragmento se prepara químicamente, es decir en solución o en una resina mediante el uso de química de péptidos en fase sólida. El acoplamiento de los fragmentos puede realizarse ya sea química o enzimáticamente.
El término “separar la molécula precursora expresada” como se usa en la presente descripción significa cualquier tipo de separación, que incluye el aislamiento del compuesto producido recombinantemente e incluye, además, desintegrar o permeabilizar una célula huésped.
En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para producir un análogo o derivado del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de:
(i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo o derivado del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora, (ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo,
(iii) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora expresada,
(iv) aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados, como se conoce en la técnica.
En el presente contexto, el término "molécula precursora del análogo del GLP-1", debe entenderse como un péptido derivado de los péptidos GLP-1, GLP-2, Exendina-3 o Exendina-4, es decir, una secuencia análoga de GLP-1, antes de la adición de una extensión de aminoácidos N-terminal. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a GLP-1 (11-37) humano o un análogo de estos, GLP-1 humano (9-37) o un análogo de estos y GLP-1 (8-37) o un análogo de estos. En consecuencia, en un aspecto la molécula precursora del análogo del GLP-1 de acuerdo con la invención, comprende un péptido GLP-1 derivado de la secuencia GLP-1 (7-37) como se muestra en la SEQ ID NO:1.
La Exendina-4 es un péptido de residuos de 39 aminoácidos aislado a partir del veneno de los lagartos monstruos de Gila (Sospecha de Heloderma y Heloderma horridum). Este péptido comparte 52 % de homología con GLP-1 (7­ 37) en la región de superposición. La exendina-4 es un agonista potente del receptor del GLP-1 y se ha demostrado además que estimula la liberación de insulina y que por consiguiente disminuye el nivel de glucosa en sangre cuando se inyecta en perros.
Por lo tanto, debido a la homología del 52 % con GLP-1 (7-37) en la región de superposición, la molécula precursora del análogo del GLP-1 de acuerdo con la invención, puede derivarse en ciertas modalidades de un péptido exendina-4 como se muestra en la SEQ ID NO:2.
En consecuencia, las moléculas precursoras del análogo del GLP-1 pueden en un aspecto adicional comprender una secuencia de aminoácidos de la fórmula general:
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Xaai9-Xaa2o-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-leu-Xaa33-Xaa3«-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39 Xaa4o-Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 (SEQ ID NOi3)
en donde
Xaa16 es Val o Leu;
Xaa 18 es Ser, Lys o Arg;
Xaaig es Tyr o Gln;
Xaa20 es Leu o Met;
Xaa22 es Gly o Glu;
Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Lys, Glu o Arg;
Xaa27 es Glu o Leu;
Xaa30 es Ala, Glu o Arg;
Xaa33 es Val, Lys, o Arg;
Xaa34 es Lys, Glu, Asn, His o Arg;
Xaa35 es Gly;
Xaa36 es Arg, Gly o Lys;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, o está ausente;
Xaa38 es Lys, Ser o está ausente.
Xaa39 es Ser, Lys, o está ausente;
Xaa40 es Gly o ausente.
Xaa41 es Ala o está ausente;
Xaa42 es Pro o está ausente;
Xaa43 es Pro o está ausente;
Xaa44 es Pro o está ausente;
Xaa45 es Ser o está ausente;
siempre y cuando si Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa41, Xaa42, Xaa43, Xaa44 o Xaa45 está ausente, entonces cada residuo de aminoácido corriente abajo también está ausente.
En otros aspectos, la molécula precursora del análogo del GLP-1 se selecciona de la lista de moléculas precursoras que comprende la secuencia de aminoácidos de la fórmula general:
Xaa9- Xaaio-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Xaai9-Xaa2o-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa4o-Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 (SEQ ID NOi4)
en donde
Xaa9 es Glu o Asp
Xaa10 es Gly o Ala
Xaa16 es Val o Leu;
Xaa18 es Ser, Lys o Arg;
Xaa19 es Tyr o Gln;
Xaa 20 es Leu o Met;
Xaa22 es Gly o Glu;
Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Lys, Glu o Arg;
Xaa27 es Glu o Leu;
Xaa30 es Ala, Glu o Arg;
Xaa33 es Val, Lys, o Arg;
Xaa34 es Lys, Glu, Asn, His o Arg;
Xaa35 es Gly;
Xaa36 es Arg, Gly o Lys;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, o está ausente;
Xaa38 es Lys, Ser o está ausente.
Xaa39 es Ser, Lys, o está ausente;
Xaa40 es Gly o ausente.
Xaa41 es Ala o está ausente;
Xaa42 es Pro o está ausente;
Xaa43 es Pro o está ausente;
Xaa44 es Pro o está ausente;
Xaa45 es Ser o está ausente;
siempre y cuando si Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa41, Xaa42, Xaa43, Xaa44 o Xaa45 está ausente, entonces cada residuo de aminoácido corriente abajo también está ausente.
En un aspecto adicional, la molécula precursora del análogo del GLP-1 se selecciona de las moléculas precursoras que comprenden una secuencia de aminoácidos de la fórmula general:
Xaa8- Xaa$- Xaaio-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Xaai9-Xaa2o-Glu-Xaa22-Xaa23*Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 (SEQ ID NO:5)
en donde
Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile o Lys;
Xaa9 es Gly o Asp;
Xaa10 es Gly o Ala;
Xaa16 es Val o Leu;
Xaa18 es Ser, Lys o Arg;
Xaa19 es Tyr o Gln;
Xaa 20 es Leu o Met;
Xaa22 es Gly o Glu;
Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Lys, Glu o Arg;
Xaa27 es Glu o Leu;
Xaa30 es Ala, Glu o Arg;
Xaa33 es Val, Lys, o Arg;
Xaa34 es Lys, Glu, Asn, His o Arg;
Xaa35 es Gly;
Xaa36 es Arg, Gly o Lys;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, o está ausente;
Xaa38 es Lys, Ser o está ausente,
Xaa39 es Ser, Lys, o está ausente;
Xaa40 es Gly o ausente.
Xaa41 es Ala o está ausente;
Xaa42 es Pro o está ausente;
Xaa43 es Pro o está ausente;
Xaa44 es Pro o está ausente;
Xaa45 es Ser o está ausente;
siempre y cuando si Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa41, Xaa42, Xaa43, Xaa44 o Xaa45 está ausente, entonces cada residuo de aminoácido corriente abajo también está ausente.
Las moléculas precursoras de los análogas del GLP-1 de la presente invención pueden prepararse por medio de tecnología de ADN recombinante mediante el uso de métodos y principios generales conocidos por la persona experta en la técnica, mediante el cultivo de una célula huésped adecuada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora del análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula precursora.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula precursora del análogo del GLP-1 puede prepararse sintéticamente por métodos estándar establecidos bien conocidos en la técnica, por ejemplo al sintetizar oligonucleótidos en un sintetizador de ADN automático, y posteriormente purificar, alinear, ligar y clonar las secuencias de ácido nucleico en vectores adecuados.
La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la molécula precursora del análogo del GLP-1 puede efectuarse, por ejemplo, mediante el uso de la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula precursora del análogo del GLP-1 se inserta en un vector de expresión recombinante que puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a los procedimientos de ADN recombinante. La elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir. Por lo tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) donde se ha integrado.
Para los productos extracelulares los componentes proteicos del sobrenadante se aíslan mediante filtración, cromatografía en columna o precipitación, por ejemplo, microfiltración, ultrafiltración, precipitación isoeléctrica, purificación mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, o similares, dependiendo del tipo de polipéptido en cuestión. Para los productos intracelulares o periplasmáticos las células aisladas del medio de cultivo se desintegran o permeabilizan y se extraen para recuperar el polipéptido del producto o precursor de este.
La secuencia de ADN que codifica la molécula precursora del análogo del GLP-1 puede ser adecuadamente de origen genómico o de ADNc, por ejemplo, obtenida mediante la preparación de una biblioteca genómica o de ADNc y mediante la selección de secuencias de ADN que codifican todo o parte del péptido por hibridación mediante el uso de sondas de oligonucleótidos sintéticas de acuerdo con técnicas estándar (ver, por ejemplo, Sambrook, J, Fritsch, EF y Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989). La secuencia de ADN que codifica el polipéptido puede prepararse, además, sintéticamente mediante métodos estándar establecidos, por ejemplo, el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, o el método descrito por Matthes y otros, EMBO Journal 3 (1984), 801­ 805. La secuencia de ADN puede prepararse, además, por la reacción en cadena de la polimerasa mediante el uso de cebadores específicos, por ejemplo como se describió en la patente de Estados Unidos núm. 4,683,202 o Saiki y otros, Science 239 (1988), 487-491.
La secuencia de ADN que codifica la molécula precursora del análogo del GLP-1 puede insertarse en cualquier vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir. De este modo, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) donde se ha integrado.
El vector es preferentemente un vector de expresión en el que la secuencia de ADN que codifica la molécula precursora del análogo del GLP-1 se une operativamente a segmentos adicionales necesarios para la transcripción del ADN, tal como un promotor. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede derivarse de genes que codifican proteínas ya sea homólogas o heterólogas a la célula huésped. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción del ADN que codifica el péptido de la invención en una diversidad de células huésped son bien conocidos en la técnica (consultar, por ejemplo, Sambrook y otros, más arriba).
La secuencia de ADN que codifica la molécula precursora del análogo del GLP-1 puede, además, si es necesario, conectarse operativamente a un terminador adecuado, señales de poliadenilación, secuencias potenciadoras de la transcripción y secuencias potenciadoras de la traducción. El vector recombinante de la invención puede comprender, además, una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la célula huésped en cuestión.
El vector puede comprender, además, un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complemente un defecto en la célula huésped o uno que confiera resistencia a un fármaco, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato. Para la fabricación a gran escala el marcador seleccionable preferentemente no es la resistencia a antibióticos, por ejemplo, los genes de resistencia a antibióticos en el vector se escinden preferentemente cuando el vector se usa para la fabricación a gran escala. Los métodos para eliminar genes de resistencia a antibióticos de vectores se conocen en la técnica, ver por ejemplo US 6,358, 705 que se incorpora en la presente descripción como referencia.
Para dirigir la molécula precursora del análogo del GLP-1 de la presente invención hacia la ruta secretora de las células huésped, puede proporcionarse una secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector recombinante. La secuencia señal secretora se une a la secuencia de ADN que codifica el péptido en el marco de lectura correcto. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el péptido. La secuencia señal secretora puede ser la asociada normalmente con el péptido o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada.
Los procedimientos usados para ligar las secuencias de ADN que codifican la molécula precursora del análogo del GLP-1, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia señal secretora, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica (consultar, por ejemplo, Sambrook y otros, más arriba).
La célula huésped en la que la secuencia de ADN o el vector recombinante se introduce puede ser cualquier célula que sea capaz de producir la molécula precursora del análogo del GLP-1 e incluye, pero sin limitarse a, células huésped de mamífero, células huésped de aves, células huésped de insectos, células huésped vegetales, células huésped bacterianas, células huésped fúngicas y células huésped de levaduras. Los ejemplos de células huésped adecuadas bien conocidas y usadas en la técnica incluyen, pero sin limitarse a Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y otras levaduras, E. coli, Bacillus subtilis, y Pseudomonas fluorescens o líneas celulares de mamíferos BHK o CHO.
Los métodos para introducir el ácido nucleico exógeno en los huéspedes se conocen bien en la técnica, y variarán con la célula huésped usada. La célula huésped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza una molécula precursora del GLP-1 que puede recolectarse posteriormente del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta al medio) o directamente de la célula huésped que lo produce (si no lo secreta).
En una modalidad, las moléculas precursoras del GLP-1 se producen en células de levadura. Los huéspedes de expresión de levadura se conocen bien en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans y C. Maltosa, Hansenula polimorfa, Kluyveromyces fragilis y K. lactis, Pichia guillerimoni, Pichia metanolica y Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, y Yarrwia lipolytica.
En una modalidad, las moléculas precursoras del GLP-1 se producen en sistemas bacterianos. Los huéspedes de expresión bacteriana se conocen bien en la técnica, e incluyen pero sin limitarse a E. coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Lactococcus lactis, Streptococcus cremoris, y Streptococcus nutridans.
En una modalidad, las moléculas precursoras del GLP-1 se expresan en hongos filamentosos. Los huéspedes de hongos filamentosos se conocen bien en la técnica, e incluyen pero sin limitarse a Neurospora, penicillium, tolipocladio, y Aspergillus huéspedes como Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzea y Aspergillus niger.
En una modalidad, las moléculas precursoras del GLP-1 se producen en células de insectos. Se han desarrollado sistemas de expresión para Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melangaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni. Cada una de estas líneas celulares se conoce por y está disponible para los expertos en la técnica de expresión de proteínas.
En una modalidad, las moléculas precursoras del GLP-1 se producen en otras células eucariotas superiores. Estas incluyen, pero sin limitarse a, células de aves y células vegetales tal como Chlamydomonas reinhardtii.
En una modalidad, las moléculas precursoras del GLP-1 se producen en líneas celulares huésped de mamífero. Los ejemplos de estasincluyen, pero sin limitarse a riñón de hámster bebé (BHK), ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Los ejemplos más específicos incluyen, pero sin limitarse a la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionaria humana (293); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065).
La célula huésped adecuada se selecciona por la persona experta en la técnica.
El medio usado para cultivar las células huéspedes puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer las células huésped, tales como medios mínimos o complejos que contengan los suplementos apropiados. Los medios adecuados están disponibles a través de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con fórmulas publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection).
La molécula precursora del análogo del GLP-1 producida por las células puede entonces separarse del caldo de cultivo o medio de cultivo mediante procedimientos convencionales que incluyen separar las células huéspedes del medio mediante centrifugación o filtración.
Como se mencionó anteriormente, es un aspecto de la presente invención acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora del análogo del GLP-1 expresada, para producir el compuesto más resistente a la peptidasa plasmática dipeptidil peptidasa 4 (DPP-IV). Tales aminoácidos no proteinogénicos pueden seleccionarse de Y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-aminoácidos tales como D-alanina y D-glutamina, D-alanina y D-leucina, Aib ( ácido a-aminobutírico), Abu ( ácido aaminobutírico), Tle (tert-butilglicina), 3-ácido aminometil benzoico, ácido antranílico, des-amino-Histidina, p-alanina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, a-fluorometilhistidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina, 4-piridilalanina, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, ácido (1-aminociclooctil) carboxílico, a-metil prolina, 1-metil histidina, 3-metil histidina, y ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-C]piridina-6-carboxílico p-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina. Por lo tanto, la desamino-histidina, aunque no contiene un grupo amino, se refiere en la presente descripción como aminoácido no proteinogénico, para facilitar su clasificación y nomenclatura.
En un aspecto, la longitud de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos es 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos o 4 aminoácidos.
En un aspecto de la invención, la longitud de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos es 2 aminoácidos o 4 aminoácidos.
En un aspecto, la longitud de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos es 1 aminoácido o 2 aminoácidos.
En un aspecto de la invención, la longitud de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos es 2 aminoácidos.
Se contempla que no todos los aminoácidos de la extensión de aminoácidos N-terminal necesariamente son aminoácidos no proteinogénicos.
En otros aspectos de la invención, la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
XSSy-XSSg- X33g- Xi3S.-| 3
en donde
Xaa7 se selecciona de L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina y 4-piridilalanina, 1-metil histidina, 3-metil histidina, y ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-C]piridina-6-carboxílico p-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina;
Xaa8 se selecciona de Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, o ácido (1-aminociclooctil) carboxílico y alfa-metil prolina
Xaag se selecciona de Glu, Asp, Y,Y-dimetil Glu, p,p-dimetil Glu y p,p-dimetil Asp, y
Xaaio se selecciona de Gly, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, y ácido (1-aminociclooctil) carboxílico.
El ácido carboxílico libre de la secuencia Xaa7-Xaas- Xaag-Xaa™ puede prepararse eficientemente en una solución o en una resina tal como resina de 2-clorotritlorcloruro, por ejemplo, mediante una estrategia basada en Fmoc mediante el uso de bloques de construcción protegidos adecuadamente mediante el uso de las condiciones de reacción adecuadas descritas en las referencias (Organic Synthesis on solid Phase, Florencio Zaragoza Dorwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000), (Novabiochem Catalog, Merck Biosciences 2006/2007) y (Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 0­ 19-963724-5). Los aminoácidos en la secuencia pueden estar protegidos o no protegidos. El péptido de extensión N-terminal de la secuencia Xaa7-Xaas-Xaa9-Xaa10 puede activarse a un agente de acilación activado. El término agente de acilación “activado” significa un agente de acilación que se ha activado mediante el uso de técnicas generales como por ejemplo, las descritas en “Amide bond formation and peptide coupling” [Tetrahedron 61(46), 10827-10852 (2005)].
Los ejemplos de ésteres activados incluyen, pero sin limitarse a cloruro de ácido, bromuros de ácidos, fluoruros de ácidos, anhídrido simétrico, anhídrido mezclado, ácidos carboxílicos activados mediante el uso de carbodiimidas comunes tales como, pero sin limitarse a, diisopropilcarbodiimida (DIPCDI), N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida hidrocloruro (EDC). Además, se incluyen, pero sin limitarse a, ácidos carboxílicos que usan los carbodiimidas antes mencionados y un aditivo tal como pero sin limitarse N-hidroxibenzotriazol (HOBt), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, 6-cloro-N-hidroxibenzotriazol (HOAt), 3-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (DhbToH). También se incluyen, pero sin limitarse a, ácidos carboxílicos activados con una sal de uronio o una sal de fosfonio, tal como, pero sin limitarse a, hexafluorofosfato de O-Benzotriazol-N,N,N'N-tetrametiluronio (HBTU), tetrafluoroborato de O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio (TBTU), hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (HCTU), tetrafluoroborato de (2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio) (TcTu ), hexafluorofosfato de 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronio (HATU), hexafluorofosfato de 1-benzotriazolioxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PYBOP). Otros ésteres activados incluyen, pero sin limitarse a ésteres de N-hidroxisuccinimida (éster NHS), pentafluorofenol éster (PfP-éster), 2,4-dinitrofenil éster, 4-nitrofenil éster, 3-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HODhbt) y Carbonildiimidazol (CDI), N-etil-5-fenilsoxazolium-3'-sulfonato (NEPIS), preferentemente un éster de N-hidroxisuccinimida o un éster HOBt o un derivado de este mediante el uso de las condiciones de reacción descritas en las referencias (Organic Synthesis on solid Phase, Florencio Zaragoza Dorwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000), (Catálogo Novabiochem, Merck Biosciences 2006/2007) y (Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5).
Un ejemplo de un péptido de extensión N-terminal que tiene la fórmula general Xaa7-Xaa8- Xaag-Xaa-10 es;
Figure imgf000014_0001
en donde R1 y R2 son grupos protectores elegidos individualmente tales como, pero sin limitarse a: Carbamatos que incluyen pero sin limitarse a 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), terc-butoxicarbonilo (Boc) y bencilcarbarmato (Cbz); Amidas que incluyen pero sin limitarse a benzamida; imidas que incluyen pero sin limitarse a N-ftalimida; y alquilos que incluyen pero sin limitarse a 1-adamantilo (1-Adoc) y trifenilmetilo (Trt). En una modalidad preferida R1 se selecciona del grupo que consiste en 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), terc-butoxicarbonilo (Boc) y bencilcarbamato (Cbz), y R2 se selecciona del grupo que consiste en terc-butoxicarbonilo (Boc) y trifenilmetilo (T rt). R3 es un grupo protector seleccionado individualmente tal como pero sin limitarse a: Ésteres que incluyen pero sin limitarse a metilo, etilo, terc-butilo, bencilo y 9H-fluoren-9-ilmetilo (Fm). En una modalidad preferida R3 es terc-butil o bencilo.
Un ejemplo de un péptido de extensión N-terminal de la secuencia Xaa7-Xaa8- Xaag-Xaai0 que se activa como el éster de N-hidroxisuccinimida correspondiente es;
Figure imgf000014_0002
en donde R1, R2, y R3 son grupos protectores seleccionados individualmente tal como se describió anteriormente. En un aspecto adicional de la invención, la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
Figure imgf000014_0003
en donde
Xaa7 se selecciona de L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na -acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina y 4-piridilalanina; 1-metil histidina, 3-metil histidina, ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-C]piridina-6-carboxílico p-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina; y
Xaa8 se selecciona de Gly, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, o ácido (1-aminociclooctil) carboxílico y alfa metil prolina
El ácido carboxílico libre de la secuencia Xaa7-Xaa8 puede prepararse eficientemente en una resina tal como resina de 2-clorotritlorcloruro, por ejemplo, mediante una estrategia basada en Fmoc mediante el uso de bloques de construcción protegidos adecuadamente mediante el uso de condiciones de reacción apropiadas como se describió anteriormente o alternativamente puede prepararse en solución. Los aminoácidos en la secuencia pueden estar protegidos o no protegidos.
El péptido de extensión N-terminal de la secuencia Xaa7-Xaa8 puede activarse a agentes de acilación activados como se describió anteriormente.
Un ejemplo de un péptido de extensión N-terminal con la fórmula Xaa7-Xaa8 es:
Figure imgf000015_0001
en donde R1 y R2 son grupos protectores seleccionados individualmente como se describió anteriormente.
Un ejemplo de un péptido de extensión N-terminal con la secuencia Xaa7-Xaa8 que se activa como el éster de N-hidroxisuccinimida correspondiente es;
Figure imgf000015_0002
en donde R1 y R2 son grupos protectores seleccionados individualmente como se describió anteriormente.
En un aspecto adicional de la invención, el análogo del GLP-1 producido de acuerdo con la invención, es un análogo del GLP-1 donde la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
Xaa7-Xaa8- Xaag- Xaa10 como se definió anteriormente;
y la molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 tiene la fórmula general
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 como se definió anteriormente. En un aspecto adicional de la invención, el análogo del GLP-1 producido de acuerdo con la invención, es un análogo del GLP-1 donde la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
Xaa7-Xaa8 como se definió anteriormente;
y la molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 tiene la fórmula general
Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 como se definió anteriormente.
El acoplamiento de análogos de aminoácidos adicionales en un fragmento polipeptídico no protegido tal como la molécula precursora del análogo del GLP-1 puede no ser una tarea trivial, debido a la gran cantidad de reacciones secundarias posibles que pueden tener lugar en las condiciones de reacción usadas. Un reactivo electrolítico como por ejemplo un éster activo tal como un éster de N-hidroxisuccinimida, en general, reaccionará con los nucleófilos presentes en un polipéptido. Tales nucleófilos pueden ser tioles, aminas, imidazoles, grupos hidroxi fenólicos, alcoholes, y guanidinas. La velocidad de acilación en los grupos funcionales dependerá de la reactividad inherente de los grupos individuales, pero también de la estructura primaria, secundaria, terciaria e incluso cuaternaria del polipéptido. Por lo tanto, a menudo será difícil predecir la reactividad relativa de diferentes porciones de aminoácidos en un polipéptido. En la práctica las reacciones en un polipéptido no protegido dan lugar a mezclas de productos. Sin embargo, la reactividad relativa de los grupos individuales en un polipéptido puede, en algunos casos, controlarse parcialmente por las condiciones en las que se realiza la reacción. Por lo tanto, un cambio en el pH en una mezcla de reacción puede conducir a una reactividad alterada de algunos grupos. Igualmente, un cambio en el solvente de uno no prótico a uno prótico puede resultar en una reactividad alterada de algunos grupos.
En el método de acuerdo con la invención, el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora del GLP-1 puede, en ciertas modalidades útiles, tener lugar en un solvente, que incluye un solvente polar orgánico seleccionado de 1-metilpirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida y W-metil-formamida.
En otras modalidades útiles, el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal puede tener lugar en una mezcla de solventes acuoso, tal como una mezcla de solventes acuosos que puede comprender un solvente polar orgánico, tal como un solvente seleccionado de 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida y W-metil-formamida.
Además, se ha descubierto que el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal de acuerdo con la invención, puede en modalidades útiles tener lugar en una mezcla de solventes acuosos, en donde el pH en la mezcla de reacción está entre 6 y 12, tal como entre 7 y 10. En modalidades adicionales el pH en la mezcla de reacción está en el intervalo de 7-8, 8-9, 9-10 o 10-12.
Como se mencionó previamente, los aminoácidos en la extensión de aminoácidos N-terminal que comprenden uno o más aminoácidos no proteinogénicos pueden comprender uno o más grupos de protección. Por lo tanto, se contempla que el método de acuerdo con la invención, puede comprender además una o más etapas de eliminar uno o más de estos grupos de protección de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos. Tales etapas de desprotección se describen bien en la literatura.
El método de acuerdo con la invención puede incluir una etapa adicional de acilación del grupo épsilon amino de al menos un residuo de lisina en la molécula precursora expresada o el análogo del GLP-1 obtenido del acoplamiento de la molécula de extensión N-terminal a la molécula precursora expresada, con un agente de acilación.
En ciertas modalidades, puede ser ventajoso llevar a cabo esta etapa antes del acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora del análogo del GLP-1. Por lo tanto, la molécula precursora del análogo del GLP-1 usada en el método de acuerdo con la invención puede acilarse en ciertas modalidades con un agente de acilación, activado opcionalmente, en, por ejemplo, un grupo épsilon amino de un residuo de lisina.
Por lo tanto, en un aspecto la presente invención se refiere a un método para producir un análogo o derivado del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de:
(i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora,
(ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo,
(iii) opcionalmente acilar el grupo épsilon amino de al menos un residuo de lisina en la molécula precursora expresada con un agente de acilación, que se activa opcionalmente, para obtener un derivado de la molécula precursora, y opcionalmente aislar dicho derivado de la molécula precursora,
(iv) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora expresada o derivado de la molécula precursora,
(v) aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados.
El método de acuerdo con la invención puede incluir opcionalmente además una etapa de proteger selectivamente el grupo épsilon amino de al menos un residuo de lisina con un agente protector de amina como se describió anteriormente.
En ciertas modalidades, puede ser ventajoso llevar a cabo esta etapa de protección antes del acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora del análogo del GLP-1. Por lo tanto, el derivado de la molécula precursora del análogo del GLP-1 con la lisina protegido resultante usado en el método de acuerdo con dicha modalidad de la invención puede acoplarse a la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos. Después de dicho acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal a la molécula precursora del análogo del GLP-1 con la lisina protegida, el(los) grupo(s) de protección en los grupos épsilon amina de cualquier lisina(s) puede eliminarse mediante el uso de técnicas convencionales y el grupo amino épsilon resultante de una lisina puede opcionalmente acilarse con un agente de acilación, activado opcionalmente.
Por lo tanto, en un aspecto la presente invención se refiere a un método para producir un análogo del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de:
(i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho péptido insulinotrópico en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora, (ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo,
(iii) proteger el grupo épsilon amino de al menos un residuo de lisina en la molécula precursora expresada con un agente protector para obtener una molécula precursora protegida, y opcionalmente aislar dicha molécula precursora protegida,
(iv) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora protegida para obtener un análogo del GLP-1 protegido y opcionalmente aislar dicho análogo del GLP-1 protegido,
(v) desprotección de los grupos de protección épsilon amino, y aislar opcionalmente el análogo del GLP-1 resultante, (vi) opcionalmente acilar el grupo épsilon amino de al menos un residuo de lisina en el análogo del GLP-1 con un agente de acilación, que se activa opcionalmente, para obtener un derivado de la molécula precursora,
(vii) aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados, como se conoce en la técnica.
En un aspecto, el agente de acilación usado en la acilación del grupo épsilon amino de un residuo de lisina es un análogo de ácido carboxílico de la fórmula general:
A-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH o A-B-C-D-OH
en donde un ácido carboxílico de terminal libre, tal como el grupo -OH de A-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH o A-B-C-D-OH, opcionalmente se activa y en donde cualquier otro ácido carboxílico libre contenido opcionalmente se protege con un grupo o grupos protectores adecuados, por ejemplo, seleccionados de pero sin limitarse a terc-butilo, bencilo o alilo y
en donde
A se selecciona del grupo que consiste en;
Figure imgf000017_0002
en donde n se selecciona del grupo que consiste en 14, 15, 1617, 18 y 19, p se selecciona del grupo que consiste en 10, 11, 12, 13 y 14, y d se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4 y 5, y m se selecciona del grupo que consiste en 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, k se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 y 27, y m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y R1 se selecciona del grupo de 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), terc-butoxicarbonilo (Boc), bencilcarbamato (Cbz)-B se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
en donde x se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3 y 4, e y se selecciona del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12,
C se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000018_0003
en donde b y e se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en 0, 1 y 2, y c y f se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en 0, 1 y 2 siempre y cuando b es 1 o 2 cuando c es 0, o b es 0 cuando c es 1 o 2, y e es 1 o 2 cuando f es 0, o e es 0 cuando f es 1 o 2, y D se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0001
en donde k se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 y 27 y m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, y 6.
En un aspecto los fragmentos A-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH o A-B-C-D-OH usados en la acilación de la £-N de una porción de lisina son derivados de ácido carboxílico que se activan a agentes de acilación activados como se describió anteriormente.
En un aspecto un grupo químico funcional libre, tal como un ácido carboxílico contenido en el fragmento A o C de los fragmentos A-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH o A-B-C-D-OH se protege con un grupo protector apropiado seleccionado de, pero sin limitarse a terc-butilo, bencilo o alilo.
Cuando se usa en la presente descripción el término “contenido” en relación con un péptido y/o un agente de acilación alrededor de un grupo químico funcional, tal como un ácido carboxílico, significará un grupo químico funcional presente en el péptido o agente de acilación.
Los derivados de ácido carboxílico pueden prepararse eficientemente en una resina tal como resina de 2-clorotritlorcloruro mediante una estrategia basada en Fmoc mediante el uso de bloques de construcción protegidos adecuadamente mediante el uso de las condiciones de reacción descritas en (Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5).
Un ejemplo de un fragmento A-B-C-D-OH es:
Figure imgf000019_0002
El análogo activado correspondiente podría ser el éster de N-hidroxisuccinimida;
Figure imgf000019_0003
Ejemplos de fragmentos A-B-C-D-:
Figure imgf000019_0004
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Ejemplos de fragmentos A-C-D-:
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
Ejemplos de fragmentos A-B-C-:
Figure imgf000022_0002
En todos los fragmentos específicos mencionados A-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH o A-B-C-D-OH cualquier ácido carboxílico libre contenido, puede protegerse opcionalmente con un grupo protector apropiado seleccionado de, pero sin limitarse a terc-butilo, bencilo o alilo.
En todos los fragmentos específicos mencionados A-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH o A-B-C-D-OH los centros quirales se especifiquen o no pueden ser el enantiómero R o S independiente de otros centros quirales en el mismo fragmento.
En una modalidad, cuando uno o más centros quirales están presentes, los fragmentos pueden estar en forma de una mezcla de enantiómeros.
En otra modalidad, cuando uno o más centros quirales están presentes, los fragmentos pueden estar en forma de un enantiómero puro, en donde cada uno de los centros quirales son R o S.
En otra modalidad, la quiralidad es como se representa en los fragmentos de la presente invención mencionados específicamente.
En un aspecto el grupo de protección de amina épsilon de un residuo de aminoácido de lisina puede seleccionarse de, pero sin limitarse a, los siguientes ejemplos:
Figure imgf000023_0001
En el método de acuerdo con la invención, la etapa de acilación en ciertas modalidades útiles puede tener lugar en un solvente, que incluye un solvente polar orgánico seleccionado de 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, WW-dimetilformamida y W-metil-formamida.
En una modalidad adicional, la etapa de acilación puede tener lugar en una mezcla de solventes acuosos, tal como una mezcla de solventes acuosos que comprende un solvente polar orgánico. Tal solvente polar orgánico puede seleccionarse ventajosamente de 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida y N-metil-formamida.
En una modalidad adicional, la etapa de acilación puede tener lugar en solución acuosa.
La cantidad de 1 -metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido y W,W-dimetilformamida o W-metil-formamida puede, en ciertas modalidades, ser de modo que la cantidad de dicho solvente sea menor que 80 % (v/v), tal como menor que 50 % (v/v). En otros aspectos la cantidad de 1 -metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida o N-metil-formamida está en el intervalo de aproximadamente 40-80 % (v/v), que incluye el intervalo de 40-45, 45-50, 50-60, 60-70 y 70-80 % (v/v). Se contempla además que el agente de acilación puede agregarse a la mezcla de reacción como un sólido.
El valor de pH de la mezcla de reacción de solventes acuosos en donde tiene lugar la etapa de acilación, es en modalidades útiles entre 9 y 13, tal como entre 10 y 12, que incluye entre 10,5 y 11,5. En modalidades adicionales el pH en la mezcla de reacción está en el intervalo de 9-10, 10-11, 11-12 o 12-13.
El agente de acilación usado de acuerdo con la invención puede comprender uno o más grupos de protección. Por lo tanto, se contempla que el método de acuerdo con la invención puede comprender además una o más etapas de eliminar uno o más de estos grupos de protección a partir del agente de acilación una vez que se ha acoplado a la molécula precursora del análogo del GLP-1. Tales etapas de desprotección se describen bien en la literatura.
La expresión eficiente de proteínas heterólogas en las células huésped, frecuentemente requiere que la proteína se exprese en forma de un propéptido, es decir, un polipéptido que tiene una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre). Sin embargo, esta secuencia líder no se quiere normalmente en el polipéptido deseado, y por lo tanto el método de acuerdo con la invención puede, en ciertos aspectos, incluir una etapa adicional de eliminar las extensiones propeptídicas en el N-terminal y/o C-terminal de la molécula precursora del análogo del GLP-1.
El método de acuerdo con la invención comprende una etapa de aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados, por ejemplo métodos de purificación estándar conocidos en la técnica.
También está dentro del alcance de la invención que los análogos del GLP-1 o derivados que resultan del método de acuerdo con la invención en ciertas modalidades pueden derivarse con una porción de unión a albúmina o pegilarse. Las secuencias líderes de la presente invención pueden estar en la forma optimizada como se enumera en la figura 4.
El término "porción de unión a albúmina" como se usa en la presente descripción significa un residuo que se une no covalentemente a la albúmina sérica humana. El residuo de unión a albúmina unido al polipéptido terapéutico tiene típicamente una afinidad por debajo de 10 jm para la albúmina de suero humano y preferentemente por debajo de 1 |jm. Se conoce un intervalo de residuos de unión a la albúmina entre las porciones lipófilas lineales y ramificadas que contienen de 4-40 átomos de carbono que tienen un grupo ácido distal.
Modalidades de acuerdo con la invención
1. Un método para producir un análogo o derivado del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de
(i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora,
(ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo,
(iii) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora expresada,
(iv) aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados.
2. Un método para producir un análogo o derivado del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de:
i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora,
ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo,
iii) proteger el(los) grupo(s) de lisina(s) de la molécula precursora,
iv) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora protegida, para obtener un análogo del GLP-1 protegido,
v) desproteger el grupo de lisina de dicho análogo del GLP-1 protegido,
vi) aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados.
3. Un método de acuerdo con las modalidades 1 o 2, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal se protege antes de su uso en la etapa de acoplamiento, donde una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos se acopla a la molécula precursora protegida y en donde el análogo del GLP-1 protegido se desprotege de nuevo después del acoplamiento de la extensión N-terminal.
4. Un método para producir un análogo o derivado del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de:
i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora,
ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo,
iii) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal protegida que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora expresada,
iv) desproteger cualquier grupo protector del análogo o derivado del GLP-1 protegido,
v) aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados.
5. Un método para producir un análogo o derivado del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de:
i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora,
ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo,
iii) proteger el(los) grupo(s) de lisina(s) de la molécula precursora,
iv) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal protegida que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos a la molécula precursora protegida, para obtener un análogo o derivado del GLP-1 protegido, v) desproteger cualquier grupo protector del análogo o derivado del GLP-1 protegido,
vi) aislar el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 se selecciona de la lista de moléculas precursoras que comprende la secuencia de aminoácidos de la fórmula general:
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
en donde
Xaa16 es Val o Leu;
Xaa18 es Ser, Lys o Arg;
Xaa19 es Tyr o Gln;
Xaa20 es Leu o Met;
Xaa22 es Gly o Glu;
Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Lys, Glu o Arg;
Xaa27 es Glu o Leu;
Xaa30 es Ala, Glu o Arg;
Xaa33 es Val, Lys, o Arg;
Xaa34 es Lys, Glu, Asn, His o Arg;
Xaa35 es Gly;
Xaa36 es Arg, Gly o Lys;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, o está ausente;
Xaa38 es Lys, Ser o está ausente.
Xaa39 es Ser, Lys, o está ausente;
Xaa40 es Gly o ausente.
Xaa4i es Ala o está ausente;
Xaa42 es Pro o está ausente;
Xaa43 es Pro o está ausente;
Xaa44 es Pro o está ausente;
Xaa45 es Ser o está ausente;
siempre y cuando si Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa4i, Xaa42, Xaa43, Xaa44 o Xaa45 está ausente, entonces cada residuo de aminoácido corriente abajo también está ausente.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde la molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 se selecciona de la lista de moléculas precursoras que comprende la secuencia de aminoácidos de la fórmula general:
Xaa9- Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
en donde
Xaa9 es Glu o Asp
Xaa10 es Gly o Ala
Xaa16 es Val o Leu;
Xaa18 es Ser, Lys o Arg;
Xaa19 es Tyr o Gln;
Xaa20 es Leu o Met;
Xaa22 es Gly o Glu;
Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Lys, Glu o Arg;
Xaa27 es Glu o Leu;
Xaa30 es Ala, Glu o Arg;
Xaa33 es Val, Lys, o Arg;
Xaa34 es Lys, Glu, Asn, His o Arg;
Xaa35 es Gly;
Xaa36 es Arg, Gly o Lys;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, o está ausente;
Xaa38 es Lys, Ser o está ausente.
Xaa39 es Ser, Lys, o está ausente;
Xaa40 es Gly o ausente.
Xaa41 es Ala o está ausente;
Xaa42 es Pro o está ausente;
Xaa43 es Pro o está ausente;
Xaa44 es Pro o está ausente;
Xaa45 es Ser o está ausente;
siempre y cuando si Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa4 i , Xaa42, Xaa43, Xaa44 o Xaa45 está ausente, entonces cada residuo de aminoácido corriente abajo también está ausente.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde la molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 se selecciona de la lista de moléculas precursoras que comprende la secuencia de aminoácidos de la fórmula general:
Xaa8-Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45
en donde
Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys
Xaa9 es Glu, Asp
Xaa10 es Gly, Ala
Xaa16 es Val o Leu;
Xaa18 es Ser, Lys o Arg;
Xaa19 es Tyr o Gln;
Xaa20 es Leu o Met;
Xaa22 es Gly o Glu;
Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg;
Xaa25 es Ala o Val;
Xaa26 es Lys, Glu o Arg;
Xaa27 es Glu o Leu;
Xaa30 es Ala, Glu o Arg;
Xaa33 es Val, Lys, o Arg;
Xaa34 es Lys, Glu, Asn, His o Arg;
Xaa35 es Gly;
Xaa36 es Arg, Gly o Lys;
Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, o está ausente;
Xaa38 es Lys, Ser o está ausente.
Xaa39 es Ser, Lys, o está ausente;
Xaa40 es Gly o ausente.
Xaa41 es Ala o está ausente;
Xaa42 es Pro o está ausente;
Xaa43 es Pro o está ausente;
Xaa44 es Pro o está ausente;
Xaa45 es Ser o está ausente;
siempre y cuando si Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa4i, Xaa42, Xaa43, Xaa44 o Xaa45 está ausente, entonces cada residuo de aminoácido corriente abajo también está ausente.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los aminoácidos no proteinogénicos en la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos, se seleccionan del grupo que consiste en Y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-aminoácidos tales como D-alanina y D-glutamina, D-alanina y D-leucina, Aib (a-ácido a-aminobutírico), Abu (ácido aaminobutírico), Tle (tert-butilglicina), ácido 3-aminometil benzoico, ácido antranílico, des-amino-histidina, p-alanina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, a-fluorometilhistidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina, 4-piridilalanina, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, ácido (1-aminociclooctil) carboxílico, a-metil prolina, 1-metil histidina, 3-metil histidina, y ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-C]piridina-6-carboxílico p-(1,2,4-triazol-1-yl)-alanina.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la longitud de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos es de 1 aminoácido.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-9, en donde la longitud de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos es 2 aminoácidos.
12. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-9, en donde la longitud de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos es 3 aminoácidos.
13. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-9, en donde la longitud de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos es de 4 aminoácidos.
14. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal comprende dos aminoácidos no proteinogénicos.
15. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-13, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal comprende tres aminoácidos no proteinogénicos.
16. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-13, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal comprende cuatro aminoácidos no proteinogénicos.
17. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
Xaa7-Xaa8- Xaa9- Xaa10
en donde
Xaa7 se selecciona de L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na -acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina y 4-piridilalanina, 1-metil histidina, 3-metil histidina, y ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-C]piridina-6-carboxílico p-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina
Xaa8 se selecciona de Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, o ácido (1-aminociclooctil) carboxílico y alfa-metil prolina
Xaa9 se selecciona de Glu, Asp, Y,Y-dimetil Glu, p,p-dimetil Glu y p,p-dimetil Asp, y
Xaa10 se selecciona de Gly, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, y ácido (1-aminociclooctil) carboxílico.
18. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-16, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
Xaa7-Xaa8
en donde
Xaa7 se selecciona de L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na -acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina y 4-piridilalanina; 1-metil histidina, 3-metil histidina, ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-C]piridina-6-carboxílico p-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina; y
Xaa8 se selecciona de Gly, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, o ácido (1-aminociclooctil) carboxílico y alfa metil prolina
19. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-16, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende un aminoácido no proteinogénico que tiene la fórmula general
Xaa7
en donde
Xaa7 se selecciona de D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na -acetilhistidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina y 4-piridilalanina; 1-metil histidina, 3-metil histidina, y ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-C]piridina-6-carboxílico p-(1,2,4-triazol-1-il)-alanina.
20. Un método de acuerdo con la modalidad 19, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal es desaminohistidina y la reacción de acoplamiento se lleva a cabo por una sal de 4-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonil)-etil]-1H-imidazol-1-io, tal como trifluoroacetato, con la molécula precursora expresada.
21. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
Xaa7-Xaa8- Xaag- Xaa10 como se define en la modalidad 17;
y el análogo del GLP-1 tiene la fórmula general
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 como se define en la modalidad 3.
22. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
Xaa7-Xaa8 como se define en la modalidad 18;
y el análogo del GLP-1 tiene la fórmula general
Xaa9-Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-T rp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 como se define en la modalidad 4.
23. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-5, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene la fórmula general
Xaa7 como se define en la modalidad 19;
y el análogo del GLP-1 tiene la fórmula general
Xaa8- Xaa9- Xaa10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-T rp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 como se define en la modalidad 4.
24. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 17-23, en donde el aminoácido C-terminal no proteinogénico o proteinogénico en las extensiones N-terminal Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10 o Xaa7-Xaa8 , o el aminoácido no proteinogénico Xaa7 se activa.
25. Un método de acuerdo con la modalidad 24, en donde el(los) aminoácido(s) activado(s) se selecciona(n) del grupo que consiste en: cloruro de ácido, bromuro de ácido, fluoruro de ácido, anhídrido simétrico, anhídrido mezclado, ácidos carboxílicos activados mediante el uso de carbodiimidas comunes, ácidos carboxílicos mediante el uso de carbodiimidas y un aditivo y ácidos carboxílicos activados con una sal de uronio o una sal de fosfonio.
26. Un método de acuerdo con la modalidad 24, en donde el(los) aminoácido(s) activado(s) se selecciona(n) del grupo que consiste en: ácidos carboxílicos activados mediante el uso de carbodiimidas comunes, diisopropilcarbodiimida (DIPCDI), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida hidrocloruro (EDC).
27. Un método de acuerdo con la modalidad 24, en donde el(los) aminoácido(s) activado(s) se selecciona(n) del grupo que consiste en: ácidos carboxílicos con carbodiimidas y un aditivo seleccionado del grupo que consiste en N-hidroxibenzotriazol (HOBt), 1-Hidroxi-7-azabenzotriazol, 6-cloro-N-hidroxibenzotriazol (HOAt) y 3-Hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (DhbT oH),
28. Un método de acuerdo con la modalidad 24, en donde el(los) aminoácido(s) activado(s) se selecciona(n) del grupo que consiste en: ácidos carboxílicos activados con una sal de uronio o una sal de fosfonio, O-Benzotriazol-N,N,N'N-tetrametil-uronio-hexafluoro-fosfato (HBTU), O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrafluoroborato de -tetrametiluronio (TBTU), 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronio hexafluorofosfato (HATU), 1-benzotriazolioxitris(dimetilamino)fosfonio hexafluorofosfato (BOP) benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PYBOP), ésteres de N-hidroxisuccinimida (éster NHS), pentafluorofenol éster (PfP-éster), 2,4-dinitrofenil éster, 4-nitrofenil éster, 3-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HODhbt) Carbonildiimidazol (CDI), N-etil-5-fenilsoxazolium-3'-sulfonato (NEPIS).
29. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene lugar en un disolvente polar orgánico seleccionado del grupo que consiste en l-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido N,N-dimetilformamida y N-metil-formamida.
30. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos.
31. Un método de acuerdo con la modalidad 30, en donde la mezcla de solventes acuosos comprende un solvente polar orgánico seleccionado del grupo que consiste en l-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido N,N-dimetilformamida y N-metil-formamida.
32. Un método de acuerdo con las modalidades 30 o 31, en donde el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos, en donde el pH en la mezcla de reacción está entre 4 y 12, preferentemente entre 6 y 10.
33. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde los aminoácidos en la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos comprenden uno o más grupos de protección.
34. Un método de acuerdo con la modalidad 33, que comprende además la etapa de eliminar uno o más grupos de protección de dicha extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos.
35. Un método de acuerdo con la modalidad 1, que comprende además la etapa de acilar el grupo épsilon amino de al menos un residuo de lisina en la molécula precursora expresada con un agente de acilación.
36. Un método de acuerdo con la modalidad 35, en donde el agente de acilación es un análogo de ácido carboxílico de la fórmula general;
A-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH o A-B-C-D-OH
que se activa y/o se protege opcionalmente con uno o más grupos de protección,
en donde
A se selecciona del grupo que consiste en;
Figure imgf000031_0001
en donde n se selecciona del grupo que consiste en 14, 15, 1617, 18 y 19, p se selecciona del grupo que consiste en 10, 11, 12, 13 y 14, y d se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4 y 5, y m se selecciona del grupo que consiste en 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, k se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 y 27, y m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y R1 se selecciona del grupo de 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), terc-butoxicarbonilo (Boc), bencilcarbarmata (Cbz).
B se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000031_0002
en donde x se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3 y 4, e y se selecciona del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12,
C se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000032_0002
en donde b y e se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en 0, 1 y 2, y c y f se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en 0, 1 y 2 siempre y cuando b es 1 o 2 cuando c es 0, o b es 0 cuando c es 1 o 2, y e es 1 o 2 cuando f es 0, o e es 0 cuando f es 1 o 2, y
D se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
en donde x se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 y 27 y m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, y 6.
37. Un método de acuerdo con la modalidad 36, en donde el ácido carboxílico A-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH o A-B-C-D-OH se activa al agente de acilación activado.
38. Un método de acuerdo con la modalidad 35, en donde dicha etapa de acilación tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos.
39. Un método de acuerdo con la modalidad 38, en donde dicha mezcla de solventes acuosos comprende un solvente polar orgánico.
40. Un método de acuerdo con la modalidad 39, en donde dicho solvente polar orgánico se selecciona del grupo que consiste en 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida y W-metilformamida.
41. Un método de acuerdo con la modalidad 40, en donde la cantidad de 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida o W-metil-formamida es menor que 80 % (v/v).
42. Un método de acuerdo con la modalidad 40, en donde la cantidad de 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida o W-metil-formamida es menor que 50 % (v/v).
43. Un método de acuerdo con la modalidad 40, en donde la cantidad de 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida o W-metil-formamida está en el intervalo de aproximadamente 40-80 % (v/v).
44. Un método de acuerdo con la modalidad 35, en donde el agente de acilación se agrega a la mezcla de reacción como un sólido.
45. Un método de acuerdo con la modalidad 35, en donde dicha etapa de acilación tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos, en donde el pH en la mezcla de reacción está entre 9 y 13, preferentemente entre 10 y 12 o incluso con mayor preferencia entre 10,5 y 11,5.
46. Un método de acuerdo con la modalidad 35, en donde el agente de acilación, que se activa opcionalmente, comprende uno o más grupos de protección.
47. Un método de acuerdo con la modalidad 46, que comprende además la etapa de eliminar uno o más grupos de protección de dicho agente de acilación activado.
48. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, que comprende además la etapa de eliminar una extensión propéptido N-terminal de la molécula precursora resultante.
49. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-47, que comprende además la etapa de eliminar una extensión propéptido C-terminal de la molécula precursora resultante.
50. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la célula huésped es una célula huésped de mamífero.
51. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-49, en donde la célula huésped es una célula huésped bacteriana.
52. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-49, en donde la célula huésped es una célula huésped de levadura.
53. Un método de acuerdo con la modalidad 52, en donde la célula huésped de levadura es Saccharomyces ceri visiae.
54. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el análogo del GLP-1 es un análogo o derivado del GLP-1(7-37) humano, GLP-2 humano, exendina-3 o exendina-4.
55. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el análogo del GLP-1 es un análogo o derivado del GLP-1(7-37) humano.
56. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde dicho análogo del GLP-1 se selecciona del grupo que consiste en Aib8-GLP-1(7-36)-amida, Aib8-GLP-1(7-37), Aib835 GLP-1(7-37), [Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37), [DesaminoHis7, Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37), [DesaminoHis7, Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)amida,
[DesaminoHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)amida,
[DesaminoHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)amida,
[DesaminoHis7, Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37),
[DesaminoHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37),
[DesaminoHis7, Glu22,Arg26, Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37),
[DesaminoHis7, Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)amida,
[DesaminoH is7,Arg34]GLP-1-(7-37), [Aib8, Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)amida,
[DesaminoHis7, Glu22 Arg26, Arg 34, Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)amida, [DesaminoHis7, Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys,
[DesaminoHis7, Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys,
[dDesaminoHis7,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys,
[DesaminoHis7, Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)amida,
y análogos de estos.
57. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el análogo del GLP-1 es la única sustancia biológicamente activa en la composición farmacéutica.
58. Un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el análogo del GLP-1 es un análogo de exendina-4.
59. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores que comprende una etapa de proteger selectivamente el grupo épsilon amino de al menos un residuo de lisina.
60. El método de acuerdo con la modalidad 59 en donde la etapa se agrega después de la etapa (ii) que separa la molécula precursora expresada del caldo de cultivo.
61. El método de acuerdo con la modalidad 59 en donde la etapa se agrega después de la etapa (iv) como se define en la modalidad 1 que aísla el análogo o derivado del GLP-1 resultante por medios adecuados.
62. El método de acuerdo con la modalidad 19, en donde el aminoácido N-terminal es desamino-histidina introducido por el agente de acilación activado 4-{3-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]-3-oxopropil}-1Himidazol-1-io
Figure imgf000034_0001
63. El método de acuerdo con la modalidad 19, en donde el aminoácido N-terminal es desamino-histidina introducido por el uso del agente acilado activado trifluoroacetato de 4-{3-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]-3-oxopropil}-1Himidazol-1-io
Figure imgf000035_0001
64. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene lugar en un disolvente polar orgánico seleccionado del grupo que consiste en 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido W,W-dimetilformamida y W-metil-formamida.
65. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-63, en donde el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos.
66. El método de acuerdo con la modalidad 65, en donde la mezcla de solventes acuosos comprende un solvente polar orgánico seleccionado del grupo que consiste en 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido W,W-dimetilformamida y W-metil-formamida.
67. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-63, en donde el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos, en donde el pH en la mezcla de reacción está entre 7 y 11, preferentemente entre 8 y 10.
68. Un método para introducir des-aminohistidina en un agente insulinotrópico con el uso del agente de acilación activado 4-{3-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]-3-oxopropil}-1Wimidazol-1-io:
Figure imgf000035_0002
69. Un método para introducir des-aminohistidina en un agente insulinotrópico con el uso del agente acilado activado trifluoroacetato de 4-{3-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]-3-oxopropil}-1Wimidazol-1-io
Figure imgf000035_0003
La presente invención se describirá ahora en más detalles en los siguientes ejemplos y dibujos no limitantes.
EJEMPLOS
Abreviaturas usadas:
Adoc: adamantiloxicarbonilo
Aib: ácido a-aminoisobutírico
Boc terc butiloxicarbonilo
CH3CN acetonitrilo
DCM: diclorometano
DIC: Diisopropilcarbodiimida
DIPEA: diisopropiletilamina
DMF: N,N dimetilformamida
EtOAc: Etilacetato
Et2O: éter dietílico
Fmoc: 9 H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo
HATU: hexafluorofosfato de 2-(7-azabenzotriazol-1-il-)-1,1,3,3 tetrametiluronio
HBTU: hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
H2O: agua
HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol
HOBt: 1-hidroxibenzotriazol
MeCN: acetonitrilo
Mtt: 4-Metiltritilo
PM: Peso molecular
NaOH: Hidróxido de sodio
NHS: N-Hidroxisuccinimida
NMP: 1-metil-pirrolidin-2-ona
OtBu: éster terc butilo
PyBop hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio
PibroP hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfonio
r.t: temperatura ambiente
OSu: éster de N-hidroxisuccinimida
tBu: terc butilo
TBME: terc-butilmetiléter
TEA: trietilamina
TFA: ácido trifluoroacético
TFFH Hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio
TIS: triisopropilsilano
Trt: Tritilo, trifenilmetilo
TSTU: tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio
Métodos generales
Método general para la preparación de péptidos (método A)
El péptido puede sintetizarse de acuerdo con la estrategia de Fmoc en un sintetizador de péptidos 433 Applied Biosystems en escala de 0,25 mmol o 1,0 mmol mediante el uso de los protocolos FastMoc UV suministrados por el fabricante que emplean acoplamientos mediados por HBTU hexafluorofosfato de (2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3 tetrametiluronio) o HATU ( hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio) en NMP (N-metilpirrolidona), y monitoreo UV de la desprotección del grupo de protección Fmoc. Las resinas basadas en Wang o tritilo pueden usarse como soporte sólido y los derivados de aminoácidos protegidos usados son Fmoc-aminoácidos estándar (suministrados de por ejemplo Anaspec, o Novabiochem) suministrado en cartuchos previamente pesados adecuados para el sintetizador ABI433A. El aminoácido N terminal se protege con Boc en el grupo alfa amino (por ejemplo, se usó Boc-His(Boc)OH para los péptidos con His en el N-terminal). La síntesis de los péptidos puede mejorarse en algunos casos mediante el uso de dipéptidos protegidos en el enlace amida del dipéptido amídico con un grupo que puede escindirse en condiciones ácidas, tales como, pero sin limitarse a, 2-Fmoc-oxi-4-metoxibencilo o 2,4,6-trimetoxibencilo. En los casos en que está presente una serina o una treonina en el péptido, pueden usarse dipéptidos de pseudoprolina (ver, por ejemplo, el catálogo de Novobiochem 2002/2003 o una versión más reciente, o WR Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403.
Método general para la preparación de péptidos (método B)
Un método alternativo de síntesis de péptidos es mediante la química de Fmoc en un sintetizador de péptidos Liberty basado en microondas (CEM Corp., Carolina del Norte). Las resinas de Wang o basadas en tritil pueden usarse como el soporte sólido. La química de acoplamiento se realiza con DIC/HOAt en NMP mediante el uso de soluciones de aminoácidos de 0,4 M en NMP y un exceso molar de 8-10 veces. Las condiciones de acoplamiento son 5 minutos a 70 °C. La desprotección se logra con piperidina al 5 % en NMP hasta 70 °C.
Las moléculas precursoras del GLP-1 pueden por ejemplo purificarse mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, HPLC de fase reversa o similares, en dependencia del tipo de polipéptido en cuestión.
Método general para la preparación de agentes de acilación A-OH A-B-C-D-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH y extensiones de aminoácidos N-terminal Xaa7-Xaa8-Xaag-Xaa10, Xaaz-Xaas y Xaa7
Los ácidos carboxílicos necesarios pueden prepararse en una resina de 2-clorotritilcloruro mediante el uso de química de Fmoc estándar. El primer ácido amino carboxílico protegido con Fmoc puede unirse a la resina de 2-clorotritilcloruro mediante el hinchamiento de la resina en un solvente adecuado como NMP, DCM, DMF o similar, preferentemente DCM. El ácido amino carboxílico Fmoc protegido adecuadamente se agrega junto con una base adecuada tal como DIPEA o TEA, y la resina se agita durante un periodo de tiempo adecuado tal como 30 min a r.t. La resina se lava con un solvente adecuado tal como NMP, DMF o DCM.
La desprotección de Fmoc se logra mediante el uso de piperidina en NMP, preferentemente piperidina al 20 % en NMP a r.t. durante 1 a 30 min, típicamente 10 min, antes de lavarse bien la resina con NMP, DMF o DCM. La etapa se repite hasta que se obtiene la desprotección completa, típicamente 3 veces o más.
El acoplamiento del siguiente ácido carboxílico amino protegido con Fmoc se logra mediante el uso de condiciones de acoplamiento estándar; la resina se hincha en un solvente como NMP, DMF, DCM o una mezcla de estos. Otra solución de ácido carboxílico amino protegido con Fmoc en un solvente como NMP, DMF, DCM o una mezcla de estos y HOBt o HOAt se agrega DIC o un equivalente de estos. Esta mezcla se agrega a la resina y la mezcla se agrega DIPEA o TEA y la mezcla se agita a r.t. durante 1 a 16 horas típicamente 3 horas. Alternativamente, la mezcla se agita durante 1 a 60 min antes de agregar DIPEA o TEA a la mezcla. Si el acoplamiento no se completa de acuerdo con la prueba de TNBS, la prueba de nihdrina o la prueba de cloranil la etapa se repite hasta la prueba negativa.
Alternativamente, la activación del ácido carboxílico amino protegido con Fmoc puede lograrse mediante el uso de los siguientes reactivos de acoplamiento; PyBOP, PyBroP, HBTU, HATU o TFFH.
La incorporación adicional de ácidos carboxílicos Fmoc-amino protegidos adecuadamente puede introducirse mediante el uso del procedimiento proporcionado anteriormente. La última etapa de acoplamiento que comprende la incorporación de un derivado de ácido carboxílico se introduce mediante el uso de las condiciones de acoplamiento descritas anteriormente.
La escisión de la resina puede lograrse mediante el tratamiento de la resina con 20 % de trifluoroetanol en DCM, DCM-TIPS-TFA (95,5:2,5:2) o hexafluoroisopropanol de 5 min a 3 horas para dar el derivado totalmente protegido. La escisión de la resina también puede lograrse mediante el uso de TFA-TIPS-Agua (95:2,5:2,5) de 5 min a 3 horas para proporcionar los derivados totalmente desprotegidos.
Alternativamente los derivados pueden prepararse en solución mediante el uso de procedimientos estándares descritos en la literatura.
Los bloques de construcción protegidos apropiadamente están disponibles comercialmente o pueden prepararse mediante el uso de procedimientos descritos en la literatura.
Xaa7 está disponible comercialmente o puede prepararse mediante procedimientos descritos en la literatura.
Método general para la activación de agentes de acilación A-OH A-B-C-D-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH y extensiones de aminoácidos N-terminal Xaa7-Xaa8-Xaag-Xaa-i0, Xaa7-Xaa8 y Xaa7
La activación de los aminoácidos requeridos puede lograrse mediante el uso de procedimientos estándar descritos en la literatura. Si se requiere un éster activo tal como un N-hidroxisuccinimida éster, el ácido carboxílico se disuelve en un solvente apropiado tal como THF, acetato de etilo, NMP o DMF. Un reactivo tal como hexafluorofosfato de O-(N-succin¡m¡d¡lo)-W,W,W’,W'-tetramet¡luron¡o se agrega a la solución junto con una base tal como DIPEA o TEA. La mezcla se agita a r.t. hasta que la reacción se completa típicamente de 3 a 16 horas. Alternativamente el ácido carboxílico puede disolverse junto con N-hidroxisuccinimida y tratarse con DIC. La mezcla del producto puede usarse directamente sin purificación adicional o puede someterse a un tratamiento acuoso.
Purificación
El péptido bruto se purificó mediante HPLC preparativa en una columna empacada con sílice C18. Después del secado el péptido bruto se disolvió en ácido acético al 50 % en H2O, se diluyó con H2O y se inyectó en la columna que después se eluyó con un gradiente de CH3CN de en agua y TFA al 0,1 % 10 ml/min durante 50 minutos a 40 °C. Las fracciones que contenían el péptido se recogieron y se liofilizaron después de la dilución con agua.
Análisis
LCMS
El LCMS se realizó en una configuración que consiste en un espectrómetro de masa de cuadrupolo simple Sciex API 100. El control del instrumento y la adquisición de datos se hicieron mediante el programa informático de control Sciex Sample que se ejecuta en una computadora con Windows 2000. La bomba de HPLC se conecta a dos recipientes de eluyente que contienen:
A: Ácido trifluoro acético al 0,05 % en agua
B: Ácido trifluoroacético al 0,05 % en acetonitrilo
El análisis se realizó a temperatura ambiente mediante la inyección de un volumen apropiado de la muestra (preferentemente 20 pl) en la columna que se eluyó con un gradiente de acetonitrilo.
Las condiciones del HPLC, los parámetros del detector y los parámetros del espectrómetro de masas usado se muestran en la tabla siguiente:
Columna: Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 pm
Gradiente: 5 % - 90 % de acetonitrilo lineal durante 7,5 min a 1,5 ml/min
Detección: 210 nm (salida análoga del DAD)
ELS (salida análoga del ELS) 40 °C
Modo de ionización de MS: API-ES
HPLC
Método 01_B4_2: El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema Waters 600S equipado con un detector de matriz de diodos Waters 996. Las detecciones de UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de un Symmetry 300 C18, 5 um, 3,9 mm x 150 mm, 42 oC. Se eluyó con un gradiente lineal de 5-95 % de acetonitrilo, 90-0 % de agua, y 5 % de ácido trifluoroacético (1,0 %) en agua durante 15 minutos a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min.
Método 02_B4_4: El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema Alliance Waters 2695 equipado con un detector de banda dual Waters 2487. Las detecciones de UV a 214 nm y 254 nm se registraron mediante el uso de un Symmetry300 C18, 5 um, 3,9 mm x 150 mm, 42 oC. Se eluyó con un gradiente lineal de 5-95 % de acetonitrilo, 90-0 % de agua, y 5 % de ácido trifluoroacético (1,0 %) en agua durante 15 minutos a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min.
Ejemplo 1
Construcción de sistemas de expresión de levaduras y producción de moléculas precursoras del análogo del GLP-1 (R34)GLP-1(8-37)
Los plásmidos de expresión son del tipo C-POT, similar a los descritos en el documento EP 171,142. Estos son vectores de expresión basados en 2|j caracterizados por contener el gen de triosa fosfato isomerasa (POT) de Schizosaccharomyces pombe para el propósito de selección y estabilización del plásmido en S. cerevisiae. Los plásmidos también contienen el promotor y terminador de triosa fosfato isomerasa de S. cerevisiae (Figura 1). Estas secuencias son similares a las secuencias correspondientes en el plásmido PkFN1003 (descrito en el documento WO 90100075) como todas las demás secuencias excepto las siguientes: 1) La secuencia del fragmento EcoRI-Xbal que codifica la proteína de fusión del líder y el producto de insulina. 2) Se ha introducido una mutación silente que resulta en la eliminación de un sitio Ncol en la región 2 j en el vector de expresión. Para facilitar la clonación de diferentes proteínas de fusión, la secuencia de ADN que codifica el líder pre-pro MFa1 se ha cambiado para incorporar un sitio de Ncol (ver Figura 2) y se denomina líder pre-pro MFa1*. Por lo tanto, el fragmento Ncol-Xbal se reemplaza simplemente por un fragmento Ncol-Xbal que codifica la molécula precursora del GLP-1 de interés. Tales fragmentos Ncol-Xbal pueden sintetizarse mediante el uso de oligonucleótidos sintéticos y PCR de acuerdo con técnicas estándares. Además del líder alfa, pueden usarse otros líderes.
Los fragmentos de ADN sintéticos que contienen secuencias que codifican (R34)GLP-1(11-37), (E22,R26,R34)GLP-1(8-37)K38 y (E22,R26,R34,K37)GLP-1(8-37) se obtuvieron de Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Alemania. El ADN sintético que codifica (E22,R26,R34)GLP-1(8-37)K38 y (E22,R26,R34,K37)GLP-1(8-37) se proporcionó con secuencias de ADN 3' y 5' que codifican la extensión N- y C-terminal para facilitar la expresión en levadura (Figura 2) y se denomina Ext1-(E22,R26,R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2 y Ext1-(E22,R26,R34,K37)GLP-1(8-37)-Ext2. El ADN sintético se digirió con Ncol y Xbal y se ligó al fragmento Ncol - Xbal del vector de expresión tipo cPOT modificado (Figura 1). Esto resultó en tres plásmidos de expresión Psa273, Psa277 y Psa278 que codifican (R34)GLP-1(11-37) (SEQ lD NO:6), Ext1-(E22,R26,R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2 (SEQ lD NO:7) y Ext1-(E22,R26,R34,K37)GLP-1(8-37)-Ext2 (SEQ lD NO:8), respectivamente.
Los plásmidos de expresión se propagaron en E. coli, se cultivaron en presencia de ampicilina y se aislaron mediante el uso de técnicas estándar (Sambrook y otros, 1989). El ADN plasmídico se verificó para el inserto mediante nucleasas de restricción apropiadas (por ejemplo, EcoRl, Ncol, Xbal) y se mostró mediante el análisis de secuencias para contener la secuencia adecuada de las moléculas del precursores del análogo del GLP-1 (R34)GLP-1(11-37), Ext1-(E22,R26,R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2 y Ext1-(E22,R26,R34,K37)GLP-1(8-37)-Ext2. (Figura 2).
Los plásmidos se transformaron en S. cerevisiae cepa ME1719 (MATa/a leu2/leu2 pep4-3/pep4-3 Atpi::LEU2/Atpi::LEU2 Aura3/Aura3 Ayps1::URA3 / Ayps1::ura3 Cir+). Esta cepa se describe en el documento WO 98/01535. Los transformantes de levadura que contienen el plásmido se seleccionaron por la utilización de glucosa como fuente de carbono en YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 %, glucosa al 2 %) placas de agar (2 %). Esto resultó en cepas de tres levaduras: ySA251, ySA259 y ySA260 que expresan (R34)GLp-1(11-37) (s Eq lD NO:9), Ext1-(E22,R26,R34)GLP-1(8-37)K38-Ext2 (SEQ lD NO:10) y Ext1-(E22,R26,R34,K37)GLP-1(8-37)-Ext2 (SEQ lD NO:11), respectivamente.
Las cepas de levadura ME1719 ySA251, ySA259 y ySA260 se inocularon en 5 ml de medio de cultivo, por ejemplo un medio que consiste en 5 g/L (NH4)2DE SO4, 184 mg/L (NH4)2HPO4, 2,88 g/L KH2PO4, 1,42 g/L MgSO4/H2O, 1,28 g/L, K2DE SO4, ácido succínico a 10,00 g/L, casaminoácidos a 10,00 g/L, FeSO47H2O de 0,0112 g/L, 0,0086 g/L de MnSO4H2O, 0,0014 g/L de CuSO45 H2O, 0,00185 g/L de ZnSO47H2O, 0,0129 g/L de CaCl2.2H2O, ácido cítrico a 0,071 g/l, m-inositol a 28,0 mg/l, cloruro de colina a 14,0 mg/l, tiamina a 2,8 mg/l, niacinamida a 2,8 mg/l, ácido Capantoténico a 2,1 mg/l, biotina a 0,14 mg/l, ácido fólico a 0,14 mg/l, glucosa a 40 g/l. El cultivo se llevó a cabo en 30 °C durante 3 días. Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante para el análisis cuantitativo de HPLC mediante el cual se midió la concentración del análogo del GLP-1 secretado. La identidad de las moléculas precursoras del GLP-1 se confirmó por análisis LC/MS. Las extensiones N- y C-terminal empleadas para facilitar la expresión de (E22,R26,R34)GLP-1(8-37)K38 y (E22,R26,R34,K37)GLP-1(8-37) se eliminaron por Proteasa 1 de lisina específica de Lyromobactor Lyticus de acuerdo con procedimientos bien establecidos.
Ejemplo 2
Construcción del sistema de expresión de levaduras y producción de la molécula precursora del análogo del GLP-1 (R34)GLP-1(9-37)
Un fragmento de ADN sintético que codifica (R34)GLP-1(9-37) se construyó por PCR estándar mediante el uso de los cebadores 5'-AGGGGTATCCAT GGCT AAGAGAGAAGGT ACCTT CACCT CT GAC-3' y 5'-AATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCG-3' y un plásmido que contiene la secuencia de ADN que codifica (R34)GLP-1(7-37). Los cebadores se diseñaron con un sitio 5' Ncol y un sitio 3' Xbal. Por lo tanto, el fragmento de PCR podría digerirse por Ncol y Xbal después de la purificación y ligarse al fragmento del vector Ncol - Xbal del vector de expresión de tipo cPOT modificado descrito en el Ejemplo 1. El plásmido resultante que codifica (R34)GLP-1(9-37) se denominó Psa82.
El plásmido de expresión se propagó en E. coli, se cultivó en presencia de ampicilina y se aisló mediante el uso de técnicas estándar (Sambrook y otros, 1989). El ADN plasmídico se verificó para el inserto por nucleasas de restricción apropiadas (por ejemplo, EcoRI, NcoI, XbaI) y se mostró mediante el análisis de secuencias para contener la secuencia adecuada de la molécula precursora del análogo del GLP-1 (R34)GLP-1(9-37).
El plásmido se transformó en la cepa ME1719 de S. cerevisiae y un transformante de levadura que contiene el plásmido se seleccionó como se describe en el Ejemplo 1. La cepa de levadura resultante que expresa (R34)GLP-1(9-37) se denominó ySA96.
La cepa de levadura se cultivó en medio de cultivo y (R34)GLP-1(9-37) se recuperó del medio como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Construcción de sistemas de expresión en levaduras para precursores del GLP-1
El líder y los sitios de escisión Kex2p se optimizaron para aumentar el rendimiento de expresión del péptido secretado y procesado. Los fragmentos de ADN sintético que codifican varios líderes y constructos (R34)GLP-1(11-37), o (R34)GLP-1(9-37) se amplificaron por PCR estándar. Los cebadores directos incluyeron un sitio NcoI y la secuencia que codifica la secuencia líder optimizada. Los cebadores inversos incluyeron un sitio XbaI. Por lo tanto, permitiendo la clonación de los fragmentos de PCR restringidos por NcoI-XbaI en el vector de expresión tipo cPOT restringidos por NcoI-XbaI. Consulte la figura 4 para ver las secuencias, la numeración del plásmidos de los constructos de expresión que codifican (R34)GLP-1 (11-37) y los nombres de las cepas.
Los plásmidos de expresión se propagaron en E. coli en presencia de ampicilina y se aislaron mediante el uso de técnicas estándar (Sambrook y otros, 1989). Los constructos de plásmidos se verificaron por digestión de endonucleasa de restricción mediante el uso de enzimas de restricción apropiadas. Las secuencias codificantes se verificaron por secuencia.
Los plásmidos se transformaron en la cepa ME1719 de S. cerevisae. Las células de levadura que contienen el plásmido se seleccionaron como se describe en el Ejemplo 1. El cultivo de las cepas de levadura fue esencialmente como se describe en el Ejemplo 1
La optimización de la secuencia en la cercanía del sitio de escisión Kex2p, P1 a P6, condujo a un aumento modesto en el rendimiento (figura 4: B). Se exploró la incorporación de una Prolina en la secuencia (P3 a P6) como un medio potencial para aumentar la exposición del sitio de escisión Kex2p a Kex2p. Aunque, esto se ha vuelto así para no ser el caso para (R34)GLP-1(11-37) puede observarse un efecto beneficioso para (R34)GLP-1(11-37) (figura 4:H, I). La variación de los residuos P7 a P11 tuvo un efecto pronunciado sobre el rendimiento de la expresión, se observaron aumentos de 2-2,5 veces cuando se introdujeron motivos que contienen aminoácidos cargados (Figura 4: M-Z, K5-7, L2-4). Se ha diseñado una serie de constructos para el procesamiento con DAP-1 (dipeptidil aminopeptidasa) en el proceso corriente abajo (figura 4: G, J, K, L). Los constructos J y L contienen una Q en la posición antes de Thr-11, para proteger contra la escisión promiscua por parte de DAP-1 del péptido GLP-1. Esta Gln puede eliminarse posteriormente mediante el uso de las enzimas Q-ciclasa y pGAPasa (Qiagen).
Tabla 1.
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0002
Ejemplo 4
Preparación de la extensión N-terminal Boc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OH
Figure imgf000041_0001
Se prehinchó la resina de 2-dorotritilcloruro (1 % de DVB, 1,4 mmol/g, 10 g, 14,0 mmol) en DCM antes de agregar una solución de Fmoc-Gly-OH (8,3 g, 28 mmol) y DIPEA (9,03 g, 70 mmol) en 100 ml de DCM, y se agitó durante 30 min a r.t.. La resina se lavó con NMP (2 x 100 ml) y 2 x 100 ml de DCM-MeOH-DIPEA (80:15:5, 10 min) después NMP (3 x 100 ml), antes del tratamiento con piperidina al 20 % en NMP (3 x 100 ml) durante 10 min cada una. La resina se lavó con NMP (6 x 100 ml), DCM (2 x 100 ml) y MeOH (2 x 100 ml) y se secó durante la noche al vacío. La resina se trató con 100 ml de piperidina al 20 % en n Mp durante 10 min. La etapa se repitió dos veces antes de lavarse con NMP (5 x 100 ml).
Fmoc-Glu(O-tBu)-OH (23,8 g, 56 mmol) se disolvió en una mezcla de 100 ml de NMP y 20 ml de DCM. Se agregó HOAt (7,62 g, 56 mmol) seguido por adición en forma de gotas de DIC (7,07 g, 56 mmol). La mezcla se agitó durante 15 min antes de agregar DIPEA (9,03 g, 70 mmol), y la mezcla se transfirió a la resina. La resina se agitó durante 16 h antes de lavarse con NMP (4 x 100 ml). La resina se trató con piperidina al 20 % en NMP (100 ml) durante 10 min. La etapa se repitió dos veces antes de lavarse con NMP (5 x 100 ml).
Fmoc-Aib-OH (18,22 g, 56 mmol) se disolvió en una mezcla de 100 ml de NMP y 20 ml de DCM. Se agregó HOAt (7,62 g, 56 mmol) seguido por adición en forma de gotas de DIC (7,07 g, 56 mmol). La mezcla se agitó durante 20 min antes de agregarla a la resina. La mezcla se agitó durante 30 min antes de agregar DIPEA. La mezcla se agitó durante 16 h antes de lavar la resina con NMP (4 x 100 ml). La resina se trató con piperidina al 20 % en NMP (100 ml) durante 10 min. La etapa se repitió dos veces antes de lavar con NMP (5 x 100 ml).
Se disolvió Boc-His(Boc)-OH (19,9 g, 56 mmol) en una mezcla de 100 ml de NMP y 20 ml de DCM. Se agregó HOAt (7,62 g, 56 mmol) seguido por adición en forma de gotas de DIC (7,07 g, 56 mmol). La mezcla se agitó durante 20 min antes de agregarla a la resina. La mezcla se agitó durante 30 min antes de agregar DIPEA. La mezcla se agitó durante 16 h antes de lavar la resina con NMP (3 x 100 ml), DCM (4 x 100 ml).
Se agregó trifluoroetanol-DCM (1:4, 125 ml) y la resina se agitó durante 1 hora. Se recogió el filtrado y se agregó una nueva parte de trifluoroetanol-DCM (1:4, 125 ml) y se agitó durante 15 min. Se recogió el filtrado y se retiró el solvente al vacío para dar un aceite claro. Se agregó éter de dietilo frío (300 ml) en donde se formó un precipitado blanco. Se agregó éter de petrol claro (100 ml) y el precipitado se filtró, se lavó con éter de dietilo y se secó al vacío. Rendimiento 7,3 g.
HPLC (Método 01_B4): Rt = 7,8 min
LCMS:m/z = 944 (M+H)+
PM calculado = 943,2
Ejemplo 5
Preparación de la extensión N-terminal Boc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OSuc
Figure imgf000042_0001
Se agregó una solución de Boc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OH (1,0 g, 1,47 mmol) en THF seco (60 ml), DIPEA (0,47 g, 3,66 mmol) y hexafluorofosfato de 0-(W-succinim¡dilo)-W,W,W',W-tetrametiluronio (1,10 g, 3,66 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. Se agregó diclorometano (250 ml) y la solución se lavó con H2O (2 x 100 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 1,1 g de Boc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OSu.
HPLC (Método 01_B4):Rt = 8,3 min
LCMS: m/z = 780,9 (M+H)+
PM calculado = 779,9
Ejemplo 6
Preparación del agente de acilación éster ter-butilo del ácido 17-((S)-1-terc-Butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)etoxi]etilcarbamoil}metoxi)etoxi]etilcarbamoil}propilcarbamoil)heptadecanoico
Figure imgf000043_0001
El compuesto del título se preparó mediante el método general para la preparación y activación de agentes de acilación A-OH A-B-C-D-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH como se describió anteriormente y similar al ejemplo 4.
HPLC (Método 01_B4):Rt = 16,2 min
LCMS:m/z = 944 (M+H)+
PM calculado = 943,2
Ejemplo 7
Preparación del agente de acilación ácido 17-((S)-1-carboxi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-heptadecanoico
Figure imgf000043_0002
El éster de terc-butilo del ácido 17-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)etoxi]etilcarbamoil} metoxi)etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil) heptadecanoico se disolvió en TFA y la solución resultante se agitó durante 2 h y se evaporó al vacío hasta la sequedad. El aceite resultante se coevaporó con tolueno tres veces hasta la sequedad lo que dio lugar a un residuo aceitoso
LCMS: m/z = 831 (M+H)+
Ejemplo 8
Preparación del derivado del GLP-1 [Arg34]GLP-1-(11-37)-N-épsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino) butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] [Aib8,Arg34,]GLP-1-(7-37).
Figure imgf000043_0003
[Arg34]GLP-(11-37) (50 mg, 0,017 mmol) se disolvió en 2 ml de agua y se agregó DIPEA (89 pl, 0,51 mmol). La mezcla se agitó durante 10 min antes de que el pH se midiera a 10,6. Luego una solución del éster terc-butilo del ácido 17-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil} metoxi)etoxi]etilcarbamoil}-propilcarbamoil)- heptadecanoico (20,5 mg, 0,022 mmol) en MeCN (1.5 ml) se agregó en forma de gotas durante 10 min. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora antes de eliminar MeCN al vacío y la solución se liofilizó.
El residuo resultante se disolvió en NMP (2 ml) en donde se agregó DIPEA (22 pl, 0,17 mmol) y Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu (26 mg, 0,033 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 4 horas antes de agregar una parte adicional de His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu (13 mg 0,017 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. Se agregó éter de dietilo frío (20 ml) en donde se formó un precipitado blanco. El precipitado se aisló mediante centrifugación y el sobrenadante se decantó. El precipitado se lavó con 10 ml de éter de dietilo y se secó en el aire.
Desprotección
El intermedio bruto se disolvió en TFA-triisopropilsilano-H2O (95:2,5:2,5, 10 ml) y se agitó durante 3 h, en donde la solución se concentró al vacío a la aplicación de 1 ml. Se agregó éter de dietilo frío (20 ml) en donde se formó un precipitado. El precipitado se aisló mediante centrifugación y el sobrenadante se decantó. El precipitado se lavó con éter dietílico y se secó. El compuesto bruto se disolvió en ácido acético-H2O (3:7) (10 ml) y se purificó en HPLC. HPLC (Método 02_B4): Rt = 9,6 min
LCMS: m/z = 1372,5 (M+3H)3+
PM calculado = 4113,7
Ejemplo 9
Preparación del derivado del GLP-1 péptido N-épsilon26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-ferc-butoxicarbonilheptadecanoilamino)-4(S)-ferc-butoxicarbonilbutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetilHArg34]GLP-1-(9-37).
Figure imgf000044_0001
A una solución del éster de terc-butilo del ácido 17-{(S)-1-terc-butoxicarbonil-3-[2-(2-{[2-(2-carboxiloxietoxi)etilcarbamoil]metoxi} etoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil} heptadecanoico} (94,0 mg, 0,112mmol) en NMP (2,0 ml) se agregó hexafluorofosfato de O-(1-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TSTU, 41,7 mg, 0,139mmol) y TEA (96,0 pl, 0,69 mmol). Después de agitar durante 30 min. a temperatura ambiente la mezcla se agregó en forma de gotas a una solución del péptido [Arg34]GLP-1-(9-37) (220 mg, 0,069 mmol) en agua (9 ml) y TEA (96,0 pl, 0,69 mmol). Luego de agitarse durante 30 min adicionales a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con agua (30 ml) y se liofilizó durante 16 h dando una mezcla oleosa/amorfa que se disolvió en una mezcla de ácido acético-acetonitrilo-agua (30:20:50, 180 ml), se filtró y purificó por HPLC para dar péptido N-épsilon26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-ferc-butoxicarbonilheptadecanoil-amino)-4(S)-fercbutoxicarbonilbutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil]-[Arg34]GLP-1-(9-37).
HPLC (Método 02_B4_4): Rt = 12,1 min
LCMS: m/z = 1335,5 (M+3H)3+
PM calculado = 4003,6
Ejemplo 10
Preparación del análogo del GLP-1 péptido N-épsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)-butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]-etoxi}etoxi)-acetil] [Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37).
Figure imgf000044_0002
A una solución de Boc-His(Boc)-Aib-OH (23 mg, 0,052 mmol) en NMP (2,0 ml) se agregaron hexafluorofosfato de 2-(1H-9-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU, 20 mg, 0,052 mmol) y TEA (29 pl, 0,208 mmol). Luego de agitarse durante 45 min. se agregó la mezcla a una solución de N-épsilon26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-fercbutoxicarbonilheptadecanoilamino)-4(S)-ferc-butoxicarbonilbutiramino]etoxi)etoxi] acetilamino)-etoxi]etoxi)acetil]-péptido [Arg34]GLP-1-(9-37) (83 mg, 0,021mmol) y TEA 3,6 ul, 0,026 mmol). Después de agitarse durante 14 días la mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml) y se purificó mediante HPLC. Las fracciones purificadas se agruparon y se retiró el solvente orgánico al vacío antes de liofilizar el residuo durante 16 h.
Al residuo se agregó una mezcla de trifluoroacético-triisopropilsilano-agua (94:3:3,10 ml). Luego de agitar durante 2 horas, la mezcla de reacción se evaporó al vacío, el residuo se disolvió en una mezcla de amoniaco-agua (99:1,100 ml) y se purificó mediante HPLC preparativa para dar el compuesto del título.
HPLC (Método 02_B4_4): Rt = 9,4 min
LCMS: m/z = 1372 (M+3H)3+
PM calculado = 4113,7
Ejemplo 11
Preparación del agente de acilación éster terc-butilo del ácido 20-[4-((S)-1-tert-Butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]etilcarbamoil}metoxi)etoxi]etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-piperidin-1-il]-20-oxo-icosanoico
Figure imgf000045_0001
El compuesto del título se preparó mediante el método general para la preparación y activación de agentes de acilación A-OH A-B-C-D-OH, A-C-D-OH, A-B-C-OH como se describió anteriormente y similar al ejemplo 4.
LCMS: m/z = 1111 (M+H)+
LCMS: m/z = 1082,6 (M+H)+
PM calculado = 1082,4
Ejemplo 12
Preparación del análogo del GLP-1 péptido [Des amino-His7,Glu22,Arg26,34,Lys37(Lys(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-Carboxi-4-{[1-(19-carboxinonadecanoil)piperidina-4-carbonil]amino}-butirilamino)etoxi]-etoxi}-acetilamino)etoxi]etoxi}-acetil)]- GLP-1(7-37)
Figure imgf000045_0002
A una solución del péptido [Glu22,Arg26,34,Lys37]GLP-1-(8-37) (46 mg, 0,013 mmol) en 2 ml de agua se agregó DIPEA (50,4 mg, 0,39 mmol) y la mezcla se agitó durante 10 min antes de agregar en forma de gotas una solución del éster terc-butilo del ácido 20-[4-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-piperidin-1-il]-20-oxo-icosanoico (32,4 mg, 0,03 mmol) en un 1 ml de MeCN en el transcurso de 15 min. La mezcla de reacción se agitó por 20 min antes de agregar agua (20 ml), y la solución se liofilizó.
El residuo resultante se disolvió en NMP (1 ml) y la mezcla del ácido 4-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonil)-etil]-imidazol-1-carboxílico adamantan-1-il éster (éster de Adoc-des amino His-OSu) se agitó durante 3 horas antes de agregar en forma de gotas a dietil éter frío (20 ml). El precipitado blanco se aisló mediante centrifugación y se lavó dos veces con éter de dietilo (20 ml) y se secó.
El residuo resultante se trató con TFA-TIPS-agua (95:2,5:2,5, 1 ml) durante 3 horas antes de agregar en forma de gotas a dietil éter frío (10 ml). El precipitado blanco se aisló mediante centrifugación y se lavó dos veces con éter de dietilo (10 ml). El residuo se purificó mediante HPLC preparativa para dar el compuesto del título
HPLC (Método 01_B4_2): Rt = 11.1 min
LCMS: m/z = 1484 (M+3H)3+
PM calculado = 4452,1
Ejemplo 13
Preparación del ácido 4-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonil)etil] imidazol-1-carboxílico adamantan-1-il éster
Figure imgf000046_0001
Se disolvió ácido 4-(2-carboxietil) imidazol-1-carboxílico adamantan-1-il éster (1 g, 3,1 mmol) en THF (5 ml) y DMF (10 ml). La solución se enfrió hasta 0 °C y se agregaron TSTU y DIEA. La solución se agitó a 0 °C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 16 h. La muestra se concentró al vacío. EtOAc (100 ml) se agregó, y la solución se lavó con 0,2 N de HCl (2 x 50 ml), se secó sobre MgSO4, y se concentró al vacío para producir un residuo cristalino pegajoso (1,18 g, 90 % de rendimiento). El producto bruto se usó sin purificación adicional.
LCMS:m/z = 416,2 (M+H)
1H-NMR (DMSO, 300 Mhz) (señales seleccionadas) 88,22 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 3,02 (t, 2H), 2,82-2,88 (m, 2H), 2,81 (s, 4H), 2,19 (s-br, 9H), 1,66 (s, 6H).
Ejemplo 14
Preparación del análogo del GLP-1 péptido N-épsilon37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-carboxi-3-{[1-(19-carboxinonadecanoil)piperidina-4-carbonil]amino}propionilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil [Glu22, Arg26,34, Lys 37] GLP-1 (8-37)
Figure imgf000046_0002
El análogo del GLP-1 se preparó mediante el uso de un sintetizador de péptido CEM Liberty que comienza con una resina de Wang Fmoc-Lys(Mtt). Después que se eliminó el grupo Fmoc de Ala8, el N terminal se protegió al realizar un doble acoplamiento con di-ferc-butil dicarbonato. El grupo Mtt se eliminó mediante el lavado de la resina con DCM, el tratamiento de la resina con hexafluoroisopropanol durante 15 min a r.t y el lavado de la resina con DCM. Las modificaciones de N-épsilon 37 se prepararon en el sintetizador de péptido CEM Libert mediante el uso de reactivos protegidos con Fmoc y ácido eicosanodioico mono-terc-butil éster. El péptido bruto se escindió de la resina TFA-TIPS-Agua (95:2,5:2,5) y se precipitó en éter frío, y se aisló mediante centrifugación. El péptido bruto se purificó mediante HPLC preparativa (4 cm de diámetro x 200 mm, C18, 60 ml/min, 33-53 % de acetonitrilo).
LCMS:m/z = 1065,8 (M+4H)4+
Ejemplo 15
Preparación del análogo del GLP-1 péptido N-épsilon 37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-carboxi-3-{[1-(19-carboxinonadecanoil)piperidina-4-carbonil]amino}propionilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil [Des amino-His(Adoc) 7, Glu22, Arg26,34, Lys 37]GLP-1(7-37)
El análogo del GLP-1 péptido N-épsilon37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-carboxi-3-{[1-(19-carboxinonadecanoil)piperidina-4-carbonil]amino}propionilamino)etoxi]etoxi}acetilamino)etoxi]etoxi}acetil[Glu22,Arg26,34, Lys 37]GLP-1 -(8-37) (2,1 mg, 0,001 mmol) se disolvió en NMP (105 j L). Una solución de ácido 4-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonil)etil]imidazol-1-carboxílico adamantan-1-il éster se preparó al disolver 25,3 mg en 1296 j l de NMP, y 25 j l de esta solución se agregó a la solución del péptido seguido por DIEA (0,9 jl). La conversión al producto se siguió por análisis de LCMS. Después de 2 h a r.t, se observó que la relación de la señal de ELS del producto al péptido inicial fue 976:28 (97 % de conversión).
LCMS: m/z = 1141,1 (M+4H)4+
Ejemplo 16
Preparación del agente de acilación ácido 19-{[trans-4-((S)-1-Carboxi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-ciclohexilmetil]-carbamoil}-nonadecanoico
Figure imgf000047_0001
Ácido 19-{[frans-4-((S)-1-ferc-butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxi carbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-ciclohexilmetil]-carbamoil}-nonadecanoico ferc-butil éster (1,0 g, 0,9 mmol) se agitó en TFA (10 ml) durante 1h 45 min antes de agregar 100 ml de éter de dietilo frío. El precipitado blanco se aisló mediante centrifugación y se lavó 3 x con éter de dietilo para dar el compuesto del título. El precipitado se secó al vacío durante 16 horas.
LCMS: m/z = 999 (M+1)+
Ejemplo 17
Preparación del análogo del GLP-1 péptido N-épsilon37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-carboxi-4-({trans-4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil}amino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil][Desamino His7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
Figure imgf000047_0002
[Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(8-37) preparado por medio de una técnica recombinante (300 mg, 0,09 mmol) disuelta en 6 ml de agua se agregó DIPEA (373 jl, 2,19 mmol) y se agitó durante 10 min en donde una solución de ácido 19-{[frans-4-((S)-1-carboxi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxi carbonilmetoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-ciclohexilmetil]-carbamoil}-nonadecanoico (175,7 mg, 0,18 mmol) en NMP (1,7 ml) se agregó en forma de gotas. La mezcla se agitó durante 90 min antes de agregar Na2HPO4x7H2O (470,6 mg, 1,76 mmol) y el pH se ajustó a 8,4 mediante el uso de 1 N de HCl.
En otro matraz, ácido 3-(1H-Imidazol-4-il)-propiónico (93,2 mg, 0,53 mmol), tetrafluoroborato O-(N-succinimidilo)-N,N,N'N'-tetrametiluronio de (159,0 mg, 0,53 mmol) y DIPEA (180 pl, 1,06 mmol) se mezcló en n Mp (0,75 ml) y la solución se agitó durante 1 hora antes de agregar en forma de gotas la mezcla de reacción que contiene el péptido. La mezcla se agitó durante 14 horas, en donde se agregó piperidina (350 pl, 3,51 mmol). La mezcla se agitó durante otras dos horas, antes de diluirla con agua hasta un volumen total de 20 ml, y purificarse mediante HPLC preparativa, usando un gradiente de 33 a 53% MeCN en agua.
LCMS: m/z = 1475,8 (M+3H)3+
Ejemplo 18
Preparación alternativa del análogo del GLP-1 N-épsilon26-[2-(2-(2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-carboxiheptadecano¡lam¡no)but¡r¡lam¡no]etox¡}etox¡)acet¡lam¡no]etox¡}etox¡)acet¡l][A¡b8,Arg34]GLP-1-(7-37)
Figure imgf000048_0001
[Arg34]GLP-1-(11-37) preparado mediante técnicas recombinantes (100 mg, 0,033 mmol) disuelto en 2 ml de agua se agregó a DIPEA (113 pl, 0,66 mmol) y se agitó durante 10 min en donde se agregó el ácido 17-((S)-1-carboxi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-d¡oxo-p¡rrol¡d¡n-1-¡lox¡carbon¡l-metox¡)-etox¡]-et¡lcarbamo¡l}-metox¡)-etox¡]-et¡lcarbamo¡l}-prop¡lcarbamoil)-heptadecanoico (55 mg, 0,066 mmol) (Preparado de acuerdo con los ejemplos 2, 3 y 13) en pequeñas porciones durante 15 min. La mezcla se agitó durante 60 min antes de agregar Na2HPO4x7H2O (353,9 mg, 1,32 mmol) y el pH se ajustó a 8,3 mediante el uso de 1 N de HCl. Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-OSu (246,2 mg, 0,33 mmol) se agregó a la mezcla de reacción que contiene el péptido y la mezcla se agitó durante 14 horas después de lo cual se agregó piperidina (400 pl, 4,05 mmol). La mezcla se agitó durante otros 30 min, antes de diluirla con agua-MeCN (9:1) hasta un volumen total de 40 ml, y purificarse mediante HPLC preparativa, mediante el uso de un gradiente de 30 a 50 % MeCN en agua.
LCMS: m/z = 1372,5 (M+3H)3+
Ejemplo 19
Preparación alternativa del análogo del GLP-1 péptido N-épsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil] [Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37) Acilación: [Arg34]GLP-1-(11-37) recombinante (99 mg; 33 pmol) se suspendió en H2O (4 ml) en la cámara de reacción de 70 ml de un titulador plus Metrohm 848 Titrino. El pH se ajustó a pH=11,3 controlado por el programa de autotitulación SET (por adición de 3,8 ml, 0,1 M de NaOH (ac)). A pH = 11,3 el péptido se disolvió completamente. El ácido 17-((S)-1-carbox¡-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-d¡oxo-p¡rrol¡d¡n-1-¡lox¡ carbonilmetoxi)etoxi]-etilcarbamoil}-metoxi)-etoxi]etilcarbamoil}-propilcarbamoil)-heptadecanoico de cadena lateral activada (55 mg, 66 pmol, 2 eq) se disolvió en NMP (250 pl) y se transfirió a una jeringa Hamilton de 250 pl. Mediante la acción de una bomba automatizada con jeringa se agregaron 250 pl (2,0 eq) de esta solución durante 10 minutos. Después de 60 minutos adicionales se extrajo una muestra (10 pl), se diluyó en 90 pl de MeCN-H2O (1:1). UPLC mostró un pico principal de producto acilado N26 (apróx. 95 %) traza de un péptido sin reaccionar traza de cadena lateral hidrolizada.
Ligación: Éster de NHS tetrapéptido Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-OSu (123 mg, 165 pmol, 5 eq) se disolvió en NMP (250 pl). El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 6,9 con ácido acético diluido. Luego el pH se ajustó a 7,0 mediante la función pH-stat en el titulador. Se agregaron 250 pl de éster NHS durante 20 minutos. El pH se estabilizó en pH=7,0 ± 0,1.
La muestra se extrajo después de 30 min adicionales y UPLC mostró una relación 1:1 del intermedio acilado y el producto esperado (con protección de Fmoc en la posición N-terminal).
Se agregó otro 5 eq del éster de NHS tetrapéptido como anteriormente. La solución se agitó durante 16 h. La relación fue ahora 2:8 del intermedio acilado y el producto.
Se agregó otro 2,5 eq (total de 12,5 eq) del éster de NHS tetrapéptido como anteriormente. La solución se agitó durante 16 h. La relación fue ahora apróx. 1:9 del intermedio acilado y el producto.
Se agregó piperidina (1,6 ml) a la mezcla de reacción y la agitación continuó durante 1h.
UPLC mostró desprotección total. El producto bruto se purificó en HPLC de fase inversa para proporcionar 62 mg (45 %) del producto deseado (98 % puro).
LCMS: m/z = 1372,5 (M+3H)3+
Ejemplo 20
Preparación de Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OH
Figure imgf000049_0001
Carga de glicina
La resina se prehinchó en DCM (1 litro, 20 min) antes de agregar una solución de Fmoc-Gly-OH y DIPEA en 500 ml de DCM, y se agitó durante 60 min. La resina se lavó con DMF (2 x 500 ml) y 2 x 500 ml de DCM-MeOH-DIPEA (80:15:5, 10 min) y después DMF (3 x 500 ml), DCM (500 ml) y se dejó durante la noche a temperatura ambiente. Acoplamiento 1
Se usó piperidina al 20 % en DMF (500 ml) durante 50 min para la desprotección de Fmoc, luego la resina se lavó con DMF (8 x 500 ml).
Fmoc-Glu(OtBu)-OH y TCTU se disolvieron en 700 ml de DMF agregado al reactor y se agregó DIPEA. La mezcla se agitó durante 6 h. De acuerdo con la HPLC, los grupos amina libres de prueba estaban todavía presentes; el acoplamiento se repitió mediante el uso de % de reactivos. Cuando se terminó la reacción de acoplamiento (sin grupos amino presentes), la resina se lavó con DMF (4 x 500 ml)
Acoplamiento 2
Fmoc-Aib-OH y TCTU se disolvieron en 700 ml de solución de DMF, se colocó en el reactor y se agregó DIPEA. La mezcla se agitó durante 50 min. Cuando terminó la reacción de acoplamiento (sin grupos amino presentes), la resina se lavó con DMF (4 x 500 ml).
Acoplamiento 3
Se usó piperidina al 20 % en DMF (500 ml) durante 30 min para la desprotección de Fmoc y luego la resina se lavó con DMF (8 x 500 ml).
Fmoc-His(Boc)-OH y TCTU se disolvieron en 700 ml de DMF, se agregó la solución en el reactor y se agregó DIPEA. La mezcla se agitó durante 50 min. Cuando terminó la reacción de acoplamiento (sin grupos amino presentes), la resina se lavó con DMF (3 x 500 ml) y DCM (2 x 500 ml).
1ra Escisión
La 1ra escisión se realizó mediante el uso de 1/7 de resina. Se agregó trifluoroetanol-DCM (1:4, 500 ml) y la resina se agitó durante 70 min. Se recogió el filtrado y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar aceite. El aceite se disolvió en acetato de etilo y se dejó en refrigerador para formar cristales. Los cristales se filtraron, se lavaron mediante el uso de éter de dietilo y se secaron al aire, para proporcionar 6,1 g del producto (rendimiento de 45 %), pureza mediante HPLC de 99,0 %.
2da Escisión
La 2da escisión se realizó mediante el uso de 3/7 de resina. Se agregó trifluoroetanol-DCM (1:4, 1000 ml) y la resina se agitó durante 90 min. Se recogió el filtrado y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar aceite. El aceite se disolvió en acetato de etilo y se dejó en refrigerador durante toda la noche para formar cristales. Los cristales se filtraron, se lavaron con éter de dietilo y se secaron al aire para proporcionar 33,1 g de producto (rendimiento de 80 %), pureza mediante HPLC de 98,7 %.
Rendimiento: 6,1 g (45 %)
ESI+MS m/z: 805,1 (M+H)+, 1610,7 (2M+H)+.
HPLC Rt (Luna 4,6 x 250, 5 ul, 100A; acetonitrilo / tampón* 30:70 a 60:40, 30 min, 1 ml/min., 220 nm): 23,31 min.; pureza de 99,0%
y 33,1 g (80 %)
ESI+MS m/z: 805,1 (M+H)+, 1610,8 (2M+H)+.
HPLC Rt (Luna 4,6 x 250, 5 ul, 100A, acetonitrilo / tampón* 30:70 a 60:40, 30 min, 1 ml/min., 220 nm): 23,16 min.; pureza de 98,7%
*tampón: 2,71 g de KH2PO4, 7,13 g de NaH2PO4.2H2O disuelto en H2O (2L);
Ejemplo 21
Figure imgf000051_0001
Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(O-tBu)-Gly-OH (1,25 g, 1,56 mmol) se disolvió en THF (10 ml) y se agregó DIPEA (0,64 g, 3,73 mmol) y TSTU (0,56 g, 1,87 mmol, 1,2 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
LCMS: conversión de la aplicación de 95 %. La mezcla se filtró y el solvente se eliminó al vacío. EtOAc (100 ml) se agregó y la fase orgánica se lavó dos veces con 0,1 N de HCl frío y se secó sobre Na2SO4, se filtró y se evaporó para dar Fmoc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OSu bruto (1,1 g, 79 %).
El producto bruto se disolvió en DCM (2 ml) y se agregó TFA (1 ml). Se agitó durante 1h. LCMS: 100 % de desprotección. Después de la evaporación del solvente orgánico se agregó dietiletéter frío al residuo y se recogió el precipitado resultante mediante filtración y se secó en un horno de vacío para dar Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-OSu (430 mg)
LCMS: m/z = 746,3 (M+H)
Ejemplo 22
Preparación de Ácido 3-(1-tr¡t¡l-1H-¡m¡dazol-4-¡l)-prop¡ón¡co 2,5-d¡oxo-p¡rrol¡d¡n-1-¡l éster
Figure imgf000051_0002
Ácido 3-(W-tr¡tac¡l¡m¡dazol-4-¡l)prop¡ón¡co (Jung y otros, Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 2317-2336, 1998) (50 g, 0,13 mol) se disolvió en DCM (500 ml), N-hidroxisuccinimida (24 g, 0,209 mol) y se agregó N^'-diciclohexilcarbodiimida (35 g 0,170 mol), mientras que se mantiene la temperatura interna por debajo de 30 oC con un baño de hielo. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se filtró y la solución resultante se concentró al vacío, se volvió a disolver en THF (350 ml) tras el calentamiento y se mezcló con 2-propanol (350 ml) hasta una temperatura resultante de 32 oC, luego se enfrió hasta 5 oC. El producto cristalino se filtró y se lavó con 2-propanol (150 ml) y se secó al vacío para proporcionar el compuesto del título (47,3 g, rendimiento de 75 %).
1H NMR (De-DMSO, 400Mhz):^ 7,15-6,99 (m, 9H), 6,82 (s, 1H), 6,81-6,62 (m, 6H), 6,38 (s, 1H), 2,63 (t, 3H), 2,4 (m, 6H).
Ejemplo 23
Preparación de trifluoroacetato de 4-[2-(2,5-d¡oxo-p¡rrol¡d¡n-1-¡lox¡carbon¡l)-et¡l]-1H-/m/dazol-7-/o
Figure imgf000051_0003
Se disolvió el ácido 3-(1-tritil-1H-imidazol-4-il)-propiónico 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il éster (40g, 83 mmol) en DCM (240 ml). Se agregó triisopropilsilano (42 ml) y ácido trifluoroacético (240 ml) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 90 min. La solución se evaporó al vacío, se volvió a disolver en acetonitrilo (120 ml), y se agregó terc-butilmetil éter (290 ml) en forma de gotas y la solución se enfrió hasta 8 oC. El precipitado se recogió mediante filtración y se secó al vacío para proporcionar un compuesto blanco (24 g, 82 %).
1H NMR (De-DMSO, 400Mhz): • 8,90 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,09 (t, 2H), 2,79 (t, 2H), 2,79 (s, 4H).
Ejemplo 24
Preparación alternativa del análogo del GLP-1 péptido N-épsilon37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S) -4-carboxi-4-({trans-4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil}amino)butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]etoxi}etoxi)acetil]-[DesaminoHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
Figure imgf000052_0001
El péptido [Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(8-37) (80 g, 0,023 mol) preparado a través de una técnica recombinante se disolvió en agua (6400 ml) y se agregó trietilamina (28 ml) a pH 11,0. Ácido (22S)-22-{[(trans-4-{[(19-carboxinonadecanoil)amino]metil}-ciclohexil)carbonil]amino}-1 -[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]-1,10,19-trioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazatricosan-23-oico (34.9 g, 0.035 mol) se disolvió en NMP (210 ml) y se agregó a la solución durante 2 h, mientras que se mantuvo el pH entre 11,0 - 11,1 por adición continua de triehilamina. El pH se ajustó a 7,0 mediante la adición de ácido sulfúrico 1 M (ac, 140 ml). Se disolvió trifluoroacetato de 4-[2-(2,5-Dioxopirrolidin-1-iloxicarbonil)-etil]-1H-/m/dazol-7-/o (36,99 g, 0,105 mol) en NMP y se agregó a la solución durante 2 h, mientras se mantuvo el pH a 7,0 - 7,1 mediante la adición continua de trietilamina. El pH se ajustó a 11,2 mediante la adición de 1 M de NaOH (ac, 500 ml) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 7 h. El pH se ajustó a 7,4 mediante la adición de ácido sulfúrico 1 M (ac, 140 ml), a un total de 7973,8 g que se purificó mediante HPLC preparativa.
LCMS: m/z = 1476 (M+3H)3+
Ejemplo 25
Preparación del péptido [Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
Figure imgf000052_0002
Figure imgf000053_0001
Arg34-GLP-1[9-37] ■ 4TFA (103 mg; 0,028 mmol) se disolvió en 2 ml de agua y se transfirió a una cámara de reacción de titulación con 2 x 1 ml adicionales de agua. La cámara de reacción se equipó con un imán de agitación, electrodo de pH y un tubo de titulante. El pH de la solución fue 1,9. El titulador se programó a un método 'STAT' a pH fijo = 11,3. El titulante, el hidróxido de sodio (3,27 ml, 0,1 M ac), se agregó a la titulación para alcanzar pH = 11,3. (Boc)2O (186 mg, 0,85 mmol, 3 eq) se disolvió en NMP (2,500 ml) y se llenó una jeringa de Hammilton de 250 pl con esta solución (es decir, 250 pl; 18,6 mg de (Boc)2O, 3 eq).
Se agregó agua (1,0 ml) a la cámara de reacción para obtener un volumen total de 8,3 ml y la solución de (Boc)2O NMP se agregó después durante 20 min mediante la ayuda de una bomba de jeringa a temperatura ambiente. El titulador mantuvo el pH = 11,3 mediante la adición automática del titulante. Después de agitar durante 10 minutos adicionales, LCMS mostró 88 % del producto Lys26(NHBoc) junto con un producto diboc (9 %) y material de partida (3 %). El pH de la solución se ajustó a 6,5 con un volumen pequeño de HOAc diluido (ac) y el titulador se ajustó en pH = 7,5 para la reacción adicional.
Una solución de Boc-His(Boc)-Aib-OSu (305 mg, 0,568 mmol, 20 eq) se disolvió en NMP (500 pl) lo que proporcionó un volumen total de 715 pl. De esta solución 2 x 250 pl (2 x 7 eq) se agregó a la mezcla de reacción durante 2 x 30 minutos, manteniendo el pH = 7,5. Se observó precipitación inmediata de Boc-His(Boc)-Aib-OSu, pero al agitar todo se disolvió. Después del final de la adición, la mezcla se agitó durante otras 2 h a pH = 7,5 y a temperatura ambiente para permitir la disolución y la reacción del reactivo.
La mezcla se liofilizó y se trató con TFA que contenía 3 % de TIPS y 3 % de agua durante 2 h. Los solventes se evaporaron y el residuo se purificó mediante HPLC para dar el producto deseado.
LCMS m/z: 849,88 (M+4H)4+, 1132,86 (M+3H)3+. Calculado 3396,698 (M+H)+.
Ejemplo 26
Preparación de Boc-His(Boc)-Aib-OH
Figure imgf000053_0002
Carga de Aib: La resina de 2-clortritilcloruro al 1 % DVB (Carga 1,1 mmol/g) (10,0 g, 11 mmol) se prehinchó en DCM antes de agregar una solución de Fmoc-Aib-OH (7,16 g, 22 mmol) y DIPeA (9,4 ml, 55 mmol) en DCM (100 ml). La mezcla se agitó durante 60 min. La resina se lavó con NMP (2 x 100 ml) y DCM-MeOH-DIPEA (80:15:5) (2 x 100 ml, 10 minutos cada uno), y NMP (3 x 100 ml). La resina lavada se trató con piperidina al 20 % en NMP (3 x 100 ml, 10 min cada una). La resina se lavó con NMP (6 x 100 ml).
Acoplamiento: Se disolvió Boc-His(Boc)-OH (15,64 g, 44 mmol) en NMP (100 ml) y se agregó DCM (20 ml) y HOBt (5,95 g, 44 mmol) seguido por la adición lenta de DIC (6,81 ml, 44 mmol). La mezcla se agitó durante 15 min antes de agregar DIPEA (9,40 ml, 55 mmol). La mezcla activada se agregó a la resina y la resina se agitó durante 16 h antes de lavarse con NMP (4 x 100 ml) y DCM (10 x 100 ml).
Escisión: Se agregó trifluoroetanol-DCM (1:4, 100 ml) y la resina se agitó durante 1 hora. Se recogió el filtrado y se agregó y agitó una nueva parte de trifluoroetanol-DCM (1:4, 100 ml) durante 15 min y se recogió el filtrado. Los filtrados combinados se evaporaron al vacío y se agregó petroléter (50 ml). El precipitado resultante se lavó con petroléter, se recogió y se secó en horno de vacío durante 16 h a 40 °C para dar Boc-His(Boc)-Aib-OH (1,00 g, rendimiento de 21 %, pureza de 95 %).
LCMS m/z: 441,18 (M+H)+. Calculado 440,227 (M+H)+.
Ejemplo 27
Preparación de Boc-His(Boc)-Aib-OSu
Figure imgf000054_0001
Se disolvió Boc-His(Boc)-Aib-OH (0,70 g, 1,59 mmol) en THF (5,0 ml) y se agregó TSTU (1,44 g, 4.77 mmol) y DIPEA (1,36 ml, 7,95 mmol). La mezcla de reacción se agitó a rt. durante 2 h. LCMS mostró una conversión casi completa en el producto de oxazolona. La mezcla de reacción se filtró y el solvente se evaporó. El residuo se volvió a disolver en DCM (10 ml) y se agregó N-hidroxisuccinimida (292 mg, 2,56 mmol, 1,6 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. UPLC muestra un pico principal del éster de Su deseado (85 %), traza de material inicial sin reaccionar y 5 % de la oxazolona anillo cerrado. El solvente se evaporó a temperatura ambiente a presión reducida y se agregó H2O (25 ml) para disolver N-hidroxisuccinimida sin reaccionar. E1H2O se decantó y el residuo se disolvió en EtOAc (100 ml) se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó para dar una espuma blanca que contiene 70 % del producto deseado.
LCMS m/z: 538,18 (M+H)+. Calculado 538,251 (M+H)+
Ejemplo 28
Preparación de Fmoc-His-Aib-OSu
Figure imgf000054_0002
Fmoc-His(Trt)-Aib-OH (5 g, 7,1 mmol) se disolvió en THF (50 ml). Se agregó DCC (1,61 g, 7,8 mmol) y NHS (0,94 g, 8,2 mmol) y la solución resultante se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. DCU se filtró y la solución se evaporó al vacío. El aceite resultante se disolvió en DCM (34 ml) y se agregó ácido trifluoroacético (34 ml) y TIPS (6 ml). La solución se agitó durante 2 h a temperatura ambiente, se evaporó al vacío a 25 ml, se agregó en forma de gotas a TBME (200 ml), se agitó durante 60 minutos, y se recogió el precipitado blanco resultante mediante filtración, y se lavó con TBME adicional. El precipitado recogido se secó al vacío durante 16 h.
LCMS: m/z = 560 (M+H)+
Ejemplo 29
Preparación del derivado del GLP-1 péptido [Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
Figure imgf000054_0003
El péptido [Arg34] GLP-1(9-37) ■ 4TFA (103 mg; 0,028 mmol) se disolvió en 0,1 M de TEA (ac., 7,5 ml) se agregó TEA adicional (140 pl) para un pH resultante de 11,28. FmocOSu (90 mg) se disolvió en NMP (1600 pl) y se agregó 334 pl (0,055 mmol) de esta solución en forma de gotas a la solución de péptido acuosa. El pH se ajustó a 7 mediante la adición de 1M de H2SO4 (ac). La sal de trifluroacetato FmocHisAibOSu (90 mg, 0,134 mmol) se disolvió en NMP (800 ul) y se agregó en forma de gotas a la solución mientras se mantuvo el pH entre 7,0 y 7,5 mediante la adición continua de 1M de NaOH(ac). Se agregó piperidina (2 ml) y la solución resultante se agitó durante 60 min a

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un derivado de un análogo del GLP-1 que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos en la parte N-terminal, dicho método que comprende las etapas de:
(i) cultivar una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula precursora de dicho análogo del GLP-1 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula precursora;
(ii) separar la molécula precursora expresada del caldo de cultivo;
(iii) acilar el grupo épsilon amino de un residuo de lisina en la molécula precursora expresada con un agente de acilación, que se activa opcionalmente, para obtener un derivado de la molécula precursora, y opcionalmente aislar dicho derivado de la molécula precursora;
(iv) acoplar una extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos al derivado de la molécula precursora expresado; y
(v) aislar el derivado resultante de un análogo del GLP-1 por medios adecuados;
en donde
(a) dicha etapa de acilación (iii) tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos con un pH entre 9 y 13; (b) dicha extensión N-terminal tiene una longitud de 2 o 4 aminoácidos, y
(c) dicho derivado resultante de un análogo del GLP-1 es el péptido N-épsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Carboxi-4-(17-carboxi-heptadecanoilamino)-butirilamino]etoxi}etoxi)acetilamino]-etoxi}etoxi)-acetil][Aib8,Arg34] GLP-1-(7-37)
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha molécula precursora es [Arg34]GLP-1 (11-37).
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha molécula precursora es [Arg34]GLP-1(9-37).
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la extensión de aminoácidos N-terminal se protege con uno o más grupos de protección antes de su uso en la etapa (iv) y se desprotege otra vez después del acoplamiento de la extensión N-terminal.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene lugar en un disolvente polar orgánico seleccionado del grupo que consiste en 1-metil-pirrolidin-2-ona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido W,W-dimetilformamida y W-metil-formamida.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el acoplamiento de la extensión de aminoácidos N-terminal que comprende uno o más aminoácidos no proteinogénicos tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos.
7. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende además la etapa de eliminar (i) una extensión propéptido N-terminal o (ii) una extensión propéptido C-terminal de la molécula precursora resultante.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha etapa de acilación (iii) tiene lugar en una mezcla de solventes acuosos con un pH entre 10 y 12, tal como entre 10,5 y 11,5.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha célula huésped se selecciona de una célula huésped de mamífero, una célula huésped de ave, una célula huésped de insectos, una célula huésped vegetal, una célula huésped bacteriana, una célula huésped fúngica y una célula huésped de levadura.
10. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde dicho agente de acilación es un análogo de ácido carboxílico de la fórmula general:
A-C-D-OH
en donde
un ácido carboxílico de terminal libre se activa opcionalmente, y
A-C-D- se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000069_0001
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Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106317164A (zh) * 2008-09-12 2017-01-11 诺沃—诺迪斯克有限公司 酰化肽或蛋白的方法
PL2513140T3 (pl) 2009-12-16 2016-04-29 Novo Nordisk As Podwójnie acylowane pochodne glp-1
MX336412B (es) * 2010-03-26 2016-01-19 Novo Nordisk As Nuevos analogos de glucagon.
EP2560675A1 (en) * 2010-04-20 2013-02-27 Novo Nordisk A/S Long-acting gastrin derivatives
US9487570B2 (en) * 2010-05-17 2016-11-08 Betta Pharmaceuticals Co., Ltd Glucagon like peptide analogs, composition, and method of use
JP2013533227A (ja) 2010-06-08 2013-08-22 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｆｇｆ２１類似体および誘導体
JP6069198B2 (ja) 2010-07-20 2017-02-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｎ末端が修飾されたｆｇｆ２１化合物
CN102203130B (zh) * 2010-08-06 2014-06-25 贝达药业股份有限公司 Glp-1衍生物及其应用
JP6039569B2 (ja) 2010-11-09 2016-12-07 ノヴォ ノルディスク アー／エス 二重アシル化されたｇｌｐ−１誘導体
EP3326620B1 (en) 2010-12-16 2020-03-04 Novo Nordisk A/S Solid compositions comprising a glp-1 agonist and a salt of n-(8-(2- hydroxybenzoyl)amino)caprylic acid
CN103379919A (zh) 2011-01-26 2013-10-30 诺沃—诺迪斯克有限公司 瘦蛋白衍生物
CN106117344B (zh) 2011-04-12 2020-11-03 诺沃—诺迪斯克有限公司 双酰化glp-1衍生物
EP2720711A1 (en) 2011-06-15 2014-04-23 Novo Nordisk A/S Multi substituted insulins
WO2013037690A1 (en) 2011-09-06 2013-03-21 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives
IN2014CN02448A (es) 2011-09-23 2015-06-19 Novo Nordisk As
CN102363633B (zh) * 2011-11-16 2013-11-20 天津拓飞生物科技有限公司 胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用
US20140364587A1 (en) 2011-12-29 2014-12-11 Novo Nordisk A/S Dipeptide Comprising a Non-Proteogenic Amino Acid
US9452225B2 (en) * 2012-03-01 2016-09-27 Novo Nordisk A/S GLP-1 prodrugs
CN104203266B (zh) 2012-03-22 2017-12-26 诺和诺德股份有限公司 Glp‑1肽组合物及其制备
ES2715308T3 (es) 2012-03-22 2019-06-03 Novo Nordisk As Composiciones que comprenden un agente de suministro y su preparación
CN111494323B (zh) 2012-03-22 2023-03-28 诺和诺德股份有限公司 包含递送剂的组合物及其制备
EP2846824B1 (en) 2012-05-08 2017-04-05 Novo Nordisk A/S Double-acylated glp-1 derivatives
JP6250034B2 (ja) 2012-05-08 2017-12-20 ノヴォ ノルディスク アー／エス 二重アシル化されたｇｌｐ−１誘導体
WO2013189988A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Novo Nordisk A/S Tablet formulation comprising a peptide and a delivery agent
MX376058B (es) 2012-07-01 2025-03-07 Novo Nordisk As Uso de peptidos glp-1 de accion prolongada.
JP2016500682A (ja) 2012-10-17 2016-01-14 ノヴォ ノルディスク アー／エス 経口ペプチドデリバリーのための脂肪酸アシル化アミノ酸
WO2014170496A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Novo Nordisk A/S Stable, protracted glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
SI2991671T1 (sl) 2013-05-02 2018-10-30 Novo Nordisk A/S Peroralno odmerjanje spojin GLP-1
BR112015032875A2 (pt) 2013-07-04 2017-11-07 Novo Nordisk As derivados de peptídeos do tipo glp-1, e usos dos mesmos
EP3151852A1 (en) 2014-06-04 2017-04-12 Novo Nordisk A/S Glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
WO2015193378A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Novo Nordisk A/S Novel glp-1 receptor agonists with cholesterol efflux activity
GR20140100479A (el) * 2014-09-23 2016-05-05 Novetide, Ltd., Συνθεση λιραγλουτιδης
WO2016102562A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Novo Nordisk A/S Fgf21 derivatives and uses thereof
JOP20200119A1 (ar) * 2015-01-09 2017-06-16 Lilly Co Eli مركبات مساعد مشترك من gip وglp-1
GB2545395A (en) * 2015-11-27 2017-06-21 The Inst Of Food Res Engineered lactococcus lactis producing biologically active GLP-1
ES2835033T3 (es) 2016-03-03 2021-06-21 Novo Nordisk As Derivados de GLP-1 y sus usos
EP3534962B1 (en) * 2016-11-07 2020-08-19 Novo Nordisk A/S Dchbs-active esters of peg compounds and their use
TWI710377B (zh) 2017-05-23 2020-11-21 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 Ｍｉｃ－１化合物及其用途
CN110945017B (zh) * 2017-07-19 2024-07-16 诺和诺德股份有限公司 双功能化合物
WO2019082138A1 (en) * 2017-10-27 2019-05-02 Lorven Biologics Private Limited PROCESS FOR THE PREPARATION OF LIRAGLUTIDE USING RECOMBINANT SACCHAROMYCES CEREVISIAE
JP6898518B2 (ja) 2018-02-02 2021-07-07 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ−１アゴニスト、ｎ−（８−（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ）カプリル酸の塩及び滑沢剤を含む固形組成物
CN111378028A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 万新医药科技(苏州)有限公司 酰化glp-1化合物及其修饰基团的合成
CN110041219B (zh) * 2019-05-09 2020-09-25 南京工业大学 一种索马鲁肽侧链的液相合成方法
CN111909256A (zh) * 2019-05-10 2020-11-10 宁波鲲鹏生物科技有限公司 多肽衍生物及其制备方法
CN110305223B (zh) 2019-06-26 2022-05-13 重庆派金生物科技有限公司 重组串联融合蛋白制备目标多肽的方法
CN110684082B (zh) * 2019-10-08 2021-12-10 江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司 Gip和glp-1双激动多肽化合物及药学上可接受的盐与用途
CN111217901A (zh) * 2019-10-31 2020-06-02 成都圣诺生物制药有限公司 一种索马鲁肽的制备方法
CN116925237A (zh) 2019-12-31 2023-10-24 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和gdf15的融合蛋白以及其缀合物
CN113728013B (zh) 2020-01-11 2022-06-14 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物
CN111253287A (zh) * 2020-01-16 2020-06-09 浙江工业大学 液相汇聚式合成索马鲁肽侧链的方法
CN111285780A (zh) * 2020-01-16 2020-06-16 浙江工业大学 索马鲁肽侧链的汇聚式液相合成法
CN111269137A (zh) * 2020-01-16 2020-06-12 浙江工业大学 一种液相法制备索马鲁肽侧链的方法
CN113773397B (zh) * 2020-06-10 2023-10-20 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种德谷胰岛素的制备方法
CN114057886B (zh) * 2020-07-24 2024-03-01 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种索玛鲁肽衍生物及其制备方法
CN113801236A (zh) * 2020-06-11 2021-12-17 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种赖脯胰岛素的制备方法
CN114075273A (zh) * 2020-08-17 2022-02-22 四川科伦药物研究院有限公司 一种glp-1类似物片段活化酯的制备方法
EP4217503A4 (en) * 2020-09-23 2024-12-11 Dr. Reddy's Laboratories Limited PROCESS FOR THE PREPARATION OF SEMAGLUTIDE AND SEMAPEPTIDE
JP2023545684A (ja) 2020-09-30 2023-10-31 ベイジン キューエル バイオファーマシューティカル カンパニー，リミテッド ポリペプチドコンジュゲートおよび使用の方法
CN113278061B (zh) * 2021-06-22 2024-04-09 南京林业大学 一种生物化学法制备索马鲁肽的方法
CN115322250A (zh) * 2022-06-16 2022-11-11 南京汉欣医药科技有限公司 一种司美格鲁肽的合成方法
CN115197312B (zh) 2022-08-09 2023-06-09 奥锐特药业(天津)有限公司 一种索马鲁肽的制备方法及中间体
JP2024180368A (ja) 2023-06-15 2024-12-26 ノヴォ ノルディスク アー／エス シクロデキストリンを含む医薬製剤

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705483A (en) 1993-12-09 1998-01-06 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods
US6277819B1 (en) * 1996-08-30 2001-08-21 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs in treatment of myocardial infarction
US6458924B2 (en) 1996-08-30 2002-10-01 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
CA2264243C (en) 1996-08-30 2004-10-05 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives
JP2002510193A (ja) 1997-03-31 2002-04-02 イーライ・リリー・アンド・カンパニー グルカゴン様ペプチド−１類似体
US20060160740A1 (en) * 1999-10-21 2006-07-20 Suad Efendic Use of GLP-1 or analogs in treatment of stroke
CA2452735A1 (en) * 2001-07-24 2003-02-06 Ivan Diers Method for making acylated polypeptides
JP2005503141A (ja) 2001-07-24 2005-02-03 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ アシル化ポリペプチドを作出するための方法
US7595172B2 (en) * 2001-07-24 2009-09-29 Novo Nordisk A/S Method for making acylated polypeptides
WO2003018516A2 (en) * 2001-08-23 2003-03-06 Eli Lilly And Company Glucagon-like peptide-1 analogs
DE10209821A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
CN101974090B (zh) * 2003-06-12 2015-06-17 伊莱利利公司 Glp-1类似物融合蛋白质
SI2932981T1 (sl) * 2003-09-19 2021-11-30 Novo Nordisk A/S Albumin-vezavni derivati GLP-1
BRPI0417684A (pt) 2003-12-18 2007-03-20 Novo Nordisk As composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto
RU2006144821A (ru) 2004-07-08 2008-08-20 Ново Нордиск А/С (DK) Пролонгирующие метки полипептидов, содержащие тетразольную группировку
WO2006037810A2 (en) * 2004-10-07 2006-04-13 Novo Nordisk A/S Protracted glp-1 compounds
KR20070120112A (ko) * 2005-03-18 2007-12-21 노보 노르디스크 에이/에스 연장형 ｇｌｐ-1 화합물
US20090062192A1 (en) 2005-03-18 2009-03-05 Novo Nordisk A/S Dimeric Peptide Agonists of the Glp-1 Receptor
TWI372629B (en) * 2005-03-18 2012-09-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
WO2007113205A1 (en) * 2006-04-03 2007-10-11 Novo Nordisk A/S Glp-1 peptide agonists
ATE466881T1 (de) * 2006-06-23 2010-05-15 Hoffmann La Roche Synthese eines insulinotropen peptids

Also Published As

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WO2009083549A1 (en) 2009-07-09
CN105154498A (zh) 2015-12-16
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