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ES2835033T3 - Derivados de GLP-1 y sus usos - Google Patents

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ES2835033T3
ES2835033T3 ES17708491T ES17708491T ES2835033T3 ES 2835033 T3 ES2835033 T3 ES 2835033T3 ES 17708491 T ES17708491 T ES 17708491T ES 17708491 T ES17708491 T ES 17708491T ES 2835033 T3 ES2835033 T3 ES 2835033T3
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ES
Spain
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ethoxy
amino
glp
acetyl
chemical compound
Prior art date
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Active
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ES17708491T
Other languages
English (en)
Inventor
Jacob Kofoed
János Kodra
Lars Linderoth
Patrick Garibay
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
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Publication date
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Abstract

Un derivado que comprende un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) y en donde un sustituyente que comprende al menos ocho grupos -CH2- consecutivos y al menos un grupo funcional con un pKa < 7 se une a un residuo Lys del análogo de GLP-1; en donde el derivado es de fórmula I: (PL)U-B-GLP1, en donde GLP1 es un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) que comprende un péptido de fórmula: Xaa7-Trp-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26- Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42, en donde Xaa7 es L-histidina; Xaa12 es Phe; Xaa16 es Val; Xaa18 es Ser; Xaa19 es Tyr; Xaa20 es Leu; Xaa22 es Gly o Glu; Xaa23 es Gln; Xaa25 es Ala; Xaa26 es Arg o Lys; Xaa27 is Glu o Lys; Xaa30 es Ala o Glu; Xaa31 es Trp; Xaa33 es Val; Xaa34 es Arg; Xaa35 es Gly; Xaa36 es Arg o Lys; Xaa37 es Gly, Lys, o Pro; Xaa38 es Glu, Lys, o ausente; Xaa39 es Gly o ausente; Xaa40 es Gly o ausente; Xaa41 es Ser o ausente; y Xaa42 es Lys o ausente; en donde (P-L) es el sustituyente unido a un residuo Lys del análogo de GLP-1 a través de un grupo de ramificación opcional (B) y comprende una porción prolongada (P) y un enlazador (L), U representa el número de sustituyentes (P-L) en el derivado y es 1 o 2, en donde cada sustituyente (P-L) comprende (i) una porción de prolongación (P) seleccionada del Compuesto químico 10, Compuesto químico 11, Compuesto químico 12, Compuesto químico 13 y Compuesto químico 14: **(Ver fórmula)** y (ii) un enlazador (L) que comprende al menos un elemento enlazador seleccionado de Compuesto químico 15, Compuesto químico 16, Compuesto químico 17 y Compuesto químico 18: **(Ver fórmula)** en donde R es -COOH; cada uno de s, x, y, z, y p representan independientemente un número entero en el intervalo de 8-20; cada uno de n, m, y q representan independientemente un número entero en el intervalo de 0-4; y cada uno de k, l, y t representan independientemente un número entero en el intervalo de 1-5; y (iii) en donde el grupo de ramificación (B), si está presente, comprende un enlazador ramificado (BL) seleccionado de Compuesto químico 19 y Compuesto químico 20: **(Ver fórmula)** en donde u y v representan independientemente un número entero en el intervalo de 0-5 y cada w representa un número entero en el intervalo de 0-2, con la condición de que cuando u es 0 v es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando v es 0 u es un número entero en el intervalo de 1-5; qué derivado es capaz de activar el receptor de GLP-1 humano; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de GLP-1 y sus usos
Campo técnico
La presente invención se refiere a análogos y derivados del péptido tipo glucagón 1 (GLP-1), su preparación, y su uso farmacéutico. Los análogos y derivados de GLP-1 de la invención tienen un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1). Los derivados de la invención tienen uno o dos sustituyentes (P-L) unidos a un residuo Lys del análogo de GLP-1 a través de un grupo de ramificación opcional (B), en donde P es una porción prolongada y L es un enlazador.
Listado de secuencias
El listado de secuencias tiene 21084 bytes, se creó el 28 de febrero de 2017.
Antecedentes de la invención
El documento núm. CN 101255191 A describe varios análogos de GLP-1 y un método de síntesis en fase sólida promovido por microondas de estos, que incluyen en el Ejemplo 3 la amida Trp8-GLP-1(7-36) que es la SEC ID NO: 4 en el listado de secuencias de esta solicitud china.
Los derivados de GLP-1 que tienen dos sustituyentes unidos a uno o dos residuos de Lys de varios análogos de GLP-1 se describen, por ejemplo, en los documentos núm. WO2012/140117 A1 y WO 2014/202727 A1 (sin y con un grupo ramificador, respectivamente).
Regulatory Peptides vol. 85 (1999), páginas 9-24 de Rolf Mentlein es una revisión de la función de la dipeptidilpeptidasa IV (CD26)-participación en la inactivación de péptidos reguladores.
Diabetologia vol. 41 (1998), páginas 271-278 de Deacon y otros discute los análogos de GLP-1 resistentes a dipeptidil peptidasa IV que tienen estabilidad metabólica extendida y actividad biológica mejorada.
Breve descripción de la invención
La invención se refiere a análogos y derivados de GLP-1 que tienen un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1). Los derivados de la invención tienen uno o dos sustituyentes (P-L) unidos a un residuo Lys del análogo de GLP-1 a través de un grupo de ramificación opcional (B), en donde P es una porción prolongada y L es un enlazador.
Más en particular la invención se refiere a un derivado de Fórmula I:
(PL)u-B-GLP1, en donde GLP1 es un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1), (P-L) es un sustituyente unido a un residuo de Lys del análogo de GLP-1 a través de un grupo de ramificación opcional (B) y comprende una porción prolongada (P) y un enlazador (L), U representa el número de sustituyentes (P-L) en el derivado y es 1 o 2, en donde cada sustituyente (P-L) comprende (i) una porción prolongada (P) seleccionada de:
Compuesto químico 10:
Figure imgf000002_0001
Compuesto químico 11:
Figure imgf000002_0002
Compuesto químico 12
Figure imgf000003_0001
Compuesto químico 13:
Figure imgf000003_0002
Compuesto químico 14:
Figure imgf000003_0003
y (ii) un enlazador (L) que comprende al menos un elemento enlazador seleccionado de:
Compuesto químico 15:
Figure imgf000003_0004
Compuesto químico 17:
Figure imgf000003_0005
en donde R es -COOH; cada uno de s, x, y, z, y p representa independientemente un número entero en el intervalo de 8-20; cada uno de n, m, y q representa independientemente un número entero en el intervalo de 0-4; y cada uno de k, l, y t representa independientemente un número entero en el intervalo de 1-5; y
(iii) en donde el grupo de ramificación (B), si está presente comprende un enlazador ramificado (BL) seleccionado entre:
Compuesto químico 19:
Figure imgf000004_0001
en donde u y v representa independientemente un número entero en el intervalo de 0-5 y cada w representa un número entero en el intervalo de 0-2, con la condición de que cuando u es 0 v es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando v es 0, u es un número entero en el intervalo de 1-5; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de estos.
La invención también se refiere a una serie de derivados de GLP-1 específicos, cuyas fórmulas estructurales se incluyen en la presente descripción como Compuestos químicos números 21-32, así como también sus sales, amidas, y ésteres farmacéuticamente aceptables.
En adición, la invención se refiere a un número de análogos de GLP-1 específicos que comprenden la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 15, los aminoácidos 1-275 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, o la SEQ ID NO: 20; así como también sus sales, amidas, o ésteres farmacéuticamente aceptables.
La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y usos de estos análogos y derivados, así como también a métodos para su preparación, que comprenden la etapa de producir recombinantemente un análogo de GLP-1 que tenga Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1).
La secuencia de aminoácidos del GLP-1(7-37) humano nativo se incluye en el listado de secuencias como la SEQ ID NO: 1. Las SEQ ID NO 4, 5, 7, 9, 11, 15, 16, 18, y 20 son análogos de GLP-1 específicos de la invención. Las SEQ ID NO 2-3, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 17, 19, y 21 son análogos de GLP-1 específicos de compuestos de GLP-1 comparativos. Los análogos y derivados de la invención son sorprendentemente muy estables frente a la degradación por DPP-IV. También o alternativamente, los análogos y derivados de la invención son capaces de unirse al receptor de GLP-1. También o alternativamente, los análogos y derivados de la invención son capaces de activar el receptor de GLP-1.
También o alternativamente, las partes peptídicas de los derivados de la invención pueden producirse de forma completamente recombinante.
También o alternativamente, los análogos y derivados de la invención son activos in vivo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un plásmido de expresión en levadura adecuado para su uso en la producción recombinante de partes peptídicas de los derivados de GLP-1 de la invención.
Descripción
En lo que sigue, las letras griegas pueden representarse por sus símbolo o el nombre escrito correspondiente, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = épsilon; y = gamma; 8 = delta; o = omega; etcétera. También la letra griega de |i puede representarse por "u", por ejemplo, en |il = ul, o en |iM = uM.
Un asterisco (*) o una línea ondulada en una fórmula química designa i) un punto de unión, ii) un radical, y/o iii) un electrón no compartido.
Cualquier elemento enlazador estereoactivo puede estar en la forma D, forma L, forma D/L, o ser una mezcla racémica. Cuando se usa en la presente descripción, la palabra "aun/una" generalmente significa "uno/una o más". Por ejemplo, el derivado de la invención (que se define para comprender un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 y en donde "un" sustituyente especificado se une a "un" residuo de Lys) puede tener uno o más sustituyentes unidos a uno o más residuos de Lys.
Cualquier intervalo descrito en la presente descripción está generalmente cerrado, es decir, se incluyen los puntos finales. Por ejemplo, el número de grupos -CH2- consecutivos en el sustituyente unido a un residuo Lys de la invención está en el intervalo de 8-20, lo que significa de 8 a 20, ambos inclusive.
A menos que se defina lo contrario en la presente, los términos presentados en forma singular generalmente también incluyen la situación en plural.
La invención también se refiere a derivados, análogos de GLP-1, métodos de preparación, y composiciones farmacéuticas y usos como se describe en la presente descripción, en donde los términos abiertos como "comprende" y "que comprende" se sustituyen con términos cerrados tales como "consiste en", "que consiste en", y similares. En un primer aspecto, la invención se refiere a un derivado de fórmula I:
(PL)u-B-GLPI, en donde GLP1 es un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1), (P-L) es un sustituyente unido a un residuo de Lys del análogo de GLP-1 a través de un grupo de ramificación opcional (B) y comprende una porción prolongada (P) y un enlazador (L), U representa el número de sustituyentes (P-L) en el derivado y es 1 o 2, en donde cada sustituyente (P-L) comprende (i) una porción prolongada (P) seleccionada de:
Compuesto químico 10:
Figure imgf000005_0001
Compuesto químico 11:
Figure imgf000005_0002
Compuesto químico 12
Figure imgf000006_0001
Compuesto químico 13:
Figure imgf000006_0002
Compuesto químico 14:
Figure imgf000006_0003
y (ii) un enlazador (L) que comprende al menos un elemento enlazador seleccionado de:
Compuesto químico 15:
Figure imgf000006_0004
Compuesto químico 17:
Figure imgf000006_0005
en donde R es -COOH; cada uno de s, x, y, z, y p representa independientemente un número entero en el intervalo de 8-20; cada uno de n, m, y q representa independientemente un número entero en el intervalo de 0-4; y cada uno de k, l, y t representa independientemente un número entero en el intervalo de 1-5; y
(iii) en donde el grupo de ramificación (B), si está presente comprende un enlazador ramificado (BL) seleccionado entre:
Compuesto químico 19:
Figure imgf000007_0001
en donde u y v representan independientemente un número entero en el intervalo de 0-5 y cada w representa un número entero en el intervalo de 0-2, con la condición de que cuando u es 0 v es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando v es 0, u es un número entero en el intervalo de 1-5; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de estos.
La invención también se refiere a una serie de derivados de GLP-1 específicos, cuyas fórmulas estructurales se incluyen en la presente descripción como Compuestos químicos números 21-32, así como también sus sales, amidas, y ésteres farmacéuticamente aceptables.
En su segundo aspecto, la invención se refiere a una serie de análogos de GLP-1 específicos seleccionados de la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 15, los aminoácidos 1-275 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, o la SEQ ID NO: 20; así como también sus sales, amidas, o ésteres farmacéuticamente aceptables.
En su tercer aspecto la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende tal derivado o análogo y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En su cuarto aspecto, la invención se refiere a tal derivado o análogo para su uso como medicamento. En algunas modalidades, el derivado o análogo se usa en (i) la prevención o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de inicio en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional, y/o por la reducción de HbA1C; (ii) prevención o tratamiento de trastornos cognitivos o trastornos neurodegenerativos, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y/o esclerosis múltiple; (iii) prevención y/o tratamiento de trastornos alimentarios, tales como la obesidad; (iv) prevención o tratamiento de complicaciones diabéticas, tales como angiopatía; neuropatía, que incluye la neuropatía periférica; nefropatía; y/o retinopatía; (vii) prevención o tratamiento de la dislipidemia; (viii) prevención y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como síndrome X, aterosclerosis, infarto de miocardio, enfermedad cardíaca coronaria, lesión por reperfusión, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, una enfermedad cardíaca o cardiovascular temprana, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, hipertensión esencial, emergencia hipertensiva aguda, cardiomiopatía, insuficiencia cardíaca, intolerancia al ejercicio, insuficiencia cardíaca aguda y/o crónica, arritmia, disritmia cardíaca, síncopia, angina de pecho, derivación cardíaca y/o reoclusión del stent, claudicación intermitente (aterosclerosis obliterante), disfunción diastólica, disfunción sistólica, y reducción de la presión arterial; (ix) prevención y/o tratamiento de enfermedades gastrointestinales, tales como enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino corto, o enfermedad de Crohn, colitis; dispepsia y/o úlceras gástricas; y/o inflamación, tales como psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, y/o lupus eritematoso sistémico.
En su quinto aspecto la invención se refiere a métodos para la preparación de tales análogos y derivados, que comprenden la etapa de producir recombinantemente un análogo de GLP-1 que tiene Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1).
Agonista del receptor de GLP-1
Un agonista del receptor puede definirse como un análogo que se une a un receptor e induce una respuesta típica del ligando natural. Un agonista completo puede definirse como uno que induce una respuesta de la misma magnitud que el ligando natural (ver, por ejemplo, "Principles of Biochemistry", AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Segunda edición, Worth Publishers, 1993, página 763).
Así, por ejemplo, un “agonista del receptor de GLP-1” puede definirse como un compuesto que es capaz de unirse al receptor de GLP-1 y es capaz de activarlo. Y un agonista del receptor de GLP-1 "completo" puede definirse como un agonista del receptor de GLP-1 que es capaz de inducir una magnitud de la respuesta del receptor de GLP-1 que es similar a GLP-1 nativo.
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 de la invención es un agonista del receptor de GLP-1. En algunas modalidades el análogo de GLP-1 de la invención es un agonista del receptor de g LP-1 completo. En algunas modalidades el derivado de GLP-1 de la invención es un agonista del receptor de GLP-1. En algunas modalidades el derivado de GLP-1 de la invención es un agonista del receptor de GLP-1 completo.
Características estructurales
Análogos de GLP-1
El término “análogo de GLP-1” como se usa en la presente descripción se refiere a un análogo (o variante) del péptido tipo glucagón-1 humano (GLP-1(7-37)), la secuencia del cual se incluye en el listado de secuencias como la SEQ ID NO: 1. El péptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 también puede denominarse como GLP-1 "nativo".
El análogo de GLP-1 de la invención tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1).
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 de la invención es un análogo de GLP-1(7-37) que tiene de 30 a 36 residuos de aminoácidos.
La numeración de los residuos de aminoácidos (tal como “posición 8”) en los análogos de GLP-1 de la invención sigue la práctica establecida en la técnica para GLP-1 nativo, principalmente que el primer residuo de aminoácido (N-terminal) se numera o se le concede la posición núm. 7, y los residuos de aminoácidos subsecuentes aguas abajo hacia el extremo C se numeran 8, 9, 10, y así sucesivamente, hasta el último residuo de aminoácidos (C-terminal). En el GLP-1 nativo el residuo de aminoácido C-terminal es Gly, con el número 37.
La numeración es diferente en el listado de secuencias, donde el primer residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 1 (His) se asigna núm. 1 y el último (Gly) núm. 31. Sin embargo, en la presente descripción seguimos la práctica de numeración establecida en la técnica, como se explicó anteriormente.
En algunas modalidades del 2do aspecto de la presente invención (el análogo de GLP-1 de la invención) el análogo de GLP-1 comprende (o es) un péptido de fórmula II: Xaa7-Trp-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42, en donde Xaa7 es L-histidina; Xaa12 es Phe; Xaa16 es Val; Xaa18 es Ser; Xaa19 es Tyr; Xaa20 es Leu; Xaa22 es Gly o Glu; Xaa23 es Gln; Xaa25 es Ala; Xaa26 es Arg o Lys; Xaa27 es Glu o Lys; Xaa30 es Ala o Glu; Xaa31 es Trp; Xaa33 es Val; Xaa34 es Arg; Xaa35 es Gly; Xaa36 es Arg o Lys; Xaa37 es Gly, Lys o Pro; Xaa38 es Glu, Lys, o está ausente; Xaa39 es Gly o está ausente; Xaa40 es Gly e está ausente; Xaa41 es Ser o está ausente; y Xaa42 es Lys está ausente; con la condición de que si uno de Xaa37, Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa41, o Xaa42 está ausente, entonces cada residuo de aminoácido subsiguiente también está ausente, y con la condición de que al menos uno de Xaa26, Xaa27, Xaa36, Xaa37, Xaa38, o Xaa42 es Lys; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de esta.
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 de la invención comprende (o es) la secuencia de una cualquiera de las fórmulas IIa, IIb, IIc, o IId, como se define en la sección titulada "Modalidades particulares"; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de estas.
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 de la invención no se selecciona de la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 15, los aminoácidos 1-275 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, y la SEQ ID NO: 20; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
Como aparece en la fórmula II anterior, el aminoácido C-terminal puede ser Xaa36, Xaa37, Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa41, 0 Xaa42, es decir, tiene los números 36, 37, 38, 39, 40, 41 o 42, respectivamente. Los análogos de GLP-1 de la invención donde el aminoácido C-terminal Xaa38 está presente puede decirse que comprenden una adición (o extensión) de un aminoácido, en comparación con el GLP-1 nativo. Asimismo, los análogos de GLP-1 de la invención donde el aminoácido C-terminal es Xaa39 puede decirse que comprende una adición de dos aminoácidos (a saber, Xaa38 y Xaa39), en comparación con el GLP-1 nativo; etcétera.
Cada uno de los análogos de GLP-1 de los derivados de la invención pueden describirse como referencia i) al número del residuo de aminoácido en el GLP-1(7-37) nativo que corresponde al residuo de aminoácido que se cambia (es decir, la posición correspondiente en el GLP-1 nativo) y ii) al cambio real.
En otras palabras, el análogo de GLP-1 de la invención pueden describirse mediante referencia al péptido GLP-1(7-37) nativo, principalmente como una variante de este en el cual se cambió una cantidad de residuos de aminoácidos cuando se compara con el GLP-1(7-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Estos cambios pueden representar, independientemente, una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de la nomenclatura apropiada de los análogos:
El análogo de GLP-1 incorporado en el derivado del Ejemplo 1 en la presente descripción puede referirse como (8W, 22E, 26R, 34R, 36K, 37K) GLP-1(7-37). Cuando este análogo del Ejemplo 1 se alinea con el GLP-1 nativo, el aminoácido en el posición en el análogo que corresponde, de acuerdo con el alineamiento, a la posición 8 en el GLP-1 nativo es W, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 22 en el GLP-1 nativo es E, el aminoácido en el posición en el análogo que corresponde a la posición 26 en el GLP-1 nativo es R, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 34 en el GLP-1 nativo es R, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 36 en el GLP-1 nativo es K, y el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 37 en el GLP-1 nativo es K. Todos los otros aminoácidos en este análogo son idénticos al aminoácido correspondiente en el GLP-1 nativo.
Como otro ejemplo el análogo de GLP-1 que se incorpora en el derivado del Ejemplo 3 en la presente descripción puede referirse como (8W, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G) GLP-1(7-37). Cuando este análogo del Ejemplo 3 se alinea con el GLP-1 nativo, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde, de acuerdo con el alineamiento, a la posición 8 en el GLP-1 nativo es W, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 22 en el GLP-1 nativo es E, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 26 en el GLP-1 nativo es R, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 27 en el GLP-1 nativo es K, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 30 en GLP-1 nativo es E, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 34 en el GLP-1 nativo es R, el aminoácido en la posición en el análogo que corresponde a la posición 36 en GLP-1 nativo es K, y entonces el análogo del Ejemplo 3 incluye una adición C terminal (o extensión) del dipéptido E-G, que para los fines de la presente se diuce que corresponden a las posiciones 38-39, respectivamente, en el GLP-1. Cada uno de los otros aminoácidos en este análogo es idéntico al aminoácido correspondiente en el GLP-1 nativo.
La fórmula general II debe entenderse de manera similar.
Los análogos “que comprenden” determinados cambios especificados pueden comprender otros cambios, en comparación con la SEQ ID NO: 1. En una modalidad particular, el análogo "tiene" los cambios especificados, o "es" el análogo especificado, en cuyo caso no hay más cambios, en comparación con la SEQ ID NO: 1.
Como es evidente a partir de lo anterior, los residuos de aminoácidos pueden identificarse mediante su nombre completo, su código de una letra y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son completamente equivalentes.
Las expresiones “una posición equivalente a” o "posición correspondiente" se usan en la presente descripción para caracterizar el sitio de cambio en una secuencia variante de GLP-1(7-37) como referencia a una secuencia de referencia tal como GLP-1(7-37) nativo (SEQ ID NO: 1). Las posiciones equivalentes o correspondientes, así como también la cantidad de cambios, se deducen fácilmente, por ejemplo, mediante simple escritura e inspección visual; y/o puede usarse un programa estándar de alineamiento de proteínas o péptidos, tal como "align" que se basa en un algoritmo de Needleman-Wunsch. Este algoritmo se describe en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, y el programa de alineamiento de Myers y W. Miller en "Alignments Optimum in Linear Space" CABIOS (aplicaciones informáticas en las biociencias) (1988) 4:11-17. Para el alineamiento, puede usarse la matriz de puntuación predeterminada BLOSUM62 y la matriz de identidad predeterminada, y la penalización para el primer residuo en una interrupción puede fijarse en -12 o, preferentemente, en -10 y las penalizaciones para residuos adicionales en una interrupción en -2 o, preferentemente, en -0,5.
Un ejemplo de dicho alineamiento se inserta más abajo del GLP-1 nativo de la SEQ ID NO: 1, el análogo (8W, 22E, 26R, 27K, 30E, 34R, 36K, 38E, 39G) de este de SEQ ID NO: 9:
#=======================================
#
# Secuencias alineadas: 2
# 1: SEQ_ID_NO_1
# 2: SEQ_ID_NO_9
# Matriz: EBLOSUM62
# Penalización interrupción: 10,0
# Penalización extendida: 0,5
#
# Longitud: 33
# Identidad: 24/33 (72,7 %)
# Similitud: 28/33 (84,8 %)
# Interrupciones: 2/33 (6,1 %)
# Puntuación: 128,0
#
#
#=======================================
SEQ_ID_NO_1 1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG— 31
M M M M M M |M M ::|M M :|:|
SEQ_ID_NO_9 1 HWEGTFTSDVSSYLEEQAARKFIEWLVRGKGEG 33
Cuando 6 se añade a los números de posición mostrados en este alineamiento (por ejemplo, "1" y "31" en la secuencia 1, y a "1" y "33" en la secuencia 2) se obtiene la numeración de posición como se usa en la presente descripción. Por ejemplo, en la secuencia 1 (que es idéntica a la SEQ ID NO: 1), el aminoácido N terminal (H) tiene número de posición 7, y el aminoácido C terminal (G) tiene el número 37. Con respecto a la secuencia 2, el aminoácido N-terminal (H) tiene el número 7 y el aminoácido C-terminal (G) tiene el número 39.
En el caso de los residuos de aminoácidos específicos o similares con ningún codón de una sola letra (tal como deamino-histidina (Imp) se incluyen en la secuencia, estos pueden, para los fines de alineamiento, sustituirse con, por ejemplo, X. Si se desea, X puede corregirse manualmente después.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de lo que puede inferirse del alineamiento anterior:
Como un ejemplo, puede inferirse que la secuencia 2 tiene 9 cambios de aminoácidos en comparación con la secuencia 1 (específicamente en todas las posiciones donde un punto final ("."), dos puntos (":"), o un guión horizontal ("-") se muestra en el alineamiento).
Como otro ejemplo puede inferirse que, por ejemplo, la secuencia núm. 2 comprende 39G, ya que tiene una G en la posición que corresponde, de acuerdo con el alineamiento, a la posición 39 en la secuencia de referencia (secuencia 1, SEQ ID NO: 1).
Y de manera similar, todos los otros cambios en la secuencia 2 en comparación con la secuencia 1 pueden deducirse del alineamiento.
En lo que sigue, todos los aminoácidos del análogo de GLP-1 de la invención para los cuales no se indica el isómero óptico debe entenderse que significa el isómero L (a menos que se especifique de cualquier otra manera).
Algunas modalidades adicionales de análogos de GLP-1 de la invención, y para la incorporación en los derivados de la invención, se describen en las secciones tituladas MODALIDADES PARTICULARES, MODALIDADES PARTICULARES ADICIONALES, y AÚN OTRAS MODALIDADES PARTICULARES.
Derivados de GLP-1
El término “derivado” como se usa en la presente descripción en el contexto de un análogo de GLP-1 se refiere a un análogo de GLP-1 modificado químicamente en el cual uno o más sustituyentes se han unido covalentemente al análogo.
En algunas modalidades el sustituyente puede referirse como una cadena lateral.
El derivado de la invención comprende un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) y un sustituyente que comprende al menos ocho grupos -CH2- consecutivos y al menos un grupo funcional (FG) con un pKa < 7 se une a un residuo Lys del análogo de g LP-1.
En algunas modalidades el derivado comprende uno o dos de tales sustituyentes.
En algunas modalidades el número de grupos -CH2- consecutivos en el sustituyente está en el intervalo de 8-20. En algunas modalidades el grupo funcional (FG) se selecciona del Compuesto químico 1, Compuesto químico 2, y Compuesto químico 4:
Compuesto químico 1:
Figure imgf000011_0001
Compuesto químico 2:
Figure imgf000011_0002
Compuesto químico 4:
Figure imgf000011_0003
En algunas modalidades pKa es el pH de una solución de CH3-FG en agua.
En algunas modalidades la invención, en su primer aspecto, se refiere a un derivado de fórmula I:(PL)u-B-GLP1, en donde GLP1 es un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1), (P-L) es un sustituyente unido a un residuo Lys del análogo de GLP-1 a través de un grupo de ramificación opcional (B) y comprende una porción prolongada (P) y un enlazador (L), U representa el número de sustituyentes (P-L) en el derivado y es 1 o 2; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
En algunas modalidades cada uno de el uno o dos sustituyentes (P-L) comprende una porción prolongada (P) seleccionada del Compuesto químico 10, Compuesto químico 11, Compuesto químico 12, Compuesto químico 13 y Compuesto químico 14:
Compuesto químico 10:
Figure imgf000011_0004
Compuesto químico 11:
Figure imgf000011_0005
Compuesto químco 12:
Compuesto químico 13:
Figure imgf000012_0001
Compuesto químico 14:
Figure imgf000012_0002
un enlazador (L) que comprende al menos un elemento enlazador seleccionado del Compuesto químico 15, Compuesto químico 16, Compuesto químico 17 y Compuesto químico 18:
Compuesto químico 15:
Figure imgf000012_0003
Compuesto químico 17:
Figure imgf000012_0004
en donde
R es -COOH;
cada uno de s, x, y, z, y p representa independientemente un número entero en el intervalo de 8-20;
cada uno de n, m, y q representa independientemente un número entero en el intervalo de 0-4; y
cada uno de k, l, y t representa independientemente un número entero en el intervalo de 1-5.
En algunas modalidades, el grupo de ramificación (B) comprende un enlazador ramificado (BL) seleccionado del Compuesto químico 19 y Compuesto químico 20:
Compuesto químico 19:
Figure imgf000013_0001
en donde u y v representan independientemente un número entero en el intervalo de 0-5, con la condición de que cuando u es 0 v es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando v es 0, u es un número entero en el intervalo de 1-5; y cuando cada w representa un número entero en el intervalo de 0-2.
En algunas modalidades cuando u es 4, y v es 0 (o u es 0 y v es 4), el enlazador ramificado del Compuesto químico 20 puede referirse como un tri-radical de eps-Lys(Bis), del Compuesto químico 19a:
Figure imgf000013_0002
En algunas modalidades donde w es 1, el enlazador ramificado del Compuesto químico 20 puede referirse como un trirradical de Amino-C3-Gly(Bis).
En algunas modalidades (B ausente, U = 1) el derivado tiene la fórmula Ia:
Fórmula Ia:(PL)-GLP1 (tal como el compuesto del Ejemplo 5).
En algunas modalidades (B ausente, U = 2) el derivado tiene la fórmula Ib:
Fórmula Ib:(PL)2-GLP1 (tal como el compuesto del Ejemplo 3).
En algunas modalidades (B presente, U = 2) el derivado tiene una estructura de "horquilla" de fórmula Ic o Id:
Fórmula Ic:(PL)2>BL-PL-GLP1 (tal como el compuesto del Ejemplo 13)
Fórmula Id:(PL)2>BL-GLP1 (tal como el compuesto del Ejemplo 10);
en donde P, L se definen anteriormente y B está representado por (BL-PL), en donde PL es un preenlazador opcional (PL está presente en la fórmula Ic, PL está ausente en la fórmula Id) y BL es un enlazador ramificado (modalidades del cual se definen anteriormente), que proporciona la estructura de "horquilla".
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) es un análogo de GLP-1 que comprende la fórmula II, como se define en la sección anterior titulada "Análogos de GLP-1".
En algunas modalidades uno o dos de los siguientes residuos de aminoácidos del análogo de fórmula II es/son Lys: Xaa26, Xaa27, Xaa36, Xaa37, Xaa38, y/o Xaa42.
En algunas modalidades el derivado es un compuesto de cualquiera de los Ejemplos 1-5.
Los derivados de la invención pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas que tienen la misma fórmula molecular y secuencia de átomos unidos, pero que difieren solo en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. El estereoisomerismo de los derivados ejemplificados de la invención se indica en la sección experimental, en los nombres así como también en las estructuras, mediante el uso de la nomenclatura estándar. A menos que se establezca de cualquier otra manera la invención se refiere a todas las formas estereoisoméricas de los derivados reivindicados.
La concentración plasmática de los derivados de GLP-1 de la invención puede determinarse mediante el uso de cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede usarse LC-MS (Espectroscopía de masas acoplada a cromatografía líquida), o inmunoensayos tales como RIA (Radioinmunoensayo), ELISA (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) y LOCI (Inmunoensayo de luminiscencia de canalización de oxígeno). Los protocolos generales para ensayos RIA y ELISA adecuados se encuentran en, por ejemplo, el documento núm. WO 2009/030738 en las páginas 116-118. Un ensayo preferido es el ensayo LOCI, donde LOCI se refiere al Inmunoensayo de luminiscencia de canalización de oxígeno, que se describe generalmente para la determinación de insulina por Poulsen y Jensen en Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, páginas 240-247. Las perlas donantes se recubrieron con estreptavidina, mientras que las perlas aceptoras se conjugaron con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo medio/C-terminal del péptido. Otro anticuerpo monoclonal, específico para el N-terminal, se biotiniló. Los tres reactivos se combinaron con el analito y formaron un inmunocomplejo de dos sitios. La iluminación del complejo liberó átomos de oxígeno singlete de las perlas donantes, que se canalizaron en las esferas aceptoras y desencadenaron la quimioluminiscencia que se midió en un lector de placas Envision. La cantidad de luz fue proporcional a la concentración del compuesto.
Los derivados de GLP-1 y los análogos de la invención tienen actividad de GLP-1. Este término se refiere a la capacidad de unirse al receptor de GLP-1 e iniciar una vía de transducción de señales que da como resultado la acción insulinotrópica u otros efectos fisiológicos como se conoce en la técnica. Por ejemplo, los análogos y derivados de la invención pueden probarse para determinar la actividad de GLP-1 mediante el uso de los ensayos descritos en los Ejemplos 15 y 16 en la presente descripción.
Sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable
Los derivados y análogos de la invención pueden estar en la forma de una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptables.
Las sales se forman, por ejemplo, mediante una reacción química entre una base y un ácido, por ejemplo: 2 NH3 + H2SO4 ^ (NH4)2SO4.
La sal puede ser una sal básica, una sal ácida, o puede no ser ninguna de estas (es decir, una sal neutra). En agua, las sales básicas producen iones hidróxido y las sales ácidas iones hidronio.
Las sales del derivado o análogo de la invención pueden formarse con cationes o aniones añadidos entre grupos aniónicos o catiónicos, respectivamente. Estos grupos pueden ubicarse en la porción peptídica, y/o en la(s) cadena(s) lateral(es) de los derivados de la invención.
Los ejemplos no limitantes de los grupos aniónicos del derivado o análogo de la invención incluyen grupos carboxílicos libres en la cadena lateral, si los hay, así como también en la porción peptídica. La porción peptídica incluye frecuentemente un grupo de ácido carboxílico libre en el C-terminal y también puede incluir grupos carboxílicos libres en los residuos aminoacídicos ácidos internos tales como Asp y Glu.
Los ejemplos no limitantes de grupos catiónicos en la porción peptídica incluyen el grupo amino libre en el N-terminal, si se presenta, así como también cualquier grupo amino libre de residuos aminoacídicos básicos internos tales como His, Arg y Lys.
El éster de los derivados o análogos de la invención puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo ácido carboxílico libre con un alcohol o un fenol, lo cual conduce a la sustitución de al menos un grupo hidroxilo por un grupo alcoxi o ariloxi.
La formación de ésteres puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, y/o cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral.
La amida de los análogos o derivados de la invención puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con una amina o una amina sustituida, o mediante la reacción de un grupo amino libre o sustituido con un ácido carboxílico.
La formación de amida puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral, el grupo amino libre en el N-terminal del péptido, y/o cualquier grupo amino libre o sustituido del péptido en el péptido y/o la cadena lateral.
En algunas modalidades, el péptido o derivado de la invención está en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el análogo o derivado de la invención está en la forma de amida farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades el análogo o derivado de la invención tiene un grupo amida en el extremo C-terminal del péptido. En algunas modalidades el análogo o derivado de la invención está en forma de un éster farmacéuticamente aceptable.
Propiedades funcionales
En algunas modalidades los análogos de GLP-1 y los derivados de GLP-1 de la invención son estables frente a la degradación por DPP-IV.
También o alternativamente, en algunas modalidades los análogos de GLP-1 y los derivados de GLP-1 de la invención tienen una buena potencia in vitro.
También o alternativamente, en algunas modalidades los análogos de GLP-1 y los derivados de GLP-1 de la invención tienen una buena potencia in vivo.
También o alternativamente, en algunas modalidades los análogos de GLP-1 y los derivados de GLP-1 de la invención se unen bien al receptor de GLP-1.
También o alternativamente, en algunas modalidades son agonistas del receptor de GLP-1.
Estabilidad frente a la DPP-IV
Como se informó en la prueba de estabilidad a DPP-IV in vitro del Ejemplo 14, el análogo de GLP-1 del Ejemplo D (8W GLP-1(7-37)) demostró una estabilidad alta impresionante frente a la degradación por la enzima DPP-IV, que fue bastante sorprendente y totalmente inesperado.
Por supuesto, esta observación también es relevante para el derivado de la invención que incorpora un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1).
Actividad biológica - potencia
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 de la invención es biológicamente activo, o potente. En algunas modalidades el derivado de GLP-1 de la invención es biológicamente activo, o potente.
En algunas modalidades, la potencia y/o actividad se refiere a la potencia in vitro, es decir el rendimiento en un ensayo de receptor de GLP-1 funcional, más en particular a la capacidad de activar el receptor de GLP-1 humano.
La potencia in vitro puede determinarse, por ejemplo, en un medio que contiene membranas que expresan el receptor de GLP-1 humano, y/o en un ensayo con células completas que expresan el receptor de GLP-1 humano.
Por ejemplo, la respuesta del receptor de GLP-1 humano puede medirse en un ensayo de gen reportero, por ejemplo, en una línea celular BHK transfectada establemente que expresa el receptor de GLP-1 humano y que contiene el ADN para el elemento de respuesta al AMPc (CRE) acoplado a un promotor y el gen para la luciferasa de luciérnaga (CRE luciferasa). Cuando se produce AMPc como resultado de la activación del receptor de GLP-1 esto a su vez resulta en que se exprese la luciferasa. La luciferasa puede determinarse mediante la adición de luciferina, que se convierte por la enzima en oxiluciferina y produce bioluminiscencia, que se mide y es una medida de la potencia in vitro. Un ejemplo no limitante de tal ensayo se describe en el Ejemplo 15.
El término concentración eficaz semimáxima (EC50) se refiere generalmente a la concentración que induce la mitad de una respuesta entre el valor basal y el máximo, en referencia a la curva de respuesta a la dosis. La EC50 se usa como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentración donde se observa el 50 % de su efecto máximo.
La potencia in vitro de los derivados y análogos de la invención puede determinarse como se describió anteriormente, y determinarse la EC50. A menor valor de EC50, mejor será la potencia.
En algunas modalidades, el derivado o análogo de la invención tiene una potencia in vitro correspondiente a una EC50 de o inferior a 300 pM, determinada mediante el uso del método del Ejemplo 15.
En algunas modalidades los derivados de la invención así como también los análogos de GLP-1 constituyentes como tal son potentes in vivo, lo que puede determinarse como se conoce en la técnica en cualquier modelo animal adecuado, así como también en ensayos clínicos. En algunas modalidades, la potencia in vivo puede determinarse mediante el uso del estudio de PD del Ejemplo 17 en la presente descripción.
Se describen algunas modalidades adicionales en las secciones tituladas MODALIDADES PARTICULARES, MODALIDADES PARTICULARES, y AÚN OTRAS MODALIDADES PARTICULARES ADICIONALES.
Actividad biológica - unión al receptor in vitro
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 de la invención se une muy bien al receptor de GLP-1. En algunas modalidades el derivado de GLP-1 de la invención se une muy bien al receptor de GLP-1. En algunas modalidades la unión al receptor de GLP-1 se determina a una concentración baja de albúmina, en algunas modalidades se determina a una concentración alta de albúmina. Esto puede determinarse como se describe en el Ejemplo 16.
En algunas modalidades la unión al receptor de GLP-1 a baja concentración de albúmina es muy buena, correspondiente a un bajo valor de IC50.
El valor de IC50 a alta concentración de albúmina refleja la influencia de la albúmina sérica sobre la unión al receptor de GLP-1. Debido a las cadenas laterales el derivado de GLP-1 de la invención puede unirse a la albúmina sérica y si este es el caso entonces el valor de IC50 a albúmina sérica alta será mayor que el valor de IC50 a albúmina baja. Un valor de IC50 aumentado en albúmina sérica alta representa una reducción de la unión al receptor de GLP-1 provocada por la unión de la albúmina sérica que compite con la unión al receptor de GLP-1.
En algunas modalidades, el análogo o derivado de la invención se une muy bien al receptor de GLP-1 a una concentración de albúmina baja. También o alternativamente, en algunas modalidades se unen muy bien a una alta concentración de albúmina.
En algunas modalidades la afinidad de unión al receptor de GLP-1 (IC50) del análogo o derivado de la invención en presencia de 2,0 % de HSA (albúmina alta) es de 800 nM o menor.
Se describen algunas modalidades particulares adicionales en las secciones tituladas MODALIDADES PARTICULARES, MODALIDADES PARTICULARES, y AÚN OTRAS MODALIDADES PARTICULARES ADICIONALES.
Perfil farmacocinético
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 de la invención tiene propiedades farmacocinéticas mejoradas tales como una vida media terminal aumentada y/o un aclaramiento reducido. En algunas modalidades el derivado de GLP-1 de la invención tiene propiedades farmacocinéticas mejoradas tales como un mayor tiempo de vida media terminal, y/o aclaramiento disminuido.
El aumento de la vida media terminal y/o la disminución del aclaramiento significa que el compuesto en cuestión se elimina de manera más lenta del cuerpo. Para el derivado o análogo de la invención esto implica una duración extendida del efecto farmacológico.
Las propiedades farmacocinéticas pueden determinarse adecuadamente in vivo en estudios farmacocinéticos (PK). Tales estudios se realizan para evaluar cómo los compuestos farmacéuticos se absorben, distribuyen, y eliminan en el cuerpo, y cómo estos procesos afectan la concentración del compuesto en el cuerpo, en el transcurso del tiempo. En el descubrimiento y la fase preclínica del desarrollo farmacéutico de fármacos, los modelos animales tales como el ratón, rata, mono, perro, o cerdo, pueden usarse para realizar esta caracterización. Cualquiera de estos modelos puede usarse para probar las propiedades farmacocinéticas de los compuestos de la invención.
En tales estudios, los animales se administran típicamente con una única dosis del fármaco, ya sea por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), u oral (p.o.) en una formulación relevante. Se extraen las muestras de sangre en puntos temporales predefinidos después de la administración de la dosis, y las muestras se analizan para determinar la concentración del fármaco con un ensayo cuantitativo relevante. En base a estas mediciones, se representan los perfiles de concentración plasmática frente al tiempo y se realiza el denominado análisis farmacocinético no compartimental de los datos.
Para la mayoría de los compuestos, la parte terminal de los perfiles de concentración plasmática frente al tiempo será lineal cuando se dibuje en un gráfico semilogarítmico, lo que refleja que después de la absorción inicial y la distribución, el fármaco se elimina del cuerpo a una tasa fraccional constante. La tasa (lambda Z o Xz) es igual a menos la pendiente de la parte terminal del gráfico. A partir de esta tasa, también puede calcularse una vida media terminal, como t1^ = ln(2)A¿ (ver, por ejemplo, Johan Gabrielsson y Daniel Weiner: Pharmacokinetics and Pharmacodynamic Data Analysis. Concepts & Applications, 3ra Ed., Swedish Pharmaceutical Press, Estocolmo (2000)).
El aclaramiento puede determinarse después de la administración i.v. y se define como la dosis (D) dividida por el área bajo la curva (AUC) en el perfil de concentración en plasma frente al tiempo (Rowland, M y Tozer TN: Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications, 3ra edición, 1995 Williams Wilkins).
El cálculo de la vida media terminal y/o la eliminación es relevante para la evaluación de regímenes de administración de la dosis y es un parámetro importante en el desarrollo de fármacos, en la evaluación de nuevos compuestos farmacológicos.
Procesos de producción
La producción de péptidos tipo GLP-1(7-37) y análogos de GLP-1 es bien conocida en la técnica.
La porción del péptido GLP-1 de los derivados de la invención (o sus fragmentos) así como también los análogos de GLP-1 de la invención puede producirse, por ejemplo, mediante síntesis peptídica clásica, por ejemplo, síntesis peptídica en fase sólida mediante el uso de compuestos químicos t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, ver, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.
En algunas modalidades el análogo de GLP-1 completo de la invención, o la parte del análogo de GLP-1 del derivado de la invención, se produce por métodos recombinantes, a saber, mediante el cultivo de una célula hospedera que contiene una secuencia de ADN que codifica el análogo y es capaz de expresarlo en un medio nutriente adecuado en condiciones que permitan la expresión del péptido. Los ejemplos de células hospederas adecuadas para la expresión de estos péptidos no limitantes son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, así como también, líneas celulares BHK o CHO de mamíferos. En algunas modalidades tal etapa de fermentación completamente recombinante del método del proceso de producción es deseable, por ejemplo, debido a consideraciones de economía de producción.
En algunas modalidades en las que el análogo de GLP-1 de la invención, o la parte análoga de GLP-1 del derivado de la invención, incluye aminoácidos no codificados, el análogo puede producirse como se conoce en la técnica, ver, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, núm. 7 (2004), páginas 422-430; y el documento núm. WO 2009/083549 A1 titulado "Semirecombinant preparation of GLP-1 analogues".
Los ejemplos específicos de métodos para preparar varios derivados de la invención se incluyen en la parte experimental.
El Ejemplo 18 demuestra la ventajosa expresión completamente recombinante de varios de los análogos de la invención y compara el rendimiento de expresión con el rendimiento de expresión en un método conocido semirecombinante para análogos de GLP-1 estabilizados a DPP-IV conocidos que incluyen uno o más aminoácidos no codificados en su secuencia.
Composiciones farmacéuticas
La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado o un análogo de la invención, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden prepararse como se conoce en la técnica.
El término "excipiente" se refiere, en un sentido amplio, a cualquier componente aparte del/de los ingrediente/s terapéutico/s activo/s. El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente.
El excipiente puede servir para diversos fines, por ejemplo como portador, vehículo, diluyente, auxiliar para comprimidos, y/o para mejorar la administración, y/o la ingesta de la sustancia activa.
En la técnica se conoce la formulación de ingredientes farmacéuticamente activos con diversos excipientes, ver, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo, 19na edición (1995) y cualquiera de las ediciones posteriores).
Los ejemplos no limitantes de excipientes son: Los disolventes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes reguladores de la tonicidad, agentes quelantes, y estabilizadores.
Los ejemplos de formulaciones incluyen formulaciones líquidas, es decir, formulaciones acuosas que comprenden agua. Una formulación líquida puede ser una solución, o una suspensión. Una formulación acuosa típicamente comprende al menos 50 % p/p de agua, o al menos 60 %, 70 %, 80 %, o incluso al menos 90 % p/p de agua.
Alternativamente una composición farmacéutica puede ser una formulación sólida, por ejemplo, una composición liofilizada o secada por pulverización, que puede usarse tal cual, a la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de su uso.
El pH en una formulación acuosa puede ser cualquiera entre pH 3 y pH 10, por ejemplo, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,5; o de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, tal como de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,5, o de 3,0 a 7,0.
Una composición farmacéutica puede comprender un tampón. El tampón puede seleccionarse, por ejemplo, de acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrógeno fosfato de sodio, hidrógeno fosfato de disodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de estos.
Una composición farmacéutica puede comprender un conservante. El conservante puede seleccionarse, por ejemplo, de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, phidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomersal, bronopol, ácido benzoico, imidaurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) y mezclas de estos. El conservante puede estar presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Una composición farmacéutica puede comprender un agente isotónico. El agente isotónico puede seleccionarse, por ejemplo, de una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azúcar o alcohol de azúcar, un aminoácido (por ejemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) y mezclas de estos. Puede usarse cualquier azúcar tal como mono-, di-, o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, que incluyen, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa y beta HPCD, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa de Na. El azúcar alcohólico se define como un hidrocarburo C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una modalidad, el aditivo de azúcar alcohólico es manitol.
Una composición farmacéutica puede comprender un agente quelante. El agente quelante puede seleccionarse, por ejemplo, de sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico y mezclas de estos.
Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizador. El estabilizador puede ser, por ejemplo, uno o más inhibidores de la oxidación, inhibidores de la agregación, tensioactivos y/o uno o más inhibidores de proteasas. Los ejemplos no limitantes de estos diversos tipos de estabilizadores se describen a continuación.
El término "formación de agregados" se refiere a una interacción física entre las moléculas polipeptídicas que resulta en la formación de oligómeros, que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan de la solución. La formación de agregados por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar adversamente la actividad biológica de ese polipéptido, lo que resulta en la pérdida de la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, la formación de agregados puede provocar otros problemas tales como el bloqueo de tubos, membranas, o bombas cuando la composición farmacéutica que contiene polipéptidos se administra mediante el uso de un sistema de infusión.
Una composición farmacéutica puede comprender una cantidad de una base de aminoácido suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición. El término "base de aminoácido" se refiere a uno o más aminoácidos (tales como metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), o los análogos de estos. Cualquier aminoácido puede presentarse ya sea en su forma de base libre o en su forma de sal. Cualquier estereoisómero (es decir, L, D, o una mezcla de estos) de la base de aminoácido puede estar presente.
Puede añadirse metionina (u otros aminoácidos o análogos de aminoácidos sulfúricos) para inhibir la oxidación de los residuos de metionina a metionina sulfóxido cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible a tal oxidación. Puede usarse cualquier estereoisómero de metionina (L o D) o combinaciones de estos.
Una composición farmacéutica puede comprender un estabilizador seleccionado de polímeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. El estabilizador puede seleccionarse, por ejemplo, de polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxicelulosa o derivados de estos (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol y sales diferentes (por ejemplo, cloruro de sodio). Una composición farmacéutica puede comprender agentes estabilizadores adicionales tales como, pero sin limitarse a, metionina y EDTA, que protegen al polipéptido de la oxidación de la metionina y un tensioactivo no iónico, que protege al polipéptido de la agregación asociada a la congelación-descongelación o al cizallamiento mecánico.
Una composición farmacéutica puede comprender uno o más tensioactivos. El término "tensioactivo" se refiere a cualesquiera moléculas o iones que se comprenden de una parte soluble en agua (hidrófila) y una parte soluble en grasa (lipófila). El tensioactivo puede seleccionarse, por ejemplo, de tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos no iónicos y/o tensioactivos zwitteriónicos.
Una composición farmacéutica puede comprender uno o más inhibidores de proteasas, tales como, por ejemplo, EDTA (ácido etilendiamina tetraacético) y/o benzamidinaHCl.
Los ingredientes adicionales, opcionales de una composición farmacéutica incluyen, por ejemplo, agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes que añaden volumen, iones metálicos, vehículos oleosos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina) y/o un zwitterión (por ejemplo, un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina).
Aún más, una composición farmacéutica puede formularse como es conocido en la técnica de las formulaciones orales de compuestos insulinotrópicos, por ejemplo, mediante el uso de una cualquiera o más de las formulaciones descritas en los documentos núm. WO 2008/145728, WO 2012/080471, WO 2013/139694, y WO 2000/050012. En algunas modalidades se usa una sal de un aminoácido alifático modificado tal como N-(8-(2-hidroxibenzoil)amino)caprilato de sodio (SNAC) como portador para mejorar la absorción del compuesto de GLP-1 de la invención.
Una dosis administrada puede contener de 0,1 mg - 100 mg del derivado, de 1-100 mg del derivado, o de 1-50 mg del derivado.
El derivado o análogo puede administrarse en la forma de una composición farmacéutica. Puede administrarse a un paciente que lo necesita en diversos sitios, por ejemplo, en sitios tópicos tales como la piel o sitios de mucosa; en sitios en donde no se produce absorción tales como en una arteria, en una vena, o en el corazón; y en sitios que implican la absorción, tales como en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.
La vía de administración puede ser, por ejemplo, lingual; sublingual; bucal; en la boca; oral; en el estómago; en el intestino; nasal; pulmonar, tal como a través de los bronquiolos, los alvéolos o una combinación de estas; parenteral, epidérmico; dérmico; transdérmico; conjuntival; uretral; vaginal; rectal; y/u ocular. Una composición puede ser una composición oral, y la vía de administración es oral.
Una composición puede administrarse en varias formas de administración de dosis, por ejemplo, como una solución; una suspensión; una emulsión; una microemulsión; emulsiones múltiples; una espuma; un ungüento; una pasta; un yeso; una pomada; un comprimido; un comprimido recubierto; una goma de mascar; un enjuague; una cápsula tal como cápsulas de gelatina duras o blandas; un supositorio; una cápsula rectal; gotas; un gel; un aerosol; un polvo; un aerosol; un inhalante; gotas oculares; una ungüento oftálmico; un enjuague oftálmico; un pesario vaginal; un anillo vaginal; un ungüento vaginal; una solución de inyección; una solución de transformación in situ, tal como la gelificación in situ, fraguado, precipitación y cristalización in situ; una solución de infusión; o como un implante.
Una composición puede ser un comprimido, opcionalmente recubierto, una cápsula, o una goma de mascar.
Una composición puede combinarse adicionalmente en un portador o sistema de administración de fármacos, por ejemplo, para mejorar la estabilidad, biodisponibilidad y/o solubilidad. En una modalidad particular, una composición puede unirse a tal sistema a través de interacciones covalentes, hidrófobas y/o electrostáticas. El propósito de tal composición puede ser, por ejemplo, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia y/o aumentar la satisfacción del paciente.
Una composición también puede usarse en la formulación de sistemas de suministro de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y/o lenta.
La administración parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma o por medio de una bomba de infusión.
Una composición puede administrarse por vía nasal en la forma de una solución, una suspensión, o un polvo; o puede administrarse por vía pulmonar en la forma de un aerosol líquido o en polvo.
La administración transdérmica es una opción adicional, por ejemplo, mediante inyección sin aguja, desde un parche tal como un parche iontoforético, o mediante una vía transmucosal, por ejemplo, por vía bucal.
Una composición puede ser una formulación estabilizada. El término “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con estabilidad física y/o química aumentada, preferentemente, ambas. En general, una formulación debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de conformidad con el uso recomendado y las condiciones de almacenamiento) hasta que se alcance la fecha de vencimiento.
El término “estabilidad física” se refiere a la tendencia del polipéptido a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles como un resultado de la exposición a estrés termomecánico y/o a la interacción con interfaces y superficies desestabilizantes (tales como superficies hidrófobas). La estabilidad física de una formulación acuosa de polipéptido se evaluó por medio de inspección visual y/o mediciones de la turbidez después de exponer a estrés mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante diversos períodos de tiempo. Alternativamente, la estabilidad física puede evaluarse mediante el uso de un agente espectroscópico o sonda del estado conformacional del polipéptido tal como, por ejemplo, Tioflavina T o sondas de “parche hidrófobo”.
El término “estabilidad química” se refiere a cambios químicos (en particular covalentes) en la estructura polipeptídica que conduce a la formación de productos de degradación química que tienen potencialmente una potencia biológica reducida, y/o un efecto inmunogénico aumentado en comparación con el polipéptido intacto. La estabilidad química puede evaluarse mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en diversos puntos temporales después de la exposición a diferentes condiciones ambientales, por ejemplo mediante SEC-HPLC, y/o RP-HPLC.
El tratamiento con un derivado o análogo de acuerdo con la presente invención también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas adicionales, por ejemplo, que se seleccionan de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones resultantes de o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con la obesidad. Ejemplos de estas sustancias activas farmacológicamente son: Insulina, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, inhibidores de glucosidasa, agonistas de glucagón, antagonistas de glucagón, inhibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidasa-IV), inhibidores de enzimas hepáticas implicadas en la estimulación de la gluconeogénesis y/o glucogenólisis, moduladores de la captación de glucosa, compuestos que modifican el metabolismo lipídico tales como agentes antihiperlipidémicos como inhibidores HMG CoA (estatinas), polipéptidos inhibidores gástricos (análogos GIP), compuestos que reducen la ingesta de alimentos, agonistas RXR y agentes que actúan sobre el canal de potasio dependiente de ATP de las pcélulas; colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozilo, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; p-bloqueadores tales como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol y metoprolol, inhibidores de a Ce (enzima convertidora de angiotensina) tales como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril y ramipril, bloqueadores de los canales de calcio tales como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem y verapamilo y a-bloqueadores tales como doxazosina, urapidilo, prazosina y terazosina; agonistas de CART (transcripto regulado por cocaína y anfetamina), antagonistas de NPY (neuropéptido Y), agonistas de PYY, agonistas del receptor de Y2, agonistas del receptor de Y4, agonistas mixtos del receptor de Y2/Y4, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas del TNF (factor de necrosis tumoral), agonistas del CRF (factor de liberación de corticotropina), antagonistas del CRF BP (proteína de unión al factor de liberación de corticotropina), agonistas de urocortina, pagonistas 3, oxintomodulina y análogos, agonistas de MSH (hormona estimulante de melanocitos), antagonistas de MCH (hormona concentradora de melanocitos), agonistas de CCK (colecistoquinina), inhibidores de la recaptación de serotonina, inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, compuestos mixtos de serotonina y noradrenérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21), antagonistas de galanina, hormona de crecimiento, compuestos de liberación de la hormona del crecimiento, agonistas de TRH (hormona liberadora de tireotropina), moduladores de UCP 2 o 3 (proteínas desacopladoras 2 o 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inhibidores de lipasa/amilasa, moduladores de RXR (receptor retinoide X), agonistas pTR; antagonistas de histamina H3, agonistas o antagonistas del polipéptido inhibidor gástrico (análogos de GIP), gastrina y análogos de gastrina.
El tratamiento con un derivado o análogo de acuerdo con esta invención también puede combinarse con una cirugía que influya en los niveles de glucosa, y/o homeostasis lipídica tal como la banda gástrica o la derivación gástrica.
Indicaciones farmacéuticas
La presente invención también se refiere a un derivado o análogo de la invención para el uso como un medicamento. En algunas modalidades, el derivado o análogo de la invención puede usarse para los siguientes tratamientos médicos:
(i) prevención y/o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional, y/o por reducción de HbA1C;
(iv) prevención o tratamiento de trastornos cognitivos o trastornos neurodegenerativos, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y esclerosis múltiple;
(iii) prevención y/o tratamiento de trastornos alimentarios, como la obesidad;
(vi) prevención o tratamiento de complicaciones diabéticas, tales como angiopatía, neuropatía, lo que incluye la neuropatía periférica; nefropatía; y retinopatía;
(v) prevención o tratamiento de la dislipidemia;
(vii) prevención y/o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como síndrome X, ateroesclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria, daño por reperfusión, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, una enfermedad cardiaca temprana o cardiovascular temprana, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, hipertensión esencial, emergencia hipertensiva aguda, cardiomiopatía, insuficiencia cardiaca, intolerancia al ejercicio, fallo cardiaco agudo y/o crónico, arritmia, disritmia cardiaca, síncope, angina de pecho, derivación cardiaca y/o reoclusión con stent, claudicación intermitente (ateroesclerosis obliterante), disfunción diastólica, y disfunción sistólica; y reducción de la presión sanguínea,;
(ix) prevención o tratamiento de enfermedades gastrointestinales, tales como enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome de intestino corto, enfermedad de Crohn, colitis; disepsia, y úlceras gástricas; o inflamación, tales como psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, y lupus eritematoso sistémico;
En algunas modalidades la indicación se selecciona del grupo que consiste en (i)-(vii), y se relaciona de una forma u otra con la diabetes.
En algunas modalidades, la indicación es (i). En una modalidad particular adicional la indicación es (iii). Aún en otra modalidad particular adicional la indicación es (vi).
En algunas modalidades el derivado o análogo de la invención puede usarse en el tratamiento o prevención de todas las formas de diabetes que incluyen los trastornos alimentarios, enfermedades cardiovasculares, enfermedades gastrointestinales, y complicaciones diabéticas.
Se prefieren particularmente las siguientes indicaciones: Diabetes tipo 2 y/u obesidad.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para el control del peso.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para la reducción del apetito.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para la reducción de la ingestión de alimentos.
Generalmente, todos los sujetos que padecen de obesidad también se considera que padecen de sobrepeso. En algunas modalidades la invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de la obesidad. En algunas modalidades la invención se refiere al uso del derivado o análogo de la invención para el tratamiento o la prevención de la obesidad. En algunas modalidades el sujeto que padece de obesidad es un ser humano, tal como un ser humano adulto o un ser humano pediátrico (que incluye bebés, niños y adolescentes). El índice de masa corporal (IMC) es una medida de la grasa del cuerpo basada en la altura y el peso. La fórmula para el cálculo es IMC = peso en kilogramos/(altura en metros)2. Un sujeto humano que padece de obesidad puede tener un IMC de >30; este sujeto también puede referirse como obeso. En algunas modalidades el sujeto humano que padece de obesidad puede tener un IMC de >35 o un IMC en el intervalo de >30 a <40. En algunas modalidades la obesidad es obesidad grave u obesidad mórbida, en donde el sujeto humano puede tener un IMC de > 40.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para el tratamiento o la prevención del sobrepeso, opcionalmente en presencia de al menos una comorbilidad relacionada con el peso. En algunas modalidades la invención se refiere al uso del derivado o análogo de la invención para el tratamiento o la prevención del sobrepeso, opcionalmente en presencia de al menos una comorbilidad relacionada con el peso. En algunas modalidades el sujeto que padece de sobrepeso es un ser humano, tal como un ser humano adulto o un ser humano pediátrico (que incluye bebés, niños y adolescentes). En algunas modalidades, un sujeto humano que padece de sobrepeso puede tener un IMC de >25, tal como un IMC de >27. En algunas modalidades un sujeto humano que padece de sobrepeso tiene un IMC en el intervalo de 25 a <30 o en el intervalo de 27 a <30. En algunas modalidades la comorbilidad relacionada con el peso se selecciona del grupo que consiste en hipertensión, diabetes (tal como diabetes tipo 2), dislipidemia, colesterol alto y apnea obstructiva del sueño.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para la reducción del peso corporal. En algunas modalidades la invención se refiere al uso del derivado o análogo de la invención para la reducción del peso corporal. Un ser humano que va a someterse a una reducción del peso corporal de acuerdo con la presente invención puede tener un IMC de > 25, tal como un IMC de > 27 o un IMC de > 30. En algunas modalidades el humano que se somete a reducción del peso corporal de acuerdo con la presente invención puede tener un IMC de >35 o un IMC de >40. El término “reducción del peso corporal” puede incluir tratamiento o prevención de la obesidad y/o sobrepeso.
Ejemplos
Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas y le continúa una sección que incluye los métodos generales para sintetizar y caracterizar los análogos y derivados de la invención. Después le continúa una serie de ejemplos que se relacionan con la preparación de derivados de GLP-1 específicos y al final se incluyó una serie de ejemplos relacionados con la actividad y las propiedades de estos análogos y derivados (sección titulada métodos farmacológicos).
Los ejemplos sirven para ilustrar la invención.
Lista de abreviaturas
Aib: ácido a-aminoisobutírico (ácido 2-aminoisobutírico)
Ado: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico
API: Ingrediente farmacéutico activo
AUC: Área bajo la curva
BG: Glucosa en sangre
BHK Riñón de hámster recién nacido
BW: Peso corporal
Boc: f-butiloxicarbonilo
Bom: benciloximetilo
BSA: Albúmina sérica bovina
Bzl: bencilo
Diácido C20: ácido icosanodioico
CAS: Servicio de resúmenes químicos
Clt: 2-clorotritilo
colidina: 2,4,6-trimetilpiridina
DCM: diclorometano
Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etilo
DIC: diisopropilcarbodiimida
DIPEA: diisopropiletilamina
DMAP: 4-dimetilaminopiridina
DMEM: Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
EGTA: ácido etilenglicoltetraacético
FCS: Suero de Ternera Fetal
Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
HATU: (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato)
HBTU: (2-(1H-benzotriazol-1-il-)-1,1,3,3 tetrametiluronio
hexafluorofosfato)
HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
HFIP: 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol o hexafluoroisopropanol
HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol
HOBt: 1-hidroxibenzotriazol
HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución
HSA: Albúmina sérica humana
IBMX: 3-isobutil-1-metilxantina
Imp: Ácido imidazopropiónico (ácido 3-(imidazol-5-il)propanoico) (también llamado deaminohistidina o deamino-His)
i.v. vía intravenosa
ivDde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutilo
IVGTT: Prueba de tolerancia a glucosa intravenosa
LCMS: Cromatografía líquida acoplada a espectroscopía de masas
LYD: Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS: Ver MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS: Espectroscopia de masas de tiempo de vuelo de Desorción/Ionización láser asistida por matriz
MeOH: metanol
Mmt: 4-metoxitritilo
Mtt: 4-metiltritilo
NMP: N-metil pirrolidona
OtBu: éster de terc-butilo
Oxyma Pure®: Éster etílico de ácido ciano-hidroxiimino-acético
Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
PBS: Solución salina tamponada con fosfato
PD: Farmacodinámica
Pen/Estrep: Penicilina/Estreptomicina
PK: Farmacocinética
RP: Fase inversa
RP-HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa
TA: Temperatura ambiente
TA: Tiempo de retención
s.c.: Vía subcutánea
SD: Desviación estándar
SEC-HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución de exclusión molecular
SEM: Error estándar de la media
SPA: Ensayo de proximidad por centelleo
SPPS: Síntesis de péptidos en fase sólida
tBu: terc-butilo
TFA: ácido trifluoroacético
TIS: triisopropilsilano
TLC: Cromatografía de capa delgada
Tos: tosilato (o para-toluenosulfonilo)
Tris: tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
Trt: trifenilmetilo (tritilo)
Trx: ácido tranexámico (ácido trans-4-(aminometil)ciclohexanocarboxílico)
UPLC: Cromatografía líquida de ultra alta resolución
v/v: Volumen/volumen
p/v: Peso/volumen
Materiales y métodos
Ácido icosanodioico mono-terc-butil éster
Ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico
Ácido 17-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-9-aza-3,6,12,15-tetraoxa-10-on-heptadecanoico
Ácido 1-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosan-21-oico
Ácido 1-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-dodecaoxanonatriacontan-39-oico
ácido alfa-Fmoc-amino-20(etilenglicol)-omegacarboxílico
Ácido Fmoc-tranexámico
Boc-Lys(Fmoc)-OH
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH
Fmoc-Glu-OtBu
Resina Fmoc-Lys(Mtt)-Wang
Métodos químicos
Esta sección se divide en dos: La sección A que se relaciona con los métodos generales (de preparación (A1); y de detección y caracterización (A2)), y la sección B, en la que se describe la preparación y caracterización de un número de compuestos comparativos y compuestos de ejemplos específicos.
A. Métodos generales
A1. Métodos de preparación
Esta sección se refiere a métodos para la síntesis de péptidos en fase sólida (métodos SPPS, que incluyen métodos para la desprotección de aminoácidos, métodos para escindir el péptido de la resina y para su purificación), así como también métodos para detectar y caracterizar el péptido resultante (métodos de LCMS, MALDI y UPLC). La síntesis de los péptidos en fase sólida puede mejorarse en algunos casos mediante el uso de dipéptidos protegidos en el enlace amida del dipéptido con un grupo que puede escindirse en condiciones ácidas tales como, pero sin limitarse a, 2-Fmoc-oxi-4-metoxibencilo o 2,4,6-trimetoxibencilo. En los casos en que se presenta una serina o una treonina en el péptido, pueden usarse dipéptidos de pseudoprolina (disponibles de, por ejemplo, Novobiochem, ver también W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403). Los derivados de aminoácidos protegidos con Fmoc usados fueron el estándar recomendado: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, o, Fmoc-Val-OH, etc. disponibles de, por ejemplo, Anaspec, Bachem, Iris Biotech, o Novabiochem. Donde no se especifica nada más, se usa la forma L natural de los aminoácidos. El aminoácido N-terminal se protegió con Boc en el grupo alfa amino (por ejemplo, Boc-His(Boc)-OH, o Boc-His(Trt)-OH para los péptidos con His en el N-terminal). En el caso de la unión modular de la cadena lateral mediante el uso de SPPS, se usaron los siguientes bloques de construcción adecuadamente protegidos tales como, pero sin limitarse a ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico, ácido Fmoc-tranexámico, Fmoc-Glu-OtBu, mono éster terc-butílico del ácido octadecanodioico, mono éster terc-butílico del ácido nonadecanodioico, mono éster terc-butílico del ácido tetradecanodioico, o éster terc-butílico del ácido 4-(9-carboxinoniloxi)benzoico. Todas las operaciones indicadas más abajo se realizaron a una escala de síntesis de 250 pmol.
1. Síntesis de la cadena principal peptídica protegida unida a la resina
Método:SPPSJP
La SPPS_P se realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida Prelude de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714, EE.UU.) a una escala de 250 pmol mediante el uso de un exceso de seis veces de Fmoc-aminoácidos (300 mM en NMP con HOAt u Oxyma Pure® 300 mM) con relación a la carga de la resina, por ejemplo, carga baja de Fmoc-Gly-Wang (0,35 mmol/g). La desprotección de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 20 % (v/v) en NMP. El acoplamiento se realizó mediante el uso de 3 : 3 : 3 : 4 aminoácido/(HOAt u Oxyma Pure®)/DIC/colidina en NMP. Se realizaron lavados superiores con NMP y DCM (7 ml, 0,5 min, 2 x 2 cada uno) entre las etapas de desprotección y acoplamiento. Los tiempos de acoplamiento fueron generalmente de 60 minutos. Algunos aminoácidos, lo que incluye, pero no se limita a, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH o Boc-His(Trt)-OH se “acoplaron doblemente”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 60 min), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácido, (HOAt u Oxyma Pure®), DIC, y colidina), y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (por ejemplo, 60 min).
Método:SPPS_L
La SPPS_L se realizó en un sintetizador de péptidos Liberty basado en microondas de CEM Corp. (Matthews, NC 28106, EE.UU.) a una escala de 250 pmol o 100 pmol mediante el uso de un exceso de seis veces de Fmocaminoácidos (300 mM en NMP con HOAt u Oxyma Pure® 300 mM) con relación a la carga de la resina, por ejemplo carga baja de Fmoc-Lys(Mtt)-Wang (0,35 mmol/g). La desprotección de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 5 % (v/v) en NMP a hasta 75 °C durante 30 segundos donde después se drenó la resina y se lavó con NMP y se repitió la desprotección de Fmoc esta vez durante 2 minutos a 75 °C. El acoplamiento se realizó mediante el uso de aminoácido/(HOAt u Oxyma Pure®)/DIC 1 : 1 : 1 en NMP. Los tiempos y las temperaturas de acoplamiento fueron generalmente de 5 minutos a hasta 75 °C. Los tiempos de acoplamiento más largos se usaron para reacciones a mayor escala, por ejemplo, 10 min. Los aminoácidos histidina se acoplaron doblemente a 50 °C, o se acoplaron cuatro veces si el aminoácido anterior estaba impedido estéricamente (por ejemplo, Aib). Los aminoácidos arginina se acoplaron a TA durante 25 minutos y después se calentaron hasta 75 °C durante 5 min. Algunos aminoácidos, tales como, pero sin limitarse a Aib, se “acoplaron doblemente”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 5 min a 75 °C), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácidos, (HOAt u Oxyma Pure®) y DIC), y la mezcla se calienta de nuevo (por ejemplo, 5 min a 75 °C). Se realizaron lavados con NMP (5 x 10 ml) entre las etapas de desprotección y acoplamiento.
Método:SPPS_S
La SPPS se realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida Symphony de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714, EE.UU) a una escala de 250 pmol mediante el uso de un exceso de 9 veces de Fmoc-aminoácidos en relación a la carga de resina. La carga de resina estuvo típicamente en el intervalo de 0,25 mmol/g-0,4 mmol/g. La desprotección de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 20 % (v/v) en NMP. El acoplamiento se realizó mediante el uso de 3 : 3 : 3 : 4 aminoácido/(HOAt u Oxyma Pure®)/DIC/colidina en NMP. Se realizaron lavados superiores con NMP y DCM (7 ml, 0,5 min, 2 x 2 cada uno) entre las etapas de desprotección y acoplamiento. Los tiempos de acoplamiento fueron generalmente de 60 minutos. Algunos aminoácidos, lo que incluye, pero no se limita a, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH o Boc-His(Trt)-OH se “acoplaron doblemente”, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo, 60 min), la resina se drena y se añaden más reactivos (aminoácido, (HOAt u Oxyma Pure®), DIC, y colidina), y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (por ejemplo, 60 min).
2. Síntesis de cadenas laterales
Monoésteres de diácidos
El reflujo durante toda la noche de los diácidos C8, C10, C12, C14, C16 y C18 con anhídrido de Boc DMAP t-butanol en tolueno proporciona predominantemente el monoéster de t-butilo. Se obtiene después del tratamiento una mezcla de monoácido, diácido y diéster. La purificación se lleva a cabo mediante lavado, filtración de sílice de tapón corto y cristalización. El ácido icosanedioico mono-terc-butil éster puede prepararse como se conoce en la técnica. Para un método, consulte el documento núm. WO 2010102886 A1.
3. Unión de las cadenas laterales a la cadena principal peptídica protegida unida a la resina
Cuando se presenta una acilación en una cadena lateral de lisina, el grupo epsilon amino de la lisina a acilar se protegió con Mtt, Mmt, Dde, ivDde o Boc, en dependencia de la ruta para la unión de la porción de prolongación y el enlazador. La desprotección de Dde o ivDde se realizó con hidracina al 2 % (v/v) en NMP (2 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con NMP (4 x 20 ml). La desprotección de Mtt o Mmt se realizó con TFA al 2 % (v/v) y TIS al 2-3 % (v/v) en DCM (5 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados con DCM (2 x 20 ml), MeOH al 10 % (v/v) y DIPEA al 5 % (v/v) en DCM (2 x 20 ml) y NMP (4 x 20 ml), o mediante tratamiento con hexafluoroisopropanol/DCM (75:25, 5 x 20 ml, 10 min cada uno) seguido por lavados como anteriormente. En algunos casos el grupo Mtt se eliminó mediante etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Liberty. La desprotección de Mtt se realizó con hexafluoroisopropanol o hexafluoroisopropanol/DCM (75:25) a temperatura ambiente durante 30 min seguido por el lavado con d Cm (7 ml x 5), seguido por lavados con NMP (7 ml x 5). Los elementos de la cadena lateral pueden unirse al péptido ya sea mediante acilación del péptido unido a la resina o mediante acilación en solución del péptido desprotegido. En el caso de la unión de los elementos de la cadena lateral a la resina peptidil protegida la unión puede ser modular mediante el uso de SPPS y bloques de construcción adecuadamente protegidos.
Método:SC_P
Si el grupo de protección de la N-e-lisina fue Mtt, el grupo Mtt se eliminó con HFIP puro (3 x 15 min) seguido por lavado con DCM y la acilación realizada en un sintetizador de péptidos Prelude ((Fmoc-AA 10 eq., DIC 10 eq. y Oxyma Pure® 10 eq., colidina 10 eq. 30 min y piperidina al 25 % (v/v) en NMP para eliminar el grupo Fmoc). El Fmoc-Glu-OtBu se acopló doblemente durante 4 horas. El residuo terminal se unió mediante el uso de condiciones similares.
Método:SC_L
El grupo de protección de N-e-lisina se eliminó como se describió anteriormente y la modificación química de la lisina se realizó mediante una o más etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Liberty mediante el uso de bloques de construcción protegidos adecuadamente como se describió anteriormente. Los acoplamientos dobles se realizaron como se describe en SPPS_P.
Método:SC_S
El grupo de protección de la N-e-lisina se eliminó como se describió anteriormente y la modificación química de la lisina se realizó mediante una o más etapas automatizadas en el sintetizador de péptidos Symphony mediante el uso de bloques de construcción protegidos adecuadamente como se describió anteriormente. Los acoplamientos dobles se realizaron como se describe en SPPS_P.
Método: SC_M1
El grupo de protección N-e-lisina se eliminó como se describió anteriormente. El elemento de la cadena lateral se disolvió en NMP/DCM (1:1,10 ml). Se añadió el reactivo de activación tal como HOBt u Oxyma Pure®(4 equivalentes molares en relación a la resina) y DIC (4 equivalentes molares en relación a la resina) y la solución se agitó durante 15 minutos. La solución se añadió a la resina y se añadió DIPEA (4 equivalentes molares en relación a la resina). La resina se agitó de 2 a 24 horas a temperatura ambiente. La resina se lavó con NMP (2 x 20 ml), NMP/DCM (1:1,2 x 20ml) 20 y DCM (2 x 20 ml).
Método: SC_M2
El grupo de protección N-e-lisina se eliminó como se describió anteriormente. La acilación de la cadena lateral se realizó en un sintetizador de péptidos Prelude (Fmoc-AA 10 eq., DIC 10 eq. y Oxyma Pure® 10 eq., colidina 10 eq. 30 min y piperidina al 25 % (v/v) en NMP para eliminar el grupo Fmoc). El Fmoc-Glu-OtBu se acopló doblemente durante 4 horas. La cxadena principal del péptido se transfirió a un agitador. El elemento de la cadena lateral se disolvió en NMP/DCM (1:1,10 ml). Se añadió el reactivo de activación tal como HOBt u Oxyma Pure® (4 equivalentes molares en relación a la resina) y DIC (4 equivalentes molares en relación a la resina) y la solución se agitó durante 15 minutos.
La solución se añadió a la resina y se añadió DIPEA (4 equivalentes molares en relación a la resina). La resina se agitó de 2 a 24 horas a temperatura ambiente. La resina se lavó con NMP (2 x 20 ml), NMP/DCM (1:1, 2 x 20ml) 20 y DCM (2 x 20 ml).
4. Escisión del péptido unido a la resina con o sin cadenas laterales unidas y purificación
Método:CP_M1
Después de la síntesis la resina se lavó con DCM y el péptido se escindió de la resina mediante un tratamiento de 2­ 3 horas con TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5 o 92,5/5/2,5) seguido por precipitación con éter dietílico. El péptido se disolvió en un disolvente adecuado (tal como, por ejemplo, ácido acético al 30 % (v/v)) y se purificó mediante RP-HPLC estándar en una columna C18, 5 pM, mediante el uso de acetonitrilo/agua/TFA. Las fracciones se analizaron mediante una combinación de métodos de UPLC, MALDI y LCMS y las fracciones apropiadas se agruparon y se liofilizaron. A2. Métodos generales para la detección y caracterización
1. Métodos de LC-MS
Método:LCMS_4
LCMS_4 se realizó en una configuración que consistió en un sistema UPLC Acquity Waters y espectrómetro de masas LCT Premier XE de Micromass. Eluyentes: A: Ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en agua
B: Ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo. El análisis se realizó a TA mediante la inyección de un volumen apropiado de la muestra (preferentemente, 2-10 j l ) en la columna que se eluyó con un gradiente de A y B. Las condiciones de UPLC, los ajustes del detector y los ajustes del espectrómetro de masas fueron: Columna: UPLC Waters Acquity BEH, C-18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm. Gradiente: 5 % - 95 % de acetonitrilo lineal durante 4,0 min (alternativamente, 8,0 min) a 0,4 ml/min. Detección: 214 nm (salida analógica de TUV (detector de UV ajustable)) modo de ionización MS: API­ ES
Barrido: 100-2000 amu (alternativamente, 500-2000 amu), etapa 0,1 amu.
2. Métodos de UPLC
Método:B4_1
El análisis de RP se realizó mediante el uso de un sistema UPLC Waters ajustado con un detector de doble banda. Las detecciones UV a 214 nm y 254 nm se recolectaron mediante el uso de una columna ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 A, 1,7 pm, 2,1 mm x 150 mm, 40 °C. El sistema UPLC se conectó a dos recipientes de eluyente que contenían: A: 99,95 % (v/v) H2O, 0,05 % (v/v) de TFA; B: 99,95 % de CH3CN, 0,05 % de TfA. Se usó el siguiente gradiente lineal: 95 % A, 5 % B a 5 % A, 95 % B durante 16 minutos a una velocidad de flujo de 0,40 ml/min.
B. Síntesis de compuestos de la invención
Ejemplo 1
N{Epsilon-36}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(3-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Epsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(3-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 21:
Figure imgf000027_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 5.
Método de preparación: SPPS_P; SC_M2; CP_M1
LCMS_4: Rt = 2,1 min m/z: m/5 = 1013, m/4 = 1266, m/3 = 1688
UPLC_B4_1: Rt = 8,5 min
Ejemplo 2
N{Epsilon-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 22:
Figure imgf000027_0002
LCMS_4: Rt = 2,2 min m/z: m/5 = 843, m/4 = 1054, m/3 = 1405
UPLC_B4_1: Rt = 9,4 min
Ejemplo 3
N{Epsilon-27}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Epsilon-36}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu-Gly
Compuesto químico 23:
Figure imgf000028_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 9.
Método de preparación: SPPS_L; SC_L; CP_M1
LCMS_4: Rt = 2,1 min m/z: m/4 = 1310, m/3 = 1746
UPLC_B4_1: Rt = 8,2 min
Ejemplo 4
N{EpsNon-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxiphenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Epsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 24:
Figure imgf000028_0002
Método de preparación: SPPS_S; SC_S; CP_M1
LCMS_4: Rt = 2,2 min m/z: m/5 = 998, m/4 = 1248, m/3 = 1663
UPLC_B4_1: Rt = 8,2 min
Ejemplo 5
N{Epsilon-26}-[(4S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil]-[Trp8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 25:
Figure imgf000029_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 7.
Método de preparación: SPPS_S; SC_S; CP_M1
LCMS_4: Rt = 2,6 min m/z: m/5 = 774, m/4 = 967, m/3 = 1289
UPLC_B4_1: Rt = 9,9 min
Ejemplo 6
Se preparó dulaglutida 8W como se describe en el Ejemplo 6A más abajo.
Ejemplo 7
N{Epsilon-36H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]e toxi]acetil],N{Epsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]e toxi]acetil]-[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 26:
Figure imgf000029_0002
Este compuesto es un derivado del análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 5.
Método de preparación: SPPS_P; SC_P; CP_M1
LCMS_4: Rt = 2,1 min m/z: m/5 = 1109, m/4 = 1386, m/3 = 1848
UPLC_B4_1: Rt = 9,0 min
Ejemplo 8
N{EpsNon-36H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[11-(4-carboxifenoxi)undecanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Epsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[11-(4-carboxifenoxi)undecanoNammo]butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]amino]etoxi]etoxi]acetN]-[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 27:
Figure imgf000030_0001
LCMS_4: Rt = 2,2 min m/z: m/5 = 1019, m/4 = 1273
UPLC_B4_1: Rt = 8,6 min
Ejemplo 9
N{Alpha}([Trp8,Glu22,Arg26,Arg34]-GLP-1-(7-37)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carb oxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]ethoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys-Gly-Gly-Ser-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbo nil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys
Compuesto químico 28:
Figure imgf000030_0002
LCMS_4: Rt = 2,9 min m/z: m/5 = 1165, m/4 = 1456, m/3 = 1940
UPLC_B4_1: Rt = 11,3 min
Ejemplo 10
N{Epsilon-37}-[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinona decanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]e toxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]-[Trp8,Glu22,Arg26, Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 29:
Figure imgf000031_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 18.
Método de preparación: SPPS_P; SC_P; CP_M1
LCMS_4: Rt = 2,9 min m/z: m/5 = 1345, m/4 = 1681, m/3 = 2241
UPLC_B4_1: Rt = 11,0 min
Ejemplo 11
N{AlfaX[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Pro37]-GLP-1-(7-37)-peptidN)-N{Epsilon}[2-[bis[3-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amin o]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]aceti]amino]etoxi]etoxi]acetil]amin o]etoxi]etoxi]acetil]amino]propil]amino]acetil]Lys
Compuesto químico 30:
Figure imgf000032_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 20.
Método de preparación: SPPS_P; SC_P; CP_M1
LCMS_4: Rt = 2,8 min m/z: m/5 = 1373, m/4 = 1716, m/3 = 2288
UPLC_B4_1: RT = 10,7 min
Ejemplo 12
N{Epsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxmona
decanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]e
toxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Glu22,Arg26,
Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 31:
Figure imgf000033_0001
Este compuesto es un derivado del análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 18.
Método de preparación: SPPS_P; SC_P; CP_M1
LCMS_4: Rt = 3,3 min m/z: m/5 = 1287, m/4 = 1609, m/3 = 2145
UPLC_B4_1: Rt = 11,0 min
Ejemplo 13
N{Epsilon-37H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[bis[3-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadec anoilamino)metil]cidohexanocarbonil]aminojbutanoiljamino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi ]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]propil]amino]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Glu22,
Arg26,Arg34,Lys37j-GLP-1-(7-37)-péptido
Compuesto químico 32:
Figure imgf000034_0001
Método de preparación: SPPS_P; SC_P; CP_M1
LCMS_4: Rt = 2,9 min m/z: m/5 = 1296, m/4 = 1619, m/3 = 2159
UPLC_B4_1: Rt = 11,0 min
Ejemplo comparativo A
Este compuesto es GLP-1 nativo (GLP-1(7-37)-péptido), de la SEQ ID NO: 1. El compuesto puede prepararse como se conoce en la técnica.
Ejemplo comparativo B
[Pro8,Glu22,Arg26]-GLP-1-(7-37)-péptido
Figure imgf000034_0002
Este compuesto es el análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 2.
Método de preparación: SPPS_P; CP_M1
LCMS 4: Rt = 1,8 min m/z: m/4 = 871, m/3 = 1161, m/2 = 1742
Ejemplo comparativo C
[Gly8]-GLP-1-(7-37)-péptido
Figure imgf000035_0001
Este compuesto es el análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 3.
Método de preparación: SPPS_S; CP_M1
LCMS_4: Rt = 1,7 min m/z: m/4 = 836, m/3 = 1115
Ejemplo comparativo D
[Trp8]-GLP-1-(7-37)-péptido
Figure imgf000035_0002
Este compuesto es el análogo de GLP-1 de la SEQ ID NO: 4.
Método de preparación: SPPS_P; CP_M1
LCMS 4: m/z: m/4 = 869, m/3 = 1158, m/2 = 1737
Ejemplo comparativo 1A
Este compuesto es el Ejemplo 15 del documento núm. WO 2015/155151.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 1 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 2A
Este es compuesto es el Ejemplo 4 del documento núm. WO 2006/097537, viz. N{Epsilon-26}-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8Arg34]GLP-1-(7-37)péptido. Se diferencia del compuesto del Ejemplo 2 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo Comparativo 3A
Este compuesto es el Ejemplo 31 del documento núm. WO 2012/140117.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 3 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 4A
Este compuesto es el Ejemplo 2 del documento núm. WO 2011/080103.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 4 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 5A
Este compuesto es el Ejemplo 37 del documento núm. WO 98/08871.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 5 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 6A - Dulaglutida y dulaglutida 8W
La dulaglutida es una proteína de fusión a Fc de un análogo de GLP-1. Su preparación y caracterización se describe en Diabetes/Metabolism Research and Reviews, 2010, vol. 26, páginas 287-296 por Glaesner y otros (incorporado en la presente descripción como referencia). La proteína de fusión GLP-1-Fc de Glaesner que adquirió el nombre INN dulaglutida se llama LY2189265. La secuencia de aminoácidos de la parte del péptido análogo de GLP-1 que incluye el enlazador (4xG-S-4xG-S-4xG-SA) es HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSA, ver la leyenda de la Figura 1 en la página 291 de Glaesner y otros. Esto corresponde a la secuencia de los aminoácidos 17-63 y 308-354 de la SEQ ID NO: 14 del presente listado de secuencias. El compañero de fusión IgG-Fc se describe en la página 290 de Glaesner y otros, en la columna de la derecha, 1er párrafo de la sección titulada "The GLP-1-Fc fusion protein LY2189265 has preserved in vitro activity and an extended in vivo half-life". Esto corresponde a las partes restantes de péptido no señal de la SEQ ID NO: 14 del presente listado de secuencias (es decir, los aminoácidos 64-291 y 355-582). Según Glaesner y otros, se realizaron las siguientes sustituciones en la parte de IgG-Fc: S228P, F234A, L234A (mediante el uso de la numeración de Kabat que es estándar para anticuerpos, que corresponde a los aminoácidos 73, 79, y 80, respectivamente, en la SEQ ID NO: 14).
La expresión "dulaglutida 8W" se refiere a un análogo de dulaglutida en el que el residuo Gly en la posición correspondiente a la posición 8 en el GLP-1 nativo (SEQ ID NO: 1) está sustituido por un Trp (ver la secuencia más abajo, parte de SEQ ID NO: 15, énfasis añadido).
Las partes de péptidos maduros de las secuencias de aminoácidos del monómero de dulaglutida y el monómero de dulaglutida 8W son las siguientes:
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (parte monomérica madura de la SEQ ID NO: 14, es decir, amino ácidos 17-291 o 308-582 de la SEQ ID NO: 14), y
HWEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (parte monomérica de la SEQ ID NO: 15, es decir, amino ácidos 1-275 o 276-550 de este), respectivamente.
En solución, dos de estas moléculas forman un dímero con enlaces Cys-Cys intracadena entre los residuos de Cys en la posición 55 y 58 (es decir, entre Cys71 y Cys362, y Cys74 y Cys365 de la SEQ ID NO: 14, que incluye el doble de la parte del péptido señal de 16 aminoácidos).
Clonación de construcciones de dulaglutida y dulaglutida 8W en un vector basado en pTT5
Se preparó una construcción de vector que contiene un fragmento de ADN sintetizado químicamente que codifica la CD33-dulaglutida (donde CD33 es el péptido señal del antígeno CD33 humano, Gp67). La parte madura de la secuencia de aminoácidos (de dulaglutida) codificada por el fragmento de ADN se proporciona en la SEQ ID NO: 14 (aminoácidos 17-291 y 308-582). Se realizó mutagénesis en la construcción con el fin de introducir la mutación 8W en el gen de la CD33-dulaglutida. La parte madura de la secuencia de aminoácidos codificada por el fragmento de ADN resultante se da en la SEQ ID n O: 15 (aminoácidos 1-275 y 276-550 de la SEQ ID NO: 15, es decir, también un dímero). En la SEQ ID NO: 15, cada uno de los fragmentos de aminoácidos 1-47 y 276-322 constituye el péptido de GLP-1 con enlazador, mientras que los aminoácidos 48-275 y 323-550 de la SEQ ID NO: 15 es la parte IgG-Fc, en la que hay enlaces Cys-Cys entre Cys55 y Cys330, así como también entre Cys58 y Cys333.
Los fragmentos de ADN que codifican CD33-dulaglutida y CD33-8W dulaglutida se amplificaron mediante PCR y se clonaron en un vector de expresión para expresión transitoria. La expresión de los genes CD33-dulaglutida y c D33-8W dulaglutida estaba bajo el control de un promotor de CMV en los vectores de expresión transitoria resultantes. Una señal de poliadenilación de betaglobina de conejo actuó como terminador transcripcional en los vectores de expresión transitorios. Todos las etapas de biología molecular descritas anteriormente se realizaron mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular.
Expresión de dulaglutida y dulaglutida 8W en células EXPI293F
Los dos plásmidos resultantes de la clonación de las construcciones de dulaglutida y dulaglutida 8W en el vector de expresión transitoria se expresaron a una escala de 200 mL en el sistema de expresión Expi293™ (Thermo Fisher Scientific, núm. de cat. A14635). Las transfecciones se realizaron mediante el uso de 1 mg de construcción de ADN/L de células transfectadas. Las transfecciones se realizaron mediante el seguimiento del protocolo proporcionado por el proveedor del sistema de expresión. Las células transfectadas se cultivaron a 36,5 °C en un agitador orbital durante cinco días. El sobrenadante se recolectó mediante centrifugación. Posteriormente, el sobrenadante se esterilizó por filtración mediante el uso de un filtro PES de poro de 0,22 |jm y se entregó para purificación.
Purificación
Los sobrenadantes libres de células que contenían dulaglutida o dulaglutida 8W se aplicaron en columnas de Proteína A. Las columnas se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfato) y la proteína unida se eluyó con ácido acético 0,1 M. Las fracciones eluidas se mezclaron inmediatamente con 0,3 volúmenes de Tris-Cl 1 M (pH 9,0). Las proteínas se purificaron adicionalmente en una columna de exclusión por tamaño que funcionaba en PBS o se desalaron mediante el pase a través de una columna de desalación en PBS. Las fracciones que contenían dulaglutida o dulaglutida 8W se caracterizaron por SDS-PAGE y espectrometría de masas, se esterilizaron por filtración (0,22 |jm), se evaluaron para determinar la concentración (absorción a 280 nm) y se almacenaron a -20 °C. Las masas determinadas experimentalmente obtenidas mediante espectrometría de masas verificaron la identidad de la dulaglutida y dulaglutida 8W, respectivamente.
Ejemplo comparativo 7A
Este compuesto es el Ejemplo 20 del documento núm. WO 2015/155151.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 7 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 8A
Este compuesto es el Ejemplo 1 del documento núm. 2015/155151.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 8 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 9A
Este compuesto es el Ejemplo 3 del documento núm. WO 2015/000942.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 9 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 10A
Este compuesto es el Ejemplo 32 del documento núm. WO 2014/202727.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 10 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 11A
Este compuesto es el Ejemplo 10 del documento núm. WO 2016/083499.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 11 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 12A
Este compuesto es el Ejemplo 14 del documento núm. WO 2016/097108.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 12 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Ejemplo comparativo 13A
Este compuesto es el Ejemplo 11 del documento núm. WO 2016/083499.
Se diferencia del compuesto del Ejemplo 13 solo en que tiene Aib8 en lugar de Trp8.
Métodos farmacológicos
Ejemplo 14: Estabilidad de DPP-IV in vitro
El propósito de este ejemplo es probar la estabilidad de los análogos de GLP-1 frente a la degradación por la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV), en comparación con el GLP-1 nativo.
Los análogos de GLP-1 de los Ejemplos A, B, C, y D se probaron como se describe más abajo.
Principio
Los péptidos se incuban in vitro en tampón con DPP-IV, se toman muestras a intervalos regulares, la enzima DPP-IV se inactiva para detener la degradación adicional y la cantidad de péptido no degradado en las muestras se determina mediante el uso de LC-MS.
Materiales y métodos
Tampón A
El tampón A es un tampón HEPES (Gibco de Life Science, NY, EE. UU.) al que se añadieron un 0,005 % (v/v) de Tween20® Sigma-Aldrich, EE. UU.) Y un 0,001 % (p/v) de BSA (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y el pH se ajustó a 7,4. Método de LC-MS
La LC-MS se realizó en una configuración que constaba del sistema Waters Acquity UPLC y Maxis 4G de Bruker Daltonics. Las fases móviles consistieron en: A: 0,1 % (v/v) de ácido fórmico en agua; B: 0,1 % (v/v) de ácido fórmico en acetonitrilo. El análisis de HPLC se realizó a 60 °C mediante la inyección de 10 pl de la muestra en la columna, la cual se eluyó con un gradiente de A y B. Las condiciones de UpLC, los ajustes del detector y los ajustes del espectrómetro de masas fueron: Columna: Waters Acquity UPLC BEH, C-4, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm). Gradiente: Lineal 5 % - 70 % de fase móvil B durante 8 min a 0,3 ml/min. La MS se realizó en modo de ionización positiva mediante ionización por electropulverización desde el modo de ionización m/z y barrido desde m/z 300-1800.
Estándar interno
Se usó liraglutida (compuesto del Ejemplo 5A) como patrón interno.
Procedimiento
Se incubaron 10 pM del péptido respectivo con DPP-IV (Dipeptidil peptidasa recombinante, R & D systems, 2 pg/ml) a 37 °C en Tampón A. Se tomaron alícuotas de muestra a los 3, 8, 15, 30, 60, 120 y 180 min. Las reacciones se terminaron mediante la adición de 6 volúmenes de etanol que contenían TFA al 1 % (v/v) (Biosolve BV, Países Bajos) y patrón interno. Las muestras se analizaron por LC-MS para el péptido no degradado respectivo. Los datos se trazaron de acuerdo con una cinética de 1er orden (por GraphPad Prism) y las vidas medias (Ty) se calcularon por el programa informático y se informaron en minutos.
Resultados
Las vidas medias resultantes se muestran en la Tabla 1 más abajo, en relación con la vida media del compuesto del Ejemplo A (GLP-1 nativo).
Tabla 1: Estabilidad de DPP-IV in vitro - vida media
Ejemplo núm. Vida media (min)
Figure imgf000038_0001
La estabilidad a DPP-IV in vitro del análogo de GLP-1 del Ejemplo B (es decir, con sustituciones 8P, 22E, 26R) es similar a la del GLP-1 nativo (A). Como era de esperar, la estabilidad del análogo del Ejemplo C (8G) es mejor que la del GLP-1 nativo. Sin embargo, de manera bastante inesperada, la estabilidad del análogo del Ejemplo D (8W) demostró ser mucho mejor, de hecho no se observó degradación alguna.
Ejemplo 15: Potencia in vitro
El propósito de este ejemplo es probar la actividad, o potencia, de los compuestos de GLP-1 de la invención junto con compuestos comparativos seleccionados. La potencia in vitro es la medida de la activación del receptor de GLP-1 humano en un ensayo de células completas funcional.
Las potencias de los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 1-5 y 7-13, y los compuestos de los Ejemplos comparativos 1A-13A y A-D se determinaron como se describe más abajo.
Principio
La potencia in vitro se determinó mediante la medición de la respuesta del receptor de GLP-1 humano en un ensayo de gen reportero. El ensayo se realizó en una línea celular BHK transfectada establemente que expresa el receptor de GLP-1 humano y contiene el ADN para el elemento de respuesta al AMPc (CRE) acoplado a un promotor y el gen para luciferasa de luciérnaga (CRE luciferasa). Cuando el receptor de GLP-1 humano se activa esto da como resultado la producción de AMPc, que a su vez da como resultado la expresión de la proteína luciferasa. Cuando se termina la incubación del ensayo, se añade el sustrato de luciferasa (luciferina) y la enzima convierte la luciferina en oxiluciferina para producir bioluminiscencia. La luminiscencia se mide como la lectura para el ensayo.
Cultivo celular y preparación
Las células usadas en este ensayo (clon FCW467-12A/KZ10-1) fueron células BHK con BHKTS13 como una línea celular parental. Las células se derivaron de un clon (FCW467-12A) que expresa el receptor de GLP-1 humano y se establecieron por transfección adicional con CRE luciferasa para obtener el clon actual.
Las células se cultivaron a 5 % de CO2 en medio de cultivo celular. Se dividieron en alícuotas y se almacenaron en nitrógeno líquido. Antes de cada ensayo se tomó una alícuota y se lavó dos veces en PBS antes de suspenderse a la concentración deseada en el tampón específico del ensayo. Para placas de 96 pocillos la suspensión se hizo para dar una concentración final de 5x103 células/pocillo.
Materiales
Se usaron los siguientes compuestos químicos en el ensayo: Pluronic F-68 (10 %) (Gibco 2404), ovoalbúmina (Sigma A5503), DMEM sin rojo de fenol (Gibco 11880-028), Hepes 1 M (Gibco 15630), Glutamax 100x (Gibco 35050) y steadylite plus (PerkinElmer 6016757).
Tampones
El medio de cultivo celular consistió en medio DMEM con 10 % p/v de FBS (Suero Bovino Fetal; Invitrogen 16140­ 071), 1 mg/ml de G418 (Invitrogen 15140-122), 240 nM de MTX (metotrexato; Sigma M9929) y 1 % p/v de pen/strep (penicilina/estreptomicina; Invitrogen 15140-122).
El medio de ensayo consistió en DMEM sin fenol rojo, 10 mM Hepes y 1x Glutamax. El tampón de ensayo consistió en 2 % p/v de ovoalbúmina y 0,2 % v/v de Pluronic F-68 en medio de ensayo.
Procedimiento
1) Los stocks de células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C.
2) Las células se lavaron tres veces en PBS.
3) Las células se contaron y se ajustaron a 5x103 células/50 pl (1x105 células/ml) en medio de ensayo. Una alícuota de 50 pl de células se transfirió a cada pocillo en la placa del ensayo.
4) Las reservas de los compuestos de prueba y los compuestos de referencia se diluyeron a una concentración de 0,2 pM en tampón del ensayo. Los compuestos se diluyeron 10 veces para producir las siguientes concentraciones: 2x10' 7 M, 2x10-8 M; 2x10-9 M, 2x10‘10 M, 2x10‘11 M, 2x10‘12 M, 2x10‘13 M y 2x10‘14 M.
5) Se transfirió una alícuota de 50 pl del compuesto o blanco de la placa de dilución a la placa de ensayo. Los compuestos se probaron en las siguientes concentraciones finales: 1x10‘7 M, 1x10‘8 M; 1x10‘9 M, 1x10_1° M, 1x10‘11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, y 1x10‘14 M.
6) La placa de ensayo se incubó durante 3 h en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C.
7) La placa de ensayo se retiró de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 min.
8) Una alícuota de 100 pl del reactivo steadylite plus se añadió a cada pocillo de la placa del ensayo.
9) Cada placa del ensayo se cubrió con papel de aluminio para protegerlo de la luz y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente.
10) Cada placa del ensayo se leyó en un lector multimodo BioTek Synergy 2.
Cálculos y resultados
Los datos del lector de multimodo BioTek Synergy 2 se transfirieron al programa informático GraphPad Prism. El programa informático realiza una regresión no lineal (log(agonista) vs. respuesta (tres parámetros)). Los valores de EC50 que se calcularon mediante el programa informático y se informaron en pM, se muestran en la Tabla 2 más abajo.
Se midieron un mínimo de tres réplicas para cada muestra. Los valores de EC50 informados son promedios de todos los valores medidos para cada compuesto.
Tabla 2: Potencia in vitro
Ejemplo núm. 50 (pM)
1 17
Comparativo 1A 8,1
2 19
Comparativo 2A 3,7
3 2,7
Comparativo 3A 0,53
4 30
Comparativo 4A 6,9
5 21
Comparativo 5A 6,8
Comparativo 6A, dulagl 26
Comparativo 6A,
Dulaglutida 8W 11
7 5,6
Comparativo 7A 2,6
8 4,4
Comparativo 8A 1,2
9 70,5
Comparativo 9A 41,3
10 31,2
Comparativo 10A 16,8
11 34,1
Comparativo 11A 12,5
12 62,9
Comparativo 12A 13,7
13 32,1
Comparativo 13A
Figure imgf000040_0001
14,7
Figure imgf000041_0001
T odos los compuestos tienen datos de potencia que confirman que son agonistas del receptor de GLP-1. Por lo tanto, en lo que respecta a la potencia in vitro todos podrían avanzar hacia un mayor desarrollo.
Ejemplo 16: Unión al receptor de GLP-1
El propósito de este ejemplo es probar la unión al receptor de los compuestos de GLP-1 de la invención in vitro, junto con los compuestos comparativos seleccionados. La unión al receptor es una medida de la afinidad de un derivado por el receptor de GLP-1 humano.
Las potencias de los derivados de GLP-1 de los Ejemplos 1-5 y 7-13 y los compuestos de los Ejemplos comparativos 1A-5A, 7A-13A, y A-D se determinaron como se describe más abajo.
Principio
La unión del receptor al receptor de GLP-1 humano se midió en un ensayo de unión competitiva. En este tipo de ensayo un ligando marcado (en este caso 125I-GLP-1) se une al receptor. Cada compuesto se añade en una serie de concentraciones a membranas aisladas que contienen el receptor de GLP-1 humano y se supervisa el desplazamiento del ligando marcado. La unión al receptor se informa como la concentración en la cual la mitad del ligando marcado se desplaza del receptor, el valor de IC50. Para probar la unión de los derivados a albúmina, el ensayo se realiza en una concentración baja de albúmina sérica humana (HSA) (concentración máx. de ensayo final de 0,001 % (p/v)) así como también en presencia de una concentración considerablemente mayor de HSA (concentración de ensayo final de 2,0 % (p/v)). Un aumento del valor de IC50 en presencia de HSA indica una afinidad por la albúmina sérica y representa un método para predecir un perfil farmacocinético prolongado de la sustancia de prueba en modelos animales.
Materiales
Se usaron los siguientes compuestos químicos en el ensayo: Albúmina sérica humana (HSA) (Sigma A1653), DMEM sin rojo de fenol (Gibco 11880-028), Pen/estrep (Invitrogen 15140-122), G418 (Invitrogen 10131-027), Hepes 1 M (Gibco 15630), e Dt A (Invitrogen 15575-038), PBS (Invitrogen 14190-094), suero fetal bovino (Invitrogen 16140-071), EGTA, MgCl2 (Merck 1.05832.1000), Tween 20 (Amresco 0850C335), partículas SPA (perlas de SPA con aglutinina de germen de trigo (WGA), Perkin Elmer RPNQ0001), [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 (producido internamente), OptiPlate™-96 (Packard 6005290).
El Tampón 1 consistió en Na-HEPES 20 mM más EDTA 10 mM y el pH se ajustó a 7,4. El Tampón 2 consistió en Na-HEPES 20 mM más EDTA 0,1 mM y el pH se ajustó a 7,4. El tampón de ensayo consistió en HEPES 50 mM suplementado con EGTA 5 mM, MgCb 5 mM, Tween 20 al 0,005 % p/v y el pH se ajustó a 7,4. Una solución concentrada de albúmina al 8 % consistió en HSA disuelta al 8 % (p/v) en tampón de ensayo. Una solución concentrada de albúmina al 0,02 % consistió en HSA disuelta al 0,02 % (p/v) en tampón de ensayo.
Cultivo celular y preparación de las membranas
Las células usadas en este ensayo (clon FCW467-12A) fueron células BHK con BHKTS13 como una línea celular parental. Las células expresan el receptor de GLP-1 humano.
Las células se crecieron en CO2 al 5 % en DMEM, suero fetal bovino al 10 % p/v, Pen/Estrep (penicilina/estreptomicina) al 1 % p/v y 1,0 mg/ml del marcador de selección G418.
Para elaborar una preparación de membrana, las células se cultivaron a aproximadamente 80 % de confluencia. Las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato y se cosecharon. Las células se sedimentaron mediante el uso de una breve centrifugación y el sedimento celular se mantuvo en hielo. El sedimento celular se homogenizó con un instrumento de dispersión ULTRA-THURRAX™ durante 20-30 segundos en una cantidad adecuada de Tampón 1 (por ejemplo, 10 ml). El homogenato se centrifugó durante 15 minutos. El sedimento se resuspendió (homogeneizó) en 10 ml de Tampón 2 y se centrifugó. Esta etapa se repitió una vez más. El sedimento resultante se resuspendió en el Tampón 2 y se determinó la concentración de proteínas. Las membranas se dividieron en alícuotas y se almacenaron a menos 80°C.
Procedimiento
1. Para el ensayo de unión al receptor en presencia de HSA baja (0,005 % (p/v)) se añadieron 50 j l del tampón de ensayo a cada pocillo de una placa de ensayo. El ensayo continuó con la Etapa 3.
2. Para el ensayo de unión al receptor en presencia de HSA alta (2 % (p/v)) se añadieron 50 j l del stock de albúmina al 8 % (p/v) a cada pocillo de una placa de ensayo. El ensayo continuó con la Etapa 3.
3. Los compuestos de prueba se diluyeron en serie para obtener las siguientes concentraciones: 8x10-7 M, 8x10-8 M, 8x10-9 M, 8x10-10 M, 8x10-11 M, 8x10-12 M y 8x10-13 M. Se añadieron veinticinco j l a los pocillos apropiados en la placa de ensayo.
4. Las alícuotas de membrana celular se descongelaron y diluyeron hasta su concentración de trabajo. Se añadieron cincuenta j l a cada pocillo en la placa de ensayo.
5. Las perlas de SPA con WGA se suspendieron en el tampón de ensayo a 20 mg/ml. La suspensión se diluyó a 10 mg/ml en el tampón de ensayo justo antes de la adición a la placa de ensayo. Se añadieron cincuenta j l a cada pocillo en la placa de ensayo.
6. La incubación se inició mediante la adición de 25 j l de solución de [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2 480 pM a cada pocillo de la placa de ensayo. Se reservó una alícuota de 25 j l para medir los conteos totales/pocillo.
7. La placa de ensayo se incubó durante 2 h a 30 °C.
8. La placa de ensayo se centrifugó durante 10 min.
9. La placa de ensayo se leyó en un instrumento Packard TopCount NXT.
Cálculos
Las réplicas individuales se analizaron mediante el uso de regresión no lineal en GraphPad Prism. Los valores de IC50 se calcularon por el programa informático y se informaron en nM. Se midió un mínimo de dos réplicas para cada muestra. Los valores informados son promedios de todos los valores medidos para cada compuesto.
Resultados
Se obtuvieron los siguientes resultados:
Tabla 3: Unión al receptor de GLP-1
Ejemplo núm. HSA baja IC50 (nM) HSA alta IC50 (nM)
1 0,405 410
Comparativo 1A 0,318 116
2 1,60 120
Comparativo 2A 0,588 415
3 1,03 84,9
Comparativo 3A 0,260 134
4 6,23 771
Comparativo 4A 2,10 479
5 1,42 4,95
Comparativo 5A
Figure imgf000042_0001
0,347 9,06
7 0,550
Figure imgf000042_0002
71,0
Comparati 0,744 31,5
8 0,535 170
Comparati 0,245 110
9 1,60 305
Comparati 1,04 235
10 0,865 123
Comparativ 0,591 108
11 0,618 34,0
Comparativ 0,401 34,4
12 3,16 51,8
Comparativ 0,536 42,3
13 0,818 71,6
Comparativ 0,383 35,4
A 0,435 0,164
B 0,075 0,035
C 2,64 0,620
D
Figure imgf000043_0002
0,670
Figure imgf000043_0001
0,208
Todos los compuestos tienen valores de IC50 que son totalmente aceptables, por tanto en lo que respecta a la unión al receptor in vitro ellos podrían progresar hacia un mayor desarrollo.
Ejemplo 17: Estudio farmacodinámico en ratones db/db
El propósito del estudio fue verificar el efecto agudo de los derivados de GLP-1 de la invención sobre la glucosa en sangre (BG) y el peso corporal (BW) en un ambiente diabético.
Los derivados de GLP-1 del Ejemplo 2 se analizan en un estudio de dosis única en un modelo de ratón obeso, diabético (ratones db/db) como se describe a continuación. El derivado se probó a diferentes dosis, a saber, 0,3, 1,0, 3,0, 10, 30 o 100 nmol/kg.
Los ratones (de Taconic, Dinamarca), alimentados desde el nacimiento con la dieta NIH31 (Dieta de roedores NIH 31M, comercialmente disponible de Taconic Farms, Inc., EE.UU, ver www.taconic.com), se enrolaron para el estudioa la edad de aproximadamente 10 semanas. Despés del arribo a la unidad en Mál0v, Dinamarca, los ratones tuvieron libre acceso a un pienso estándar (por ejemplo Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca) y agua corriente y se mantuvieron a 24 °C. Después de 1-2 semanas de adaptación, la glucosa en sangre basal se evaluó dos veces en un día. Los ratones se asignaron a grupos de tratamiento en base a los niveles de glucosa en sangre y el peso corporal. Los ratones se usaron en este experimento con una duración de 96 horas, y se reusaron una vez para un experimento no relacionado. Después del último experimento los ratones se sacrifican.
Los animales se agruparon para recibir el tratamiento de la siguiente manera: Vehículo, por vía subcutánea o derivado de GLP-1, 0,3, 1,0, 3,0, 10, 30 o 100 nmol/kg, por vía subcutánea, donde el vehículo era fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 70 mM, polisorbato 80 al 0,05 %, pH 7,4.
El derivado de GLP-1 se disolvió en el vehículo, a concentraciones de 0,05, 0,17, 0,5, 1,7, 5,0 y 17 nmol/ml. Los animales se dosificaron una vez, al inicio del experimento, s.c. con un volumen de dosis de 6 ml/kg (es decir, 300 pl por 50 g de ratón).
El día de la administración de la dosis, la glucosa en sangre se evaluó en el tiempo de -1^h (9:00 a.m.), después los ratones se pesaron. El derivado de GLP-1 se dosificó a aproximadamente las 9:30 am (tiempo 0). El día de la administración de la dosis, la glucosa en sangre se evaluó en los tiempos 1, 2, 4 y 8 h (10:30 am, 11:30 am, 1:30 pm y 5:30 pm) después de la administración de la dosis.
En los días siguientes, se evaluó la glucosa en sangre a las 24 h, 48 h, 72 h, y 96 h. En cada día, los ratones se pesaron después del muestreo de glucosa en sangre.
Los ratones se pesaron individualmente en una balanza digital.
Las muestras para la medición de la glucosa en sangre se obtuvieron del capilar de la punta de la cola de ratones conscientes. La sangre, 5 pl, se recolectó en capilares heparinizados y se transfierió a 250 pl de tampón de glucosa (solución del sistema EKF, Eppendorf, Alemania). La concentración de glucosa se midió mediante el uso del método de la glucosa oxidasa (analizador de glucosa Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Alemania). Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente durante hasta 1 h hasta el análisis. Si fue necesario posponer el análisis, las muestras se mantuvieron a 4 °C durante un máximo de 24 h.
Se elaboraron curvas de respuesta a la dosis para la glucosa en sangre delta y el peso corporal delta frente al tiempo para cada una de las dosis únicas del derivado de GLP-1. El delta se refiere a la glucosa en sangre/peso corporal real en un momento dado, menos la línea de base, donde la línea de base es el nivel de glucosa en sangre y el peso corporal en el momento 0. Por tanto, en estas curvas y=0 representa la línea base.
Para obtener una indicación del efecto del derivado de GLP-1 sobre la glucosa en sangre y el peso corporal, se calculó el área bajo la curva para la glucosa en sangre delta desde 0 hasta 24 horas (AUC ABG24h) y el aumento de peso corporal delta 24 horas después de la administración (ABW24h), para cada una de las curvas de respuesta a la dosis individual, y se calcularon las dosis efectivas al 50 % (ED50, dosis del derivado de GLP-1 que da una respuesta a la mitad entre el valor de base y el efecto máximo) para el AUC ABG24h y ABW24h.
Los valores de ED50 resultantes se muestran en la Tabla 4 más abajo (promedios de 4-6 determinaciones).
^
Figure imgf000044_0001
El derivado de GLP-1 del Ejemplo 2 mostró un efecto in vivo al disminuir de manera dependiente de la dosis la glucosa en sangre así como también el peso corporal.
Ejemplo 18: Proceso completamente recombinante vs semirecombinante, rendimiento de expresión
Antecedentes de la invención
El propósito de este ejemplo es describir un proceso completamente recombinante para la expresión de las partes peptídicas estables a DPP-iv (8W) de los derivados de GLP-1 de la invención.
Un proceso conocido para preparar péptidos de GLP-1 que se estabilizaron a DPP-iv mediante la incorporación de uno o más aminoácidos no codificados en el extremo N-terminal (por ejemplo, sustitución de Ala nativa en la posición 8 por Aib) es el llamado semiproceso recombinante. De acuerdo con este proceso, primero se prepara un péptido precursor recombinantemente (por ejemplo, un péptido GLP-1(9-37) precursor en el que se eliminaron los dos aminoácidos N-terminales). Y en una etapa siguiente, los dos aminoácidos N-terminales que faltan que incluyen el aminoácido o los aminoácidos no codificados (por ejemplo, el dipéptido His-Aib) se añaden al N-terminal del péptido precursor mediante un proceso llamado ligamiento. En general, este proceso de preparación de dos etapas se denomina proceso semirecombinante. El proceso semi-ecombinante se describe en, por ejemplo, el documento núm. WO 2009/083549 (expresión recombinante del péptido precursor) y documento núm. WO 2013/098191 (ligamiento). El presente ejemplo también compara el rendimiento de expresión para la expresión completamente recombinante con el rendimiento de expresión para la etapa de expresión del proceso semirecombinante.
Más en particular, los rendimientos de la expresión completamente recombinante de dos péptidos de GLP-1 incorporados en derivados de la invención (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9) se comparan con los rendimientos de la expresión de los péptidos precursores correspondientes que carecen de los dos aminoácidos N-terminales (SEQ ID n O: 22 y SEQ ID n O: 23, respectivamente).
En el procedimiento experimental descrito más abajo se añadió una extensión N-terminal de DVKPGQPMYDDDDK (SEQ ID NO: 24) a cada uno de estos cuatro péptidos de GLP-1. Esta extensión N-terminal se usa para fines de optimización que no están relacionados y no son relevantes para la presente aplicación.
Experimental

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un derivado que comprende un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1) y en donde un sustituyente que comprende al menos ocho grupos -CH2- consecutivos y al menos un grupo funcional con un pKa < 7 se une a un residuo Lys del análogo de GLP-1;
    en donde el derivado es de fórmula I:
    (PL)u-B-GLP1,
    en donde GLP1 es un análogo de GLP-1 que tiene un Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1 (7-37) (SEQ ID NO: 1) que comprende un péptido de fórmula:
    Xaa7-Trp-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42, en donde Xaa7 es L-histidina; Xaa12 es Phe; Xaa16 es Val; Xaa18 es Ser; Xaa19 es Tyr; Xaa20 es Leu; Xaa22 es Gly o Glu; Xaa23 es Gln; Xaa25 es Ala; Xaa26 es Arg o Lys; Xaa27 is Glu o Lys; Xaa30 es Ala o Glu; Xaa31 es Trp; Xaa33 es Val; Xaa34 es Arg; Xaa35 es Gly; Xaa36 es Arg o Lys; Xaa37 es Gly, Lys, o Pro; Xaa38 es Glu, Lys, o ausente; Xaa39 es Gly o ausente; Xaa40 es Gly o ausente; Xaa41 es Ser o ausente; y Xaa42 es Lys o ausente;
    en donde (P-L) es el sustituyente unido a un residuo Lys del análogo de GLP-1 a través de un grupo de ramificación opcional (B) y comprende una porción prolongada (P) y un enlazador (L), U representa el número de sustituyentes (P-L) en el derivado y es 1 o 2, en donde cada sustituyente (P-L) comprende
    (i) una porción de prolongación (P) seleccionada del Compuesto químico 10, Compuesto químico 11, Compuesto químico 12, Compuesto químico 13 y Compuesto químico 14:
    Compuesto químico 10:
    Figure imgf000060_0001
    Compuesto químico 11:
    O O
    Co ■mpue Asto quí Amico 12:
    Figure imgf000060_0002
    Compuesto químico 13:
    N- O
    HN
    Com Apuesto q Auímico 14:
    Figure imgf000060_0003
    y
    (ii) un enlazador (L) que comprende al menos un elemento enlazador seleccionado de Compuesto químico 15, Compuesto químico 16, Compuesto químico 17 y Compuesto químico 18:
    Compuesto químico 15:
    Figure imgf000060_0004
    Compuesto químico 16:
    Figure imgf000061_0001
    cada uno de n, m, y q representan independientemente un número entero en el intervalo de 0-4; y cada uno de k, l, y t representan independientemente un número entero en el intervalo de 1-5; y
    (iii) en donde el grupo de ramificación (B), si está presente, comprende un enlazador ramificado (BL) seleccionado de Compuesto químico 19 y Compuesto químico 20:
    Compuesto químico 19:
    Figure imgf000061_0002
    en donde u y v representan independientemente un número entero en el intervalo de 0-5 y cada w representa un número entero en el intervalo de 0-2, con la condición de que cuando u es 0 v es un número entero en el intervalo de 1-5, y cuando v es 0 u es un número entero en el intervalo de 1-5;
    qué derivado es capaz de activar el receptor de GLP-1 humano;
    o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
    El derivado de la reivindicación 1, que tiene la fórmula Ia:
    Fórmula Ia: (PL)-GLP1;
    o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
    3. El derivado de la reivindicación 1, que tiene la fórmula Ib:
    Fórmula Ib: (PL)2-GLP1;
    o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
    4. El derivado de la reivindicación 1, que tiene la fórmula Ic:
    Fórmula Ic: (PL)2>BL-PL-GLP1,
    en donde
    (i) >BL es un enlazador ramificado como se define en la reivindicación 1, y
    (ii) PL es un preenlazador que comprende el Compuesto químico 16:
    Figure imgf000062_0001
    en donde cada uno de k y l representa independientemente un número entero en el intervalo de 1-5; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
    5. El derivado de la reivindicación 1, que tiene la fórmula Id:
    Fórmula Id: (PL)2>BL-GLP1,
    en donde >BL es un enlazador ramificado como se define en la reivindicación 1;
    o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
    6. Un derivado de la reivindicación 1 seleccionado de los siguientes:
    N{Epsilon-36H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(3-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etox¡]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Epsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(3-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    Compuesto químico 21:
    Figure imgf000062_0002
    N{Epsilon-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    Compuesto químico 22:
    Figure imgf000062_0003
    N{Epsilon-27}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etox¡]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Epsilon-36}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]
    [Trp8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-peptidil-Glu-Gly,
    Compuesto químico 23:
    hüJ ' C l
    Figure imgf000063_0001
    N{EpsNon-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxijetoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil],N{Epsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[10-(4-carboxifenoxi)decanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    Compuesto químico 24:
    Figure imgf000063_0002
    N{Epsilon-26}-[(4S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil]-[Trp8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    Compuesto químico 25:
    Figure imgf000063_0003
    N{Epsilon-36}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi]acetil],N{Epsilon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(13-carboxitridecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino] etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    Compuesto químico 26:
    Figure imgf000064_0001
    [2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[ 11-(4-carboxifenoxi)undecanoilamino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    Compuesto químico 27:
    Figure imgf000064_0002
    ]acetil]Lys-Gly-Gly-Ser-N{Epsilon}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil] ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]Lys,
    Compuesto químico 28:
    Figure imgf000065_0001
    amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil] -[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    Compuesto químico 29:
    Figure imgf000065_0002
    N{Alpha}([Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Pro37]-GLP-1-(7-37)-peptidil)-N{Epsilon}[2-[bis[3-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2 -[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]ami no]butanoil]amino]ethoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]am ino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etox]etoxi]acetil]amino]propil]amino]acetil]Lys,
    Compuesto químico 30:
    Figure imgf000066_0001
    N{EpsNon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carbo xinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil] amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]hexanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil] -[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    Compuesto químico 31:
    Figure imgf000066_0002
    N{EpsNon-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[bis[3-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxm onadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]a mino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]propil]amino]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]eto xi]acetil]-[Trp8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-péptido,
    y
    Compuesto químico 32:
    Figure imgf000067_0001
    7. Un análogo de GLP-1 seleccionado de la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 15, los aminoácidos 1-275 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, y la SEQ ID NO: 20; o una sal, amida, o éster farmacéuticamente aceptable de este.
    8. Un método para preparar un derivado o análogo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende la etapa de producir recombinantemente un análogo de GLP-1 que tiene Trp en una posición correspondiente a la posición 8 de GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1).
    9. El método de la reivindicación 8, en donde el análogo de GLP-1 tiene actividad de GLP-1 y está estabilizado a DPP-IV.
    10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8-9, que comprende, además, la etapa de purificar el análogo de GLP-1 producido recombinantemente.
    11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, que comprende, además, la etapa de unir un sustituyente a un residuo Lys del análogo de GLP-1 y purificar el derivado de GLP-1 resultante.
    12. Una composición farmacéutica que comprende un derivado o un análogo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
    13. Un derivado o un análogo de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-7, para el uso como un medicamento.
    14. Un derivado o un análogo de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-7, para su uso en
    (i) prevención o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional, y/o por reducción de HbA1C;
    (iv) prevención o el tratamiento de trastornos cognitivos o trastornos neurodegenerativos, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y esclerosis múltiple;
    (iii) prevención o tratamiento de trastornos alimentarios, tales como la obesidad;
    (v) prevención o tratamiento de complicaciones diabéticas, tales como angiopatía; neuropatía, neuropatía periférica; nefropatía; y retinopatía;
    (v) prevención o tratamiento de la dislipidemia;
    (vii) prevención o tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como el síndrome X, ateroesclerosis, infarto de miocardio, enfermedad coronaria, daño por reperfusión, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, una enfermedad cardiaca temprana o cardiovascular temprana, hipertrofia ventricular izquierda, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, hipertensión esencial, emergencia hipertensiva aguda, cardiomiopatía, insuficiencia cardiaca, intolerancia al ejercicio, fallo cardiaco agudo y/o crónico, arritmia, disritmia cardiaca, síncope, angina de pecho, derivación cardiaca y/o reoclusión con stent, claudicación intermitente (ateroesclerosis obliterante), disfunción diastólica, y/o disfunción sistólica; y/o reducción de la presión sanguínea;
    (ix) prevención o tratamiento de enfermedades gastrointestinales, tales como enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome de intestino corto, enfermedad de Crohn, colitis; disepsia, y úlceras gástricas; o inflamación, tales como psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, y lupus eritematoso sistémico;
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