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CN101255191A - 微波促进固相合成胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物及其应用 - Google Patents

微波促进固相合成胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物及其应用 Download PDF

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CN101255191A
CN101255191A CNA2008100196825A CN200810019682A CN101255191A CN 101255191 A CN101255191 A CN 101255191A CN A2008100196825 A CNA2008100196825 A CN A2008100196825A CN 200810019682 A CN200810019682 A CN 200810019682A CN 101255191 A CN101255191 A CN 101255191A
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CN
China
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gly
ser
glu
ala
leu
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CNA2008100196825A
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黄文龙
张惠斌
迟玉石
周金培
周映红
倪帅键
钱海
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China Pharmaceutical University
Original Assignee
China Pharmaceutical University
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Abstract

本发明涉及新型GLP－1类似物及其微波促进固相合成方法。通过对天然GLP－1的8，9，16，22，27或37位点进行改造得到具有更长药理作用时间的GLP－1类似物；其化学合成是通过微波促进固相合成方法高效快速实现，粗品经制备级高效液相纯化，最后冻干得到GLP－1类似物。

Description

微波促进固相合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用
技术领域
本发明涉及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其微波促进固相合成方法。
背景技术
糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，全球约有2亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至3亿。2007年，中国有3000万糖尿病患者，预计到2030年，我国糖尿病患者人数将突破5000万，中国已经成为仅次于印度的糖尿病第二大国，其中2型糖尿病约占糖尿病患者总人数的90％。现在治疗2型糖尿病最有效的方法是注射胰岛素。在临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，胰岛素治疗在降低血糖的同时可以一定程度上逆转胰岛β-细胞功能损害。但是使用胰岛素会出现低血糖的危险。受到剂量大小、注射部位、注射途径、个体差异或注射后未进食等因素的影响，如果使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰岛素分泌而不出现低血糖，这种葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌特性，避免了糖尿病治疗中常存在的产生低血糖症的危险，这些生理功能使开发GLP-1作为一种2型糖尿病治疗药物具有广阔的前景。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)主要由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，在体内有多种存在形式。胰高血糖素原基因位于2号染色体长臂，由6个外显子和5个内含子组成，在胰腺和肠道L细胞内表达，生成由160个氨基酸组成的胰高血糖素原(proglucagon，PG)。胰高血糖素原在胰腺和肠道中裂解后转化的产物不同。PG在肠道中主要裂解为：肠高血糖素(Glicentin：PG1～69)，肠高血糖素分子继续裂解为GRPP(PG1～30)和胃泌酸调节素(Oxyntomodulin：PG33～69)；插入肽-2(IP-2：PG111～123)；胰高血糖素样肽-2(GLP-2：PG126～158)；和GLP-1(1～37)-OH(PG 72～108)。GLP-1(1～37)-OH是无活性的肽链，需酶解切除N端6肽，成为具有生理活性的GLP-1(7～37)-OH，其C末端甘氨酸可以作为酰胺化酶的底物，因此GLP-1(7～37)-OH的C末端酰胺化后即生成具有高度活性的GLP-1(7～36)-NH2，氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2；GLP-1(7～37)-OH的氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSLEGQAAKEFIAWLVKGRG-COOH。GLP-1(7～36)-NH2是人体内GLP-1主要的天然形式，约占80％，其促进胰岛素分泌的作用在GLP-1肽中最强。另外GLP-1(7～37)-OH约占20％，两者具有相同的生理功能。
GLP-1通过作用于胰岛β-细胞膜上的受体GLP-1受体(GLP-1R)，促进胰岛素的分泌。GLP-1R在胰腺β-细胞膜上高度表达，是由463个氨基酸组成，属于七次跨膜的G-蛋白偶联受体家族，与GLP-1高度特异性结合。GLP-1与其受体结合后可以增加胰岛细胞腺苷酸环化酶的活性，刺激细胞内的第二信使cAMP的增加，导致细胞膜K+通道关闭，细胞去极化，诱发电压依赖性的Ca2+通道开放，细胞外Ca2+内流，细胞浆Ca2+浓度升高触发胰岛素的释放。此外cAMP水平升高，又激活cAMP依赖的蛋白激酶A和磷酸化酶，进而刺激β-细胞胰岛素基因的转录和翻译，刺激β-细胞的增值和分化。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)具有多种生物学效应。如下：
1、具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用；
2、阻止胰腺β-细胞退化，刺激β-细胞的增值和分化；
3、诱导前胰岛素基因的转录，促进前胰岛素的生物合成；
4、增加胰岛素的敏感性；
5、增加生长抑素分泌，抑制胰高血糖素的产生(此作用也是血糖依赖性)；
6、抑制胃酸分泌，延迟胃排空；
7、通过作用于丘脑下部的中枢抑制食欲，降低食物摄取量等作用。
然而，虽然天然GLP-1在治疗糖尿病上有以上诸多优点，但它在体内却会被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPPIV)快速降解[6]。二肽基肽酶IV可特异性识别GLP-1N末端第二位丙氨酸Ala残基，从肽链N末端第2位丙氨酸(Ala)处切除二肽，使其转变为无活性的形式，其体内半衰期仅5分钟左右。GLP-1分子N端是与GLP-1受体的结合部位，其组氨酸残基丧失，导致GLP-1完全失去生物活性。所以这需要我们对天然GLP-1进行改造，以期望寻找到能够抵抗DPP-IV，生物半衰期长的GLP-1类似物。
多肽可以通过基因工程的方法或者化学合成的方法得到。基因工程的方法在获取长肽(氨基酸残基长度大于50)或蛋白质上比化学方法有优势，但是多肽的化学合成方法尤其是在固相合成策略出现后，在制备氨基酸残基长度小于40的多肽或小肽上有基因工程方法难以比拟的灵活性、多样性和高效性等。1963年Merrifield创立并开发了固相合成多肽的方法。固相多肽合成一般有两种策略：即Boc/Bzl正交保护固相合成策略和Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，Merrifield创立的固相合成法即为Boc/Bzl正交保护固相合成策略。但是，Boc/Bzl正交保护固相合成策略中存在一些缺点，如副反应多、条件苛刻以及在延长肽链的过程中多肽链会从固相上丢失等。而随后出现的Fmoc/tBu正交保护固相合成策略则反应条件温和的多。当近年来微波技术运用于多肽的固相合成中后，使多肽的合成技术产生了一个飞跃。微波促进化学反应是由于其使极性分子在微波场中快速旋转，使得一些反应速率较常规加热方法快10到1000倍，而且产率大大提高。1986年Gedye等人首次报道了将微波应用于有机合成中，微波可以促进许多化学反应，如Diels-Alder反应，皂化反应等，可以显著地加快反应速率并提高收率。在1992年，Hui-ming Yu等首先报道了将微波应用于多肽固相合成领域中，他们完成了酰基载体蛋白片断十肽(acyl carrier protein，ACP 65～74)的合成。
如何高效的合成长肽(大于30肽)在世界上仍然是一个挑战，因为多肽随着肽链的增加，其合成难度成倍增加。用传统的固相方法合成长肽，其收率往往很低杂质较多纯化困难，从而从实用的角度上说失去了合成的意义。其次合成周期长，在中间不出现困难肽序的情况下30肽一般需要近一个星期时间才能完成合成周期，如果出现困难肽序，往往就无法合成得到目标多肽。而使用微波促进固相合成多肽，可以克服困难肽序，合成传统固相方法无法得到的多肽，而且合成时间大大缩短，且显著提高多肽粗品纯度及收率，使得产品的纯化大大方便，只要经过一次制备型HPLC就能得到纯度较高的产品；此外还可以非常方便的用D型氨基酸及非天然氨基酸等对多肽进行定点修饰，去寻找活性更高、生物半衰期更长的多肽，这更是基因工程技术无法做到的。因此，我们在GLP-1类似物的合成中采用此种方法快速高效的合成得到GLP-1系列类似物。
发明内容
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌肠降血糖多肽激素，其有治疗糖尿病的优点突出，但是其生物半率期短。
本发明的第一个目的是针对其易被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP IV)及体内其它活性酶(如中性肽链内切酶neutral endopeptidase 24.11水解)的缺点，将其易被水解部位的氨基酸用其它氨基酸或非天然氨基酸替换，以期望达到延长半衰期的效果，合成了一类GLP-1衍生物。其特征在于其结构具有以下形式：
His-Xaa1-Xaa2-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa3-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa4-Gln-Ala-Ala-Lys-Xaa5-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa6(SEQ.ID NO：1)
Xaa1：Asp，Asn，Arg，Lys，His，Glu，Gln，Trp，Phe，Tyr，Met，D-Gly，D-VaL，D-Leu，D-Ile，D-Ser，D-Thr
Xaa2：Glu，Pro
Xaa3：Val，Leu
Xaa4：Gly，Glu，Gln，Trp，Phe，Tyr，Met，D-Gly，D-VaL，D-Leu，D-Ile，D-Ser，D-Glu，D-Gln，D-Trp，D-Met
Xaa5：Glu，Leu
Xaa6：Gly，-NH2
本发明的第二个目的是提供了GLP-1衍生物的固相制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到系列GLP-1类似物。
其特征在于：采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，于固相载体上先合成得到载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂，茚三酮法检测为阴性后脱去Fmoc保护基得到载有第一个氨基酸残基的树脂；再进入下一个偶联循环，按照相应的肽序用不同的保护氨基酸重复偶联和脱保护的步骤，依次延长所需的氨基酸序列，合成得到载有相应多肽的树脂，最后用裂解剂将多肽从树脂上切割下来得到多肽粗品。粗品经制备级高效液相色谱纯化，冻干得多肽纯品。
载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，其特征是通过在微波照射条件下Fmoc保护氨基酸先经活化剂活化后再与固相载体偶合得到，反应中加入1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有机碱中和反应的酸性。载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂所使用的固相载体是Rink树脂、Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。活化剂是二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N″-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或使用的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。有机碱为三乙胺(TEA)、N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)；微波促进条件是：微波频率2450MHz，反应温度：20～100℃，反应时间为5～15min。
Fmoc保护基的脱除是通过使用含有0.1mol·L-1的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)的六氢吡啶溶液在微波促进下反应，选用二甲基甲酰胺(DM F)、二甲亚砜(DMSO)、或N-甲基吡咯烷酮(NMP)为反应溶剂。微波促进条件是：微波频率2450MHz，反应温度：20～100℃，反应时间为1～10min。
本发明的优点在于：
1.提出的一种GLP-1类似物可以在保留降糖活性的基础上，提高GLP-1的稳定性，延长作用时间。具有抗DPP IV等酶解作用，生物半率期较GLP-1原型长。
2.微波促进固相合成GLP-1类似物大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。
3.微波促进固相合成GLP-1类似物合成得到的粗品的纯度大于60％，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作，只需要经过一次制备液相纯化，冻干即可得到目标纯品。
4.微波促进固相方法合成GLP-1类似物，其成本低，由于偶合效率较高，所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。
5.微波促进固相合成GLP-1类似物方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。
因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的GLP-1类似物，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的GLP-1类似物，比天然GLP-1更加稳定，适合作为治疗糖尿病药物的活性成分。
附图说明
上文对本发明做了一般性描述，下面附图用于说明本发明的具体实施方案。其中：
图1显示的是GLP-1(7～36)-NH2与DPP IV温孵0h和4h的HPLC分析谱图；
图2显示的是GLP-1(7～36)-NH2与人血浆温孵0h和4h的HPLC分析谱图；
图3显示的是改造后的D-Gly8-GLP-(7～36)-NH2与DPP IV温孵0h和4h的HPLC分析谱图；
图4显示的是改造后的D-Gly8-GLP-(7～36)-NH2与人血浆温孵0h和4h的HPLC分析谱图；
具体实施方式
在本说明书全文中采用以下缩写：
Et3N：三乙胺；NMM：N-甲基吗啉；DIEA：N，N′-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DM SO：二甲亚砜；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9芴甲氧羰基；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；CDI：N，N’-羰基二咪唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；Gly：甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：苏氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天门冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸。Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺。
本发明是通过下列实施列来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。
实施例1
His-D-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：2)的微波促进固相合成
(1)树脂的溶胀
称取Fmoc-rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mLNMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。
(2)微波促进Fmoc保护基的脱除
将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。
(3)微波促进Fmoc-Arg(Pbf)-rink amide-MBHA Resin的合成
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
(4)偶合效率的检测
用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。
茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
(5)肽链的延长
按照D-Gly8-GLP-(7～36)-NH2的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合微波促进反应时间5～20min不等。得到连有D-Gly8-GLP-(7～36)-NH2的树脂。
(6)树脂上多肽的裂解
将上述得到的连有D-Gly8-GLP-(7～36)-NH2的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Regeant K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5：5：5：5：2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到D-Gly8-GLP-(7～36)-NH2粗品63.2mg，收率为94.3％。
(7)D-Gly8-GLP-(7～36)-NH2粗品的纯化
将上面得到的D-Gly8-GLP-(7～36)-NH2粗品，溶于少量的水中，用岛津制备型反相HPLC纯化粗品。纯化中采用C18反相制备柱(340mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％ TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 20％～65％，40min；流速为6mL/min；检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品，最终得到纯品29.7mg。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1095.5，[M+4H]4+821.9，[M+5H]5+657.8；calu[M+3H]3+1095.5，[M+4H]4+821.9，[M+5H]5+657.7。理论相对分子质量为3283.6，实际相对分子量为3283.6。
实施例2～28
根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2～28的多肽，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。
实施例2
His-Asn-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：3)；理论相对分子质量为3340.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1114.5，[M+4H]4+836.1，[M+5H]5+669.1；calu[M+3H]3+1114.6，[M+4H]4+836.3，[M+5H]5+669.1。
实施例3
His-Trp-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：4)；理论相对分子质量为3412.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1138.6，[M+4H]4+854.2，[M+5H]5+683.6；calu[M+3H]3+1138.6，[M+4H]4+854.2，[M+5H]5+683.6。
实施例4
His-Tyr-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：5)；理论相对分子质量为3389.8。ESI-MS m/z：found calu[M+3H]3+1130.8，[M+4H]4+848.4，[M+5H]5+679.0；calu[M+3H]3+1130.9，[M+4H]4+848.5，[M+5H]5+679.0。
实施例5
His-Met-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：6)；理论相对分子质量为3357.8。ESI-MSm/z：found [M+3H]3+1120.2，[M+4H]4+840.4，[M+5H]5+672.5；calu[M+3H]3+1120.3；[M+4H]4+840.5，[M+5H]5+672.6。
实施例6
His-Glu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：7)；理论相对分子质量为3355.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1119.3，[M+4H]4+839.9，[M+5H]5+672.2；calu[M+3H]3+1119.6，[M+4H]4+839.9，[M+5H]5+672.1。
实施例7
His-D-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：8)；理论相对分子质量为3325.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1109.8，[M+4H]4+832.4，[M+5H]5+665.9；calu[M+3H]3+1109.6，[M+4H]4+832.4，[M+5H]5+666.1。
实施例8
His-D-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：9)；论相对分子质量为3339.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1114.2，[M+4H]4+836.0，[M+5H]5+668.8；calu[M+3H]3+1114.3，[M+4H]4+835.9，[M+5H]5+669.0。
实施例9
His-D-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：10)；理论相对分子质量为3313.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1105.5，[M+4H]4+829.5，[M+5H]5+663.7；calu[M+3H]3+1105.6，[M+4H]4+829.4，[M+5H]5+663.7。
实施例10
His-D-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：11)；理论相对分子质量为3339.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1114.2，[M+4H]4+836.0，[M+5H]5+668.8；calu[M+3H]3+1114.3，[M+4H]4+835.9，[M+5H]5+669.0。
实施例11
His-D-Thr-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：12)；理论相对分子质量为3327.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1110.2，[M+4H]4+832.8；calu[M+3H]3+1110.2，[M+4H]4+832.9，[M+5H]5+666.5。
实施例12
His-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：13)；理论相对分子质量为3281.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1095.0，[M+4H]4+821.5，[M+5H]5+657.5；calu[M+3H]3+1094.9，[M+4H]4+821.4，[M+5H]5+657.3。
实施例13
His-Val-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：14)；理论相对分子质量为3293.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1098.9，[M+4H]4+824.5；calu[M+3H]3+1098.9，[M+4H]4+824.4。
实施例14
His-Leu-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：15)；理论相对分子质量为3307.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1103.8，[M+4H]4+828.0，[M+4H+Na]5+667.0；calu[M+3H]3+1103.6，[M+4H]4+827.9，[M+4H+Na]5+667.0。
实施例15
His-Gly-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：16)；理论相对分子质量为3251.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1084.8，[M+4H]4+813.8，[M+5H]5+651.2；calu[M+3H]3+1084.9，[M+4H]4+813.9，[M+5H]5+651.3。
实施例16
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：17)；理论相对分子质量为3297.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1100.3，[M+4H]4+825.3，[M+5H]5+660.7；calu[M+3H]3+1100.2，[M+4H]4+825.4，[M+5H]5+660.5。
实施例17
His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：18)；理论相对分子质量为3327.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1110.2，[M+4H]4+832.8，[M+5H]5+666.6；calu[M+3H]3+1110.2，[M+4H]4+832.9，[M+5H]5+666.5。
实施例18
His-Thr-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：19)；理论相对分子质量为3341.7。ESI-MSm/z：calu[M+3H]3+1115.1，[M+4H]4+836.5，[M+5H]5+669.4；calu[M+3H]3+1114.9，[M+4H]4+836.4，[M+5H]5+669.3。
实施例19
His-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：20)；理论相对分子质量为3353.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1118.9，[M+4H]4+839.5，[M+5H]5+672.0；calu[M+3H]3+1118.9，[M+4H]4+839.5，[M+5H]5+671.8。
实施例20
His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：21)；理论相对分子质量为3297.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1100.2，[M+4H]4+825.4，[M+4H+Na]5+665.0；calu[M+3H]3+1100.3，[M+4H]4+825.5，[M+4H+Na]5+665.0。
实施例21
His-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：22)；。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1118.9，[M+4H]4+839.5，[M+5H]5+672.0；calu[M+3H]3+1118.9，[M+4H]4+839.5，[M+5H]5+671.8。
实施例22
His-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：23)；理论相对分子质量为3323.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1108.9，[M+4H]4+831.9，[M+5H]5+666.0；calu[M+3H]3+1108.9，[M+4H]4+832.0，[M+5H]5+665.8。
实施例23
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：24)；理论相对分子质量为3267.7。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1090.2，[M+4H]4+817.9，[M+5H]5+654.5；calu[M+3H]3+1090.2，[M+4H]4+817.9，[M+5H]5+654.5。
实施例24
His-Phe-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：25)；理论相对分子质量为3345.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1149.4，[M+4H]4+862.4；calu[M+3H]3+1149.6，[M+4H]4+862.5。
实施例25
His-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：26)；理论相对分子质量为3411.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1138.2，[M+4H]4+854.0，[M+5H]5+683.4；calu[M+3H]3+1138.3，[M+4H]4+854.0，[M+5H]5+683.4。
实施例26
His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：27)；理论相对分子质量为3397.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1133.5，[M+4H]4+850.5，[M+5H]5+680.5；calu[M+3H]3+1133.6，[M+4H]4+850.4，[M+5H]5+680.6。
实施例27
His-Lys-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：28)；理论相对分子质量为3426.8。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1143.2，[M+4H]4+857.7，[M+5H]5+686.6；calu[M+3H]3+1143.3，[M+4H]4+857.7，[M+5H]5+686.4。
实施例28
His-D-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：29)；理论相对分子质量为3355.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1119.4，[M+4H]4+839.8，[M+4H+K]5+679.8；calu[M+3H]3+1119.6，[M+4H]4+839.9，[M+4H+K]5+672.7。
实施例29
His-D-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.ID NO：30)的微波促进固相合成
(1)树脂的溶胀
称取Wang Resin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mLNMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。
(2)Fmoc-Gly-Wang Resin的合成
将Fmoc-Gly-OH(0.08mmol)，HBTU(0.08mmol)，HOBT(0.08mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
将得到的树脂加入10ml 15％的醋酐/DCM溶液中，再加入0.01g DMAP，室温下振摇3h，反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
(3)微波促进Fmoc保护基的脱除
将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。
(4)微波促进Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang Resin的合成
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
(4)偶合效率的检测
用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。
茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
(5)肽链的延长
按照D-Leu8-Leu16-GLP-(7～37)-OH的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合微波促进反应时间5～20min不等。得到连有D-Leu8-Leu16-GLP-(7～37)-OH的树脂。
(6)树脂上多肽的裂解
将上述得到的连有D-Leu8-Leu16-GLP-(7～37)-OH的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Regeant K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5∶5∶5∶5∶2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到D-Leu8-Leu16-GLP-(7～37)-OH粗品59.8mg，收率为92.4％。
(7)D-Leu8-Leu16-GLP-(7～37)-OH粗品的纯化
将上面得到的D-Leu8-Leu16-GLP-(7～37)-OH粗品，溶于少量的水中，用岛津制备型反相HPLC纯化粗品。纯化中采用C18反相制备柱(340mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 20％～65％，40min；流速为6mL/min；检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品，最终得到纯品29.7mg。ESI-MSm/z：found[M+3H]3+1138.2，[M+4H]4+854.0，[M+5H]5+683.5；calu[M+3H]3+1138.3，[M+4H]4+854.0，[M+5H]5+683.4.实际相对分子量为3411.8。
实施例30～33
根据实施例29所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例30～31的多肽，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。
实施例30
His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.ID NO：31)；理论相对分子质量为3385.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1129.4，[M+4H]4+847.5，[M+5H]5+678.2；calu[M+3H]3+1129.6，[M+4H]4+847.4，[M+5H]5+678.2。
实施例31
His-D-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.ID NO：32)；理论相对分子质量为3341.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1119.7，[M+4H]4+839.7，[M+5H]5+672.1；calu[M+3H]3+1119.7，[M+4H]4+839.9，[M+5H]5+672.2。
实施例32
GLP-1及其类似物对DPP IV的稳定性实验
经过纯化后的GLP-1或其类似物D-Gly8-GLP-(7～36)-NH25nmol和5mU的DPP IV在200μL浓度为50mM的Tris-HCL缓冲溶液中，37℃温孵4h，pH 7.4。最后加入10μL 20％的乙腈/水溶液终止反应。分别取0h，4h点的温孵溶液，离心，取上清液，进HPLC分析；柱尾收集降解产物GLP-1(9～36)-NH2。分析采用C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 10％～45％，22min；流速为1mL/min；柱温为40℃；检测波长为214nm。
如图1，图2所示，结果显示未经改造的天然GLP-1在与DPPIV温孵4h后，基本上皆被水解为无活性的GLP-1(9～36)-NH2，完整的肽链小于10％。而改造后的GLP-1类似物与DPP IV温孵4h后基本上都仍保持原型，未见有降解，完整的肽链大于90％。结果表明通过对GLP-1易被DPP IV水解的部位改造，可以使GLP-1类似物抵抗DPP IV的酶解作用，从而能保持肽链的完整性。
实施例33
GLP-1及其类似物对人血浆的稳定性实验
经过纯化后的GLP-1或其类似物D-Gly8-GLP-(7～36)-NH25nmol和10μL人血浆在200μL浓度为50mM的Tris-HCL缓冲溶液中，37℃温孵4h，pH 7.4。最后加入10μL 20％的乙腈水溶液终止反应。分别取0h，4h点的温孵溶液，离心，取上清液，进HPLC分析。分析采用C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 0％，3min；0％～24％，17min；24％～48％，30min；48％～80％，1min。流速为1mL/min；柱温为40℃；检测波长为214nm。
如图3，图4所示，结果显示未经改造的天然GLP-1在与人血浆温孵4h后，基本上皆被水解为无活性的GLP-1(9～36)-NH2，完整的肽链小于15％。而改造后的GLP-1类似物与人血浆温孵4h后基本上都仍保持原型，未见有降解，完整的肽链大于90％。结果表明通过对GLP-1易被酶水解的部位改造，可以使GLP-1类似物抵抗血浆中的酶解作用，从而能保持肽链的完整性。
实施例34
GLP-1及其类似物体内降糖活性实验
取10周龄雄性昆明小鼠(体重18～22g)，随机分组，每组6只。只给饮水，禁食过夜。一组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液(浓度20％)和生理盐水；其他组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液和25nmol的GLP-1类似物溶液(10μmol/L)。在0，15，30，45，60用血糖仪测定血糖值。
如表1所示，由于修饰后的GLP-1具有抗酶解作用，其生物半衰期大大延长，所以体内降血糖实验显示其促胰岛素分泌作用不仅未被减弱，还比未经改造的天然GLP-1更强。
表1 GLP-1及其类似物降血糖的效应
Figure A20081001968200201
n＝6，x±s.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001vs saline
序列表
<110>中国药科大学
<120>微波促进固相合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用
<160>32
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是Asp，Asn，Arg，Lys，His，Glu，Gln，Trp，Phe，Tyr，Met，D-Gly，D-VaL，D-Leu，D-Ile，D-Ser，或D-Thr
<220>
<221>合成构建体
<222>(3)..(3)
<223>第3位的Xaa是Glu，或Pro
<220>
<221>合成构建体
<222>(10)..(10)
<223>第10位的Xaa是Val，或Leu
<220>
<221>合成构建体
<222>(16)..(16)
<223>第10位的Xaa是Gly，Glu，Gln，Trp，Phe，Tyr，Met，D-Gly，D-VaL，D-Leu，D-Ile，D-Ser，D-Glu，D-Gln，D-Trp，或D-Met
<220>
<221>合成构建体
<222>(21)..(21)
<223>第21位的Xaa是Glu，或Leu
<220>
<221>合成构建体
<222>(31)..(31)
<223>第31位的Xaa是Gly，或-NH2
<400>1
His Xaa Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa
1                 5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
            20                   25                     30
<210>2
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是D-Gly
<400>2
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                   15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                   25                 30
<210>3
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
His Asn Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>4
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
His Trp Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                    10                 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>5
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
His Tyr Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                    10                 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                   25                 30
<210>6
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
His Met Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                   25                  30
<210>7
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
His Glu Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                   15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>8
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是D-Val
<400>8
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>9
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa D-Leu
<400>9
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                   25                 30
<210>10
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是D-Ser
<400>10
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>11
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是D-Ile
<400>11
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>12
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是D-Thr
<400>12
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>13
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13
His Ser Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>14
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>14
His Val Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>15
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>15
His Leu Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>16
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>16
His Gly Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>17
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>17
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>18
<21l>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>18
His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>19
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>19
His Thr Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>20
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>20
His Leu Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>21
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>21
His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>22
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
His Ile Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>23
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>23
His Leu Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>24
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>24
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>25
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>25
His Phe Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>26
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>26
His Ile Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                   15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>27
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>27
His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>28
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>28
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>29
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是D-Gly
<400>29
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>30
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是D-Leu
<400>30
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>31
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<400>31
His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>32
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(2)..(2)
<223>第2位的Xaa是D-Gly
<400>32
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                   25                  30

Claims (8)

1.一种含有式I(SEQ.ID NO：1)结构的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，得到的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物；其特征在于其结构具有以下形式：
His-Xaa1-Xaa2-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa3-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa4-Gln-Ala-Ala-Lys-Xaa5-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa6(SEQ.IDNO：1)
Xaa1：Asp，Asn，Arg，Lys，His，Glu，Gln，Trp，Phe，Tyr，Met，D-Gly，D-VaL，D-Leu，D-Ile，D-Ser，或D-Thr；
Xaa2：Glu，或Pro；
Xaa3：Val，或Leu；
Xaa4：Gly，Glu，Gln，Trp，Phe，Tyr，Met，D-Gly，D-VaL，D-Leu，D-Ile，D-Ser，D-Glu，D-Gln，D-Trp，或D-Met；
Xaa5：Glu，或Leu；
Xaa6：Gly，或-NH2。
2.根据权利要求1所述的多肽，具有如下序列：
His-D-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：2)；
His-Asn-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：3)；
His-Trp-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：4)；
His-Tyr-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：5)；
His-Met-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：6)；
His-Glu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：7)；
His-D-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：8)；
His-D-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：9)；
His-D-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：10)；
His-D-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：11)；
His-D-Thr-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：12)；
His-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：13)；
His-Val-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：14)；
His-Leu-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：15)；
His-Gly-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：16)；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：17)；
His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：18)；
His-Thr-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：19)；
His-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：20)；
His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：21)；
His-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：22)；
His-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：23)；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：24)；
His-Phe-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：25)；
His-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：26)；
His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：27)；
His-Lys-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Aia-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：28)；
His-D-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.ID NO：29)
His-D-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.ID NO：30)；
His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.ID NO：31)
His-D-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.ID NO：32)。
3.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1中所述的GLP-1类似物或者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。
4.权利要求1中所述的GLP-1类似物或者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于治疗糖尿病的药物中的运用。
5.权利要求1中所述的GLP-1类似物的制备方法，其特征在于：采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，于固相载体上先合成得到载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂，茚三酮法检测为阴性后脱去Fmoc保护基得到载有第一个氨基酸残基的树脂；再进入下一个偶联循环，按照相应的肽序用不同的保护氨基酸重复偶联和脱保护的步骤，依次延长所需的氨基酸序列，合成得到载有相应多肽的树脂，最后用裂解剂将多肽从树脂上切割下来得到多肽粗品。粗品经制备级高效液相色谱纯化，冻干得多肽纯品。
6.根据权利要求5中所述微波促进固相合成GLP-1类似物方法，其特征是载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，是通过在微波照射条件下Fmoc保护氨基酸先经活化剂活化后再与固相载体偶合得到，反应中加入1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有机碱中和反应的酸性。
7.根据权利要求6所述的载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，其特征在于使用的固相载体是Rink树脂、Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂；使用的活化剂是二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N″-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)；使用的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)；使用的有机碱为三乙胺(TEA)、N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)；微波促进条件是：微波频率2450MHz，反应温度：20～100℃，反应时间为5～15min。
8.根据权利要求5中所述微波促进固相合成GLP-1类似物合成方法，其特征是Fmoc保护基的脱除是通过使用含有0.1mol·L-1的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)的六氢吡啶溶液在微波促进下反应，选用二甲基甲酰胺(DM F)、二甲亚砜(DM SO)、或N-甲基吡咯烷酮(NMP)为反应溶剂；微波促进条件是：微波频率2450MHz，反应温度：20～100℃，反应时间为1～10min。
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