ES2710916T3 - Proteínas de unión sustitutas - Google Patents

Abstract

Una proteína de unión sustituta bivalente ("SBP") que comprende: una secuencia de la VpreB fusionada con una secuencia de la λ5; y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que está emparejada con la secuencia de la VpreB fusionada con la secuencia de la λ5 para formar una SBP, en la que la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR) 1 de la SEQ ID NO: 39, una secuencia de la CDR2 de la SEQ ID NO: 40 y una secuencia de la CDR3 de la SEQ ID NO: 41; y en la que dicha SBP bivalente se une de forma selectiva y bivalente tanto al DR4 como al DR5 y actúa como un agonista para activar la señalización del DR4 y del DR5.

Description

DESCRIPCION

Protelnas de union sustitutas

LISTA DE SECUENCIAS

[0001] La presente solicitud ha sido enmendada para que incluya una Lista de Secuencias en formato electronico. La Lista de Secuencias se proporciona en forma de un archivo con el tltulo SeqListing.txt, creado el 19 de diciembre de 2012, que tiene un tamano de 268.337 bytes.

CAMPO DE LA INVENCION

[0002] La presente invencion se refiere de forma general a construcciones sustitutas de la cadena ligera y a otras protelnas de union.

ANTECEDENTES

[0003] La apoptosis juega una diversidad de papeles, incluyendo la eliminacion de las celulas anormales, tales como las celulas tumorales. La apoptosis puede ser activada mediante dos rutas: una ruta intrlnseca, que implica una disfuncion mitocondrial, y una ruta extrlnseca a traves de la estimulacion del receptor de muerte. Los receptores de muerte son receptores de la superficie celular de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) e incluyen el TNF-R1, el CD95 (APO-1, Fas), el receptor del ligando inductor de la apoptosis relacionado con el TNF 1 (TRAIL-R1; DR4) y el TRAIL-R2 (DR5). Los receptores de muerte comprenden un dominio de muerte citoplasmatico, y la union a sus respectivos ligandos da lugar a la activacion. El ligando inductor de la apoptosis relacionado con el TNF (TRAIL) es un ligando del DR4 y del DR5. La union del ligando da lugar a su asociacion con el dominio de muerte asociado con Fas (FADD). Este adaptador recluta la caspasa-8 y la caspasa-10 para formar un complejo de serialization inductor de muerte (DISC), que da lugar a la activacion efectora de la caspasa y a la muerte celular.

[0004] Se ha demostrado que la activacion del TNF-R1 y del CD95 destruye de forma eficaz las celulas tumorales. Por lo tanto, se han implantado terapias contra el cancer que intentan inducir la apoptosis de las celulas tumorales mediante la activacion de estos receptores de muerte mediante el uso de ligandos y de anticuerpos agonistas. Sin embargo, dichos esfuerzos han estado limitados por los graves efectos secundarios que se han observado. Por otro lado, se ha demostrado que la activacion del DR4 y del DR5 elimina selectivamente las celulas cancerosas sin una toxicidad potencialmente mortal, y se ha demostrado que el ligando tiene efectos sinergicos con otros productos quimioterapeuticos en la destruction de las celulas tumorales sin unos efectos secundarios adicionales.

RESUMEN

[0005] Se proporciona una protelna de union sustituta bivalente ("SBP") segun la reivindicación 1. La protelna de union sustituta se une tanto al receptor DR4 como al DR5. En algunas realizaciónes, la SBP se une tanto al DR4 como al DR5, pero no se une a los receptores senuelo. La SBP puede actuar como un agonista del DR4 y del DR5.

[0006] En algunas realizaciónes, se proporciona una protelna de union sustituta biespeclfica segun la reivindicación 8. El segundo sitio de la protelna de union sustituta se une a una segunda diana. En algunas realizaciónes, el segundo sitio de la protelna de union sustituta se une a una diana implicada en la patogenia del cancer que no es un receptor DR4 o DR5.

[0007] Se proporciona una protelna de union sustituta biespeclfica segun la reivindicación 8. La SBP comprende una primera secuencia VpreB fusionada con una primera secuencia A5, una primera secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada segun la reivindicación 8 que esta emparejada con la primera secuencia VpreB fusionada con la primera secuencia A5 para formar un primer sitio de union. El primer sitio de union de la protelna de union sustituta se une bivalentemente a un receptor DR4 y a un DR5 y es un agonista del DR4 y del DR5. La SBP puede comprender adicionalmente una region variable de la cadena ligera o una segunda secuencia VpreB fusionada con una segunda secuencia A5. La SBP puede comprender adicionalmente una segunda secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la region variable de la cadena ligera o una segunda secuencia VpreB fusionada con una segunda secuencia A5, para formar un segundo sitio de union, en la que dicho segundo sitio de union se une a una segunda diana. En algunas realizaciónes, el segundo sitio de union se une a, y/o inhibe, una diana implicada en la patogenia del cancer que no es un DR4 o un DR5.

[0008] En algunas realizaciónes se proporciona una SBP agonista doble del DR4 y del DR5. En algunas realizaciónes, la SBP agonista doble puede unirse al DR4 humano y al DR5 humano, as! como a los DR4 y DR5 de un primate no humano, tales como los cyno DR4 y DR5. En algunas realizaciónes la SBP agonista doble no se une a receptores senuelo. La SBP agonista doble del DR4 y del DR5 comprende uno o mas dominios de union de la

SL231 (denominada tambien en esta invention 3631-G09).

[0009] En algunas realizaciónes, se proporciona una protelna de union sustituta que puede reducir la

proliferation de las celulas cancerosas, el crecimiento de las celulas cancerosas o la proliferation y el crecimiento de

las celulas cancerosas, en los que las celulas cancerosas expresan el DR4 y/o el DR5.

[0010] Se describen procedimientos para la estimulacion de la apoptosis en las celulas que expresan el DR4,

el DR5, o el DR4 y el DR5. Los procedimientos pueden comprender proporcionar una protelna de union sustituta

agonista del DR4 y/o del DR5 a celulas que expresan el DR4 y/o el d R5. Las celulas pueden ser, por ejemplo, celulas tumorales. En algunas realizaciónes, la SBP es un agonista doble del receptor DR4 y DR5, tal com SL466 (3706-A02) o la SL231 (3631-G09), o una SBP que comprende una o mas CDR de la SL466 o de la SL231.

Las celulas pueden expresar diferencialmente el DR4 y el DR5.

[0011] Se describen procedimientos para la supresion de la proliferacion de las celulas que expresan el DR4,

el DR5, o el DR4 y el DR5. Los procedimientos pueden comprender proporcionar una protelna de union sustituta

agonista del DR4 y/o del DR5 a celulas que expresan el DR4 y/o el d R5. Las celulas pueden ser, por ejem celulas tumorales. En algunas realizaciónes, la SBP es un agonista doble del receptor DR4 y DR5, tal como la

SL466 (3706-A02) o la SL231 (3631-G09), o una SBP que comprende una o mas CDR de la SL466 o de la SL231.

Las celulas pueden expresar diferencialmente el DR4 y el DR5.

[0012] Se describe un procedimiento para la destruction de celulas cancerosas en un sujeto. Los

procedimientos comprenden la identification de un sujeto que tiene una celula cancerosa, en el que dicha celula

cancerosa expresa el DR4, el DR5, o el DR4 y el ^d R5, en la administration al sujeto de una protelna de union

sustituta agonista del DR4, del DR5, o del DR4 y del DR5, en una cantidad suficiente para que se una a, y active, el

DR4, el DR5, o el DR4 y el DR5 de la celula cancerosa, activando as! una ruta de un receptor de muerte. La

activation de la ruta del receptor de muerte puede dar como resultado la apoptosis de la celula cancerosa,

produciendo as! la destruccion de la celula. En algunas realizaciónes la SBP es un agonista doble del receptor DR4

y DR5, tal como la SL466 (3706-A02) o la SL231 (3631-G09) o una SBP que comprende una o mas CDR de la

SL466 o de la SL231. La celula cancerosa puede expresar diferencialmente el DR4 y el DR5.

[0013] Adicionalmente se describe un procedimiento para el tratamiento del cancer. El procedimiento

comprende la identificacion de un sujeto para que reciba un tratamiento para un cancer, en el que las celulas

asociadas a dicho cancer expresan el DR4, el DR5, o el DR4 y el DR5; y la administracion al sujeto de una protelna

de union sustituta del DR4, del DR5, o del DR4 y del DR5, o de porciones de union al antlgeno de las mismas. En

algunas realizaciónes la SBP es un agonista doble del receptor DR4 y DR5, tal como la SL466 (3706-A02) o la

SL231 (3631-G09), o una SBP que comprende una o mas CDR de la SL466 o de la SL231. En algunas

realizaciónes, la SBP puede estar conjugada con un agente terapeutico, tal como una toxina.

[0014] Adicionalmente se describe un procedimiento para el tratamiento del cancer. El procedimiento

comprende la administracion de un producto quimioterapeutico o biologico a un sujeto y la administracion de una

SBP agonista del DR4, del DR5, o del DR4 y del DR5, a un sujeto. En algunas realizaciónes, la SBP es un agonista

doble del receptor DR4 y DR5, tal como la SL466 (3706-A02) o la SL231 (3631-G09), o una SBP que comprende

una o mas CDR de la SL466 o de la SL231. En algunas realizaciónes, la SBP puede estar conjugada con un agente

terapeutico, tal como una toxina.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0015]

Las FIGs. 1A y 1B ilustran la union de los clones del cribado de expresion en fago al DR5.

Las FIGs. 2A y B ilustran el analisis de la union al DR4 y al DR5 de dos SBP monovalentes.

Las FIGs. 3A-D muestran los resultados de los analisis de ELISA de la union de los mismos clones mostrados en la

Figura 1 a los receptores senuelo DcR1 y DcR2.

La FIG. 4 es una alineacion de las secuencias de los dominios extracelulares de los DR4, DR5, DcR1 y DcR2

humanos.

Las FIGs. 5A-C ilustran los resultados de las pruebas de la union de la SBP al DR4 humano, al DR5 humano y al

DR5 de raton.

La FIG. 6 es una alineacion de las secuencias de aminoacidos de los dominios de union del TRAIL al DR4 humano,

al DR5 humano y al DR5 de raton.

Las FIGs. 7A y B ilustran los resultados de la union de la SBP bivalente al DR4 humano y al DR5 humano en un

ensayo de ELlSA.

Las FIGs. 7C y D ilustran los resultados de la union de la SBP bivalente a los DR4 y DR5 humanos, a los receptores

senuelo DcR1 y DcR2 humanos y a la osteoprotegrina.

La FIG. 8 ilustra la inhibition de la proliferacion celular mediante una SBP monovalente cuando es reticulada por multiples anticuerpos.

La FIG. 9 ilustra los resultados de las pruebas de multiples SBP monovalentes cuando son reticuladas por multiples anticuerpos.

Las FIGs. 10A y B ilustran la inhibicion de la proliferacion celular mediante SBP agonistas bivalentes de los receptores de muerte.

Las FIGs. 11A-C ilustran la activacion de las caspasas inductoras de la apoptosis mediante SBP reticuladas, bivalentes anti-receptor de muerte.

La FIG. 12 es un gel que muestra que las SBP reticuladas, bivalentes anti-receptor de muerte, inducen el escalonamiento apoptotico del ADN en la llnea celular de cancer de colon Colo205.

Las FIGs. 13A-G ilustran la actividad de las SBP agonistas del receptor de muerte frente a un conjunto de llneas celulares que representan diversos tipos de cancer.

La FIG. 14A ilustra los efectos antitumorales in vivo de las SBP agonistas bivalentes del receptor de muerte en un modelo de raton de xenoinjerto tumoral.

Las FIGs. 14B-G ilustran las respuestas individuales del tumor in vivo a las SBP agonistas bivalentes del receptor de muerte y los controles.

Las FIGs. 15A-F ilustran los efectos antiproliferativos de las SBP reticuladas bivalentes en combinacion con un tratamiento quimioterapeutico en la llnea celular de cancer de pancreas BxPC3.

Las FIGs. 16A-F ilustran los efectos antiproliferativos de las SBP reticuladas bivalentes junto con agentes quimioterapeuticos en la llnea celular de cancer de colon colo205.

Las FIGs. 17A-F ilustran los efectos antiproliferativos de las SBP reticuladas SBP bivalentes en combinacion con un tratamiento quimioterapeutico en la llnea celular de cancer de mama BT-474.

La FIG. 18 ilustra el efecto del tratamiento con la SBP bivalente 3631-G09 sobre el crecimiento tumoral del xenoinjerto Ramos.

Las FIGs. 19A-I ilustran los efectos antiproliferativos del tratamiento con la SBP bivalente reticulada 3631-G09 y agentes quimioterapeuticos especlficos de ruta en celulas de cancer de colon Colo205.

La FIG. 20A-I ilustran los efectos antiproliferativos del tratamiento con la SBP bivalente reticulada 3641-F01 y agentes quimioterapeuticos especlficos de ruta en celulas de cancer de colon Colo205.

Las FIGs. 21 A-l ilustran los efectos antiproliferativos del tratamiento con la SBP bivalente reticulada 3631-G09 y agentes quimioterapeuticos especlficos de ruta en celulas de cancer de pancreas BxPC3.

Las FIGs. 22A-I ilustran los efectos antiproliferativos del tratamiento con la SBP bivalente reticulada 3641-F01 y agentes quimioterapeuticos especlficos de ruta en celulas de cancer de pancreas BxPC3.

Las FIGs. 23A-D muestran que las SgG se unen con una elevada afinidad al DR4-Fc Cinomologo y Rhesus (FIG 23A y C) y al DR5-Fc Cinomologo y Rhesus (FIG 23B y D). Las afinidades estan indicadas en el recuadro de la FIG 23A y en el recuadro de la FIG 23B.

Las FIGs. 24A y B ilustran la actividad de las protelnas de union sustitutas del receptor de muerte en las llneas celulares LCL8664 y CMMT, derivadas del mono Rhesus (Macaca mulatta).

Las FIGs. 25A y B ilustran la actividad de las protelnas de union sustitutas del receptor de muerte en las llneas celulares HSC-F y AG21329, derivadas del mono Cinomologo (Macaca fascicularis).

La FIG. 26 muestra la alineacion de la VpreB1 humana (SEQ ID NO: 1) y de la A5 humana con las regiones variables y constantes de la cadena A del anticuerpo. La VpreB1 comparte una cierta similitud en la secuencia con las regiones de la cadena variable del anticuerpo A, mientras que la A5 comparte una cierta similitud con las regiones constantes y la region en marco 4 de la cadena A del anticuerpo. Las regiones enmarcadas identifican las regiones VpreB1 y A5 del bucle 1 (LR1), 2 (LR2) y 3 (LR3).

La FIG. 27 es una ilustracion esquematica de una cadena ligera sustituta formada por las secuencias VpreB y A5, polipeptidos de fusion ilustrativos que comprenden las secuencias sustitutas de la cadena ligera y una estructura de la cadena ligera de un anticuerpo derivada de la union V-J.

La FIG. 28 es una ilustracion esquematica de varias construcciones sustitutas por delecion de la cadena ligera y de cadena unica.

La FIG. 29 muestra las estructuras genicas y proteicas de varias protelnas de union sustitutas ilustrativas.

La FIG. 30 es la alineacion de las secuencias de la VpreB1 con las secuencias de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo A5. Las regiones con el mayor grado de similitud en la secuencia estan enmarcadas. Segun se muestra en la figura, la VpreB1 muestra unicamente un 56 % - 62 % (los aminoacidos 2 hasta 97) de identidad en la secuencia con las secuencias germinales de la region variable de la cadena ligera A5.

La FIG. 31 es la alineacion de las secuencias de la VpreB1 con las secuencias de la region constante de la cadena ligera A5 del anticuerpo. Segun se muestra en la figura, las secuencias de la VpreB1 alineadas muestran unicamente un 62 % (los aminoacidos 97 hasta 209) de identidad en la secuencia con las correspondientes secuencias de la region constante de la cadena ligera A5 del anticuerpo.

La FIG. 32 es la alineacion de las secuencias de la VpreB 1 con las secuencias de la region constante de la cadena ligera k del anticuerpo. Segun se muestra en la figura, las secuencias alineadas de la VpreB 1 muestran unicamente un 35 % (los aminoacidos 105 hasta 209) de identidad en la secuencia con las correspondientes secuencias de la region constante de la cadena ligera ^k del anticuerpo.

La FIG. 33 muestra la secuencia de la VpreB 1 humana de la SEQ ID NO: 1, las secuencias de la VpreB2 de raton de las SEQ ID NOS: 2 y 3; la secuencia de la VpreB3 humana de la SEQ ID NO: 4, la secuencia de la A5 humana de la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de la protelna de tipo A5 humana de la SEQ ID NO: 6 y las secuencias de varias construcciones usadas en los Ejemplos.

La FIG. 34 ilustra varias realizaciónes de SBP trimericas y dimericas.

La FIG. 35 proporciona la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada y de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de una SBP (la 3631) que se une al DR4 y al DR5.

La FIG. 36 proporciona las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada y de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de varias SBP que se unen al DR4, al DR5, o al DR4 y al DR5.

La FIG. 37 proporciona las secuencias de aminoacidos del DR4.

La FIG. 38 proporciona las secuencias de aminoacidos del DR5.

La FIG. 39A y B muestra la induccion de la actividad de la caspasa en celulas MDA-MB-231 mediante SBP agonistas dobles de los receptores de muerte DR4 y DR5. Las SBP agonistas dobles activan la actividad de la caspasa e inducen la apoptosis de una forma mas potente que los agonistas monoespeclficos de los receptores o que su combinacion.

La FIG. 40 muestra la inhibicion de la proliferation de las celulas 786-0 de carcinoma de celulas renales que expresan el DR4 y el DR5 mediante una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 conjugada con una toxina.

La FIG. 41 muestra la inhibicion de la proliferacion de las celulas 786-0 de carcinoma de celulas renales que expresan el DR4 y el DR5 mediante una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 conjugada con una toxina.

La FIG. 42 proporciona una inmunotransferencia que muestra la activation de la caspasa mediante una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 (la SL-466) con respecto a los anticuerpos dirigidos al DR4 y al DR5 individualmente, as! como una combination de dichos anticuerpos.

La FIG. 43 muestra la induccion de la apoptosis esferoidal en celulas MDA-MB-231 por parte de una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 (la SL-466) con respecto al TRAIL, a los anticuerpos dirigidos al DR4 y al DR5 individualmente, y a una combinacion de dichos anticuerpos.

La FIG. 44 ilustra los efectos antiproliferativos de las SBP agonistas dobles reticuladas del DR4 y del DR5 junto con un tratamiento quimioterapeutico en la llnea celular de cancer de pancreas PANC-1.

La FIG. 45 ilustra los efectos antiproliferativos de las SBP agonistas dobles reticuladas del DR4 y del DR5 en combinacion con un tratamiento quimioterapeutico en la llnea celular de cancer de pancreas MiaPaCa.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA REALIZACION PREFERIDA

[0016] La activacion del receptor de muerte 4 (DR4) y del receptor de muerte 5 (DR5) puede dar lugar a una apoptosis y, en algunos casos, a una apoptosis selectiva en las celulas cancerosas con respecto a las celulas sanas. Se proporcionan protelnas de union sustitutas bivalentes (SBP) que pueden unirse al DR4 y al DR5. Las SBP son agonistas del DR4 y del DR5 y, por lo tanto, capaces de activar el DR4 y el DR5. Dicha activacion puede estimular la apoptosis en las celulas que comprenden el (los) receptor(es) activado(s). Se describen anticuerpos o moleculas de tipo anticuerpo que se unen al DR4 y/o al DR5, en lugar de las SBP. Sin embargo, dichos anticuerpos pueden incluir la region variable de la cadena pesada de las SBP, o una o mas CDR de la cadena pesada de la SBP, segun se describe en esta invention. Las SBP, los anticuerpos o las moleculas de tipo anticuerpo que se unen a, y activan, el DR4 y/o el DR5, pueden usarse terapeuticamente en los casos en los que es deseable la muerte celular y/o la reduction de la proliferacion celular, por ejemplo, en el tratamiento del cancer. En algunas realizaciónes, las SBP, los anticuerpos o las moleculas de tipo anticuerpo se combinan con uno o mas agentes terapeuticos adicionales.

[0017] La presente memoria descriptiva proporciona en primer lugar una lista de definiciones y/o de realizaciónes. Despues, la memoria descriptiva continua analizando las diversas realizaciónes de las SBP y/o de los anticuerpos. Esa seccion esta seguida a continuacion por una descripcion de los diversos aspectos relativos a las SBP de una forma generica (estableciendo realizaciónes adicionales para las SBP especlficas, ejemplos de secuencias VpreB y lambda 5, etc.). Esa section esta seguida a continuation por un conjunto de ejemplos para las realizaciónes DR4/DR5, que estan seguidos a continuacion por un conjunto de ejemplos relativos a las SBP de una forma generica (que, por supuesto, se contemplan en combinacion con las realizaciónes especlficas de las SBP descritas en esta invencion). Los encabezamientos y las secciones proporcionados en esta invencion se proporcionan unicamente por conveniencia y no deben considerarse como limitantes en modo alguno de las realizaciónes o de las combinaciones proporcionadas por esta description para los expertos en la materia.

A. Definiciones

[0018] Salvo que se definan de otro modo, los terminos tecnicos y cientlficos usados en esta invencion tienen el mismo significado al comprendido habitualmente por el experto habitual en la materia a la que pertenece esta invencion. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994), proporciona al experto en la materia una gula general sobre muchos de los terminos usados en la presente solicitud.

[0019] El experto en la materia reconocera muchos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invencion, que pueden usarse en la practica de la presente invencion. De hecho, la presente invencion no esta limitada en modo alguno a los procedimientos y los materiales descritos. Para el proposito de la presente invencion, se definen a continuacion los siguientes terminos.

[0020] El termino "cadena ligera sustituta”, segun se usa en esta invencion, se refiere a la protelna VpreB, a la A5 o a la VpreB y la A5.

[0021] El termino "VpreB" se usa en esta invention en el sentido mas amplio y se refiere a cualquier secuencia nativa o polipeptido VpreB variante, incluyendo especificamente, sin limitation, la VpreB1 humana de la SEQ ID NO: 1, la VpreB2 de raton de las SEQ ID NOS: 2 y 3, la VpreB3 humana de la SEQ ID NO: 4 y las isoformas, incluyendo las variantes de ayuste y las variantes formadas mediante modificaciones post-traduccionales, otros homologos de mamifero de las mismas, asi como las variantes de dichos polipeptidos de secuencia nativa.

[0022] El termino "A5" se usa en esta invencion en el sentido mas amplio y se refiere a cualquier secuencia nativa o polipeptido A5 variante, incluyendo especificamente, sin limitacion, la A5 de raton de la SEQ ID NO: 5, la A5 humana de la SEQ ID NO: 6 y sus isoformas, incluyendo las variantes de ayuste y las variantes formadas mediante modificaciones post-traduccionales, otros homologos de mamifero de las mismas, asi como las variantes de dichos polipeptidos de secuencia nativa.

[0023] Los terminos "polipeptido VpreB variante" y "una variante de un polipeptido VpreB" se usan de forma intercambiable y se definen en esta invencion como un polipeptido que difiere de un polipeptido VpreB de secuencia nativa en una o mas posiciones de aminoacidos como resultado de una modification de aminoacido. El "polipeptido VpreB variante”, segun se define en esta invencion, sera diferente de la secuencia nativa de la cadena ligera A o k de un anticuerpo, o de un fragmento de las mismas. El "polipeptido VpreB variante" conservara preferentemente al menos aproximadamente un 65 % o al menos aproximadamente un 70 % o al menos aproximadamente un 75 % o al menos aproximadamente un 80 % o al menos aproximadamente un 85 % o al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 98 % de identidad en la secuencia con un polipeptido VpreB de secuencia nativa. En otra realization, el "polipeptido VpreB variante" puede contener hasta un 80 % o hasta un 90 % o hasta un 100 % de regiones en marco de la cadena ligera variable de un anticuerpo. En otra realización preferida, el "polipeptido VpreB variante" sera menos de un 95 % o menos de un 90 % o menos de un 85 % o menos de un 80 % o menos de un 75 % o menos de un 70 % o menos de un 65 % o menos de un 60 % identico en su secuencia de aminoacidos a una secuencia nativa de la cadena ligera A o k de un anticuerpo. Algunos polipeptidos VpreB variantes incluyen especificamente, sin limitacion, polipeptidos VpreB en los que la cola unica que no es de tipo Ig en el C terminal de la secuencia VpreB esta parcial o completamente eliminada.

[0024] Los terminos "polipeptido A5 variante" y "una variante de un polipeptido A5" se usan de forma intercambiable y se definen en esta invencion como un polipeptido que difiere de un polipeptido A5 de secuencia nativa en una o mas posiciones de aminoacidos como resultado de una modificacion de aminoacido. El "polipeptido A5 variante”, segun se define en esta invencion, sera diferente de la secuencia nativa de la cadena ligera A o k de un anticuerpo, o un fragmento de las mismas. El "polipeptido A5 variante" conservara preferentemente al menos aproximadamente un 65 % o al menos aproximadamente un 70 % o al menos aproximadamente un 75 % o al menos aproximadamente un 80 % o al menos aproximadamente un 85 % o al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 98 % de identidad en la secuencia con un polipeptido A5 de secuencia nativa. En otra realización, el "polipeptido A5 variante" puede contener hasta un 80 % o hasta un 90 % o hasta un 100 % de regiones variables J de la cadena ligera de un anticuerpo. En otra realización, el "polipeptido A5 variante" puede contener hasta un 80 % o hasta un 90 % o hasta un 100 % de regiones constantes de la cadena ligera de un anticuerpo. En otra realización preferida, el "polipeptido A5 variante" sera menos de un 95 % o menos de un 90 % o menos de un 85 % o menos de un 80 % o menos de un 75 % o menos de un 70 % o menos de un 65 % o menos de un 60 % identico en su secuencia de aminoacidos a una secuencia nativa de la cadena ligera A o k de un anticuerpo. Algunos polipeptidos A5 variantes incluyen especificamente, sin limitacion, polipeptidos A5 en los que la cola unica en el N terminal de la secuencia A5 esta parcial o completamente eliminada.

[0025] El porcentaje de identidad en la secuencia de aminoacidos puede ser determinado mediante el uso del programa de comparacion de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). El programa de comparacion de secuencias NCBI-BLAST2 puede descargarse en http:// seguido por www.ncbl.nlm.nlh.gov o puede obtenerse de otro modo en el National Institute of Health, Bethesda, MD. El NCBI-BLAST2 usa diversos parametros de busqueda, en los que todos aquellos parametros de busqueda se establecen a los valores por defecto que incluyen, por ejemplo, desenmascaramiento = si, hebra = todos, ocurrencias esperadas= 10, longitud minima de la complejidad baja = 15/5, valor de e multipase = 0,01, constante de multipase = 25, decrecimiento para la alineacion de huecos final = 25 y matriz de puntuacion = BLOSUM62.

[0026] El termino "secuencia VpreB" se usa en esta invencion para referirse a la secuencia de "VpreB”, segun se ha definido anteriormente en esta invencion, o a un fragmento de la misma.

[0027] El termino "secuencia A5" se usa en esta invencion para referirse a la secuencia de "A5”, segun se ha definido anteriormente en esta invencion, o a un fragmento de la misma.

[0028] El termino "secuencia de la cadena ligera sustituta”, segun se define en esta invencion, significa cualquier secuencia de polipeptido que comprende una "secuencia VpreB" y/o una "secuencia A5”, segun se ha definido anteriormente en esta invencion. La "secuencia de la cadena ligera sustituta”, segun se define en esta invencion, incluye especlficamente, sin limitacion, la secuencia de la VpreBI humana de la SEQ ID NO 1, las secuencias de la VpreB2 de raton de las SEQ ID NOS: 2 y 3 y la secuencia de la VpreB3 humana de la SEQ ID NO: 4 y sus varias isoformas, incluyendo las variantes de ayuste y las variantes formadas mediante modificaciones posttraduccionales, los homologos de las mismas en otras especies de mamlfero, as! como los fragmentos y las variantes de los mismos. El termino "secuencia de la cadena ligera sustituta" incluye adicionalmente, sin limitacion, la secuencia de la A5 humana de la SEQ ID NO: 6, la secuencia de raton de la SEQ ID NO: 5 y sus isoformas, incluyendo las variantes de ayuste y las variantes formadas mediante modificaciones post-traduccionales, los homologos de las mismas en otras especies de mamlfero, as! como los fragmentos y las variantes de los mismos. El termino "secuencia de la cadena ligera sustituta" incluye adicionalmente una secuencia que comprende ambas secuencias VpreB y A5 segun se ha definido anteriormente en esta invencion.

[0029] Para la estructura tridimensional del receptor de los linfocitos pre-B (pre-BCR), incluyendo la estructura de la cadena ligera sustituta (SLC) y sus componentes vease, por ejemplo, Lanig et al., Mol. Immunol. 40 (17): 1263-72 (2004).

[0030] La secuencia de la cadena ligera sustituta puede conjugarse opcionalmente con una secuencia de aminoacidos heterogenea, o con cualquier otro componente heterogeneo, para formar una "construction de cadena ligera sustituta" de esta invencion. Por lo tanto, el termino "construccion de cadena ligera sustituta" se usa en el sentido mas amplio e incluye cualquiera y todos los componentes heterogeneos adicionales, incluyendo una secuencia de aminoacidos heterogenea, un acido nucleico y otras moleculas conjugadas con una secuencia de la cadena ligera sustituta, en las que la "conjugation" se define a continuation.

[0031] En el contexto de los polipeptidos de la presente invencion, el termino "secuencia de aminoacidos heterogenea" relativa a una primera secuencia de aminoacidos, se usa para referirse a una secuencia de aminoacidos que no esta asociada de forma natural con la primera secuencia de aminoacidos, al menos no en la forma en la que esta presente en las SBP en esta invencion. Por lo tanto, una "secuencia de aminoacidos heterogenea" relativa a una VpreB es cualquier secuencia de aminoacidos que no esta asociada con una VpreB nativa en su entorno nativo, incluyendo, sin limitacion, las secuencias A5 que son diferentes de aquellas secuencias A5 que, junto con la VpreB, forman la cadena ligera sustituta en los linfocitos B en desarrollo, tales como las secuencias de aminoacidos variantes, por ejemplo, las secuencias A5 truncadas y/o derivatizadas. Una "secuencia de aminoacidos heterogenea" relativa a una VpreB tambien incluye las secuencias A5 asociadas covalentemente, por ejemplo, fusionadas, con una VpreB, incluyendo una secuencia A5 nativa, dado que, en su entorno nativo, las secuencias VpreB y A5 no estan asociadas covalentemente, por ejemplo, fusionadas entre si. Algunas secuencias de aminoacidos heterogeneas tambien incluyen, sin limitacion, secuencias de anticuerpos, que incluyen un anticuerpo y las secuencias de la cadena pesada y fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, secuencias de la region variable de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo y secuencias de la region constante de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo.

[0032] Los terminos "conjugado" y "conjugacion" se refieren a cualquiera y a todas las formas de enlaces covalentes o no covalentes e incluyen, sin limitacion, una fusion directa genetica o qulmica, un acoplamiento a traves de un conector o de un agente de reticulation y una asociacion no covalente, por ejemplo, a traves de fuerzas de Van der Waals, o mediante el uso de una cremallera de leucina.

[0033] El termino "fusion" se usa en esta invencion para referirse a la combination de secuencias de aminoacidos de diferente origen en una cadena polipeptldica mediante una combinacion en marco de sus secuencias de nucleotidos codificantes. El termino "fusion" engloba expllcitamente las fusiones internas, es decir, la insertion de secuencias de diferente origen en una cadena polipeptldica, ademas de la fusion en uno de sus terminales.

[0034] Segun se usa en esta invencion, el termino "diana" es una sustancia que interactua con un polipeptido en esta invencion. Las dianas, segun se definen en esta invencion, incluyen especlficamente antlgenos con los que interactuan las construcciones que contienen lambda-5, las construcciones que contienen VpreB, o tanto las construcciones que contienen lambda-5 como las construcciones que contienen VpreB de la presente invencion. En algunas realizaciónes, segun se define en esta invencion, las "dianas" incluyen especlficamente los antlgenos con los que interactua la cadena pesada, por ejemplo, la CDRH1, la CDRH2, la CDRH3, y cualquier combinacion de los mismos. Preferiblemente, la interaction tiene lugar mediante una union directa.

[0035] Segun se usa en esta invencion, todos los terminos "peptido”, "polipeptido" y "protelna" se refieren a una secuencia primaria de aminoacidos que estan unidos mediante "enlaces peptldicos" covalentes. En general, un peptido consiste en unos pocos aminoacidos, normalmente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 50 aminoacidos, y es mas corto que una protelna. El termino "polipeptido”, segun se define en esta invencion, engloba peptidos y protelnas.

[0036] El termino "aminoacido" o "residuo de aminoacido" normalmente se refiere a un aminoacido que tiene su definition reconocida en la materia, tal como un aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en: alanina (Ala); arginina (Arg); asparragina (Asn); acido aspartico (Asp); cistelna (Cys); glutamina (Gln); acido glutamico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val), aunque segun se desee, pueden usarse aminoacidos modificados, sinteticos o raros. Por lo tanto, los aminoacidos modificados y no habituales recogidos en el 37 CFR 1.822 (b) (4) estan incluidos especlficamente en esta definicion. Los aminoacidos pueden subdividirse en varios subgrupos. Por lo tanto, los aminoacidos pueden agruparse por tener una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val); una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar sin carga (por ejemplo, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr y Tyr). Los aminoacidos tambien pueden agruparse como aminoacidos pequenos (Gly, Ala), aminoacidos nucleofilos (Ser, His, Thr, Cys), aminoacidos hidrofobos (Val, Leu, Ile, Met, Pro), aminoacidos aromaticos (Phe, Tyr, Trp,), amidas (Asn, Gln), aminoacidos acidos (Asp, Glu) y basicos (Lys, Arg).

[0037] El termino "polinucleotido(s)" se refiere a acidos nucleicos tales como moleculas de ADN y moleculas de ^a Rⁿ y los analogos de las mismas (por ejemplo, el ADN o el ARN generado mediante el uso de analogos de nucleotidos o mediante el uso de una qulmica de acidos nucleicos). Segun se desee, los polinucleotidos pueden ser elaborados sinteticamente, por ejemplo, mediante el uso de una qulmica de acidos nucleicos reconocida en la materia, o enzimaticamente mediante el uso de, por ejemplo, una polimerasa, y si se desea, ser modificados. Algunas modificaciones tlpicas incluyen metilacion, biotinilacion y otras modificaciones conocidas en la materia. Ademas, la molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria y, cuando se desee, estar unida a una fraccion detectable.

[0038] El termino "variante" con respecto a un polipeptido de referencia se refiere a un polipeptido que posee al menos una mutacion o modificacion de aminoacido (es decir, una alteration) en comparacion con un polipeptido nativo. Las variantes generadas mediante "modificaciones de un aminoacido" pueden ser producidas, por ejemplo, mediante una sustitucion, una deletion, una insertion y/o una modificacion qulmica de al menos un aminoacido de la secuencia nativa de aminoacidos.

[0039] Una "modificacion de un aminoacido" se refiere a un cambio en la secuencia de aminoacidos de una secuencia de aminoacidos predeterminada. Algunos ejemplos de modificaciones incluyen una sustitucion, una insercion y/o una delecion de un aminoacido.

[0040] Una "modificacion de un aminoacido en" una position especlfica se refiere a la sustitucion o la delecion del residuo especificado, o a la insercion de al menos un residuo de aminoacido adyacente al residuo especificado. Por insercion "adyacente" a un residuo especificado se entiende la insercion en entre uno y dos residuos del mismo. La insercion puede ser N terminal o C terminal al residuo especificado.

[0041] Una "sustitucion de un aminoacido" se refiere a la sustitucion de al menos un residuo de aminoacido existente en una secuencia de aminoacidos predeterminada por otro residuo de aminoacido de "sustitucion" diferente. El o los residuos de sustitucion pueden ser "residuos de aminoacidos naturales" (es decir, codificados por el codigo genetico) y seleccionados entre el grupo que consiste en: alanina (Ala); arginina (Arg); asparragina (Asn); acido aspartico (Asp); cistelna (Cys); glutamina (Gln); acido glutamico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). La sustitucion por uno o mas residuos de aminoacidos no naturales tambien esta englobada por la definicion de una sustitucion de un aminoacido en esta invention.

[0042] Un "residuo de aminoacido no natural" se refiere a un residuo, distinto a los residuos de aminoacidos que aparecen de forma natural indicados anteriormente, que es capaz de unirse covalentemente a un(os) residuo(s) de aminoacidos(s) adyacente(s) en una cadena polipeptldica. Algunos ejemplos de residuos de aminoacidos no naturales incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros analogos de un residuo de aminoacido tales como los descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301 336 (1991). Para generar dichos residuos de aminoacidos no naturales, pueden usarse los procedimientos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) y de Ellman et al., supra. En resumen, estos procedimientos implican la activation qulmica de un ARNt supresor con un residuo de aminoacido no natural, seguida de una transcription y una traduction in vitro del ARN.

[0043] Una "insercion de un aminoacido" se refiere a la incorporation de al menos un aminoacido en una secuencia de aminoacidos predeterminada. Aunque la insercion consistira habitualmente en la insercion de uno o dos residuos de aminoacidos, la presente solicitud contempla unas "inserciones peptldicas" mayores, por ejemplo, la insercion de entre aproximadamente tres y aproximadamente cinco o incluso hasta aproximadamente diez residuos de aminoacidos. El (los) residuo(s) insertado(s) pueden ser naturales o no naturales, como se ha descrito mas arriba.

[0044] Una "delecion de un aminoacido" se refiere a la elimination de al menos un residuo de aminoacido de una secuencia de aminoacidos predeterminada.

[0045] El termino "mutagenesis" se refiere, salvo que se especifique de otro modo, a cualquier tecnica reconocida en la materia para la alteracion de una secuencia de polinucleotidos o de polipeptidos. Algunos tipos preferidos de mutagenesis incluyen una mutagenesis mediante una PCR con tendencia a error, una mutagenesis por saturacion u otras mutagenesis dirigidas.

[0046] La "mutagenesis dirigida" es una tecnica convencional en la materia y se lleva a cabo mediante el uso de un cebador oligonucleotldico sintetico complementario de un ADN de fago monocatenario que va a ser mutagenizado excepto por un malapareamiento limitado, que representa la mutacion deseada. En resumen, se usa un oligonucleotido el sintetico como cebador para la slntesis directa de una hebra complementaria del ADN de fago monocatenario, y el ADN bicatenario resultante es transformado en una bacteria hospedadora que soporta el fago. Los cultivos de las bacterias transformadas se colocan en placas con la parte superior de agar, lo que permite la formacion de placas a partir de celulas individuales que portan el fago. Teoricamente, el 50 % de las nuevas placas contendra el fago que tiene, como unica hebra, la forma mutada; el 50 % tendra la secuencia original. Las placas de interes son seleccionadas mediante una hibridacion con un cebador sintetico cinasado a una temperatura que permite la hibridacion de un emparejamiento exacto, pero a la cual los malapareamientos con la hebra original son suficientes para impedir la hibridacion. A continuacion, se seleccionan las placas que hibridan con la sonda, se secuencian y se cultivan, y se recupera el ADN.

[0047] En el contexto de la presente invencion, el termino "anticuerpo" (Ac) se usa en su sentido mas amplio. Este incluye, por ejemplo, un anticuerpo nativo formado tanto por una cadena pesada recombinada, un producto derivado normalmente de la recombinacion genica V(D)J, como una cadena ligera recombinada, tambien un producto derivado normalmente de la recombinacion genica VJ, o un fragmento las mismas.

[0048] Un "anticuerpo nativo" es una glicoprotelna heterotetramerica de aproximadamente 150.000 daltons, formada por dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada mediante puentes de disulfuro covalentes, mientras que el numero de puentes de disulfuro varla entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes de disulfuro intracatenarios separados con regularidad. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (V^h) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que algunos residuos de aminoacidos en particular forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la pesada, Chotia et al, J. Mol. Biol. 186: 651 (1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 4592 (1985).

[0049] El termino "anticuerpo monoclonal", segun se usa en esta invencion, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de, o preparado en forma de, una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones naturales que pueda haber presentes en unas cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy especlficos, estando dirigidos contra un unico sitio antigenico. Adicionalmente, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epltopos), cada anticuerpo monoclonal normalmente esta dirigido contra un unico determinante del antlgeno. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados mediante el uso de cualquier tecnica reconocida en la materia y aquellas que se describen en esta invencion tales como, por ejemplo, un metodo con hibridoma, segun describen Kohler et al. (1975) Nature, 256: 495, un animal transgenico, segun describen, por ejemplo, (vease, por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859), metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 4.816.567) o mediante el uso de colecciones de anticuerpos en fago mediante el uso de las tecnicas descritas, por ejemplo, en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos quimericos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados, y pueden aparecer de forma natural o ser producidos recombinantemente.

[0050] El termino "anticuerpo recombinante" se refiere a anticuerpos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante un medio recombinante, tal como (a) los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para los genes de la inmunoglobulina (por ejemplo, para los genes de una inmunoglobulina humana) o de un hibridoma preparado a partir del mismo, (b) los anticuerpos aislados a partir de una celula hospedadora transformada para que exprese el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) los anticuerpos aislados a partir de una coleccion combinatoria de anticuerpos recombinantes (por ejemplo, que contienen secuencias de anticuerpos humanos) mediante el uso de una expresion en fago y (d) los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implica el ayuste de las secuencias genicas de una inmunoglobulina (por ejemplo, los genes de una inmunoglobulina humana) con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes pueden tener unas regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de una llnea germinal humana. Sin embargo, en ciertas realizaciónes, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a una mutagenesis in vitro, y por lo tanto, las secuencias de aminoacidos de las regiones V^{h y} V^l de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de, y estan relacionadas con, las secuencias V^{h y} V^l de la llnea germinal humana, no pueden existir de forma natural en el repertorio de anticuerpos de la llnea germinal humana in vivo.

[0051] El termino "inmunoglobulina quimerica" o "anticuerpo quimerico" se refiere a una inmunoglobulina o a un anticuerpo o a una SBP con al menos una region variable derivada de una primera especie, y al menos una region constante derivada de una segunda especie. Las inmunoglobulinas o los anticuerpos o las SBP quimericas pueden construirse, por ejemplo, mediante ingenierla genetica.

[0052] El termino "anticuerpo humano", segun se usa en esta invencion, pretende incluir los anticuerpos que tienen unas regiones variables en las que tanto las regiones en marco como las CDR derivan de las secuencias de inmunoglobulinas de la llnea germinal humana segun describen, por ejemplo, Kabat et al. (vease Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publication del NIH n.° 91-3242). Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una region constante, la region constante tambien deriva de las secuencias de inmunoglobulinas de la llnea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoacidos que no estan codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la llnea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante una mutagenesis aleatoria o especlfica in vitro o mediante una mutation somatica in vivo). Sin embargo, el termino "anticuerpo humano", segun se usa en esta invencion, no pretende incluir los anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR que derivan de la llnea germinal de otras especies de mamlferos, tales como un raton, en secuencias en marco humanas.

[0053] El anticuerpo humano puede tener al menos uno o mas aminoacidos sustituidos por un residuo de aminoacido, por ejemplo, un residuo de aminoacido que mejora la actividad que no esta codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la llnea germinal humana. El anticuerpo humano puede tener veinte o mas posiciones sustituidas por residuos de aminoacidos que no son parte de la secuencia de la inmunoglobulina de la llnea germinal humana. En algunas realizaciónes, estas sustituciones estan en las regiones de CDR segun se escribe con detalle a continuation.

[0054] El termino "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina o a un anticuerpo que incluye al menos una cadena humanizada de una inmunoglobulina o de un anticuerpo (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada). El termino "cadena de inmunoglobulina humanizada" o "cadena de anticuerpo humanizada" (es decir, una "cadena ligera de una inmunoglobulina humanizada" o una "cadena pesada de una inmunoglobulina humanizada") se refiere a una cadena de una inmunoglobulina o de un anticuerpo (es decir, una cadena ligera o una pesada, respectivamente) que tiene una region variable que incluye una region variable en marco sustancialmente de una inmunoglobulina o de un anticuerpo humano, y unas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (por ejemplo, al menos una CDR, preferentemente dos CDR, mas preferentemente tres CDR) sustancialmente de una inmunoglobulina o de un anticuerpo no humano, y que incluye ademas unas regiones constantes (por ejemplo, al menos una region constante o una portion de la misma, en el caso de una cadena ligera, y preferentemente tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada). El termino "region variable humanizada" (por ejemplo, "region variable humanizada de la cadena ligera" o "region variable humanizada de la cadena pesada") se refiere a una region variable que incluye una region variable en marco sustancialmente de una inmunoglobulina o de un anticuerpo humano, y unas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) sustancialmente de una inmunoglobulina o de un anticuerpo no humano.

[0055] Una protelna y/o un anticuerpo de union "biespeclfico" o "bifuncional" Surrobody™ es un hlbrido artificial de una SBP y/o de un anticuerpo que tiene dos pares diferentes de cadena pesada/ligera y dos o mas sitios de union diferentes. Las SBP y/o los anticuerpos biespeclficos pueden ser producidos mediante una diversidad de procedimientos que incluyen la fusion de hibridomas o la union de fragmentos Fab'. Vease, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553. En algunas realizaciónes, una SBP o un anticuerpo biespeclfico incluye sitios de union tanto para el DR4 como para el DR5. En algunas realizaciónes, la SBP o el anticuerpo biespeclfico se une a, y/o activa, el DR4 y el DR5. En algunas realizaciónes, el anticuerpo y/o la SBP biespeclfica induce la apoptosis en las celulas que comprenden el DR4 y/o el DR5.

[0056] Segun se usa en esta invencion, un anticuerpo "heterologo" se define en relation con el organismo no humano o la planta transgenica que produce dicho un anticuerpo.

[0057] Un anticuerpo "aislado", segun se usa en esta invencion, pretende referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especlficamente a un DR5 esta sustancialmente exento de anticuerpos que se unen especlficamente a antlgenos distintos al DR5). Ademas, un anticuerpo aislado normalmente esta exento de otros materiales y/o de protelnas celulares. En algunas realizaciónes, una combination de anticuerpos "aislados" que tienen diferentes especificidades de union al DR4 y/o al DR5 se combinan en una composition bien definida.

[0058] Segun se usa en esta invencion, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) o de SBP que esta codificada por los genes de la region constante de la cadena pesada. En algunas realizaciónes, un anticuerpo o una porcion de union al antlgeno del mismo es de un isotipo seleccionado entre un isotipo de anticuerpo de una IgG1, de una IgG2, de una IgG3, de una IgG4, de una IgM, de una IgAI, de una IgA2, de una IgAsec, de una IgD o de una IgE. En algunas realizaciónes, un anticuerpo es del isotipo IgG1. En algunas realizaciónes, un anticuerpo es del isotipo IgG2.

[0059] Segun se usa en esta invencion, "cambio de isotipo" se refiere al fenomeno mediante el cual la clase, o el isotipo, de un anticuerpo cambia desde una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.

[0060] Segun se usa en esta invencion, "isotipo no cambiado" se refiere a la clase isotlpica de cadena pesada que se produce cuando no ha tenido lugar ningun cambio de isotipo; el gen CH que codifica el isotipo no cambiado es normalmente el primer gen CH inmediatamente secuencia abajo del gen VDJ reordenado funcionalmente. El cambio de isotipo se ha clasificado como cambio de isotipo clasico o no clasico. El cambio de isotipo clasico se produce mediante acontecimientos de recombinacion que implican al menos una region de secuencia cambiada en un gen que codifica un anticuerpo.

[0061] El cambio de isotipo no clasico puede producirse, por ejemplo, mediante una recombinacion homologa entre sigma^mu humano y .SIGMA^mu humano (delecion asociada a .delta.). Pueden producirse algunos mecanismos de cambio alternativos no clasicos, tales como una recombinacion intertransgenica y/o intercromosomica, entre otros, y efectuar el cambio de isotipo.

[0062] El termino "variable" con referencia a las cadenas de SBP o de anticuerpo (para las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, pero no para la cadena ligera sustituta) se usa para referirse a las porciones de las cadenas de una SBP y/o de un anticuerpo que difieren ampliamente en la secuencia entre las cadenas pesadas de una SBP o de un anticuerpo y participan en la union y en la especificidad de cada SBP y/o anticuerpo en particular para su antlgeno en particular. Dicha variabilidad esta concentrada en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada para los anticuerpos (y solo de los dominios variables de la cadena pesada para las SBP (pero en los dominios variables tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera para los anticuerpos). Las porciones mas conservadas de los dominios variables se denominan region en marco (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas de un anticuerpo comprende cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan en su mayor parte una configuracion en lamina p, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles de conexion con, y en algunos casos, que forman parte de, la estructura en lamina p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen unidas en una estrecha proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formation del sitio de union al antlgeno de los anticuerpos (vease, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), paginas 647-669). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo y/o de una SBP a un antlgeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participation del anticuerpo y/o de la SBP en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo o dependiente de la SBP, respectivamente.

[0063] El termino "region hipervariable", cuando se usa en esta invencion, se refiere a los residuos de aminoacidos de un anticuerpo y/o de una SBP que son fundamentalmente responsables de la union al antlgeno. La region hipervariable comprende los residuos de aminoacidos de una "region determinante de la complementariedad" o "CDR" que tiene una gran propension a entrar en contacto con la diana (es decir, los residuos 30-35 (HI), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; MacCallum et al., J Mol Biol. 262 (5): 732-45 (1996)). Alternativamente, estan definidas por otros a regiones similares, vease Chotia y/o Kabat.

[0064] El termino "region de bucle" ("LR"), "region LR1" y "LR2" representa una region de la VpreB que forma una estructura en bucle adyacente, o proxima, a las CDR de la cadena pesada. La "region de bucle" o "region LR3" tambien puede representar la pequena estructura en bucle predicha (de aproximadamente 10 aminoacidos de longitud) creada a traves de la fusion recombinante de 1) la VpreB y la A5, o 2) la VpreB y la cadena ligera constante que puede contener una region J, o 3) la region ligera variable, con o sin una region J, y la A5.

[0065] El termino "region en marco" se refiere a las porciones de la region variable de un anticuerpo y/o de una SBP reconocidas en la materia que existen entre las regiones mas divergentes. Dichas regiones en marco se denominan normalmente en marco 1 hasta 4 (FR1, FR2, FR3 y FR4) y proporcionan un armazon para sostener, en el espacio tridimensional, las tres CDR que se encuentran en la region variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo y/o de una SBP, de forma que las CDR pueden formar una superficie de union al antlgeno. Como apreciaran los expertos en la materia, son posibles variaciones menores y estan contempladas para varias realizaciónes que implican regiones en marco. El termino “region FR analoga”, “region FR1 analoga”, “region FR2 analoga”, “region FR3 analoga” o “region FR4 analoga” representa una region de la VpreB o de la A5 que de otro modo se corresponded con una region FR (o la region FR1, FR2, FR3 o FR4 respectivamente) de la cadena ligera de un anticuerpo, o que de otro modo es adyacente a las "regiones en bucle".

[0066] Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden ser asignados a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA y IgA2.

[0067] Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 5, £, y y p, respectivamente.

[0068] Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), sobre la base de las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes. Cualquier referencia a una cadena ligera de un anticuerpo en esta invention incluye ambas cadenas ligeras k y A.

[0069] Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una portion de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la union al antlgeno o un dominio variable del mismo. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')², Dab, scFv y (scFv)². Los "fragmentos de una SBP" comprenden una porcion correspondiente de una SBP de longitud completa, generalmente la union al antlgeno o un dominio variable del mismo. Algunos ejemplos de fragmentos de una SBP incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una SBP monovalente, de una SBP monovalente', Sab, Sab', S(ab')², scSv y (scSv)². El termino "protelna de union sustituta" o "SBP" engloba tanto las globulinas sustitutas de longitud completa (SBP bivalente) como los fragmentos de union de las mismas, que incluyen, pero no se limitan a, una SBP monovalente, una SBP bivalente, (de 2 piezas o de 3 piezas), una SBP de cadena unica (scSv) y/o un dominio SLC

[0070] Segun se usa en esta invencion el termino "region de union del anticuerpo" se refiere a una o mas porciones de una inmunoglobulina o de la region variable de un anticuerpo capaz de unirse a una diana. Normalmente, la region de union del anticuerpo es, por ejemplo, una cadena ligera de un anticuerpo (VL) (o la region variable de la misma), una cadena pesada de un anticuerpo (VH) (o la region variable de la misma), una region Fd de la cadena pesada, una cadena ligera y pesada de un anticuerpo combinadas (o la region variable de las mismas) tales como un Fab, un F(ab')², un dominio individual o un anticuerpo de cadena unica (scFv), o un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG (por ejemplo, un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM. Algunos ejemplos de las regiones de union de anticuerpos englobadas en el termino incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')², un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios V^{h y} CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios V^l y V^h de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un dAb que incluye los dominios VH y VL; (vi) un fragmento de un dAb (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546), que consiste en un dominio V^h; (vii) un dAb que consiste en un dominio VH o VL; y (viii) una region determinante de la complementariedad aislada (CDR) o (ix) una combination de dos o mas CDR aisladas que opcionalmente pueden estar unidas por un conector sintetico. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V^l y V^h, estan codificados por genes diferentes, pueden ser unidos mediante el uso de procedimientos recombinantes a traves de un conector sintetico que les permite ser formados como una cadena proteica individual en la que las regiones V^l y V^h se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena unica (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242, 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85, 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena unica tambien pretenden estar englobados en el termino "region de union del anticuerpo" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante el uso de las tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos son cribados para evaluar su utilidad de la misma forma que lo son los anticuerpos intactos. Las regiones de union de los anticuerpos pueden ser producidas mediante tecnicas de ADN recombinante, o mediante una escision enzimatica o qulmica de inmunoglobulinas intactas.

[0071] Segun se usa en esta invencion, el termino "protelna de union sustituta" o "SBP" se refiere a una o mas porciones de la region variable de una protelna de union sustituta o SBP capaz de unirse a un antlgeno o antlgenos. En algunas realizaciónes, la region de union de la SBP es o incluye, por ejemplo, una cadena pesada de un anticuerpo (VH) (o la region variable de la misma), una region Fd de una cadena pesada, una VpreB y/o una lambda 5 y una cadena pesada de un anticuerpo (o la region variable de la misma) tales como una SBP monovalente, una S(ab')² (una estructura de tipo F(ab')²) o una SBP de cadena unica (scSv), o una globulina sustituta de longitud completa (una SBP bivalente). Algunos ejemplos de regiones de union de la SBP englobadas en el termino incluyen (i) una globulina sustituta que se refiere a una protelna de union bivalente que incluye la VpreB1 y/o la lambda 5 o el CL o, el VL y la lambda 5, el V^h, el dominio CH1 y un Fc (los dominios ^c H2 y CH3); (ii) un fragmento de una SBP monovalente, fragmento monovalente que incluye la VpreB1 y/o la lambda 5 o el CL, los dominios V^{h y} CH1; (iii) un fragmento S(ab')², un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de una SBP monovalente unidos por un puente de disulfuro en la region de bisagra; (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios V^h y CH1; (v) un fragmento Sv que incluye la VpreB y/o la lambda 5 y los dominios V^h de un unico brazo de un anticuerpo, (vi) un dAb que incluye los dominios VH y la VpreB y/o la lambda 5; (vll) un fragmento de un dAb (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546), que incluye un dominio V^h; (viii) un dAb que incluye un dominio VH o la VpreB y/o la lambda 5; y (ix) una region determinante de la complementariedad aislada (CDR) o (x) una combinacion de dos o mas CDR aisladas que opcionalmente pueden estar unidas por un conector sintetico. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Sv, de la VpreB y/o de la lambda 5 y el V^H, estan codificados por genes diferentes, pueden ser unidos mediante el uso de procedimientos recombinantes a traves de un conector sintetico que les permite ser formados como una cadena proteica individual en la que las regiones VpreB y/o lambda 5 y V^h se emparejan para formar moleculas monovalentes (indicadas aqul como Sv de cadena unica (scSv); para las correspondientes correlaciones con los anticuerpos vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242, 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85, 5879-5883). Tambien se pretende que dichas SBP de cadena unica esten englobadas en el termino "region de union de una SBP" de una SBP. Estos fragmentos SBP se obtienen mediante el uso de las tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos son cribados para evaluar su utilidad de la misma forma que lo son los anticuerpos o las SBP intactas. Las regiones de union de la SBP pueden ser producidas mediante tecnicas de ADN recombinante, o mediante una escision enzimatica o qulmica de las globulinas sustitutas intactas.

[0072] En algunas realizaciónes, la CDR de la cadena pesada es la CDR1, la CDR2 o la CDR3. En algunas realizaciónes, se incluyen dos CDR de la cadena pesada y pueden seleccionarse entre la CDR1 y la CDR2, la CDR2 y la CDR3, o la CDR1 y la CDR3. En algunas realizaciónes, la SBP comprende una secuencia de la cadena ligera sustituta y una cadena pesada CDR1 (HCDR1), una cadena pesada CDR2 (HCDR2) y una cadena pesada CDR3 (HCDR3). En algunas realizaciónes, la SBP comprende una secuencia de la cadena ligera sustituta y una region variable de la cadena pesada. En algunas realizaciónes, la SBP comprende una secuencia de la cadena ligera sustituta y una secuencia de la cadena pesada. El termino SBP tambien incluye las SBP monovalentes, la SBP bivalente y otras formas o variaciones de las estructuras de tipo anticuerpo (incluyendo las detalladas en esta invention, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')², scFv y (scFv)², excepto, por ejemplo, con al menos una secuencia de la VpreB y/o de la lambda 5 en lugar de la correspondiente section de la cadena ligera).

[0073] Segun se usa en esta invencion el termino "region de union" se refiere a una o mas porciones de una protelna de union, tal como una SBP, capaz de unirse a una diana. Normalmente, la region de union es, por ejemplo, una cadena ligera de un anticuerpo (VL) (o la region variable de la misma y/o una cadena ligera sustituta), una cadena pesada de un anticuerpo (VH) (o la region variable de la misma), una region Fd de una cadena pesada, una cadena ligera (y/o una cadena ligera sustituta) y una cadena pesada (o la region variable de las mismas) de un anticuerpo combinadas, tales como un Fab, un F(ab')², un dominio individual o un anticuerpo de cadena unica (scFv), o un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG (por ejemplo, un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgAI, IgA2, IgD, IgE o IgM. En algunas realizaciónes se emplea la secuencia de la lambda 5 y/o la secuencia de la VpreB en lugar de una cadena ligera de un anticuerpo o de un fragmento de la misma.

[0074] El termino "epltopo" segun se usa en esta invencion, se refiere a una secuencia de al menos aproximadamente entre 3 y 5, preferentemente de al menos aproximadamente entre 5 y 10, o de al menos aproximadamente entre 5 y 15 aminoacidos y normalmente de no mas de aproximadamente 500, o de aproximadamente 1.000 aminoacidos, que define una secuencia que por si misma, o como parte de una secuencia mayor, es unida por una SBP y/o por un anticuerpo. Un epltopo no esta limitado a un polipeptido que tiene una secuencia identica a la portion de la protelna parental de la que deriva. De hecho, los genomas vlricos estan en un estado de cambio constante y muestran unos grados de variabilidad relativamente aislados entre las cepas vlricas aisladas. Por lo tanto, el termino "epltopo" engloba secuencias identicas a la secuencia nativa, as! como modificaciones, tales como deleciones, sustituciones y/o inserciones en la secuencia nativa. Generalmente, dichas modificaciones son de naturaleza conservativa, pero tambien se contemplan modificaciones no conservativas. El termino incluye especlficamente los "mimotopos”, es decir, las secuencias que no identifican una secuencia lineal continua nativa o que no aparecen necesariamente en una protelna nativa, pero que funcionalmente simulan un epltopo en una protelna nativa. El termino "epltopo" incluye especlficamente los epltopos lineales y conformacionales.

[0075] El termino "vector" se usa para referirse a una molecula de ADNr capaz de una replication autonoma en una celula y a la que puede unirse operativamente un segmento de ADN, por ejemplo, un gen o un polinucleotido, de forma que se produzca la replicacion del segmento unido. Los vectores capaces de dirigir la expresion de genes que codifican uno o mas polipeptidos se denominan en esta invencion "vectores de expresion". El termino "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador en particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de union al ribosoma. Se sabe que las celulas eucariotas utilizan promotores, senales de poliadenilacion y potenciadores.

[0076] Un acido nucleico esta "unido operativamente" cuando esta colocado en una relation funcional con otra secuencia de un acido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia presecretora o llder esta unido operativamente al ADN para un polipeptido si es expresado en forma de una preprotelna que participa en la secretion del polipeptido; un promotor o un potenciador esta unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcription de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma esta unido operativamente a una secuencia codificante si esta posicionado de forma que facilite la traduction. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se estan uniendo son contiguas, y en el caso de un llder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La union se lleva a cabo mediante la ligation en los sitios de restriction convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan los adaptadores o conectores de oligonucleotidos sinteticos segun la practica convencional.

[0077] Un "banco de expresion en fago" es un banco de expresion de protelnas que expresa una coleccion de secuencias de protelnas clonadas en forma de fusiones con una protelna que recubre un fago. Por lo tanto, la frase "banco de expresion en fago" se refiere en esta invencion a una coleccion de fagos (por ejemplo, de fagos filamentosos) en la que el fago expresa una protelna externa (normalmente heterologa). La protelna externa esta exenta de interaccion (de union) con otras fracciones con las que los fagos estan en contacto. Cada fago que expresa una protelna externa es un "miembro" del banco de expresion en fago.

[0078] El termino "fago filamentoso" se refiere a una partlcula vlrica capaz de mostrar un polipeptido heterogeneo en su superficie, e incluye, sin limitacion, f1, fd, Pf1 y M13. El fago filamentoso puede contener un marcador seleccionable tal como tetraciclina (por ejemplo, "fd-tet"). Varios sistemas de expresion en fago filamentoso son bien conocidos por los expertos en la materia (vease, por ejemplo, Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980), Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985); y Parmley y Smith Gene 73: 305-318 (1988)).

[0079] El termino "seleccion" se usa se usa para referirse a las multiples rondas del proceso de cribado en la identification y el aislamiento de los fagos portadores de compuestos, tales como anticuerpos, con una elevada afinidad y especificidad por una diana.

[0080] El termino "activation" segun se usa en esta invencion, se refiere a cualquier aumento estadlsticamente significativo en la actividad biologica. Por ejemplo, "activacion" puede referirse a un aumento de aproximadamente el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 % en la actividad biologica. En algunas realizaciónes, la actividad biologica puede ser la apoptosis.

[0081] El termino "inhibition", segun se usa en esta invencion, se refiere a cualquier disminucion estadlsticamente significativa en la actividad biologica. Por ejemplo, "inhibicion" puede referirse a una disminucion de aproximadamente el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 % en una actividad biologica. En algunas realizaciónes, la actividad biologica puede ser la proliferacion celular.

[0082] Los terminos "tratar" o "prevenir" no requieren un tratamiento completo ni una prevention completa en todas las condiciones. Una ralentizacion en la aparicion de un trastorno o de sus slntomas o una disminucion en los slntomas puede ser una "prevencion" adecuada en algunas realizaciónes. De forma analoga, una disminucion en la gravedad de los slntomas del trastorno tambien puede ser un tratamiento eficaz para un trastorno.

[0083] El termino "secuencia consenso", segun se usa en esta invencion con respecto a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), se refiere a una secuencia compuesta o generica de una CDR que ha sido definida sobre la base de la information relativa a los residuos de aminoacidos de la CDR que son susceptibles de una modification sin perjudicar a la union al antlgeno. Por lo tanto, en una "secuencia consenso" de una CDR, ciertas posiciones de aminoacidos estan ocupadas por uno de los multiples posibles residuos de aminoacidos en esa position. Por ejemplo, en una CDR, si se ha encontrado que la union al antlgeno no se ve afectada por la presencia de una tirosina o de una fenilalanina en una posicion en particular, entonces esa posicion en particular de la secuencia consenso puede ser bien una tirosina o bien una fenilalanina (Y/F). Las secuencias consenso de las CDR pueden ser definidas, por ejemplo, mediante una mutagenesis de cribado (por ejemplo, una mutagenesis de cribado de alanina) de los residuos de aminoacidos del anticuerpo y/o de las CDR de la SBP, seguida por una evaluation de la union de los mutantes al antlgeno para determinar si la posicion del aminoacido mutado afecta a la union al antlgeno.

[0084] Segun se usa en esta invencion, los terminos "union especifica”, "se une especlficamente”, "union selectiva” y "se une selectivamente”, significan que una SBP, una portion de union al antlgeno de la misma o un anticuerpo muestran una afinidad apreciable por un antlgeno o un epltopo en particular y, generalmente, no muestran una union no especifica significativa a otros antlgenos y epltopos. Una union "apreciable" o preferida incluye la union con una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M-1 o 1010 M-1. Son mas preferidas unas afinidades mayores de 107 M-1, preferentemente mayores de 108 M-1. Tambien se pretende que los valores intermedios de los establecidos en esta invencion esten en el ambito de la presente invencion, y una afinidad de union preferida puede estar indicada en forma de un intervalo de afinidades, por ejemplo, de entre 106 y 1010 M-1, preferentemente de entre 107 y 1011 M-1, mas preferentemente de entre 108 y 1012 M-1. Un anticuerpo y/o una SBP que "no muestra una union no especifica significativa" es aquella que no se unira apreciablemente a una entidad indeseable (por ejemplo, una entidad proteica indeseable). Por ejemplo, en algunas realizaciónes, un anticuerpo y/o una SBP o una porcion de union al antlgeno de los mismos que se une especlficamente a un DR5 se unira apreciablemente a esa molecula de DR5, pero no reaccionara significativamente con otras moleculas de protelnas o peptidos de receptores de muerte y de un receptor que no es de muerte. En algunas realizaciónes, puede considerarse que un anticuerpo, una porcion de union al antlgeno del mismo o una SBP "se une especlficamente" a dos o mas antlgenos o epltopos, por ejemplo, si muestra una afinidad apreciable por los dos o mas antlgenos o epltopos en particular, pero no muestra una significativa reactividad cruzada con otros antlgenos o con otros epltopos. Por ejemplo, en algunas realizaciónes, un anticuerpo y/o una SBP o una porcion de union al antlgeno de los mismos que se une especlficamente a un DR4 y a un DR5 se unira apreciablemente a ambas moleculas de DR4 y de DR5, pero no reaccionara significativamente con otras moleculas de proteinas o peptidos de receptores de muerte y de un receptor que no es de muerte. La union especifica o selectiva puede ser determinada y analizada segun cualquier medio reconocido en la materia para la determinacion de dicha union, incluyendo, por ejemplo, segun un analisis de Scatchard y/o ensayos de union competitiva.

[0085] El termino "K^d”, segun se usa en esta invencion, pretende referirse a la constante de disociacion en equilibrio de una SBP y/o de una interaccion anticuerpo-antigeno en particular o a la afinidad de un anticuerpo y/o de una SBP por un antigeno, medida preferentemente mediante el uso de un ensayo de resonancia de plasmon superficial (por ejemplo, segun se determina con un instrumento BIACORE 3000 (GE Healthcare) mediante el uso de un DR4 o de un DR5 recombinante como analito(s) y del anticuerpo y/o de la SBP como ligando) o de un ensayo de union celular. En algunas realizaciónes, la SBP, la porcion de union al antigeno y/o el anticuerpo, se une a un antigeno (por ejemplo, al DR5 y/o al DR4) con una afinidad (K^d) de 50 nM o mejor (es decir, o menor) (por ejemplo, de 40 nM o de 30 nM o de 20 nM o de 10 nM o menos). En algunas realizaciónes en particular, una SBP, una porcion de union al antigeno y/o un anticuerpo, se une al DR5 y/o al DR4 con una afinidad (K^d) de 8 nM o mejor (por ejemplo, de 7 nM, de 6 nM, de 5 nM, de 4 nM, de 2 nM, de 1,5 nM, de 1,4 nM, de 1,3 nM, de 1 nM, de 0,5 nM, de 0,1 nM, de 0,05 nM o menos. En algunas realizaciónes, una SBP, una porcion de union al antigeno y/o un anticuerpo, se une a un antigeno (por ejemplo, al DR5 y/o al DR4) con una afinidad (K^d) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como de aproximadamente menos de 10^-8 M, de 10^-9 M o de 10^-10 M o incluso menor, y se une al antigeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por la union a un antigeno no especifico (por ejemplo, BSA, caseina) distinto al antigeno predeterminado o a un antigeno estrechamente relacionado. El termino "K^off”, segun se usa en esta invencion, pretende referirse a la constante de la velocidad de disociacion para la disociacion de una SBP y/o de un anticuerpo del complejo anticuerpo y/o SBP/antigeno.

[0086] El termino "CE⁵⁰”, segun se usa en esta invencion, se refiere a la concentracion de una SBP o de una porcion de union al antigeno de la misma y/o de un anticuerpo, que induce una respuesta, tanto en un ensayo in vitro como in vivo, que es el 50 % de la respuesta maxima, es decir, a mitad de camino entre la respuesta maxima y la situacion inicial.

[0087] El termino "natural" segun se usa en esta invencion al aplicarse a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de un polipeptido o de un polinucleotido que esta presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislada a partir de una fuente de la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio, es natural.

[0088] Una "secuencia consenso" es una secuencia formada por los aminoacidos (o nucleotidos) que aparecen mas frecuentemente en una familia de secuencias relacionadas (vease, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de proteinas, cada posicion de la secuencia consenso esta ocupada por el aminoacido que aparece mas frecuentemente en esa posicion en la familia. Si dos aminoacidos aparecen con la misma frecuencia, puede incluirse cualquiera en la secuencia consenso. Un "marco consenso" de una inmunoglobulina se refiere a una region en marco de la secuencia consenso de la inmunoglobulina.

[0089] En algunas realizaciónes se proporcionan anticuerpos y/o SBP que se unen al mismo epitopo, o a uno solapante, que los anticuerpos y/o las s Bp para los que se describen las secuencias de aminoacidos de esta invencion, por ejemplo, anticuerpos y/o SBP que compiten por la union al DR5 y/o al DR4, o que se unen a epitopos que se solapan con los epitopos unidos por los anticuerpos o las SBP descritos en esta invencion. Las SBP y/o los anticuerpos que reconocen el mismo epitopo pueden ser identificados mediante el uso de tecnicas rutinarias tales como un inmunoensayo, por ejemplo, mostrando la capacidad de un anticuerpo y/o de una SBP para bloquear la union de otro anticuerpo y/o de otra SBP a un antigeno diana, es decir, un ensayo de union competitiva. La union competitiva se determina en un ensayo en el que la inmunoglobulina de prueba inhibe la union especifica de un anticuerpo y/o de una SBP de referencia a un antigeno comun, tal como un DR5 y/o un DR4. Se conocen numerosos tipos de ensayos de union competitiva, por ejemplo: un radioinmunoensayo directo o indirecto en fase solida (RIA), un inmunoensayo enzimatico directo o indirecto en fase solida (EIA), un ensayo de competicion en sandwich (vease Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9: 242); un EIA directo en fase solida con biotinaavidina (vease, Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137: 3614); un ensayo directo en fase solida marcado, un ensayo en sandwich directo en fase solida marcado (vease Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); un RIA en fase solida directo marcado mediante el uso de un marcador de 1-125 (vease Morel et al., (1988) Mol. Immunol. 25 (1): 7); un EIA directo en fase solida con biotina-avidina (Cheung et al., (1990) Virology 176: 546); y un RIA directo marcado (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32: 77). Normalmente, dicho ensayo implica el uso de un antigeno purificado (por ejemplo, un DR5 y/o un DR4) unido sobre una superficie solida o a celulas portadoras de alguno de estos, de una globulina sustituta de prueba sin marcar y de una inmunoglobulina de referencia marcada y/o de una SBP. La inhibicion competitiva se mide mediante la determinacion de la cantidad de marcador unido a la superficie solida o a las celulas en presencia de la globulina sustituta de prueba. Normalmente, la globulina sustituta de prueba esta presente en exceso. Normalmente, cuando hay presente un exceso de anticuerpo y/o de SBP competitivos, inhibira especificamente la union de un anticuerpo de referenda y/o de una SBP a un antlgeno comun en al menos un 50-55 %, un 55-60 %, un 60-65 %, un 65-70 %, un 70-75 % o mas.

[0090] El termino "muestra" se refiere a un tejido, a un fluido corporal o a una celula de un paciente o de un sujeto. Normalmente, el tejido o la celula seran extraldos del paciente, pero tambien se contempla un diagnostico in vivo. En el caso de un tumor solido puede tomarse una muestra de tejido del tumor extraldo quirurgicamente y prepararse para su prueba mediante las tecnicas convencionales. En el caso de linfomas y de leucemias, pueden obtenerse linfocitos, celulas leucemicas o tejidos linfoides y prepararse apropiadamente. Otras muestras de un paciente, que incluyen orina, lagrimas, suero, llquido cefalorraquldeo, heces, esputo, extractos celulares, etc., tambien pueden ser utiles para algunos tumores en particular.

[0091] El termino "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamlferos que reciben un tratamiento profilactico o terapeutico.

[0092] Segun se usa en esta invencion, el termino "sujeto" incluye cualquier ser humano o animal no humano. Por ejemplo, los procedimientos y las composiciones descritas en esta invencion pueden usarse para el tratamiento de un sujeto que tiene cancer. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. El termino "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamlferos y no mamlferos, tales como primates no humanos, oveja, perro, vaca, etc.

[0093] Los terminos "agente anticanceroso" y "agente antineoplasico" se refieren a los farmacos usados para el tratamiento de neoplasias, tales como crecimientos cancerosos. La terapia farmacologica puede usarse sola o junto con otros tratamientos tales como una cirugla o una radioterapia. Pueden usarse numerosas clases de farmacos en el tratamiento del cancer dependiendo de la naturaleza del organo implicado. Algunos agentes anticancerosos para su uso en ciertos procedimientos de la presente descripcion incluyen, entre otros, los agentes en la Tabla 0.1

T l .1

[0094] Otros agentes anticancerosos que pueden usarse en algunas realizaciónes incluyen bortezomib (Velcade), un inhibidor del proteosoma (Takeda/Millenium); obatoclax (Cepheid/Teva), un inhibidor de la familia Bcl-2; navitoclax (Abbott/Genentech) un inhibidor de Bcl-2 y de Bcl-xL; y HGS1029 (HGS/Aegera), un inhibidor de la XIAP.

[0095] Salvo que se indique de otro modo, el termino "DR4" se refiere a un DR4 humano, por ejemplo, segun se describe en Pan, et al, Science 276, 111 (1997). Las secuencias de las protelnas del DR4 se proporcionan en la FIG. 4 (SEQ ID NO: 22) y en la FIG. 37 (SEQ ID NOs: 474, 475, 476 y 477).

[0096] Salvo que se indique de otro modo, el termino "DR5" se refiere a un DR5 humano, por ejemplo, segun se describe en Walczak, et al, EMBO J, vol. 16, n.° 17 (1997). Las secuencias de las protelnas del DR5 se proporcionan en la FIG. 4 (SEQ ID NO: 24) y en la FIG. 38 (SEQ ID NOs: 478, 479, 480, 481, 482).

[0097] Un "antlgeno" es una entidad (por ejemplo, una entidad proteica o un peptido) al que se une una SBP, una porcion de union al antlgeno de la misma y/o un anticuerpo. En varias de las realizaciónes descritas en esta invencion, un antlgeno es el DR4. En algunas realizaciónes es el DR4 humano. En algunas realizaciónes, un antlgeno es el DR5 y puede ser, por ejemplo, el DR5 humano.

[0098] El termino "enfermedad asociada con la senalizacion dependiente del DR4 y/o del DR5” o "trastorno asociado con la senalizacion dependiente del DR4 y/o del DR5”, segun se usa en esta invencion, incluye estados patologicos y/o los slntomas asociados con un estado patologico, en los que se encuentra un aumento en los niveles del DR4 y/o del DR5 y/o la activacion de las cascadas celulares que implican al DR4 y/o al DR5. En general, el termino "enfermedad asociada con la senalizacion dependiente del DR5 y/o del DR5 " se refiere a cualquier trastorno en el que la aparicion, la progresion o la persistencia de los slntomas requiere la participacion del DR4 y/o del DR5. Sin embargo, En algunas realizaciónes, las enfermedades asociadas con una senalizacion dependiente del DR4 y/o del DR5 incluyen estados patologicos en los que se observa un aumento en la sensibilidad al DR4, al DR5 y/o agonistas del DR4 y/o del DR5. El termino "enfermedad con la senalizacion dependiente del DR4 y/o del ^d R5" tambien incluye estados patologicos y/o los slntomas asociados con estados patologicos en los que se encuentra un aumento o una disminucion en los niveles de actividad del DR4 y/o del DR5. Algunos ejemplos de trastornos mediados por el DR4 y/o por el DR5 incluyen, pero no se limitan a, cancer e inflamacion.

[0099] Los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren a, o describen, el estado fisiologico de mamlferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Algunos ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Algunos ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer epidermoide, cancer de pulmon microcltico, cancer de pulmon no microcltico, cancer gastrico, cancer de pancreas, tumores de las celulas gliales tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cancer cervicouterino, cancer de ovario, cancer de hlgado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, melanoma, cancer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de las glandulas salivales, cancer de rinon, cancer renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y varios tipos de cancer de cabeza y cuello. En una realización en particular, un cancer tratado o diagnosticado mediante el uso de los procedimientos descritos en esta invencion se selecciona entre melanoma, cancer de mama, cancer de ovario, carcinoma renal, cancer gastrointestinal/de colon (incluyendo cancer gastrico), cancer de pulmon, leucemia, linfoma no Hodgkin y cancer de prostata.

[0100] El termino "cantidad eficaz”, segun se usa en esta invencion, se refiere a la cantidad de un anticuerpo, de una porcion de union al antlgeno del mismo y/o de una SBP que se une al DR5 y/o al DR4, que es suficiente para efectuar el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno mediante la activacion del DR5 y/o del DR4.

[0101] Una cantidad terapeuticamente eficaz variara dependiendo del sujeto y del estado patologico que se va a tratar, del peso y de la edad del sujeto, de la gravedad del estado patologico, de la via de administracion y similares, que pueden ser facilmente determinados por el experto habitual en la materia. Las dosis para la administracion pueden variar, por ejemplo, entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 10.000 mg, entre aproximadamente 5 ng y aproximadamente 9.500 mg, entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 9.000 mg, entre aproximadamente 20 ng y aproximadamente 8.500 mg, entre aproximadamente 30 ng y aproximadamente 7.500 mg, entre aproximadamente 40 ng y aproximadamente 7.000 mg, entre aproximadamente 50 ng y aproximadamente 6.500 mg, entre aproximadamente 100 ng y aproximadamente 6.000 mg, entre aproximadamente 200 ng y aproximadamente 5.500 mg, entre aproximadamente 300 ng y aproximadamente 5.000 mg, entre aproximadamente 400 ng y aproximadamente 4.500 mg, entre aproximadamente 500 ng y aproximadamente 4.000 mg, entre aproximadamente 1 .mu.g y aproximadamente 3.500 mg, entre aproximadamente 5 .mu.g y aproximadamente 3.000 mg, entre aproximadamente 10.mu.g y aproximadamente 2.600 mg, entre aproximadamente 20 .mu.g y aproximadamente 2.575 mg, entre aproximadamente 30 .mu.g y aproximadamente 2.550 mg, entre aproximadamente 40 .mu.g y aproximadamente 2.500 mg, entre aproximadamente 50 .mu.g y aproximadamente 2.475 mg, entre aproximadamente 100.mu.g y aproximadamente 2.450 mg, entre aproximadamente 200 .mu.g y aproximadamente 2.425 mg, entre aproximadamente 300 .mu.g y aproximadamente 2.000, entre aproximadamente 400 .mu.g y aproximadamente 1.175 mg, entre aproximadamente 500 .mu.g y aproximadamente 1.150 mg, entre aproximadamente 0,5 mg y aproximadamente 1.125 mg, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 1.100 mg, entre aproximadamente 1,25 mg y aproximadamente 1.075 mg, entre aproximadamente 1,5 mg y aproximadamente 1.050 mg, entre aproximadamente 2,0 mg y aproximadamente 1.025 mg, entre aproximadamente 2,5 mg y aproximadamente 1.000 mg, entre aproximadamente 3,0 mg y aproximadamente 975 mg, entre aproximadamente 3,5 mg y aproximadamente 950 mg, entre aproximadamente 4,0 mg y aproximadamente 925 mg, entre aproximadamente 4,5 mg y aproximadamente 900 mg, entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 875 mg, entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 20 mg y aproximadamente 825 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 775 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 100 mg y aproximadamente 725 mg, entre aproximadamente 200 mg y aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 300 mg y aproximadamente 675 mg, entre aproximadamente 400 mg y aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 500 mg o entre aproximadamente 525 mg y aproximadamente 625 mg, de un anticuerpo, de una porcion de union al antlgeno del mismo, o y/o de una SBP segun la descripcion. Los reglmenes de dosificacion pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Una cantidad eficaz tambien es aquella en la que se minimiza cualquier efecto toxico o perjudicial (es decir, los efectos secundarios) de un anticuerpo, de una porcion de union al antlgeno del mismo, y/o de una SBP y/o se sopesan con los efectos beneficiosos. Algunos reglmenes de dosificacion adicionales preferidos se describen adicionalmente a continuacion, en la seccion relativa a las composiciones farmaceuticas.

[0102] En algunas realizaciónes puede realizarse el pronostico o el diagnostico de una enfermedad asociada con la serialization dependiente del DR4 y/o del DR5. Antes del uso terapeutico de una SBP bivalente agonista del receptor de muerte o protelna de union sustituta, puede realizarse una evaluation sobre la idoneidad de la estrategia, por ejemplo, para asegurar que la poblacion de celulas diana expresa el DR5 y/o el DR4. Pueden usarse protelnas de union sustitutas radiomarcadas o con un marcaje fluorescente para mostrar la expresion del receptor en las celulas diana. Adicionalmente, pueden usarse las protelnas de union sustitutas del receptor de muerte para evaluar el pronostico de un paciente en algunas realizaciónes. Por ejemplo, en pacientes con cancer colorrectal, la detection del c-Met y del d R5 activados se ha correlacionado con una mejora en la supervivencia en comparacion con los pacientes que carecen de la expresion de cualquiera de las protelnas.

[0103] En algunas realizaciónes, las SBP y los anticuerpos descritos en esta invention son agonistas del DR5 y del DR4 y estimulan la apoptosis en las celulas que comprenden el DR5 y/o el DR4. Consecuentemente, la frase "estimulacion de la apoptosis" segun se usa en esta invencion, se refiere a la capacidad de una SBP, de una porcion de union al antlgeno y/o de un anticuerpo de aumentar estadlsticamente significativamente la apoptosis en una poblacion de celulas que expresan el DR5 y/o el DR4, con respecto a una poblacion de celulas sin tratar (de control). La poblacion de celulas que expresa el DR5 y/o el DR4 puede comprender celulas naturales o ser una llnea celular natural, o puede ser producida recombinantemente mediante la introduction de acidos nucleicos que codifican el DR5 y/o el DR4 en una o mas celulas hospedadoras. En algunas realizaciónes, la SBP, la porcion de union al antlgeno de la misma y/o el anticuerpo, aumentan la apoptosis en al menos un 10 % o en al menos un 20 % o en al menos un 30 % o en al menos un 40 % o en al menos un 50 % o en al menos un 60 % o en al menos un 70 % o en al menos un 80 % o en al menos un 90 % o en al menos un 91, un 92, un 93, un 94, un 95, un 96, un 97, un 98, un 99 % o un 100 % segun se determina, por ejemplo, mediante el uso de tecnicas reconocidas en la materia que miden la muerte celular y/u otras senales de la apoptosis. La apoptosis celular puede ensayarse, por ejemplo, mediante el uso de tecnicas reconocidas en la materia que miden la viabilidad celular, la actividad metabolica, la union de la anexina V, la activation apoptotica de la caspasa y/o el Indice de perdida de celulas en una poblacion de celulas debido a una diferenciacion terminal o a una muerte celular (por ejemplo, mediante el uso de un ensayo CellTiter-Glo™ o de la incorporation de timidina). Algunos ejemplos de ensayos para la medicion de la apoptosis se describen a continuacion. En algunas realizaciónes, pueden usarse cualquiera de las SBP, de la porcion de union al antlgeno de las mismas y/o de los anticuerpos descritos en esta invencion para aumentar la apoptosis en una poblacion de celulas. En algunas realizaciónes, un procedimiento para aumentar la apoptosis puede comprender poner en contacto una poblacion de celulas con una o mas SBP agonistas del DR4 y/o del DR5, con una porcion de union al antlgeno de las mismas o con los anticuerpos descritos en esta invencion.

[0104] En algunas realizaciónes, las SBP, los fragmentos de union al antlgeno de las mismas y/o los anticuerpos descritos en esta invencion son agonistas del DR5 y/o del DR4 e inhiben la proliferation de las celulas que comprenden el DR5 y/o el DR4. La expresion "inhibition de la proliferacion" de una celula que expresa el DR4 y/o el DR5, segun se usa en esta invencion, se refiere a la capacidad de una SBP, de una porcion de union al antlgeno de la misma y/o de un anticuerpo de disminuir estadlsticamente significativamente la proliferacion de una celula que expresa el DR5 y/o el DR4 con respecto a la proliferacion en ausencia de la SBP, del fragmento de union al antlgeno y/o del anticuerpo. En algunas realizaciónes, la proliferacion de una celula que expresa el DR5 y/o el DR4 (por ejemplo, de una celula cancerosa) puede ser disminuida en al menos un 10 % o en al menos un 20 % o en al menos un 30 % o en al menos un 40 % o en al menos un 50 % o en al menos un 60 % o en al menos un 70 % o en al menos un 80 % o en al menos un 90 % o en al menos un 91, un 92, un 93, un 94, un 95, un 96, un 97, un 98, un 99 % o un 100 % cuando las celulas se ponen en contacto con una SBP, con una porcion de union al antlgeno de la misma y/o con un anticuerpo, con respecto a la proliferacion medida en ausencia de la SBP, de la porcion de union al antlgeno de la misma y/o del anticuerpo (de control). La proliferacion celular puede ensayarse mediante el uso de las tecnicas reconocidas en la materia que miden el Indice de division celular, la fraction de celulas de una poblacion de celulas que experimenta una division celular y/o el Indice de perdida de celulas en una poblacion de celulas debido a una diferenciacion terminal o a una muerte celular (por ejemplo, mediante el uso de un ensayo CellTiter-Glo™ o de la incorporacion de timidina). Algunos ejemplos de ensayos para la medicion de la proliferacion se describen a continuacion.

[0105] El termino "SBP humana”, segun se usa en esta invencion, pretende incluir las SBP que tienen unas regiones variables en las que tanto las regiones en marco como otras derivan de las secuencias de la cadena pesada de una inmunoglobulina humana segun describen, por ejemplo, Kabat et al. (vease Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publication del NIH n.° 91-3242). Adicionalmente, si la SBP contiene una region constante, la region constante tambien deriva de las secuencias de la cadena pesada de una inmunoglobulina humana. Las SBP humanas pueden incluir residuos de aminoacidos que no estan codificados por las secuencias de las inmunoglobulinas de la llnea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante una mutagenesis aleatoria o especlfica in vitro o mediante una mutation somatica in vivo). Sin embargo, el termino "SBP humana", segun se usa en esta invention, no pretende incluir las SBP en las que las secuencias de CDR derivadas de la llnea germinal de otra especie de mamlfero, tal como un raton, han sido injertadas en secuencias en marco humanas.

[0106] El termino "SBP humanizada" se refiere a una SBP que incluye al menos una cadena de una inmunoglobulina humanizada (por ejemplo, una cadena pesada humanizada). El termino "SBP humanizada" se refiere a una cadena de una SBP que tiene una region variable que incluye una region variable en marco sustancialmente de una SBP humana y unas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (por ejemplo, al menos una CDR, preferentemente dos CDR, mas preferentemente tres CDR) sustancialmente de una cadena pesada no humana.

B. Descripcion detallada

[0107] Las tecnicas para llevar a cabo algunos de los procedimientos basicos indicados en esta invencion son bien conocidas en la materia y se describen en los libros de texto de laboratorio convencionales, que incluyen, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edicion, J. Sambrook y D. W. Russell, eds., Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; O'Brian et al., Analytical Chemistry of Bacillus Thuringlensis, Hickle and Fitch, eds., Am. Chem. Soc., 1990; Bacillus thuringlensis: biology, ecology and safety, T. R. Glare y M. O'Callaghan, eds., John Wiley, 2000; Antibody Phage Display, Methods and Protocols, Humana Press, 2001; y Antibodies, G. Subramanian, ed., Kluwer Academic, 2004. La mutagenesis puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el uso de una mutagenesis dirigida (Kunkelet al., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 82: 488-492 (1985)). Los procedimientos de amplification mediante PCR se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 4.683.192, 4.683.202, 4.800.159 y 4.965.188 y en numerosos libros de texto, que incluyen "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", H. Erlich, ed., Stockton Press, Nueva York (1989); y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

[0108] En algunas realizaciónes, la presente descripcion describe polipeptidos que comprenden secuencias de la VpreB y/o de la A5 y que tienen la capacidad de unirse a una diana. Las dianas incluyen especlficamente todos los tipos de dianas denominados de forma general "antlgenos" en el contexto de la union a un anticuerpo. En algunas realizaciónes, la diana es un receptor DR4, un receptor DR5 o tanto el receptor DR4 como al DR5. En algunas realizaciónes se proporcionan SBP para el DR4, el DR5 o tanto para el DR4 como para el DR5. En algunas realizaciónes las SBP se unen al DR4, al DR5 o tanto al DR4 como al DR5. En algunas realizaciónes las SBP son agonistas que se unen a, y activan, el DR4, el DR5 o tanto el DR4 como el DR5.

[0109] Segun se muestra en el Ejemplo 1, se identificaron varias SBP que se unen al DR4 y/o al DR5 mediante un cribado de expresion en fago (FIGs. 1 y 2). Las secuencias de varias SBP se detallan en las FIGs. 35 y 36.

[0110] Las SBP muestran un abanico de capacidades para unirse al DR4 y al DR5 (FIG. 7). En algunas realizaciónes, las SBP no se unen apreciablemente a los receptores senuelo DcR1 y DcR2.

[0111] En algunas realizaciónes las SBP son agonistas del DR4 y/o del DR5. Segun se describe en los siguientes Ejemplos y se muestra, por ejemplo, en las FIGS. 8-12, varias s Bp estimulan la actividad de la caspasa e inducen una apoptosis.

[0112] En algunas realizaciónes, se describen variantes de las SBP. En algunas realizaciónes, las SBP incluiran una region variable de la cadena pesada que es identica en al menos un 85 % a una de las secuencias de la FIG. 35 o 36 En algunas realizaciónes, la cadena pesada variante para las SBP sera identica en un 85, en un 86, en un 87, en un 88, en un 89, en un 90, en un 91, en un 92, en un 93, en un 94, en un 95, en un 96, en un 97, en un 98, en un 99 % o practicamente identica a una cualquiera o mas de las secuencias de la FIG. 35 o 36. En algunas realizaciónes, la cadena pesada variante para las SBP sera identica en un 85, en un 86, en un 87, en un 88, en un 89, en un 90, en un 91, en un 92, en un 93, en un 94, en un 95, en un 96, en un 97, en un 98, en un 99 % o practicamente identica a la region variable de la cadena pesada de la 3706-A02 (denominada tambien en esta invencion SL-466), de la SBP bivalente 3631-G09 (denominada tambien en esta invencion SL-231), de la SBP bivalente 3641-F01, de la SBP bivalente 2737-F08, de la SBP bivalente 2737-A01, de la 3706-B03 (denominada tambien en esta invencion SL465), de la 3706-C01 (denominada tambien en esta invencion SL467), de la 3726-A01 (denominada tambien en esta invencion SL-468) o de la SL-144.

[0113] En algunas realizaciónes se describen variantes de acidos nucleicos que codifican las SBP. En algunas realizaciónes, los acidos nucleicos que codifican las SBP incluiran una secuencia que codifica una region variable de la cadena pesada que es identica en al menos un 85 % a una de las secuencias de la FIG. 35 o 36. En algunas realizaciónes, los acidos nucleicos que codifican las SBP incluiran una secuencia de acido nucleico que codifica una region variable de la cadena pesada que es identica en al menos un 85, un 86, un 87, un 88, un 89, un 90, un 91, un 92, un 93, un 94, un 95, un 96, un 97, un 98, un 99, o practicamente identica, a una de las secuencias de la FIG. 35 o 36.

[0114] En algunas realizaciónes, las SBP estan en forma de fragmentos de union, tales como SBP monovalentes. En algunas realizaciónes, las SBP estan en forma de una globulina sustituta completa, tal como una SBP bivalente. El Ejemplo 6 detalla un procedimiento mediante el cual se convirtieron varias SBP monovalentes iniciales en una SBP bivalente. La siguiente Tabla 0.2 muestra la nomenclatura de varias SBP monovalentes que se convirtieron en una SBP bivalente.

Tabla 0.2

Clon de SBP monovalente 3631-G09 = SBP bivalente 3631-G09 (formato de SBP bivalente)

Clon de SBP monovalente 3641-F01 = SBP bivalente 3641-F01 (formato de SBP bivalente)

Clon de SBP monovalente 2737-F08 = SBP bivalente 2737-F08 (formato de SBP bivalente)

Clon de SBP monovalente 2736-B09 = SL-144 (formato de SBP bivalente)

Clon de SBP monovalente 2737-A01 = SBP bivalente 2737-A01 (formato de SBP bivalente)

[0115] En algunas realizaciónes una SBP se une tanto al DR4 humano como al DR5 humano. En algunas realizaciónes, una SBP se une a uno o ambos del DR4 y el DR5 humanos, pero no se une al DR5 de raton. En algunas realizaciónes una SBP impide la union del DR5 al TRAIL, segun se describe en el Ejemplo 3. En algunas realizaciónes una SBP no se une apreciablemente a los receptores senuelo DcR1 y/o DcR2. Vease el Ejemplo 4. En algunas realizaciónes una SBP se une al DR5 humano, pero no al DR5 de raton, por ejemplo, segun se describe en el Ejemplo 7.

[0116] En algunas realizaciónes, una SBP puede unirse al DR5 que es expresado en celulas. En algunas realizaciónes, la CE⁵⁰ de la SBP para dicha interaccion con el DR5 humano expresado en una celula es menor de 0,5 nM, por ejemplo, de 0,3, de 0,2, de 0,15, de 0,1 de 0,09, de 0,08, de 0,07, de 0,06, de 0,05, de 0,04, de 0,03, de 0,02 nM o menos, incluyendo cualquier intervalo inferior a cualquiera de los valores anteriores y cualquier intervalo definido entre dos cualesquiera de los valores anteriores.

[0117] En algunas realizaciónes, una globulina sustituta puede unirse a un DR4 que es expresado en celulas. En algunas realizaciónes, la CE⁵⁰ de la globulina sustituta para dicha interaccion con un DR4 humano expresado en una celula es menor de 20 nM, por ejemplo, de 15, de 10, de 5, de 2, de 1, de 0,5, de 0,3, de 0,2, de 0,15, de 0,1 0,09, de 0,08, de 0,07, de 0,06, de 0,05, de 0,04, de 0,03 nM o menos, incluyendo cualquier intervalo inferior a cualquiera de los valores anteriores y cualquier intervalo definido entre dos cualesquiera de los valores anteriores.

[0118] En algunas realizaciónes, una SBP puede unirse al DR5 y al DR4 que es expresado en celulas. En algunas realizaciónes, la CE⁵⁰ de la SBP puede ser como se ha descrito anteriormente para el DR5 y para el DR4, respectivamente.

[0119] En algunas realizaciónes, la SBP puede unirse al DR4 y/o al DR5 e inhibir la proliferacion de celulas in vitro o in vivo. En algunas realizaciónes, la SBP puede unirse al DR5 y/o al DR4 e inhibir la proliferacion celular in vivo. En algunas realizaciónes, una globulina sustituta puede unirse al DR5 y/o al DR4 y activar la actividad apoptotica en celulas, tanto in vitro como in vivo. En algunas realizaciónes, una s Bp puede unirse al DR5 y/o al DR4 y activar las rutas de la caspasa, incluyendo la caspasa 3/7, la caspasa 8 y la caspasa 9, tanto in vitro como in vivo.

[0120] En la invencion, una SBP puede unirse al DR4 y al DR5. En algunas realizaciónes la SBP es un agonista doble del DR4 y del DR5. En algunas realizaciónes, una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 puede aumentar la actividad apoptotica en las celulas que expresan el DR4 y el DR5. En algunas realizaciónes, un agonista doble del DR4 y del DR5 SBP puede aumentar la actividad de la caspasa en las celulas que expresan el DR4 y el DR5. El aumento en la actividad de la caspasa puede estar aumentado en la actividad de la caspasa 3/, de la caspasa 8 y o de la caspasa 9. En algunas realizaciónes una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 puede inhibir la proliferacion celular en las celulas que expresan el DR4 y el DR5. La SBP agonista doble del DR4 y del DR5 puede ser, en algunas realizaciónes, mas potente que el TRAIL en el aumento de la actividad apoptotica, en el aumento de la actividad de la caspasa y/o en la inhibition de la proliferacion celular en las celulas que expresan DR4 y el DR5. En algunas realizaciónes la SBP agonista doble del DR4 y del DR5 no se une a los receptores senuelo.

[0121] En algunas realizaciónes, las SBP pueden ser reticuladas antes de su administration. Por ejemplo, las SBP pueden ser reticuladas con un anticuerpo anti-Fc o con una protelna G. En algunas realizaciónes la reticulacion puede llevarse a cabo como se describe a continuation.

[0122] En algunas realizaciónes, una SBP comprende una secuencia de la VpreB, una secuencia de la A5, o una secuencia de la VpreB y una secuencia de la A5, y una secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la secuencia de la VpreB, con la secuencia de la A5, o con la secuencia de la VpreB y la secuencia de la a5, para formar la SBP que puede unirse a una protelna DR5 y/o DR4. En algunas realizaciónes una secuencia de la VpreB esta fusionada con la secuencia de una cadena ligera constante.

[0123] En algunas realizaciónes la protelna DR5 humana a la que se une la SBP es la representada en la FIG. 4 o la proporcionada en la FIG. 38. En algunas realizaciónes el d R5 comprende una o mas de la SEQ ID NO: 24, de la SEQ ID NO: 26, de la SEQ ID NO: 478, de la SEQ ID NO 479, de la SEQ ID NO 480, de la SEQ ID NO 481 y de la SEQ ID NO 482 En algunas realizaciónes una SBP se une a una protelna DR4 humana representada en la FIG. 4 o proporcionada en la FIG. 37. En algunas realizaciónes el DR4 comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos de la SEQ ID NO: 22, de la SEQ ID NO: 25, de la SEQ ID NO 474, de la SEQ ID NO 475, de la SEQ ID NO 476 y de la SEQ ID NO 477.

[0124] En algunas realizaciónes, la SBP (o el Ac) comprende una region variable de la cadena pesada. En algunas realizaciónes, la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia segun se muestra en la FIG. 35 o 36. En algunas realizaciónes, por ejemplo, pueden emplearse variantes que son identicas en un 80, en un 85, en un 90, en un 95, en un 96, en un 97, en un 98, en un 99 % a las secuencias de las FIGs. 35 y/o 36 para la SBP. En algunas realizaciónes, la SBP comprende una region variable de la cadena pesada, o una variante de la misma, de la FIG. 35 o 36 junto con una secuencia de la VpreB y/o una secuencia de la A5. En algunas realizaciónes, la secuencia de la VpreB y/o la secuencia de la A5 comprende parte o la totalidad de una o mas de las secuencias mostradas en las FIGs. 26, 30, 31, 32 o 33.

[0125] En algunas realizaciónes, la SBP (o el Ac) comprende una o mas regiones de CDR de la cadena pesada (por ejemplo, 1, 2 o 3), tales como las regiones de CDR de la cadena pesada proporcionadas en la FIG. 35 o 36. En algunas realizaciónes, la region de CDR de la cadena pesada comprende una secuencia segun se muestra en la FIG. 35 o 36. En algunas realizaciónes, por ejemplo, pueden emplearse variantes que son identicas en un 80, en un 85, en un 90, en un 95, en un 96, en un 97, en un 98, en un 99 % a 1, 2 o 3 de las secuencias de CDR de las FIGs. 35 y/o 36 para la SBP. En algunas realizaciónes una SBP comprende las CDR 1, 2 y 3 de una SBP de la FIG.

35 o 36. En algunas realizaciónes una SBP comprende la CDR 1 y la 3, la CDR 2 y la 3 o la CDR 1 y la 2 de una SBP de la FIG. 35 o 36. En algunas realizaciónes una SBP comprende una o mas secuencias de CDR de la FIG. 35 o 36. En algunas realizaciónes, la SBP comprende 1, 2 o 3 CDR o variantes de las mismas, de la FIG. 35 o 36 junto con una secuencia de la VpreB y/o una secuencia de la A5. En algunas realizaciónes, la secuencia de la VpreB y/o la secuencia de la A5 comprende parte o la totalidad de una o mas de las secuencias mostradas en las FIGs. 26 , 30, 31, 32 o 33. En algunas realizaciónes, las CDR se seleccionan entre el siguiente grupo: CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 y CDR2, CDR2 y CDR3, CDR1 y CDR3 y CDR1 CDR2 y CDR3. En algunas realizaciónes, la CDR se define como una secuencia de Kabat. En algunas realizaciónes, la CDR se define como una secuencia de Chothia

[0126] Segun se describe, la SBP comprende una combination de SBP segun se establece en la siguiente Tabla 0.3:

TABLA 0.3

[0127] Segun se describe, puede combinarse cualquiera de las opciones de las regiones variables de una cadena pesada y/o de las CDR de la cadena pesada detallada en la Tabla 0.3 o proporcionada en la FIG. 35 o 36 con una region variable de la cadena ligera de un anticuerpo contra el DR5 o el DR4 o una o mas CDR de la cadena ligera contra el DR5 o el DR4. Segun se describe, puede emplearse cualquier cadena ligera, de la llnea germinal o reordenada. Segun se describe, se emplea la lambda. Segun se describe, se emplea la kappa.

[0128] La selectividad y la fuerza de la union de la SBP puede ser atribuida a la combinacion de cadenas pesadas variables en marco y a la composicion especifica de la CDR. Se predice que estos atributos de union pueden ser alterados mediante unas sustituciones sensatas de residuos especificos de la cadena ligera sustituta. Por ejemplo, se predice que los bucles de la VpreB, de la lambda 5, o un bucle formado mediante la fusion quimerica de la VpreB y de la lambda 5, pueden ser sustituidos por otros residuos para permitir estos cambios. La naturaleza de estas sustituciones puede ser conservativa, no conservativa, o una combinacion de ambas, o ambas.

[0129] La sustitucion de cualquiera de los residuos de la cadena ligera sustituta proximos a, o distantes de, las CDR de la cadena pesada, puede realizarse con fines de optimizacion de la actividad. El beneficio de estos cambios conservativos puede derivar de una mejora en el acceso entre la diana y la cadena pesada. Al mantener la quimica de los terminales de la cadena lateral, y alterar las longitudes del esqueleto peptidico, puede mejorarse la necesaria estructura complementaria y su accesibilidad esterica. Una reduccion de la cadena lateral o un reposicionamiento de los terminales de la cadena lateral puede proporcionar mas espacio libre que puede dar como resultado una mejor union. Alternativamente, por oposicion a los cambios que reducen la distancia entre las quimicas de la cadena lateral y el enlace peptidico, podrian aportar unas quimicas interactivas para una posicion de union mejor y mas cercana. Las Tablas 0.3B-0.3D proporcionan una lista de algunas opciones para las areas de la cadena ligera sustituta que pueden ser modificadas, y algunos ejemplos de como pueden ser modificadas.

Tabla 0.3B

Tabla 0.3C

Tabla 0.3D

[0130] La numeration de los residuos indicada anteriormente es relativa a la SEQ ID NO: 483 (FIG. 33). Por lo tanto, cualquiera de los residuos indicados anteriormente puede ser alterado en la SEQ ID NO: 276 y ser todavia predicho como aceptable. En algunas realizaciónes, pueden alterarse otros residuos de la cadena ligera sustituta (por ejemplo, secuencias identicas en un 80 %, en un 85 %, en un 90 %, en un 95 %, en un 98 % y en un 99 % a las secuencias sustitutas de la cadena ligera proporcionadas en esta invention (por ejemplo, FIG. 33)).

[0131] Es posible incorporar quimicamente diversos aminoacidos que crean nuevas interacciones ventajosas bien con la diana o bien con la estructura de la cadena pesada complementaria de una forma estructuralmente similar a la descrita anteriormente, excepto porque la mejorada "capacidad" hacia la diana deriva de interacciones con la cadena lateral que previamente no existian. Las posibles sustituciones en bucles adyacentes predichos de la diana (SEQ ID 484-486) segun se muestran segun sus respectivas posiciones en las Tablas 0.3B, 0.3C y/o 0.3D). En algunas realizaciónes, cualquiera de las cadenas ligeras sustitutas proporcionadas en esta invencion puede ser emparejada con cualquiera de las secuencias de la cadena pesada proporcionadas en esta invencion.

[0132] La description anterior destaca los cambios en la afinidad, pero pueden ser extendidos a otras funciones beneficiosas, tales como la estabilidad termica, las propiedades farmacocineticas, la inmunogenicidad, la solubilidad, la expresion y la agregacion.

[0133] Segun se describe, cualquiera de las opciones de las regiones variables de la cadena pesada y/o de las CDR de la cadena pesada detalladas en la Tabla 0.3 o proporcionadas en la FIG. 35 o 36 puede combinarse con 1, 2 y/o 3 regiones analogas de CDR de la cadena ligera de cualquiera de las secuencias indicadas en la Tabla 0.3. En algunas realizaciónes, se emplean las LR2 y LR3. Segun se describe, se emplean las regiones LR1 y LR3. Algunos ejemplos de regiones de bucle pueden encontrarse en la FIG. 26.

[0134] Segun se describe, la SBP y/o el anticuerpo se une a un epltopo del DR4 o del DR5 que es importante para la union del TRAIL o para la transmision de una senal. En algunas realizaciónes, la SBP y/o el anticuerpo se une tanto al DR4 como al DR5, desestabiliza la union del TRAIL a ambos receptores y se une a, y activa, el DR4 y el DR5 de un primate no humano. En algunas realizaciónes, la SBP y/o el anticuerpo se une al DR4 y al DR5 humanos, y al DR4 y al DR5 de un primate no humano. En algunas realizaciónes se proporciona un agonista doble del DR4 y del DR5 que se une al DR4 y al DR5 humanos, as! como a los DR4 y DR5 no humanos. El agonista doble del DR4 y del DR5 puede comprender, segun se describe, uno o mas dominios de union de la SL466 (3706-A02) o de la SL231 (3631-G09).

[0135] En algunas realizaciónes, la SBP tiene una KD que es menor de 100 nM, preferentemente de entre 0,01 nM y 10 nM.

[0136] Segun se describe, la secuencia VpreB se selecciona entre el grupo que consiste en una secuencia VpreB 1 nativa, una secuencia VpreB2 nativa, una secuencia VpreB3 nativa, fragmentos de cualquiera de las anteriores y variantes de cualquiera de las anteriores. En algunas realizaciónes, la secuencia nativa VpreB se selecciona entre el grupo que consiste en la VpreB 1 humana de la SEQ ID NO: 1, la VpreB2 raton de las SEQ ID NOS: 2 y 3, la VpreB3 humana de la SEQ ID NO: 4, fragmentos de cualquiera de las anteriores y variantes de cualquiera de las anteriores.

[0137] Segun se describe, la SBP incluye la secuencia de la A5. En algunas realizaciónes, la secuencia de la A5 comprende la totalidad o parte de una A5 humana de la SEQ ID NO: 6 o de un polipeptido de raton de la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciónes, la secuencia de la A5 esta fusionada con dicha secuencia de la VpreB. En algunas realizaciónes, la SBP comprende una secuencia de la VpreB fusionada con una secuencia de la A5. En algunas realizaciónes, la secuencia de la VpreB se selecciona entre el grupo que consiste en la VpreB1 humana de la SEQ ID NO: 1, la VpreB2 de raton de las SEQ ID NOS: 2 y 3, la VpreB3 humana de la SEQ ID NO: 4, fragmentos de cualquiera de las anteriores, variantes de cualquiera de las anteriores y cualquier combination de las mismas. En algunas realizaciónes, la secuencia A5 se selecciona entre el grupo que consiste en una A5 humana de la SEQ ID NO: 6 , una de raton de la SEQ D NO: 6 , fragmentos de cualquiera de las anteriores, variantes y cualquier combinacion de las mismas. En algunas realizaciónes, la secuencia de la VpreB se fusiona con la secuencia de la A5 en, o alrededor de, una LR3 de dicha secuencia de la VpreB y de la A5, respectivamente. En algunas realizaciónes, la A5 esta unida covalentemente a las secuencias de la VpreB. En algunas realizaciónes, la A5 esta unida covalentemente a las secuencias de la VpreB mediante un peptido de conexion o una secuencia de polipeptidos. En algunas realizaciónes, la protelna de union sustituta comprende la VpreB y la A5, y la secuencia de la VpreB esta conjugada con la secuencia de la A5 mediante una asociacion no covalente, y en las que al menos una de dichas secuencias VpreB y A5 es distinta a la secuencia completa nativa de la VpreB y de la A5, respectivamente. En algunas realizaciónes, al menos una de dichas secuencias VpreB y A5 es un fragmento o una variante de una secuencia nativa de la VpreB y de la A5, respectivamente. En algunas realizaciónes, la secuencia de la VpreB esta fusionada con la secuencia de la A5, y la secuencia de la VpreB fusionada con la secuencia de la A5 esta emparejada con la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada. En algunas realizaciónes, la secuencia de la VpreB, de la A5, o de la VpreB y de la A5, estan fusionadas con una construction de cadena pesada variable segun se describe en esta invention. En algunas realizaciónes, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de un anticuerpo esta emparejada covalentemente a traves de un conector peptldico.

[0138] Segun se describe, la SBP comprende una secuencia de la VpreB fusionada con una secuencia de la A5, en la que la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de un anticuerpo esta conjugada con la secuencia de la VpreB fusionada con la secuencia de la A5 mediante una asociacion no covalente, para formar un complejo dimerico. En algunas realizaciónes la SBP comprende una VpreB fusionada con una secuencia ligera constante. En algunas realizaciónes, la SBP comprende una Lambda-5 fusionada con una secuencia ligera variable.

[0139] Segun se describe, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada se une al DR4 y/o al DR5, y la secuencia de la VpreB, la secuencia de la A5, o la secuencia de la VpreB y la secuencia de la A5, tambien se unen al DR4 y/o DR5.

[0140] Segun se describe, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada se une a una diana diferente de la diana a la que se une la secuencia de la VpreB, la secuencia de la A5, o la secuencia de la VpreB y la secuencia de la A5.

[0141] Segun se describe, la secuencia de la VpreB, la secuencia de la A5, o la secuencia de la VpreB y la secuencia de la A5, se unen al DR4 y/o al DR5, y la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada se une a una diana y/o a un epitopo diferente. En algunas realizaciónes, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada se une a una diana y/o a un epitopo que no es el DR4 o el DR5 o una porcion de los mismos.

[0142] Segun se describe, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada se une al DR4, y la secuencia de la VpreB, la secuencia de la A5, o la secuencia de la VpreB y la secuencia de la A5, se unen al DR5. En algunas realizaciónes, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada se une al DR5, y la secuencia de la VpreB, la secuencia de la A5, o la secuencia de la VpreB y la secuencia de la A5, se unen al DR4. En algunas realizaciónes, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada se une al DR4 y/o al DR5, y la secuencia de la VpreB, la secuencia de la A5, o la secuencia de la VpreB y la secuencia de la A5, se unen a una diana y/o a un epitopo diferente.

[0143] Segun se describe, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada esta asociada no covalentemente con la secuencia de la VpreB y la secuencia de la A5, que tambien estan asociadas covalentemente entre si, para formar un complejo trimerico. En algunas realizaciónes, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada (de un Ac o de una SBP) se une al DR4 y/o al DR5.

[0144] Segun se describe, una SBP biespecifica o las porciones de union al antigeno de la misma comprenden una primera secuencia de la VpreB, una primera secuencia de la A5, o una primera secuencia de la VpreB y una primera secuencia de la A5. Adicionalmente pueden incluir una primera secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la primera secuencia de la VpreB, con la primera secuencia de la A5, o con la primera secuencia de la VpreB y la primera secuencia de la A5, para formar un primer sitio de union de la SBP, en el que dicha SBP o una porcion de union al antigeno de la misma se une a y/o activa el DR4 y/o el DR5. En algunas realizaciónes, puede incluir adicionalmente una segunda secuencia de la VpreB, una segunda secuencia de la A5, o una segunda secuencia de la VpreB y una segunda secuencia de la A5. En algunas realizaciónes, puede incluir adicionalmente una segunda secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la segunda secuencia de la VpreB, con la segunda secuencia de la A5, o con la segunda secuencia de la VpreB y la segunda secuencia de la A5, para formar un segundo sitio de la SBP. El segundo sitio de la SBP puede unirse a, y/o activar, el DR4 y/o el DR5 u otra diana. Por ejemplo, el primer sitio de union de la SBP puede unirse a, y/o activar, el DR5 y el segundo sitio de la SBP puede unirse a, y/o activar, el DR5, o viceversa. En algunas realizaciónes el segundo sitio de la SBP se une a una diana que no es la DR4 o la DR5, tal como una diana implicada en la patogenia del cancer. En algunas realizaciónes el segundo sitio de la SBP se une a, e inhibe, una diana, mientras que en otras realizaciónes el segundo sitio de la SBP se une a, y activa, una diana.

[0145] Segun se describe, se proporciona una proteina de union sustituta biespecifica que comprende una secuencia de la VpreB, una secuencia de la A5, o una secuencia de la VpreB y una secuencia de la A5, una primera secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la secuencia de la VpreB, con la secuencia de la A5, o con la secuencia de la VpreB y la primera secuencia de la A5, para formar un primer sitio de union. El sitio de union de la primera proteina de union sustituta se une a, y/o activa, un receptor DR4 o DR5. La SBP puede comprender adicionalmente una region variable de la cadena ligera. La SBP puede comprender adicionalmente una segunda secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la region variable de la cadena ligera para formar un segundo sitio de union, en la que dicho segundo sitio de union se une a una segunda diana, por ejemplo, el otro del receptor DR4 o el receptor DR5 que era la diana del primer sitio de union. En algunas realizaciónes, el segundo sitio de union se une a una diana implicada en la patogenia del cancer que no es el DR4 o el DR5. En algunas realizaciónes el segundo sitio de la SBP se une a, e inhibe, una diana, mientras que en otras realizaciónes el segundo sitio de la SBP se une a, y activa, una diana.

[0146] Segun se describe, la SBP comprende una region de CDR analoga de una secuencia de la VpreB y/o de una secuencia de la A5 que esta modificada mediante el injerto de las correspondientes secuencias de CDR de un anticuerpo terapeutico.

[0147] La SBP puede aumentar la actividad apoptotica, aumentar la actividad de la caspasa y/o inhibir la proliferacion celular en las celulas que expresan el DR4 y/o el DR5. En algunas realizaciónes una SBP agonista doble se une selectivamente a, y activa, el DR4 y el DR5. La SBP agonista doble puede aumentar la actividad apoptotica, aumentar la actividad de la caspasa y/o inhibir la proliferacion celular en las celulas que expresan el DR4 y el DR5. En algunas realizaciónes la SBP agonista doble es mas eficaz que una SBP que se dirige solo al DR4, que una SBP que se dirige solo al DR5, o que una combinacion de SBP que se dirigen individualmente al DR4 y el d R5. En algunas realizaciónes la SBP agonista doble que se une a, y activa, el DR4 y el DR5, proporciona al menos una inhibition mayor del 10 % de la proliferacion celular con respecto a las SBP que se dirigen al DR4 o al DR5 individualmente, y/o que una combinacion de dos SBP diferentes que se dirigen al DR4 y al DR5, por ejemplo, al menos un 10, un 50, un 100, un 200, un 300, un 400, un 500, un 600, un 700, un 800, un 900, un 1.000 % o mas de inhibicion (por ejemplo, la concentration necesaria para conseguir un porcentaje de inhibicion en particular). En algunas realizaciónes la SBP agonista doble que se une a, y activa, el ^d R4 y el DR5, proporciona al menos un 10 % de aumento mayor en la actividad apoptotica con respecto a las SBP que se dirigen al DR4 o al DR5 individualmente, y/o que una combinacion de dos SBP diferentes que se dirigen al DR4 y al DR5, por ejemplo, al menos un 10, un 50, un 100, un 200, un 300, un 400, un 500, un 600, un 700, un 800, un 900, un 1.000 % o mas de aumento en la actividad apoptotica. En algunas realizaciónes la SBP agonista doble que se une a, y activa, el DR4 y el DR5 proporciona al menos un 10 % de aumento mayor en la actividad de la caspasa con respecto a las SBP que se dirigen al DR4 o al DR5 individualmente, y/o que una combinacion de dos SBP diferentes que se dirigen al DR4 y al DR5, por ejemplo, al menos un 10, un 50, un 100, un 200, un 300, un 400, un 500, un 600, un 700, un 800, un 900, un 1.000 % o mas de aumento en la actividad de la caspasa (por ejemplo, la activacion de la caspasa 3/7).

[0148] Segun se describe, dos o mas de las SBP descritas se unen a un epltopo similar, al mismo o a uno solapante. En algunas realizaciónes se unen a epltopos no solapantes.

[0149] Segun se describe, las SBP pueden unirse a cualquiera de los epltopos a los que pueden unirse las SBP de la Tabla 0.3. En algunas realizaciónes las SBP pueden unirse a cualquiera de los epltopos a los que pueden unirse las SBP de las FIGs. 35 o 36, o a epltopos similares o solapantes.

[0150] Segun se describe, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epltopo o a uno solapante que cualquiera al que se unen las SBP descritas en esta invencion. En algunas realizaciónes, el Ac tiene la misma CDR de la cadena pesada o una similar, CDR o regiones variables de la cadena pesada de cualquiera de las SBP de esta invencion (incluyendo las indicadas en la Tabla 0.3). En algunas realizaciónes, el anticuerpo desplaza la SBP cuando el anticuerpo se une a un epltopo del DR4 y/o del DR5. En algunas realizaciónes, el anticuerpo no desplazara una SBP si la SBP ya esta unida al DR4 o al DR5.

[0151] Segun se describe, una SBP biespeclfica incluira al menos una de las CDR de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) (SEQ ID NOs: 459, 460, 461; FIG. 35) y/o de la SL-231 (3631-G09) (SEQ ID NOs: 39, 40, 41; FIG. 36). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica puede incluir cualquiera de las cadenas ligeras sustitutas proporcionadas en esta invencion. En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos una CDR de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) y/o de la SL-231 (3631-G09). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos dos CDR de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) y/o de la SL-231 (3631-G09). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos tres CDR de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) y/o de la SL-231 (3631-G09). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos la region variable de la cadena pesada de al menos una de la SL-466 (3706-A02) (SEQ ID NO: 458) y/o de la SL-231 (3631-G09) (SEQ ID NO: 38). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos una region variable de la cadena pesada que es identica en al menos un 85 % a la secuencia de la region variable de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) y/o de la SL-231 (3631-G09). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos una region variable de la cadena pesada que es identica en al menos un 90 % a la secuencia de la region variable de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) y/o de la SL-231 (3631-G09). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos una region variable de la cadena pesada que es identica en al menos un 95 % a la secuencia de la region variable de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) y/o de la SL-231 (3631-G09). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos una region variable de la cadena pesada que es identica en al menos un 98 % a la secuencia de la region variable de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) y/o de la SL-231 (3631-G09). En algunas realizaciónes, la SBP biespeclfica incluira al menos una region variable de la cadena pesada que es identica en al menos un 99 % a la secuencia de la region variable de la cadena pesada de la SL-466 (3706-A02) y/o de la SL-231 (3631-G09).

Construcciones de cadena ligera sustituta

[0152] Se han identificado los precursores de los linfocitos B (linfocitos pre-B) en la medula osea como linfocitos en una fase de desarrollo que producen cadenas pesadas p pero que todavla no han comenzado a producir cadenas ligeras, sino que en su lugar expresan un conjunto de genes especlficos de la estirpe B denominados VpreB (1-3) y A5, respectivamente.

[0153] Una isoforma de la VpreB1 humana (CAG30495) es un polipeptido de 145 aa de longitud (la SEQ ID NO: 1). Tiene una estructura de tipo dominio Ig V, pero carece de la ultima hebra p (p7) de un dominio V tlpico, y en su lugar tiene un extremo carboxilo terminal que no muestra homologlas en la secuencia con ninguna otra protelna VpreB2 que tiene varias isoformas, incluyendo un polipeptido VpreB2 de raton de 142 aminoacidos (P13373; la SEQ ID NO: 2) y una variante de ayuste de 171 aminoacidos de longitud de la secuencia de la VpreB2 de raton (CAA019641 la SEQ ID NO: 3). Las secuencias de la VpreB1 y de la VpreB2 se han descrito en el documento EP 0 269 127 y en la Patente de Estados Unidos n.° 5.182.205; en Collins et al., Genome Biol. 5 (10): R84 (2004); y en Hollins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86 (14): 5552-5556 (1989). Una isoforma de la VpreB3 humana (la SeQ ID NO: 4) es una protelna de 123 aminoacidos de longitud (CAG30496), descrita en Collins et al., Genome Biol. 5 (10): R84 (2004).

[0154] En algunas situaciones, la VpreB (1-3) puede estar asociada no covalentemente con otra protelna, la A5. La A5 humana es un polipeptido de 209 aminoacidos (CAA01962; la SEQ ID NO: 5) que porta una estructura de tipo dominio Ig C con unas importantes homologlas con las cadenas ligeras de un anticuerpo y, hacia su extremo amino terminal, dos regiones funcionalmente distintas, una de las cuales muestra una importante homologla con la hebra p7 de los dominios VA. Una protelna de tipo A5 de raton tiene 29 aminoacidos (CAA01962; la SEQ ID NO: 5) y muestra una identidad en la secuencia de aproximadamente un 62 % con la region constante de la cadena ligera A del anticuerpo.

[0155] Para detalles adicionales, veanse los siguientes artlculos de revision: Karasuyamaet al., Adv. Immunol. 63: 1-41 (1996); Melchers et al., Immunology Today 14: 60-68 (1993); y Melchers, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96: 2571-2573 (1999).

[0156] Tradicionalmente, los polipeptidos VpreB y A5 forman conjuntamente una estructura asociada no covalentemente, denominada cadena ligera sustituta. En la superficie de los linfocitos preB tempranos, la cadena ligera sustituta esta complejada con la cadena pesada p de la Ig unida a la membrana en asociacion con un heterodlmero transductor de senales CD79a/CD79b para formar una estructura de tipo receptor de los linfocitos B, el denominado receptor de los linfocitos preB (preBCR).

[0157] Como se ha analizado anteriormente, se han identificado los linfocitos pre-B en la medula osea como linfocitos que producen cadenas pesadas p, pero en lugar de las cadenas ligeras completamente desarrolladas, expresan un conjunto de genes especlficos de la estirpe B denominados VpreB (1-3) y A5, respectivamente. Los polipeptidos VpreB y A5 forman conjuntamente una estructura asociada no covalentemente, denominada cadena ligera sustituta. La cadena ligera sustituta, aunque no es una cadena de un anticuerpo, se asocia de forma natural con todas las cadenas pesadas de un anticuerpo recombinadas.

[0158] Segun se describe, las SBP incluyen, sin limitacion, conjugados de secuencias de la VpreB con secuencias de aminoacidos heterogeneas, con la condicion de que conserven la capacidad de unirse a una diana deseada. La union de la secuencia de la VpreB a la secuencia de aminoacidos heterogenea puede ser tanto covalente como no covalente, y puede producirse directamente o a traves de un conector, incluyendo conectores peptldicos.

[0159] Algunos ejemplos especlficos de las construcciones polipeptldicas de esta invencion incluyen los polipeptidos en los que una secuencia de la VpreB, tal como una secuencia de la VpreB 1, de la VpreB2 o de la VpreB3, incluyendo fragmentos y variantes de las secuencias nativas, esta conjugada con una secuencia de la A5, incluyendo fragmentos y variantes de la secuencia nativa. Algunas fusiones representativas de este tipo estan ilustradas en las FIGs. 27 y 34.

[0160] En una fusion directa, normalmente el C terminal de una secuencia de la VpreB (por ejemplo, de una secuencia de la VpreB 1, de la VpreB2 o de la VpreB3) esta fusionada con el N terminal de una secuencia de la A5. Aunque es posible fusionar la totalidad de la longitud de una secuencia nativa de la VpreB con una secuencia de la A5 de longitud completa (vease, por ejemplo, el primer diagrama de la FIG. 27), normalmente la fusion tiene lugar en, o alrededor de, un sitio peptldico de tipo no inmunoglobulina de cada uno de los dos polipeptidos. Dichos sitios similares para la VpreB 1 y la A5 estan ilustrados en la FIG. 26, y una construction de fusion representativa esta ilustrada en la FIG. 27. En esta realization, la fusion puede tener lugar en, o en una ubicacion a aproximadamente, los 10 residuos de aminoacidos a cualquier lado de esta region. En una realización preferida, la fusion tiene lugar entre aproximadamente los residuos de aminoacidos 116-126 de la secuencia de la VpreB1 humana nativa (la SEQ ID NO: 1) y entre aproximadamente los residuos de aminoacidos 87 y 97 de la secuencia de la A5 humana nativa (la SEQ ID NO: 6).

[0161] Tambien es posible fusionar la secuencia de la VpreB con la region CDR3 de la cadena ligera A de un anticuerpo, segun se muestra en la FIG. 27. Tambien es posible fusionar los carboxi terminales de una construccion de la VpreB y de la A5 al amino terminal de la region constante de la cadena ligera de la cadena ligera A de un anticuerpo, segun se muestra tambien en la Figura 27. Algunas construcciones adicionales, en las que unicamente una de la VpreB y la A5 esta truncada, se muestran en la FIG. 28. Pueden prepararse construcciones similares mediante el uso de las secuencias de la cadena ligera k del anticuerpo.

[0162] Algunas estructuras de fusion directa adicionales estan ilustradas en el lado derecho de la FIG. 34. La estructura denominada "fusion SLC 1" es un tetramero, formado por dos dlmeros, en los que la fusion de una secuencia de la V-preB1 truncada (que carece de la caracterlstica "cola” en el C terminal de la VpreB1 nativa) con una secuencia de la A5 truncada de forma similar, esta asociada no covalentemente con una cadena pesada de un anticuerpo. La estructura denominada "fusion SLC 2" es un tetramero, formado por dos dlmeros, en los que la fusion de una secuencia de la VpreB 1 truncada (que carece de la caracterlstica "cola” en el C terminal de la VpreB1 nativa) con una region constante de la cadena ligera de un anticuerpo, esta asociada no covalentemente con una cadena pesada de un anticuerpo. La estructura denominada "fusion SLC 3" es un tetramero, formado por dos dlmeros, en los que la fusion de una region variable de la cadena ligera de un anticuerpo con una secuencia de la A5 truncada (que carece de la caracterlstica "cola” en el C terminal de la A5 nativa) esta asociada no covalentemente con una cadena pesada de un anticuerpo.

[0163] Como se ha mencionado anteriormente, ademas de las fusiones directas, las construcciones polipeptldicas incluyen asociaciones no covalentes de una secuencia de la VpreB (incluyendo fragmentos y variantes de una secuencia nativa) con una secuencia heterogenea, tal como una secuencia de la A5 (incluyendo fragmentos y variantes de la secuencia nativa) y/o con una secuencia de un anticuerpo. Por lo tanto, por ejemplo, una secuencia de la VpreB de longitud completa puede estar asociada no covalentemente con una secuencia de la A5 truncada. Alternativamente, una secuencia de la VpreB truncada puede estar asociada no covalentemente con una secuencia de la A5 de longitud completa.

[0164] Las construcciones de una cadena ligera sustituta que comprenden secuencias de la VpreB 1 y de la A5 asociadas no covalentemente, en una asociacion no covalente con una cadena pesada de un anticuerpo, se muestran en el lado izquierdo de la FIG. 34. Como muestran las diversas ilustraciones, las estructuras pueden incluir, por ejemplo, secuencias de la VpreB 1 y de la A5 de longitud completa, una secuencia de la VpreB 1 de longitud completa asociada con una secuencia de la A5 truncada ("Lambda 5dT"), una secuencia de la V-reB1 truncada asociada con una secuencia de la A5 de longitud completa (VpreB dT") y una secuencia de la VpreB1 truncada asociada con una secuencia de la A5 truncada ("corta").

[0165] Aunque la FIG. 34 ilustra ciertas construcciones especlficas, el experto habitual apreciara que puede elaborarse una diversidad de otras construcciones y usarse de una forma similar. Por ejemplo, las estructuras pueden ser asimetricas, comprendiendo diferentes secuencias sustitutas de la cadena ligera de cada brazo y/o tener estructuras trimericas o pentamericas, por oposicion a las estructuras ilustradas en la FIG 34. Tambien es posible incluir funcionalidades diferentes en varias porciones de las construcciones sustitutas de la cadena ligera, produciendo as! construcciones multiespeclficas y/o multivalentes.

[0166] Si se desea, las construcciones pueden ser modificadas, por ejemplo, mediante la incorporation o el anexado de secuencias o de motivos de secuencia conocidos de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de anticuerpos, incluyendo anticuerpos terapeuticos conocidos, en regiones similares de las construcciones sustitutas de la cadena ligera. Esto permite la creation de moleculas que no son anticuerpos, pero que mostraran unas especificidades y unas afinidades de union muy similares a las de un anticuerpo terapeutico conocido.

[0167] Todas las construcciones sustitutas de la cadena ligera en esta invention pueden estar asociadas con las secuencias de una cadena pesada de un anticuerpo. Por ejemplo, segun se muestra en la FIG. 29, puede unirse una fusion VpreB-A5 a la secuencia de la region variable de la cadena pesada de un anticuerpo mediante un conector peptldico. En algunas realizaciónes, una fusion VpreB-A5 esta asociada con una cadena pesada de un anticuerpo, o con un fragmento de la misma que incluye una secuencia de la region variable, para formar un complejo dimerico. En otra realization mas, las secuencias de la VpreB y de la A5 estan asociadas entre si, y con una cadena pesada de un anticuerpo, o un fragmento de la misma que incluye una secuencia de la region variable, formando as! un complejo trimerico. Algunos ejemplos de construcciones que comprenden una cadena pesada de un anticuerpo estan ilustrados en la FIG. 34.

[0168] Aunque las construcciones estan ilustradas mediante referencia a ciertas realizaciónes, el experto habitual comprendera que son posibles numerosas realizaciónes adicionales obtenidas mediante las diversas permutaciones de la cadena ligera sustituta y de las secuencias de un anticuerpo, y estan en el ambito de la presente description. La presente description incluye todas las construcciones que comprenden secuencias sustitutas de la cadena ligera y que tienen la capacidad de unirse a una diana deseada. En una cierta realización, las construcciones tambien tienen la capacidad de asociarse con las secuencias de una region variable de la cadena pesada de un anticuerpo.

[0169] Las construcciones pueden usarse para construir bancos de secuencias sustitutas de la cadena ligera, que pueden usarse para diversos fines, de forma similar a los bancos de anticuerpos, incluyendo la selection de las construcciones con las especificidades y afinidades de union deseadas.

[0170] Cuando las secuencias sustitutas de la cadena ligera VpreB y A5 estan asociadas no covalentemente entre si, los extremos libres de uno o de ambos componentes (es decir, el extremo C terminal de la secuencia de la VpreB y/o el extremo N terminal de la secuencia de la A5) estan disponibles para la incorporacion de una diversidad adicional del banco de dichas secuencias. Por ejemplo, puede anexarse o sustituirse un peptido aleatorio del banco en uno de estos extremos libres y seleccionarse segun la union especlfica a una diana en particular. Mediante la combination de la cadena ligera sustituta, identificada por tener la especificidad de union deseada, con una cadena pesada o un fragmento de la cadena pesada de un anticuerpo, a la misma diana, puede crearse una molecula que tiene la capacidad de unirse a la diana analoga en dos sitios distintos. Esta union en tandem, o efecto "quelante", refuerza fuertemente la union a una unica diana, de forma similar a los efectos de avidez observados en las inmunoglobulinas dimericas. Tambien es posible usar componentes que se unan a dianas diferentes. Por lo tanto, por ejemplo, el componente de la cadena ligera sustituta con la especificidad de union deseada puede combinarse con una cadena pesada de un anticuerpo o con un fragmento pesado que se une a una diana diferente. Por ejemplo, el componente de la cadena ligera sustituta puede unirse a un antlgeno tumoral, mientras que la cadena pesada de un anticuerpo o un fragmento de la cadena pesada puede unirse a celulas efectoras. De esta forma puede crearse una unica entidad dirigida y con actividad antitumoral. En una realización en particular, el anexado o el polipeptido que conecta las secuencias de la VpreB y de la A5 puede ser un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, tal como un fragmento Fab o scFv. La incorporacion de una secuencia de un anticuerpo no creara un efecto "quelante", sino que tambien puede generar una bispecificidad en una unica molecula sin la necesidad de un segundo brazo independiente, tal como lo que se encuentra en los anticuerpos biespeclficos. Las dos especificidades pueden ser hacia partes diferentes de la misma diana, hacia dianas distintas o hacia un complejo de anticuerpo diana. De forma analoga, pueden elaborarse construcciones multiespeclficas con cualquier tipo de molecula, distinta a anticuerpos o a fragmentos de anticuerpos, incluyendo peptidos, protelnas, enzimas y similares. Por ejemplo, el componente de la cadena ligera sustituta con la especificidad deseada puede combinarse con cualquier peptido o protelna terapeutica.

[0171] Segun se describe, los componentes VpreB y A5 de la SBP pueden ser modificados de numerosas formas para mejorar la estructura, el comportamiento y/o la estabilidad de las SBP resultantes. Una estrategia para mejorar las cualidades de las SBP puede llevase a cabo mediante la incorporacion de elementos de cadenas ligeras de un anticuerpo en la cadena ligera sustituta. Un ejemplo serla la sustitucion de una o mas regiones en marco de los dominios variables de la cadena ligera de un anticuerpo en las regiones estructuralmente similares de la cadena ligera sustituta. Especlficamente, se podrlan sustituir los residuos definidos por contacto relacionados con el marco de la cadena ligera variable numerados segun Kabat 1-29, 37-45 o 56-88, por los residuos 21-47, 58-67 o 82-117 de la VpreB, respectivamente. Alternativamente, se podrlan sustituir los residuos definidos por Chotia relacionados con el marco de la cadena ligera variable numerados segun Kabat 1-23, 35-49, 57-88, por los residuos 21-41, 56-71 u 83-117 de la VpreB, respectivamente. Estas sustituciones regionales pueden llevarse a cabo en su totalidad, o en forma de una porcion continua o discontinua, para conseguir la cadena ligera sustituta deseada. Adicionalmente, puede llevarse a cabo la sustitucion de una o mas regiones de los dominios de la cadena ligera variable y constante de un anticuerpo en las regiones estructuralmente similares de la cadena ligera sustituta. En este caso se podrlan sustituir los residuos de Kabat del dominio de la cadena ligera 97-215 por los residuos 94-211 de A5, respectivamente. Esta sustitucion regional tambien puede llevarse a cabo en su totalidad, o en forma de una porcion continua o discontinua, para conseguir la cadena ligera sustituta deseada. Tambien pueden incorporarse combinaciones de dichas sustituciones tanto para la VpreB como para la A5 para conseguir la cadena ligera deseada. En cualquier caso, cualquiera o todas las cadenas ligeras sustitutas modificadas y sus respectivas SBP resultantes pueden ser producidas y probadas en sistemas de expresion de protelnas, o usadas por sus potenciales cualidades mejoradas.

Preparation de las construcciones sustitutas de la cadena ligera

[0172] Las construcciones sustitutas de la cadena ligera pueden ser preparadas mediante procedimientos conocidos en la materia, incluyendo tecnicas bien conocidas de la tecnologla de ADN recombinante.

[0173] El acido nucleico que codifica una cadena ligera sustituta, por ejemplo, los polipeptidos VpreB y A5, puede ser aislado a partir de fuentes naturales, por ejemplo, de linfocitos B en desarrollo, y/u obtenidos mediante procedimientos sinteticos o semisinteticos. Una vez que se ha identificado y aislado este a Dn o producido de otro modo, puede ser ligado en un vector replicable para una clonacion adicional o para su expresion.

[0174] Los vectores de clonacion y de expresion que pueden usarse para la expresion de las secuencias codificantes de los polipeptidos de esta invencion son bien conocidos en la materia y estan disponibles en el mercado. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o mas de los siguientes: una secuencia de serialization, un origen de replication, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de termination de la transcription. Algunas celulas hospedadoras adecuadas para la clonacion o la expresion del ADN que codifica las construcciones sustitutas de la cadena ligera en los vectores en esta invencion son celulas procariotas, de levadura o de eucariotas superiores (de mamlfero), siendo preferidas las celulas de mamlfero.

[0175] Algunos ejemplos de llneas de celulas hospedadoras de mamlfero adecuadas incluyen, sin limitation, la llnea de rinon de mono CV1 transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la llnea de rinon embrionario humano 293 (celulas 293) subclonada para su cultivo en un cultivo en suspension, Graham et al, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); celulas de rinon de cachorro de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/-DFHR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77: 4216 (1980)); celulas de sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1 ^a T^c C CCL70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); celulas de carcinoma cervicouterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de hlgado de la rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de hlgado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de raton (MMT 060562, ATCC CCL51); celulas TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una llnea de hepatoma humano (Hep G2).

[0176] Para su uso en las celulas de mamlfero, las funciones de control de los vectores de expresion son proporcionadas a menudo por material vlrico. Por lo tanto, los promotores usados habitualmente pueden derivar de los genomas de polioma, de Adenovirus2, de retrovirus, de citomegalovirus y del Virus Simio 40 (SV40). Otros promotores, tales como el promotor de la actina p, proceden de fuentes heterologas. Algunos ejemplos de promotores adecuados incluyen, sin limitacion, los promotores temprano y tardio del virus SV40 (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)), el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982)) y el promotor y/o las secuencias de control asociadas normalmente con la secuencia genica deseada, siempre que dichas secuencias de control sean compatibles con el sistema de la celula hospedadora.

[0177] La transcripcion de un ADN que codifica un polipeptido heterologo deseado por parte de eucariotas superiores se aumenta mediante la insercion de una secuencia potenciadora en el vector. El potenciador es un elemento que actua en cis del ADN, habitualmente de entre aproximadamente 10 y 300 pb, que actua sobre un promotor para potenciar su actividad de inicio de la transcripcion. Los potenciadores son independientes de la orientacion y la posicion relativa, pero preferentemente estan ubicados secuencia arriba de la secuencia del promotor presente en el vector de expresion. El potenciador puede proceder de la misma fuente que el promotor, tal como, por ejemplo, de un virus de la celula eucariota, por ejemplo, el potenciador del SV40 en el lado tardio del origen de replicacion (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardio del origen de replicacion y potenciadores de adenovirus.

[0178] Los vectores de expresion usados en las celulas hospedadoras de mamifero tambien contienen sitios de poliadenilacion, tales como los obtenidos a partir de virus tales como, por ejemplo, el SV40 (temprano y tardio) o el HBV.

[0179] Un origen de replicacion puede ser proporcionado bien mediante la construccion del vector para que incluya un origen exogeno, tal como el derivado del SV40 o de otra fuente virica (por ejemplo, Polioma, Adeno, v Sv , BPV), o puede ser proporcionado por la celula hospedadora.

[0180] Los vectores de expresion contienen habitualmente un marcador seleccionable que codifica una proteina necesaria para la supervivencia o el crecimiento de una celula hospedadora transformada con el vector. Algunos ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mamifero incluyen la reductasa de dihidrofolato (DHFR), la cinasa de timidina (TK) y la neomicina.

[0181] Los vectores de expresion de mamifero adecuados son bien conocidos en la materia y estan disponibles comercialmente. Por lo tanto, por ejemplo, las construcciones sustitutas de la cadena ligera pueden ser producidas en celulas hospedadoras de mamifero mediante el uso de un vector de expresion pCI (Promega), portador de la region de un potenciador inmediato-temprano/promotor del citomegalovirus humano (CMV), para promover la expresion constitutiva de un inserto de ADN. El vector puede contener un gen de la fosfotransferasa de neomicina como marcador seleccionable.

[0182] Las construcciones sustitutas de la cadena ligera tambien pueden ser producidas en celulas hospedadoras bacterianas. Los elementos de control para su uso en los sistemas bacterianos incluyen promotores, que opcionalmente contienen secuencias operadoras y sitios de union al ribosoma. Algunos promotores adecuados incluyen, sin limitacion, los promotores de la galactosa (gal), de la lactosa (lac), de la maltosa, del triptofano (trp), de la p-lactamasa, el bacteriofago A y el T7. Ademas, pueden usarse promotores sinteticos, tales como el promotor tac. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos tambien contienen generalmente una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) unida operativamente al ADN que codifica la molecula del Fab. El origen de replicacion del plasmido pBR322 es adecuado para la mayoria de las bacterias gramnegativas.

[0183] Las secuencias codificantes de las cadenas individuales de una construccion multicadena que comprenden las secuencias sustitutas de la cadena ligera de un anticuerpo pueden estar presentes en el mismo vector de expresion, bajo el control de secuencias reguladoras individuales, o en vectores de expresion por separado, usarse para la cotransfeccion de las celulas hospedadoras deseadas, incluyendo hospedadores eucariotas y procariotas. Por lo tanto, pueden coexpresarse multiples genes mediante el uso de los vectores Duet™ disponibles comercialmente en Novagen.

[0184] Las celulas hospedadoras transformadas pueden ser cultivadas en una diversidad de medios. Algunos medios disponibles comercialmente para el cultivo de celulas hospedadoras de mamifero incluyen Ham's F10 (Sigma), medio esencial minirno ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma). Ademas, puede usarse cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979) y en Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980) como medio de cultivo para las celulas hospedadoras. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la celula hospedadora seleccionada para la expresion, y estan incluidas en las instrucciones del fabricante o seran evidentes de otro modo para el artesano experto habitual.

[0185] Algunos medios adecuados adicionales para el cultivo de celulas de mamifero, bacterianas (por ejemplo, de E. coli) o de otras celulas hospedadoras tambien se describen en los libros de texto convencionales, tales como, por ejemplo, Sambrook et al., supra, o Ausubel et al., supra.

[0186] La purificacion puede llevarse a cabo mediante los procedimientos conocidos en la materia. En una realización preferida, las moleculas sustitutas del anticuerpo son purificadas en una forma marcada con 6xHis, mediante el uso del sistema de purificacion Ni-NTA (Invitrogen).

Usos de las secuencias sustitutas de la cadena ligera, de las construcciones y de los bancos que las contienen

[0187] Los bancos pueden usarse para la identificacion de las secuencias sustitutas de la cadena ligera y de las construcciones sustitutas de la cadena ligera, tales como las fusiones que comprenden las secuencias sustitutas de la cadena ligera, con las propiedades deseadas. Por ejemplo, un cribado in vitro o in vivo de los bancos de esta invention puede producir polipeptidos que comprenden las secuencias sustitutas de la cadena ligera que se unen a las dianas deseadas con una elevada especificidad y afinidad de union. Por lo tanto, los bancos en esta invencion pueden usarse para la identificacion de moleculas con fines terapeuticos y diagnosticos, tales como polipeptidos que comprenden las secuencias sustitutas de la cadena ligera que se unen a los marcadores tumorales o a otras dianas moleculares de intervention terapeutica. Ademas, mediante las tecnicas descritas anteriormente, pueden disenarse bancos de polipeptidos de la cadena ligera sustituta muy diversos, que incluyen bancos que comprenden una coleccion de polipeptidos que se unen a la misma diana, bancos de polipeptidos que se unen a dianas diferentes, bancos de polipeptidos con multiples especificidades, y similares.

[0188] Como resultado de su capacidad para unirse a cualquier diana deseada, las construcciones de la cadena ligera sustituta de un anticuerpo pueden usarse en ensayos anallticos y diagnosticos para detectar la presencia de una molecula diana deseada, tal como un antlgeno tumoral o cualquier polipeptido asociado con un estado patologico o con una afeccion. En algunas realizaciónes, pueden detectarse la presencia de las celulas que expresan el DR4 y/o el DR5. Ademas, las construcciones sustitutas de la cadena ligera pueden usarse como agentes terapeuticos, tales como, por ejemplo, en una terapia oncologica, contra las celulas diana que estan asociadas con una enfermedad o un trastorno y en las que serla deseable una apoptosis o una proliferation reducida, tal como en el tratamiento del cancer. En algunas realizaciónes se determina que las celulas que expresan el DR4 y o el DR5 estan asociadas con el desarrollo y/o la diseminacion del cancer, y son la diana.

Acoplamiento de las SBP a agentes terapeuticos o a marcadores

[0189] Aunque, para algunas realizaciónes, la union de las SBP a sus ligandos puede modular la actividad biologica de la celula diana, por ejemplo, mediante la activation del DR4 y/o del DR5, el efecto de las SBP sobre la actividad biologica puede aumentarse mediante el acoplamiento de un agente terapeutico a las SBP. En algunas realizaciónes, por lo tanto, las SBP son derivatizadas para introducir grupos funcionales que permiten la union de un agente terapeutico. La SBP puede ser derivatizada para introducir, por ejemplo, cadenas laterales que terminan en grupos hidracida, hidrazina, amina primaria o amina secundaria. Los agentes terapeuticos pueden ser conjugados, por ejemplo, a traves de una union con una base de Schiff, de un enlace de hidrazona o de acil hidrazona o de un conector de hidracida (veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.° 5.474.765 y 5.762.918). En la materia se conoce bien una diversidad de otras qulmicas adecuadas para la conjugation de los agentes terapeuticos a la SBP, segun se ejemplifica en Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, Calif. (1996).

[0190] Segun se describe, puede sustituirse un residuo de cistelna en una cadena ligera sustituta con objeto de acomodar la conjugacion de un farmaco. Por ejemplo, la cadena ligera sustituta ilustrada en la SEQ ID NO: 483 puede ser modificada para sustituir una cistelna en diversas posiciones, incluyendo las posiciones 16 (SEQ ID NO: 487), 21 (SEQ ID NO: 488), 107 (SEQ ID NO: 489), 121 (SEQ ID NO: 490), 125 (SEQ ID NO: 491), 126 (SEQ ID NO: 492), 132 (SEQ ID NO: 493), 138 (SEQ ID NO: 494), 157 (SEQ ID NO: 495), 170 (SEQ ID NO: 496), 178 (SEQ ID NO: 497), 180 (SEQ ID NO: 498), 213 (SEQ ID NO: 499) o 217 (SEQ ID NO: 480). Por ejemplo, la cistelna puede ser sustituida por una treonina en la position 21 (SEQ ID NO: 488), o por una valina en la position 213 (SEQ ID NO: 499). En algunas realizaciónes, una SBP comprende una de estas secuencias de la cadena ligera. Puede unirse un marcador o un agente terapeutico a la SBP a traves de la cistelna sustituida. Por ejemplo, puede usarse una qulmica de maleimida para unir una toxina tal como la monometil auristatina.

[0191] Los agentes terapeuticos pueden seleccionarse, por ejemplo, entre agentes antineoplasicos, agentes antimetabolicos, agentes radioactivos, agentes citotoxicos y agentes quimioterapeuticos.

[0192] Algunos agentes anticancerosos incluyen agentes citotoxicos tales como los siguientes: auristatinas y sus derivados, caliqueamicinas y sus derivados, maitansinoides y sus derivados, la exotoxina de Pseudomonas, ricina, la toxina difterica, gemcitabina; metotrexato; 5-FU; FUDR; FdUMP; hidroxiurea; docetaxel; discodermolida; epotilones; vincristina; vinblastina; vinorelbina; meta-pac; irinotecan; SN-38; 10-OH campto; topotecan; etoposido; adriamicina; flavopiridol; cisplatino; carboplatino; bleomicina; mitomicina C; mitraniicina; capecitabina; citarabina; 2-CI-2'desoxiadenosina; mitoxantrona; mitozolomida; pentostatina; y raltitrexed.

[0193] Las SBP pueden ser adicionalmente modificadas o marcadas para facilitar los usos diagnosticos o terapeuticos. Por ejemplo, pueden conjugarse marcadores detectables tales como un marcador radioactivo, fluorescente, un metal pesado u otro marcador, con las SBP. El marcaje individual, doble o multiple de las SBP puede ser ventajoso. Por ejemplo, una SBP puede tener un marcaje doble, tanto con una yodacion radioactiva de uno o mas residuos, como con el acoplamiento de, por ejemplo, 90Y a traves de un grupo quelante del lateral que contiene la amina, o de grupos reactivos. Este marcaje de combinacion puede ser util para unas necesidades diagnosticas especializadas, tales como la identificacion de masas celulares neoplasicas pequenas ampliamente dispersas.

[0194] Los radioisotopos para el radiomarcaje de las SBP pueden incluir cualquier radioisotopo que pueda ser conjugado o acoplado a un residuo de las SBP. Los radioisotopos pueden seleccionarse entre los radioisotopos que emiten radiacion beta o gamma, o como alternativa, los agentes peptldicos pueden modificarse para que contengan grupos quelantes que, por ejemplo, pueden unirse covalentemente a residuo(s) de lisina del analogo. Despues, los grupos quelantes pueden ser modificados para que contengan cualquiera de una diversidad de radioisotopos, tales como yodo, galio, indio, tecnecio, iterbio, renio o talio (por ejemplo, 125l, 67Ga, 111ln, 99mTc, 169Yb, 186Re, 201TI).

[0195] Los grupos quelantes pueden usarse para acoplar indirectamente marcadores detectables u otras moleculas a la SBP. Por ejemplo, puede unirse un quelante estable bifuncional a uno o mas grupos reactivos de un aminoacido terminal o interno a traves de un isotiocianato beta-Ala o de un conector apropiado que no sea un alfaaminoacido que impida una degradacion de Edman. Algunos ejemplos de quelantes conocidos en la materia incluyen, por ejemplo, los grupos reactivos ininocarboxllico y poliaminopolicarboxllico, DTPA (N,N-bis[2-[bis(carboximetil)amino]etil]glicina) y DOTA (acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10- tetraacetico).

[0196] En terminos de diagnostico y tratamiento de enfermedades o de trastornos tales como el cancer, la SBP puede usarse para la preparacion de composiciones diagnosticas y de imagen y de kits que utilizan las SBP en procedimientos diagnosticos y de imagen (por ejemplo, procedimientos diagnosticos in vivo e in vitro). Por ejemplo, pueden obtenerse imagenes de un tumor vascularizado mediante el uso de una cantidad diagnosticamente eficaz de una SBP que incluye al menos una primera molecula de union que se une a un componente accesible de una celula tumoral, de la vasculatura tumoral o del estroma tumoral, unida a un agente de obtencion de imagenes diagnosticas in vivo.

[0197] En algunas realizaciónes en las que la enfermedad o el trastorno es un cancer, la obtencion de imagenes previas antes del tratamiento del cancer puede llevarse a cabo mediante: (a) la administracion al animal o al paciente de una cantidad diagnosticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende una SBP marcada de forma detectable que tiene una primera molecula de union que se une con una elevada afinidad a un receptor caracterlstico muy expresado de una celula tumoral, o a la vasculatura tumoral o al estroma tumoral, y una segunda molecula de union que se une con al menos un orden de magnitud de afinidad menor a un segundo receptor expresado de forma ubicua; y (b) la posterior deteccion de la SBP marcada de forma detectable unida a las celulas tumorales, a los vasos sangulneos del tumor o al estroma tumoral; obteniendo as! una imagen del tumor, de la vasculatura tumoral y/o del estroma tumoral.

Usos terapeuticos

[0198] En algunas realizaciónes, las SBP pueden usarse para/en terapias que implican la administracion de las SBP a un animal, preferentemente a un mamlfero y lo mas preferentemente un paciente humano, para el tratamiento de una o mas enfermedades o trastornos. En algunas realizaciónes, las SBP o las porciones de union de las mismas se usan para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno asociado con la senalizacion dependiente del DR4 y/o del DR5, o de una enfermedad o de un trastorno que implica las celulas que expresan el DR4 y/o el DR5. Algunos compuestos terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, las SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas. Las SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas pueden usarse para el tratamiento, la inhibicion o la prevention de enfermedades en las que serla beneficiosa una reduction de la proliferacion celular o una apoptosis de las celulas que expresan de forma natural, o que se han modificado para que expresen, el DR4 y/o el DR5, incluyendo las enfermedades y los trastornos descritos en esta invention. En algunas realizaciónes, las enfermedades o los trastornos que se van a tratar estan asociados con una proliferation celular aberrante. El tratamiento y/o la prevencion de las enfermedades y de los trastornos puede incluir, pero no se limita a, el alivio de los slntomas asociados con las enfermedades y los trastornos. Las SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas pueden ser proporcionadas en composiciones farmaceuticamente aceptables, segun se conoce en la materia o segun se describe en esta invencion. Armado con las ensenanzas proporcionadas en esta invencion, el experto habitual en la materia sabra como usar las SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas para fines diagnosticos, de monitorizacion y terapeuticos sin una excesiva experimentation.

[0199] Segun se describe, las SBP pueden ser administradas solas o junto con otros tipos de tratamiento (por ejemplo, una radioterapia, uno quimioterapia, una terapia hormonal, una inmunoterapia y con agentes antitumorales). Como se ha analizado anteriormente, en algunas realizaciónes las SBP pueden estar acopladas a un agente terapeutico y/o un agente diagnostico. Por ejemplo, una SBP puede estar acoplada a una toxina.

[0200] Tambien se proporcionan procedimientos que usan las SBP, las porciones de union al antlgeno de las mismas y los anticuerpos que se unen al DR4 y/o al DR5 en una diversidad de aplicaciones diagnosticas y terapeuticas ex vivo e in vivo. Por ejemplo, las SBP y/o los anticuerpos descritos en esta invencion pueden usarse para el tratamiento de una enfermedad en la que las celulas que van a ser la diana expresan el DR4 y/o el DR5, incluyendo una diversidad de canceres. En algunas realizaciónes, las celulas asociadas con una enfermedad o con un trastorno pueden ser ensayadas para evaluar la expresion del DR4 y o del DR5 antes del tratamiento. En algunas realizaciónes, las celulas asociadas con una enfermedad o con un trastorno pueden ser modificadas para que expresen el DR4 y/o el DR5 antes del tratamiento con una SBP o con una porcion de union al antlgeno de la misma.

[0201] Segun se describe, se proporcionan procedimientos para el tratamiento de una enfermedad en los que las celulas que expresan el DR4 y/o el DR5 van a ser destruidas o se va a inhibir su proliferacion mediante la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una SBP, de una porcion de union al antlgeno de la misma y/o de los anticuerpos, en una cantidad eficaz para el tratamiento de la enfermedad. En algunas realizaciónes, la SBP es una SBP agonista doble, tal como la SL-466 o la SL-231. En algunas realizaciónes, la SBP se acopla a un agente terapeutico diferente, tal como una toxina. Algunas enfermedades adecuadas incluyen, por ejemplo, una diversidad de canceres que incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cancer de mama, cancer de ovario, carcinoma renal, canceres linfoides, cancer gastrointestinal, cancer de colon, canceres epidemicos, cancer de pulmon (por ejemplo, cancer de pulmon no microcltico), cancer de pancreas y cancer de prostata; enfermedades infecciosas vlricas tales como la gripe, VIH, CMV, RSV y HTLV; y una enfermedad inflamatoria autoinmune tal como el lupus eritematoso sistemico y la artritis reumatoide.

[0202] Segun se describe, la SBP, la porcion de union al antlgeno de la misma y/o los anticuerpos pueden ser administrados solos o con otro agente terapeutico que actua junto o sinergicamente con la SBP, con la porcion de union al antlgeno de la misma y/o con los anticuerpos para el tratamiento de la enfermedad o del trastorno. Dichos agentes terapeuticos pueden incluir, por ejemplo, los agentes anticancerosos descritos infra (por ejemplo, citotoxinas, agentes quimioterapeuticos, moleculas pequenas y radiacion). En algunas realizaciónes, los agentes terapeuticos para la terapia de combination incluyen erlotinib (Tarceva.RTM.), paclitaxel (Taxol™.) y cisplatino (CD-DP). En algunas realizaciónes los agentes incluyen inhibidores de la aromatasa, inhibidores del receptor de estrogenos, lapatinab, gefitinib, inhibidores de la cinasa de Pl3 y/o inhibidores de la AKT.

[0203] En ciertos aspectos, las SBP, las porciones de union al antlgeno de las mismas y/o los anticuerpos descritos en esta invencion son administrados a pacientes.

[0204] Segun se describe, se proporcionan procedimientos para el diagnostico de una enfermedad (por ejemplo, de un cancer) asociada con la expresion del receptor de muerte en un sujeto, poniendo en contacto los anticuerpos, las porciones de union al antlgeno y/o las SBP descritas en esta invencion (por ejemplo, ex vivo o in vivo) con las celulas del sujeto, y midiendo el nivel de union al DR4, al DR5 o tanto al DR4 como al DR5, en las celulas. Unos niveles de union anormalmente elevados a los receptores de muerte indican que el sujeto tiene una enfermedad para la cual las protelnas de union sustitutas agonistas del receptor de muerte son o pueden ser una option de tratamiento.

[0205] Segun se describe, se proporcionan procedimientos para la supresion del crecimiento tumoral. Los procedimientos pueden incluir proporcionar una SBP del DR4 y/o del DR5 o porciones de union al antlgeno de la misma, tal como se describe en esta invencion, a un tumor que comprende celulas que expresan el DR4 y/o el DR5. La SBP puede reducir la proliferacion de las celulas tumorales, por ejemplo, mediante la estimulacion de la ruta del receptor de muerte. En algunas realizaciónes, los procedimientos de supresion del crecimiento tumoral comprenden proporcionar una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 a un tumor que comprende celulas que expresan el DR4 y el DR5. La SBP agonista doble puede ser, por ejemplo, la SL-466 o la SL-231 o comprender una o mas porciones de union al antlgeno de la misma. La SBP puede estar conjugada con un agente terapeutico tal como una toxina. En algunas realizaciónes, la SBP agonista doble del DR4 y del DR5 puede ser mas eficaz en la supresion del crecimiento tumoral que los agonistas simples del receptor.

[0206] Se describen procedimientos para la destruction de las celulas tumorales. Los procedimientos pueden comprender poner en contacto las celulas tumorales que expresan el DR4 y/o el DR5 con una SBP o con porciones de union al antlgeno de la misma, segun se describe en esta invencion. La SBP puede desencadenar la apoptosis en las celulas tumorales. En algunas realizaciónes, las celulas tumorales se ponen en contacto in vivo. En algunas realizaciónes, las SBP son administradas junto con otra composition que reduce la proliferacion celular del tumor y/o que destruye las celulas tumorales. En algunas realizaciónes, los procedimientos de destruccion de las celulas tumorales comprenden proporcionar una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 a un tumor que comprende celulas que expresan el DR4 y el DR5. La SBP agonista doble puede ser, por ejemplo, la SL-466 o la SL-231, o comprender una o mas porciones de union al antlgeno de la misma. La SBP puede estar conjugada con un agente terapeutico tal como una toxina. En algunas realizaciónes, una SBP agonista doble es capaz de activar la apoptosis en los tumores que son poco o nada sensibles a los agonistas simples del receptor.

[0207] En algunas realizaciónes, las SBP descritas en esta invencion, o las porciones de union al antlgeno de las mismas, pueden usarse para inhibir, bloquear o reducir la proliferacion de celulas in vitro, in vivo o ex vivo. En algunas realizaciónes, las celulas que comprenden el DR4 y/o el DR5 se ponen en contacto con una SBP o con porciones de union al antlgeno de la misma. La SBP puede inducir la apoptosis en las celulas, en algunas realizaciónes, los procedimientos comprenden poner en contacto las celulas con una SBP agonista doble con un tumor que comprende celulas que expresan el DR4 y el DR5. La SBP agonista doble puede ser, por ejemplo, la SL-466 o la SL-231, o comprender una o mas porciones de union al antlgeno de la misma.

[0208] Se describen procedimientos para la estimulacion de la apoptosis en celulas que expresan el DR4 y/o el DR5. Los procedimientos pueden llevarse a cabo in vitro, in vivo o ex vivo. Los procedimientos pueden comprender poner en contacto las celulas que expresan el DR4 y/o el DR5 con una SBP o con porciones de union al antlgeno de la misma, segun se describe en esta invencion. La SBP puede estimular la apoptosis en las celulas, en algunas realizaciónes las celulas se ponen en contacto in vivo. En algunas realizaciónes, las SBP son administradas en combinacion con otra composicion que reduce la proliferacion celular y/o que destruye las celulas. En algunas realizaciónes, la SBP esta conjugada con una composicion que reduce la proliferacion celular y/o que destruye las celulas. En algunas realizaciónes, los procedimientos de estimulacion de la apoptosis en las celulas comprenden proporcionar una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 a las celulas que expresan el DR4 y el DR5. La SBP agonista doble puede ser, por ejemplo, la SL-466 o la SL-231, o comprender una o mas porciones de union al antlgeno de la misma. La ^s B^p puede estar conjugada con un agente tal como una toxina. En algunas realizaciónes, una SBP agonista doble es capaz de estimular la apoptosis en las celulas que son poco o nada sensibles a los agonistas simples del receptor.

[0209] En algunas realizaciónes, la cantidad de cualquiera de las protelnas de union sustitutas proporcionadas en esta invencion (por ejemplo, la SL466 y/o la SL231) puede usarse en una cantidad de al menos 0,001 mg/kg de peso corporal del sujeto, por ejemplo, de 0,001, de 0,01, de 0,1, de 1, de 10, de 20, de 30, de 40, de 50, de 60, de 70, de 80, de 90 o de 100 mg/kg de peso corporal del sujeto, incluyendo cualquier intervalo definido entre dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunas realizaciónes, la cantidad de la protelna de union sustituta usada es de entre 0,1 y 100 mg/kg.

[0210] En algunas realizaciónes se usa terapeuticamente una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno que es poco o nada sensible a los agentes que se dirigen al DR4 o al DR5 individualmente. En algunas realizaciónes se usa una SBP agonista doble del DR4 y del DR5 para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno caracterizado por celulas que tienen unos perfiles de receptor de muerte heterogeneos, tales como las celulas que tienen una expresion diferencial del DR4 y del DR5. En algunas realizaciónes, la expresion diferencial puede incluir, pero no se limita a, ninguna o una baja expression del DR4 y una elevada expresion del DR5. En algunas realizaciónes, la enfermedad o el trastorno puede ser un cancer de pancreas, un linfoma, tal como un linfoma de Burkitt o un linfoma de linfocitos T o un cancer de mama. En algunas realizaciónes se usa terapeuticamente una SBP agonista doble del DR4 y del DR5, y es mas eficaz que cualquiera de una SBP del DR4 o un anticuerpo, una SBP del DR5 o un anticuerpo, o una combinacion de una SBP del DR4 o un anticuerpo y una SBP del DR5 o un anticuerpo. En algunas de las realizaciónes mencionadas anteriormente, la SBP agonista doble del DR4 y del DR5 puede ser la SL466 (3706-A02) o la SL231 (3631-G09), o una SBP que comprende una o mas CDR o dominios de union de la SL466 o de la SL231. En algunas realizaciónes, la SBP agonista doble puede estar conjugada con un agente terapeutico, tal como una toxina o un agente quimioterapeutico. En algunas realizaciónes la SBP agonista doble puede ser administrada junto con un agente quimioterapeutico, por ejemplo, obatoclax o doxorrubicina.

Composiciones terapeuticas/profilacticas basadas en la protefna de union sustituta y administracion de las mismas

[0211] Algunas realizaciónes proporcionan procedimientos para el tratamiento, la inhibicion y la profilaxis mediante la administracion a un sujeto de una cantidad eficaz de una SBP o de una porcion de union al antlgeno de la misma. En algunas realizaciónes, la SBP o la porcion de union al antlgeno de la misma esta sustancialmente purificada (por ejemplo, sustancialmente exenta de sustancias que limitan su efecto o que producen unos efectos secundarios no deseados). El sujeto puede ser un animal, incluyendo, pero no se limitan a, animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos y perros, y preferentemente es un mamlfero, y en algunas realizaciónes, un ser humano.

[0212] Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para la administracion de una SBP, por ejemplo, una encapsulacion en liposomas, micropartlculas, microcapsulas, celulas recombinantes capaces de expresar la SBP o porciones de union al antlgeno de las mismas, una endocitosis mediada por receptor (vease, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432, 1987), la construccion de un acido nucleico como parte de un vector retrovlrico o de otro, etc. Algunos procedimientos de introduccion incluyen, pero no se limitan a, la via intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural y oral. Las SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas pueden ser administradas mediante cualquier via conveniente, por ejemplo, mediante una infusion o una inyeccion en bolo, mediante una absorcion a traves del revestimiento epitelial o mucocutaneo (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden ser administradas junto con otros agentes biologicamente activos. La administracion puede ser sistemica o local. Ademas, puede ser deseable introducir la SBP o las porciones de union al antlgeno de la misma en el sistema nervioso central mediante cualquier via adecuada, incluyendo una inyeccion intraventricular e intratecal; una inyeccion intraventricular puede ser facilitada mediante un cateter intraventricular, por ejemplo, unido a un deposito, tal como un deposito de Ommaya. Tambien puede emplearse una administration pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o de un nebulizador y de la formulation con un agente de aerosolizacion.

[0213] En algunas realizaciónes puede ser deseable administrar las SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas localmente en la zona en necesidad de tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo y no como limitation, mediante una infusion local durante una cirugla, una aplicacion topica, por ejemplo, junto con el aposito de una herida despues de la cirugla, mediante una inyeccion, por medio de un cateter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialasticas, o fibras. En algunas realizaciónes, cuando se administra una SBP o unas porciones de union al antlgeno de la misma, debe tenerse cuidado de usar materiales a los que no se absorba la SBP o la portion de union al antlgeno de la misma.

[0214] En algunas realizaciónes, las SBP, las porciones de union al antlgeno de las mismas y/o los anticuerpos pueden ser suministrados en una veslcula, en particular en un liposoma (vease, Langer, Science 249: 1527-1533,1990; y Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, paginas 353-365, 1989).

[0215] En algunas realizaciónes, la SBP, las porciones de union al antlgeno de la misma y/o los anticuerpos pueden ser suministrados en un sistema de liberation controlada. En algunas realizaciónes puede usarse una bomba (vease, Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201, 1987; Buchwald et al., Surgery 88: 507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574, 1989). En algunas realizaciónes pueden usarse materiales polimericos (vease, Medical Applications of Controlled Release Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, N. Y. (1984); Ranger y Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; vease tambien Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Floward et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). En algunas realizaciónes, puede colocarse un sistema de liberacion controlada en las proximidades de la diana terapeutica, por ejemplo, de un organo del cuerpo afectado, tal como el cerebro, los pulmones, un rinon, el hlgado, un ovario, los testlculos, el colon, el pancreas, una mama y la piel, requiriendo por tanto unicamente una fraction de la dosis sistemica (vease, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, paginas 115­ 138 (1984)). Otros sistemas de liberacion controlada se analizan en la revision de Langer (1990, Science 249: 1527­ 1533).

[0216] Las SBP, las porciones de union al antlgeno de las mismas y/o los anticuerpos tambien pueden ser proporcionados en una composition farmaceutica. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una SBP, de unas porciones de union al antlgeno de la misma y/o de los anticuerpos, y un portador farmaceuticamente aceptable. En algunas realizaciónes, el termino "farmaceuticamente aceptable" significa aprobado por una autoridad sanitaria del gobierno federal o estatal, o recogido en la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra Farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "portador" se refiere a un diluyente, un adyuvante, un excipiente o un vehlculo con el que se administra el producto terapeutico. Dichos portadores farmaceuticos pueden ser llquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen del petroleo, animal, vegetal o sintetico, tal como el aceite de cacahuete, el aceite de soja, un aceite mineral, el aceite de sesamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composicion farmaceutica se administra por via intravenosa. Tambien pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y de glicerol como portadores llquidos, particularmente para soluciones inyectables. Algunos excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sllice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composicion tambien puede contener unas cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o de agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsion, comprimidos, plldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. La composicion puede estar formulada en forma de un supositorio, con los aglutinantes y portadores tradicionales tales como trigliceridos. La formulacion oral puede incluir los portadores convencionales tales como manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. de calidad farmaceutica. Algunos ejemplos de portadores farmaceuticos adecuados se describen en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, A. R. Gennaro, ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. (20a Ed., 2003). Dichas composiciones contendran una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto, preferentemente en una forma purificada, junto con una cantidad adecuada del portador, de forma que se proporcione la forma para su administracion apropiada al paciente. La formulacion deberla ajustarse al modo de administracion.

[0217] En algunas realizaciónes, la composicion es formulada segun los procedimientos rutinarios en forma de una composicion farmaceutica adaptada para su administracion intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administracion intravenosa son soluciones en un tampon acuoso isotonico esteril. Cuando sea necesario, la composicion tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como lignocalna para atenuar el dolor en el sitio de la inyeccion. Generalmente, los ingredientes son suministrados bien por separado o bien mezclados entre si en una forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado o seco, o de un concentrado exento de agua en un recipiente sellado hermeticamente tal como una ampolla o una bolsita que indica la cantidad del agente activo. Cuando la composicion va a ser administrada mediante una infusion, puede ser dispensada con un frasco de infusion que contiene agua o solucion salina esteril de calidad farmaceutica. Cuando la composicion es administrada mediante inyeccion, puede proporcionarse una ampolla de agua esteril para inyeccion o una solucion salina, de forma que los ingredientes puedan ser mezclados antes de su administracion.

[0218] Las SBP, las porciones de union al antlgeno de las mismas y/o los anticuerpos, cuando son formulados en composiciones farmaceuticas, pueden ser formulados en formas neutras o salinas. Algunas sales farmaceuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como las obtenidas a partir de los acidos clorhldrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc. y las formadas con cationes tales como las obtenidas a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxidos ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etil-amino etanol, histidina o procalna.

[0219] La cantidad de la SBP, de las porciones de union al antlgeno de la misma y/o de los anticuerpos que seran eficaces en el tratamiento, la inhibicion y la prevention de una enfermedad o de un trastorno, tales como los asociados con una actividad celular aberrante, puede ser determinada mediante las tecnicas cllnicas convencionales, a la luz de la description presentada en esta invention. Ademas, opcionalmente pueden emplearse ensayos in vitro para ayudar en la identification de los intervalos de dosificacion optimos. La dosis precisa que se va a emplear en la formulation tambien dependera de la via de administracion y de la gravedad de la enfermedad o del trastorno, y debera ser decidida segun el juicio de profesional y de las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden ser extrapoladas a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o con un modelo de animal.

[0220] Para las SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas, la dosis administrada a un paciente es normalmente de entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada a un paciente es de entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, mas preferentemente de entre 1 mg/kg y 10 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosis y la frecuencia de administracion de las SBP o de las porciones de union al antlgeno de las mismas puede reducirse mejorando la captation y la penetration tisular de las SBP o de las porciones de union al antlgeno de las mismas mediante modificaciones tales como, por ejemplo, una lipidacion.

[0221] En algunas realizaciónes, puede usarse cualquiera de las SBP descritas para la preparation de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de los trastornos anteriores.

[0222] En otro aspecto se describe una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, que contiene una o una combination de SBP, de las porciones de union antlgeno de las mismas y/o de los anticuerpos descritos en esta invencion, formulados junto con un portador farmaceuticamente aceptable. Segun se describe, las composiciones incluyen una combinacion de multiples (por ejemplo, dos o mas) agentes aislados que se unen a diferentes epltopos del DR4 y/o del DR5. Segun se describe, las composiciones incluyen SBP agonistas dobles del DR4 y del DR5 o porciones de union de las mismas. Segun se describe, las composiciones comprenden una o ambas de la SL-466 y la SL-231.

[0223] Segun se usa en esta invencion, un "portador farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion y similares que sean fisiologicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para una administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, mediante una inyeccion o una infusion). Dependiendo de la via de administracion, el agente activo, es decir, la SBP o la portion de union de la misma, el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo, la molecula biespeclfica y multiespeclfica, puede ser recubierta en un material para proteger al agente de la action de los acidos y de otras condiciones naturales que pudieran inactivarlo.

[0224] Una "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biologica deseada de compuesto parental y que no imparte ningun efecto toxicologico no deseado (vease, por ejemplo, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sel. 66 : 1-19). Algunos ejemplos de dichas sales incluyen sales de adicion acida y sales de adicion basica. Algunas sales de adicion acida incluyen las obtenidas a partir de acidos inorganicos no toxicos, tales como clorhldrico, nltrico, fosforico, sulfurico, bromhldrico, clorhldrico, fosforoso y similares, as! como de acidos organicos no toxicos tales como acidos mono- y dicarboxllicos alifaticos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxi alcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos, y similares. Algunas sales de adicion basica incluyen las obtenidas a partir de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, as! como a partir de aminas organicas no toxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, clorprocalna, colina, dietanolamina, etilendiamina, procalna y similares.

[0225] Las composiciones farmaceuticas pueden comprender otros agentes. Por ejemplo, la composicion puede incluir al menos uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como los agentes anticancerosos descritos infra. Las composiciones farmaceuticas tambien pueden ser administradas junto con una radioterapia y/o una cirugla. Alternativamente, una composicion puede ser administrada conjuntamente por separado con al menos uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como los agentes anticancerosos descritos infra.

[0226] Para las composiciones terapeuticas, las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para una administracion oral, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), transdermica, subcutanea, intratecal, intraespinal, rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificacion unitaria, y pueden ser preparadas mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica de la Farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion individual variara dependiendo del sujeto que se va a tratar y del modo de administracion en particular. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion individual sera generalmente aquella cantidad de la composicion que produce un efecto terapeutico. Generalmente, de un cien por ciento, esta cantidad variara entre aproximadamente el 0,001 por ciento y aproximadamente un noventa por ciento del principio activo, preferentemente entre aproximadamente el 0,005 por ciento y aproximadamente el 70 por ciento, lo mas preferentemente entre aproximadamente el 0,01 por ciento y aproximadamente el 30 por ciento.

[0227] Las formulaciones que son adecuadas para una administracion vaginal tambien incluyen ovulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen dichos portadores, como se sabe que es apropiado en la materia. Las formas de dosificacion para la administracion topica o transdermica de las composiciones incluyen polvos, aerosoles, unguentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. El agente activo puede mezclarse en unas condiciones esteriles con un portador farmaceuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampon o propelente.

[0228] Las frases "administracion parenteral" y "administrado por via parenteral" segun se usan en esta invention significan los modos de administracion distintos a la administracion enteral y topica, habitualmente mediante una inyeccion, e incluyen, sin limitation, una inyeccion y una infusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

[0229] Algunos ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y las mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La apropiada fluidez puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

[0230] Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Algunos ejemplos en particular de adyuvantes que son bien conocidos en la materia incluyen, por ejemplo, adyuvantes inorganicos (tales como sales de aluminio, por ejemplo, fosfato de aluminio e hidroxido de aluminio), adyuvantes organicos (por ejemplo, escualeno), adyuvantes con base oleosa, virosomas (por ejemplo, virosomas que contienen una hemaglutinina unida a la membrana y una neuraminidasa derivada del virus de la gripe).

[0231] La prevention de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto mediante procedimientos de esterilizacion, supra, como mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, acido fenol sorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio y similares, en las composiciones.

[0232] Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusion de agentes que retrasan la absorcion, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

[0233] Cuando las SBP de la presente description son administradas en forma de productos farmaceuticos a seres humanos y a animales, pueden ser administradas solas o en forma de una composicion farmaceutica que contiene, por ejemplo, del 0,001 al 90 % (mas preferentemente, del 0,005 al 70 %, tal como del 0,01 al 30 %) de principio activo junto con un portador farmaceuticamente aceptable.

[0234] Independientemente de la via de administracion seleccionada, las SBP, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmaceuticas, se formulan en unas formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables mediante los procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

[0235] Los niveles de dosificacion reales de los principios activos en las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion pueden modificarse de forma que se obtenga una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion en particular, sin que sea toxica para el paciente. Los niveles de dosis seleccionados dependeran de una diversidad de factores farmacocineticos que incluyen la actividad de las composiciones empleadas en particular, o, para los compuestos administrados conjuntamente con anticuerpos o con fragmentos de los mismos proporcionados en esta invencion, el ester, la sal o la amida de los mismos, la via de administracion, el momento de la administracion, el Indice de excrecion del agente en particular que se esta empleando, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados junto con las composiciones en particular empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y los antecedentes medicos previos del paciente que se va a tratar y factores similares bien conocidos en el arte medico. Un medico o un veterinario con una pericia habitual en la materia puede determinar facilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composicion farmaceutica requerida. Por ejemplo, el medico o el veterinario puede comenzar las dosis de las SBP, de las porciones de union al antlgeno de las mismas y/o de los anticuerpos empleados en la composicion farmaceutica a unos niveles menores de los necesarios con objeto de conseguir el efecto terapeutico deseado, y aumentar gradualmente la dosis hasta que se consiga el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composicion sera aquella cantidad que proporcione el menor nivel de dosis eficaz para producir un efecto terapeutico. Dicha dosis eficaz dependera generalmente de los factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administracion sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea, preferentemente administrada proxima al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composicion terapeutica puede ser administrada en forma de dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis administradas por separado a unos intervalos apropiados a lo largo del dla, opcionalmente, en formas de dosificacion unitaria. Aunque es posible que una SBP, una porcion de union al antlgeno y/o un anticuerpo de la presente descripcion sean administrados solos, es preferible administrar la SBP, la porcion de union al antlgeno y/o el anticuerpo en forma de una formulacion (composicion) farmaceutica.

[0236] Las composiciones terapeuticas pueden ser administradas con dispositivos medicos conocidos en la materia. Por ejemplo, en una realización preferida, una composicion terapeutica de la descripcion puede ser administrada con un dispositivo de inyeccion hipodermico sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Algunos ejemplos de implantes y modulos bien conocidos incluyen: la Patente de Estados Unidos n.° 4.487.603, que describe una bomba de microinfusion implantable para la dispensacion de una medicacion a una velocidad controlada; la Patente de Estados Unidos n.° 4.486.194, que describe un dispositivo terapeutico para la administracion de medicaciones a traves de la piel; la Patente de Estados Unidos n.° 4.447.233, que describe una bomba de infusion de medicacion para la administracion de medicacion a una velocidad de infusion precisa; la Patente de Estados Unidos n.° 4.447.224, que describe un aparato de infusion implantable de caudal variable para la administracion continua de farmacos; la Patente de Estados Unidos n.° 4.439.196, que describe un sistema de administracion osmotico de farmacos que tiene unos compartimentos multicamara; y la Patente de Estados Unidos n.° 4.475.196, que describe un sistema de administracion osmotico de farmacos. Muchos otros implantes, sistemas y modulos de administracion son conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciónes, una SBP, una porcion de union al antlgeno de la misma y/o un anticuerpo pueden ser administrados por via intravenosa, transdermica, subcutanea, intraperitoneal, intratecal, epidural y/o espinal.

[0237] En ciertas realizaciónes, las composiciones descritas en esta invencion pueden ser formuladas para asegurar una apropiada distribution in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefalica (BHE) excluye muchos compuestos muy hidrofilos. Para asegurar que los compuestos terapeuticos atraviesan la BHE (si se desea), pueden ser formulados, por ejemplo, en liposomas. Para los procedimientos de elaboration de liposomas, veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.° 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o mas fracciones que son transportadas selectivamente a celulas u organos especlficos, mejorando as! la administracion dirigida de farmacos (vease, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Algunos ejemplos de fracciones de direccionamiento incluyen folato o biotina (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.416.016 a favor de Low et al.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.

153: 1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); el receptor de la protelna tensioactiva A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), diferentes especies de los cuales pueden comprender las formulaciones, as! como los componentes de las moleculas inventadas; pag. 120 (Schreleret al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); vease tambien K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Kllllon; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

[0238] En algunas realizaciónes, una combination o composicion de una SBP incluye mas de una SBP, de una porcion de union al antlgeno de la misma y/o de un anticuerpo. En algunas realizaciónes, la composicion comprende al menos una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR4 y/o al DR5. En algunas realizaciónes, la composicion comprende al menos una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une tanto al DR4 como al ^d R5. En algunas realizaciónes, la composicion comprende al menos una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR4 y/o al DR5, y una segunda SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR4 y/o al DR5. En algunas realizaciónes, las dos o mas SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas se unen a diferentes epltopos o no compiten entre si por la union al ^d R4 y/o al DR5. En algunas realizaciónes, las dos o mas SBP o las porciones de union al antlgeno de las mismas se unen a epltopos similares o solapantes.

[0239] En algunas realizaciónes, una composicion comprende al menos una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR5 y una segunda SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR4. En algunas realizaciónes, una composicion comprende al menos una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR5 y al DR4 y una segunda SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une tanto al DR5 como al DR4. En algunas realizaciónes, la composicion comprende al menos una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR5 y/o al DR4, y un anticuerpo que se une a ese DR5 y/o DR4. En algunas realizaciónes, la composicion comprende al menos una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR5 y un anticuerpo que se une al DR4, o viceversa. En algunas realizaciónes, la composicion comprende al menos una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma que se une al DR5 y al DR4, y un anticuerpo que se une al DR5 y/o al ^d R4. Para las anteriores realizaciónes pertinentes, las SBP pueden ser tanto una construccion biespeclfica individual como un par de construcciones.

[0240] En algunas realizaciónes, se puede combinar una SBP, una porcion de union al antlgeno de la misma o un anticuerpo con uno o mas inhibidores de un factor de crecimiento o con otras composiciones para aumentar la destruccion de las celulas tumorales.

[0241] En algunas realizaciónes, pueden combinarse una o mas SBP, porciones de union al antlgeno o anticuerpos con uno o mas agentes quimioterapeuticos tradicionales, inhibidores de la cinasa de tirosina del factor de crecimiento, inhibidores de la cinasa de protelna, activadores de la caspasa o apoptoticos, inhibidores de los microtubulos (por ejemplo, taxanos), inhibidores del receptor de estrogenos (tamoxifin), inhibidores de la aromatasa y/o inhibidores de la HSP90.

[0242] En algunas realizaciónes, cualquiera de los procedimientos proporcionados en esta invencion puede emplear cualquiera de las composiciones, los compuestos, los kits, las s Bp , las combinaciones de SBP, etc. descritos en esta invencion.

Kits

[0243] Algunas realizaciónes tambien engloban kits para su uso en terapia o en la deteccion de las celulas que expresan o que sobreexpresan las moleculas in vivo, o en muestras biologicas. En algunas realizaciónes, los kits contienen SBP, porciones de union al antlgeno de las mismas y/o anticuerpos dirigidos contra el DR4 y/o el DR5. En algunas realizaciónes, los kits contienen SBP, porciones de union al antlgeno de las mismas o anticuerpos, dirigidos contra el DR4 y el DR5. Dependiendo del uso, las SBP, las porciones de union al antlgeno de las mismas y/o los anticuerpos, pueden ser funcionalizados con conectores o quelantes, o con ambos, para el acoplamiento a un efector (por ejemplo, una fraccion radioactiva, un liposoma, una citotoxina, un anticuerpo, una SBP o una porcion de union al antlgeno de la misma, etc.) segun se describe en esta invencion. Los kits comprenden adicionalmente opcionalmente tampones y composiciones que se van a usar para la deteccion de la SBP o de la porcion de union al antlgeno de la misma.

[0244] Los kits tambien pueden incluir materiales de instrucciones que ensenan el uso de las SBP o de las porciones de union al antlgeno de las mismas, para la terapia o para la deteccion, por ejemplo, de celulas cancerosas, y/o que ensenan la combinacion de las SBP o de las porciones de union al antlgeno de las mismas con reactivos de funcionalizacion, o que ensenan el uso de las SBP funcionalizadas o de las porciones de union al antlgeno de las mismas para aplicaciones de obtencion de imagenes y/o terapeuticas. En algunas realizaciónes, la SBP o la porcion de union al antlgeno de la misma se proporciona funcionalizada con un conector y/o con un quelante (en un recipiente) junto con uno o mas efectores, por ejemplo, citotoxinas, marcadores radiactivos (en un segundo recipiente) de forma que los dos componentes puedan ser administrados por separado (por ejemplo, en estrategias de pre-direccionamiento) o de forma que los dos componentes puedan combinarse poco antes de su uso.

[0245] Ciertos materiales de instrucciones pueden proporcionar el regimen de dosificacion recomendado, las contraindicaciones y similares. Aunque los materiales de instrucciones comprenden normalmente materiales escritos o impresos, en esta descripcion se contempla cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y comunicarlas al usuario final. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, medios de almacenamiento electronico (por ejemplo, discos magneticos, cintas, cartuchos, chips), medios opticos (por ejemplo, un CD ROM) y similares, o ubicaciones de internet que proporcionan las instrucciones. En algunas realizaciónes, tambien se proporciona un paquete o un kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes que contienen uno o mas de los ingredientes de las composiciones farmaceuticas de la SBP. Opcionalmente, asociado con dicho(s) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una autoridad sanitaria que regula la fabricacion, el uso o la venta de productos farmaceuticos o biologicos, aviso que refleja la aprobacion por parte de la autoridad sanitaria del uso o la venta para su administration a seres humanos.

[0246] En algunas realizaciónes, cualquiera de las SBP descritas puede ser parte de un kit para el tratamiento de uno de los trastornos anteriores. En algunas realizaciónes, el kit incluira una dosis unitaria que va a ser administrada a un sujeto 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 veces al dla. En algunas realizaciónes, la composicion esta configurada para una administracion subcutanea o IV.

[0247] Los detalles adicionales de la invencion se proporcionan en los siguientes Ejemplos no limitantes. EJEMPLO 1

IDENTIFICACION DE LAS SBP MONOVALENTES DE UNION AL DR5 A PARTIR DE UN CRIBADO DE EXPRESION EN FAGO

[0248] Este ejemplo detalla la construccion de un banco de globulinas sustitutas (en particular, de SBP monovalentes) y la identificacion de las globulinas sustitutas (en particular, de las SBP monovalentes) que se unen al DR5.

[0249] Los bancos de expresion en fago estaban formados por SBP monovalentes diversificadas mostradas en forma de fusiones PIll en la superficie del bacteriofago M13. Las SBP monovalentes comprenden cadenas pesadas en marco (en particular VH1 o VH3), que incluyen la region CH1, diversificadas en las CDR 1, 2 y 3 y complejadas con la fusion de la cadena ligera sustituta 1. (Xu, Yee et al. 2008). El diseno y la construccion de las cadenas pesadas diversificadas para su uso en la expresion en fago se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 20090082213 CONSTRUCTION OF DIVERSE SYNTHETIC PEPTIDE AND POLYPEPTIDE LIBRARIES.

[0250] La expresion en fagemido de los bancos de SBP monovalente se llevo a cabo mediante los procedimientos convencionales. Las celulas TG-1 transformadas con plasmidos de expresion se cultivaron hasta un semilog (D.O. de 600 -0.3) en medio 2-YT complementado con 100 mcg/ml de ampicilina y un 2 % de represion de glucosa y despues se infectaron con el fago colaborador m13K07 y se cultivaron durante una noche en medio 2-YT complementado con 100 mcg de ampicilina, 70 mcg/ml de kanamicina y 200 micromolar de IPTG. Los sobrenadantes que contenlan el fago se precipitaron mediante el uso de polietilenglicol y los fagos resuspendidos en PBS se usaron para la seleccion en DR5 inmovilizados.

[0251] La seleccion de los bancos se llevo a cabo mediante el uso bien de sDR5 (Peprotech) inmovilizado en los pocillos de una placa de microtitulacion, o bien de sDR5 biotinilado inmovilizado en microesferas magneticas derivatizadas con estreptavidina (Dynal).

[0252] En el formato basado en placas, se recubrieron placas de ELISA Immulon 4HBX con el sDR5. Despues las placas se bloquearon con p Bs , Tween 20 al 0,05 %, un 4 % de leche en polvo desnatada durante 1 hora. Se bloquearon aproximadamente 1012-1013 fagos como anteriormente y se aplicaron a los pocillos recubiertos con la diana. Despues de una incubacion de dos horas, los pocillos se lavaron mediante el uso de PBS, Tween 20 al 0,05 %. Despues, los fagos se eluyeron con glicina-HCI 0,2 M, a un pH de 2,2, con 1 mg/ml de BSA. Los fagos eluldos fueron neutralizados mediante el uso de Tris base 2 M. Los fagos eluldos fueron sometidos a rondas de amplificacion adicionales y se seleccionaron hasta que el tltulo del fago eluldo de los pocillos recubiertos con el DR5 excedla el tltulo eluldo de los pocillos bloqueados no recubiertos.

[0253] En la seleccion basada en microesferas, el sDR5 fue biotinilado mediante el uso de un kit de biotinilacion de NHS-PEO⁴ (Pierce). Despues, la protelna biotinilada fue inmovilizada en microesferas magneticas de estreptavidina (Dynal). La seleccion se llevo a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente para la seleccion basada en placa, excepto porque se uso PBS, Tween 20 al 0,05 %, un 1 % de BSA como el agente bloqueante. Se recogieron las microesferas magneticamente despues de la union inicial del fago y despues de cada etapa de lavado.

[0254] Para identificar los clones del fago que codificaban las SBP monovalentes de union al DR5, se uso una porcion del fago eluldo para infectar la E. coli HB2151, permitiendo la expresion de las SBP monovalentes periplasmicas codificadas por el fago. Los clones individuales se recogieron en placas de pocillos profundos y se cultivaron durante una noche en 2YT que contiene ampicilina e IPTG 0,2 mM. Las bacterias se lisaron con BPERII y los lisados se aplicaron a las placas recubiertas con el sDR5. Despues del lavado, la union de las globulinas sustitutas se detecto mediante el uso de un anticuerpo anti-etiqueta E conjugado con HRP (Abeam).

[0255] El analisis de la tercera ronda de clasificacion dio como resultado la union de mas de un 72 % de los clones ensayados al DR5. Veanse las FIGs. 1A y B.

EJEMPLO 2

ANALISIS DE LA UNION AL DR4 Y AL DR5 DE LAS SBP MONOVALENTES IDENTIFICADAS A PARTIR DEL CRIBADO CON EL DR4 O EL DR5

[0256] Se probo la union de las SBP monovalentes 3631-G09 y 3641-F01 al DR4 y al DR5. La union de las SBP monovalentes en una serie de diluciones se llevo a cabo en pocillos de microtitulacion recubiertos con 100 ul de DR4 o de DR5 a 1 microgramo/ml. La presencia de las SBP monovalentes unidas fue detectada mediante el uso de un anticuerpo anti-etiqueta E conjugado con HRP. La SBP monovalente 3631-G09 reconoce tanto el DR4 como el DR5, mientras que la 3641-F01 es especlfica para el DR5. Veanse las FIGs. 2A y B.

EJEMPLO 3

LAS SBP MONOVALENTES DE UNION AL DR5 MUESTRAN UN INTERVALO DE CAPACIDADES PARA INHIBIR LA UNION DEL DR5 AL TRAIL

[0257] Las SBP monovalentes cuya union al DR5 se confirmo fueron probadas para evaluar su capacidad de bloquear la interaccion del TRAIL con el DR5. En resumen, se mezclaron DR5 8 nM en PBST IX un 4 % (concentracion final) de leche en polvo desnatada (NFDM) con el lisado HB2151 de las SBP monovalentes de union al DR5, y se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla se anadio despues a una placa de microtitulacion previamente recubierta con TRAIL 20 nM y bloqueada con NFDM. Los complejos se incubaron con el TRAIL durante 1 hora a la temperatura ambiente, y despues las protelnas no unidas se eliminaron mediante un lavado 3x con PBST IX. La presencia del DR5 unido fue detectada con un anticuerpo policlonal de cabra anti-DR5 y un anticuerpo policlonal anti-cabra conjugado con HRP.

[0258] Segun se muestra en la siguiente Tabla 0.4, las SBP monovalentes de union al DR5 mostraron diferentes capacidades para bloquear la union del DR5 al TRAIL. Aquellas que muestran una inhibition > 40 % fueron seleccionadas para analisis adicionales.

Tabla 0.4

EJEMPLO 4

LOS RESULTADOS POSITIVOS DEL CRIBADO DEL DR5 NO SE UNEN A LOS RECEPTORES SENUELO DCR1 Y DCR2

[0259] Se probo la capacidad de las SBP monovalentes de unirse a los receptores senuelo DcR1 y DcR2. El analisis de union de ELISA se llevo a cabo de una forma similar al procedimiento descrito en el Ejemplo 1, con la excepcion de que se usaron el DcR1 y el DcR2 para recubrir los pocillos de microtitulacion, cada uno a 1 microgramo/ml de concentracion y se usaron 100 ul por pocillo. Los resultados se muestran en las FIGs. 3A- D.

[0260] Los resultados positivos identificados que se unlan al DR5 o al DR4 y al DR5 son especlficos y no se unen al DcR1 o al DcR2.

EJEMPLO 5

DOMINIOS DE UNION AL TRAIL

[0261] El DR4 humano (SEQ ID NO: 22), el DR5 (SEQ ID NO: 24), el DcR1 (SEQ ID NO: 21) y el DcR2 (SEQ ID NO: 23) muestran una similitud limitada en los dominios de union extracelulares a las protelnas TRAIL (FIG. 4). Se produce una divergencia significativa en el dominio rico en cistelna (CRD) que contiene 6 pares conservados de cistelna que participan en los puentes de disulfuro para formar el dominio de union al TRAIL. La homologla entre las protelnas se muestra en la siguiente Tabla 0.5, con la mayor homologla entre el DcR1 y el DcR2. Debido a dicha divergencia en la secuencia, es posible identificar las protelnas de union sustitutas que se unen a un miembro de la familia o a un subconjunto de miembros de la familia, y no a otros.

Tabla 0.5

EJEMPLO 6

MODIFICACION DE LA SAB EN GLOBULINAS SUSTITUTAS HUMANAS

[0262] Este ejemplo detalla el reformateo de las SBP monovalentes en una SBP bivalente. En este ejemplo, la SBP bivalente esta formada por una cadena pesada en marco de longitud completa complejada con la fusion de cadena ligera sustituta 1. (Xu, Yee et al. 2008 Proc Natl Acad Sci U S A 105 (31): 10756-61). La cadena pesada contiene en este ejemplo una Fc humana gamma I. Las secuencias de las cadenas pesadas fueron optimizadas para su expresion en celulas de mamlfero mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA). Despues de la slntesis, se subclonaron en un vector de expresion de mamlfero de forma que las regiones variables estuvieran fusionadas con una Fc de longitud completa de la IgG1. Estas construcciones fueron cotransfectadas junto con un vector de expresion de la cadena ligera sustituta que estaba optimizado de forma similar para su expresion en celulas de mamlfero. Las SBP bivalentes fueron producidas temporalmente en sistemas basados en HEK293 esencialmente segun se describe (Xu, Yee et al. (2008) "Combinatorial surrobody libraries." Proc Natl Acad Sci U S A 105 (31): 10756-61). Las SBP bivalentes resultantes descritas en los ejemplos se purificaron mediante una FPLC a traves de una cromatografla de Protelna A.

EJEMPLO 7

LAS GLOBULINAS SUSTITUTAS DE UNION AL RECEPTOR DE MUERTE SE UNEN A LOS RECEPTORES DE MUERTE HUMANOS Y NO A LOS DE RATON

[0263] Las SBP bivalentes derivadas de la selection mediante la expresion en fago con el DR4 o el DR5 humanos son especlficas para las protelnas humanas y no se unen al receptor de muerte de raton. Se probaron 5 protelnas de union sustitutas de union al receptor de muerte para evaluar su capacidad de unirse al DR4 humano, al DR5 humano y al DR5 de raton. Se recubrieron pocillos de microtitulacion con 100 nanogramos/pocillo de DR4 humano-Fc, de DR5 humano-Fc o de DR5 de raton-Fc, y se usaron una SBP bivalente 10 nM, anticuerpos policlonales de control anti-diana o TRAIL biotinilado para la detection y la confirmation de la actividad de union. Segun se muestra en las FIGs. 5A-C, una SBP bivalente, la 3631-G09, se une a tanto al DR4 humano como al DR5 humano, pero no al DR5 de raton. Todas las demas SBP bivalentes se unen al DR5 humano y no al DR5 de raton.

EJEMPLO 8

EL RECEPTOR DE MUERTE DE RATON DR5 TIENE POCA HOMOLOGIA CON LOS RECEPTORES DE MUERTE HUMANOS

[0264] Se alinearon los dominios de union al TRAIL del DR4 humano, del DR5 humano y del DR5 de raton para su comparacion. FIG. 6. La CRD con los 6 pares de cistelnas, una marca caracterlstica de la familia de receptores de muerte, esta conservada, pero la similitud global es baja en esta region. El DR5 de raton comparte una similitud (identidad) del 44,9 % (34,6 %) y del 42,6 % (36,8 %) con el DR4 y el DR5 humanos, respectivamente. A pesar de la limitada similitud en la secuencia con las protelnas humanas, el receptor de muerte del raton es capaz de unirse al TRAIL humano.

EJEMPLO 9

LA SBP BIVALENTE DEL RECEPTOR DE MUERTE MUESTRA UNA ELEVADA AFINIDAD MEDIANTE UN ELISA DE ANTIGENO

[0265] Las SBP bivalentes del receptor de muerte tienen una fuerte union al DR5 o al DR4 y al DR5, y muestran especificidad por los antlgenos en un ELISA. La SBP bivalente 3631-G09 muestra una fuerte union tanto al DR4 como al DR5. FIGs. 7A y 7B.

[0266] Los pocillos recubiertos con 100 ul de 1 microgramo/ml de DR4 humano o de DR5 humano fueron bloqueados y a continuation expuestos a una serie de diluciones semilogarltmicas de varias SBP anti-receptor de muerte en PBST IX, un 4 % de NFDM. Las SBP bivalentes fueran detectadas mediante el uso de un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con HRP. La IgG de control Mab631 (R&D Systems, Minneapolis MN) fue detectada con un anticuerpo policlonal anti-raton conjugado con HRP, y el TRAIL biotinilado fue detectado con estreptavidina HRP. La 3631-G09 (SL231) tiene una elevada afinidad por el DR4 y el DR5, con unas concentraciones de union de la mitad de la maxima de ~ 30 pM y de 50 pM, respectivamente. A pesar de no mostrar union como las SBP monovalentes monovalentes, la 2737-F08 y la 3641-F01 muestran una union debil al DR4 como la SBP bivalente, con unas concentraciones de la mitad de la senal del ELISA de 11,7 nM y de 21 nM. Todas las SBP bivalentes probadas aqul tenlan unas concentraciones de la mitad de la senal del ELISA de < 1 nM con sus respectivas dianas.

[0267] Ademas del analisis con el DR4 y el DR5, se analizo la union de las SBP bivalentes 3631-G09 (SL231) y 3641-F01 al DcR1, al DcR2 y a la osteoprotegrina (FIG. 7C y D). La menor concentracion que muestra la union maxima esta representada con la determinacion de la CE⁵⁰ proporcionada en el recuadro de la tabla (Fig. 7C y D). No se observo union a los receptores senuelo a 1.000 nM, mientras que se observo una union maxima a los receptores de muerte a 10 nM

EJEMPLO 10

LA SBP MONOVALENTE DEL RECEPTOR DE MUERTE INHIBE LA PROLIFERACION CELULAR EN CELULAS COLO205

[0268] La SBP monovalente anti-receptor de muerte inhibe la proliferacion celular cuando es reticulada por multiples anticuerpos y permite las pruebas funcionales de las SBP monovalentes expresadas en bacterias. FIG. 8.

[0269] Las celulas Colo205 se cultivaron en placas de microtitulacion de 96 pocillos sembradas a una densidad de 10.000 celulas/pocillo. La SBP monovalente 3631-G09 (SL231) se preparo mediante la mezcla de la SBP monovalente 1 uM con 500 nM de un anticuerpo monoclonal anti-etiqueta de His, 250 nM de un anticuerpo policlonal anti-raton y 500 nM de un anticuerpo anti-VpreB durante 1 hora, para promover la reticulacion de la ^s B^p monovalente. La mezcla de SBP monovalente reticulada/anticuerpo se diluyo a continuacion sucesivamente en incrementos semilogarltmicos, se anadio a las celulas y se incubo a 37 C durante 48 horas. Los pocillos que contienen los anticuerpos usados para la reticulacion sin la SBP monovalente se usaron como controles, ademas del Mab631 y el lisado de celulas HB2151 solo. Para revelar el ensayo, se anadieron 10 ul de reactivo WST (Roche) y las celulas se incubaron durante 4 horas adicionales. Las placas se leyeron con un lector de microplacas Molecular Devices con un filtro de 450 nm. Los datos fueron analizados y representados graficamente mediante el uso de Microsoft Excel.

[0270] Las SBP monovalentes agonistas del DR5 fueron identificadas rapidamente mediante una prueba funcional en un ensayo basado en celulas desarrollado mediante el uso del sustrato fluorescente Cell-TiterGlo (Promega). Se probaron las SBP monovalentes identificadas mediante el uso del ensayo de interferencia del TRAIL (FIG. 9).

EJEMPLO 11

LA SBP BIVALENTE AGONISTA DEL RECEPTOR DE MUERTE INHIBE LA PROLIFERACION CELULAR EN UN ENSAYO BASADO EN CELULAS

[0271] La reticulacion de una SBP bivalente anti-DR5, que se ha demostrado que desestabiliza la union del DR5 al TRAIL como una SBP monovalente, inhibe potencialmente la proliferacion celular. FIGs. 10A y B. Se sembraron celulas Colo205 a 10.000 celulas/pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Se anadieron diluciones sucesivas de la SBP a las celulas (FIG. 10A) y se incubaron durante 48 horas antes de su revelado con el reactivo WST-1. Alternativamente, se mezclaron diluciones sucesivas semilogaritmicas de la SBP bivalente con un anticuerpo anti-Fc humano al 50 % de la concentracion de la SBP bivalente, y esta mezcla se anadio a las celulas (FIG. 10B) y se revelo de una forma similar. Se usaron celulas sin tratar y Mab631 (R&D Systems) como controles.

EJEMPLO 12

ACTIVACION DE LAS RUTAS DE LA CASPASA INDUCTORAS DE LA APOPTOSIS MEDIANTE LAS GLOBULINAS SUSTITUTAS RETICULADAS ANTI-RECEPTOR DE MUERTE

[0272] La inhibicion de la proliferacion celular causada por la reticulacion de las SBP bivalentes de las globulinas sustitutas anti-receptor de muerte es debida a la activacion de la ruta pro-apoptotica de la caspasa. FIGs.

11A, B y C. Se colocaron celulas Colo205 a 10.000 celulas/pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos y se incubaron durante una noche. Al dla siguiente se anadieron a los pocillos una SBP bivalente 20 nM anticuerpo anti-Fc o Mab631 10 nM (R&D Systems). La activacion de la caspasa fue monitorizada en el momento 0 y despues cada hora durante siete horas y a las 24 horas. Se anadieron los sustratos peptldicos especlficos de la caspasa que se vuelven luminiscentes tras la escision (Caspasa 8 Glo, Caspasa 3/7 Glo y Caspasa 9 Glo, Promega) en los intervalos de tiempo apropiados, y se midio la luminiscencia.

EJEMPLO 13

LAS SBP BIVALENTES RETICULADAS ANTI-RECEPTOR DE MUERTE ACTIVAN LA APOPTOSIS SEGUN SE MUESTRA MEDIANTE LA ESCISION DEL ADN

[0273] La inhibition de la proliferation celular inducida por el receptor de muerte esta mediada por la activation de las rutas pro-apoptoticas que culminan en la fase irreversible de la escision del ADN. FIG. 12. Se incubaron celulas Colo205 (2 millones por tratamiento) con una SBP bivalente 100 nM anticuerpo anti-Fc 50 nM o Mab631 100 nM solo durante 5 horas. Se purifico el ADN a partir de las celulas y se analizo mediante una electroforesis en gel y una tincion con bromuro de etidio para la visualization. El carril marcado como control contiene el ADN de la celula U87 proporcionado por el fabricante del kit (Roche)

EJEMPLO 14

ACTIVACION DE LA ACTIVIDAD APOPTOTICA DE LAS SBP BIVALENTES EN CELULAS COLO205 MEDIANTE UNA RETICULACION ANTI-FC O PROTEINA G

[0274] Se llevo a cabo una comparacion de los diferentes agentes de reticulation y proporciones de reticulador: SBP bivalente, siendo la lectura la proliferacion celular de las Colo205. Se incubo un anticuerpo anti-Fc o protelna G a una equivalencia molar del 50 % o en forma de una concentration fija (unicamente la protelna G) a traves de un intervalo de diluciones semilogarltmicas de los artlculos de prueba. Las celulas (10.000/pocillo) se incubaron durante 48 horas en presencia del agente de prueba antes de la adicion del WST-1 para el revelado.

[0275] La SBP bivalente reticulada anti-Fc tenia la mayor actividad, y la mitad de la concentracion de la protelna G era mas coherente (intervalo menor). La condition de equivalencia molar del 50 % tenia una menor variation, y es probable que los valores generados representen las CE⁵⁰ para los dimeros de SBP bivalente y no para los complejos de ordenes mayores. Vease la siguiente Tabla 0.6.

Tabla 0.6

EJEMPLO 15

ACTIVIDAD DE LA SBP BIVALENTE AGONISTA DEL RECEPTOR DE MUERTE FRENTE A UN CONJUNTO DE LINEAS CELULARES QUE REPRESENTAN DIVERSOS TIPOS DE CANCER

[0276] De forma similar a los ensayos basados en celulas que usan la linea Colo205, se probaron las SgG con lineas celulares de origen linfoide, hepatico, epidermico y pancreatico. Los ensayos se llevaron a cabo esencialmente segun se describe para la linea celular Colo205, mas arriba.

[0277] Las lineas celulares de diferentes tejidos de origen (de colon - Colo205, linfoide - Ramos-RAI Jurkat, epidermico (de pulmon) - A549, hepatico - HepG2, de mama - MDA-MB-231 y pancreatico - BxPC3) muestran sensibilidad al agonismo del receptor de muerte (FIG 13A-G). La 3631-G09, que presenta reactividad cruzada con el DR4 y con el DR5 en ensayos bioquimicos, muestra actividad en la linea celular Ramos, que expresa predominantemente el DR4, lo que confirma la doble activacion de la reactividad y del receptor de muerte en las celulas. La 3641-F01, una molecula agonista especifica del DR5, tenia muy poco efecto sobre estas celulas, lo que demuestra que el agonismo del DR4 es responsable del efecto sobre la proliferacion celular (FIG. 13B). Las CE⁵⁰ se proporcionan en la Tabla 0.7. En estos ensayos, todas las lineas celulares se usaron a 10.000 celulas/pocillo excepto las celulas Ramos, que se usaron a 50.000 por pocillo. Se uso el siguiente medio de crecimiento para las ilneas celulares indicadas: RPM11640 10 % de FBS - Colo205, Ramos, Jurkat, BxPC3; F12K 10 % de FBS -A549; EMEM 10 % de FBS - HepG2; L-15 de Leibowitz 10 % de FBS - MDA-MB-231. Todas las llneas celulares se obtuvieron en la ATCC y se conservaron segun las especificaciones recomendadas. Se mezclaron diluciones sucesivas semilogarltmicas de la SgG con un anticuerpo anti-Fc humano o Protelna G al 50 % de la concentracion de la SgG. Esto fue seguido por una incubacion a 37 C 5 % de CO2 durante 48 horas antes de revelar con el reactivo WST-1. En los ensayos con las celulas Jurkat y MDA-MB-231, los ensayos se incubaron durante 18 horas seguido del revelado con Caspasa 3/7 GLO. Los datos fueron analizados con el programa informatico Prism GraphPad y los resultados se muestran en la FIG13 y en la Tabla 0.7.

Tabla 0.7

EJEMPLO 16

EFECTOS ANTI-TUMORALES ^{IN V IV O} DE LA SBP BIVALENTE AGONISTA DEL RECEPTOR DE MUERTE EN UN MODELO DE RATON

[0278] Estudio de un xenoinjerto de Colo205 para determinar los efectos anti-tumorales in vivo de las globulinas sustitutas agonistas del receptor de muerte en un modelo de raton. Se inyectaron por via subcutanea 5 x 106 celulas Colo205 en un 50 % de Matrlgel en la axila derecha de ratones atlmicos exogamicos. Los tumores se dejaron desarrollar hasta que alcanzaron un volumen de ~ 150 mm3, segun se determino mediante la medicion con un calibre. Los ratones (10 por grupo) se trataron a continuacion 2x/semana con el vehlculo (PBS IX), con el control (Avastin, 5 mg/kg) o con la SBP bivalente (la 3631-G09, la 3641-F01, la 2737-F08 y la 2737-A01, todas a 3 mg/kg). El volumen del tumor y el peso del raton se midieron dos veces por semana. El punto final era 45 dlas o un volumen tumoral que alcanza los 1.000 mm3. La administracion continuo en todos los grupos hasta el dla 45, excepto para el grupo con la SBP bivalente 3631-G09, en el que la administracion se detuvo el dla 21 para permitir la recidiva del tumor, y el de PBS, que alcanzo el punto final. Se representaron graficamente las curvas de crecimiento tumoral medias (FIG. 14A) y las respuestas tumorales individuales (FIGs. 14B-G).

[0279] El tratamiento con la SBP bivalente impacto de forma importante en el crecimiento tumoral del xenoinjerto de Colo205. La SBP bivalente 3631-G09 genero respuestas tumorales en la totalidad de los 10 ratones, 9 regresiones completas y 1 regresion parcial. Despues del dla 21 (tratamiento #5), no se administraron tratamientos adicionales al grupo con la SBP bivalente 3631-G09 para evaluar la recidiva del tumor. Todos los ratones tratados con la SBP bivalente 3631-G09 con una regresion completa permanecieron sin tumores hasta el final del estudio. En el grupo con la SBP bivalente 3641-F01, sobrevivio la totalidad de los 10 ratones y el tratamiento genero 2 regresiones completas y 2 regresiones parciales. El tratamiento con la SBP bivalente 2737-F08 produjo 6 ratones supervivientes sin ninguna regresion del tumor, y con la SBP bivalente 2737-A01 habla 9 ratones supervivientes, con 1 regresion completa y 3 regresiones parciales. El tratamiento con Avastin no produjo ninguna regresion tumoral, pero dio como resultado un retraso en el crecimiento del tumor, como se esperaba para este modelo con un Indice de supervivencia del 50 %.

EJEMPLO 17

COMBINACION DE UNA GLOBULINA SUSTITUTA Y UN TRATAMIENTO QUIMIOTERAPEUTICO EN UNA LINEA CELULAR DE CANCER DE PANCREAS

[0280] Se observo un aumento en la eficacia al combinar un tratamiento quimioterapeutico con una SBP bivalente agonista del receptor de muerte a unas dosis submaximas para ambos agentes en una llnea celular de cancer de pancreas. Se evaluo la mejora en los efectos antiproliferativos de las celulas BxPC3 solas, tratadas con 1 uM de agentes quimioterapeuticos citotoxicos, con 3 nM de la SBP bivalente, o con los tratamientos combinados de agentes quimioterapeuticos/SBP bivalente, del agonismo combinado de quimioterapia/receptor de muerte. FIGs 15A-F. Los agentes quimioterapeuticos fueron elegidos sobre la base del tratamiento y la validacion cllnicas convencionales, y se anadieron a las celulas 24 horas antes de la adicion de la SBP bivalente, seguido de 48 horas de incubacion a 37C y un revelado mediante el uso del reactivo WST-1.

[0281] Se observo un aumento en los efectos antiproliferativos en las celulas BxPC3 con la mayorla de las SBP junto con 5-FU u oxaliplatino. Se detectaron unos efectos mas debiles en las combinaciones de la SBP bivalente con etoposido, irinotecan y posiblemente doxorrubicina. No se observo que el carboplatino tuviera ningun efecto junto con las SBP, ni que la SBP bivalente 2737-F08 fuera activa en ninguna combinacion, a esta concentracion.

[0282] En dos estudios similares se observo un aumento en la eficacia o en la potencia despues de la combinacion de un tratamiento quimioterapeutico con una SBP bivalente agonista del receptor de muerte a unas dosis submaximas para diversos agentes en la llnea celular de cancer de pancreas PANC-1 y MiaPaCa. Esencialmente, las celulas se trataron con una concentracion fija de entre 3 y 30 uM de agentes quimioterapeuticos citotoxicos, y un intervalo de dosis de los tratamientos con la SBP, y se evaluaron frente al tratamiento solo con la SBP. El ensayo se llevo a cabo de una forma similar a los anteriores, excepto porque se sembraron 10.000 celulas por pocillo, y el tratamiento duro 72 horas antes de la evaluacion con el WST-1. Cada llnea celular y regimen de tratamiento fueron analizados y representados graficamente mediante el uso de un analisis de datos Prism, segun se muestra en la FIG. 44 y 45.

[0283] En el caso de las celulas PANC-1, todas las condiciones mostraban un aumento en la actividad o en la potencia, mientras que las celulas MiaPaCa solo mostraron un aumento en la actividad o en la potencia en algunas de las condiciones de combinacion, notablemente cuando se combinaban con vorinostat, etoposido u obataclax. EJEMPLO 18

COMBINACION DE UNA GLOBULINA SUSTITUTA Y UN TRATAMIENTO QUIMIOTERAPEUTICO EN UNA

LiNEA CELULAR DE CANCER DE COLON

[0284] Aumento en la eficacia al combinar un tratamiento quimioterapeutico con las globulinas sustitutas agonistas del receptor de muerte a unas dosis submaximas para ambos agentes en una llnea celular de cancer de colon. Se evaluo la mejora en los efectos antiproliferativos de las celulas Colo205 solas, tratadas con 0,1 uM o con 1 uM de agentes quimioterapeuticos citotoxicos, con la CI²⁵ de la SBP, o con los tratamientos combinados de agente quimioterapeutico/SBP bivalente, del agonismo combinado de quimioterapia/receptor de muerte. FIGs. 16A-F. Los agentes quimioterapeuticos fueron elegidos sobre la base del tratamiento y la validacion cllnicas convencionales, y se anadieron a las celulas 24 horas antes de la adicion de la SBP bivalente, seguido de 48 horas de incubacion a 37C y un revelado mediante el uso del reactivo WST-1.

[0285] Se observo un aumento en los efectos antiproliferativos en las celulas Colo205 con la mayorla de las SBP bivalentes junto con irinotecan. Se detectaron unos efectos mas debiles en las combinaciones de la SBP bivalente con etoposido, carboplatino y posiblemente 5-FU y doxorrubicina. No se observo que el carboplatino tuviera ningun efecto en la combinacion de SBP bivalentes, ni que la SBP bivalente 2737-F08 SBP fuera activa en ninguna combinacion, a esta concentracion.

EJEMPLO 19

COMBINACION DE UNA GLOBULINA SUSTITUTA Y UN TRATAMIENTO QUIMIOTERAPEUTICO EN UNA

LiNEA CELULAR DE CANCER DE MAMA

[0286] Aumento en la eficacia al combinar un tratamiento quimioterapeutico con las globulinas sustitutas agonistas del receptor de muerte a unas dosis submaximas para ambos agentes en una llnea celular de cancer de mama. Se evaluo la mejora en los efectos antiproliferativos de las celulas BT-474 solas, tratadas con 0,28 uM o con 1 uM de agentes quimioterapeuticos citotoxicos, con 10 nM de la SBP, o con los tratamientos combinados de agente quimioterapeutico/SBP, del agonismo combinado de quimioterapia/receptor de muerte. FIGs. 17A-F. Los agentes quimioterapeuticos fueron elegidos sobre la base del tratamiento y la validacion cllnicas convencionales, y se anadieron a las celulas 24 horas antes de la adicion de la SBP bivalente, seguido de 48 horas de incubacion a 37C y un revelado mediante el uso del reactivo WST-1.

[0287] Se observo un aumento en los efectos antiproliferativos en las celulas BT-474 con la mayorla de las SBP junto con doxorrubicina, y se observaron unos posibles efectos mas debiles junto con oxaliplatino.

EJEMPLO 20

LA SBP BIVALENTE 3631-G09 RALENTIZA EL CRECIMIENTO TUMORAL DEL XENOINJERTO RAMOS [0288] A ratones CB17 SCID (CRL) se les inyectaron 1 x 10⁶ celulas Ramos en el costado derecho, y los tumores se dejaron crecer hasta un volumen de 150 mm³. Despues los ratones se clasificaron en grupos de 10 para un tratamiento de 2x/semana con PBS IX, o con 0,1, 0,3, 1, 3,2 o 10 mg/kg de la SBP bivalente 3631-G09, o con 5 mg/kg de rituximab (el control para este modelo de xenoinjerto y el tratamiento cllnico convencional). Los tumores se midieron 2x/semana y se realizo un seguimiento del volumen del tumor hasta el punto final del estudio (volumen tumoral > 2.000 mm³ o 30 dlas). Los ratones con unos tumores que alcanzaban los 2.000 mm³ o que se encontraban en un estado moribundo fueron eliminados del estudio y sacrificados humanamente. Se midio el volumen del tumor medio e individual, y se representaron graficamente las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (FIG. 18).

[0289] El tratamiento con la SBP bivalente 3631-G09 (SL231) a 3,2 y a 10 mg/kg dio como resultado un beneficio de supervivencia estadisticamente significativo en comparacion con el tratamiento con PBS, y no era significativamente diferente del tratamiento con rituximab (5 mg/kg) (panel superior derecho). Adicionalmente, se comparo el volumen medio del tumor en el dia 8 despues del tratamiento (el ultimo punto de datos en el que todos los animales todavia estaban en el estudio) en todos los grupos de tratamiento mediante una prueba de la t unidireccional. El rituximab y 10 mg/kg de la SBP bivalente 3631-G09 eran estadisticamente significativos con respecto al PBS. Ademas, no se observo ninguna diferencia estadisticamente significativa entre el rituximab y los dos niveles de dosis de la SBP bivalente 3631-G09 (SL231).

EJEMPLO 21

TRATAMIENTO DE COMBINACION DE LA LINEA CELULAR DE CANCER DE COLON COLO205 CON LA SBP BIVALENTE 3631-G09

[0290] El tratamiento de combinacion de la linea celular de cancer de colon Colo205 con la SBP bivalente 3631-G09 (SL231) y diversos agentes quimioterapeuticos especificos de ruta mostro un aumento en los efectos antiproliferativos. Las celulas Colo205 se sembraron a 10.000 celulas/pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Despues de una incubacion durante 5 horas a 37C 5 % de CO², se anadieron los agentes quimioterapeuticos a las concentraciones indicadas, y despues se incubaron a 37C 5 % de CO² durante una noche. Al dia siguiente se anadieron una serie de diluciones de la SBP bivalente 3631-G09 a los pocillos apropiados, seguido de una incubacion durante 24 horas a 37C 5 % de CO². Despues, los ensayos se revelaron mediante el uso del reactivo WST-1, se incubaron durante 4 horas a 37C 5 % de CO², se leyeron con un lector de placas y se representaron graficamente mediante el uso del programa informatico GraphPad Prism v5.03.

[0291] Varios inhibidores especificos de la ruta mostraron un aumento en la potencia cuando se usaban junto con las SBP agonistas del receptor de muerte. FIGs. 19A-1. Bortezomib, vorinostat, obatoclax, navitoclax y GDC-0941 mostraron, todos, unos efectos aditivos o sinergicos. Los efectos mas pronunciados fueron observados con el vorinostat, un inhibidor de la HDAC. Obatoclax y navitoclax, inhibidores de la Bcl-2, tambien mostraron un aumento en la potencia con la SBP bivalente 3631-G09.

EJEMPLO 22

TRATAMIENTO DE COMBINACION DE LA LINEA CELULAR DE CANCER DE COLON COLO205 CON LA SBP BIVALENTE 3641-F01

[0292] El tratamiento de combinacion de la linea celular de cancer de colon Colo205 con la SBP bivalente 3641-F01 y diversos agentes quimioterapeuticos especificos de ruta mostro un aumento en los efectos antiproliferativos. Las celulas Colo205 se sembraron a 10.000 celulas/pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Despues de una incubacion durante 5 horas a 37C 5 % de CO², se anadieron los agentes quimioterapeuticos a las concentraciones indicadas, y despues se incubaron a 37C 5 % de CO² durante una noche. Al dia siguiente se anadieron una serie de diluciones de la SBP bivalente 3641-F01 a los pocillos apropiados, seguido de una incubacion durante 24 horas a 37C 5 % de CO². Despues, los ensayos se revelaron mediante el uso del reactivo WST-1, se incubaron durante 4 horas a 37C 5 % de CO², se leyeron con un lector de placas y se representaron graficamente mediante el uso del programa informatico GraphPad Prism v5.03.

[0293] Varios inhibidores especificos de la ruta mostraron un aumento en la potencia cuando se usaban junto con las SBP agonistas del receptor de muerte. FIGs. 20A-I. Bortezomib, vorinostat, obatoclax, navitoclax y GDC-0941 mostraron, todos, unos efectos aditivos o sinergicos. Los efectos mas pronunciados fueron observados vorinostat, un inhibidor de la HDAC. Obatoclax y navitoclax, inhibidores de la Bcl-2, tambien mostraron un aumento en la potencia con la SBP bivalente 3641-F01.

EJEMPLO 23

TRATAMIENTO DE COMBINACION DE LA LINEA CELULAR DE CANCER DE PANCREAS BXPC3 CON LA SBP BIVALENTE 3631-G09

[0294] El tratamiento de combinacion de la linea celular de cancer de pancreas BxPC3 con la SBP bivalente 3631-G09 y diversos agentes quimioterapeuticos especificos de ruta mostro un aumento en los efectos antiproliferativos. Las celulas BxPC3 celulas se sembraron a 10.000 celulas/pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Despues de una incubacion durante 5 horas a 37C 5 % de CO², se anadieron los agentes quimioterapeuticos a las concentraciones indicadas, y despues se incubaron a 37C 5 % de CO² durante una noche. Al dia siguiente se anadieron una serie de diluciones de la SBP bivalente 3631-G09 (SL-231) a los pocillos apropiados, seguido de una incubacion durante 24 horas a 37C 5 % de CO². Despues, los ensayos se revelaron mediante el uso del reactivo WST-1, se incubaron durante 4 horas a 37C 5 % de CO², se leyeron con un lector de placas y se representaron graficamente mediante el uso del programa informatico GraphPad Prism v5.03.

[0295] Varios inhibidores especificos de la ruta mostraron un aumento en la potencia cuando se usaban en combinacion con las SBP agonistas del receptor de muerte. FIGs. 21 A-l. Obatoclax, navitoclax y GDC-0941 mostraron, todos, unos efectos aditivos en combinacion con la SBP bivalente 3631-G09 (SL-231).

EJEMPLO 24

TRATAMIENTO DE COMBINACION DE LA LINEA CELULAR DE CANCER DE PANCREAS BXPC3 CON LA SBP BIVALENTE 3641-F01

[0296] El tratamiento de combinacion de la linea celular de cancer de pancreas BxPC3 con la SBP bivalente 3641-F01 y diversos agentes quimioterapeuticos especificos de ruta mostro un aumento en los efectos antiproliferativos. Las celulas BxPC3 se sembraron a 10.000 celulas/pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Despues de una incubacion durante 5 horas a 37C 5 % de CO², se anadieron los agentes quimioterapeuticos a las concentraciones indicadas, y despues se incubaron a 37C 5 % de CO² durante una noche. Al dia siguiente se anadieron una serie de diluciones de la SBP bivalente 3641-F01 a los pocillos apropiados, seguido de una incubacion durante 24 horas a 37C 5 % de CO². Despues, los ensayos se revelaron mediante el uso del reactivo WST-1, se incubaron durante 4 horas a 37C 5 % de CO², se leyeron con un lector de placas y se representaron graficamente mediante el uso del programa informatico GraphPad Prism v5.03.

[0297] Varios inhibidores especificos de la ruta mostraron un aumento en la potencia cuando se usaban en combinacion con las SBP agonistas del receptor de muerte. FIGs. 22A-l. Obatoclax, navitoclax y GDC-0941 mostraron, todos, unos efectos aditivos junto con la SBP bivalente 3641- F01.

EJEMPLO 25

TRATAMIENTO DEL CANCER MEDIANTE EL USO DE UNA SBP BIVALENTE DEL DR4 O DEL DR5

[0298] Este ejemplo detalla el tratamiento de un cancer mediante el uso de una SBP bivalente del DR4 y/o del DR5.

[0299] A un sujeto que tiene un cancer en el que las celulas tumorales expresan o pueden ser inducidas a que expresen el DR4 y/o el DR5 se le administra una dosis de una globulina sustituta agonista del DR4 y/o del DR5, tal como la SBP bivalente 3631-G09 (SL231), la SBP bivalente 3641-F01, la SBP bivalente 2737-F08 o la SBP bivalente 2737-A01. La SBP bivalente es administrada en una cantidad suficiente para inhibir la proliferacion celular del tumor y/o para reducir el tamano del tumor, ralentizando, reduciendo o eliminando asi el cancer.

EJEMPLO 26

TRATAMIENTO DEL CANCER MEDIANTE EL USO DE UNA TERAPIA DE COMBINACION DE UNA SBP BIVALENTE

[0300] Este ejemplo detalla el tratamiento de un cancer mediante el uso de una SBP bivalente del DR4 y/o del ^d R5 en combinacion con un compuesto dirigido que inhibe el crecimiento del cancer. A un sujeto que tiene un cancer en el que las celulas tumorales expresan el DR4 y/o el DR5 se le administra una dosis de una globulina sustituta agonista del DR4 y/o del DR5, tal como la SBP bivalente 3631-G09, la SBP bivalente 3641-F01, la SBP bivalente 2737-F08 o la SBP bivalente 2737-A01 (u otra SBP bivalente) ya sea antes, despues o en combinacion con un compuesto que inhibe apropiadamente la proliferacion o la supervivencia celular regulada. Algunos inhibidores que pueden usarse en esta capacidad incluyen, sin limitacion, inhibidores de la HDAC, inhibidores de la Bcl-2, inhibidores de la PI3K, inhibidores de la cinasa de proteina C, inhibidores de la RAF, inhibidores de la MAPK, inhibidores de la MEK, inhibidores de la AKT, inhibidores de la mTOR, inhibidores de la familia de cinasas de tirosina BCR/ABL y Src, inhibidores de la cinasa de aurora e inhibidores de la HSP90. Algunos ejemplos de dichos inhibidores pueden incluir, pero no se limitan a, BAY43-9006, PLX4032, SB590885, PLX4720, XL281, RAF265, XL518, CI-1040, PD035901, AZD6244, GSK1120212, sorafenib, dasatinib, nilotinib e imatinib. En algunas realizaciónes, se le administra una SBP bivalente agonista del DR4 y/o del DR5 en combinacion con uno o mas de bortezomib, vorinostat, obatoclax, navitoclax o GDC-0941.

[0301] La SBP bivalente es administrada en una cantidad suficiente para inducir la apoptosis en las celulas tumorales y/o para disminuir la proliferacion, ralentizando o reduciendo asi el cancer. El resultado de la terapia combinada es una mejora en la inhibicion del crecimiento del tumor que es al menos mayor que el uso de la SBP bivalente y/o del compuesto solos a una dosis equivalente.

EJEMPLO 27

TRATAMIENTO DEL CANCER MEDIANTE EL USO DE UNA TERAPIA DE COMBINACION DE UNA SBP BIVALENTE CON UN AGENTE QUIMIOTERAPEUTICO CITOTOXICO

[0302] Este ejemplo detalla el tratamiento de un cancer mediante el uso de una SBP bivalente del DR4 y/o del ^d R5 y de un agente quimioterapeutico que inhibe el crecimiento del cancer. A un sujeto que tiene un cancer en el que las celulas tumorales expresan el DR4 y/o el DR5 se le administra una dosis de una globulina sustituta agonista del DR4 y/o del DR5, tal como la 3706-A02 (SL466), la SBP bivalente 3631-G09 (SL231), la SBP bivalente 3641-F01, la SBP bivalente 2737-F08 o la SBP bivalente 2737-A01 SBP (u otra SBP bivalente) ya sea antes, despues o en combinacion con uno o mas compuestos quimioterapeuticos. Algunos compuestos que pueden usarse en esta capacidad incluyen, sin limitacion, inhibidores de la topoisomerasa, agentes alquilantes, analogos de nucleosidos, inhibidores de los microtubulos, agentes de reticulacion del ADN y agentes intercalantes del ADN. Algunos ejemplos de dichos inhibidores pueden incluir, pero no se limitan a, cisplatino, etoposido, carboplatino, oxaliplatino, etoposido, irinotecan, paclitaxel, docetaxel, tartrato de vinorelbina, doxorrubicina, sulfato de vincristina, ifosfamida, clorhidrato de gemcitabina y/o 5-FU. La SBP bivalente es administrada en una cantidad suficiente para inducir la apoptosis en algunas de las celulas tumorales y/o para reducir la proliferacion celular del tumor, ralentizando o reduciendo as! el cancer. El resultado de la terapia combinada es una mejora en la inhibicion del crecimiento del tumor que es al menos mayor que el uso de la SBP bivalente y/o del compuesto solos a una dosis equivalente.

[0303] En algunas realizaciónes, las globulinas sustitutas agonistas del DR4 y/o del DR5 son administradas en combinacion con un agente quimioterapeutico seleccionado entre 5-FU, oxaliplatino, etoposido, irinotecan y doxorrubicina. En algunas realizaciónes, se proporciona una globulina sustituta agonista del d R4 y/o del DR5 junto con 5-FU y/u oxaliplatino.

EJEMPLO 28

TRATAMIENTO DEL CANCER MEDIANTE EL USO DE UNA TERAPIA DE COMBINACION DE UNA SBP BIVALENTE CON UN INHIBIDOR DE LA ANGIOGENESIS DIRIGIDO

[0304] Este ejemplo detalla el tratamiento de un cancer mediante el uso de una SBP bivalente del DR4 y/o del DR5 y un inhibidor de la angiogenesis dirigido que inhibe el crecimiento del cancer. A un sujeto que tiene un cancer en el que las celulas tumorales expresan el DR4 y/o el DR5 se le administra una dosis de una globulina sustituta agonista del DR4 y/o del DR5, tal como la SBP bivalente 3631-G09 (SL231), la SBP bivalente 3641-F01, la SBP bivalente 2737-F08, la SBP bivalente 2706-A02 (SL466) o la SBP bivalente 2737-A01 (u otra SBP bivalente) ya sea antes, despues o en combinacion con un inhibidor de la angiogenesis. Algunos compuestos que pueden usarse en esta capacidad incluyen anticuerpos o globulinas sustitutas del VEGF, del PLGF, de la angioponyetina, del DLL-4 o receptores de cualquiera de estos factores. Algunos compuestos adicionales que pueden usarse en esta capacidad son receptores senuelo, tales como aflibercept y los inhibidores de la senalizacion desencadenada por la union de compuestos proangiogenicos a sus receptores, incluyendo, pero no se limitan a axitinib, cediranib, regorafenib, sunitinib, vandetanib, vatalanib. La SBP bivalente es administrada en una cantidad suficiente para inducir la apoptosis en algunas de las celulas tumorales y/o para reducir la proliferacion celular del tumor, ralentizando o reduciendo as! el cancer. El resultado de la terapia combinada es una mejora en la inhibicion del crecimiento del tumor que es al menos mayor que el uso de la SBP bivalente y/o del compuesto solos a una dosis equivalente.

EJEMPLO 29

USOS DE UNA SBP BIESPECIFICA DEL DR4 Y/O DEL DR5

[0305] Este ejemplo detalla potenciales tratamientos biespeclficos de un cancer mediante el uso de una combinacion de una protelna sustituta del DR4 y/o del DR5 y de otra protelna sustituta o anticuerpo especlfico dirigido inequlvocamente. Como se ha mencionado previamente, la administracion conjunta de agentes complementarios puede tener unos beneficios significativos en comparacion con el uso de los agentes individuales solos. Sin embargo, algunas entidades biespeclficas, que contienen dos o mas especificidades de estos tipos de combinaciones, en una unica entidad molecular, pueden producir un beneficio incluso mayor en comparacion con cualquiera de los agentes solos, as! como el de las combinaciones administradas conjuntamente.

[0306] Se construye una SBP bivalente biespeclfica de forma que comprenda un dominio variable que reconozca el DR4 y/o el DR5, as! como uno o mas dominios variables caracterlsticos adicionales. El dominio variable de especificidad tradicional puede ser derivado mediante la seleccion de la expresion de una SBP monovalente en un banco de fagos segun se detalla en el Ejemplo 1. Los dominios variables pueden ser unidos mediante numerosos procedimientos. Un ejemplo de dicha union biespeclfica se describe en (Xu, et. al, JMB 2010) algunas estrategias adicionales para generar biespeclficos pueden adaptar las nuevas tecnologlas o adaptar las tecnicas descritas previamente para el ensamblaje de biespeclficos.

EJEMPLO 30

USOS ANTAGONISTAS DE LAS PROTEINAS DE UNION SUSTITUTAS DEL DR4 Y/O DEL DR5

[0307] Estos ejemplos detallan el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como el lupus, la nefritis glomerular, el lupus eritematoso sistemico (SLE), en las que el DR4 y el DR5 estan sobreexpresados y transmiten una senal proliferativa en lugar de una senalizacion apoptotica con una protelna de union sustituta que se une, pero que no es capaz de inducir a los complejos del receptor DR4 o DR5 para que inicien la senalizacion. Esto puede llevarse a cabo mediante el uso de una protelna de union sustituta que contiene un unico dominio de union al receptor de muerte, que no puede ser reticulada in vivo, o que tiene unas especificidades que difieren para cada dominio de union que impiden una agregacion del complejo de receptor de un orden mayor. Dichas protelnas de union sustitutas pueden manifestarse en diferentes formatos, incluyendo una SBP monovalente, un s(ab2'), una SBP bivalente, una SBP biespeclfica.

EJEMPLO 31

USOS DIAGNOSTICOS DE LAS PROTEINAS DE UNION SUSTITUTAS DEL DR4 Y/O DEL DR5

[0308] Esta seccion detalla el uso de las protelnas de union sustitutas especlficas del receptor de muerte para su uso diagnostico en la evaluacion de la potencial sensibilidad de las neoplasias a los agonistas del receptor de muerte. Las protelnas de union sustitutas del receptor de muerte pueden marcarse con un trazador radioactivo tal como 125I, 111In y agentes fluorescentes para su uso in vivo. Adicionalmente, las protelnas de union sustitutas pueden unirse covalentemente a enzimas tales como la peroxidasa de rabano picante y la fosfatasa alcalina para analisis inmunohistoqulmicos de la expresion del receptor de muerte en muestras de biopsias. Los kits para la deteccion de la expresion del receptor de muerte en biopsias tambien estan incluidos en esta description.

EJEMPLO 32

TRATAMIENTO DE INFECCIONES VIRICAS CON LAS GLOBULINAS SUSTITUTAS ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE MUERTE

[0309] El potencial uso beneficioso de los antagonistas del receptor de muerte esta en dos amplias areas; la primera area de oportunidad implica la conservation de las poblaciones celulares inmunitarias deseables frente a una inapropiada elimination especlfica del receptor de muerte, y la segunda area de oportunidad es reducir los posibles danos a las celulas no infectadas a traves de la activation especlfica del receptor de muerte.

[0310] Las celulas inmunitarias aumentan la expresion de los receptores de muerte y del TRAIL en respuesta a una infection vlrica, haciendolos sensibles a la actividad de los linfocitos T citotoxicos productores del TRAIL. Algunas protelnas vlricas libres, liberadas a partir de las celulas infectadas (por ejemplo, la T^{a t} del VIH) inducen la misma respuesta, produciendo un "efecto por vecindad" en las celulas no infectadas, en las que los receptores de muerte y el TRAIL regulados por aumento en la superficie de la celula dan lugar a su eliminacion. El uso de una SgG antagonista del receptor de muerte protege a las celulas vecinas no infectadas de los linfocitos T citotoxicos. Adicionalmente, las fuertes respuestas perjudiciales de los linfocitos T, tales como las que se encuentran en la infeccion de hepatitis C, pueden ser ralentizadas y tratadas con las SgG antagonistas del receptor de muerte para reducir las lesiones al tejido no infectado. Ademas, dado que la apoptosis a traves de la activacion del receptor de muerte hace que la respuesta de los linfocitos T se reduzca a traves de su eliminacion, las SgG antagonistas del receptor de muerte pueden prolongar la actividad de los linfocitos T y prevenir un agotamiento de los linfocitos T en infecciones cronicas. En otro escenario, las celulas presentadoras del antlgeno infectadas por el virus que tienen el TRAIL de la superficie celular regulado por aumento tendrlan unos efectos perjudiciales en las poblaciones de linfocitos tanto citotoxicos como T colaboradores. Para proteger los linfocitos T y permitir una respuesta inmunitaria robusta adaptativa a la infeccion vlrica, pueden usarse las SgG antagonistas para bloquear los receptores de muerte de los linfocitos T impidiendo su activacion por parte de estas celulas presentadoras del antlgeno infectadas.

EJEMPLO 33

UNION DE LAS SBP BIVALENTES A LOS RECEPTORES DE MUERTE DE PRIMATES NO HUMANOS

[0311] Las SBP del receptor de muerte tienen una fuerte union a los DR4 y DR5 de cinomologos y de Rhesus. El analisis de union de ELISA se llevo a cabo de una forma similar al procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Se usaron los antlgenos humanos Fc-protelna de fusion de DR4-Fc de cinomologos (NHP-1), de DR4-Fc de Rhesus (NHP-2) de DR5-Fc de cinomologos (NHP-1) y de DR5-Fc de Rhesus (NHP-2) para recubrir los pocillos de microtitulacion a 1 microgramo/ml de concentration y se usaron 100 ul por pocillo. Despues se anadieron diluciones sucesivas semilogarltmicas del TRAIL biotinilado, de la 3631-G09 (SL231), de la 3736-B03 (SL465), de la 3706-A02 (SL466), de la 3706-C01 (SL467) y de la 3726-A01 (SL468) a los pocillos recubiertos con el antlgeno, para determinar las concentraciones de union maxima y mitad de la maxima. Se uso estreptavidina-HRP o un anticuerpo monoclonal conjugado con anti-VpreB-HRP para la deteccion, y el ensayo se revelo con una solucion de TMB. Las SgG se unen con una elevada afinidad al DR4-Fc de cinomologos y de Rhesus (FIG 23A y C) y al DR5-Fc de cinomologos y de Rhesus (FIG 23B y D). Los datos fueron analizados con Prism GraphPad las afinidades indicadas (FIG 23A-D, recuadro)

EJEMPLO 34

ACTIVACION POR PARTE DE LAS SBP BIVALENTES DE LAS CASPASAS INDUCTORAS DE LA APOPTOSIS EN LINEAS CELULARES TUMORALES DE PRIMATES RHESUS NO HUMANOS

[0312] Este ejemplo describe la actividad de las protelnas de union sustitutas del receptor de muerte sobre las llneas celulares derivadas del mono Rhesus (Macaca mulatta). La LCL8664 y la CMMT (ATCC) son llneas celulares de linfoblastos transformadas con virus y de origen mamario. Se trataron 10.000 celulas LCL8664 con 1 microgramo/ml de ciclohexamida y diluciones sucesivas semilogarltmicas de una mezcla de protelna G 100 nM 50 nM en RPMI 1640 10 % de FBS. Las celulas se incubaron durante una noche en una estufa de incubacion humidificada a 37C con un 5 % de CO2. Despues de 18 horas, el ensayo se revelo mediante la adicion de 100 ul de Caspasa 3/7 glo (Promega) y se leyo con un luminometro (FIG 24A). Para las celulas CMMT se uso una estrategia similar en DMEM 10 % de medio FBS (FIG 24B). Las celulas LCL8664 activan la apoptosis en respuesta a la estimulacion del DR4, mientras que las celulas CMMT responden a una estimulacion especlfica del DR5. Ambas llneas celulares activan la cascada apoptotica de las caspasas en respuesta a las protelnas de union sustitutas agonistas y al TRAIL. Los datos fueron analizados con el programa informatico Prism GraphPad y se muestran los valores cuantitativos de la CE (recuadro de la FIG 24A y recuadro de la FIG 24B)

EJEMPLO 35

ACTIVACION POR PARTE DE LAS SBP BIVALENTES DE LAS CASPASAS INDUCTORAS DE LA APOPTOSIS EN LINEAS CELULARES TUMORALES DE PRIMATES CINOMOLOGOS NO HUMANOS

[0313] Este ejemplo describe la actividad de las protelnas de union sustitutas del receptor de muerte sobre las llneas celulares derivadas del mono cinomologo (Macaca fascicularis). Se usan la HSC-F (linfoblasto de Herpes samirii transformado, NHPRR) y la AG21329 (fibroblasto primario, Coriell Institute) para evaluar la actividad de serialization del receptor de muerte. Se trataron 30.000 celulas HSC-F con 1 microgramo/ml de ciclohexamida y diluciones sucesivas semilogarltmicas de una mezcla de protelna G 100 nM 50 nM en RPMI 1640 10 % de FBS. Las celulas se incubaron durante una noche en una estufa de incubacion humidificada a 37C con un 5 % de CO2. Despues de 18 horas, el ensayo se revelo mediante la adicion de 100 ul de Caspasa 3/7 glo (Promega) y se leyo con un luminometro (FIG 25A). Para las celulas AG21329 (10.000/pocillo con 250 ng/ml de actinomicina D), se uso una estrategia similar para inducir la actividad de la caspasa (FIG 25B). Se observa una senalizacion apoptotica a traves de la activation de la caspasa en respuesta a las protelnas de union sustitutas agonistas y al TRAIL. Los datos fueron analizados con el programa informatico Prism GraphPad y se muestran los valores cuantitativos de la CE (recuadro de la FIG 25)

EJEMPLO 36

ACTIVACION POR PARTE DE LAS GLOBULINAS SUSTITUTAS DE LAS CASPASAS INDUCTORAS DE LA APOPTOSIS EN LAS LINEAS CELULARES QUE EXPRESAN DE FORMA ESTABLE EL RECEPTOR DE MUERTE

[0314] Este ejemplo detalla el uso de las protelnas de union sustitutas del receptor de muerte en las llneas celulares que expresan receptores de muerte recombinantes. Los receptores de muerte son expresados bien en forma de protelnas nativas de longitud completa o bien en forma de quimeras de especies cruzadas, mlnimamente, con el dominio intracelular del receptor de muerte de la celula hospedadora. Las celulas hospedadoras, tales como la llnea celular de raton NIH3T3, que son insensibles a las protelnas de union sustitutas aqui descritas y proporcionan un fondo nulo, son transfectadas con un plasmido de integration estable (tal como el pCADN3.1 con marcadores seleccionables de higromicina o de zeomicina) que porta un receptor de muerte subclonado. La selection, despues de la recuperation a partir de la transfection, produce una poblacion de celulas que expresa el receptor de muerte recombinante y que puede ser usada a continuation para probar directamente la senalizacion del receptor de muerte a traves de la activacion o la inhibition por parte de la caspasa de la proliferation celular.

EJEMPLO 37

POTENCIA MEJORADA DE LA PROTEINA DE UNION SUSTITUTA AGONISTA DOBLE DE LA ACTIVACION DE LA CASPASA INDUCTORA DE LA APOPTOSIS EN CELULAS CON UNA RESPUESTA MODERADA A LAS AGONISTAS MONOESPECIFICAS DEL RECEPTOR Y A SU COMBINACION

[0315] Este ejemplo demuestra el aumento en la actividad apoptotica de las protelnas de union sustitutas agonistas del receptor de muerte con respecto al TRAIL y a anticuerpos conocidos especlficos del receptor, individualmente y en combinacion. Se crearon anticuerpos especlficos contra el receptor DR4 y DR5 (la SL-240 y la SL-297, respectivamente) mediante el uso de procedimientos de ADN recombinante. Las protelnas se expresaron y se purificaron segun se describe en el Ejemplo 6 , con la excepcion de que se usaron las cadenas ligeras del anticuerpo en lugar de la cadena ligera sustituta.

[0316] En el ensayo celular ilustrado en la FIG. 39, se sembraron celulas de cancer de mama MDA-MB-231 a 30.000 celulas/pocillo y despues se trataron con las protelnas de union sustitutas agonistas dobles del receptor de muerte; con un anticuerpo especlfico contra el DR5, la SL-240; con un anticuerpo especlfico contra el DR4, la SL-297; o con una combinacion equimolar de los anticuerpos especlficos de los receptores, dando como resultado una concentracion total de anticuerpo de 100 nM (FIG. 39B). Las protelnas de union sustitutas y los anticuerpos se trataron como en el Ejemplo l5. Los datos de la induccion de la caspasa 3/7 y de la inhibicion de la proliferacion celular se obtuvieron mediante el uso de los reactivos Caspasa 3/7 Glo (Promega) y WST-1 (Roche), respectivamente, despues de 24-48 horas, o mediante un analisis de inmunotransferencia western mediante el uso de anticuerpos especlficos contra la PARP, la Caspasa-8 y la Caspasa-3 activa (Cell Signaling Technology, MA).

[0317] Las protelnas de union sustitutas agonistas dobles del receptor de muerte activan la actividad de la caspasa e inducen la apoptosis de una forma mas potente que las agonistas monoespeclficas del receptor (FIG.

39A), que su combinacion (FIG. 39B) y que el TRAIL. Estos resultados demuestran que la potente activacion de la caspasa 3/7 y la induccion de la apoptosis en esta llnea celular esta dirigida unicamente por la protelna de union sustituta agonista doble del receptor de muerte. Las protelnas de union sustitutas agonistas dobles del receptor de muerte activan de una forma mas potente las caspasas debido a que pueden activar tanto el DR4 como el DR5 sin la complicacion del receptor senuelo, y lo hacen de una forma en la que ambos complejos del DR4 y del DR5 se juntarlan.

[0318] En un segundo ensayo celular similar, se trataron celulas de cancer de mama MDA-MB-231 con las protelnas de union sustitutas agonistas dobles del receptor de muerte; el TRAIL, con un anticuerpo especlfico contra el DR5, la SL-240; con un anticuerpo especlfico contra el DR4, la SL-297; o con una combinacion equimolar de los anticuerpos especlficos de los receptores (FIG. 42). Las protelnas de union sustitutas y los anticuerpos se trataron como en el Ejemplo 15. La activacion de la PARP y de la Caspasa-8 se analizo mediante un analisis de inmunotransferencia western mediante el uso de anticuerpos especlficos (Cell Signaling Technologies) y se reflejo por la generacion de bandas de un peso molecular mas bajo. La activacion de la Caspasa 3 se analizo mediante un analisis de inmunotransferencia western mediante el uso de anticuerpos especlficos anti-activas (Cell Signaling Technologies) y se reflejo por la generacion de bandas reactivas. De nuevo, la SBP agonista doble del DR4 y del DR5 era capaz de activar las caspasas de una forma mas eficaz que las agonistas individuales del receptor o que su combinacion, y eran comparables al TRAIL.

[0319] Las protelnas de union sustitutas agonistas dobles del receptor de muerte eran capaces de iniciar una respuesta apoptotica de tipo I, mientras que los anticuerpos monoespeclficos del receptor funcionan a traves de una respuesta de tipo II. En las respuestas de tipo I, una expresion y una activacion suficientes del receptor dan lugar a una elevada actividad de la caspasa, que es capaz de activar directamente la caspasa efectora 3/7. En la respuesta de tipo II, un menor nivel de expresion y de activacion del receptor requiere la amplificacion de la senal de la caspasa a traves de la ruta apoptotica intrlnseca y la activacion de la caspasa 9. La capacidad para activar tanto el DR4 como el DR5 mantendra la actividad de senalizacion apoptotica de tipo I en las situaciones en las que la expresion especlfica del receptor disminuye, y permite la senalizacion de tipo II cuando los niveles del receptor caen por debajo del umbral para activar las respuestas de tipo I. El resultado funcional es que las protelnas de union sustitutas agonistas dobles del receptor de muerte son eficaces en un abanico mas amplio de niveles de expresion celular del receptor de muerte que los agentes monoespeclficos.

EJEMPLO 38

ACTIVIDAD DIRIGIDA DE LAS PROTEINAS DE UNION SUSTITUTAS AGONISTAS DOBLES CONJUGADAS CON UN FARMACO SOBRE LA EXPRESION CELULAR DE LOS RECEPTORES DE MUERTE

[0320] Este ejemplo describe el uso de las protelnas de union sustitutas agonistas dobles del receptor de muerte en celulas o tumores diana que expresan los receptores de muerte. Se conjugo monometil auristatina E con dos versiones de una protelna de union sustituta agonista doble del receptor de muerte (la SL466; 3706-A02) modificada para que contenga un sitio aceptor introducido: la SL466T21C y la SL466V213C. Ambas protelnas de union sustitutas conjugadas (la SL466T21Cconj y la SL466V213Cconj) y no conjugadas se probaron junto con las protelnas de union sustitutas parentales (la SL466T21C, la SL466V213C y la SL466) y una protelna de union sustituta que reconoce un ligando soluble como control (la SL779V213Cconj).

[0321] Para evaluar la capacidad de direccionamiento de la protelna de union sustituta agonista doble, se usaron celulas de carcinoma de celulas renales 786-0 que expresan el DR4 y el DR5 pero que no muestran ninguna sensibilidad frente a las moleculas agonistas del receptor de muerte. El ensayo se llevo a cabo segun se describe

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una protelna de union sustituta bivalente ("SBP") que comprende:

una secuencia de la VpreB fusionada con una secuencia de la A5; y

una secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la secuencia de la VpreB fusionada con la secuencia de la A5 para formar una SBP,

en la que la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de una region determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR) 1 de la SEQ ID NO: 39, una secuencia de la CDR2 de la SEQ ID NO: 40 y una secuencia de la Cd R3 de la SEQ ID NO: 41; y

en la que dicha SBP bivalente se une de forma selectiva y bivalente tanto al DR4 como al DR5 y actua como un agonista para activar la senalizacion del DR4 y del DR5.

2. La SBP bivalente de la Reivindicacion 1, en la que la SBP bivalente se une al DR5 y al DR4 e inhibe la union del DR5 al TRAIL.

3. La SBP bivalente de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que al menos uno de:

(a) el DR4 comprende una de la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO 474, la SEQ ID NO 475, la SEQ ID NO 476 y la SEQ ID NO 477;

(b) el DR5 comprende una de la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 478, la SEQ ID NO 479, la SEQ ID NO 480, la SEQ ID NO 481 y la SEQ ID NO 482; o

(c) el DR4 comprende una de las SEQ ID NOS: 474-477 y el DR5 comprende una de las SEQ ID NOS: 478-482.

4. La SBP bivalente de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que al menos una de:

(b) dicha secuencia de la VpreB se selecciona entre el grupo que consiste en una secuencia de la VpreB1 nativa, una secuencia de la VpreB2 nativa, una secuencia de la VpreB3 nativa y fragmentos de cualquiera de las anteriores; o

(c) dicha secuencia de la VpreB comprende una secuencia de la VpreB nativa seleccionada entre el grupo que consiste en la VpreB1 humana de la SEQ ID NO: 1, la VpreB2 de raton de las SEQ ID NOS: 2 y 3, la VpreB3 humana de la SEQ ID NO: 4, y fragmentos de cualquiera de las anteriores.

5. La SBP bivalente de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que:

la secuencia de la A5 comprende la totalidad o parte de una A5 humana de la SEQ ID NO: 6 , de un polipeptido A5 de raton de la SEQ ID NO: 5, o fragmentos de cualquiera de las anteriores.

6. La SBP bivalente de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que al menos una de:

(b) dicha secuencia de la VpreB se selecciona entre el grupo que consiste en la VpreB1 humana de la SEQ ID nO: 1, la VpreB2 de raton de las SEQ ID NOS: 2 y 3, la VpreB3 humana de la SEQ ID NO: 4 y fragmentos de cualquiera de las anteriores;

(c) dicha secuencia de la A5 se selecciona entre el grupo que consiste en una A5 humana de la SEQ ID NO: 6 , un polipeptido A5 de raton de la SEQ D NO: 5 y fragmentos de cualquiera de las anteriores;

(h) al menos una de dichas secuencias de la VpreB y de la A5 es un fragmento de una secuencia de la VpreB y de la A5 nativa, respectivamente;

(i) la SBP comprende la secuencia de la VpreB fusionada con la secuencia de la A5, en la que la secuencia de la VpreB fusionada con la secuencia de la A5 esta emparejada covalentemente con la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada;

(j) dicha secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada esta emparejada covalentemente a traves de un conector peptldico; o

(k) la SBP comprende la secuencia de la VpreB fusionada con la secuencia de la A5, en la que dicha secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada esta conjugada con la secuencia de la VpreB fusionada con la secuencia de la A5 mediante una asociacion no covalente, para formar un complejo dimerico.

7. La SBP bivalente de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 38.

8. Una protelna de union sustituta biespeclfica (SBP) que comprende:

(a) un primer sitio de union de una SBP bivalente que comprende una primera secuencia de la VpreB fusionada con una primera secuencia de la A5; una primera secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la primera secuencia de la VpreB fusionada con la primera secuencia de la A5, en la que la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de CDR1 de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 39, una secuencia de CDR2 de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 40 y una secuencia de CDR3 de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 41 y en la que el primer sitio de union de la SBP se une bivalentemente tanto al receptor DR4 como al DR5 y es un agonista del DR4 y del DR5; y (b) un segundo sitio de union de una SBP que comprende:

una segunda secuencia de la VpreB fusionada con una segunda secuencia de la A5; y

una segunda secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con la segunda secuencia de la VpreB fusionada con la segunda secuencia de la A5, en la que dicho segundo sitio de la SBP se une a una segunda diana; o

una segunda secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada que esta emparejada con una region variable de la cadena ligera para formar un segundo sitio de union, en la que dicho segundo sitio de union se une a una segunda diana.

9. La SBP biespeclfica de la reivindicación 8 , en la que la segunda diana esta implicada en la patogenia del cancer.

10. La SBP bivalente de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la SBP biespeclfica de la reivindicacion 8 o 9 para su uso en terapia.

11. La SBP bivalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la SBP biespeclfica de la reivindicación 8 o 9 para su uso en el tratamiento del cancer.