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KR101540822B1 - 항체 대용물 경쇄 서열을 포함하는 구축물 및 라이브러리 - Google Patents

항체 대용물 경쇄 서열을 포함하는 구축물 및 라이브러리 Download PDF

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KR101540822B1
KR101540822B1 KR1020097022324A KR20097022324A KR101540822B1 KR 101540822 B1 KR101540822 B1 KR 101540822B1 KR 1020097022324 A KR1020097022324 A KR 1020097022324A KR 20097022324 A KR20097022324 A KR 20097022324A KR 101540822 B1 KR101540822 B1 KR 101540822B1
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Abstract

본 발명은 항체 대용물 경쇄 서열을 포함하는 구축물 및 라이브러리에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 VpreB 서열 (임의적으로 또다른 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 중쇄 가변 도메인 서열과 파트너를 이룸)을 포함하는 구축물, 및 이를 함유하는 라이브러리에 관한 것이다.
VpreB, λ5, 대용물 경쇄

Description

항체 대용물 경쇄 서열을 포함하는 구축물 및 라이브러리 {CONSTRUCTS AND LIBRARIES COMPRISING ANTIBODY SURROGATE LIGHT CHAIN SEQUENCES}
본 발명은 항체 대용물(surrogate) 경쇄 서열을 포함하는 구축물 및 라이브러리에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 VpreB 서열 (임의적으로 또다른 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 중쇄 가변 도메인 서열과 파트너를 이룬다)을 포함하는 구축물, 및 이를 함유하는 라이브러리에 관한 것이다.
B-림프구에 의해 생산되는 항체 (Ig) 분자는 중쇄 (H) 및 경쇄 (L)로 형성된다. H 및 L 사슬의 아미노 말단 도메인의 아미노산 서열은 가변성이고 (VH 및 VL), 항원 결합 부위를 형성하는 3개의 초가변 영역 (CDR1, CDR2, CDR3)에서 특히 그러하다. H 및 L 사슬의 어셈블리(assembly)는 L 사슬의 불변 영역 (CL)과 중쇄의 제1 불변 영역 (CH1) 간의 디술피드 결합 및 VH 도메인과 및 VL 도메인 간의 비-공유 상호작용에 의해 안정화된다.
인간 및 다수의 동물, 예컨대 마우스에서, 항체 H 및 L 사슬을 코딩하는 유전자들이 V 영역의 일부분을 코딩하는 유전자 단편들의 계단식 체세포 재배열에 의해 어셈블리된다. B 림프구 발달의 여러 단계들이 Ig 유전자좌의 재배열 상태에 의해 특성화된다 (예를 들어 [Melchers, F. & Rolink, A., B-Lymphocyte Development and Biology, Paul, W.E., ed., 1999, Lippincott, Philadephia] 참조).
B 세포의 전구체 (pre-B 세포)가 μ 중쇄를 생산하지만 완전하게 발달된 경쇄 대신 각각 VpreB(1-3) 및 λ5로 칭해지는 B 계통-특이적 유전자들의 셋트를 발현하는 림프구로서 골수에서 확인되었다.
인간 VpreB1의 주요 이소형(isoform) (CAG30495)은 아미노산 145개 길이의 폴리펩티드 (서열 1)이다. 이는 Ig V 도메인-유사 구조를 갖지만, 전형적인 V 도메인의 마지막 β-가닥 (β7)이 없고, 어떠한 다른 단백질에 대해서도 서열 상동성을 나타내지 않는 카르복실 말단 끝부분을 갖는다. VpreB2에는 아미노산 142개의 마우스 VpreB2 폴리펩티드 (P13373; 서열 2), 및 마우스 VpreB2 서열의 아미노산 171개 길이의 스플라이스(splice) 변이체 (CAA019641; 서열 3)를 포함하여 여러 이소형이 있다. VpreB1 및 VpreB2 서열이 EP 0 269 127 및 U.S. 특허 번호 5,182,205; [Collins et al., Genome Biol. 5(10):R84 (2004)]; 및 [Hollins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(14):5552-5556 (1989)]에 개시되어 있다. 인간 VpreB3의 주요 이소형 (서열 4)은 아미노산 123개 길이의 단백질 (CAG30496)이고, 이는 [Collins et al., Genome Biol. 5(10):R84 (2004)]에 개시되어 있다.
VpreB(1-3)은 또다른 단백질인 λ5과 비-공유결합적으로 회합된다. 인간 λ5는 아미노산 209개의 폴리펩티드 (CAA01962; 서열 5)이고, 이는 항체 경쇄에 대한 강한 상동성이 있는 Ig C 도메인-유사 구조 및 아미노 말단 끝부분 쪽의 2개의 기 능적으로 별개인 영역을 보유하며, 상기 2개의 영역 중 하나는 Vλ 도메인의 β7 가닥에 대해 강한 상동성을 나타낸다. 인간 λ5-유사 단백질에는 아미노산 213개가 있고 (NP_064455; 서열 6), 항체 λ 경쇄 불변 영역에 대한 약 84％의 서열 동일성을 나타낸다.
추가적인 상세사항을 위해, 하기의 리뷰 논문을 참조한다: [Karasuyama et al., Adv. Immunol. 63:1-41 (1996)]; [Melchers et al., Immunology Today 14:60-68 (1993)]; 및 [Melchers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2571-2573 (1999)].
VpreB 및 λ5 폴리펩티드는 비-공유결합적으로 회합된 Ig 경쇄-유사 구조를 함께 형성하고, 이는 대용물 경쇄 또는 모조(pseudo) 경쇄로 칭해진다. 조기 pre-B 세포의 표면 상에서, 대용물 경쇄는 신호 변환인자 CD79a/CD79b 이종이량체와 회합된 막-결합형 Ig μ 중쇄에 디술피드-연결되어, B 세포 수용체-유사 구조인 소위 preB 세포 수용체 (preBCR)를 형성한다.
발명의 개요
한 양상에서, 본 발명은 이종성 아미노산 서열에 접합된 VpreB 서열 또는 λ5 서열을 포함하고, 표적에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 VpreB 서열을 포함하고, 이때 VpreB는 폴리펩티드가 표적에 결합하는 능력을 유지하는 한, 인간 VpreB1 (서열 1), 마우스 VpreB2 (서열 2 및 3) 및 인간 VpreB3 (서열 4), 또는 또다른 포유류 종에서의 이의 상동체를 포함하는 임의의 천연 VpreB, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 이종성 아미노산 서열은 λ5 서열이고, 이때 이는 서열 5의 천연 인간 λ5 서열, 서열 6의 인간 λ5-유사 서열, 및 이의 단편 및 변이체를 포함하는 임의의 천연 λ5 서열, 또는 이의 임의의 단편 또는 변이체일 수 있다.
VpreB 서열 및 이종성 아미노산 서열, 예를 들어 λ5 서열은 서로 직접적으로 융합될 수 있거나, 또는 비-공유결합적으로 회합될 수 있다. 전자의 경우에, 바람직하게는 융합은 VpreB 및 λ5 각각의 CDR3 유사 영역에서 또는 주변에서 일어난다.
또다른 실시양태에서, 이종성 아미노산 서열은 항체 경쇄 가변 영역 서열이거나 이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 경쇄 가변 영역 서열이 항체 경쇄 CDR3 영역에 유사한 부위에서 VpreB 서열에 융합된다. 또다른 실시양태에서, 융합은 항체 경쇄의 CDR3 영역과 VpreB의 CDR3 유사 영역 간의 융합이다. 모든 실시양태에서, 항체 경쇄는 λ 사슬 또는 κ 사슬일 수 있다.
특정 실시양태에서, VpreB-λ5 접합체 (융합체, 기타 공유결합 연결물, 및 비-공유결합 회합체 포함) 및 VpreB-항체 경쇄 접합체가 비제한적으로 포함되는 본원에서의 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 서열, 예컨대 항체 중쇄 가변 영역, 또는 완전한 항체 중쇄 (가변 영역 포함)와 추가로 회합될 수 있다.
폴리펩티드가 λ5 서열을 포함하는 경우, λ5는 표적에 결합하는 능력을 폴리펩티드가 유지하는 한, 서열 5의 인간 λ5 및 서열 6의 인간 λ5-유사 단백질, 또는 임의의 또다른 포유류 종에서의 상동체를 포함하는 임의의 천연 λ5, 또는 이 의 임의의 단편 또는 변이체일 수 있다. 특정 실시양태에서, λ5 서열에 융합된 이종성 아미노산 서열은 VpreB 서열이다.
본 발명의 폴리펩티드 구축물에서, VpreB 및 λ5 서열은, 양쪽 모두 존재하는 경우, 직접적인 융합, 링커(linker) 서열 (예를 들어, 펩티드 링커)에 의한 공유결합 연결 및 비-공유결합 회합을 포함하는 임의의 수단에 의해 접합될 수 있다.
특정 실시양태에서, VpreB 서열과 λ5 서열의 융합체가 비-공유결합 회합에 의해 항체 중쇄 서열에 접합되어, 이량체성 복합체가 형성된다.
또다른 실시양태에서, VpreB 서열, λ5 서열 및 항체 중쇄 서열의 비-공유결합 회합에 의해 삼량체성 복합체가 형성된다. 특정 실시양태에서, "SURROBODY™ 변이체"의 변이체 대용물 경쇄 구조물로 또한 지칭되는 이러한 구조물에서, VpreB 및 λ5 부분 중 하나 또는 양쪽 모두의 특징적인 꼬리 (부가물)가 유지될 수 있다 (그러나 반드시 유지되어야 하지는 않는다). 추가적인 기능성을 이같은 부가물에 부여할 수 있다. 또한, 다양한 실시양태에서, 구축물의 다양한 성질, 예컨대 PK 및/또는 효능을 개선하기 위해, 이로운 부가물 융합체를 디자인하여 만들 수 있다.
모든 실시양태에서, 가변 영역 서열을 포함하는 항체 중쇄가 존재하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체 중쇄 가변 영역 서열이 동일한 표적 또는 상이한 표적에 결합할 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 이같은 폴리펩티드들의 라이브러리에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 항체 중쇄 또는 가변 영역 서열을 포함하는 이 의 단편과 회합된 이같은 폴리펩티드들의 라이브러리에 관한 것이다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 대용물 경쇄 서열들 (임의적으로 항체 중쇄 가변 영역 서열들과 회합됨)의 수집물을 포함하는 라이브러리에 관한 것이다.
모든 양상에서, 라이브러리는 디스플레이(display), 예를 들어, 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이, DNA 디스플레이, 포유류 세포 상의 디스플레이, 포자 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 단백질-DNA 연결을 기초로 하는 디스플레이, 또는 마이크로비드(microbead) 디스플레이의 형태일 수 있다.
추가로 본 발명은 이같은 폴리펩티드 및 이같은 폴리펩티드를 함유하는 라이브러리의 다양한 용도, 예를 들어, 중요한 치료적 용도가 있는, 원하는 결합 특이성 및/또는 결합 친화력이 있는 항체-유사 분자를 디자인 또는 선별하기 위한 용도에 관한 것이다.
도 1은 인간 VpreB1 (서열 1) 및 인간 λ5 (서열 5)와 항체 λ 사슬 가변 (서열 27) 및 불변 영역 (서열 28)의 정렬을 나타낸다. VpreB1은 항체 λ 사슬 가변 영역에 대해 약간의 서열 유사성을 공유하는 한편, λ5는 항체 λ 사슬 불변 영역 및 프레임워크 영역 4에 대해 약간의 동일성을 공유한다. 상자로 표시된 영역에서 각각 항체 λ 사슬 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 유사한 VpreB1 및 λ5 서열이 확인된다.
도 2는 VpreB 및 λ5 서열에 의해 형성된 대용물 경쇄, 대용물 경쇄 서열을 포함하는 예시적인 융합 폴리펩티드, 및 V-J 연결로부터 유래된 항체 경쇄 구조의 개략도이다.
도 3은 다양한 대용물 경쇄 결실 및 단일쇄 구축물의 개략도이다.
도 4는 대용물 경쇄 구축물 내로의 조합형 기능적 다양성의 혼입을 개략적으로 도해한다.
도 5는 다양한 예시적인 대용물 경쇄 구축물의 유전자 및 단백질 구조를 나타낸다. 서열 35로서 개시된 (Gly4Ser)3 링커.
도 6은 VpreB1 서열 (서열 1)과 항체 λ5 경쇄 가변 영역 서열 (나타난 순서대로, 각각 서열 29-31)의 정렬이다. 서열 유사성 정도가 가장 높은 영역이 상자로 표시된다. 도면에 나타난 바와 같이, VpreB1은 λ5 경쇄 가변 영역 생식계열 서열에 대해 단지 56％-62％ (아미노산 2 내지 97)의 서열 동일성을 나타낸다.
도 7은 VpreB1 서열과 항체 λ5 경쇄 불변 영역 서열의 정렬을 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이, 정렬된 VpreB1 서열은 상응하는 항체 λ5 경쇄 불변 영역 서열에 대해 단지 62％ (아미노산 97 내지 209)의 서열 동일성을 나타낸다. 도 7은 나타난 순서대로, 각각 서열 5 및 32를 개시한다.
도 8은 VpreB1 서열과 항체 κ 경쇄 불변 영역 서열의 정렬을 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이, 정렬된 VpreB1 서열은 상응하는 항체 κ 경쇄 불변 영역 서열에 대해 단지 35％ (아미노산 105 내지 209)의 서열 동일성을 나타낸다. 도 8은 서열 5 및 서열 33의 잔기 1-208을 개시한다.
도 9는 대용물 경쇄 (SLC) 성분에 기능성을 부가하는 다양한 대표적인 방식들을 도해한다.
도 10은 서열 1의 인간 VpreB1 서열, 서열 2 및 3의 마우스 VpreB2 서열; 서열 4의 인간 VpreB3 서열, 서열 5의 인간 λ5 서열 및 서열 6의 인간 λ5-유사 단 백질 서열, 및 실시예에서 사용된 다양한 구축물들의 서열을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 다양한 삼량체성 및 이량체성 대용물 경쇄 구축물을 도해한다.
도 12: 대용물 경쇄 및 접합된 중쇄의 검출. 레인 1: 전장; 레인 2: 람다 5 dT; 레인 3: VpreB dt; 레인 4: 단축형; 레인 5: SCL 융합체 1; 레인 6: SLC 융합체 2; 레인 7: 항체.
도 13: SLC 융합 단백질이 발현되어 대장균의 원형질막 주위공간 내로 잘 분비되고, IgM보다는 IgG1으로부터의 중쇄 CH1과 가장 잘 파트너를 이룬다. 패널 A: 대장균에서의 SCL 융합 단백질 발현. 패널 B: IgM μ 사슬보다 IgG1 감마 사슬이 SLC 융합체와 더 잘 파트너를 이루어 정제된다.
도 14: 항-파지 검출을 통한 파지 대용물 경쇄 구축물 포획 ELISA.
도 15: 포유류 세포에서 발현된 정제된 대용물 경쇄 구축물이 바이러스 표적에 결합한다.
도 16: 포유류 세포에서 발현된 정제된 대용물 경쇄 구축물이 바이러스 항원에 결합하는 안정적인 복합체를 함유한다.
도 17: 대장균 원형질막 주위공간 용해물과의 항원 결합.
도 18: 중화성 중쇄와 쌍을 이룬 대용물 경쇄 융합체 구축물 파지가 H5 HA 항원에 쉽게 결합한다.
도 19: 중화성 중쇄와 쌍을 이룬 대용물 경쇄 구축물 파지가 항원에 결합한다.
도 20: 파지 디슬플레이 실험의 결과가 요약된 표.
도 21 및 22: 대용물 경쇄 융합체 1 및 2의 라운드 1 및 2의 클론 분석의 결과.
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명의 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)]는 본 출원에서 사용된 용어들 중 다수에 대한 일반적인 안내를 당업자에게 제공한다.
당업자는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있는, 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 다수의 방법 및 물질들을 인지할 것이다. 실제로, 본 발명은 기술된 방법 및 물질에 결코 한정되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 이하의 용어들이 하기에 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "대용물 경쇄"는 VpreB 및 λ5 단백질의 비-공유결합 회합에 의해 형성된 이량체를 지칭한다.
용어 "VpreB"는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되고, 임의의 천연 서열 또는 변이체 VpreB 폴리펩티드를 지칭하며, 특히 서열 1의 인간 VpreB1, 서열 2 및 3의 마우스 VpreB2, 서열 4의 인간 VpreB3, 및 스플라이스 변이체 및 번역후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이소형, 이들의 기타 포유류 상동체, 뿐만 아니라 이같은 천연 서열 폴리펩티드들의 변이체가 비제한적으로 포함된다.
용어 "λ5"는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되고, 임의의 천연 서열 또는 변이체 λ5 폴리펩티드를 지칭하며, 서열 5의 인간 λ5, 서열 6의 인간 λ5-유사 단백질, 및 스플라이스 변이체 및 번역후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이들의 이소형, 이들의 기타 포유류 상동체, 뿐만 아니라 이같은 천연 서열 폴리펩티드들의 변이체가 특히 비제한적으로 포함된다.
용어 "변이체 VpreB 폴리펩티드" 및 "VpreB 폴리펩티드의 변이체"는 상호교환가능하게 사용되고, 아미노산 변형의 결과로 하나 이상의 아미노산 위치에서 천연 서열 VpreB 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드로서 본원에서 정의된다. 본원에서 정의된 바와 같은 "변이체 VpreB 폴리펩티드"는 천연 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열, 또는 이의 단편과 상이할 것이다. 바람직하게는, "변이체 VpreB 폴리펩티드"는 천연 서열 VpreB 폴리펩티드와 적어도 약 65％, 또는 적어도 약 70％, 또는 적어도 약 75％, 또는 적어도 약 80％, 또는 적어도 약 85％, 또는 적어도 약 90％, 또는 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 98％의 서열 동일성을 보유할 것이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, "변이체 VpreB 폴리펩티드"는 이의 아미노산 서열이 천연 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열에 대해 95％ 미만, 또는 90％ 미만, 또는 85％ 미만, 또는 80％ 미만, 또는 75％ 미만, 또는 70％ 미만, 또는 65％ 미만, 또는 60％ 미만으로 동일할 것이다. 변이체 VpreB 폴리펩티드에는 VpreB 서열의 C-말단의 Ig와 유사하지 않은 독특한 꼬리가 부분적으로 또는 완전히 제거된 VpreB 폴리펩티드가 비제한적으로 특히 포함된다.
용어 "변이체 λ5 폴리펩티드" 및 "λ5 폴리펩티드의 변이체"는 상호교환가능하게 사용되고, 아미노산 변형의 결과로 하나 이상의 아미노산 위치에서 천연 서열 λ5 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드로서 본원에서 정의된다. 본원에서 정의된 바와 같은 "변이체 λ5 폴리펩티드"는 천연 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열, 또는 이의 단편과 상이할 것이다. 바람직하게는, "변이체 λ5 폴리펩티드"는 천연 서열 λ5 폴리펩티드와 적어도 약 65％, 또는 적어도 약 70％, 또는 적어도 약 75％, 또는 적어도 약 80％, 또는 적어도 약 85％, 또는 적어도 약 90％, 또는 적어도 약 95％, 또는 적어도 약 98％의 서열 동일성을 보유할 것이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, "변이체 λ5 폴리펩티드"는 이의 아미노산 서열이 천연 항체 λ 또는 κ 경쇄 서열에 대해 95％ 미만, 또는 90％ 미만, 또는 85％ 미만, 또는 80％ 미만, 또는 75％ 미만, 또는 70％ 미만, 또는 65％ 미만, 또는 60％ 미만으로 동일할 것이다. 변이체 λ5 폴리펩티드에는 λ5 서열의 N-말단의 독특한 꼬리가 부분적으로 또는 완전히 제거된 λ5 폴리펩티드가 비제한적으로 특히 포함된다.
어버이 아미노산 서열 신원을 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 ([Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)])을 사용하여 결정할 수 있다. NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 다운로드받을 수 있거나, 또는 미국 국립 보건원(National Institute of Health, Bethesda, MD)에서 수득할 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 검색 프로그램을 사용하고, 이때 모든 이러한 검색 파라메터들은 언마스크(unmask) = 예스(yes), 가닥 = 모두, 기대 발생률(expected occurrence) = 10, 최소의 낮은 복잡성 길이 = 15/5, 멀티-패스(multi-pass) e-값 = 0.01, 멀티-패스에 대한 상수 = 25. 최종 갭(gapped) 정렬에 대한 드롭오프(dropoff) = 25 및 채점 매트릭스 = BLOSUM62가 예를 들어 포함되는 디폴트(default) 값으로 설정된다.
용어 "VpreB 서열"은 상기에 정의된 바와 같은 "VpreB", 또는 이의 단편의 서열을 지칭하도록 본원에서 사용된다.
용어 "λ5 서열"은 상기에 정의된 바와 같은 "λ5", 또는 이의 단편의 서열을 지칭하도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "대용물 경쇄 서열"은 상기에 정의된 바와 같은 "VpreB 서열" 및/또는 "λ5 서열"을 포함하는 임의의 폴리펩티드 서열을 의미한다. 구체적으로, 본원에서 사용된 "대용물 경쇄 서열"에는 서열 1의 인간 VpreB1 서열, 서열 2 및 3의 마우스 VpreB2 서열, 및 서열 4의 인간 VpreB3 서열, 및 스플라이스 변이체 및 번역후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이들의 다양한 이소형, 또다른 포유류 종에서의 이들의 상동체, 뿐만 아니라 이들의 단편 및 변이체가 비제한적으로 포함된다. 추가적으로, 용어 "대용물 경쇄 서열"에는 서열 5의 인간 λ5 서열, 서열 6의 인간 λ5-유사 서열, 및 스플라이스 변이체 및 번역후 변형에 의해 형성된 변이체를 포함하는 이들의 이소형, 또다른 포유류 종에서의 이들의 상동체, 뿐만 아니라 이들의 단편 및 변이체가 비제한적으로 포함된다. 용어 "대용물 경쇄 서열"에는 상기 정의된 바와 같은 VpreB 및 λ5 서열 양쪽 모두를 포함하는 서열이 추가적으로 포함된다.
대용물 경쇄 (SCL) 및 이의 성분들의 구조를 포함하는 pre-B-세포 수용체 (pre-BCR)의 3차원 구조에 대해서, 예를 들어 [Lanig et al., Mol. Immunol. 40(17):1263-72 (2004)]를 참조한다.
"대용물 경쇄 서열"이 본원에서의 "대용물 경쇄 구축물"을 형성하도록 이종성 아미노산 서열 또는 임의의 또다른 이종성 성분에 임의적으로 접합될 수 있다. 따라서, 용어 "대용물 경쇄 구축물"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 대용물 경쇄 서열에 접합된 이종성 아미노산 서열, 핵산 및 기타 분자를 포함하여 임의의 모든 추가적인 이종성 성분을 포함하며, 이때 "접합"은 하기 정의된 바와 같다. "대용물 경쇄 구축물"은 본원에서 'SURROBODY™'로 또한 칭해지고, 2개의 용어는 상호교환가능하게 사용된다.
본 발명의 폴리펩티드의 문맥에서, 제1 아미노산 서열과 관련된 용어 "이종성 아미노산 서열"은 천연적으로는 제1 아미노산 서열과 회합되지 않은 (적어도 본원에서의 대용물 경쇄 구축물에서 존재하는 형태가 아닌) 아미노산을 지칭하도록 사용된다. 따라서, VpreB와 관련된 "이종성 아미노산 서열"은 천연 환경에서 천연 VpreB와 회합되지 않은 임의의 아미노산 서열이고, 비제한적으로, 발달 중인 B-세포 상에서 VpreB와 함께 대용물 경쇄를 형성하는 λ5 서열과 상이한 λ5 서열, 예컨대 아미노산 서열 변이체, 예를 들어, 말단절단 및/또는 유도체화 λ5 서열을 포함한다. 천연 환경에서는 VpreB 및 λ5 서열이 서로 공유결합적으로 회합, 예를 들어 융합되지 않기 때문에, VpreB와 관련된 "이종성 아미노산 서열"은 VpreB와 공유결합적으로 회합된, 예를 들어 VpreB에 융합된 λ5 서열 (천연 서열 λ5 포함)을 또한 포함한다. 이종성 아미노산 서열은 항체 및 중쇄 서열 및 이의 단편, 예를 들어, 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열, 및 항체 경쇄 및 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 항체 서열을 비제한적으로 또한 포함한다.
용어 "접합체", "접합된", 및 "접합"은 임의의 모든 형태의 공유결합 또는 비-공유결합 연결을 지칭하고, 직접적인 유전학적 또는 화학적 융합, 링커 또는 가교제를 통한 커플링, 및 비-공유결합 회합, 예를 들어, 반데르발스 힘을 통한 또는 류신 지퍼를 사용하는 것에 의한 회합이 비제한적으로 포함된다.
용어 "융합"은 기원이 상이한 아미노산 서열들이 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열들의 인-프레임(in-frame) 조합에 의해 하나의 폴리펩티드 사슬에서 조합되는 것을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 용어 "융합"은, 폴리펩티드 사슬 말단 중 하나에 융합되는 것에 것에 더하여, 내부 융합, 즉 상이한 기원의 서열이 폴리펩티드 사슬 내에 삽입되는 것을 명확하게 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "표적"은 본원에서의 폴리펩티드와 상호작용하는 물질이다. 본원에서 정의된 바와 같은 표적에는 본 발명의 VpreB-함유 구축물이 상호작용하는 항원이 구체적으로 포함된다. 바람직하게는, 상호작용은 직접적인 결합에 의해 일어난다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 모두 공유결합적 "펩티드 연결"에 의해 연결된 아미노산들의 1차 서열을 지칭한다. 일반적으로, 펩티드는 몇몇개의 아미노산, 전형적으로는 약 2개 내지 약 50개의 아미노산으로 구성되고, 단백질보다 더 짧다. 본원에서 정의된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 및 단백질을 포함한다.
용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는 당업계에서 인정되는 정의의 아미노산, 예컨대 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 타이로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 전형적으로 지칭하지만, 원한다면 변형, 합성 또는 희귀 아미노산이 사용될 수 있다. 따라서, 37 CFR 1.822(b)(4)에 열거된 변형된 아미노산 및 일반적이지 않은 아미노산이 이러한 정의 내에 명확하게 포함되고, 거명에 의해 본원에 특히 포함된다. 아미노산은 다양한 하위군으로 나뉠 수 있다. 따라서, 아미노산은 비극성 측쇄가 있는 것 (예를 들어, Ala, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val); 음성 전하를 띠는 측쇄가 있는 것 (예를 들어, Asp. Glu): 양성 전하를 띠는 측쇄가 있는 것 (예를 들어, Arg, His, Lys); 또는 전하를 띠지 않는 극성 측쇄가 있는 것 (예를 들어, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, 및 Tyr)으로 분류될 수 있다. 아미노산은 소형 아미노산 (Gly, Ala), 친핵성 아미노산 (Ser, His, Thr, Cys), 소수성 아미노산 (Val, Leu, Ile, Met, Pro), 방향족 아미노산 (Phe, Tyr, Trp, Asp, Glu), 아미드 (Asp, Glu), 및 염기성 아미노산 (Lys, Arg)으로 또한 분류될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 핵산 예컨대 DNA 분자 및 RNA 분자 및 이들의 유사체 (예를 들어, 뉴클레오티드 유사체를 사용하거나 핵산 화학을 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA)를 지칭한다. 원한다면, 폴리뉴클레오티드를 합성에 의해, 예를 들어 당업계에 인정된 핵산 화학을 사용하여, 또는 효소에 의해, 예를 들어, 중합효소를 사용하여 제조할 수 있고, 원한다면 변형시킬 수 있다. 전형적인 변형에는 메틸화, 비오틴화, 및 기타 당업계에 공지된 변형이 포함된다. 또한, 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 원한다면, 검출가능한 모이어티(moiety)에 연결될 수 있다.
기준 폴리펩티드와 관련된 용어 "변이체"는 천연 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이 또는 변형 (즉, 변경)이 있는 폴리펩티드를 지칭한다. "아미노산 변형"에 의해 생성된 변이체는, 예를 들어, 천연 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에서의 치환, 결실, 삽입 및/또는 화학적 변형에 의해 생산될 수 있다.
"아미노산 변형"은 미리 정해진 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 변화를 지칭한다. 예시적인 변형에는 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실이 포함된다.
특정 위치"에서의 아미노산 변형"은 특정 잔기의 치환 또는 결실, 또는 특정 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 특정 잔기에 "인접한" 삽입은 이로부터 1개 내지 2개 잔기 이내에서의 삽입을 의미한다. 삽입은 특정 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
"아미노산 치환"은 미리 정해진 아미노산 서열 내의 하나 이상의 기존의 아미노산 잔기를 또다른 상이한 "교체" 아미노산 잔기로 교체하는 것을 지칭한다. 교체 잔기 또는 잔기들은 "천연 발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩되는 잔기)일 수 있고, 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 타이로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 비-천연발생 아미노산 잔기로의 치환이 본원에서의 아미노산 치환의 정의에 또한 포함된다.
"비-천연 발생 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 사슬 내의 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유결합적으로 결합할 수 있는, 상기 열거된 천연 발생 아미노산 잔기 이외의 잔기를 지칭한다. 비-천연 발생 아미노산 잔기의 예로는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 기타 아미노산 잔기 유사체 예컨대 [Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301 336 (1991)]에 기술된 것들이 포함된다. 이같은 비-천연 발생 아미노산 잔기를 생성시키기 위해, [Noren et al. Science 244: 182 (1989)] 및 [Ellman et al., 상기 문헌]의 절차를 사용할 수 있다. 간략하게, 이러한 절차들은 억제인자(suppressor) tRNA를 비-천연 발생 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화시키는 것에 이은 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다.
"아미노산 삽입"은 하나 이상의 아미노산이 미리 정해진 아미노산 서열 내로 혼입되는 것을 지칭한다. 일반적으로 삽입은 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 구성될 것이지만, 본 출원에서 더 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어 약 3개 내지 약 5개 또는 심지어 약 10개까지의 아미노산 잔기의 삽입이 구현된다. 삽입된 잔기(들)은 상기 개시된 바와 같은 천연 발생 또는 비-천연 발생 잔기일 수 있다.
"아미노산 결실"은 미리 정해진 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되는 것을 지칭한다.
용어 "돌연변이유발"은, 달리 특정되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 변경시키기 위한 임의의 당업계에서 인정되는 기술을 지칭한다. 바람직한 유형의 돌연변이유발에는 에러-경향 PCR 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 또는 기타 부위-지정 돌연변이유발이 포함된다.
"부위-지정 돌연변이유발"은 당업계에서 표준인 기술이고, 원하는 돌연변이를 나타내는 제한된 미스매칭(mismatching)을 제외하고는 돌연변이될 단일 가닥 파지 DNA에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행된다. 간략하게, 합성 올리고뉴클레오티드가 프라이머로 사용되어 단일 가닥 파지 DNA에 상보적인 가닥의 합성이 지시되고, 생성된 이중 가닥 DNA가 파지를 지지하는 숙주 박테리아 내로 형질전환된다. 형질전환된 박테리아의 배양물을 최상층 한천에 놓아, 파지가 있는 단일 세포로부터 플라크가 형성되도록 한다. 이론적으로, 새로운 플라크의 50％는 단일 가닥으로서 돌연변이된 형태를 갖는 파지를 함유할 것이고, 50％는 원래의 서열을 가질 것이다. 정확한 매치의 혼성화를 허용하지만, 원래의 서열과의 미스매치는 혼성화를 방지하기에 충분한 온도에서, 키나제로 처리된 합성 프라이머와 혼성화시킴으로써 당해 플라크를 선별한다. 그후, 프로브와 혼성화한 플라크를 선별하고, 서열분석하고, 배양하고, DNA를 회수한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "항체" (Ab)는 V(D)J 유전자 재조합으로부터 유래된 고전적으로 재조합된 중쇄 및 VJ 유전자 재조합으로부터 또한 유래된 고전적으로 재조합된 경쇄로부터의 천연 항체, 또는 이의 단편을 지칭하도록 사용된다.
"천연 항체"는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성(heterotetrameric) 당단백질이다. 각각의 경쇄는 디술피드 공유 결합(들)에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 디술피드 연결의 개수는 여러 면역글로불린 이소타입(isotype)의 중쇄들 간에 상이하다. 또한 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적인 간격의 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 다수의 불변 도메인이 이어지는 가변 도메인 (VH)을 한쪽 말단에 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다 ([Chothia et al., J. Mol. Biol. 186:651 (1985)]; [Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592 (1985)]).
항체 사슬과 관련하여 용어 "가변"은 항체들 간에서 서열이 크게 상이하고 각각의 특정 항체의 자신의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 참여하는 항체 사슬의 부분을 지칭하도록 사용된다. 이같은 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 양쪽 모두 내의 초가변 영역으로 칭해지는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해진다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 형상을 주로 채택한 4개의 FR (각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함하고, 상기 초가변 영역은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 초가변 영역들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pp 647-669] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 수반되지는 않지만, 항체-의존적 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 30-36 (L1), 46-55 (L2) 및 86-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 30-35 (H1), 47-58 (H2) 및 93-101 (H3); [MacCallum et al,. J Mol Biol. 262(5):732-45 (1996)])를 포함한다.
용어 "프레임워크 영역"은 더욱 상이한 CDR 영역들 간에 존재하는, 당업계에서 인정된 항체 가변 영역의 일부분을 지칭한다. 이같은 프레임워크 영역은 프레임워크 1 내지 4 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)로 지칭되고, 3차원 공간에서, 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 영역에서 발견되는 3개의 CDR을 이들이 항원 결합 표면을 형성할 수 있도록 홀딩(holding)하기 위한 스캐폴드(scaffold)를 제공한다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 여러 클래스로 할당될 수 있다. 항체 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(subclass) (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다.
상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 칭해진다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 칭해지는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 할당될 수 있다. 본원에서의 항체 경쇄에 대한 임의의 언급은 κ 및 λ 경쇄 양쪽 모두를 포함한다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부분, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 도메인을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 및 (ScFv)2 단편이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 용어 "항체 결합 영역"은 항원(들)에 결합할 수 있는 면역글로불린 또는 항체 가변 영역의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 전형적으로, 항체 결합 영역은, 예를 들어, 항체 경쇄 (VL) (또는 이의 가변 영역), 항체 중쇄 (VH) (또는 이의 가변 영역), 중쇄 Fd 영역, 조합된 항체 경쇄 및 중쇄 (또는 이의 가변 영역) 예컨대 Fab, F(ab')2, 단일 도메인, 또는 단일쇄 항체 (scFv), 또는 전장 항체, 예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 아미노산이 적어도 약 3개 내지 5개, 바람직하게는 적어도 약 5개 내지 10개, 또는 적어도 약 5개 내지 15개이고, 전형적으로는 아미노산이 약 500개 미만 또는 약 1,000개 미만인 서열로서, 혼자서 또는 더 큰 서열의 일부분으로서, 이같은 서열에 응답하여 생성된 항체에 결합하는 서열을 정의하는 서열을 지칭한다. 에피토프는 자신이 유래된 어버이 단백질의 일부분과 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드에 한정되지 않는다. 실제로, 바이러스 게놈은 지속적인 변화 상태에 있고, 단리물들 간에 비교적 높은 정도의 가변성을 나타낸다. 따라서, 용어 "에피토프"는 천연 서열에 동일한 서열, 뿐만 아니라 변형, 예컨대 천연 서열에 대한 결실, 치환 및/또는 삽입을 포함한다. 일반적으로, 이같은 변형은 성질 면에서 보존적이지만, 비-보존적 변형이 또한 구현된다. 이 용어는 "미모토프(mimotope)", 즉 연속적인 선형 천연 서열이 확인되지 않거나 반드시 천연 단백질 내에 존재하지는 않지만, 천연 단백질 상의 에피토프를 기능적으로 모방하는 서열을 명확하게 포함한다. 용어 "에피토프"는 선형 및 구조적 에피토프를 명확하게 포함한다.
용어 "벡터"는 세포 내에서 자기 복제될 수 있고, 부착된 절편의 복제를 야기하도록 DNA 절편, 예를 들어, 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 작동적으로 연결될 수 있는 rDNA 분자를 지칭하도록 사용된다. 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 용어 "제어 서열"은 특정 숙주 생물에서의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적절한 제어 서열에는, 예를 들어, 프로모터, 임의적인 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우에 상기 DNA가 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우에 프로모터 또는 인핸서가 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나, 또는 리보좀 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 배치된 경우에 리보좀 결합 부위가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하고, 분비 리더의 경우에는 인접하고 판독 상 내에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.
"파지 디스플레이 라이브러리"는 클로닝된 단백질 서열들의 수집물을 파지 코트 단백질과의 융합체로서 발현하는 단백질 발현 라이브러리이다. 따라서, "파지 디스플레이 라이브러리"라는 구절은 외인성 (전형적으로는 이종성) 단백질을 발현하는 파지 (예를 들어, 필라멘트형 파지)의 수집물을 본원에서 지칭한다. 외인성 단백질은 파지가 접촉되는 다른 모이어티와 자유롭게 상호작용 (결합)할 수 있다. 외인성 단백질을 디스플레이하는 각각의 파지가 파지 디스플레이 라이브러리의 "구성원"이다.
용어 "필라멘트형 파지"는 이종성 폴리펩티드를 표면 상에 디스플레이할 수 있는 바이러스 입자를 지칭하고, 비제한적으로, f1, fd, Pf1, 및 M13을 포함한다. 필라멘트형 파지는 선별성 마커 예컨대 테트라사이클린을 함유할 수 있다 (예를 들어, "fd-tet"). 다양한 필라멘트형 파지 디스플레이 시스템이 당업자에게 주지되어 있다 (예를 들어, [Zacher et al. Gene 9:127-140 (1980)], [Smith et al. Science 228:1315-1317 (1985)]; 및 [Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988)] 참조).
용어 "패닝(panning)"은 표적에 대한 친화력 및 특이성이 높은 화합물, 예컨대 항체를 보유하는 파지의 확인 및 단리에서의 다중 라운드의 스크리닝 프로세스를 지칭하도록 사용된다.
B. 상세한 설명
본 발명의 방법을 수행하기 위한 기술은 당업계에 주지되어 있고, [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)]; [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, J. Sambrook and D. W. Russell, eds.. Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]; [O'Brian et al., Analytical Chemistry of Bacillus Thuringiensis, Hickle and Fitch, eds., Am. Chem. Soc, 1990]; [Bacillus thuringiensis: biology, ecology and safety, T.R. Glare and M. O'Callaghan, eds., John Wiley, 2000]; [Antibody Phage Display, Methods and Protocols, Humana Press, 2001]; 및 [Antibodies, G. Subramanian, ed., Kluwer Academic, 2004]이 예를 들어 포함되는 표준 실험 교본에 기술되어 있다. 돌연변이유발은, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 ([Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488-492 (1985)])를 사용하여 수행할 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 번호 4,683,192, 4,683,202, 4,800,159, 및 4,965,188, 및 ["PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", H. Erlich, ed., Stockton Press, New York (1989)]; 및 [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds.. Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]이 포함되는 여러 교본에 기술되어 있다.
본 발명은 항체 대용물 경쇄 서열을 포함하는 구축물 및 라이브러리에 관한 것이다.
대용물 경쇄 구축물
상기 논의된 바와 같이, pre-B-세포가 μ 중쇄를 생산하지만 완전하게 발달된 경쇄 대신 각각 VpreB(1-3) 및 λ5로 칭해지는 B 계통-특이적 유전자들의 셋트를 발현하는 림프구로서 골수에서 확인되었다. VpreB 및 λ5 폴리펩티드는 비-공유결합적으로 회합된 Ig 경쇄-유사 구조를 함께 형성하고, 이는 대용물 경쇄로 칭해진다. 대용물 경쇄는, 비록 항체 사슬은 아니지만, 모든 항체 중쇄와 천연적으로 회합하고, 대용물 경쇄-항체 중쇄 복합체는 자가-항원에 결합하는 것으로 나타났다.
한 양상에서, 본 발명은 VpreB 및/또는 λ5 서열을 포함하고 표적에 결합하는 능력이 있는 폴리펩티드를 제공한다. 표적은 본 발명의 VpreB 및/또는 λ5 서열-함유 폴리펩티드에 대한 결합 파트너인 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 표적은 항체 결합의 정황에서 "항원"으로 일반적으로 지칭되는 표적의 모든 유형을 명확하게 포함한다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 원하는 표적에 결합하는 능력을 유지하는 한, 이종성 아미노산 서열에 대한 VpreB 서열의 접합체를 비제한적으로 포함한다. 이종성 아미노산 서열에 대한 VpreB 서열의 결합은 공유결합 또는 비-공유결합일 수 있고, 직접적으로 또는 링커 (펩티드 링커 포함)를 통해 일어날 수 있다.
본원에서의 폴리펩티드 구축물의 구체적인 예로는 VpreB 서열, 예컨대 VpreB1, VpreB2, 또는 VpreB3 서열 (천연 서열의 단편 및 변이체 포함)이 λ5 서열 (천연 서열의 단편 및 변이체 포함)에 접합되어 있는 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 유형의 대표적인 융합체가 도 2 및 11에 도해되고, 실시예에 기술된다.
직접적인 융합체에서, 전형적으로 VpreB 서열 (예를 들어, VpreB1, VpreB2 또는 VpreB3 서열)의 C-말단이 λ5 서열의 N-말단에 융합된다. 천연 VpreB 서열의 전체 길이를 전장 λ5 서열에 융합시키는 것이 가능하지만 (예를 들어, 도 3의 첫번째 도식 참조), 전형적으로는 2개의 폴리펩티드 각각 내의 CDR3 유사 부위에서 또는 이러한 부위 주변에서 융합이 일어난다. VpreB1 및 λ5에 대한 이같은 CDR3 유사 부위가 도 1에 도해되고, 대표적인 융합 구축물이 도 2에 도해된다. 이러한 실시양태에서, CDR3 유사 영역 내에서 또는 이러한 영역의 어느 한쪽 측면에서 아미노산 잔기 약 10개 이내의 위치에서 융합이 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 천연 인간 VpreB1 서열 (서열 1)의 대략적인 아미노산 잔기 116 내지 126 사이에서, 그리고 천연 인간 λ5 서열 (서열 5)의 대략적인 아미노산 잔기 82 내지 93 사이에서 융합이 일어난다.
도 2에 나타난 바와 같이, VpreB 서열을 항체 λ 경쇄의 CDR3 영역에 융합시키는 것이 또한 가능하다. VpreB 및 λ5 중 하나만이 말단절단된 추가적인 구축물이 도 3에서 제시된다. 항체 κ 경쇄 서열을 사용하여 유사한 구축물들을 제조할 수 있다.
추가적인 직접적인 융합 구조물이 도 11의 오른쪽에 도해된다. "SLC 융합체 1"로 명시된 구조물은 말단절단된 V-preB1 서열 (천연 VpreB1의 C-말단의 특징적인 "꼬리"가 없음)과 유사하게 말단절단된 λ5 서열의 융합체가 항체 중쇄와 비-공유결합적으로 회합되어 있는 2개의 이량체로 구성된 사량체이다. "SLC 융합체 2"로 명시된 구조물은 말단절단된 V-preB1 서열 (천연 VpreB1의 C-말단의 특징적인 "꼬리"가 없음)과 항체 경쇄 불변 영역의 융합체가 항체 중쇄와 비-공유결합적으로 회합되어 있는 2개의 이량체로 구성된 사량체이다. "SLC 융합체 3"으로 명시된 구조물은 항체 경쇄 가변 영역과 말단절단된 λ5 서열 (천연 λ5 의 N-말단의 특징적인 "꼬리"가 없음)의 융합체가 항체 중쇄와 비-공유결합적으로 회합되어 있는 2개의 이량체로 구성된 사량체이다.
상기 주지된 바와 같이, 직접적인 융합체에 더하여, 본 발명의 폴리펩티드 구축물은 VpreB 서열 (천연 서열의 단편 및 변이체 포함)과 이종성 서열, 예컨대 λ5 서열 (천연 서열의 단편 및 변이체 포함), 및/또는 항체 서열의 비-공유결합 회합체를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 전장 VpreB 서열이 말단절단된 λ5 서열과 비-공유결합적으로 회합될 수 있다. 별법적으로, 말단절단된 VpreB 서열이 전장 λ5 서열과 비-공유결합적으로 회합될 수 있다.
항체 중쇄와 비-공유결합적으로 회합된, 비-공유결합적으로 회합된 VpreB1과 λ5 서열을 포함하는 대용물 경쇄 구축물이 도 11의 왼쪽에 제시된다. 다양한 도해들이 나타내는 바와 같이, 구조물은, 예를 들어, 전장 VpreB1 및 λ5 서열, 말단절단된 λ5 서열과 회합된 전장 VpreB1 서열 ("람다 5 dT"), 전장 λ5 서열과 회합된 말단절단된 VpreB1 서열 ("VpreB dT") 및 말단절단된 λ5 서열과 회합된 말단절단된 VpreB1 서열 ("단축형")을 포함할 수 있다.
도 11에서 특정한 구체적인 구축물들이 도해되었지만, 당업자는 다양한 또다른 구축물들이 유사한 방식으로 제조되어 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 도 11에 도해된 구조물과 대립적으로, 각각의 팔에 상이한 대용물 경쇄 서열을 포함하고/하거나 삼량체성 또는 오량체성 구조물이 있어서 구조물이 비대칭적일 수 있다. 본 발명의 대용물 경쇄 구축물의 다양한 부분에서 상이한 기능성 기를 포함함으로써, 다중특이적 및/또는 다가 구축물을 생산하는 것이 또한 가능하다.
원한다면, 예를 들어, 대용물 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 유사 영역 내로 항체 (공지된 치료적 항체 포함)의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역으로부터의 공지된 서열 또는 서열 모티프를 혼입 또는 부가함으로써, 본 발명의 구축물을 조작할 수 있다. 이는 항체는 아니지만 공지된 치료적 항체와 매우 유사한 결합 특이성 및 친화력을 나타낼 분자가 생성되도록 한다.
본원에서의 모든 대용물 경쇄 구축물은 항체 서열과 회합될 수 있다. 예를 들어, 도 5에 나타난 바와 같이, VpreB-λ5 융합체가 펩티드 링커에 의해 항체 중쇄 가변 영역 서열에 연결될 수 있다. 또다른 실시양태에서, VpreB-λ5 융합체가 항체 중쇄, 또는 가변 영역 서열을 포함하는 이의 단편과 비-공유결합적으로 회합되어, 이량체성 복합체가 형성될 수 있다. 또다른 실시양태에서, VpreB 및 λ5 서열이 서로, 그리고 항체 중쇄, 또는 가변 영역 서열을 포함하는 이의 단편과 비-공유결합적으로 회합되어, 삼량체성 복합체가 형성된다. 항체 중쇄를 포함하는 예시적인 구축물들이 도 11에 도해된다.
본 발명의 구축물이 특정 실시양태들을 참조로 도해되었지만, 당업자는 대용물 경쇄 및 항체 서열의 다양한 교환에 의해 수득된 수많은 추가적인 실시양태들이 가능하고, 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 대용물 경쇄 서열을 포함하고 원하는 표적에 결합하는 능력이 있는 모든 구축물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 구축물은 항체 중쇄 가변 영역 서열과 회합하는 능력을 또한 갖는다.
본 발명의 구축물은 대용물 경쇄 서열의 라이브러리를 건설하는데 사용될 수 있고, 이러한 라이브러리는 원하는 결합 특이성 및 친화력이 있는 구축물의 선별을 포함하여, 항체 라이브러리와 유사하게, 다양한 목적으로 사용될 수 있다.
VpreB 및 λ5 대용물 경쇄 서열이 서로 비-공유결합적으로 회합되는 경우, 성분들 중 하나 또는 양쪽 모두의 자유로운 끝부분 (즉, VpreB 서열의 C-말단 끝부분 및/또는 λ5 서열의 N-말단 끝부분)은 이같은 서열들의 라이브러리 내로 추가적인 다양성을 혼입시키는데 이용가능하다. 예를 들어, 무작위 펩티드 라이브러리가 이러한 자유로운 끝부분들 중 하나에 부가 또는 치환될 수 있고, 특정한 표적에 대한 특이적인 결합에 대해 패닝될 수 있다. 원하는 결합 특이성이 있는 것으로 확인된 대용물 경쇄를 동일한 표적에 대한 항체로부터의 중쇄 또는 중쇄 단편과 조합함으로써, 2개의 별개의 장소에서 동족 표적에 결합하는 능력이 있는 분자가 생성될 수 있다. 이러한 연계(tandem) 결합, 또는 "킬레이팅(chelating)" 효과는, 이량체성 면역글로불린에서 보이는 결합성(avidity) 효과와 유사하게, 단일 표적에 대한 결합을 강력하게 강화시킨다. 상이한 표적에 결합하는 성분을 사용하는 것이 또한 가능하다. 따라서, 예를 들어, 원하는 결합 특이성이 있는 대용물 경쇄 성분이 상이한 표적에 결합하는 항체 중쇄 또는 중쇄 단편과 조합될 수 있다. 예를 들어, 대용물 경쇄 성분은 종양 항원에 결합할 수 있는 한편, 항체 중쇄 또는 중쇄 단편은 이펙터 세포에 결합할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적화 및 항-종양 활성이 있는 단일한 본체(entity)가 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, VpreB와 λ5 서열을 연결시키는 폴리펩티드 또는 부가물은 항체 또는 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 scFv 단편일 수 있다. 항체 서열의 혼입은 "킬레이팅" 효과를 일으킬 뿐만 아니라, 제2의 독립적인 팔, 예컨대 이중특이적 항체에서 발견되는 것을 필요로 하지 않으면서, 단일 분자 내에 이중특이성을 또한 생성시킬 것이다. 2가지 특이성은 동일한 표적의 상이한 부분들, 전혀 다른 표적들, 또는 표적 항체 복합체에 대한 것일 수 있다. 유사하게, 펩티드, 단백질, 효소 등이 포함되는, 항체 또는 항체 단편 이외의 임의 유형의 분자와 함께 다중특이적 구축물이 제조될 수 있다. 예를 들어, 원하는 특이성이 있는 대용물 경쇄 성분이 임의의 치료적 펩티드 또는 단백질과 조합될 수 있다.
대용물 경쇄 구축물의 제조
본 발명의 대용물 경쇄 구축물을 재조합 DNA 테크놀로지의 주지된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
대용물 경쇄, 예를 들어 VpreB 및 λ5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 천연 공급원, 예를 들어, 발달 중인 B-세포로부터 단리할 수 있고/있거나 합성 또는 반-합성 방법에 의해 수득할 수 있다. 일단 이러한 DNA가 확인 및 단리되거나 또는 다른 방식으로 생산되면, 이를 추가적인 클로닝 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 결찰시킬 수 있다.
본원에서의 폴리펩티드의 코딩 서열을 발현시키기 위해 사용될 수 있는 클로닝 및 발현 벡터는 당업계에 주지되어 있고, 시판된다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 일반적으로 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본원에서의 벡터 내의 대용물 경쇄 구축물을 코딩하는 DNA의 클로닝 또는 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고급 진핵생물 (포유류) 세포이고, 포유류 세포가 바람직하다.
적절한 포유류 숙주 세포주의 예로는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 인간 배아 신장 세포주 293 (293 세포) ([Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ([Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)가 비제한적으로 포함된다.
포유류 세포에서 사용하기 위해, 발현 벡터 상에서의 제어 기능이 바이러스 물질에 의해 종종 제공된다. 따라서, 통상적으로 사용되는 프로모터가 폴리오마, 아데노바이러스2, 레트로바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 기타 프로모터, 예컨대 β-액틴 프로모터가 이종성 공급원으로부터 유래된다. 적절한 프로모터의 예로는 SV40의 초기 및 후기 바이러스 ([Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)]), 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 프로모터 ([Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982)]), 및 원하는 유전자 서열과 정상적으로 회합되는 프로모터 및/또는 제어 서열이 비제한적으로 포함되고, 단 이같은 제어 서열은 숙주 세포 시스템과 화합성(compatible)이다.
고급 진핵생물에 의한 원하는 이종성 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 프로모터 상에 작용하여 이의 전사 개시 활성을 강화시키는, DNA의 시스(cis)-작용 요소 (일반적으로 약 10 내지 300 bp)이다. 인핸서는 비교적 배향 및 위치가 독립적이지만, 바람직하게는 발현 벡터 내에 존재하는 프로모터 서열의 상류에 위치한다. 인핸서는 프로모터와 동일한 공급원으로부터, 예컨대 진핵세포 생물 바이러스로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 복제 기원의 후기 측면의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측면의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서이다.
포유류 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 폴리아데닐화 부위, 예컨대 SV40 (초기 및 후기) 또는 HBV와 같은 바이러스로부터 유래된 것들을 또한 함유한다.
외인성 기원을 포함하도록 벡터를 구축함으로써 복제 기원이 제공될 수 있고, 예컨대 SV40 또는 기타 바이러스 (예를 들어, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV) 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 숙주 세포에 의해 복제 기원이 제공될 수 있다.
발현 벡터는 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩하는 선별성 마커를 일반적으로 함유한다. 포유류 세포에 대한 적절한 선별성 마커의 예로는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK) 및 네오마이신이 포함된다.
적절한 포유류 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있고 시판된다. 따라서, 예를 들어, DNA 삽입물의 구성적인 발현을 촉진하는 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 인핸서/프로모터 영역을 보유하는 pCI 발현 벡터 (Promega)를 사용하여 포유류 숙주 세포에서 본 발명의 대용물 경쇄 구축물을 생산할 수 있다. 벡터는 선별성 마커로서 네오마이신 포스포트랜스페라제 유전자를 함유할 수 있다.
본 발명의 대용물 경쇄 구축물은 박테리아 숙주 세포에서 또한 생산될 수 있다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 제어 요소에는 프로모터 (오퍼레이터 서열을 임의적으로 함유함), 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 적절한 프로모터에는 갈락토스 (gal), 락토스 (lac), 말토스, 트립토판 (trp), β-락타마제 프로모터, 박테리오파지 λ 및 T7 프로모터가 비제한적으로 포함된다. 또한, 합성 프로모터, 예컨대 tac 프로모터가 사용될 수 있다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 Fab 분자를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (SD: Shine-Dalgarno) 서열을 또한 일반적으로 함유한다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원이 대부분의 그람(Gram)-음성 박테리아에 적절하다.
항체 대용물 경쇄 서열을 포함하는 다중 사슬 구축물 내의 개별적인 사슬들의 코딩 서열들은 별도의 조절 서열들의 제어 하에 동일한 발현 벡터 내에 존재할 수 있거나, 또는 별도의 발현 벡터들 내에 존재하여 원하는 숙주 세포 (진핵생물 및 원핵생물 숙주 포함)를 공동-형질감염시키는데 사용될 수 있다. 따라서, Novagen에서 시판되는 Duet™ 벡터를 사용하여 다중 유전자들을 공동-발현시킬 수 있다.
형질전환된 숙주 세포를 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 포유류 숙주 세포를 배양하기 위한 시판되는 배지에는 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)가 포함된다. 또한, [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)] 및 [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)]에 기술된 배지들 중 임의의 배지를 숙주 세포용 배양 배지로 사용할 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 제조업자의 지침서에 포함되거나, 또는 당업자에게 명백할 것이다.
포유류, 박테리아 (예를 들어, 대장균) 또는 기타 숙주 세포를 배양하기 위한 추가적인 적절한 배지가 표준 교본, 예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌], 또는 [Ausubel et al., 상기 문헌]에 또한 기술되어 있다.
당업계에 공지된 방법에 의해 정제를 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, Ni-NTA 정제 시스템 (Invitrogen)을 사용하여, 6×His-태그가 부착된 형태로 대용물 항체 분자가 정제된다.
대용물 경쇄 서열을 포함하는 라이브러리
추가적으로 본 발명은 대용물 경쇄 서열 및 이같은 서열을 포함하는 구축물의 다양한 라이브러리에 관한 것이다. 따라서, 이같은 라이브러리는 상기에 구체적으로 기술되고/되거나, 도면에서 도해되고/되거나 실시예에 기술된 것들을 비제한적으로 포함하여, 본 발명의 VpreB- 및/또는 λ5-함유 구축물들과 같은 대용물 경쇄 서열들의 디스플레이들을 포함하거나, 이러한 디스플레이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이러한 디스플레이들로 구성될 수 있다.
본 발명의 라이브러리는 바람직하게는 디스플레이의 형태이다. 항체 및 기타 폴리펩티드가 포함되는 이종성 단백질을 디스플레이하기 위한 시스템이 당업계에 주지되어 있다. 항체 유전자를 코딩하는 필라멘트형 파지의 표면 상에 항체 단편이 디스플레이되었다 ([Hoogenboom and Winter J. Mol. Biol, 222:381 388 (1992)]; [McCafferty et al., Nature 348(6301):552 554 (1990)]; [Griffiths et al. EMBO J., 13(14):3245-3260 (1994)]). 항체 라이브러리를 선별하고 스크리닝하기 위한 기술의 리뷰를 위해서, 예를 들어, [Hoogenboom, Nature Biotechnol. 23(9):1105-1116 (2005)]을 참조한다. 또한, 대장균 ([Agterberg et al., Gene 88:37-45 (1990)]; [Charbit et al., Gene 70:181-189 (1988)]; [Francisco et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:2713-2717 (1992)]), 및 효모 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) ([Boder and Wittrup. Nat. Biotechnol. 15:553-557 (1997)]; [Kieke et al., Protein Eng. 10:1303-1310 (1997)])의 표면 상에서의 이종성 단백질 및 이의 단편의 디스플레이를 위한 시스템들이 당업계에 공지되어 있다. 또다른 공지된 디스플레이 기술에는 리보솜 또는 mRNA 디스플레이 ([Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:9022-9026 (1994)]; [Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:4937-4942 (1997)]), DNA 디스플레이 ([Yonezawa et al., Nucl. Acid Res. 31(19):e118 (2003)]); 미생물 세포 디스플레이, 예컨대 박테리아 디스플레이 ([Georgiou et al., Nature Biotech. 15:29-34 (1997)]), 포유류 세포 상의 디스플레이, 포자 디스플레이 ([Isticato et al., J. Bacteriol. 183:6294-6301 (2001)]; [Cheng et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:3337-3341 (2005)] 및 공동-계류 중인 가출운 일련 번호 60/865,574 (2006년 11월 13일 출원)), 바이러스 디스플레이, 예컨대 레트로바이러스 디스플레이 ([Urban et al., Nucleic Acids Res. 33:e35 (2005)]), 단백질-DNA 연결을 기초로 하는 디스플레이 ([Odegrip et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 101:2806-2810 (2004)]; [Reiersen et al., Nucleic Acids Res. 33:e10 (2005)]), 및 마이크로비드 디스플레이 ([Sepp et al., FEBS Lett. 532:455-458 (2002)])가 포함된다.
본 발명의 목적을 위해, 파지 디스플레이 및 포자 디스플레이가 포함되는 임의의 디스플레이 기술을 사용하여 대용물 경쇄-함유 라이브러리가 유리하게 디스플레이될 수 있다.
파지 디스플레이에서, 이종성 단백질, 예컨대 대용물 경쇄 폴리펩티드가 파지 입자의 코트 단백질에 연결되는 한편, 이종 단백질이 발현되는 DNA 서열이 파지 코트 내에 포장된다. 파지 디스플레이 방법의 상세사항을, 예를 들어, 면역화되지 않은 도너로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산하는 것이 기술되어 있는 [McCafferty et al., Nature 348, 552-553 (1990)]에서 확인할 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트형 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 하는 선별로 이러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 또한 선별된다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질을 일부 모방한다.
파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다; 이의 리뷰를 위해서, 예를 들어, [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)]를 참조한다. 중쇄 V-유전자 절편의 다양한 공급원을 파지 디스플레이를 통해 발견할 수 있다. [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 중쇄 및 경쇄의 다양한 어레이가 단리되었다. 본질적으로 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993)]에 기술된 기술에 따라, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대해 특이적인, 면역화되지 않은 인간 도너로부터의 중쇄 및 경쇄 V 유전자의 레퍼토리가 구축 및 회수될 수 있다. 이러한 기술 및 당업계에 공지된 기타 기술을 대용물 경쇄 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 구축물이 포함되는 임의의 폴리펩티드의 디스플레이에 대해 개조할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 전적으로 분자 생물학 기술을 통해 만들어진 합성적으로 생성된 수집물 또는 천연적으로 다른 공급원, 예컨대 림프구로부터의 중쇄들의 수집물이 대용물 경쇄에 보충될 수 있다. 이러한 수집물들은 당업계에 공지된 방법에 의해 클로닝, 발현 및 선별될 수 있다. 선별된 SURROBODY™는 직접적으로 사용될 수 있거나, 다량체성 분자로 발현될 수 있거나, 또는 중쇄 최적화 또는 대용물 경쇄 최적화 (예를 들어, 무작위성 또는 비-무작위성 부위 특이적 또는 영역성 돌연변이유발을 사용함)를 통해 추가적으로 최적화될 수 있다.
포자 디스플레이 시스템은 디스플레이될 서열을 코트 단백질, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 포자 코트 단백질에 부착시키는 것을 기초로 한다. 포자 원형질체 (코어(core))는 세포벽, 피질 및 포자 코트로 둘러싸인다. 종에 따라, 포자외피(exosporium)가 또한 존재할 수 있다. 코어 벽은 식물의 세포벽과 동일한 유형의 펩티도글리칸으로 구성된다. 바실루스 서브틸리스 포자 코트 (CorB) 및 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) (Bt) 포자 디스플레이의 성분을 사용하는 표면 디스플레이 시스템이 포함되는 포자 디스플레이가 [Isticato et al., J. Bacteriol. 183:6294-6301 (2001)]; [Cheng et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:3337-3341 (2005)]에 기술되어 있고, 이에 의해 상기 문헌들의 전체 개시내용은 거명에 의해 명확하게 포함된다. 다양한 포자 디스플레이 기술이 미국 특허 출원 공개 번호 20020150594; 20030165538; 20040180348; 20040171065; 및 20040254364에 또한 개시되어 있고, 이에 의해 이들의 전체 개시내용이 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
포자 디스플레이 시스템의 장점은 비-진핵세포성 성질의 균질한 입자 표면 및 입자 크기이고, 이는 이상적인 비-반응성 배경을 제공할 것으로 예상된다. 또한, 포자의 입자 크기가 상호작용을 기초로 선별가능한 클론 단리를 허용하는 유동 세포측정법에 의한 선별을 가능하게 하기에 충분하다.
포자의 안정성에 영향을 미치면서, 다양한 포자형성후 화학적, 효소적 및/또는 환경적 처리 및 변형을 수행하는 것이 가능하다. 따라서, 구조적인 나선형 구조물이 디스플레이되는 경우, 이같은 구조물을 트리플루오로에탄올 (TFE)로 안정화시키는 것이 가능하다. 또한, 산화 스트레스 처리, 예컨대 반응성 산소 종 (예를 들어, 과산화물) 또는 반응성 질소 종 (예를 들어, 아질산)으로의 처리가 가능하다. 포자-디스플레이 폴리펩티드들의 한정된 또는 미처리(crude) 집단을 효소적 처리, 예컨대 단백질용해성 노출, 기타 효소적 프로세스, 인산화 등에 노출시키는 것이 또한 가능하다. 기타 가능한 처리에는 퍼옥시니트라이트 처리에 의한 니트로실화, 재조합 프로테아제, 정제된 프로테아제 또는 혈청 프로테아제 처리에 의한 단백질용해, 방사선조사, 공지된 샤페론, 예컨대 열 충격 단백질 (박테리아성 및 포유류 양쪽 모두)과의 공동-인큐베이션, 폴딩(folding) 단백질, 예컨대 단백질 디술피드 이소머라제, 프롤릴 이소머라제 등으로의 처리, 동결건조, 및 방부제-유사 처리, 예컨대 티메로솔로의 처리가 비제한적으로 포함된다. 이러한 처리들은 당업계에 주지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
유사한 기술들이 부착이 포자 코트 단백질에 대한 것인 디스플레이 (예를 들어, 에 개시된 포자 디스플레이 시스템이 포함됨)가 포함되는 모든 포자 디스플레이 시스템에서 사용될 수 있다.
대용물 경쇄 서열, 이를 함유하는 구축물 및 라이브러리의 용도
본 발명의 라이브러리는 원하는 성질이 있는 대용물 경쇄 서열 및 대용물 경쇄 구축물, 예컨대 대용물 경쇄 서열을 포함하는 융합체를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서의 라이브러리의 시험관내 또는 생체내 스크리닝으로 높은 결합 특이성 및 친화력으로 원하는 표적에 결합하는 대용물 경쇄 서열을 포함하는 폴리펩티드가 산출될 수 있다. 따라서, 본원에서의 라이브러리를 사용하여, 치료 및 진단 목적을 위한 분자, 예컨대 치료적 시술의 종양 마커 또는 기타 분자 표적에 결합하는 대용물 경쇄 서열을 포함하는 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 또한, 상기 기술된 기술에 의해, 동일한 표적에 결합하는 폴리펩티드들의 수집물을 포함하는 라이브러리, 상이한 표적에 결합하는 폴리펩티드들의 라이브러리, 다중 특이성이 있는 폴리펩티드들의 라이브러리 등을 포함하여, 대용물 경쇄 폴리펩티드들의 고도로 다양한 라이브러리가 조작될 수 있다.
임의의 원하는 표적에 결합하는 능력의 결과로서, 원하는 표적 분자, 예컨대 종양 항원 또는 질환 상태 또는 용태와 관련된 임의의 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위해, 본 발명의 항체 대용물 경쇄 구축물이 분석적 및 진단적 분석법에서 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 암 치료법에서, 암의 발달 및/또는 확산과 관련되는 것으로 결정된 종양 항원을 표적화하기 위해, 본 발명의 대용물 경쇄 구축물이 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 상세사항들이 하기의 비-제한적인 실시예에서 제공된다.
실시예 1
결합 도메인 단백질로서의 VpreB 및 이를 함유하는 융합체
VpreB 결합 도메인을 제조하기 위해, 도 5에 제시된 단일 단백질이 재조합적으로 생성되었다. SLC 결합 도메인 단백질 구축물은 VpreB1로부터의 아미노산 20 내지 121 및 λ5로부터의 아미노산 87 내지 105로 구성되었다. 원한다면, 특이적인 신규 결합 능력을 생성시키기 위해, 구조적 또는 서열 증거에 따라 분자를 재조작하였다. 추가적으로, 또는 별법적으로, 변이체들의 수집물이 무작위로, 예를 들어 에러-경향 PCR에 의해, 또는 직접적으로 아미노산들의 수집물으로의 단일 또는 다중-부위 특이적 돌연변이유발에 의해 생성되었다. 그후, 생성된 클론 또는 수집물을 파지 또는 파지미드 디스플레이에서 사용하기 위해 pIII과 인-프레임으로 클로닝하였다. 이러한 파지미드 구축물을 TG1 세포 내로 형질전환시켰다. 이어서, 단일 콜로니를 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 2％ 글루코스가 보충된 루리아 브로스 (LB: Luria Broth)에서 OD600이 약 0.3에 도달할 때까지 번식시키고, 진탕하지 않으면서 37℃에서 30분 동안 MK307 헬퍼 파지로 감염시켰다. 그후, 세포를 펠렛화시키고, 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 75 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB에 재현탁시키고, 강하게 통기시키면서 30℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 다음날, 파지미드가 발현한 SLC-HC 융합 단백질을 함유하는 상등액을 파지 ELISA에서 사용하여, 표적화된 결합을 결정하였다. 간략하게, ELISA는 ELISA 플레이트를 인간 TNF-α로 코팅 및 차단한 후, SLC-HC 파지를 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하고, PBS-트윈(Tween)-20 (0.05％)으로 세정하고, 항-m13-HRP 항체로 직접적으로 검출하는 것을 수반하였다. 별법적으로, 결합된 파지를 직접적으로 증폭 또는 용출시키고 XL-1 블루(Blue) 세포를 사용하여 파지 역가를 결정함으로써 결합을 평가하였다. 이러한 예는 단일 클론으로서의 SLC 결합 도메인 융합체를 기술하지만, 이러한 SLC는 공통적인 표적을 인식하는 다른 이종성 서열과 재조합적으로 조합될 수 있고, 라이브러리로서 스크 리닝될 수 있다. 또한, 이러한 SLC 결합 단백질이 중쇄들의 앞서 선별된 수집물과 조합될 수 있고, 동일한 관심 표적 또는 이중특이적 분자를 생성시키기 위한 제2의 관심 표적 상에서 직접적으로 스크리닝될 수 있다. 별법적으로, 이러한 강화된 결합 또는 이중특이적 결합이 중쇄들의 선별되지 않은 수집물에 관련하여 스크리닝함으로써 발견될 수 있다. 또한, 이러한 예는 항체 중쇄를 지시하지만, 완전한 중쇄가 필요하지는 않다는 것을 이해하여야 한다. 중쇄 불변 영역의 부재 하의 중쇄 가변 영역 서열, 또는 완전한 중쇄 불변 영역을 포함하는 단일쇄 융합체가 유사한 방식으로 제조될 수 있고, 이러한 예의 범주 내에 속한다.
실시예 2
가변 중쇄 ( VH ) 파트너로서의 VpreB 융합체
도 5의 두번째 도식에 제시된 기능성 VpreB-λ5 융합 단백질 ("VpreB 단백질 융합체 - 이량체성 복합체"로 명시됨)이 재조합적으로 생성되었다. VpreB-λ5 융합 단백질은 m13 유전자 III 신호 서열, VpreB1으로부터의 아미노산 20 내지 115, 및 λ5로부터의 아미노산 83 내지 209로 구성되었다. 이러한 구축물을 파지 또는 파지미드 디스플레이에서 사용하기 위해 pIII과 인-프레임으로 가변 중쇄 CH1 융합체와 공동-발현시켰다. VH 코딩 서열로서, 항-TNF-α 항체인 D2E7로부터의 VH 코딩 서열이 사용되었고, CH1은 인간 IgG1의 CH1 영역이었다. 이러한 파지미드 구축물을 TG1 세포 내로 형질전환시켰다. 이어서, 단일 콜로니를 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 2％ 글루코스가 보충된 루리아 브로스 (LB)에서 OD600이 약 0.3에 도달할 때까지 번식시키고, 진탕하지 않으면서 37℃에서 30분 동안 MK307 헬퍼 파지로 감염시 켰다. 그후, 세포를 펠렛화시키고, 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 75 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB에 재현탁시키고, 강하게 통기시키면서 30℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 다음날, 파지미드가 발현한 SLC-HC 융합 단백질을 함유하는 상등액을 파지 ELISA에서 사용하여, 표적화된 결합을 결정하였다. 간략하게, ELISA는 ELISA 플레이트를 인간 TNF-α로 코팅 및 차단한 후, SLC-HC 파지를 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하고, PBS-트윈-20 (0.05％)으로 세정하고, 항-m13-HRP 항체로 직접적으로 검출하는 것을 수반하였다. 별법적으로, 결합된 파지를 직접적으로 증폭 또는 용출시키고 XL-1 블루 세포를 사용하여 파지 역가를 결정함으로써 결합을 평가할 수 있다. 이러한 예는 단일 클론으로서의 중쇄 가변-CH1 융합체와 파트너를 이룬 SLC 융합체를 기술하지만, 이러한 SLC는 공통적인 표적을 인식하는 중쇄 가변 영역들의 집중된 수집물과 또한 조합될 수 있고, 라이브러리로서 스크리닝될 수 있다. 또한, 이러한 SLC 융합체가 중쇄들의 선별되지 않은 수집물과 조합될 수 있고, 관심 표적 상에서 직접적으로 스크리닝될 수 있다. 합리적인 SLC 융합체 대안물로서, λ5 단백질 단편 대신 전통적인 항체 경쇄로부터의 불변 람다 영역을 융합시킴으로써 VH 회합이 강화될 수 있다.
실시예 3
회합된 가변 중쇄 (VH) 파트너로서의 VpreB 및 람다5
도 5의 세번째 도식에 제시된 VpreB-λ5 공동-발현 단백질 ("VpreB 및 람다 5 - 삼량체성 복합체"로 명시됨)이 m13 유전자 III 신호 서열 및 예상되는 성숙형의 프로세싱된 preB1 (아미노산 20 내지 146) 및 람다 5 (아미노산 31 내지 209)의 상응하는 아미노산으로 제조되었다. 이들을 파지 또는 파지미드 디스플레이에서 사용하기 위해 pIII과 인-프레임으로 가변 중쇄-CH1 융합체와 공동-발현시켰다. VH 코딩 서열로서, 항-TNF-α 항체인 D2E7로부터의 VH 코딩 서열이 사용되었고, CH1은 인간 IgG1의 CH1 영역이었다. 이러한 파지미드 구축물을 TG1 세포 내로 형질전환시켰다. 이어서, 단일 콜로니를 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 2％ 글루코스가 보충된 루리아 브로스 (LB)에서 OD600이 약 0.3에 도달할 때까지 번식시키고, 진탕하지 않으면서 37℃에서 30분 동안 MK307 헬퍼 파지로 감염시켰다. 그후, 세포를 펠렛화시키고, 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 75 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB에 재현탁시키고, 강하게 통기시키면서 30℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 다음날, 파지미드가 발현한 SLC HC 삼량체성 단백질 복합체를 함유하는 상등액을 파지 ELISA에서 사용하여, 표적화된 결합을 결정하였다. 간략하게, ELISA는 ELISA 플레이트를 인간 TNF-α로 코팅 및 차단한 후, SLC-HC 파지를 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하고, PBS-트윈-20 (0.05％)으로 세정하고, 항-m13-HRP 항체로 직접적으로 검출하는 것을 수반하였다. 별법적으로, 결합된 파지를 직접적으로 증폭 또는 용출시키고 XL-1 블루 세포를 사용하여 파지 역가를 결정함으로써 결합을 평가할 수 있다. 이러한 예는 단일 클론으로서의 중쇄 가변-CH11 융합체와 파트너를 이룬 SLC를 기술하지만, 이러한 SLC는 공통적인 표적을 인식하는 중쇄 가변 영역들의 집중된 수집물과 또한 조합될 수 있고, 라이브러리로서 스크리닝될 수 있다. 또한, 이러한 SLC 융합체가 중쇄들의 선별되지 않은 수집물과 조합될 수 있고, 관심 표적 상에서 직접적으로 스크리닝될 수 있다.
실시예 4
VpreB1 CDR3 유사 영역 내로의 다양성의 조작
대용물 경쇄 (SLC)의 CDR 유사 영역은 항체 경쇄의 CDR과 기능이 유사할 것이기 때문에, VpreB와 λ5 사이의 융합점을 결정하는 것이 중요하다. 한 접근법에 따라, 모든 VpreB 아미노산을 함유하는 CDR 유사 부위로 시작하여 클로닝가능한 올리고뉴클레오티드 내에 코딩된 λ5로부터 한 위치씩 아미노산을 증분식으로 치환시켜 특정 목적에 대한 가장 적절한 융합점이 결정되었다. 이러한 증분식 치환을 CDR 유사 부위가 완전히 λ5 공급원 서열로 구성될 때까지 계속하였다. 이러한 프로세스 동안의 일부 지점에서, 상보적인 중쇄를 부가하고 이의 항원 결합 및 인식을 허용/촉진하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 상보성을 추가로 강화하거나 이를 가능하게 하기 위해, 임의의 CDR 유사 부위에서 무작위 다양성을 사용할 수 있을 뿐만 아니라 매칭된 CDR 길이 분석을 기초로 하는 다양성을 사용할 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 항체 Vλ5 서열을 사용하여 다양성을 부가할 수 있는데, 이의 CDR 길이가 VpreB CDR 유사 부위 길이와 잘 매칭되기 때문이다.
실시예 5
SLC 성분에의 기능성 부가
SLC는 2개의 독립적인 폴리펩티드로 구성되기 때문에, 이는 제2의 기능성을 부가시키거나 내재시킬 자연스러운 기회를 야기한다. 본 실시예에서, 첫번째 예에서, 항-VEGF scFv가 삽입되어 VpreB 및 λ5를 연결하는 융합 단백질이 생성되었다 (도 9A). 생성된 이러한 조작된 SLC-구속(constrained) scFv는 항-TNF-α 항체의 중쇄와 쌍을 이루었다. 생성된 구축물을 파지 또는 파지미드 디스플레이에서 사용하기 위해 pIII과 인-프레임으로 클로닝된 중쇄와 공동-발현시켰다. 이러한 파지미드 구축물을 TG1 세포 내로 형질전환시키고, 단일 콜로니를 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 2％ 글루코스가 보충된 루리아 브로스 (LB)에서 OD600이 약 0.3에 도달할 때까지 번식시키고, 진탕하지 않으면서 37℃에서 30분 동안 MK307 헬퍼 파지로 감염시켰다. 그후, 세포를 펠렛화시키고, 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 75 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB에 재현탁시키고, 강하게 통기시키면서 30℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 다음날, 파지미드가 발현한 SLC-HC 융합 단백질을 함유하는 상등액을 파지 ELISA에서 사용하여, 표적화된 결합을 결정하였다. 간략하게, ELISA는 ELISA 플레이트를 인간 TNF-α 또는 인간 VEGF로 코팅 및 차단한 후, SLC-HC 파지를 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하고, PBS-트윈-20 (0.05％)으로 세정하고, 항-m13-HRP 항체로 직접적으로 검출하는 것을 수반하였다.
이어서, 항-VEGF scFv를 VpreB의 C-말단에 융합시키고, 생성된 3부식(tripartite) 단백질 복합체 구축물을 상기 기술된 파지미드 ELISA와 유사하게 평가하였다.
별법적으로, 항-오브알부민 scFv를 λ5의 아미노 말단에 융합시키고, 3부식 단백질 복합체를 TNF-α 및 오브알부민 양쪽 모두에의 결합에 대해 테스트하였다.
마지막으로, 이러한 2개의 융합 구축물 (VpreB-항VEGF scFv 및 λ5-항-오브알부민)을 항-TNF-α 항체의 중쇄와 조합시켜 삼중특이적 분자를 생성시킨 후, 이를 상기 기술된 바와 같이 파지미드 ELISA에서 확인하였다.
설명에서, 전혀 다른 표적에 대한 scFv가 혼입되었지만, 동일한 표적에 대한 기능성 결합제들을 조합하여, 연계성 "수퍼-결합제"를 생성시킬 수 있다. 이러한 연계성 결합제는 강화된 결합을 제공할 수 있거나, 심지어 일부 경우에는 가교 작용을 제공할 수 있다. 전체 항체가 바람직하지 않고 장기적인 가교를 제공하는 경우에 Fab 가교가 이로울 것이다. 예를 들어, 인슐린 대리물로 작용하는 전체 면역글로불린 인슐린 수용체 항체가 혈청 소거에 3-4주를 필요로 하는 것이 바람직하지 않을 수 있다. 인슐린은 일반적으로 반감기가 수분이기 때문에, Fab가 이러한 규모의 반감기와 더욱 조화로울 것이고, 연계 기능성이 이러한 용도를 적절하게 다룰 것이다.
상기의 설명은 제2의 기능성 기로서 항체만을 기술하고 있지만, 부가 및 구속된 구축물에 관련된 펩티드 (예를 들어, 에리트로포이에틴 (EPO) 모방체), 수용체 (예를 들어, TNF-R1), 결합 단백질 (예를 들어, IL-1ra), 및 임의의 치료적 단백질, 예컨대 인터페론을 또한 유사하게 혼입시켜 유사한 기능의 분자들을 생성시킬 수 있다.
또한, 중쇄 및 경쇄와 같이 이종이량체성 단백질을 혼입시키기 위한 2개의 부위를 사용하여, 제2의 Fab-유사 분자를 생성시킬 수 있다.
마지막으로, 본 발명가들은 단일한 예만을 기술하였지만, SLC 후보 항체로 이의 지시되고 원하는 표적에 대해 스크리닝하기 위해, 조합형으로 다양한 파지 항체 라이브러리 및 펩티드 다양성 라이브러리의 혼입이 본원에 또한 포함된다.
실시예 6
포유류 세포에서의 대용물 경쇄 구축물 (SURROBODY™)의 발현
"삼량체" ("SURROBODY™ 변이체"로 또한 지칭됨)로 도 11에 명시된 구조물의 대용물 경쇄 성분의 코딩 서열을 전장 IgG1 항체 중쇄와 함께 CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61) 내로 공동-형질감염시켜, 생화학적 분석을 위해 대용물 경쇄 구축물을 생산하였다. 구체적으로, 전장 인간 VpreB1 및 λ5를 포유류 발현 벡터 pCI (Promega, Madison WI) 내로 클로닝하였다. 이러한 구축물들은 이들의 예상되는 천연 분비 신호를 함유하였다. VpreB1의 경우, 예상되는 신호 펩티드는 서열 1의 아미노산 1-20이고, λ5에 대해서는 예상되는 신호 서열은 서열 5의 아미노산 1-30이었다. 이러한 단백질들 양쪽 모두에 대해, 이들의 예상되는 비-구조적 꼬리의 일부분을 결실시켰다. VpreB1에 대해, 이는 서열 1의 C-말단 아미노산 122-146을 포함하였고, 람다 5에 대해서는 이는 서열 5의 N-말단 아미노산 30-86을 포함하였다.
도 11에서 "람다 5 dT"로 명시된 "삼량체" 내의 말단절단된 λ5 서열의 서열이 서열 7로 제시된다. 도 11에서 "VpreB dT"로 명시된 "삼량체" 내의 말단절단된 VpreB1 서열의 서열이 서열 8로 제시된다.
가능성이 있는 4개의 조합형 대용물 경쇄 각각을 C-말단 헥사히스티딘 (His6) 태그 (서열 34로서 개시된 His6 태그)를 함유하는 공지된 인간 항-인플루엔자 중쇄 (서열 9)와 함께 공동-형질감염시키고, 제조업자의 권고사항 (Invitrogen, Carlsbad CA)에 따라 저혈청 배지에서 발현시켰다. 3일 후, 상등액을 수집하고, 여과하고, 니켈 킬레이트 크로마토그래피 (Qiagen, Germany)에 의해 정제하였다. 그후, 정제된 단백질을 항-펩티드 토끼 혈청 (VpreB 및 λ5) 또는 항-히스티딘 항체 (Serotec. Raleigh NC)로 웨스턴 블롯 분석에 의해 검사하였다. 항-토끼 HRP (VpreB 및 λ5) 또는 항-마우스 HRP (중쇄) 및 TMB 기질로의 비색 발색 후에 단백질의 검출이 시각화되었다 (도 12, 레인 1-4).
추가적으로, VpreB1 유전자, 및 λ5 유전자 또는 경쇄 불변 람다 도메인 중 하나로 구성된 키메라 단백질을 조작함으로써 대용물 경쇄 융합체들 (도 11 참조)이 생성되었다. 구체적으로, VpreB (서열 1)로부터의 아미노산 1-87 내지 λ5 단백질 (서열 5)의 아미노산 121-209을 함유한 재조합적으로 융합된 단백질이 생산되었다 (서열 10). 추가적으로, VpreB (서열 1)로부터의 아미노산 1-87 내지 항체 λ 경쇄 불변 영역의 C-말단의 아미노산 121개를 함유한 제2의 융합체가 제조되었다 (서열 11). 본질적으로 상기 기술된 바와 같이, 각각의 대용물 경쇄 융합체를 일시적으로 발현시키고, 수확하고, 정제하여, 웨스턴 불롯 분석에 의해 시험하였다. 현저하게, 양쪽 중합체 모두 항-VpreB1 항-펩티드 혈청에 대한 에피토프를 함유하였기 때문에, 이러한 에피토프가 웨스턴 블롯 분석에 대해 사용되었다. (도 12, 레인 5-6)
실시예 7
대장균에서의 대용물 경쇄 구축물 (SURROBODY™)의 발현
재조합 단백질이 박테리아에서 종종 이롭게 발현되기 때문에, 원핵생물 시스템에서 가용성 대용물 경쇄 구축물을 생산하는 능력을 테스트하였다. 이를 다루기 위해, 도 11에서 "이량체"로 명시된 대용물 경쇄 융합체를 대장균 발현/분비 시스 템 내로 클로닝하였다. 원핵생물 리더 서열에의 재조합 융합에 의해 성숙형 포유류 단백질이 발현되어 원형질막 주위공간 내로 분비되는 pLac 억제성 발현 시스템을 사용하였다. 구체적으로, 성숙형 단백질의 코딩 서열을 m13 gIII 리더 코딩 서열의 C-말단에 융합시킴으로써 대용물 경쇄 융합체가 원형질막 주위공간으로 지시되었다 (서열 12 및 13). 항-인플루엔자 항체의 IgG1 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 도메인을 pelB 리더 서열의 C-말단에 융합시킴으로써 중쇄가 발현되었다 (서열 14). 양쪽 단백질을 발현하는 플라스미드들을 HB2151 대장균 세포 (Stratagene) 내로 형질전환시키고, 100 ㎍/㎖ 앰피실린 및 200 마이크로몰의 IPTG를 함유하는 LB 배지에서 30℃에서 하룻밤 동안 발현시켰다. 당업계에 공지된 방법에 따라 세포를 수확하고 원형질막 주위공간 용해물을 제조하였다. 원형질막 주위공간 용해물을 직접적으로 웨스턴 블롯 분석에 의해 테스트하거나, 또는 상기 기술된 바와 같이 정제하였다 (도 13. 패널 A).
대용물 경쇄는 전통적으로 막 결합형 preB-세포 수용체의 성분이기 때문에, 이는 정상적으로는 IgM 클래스 중쇄와 쌍을 이루어 발견된다. 본 발명가들의 실용적인 목적을 위해, 대용물 경쇄 융합체가 IgM 대 IgG 기반 불변 중쇄 도메인 1 영역과 쌍을 이루는 능력을 비교하기를 원했다. 이를 시험하기 위해, 본 발명가들은 μ 불변 중쇄 도메인 1 (서열 15)로 상기 기술된 항-인플루엔자 항체의 감마 불변 중쇄 도메인 영역을 치환하였다. 원형질막 주위공간 용해물의 웨스턴 블롯 분석으로부터, 본 발명가들은 μ-기반 불변 중쇄 도메인을 기초로 하는 시스템보다 IgG (γ)-기반 불변 중쇄 도메인이 더 잘 발현되고 더 큰 수준으로 정제되었음을 발견 하였다 (도 13, 패널 B).
실시예 8
m13 파지미드에서의 대용물 경쇄 구축물 (SURROBODY™)의 발현
재조합 단백질이 박테리아에서만 유용하게 발현될 뿐만 아니라, 박테리아 바이러스 입자의 표면 상에서 다양한 라이브러리 수집물에서 및 개별적으로 또한 발현되기 때문에, 본 발명가들은 m13 파지미드의 표면 상에서 가용성 대용물 경쇄 구축물을 생산하기를 원했다. 이를 다루기 위해, 대용물 경쇄 융합체 (도 11의 "이량체")를 대장균 발현/분비 시스템 내로 클로닝하였다. 모든 시스템에 대해, 상기 기술된 pLac 억제성 발현 시스템을 사용하였다. 그러나, 본 경우에는, E-태그 에피토프 (GAPVPYPDPLEPR) (서열 16)를 대용물 경쇄 융합체, 뿐만 아니라 경쇄 대조군 단백질에 부가하였다. 유전자III VpreB1-람다5-E 태그 융합체 (융합체 1) 및 유전자III VpreB1-CI-E 태그 융합체 (융합체 2)의 서열이 각각 서열 12 및 13에 제시된다. 중쇄 구축물을 m13 파지미드에 앵커링(anchoring)시키기 위해, 중쇄 구축물을 가변 중쇄 및 감마 불변 중쇄 도메인 1 영역을 m13 유전자 III 생성물과 인-프레임으로 재조합적으로 클로닝하였다. 구체적으로, 재조합 단백질은 개재물, 헥사히스티딘 펩티드 (서열 34), 항-c-myc 항체에 대한 펩티드 에피토프 (GEQKLISLEEDL) (서열 17), 및 앰버(amber) 정지 코돈을 함유하였다. 본 발명가들은 각각 항- 히스티딘 및 항-E 포획 ELISA에 의해 단백질 발현 및 복합체 형성의 충실도를 시험하였다.
항체 및 서로바디(surrobody)의 파지미드 발현을 당업계에 주지된 표준 방법에 의해 달성하였다. 본질적으로, 발현 플라스미드로 형질전환된 TG-1 세포를 100 ㎍/㎖ 앰피실린 및 2％ 글루코스 억제가 보충된 2-YT 배지에서 미드-로그(mid-log) (OD600 약 0.3)로 성장시킨 후, m13K07 헬퍼 파지로 감염시키고, 100 ㎍ 앰피실린, 70 ㎍/㎖ 카나마이신 및 200 마이크로몰의 IPTG가 보충된 2-YT 배지에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 파지를 함유하는 상등액, 또는 침전되고 PBS에 재현탁된 파지를 파지 포획 ELISA에 사용하였다. 미량역가 플레이트를 항-히스티딘 (Serotec) 또는 항-E 항체 (Abcam)으로 코팅한 후, 항-m13 과산화효소 항체 (Pharmacia)와의 결합을 검출하고, TMB 기질로 비색 시각화함으로써 파지 포획 ELISA를 달성하였다. 이러한 예에서, 본 발명가들은 양쪽 방법 모두에 의한 파지의 특이적 포착을 발견하였고, 이는 중쇄 및 안정적인 대용물 경쇄 회합에 의한 파지에 대한 높은 충실도의 단백질 발현 융합을 지지한다. 결과가 도 14에 제시된다.
실시예 9
포유류 세포에서 발현된 대용물 경쇄 구축물의 항원 결합
대용물 경쇄 변이체가 니켈 킬레이트 크로마토그래피 후 쉽게 검출가능한 복합체를 형성한 것으로 여겨졌기 때문에, 동족 중쇄 파트너의 어버이 항원에 결합하는 능력을 테스트하였다. 일시적인 발현 및 정제를 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 항원 결합을 ELISA에 의해 테스트하였다. 간략하게, 미량역가 플레이트를 불활성화된 H5N1 베트남 12-3/04 바이러스 제제 (USFDA - CBER, 항원 표준물)로 코팅하고, 차단한 후, 정량된, 단계 희석된 정제된 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 세정 후, 복합체를 항-인간 Fc 과산화효소 접합 항체로 검출하였다. 마지막으로, 결합을 비색적으로 시각화하고, TMB 기질 발색으로 정량하였다 (도 15 참조).
추가적으로, 일시적인 형질감염으로부터의 상등액을 유사하게 테스트하였고, 항원 결합에 대해 희석하지 않았으며, 이를 도 16에 나타낸다. 세정 후, 대용물 경쇄 복합체를 항-VpreB1 항-펩티드 혈청 및 항-토끼 과산화효소 접합 2차 또는 항-인간 Fc 과산화효소 접합 항체로 검출하고, 비색적으로 시각화하고, TMB 기질 발색으로 정량하였다.
실시예 10
대장균에서 발현된 대용물 경쇄 구축물의 항원 결합
대용물 경쇄 융합체가 안정적인 복합체를 형성하는 것으로 여겨졌기 때문에, 본 발명가들은 이같은 융합체가 항-인플루엔자 항체로부터의 중쇄와 쌍을 이뤘는지 여부 및 항체의 동족 바이러스에 결합할지 여부를 확립하기를 원했다. 결합을 평가하기 위해, 원형질막 주위공간 용해물을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. 그후, 폴리클로날 친화력 정제 항체를 통해 대용물 경쇄 융합체의 C-말단의 부가된 E-태그에 대한 또는 중쇄의 C-말단의 부가된 헥사히스티딘 (서열 34) 에피토프에 대한 모노클로날 항체로 결합을 검출하는 것을 제외하고는 본질적으로 상기 기술된 바와 같은 ELISA 항원 결합에 용해물을 적용하였다. 에피토프를 항-마우스 또는 항-토끼 과산화효소 접합 항체로 검출하였다. 마지막으로, 결합을 비색적으로 시각화하고, TMB 기질 발색으로 정량하였다. 결과가 도 17에 제시된다.
실시예 11
파지에 디스플레이된 대용물 경쇄 구축물의 항원 결합
이종성 시스템에서 대용물 경쇄 변이체를 제조하는 것이 가능하였고, 파지에 디스플레이된 수집물들이 추후의 단백질 발견 및 조작에 바람직하기 때문에, 본 발명가들은 대용물 경쇄 변이체 및/또는 융합체가 유전자 III-회합 복합체로서 m13 파지의 표면 상에 쉽게 디스플레이되었는지 여부를 결정하기를 원했다. 변이체 (서열 18-22) 및 종전에 기술된 융합체 (서열 12 및 13)를 상기 기술된 2개의 항-인플루엔자 항체 중쇄 (서열 19 및 14) 중 하나와 공동-발현시켰고, 결합은 상기에 또한 기술된 조건을 본질적으로 따랐다. 간략하게, 미량역가 웰을 H5N1 베트남 1203/04 바이러스로 코팅하고, 파지미드를 결합시킨 후, 세정하고, 항-m13 과산화효소 접합 항체를 통해 직접적으로 검출하였다. TMB로의 비색 기질 생성물 형성 후에 결합을 정량적으로 결정하였다. 결과가 도 18 및 19에 제시된다.
실시예 12
파지 대용물 경쇄 구축물 라이브러리 구축, 선별, 및 클론 ELISA
조합형 항체 라이브러리를 사용하는 반복적 접근법을 사용하여, 항원에 결합한 대용물 경쇄 구축물을 생성시키고 테스트하였다. 간략하게, H5N1 조류 인플루엔자 생존자의 골수로부터 제조된 조합형 항체 라이브러리를 생성시켰다. 이러한 라이브러리를 2회의 라운드의 선별로 H5N1 바이러스 헤마글루티닌 단백질에 대해 스크리닝하였다. 이어서, 파지미드 플라스미드를 증폭시키고 정제하였다. 중쇄 가변 영역을 제한 소화에 의해 이러한 플라스미드 제제로부터 단리하고, 불변 중쇄 도메인 1과 인-프레임으로 클로닝하여, 파지미드 디스플레이를 위한 m13 유전자 III 코트 단백질에의 재조합 융합체를 형성시켰다. 중요하게, 본 발명가들은 VpreB1 및 람다 5로 구성된 대용물 경쇄 융합체 (SLC 융합체 1) (서열 10) 또는 VpreB1 및 고전적인 람다 경쇄로부터의 불변 람다 도메인으로 구성된 융합체 (서열 11) (SLC 융합체 2)를 공동-발현하는 2개의 수용자 플라스미드를 사용하였다. 융합체 1 라이브러리에서는 3.84×107 개의 독립적인 형질전환체가 생산된 한편, 융합체 2 라이브러리에서는 7.8×107 개의 형질전환체가 생산되었다. 양쪽 라이브러리를 2회의 라운드를 통해 독립적으로 스크리닝하였고, 양쪽 모두 배경에 비해 현저한 강화를 나타냈으며 (융합체 1 = 5×, 융합체 2 = 20×), 이는 제2 라운드의 패닝에서 증가되었다 (융합체 1 = 97×, 융합체 2 = 48×).
클론 항원에 대해 ELISA에 의해 테스트하기 위해, 양쪽 라운드 및 양쪽 라이브러리로부터의 결합 파지를 HB2151 대장균 균주 내로 전달하여, 가용성 서로바디 융합 단백질을 생산하였다. 간략하게, HB2151 클론을 성장시키고, 가용성 서로바디를 생산하도록 유도하였다. 구체적으로, 콜로니들을 100 ㎍/㎖ 앰피실린 및 200 마이크로몰의 IPTG가 보충된 2-YT 배지에서 하룻밤 동안 30℃에서 배양하고, 상기 기술된 바와 같이 원형질막 주위공간 용해물을 제조하였다. 생성된 원형질막 주위공간 용해물을 본질적으로 상기에 개요된 바와 같이 ELISA에 의해 테스트하였다.
라운드 1 및 2의 패닝에서의 형질전환체의 개수 및 2개의 융합체에 대한 양성 클론의 백분율이 도 20에서 제시되고, 융합체 1 및 융합체 2 라이브러리 클론의 라운드 1 및 2에 대한 클론 분석 데이터가 도 21 및 22에서 제시된다.
실시예 13
혈청 반감기를 증가시키기 위한 대용물 경쇄 융합체
생체내에서의 항체 단편의 반감기는 단편이 안정적인 항원 결합 단편을 형성하는데 필요한 도메인만이 아니라 모든 중쇄 불변 도메인을 포함하는 무손상 및 완전한 중쇄에 대한 융합체의 일부인 경우에 상당히 연장된다. IgG의 경우, 이는 도메인 도메인 CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 것을 의미한다. 특히, CH2 및 CH3가 생체내에서 이러한 효과의 대부분을 부여하는 것으로 잘 확립되어 있다. 실제로, 이러한 CH2 및 CH3 도메인을 이종성 단백질에 융합시키는 것이 어버이 분자와 비교하여 이러한 키메라성 분자의 효능 및 PK/PD를 개선시키는데 전형적으로 충분하다. VpreB 및 λ5 중 하나 또는 양쪽 모두에 대한 유사하게 기능적인 융합체가 중쇄의 불변 도메인과의 이러한 회합에 의해 이득을 얻는다.
제II형 당뇨병의 치료를 위해, 글루카곤-유사 펩티드 1 (또는 GLP-1)의 투여는 췌장에서 글루코스-의존적 인슐린 분비를 유도함으로써 환자들에서 글루코스 조절을 개선시키는 것에 의해 개체들을 이롭게 한다. 그러나, 수명이 긴 GLP-1 펩티드가 바람직한 목표이다. 대용물 경쇄의 꼬리가 독특하고 접근하기 쉽기 때문에, 본 발명가들은 활성 GLP-1 모이어티를 VpreB1 꼬리의 C-말단 (서열 23 및 24) 또는 λ5의 N-말단 꼬리 (서열 25 및 26)에 재조합적으로 융합시킴으로써 이러한 목표를 달성할 수 있었다. λ5 융합체의 경우, 도 11에 묘사된 바와 같이, 본 발명가들은 VpreB1의 존재 또는 부재 하에, 그리고 심지어 가변 중쇄 도메인의 존재 또는 부재 하에 이를 발현시킬 수 있었다. VpreB1에의 융합체를 λ5의 존재 또는 부재 하에, 그리고 가능하게는 중쇄의 CH1 도메인과 함께 또는 중쇄의 CH1 도메인 없이 유사하게 제조할 수 있었다. 유사하게, 다른 이로운 성장 인자, 사이토카인, 수용체, 및 효소 융합체를 생성시킬 수 있었다. 모든 이러한 경우에, 결합은 대용물 경쇄 또는 SURROBODY™ 성분의 필수품이 아니지만, 이종성 대용물 경쇄 융합 요소에 의해 전체적으로 또는 대부분이 부여될 수 있다.
상기의 기술에서, 본 발명의 특정 실시양태들을 참조로 예증되었지만, 본 발명은 이렇게 한정되지 않는다. 실제로, 본원에서 제시되고 기술된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기의 기술로부터 당업자에게 명백할 것이고, 첨부된 청구항의 범주 내에 속한다.
실시예 14
헤마글루티닌-결합 대용물 경쇄 구축물의 친화력 결정
융합체 대용물 경쇄 구축물 (SURROBODIES™, 도 11 참조)의 친화력을 결정하기 위해, 본 발명가들은 다양한 서로바디를 대장균에서 과발현시켜 정제하고, 중쇄가 최초로 확인된 어버이 Fab들과 이들을 비교하였다. 본질적으로 하기와 같이 BioForte Octet 상에서 Bio-Layer 간섭측정법에 의해 친화력을 결정하였다. 먼저, 100 ㎍의 정제된 헤마글루티닌 단백질을 20:1 몰과량으로 제조업자의 설명서에 따라 Pierce No-Weigh PEO4 비오틴 (카탈로그# 21329)을 사용하여 비오틴화시키고, 간헐적으로 혼합시키면서 실온에서 1-3시간 동안 인큐베이션한 후, 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 과량의 비오틴을 크기 배제 스핀 컬럼에 의해 제거하고, PBS 내로 교환하였다. 이어서, HA 결합 대용물 경쇄 구축물 및 Fab를 Ni2+ 친화력 크로마토그래피를 사용하여 FPLC에 의해 정제하고, 탈염시켜 과량의 이미다졸 을 제거하고, 농축하고, 정량적 경쇄 ELISA (Bethel Labs, 카탈로그# E80-115-κ, 및 E80-116-λ)를 제조업자의 지침에 따라 수행하여 정량하였다. 마지막으로, 광범위한 샘플 농도 (전형적으로, 단계적 2배 희석된 15 nM-500 nM임)를 분석함으로써 친화력을 결정하였다. 샘플을 HA 단백질로 코팅된 바이오센서와 함께 15분까지 인큐베이션한 후, 샘플 희석제에서 1시간까지 인큐베이션하였다. 모든 이러한 단계들을 1500 RPM으로 샘플 플레이트를 회전시키면서 수행하였다. HA-코팅 바이오센서와의 Fab 인큐베이션 동안 회합이 측정되었고, 결합 후의 샘플 희석제 인큐베이션에서 해리가 측정되었다. 친화력이 하기 표에서 제시된다.
Figure 112009065330235-pct00001
명세서 전반에 걸쳐 언급된 모든 참조 문헌 및 이에 언급된 참조문헌은 이에 의해 전체적으로 거명에 의해 명확하게 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SEA LANE BIOTECHNOLOGIES, LLC <120> CONSTRUCTS AND LIBRARIES COMPRISING ANTIBODY SURROGATE LIGHT CHAIN SEQUENCES <130> SLN-0009 PCT <140> PCT/US2008/058283 <141> 2008-04-17 <150> 60/920,568 <151> 2007-03-27 <160> 35 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Trp Ala Pro Val Leu Leu Met Leu Phe Val Tyr Cys Thr Gly 1 5 10 15 Cys Gly Pro Gln Pro Val Leu His Gln Pro Pro Ala Met Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Gly Thr Thr Ile Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Asn Asp His Asp 35 40 45 Ile Gly Val Tyr Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Pro 50 55 60 Pro Arg Phe Leu Leu Arg Tyr Phe Ser Gln Ser Asp Lys Ser Gln Gly 65 70 75 80 Pro Gln Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ala Arg Asn 85 90 95 Arg Gly Tyr Leu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Met Gly Ala Arg Ser Ser Glu Lys Glu Glu Arg Glu 115 120 125 Arg Glu Trp Glu Glu Glu Met Glu Pro Thr Ala Ala Arg Thr Arg Val 130 135 140 Pro 145 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120 125 Arg Glu Trp Glu Glu Glu Met Glu Pro Thr Ala Ala Arg Thr Arg Val 130 135 140 Pro His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 145 150 155 160 Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 165 170 175 <210> 24 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic construct" <400> 24 Met Ser Trp Ala Pro Val Leu Leu Met Leu Phe Val Tyr Cys Thr Gly 1 5 10 15 Cys Gly Pro Gln Pro Val Leu His Gln Pro Pro Ala Met Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Gly Thr Thr Ile Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Asn Asp His Asp 35 40 45 Ile Gly Val Tyr Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Pro 50 55 60 Pro Arg Phe Leu Leu Arg Tyr Phe Ser Gln Ser Asp Lys Ser Gln Gly 65 70 75 80 Pro Gln Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ala Arg Asn 85 90 95 Arg Gly Tyr Leu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Met Gly Ala His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 115 120 125 Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp 130 135 140 Leu Val Lys Gly Arg 145 <210> 25 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic construct" <400> 25 Met Arg Pro Gly Thr Gly Gln Gly Gly Leu Glu Ala Pro Gly Glu Pro 1 5 10 15 Gly Pro Asn Leu Arg Gln Arg Trp Pro Leu Leu Leu Leu His Ala Glu 20 25 30 Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala 35 40 45 Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Leu Ala Val Val 50 55 60 Thr His Gly Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala Ser Gln Ser Arg Ala Leu 65 70 75 80 Gly Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Arg Ser Arg 85 90 95 Trp Gly Arg Phe Leu Leu Gln Arg Gly Ser Trp Thr Gly Pro Arg Cys 100 105 110 Trp Pro Arg Gly Phe Gln Ser Lys His Asn Ser Val Thr His Val Phe 115 120 125 Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ala Thr Pro 130 135 140 Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys 145 150 155 160 Ala Thr Leu Val Cys Leu Met Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ile Leu Thr 165 170 175 Val Thr Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro Ile Thr Gln Gly Val Glu Met 180 185 190 Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr 195 200 205 Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Arg Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Cys 210 215 220 Gln Val Met His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala 225 230 235 240 Glu Cys Ser <210> 26 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic construct" <400> 26 Met Arg Pro Gly Thr Gly Gln Gly Gly Leu Glu Ala Pro Gly Glu Pro 1 5 10 15 Gly Pro Asn Leu Arg Gln Arg Trp Pro Leu Leu Leu Leu Gly His Ala 20 25 30 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala 35 40 45 Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Leu Ala Val Val 50 55 60 Thr His Gly Ser Val Thr His Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu Ser Gln Pro Lys Ala Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro 85 90 95 Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Met 100 105 110 Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ile Leu Thr Val Thr Trp Lys Ala Asp Gly 115 120 125 Thr Pro Ile Thr Gln Gly Val Glu Met Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser 130 135 140 Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln 145 150 155 160 Trp Arg Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Met His Glu Gly Ser 165 170 175 Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 180 185 <210> 27 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly 20 25 30 Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly 65 70 75 80 Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser 85 90 95 Ser Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly 100 105 <210> 28 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser 1 5 10 15 Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala 20 25 30 Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val 35 40 45 Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr 50 55 60 Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 65 70 75 80 Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln 85 90 95 Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu 100 105 110 Cys Ser <210> 29 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser His Ser Ala Ser Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Thr Cys Met Leu Ser Ser Gly Phe Ser Val Gly Asp 20 25 30 Phe Trp Ile Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Pro Pro Arg Tyr 35 40 45 Leu Leu Tyr Tyr His Ser Asp Ser Asn Lys Gly Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Asn Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80 Leu Arg Ile Ser Gly Leu 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Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Thr Gly Ile 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Ile Trp Pro Ser Asn Ala Ser 100 <210> 32 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr 20 25 30 Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala 35 40 45 Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val 85 90 95 Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys 100 105 110 Ser <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 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Claims (88)

  1. (1) 이종성 아미노산 서열에 직접 융합된 VpreB 서열을 포함하고, 여기서 이종성 아미노산 서열은 λ5 서열 또는 항체 경쇄 가변 영역 서열인 폴리펩티드, 및
    (2) 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄 서열
    을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 상기 중쇄 서열에 접합되어 있으며, 상기 VpreB 서열은 서열 1의 VpreB1, 서열 2 및 3의 VpreB2, 서열 4의 VpreB3, 및 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인,
    표적에 특이적으로 결합할 수 있는 구축물.
  2. 제1항에 있어서, 이종성 아미노산 서열이 λ5 서열인 구축물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 λ5 서열이 서열 5의 λ5의 서열, 서열 6의 λ5-유사 폴리펩티드, 또는 그의 단편인 구축물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합이 각각 상기 VpreB 서열의 CDR3 유사 영역 및 λ5의 CDR3 유사 영역의 양측에서의 10개 아미노산 잔기에서 또는 10개 아미노산 잔기 내에서 일어나는 것인 구축물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 경쇄 가변 영역 서열 또는 그의 CDR3 영역이 항체 경쇄 CDR3 영역에 유사한 부위에서 상기 VpreB 서열에 융합되는 것인 구축물.
  8. 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체 경쇄가 λ 쇄 또는 κ 쇄인 구축물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 항체 경쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함하는 것인 구축물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 불변 영역 서열이 항체 경쇄의 전체 불변 영역인 구축물.
  11. 제1항, 제2항, 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가, VpreB 서열의 C-말단에서의 비-Ig-유사 독특한 꼬리가 부분적으로 또는 완전히 제거된 VpreB 서열 또는 그의 단편과 융합된 이종성 아미노산 서열의 융합을 포함하며, 여기서 이종성 아미노산 서열은 (i) λ5 서열의 N 말단에서의 독특한 꼬리가 부분적으로 또는 완전히 제거된 λ5 서열 또는 그의 단편이거나 또는 (ii) 항체 경쇄 가변 영역 서열인, 구축물.
  12. 제11항에 있어서, VpreB1로부터의 아미노산 20 내지 121 및 λ5로부터의 아미노산 87 내지 105의 융합체를 포함하는 구축물.
  13. 제1항, 제2항, 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄 서열이 펩티드 링커, 또는 비-공유결합 회합 중 하나에 의해 상기 VpreB 서열 및 상기 λ5 서열의 융합체에 접합되어 이량체성 복합체를 형성하는 것인 구축물.
  14. 제1항에 있어서, C-말단에서 서열 5의 λ5 서열 또는 그의 단편의 N-말단으로 융합된 서열 1의 VpreB1 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를, 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄 서열에 접합시켜 포함하는 구축물.
  15. 제1항에 있어서, 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄 서열에 접합된 서열 10의 VpreB1-λ5 융합체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 구축물.
  16. 제1항에 있어서, 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄 서열에 접합된 서열 12의 VpreB1-λ5 융합체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 구축물.
  17. λ5 서열에 접합된 VpreB 서열을 포함하고, 여기서 상기 접합은 비-공유결합 회합이고, 상기 VpreB 및 λ5 서열 중 하나 이상이 각각 전장 천연 VpreB 및 λ5 서열 이외의 것이며, 비-공유결합적으로 회합된 VpreB 서열 및 λ5 서열과 비-공유결합적으로 회합되어 삼량체성 복합체를 형성하는 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄 서열을 추가로 포함하고, 상기 VpreB 서열은 서열 1의 VpreB1, 서열 2 및 3의 VpreB2, 서열 4의 VpreB3, 및 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인,
    표적에 특이적으로 결합할 수 있는 구축물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 VpreB 및 λ5 서열 중 하나 이상이 각각 천연 VpreB 및 λ5 서열의 단편인 구축물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 VpreB 서열 또는 상기 λ5 서열의 CDR 유사 영역이 치료적 항체로부터의 상응하는 CDR 서열을 그래프팅(grafting)시키는 것에 의해 조작되는 것인 구축물.
  20. 제1항에 있어서, 표적이 항원인 구축물.
  21. 제1항에 있어서, 표적이 바이러스 항원인 구축물.
  22. 제21항에 있어서, 표적이 인플루엔자 A 바이러스인 구축물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 구축물이 상기 인플루엔자 A 바이러스를 중화시키는 것인 구축물.
  24. 제1항, 제2항, 제7항, 제9항, 제10항 및 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 구축물의 라이브러리(library).
  25. 제24항에 있어서, 상기 라이브러리의 구성원에 부가되거나 또는 구성원 내에 내재된 하나 이상의 추가적인 기능성을 추가로 포함하며, 상기 추가적인 기능성은 항체, 펩티드, 또는 폴리펩티드 서열에 의해 제공되는 것인 라이브러리.
  26. 제25항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 수용체 또는 리간드 서열인 라이브러리.
  27. 제25항에 있어서, 상기 항체, 펩티드, 또는 폴리펩티드 서열이 항체, 펩티드, 또는 폴리펩티드 라이브러리의 구성원인 라이브러리.
  28. 제27항에 있어서, 상기 펩티드 라이브러리가 무작위 펩티드 서열의 라이브러리인 라이브러리.
  29. 제28항에 있어서, 상기 펩티드 서열 중 적어도 일부가 표적 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 것인 라이브러리.
  30. 제24항에 있어서, 디스플레이 형태인 라이브러리.
  31. 제30항에 있어서, 상기 디스플레이가 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이, DNA 디스플레이, 포유류 세포 상의 디스플레이, 포자 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 단백질-DNA 연결을 기초로 하는 디스플레이, 및 마이크로비드 디스플레이로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 라이브러리.
  32. 제24항에 있어서, 상기 구축물이 하나 이상의 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 것인 라이브러리.
  33. 제32항에 있어서, 상기 구축물이 동일한 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 것인 라이브러리.
  34. 제32항에 있어서, 상기 구축물이 2개 이상의 상이한 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 것인 라이브러리.
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