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ES2645272T3 - Moduladores de DLL3 y procedimientos de utilización - Google Patents

Moduladores de DLL3 y procedimientos de utilización Download PDF

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ES2645272T3
ES2645272T3 ES13707525.5T ES13707525T ES2645272T3 ES 2645272 T3 ES2645272 T3 ES 2645272T3 ES 13707525 T ES13707525 T ES 13707525T ES 2645272 T3 ES2645272 T3 ES 2645272T3
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ES
Spain
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antibody
seq
dll3
cdr
waste
Prior art date
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Active
Application number
ES13707525.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Robert A. Stull
Laura Saunders
Scott J. Dylla
Orit Foord
David Liu
Michael Torgov
Hui Shao
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AbbVie Stemcentrx LLC
Original Assignee
AbbVie Stemcentrx LLC
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47790544&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2645272(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A61K51/1096—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies radioimmunotoxins, i.e. conjugates being structurally as defined in A61K51/1093, and including a radioactive nucleus for use in radiotherapeutic applications
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
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    • C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/16—Peri-condensed systems
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
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    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
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Abstract

Conjugado de anticuerpo y fármaco supresor de tumores de fórmula M-[L-D]n, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que M comprende un anticuerpo anti-DLL3 que se une específicamente a un epítopo en el dominio DSL de una proteína DLL3 establecida como la SEQ Id NO: 3 ó 4; L comprende un enlazador opcional; D comprende un agente citotóxico; y n es un número entero de 1 a 20.

Description

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DESCRIPCION
Moduladores de DLL3 y procedimientos de utilizacion
[0001] La presente solicitud se refiere generalmente a nuevos compuestos, composiciones y procedimientos de su uso en el diagnostico, prevencion, tratamiento o mejora de trastornos proliferativos y cualquier expansion, recurrencia, recalda o metastasis de los mismos. En un aspecto amplio, la presente descripcion se refiere al uso de moduladores de ligando 3 tipo delta (DLL3), incluyendo anticuerpos anti-DLL3 y construcciones de fusion, para el tratamiento, diagnostico o profilaxis de trastornos neoplasicos. Los ejemplos seleccionados de la presente descripcion proporcionan el uso de dichos moduladores de DLL3, incluyendo conjugados de farmacos de anticuerpos, para el tratamiento inmunoterapeutico de tumores malignos que comprende preferiblemente una reduccion en la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
[0002] La diferenciacion de celulas madre y progenitoras y la proliferacion celular son procesos continuos normales que actuan en concierto para apoyar el crecimiento del tejido durante la organogenesis y el reemplazo y la reparacion celular de la mayorla de los tejidos durante la vida de todos los organismos vivos. En el curso normal de los acontecimientos, la diferenciacion y la proliferacion celular estan controladas por numerosos factores y senales que estan generalmente equilibrados para mantener las decisiones del destino celular y la arquitectura del tejido. Por lo tanto, en gran medida, es este microambiente controlado que regula la division celular y la maduracion del tejido donde las senales se generan adecuadamente en funcion de las necesidades del organismo. En este aspecto, la proliferacion y la diferenciacion celular normalmente se produce solo cuando sea necesario para la sustitucion de las celulas danadas o moribundas o para el crecimiento. Desafortunadamente, la alteration de la proliferacion y/o diferenciacion celular puede ser resultado de una mirlada de factores que incluyen, por ejemplo, la subabundancia o sobreabundancia de diversos productos qulmicos de serialization, la presencia de microambientes alterados, mutaciones geneticas o alguna combination de los mismos. Cuando la proliferacion y/o diferenciacion celular normal se perturba o de alguna manera se altera puede conducir a diversas enfermedades o trastornos, que incluyen trastornos proliferativos, tales como cancer.
[0003] Los tratamientos convencionales para el cancer incluyen quimioterapia, radioterapia, cirugla, inmunoterapia (por ejemplo, modificadores de la respuesta biologica, vacunas o agentes terapeuticos dirigidos) o combinaciones de los mismos. Desafortunadamente, ciertos tipos de cancer no son sensibles o son mlnimamente sensibles a este tipo de tratamientos. Por ejemplo, en algunos pacientes, los tumores muestran mutaciones de genes que hacen que no sean sensibles, a pesar de la eficacia general de las terapias seleccionadas. Por otra parte, dependiendo del tipo de cancer y la forma que toman algunos tratamientos disponibles, como la cirugla, pueden no ser alternativas viables. Las limitaciones inherentes en la norma actual de los productos terapeuticos de tratamiento son particularmente evidentes cuando se intentan tratar pacientes que han sido sometidos a tratamientos anteriores y han recaldo posteriormente. En tales ejemplos, los reglmenes terapeuticos fallidos y el resultante deterioro del paciente pueden contribuir a tumores refractarios que a menudo se manifiestan como una enfermedad relativamente agresiva que en ultima instancia resulta ser incurable. Aunque ha habido grandes mejoras en el diagnostico y tratamiento del cancer en los ultimos anos, las tasas de supervivencia global para muchos tumores solidos se han mantenido practicamente sin cambios, debido al fracaso de las terapias existentes para prevenir la recalda, recidiva tumoral y la metastasis. Por lo tanto, sigue siendo un reto desarrollar terapias mas especlficas y potentes para trastornos proliferativos. El documento WO2011/093097 se refiere a un anticuerpo anti-DLL3. Se proporciona un agente contra el cancer que comprende el anticuerpo.
DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION
[0004] La invention se define mediante las reivindicaciones.
[0005] Estos y otros objetivos se proporcionan por la presente descripcion que, en un sentido amplio, se refiere a procedimientos, compuestos, composiciones y artlculos de fabrication que pueden usarse en el tratamiento de trastornos asociados con DLL3 (por ejemplo, trastornos proliferativos o trastornos neoplasicos). A tal fin, la presente descripcion proporciona moduladores de ligando 3 de tipo delta (o DLL3) que se reconocen eficazmente las celulas tumorales y/o celulas madre cancerosas y pueden usarse para tratar a pacientes que sufren de una amplia variedad de tumores malignos. Como se discutira con mas detalle en el presente documento, existen al menos dos isoformas de DLL3 de origen natural o variantes y los moduladores descritos pueden comprender o asociarse selectivamente con una isoforma u otra o ambas. Ademas, en ciertas realizaciones, los moduladores de DLL3 descritos pueden reaccionar adicionalmente con uno o mas miembros de la familia de DLL (por ejemplo, DLL1 o DLL4) o, en otras realizaciones, pueden generarse y seleccionarse para asociarse o reaccionar exclusivamente con una o mas de isoformas de DLL3. En cualquier caso, los moduladores pueden comprender cualquier compuesto que reconoce, compite, agoniza, antagoniza, interactua, se une o se asocia con un determinante genotlpico o fenotlpico de DLL3 (o fragmento del mismo) y modula, ajusta, altera, regula, cambia o modifica el impacto de la protelna DLL3 en una o mas vlas fisiologicas y/o elimina las celulas asociadas a DLL3. Por lo tanto, en un sentido amplio, la presente descripcion esta generalmente dirigida a moduladores de DLL3 aislados y usos de los mismos. En ejemplos
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preferidos la descripcion se dirige mas particularmente a moduladores de DLL3 aislados que comprenden anticuerpos (es decir, anticuerpos que se unen inmunopreferencialmente, reaccionan con o se asocian con al menos una isoforma de DLL3) que, en ejemplos particularmente preferidas, estan asociados o conjugados a uno o mas agentes citotoxicos. Por otra parte, tal como se ha discutido extensamente mas adelante, tales moduladores se pueden usar para proporcionar composiciones farmaceuticas utiles para la profilaxis, el diagnostico o el tratamiento de trastornos proliferativos incluyendo el cancer.
[0006] En los ejemplos seleccionados de la descripcion, los moduladores de DLL3 pueden comprender un polipeptido DLL3 o fragmentos del mismo, ya sea en una forma aislada o fusionado o asociado con otros restos (por ejemplo, Fc-DLL3, PBG-DLL3 o DLL3 asociados con un resto de reconocimiento). En otros ejemplos seleccionados, los moduladores de DLL3 pueden comprender antagonistas de DLL3 que, para los fines de la presente solicitud, se emplean para referirse a cualquier construccion o compuesto que reconoce, compite, interactua, se une o se asocia con DLL3 y neutraliza, elimina, reduce, sensibiliza, reprograma, inhibe o controla el crecimiento de celulas neoplasicas incluyendo celulas iniciadoras del tumor. En los ejemplos preferidos, los moduladores de DLL3 de la presente descripcion comprenden anticuerpos anti-DLL3, o fragmentos o derivados de los mismos, que de forma inesperada, se ha encontrado que silencian, neutralizan, reducen, disminuyen, agotan, moderan, disminuyen, reprograman, eliminan, o de otra manera inhiben la capacidad de las celulas iniciadoras de tumores para propagar, mantener, ampliar, proliferar o de otra manera facilitan la supervivencia, recurrencia, regeneration y/o metastasis de las celulas neoplasicas. En ejemplos particularmente preferidos, los anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos pueden estar asociados con, o conjugados con, uno o mas agentes contra el cancer (por ejemplo, un agente citotoxico).
[0007] Con respecto a tales moduladores, se entendera que los anticuerpos compatibles pueden adoptar cualquiera de un numero de formas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quimericos, con CDR injertadas, humanizados y humanos, y fragmentos inmunorreactivos y/o variantes de cada uno de los anteriores. Las realizaciones preferidas comprenderan anticuerpos que son relativamente no inmunogenicos tal como construcciones humanizadas o completamente humanas. Por supuesto, en vista de la presente descripcion, los expertos en la tecnica podrlan identificar facilmente una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) asociadas con regiones variables de cadena pesada y ligera de los moduladores anticuerpos de DLL3 y utilizar esas CDR para disenar o fabricar anticuerpos quimericos, humanizados o injertados con CDR sin experimentation indebida. Por consiguiente, en ciertos ejemplos preferidos el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo que incorpora una o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR) segun se define en las figuras 11A y 11B y derivados de regiones variables murinas de cadena contigua ligera (figura 11 A) o pesada (figura 11B) (SEQ ID NOS: 20 a 203) establecidos en las mismas. Tales regiones variables con CDR injertadas se muestran tambien en la Figura 11 que comprende las SEQ ID NOS: 204-213. En ejemplos preferidos, tales anticuerpos comprenderan anticuerpos monoclonales y, en los ejemplos incluso mas preferidos, comprenderan anticuerpos quimericos, con CDR injertadas o humanizados.
[0008] Los ejemplos de secuencias de acidos nucleicos que codifican cada una de las secuencias de aminoacidos
expuestas en las figuras 11A y Fig 11B estan adjuntos al presente documento en la lista de secuencias y comprenden las SEQ ID NOS: 220 a 413. A este respecto, se entendera que la descripcion comprende ademas moleculas de acido nucleico (y constructos, vectores y celulas huesped asociados) que codifican las secuencias de aminoacidos de la region variable de anticuerpo descritas, incluyendo las expuestas en la lista de secuencias adjunta. Mas particularmente, en los ejemplos seleccionados, los moduladores de DLL3 compatibles pueden comprender un anticuerpo que tiene una region variable de cadena ligera y una region variable de cadena pesada en la que dicha region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos tal como se exponen en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:

28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 , SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:

42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEC ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO:

56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO : 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:
70, SEC TD NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SE Q ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO : 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO :: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 202 y en la que dicha region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en

secuencias de aminoacidos tal como se exponen en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:

27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:

41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO:
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55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO:

69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO:

83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO:
97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ
ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID N O: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 203. En otros ejemplos preferidos, los moduladores seleccionados comprenderan regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden 65, 70, 75 o 80% de identidad con las secuencias murinas mencionadss. En aun otros ejemplos, los moduladores comprenderan regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden 85, 90 o incluso 95% de identidad con las secuencias murinas descritas.
[0009] En otros ejemplos preferidos, los moduladores seleccionados comprenderan una o mas CDR obtenidas a partir de cualquiera de las secuencias de aminoacidos de la region variable de cadena ligera y pesada anteriores. Por consiguiente, los ejemplos seleccionados de la description incluyen un modulador de DLL3 que comprende una o mas CDR de una cualquiera de las SEQ ID NOS: 20 a 203. En aun otros ejemplos, los moduladores de la presente descripcion comprenderan cualquier anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo que compite por la union con cualquiera de los moduladores anteriores.
[0010] Otro ejemplo de la descripcion comprende moduladores obtenidos o derivados de SC16.3, SC16.4, SC16.5,
SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, S16.15, Sic16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16. 35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41,
SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61,
SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16. 80, SC16.81,
SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109,
SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121,
SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16. 125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133,
SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143,
SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 y SC16.150. En otros ejemplos la descripcion comprendera un
modulador de DLL3 que tiene una o mas CDR de cualquiera de los moduladores antes mencionados.
[0011] En aun otros ejemplos compatibles, la presente descripcion comprendera los moduladores de DLL3 con CDR injertadas o humanizados hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 y hSC16.56. Aun otros ejemplos se dirigen a un modulador de DLL3 que comprende un anticuerpo humanizado en el que dicho anticuerpo humanizado comprende una region variable de cadena ligera y una region variable de cadena pesada en el que dicha region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210 y SEQ ID NO: 212 y en el que dicha region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos expuestas en SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211 y SEQ ID NO: 213. Ademas, como se describe inmediatamente antes, las secuencias de acidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera humanizadas se exponen en la lista de secuencias adjunta como SEQ ID NOS: 404-413.
[0012] Ademas de los aspectos antes mencionados, otros ejemplos preferidos de la presente descripcion comprenderan moduladores de DLL3 asociados o conjugados con uno o mas farmacos para proporcionar conjugados de modulador que pueden ser particularmente eficaces en el tratamiento de trastornos proliferativos (solo o en combination con otros agentes farmaceuticamente activos). Mas en general, una vez que los moduladores de la descripcion se han fabricado y seleccionado, se pueden ligar, fusionar, conjugar con (por ejemplo, covalentemente o no covalentemente) o en cualquier caso asociarse con restos farmaceuticamente activos o de diagnostico o modificadores biocompatibles. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "conjugado" o "modulador conjugado" o "conjugado de anticuerpo" se utilizara ampliamente y pretende significar cualquier molecula o farmaco biologicamente activo o detectable asociado con los moduladores descritos, independientemente del procedimiento de asociacion. A este respecto, se entendera que tales conjugados pueden, ademas de los moduladores descritos, comprender peptidos, polipeptidos, protelnas, profarmacos que se metabolizan a un agente activo in vivo, pollmeros, moleculas de acidos nucleicos, moleculas pequenas, agentes de union, agentes mimeticos, farmacos sinteticos, moleculas inorganicas, moleculas organicas y radioisotopos. Por otra parte, como se indico anteriormente, el conjugado seleccionado puede estar covalente o no covalentemente asociado con, o unido a, el modulador y exhiben diversas relaciones molares estequiometricas en funcion, al menos en parte, del procedimiento utilizado para efectuar la conjugation.
[0013] Los aspectos particularmente preferidos de la presente invention comprenderan conjugados de modulador y
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anticuerpos o conjugados de anticuerpo-farmaco que pueden usarse para el diagnostico y/o tratamiento de trastornos proliferativos. Tales conjugados pueden ser representados por la formula M-[L-D]n donde M representa un modulador descrito o resto de union a diana, L es un enlazador o unidad enlazadora opcional, D es un farmaco o profarmaco compatible y n es un numero entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 20. Se entendera que, a menos que dicten lo contrario por el contexto, se entendera que los terminos "conjugado anticuerpo-farmaco" o "ADC" o la formula M-[L-D]n abarcara conjugados que comprenden restos tanto terapeuticos como de diagnostico. En tales ejemplos, los compuestos conjugados anticuerpo-farmaco comprenderan tlpicamente anti- DLL3 como la unidad de modulador (M), un resto terapeutico o de diagnostico (D), y opcionalmente un enlazador (L) que une el farmaco y el agente de union a antlgeno. En un ejemplo preferido, el anticuerpo es un mAb DLL3 que comprende al menos una CDR de las regiones variable sde cadena pesada y ligera, tal como se describe anteriormente.
[0014] Como se indico anteriormente, un aspecto de la invencion puede comprender la asociacion terapeutica inesperada de polipeptidos DLL3 con celulas madre cancerosas. Por lo tanto, en algunos otros ejemplos, la descripcion comprendera un modulador de DLL3 que reduce la frecuencia de celulas iniciadoras del tumor tras la administracion a un sujeto. Preferiblemente, la reduccion en la frecuencia se determinara utilizando analisis de dilucion limitante in vitro o in vivo. En ejemplos particularmente preferidos, tales analisis se puede realizar usando analisis de dilucion limitante in vivo que comprende el trasplante de celulas tumorales humanas vias en ratones inmunocomprometidos (por ejemplo, vease el Ejemplo 17 mas abajo). Alternativamente, el analisis de dilucion limitante se puede realizar usando un analisis de dilucion limitante in vitro que comprende la deposicion de la dilucion limitante de las celulas tumorales humanas vivas en condiciones de soporte de colonias in vitro. En cualquier caso, el analisis, calculo o cuantificacion de la reduccion en la frecuencia comprenderan preferiblemente el uso de estadlsticas de distribucion de Poisson para proporcionar una contabilidad exacta. Se entendera que, si bien se prefieren tales procedimientos de cuantificacion, tambien se pueden utilizar otras metodologlas con menor trabajo como citometrla de flujo o inmunohistoqulmica para proporcionar los valores deseados y, en consecuencia, se contemplan expresamente dentro del alcance de la presente descripcion. En tales ejemplos, la reduccion en la frecuencia se puede determinar usando analisis de citometrla de flujo o deteccion inmunohistoqulmica de marcadores de superficie de celulas tumorales conocidas para enriquecer celulas iniciadoras de tumores.
[0015] Como tal, otro ejemplo preferido de la presente descripcion comprende un procedimiento para tratar un trastorno asociado a DLL3 que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un modulador de DLL3 a un sujeto en necesidad del mismo mediante el cual la frecuencia de celulas iniciadoras del tumor se reduce. Preferiblemente, el trastorno asociado a DLL3 comprende un trastorno neoplasico. De nuevo, la reduccion en la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores preferiblemente se determinara utilizando analisis de dilucion limitante in vitro o in vivo.
[0016] A este respecto, se entendera que la presente invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los inmunogenos de DLL3 estan terapeuticamente asociados con celulas que perpetuan los tumores (es decir, celulas madre cancerosas) que estan implicadas en la etiologla de diversas trastornos proliferativos, incluyendo neoplasia. Mas especlficamente, la presente solicitud demuestra, de forma inesperada, que la administracion de diversos moduladores de DLL3 de ejemplo pueden mediar, reducir, agotar, inhibir o eliminar la serialization tumorigenica por las celulas iniciadoras del tumor (es decir, reducir la frecuencia de las celulas iniciadoras de tumores). Esta senalizacion reducida, ya sea por agotamiento, neutralization, reduccion, elimination, reprogramacion o silenciamiento de las celulas iniciadoras de tumor o mediante la modification de la morfologla celular tumoral (por ejemplo, la diferenciacion inducida, interruption del nicho), a su vez permite el tratamiento mas eficaz de los trastornos asociados con DLL3 mediante la inhibition de la tumorigenesis, mantenimiento del tumor, expansion y/o metastasis y recurrencia.
[0017] Ademas de la mencionada asociacion con las celulas madre del cancer, existe evidencia de que las isoformas de DLL3 pueden estar implicadas en el crecimiento, la recurrencia o el potencial metastasico de los tumores que comprenden o que presentan caracterlsticas neuroendocrinas o determinantes (genotlpicas o fenotlpicas). Para los fines de la presente invencion, tales tumores comprenderan tumores neuroendocrinos y tumores pseudoneuroendocrinos. La intervention en la proliferation de tales celulas tumorigenicas utilizando los moduladores de DLL3 novedosos descritos en este documento, por lo tanto, puede mejorar o tratar un trastorno por mas de un mecanismo (por ejemplo, reduccion de celulas iniciadoras de tumores y la interrupcion de la via de senalizacion oncogenica) para proporcionar efectos aditivos o sinergicos. Aun otros ejemplos preferidos pueden sacar ventaja de la internalization celular de la protelna DLL3 de superficie celular para suministrar un agente contra el cancer mediado por modulador. A este respecto, se entendera que la presente descripcion no esta limitada por ningun mecanismo particular de action, sino que mas bien abarca el amplio uso de los moduladores descritos para tratar trastornos asociados con DLL3 (incluyendo varias neoplasias).
[0018] Por lo tanto, en otros ejemplos, la presente descripcion comprendera el uso de los moduladores descritos para tratar tumores que comprenden caracterlsticas neuroendocrinas en un sujeto en necesidad de los mismos. Por supuesto, los mismos moduladores se pueden utilizar para la profilaxis, el pronostico, el diagnostico, el teragnostico, la inhibicion o el mantenimiento de estos mismos tumores.
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[0019] Otros aspectos de la presente description explotan la capacidad de los moduladores descritos de alterar potencialmente vlas oncogenicas (por ejemplo, Notch), mientras que simultaneamente silencian las celulas iniciadoras de tumores. Tales moduladores de DLL3 multiactivos (por ejemplo, antagonistas de DLL3) pueden resultar ser particularmente eficaces cuando se utilizan en combination con el estandar de agentes terapeuticos contra el cancer o agentes para la reduction de volumen. Por consiguiente, los ejemplos preferidos de la presente descripcion comprenden el uso de los moduladores descritos como agentes anti-metastaticos para terapia de mantenimiento despues de los tratamientos iniciales. Ademas, se pueden usar dos o mas antagonistas de DLL3 (por ejemplo anticuerpos que se unen especlficamente a dos epltopos discretos en DLL3) en combinacion segun las presentes ensenanzas. Por otra parte, como se discute con cierto detalle a continuation, los moduladores de DLL3 de la presente descripcion se pueden utilizar en un estado conjugado o no conjugado y, opcionalmente, como un agente sensibilizante en combinacion con una variedad de agentes contra el cancer qulmicos o biologicos.
[0020] Segun otro ejemplo preferido, la presente descripcion comprende un procedimiento de sensibilization de un tumor en un sujeto para el tratamiento con un agente contra el cancer que comprende la etapa de administrar un modulador de DLL3 a dicho sujeto. Otros ejemplos comprenden un procedimiento para reducir la metastasis o recurrencia del tumor despues del tratamiento, que comprende administrar un modulador de DLL3 a un sujeto en necesidad del mismo. En un ejemplo particularmente preferido de la descripcion, el modulador de DLL3 dara lugar especlficamente a una reduccion de la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores tal como se determina usando analisis de dilution limitante in vitro o in vivo.
[0021] Mas generalmente, los ejemplos preferidos de la descripcion comprenden un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado a DLL3 en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar un modulador de DLL3 al sujeto. En ejemplos particularmente preferidos, el modulador de DLL3 estara asociado (por ejemplo, conjugado) con un agente contra el cancer . En aun otros ejemplos, el modulador de DLL3 se internalizara despues de la asociacion o union con DLL3 sobre o cerca de la superficie de la celula. Ademas, los aspectos beneficiosos de la presente invention, incluyendo cualquier alteration de las vlas de serialization y los beneficios colaterales, se pueden conseguir si el tejido tumoral del sujeto muestra elevados niveles de DLL3 o niveles reducidos o disminuidos de DLL3 en comparacion con el tejido normal adyacente. Ejemplos particularmente preferidos comprenderan el tratamiento de trastornos que presentan niveles elevados de DLL3 en celulas tumorigenicas en comparacion con el tejido normal o celulas no tumorigenicas.
[0022] En otro ejemplo, la presente descripcion comprenderan un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece trastorno neoplasico que comprende la etapa de administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un modulador de DLL3 de internalization. Los ejemplos preferidos comprenderan la administration de los moduladores de anticuerpo de internalizacion en los que los moduladores se conjugan o asocian con un agente citotoxico.
[0023] Otros ejemplos se refieren a un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno asociado a DLL3 que comprende la etapa de administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un modulador de DLL3 en disminucion.
[0024] En otro ejemplo, la presente descripcion proporciona procedimientos de la terapia de mantenimiento en el que los efectores o moduladores descritos se administran durante un perlodo de tiempo despues de un procedimiento inicial (por ejemplo, quimioterapeuticos, radiation o cirugla) disenado para eliminar al menos una portion de la masa tumoras. Tales reglmenes de mantenimiento terapeuticos se pueden administrar durante un perlodo de semanas, un periodo de meses o incluso un perlodo de anos en los que los moduladores de DLL3 pueden actuar profilacticamente para inhibir la metastasis y/o la recurrencia del tumor. En aun otros ejemplos, los moduladores descritos pueden ser administrados en concierto con los reglmenes para la reduccion de volumen conocidos para prevenir o retardar la metastasis, mantener el tumor o recurrencia.
[0025] Como se ha mencionado anteriormente a los moduladores de DLL3 de la presente descripcion puede estar fabricado y/o seleccionado para reaccionar con ambas isoformas de DLL3 o una sola isoforma de la protelna o, a la inversa, puede comprender un modulador de pan-DLL que reacciona o se asocia con al menos un miembro de la familia DLL adicional ademas de DLL3. Mas especlficamente, los moduladores preferidos, tales como los anticuerpos pueden ser generados y seleccionados de manera que reaccionan con los dominios (o epltopos en el mismo) que sos mostrados por DLL3 solamente o con dominios que son al menos algo conservados a traves de varios o todos los miembros de la familia DLL.
[0026] En aun otros ejemplos preferidos, los moduladores se asociaran o uniran a un epltopo, porcion, motivo o dominio especlfico de DLL3. Como se discutira en detalle a continuacion, las isoformas de DLL3 incorporan una region extracelular identica (vease la Figura 1F) que comprende al menos un dominio N-terminal, un dominio DSL (Delta/setRate/lag-2) y seis dominios de tipo EGF (es decir, EGF1 - EGF6). Por consiguiente, en ciertos ejemplos, los moduladores se uniran o asociaran con el dominio N-terminal de DLL3 (es decir, los aminoacidos 27 a 175 en la protelna madura), mientras que en otros ejemplos seleccionados, los moduladores se asociaran con el dominio DSL (es decir, los aminoacidos 176-215) o epltopo en el mismo. Otros ejemplos de la presente descripcion comprenden moduladores que se asocian o se unen a un epltopo especlfico situado en un dominio particular de tipo EGF de
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DLL3. En este sentido, el modulador particular puede asociarse o unirse a un epltopo localizado en EGF1 (aminoacidos 216-249), EGF2 (aminoacidos 274-310), EGF3 (aminoacidos 312-351), EGF4 (aminoacidos 353-389), EGF5 (aminoacidos 391-427) o EGF6 (aminoacidos 429-465). Por supuesto, se entendera que cada uno de los dominios mencionados anteriormente puede comprender mas de un epltopo y/o mas de un grupo (“bin”). En ejemplos particularmente preferidos, la descripcion comprendera un modulador que se une, reacciona o se asocia con el dominio DSL o un epltopo en el mismo. En otros ejemplos preferidos, la descripcion comprendera moduladores que se unen, reaccionan o asocian con un dominio de tipo EGF en particular o un epltopo en el mismo. En aun otros ejemplos preferidos, los moduladores se uniran, reaccionaran o asociaran con el dominio N- terminal o un epltopo en el mismo.
[0027] Con respecto a “grupos” de moduladores o anticuerpos se entendera que el antlgeno DLL3 puede analizarse o mapearse a traves de la union competitiva a antlgeno usando tecnicas reconocidas en el sector para definir los grupos especlficos situados en o a lo largo de la protelna. Aunque se discute con mas detalle en este documento y se muestra en los Ejemplos 9 y 10 a continuacion, dos anticuerpos (uno de los cuales puede denominarse un "anticuerpo de referenda", "anticuerpo delineante del grupo" o "anticuerpo delineante") pueden considerarse en el mismo grupo si compiten entre si por la union al antlgeno diana. En tales ejemplos, los epltopos de anticuerpos en cuestion pueden ser identicos, sustancialmente identicos o lo suficientemente proximos (ya sea en un sentido lineal en la que estan separados por unos pocos aminoacidos o conformacionalmente) de modo que ambos anticuerpos son estericamente o electrostaticamente inhibidos o impedidos para unirse al antlgeno. Tales grupos definidos pueden estar generalmente asociados con ciertos dominios DLL3 (por ejemplo, el anticuerpo de referencia se unira con un epltopo contenido en un dominio especlfico), aunque la correlacion no es siempre precisa (por ejemplo, puede haber mas de un grupo en un dominio o el grupo puede definirse conformacionalmente y comprender mas de un dominio). Se entendera que los expertos en la tecnica pueden determinar facilmente la relacion entre los dominios DLL3 y los grupos determinados emplricamente.
[0028] Con respecto a la presente descripcion, el analisis de union competitiva utilizando tecnicas reconocidas en la
tecnica (por ejemplo, ELISA, resonancia de plasmon superficial o interferometrla de biocapa) definio al menos nueve grupos distintos, cada uno de los cuales se encontro que contenla un numero de moduladores de anticuerpo. Para los fines de la presente descripcion, los nueve grupos se denominan grupo A a grupo I. Por lo tanto, en ejemplos seleccionados, la presente descripcion comprendera un modulador que reside en un grupo seleccionado del grupo que consiste en grupo A, grupo B, grupo C, grupo D, grupo E, grupo F, grupo G, grupo H y grupo I. En otros ejemplos, la presente descripcion comprende un modulador que reside en un grupo definido por un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en SC16.3, SC16.4, SC16 0.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23 , SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16 0.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.94, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16 0.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113,
SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124,
SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16. 130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136,
SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148,
SC16.149 y SC16.150. En aun otros ejemplos, la descripcion comprendera moduladores de grupo A, moduladores de grupo B, moduladores de grupo C, moduladores de grupo D, moduladores de grupo E, moduladores de grupo F, moduladores de grupo G, moduladores de grupo H o moduladores de grupo I. Sin embargo, otros ejemplos preferidos comprenderan un modulador de anticuerpo de referencia y cualquier anticuerpo que compite con el anticuerpo de referencia.
[0029] El termino "completar" o "completar el anticuerpo" cuando se utiliza en el contexto de los moduladores descritos significa la competencia de union entre los anticuerpos tal como se determina mediante un ensayo en el que un anticuerpo de referencia o fragmento inmunologicamente funcional evita o inhibe sustancialmente (por ejemplo, mayor que 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90%) la union especlfica de un anticuerpo de prueba a un antlgeno habitual. Los procedimientos compatibles para determinar dicha competencia comprenden tecnicas conocidas, tales como, por ejemplo, interferometrla de biocapa, resonancia de plasmon superficial, citometrla de flujo, ELISA competitivo, etc.
[0030] Ademas de los moduladores antes mencionados, en los ejemplos seleccionados, la descripcion comprende un modulador de pan-DLL que se asocia con DLL3 y al menos otro miembro de la familia de DLL. En otros ejemplos seleccionados, la descripcion comprende un modulador de DLL3 que inmunoespeclficamente se asocia con una o mas isoformas de DLL3, pero no se asocia inmunoespeclficamente con cualquier otro miembro de la familia DLL. En aun otros ejemplos, la presente descripcion comprende un procedimiento de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un modulador de pan-DLL. Aun otros ejemplos comprenden un procedimiento de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un modulador de DLL3 que inmunoespeclficamente se asocia con una o mas isoformas de DLL3, pero no se asocia inmunoespeclficamente con cualquier otro miembro de la familia de DLL.
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[0031] Mas alia de los usos terapeuticos mencionados anteriormente, tambien se entendera que los moduladores de la presente descripcion pueden utilizarse para detectar, diagnosticar o clasificar los trastornos relacionados con DLL3 y, en particular, trastornos proliferativos. Tambien pueden usarse en el pronostico y/o teragnostico de tales trastornos. En algunos ejemplos el modulador se puede administrar al sujeto y se detecta o monitoriza in vivo. Los expertos en la tecnica entenderan que tales moduladores pueden estar marcados o asociados con efectores, marcadores o informadores, tal como se describe a continuacion y detectarse usando uno cualquiera de una serie de tecnicas estandar (por ejemplo, resonancia magnetica, tomografla CAT, PET, etc.).
[0032] Por lo tanto, en algunos ejemplos la descripcion comprenderan un procedimiento de diagnostico, deteccion o monitorizacion de un trastorno asociado con DLL3 in vivo en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar un modulador de DLL3.
[0033] En otros ejemplos, los moduladores pueden usarse en un entorno de procedimientos reconocidos en la tecnica (por ejemplo, inmunohistoqulmica o IHC). comprende un procedimiento de diagnostico de un trastorno hiperproliferativo en un que comprende las etapas de:
a. obtener una muestra de tejido de dicho sujeto;
b. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de DLL3; y
c. detectar o cuantificar el modulador de DLL3 asociado con la muestra.
[0034] Dichos procedimientos pueden discernirse facilmente en conjuncion con la presente solicitud y se pueden realizar facilmente utilizando tecnologla comercial generalmente disponible, tales como lectores automaticos de placas, sistemas informadores dedicados, etc. En ejemplos seleccionados, el modulador de DLL3 estara asociado con las celulas que perpetuan el tumor (es decir, celulas madre cancerosas) presentes en la muestra. En otros ejemplos preferidos, la etapa de deteccion o de cuantificacion comprendera una reduccion de la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores que puede se monitorizada, tal como se describe en el presente documento.
[0035] De manera similar, la presente descripcion tambien proporciona kits o dispositivos y procedimientos asociados que son utiles en el diagnostico y monitorizacion de los trastornos asociados a DLL3, tal como el cancer. Para este fin, la presente descripcion proporciona preferiblemente un artlculo de fabrication util para detectar, diagnosticar o tratar trastornos asociados a DLL3 que comprenden un recipiente que contiene un modulador de DLL3 y materiales de instruction para el uso de dicho modulador de DLL3 para tratar, controlar o diagnosticar el trastorno asociado a DLL3. En ejemplos seleccionados, los dispositivos y procedimientos asociados comprenderan la etapa de poner en contacto al menos una celula de tumor circulante.
[0036] Otros ejemplos preferidos de la descripcion tambien explotan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento util para identificar, caracterizar, aislar, seccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de celulas iniciadoras del tumor a traves de procedimientos, tales como inmunohistoqulmica, analisis citometrico de flujo, incluyendo clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS) o seccionamiento mediado por laser.
[0037] Como tal, otro ejemplo preferido de la presente descripcion se dirige a un procedimiento de identificar, aislar, seccionar o enriquecer una poblacion de celulas iniciadoras de tumores que comprende la etapa de poner en contacto dichas celulas iniciadoras de tumores con un modulador de DLL3.
[0038] Lo anterior es un resumen y por lo tanto contiene, por necesidad, simplificaciones, generalizaciones y omisiones de detalles; en consecuencia, los expertos en la tecnica entenderan que el resumen es solo ilustrativo y no pretende ser en modo alguno limitativo. Otros aspectos, caracterlsticas y ventajas de los procedimientos, composiciones y/o dispositivos y/o otra materia descritos en este documento se pondran de manifiesto en las ensenanzas establecidas en este documento. Se proporciona el resumen para introducir una selection de conceptos en una forma simplificada que se describen mas adelante en la descripcion detallada. Este resumen no tiene la intention de identificar caracterlsticas clave o caracterlsticas esenciales de la materia reivindicada, ni pretende ser utilizado como una ayuda al determinar el alcance de la materia reivindicada.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
[0039]
Las Figuras 1A - 1F son diversas representaciones de DLL3 incluyendo el acido nucleico o secuencias de aminoacidos en la que los ARNm de longitud completa que contienen los ORFs (subrayado) que codifican isoformas DLL3 se representan en la figura 1A y figura 1B (SEQ ID NOS: 1 y 2), las figuras 1C y 1D proporcionan la traduction de las ORFs indicados en las figuras 1A y 1B (SEQ ID NOS: 3 y 4), respectivamente, con residuos subrayados indicando el dominio transmembrana predicho que atraviesa cada isoforma de la protelna, la figura 1E muestra el alineamiento de las dos isoformas de la protelna para ilustrar las diferencias de secuencia en los extremos citoplasmaticos de cada isoforma, de nuevo con los residuos subrayados indicando el dominio transmembrana predicho y la figura 1F proporciona una representation esquematica de la region extracelular de la protelna DLL3 que ilustra las posiciones de los diferentes dominios;
Las figuras 2A y 2B son representaciones tabulares del porcentaje de identidad en el nivel de protelna entre DLL3 y
diagnostico in vitro utilizando Como tal, un ejemplo preferido sujeto en necesidad del mismo
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otros miembros de la familia de tipo Delta en el genoma humano (Figura 2A), o la isoforma humana mas cercana de DLL3 y proteinas DLL3 de mono rhesus, de raton y de rata (Figura 2B);
La figura 3 ilustra esquematicamente las interacciones geneticas entre varios genes "maestros" relevantes a las opciones de destino celular que conducen a fenotipos neuroendocrinos o no neuroendocrinos (flechas que indican la promocion de la expresion genica y flechas barradas indican la inhibicion de la expresion genica), en el que la expresion del factor de transcripcion ASCL1 tanto inicia una cascada de genes (flecha abierta) que conduce a un fenotipo neuroendocrino y al mismo tiempo la activacion de DLL3, que a su vez suprime NOTCH1 y su efector HES1, ambos de los cuales son normalmente responsables de la supresion de ASCL1 y la activacion de cascadas de genes que lleva a una fenotipo no neuroendocrino;
Las figuras 4A y 4B son representaciones tabular (Fig. 4A) y grafica (Fig. 4B) de los niveles de expresion genica de DLL3 y, en la figura 4A, otros genes de la ruta Notch o genes asociados con un fenotipo neuroendocrino como se mide usando transcriptoma toda secuenciacion (solido) de ARN derivado de las subpoblaciones de celulas tumorales o tejidos normales;
La figura 5 es una representacion grafica de los niveles relativos de expresion de ARNm DLL3 transcripcion variantes 1 y 2 como se determina por toda transcriptoma secuenciacion (solido) en xenoinjerto no tradicional seleccionado (NTX) tumores derivados de canceres de pulmon;
Las figuras 6A - 6D muestran los datos de expresion de genes y la agrupacion de los tumores que exhiben caracteristicas neuroendocrinas en el que Figura 6A representa agrupamiento no supervisado de los perfiles de microarrays para 46 lineas tumorales y 2 tejidos normales que comprenden tumores seleccionados y tejidos normales de control, las figuras 6B y 6C son representaciones tabulares de los valores de intensidad normalizados correspondientes a los niveles de expresion relativos de los genes seleccionados relacionados con fenotipos neuroendocrinos (Figura 6B) o la via de senalizacion Notch (Figura 6C) en la que las celulas no sombreadas y numeros relativamente bajos indican poco o ningun expresion y celulas mas oscuras y numeros relativamente altos indican mayores niveles de expresion y la Figura 6D es una representacion grafica que muestra niveles relativos de expresion de HES6 mRNA en diversos tumores y tejidos normales como se mide usando QRT-PCR;
La figura 7 es una representacion grafica que muestra niveles relativos de expresion de las transcripciones DLL3 medido por qRT-PCR en una variedad de muestras de ARN aisladas a partir de tejidos normales, primaria, especimenes tumorales del paciente unpassaged (denotados con "p0"), o tumores NTX a granel procedente de pulmon , rinon y neoplasia de ovario en el que los tumores de pulmon NTX especifica se agrupan por el cancer de pulmon de celulas pequenas (SCLC) y el cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC) (indicado con p1, p2, p3 o p4 para reflejar el numero de pasajes a traves de ratones), en el que el tipo de tumor se indica mediante las abreviaturas indicadas anteriormente;
Las figuras 8A - 8C son representaciones graficas que muestran los niveles de expresion genica relativa (Figura 8A) o absoluta (Figura 8B) de DLL3 humano como medidos por qRT-PCR en muestras de tumor enteros (punto gris) o tejido adyacente normal correspondiente (NAT; punto blanco) de pacientes con una de las dieciocho tipos de tumores solidos diferentes, mientras que Figura.. 8C muestra la expresion de la proteina relativa de DLL3 humano como se mide usando un ensayo ELISA sandwich de electroquimioluminiscencia;
La figura 9 proporciona representaciones graficas de determinacion basada en citometria de flujo de la expresion de proteina de la superficie de diversos receptores Notch y ligandos (por ejemplo, DLL1, DLL4) en poblaciones de celulas tumorales humanas individuales derivadas de tumores NTX de rinon, ovario y de pulmon de celulas pequenas, mostradas como representaciones de histograma (linea de color negro) que se hace referencia a la poblacion tenida con control de isotipo sometida a fluorescencia menos uno (FMO) (solido de color gris) con intensidades de fluorescencia medias indicadas (MFI);
Las figuras 10A - 10D proporcionan, respectivamente, la secuencia de ADNc (Figura 10A; SEQ ID NO: 5..) Y la secuencia de aminoacidos (Figura 10B; SEQ ID NO: 6.) que codifica la proteina madura de DLL3 murino clonada en un vector de expresion lentiviral y la secuencia de ADNc (Figura 10C; SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoacidos (Figura 10D; SEQ ID NO: 8) que codifica la proteina DLL3 de cynomalgus madura clonada en un vector de expresion lentiviral donde los vectores se utilizan para generar celulas que sobreexpresan DLL3 murino y de cynomolgus;
Las figuras 11A y 11B proporcionan, en forma de tabla, las secuencias de aminoacidos contiguos (SEQ ID NOS: 20213) de cadena ligera y pesada regiones variables de una serie de murinos y humanizados de ejemplo moduladores de DLL3 aislados, clonados y de ingenieria como se describe en los ejemplos en este documento;
La figura 12 establece propiedades bioquimicas e inmunologicas de moduladores de ejemplo de DLL3, asi como su capacidad de matar celulas KDY66 NTX in vitro, tal como se representa en un formato tabular;
Las figuras 13A - 13C ilustran caracteristicas de union de moduladores seleccionados en donde las figuras 13A y 13B muestran caracteristicas de union comparativos de un modulador murino seleccionado y su homologo humanizado utilizando resonancia de plasmon superficial, mientras que la figura 13C proporciona ciertas propiedades de las construcciones humanizadas en una forma tabular;
Las figuras 14A y 14B representan, de forma esquematica y grafica, respectivamente, los resultados del analisis de mapeo nivel de dominio de moduladores de DLL3 de ejemplo aislados, clonados y de ingenieria como se describe en los Ejemplos en el presente documento (Figura 14a) y una correlacion entre el dominio de union de moduladores seleccionados y la capacidad de matar celulas que expresan DLL3 KDY66 NTX in vitro (Figura 14B);
Las figuras 15A - 15C son histogramas de citometria de flujo que muestran la expresion DLL3 usando el modulador de ejemplo anti-DLL3 SC16.56 en las celulas 293 sin tratar (Figura 15A), celulas 293 disenadas para sobre-expresar proteinas DLL3 humanas (h293-hDLL3; Figura. 15B) o celulas 293 modificadas geneticamente para sobreexpresar la proteina DLL3 murina (h293-mDLL3; Figura 15C);
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Las figuras 16A - 16F comprenden histogramas de citometrla de flujo (figuras 16A-16C) y resultados de inmunohistoquimica en una forma tabular (figuras 16D-16F) que ilustran, respectivamente, la expresion superficial relativamente alta de DLL3 usando el modulador de ejemplo anti-DLL3 SC16.56 en las celulas humanas en vivo de ovario (OV26; Figura 16A), rinon (KDY66; Figura 16B) y un carcinoma neuroendocrino de pulmon de celulas grandes (LU37; figura 16C.) tumores NTX y la expresion de protelna DLL3 en diversos tumores NTX (Figura 16D) y celulas tumorales de carcinoma de celulas pequenas primario (Figura 16F) mientras que se demuestra que el tejido ormalcarece de la expresion de DLL3 (Figura 16E);
Las figuras 17A - 17C ilustran la capacidad de los moduladores descritos de dirigir eficazmente cargas citotoxicas a celulas que expresan DLL3 en donde la figura 17A documenta la capacidad de los moduladores de ejemplo para matar los tumores KDY66 NTX o celulas 293 que sobreexpresan hDLL3, y la figura 17B y la Fig 17C demuestran la capacidad de los moduladores descritos para entregar las cargas utiles citotoxicos a OV26 (Figura 17B) y LU37 (Figura 17C) donde la curva de pendiente negativa es indicativa de muerte celular a traves de citotoxina internalizado;
Las figuras 18A - 18E ilustran diversas propiedades de los moduladores descritos en los que las Figuras 18A y 18C demuestran por citometrla de flujo que DLL3 NSHP KDY66 y KDY66 sin tratar tienen expresion de DLL3 mientras que la expresion de DLL3 fue eliminada de manera eficiente en celulas DLL3HP2 KDY66, la figura 18B muestra que el crecimiento de las celulas tumorales DLL3HP2 es retrasada co respecto a celulas KDY66 sin tratar y las figuras 18D y 18B demuestran que las realizaciones conjugados de la presente invencion reconocen inmunoespeclficamente y eliminan celulas tumorales KDY66 que expresan DLL3 pero no KDY66 con DLL3 eliminado;
Las figuras 19A - 19C muestran la capacidad de lo casos de conjugados seleccionados de la presente descripcion para eliminar y/o suprimir el crecimiento de celulas tumorigenicas de ejemplo de pulmon in vivo;
Las figuras 20a - 20F representan la capacidad de los moduladores de conjugados de la presente invencion para eliminar sustancialmente tumores y prevenir la recurrencia del tumor in vivo consiguiendo emisiones duraderas en ratones inmunodeficientes injertados con tumores ovaricos (Figura 20A), de pulmon (figuras 20B-20D) y de rinon (las figuras 20B y 20F).; y
Las figuras 21A - 21F demuestran que los moduladores conjugados de la presente descripcion reducen la frecuencia de celulas madre cancerosas tal como se determina mediante un ensayo de dilucion limitante (LDA) para dos tumores de ejemplo pulmon de celulas pequenas, LU95 (figuras 21A -21C) y LU64 (figuras 21D-21F) donde las Figuras 21A y 21D muestran el efecto de los conjugados sobre el crecimiento tumoral, las figuras 21B y 21B muestran los resultados de la LDA y las figuras 21C y 21F presentan graficamente la reduccion en la frecuencia de celulas madre cancerosas provocada por el tratamiento con el conjugado de anticuerpo anti-DLL3 seleccionado.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
1. Introduccion
[0040] Aunque la presente invencion puede realizarse de muchas formas diferentes, se describen en el presente documento realizaciones ilustrativas especlficas de la misma que ejemplifican los principios de la invencion. Debe hacerse hincapie en que la presente invencion no se limita a las realizaciones especlficas ilustradas. Por otra parte, cualquier encabezado de las secciones usadas en este documento es solo para fines de organizacion y no debe interpretarse como limitante del objeto descrito. Por ultimo, para los fines de la presente descripcion todos los numeros de acceso de identificacion de secuencia se pueden encontrar en la base de datos de secuencia de referencia NCBI (RefSeq) y/o la base de datos de secuencias archivadas NCBI GenBank®, a menos que se indique lo contrario.
[0041] Como se discutio anteriormente, sorprendentemente, se ha encontrado que determinantes genotlpicos y/o fenotlpicos de DLL3 estan asociados con diversos trastornos proliferativos, incluyendo neoplasia, que exhiben caracterlsticas neuroendocrinas, y que DLL3 y variantes o isoformas del mismo proporcionan marcadores tumorales utiles que pueden ser explotados en el tratamiento de enfermedades relacionadas. Por otra parte, como se muestra en la presente solicitud, inesperadamente se ha encontrado que los marcadores o determinantes de DLL3, tales como la protelna DLL3 de superficie celular, se asocian terapeuticamente con celulas madre cancerosas (tambien conocidas como celulas que perpetuan el tumor) y pueden ser explotados de manera efectiva para eliminar o silenciar las mismas. La capacidad de reducir selectivamente o eliminar las celulas madre cancerosas (por ejemplo, mediante el uso de moduladores de DLL3 conjugados) es particularmente sorprendente en que se sabe que dichas celulas son generalmente resistentes a muchos tratamientos convencionales. Es decir, la eficacia de los procedimientos tradicionales, as! como de procedimientos de tratamiento dirigidos mas recientes, a menudo esta limitada por la existencia y/o la aparicion de celulas madre cancerosas resistentes que son capaces de perpetuar el crecimiento del tumor, incluso a pesar de estos diversos procedimientos de tratamiento. Ademas, los determinantes asociados con celulas madre cancerosas a menudo consiguen pobres dianas terapeuticas debido a la baja o inconsistente expresion, incapacidad de permanecer asociados con la celula tumorigenica o la incapacidad de presentarse en la superficie celular. En agudo contraste con las ensenanzas de la tecnica anterior, los compuestos y procedimientos dados aqul a conocer superan efectivamente esta resistencia inherente y eliminan especlficamente, agotan, silencian o promueven la diferenciacion de tales celulas madre cancerosas negando as! su capacidad para mantener o volver a inducir el crecimiento del tumor subyacente. Ademas, dado que la expresion de la protelna DLL3 en gran medida se ha asociado con localizaciones intracelulares, tales como el aparato de Golgi, era incierto
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que los determinantes fenotlpicos pudieran ser explotados con exito como un objetivo terapeutico tal como se ensena en el presente documento.
[0042] Por lo tanto, es particularmente destacable que los moduladores de DLL3, tales como los descritos en el presente documento, se pueden usar ventajosamente en el pronostico, el diagnostico, el teragnostico, el tratamiento y/o la prevencion de trastornos de proliferacion seleccionados (por ejemplo, neoplasicos) en sujetos en necesidad del mismo. Se entendera que, mientras que los ejemplos preferidos de la descripcion seran discutidos extensamente a continuacion, particularmente en terminos de dominios, regiones o epltopos particulares o en el contexto de las celulas madre cancerosas o tumores que comprenden caracterlsticas neuroendocrinas y sus interacciones con los moduladores descritos, aquellos expertos en la tecnica entenderan que la presente descripcion no esta limitada por tales ejemplos. Mas bien, los ejemplos mas amplios de la presente descripcion son en terminos generales y expresamente dirigidos a moduladores de DLL3 (incluyendo moduladores conjugados) y su uso en el pronostico, el diagnostico, el teragnostico, el tratamiento y/o la prevencion de una variedad de trastornos asociados o mediados por DLL3, incluyendo trastornos neoplasicos o de celulas proliferativas, independientemente de cualquier mecanismo particular de accion o tumor, componente celular o molecular reconocido especlficamente.
[0043] A tal fin, y como se demuestra en la presente solicitud, inesperadamente se ha encontrado que los moduladores de DLL3 descritos pueden utilizarse eficazmente para atacar y eliminar o de otro modo incapacitar celulas proliferativas o tumorigenicas y tratar trastornos asociados a DLL3 (por ejemplo, neoplasia). Tal como se usa en el presente documento, un "trastorno asociado a DLL3" se emplea para referirse a cualquier trastorno o enfermedad (incluyendo trastornos proliferativos) que esta marcado, diagnosticado, detectado o identificado por una aberracion fenotlpica o genotlpica de componentes geneticos o la expresion de DLL3 ("determinante de DLL3") durante el curso o la etiologla de la enfermedad o trastorno. En este sentido, una aberracion o determinante fenotlpico de DLL3 puede, por ejemplo, comprender niveles elevados o reducidos de expresion de la protelna DLL3, la expresion anormal de protelna DLL3 en ciertas poblaciones de celulas definibles o la expresion anormal de protelna DLL3 en una fase o etapa inapropiada de un ciclo de vida de la celula. Por supuesto, se entendera que los patrones de expresion similares de determinantes genotlpicos (por ejemplo, los niveles de transcription de ARNm) de DLL3 tambien se pueden utilizar para clasificar, detectar o tratar trastornos de DLL3.
[0044] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "determinante" o "determinante de DLL3" significara cualquier rasgo, propiedad, marcador o factor detectable que esta asociado identificablemente con, o especlficamente se encuentra en o sobre una celula particular, poblacion de celulas o tejido, incluyendo los identificados en o sobre un tejido, celula o poblacion de celula afectado por una enfermedad o trastorno asociado a DLL3. En los ejemplos preferidos seleccionados los moduladores de DLL3 pueden asociarse, unirse o reaccionar directamente con el determinante DLL3 (por ejemplo, protelna de superficie celular DLL3 o ARNm de DLL3) y por lo tanto mejoran el trastorno. Mas generalmente, los determinantes pueden ser morfologicos, funcionales o bioqulmicos por naturaleza y pueden ser genotlpicos o fenotlpicos. En otros ejemplos preferidos, el determinante es un antlgeno de superficie celular o componente genetico que se expresa diferencialmente o preferiblemente (o no) por tipos celulares especlficos (por ejemplo, celulas madre cancerosas) o por celulas bajo ciertas condiciones (por ejemplo, durante los puntos especlficos del ciclo celular o celulas en un nicho particular). En aun otros ejemplos preferidos, el determinante puede comprender un gen o entidad genetica que esta regulado de manera diferente (por aumento o disminucion) en una celula especlfica o poblacion de celulas discretas, un gen que se modifica diferencialmente con respecto a su estructura flsica y composition qulmica o una protelna o una coleccion de protelnas asociadas flsicamente con un gen que muestran modificaciones qulmicas diferenciales. Los determinantes contemplados en este documento se indican especlficamente como positivos o negativos y pueden indicar una celula, subpoblacion de celulas o tejido (por ejemplo, tumores) por su presencia (positivo) o ausencia (negativo).
[0045] En una llnea similar "moduladores de DLL3" de la descripcion comprenden ampliamente cualquier compuesto que reconoce, reacciona, compite, antagoniza, interactua, se une, agoniza, o asociados con un DLL3 variante o isoforma (o especlficos dominios, regiones o epltopos de los mismos ) o su componente genetico Por estas interacciones, los moduladores de DLL3 pueden eliminar ventajosamente, reducir o moderar la frecuencia, la actividad, la recurrencia, metastasis o movilidad de celulas tumorigenicas (por ejemplo, celulas que perpetuan tumorales o celulas madre cancerosas). Los moduladores de ejemplo descritos en este documento comprenden nucleotidos, oligonucleotidos, polinucleotidos, peptidos o polipeptidos. En ciertos ejemplos preferidos los moduladores seleccionados comprenderan anticuerpos frente a una isoforma de protelna DLL3 o fragmentos inmunorreactivos o derivados de los mismos. Tales anticuerpos pueden ser antagonista o agonista en la naturaleza y pueden estar opcionalmente conjugado o asociado con un agente terapeutico o de diagnostico. Ademas, tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpo puede comprender ozono, neutralizar o anticuerpos de internalization. En otros ejemplos, los moduladores dentro de la presente descripcion constituiran una construction DLL3 que comprende una isoforma DLL3 o un fragmento reactivo del mismo. Se entendera que tales construcciones pueden comprender protelnas de fusion y pueden incluir dominios reactivos de otros polipeptidos tales como inmunoglobulinas o modificadores de la respuesta biologica. En aun otros ejemplos, el modulador de DLL3 comprendera un resto de acido nucleico (por ejemplo miARN, ARNip, ARNhc, construcciones antisentido, etc.) que ejerce los efectos deseados a nivel genomico. Todavla otros moduladores compatibles con las presentes ensenanzas seran discutidas en detalle a continuacion.
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[0046] Mas generalmente, los moduladores de DLL3 de la presente descripcion comprenden ampliamente cualquier compuesto que reconoce, reacciona, compite, antagoniza, interactua, se une, agoniza, o se asocia con un determinante DLL3 (genotlpica o fenotlpica) incluyendo la protelna DLL3 superficie celular. Cualquiera que sea la forma de modulador es en ultima instancia la selecciono preferiblemente estara en un estado aislado y purificado antes de la introduction en un sujeto. A este respecto el termino "modulador de DLL3 aislado" o "aislado anticuerpo DLL3" se interpretara en un sentido amplio y segun la practica farmaceutica estandar en el sentido de cualquier preparation o composition que comprende el modulador en un estado sustancialmente libre de contaminantes no deseados (biologica o de otra manera). Ademas, estas preparaciones se pueden purificar y formular en forma de deseada utilizando diversas tecnicas artrecognized. Por supuesto, se entendera que tales preparaciones "aislados" pueden ser intencionalmente formularse o combinarse con ingredientes inertes o activos como se desee para mejorar la comercial, de fabrication o de aspectos terapeuticos de producto acabado y proporcionar composiciones farmaceuticas. En un sentido mas amplio las mismas consideraciones generales se pueden aplicar a un "aislado" isoforma DLL3 o variante o un "aislada" de acido nucleico que codifica el mismo.
[0047] Ademas, se ha encontrado sorprendentemente que los moduladores que interactuan, asociando o union a dominios particulares DLL3, motivos o epltopos son especialmente eficaces en la elimination de celulas tumorigenicas y/o silenciar o atenuar las influencias de celulas madre cancerosas sobre el crecimiento tumoral o la propagation. Es decir, mientras moduladores que reaccionan o asociados con dominios que son proximal a la superficie celular (por ejemplo, uno de los dominios similares a EGF) son eficaces en el agotamiento o neutralizar celulas tumorigenicas inesperadamente se ha descubierto que los moduladores asociar o union a dominios, motivos o regiones que son relativamente mas distal a la superficie celular tambien son eficaces en la eliminacion de, neutralizar, ozono o el silenciamiento celulas tumorigenicas. En particular, y como se muestra en los ejemplos adjuntos, se ha descubierto que los moduladores que reaccionan, asociada o se unen a la DSL o las regiones N- terminales de la protelna DLL3 son sorprendentemente eficaces en la eliminacion o neutralization de celulas tumorigenicas incluyendo los que presentan caracterlsticas neuroendocrinas y/o celulas madre cancerosas. Esto es especialmente cierto de los moduladores de conjugados tales como, por ejemplo, conjugados de farmacos de anticuerpos anti-DLL3 que comprenden un agente citotoxico. Como tal, se entendera que ciertos ejemplos preferidos de la presente descripcion se refiere a compuestos, composiciones y procedimientos que comprenden moduladores de DLL3 que se asocian, se unen o reaccionan con una portion relativamente distal de DLL3 que incluye el dominio DSL y la region N-terminal .
[0048] Aunque la presente descripcion contempla expresamente el uso de cualquier modulador de DLL3 en el tratamiento de cualquier trastorno DLL3, incluyendo cualquier tipo de neoplasia, en ejemplos particularmente preferidos los moduladores descritos pueden ser usados para prevenir, tratar o diagnosticar tumores que comprenden caracterlsticas neuroendocrinas (genotlpica o fenotlpica) incluyendo tumores neuroendocrinos. Los "tumores neuroendocrinos canonicos” (NET) o verdaderos surgen del sistema endocrino dispersos y son tlpicamente muy agresivos. Los tumores neuroendocrinos se producen en el rinon, el tracto genitourinario (vejiga, prostata, ovario, cuello uterino y endometrio), tracto gastrointestinal (estomago, colon), tiroides (cancer medular de tiroides), y de pulmon (carcinoma de pulmon de celulas pequenas y carcinoma neuroendocrino de celulas grandes). Ademas, los moduladores descritos se pueden usar ventajosamente para tratar, prevenir o diagnosticar tumores de pseudo neuroendocrinos (pNET) que genotlpicamente o fenotlpicamente mlmico, comprender, parecerse o presentar rasgos comunes con los tumores neuroendocrinos canonicas. "tumores pseudoneuroendocrinos" son tumores que surgen de las celulas del sistema neuroendocrino difuso o de celulas en el que una cascada de diferenciacion neuroendocrina se ha reactivado de forma aberrante durante el proceso oncogenico. Tales pNET comparten habitualmente cierta genotlpico, fenotlpico o caracterlsticas bioqulmicas con tumores neuroendocrinos tradicionalmente definidos, incluyendo la capacidad para producir los subconjuntos de aminas biologicamente activas, neurotransmisores y hormonas peptldicas. Por consiguiente, para los fines de la presente invention, las frases "tumores que comprenden caracterlsticas neuroendocrinas" o "tumores que exhiben caracterlsticas neuroendocrinas" se llevan a cabo para comprender tanto los tumores neuroendocrinos y tumores neuroendocrinos de pseudo menos que dicten lo contrario por el contexto.
[0049] Ademas de la asociacion con tumores generalmente se discutio anteriormente, tambien hay indicios de fenotlpica o genotlpica asociacion entre las celulas seleccionadas de iniciar tumorales (TIC) y determinantes DLL3. En este sentido TICs seleccionados (por ejemplo, las celulas madre cancerosas) pueden expresar niveles elevados de protelna DLL3 cuando se compara con las celulas del tejido y no tumorigenicas normales (NTG), que en conjunto comprenden tlpicamente mucho de un tumor solido. Por lo tanto, los determinantes DLL3 pueden comprender un marcador de tumor asociado (o antlgeno o inmunogeno) y los moduladores descritos pueden proporcionar agentes eficaces para la detection y supresion de TIC y la neoplasia asociada debido a niveles alterados de las protelnas en las superficies celulares o en el microambiente tumoral. En consecuencia, los moduladores de DLL3, incluyendo antagonistas inmunorreactivos y anticuerpos que se asocian, se unen o reaccionan con las protelnas, puede reducir eficazmente la frecuencia de celulas iniciadoras del tumor y podrla ser util en la eliminacion de, ozono, incapacitante, reduciendo, la promotion de la diferenciacion de, o de otra manera se opone o la limitation de la capacidad de estas celulas iniciadoras del tumor a permanecer en estado latente y/o continuar para impulsar el crecimiento de tumores, metastasis o recurrencia en un paciente. En este sentido los expertos en la tecnica entenderan que la presente descripcion proporciona ademas moduladores de DLL3 y su uso en la reduction de la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores.
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II. Fisioloaia de DLL3
[0050] La ruta de senalizacion Notch, identificada por primera vez en C. elegans y Drosophila y posteriormente demostrado estar conservado evolutivamente de invertebrados a los vertebrados, participa en una serie de procesos biologicos fundamentales que incluyen el desarrollo embrionario normal, la homeostasis del tejido adulto, y el mantenimiento de celulas madre ( D'Souza et al, 2010;.. Liu et al, 2010). La senalizacion de Notch es crltica para una variedad de tipos de celulas durante la especificacion, el patron y la morfogenesis. Con frecuencia, esto ocurre a traves del mecanismo de la inhibicion lateral, en el que las celulas que expresan ligando (s) de Notch adoptan un destino de la celula por defecto, sin embargo, suprimen esta suerte en las celulas adyacentes a traves de la estimulacion de Notch de senalizacion (Sternberg, 1988, Cabrera 1990). Esta eleccion del destino celular binario mediada por la senalizacion de Notch se encuentra para desempenar un papel en numerosos tejidos, incluyendo el sistema nervioso en desarrollo, los hematopoyeticas e inmunes sistemas (Bigas y Espinosoa, 2012 (de la Pompa et al., 1997); Hoyne et al 2011; Nagase et al, 2011), el intestino (Fre et al, 2005; Fre et al, 2009), el pancreas endocrino (Apelqvist et al., 1999; Jensen et al, 2000), la hipofisis, y el sistema neuroendocrino difuso (Raetzman et al., 2004) (Ito et al, 2000; Schonhoff et al, 2004). Un mecanismo generalizado para la aplicacion de este interruptor binario aparece conserva a pesar de la amplia gama de sistemas de desarrollo en la que Notch desempena un papel en las celulas donde la eleccion del destino celular predeterminado se determina por los reguladores transcripcionales conocidas como protelnas helice-bucle-helice basico (bHLH) , la senalizacion Notch conduce a la activacion de una clase de genes de respuesta Notch, que a su vez inhiben la actividad de las protelnas bHLH (Ball, 2004). Estas decisiones binarias tienen lugar en el contexto mas amplio de senales de desarrollo y de senalizacion que permiten la senalizacion de Notch para efectuar la proliferacion o inhibirla, y para activar la auto-renovacion o inhibirla.
[0051] En Drosophila, la senalizacion de Notch esta mediada principalmente por el gen receptor de una muesca y dos genes de ligandos, conocido como Serrate y Delta (Wharton et al, 1985; Rebay et al., 1991). En los seres humanos, hay cuatro receptores conocidos Notch y cinco DSL (Delta-Serrate LAG2) Ligandos - dos homologos de Serrate, conocido como Jagged1 y Jagged 2, y tres homologos de Delta, denominadas Uganda de tipo delta o DLL1, DLL3 y DLL4 . En general, los receptores Notch en la superficie de la celula de recepcion de senal se activan por las interacciones con ligandos expresados en la superficie de una celula opuesta, de envlo de la senal (denominado un trans-interaccion). Estos trans interacciones conducen a una secuencia de las divisiones de la proteasa mediada del receptor Notch. En consecuencia, el dominio intracelular del receptor Notch es libre de trasladar desde la membrana hasta el nucleo, donde se asocia con la familia de factores de transcripcion CSL (RBPJ en los seres humanos) y los convierte de represores transcripcionales en activadores de Notch genes de respuesta.
[0052] De los ligandos de Notch humano, DLL3 es diferente en que parece incapaz de activar el receptor Notch via trans-interacciones (Ladi et al., 2005). Los ligandos Notch tambien pueden interactuar con los receptores Notch en cis (en la misma celda) que conducen a la inhibicion de la senal Notch, aunque los mecanismos exactos de cis- inhibicion siguen sin estar claros y pueden variar dependiendo del ligando (por ejemplo, vease Klein et al. , 1997; Ladi et al, 2005;.. Glittenberg et al, 2006). Dos modos hipoteticos de la inhibicion incluyen la senalizacion de Notch de modulacion en la superficie celular mediante la prevencion de trans-interacciones, o mediante la reduccion de la cantidad de receptor Notch en la superficie de la celula por perturbar el procesamiento del receptor o al causar flsicamente retencion del receptor en el retlculo endoplasmatico o aparato de Golgi (Sakamoto et al, 2002; Dunwoodie, 2009). Esta claro, sin embargo, que las diferencias estocasticas en la expresion de receptores Notch y ligandos en las celulas vecinas puede ser amplificada a traves de ambos procesos de transcripcion y no de la transcripcion, y los saldos sutiles de cis y trans interacciones puede resultar en una regulacion fina de la Notch delineacion mediada de celulas destinos divergentes en los tejidos vecinos (Sprinzak et al., 2010).
[0053] DLL3 (tambien conocido como tipo Delta 3 o SCDO1) es un miembro de la familia de tipo Delta de ligandos DSL de Notch. Los ortologos de protelnas DLL3 representativos incluyen, pero no se limitan a, humanos (Nums. De Acceso NP_058637 y NP_982353), chimpance (N° de Acceso XP_003316395), raton (n° de acceso NP_031892) y de rata (N° de acceso NP_446118). En los seres humanos, el gen DLL3 consta de 8 exones que abarcan 9,5 kpb localizado en el cromosoma 19q13. El splicing alternativo dentro del ultimo exon da lugar a dos transcritos procesados, uno de 2389 bases (N° de Acceso NM_016941; figura 1A, SEQ ID NO: 1) y uno de 2052 bases (N° de acceso NM_203486; Figura.. 1B, SEQ ID NO: 2). El primer transcrito codifica una protelna de 618 aminoacidos (n° de acceso NP_058637; Figura 1C, SEQ ID NO:.. 3), mientras que el ultimo codifica una protelna de acido 587 amino (n° de acceso NP_982353; figura 1D, SEC ID NO: 4). Estas dos isoformas de la protelna de DLL3 comparten una identidad global del 100% a traves de sus dominios extracelulares y sus dominios transmembrana, que solo difieren en que la isoforma mas larga contiene una cola citoplasmica prolongada que contiene 32 residuos adicionales en el extremo carboxi de la protelna (Fig. 1E). La relevancia biologica de las isoformas no esta claro, aunque ambas isoformas se pueden detectar en las celulas tumorales (Fig. 5). Las identidades en porcentaje para cada uno de los miembros de la familia de tipo delta de las protelnas en los seres humanos se muestran en la Fig. 2A, as! como especies cruzadas identidades en la Fig. 2B.
[0054] En general, los ligandos de DSL se componen de una serie de dominios estructurales: un unico dominio N- terminal, seguido de un dominio conservado DSL, factor de crecimiento epidermico multiple en tandem con repeticiones de tipo (BGF), un dominio transmembrana, y un citoplasmatica dominio no altamente conservadas a
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traves de ligandos pero que contiene varios restos de lisina que son sitios potenciales para la ubiquitinacion por Unique ubiquitina ligasas E3. El dominio DSL es un domonio de EGF degenerado que es necesaria pero no suficiente para la interaccion con los receptores Notch (Shimizu et al., 1999). Ademas, las dos primeras repeticiones similares a EGF de la mayorla de ligandos DSL contienen un motivo de secuencia de la protelna mas pequena conocida como un dominio DOS que co-operativamente interactua con el dominio DSL al activar la senalizacion de Notch.
[0055] La Figura 1F proporciona un diagrama esquematico de la region extracelular de la protelna DLL3, que ilustra la yuxtaposicion general de los seis dominios de tipo BGF, el dominio DSL unico y el dominio N-terminal. En general, los dominios EGF se reconocen como ocurre en aproximadamente los residuos de aminoacidos 216 a 249 (dominio 1), 274-310 (dominio 2), 312-351 (dominio 3), 353-389 (dominio 4), 391-427 ( dominio 5) y 429-465 (dominio 6), con el dominio DSL en residuos de acido sobre aminoacidos 176-215 y el dominio N-terminal a unos residuos de aminoacidos 27-175 de hDLL3 (SEQ ID NOS: 3 y 4). Como se discute en mas detalle en este documento y se muestra en el Ejemplo 10 a continuacion, cada uno de los dominios similares a EGF, el dominio DSL y el dominio N- terminal comprenden parte de la protelna DLL3 como se define por una secuencia de aminoacidos distinta. Tenga en cuenta que, para los fines de la presente descripcion los respectivos dominios similares a EGF pueden denominarse EGF1 a EGF6 con EGF1 siendo mas cercana a la porcion N-terminal de la protelna. En lo que se refiere a la composicion estructural de la protelna un aspecto significativo de la presente descripcion es que los moduladores de DLL3 descritos pueden ser generados, fabricados, disenados o seleccionados de modo que reaccionen con un dominio, motivo o epltopo seleccionado. En ciertos ejemplos, tales moduladores especlficos de sitio pueden proporcionar una mayor reactividad y/o la eficacia en funcion de su modo de accion principal.
[0056] Observese que, como se usa en el presente documento los terminos "protelna madura" o "polipeptido maduro" como se usa aqul se refiere a la forma (s) de la protelna producida por expresion en una celula de mamlfero. En general se la hipotesis de que una vez se ha iniciado la exportacion de una cadena de protelna creciente a traves del retlculo endoplasmico rugoso, las protelnas secretadas por celulas de mamlferos tienen una secuencia de peptido senal (SP) que se escinde del polipeptido completo para producir una forma "madura" de la protelna. En ambas isoformas de DLL3 la protelna madura comprende un peptido senal de 26 aminoacidos que puede ser cortada antes de la expresion de la superficie celular. Asl, en protelnas maduras del dominio N-terminal se extendera desde la posicion 27 en la protelna hasta el comienzo del dominio DSL. Por supuesto, si la protelna no se procesa de esta manera el dominio N-terminal se llevarla a cabo para extender para posicionar una de las SEQ ID NOS: 3 y 4.
[0057] De los diversos ligandos de tipo delta, DLL3 es el mas divergente de los otros en la familia, ya que contiene un dominio degenerada DSL, no hay motivos DOS, y un dominio intracelular que carece de residuos de lisina. La DSL degenerada y la falta de motivos DOS son consistentes con la incapacidad de DLL3 para activar la senalizacion de Notch en trans (entre las celulas), lo que sugiere que DLL3, a diferencia de DLL1 o DLL4, solo actua como un inhibidor de la senalizacion de Notch (Ladi et al., 2005 ). Los estudios han demostrado que DLL3 puede ser residente principalmente en el cis-Golgi (Geffers et al., 2007), lo cual serla consistente con una capacidad hipotetica para retener receptor Notch intracelularmente, o para interferir con el procesamiento de los receptores Notch, la prevencion de la exportacion a la superficie de la celula y en su lugar reorientacion al lisosoma (Chapman et al., 2011). Algunos protelna DLL3 puede aparecer en la superficie celular, sin embargo, cuando la protelna se sobreexpresa artificialmente en sistemas modelo (Ladi et al., 2005), pero no es obvio que este serla el caso en contextos biologicos normales ni en tumores en los que la transcripcion de ARNm de DLL3 es elevado; algo sorprendente, los niveles de protelna detectados en tipos de tumores descritos en este documento indican significativa protelna DLL3 esta escapando a la superficie celular de diversos tumores.
[0058] Los defectos en el gen DLL3 se han relacionado con disostosis espondilocostal en los seres humanos, un nacimiento congenita grave detect resulta en la formacion vertebras y costillas anormalidades anormales (Dunwoodie, 2009). Esto esta relacionado con alteraciones en la senalizacion Notch, sabe que juega un papel crucial en la determination de la polaridad y los patrones de somitas, los precursores embrionarios a las vertebras que requieren una interaccion oscilante finamente regulada entre Notch, Wnt, y las rutas de senalizacion de FGF para el desarrollo adecuado (Kageyama et al, 2007;. Goldbeter y Pourquie, 2008). Aunque DLL1 y DLL3 se expresan tlpicamente en localizaciones similares dentro del embrion de raton en desarrollo, los experimentos con ratones transgenicos han demostrado que DLL3 no compensa DLL1 (Geffers et al., 2007). Ratones knock-out en DLL1 son embriones letales, pero los ratones mutantes con DLL3 sobreviven aunque muestran un fenotipo similar al encontrado en humanos con disostosis espondilocostal (Kusumi et al, 1998;. Shinkal et al., 2004). Estos datos son consistentes con los resultados de un sutil juego de trans- y cis-Notch interacciones cruciales para el desarrollo normal.
[0059] Ademas, como se discutio anteriormente, la senalizacion Notch desempena un papel en el desarrollo y mantenimiento de las celulas neuroendocrinas y tumores que exhiben caracterlsticas neuroendocrinas. En este sentido, la senalizacion de Notch esta implicada en una amplia gama de decisiones del destino celular en los organos endocrinos normales y en el sistema neuroendocrino difuso. Por ejemplo, en el pancreas, se requiere la senalizacion de Notch para suprimir el desarrollo de un fenotipo endocrino predeterminado mediada por el factor de transcripcion bHLH Ngn3 (Habener et al, 2005). Similar Notch mediada por la supresion de destinos de celulas
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endocrinas se produce en las celulas enteroendocrinas (Schonhoff et al., 2004), las celulas parafoliculares del tiroides (Cook et al., 2010), en la especificacion de las proporciones relativas de los tipos de celulas neuroendocrinas en la pituitaria (Dutta et al. , 2011), y es probable que participan en las decisiones de celulas dentro de los pulmones para adoptar una neuroendocrino o fenotipo no neuroendocrino (Chen et al., 1997;. Ito et al, 2000;. Sriuranpong et al, 2002). Por lo tanto, es evidente que en muchos tejidos, la supresion de la senalizacion de Notch esta vinculada a fenotipos neuroendocrinos.
[0060] La reactivacion inapropiada de las vlas de senalizacion en el desarrollo o desregulacion de las vlas de senalizacion normales se observan habitualmente en los tumores, y en el caso de la senalizacion de Notch, se han asociado con numerosos tipos de tumores (Koch y Radtke, 2010; Harris et al, 2012). La via de Notch se ha estudiado como un oncogen en los linfomas, colorrectal, de pancreas, y algunos tipos de cancer de pulmon de celulas no pequenas (ver Zarenczan y Chen, 2010 y referencias en el). En contraste, se informo de Notch para actuar como un supresor de tumores en tumores con caracterlsticas neuroendocrinas (vease Zarenczan y Chen, 2010 supra). Los tumores con caracterlsticas neuroendocrinas surgen con frecuencia en una amplia gama de sitios primarios, y aunque su clasificacion exhaustiva sigue siendo problematica (Yao et al, 2008; Klimstra et al, 2010; Kloppel de 2011), que se pueden clasificar en cuatro tipos principales: carcinoides benignos de bajo grado, de grado bajo bien diferenciados los tumores neuroendocrinos con comportamiento maligno, tumores con neuroendocrino mixto y caracterlsticas epiteliales, y de alto grado carcinomas neuroendocrinos pobremente diferenciados. De estas clasificaciones, los carcinomas neuroendocrinos pobremente diferenciados, que incluyen cancer de pulmon de celulas pequenas (SCLC) y subconjuntos de cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC), son tipos de cancer con un pronostico pesimo. Se ha postulado que SCLC es broncogenico en el origen, que surge en parte de las celulas neuroendocrinas pulmonares (Galluzzo y bocchetta, 2011). Cualquiera que sea la fuente celular de origen especlfica para cada uno de estos tumores que poseen un fenotipo neuroendocrino, se puede esperar que la supresion de la senalizacion de Notch, ya sea por lesiones directas en los propios genes de la ruta Notch, o por la activacion de otros genes que suprimen la senalizacion de Notch, puede conducir a la adquisicion del fenotipo neuroendocrino de estos tumores. Por extension, los genes que conducen a la perturbacion de la via de Notch pueden permitirse dianas terapeuticas para el tratamiento de tumores neuroendocrinos con fenotipos, en particular para las indicaciones que actualmente tienen pobres resultados cllnicos.
[0061] ASCL1 es un tal gen que parece interactuar con la via de senalizacion Notch traves DLL3. Esta claro que muchos tumores neuroendocrinos muestran un fenotipo pobremente diferenciado (es decir, parcialmente completo) endocrino; (calcitonina, CALCA; propiomelanocorin, POMC; somatostatina, SST por ejemplo cromogranina A, CHGA), protelnas asociadas con veslculas de secrecion (por ejemplo, sinaptofisina, SYP), y genes implicados en, por ejemplo, la elevacion o la expresion de diversas protelnas endocrinas y polipeptidos marcados las vlas bioqulmicas responsables de la slntesis de aminas bioactivos (por ejemplo, la dopa decarboxilasa, DDC). Quizas no sea sorprendente, estos tumores con frecuencia sobre-expresa ASCL1 (tambien conocidos como Mash1 en ratones, o hash1 en los seres humanos), un factor de transcripcion conocido para desempenar un papel en la orquestacion de cascadas de genes que conducen a fenotipos neuronales y neuroendocrinos. Aunque los detalles moleculares especlficos de la cascada permanecen Ill-definido, es cada vez mas claro que, para ciertos tipos de celulas, particularmente celulas de tiroides parafoliculares (Kameda et al., 2007), las celulas de la medula suprarrenal cromafines (Huber et al., 2002) y celulas que se encuentran en el sistema neuroendocrino difuso del pulmon (Chen et al., 1997; Ito et al, 2000; Sriuranpong et al., 2002), ASCL1 es parte de un bucle de regulacion del desarrollo finamente sintonizado en el que las decisiones del destino celular son mediada por el equilibrio de las cascadas de ASCL1 mediada y la expresion de genes Notch mediada (Fig. 3). Por ejemplo, se encontro ASCL1 en que se expresa en celulas neuroendocrinas pulmonares de ratones normales, mientras que el efector de la senalizacion de Notch HES1, se expreso en celulas no neuroendocrinos pulmonares (Ito et al., 2000). Que estos dos cascadas estan en un delicado equilibrio con el potencial de regulacion cruzada se aprecia cada vez. El HES1 Notch efector se ha demostrado que regular a la baja la expresion ASCL1 (Chen et al, 1997; Sriuranpong et al., 2002). Estos resultados demuestran claramente que la senalizacion Notch puede suprimir la diferenciacion neuroendocrina. Sin embargo, la demostracion de que ASCL1 vinculante para el promotor DLL3 activa la expresion DLL3 (Henke et al., 2009) y la observacion de que DLL3 atenua Notch senalizacion (Ladi et al., 2005) cierra el circuito genetica para elecciones destino celular entre neuroendocrino y no fenotipos neuroendocrinos.
[0062] Dado que la senalizacion Notch parece haber evolucionado para amplificar las diferencias sutiles entre las celulas vecinas para permitir dominios de tejido claramente delimitada con rutas de diferenciacion divergentes (por ejemplo, "inhibicion lateral", tal como se describe mas arriba), estos datos juntos sugieren que una finamente sintonizado desarrollo bucle de regulacion (Fig. 3) se ha convertido reactivado y desregulada en los canceres con fenotipos neuroendocrinos. Si bien no es obvio que DLL3 proporcionarla un objetivo de superficie celular adecuado para el desarrollo de anticuerpos terapeuticos dada su residencia normal dentro de los compartimentos membranosos interior de la celula (Geffers et al., 2007) y sus supuestas interacciones con Notch en el mismo, es posible que la elevacion resultante de la expresion DLL3 en los tumores neuroendocrinos puede ofrecer un objetivo terapeutico unico para los tumores con el fenotipo neuroendocrino (por ejemplo, NET y pNET). Se observa habitualmente que vasta sobreexpresion de protelnas en sistemas de laboratorio puede causar mislocalization de la protelna sobreexpresada dentro de la celula. Por lo tanto es una hipotesis razonable, sin embargo, no es obvio sin verificacion experimental, que la sobreexpresion de DLL3 en tumores puede conducir a una cierta expresion en la superficie celular de la protelna, y por lo tanto presentan una diana para el desarrollo de anticuerpos terapeuticos.
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III. Celulas madre cancerosas
[0063] Como se ha aludido anteriormente, sorprendentemente se ha descubierto que la expresion aberrante DLL3 (genotlpica y/o fenotlpica) se asocia con diversas subpoblaciones de celulas tumorigenicas. A este respecto, la presente descripcion proporciona moduladores de DLL3 que pueden ser particularmente utiles para dirigir tales celulas, y especialmente de un tumor celulas perpetuar, facilitando de este modo el tratamiento, gestion o prevencion de trastornos neoplasicos. Asl, en ejemplos preferidos moduladores de determinantes DLL3 (fenotlpica o (genotlpica) puede utilizarse ventajosamente para reducir tumor iniciar la frecuencia de celulas segun las presentes ensenanzas y facilitar asl el tratamiento o manejo de trastornos proliferativos.
[0064] Para los fines de la presente solicitud el termino "celula iniciadora de tumor" (TIC) abarca tanto "celulas que perpetuan el tumor" (TPC, es decir, las celulas madre cancerosas o CSC) como "celulas progenitoras tumorales" altamente proliferativas (denominado tProg), que en conjunto comprenden generalmente una subpoblacion unica (es decir, 0,1-40%) de un tumor a granel o en masa. Para los fines de la presente descripcion los terminos "celulas tumorales perpetuar" y "celulas madre cancerosas" o "celulas madre neoplasicas" son equivalentes y se pueden usar indistintamente en el presente documento. TPC diferir de tProg en que el TPC puede recapitular completamente la composicion de las celulas tumorales existentes dentro de un tumor y tienen la capacidad de auto- renovacion ilimitada como se demuestra por el trasplante de serie (dos o mas pasajes a traves de ratones) de numeros bajos de celulas aisladas, mientras que tProg no lo hara mostrar la capacidad de autorrenovacion ilimitada.
[0065] Los expertos en la tecnica entenderan que celulas activadas por fluorescencia (FACS) usando marcadores de superficie celular adecuado es un procedimiento fiable para aislar subpoblaciones de celulas madre cancerosas altamente enriquecido (por ejemplo,> 99,5% de pureza) debe, al menos en parte, a su capacidad para discriminar entre las celulas individuales y grupos de celulas (es decir, dobletes, etc.). Usando tales tecnicas se ha demostrado que cuando el numero de celulas bajos de celulas tProg altamente purificados se transplantan en ratones inmunocomprometidos que pueden estimular el crecimiento del tumor en un trasplante primario. Sin embargo, a diferencia de las subpoblaciones de TPC purificadas los tumores generados por tProg no reflejan completamente el tumor parental en la heterogeneidad celular fenotlpica y son demostrablemente ineficiente en reiniciar la tumorigenesis de serie en los trasplantes posteriores. En contraste, las subpoblaciones TPC reconstituir completamente la heterogeneidad celular de los tumores parentales y pueden iniciar de manera eficiente los tumores cuando se alslan en serie y trasplantado. Por lo tanto, los expertos en la tecnica reconoceran que una diferencia definitiva entre TPC y tProg, aunque ambos pueden ser de generacion de tumor en los trasplantes primarios, es la capacidad unica de TPC para alimentar perpetuamente el crecimiento del tumor heterogeneo en el trasplante de serie en los numeros de celulas bajos. Otros enfoques comunes para caracterizar TPC implican la morfologla y el examen de los marcadores de superficie celular, el perfil transcripcional, y la respuesta al farmaco, aunque la expresion del marcador puede cambiar con las condiciones de cultivo y con el paso llnea celular in vitro.
[0066] Por consiguiente, para los fines de la invention tumor instantanea celulas perpetuar, como las celulas madre normales que soportan jerarqulas celulares en el tejido normal, se definen preferiblemente por su capacidad de auto- renovacion de manera indefinida mientras se mantiene la capacidad de diferenciacion multilinaje. Las celulas que perpetuan tumores son por lo tanto capaces de generar tanto la progenie tumorigenico (es decir, celulas iniciadoras de tumores: TPC y tProg) y la progenie no tumorigenia (NTG). Tal como se usa en el presente documento una "celula no tumorigenicos" (NTG) se refiere a una celula tumoral que surge de las celulas iniciadoras de tumores, pero no en si tienen la capacidad de auto-renovacion o generar los linajes heterogenea de celulas tumorales que comprenden un tumor. Experimentalmente, las celulas NTG son incapaces de formar de manera reproducible tumores en ratones, incluso cuando se trasplantan en el numero de celulas en exceso.
[0067] Como se indica, tProg tambien se clasifican como celulas iniciadoras del tumor (o TIC) debido a su limitada capacidad para generar tumores en ratones. TPROG son progenie de TPC y son capaces tlpicamente de un numero finito de divisiones celulares no auto-renovacion. Ademas, las celulas tProg ademas pueden dividirse en celulas progenitoras tempranas tumor (PTE) y celulas progenitoras tarde tumor (LTP), cada uno de los cuales puede ser distinguido por el fenotipo (por ejemplo, marcadores de superficie celular) y diferentes capacidades para recapitular arquitectura de celulas tumorales. A pesar de tales diferencias tecnicas, tanto ETP y LTP difieren funcionalmente de TPC en que son en general menos capaces de reconstituir en serie tumores cuando se trasplantan a bajo numero de celulas y tlpicamente no reflejan la heterogeneidad del tumor parental. No obstante las distinciones anteriores, tambien se ha demostrado que diversas poblaciones tProg pueden, en raras ocasiones, el aumento de las capacidades de auto-renovacion que normalmente se atribuyen a las celulas madre y de ellos mismos convertirse en TPC (o CSC). En cualquier caso los dos tipos de celulas iniciadoras del tumor es probable representados en la masa tumoral tlpica de un solo paciente y estan sujetos a tratamiento con los moduladores como se describen en este documento. Es decir, las composiciones descritas son generalmente eficaces en la reduction de la frecuencia o la alteration de la quimiosensibilidad de tales celulas iniciadoras de tumores positivos DLL3 independientemente de la realization particular o mezcla representados en un tumor.
[0068] En el contexto de la presente invencion, TPC son mas tumorigenico, relativamente mas quiescente y con frecuencia mas quimiorresistente que el tProg (tanto ETP y LTP), celulas de NTG y las celulas derivadas no TPC
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infiltrantes de tumor (por ejemplo, fibroblastos/celulas del estroma, endoteliales y hematopoyeticas) que comprenden el grueso de un tumor. Dado que las terapias y regimenes convencionales han, en gran parte, han disenado para ambos tumores reducir el volumen y atacar a las celulas que proliferan rapidamente, TPC es probable que sean mas resistentes a las terapias y regimenes que el tProg proliferacion mas rapida y otras poblaciones de celulas tumorales a granel convencionales. Ademas, TPC a menudo expresan otras caracteristicas que los hacen relativamente quimiorresistente a las terapias convencionales, tales como aumento de la expresion de los transportadores de resistencia a multiples farmacos, los mecanismos de reparacion de ADN mejorada y las proteinas anti- apoptoticas. Estas propiedades, cada uno de los cuales contribuyen a la tolerancia a las drogas por TPC, constituyen una razon clave para el fracaso de los regimenes de tratamiento de oncologia estandar para garantizar el beneficio a largo plazo para la mayoria de pacientes con neoplasia etapa avanzada; es decir, la falta de orienten de manera adecuada y erradicar las celulas que combustible continuo el crecimiento del tumor y la recidiva (es decir, TPC o CSC).
[0069] A diferencia de muchos tratamientos de la tecnica anterior, las nuevas composiciones de la presente invencion reducen preferiblemente la frecuencia de celulas iniciadoras del tumor tras la administration a un sujeto independientemente de la forma o diana especifica (e, g., material genetico, anticuerpo DLL3 o construction de fusion de ligando) del modulador seleccionado. Como se senalo anteriormente, la reduction en la initiation de la frecuencia de celulas tumorales se puede producir como resultado de a) la elimination, el agotamiento, la sensibilization, silenciando o inhibition de las celulas iniciadoras de tumores; b) controlar el crecimiento, la expansion o la repetition de las celulas iniciadoras de tumores; c) interrumpir la iniciacion, propagation, mantenimiento, o la proliferacion de las celulas iniciadoras de tumores; o d) al obstaculizar de otro modo la supervivencia, la regeneration y/o metastasis de las celulas oncogenicas. En algunas realizaciones, la reduccion en la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores se produce como resultado de un cambio en una o mas vias fisiologicas. El cambio en la via, ya sea por reduccion o eliminacion del tumor iniciar las celulas o mediante la modification de su potencial (por ejemplo, la diferenciacion inducida, nicho de interruption) o de otra manera interferir con su capacidad para influir en el ambiente del tumor u otras celulas, a su vez permite la tratamiento mas eficaz de trastornos asociados a DLL3 mediante la inhibicion de tumorigenesis, mantenimiento tumor y/o metastasis y la recurrencia.
[0070] Entre los procedimientos reconocidos en la tecnica que se pueden utilizar para evaluar tal reduccion en la frecuencia de celulas iniciadoras del tumor esta el analisis de dilution limitada, ya sea in vitro o in vivo, preferiblemente seguido por enumeration utilizando estadisticas de distribution de Poisson o la evaluation de la frecuencia de sucesos predefinidos definitivos, tales como la capacidad de generar tumores in vivo o no. Aunque este tipo de analisis de dilucion limitante comprende procedimientos preferidos de calculo de reduccion de la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores, procedimientos menos exigentes tambien se pueden usar para determinar de manera efectiva los valores deseados, aunque ligeramente con menor precision, y son totalmente compatibles con las ensenanzas del presente documento. Por lo tanto, como se entendera por los expertos en la tecnica, tambien es posible determinar la reduccion de valores de frecuencia a traves de citometria de flujo conocida o por medios inmunohistoquimicos. En cuanto a todos los procedimientos anteriormente mencionados, vease, por ejemplo, Dylla et al. 2008, PMID: 18560594 y Hoey et al. 2009, PMID: 19664991.
[0071] Con respecto al analisis de dilucion limitante, enumeracion in vitro de la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores puede lograrse mediante el deposito de cualquiera de las celulas tumorales humanas fraccionadas o no fraccionadas (por ejemplo, de tumores tratados y sin tratar, respectivamente) en condiciones de crecimiento in vitro de que la formation de colonias de crianza. De esta manera, colonia celulas formadoras podria ser enumerado por recuento simple y caracterizacion de las colonias, o por analisis consiste en, por ejemplo, la deposition de las celulas tumorales humanas en placas en diluciones seriadas y anotando cada pocillo como positivo o negativo para la formacion de colonias al menos 10 dias despues de la siembra. Los experimentos o analisis de dilucion limitante in vivo, que son generalmente mas preciso en su capacidad para determinar tumor iniciar la frecuencia de celulas abarcan el transplante de celulas tumorales humanas, a partir de poblaciones o bien de control sin tratar o tratadas, por ejemplo, en ratones inmunocomprometidos en diluciones seriadas y posteriormente meter cada raton como positivo o negativo para la formacion de tumores al menos 60 dias despues del trasplante. La derivation de valores de frecuencia celular mediante analisis de dilucion limitante in vitro o in vivo se realiza preferiblemente mediante la aplicacion de estadisticas de distribucion de Poisson para la frecuencia conocida de acontecimientos positivos y negativos, proporcionando de este modo una frecuencia para eventos que cumplen la definition de un evento positivo; en este caso, colonia o la formacion de tumores, respectivamente.
[0072] En cuanto a otros procedimientos compatibles con la presente invencion que pueden usarse para calcular la frecuencia de celulas iniciadoras de tumor, los mas habituales comprenden tecnicas de citometria de flujo cuantificables y procedimientos de tincion inmunohistoquimica. Aunque no es tan precisa como las tecnicas de analisis de dilucion limitante descritas inmediatamente antes, estos procedimientos son mucho menos laboriosos y proporcionan valores razonables en un marco de tiempo relativamente corto. Por lo tanto, se entendera que un experto en la materia puede utilizar la citometria de flujo de superficie celular para la determination del perfil de marcador empleando uno o mas anticuerpos o reactivos que se unen a proteinas de la superficie celular reconocidos en la tecnica por enriquecer celulas iniciadoras de tumores (por ejemplo, marcadores potencialmente compatibles como se establecen en la publication PCT WO2012/031280) y de ese modo medir los niveles de TIC de diversas
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muestras. En todavla otro procedimiento compatible los expertos en la tecnica podrlan enumerar la frecuencia de TIC in situ (por ejemplo, en una seccion de tejido) por inmunohistoqulmica usando uno o mas anticuerpos o reactivos que son capaces de unirse a protelnas de superficie celular que se cree que desmarcan estas celulas.
[0073] Los expertos en la tecnica reconoceran que numerosos marcadores (o su ausencia) se han asociado con varias poblaciones de celulas madre cancerosas y se utilizan para aislar o caracterizar subpoblaciones de celulas tumorales. A este respecto, los marcadores de celulas madre cancerosas de ejemplo comprenden OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, receptor de transferrina, JAM3, carboxipeptidasa M, ADAM9, oncostatina M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, nestina, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, b-catenina, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, decorin, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, y CD49f. Vease, por ejemplo, Schulenburg y otros, 2010, PMID: 20185329, USPN 7.632.678 y USPNs. 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 y 2011/0020221.
[0074] Se entendera ademas que cada uno de los marcadores antes mencionados tambien pueden usarse como un antlgeno diana secundario en el contexto de anticuerpos biespeclficos o multiespeclficos de la presente descripcion.
[0075] De manera similar, los ejemplos no limitantes de los fenotipos de la superficie celular asociados con celulas
madre cancerosas de ciertos tipos de tumores incluyen CD44hiCD24low, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+ CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138- CD34-CD19+, CD133+RC2+,
CD44+a2b1hiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+, as! como otros fenotipos de la superficie celular madre de cancer que son conocidos en la tecnica. . Vease, por ejemplo, Schulenburg et al, 2010, supra, Visvader et al, 2008, PMID: 18784658 y USPN 2008/0138313.
[0076] Los expertos en la tecnica entenderan que los fenotipos marcadores tal como los ejemplificados inmediatamente anteriormente se pueden usar en conjuncion con el analisis de citometrla de flujo estandar y tecnicas de clasificacion celular para caracterizar, aislar, purificar o enriquecer celulas TIC y/o TPC o poblaciones de celulas para su posterior analisis. De interes con respecto a la presente invencion CD46, CD324 y, opcionalmente, CD66c se expresan altamente o heterogeneamente en la superficie de muchas celulas tumorales colorrectales ("CR"), de mama ( "BR"), de pulmon no microcltico (CPNM), de pulmon de celulas pequenas (SCLC), de pancreas ("PA"), de melanoma ("Mel"), de ovario ("OV"), y de cancer de cabeza y cuello ("HN") humanas, independientemente de si las muestras de tumor analizadas fueron muestras tumorales primarias del paciente o tumores NTX derivados del paciente.
[0077] Usando cualquiera de los procedimientos anteriormente referenciados y marcadores seleccionados tal como se conoce en la tecnica (y se muestra en el Ejemplo 17 a continuation) es posible cuantificar la reduction de la frecuencia de TIC (o el TPC en el mismo) proporcionado por los moduladores de DLL3 descritos (incluidos los conjugados con agentes citotoxicos) segun las ensenanzas del presente documento. En algunos ejemplos, los compuestos de la presente descripcion pueden reducir la frecuencia de TIC o TPC (mediante una variedad de mecanismos senalados anteriormente, incluyendo la elimination, la diferenciacion inducida, interruption de nicho, silenciamiento, etc.) en un 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o incluso un 35%. En otros ejemplos, la reduccion en la frecuencia de TIC o TPC puede ser del orden de 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65%. En ciertos ejemplos, los compuestos descritos reducen la frecuencia de TIC o TPC en un 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o incluso 95%. Por supuesto, se entendera que cualquier reduccion de la frecuencia de la TIC o TPC probable resulta en una reduccion correspondiente de la tumorigenicidad, la persistencia, la recidiva y la agresividad de la neoplasia.
IV. Moduladores de DLL3
[0078] En cualquier caso, la presente descripcion esta dirigida a la utilization de moduladores de DLL3, incluyendo antagonistas DLL3, para el diagnostico, teragnostico, tratamiento y/o profilaxis de diversos trastornos, como uno cualquiera de una serie de tumores malignos asociados a DLL3. Los moduladores descritos pueden ser utilizados solos o en conjuncion con una amplia variedad de compuestos contra el cancer tales como agentes quimioterapeuticos o inmunoterapeuticos (por ejemplo, anticuerpos terapeuticos) o modificadores de la respuesta biologica. En otros ejemplos seleccionados, dos o mas moduladores de DLL3 discretos pueden ser utilizados en combination para proporcionar efectos antineoplasicos mejorados o pueden ser utilizados para fabricar constructos multiespeclficos.
[0079] En ciertos ejemplos, los moduladores de DLL3 de la presente invencion incluiran los nucleotidos, oligonucleotidos, polinucleotidos, peptidos o polipeptidos. Mas particularmente, los moduladores de ejemplo de la descripcion pueden comprender anticuerpos y de union a antlgenos fragmentos o derivados de los mismos,
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protelnas, peptidos, glicoprotelnas, glicopeptidos, glicollpidos, polisacaridos, oligosacaridos, acidos nucleicos, constructos antisentido, ARNip, miARN, moleculas bioorganicas, peptidomimeticos, farmacologicos agentes y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y de traduccion, y similares. En ciertos ejemplos, los moduladores comprendera DLL3 soluble (sDLL3) o una forma, variante, derivado o fragmento de la misma incluyendo, por ejemplo, construcciones de fusion DLL3 (por ejemplo, DLL3-Fc, de restos DLL3 segmentacion, etc.) o DLL3 conjugados (por ejemplo, DLL3-PEG, agente DLL3-citotoxico, DLL3-brm, etc.). En otros ejemplos preferidas, los moduladores de Dll3 comprenden anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos o derivados de los mismos. En ejemplos particularmente preferidas, los moduladores de la presente descripcion comprenderan neutralizantes, ozono o la internalizacion de anticuerpos o derivados o fragmentos de los mismos. Ademas, como con los constructos de fusion anteriormente mencionados, tales moduladores anticuerpos se pueden conjugar, unidos o asociados de otro modo con agentes seleccionados citotoxicos, pollmeros, modificadores de la respuesta biologica (BRM) o similares para proporcionar inmunoterapias dirigidas con varios (y opcionalmente varios) mecanismos de accion. Como se menciono anteriormente, tales anticuerpos pueden ser anticuerpos pan-DLL y asociado con dos o mas miembros de la familia DLL o, en la alternativa, comprender antlgeno moleculas que reaccionan selectivamente con una o ambas isoformas de DLL3 vinculante. En aun otros ejemplos preferidas, los moduladores pueden operar en el nivel genetico y pueden comprender compuestos como construcciones antisentido, ARNip, miARN y similares que interactuan o se asocian con el componente genotlpico de un determinante DLL3.
[0080] Se entendera ademas que los moduladores de DLL3 descritos pueden agotar, silencio, neutralizar, eliminar o inhibir el crecimiento, propagacion o la supervivencia de las celulas tumorales, incluyendo TPC, y/o asociada neoplasia a traves de una variedad de mecanismos, incluyendo agonizante o antagonizar seleccionado vlas o la eliminacion de celulas especlficas en funcion, por ejemplo, en la forma de modulador de DLL3, cualquier carga util asociada o de dosificacion y procedimiento de entrega. Asl, mientras que ejemplos preferidos, descritos en el presente documento se dirigen al agotamiento, la inhibicion o el silenciamiento de las subpoblaciones de celulas tumorales especlficas, tales como celulas perpetuar tumorales o a moduladores que interactuan con un epltopo o dominio especlfico, hay que subrayar que tales realizaciones son meramente ilustrativos y sin limitar en ningun sentido. Mas bien, como se expone en las reivindicaciones adjuntas, la presente descripcion se refiere en general a moduladores de DLL3 y su uso en el tratamiento, gestion o la profilaxis de diversos trastornos DLL3 asociada independientemente de cualquier mecanismo particular, region de union o poblacion de celulas tumorales diana.
[0081] Independientemente de la forma del modulador seleccionado se entendera que el compuesto seleccionado puede ser antagonica en la naturaleza. Tal como se usa en el presente documento un "antagonista" se refiere a una molecula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de una diana particular o especificada (por ejemplo, DLL3), incluyendo la union de los receptores a los ligandos o las interacciones de enzimas con sustratos. A este respecto, se entendera que los antagonistas DLL3 de la presente descripcion pueden comprender cualquier ligando, polipeptido, peptido, protelna de fusion, anticuerpo o fragmento inmunologicamente activo o derivado del mismo que reconoce, reacciona, se une, combina, compite, asociados o de otro modo interactua con la protelna DLL3 o fragmento del mismo y elimina, silencios, reduce, inhibe, impide, restringe o controla el crecimiento de las celulas iniciadoras del tumor u otras celulas neoplasicas incluyendo tumor granel o celulas NTG. Los antagonistas compatibles pueden incluir, ademas, inhibidores de moleculas pequenas, aptameros, construcciones antisentido, ARNip, miARN y los, receptor o ligando moleculas como y derivados de los mismos que reconocen o asociado con un genotlpica DLL3 o determinante fenotlpica alterando de ese modo los patrones de expresion o el secuestro de su union o la interaccion con un sustrato, receptor o ligando.
[0082] Como se usa en el presente documento y se aplico a dos o mas moleculas o compuestos, los terminos "reconoce" o "asocia" se emplea para referirse a la reaccion, la union, la union especlfica, la combination, la interaccion, conexion, acoplamiento, union, coalescencia, fusion o enlace, de forma covalente o no covalente, de las moleculas mediante el cual una molecula ejerce un efecto sobre la otra molecula.
[0083] Ademas, como se demuestra en los ejemplos en el presente documento (por ejemplo, vease la Figura 2B), algunos moduladores de DLL3 humano pueden, en ciertos ejemplos, realizar una reaccion cruzada con DLL3 de una especie distinta a la humana (por ejemplo, murino). En otros ejemplos, los moduladores de ejemplo pueden ser especlficos para una o mas isoformas de DLL3 humano y no exhibiran reactividad cruzada con ortologos de DLL3 de otras especies. Por supuesto, en conjuncion con las ensenanzas de dichos ejemplos del presente documento tales ejemplos, pueden comprender anticuerpos pan-DLL que se asocian con dos o mas miembros de la familia DLL de una sola especie o anticuerpos que exclusivamente se asocian con DLL3.
[0084] En cualquier caso, y como se discute con mas detalle a continuation, los expertos en la tecnica entenderan que los moduladores descritos pueden ser utilizados en una forma conjugada o no conjugada. Es decir, el modulador puede estar asociada con o conjugado con (por ejemplo, covalentemente o no covalentemente) compuestos farmaceuticamente activos, modificadores de la respuesta biologica, agentes contra el cancer, agentes citotoxicos o citostaticos, restos de diagnostico o modificadores biocompatibles. A este respecto, se entendera que tales conjugados pueden comprender peptidos, polipeptidos, protelnas, protelnas de fusion, moleculas de acidos nucleicos, moleculas pequenas, agentes mimeticos, farmacos sinteticos, moleculas inorganicas, moleculas organicas y radioisotopos. Por otra parte, como se indica en el presente documento el conjugado seleccionado puede ser covalente o no covalentemente unido al modulador de DLL3 en diversas relaciones molares en funcion, al
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menos en parte, en el procedimiento utilizado para efectuar la conjugation.
V. Fabrication de moduladores y administration
A. Moduladores de anticuerpos
1. Information general
[0085] Como se ha mencionado anteriormente, los ejemplos de la presente description particularmente preferidos comprenden moduladores de DLL3 en forma de anticuerpos que preferiblemente se asocian con uno o mas dominios de una isoforma de la protelna DLL3 y, opcionalmente, otros miembros de la familia DLL. Aquellos de experiencia ordinaria en la tecnica entenderan la base de conocimientos bien desarrollada en anticuerpos tal como se expone, por ejemplo, en Abbas et al., Celular y Molecular Immunology, sexta ed., WB Saunders Company (2010) o Murphey et al. , de Janeway Immunobiology, 8 ed., Garland Science (2011).
[0086] El termino "anticuerpo" se destina a cubrir anticuerpos policlonales, anticuerpos multiclonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y primatizados, anticuerpos humanos, anticuerpos producidos de forma recombinante, intracuerpos, anticuerpos multiespeclficos, anticuerpos biespeclficos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos anti-idiotfpicos, anticuerpos sinteticos, incluyendo mutelnas y variantes de los mismos; fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, F (ab ') fragmentos, FvFcs de cadena unica, Fv de cadena sencilla; y derivados de los mismos, incluyendo fusiones de Fc y otros modifictaions, y cualquier otra molecula inmunologicamente activa siempre que presenten la actividad biologica deseada (es decir, la asociacion de antlgeno o de union). Ademas, el termino comprende, ademas, todas las clases de anticuerpos (es decir, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM) y todos los isotipos (es decir, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2), as! como variaciones de los mismos a menos que se dictada por el contexto. -Cadena pesada de dominios constantes que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se indican con la correspondiente letra griega minuscula a, 8, e, g y m, respectivamente. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (k), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.
[0087] Mientras que todos estos anticuerpos estan dentro del alcance de la presente invention, las realizaciones preferidas que comprenden la clase IgG de inmunoglobulina se discutiran en detalle en el presente documento unicamente para fines de ilustracion.
[0088] Como es bien sabido, los dominios variables de la parte de cadena ligera (VL) y pesada (VH) determinar el reconocimiento y la especificidad del antlgeno y los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (Ch1, Ch2 o Ch3) confieren y regulan importantes propiedades biologicas, tales como la secretion, movilidad transplacentaria, vida media de circulation, union del complemento, y similares.
[0089] La region de "variable" incluye sitios hipervariables que se manifiestan en tres segmentos de regiones determinantes de complementariedad habitualmente se denomina (CDRs), tanto en la cadena ligera y los dominios variables de cadena pesada. Las porciones mas altamente conservadas de los dominios variables que flanquean las CDR se denominan regiones marco (FR). Por ejemplo, en origen natural G anticuerpos de inmunoglobulina monomerica (IgG), los seis CDRs presentes en cada brazo de la "Y" son secuencias cortas, no contiguas de aminoacidos que estan situadas especlficamente para formar el sitio de union de antlgeno como el anticuerpo asume su configuration tridimensional en un ambiente acuoso. Por lo tanto, cada anticuerpo IgG de origen natural comprende dos sitios de union identicos proximales al extremo amino-terminal de cada brazo de la Y.
[0090] Se entendera que la position de CDR puede ser facilmente identificado por un experto normal en la tecnica usando tecnicas estandar. Tambien familiar para aquellos en la tecnica es el sistema de numeration descrito en Kabat et al. (1991, Publication del NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). En este sentido Kabat et al. se define un sistema de numeracion para las secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la tecnica puede asignar inequlvocamente este sistema de "numeracion de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningun dato experimental mas alla de la propia secuencia. A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeracion de las posiciones de residuos de aminoacidos especlficos en un anticuerpo estan segun el sistema de numeracion de Kabat.
[0091] Por lo tanto, segun Kabat, en el VH, los residuos 31-35 comprenden CDR1, los residuos 50-65 conforman CDR2, y 95-102 comprenden CDR3, mientras que en el VL, los residuos 24-34 son CDR1, 50-56 comprenden CDR2, y 89-97 constituyen CDR3. Para el contexto, en una VH, FR1 corresponde al dominio de la region variable que abarca los aminoacidos 1-30; FR2 corresponde al dominio de la region variable que abarca los aminoacidos 3649; FR3 corresponde al dominio de la region variable que abarca los aminoacidos 66-94, y FR4 corresponde al dominio de la region variable de los aminoacidos 103 al final de la region variable. Las FR de la cadena ligera estan separadas de manera similar por cada una de las CDRs de la cadena ligera de la region variable.
[0092] Observese que las CDRs varlan considerablemente de anticuerpo a anticuerpo (y por definition no muestran
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homologla con las secuencias de consenso de Kabat). Ademas, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier numero de sitio Kabat dado puede variar de cadena de anticuerpo de cadena de anticuerpo debido a interespecies o divergencia alelica. numeration alternativa se expone en Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) y MacCallum et al, J. Mol.. Biol. 262: 732-745 (1996), aunque como en Kabat, los llmites FR estan separados por los respectivos extremos terminales de CDR como se describio anteriormente. Ver tambien Chothia et al., Nature 342, pp. 877-883 (1989) y S. Dubel, ed., Handbook of terapeuticas Los anticuerpos, 3a ed., Wiley-VCH Verlag GmbH y Co. (2007), donde las definiciones incluir la superposition o subconjuntos de residuos de aminoacidos cuando se compara uno contra el otro.
[0093] Los residuos de aminoacidos que comprenden regiones de union o CDRs como se definen por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen para la comparacion a continuation.
Definiciones de CDR
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
Vh CDR1
31-35 26-32 30-35
Vh CDR2
50-65 50-58 47-58
Vh CDR3
95-102 95-102 93-101
Vl CDR1
24-34 23-34 30-36
Vl CDR2
50-56 50-56 46-55
Vl CDR3
89-97 89-97 89-96
1La numeracion de residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al, supra. 2La numeracion de residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al, supra. 3La numeracion de residuos sigue la nomenclatura de MacCallum et al., supra
[0094] En el contexto de la presente description, se entendera que cualquiera de los CDR de cadena ligera y pesada descritas derivadas de las secuencias de aminoacidos de la region variable murinos establecidos en las figuras 11A o la Figura 11B puede combinarse o reordenarse para proporcionar optimizado anti-DLL3 (por ejemplo, humanizados o quimericos anti-hDLL3) anticuerpos segun las presentes ensenanzas. Es decir, una o mas de las CDR derivadas de las secuencias contiguas de la cadena ligera de la region variable de aminoacidos expuestas en la Figura 11A (SEQ ID NOS: 20 - 202, los numeros pares) o las secuencias contiguas de la cadena pesada de la region variable de aminoacidos expuestas en la figura 11B (SEC ID NOS: 21 - 203, los numeros impares) se puede incorporar en un modulador de DLL3 y, en ejemplos particularmente preferibles, en un anticuerpo con CDR injertado o humanizado que inmunoespeclficamente se asocia con una o mas isoformas DLL3. Ejemplos de secuencias de amino acido de region variable de cadena ligera (SEQ ID NOS: 204 - 212, los numeros pares) y pesada (SEQ ID NOS: 205 - 213, los numeros impares) de tales moduladores humanizados tambien se exponen en la Figuras 11A y 11B. Tomados en conjunto estas nuevos secuencias de aminoacidos representan noventa y dos murino y cinco moduladores de ejemplo humanizados segun la presente descripcion. Por otra parte, las correspondientes secuencias de acido nucleico de cada uno de los noventa y dos moduladores murinos de ejemplo y cinco moduladores humanizados establecidos en la figura 11A y la figura 11B se incluyen en la lista de secuencias adjunta a la presente solicitud (SEQ ID NOS 220 - 413).
[0095] En las figuras 11A y 11B las CDR indicadas se definen utilizando la numeracion de Chothia. Sin embargo, como se discute en el presente documento y demuestra en el Ejemplo 8 a continuacion, un experto en la tecnica facilmente podrla definir, identificar, obtener y/o enumerar las CDR como se define por Kabat et al., Chothia et al. o MacCallum et al. para cada secuencia de la cadena pesada y ligera respectivo tal como se expone en la Figura Fig. 11A o 11B. Por consiguiente, cada uno de los CDR en cuestion y anticuerpos que comprenden CDRs definidos por tal nomenclatura incluyen expresamente dentro del alcance de la presente descripcion. En terminos mas generales, los terminos "residuos de amino acido de CDR de region variable" o mas simplemente "CDR" incluyen aminoacidos en una CDR como se identifica usando cualquier procedimiento basada en la secuencia o estructura como se ha expuesto anteriormente.
2. Generation de moduladores de anticuerpos
a. Anticuerpos policlonales
[0096] La production de anticuerpos policlonales en diversos animales huesped, incluyendo conejos, ratones, ratas, etc. es bien conocido en la tecnica. En algunos ejemplos, el suero que contiene anticuerpos policlonales anti-DLL3 se obtiene por sangrado o sacrificio del animal. El suero se puede usar para fines de investigation en la forma obtenida a partir del animal o, en la alternativa, los anticuerpos anti-DLL3 pueden estar parcial o totalmente purificadas para proporcionar fracciones de inmunoglobulinas o preparaciones de anticuerpos homogeneos.
[0097] Brevemente, el animal seleccionado se inmuniza con un inmunogeno de DLL3 (por ejemplo, DLL3 soluble o sDLL3) que puede, por ejemplo, comprender seleccionado isoformas, dominios y/o peptidos, o celulas vivas o preparaciones celulares que expresan DLL3 o fragmentos inmunorreactivos de los mismos. Conocidos en la tecnica
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adyuvantes que pueden usarse para aumentar la respuesta inmunologica, dependiendo de las especies inoculadas incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidroxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente utiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes pueden proteger al antlgeno de la rapida dispersion secuestrandolo en un deposito local, o pueden contener sustancias que estimulan el anfitrion a secretar factores que son quimiotacticos para macrofagos y otros componentes del sistema inmune. Preferiblemente, el programa de inmunizacion implicara dos o mas administraciones del inmunogeno seleccionado propagarse a lo largo de un perlodo de tiempo predeterminado.
[0098] La secuencia de aminoacidos de una protelna DLL3 como se muestra en la Figura 1C o la Figura 1D pueden analizarse para seleccionar regiones especlficas de la protelna DLL3 para generar anticuerpos. Por ejemplo, la hidrofobicidad y la hidrofilicidad analisis de una secuencia de acido amino DLL3 se utilizan para identificar regiones hidrofllicas en la estructura de DLL3. Regiones de una protelna DLL3 que muestran estructura inmunogenica, as! como otras regiones y dominios, pueden identificarse facilmente utilizando otros diversos procedimientos conocidos en la tecnica, tales como Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o el analisis de Jameson-Wolf. Los perfiles de flexibilidad media se pueden generar usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy PK, 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255. Los perfiles de giro beta pueden generarse usando el procedimiento de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294. Asl, cada DLL3 region, dominio o motivo identificado por cualquiera de estos programas o procedimientos esta dentro del alcance de la presente descripcion y pueden ser aislados o disenados para proporcionar inmunogenos que dan lugar a moduladores que comprenden propiedades deseadas. Los procedimientos preferidos para la generacion de anticuerpos DLL3 se ilustran adicionalmente por medio de los ejemplos proporcionados en este documento. Los procedimientos para preparar una protelna o polipeptido para su uso como inmunogeno son bien conocidos en la tecnica. Tambien bien conocidos en la tecnica procedimientos para preparar conjugados inmunogenicos de una protelna con un portador, tal como BSA, KLH u otra protelna vehlculo. En algunas circunstancias, la conjugacion directa usando, por ejemplo, se utilizan reactivos de carbodiimida; en otros ejemplos los reactivos que unen son afectivo. La administracion de un inmunogeno DLL3 a menudo se lleva a cabo por inyeccion durante un periodo de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se entiende en la tecnica. Durante el programa de inmunizacion, los tltulos de anticuerpos pueden ser tomadas tal como se describe en los Ejemplos a continuacion para determinar la adecuacion de la formacion de anticuerpos.
b. Anticuerpos monoclonales
[0099] Ademas, la descripcion contempla el uso de anticuerpos monoclonales. Como se conoce en la tecnica, el termino "anticuerpo monoclonal" (o mAb) se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones (por ejemplo, de origen natural mutaciones), que pueden estar presentes en cantidades menores. En ciertos ejemplos, un anticuerpo tal monoclonal incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de polipeptido que se une o se asocia con un antlgeno en el que la secuencia de polipeptidos de union a antlgeno se obtuvo por un proceso que incluye la seleccion de una unica secuencia diana polipeptido de union a partir de una pluralidad de polipeptido secuencias.
[0100] Mas generalmente, y como se ejemplifica en el Ejemplo 6 en el presente documento, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de tecnicas conocidas en la tecnica, incluyendo de hibridomas, tecnicas recombinantes, las tecnologlas de presentation en fagos, los animales transgenicos (por ejemplo, un XenoMouse® o alguna combination de los mismos Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando hibridomas y reconocidos en la tecnica tecnicas de ingenierla bioqulmicos y geneticos tales como los descritos con mas detalle en An, Zhigiang (ed.) Therapeutic monoclonal Antibodies: del laboratorio a la cllnica, John Wiley y Sons, 1st ed 2009; Shire et al (eds.) Current Trends in anticuerpo monoclonal de desarrollo y fabrication, Springer Science + Business Media LLC, 1st ed 2010; Harlow et al, Anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed 1988; Hammerling, et al., en: monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, NY, 1981.) se debe entender que una secuencia de union seleccionada puede ser fu rther alterado, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de union a la diana, para mejorar su production en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespeclfico, etc., y que un anticuerpo que comprende la alterada secuencia de union diana es tambien un anticuerpo de esta descripcion.
c. Anticuerpos quimericos
[0101] En otro ejemplo, el anticuerpo de la descripcion puede comprender anticuerpos quimericos derivados de segmentos de protelnas unidos covalentemente a partir de al menos dos especies o tipos de anticuerpos diferentes. Como se conoce en la tecnica, el termino anticuerpos "quimericos" se dirige a construcciones en las que una portion de la cadena pesada y/o apretado es identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase de anticuerpo particular o subclase, mientras que el resto de la cadena (s) es identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos
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derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, as! como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la deseada actividad biologica (USPN 4.816.567; Morrison et al, Proc Natl Acad Sci USA., 81: 6.851-6855 (1984)).
[0102] En una realizacion, un anticuerpo quimerico segun las ensenanzas de este documento puede comprender VH murina y secuencias de aminoacidos de VL y regiones constantes derivadas de fuentes humanas. En otros ejemplos compatibles un anticuerpo quimerico de la presente descripcion puede comprender un anticuerpo humanizado como se describe a continuacion. En otra realizacion, el llamado anticuerpo "injertado con CDR", el anticuerpo comprende una o mas CDR de una especie o perteneciente a una clase de anticuerpo particular o subclase particular, mientras que el resto de la cadena (s) de anticuerpo es/son identicos con o homologa a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo. Para uso en seres humanos, CDR de roedor seleccionadas pueden ser injertados en un anticuerpo humano, en sustitucion de una o mas de las regiones o CDRs del anticuerpo humano variables de origen natural. Estas construcciones tienen en general las ventajas de proporcionar funciones de modulador de fuerza completa (por ejemplo, CDC (citotoxicidad dependiente del complemento), ADCC (dependiente de anticuerpos mediada por celulas citotoxicidad), etc.), mientras que la reduccion de las respuestas inmunes no deseadas para el anticuerpo por el sujeto.
d. Anticuerpos humanizados
[0103] De manera similar al anticuerpo injertado con CDR es un anticuerpo "humanizado". Como se usa en el presente documento, las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de una o mas inmunoglobulinas no humanas. En una realizacion, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (receptor o anticuerpo aceptor) en los que los residuos de una CDR del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo , o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada. En ciertas realizaciones preferidas, los residuos en uno o mas FRs en el dominio variable de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos del anticuerpo donante para ayudar a mantener la configuration tridimensional apropiada de la CDR injertado (s) y con ello mejorar afinidad. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante a, por ejemplo, perfeccionar el rendimiento del anticuerpo.
[0104] Se describen anticuerpos con injerto de CDR y anticuerpos humanizados, por ejemplo, en USPNs. 6.180.370 y 5.693.762. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien puede comprender al menos una portion de un Fc de inmunoglobulina, tlpicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease, por ejemplo, Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); y USPNs. 6.982.321 y 7.087.409. Todavla otro procedimiento se denomina "humanization" que se describe, por ejemplo, en el documento USPN 2005/0008625. Ademas, un anticuerpo no humano puede ser tambien modificado por deletion especlfica de los epltopos de celulas T humanas o "desinmunizacion" por los procedimientos descritos en el documento WO 98/52976 y WO 00/34317.
[0105] Los anticuerpos humanizados tambien pueden manipularse biogeneticamente usando tecnicas de biologla molecular comunes, tales como aislar, manipular y expresar secuencias de acido nucleico que codifican la totalidad o parte de las regiones variables de inmunoglobulina a partir de al menos una de una cadena pesada o ligera. Ademas de las fuentes de tal acido nucleico mencionadas anteriormente, las secuencias de la llnea germinal humana estan disponibles como se describe, por ejemplo, en Tomlinson, IA et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776798; Cook, GP et al. (1995) Immunol. Hoy 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMbO J 14: 4.628 a 4.638. El directorio de V-BASE (VBASE2 - Retter et al, Nucleic Acid Res 33; 671-674, 2005). Ofrece un amplio directorio de secuencias de la region variable de la inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, IA et al Centro MRC para Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). FR humanas consenso tambien se pueden utilizar, por ejemplo, como se describe en USPN 6,300.064.
[0106] En realizaciones seleccionadas, y como se detalla en el Ejemplo 8 a continuacion, al menos 60%, 65%, 70%, 75%, o 80% de la humanizado o injertado con CDR de anticuerpo de cadena pesada o ligera de la region variable de residuos de aminoacidos se corresponden a los de la FR receptor humano y secuencias de CDR. En otras realizaciones al menos 85% o 90% de los residuos de la region variables del anticuerpo humanizado corresponderan a los de las secuencias de FR y CDR receptores. En una realizacion preferida adicional, mayor que 95% de los residuos de la region variables del anticuerpo humanizado corresponderan a los de las secuencias de FR y CDR receptores.
e. Anticuerpos humanos
[0107] En otra realizacion, los anticuerpos pueden comprender anticuerpos completamente humanos. El termino "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoacidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha hecho usando cualquiera de las tecnicas para preparar anticuerpos humanos.
[0108] Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Una tecnica
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es la presentation en fagos en la que una biblioteca de anticuerpos (preferiblemente humanos) se sintetiza en fagos, la biblioteca se rastreo con el antigeno de interes o una portion de union al anticuerpo del mismo, y el fago que se une se aisla el antigeno, de la que uno pueden obtener los fragmentos inmunorreactivos. Los procedimientos para preparar y cribar dichas bibliotecas son bien conocidos en la tecnica y los kits para generar bibliotecas de presentacion de fagos estan disponibles comercialmente (por ejemplo, el Sistema de Anticuerpos Pharmacia Recombinant Phage, n° de catalogo 27-9400-01; y el kit de expresion en fagos Stratagene SurfZAPTN, n° de catalogo 240612) Hay tambien otros procedimientos y reactivos que se pueden utilizar en la generation y selection de bibliotecas de presentacion de anticuerpos (vease, por ejemplo, USPN 5.223.409; publication PCT n° WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; y Barbas et al, Proc Natl Acad Sci USA. 88: 7978-7982 (1991)).
[0109] En un caso, los anticuerpos humanos recombinantes pueden aislarse mediante el cribado de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante preparado como anteriormente. En un caso, la biblioteca es una biblioteca de presentacion de fagos scFv, generados usando los ADNc de VL y VH humanos preparados a partir de ARNm aislado de celulas B.
[0110] Los anticuerpos producidos por las bibliotecas sin tratar (naturales o sinteticos) puede ser de afinidad moderada (Ka de aproximadamente 106 a 107 M-1), pero la maduracion de afinidad tambien puede ser imitado in vitro mediante la construction y volver a seleccionar a partir de bibliotecas secundarias como se describe en la tecnica. Por ejemplo, la mutation puede introducirse al azar in vitro mediante el uso de la polimerasa propensa a errores (reportado en Leung et al, Technique, 1: 11-15. (1989)). Ademas, la maduracion de afinidad puede llevarse a cabo mediante la mutacion al azar una o mas CDR, por ejemplo usando PCR con cebadores que llevan secuencia aleatoria que abarca el CDR de interes, en los clones de Fv individuales seleccionados y la detection de clones de mayor afinidad. WO 9607754 describe un procedimiento para inducir la mutagenesis en una CDR de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una biblioteca de genes de cadena ligera. Otro enfoque eficaz es para recombinar la VH o VL seleccionados por presentacion de fagos con repertorios de dominio V variantes naturales obtenidos a partir de donantes no inmunizados y para la deteccion de afinidad mas alta en varias rondas de reorganization de la cadena como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10: 79-783 (1992). Esta tecnica permite la production de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con una constante de disociacion KD (koff/kon) de aproximadamente 10-9 M o menos.
[0111] En otros ejemplos procedimientos similares se pueden emplear usando bibliotecas que comprenden celulas eucariotas (por ejemplo, levadura) que expresan pares de union en su superficie. Vease, por ejemplo, el documento USPN 7.700.302 y USSN 12/404.059. En un caso, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996): Sheets et al Proc Natl Acad Sci USA. 95: 6157 a 6162 (1998) en otros ejemplos, los pares de union humanas pueden aislarse a partir de bibliotecas combinatorias de anticuerpos generados en celulas eucariotas tales como levadura Vease por ejemplo, el documento USPN 7.700.302 tales tecnicas permiten ventajosamente para el cribado de un gran numero de moduladores candidatos y prever relativamente facil manipulation de secuencias candidatas (por ejemplo, mediante maduracion de la afinidad o de barajado recombinante).
[0112] Los anticuerpos humanos tambien se pueden fabricar mediante la introduction de loci de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogena han sido parcial o completamente se han introducido genes de inmunoglobulina inactivados y humanos. Tras la estimulacion, se observa produccion de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento del gen, montaje, y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en USPNs. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y USPNs. 6.075.181 y 6.150.584en relation con tecnologia XenoMouse®; y Lonberg y Huszar, Intern Rev. Immunol 13: 65-93 (1995) Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse via la inmortalizacion de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antigeno diana (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo que padece un trastorno neoplasico o pueden haber sido inmunizados in vitro). Vease, por ejemplo, Cole et al., monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al, J. Immunol, 147 (1): 86-95 (1991); y USPN 5.750.373.
3. Procesamiento posterior
[0113] No importa como obtener, el modulador celulas productoras (por ejemplo, hibridomas, colonias de levadura, etc.) puede seleccionarse, clonado y ademas examinados para caracteristicas deseables que incluyen, por ejemplo, el crecimiento robusto, alta produccion de anticuerpo y, como se discute en mas detalle a continuation, las caracteristicas de anticuerpos deseables. Los hibridomas se puede expandir in vivo en animales singeneicos, en animales que carecen de un sistema inmunologico, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivo celular in vitro. Procedimientos de seleccion, donation y expansion de hibridomas y/o colonias, cada una de las cuales produce una especie de anticuerpo discretos, son bien conocidos por los expertos normales en la tecnica.
B. Produccion de modulador recombinante
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1. Informacion general
[0114] Una vez que la fuente es ADN perfeccionado que codifica los moduladores de DLL3 deseados se puede aislar facilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse especlficamente a genes que codifican anticuerpo pesadas y cadenas ligeras). Las celulas de hibridoma aislados y subclonados (o fago o levadura colonias derivadas) pueden servir como una fuente preferida de tal ADN si el modulador es un anticuerpo. Si se desea, el acido nucleico adicional puede ser manipulado como se describe aqul para crear agentes, incluyendo protelnas de fusion, o anticuerpos quimericos, humanizados o completamente humanos. Mas particularmente, el ADN aislado (que puede ser modificada) se puede utilizar para clonar secuencias de la region constante y variable de los anticuerpos de fabrication.
[0115] Por consiguiente, en ejemplos de ejemplo anticuerpos se pueden producir de forma recombinante usando procedimientos convencionales (tales como los expuestos en Al-Rubeal; An, y Shire et al todos supra, y Sambrook J. y Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2000); Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology: a Compendium of Methods from current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)) en el que las celulas de hibridoma aisladas y subclonadas (o colonias derivadas de fagos o de levadura) sirven como una fuente preferida de moleculas de acido nucleico.
[0116] El termino "molecula de acido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir moleculas de ADN y moleculas de ARN y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, acidos nucleicos peptldicos), ya sea de cadena sencilla o de doble cadena. Los acidos nucleicos pueden codificar una o ambas cadenas de un anticuerpo de la description, o un fragmento o derivado del mismo. Las moleculas de acido nucleico de la description tambien se incluyen polinucleotidos suficientes para uso como sondas de hibridacion, cebadores de PCR o cebadores de secuenciacion para identificar, analizar, mutando o amplificar un polinucleotido que codifica un polipeptido; anti-sentido acidos nucleicos para inhibir la expresion de un polinucleotido, y as! como secuencias complementarias. Los acidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud. Pueden ser, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 o mas nucleotidos de longitud, y/o puede comprender una o mas secuencias, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o ser parte de un acido nucleico mas grande, por ejemplo, un vector. Se entendera que tales secuencias de acido nucleico pueden ser ademas manipulados para crear moduladores que incluyen anticuerpos quimericos, humanizados o completamente humanos. Mas particularmente, las moleculas de acido nucleico aisladas (que pueden ser modificadas) se pueden utilizar para clonar secuencias de la region constante y variable de los anticuerpos de fabricacion como se describe en el documento USPN 7.709.611.
[0117] El termino "acido nucleico aislado" significa una que el acido nucleico fue (i) amplificado in vitro, por ejemplo por reaction en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) producido de forma recombinante mediante donation, (iii) purificado, por ejemplo por escision y fraccionamiento por electroforesis en gel, o (iv) sintetizado, por ejemplo mediante slntesis qulmica. Un acido nucleico aislado es un acido nucleico que esta disponible para manipulation por tecnicas de ADN recombinante.
[0118] Si se obtiene o se deriva de la tecnologla de visualization de fagos, bibliotecas de levadura, la tecnologla basada en hibridomas o sinteticamente la fuente del acido nucleico que codifica la portion inmunorreactiva deseada del anticuerpo, es de entenderse que la presente descripcion abarca el acido nucleico moleculas y secuencias que codifican los anticuerpos o fragmentos de union al antlgeno o sus derivados. Ademas, la presente descripcion esta dirigida a vectores y celulas huesped que comprenden tales moleculas de acido nucleico.
2. Hibridacion e identidad de Secuencia
[0119] Como se ha indicado, la descripcion proporciona ademas acidos nucleicos que se hibridan con otros acidos nucleicos en condiciones de hibridacion particulares. Mas especlficamente, la descripcion abarca acidos moleculas nucleicos que se hibridan en condiciones de hibridacion de rigurosidad moderada o alta (por ejemplo, como se define a continuation), a las moleculas de acido nucleico de la invention. Procedimientos para la hibridacion de acidos nucleicos son bien conocidos en la tecnica. Como es bien sabido, un moderadamente rigurosas condiciones de hibridacion comprenden una solution de prelavado que contiene cloruro de 5x de sodio/citrato de sodio (SSC), 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampon de hibridacion de alrededor de 50% de formamida, 6 x SSC, y una temperatura de hibridacion de 55°C (u otras soluciones de hibridacion similares, como una que contiene aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridacion de 42°C), y el lavado de condiciones de 60°C, en 0,5xSSC, 0,1% SDS. A modo de comparacion de hibridacion en condiciones de hibridacion altamente rigurosas comprenden el lavado con 6 x SSC a 45°C, seguido de uno o mas lavados en 0,1 x SSC, 0,2% SDS a 68°C. Ademas, un experto en la tecnica puede manipular las condiciones de hibridacion y/o lavado para aumentar o disminuir la rigurosidad de la hibridacion de tal manera que los acidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleotidos que son al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 98% o 99% identicas entre si permanecen tlpicamente hibridadas entre si.
[0120] La descripcion tambien incluye moleculas de acido nucleico que son "sustancialmente identicas" a las
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moleculas de acido nucleico descritas. En un caso, el termino sustancialmente identicas con respecto a una secuencia de acido nucleico significa puede interpretarse como una secuencia de moleculas de acido nucleico que muestra al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, o 90% de identidad de secuencia . En otros ejemplos, las moleculas de acido nucleico exhiben 95% o 98% de identidad de secuencia con la secuencia de acido nucleico de referencia.
[0121] Los parametros basicos que afectan a la eleccion de las condiciones de hibridacion y la orientacion para idear condiciones adecuadas se exponen, por ejemplo, Sambrook, Fritsch, y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capltulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al, eds, John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3 a 6.4), y puede ser determinada facilmente por los que tienen experto ordinario en la tecnica basandose en, por ejemplo, la longitud y/o composicion de base del acido nucleico.
[0122] La similitud de secuencia para polipeptidos, que tambien se denomina identidad de secuencia, se mide tlpicamente usando software de analisis de secuencia. El software de analisis de protelnas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoacidos conservativas. Por ejemplo, el GCG herramienta de analisis de secuencias (Accelrys Software Inc.) contiene programas tales como "GAP" y "mejor ajuste" que se puede utilizar con los parametros por defecto para determinar homologla de secuencia o identidad de secuencia entre polipeptidos estrechamente relacionados, tales como polipeptidos homologos de diferentes especies de organismos o entre una protelna de tipo salvaje y una mutelna del mismo. (Vease, por ejemplo, GCG Version 6.1 o Durbin et Al, Biological Sequence Analysis: Probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge Press (1998)).
[0123] Las secuencias de polipeptidos tambien pueden compararse usando FASTA usando parametros por defecto o recomendados, un programa en GCG Version 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y la identidad ciento secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de busqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la descripcion a una base de datos que contiene un gran numero de secuencias de diferentes organismos es el programa informatico BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parametros por defecto. Vease, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 402.
[0124] A este respecto la descripcion tambien incluye moleculas de acido nucleico que codifican polipeptidos que son "sustancialmente identicas" con respecto a una secuencia de polipeptido de la region variable de anticuerpo (por ejemplo, ya sea region variable de cadena pesada o ligera donante o la region variable de cadena pesada o ligera aceptora). Como se aplica a tales polipeptidos, el termino "identidad sustancial" o "sustancialmente identico" significa que dos secuencias peptldicas, cuando se alinean optimamente, tal como mediante los programas GAP o Best-FIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 60% o 65% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 70%, 75%, 80%, 85%, o 90% de identidad de secuencia, incluso mas preferiblemente al menos 93%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son identicas difieren por sustituciones de aminoacidos conservativas. Una "sustitucion de aminoacidos conservativa" es una en la que un residuo de aminoacido esta sustituido por otro residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades qulmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitucion conservadora de aminoacidos no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de una protelna. En los ejemplos en que dos o mas secuencias de aminoacidos difieren entre si por sustituciones conservadoras, la identidad de secuencia en porcentaje o grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitucion.
3. Expresion
[0125] La variedad de procesos de expresion recombinante, es decir, la produccion de ARN o de ARN y de la protelna/peptido, son bien conocidos como se expone, por ejemplo, en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in volumen Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif .; Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (2000); y Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado por 2006).
[0126] Algunos de los terminos de interes incluyen "secuencia de control de la expresion" que comprende promotores, ribosomas sitios, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripcion de un gen o la traduccion del ARNm de union. Como es bien sabido, un "promotor" o "region promotora" se refiere a una secuencia de acido nucleico que generalmente se encuentra en direction 5' (5') a la secuencia de acido nucleico que se expresa y controles de expresion de la secuencia, proporcionando un sitio de reconocimiento y union para RNA- polimerasa.
[0127] Los promotores de ejemplo que son compatibles segun la invention incluyen promotores para SP6, T3 y T7 polimerasa, promotor de ARN U6 humano, el promotor de CMV, y promotores hlbridos artificiales de los mismos (por ejemplo CMV) en la que una parte o partes se fusionan a una parte o partes de promotores de genes de otras
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protelnas celulares, tales como por ejemplo, GAPDH humana (gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa), y que incluye o no incluye un intron o intrones adicionales.
[0128] En ciertos ejemplos, la molecula de acido nucleico puede estar presente en un vector, cuando sea apropiado con un promotor, que controla la expresion del acido nucleico. El termino "vector" bien conocido comprende cualquier vehlculo intermediario para un acido nucleico que permite que dicho acido nucleico, por ejemplo, a ser introducido en celulas procarioticas y/o eucarioticas y, cuando proceda, para ser integrado en un genoma. Procedimientos de transformacion de celulas de mamlfero son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, USPNs. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455. Los vectores pueden incluir una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo de la descripcion (por ejemplo, un anticuerpo completo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, una VH o VL de un anticuerpo, o una porcion del mismo, o una pesada o de cadena ligera CDR, un Fv de cadena sencilla, o fragmentos o variantes de los mismos), unido operativamente a un promotor (vease, por ejemplo, la publicacion PCT WO 86/05807; la publicacion PCT WO 89/01036; y USPN 5.122.464).
[0129] Una variedad de sistemas de vectores de expresion en huesped estan disponibles comercialmente, y muchos son compatibles con las ensenanzas del presente documento y puede ser utilizado para expresar los moduladores de la invencion. Tales sistemas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis, Streptomyces) transformadas con ADN de bacteriofago recombinante, ADN de plasmido o vectores de expresion de ADN de cosmido que contienen secuencias de modulador de codificacion; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transfectadas con vectores de expresion de levadura recombinante que contiene las secuencias de codificacion del modulador; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias de codificacion del modulador; sistemas de celulas vegetales (por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja de agua, malz, trigo, patata, etc.) infectados con vectores recombinantes de expresion viral (por ejemplo, virus mosaico de la coliflor; virus del mosaico del tabaco) o transfectadas con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (por ejemplo, plasmido Ti ) que contiene las secuencias de codificacion del modulador; o sistemas de celulas de mamlferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3, etc.) que albergan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamlfero (por ejemplo, promotor metalotionelna) o de virus de mamlferos (por ejemplo, el adenovirus tarde promotor; el promotor de 7,5 K del virus vaccinia).
[0130] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "celula huesped" cubre cualquier tipo de sistema celular que puede ser disenado para generar los polipeptidos y moleculas de union a antlgeno de la presente descripcion. En un caso, la celula huesped esta disenado para permitir la produccion de una molecula de union a antlgeno con glucoformas modificadas. En un ejemplo preferido, la molecula ligante de antlgeno, o antlgeno variante molecula de union, es un, fragmento de anticuerpo, o protelna de fusion de anticuerpos. En ciertos ejemplos, las celulas huesped han sido manipuladas adicionalmente para expresar mayores niveles de uno o mas polipeptidos que tienen actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT111). Las celulas huesped compatibles incluyen celulas cultivadas, por ejemplo, celulas cultivadas de mamlfero, tales como celulas CHO, celulas BHK, celulas nSo, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, levadura celulas, celulas de insecto, y celulas de plantas, por nombrar solo unos pocos, pero tambien celulas comprendidas dentro de un animal transgenico, planta transgenica o planta de cultivo o tejido animal.
[0131] Para la produccion a largo plazo, de alto rendimiento de protelnas recombinantes se prefiere la expresion estable. Por consiguiente, las llneas celulares que expresan de forma estable el modulador seleccionado pueden ser disenados usando tecnicas reconocidas en la tecnica estandar. En lugar de usar vectores de expresion que contienen orlgenes de replicacion virales, las celulas huesped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de expresion apropiada de control (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion, etc.) y un marcador seleccionable. Cualquiera de los sistemas de seleccion bien conocidos en la tecnica pueden utilizarse, incluyendo el sistema de expresion de gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS), que proporciona un enfoque eficaz para potenciar la expresion bajo ciertas condiciones. El sistema GS se discute, en todo o parte en relacion con las patentes EP 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 y 0 338 841 y USPNs 5.591.639 y 5.879.936.
[0132] Otro sistema de expresion preferido, Freedom™ CHO-S Kit se proporciona comercialmente por Life Technologies (numero de catalogo A13696-01) tambien permite el desarrollo de llneas celulares estables que puede utilizarse para la produccion de modulador.
[0133] Dichos sistemas de expresion en huesped representan vehlculos por los cuales las secuencias codificantes de interes pueden producirse y posteriormente purificarse, pero tambien representan celulas que pueden, cuando transformadas o transfectadas con el nucleotido apropiado secuencias de codificacion, expresan una molecula de la descripcion in situ. La celula huesped puede ser co-transfectada con dos vectores de expresion de la invencion, por ejemplo, el primer vector que codifica un polipeptido de cadena pesada derivada y el segundo vector que codifica un polipeptido derivado de cadena ligera.
[0134] Por lo tanto, en ciertos ejemplos, la presente descripcion proporciona celulas huesped recombinantes que permiten la expresion de anticuerpos o porciones de los mismos. Los anticuerpos producidos mediante la expresion
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en dichas celulas huesped recombinantes se denominan aqul anticuerpos como recombinantes. La presente descripcion tambien proporciona celulas de la progenie de tales celulas huesped, y los anticuerpos producidos por la misma.
C. Sintesis Quimica
[0135] Ademas, los moduladores pueden sintetizarse qulmicamente usando tecnicas conocidas en la tecnica (por ejemplo, vease Creighton, 1983, Protelnas: Structures and Molecular Principles, WH Freeman & Co., Nueva York, y Hunkapiller, M., et al. 1984, Nature 310: 105-111). Ademas, si se desea, los aminoacidos no clasicos o analogos de aminoacidos qulmicos (tales como isomeros D de los aminoacidos comunes, acido 2,4-diaminobutlrico, acido a- amino isobutlrico, acido 4-aminobutlrico, y similares) se pueden introducir como una sustitucion o adicion en una secuencia de polipeptido.
D. Sistemas transgenicos
[0136] En otros ejemplos moduladores pueden ser producidos transgenicamente mediante la generacion de un mamlfero o planta que es transgenico para moleculas recombinantes, tales como las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina y que produce los compuestos deseados en una forma recuperable. Esto incluye, por ejemplo, la production de moduladores de la protelna (por ejemplo, anticuerpos) en, y la recuperation de, la leche de cabras, vacas, u otros mamlferos. Vease, por ejemplo, USPNs. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, y 5.741.957. En algunos ejemplos, los animales transgenicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana se inmunizan para producir anticuerpos.
[0137] Otras tecnicas transgenicas se exponen en Hogan et al, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed, Cold Spring Harbor Press (1999);.. Jackson et al, Raton Genetica y Transgenicos: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: Un Manual de Laboratorio, Academic Press (1999) y el documento USPN 6.417.429. En algunos ejemplos, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos, y el producto deseado se produce en la sangre, leche, orina, saliva, lagrimas, moco y otros fluidos corporales de la que es pueden obtener facilmente usando tecnicas de purification reconocidos en la tecnica.
[0138] Otros sistemas de produccion compatibles incluyen procedimientos para preparar anticuerpos en plantas tales como los descritos, por ejemplo, en USPNs. 6.046.037 y 5.959.177.
E. Aislamiento/Purificacion
[0139] Una vez que un modulador de la descripcion se ha producido mediante expresion recombinante o cualquier otra de las tecnicas descritas, se puede purificar por cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la purificacion de inmunoglobulinas o protelnas. En este respecto, el modulador puede ser "aislado", que significa que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirlan con los usos diagnosticos o terapeuticos para el polipeptido y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. Los moduladores aislados incluyen un modulador in situ dentro de celulas recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del polipeptido no estara presente.
[0140] Si la molecula deseada se produce intracelularmente, como un primer paso, los restos de partlculas, bien celulas huesped o fragmentos lisados, se puede eliminar, por ejemplo, por centrifugation o ultrafltration. Cuando el modulador se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresion generalmente se concentran primero usando un filtro de concentration de protelnas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad Amicon o Pellicon de ultrafiltracion (Millipore Corp.). Una vez que se eliminan los contaminantes insolubles de la preparation el modulador puede purificarse adicionalmente usando tecnicas estandar tales como, por ejemplo, cromatografla de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, y cromatografla de afinidad, con cromatografla de afinidad de particular interes. A este respecto la protelna A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas IgG4 IgG1 humana, IgG2 o (Lindmark, et al, J Immunol Meth. 62: 1 (1983)) mientras que la protelna G se recomienda para todos los isotipos de raton y para IgG3 humana (Guss, et al, EMBO J. 5: 1567 (1986)). Otras tecnicas para la purificacion de protelnas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, precipitation con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografla en sllice, cromatografla en heparina, cromatografla de sefarosa en una resina de intercambio anionico o cationico (como una columna de acido poliaspartico), cromatoenfoque, SDS PAGE y precipitacion con sulfato de amonio tambien estan disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar. En ejemplos particularmente preferidos se purificaran los moduladores de la presente descripcion, al menos en parte, usando protelna A o cromatografla de afinidad G Protein.
VI. Fragmentos y derivados de modulador de DLL3
[0141] Cualquiera que sea la generacion y la metodologla de produccion seleccionadas, los moduladores de la presente descripcion reaccionan, se unen, se combinan, complejo, conectar, fijar, unir, interactuar o de otra manera
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asociar con un determinants diana (por ejemplo, antlgeno) y con ello proporcionar los resultados deseados. Cuando el modulador comprende un anticuerpo o fragmento, construir o derivado del mismo tipo de asociaciones puede ser a traves de uno o mas "sitios de union" o "componentes de union" expresaron en el anticuerpo, en donde un sitio de union comprende una region de un polipeptido que es responsable de forma selectiva la union a una molecula o antlgeno de interes objetivo. Los dominios de union comprenden al menos un sitio de union (por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto tendra dos dominios de union y dos sitios de union). Los dominios de union de ejemplo incluyen un dominio variable de anticuerpo, un dominio de union al receptor de un ligando, un dominio de union a ligando de un receptor o un dominio enzimatico.
A. Anticuerpos
[0142] Como se ha senalado anteriormente, el termino "anticuerpo" se destina a cubrir, al menos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiclonales, anticuerpos quimericos, anticuerpos con CDR injertadas, anticuerpos humanizados y primatizados, anticuerpos humanos, anticuerpos producidos de forma recombinante, intracuerpos, anticuerpos multiespeclficos, anticuerpos biespeclficos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos anti-idiotlpicos, as! como anticuerpos sinteticos.
B. Fragmentos
[0143] Independientemente de la forma del modulador (por ejemplo, quimericos, humanizados, etc.) se selecciona para llevar a la practica la descripcion, se entendera que los fragmentos inmunorreactivos de los mismos se pueden usar segun las ensenanzas del presente documento. Un "fragmento de anticuerpo" comprende al menos una porcion de un anticuerpo intacto. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "fragmento" de una molecula de anticuerpo incluye fragmentos de union a antlgeno de los anticuerpos, y el termino "fragmento de union a antlgeno" se refiere a un fragmento de polipeptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une o reacciona inmunoespeclficamente con un antlgeno seleccionado o determinante inmunogenico del mismo o compite con el anticuerpo intacto del que los fragmentos se derivan para la union especlfica a antlgeno.
[0144] Los fragmentos de ejemplo incluyen: VL, VH, scFv, fragmento F(ab')2, fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmentos de anticuerpos de dominio unico, diacuerpos, anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Ademas, un fragmento activo comprende una porcion del anticuerpo que conserva su capacidad de interactuar con el antlgeno/sustrato o receptores y se modifican de una manera similar a la de un anticuerpo intacto (aunque tal vez con algo menos de eficiencia).
[0145] En otras realizaciones, un fragmento de anticuerpo es uno que comprende la region Fc y que retiene al menos una de las funciones biologicas normalmente asociadas con la region Fc cuando esta presente en un anticuerpo intacto, tal como union a FcRn, modulacion de la vida media del anticuerpo, funcion ADCC y union de complemento. En una realizacion, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de dicho anticuerpo puede comprender un brazo de union a antlgeno unido a una secuencia Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.
[0146] Como es bien reconocido por los expertos en la tecnica, los fragmentos pueden obtenerse por medio de tratamiento qulmico o enzimatico (tal como papalna o pepsina) de una cadena de anticuerpo o anticuerpo intacto o completo o por medios recombinantes. Vease, por ejemplo, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, Nueva York (1999), para una descripcion mas detallada de fragmentos de anticuerpos.
C. Derivados
[0147] La descripcion incluye ademas derivados de modulador inmunorreactivos y moleculas de union a antlgeno que comprenden una o mas modificaciones.
1. Anticuerpos multivalentes
[0148] En un ejemplo, los moduladores de la descripcion pueden ser monovalentes o multivalentes (por ejemplo, bivalente, trivalente, etc.). Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "valencia" se refiere al numero de posibles sitios de union diana asociados con un anticuerpo. Cada sitio de union diana se une especlficamente a una molecula diana o posicion o locus especlfico en una molecula diana. Cuando un anticuerpo es monovalente, cada sitio de union de la molecula se unira especlficamente a una posicion de antlgeno unico o epltopo. Cuando un anticuerpo comprende mas de un sitio de union diana (multivalente), cada sitio de union diana puede unirse especlficamente a las mismas o diferentes moleculas (por ejemplo, se puede unir a diferentes ligandos o diferentes antlgenos, o diferentes epltopos o posiciones en el mismo antlgeno). Vease, por ejemplo, el documento USPN 2009/0130105. En cada caso al menos uno de los sitios de union comprendera un epltopo, motivo o dominio asociado con una isoforma de DLL3.
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[0149] En un ejemplo, los moduladores son anticuerpos biespecificos en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes, tal como se describe en Millstein et al, 1983, Nature, 305: 537-539. Otras realizaciones incluyen anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespeclficos. Otros constructos multiespeclficos compatibles mas sofisticados y los procedimientos de su fabricacion se explican en la USPN 2009/0155255, as! como el documento WO 94/04690; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymology, 121; 210; y WO96/27011.
[0150] Como se menciono anteriormente, los anticuerpos multivalentes pueden unirse inmunoespeclficamente a diferentes epltopos de la molecula diana deseada o pueden unirse inmunoespeclficamente tanto a la molecula diana como a un epltopo heterologo, tal como un polipeptido heterologo o material de soporte solido. Aunque las realizaciones preferidas de los anticuerpos anti-DLL3 solamente se unen a dos antlgenos (es decir, anticuerpos biespecificos), los anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespeclficos estan tambien abarcados por la presente invencion. Los anticuerpos biespecificos tambien incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, que dirigen celulas del sistema inmunitario a celulas no deseadas (USPN 4.676.980), y para el tratamiento de la infeccion por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar utilizando cualquier procedimiento de reticulacion conveniente. Los agentes de reticulacion adecuados son bien conocidos en la tecnica, y se describen en el documento USPN 4.676.980, junto con una serie de tecnicas de reticulacion.
[0151] En otras realizaciones, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion anticuerpo-antigeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina, tales como un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de la bisagra, regiones Ch2, y/o regiones Ch3, usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la tecnica.
2. Modificaciones de la region Fc
[0152] Ademas de las diferentes modificaciones, sustituciones, adiciones o supresiones a la region variable o de union de los moduladores descritos (por ejemplo, Fc-DLL3 o anticuerpos anti-DLL3) establecidos anteriormente, los expertos en la tecnica entenderan que los ejemplos seleccionados de la presente descripcion tambien pueden comprender sustituciones o modificaciones de la region constante (es decir, la region Fc). Mas particularmente, se contempla que los moduladores de DLL3 de la descripcion pueden contener entre otras cosas uno o mas residuos de sustituciones, mutaciones de aminoacidos y/o modificaciones que dan como resultado un compuesto con caracteristicas preferidas incluyendo, pero no limitado a: farmacocinetica alterada, aumento vida media en suero, aumento de la afinidad de union, inmunogenicidad reducida, aumento de la produccion, union alterada a un receptor Fc (FcR) de ligando Pc, actividad "ADCC" (citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos) o“CDC” (citotoxicidad dependiente del complemento) mejorada o reducida, glicosilacion y/o enlaces disulfuro alterados y especificidad de union modificada. A este respecto, se entendera que estas variantes de Fc se pueden usar ventajosamente para mejorar las propiedades antineoplasicas eficaces de los moduladores descritos.
[0153] Con este fin, ciertas realizaciones de la invencion pueden comprender sustituciones o modificaciones de la region Fc, por ejemplo la adicion de uno o mas residuos de aminoacidos, sustituciones, mutaciones y/o modificaciones para producir un compuesto con funciones efectoras Fc mejoradas o preferidas. Por ejemplo, los cambios en los residuos de aminoacidos implicados en la interaccion entre el dominio Fc y un receptor de Fc (por ejemplo, Fcg RI, Fcg RIIA y B, Fcg RIII y FcRn) pueden conducir a un aumento de la citotoxicidad y/o farmacocinetica alterada, como el aumento vida media en suero (vease, por ejemplo, Ravetch y Kinet, Annu Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al, .J. Lab Clin Med 126: 330-41 (1995)).
[0154] En realizaciones seleccionadas, los anticuerpos con una mayor in vivo la vida media en se pueden generar mediante la modification (por ejemplo, sustitucion, deletion o adicion) residuos de aminoacidos identificados como implicados en la interaccion entre el dominio Fc y el receptor FcRn (vease, por ejemplo, publication Internacional n° WO 97/34631; WO 04/029207; USPN 6.737.056 y USPN 2003/0190311 con respecto a tales realizaciones, las variantes de Fc pueden proporcionar vidas medias en un mamifero, preferiblemente un ser humano, de mas de 5 dias, mayor de 10 dias, mayor de 15 dias, preferiblemente mayor de 20 dias, mayor de 25 dias, mayor de 30 dias, mayor de 35 dias, mayor de 40 dias, mayor de 45 dias, mayor de 2 meses, mayor de 3 meses , mayor de 4 meses, o mayor de 5 meses. El aumento de los resultados la vida media en un titulo del suero mas alta que de este modo reduce la frecuencia de la administration de los anticuerpos y/o reduce la concentration de los anticuerpos a ser administrado. La union a humana FcRn in vivo y s erum media vida de polipeptidos humanos de alta afinidad de union a FcRn se puede ensayar, por ejemplo, en ratones transgenicos o lineas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran los polipeptidos con una region Fc variante. Wo 2000/42072 describe variantes de anticuerpos con la mejora o disminucion de la union a FcRns. Vease tambien, por ejemplo, Escudos et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591 a 6604 (2001).
[0155] En otras realizaciones, las alteraciones de Fc pueden conducir a actividad CDC o ADCC mejorada o reducida. Como en conocida en la tecnica, CDC se refiere a la lisis de una celula diana en presencia del complemento, y ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada obligado a FcR presentes en
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ciertas celulas citotoxicas (por ejemplo, celulas asesinas naturales, neutrofilos, y macrofagos) permite a estas celulas efectoras citotoxicas se unan especificamente a una celula diana portadora del antigeno y posteriormente destruir la celula diana con citotoxinas. En el contexto de las variantes de anticuerpos invencion instantanea se proporcionan con "alterado" afinidad de union de FcR, que o bien esta mejorada o disminuida de union en comparacion con un padre o anticuerpo no modificado o a un anticuerpo que comprende una secuencia nativa de FcR. Tales variantes que exhiben union disminuida pueden poseer poca o ninguna union apreciable, por ejemplo, la union a la FcR en comparacion con una secuencia nativa, por ejemplo, como se determina por tecnicas bien conocidas en la tecnica 020%. En otras realizaciones, la variante exhibe union mejorada en comparacion con la inmunoglobulina nativa dominio Fc. Se entendera que estos tipos de variantes de Fc se pueden usar ventajosamente para mejorar las propiedades anti-neoplasicos eficaces de los anticuerpos descritos. En aun otras realizaciones, tales alteraciones conducen a una mayor afinidad de union, una inmunogenicidad reducida, aumento de la produccion, glicosilacion alterado y/o enlaces disulfuro (por ejemplo, por sitios de conjugacion), modificado especificidad de union, el aumento de la fagocitosis; y/o regulacion a la baja de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de celulas B; BCR), etc.
3. Glicosilacion alterada
[0156] Todavia otros ejemplos comprenden uno o mas glicoformas disenadas, es decir, un modulador de DLL3 que comprende un patron alterado de glicosilacion o la composition de hidratos de carbono alterado que esta unido covalentemente a la proteina (por ejemplo, en el dominio Fc). Vease, por ejemplo, Shields, R, L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26.733 a 26.740. Las glicoformas disenadas pueden ser utiles para una variedad de propositos, incluyendo pero no limitado a, aumentar o reducir la funcion efectora, aumentar la afinidad del modulador a una diana o facilitar la produccion del modulador. En ciertas realizaciones donde se desea una funcion efectora reducida, la molecula puede ser disenada para expresar una forma aglicosilada. Las sustituciones que pueden resultar en la elimination de uno o mas sitios de glicosilacion de la estructura de la region variable para eliminar de este modo la glicosilacion en ese sitio son bien conocidos (vease, por ejemplo USPNs. 5.714.350 y 6.350.861). A la inversa, el aumento de las funciones efectoras o mejora de la union puede ser impartida a la molecula que contiene Fc por diseno en uno o mas sitios de glicosilacion.
[0157] Otras realizaciones incluyen una variante de Fc que tiene una composicion de glicosilacion alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos fucosilo o un anticuerpo que tiene una mas estructuras de GlcNAc. Tales patrones de glicosilacion alterados se han demostrado que aumentan la capacidad de ADCC de anticuerpos. Las glicoformas disenadas pueden ser generados por cualquier procedimiento conocido para un experto en la tecnica, por ejemplo mediante el uso de cepas de expresion modificadas por ingenieria o variantes, mediante la co-expresion con una o mas enzimas (por ejemplo N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11)), mediante la expresion de una molecula que comprende una region Fc en diversos organismos o lineas celulares de diferentes organismos o mediante la modification de hidratos de carbono despues de que la molecula que comprende la region Fc se haya expresado (vease, por ejemplo, el documento WO 2012/117002).
4. Procesamiento adicional
[0158] Los moduladores se pueden modificar diferencialmente durante o despues de la produccion, por ejemplo, por glicosilacion, acetilacion, fosforilacion, amidacion, derivatizacion por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escision proteolitica, union a una molecula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones quimicas pueden llevarse a cabo mediante tecnicas conocidas, incluyendo pero no limitado, a la escision quimica especifica mediante bromuro de cianogeno, tripsina, quimotripsina, papaina, proteasa V8, NaBHU, acetilacion, formilacion, oxidation, reduction, sintesis metabolica en presencia de tunicamicina, etc.
[0159] Diversas modificaciones post-traduccionales tambien abarcadas por la invencion incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidratos ligados a N u O, procesamiento de los extremos N-terminal o C-terminal, union de restos quimicos al esqueleto de aminoacidos, modificaciones quimicas de las cadenas de carbohidratos ligadas a O o N, y adicion o deletion de un residuo de metionina N-terminal como resultado de la expresion en la celula huesped procariota. Ademas, los moduladores tambien pueden modificarse con un marcador detectable, tal como un marcador enzimatico, fluorescente, radioisotopico o de afinidad para permitir la detection y el aislamiento del modulador.
VII. Caracteristicas del modulador
[0160] No importa como obtener o que formas antes mencionadas toma el modulador, diferentes casos de los moduladores descritos pueden exhibir ciertas caracteristicas. En ejemplos seleccionados, las celulas productoras de anticuerpos (por ejemplo, hibridomas o colonias de levadura) pueden seleccionarse, clonaron y ademas examinados para propiedades favorables que incluyen, por ejemplo, el crecimiento robusto, alta produccion de modulador y como se discute en mas detalle a continuation, las caracteristicas de modulador deseables. En otros ejemplos caracteristicas del modulador se pueden impartir o influenciadas por la selection de un antigeno particular (por ejemplo, una isoforma especifica DLL3) o un fragmento inmunorreactivo del antigeno diana para la inoculation del animal. Todavia en otros ejemplos los moduladores seleccionados pueden modificarse por ingenieria genetica como
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se describio anteriormente para mejorar o refinar caracterlsticas inmunoquimicos tales como afinidad o la farmacocinetica.
A. Moduladores neutralizantes
[0161] En ciertos ejemplos, los moduladores comprenderan anticuerpos "neutralizantes" o derivados o fragmentos de los mismos, es decir, la presente descripcion puede comprender moleculas de anticuerpos que se unen dominios especlficos, motivos o epltopos y son capaces de bloquear, reducir o inhibir la biologica actividad de DLL3. Mas en general, el termino "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que se une a, o interactua con una molecula o ligando diana y previene la union o asociacion de la molecula diana a una pareja de union tal como un receptor o sustrato, interrumpiendo de este modo una respuesta biologica que de otra resultarla de la interaccion de las moleculas.
[0162] Se entendera que los ensayos de union competitiva conocidos en la tecnica se pueden usar para valorar la union y la especificidad de un anticuerpo o fragmento inmunologicamente funcional o derivado del mismo. Con respecto a la presente invencion se llevara a cabo un anticuerpo o fragmento para inhibir o reducir la union de DLL3 a un socio o la union del sustrato cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de companero de union unido a DLL3 en al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o mas tal como se mide, por ejemplo, por la actividad del receptor Notch o en un ensayo de union competitiva in vitro. En el caso de anticuerpos a DLL3 por ejemplo, un anticuerpo neutralizante o antagonista alteraran preferiblemente la actividad del receptor Notch en al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 97%, 99% o mas. Se entendera que esta actividad modificada puede ser medido directamente usando tecnicas reconocidas en la tecnica o se puede medir por el impacto de la actividad alterada tiene en direction 3' (por ejemplo, la oncogenesis, la supervivencia celular o la activation o supresion de Notch genes de respuesta). Preferiblemente, la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la actividad DLL3 se evalua mediante la inhibition de la DLL3 union a un receptor Notch o mediante la evaluation de su capacidad para aliviar DLL3 mediada por la represion de la serialization de Notch.
B. Moduladores de internalization
[0163] Hay evidencia de que una parte sustancial de la protelna DLL3 expresada permanece asociado con la superficie celular tumorigenico, permitiendo de este modo la localization y la internalizacion de los moduladores descritos. En ejemplos preferidos, tales moduladores pueden estar asociados con, o conjugarse a, agentes contra el cancer, tales como restos citotoxicos que matan a la celula tras la internalizacion. En ejemplos particularmente preferidos, el modulador comprendera un conjugado de anticuerpo y farmaco de internalizacion.
[0164] Como se usa en el presente documento, un modulador que "internaliza" es uno que se recoge (junto con cualquier carga util) por la celula tras la union a un antlgeno o receptor asociado. Como se entendera, el modulador de internalizacion puede, en ejemplos preferidos, comprenden un anticuerpo, incluyendo fragmentos de anticuerpos y derivados de los mismos, as! como conjugados de anticuerpos. La internalizacion puede producirse in vitro o in vivo. Para aplicaciones terapeuticas, la internalizacion se producira preferiblemente in vivo en un sujeto en necesidad del mismo. El numero de moleculas de anticuerpo internalizadas puede ser suficiente o adecuada para matar a una celula que expresa el antlgeno, especialmente un cancer de celulas madre que expresan el antlgeno. Dependiendo de la potencia del conjugado de anticuerpo o anticuerpo, en algunos ejemplos, la captation de una sola molecula de anticuerpo en la celula es suficiente para destruir la celula diana a la que se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son tan altamente potente que la internalizacion de unas pocas moleculas de la toxina conjugada con el anticuerpo es suficiente para matar la celula tumoral. Si un anticuerpo se internaliza tras la union a una celula de mamlfero se puede determinar mediante diversos ensayos, incluyendo los descritos en los Ejemplos a continuation (por ejemplo, los Ejemplos 12 y 15-17). Los procedimientos para detectar si un anticuerpo se internaliza en una celula tambien se describen en el documento USPN 7.619.068.
C. Moduladores de agotamiento
[0165] En otras realizaciones, los anticuerpos comprendera ozono anticuerpos o derivados o fragmentos de los mismos. El termino anticuerpo de "agotamiento" se refiere a un anticuerpo que se une preferiblemente a o se asocia con un antlgeno sobre o cerca de la superficie celular e induce, promueve o causa la muerte o elimination de la celula (por ejemplo, por los CDC, ADCC o la introduction de un citotoxico agente). En algunas realizaciones, los anticuerpos de agotamiento seleccionados se asocian o conjugan a un agente citotoxico.
[0166] Preferiblemente, un anticuerpo de agotamiento sera capaz de quitar, incapacitar, eliminar o matar al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% de las celulas tumorigenicas DLL3 en una poblacion de celulas definida. En algunas realizaciones la poblacion de celulas puede comprender enriquecido, seccionado, las celulas perpetuar tumorales purificados o aislados. En otras realizaciones la poblacion de celulas puede comprender muestras tumorales enteras o extractos tumorales heterogeneos que comprenden celulas perpetuar tumorales. Los expertos en la tecnica entenderan que las tecnicas bioqulmicas estandar como se describe en los Ejemplos a continuacion (por ejemplo, los Ejemplos 13 y 14) se puede usar para controlar y cuantificar el
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agotamiento de celulas tumorigenicas o celulas perpetuar tumorales segun las ensenanzas del presente documento.
D. Agrupamiento (“binning”) y union a epitopo
[0167] Se entendera ademas los moduladores anticuerpos DLL3 contra descritos asociaran con, o unirse a, epltopos discretos o determinantes inmunogenicos presentados por la diana seleccionada o fragmento del mismo. En ciertas realizaciones, epitopo o determinantes inmunogenicos incluyen agrupaciones superficiales qulmicamente activas de moleculas tales como aminoacidos, cadenas laterales de azucar, grupos fosforilo, o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener caracterlsticas estructurales tridimensionales especlficas, y/o especlfica cargar caracterlsticas. Por lo tanto, como se usa aqul el termino "epitopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de union especifica a una inmunoglobulina o receptor de celulas T o de otra manera interactuar con una molecula. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une especificamente (o se unen inmunoespecificamente o reaccionar) a un antigeno cuando reconoce preferencialmente su antigeno diana en una mezcla compleja de proteinas y/o macromoleculas. En realizaciones preferidas, se dice que un anticuerpo para unirse especificamente a un antigeno cuando la constante de equilibrio de disociacion (KD) es menor que o igual a 10' 6 M o menor que o igual a 10' 7M, mas preferiblemente cuando el equilibrio de disociacion constante es menor que o igual a 10' 8M, y aun mas preferiblemente cuando la constante de disociacion es menor que o igual a 10' 9M
[0168] Mas directamente el termino "epitopo" se utiliza en su sentido bioquimico habitual y se refiere a aquella porcion del antigeno diana capaz de ser reconocida y unida especificamente por un modulador anticuerpo particular. Cuando el antigeno es un polipeptido tal como DLL3, los epitopos generalmente pueden estar formados de ambos aminoacidos contiguos y aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteina ("epitopos conformacionales"). En tales epitopos conformacionales los puntos de interaccion se producen a traves de residuos de aminoacidos en la proteina que estan separados linealmente una de la otra. Los epitopos formados a partir de aminoacidos contiguos (denominado a veces como epitopos "continuos" o "lineales") tipicamente se retienen sobre la desnaturalizacion de proteinas, mientras que los epitopos formados por el plegamiento terciario tipicamente se pierden tras la desnaturalizacion de proteinas. En cualquier caso un epitopo de anticuerpo incluye tipicamente al menos 3, y mas habitualmente, al menos 5 o 8-10 aminoacidos en una conformacion espacial unica.
[0169] A este respecto, se entendera que, en ciertos ejemplos, un epitopo puede estar asociada con, o residir en, una o mas regiones, dominios o motivos de la proteina DLL3 (por ejemplo, aminoacidos 1-618 de la isoforma 1). Como se discute en mas detalle en este documento la region extracelular de la proteina DLL3 comprende una serie de dominios generalmente reconocidos que incluyen seis dominios similares a EGF y un dominio de DSL. Para los fines de la presente descripcion el termino "dominio" se utiliza segun su significado generalmente aceptado y se llevara a cabo para referirse a una identificable o definible entidad estructural conservada dentro de una proteina que presenta un contenido de estructura secundaria distintivo. En muchos ejemplos, dominios homologos con funciones comunes suelen mostrar similitudes de secuencia y ser hallado en una serie de proteinas diferentes (por ejemplo, los dominios similares a EGF se informa encontrado en al menos 471 proteinas diferentes). Del mismo modo, el termino "motivo" reconocido en la tecnica sera utilizado segun su significado habitual y se referira generalmente a una region corta, conservada de una proteina que es tipicamente de diez a veinte residuos de aminoacidos contiguos. Como se ha discutido a lo largo de, las instancias seleccionadas comprenden moduladores que se asocian con o se unen a un epitope dentro de regiones, dominios o motivos de DLL3 especificos.
[0170] En cualquier caso, una vez que se determina un epitopo deseado en un antigeno, es posible generar anticuerpos frente a ese epitopo, por ejemplo, mediante la inmunizacion con un peptido que comprende el epitopo utilizando las tecnicas descritas en la presente invencion. Alternativamente, durante el proceso de descubrimiento, la generacion y caracterizacion de anticuerpos pueden elucidar informacion acerca de epitopos deseables situados en dominios o motivos especificos. A partir de esta informacion, es posible entonces detectar anticuerpos competitivos para la union al mismo epitopo. Un enfoque para lograr esto es llevar a cabo estudios de competition para encontrar anticuerpos que se unen competitivamente entre si, es decir, los anticuerpos compiten por la union al antigeno. Un proceso de alto rendimiento para binning anticuerpos en base a su competencia cruzada se describe en el documento WO 03/48731. Otros procedimientos de binning o mapeo a nivel de dominio o de epitopos que comprenden competencia de modulador o expresion de fragmento de antigeno en levadura se exponen en los Ejemplos 9 y 10 a continuation.
[0171] Tal como se utiliza aqui, el termino "binning" o “agrupacion” se refiere a procedimientos utilizados para grupo o clasificar los anticuerpos en base a sus caracterlsticas de union de antigeno y la competencia. Mientras que las tecnicas son utiles para definir y categorizar los moduladores de la presente descripcion, los grupos no siempre se correlacionan directamente con epitopos y tales determinaciones iniciales de union puede ser mas refinado y confirmado por otra metodologia reconocida en la tecnica como se describe en el presente documento epitopo. Sin embargo, como se discute y se muestra en los Ejemplos a continuacion, la asignacion empirica de moduladores de anticuerpo para grupos individuales proporciona informacion que puede ser indicativo del potencial terapeutico de los moduladores descritos.
[0172] Mas especificamente, se puede determinar si un anticuerpo de referencia seleccionado (o fragmento del
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mismo) se une al mismo epltopo o transversal compite por la union con un anticuerpo de segunda prueba (es decir, esta en la misma bin) mediante el uso de procedimientos conocidos en la tecnica y se expone en los Ejemplos en el presente documento. En un caso, un modulador de anticuerpo de referencia esta asociado con el antlgeno DLL3 bajo condiciones de saturacion y entonces la capacidad de un modulador de anticuerpo secundario o de prueba para unirse a DLL3 se determina usando tecnicas inmunoqulmicas estandar. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse sustancialmente a DLL3 al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia anti-DLL3, entonces el anticuerpo secundario o de ensayo se une a un epltopo diferente que el anticuerpo primario o de referencia. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse sustancialmente a DLL3 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo se une al mismo epltopo, un epltopo de solapamiento, o un epltopo que esta en estrecha proximidad (al menos estericamente) al epltopo unido por el anticuerpo primario. Es decir, el anticuerpo de ensayo compite por la union de antlgenos y esta en el mismo grupo o “bin” como el anticuerpo de referencia.
[0173] El termino "competir" o "anticuerpo que compite" cuando se utiliza en el contexto de los moduladores descritos significa competencia entre anticuerpos tal como se determina mediante un ensayo en el que un anticuerpo de prueba o fragmento inmunologicamente funcional bajo prueba previene o inhibe la union especlfica de una referencia anticuerpo a un antlgeno habitual. Tlpicamente, un ensayo tal implica el uso de antlgeno purificado (por ejemplo, DLL3 o un dominio o fragmento del mismo) unido a una superficie solida o celulas que llevan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibicion competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie solida o las celulas en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Por lo general, la inmunoglobulina de ensayo esta presente en exceso y/o permite que se una primero. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competicion (anticuerpos que compiten) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epltopo que el anticuerpo de referencia y los anticuerpos que se unen a un epltopo adyacente suficientemente proximo al epltopo unido por el anticuerpo de referencia para el impedimento esterico que se produzca. Detalles adicionales respecto a los procedimientos para determinar la union competitiva se proporcionan en los Ejemplos de este documento. Por lo general, cuando un anticuerpo competitivo esta presente en exceso, inhibira la union especlfica de un anticuerpo de referencia a un antlgeno habitual en al menos 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algun caso, la union es inhibida por al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 97% o mas.
[0174] A la inversa, cuando el anticuerpo de referencia esta unido sera preferiblemente inhibir la union de un anticuerpo de prueba anadido posteriormente (es decir, un modulador de DLL3) por al menos 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algun caso, la union del anticuerpo de prueba es inhibida por al menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 97% o mas.
[0175] Con respecto a la presente invencion, y como se expone en los Ejemplos 9 y 10 a continuacion, se ha determinado (por medio de resonancia de plasmon superficial o interferometrla de biocapa) que el dominio extracelular de DLL3 define al menos nueve grupos por union competitiva denominados "grupo A" a "grupo I" en el presente documento. Teniendo en cuenta la resolution proporcionada por las tecnicas de agrupacion de modulador, se cree que estos nueve grupos comprenden la mayorla de los grupos que estan presentes en la region extracelular de la protelna DLL3.
[0176] A este respecto, y como se conoce en la tecnica y se detalla en los Ejemplos siguientes, los datos de union de agrupacion o competitivos deseado se puede obtener usando radioinmunoensayo en fase solida directa o indirecta (RIA), inmunoensayo enzimatico directo o indirecto en fase solida (EIA o ELISA), ensayo de competicion de sandwich, un sistema Biacore™ 2000 (es decir, resonancia de plasmon de superficie - GE Healthcare), un analizador ForteBio® (es decir, la interferometrla de bio-capa - ForteBio, Inc.) o citometrla de flujo metodologla. El termino "resonancia de plasmon superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenomeno optico que permite el analisis de interacciones especlficas en tiempo real mediante la detection de alteraciones en concentraciones de protelna dentro de una matriz de biosensor. El termino "interferometrla de biocapa" se refiere a una tecnica analltica optico que analiza el patron de interferencia de la luz blanca reflejada por dos superficies: una capa de protelna inmovilizada en una punta de biosensor, y una capa de referencia interna Cualquier cambio en el numero de moleculas unidas a la punta de biosensor provoca un cambio en el patron de interferencia que se puede medir en tiempo real. En realizaciones particularmente preferidas, el analisis (ya sea por resonancia de plasmon de superficie, la interferometrla bio-capa o citometrla de flujo) se lleva a cabo usando un instrumento Biacore o ForteBio o un citometro de flujo (por ejemplo, FACSAria II) como se demuestra en los Ejemplos a continuacion.
[0177] Con el fin de caracterizar mejor los epltopos con los que los moduladores de DLL3 de anticuerpo descritos se asocian con o se unen a, se realizo mapeo de epltopos de nivel de dominio utilizando una modification del protocolo descrito por Cochran et al. (Procedimientos J Immunol 287 (1-2): 147-158. (2004)).
[0178] Brevemente, los dominios individuales de DLL3 que comprenden secuencias de aminoacidos especlficas se expresa en la superficie de la levadura y de union por cada anticuerpo DLL3 se determino mediante citometrla de flujo. Los resultados se discuten a continuacion en el Ejemplo 10 y se muestran en la Figuras 14A y 14B.
[0179] Otras tecnicas de mapeo de epltopos compatibles incluyen mutantes barrido de alanina, transferencias de peptido (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) o la escision del peptido de analisis. Ademas, los
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procedimientos tales como la escision epltopo, la extraction de epltopo y modification qulmica de los antlgenos se pueden emplear (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). En otras realizaciones Modification-Assisted Profiling (MAP), tambien conocido como anticuerpo de perfiles basados en la estructura del antlgeno (ASAP) proporciona un procedimiento que clasifica un gran numero de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antlgeno segun las similitudes del perfil de union de cada anticuerpo a las superficies de antlgenos modificados qulmica o enzimaticamente (USPN 2004/0101920,). Cada categorla puede reflejar un epltopo unico ya sea claramente diferente de o que se superponen parcialmente con epltopo representado por otra categorla. Esta tecnologla permite el filtrado rapido de anticuerpos geneticamente identicos, que la caracterizacion como se puede centrar en anticuerpos geneticamente distintas. Se entendera que el MAP puede ser usado para ordenar los moduladores anticuerpos hDLL3 de la invention en grupos de anticuerpos diferentes epltopos de union.
[0180] Los agentes utiles para alterar la estructura de los antlgenos inmovilizados incluyen enzimas tales como enzimas proteollticas (por ejemplo, tripsina, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Asp-N, quimotripsina, etc.). Agentes utiles para la alteration de la estructura del antlgeno inmovilizado tambien pueden ser agentes qulmicos, tales como, esteres de succinimidilo y sus derivados, compuestos que contienen aminas primarias, hidrazinas y carbohydrazines, aminoacidos libres, etc.
[0181] La protelna antlgeno puede inmovilizarse sobre cualquiera de las superficies de chips biosensores o perlas de poliestireno. Esta ultima puede ser procesada con, por ejemplo, un ensayo tal como ensayo de detection multiplex LUMINEX™ (Luminex Corp.). Debido a la capacidad de LUMlNEX manejar analisis multiplex con hasta 100 diferentes tipos de perlas, LUMINEX proporciona casi ilimitado superficies antlgeno con diversas modificaciones, lo que resulta en una mejor resolution en perfiles epltopo de anticuerpo mas de un ensayo de biosensor.
E. Caracteristicas de union de modulador
[0182] Ademas de la especificidad de epltopo de los anticuerpos descritos se pueden caracterizar usando caracteristicas fisicas tales como, por ejemplo, las afinidades de union. En este sentido la presente description abarca ademas el uso de anticuerpos que tienen una alta afinidad de union para una o mas isoformas DLL3 o, en el caso de pan-anticuerpos, mas de un miembro de la familia DLL.
[0183] El termino "Kd", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociacion de una interaction anticuerpo-antigeno particular. Un anticuerpo de la descripcion se dice que se unen inmunoespecificamente su antlgeno diana cuando la constante de disociacion KD (koff/kon) es <= 10' 7M. El anticuerpo se une especificamente al antlgeno con alta afinidad cuando la KD es <= 5x10 ** - 9M, y con muy alta afinidad cuando la KD es <= 5x10‘10M. En una realization de la invencion, el anticuerpo tiene una KD de <= 10-9M y una constante de disociacion de aproximadamente 1x10- 4/s. En una realizacion de la invencion, la velocidad de disociacion es <1x10-5/s. En otras realizaciones de la invencion, los anticuerpos se uniran a DLL3 con una KD de entre aproximadamente 10-7M y 10-10 M, y en otra realizacion mas que se uniran con una KD <= 2x10 -10M. Aun otros ejemplos seleccionados de la presente descripcion comprenden anticuerpos que tienen constante KD de disociacion (koff/kon) de menos de 10-2 M, menos de 5x10-2 M, menos de 10-3 M, menos de 5x10-3M, menos de 10-4 M, menos de 5x10-4 M, menos de 10-5 M, menos de 5x10-5 M, menos de 10-6 M, menos de 5x10-5M, menos de 10-7M, menos de 5x10-7 M, menos de 10-8 M, menos de 5x10-8M, menos de 10-9 M, menos de 5x10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 5x10■1° M, menos de 10-11 M, menos de 5x10-11 M, menos de 10-12 M, menos de 5x10-12 M , menos de 10-13 M, menos de 5x10-13 M, menos de 10-14 M, menos de 5x10-14 M, menos de 10-15 M o menos de 5x10-15 M.
[0184] En ejemplos especificos, un anticuerpo de la descripcion que se une inmunoespecificamente a DLL3 tiene una constante de velocidad de asociacion o velocidad kon (o ka) (DLL3 (Ab) + antlgeno (Ag)kon <- Ab-Ag ) de al menos 105 M-1s- 1, al menos 2x105 M-1s- 1, al menos 5x105 M-1s- 1, al menos 106 M-1s- 1, al menos 5x106 M-1s- 1, al menos 107 M-1s- 1, al menos 5x10 7 M-1s- 1 o al menos 108 M-1s- 1.
[0185] En otro ejemplo, un anticuerpo de la descripcion que se une inmunoespecificamente a DLL3 tiene una
constante de velocidad de disociacion o velocidad koff (o KD) (DLL3 (Ab) + antlgeno (Ag)koff <- Ab-Ag ) de menos de 10-1s- 1, menos de 5x10-1s- 1, menos de 10■2s■ 1, menos de 5x10■2s■ 1, menos de 10■3s■ 1, menos de 5x10■3s■ 1, menos de 10■4s■ 1, menos de 5x10■4s■ 1, menos de 10■5s■ 1, menos de 5x10■5s■ 1, menos de 10■6s■ 1, menos de 5x10■6s■ 1,
menos de 10-7s- 1, menos de 5x10-7s- 1, menos de 10■8s■ 1, menos de 5x10■8s■ 1, menos de 10■9s■ 1, menos de 5x10■9s■ 1 o menos a 10■1°s■ 1.
[0186] En otras realizaciones seleccionadas de los anticuerpos anti-DLL3 presente invencion tendra una constante de afinidad o K a (k on/koff) de al menos 102 M-1, al menos 5x102 M-1, al menos 103 M-1, al menos 5x103 M-1, al menos 104 M-1, al menos 5x104 M-1, al menos 105 M-1, al menos 5x105 M-1, al menos 106 M-1, al menos 5x106 M-1, al menos 107 M-1, al menos 5x107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5x108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5x109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5x1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5x1011 M-1 , al menos 1012 M-1, al menos 5x1012 M-1, al menos 1013 M-1, al menos 5x1013 M-1, al menos 1014 M-1, al menos 5x1014 M-1, al menos 1015 M-1 o al menos 5x1015 M-1.
[0187] Ademas de los anticuerpos caracteristicas modulador antes mencionados de la presente descripcion ademas
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se pueden caracterizar usando caracterlsticas adicionales flsicas incluyendo, por ejemplo, la estabilidad termica (es decir, temperatura de fusion; Tm), y los puntos isoelectricos. (Vease, por ejemplo, Bjellqvist et al, 1993, Electroforesis 14: 1023; Vermeer et al, 2000, Biophys J. 78:394 a 404; Vermeer et al, 2000, Biophys J. 79: 21502154).
VIII. Los moduladores coniuaados A. Informacion general
[0188] Una vez que los moduladores de la descripcion se han generado y/o fabricado y seleccionado segun las ensenanzas de este documento se puede enlazar con, fusionados a, conjugados con (por ejemplo, covalentemente o no covalentemente) o de otra manera asociado con farmaceuticamente activo o restos de diagnostico o modificadores biocompatibles. Tal como se utiliza aqul, el termino "conjugado" o "conjugado modulador" o "conjugado de anticuerpo" se utilizara en llneas generales y se mantiene a significar cualquier molecula o farmaco biologicamente activo o detectable asociado con los moduladores descritos, independientemente del procedimiento de asociacion. A este respecto, se entendera que tales conjugados pueden, ademas de los moduladores descritos, comprender peptidos, polipeptidos, protelnas, profarmacos que se metabolizan a un agente activo in vivo, pollmeros, moleculas de acidos nucleicos, moleculas pequenas, agentes de union, mimetico agentes, farmacos sinteticos, moleculas inorganicas, moleculas organicas y radioisotopos. Por otra parte, como se indico anteriormente el conjugado seleccionado puede ser covalente o no covalentemente asociado con, o unido a, el modulador y exhiben diversas relaciones molares estequiometrica en funcion, al menos en parte, en el procedimiento utilizado para efectuar la conjugacion.
[0189] Los aspectos particularmente preferidos de la presente invencion comprenderan conjugados de modulador de anticuerpos o conjugados de anticuerpo-farmaco que pueden usarse para el diagnostico y/o tratamiento de trastornos proliferativos. Se entendera que, a menos que dicten lo contrario por el contexto, el termino "conjugado anticuerpo-farmaco" o "ADC" o la formula M- [LD] n se lleva a cabo para abarcar conjugados que comprenden restos tanto terapeuticos y de diagnostico. En tales ejemplos compuestos conjugados anticuerpo-farmaco comprenderan un modulador de DLL3 (tlpicamente un anticuerpo anti-DLL3) como el modulador o unidad de union celular (abreviado como CBA, M, o Ab en el presente documento), un agente terapeutico (por ejemplo, agente contra el cancer) o resto de diagnostico (D), y opcionalmente un enlazador (L) que une el farmaco y el agente de union a antlgeno. Para los fines de la presente descripcion "n" se emplea para referirse a un numero entero de 1 a 20. En un caso preferido, el modulador es un mAb dLL3 que comprende al menos una CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera tal como se describe anteriormente.
[0190] Los expertos en la tecnica entenderan que un numero de diferentes reacciones estan disponibles para la union o asociacion de restos y/o enlazadores terapeuticos o de diagnostico a agentes de union. En ejemplos seleccionados este puede llevarse a cabo por reaccion de los residuos de aminoacidos del agente de union, por ejemplo, molecula de anticuerpo, incluyendo los grupos amino de lisina, los grupos acido carboxllico libres de acido glutamico y aspartico, los grupos sulfhidrilo de la cistelna y los diversos restos de los aminoacidos aromaticos. Uno de los procedimientos no especlficos utilizados mas habitualmente de union covalente es la reaccion de carbodiimida para unir un grupo carboxi (o amino) de un compuesto a los grupos de anticuerpo amino (o carboxi). Adicionalmente, los agentes bifuncionales tales como dialdehldos o imidoesteres se han usado para enlazar el grupo amino de un compuesto a grupos amino de una molecula de anticuerpo. Tambien disponible para la union de los farmacos a agentes de union es la reaccion de base de Schiff. Este procedimiento implica la oxidacion con peryodato de un farmaco que contiene grupos glicol o hidroxilo, formando de este modo un aldehldo que se hace reaccionar luego con el agente de union. Adjunto se produce mediante la formacion de una base de Schiff con los grupos amino del agente de union. Isotiocianatos y azlactonas tambien se pueden utilizar como agentes de acoplamiento para unir covalentemente las drogas para agentes de union.
[0191] En otros ejemplos, los moduladores descritos de la descripcion NaY ser conjugados o asociados con protelnas, polipeptidos o peptidos que imparten caracterlsticas seleccionadas (por ejemplo, biotoxinas, biomarcadores, marcadores de purificacion, etc.). En ciertos ejemplos preferidos la presente descripcion abarca el uso de moduladores o fragmentos de los mismos fusionados de forma recombinante o conjugarse qulmicamente (incluyendo tanto covalente y conjugaciones no covalentes) a una protelna o peptido heterologo, en el que la protelna o peptido comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoacidos. El constructo no necesariamente necesita estar directamente relacionado, pero puede ocurrir a traves de secuencias de engarce de aminoacidos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse para dirigir polipeptidos heterologos a tipos de celulas particulares que expresan DLL3, ya sea in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los moduladores de la presente descripcion a anticuerpos especlficos para receptores particulares de la superficie celular para proporcionar construcciones biespeclficas. Ademas, los moduladores condensados o conjugados con polipeptidos heterologos se pueden usar tambien en inmunoensayos in vitro y pueden ser particularmente compatible con la metodologla de purificacion (por ejemplo, sus-tags) como se conoce en la tecnica. Vease, por ejemplo, la publicacion internacional n° WO 93/21232; Patente Europea N° EP 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Leton. 39: 91-99; Patente de Estados Unidos. No. 5.474.981; Gillies et al, 1992, PNAS 89: 1428-1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452.
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B. Enlazadores
[0192] Ademas de los enlazadores peptldicos mencionados anteriormente o espaciadores, se entendera que varias otras variedades o tipos de enlazador se pueden usar para asociar los moduladores descritos con restos farmaceuticamente activos o de diagnostico o modificadores biocompatibles. En algunas realizaciones, el enlazador es escindible en las condiciones intracelulares, tales que la escision del enlazador libera la unidad de medicamento a partir del anticuerpo en el medio intracelular. En aun otras realizaciones, la unidad de enlazador no es escindible y el farmaco se libera, por ejemplo, por la degradacion del anticuerpo.
[0193] Los enlazadores de la ADC son preferiblemente estables extracelularmente, evitar la agregacion de moleculas de ADC y mantener el ADC libremente soluble en medio acuoso y en un estado monomerico. Antes del transporte o entrega en una celula, el conjugado anticuerpo-farmaco (ADC) es preferiblemente estable y permanece intacta, es decir, el anticuerpo permanece vinculado con el resto de farmaco. Los enlazadores son estables fuera de la celula diana y pueden ser escindidos a una tasa eficaz en el interior de la celula. Un enlazador efectiva sera: (i) mantener las propiedades de union especlfica del anticuerpo; (li) permitir la entrega intracelular del conjugado o resto de farmaco; (lii) se mantienen estables e intactas, es decir no escindido, hasta que el conjugado ha sido entregado o transportado a su sitio diana; y (iv) mantener un citotoxico, efecto de destruccion celular o un efecto citostatico del resto de farmaco PBD. La estabilidad de la ADC puede medirse mediante tecnicas anallticas estandar tales como espectroscopla de masas, HPLC, y la separacion/analisis tecnica LC/MS. La union covalente del anticuerpo y el resto de farmaco requiere que el enlazador que tiene dos grupos funcionales reactivos, es decir bivalencia en un sentido reactiva. Los reactivos enlazadores bivalentes que son utiles para unir dos restos o mas funcionales o biologicamente activos, tales como peptidos, acidos nucleicos, farmacos, toxinas, anticuerpos, haptenos, y grupos informadores son conocidos, y los procedimientos se han descrito sus conjugados resultantes (Hermanson, GT (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press: Nueva York, p 234-242).
[0194] Con este fin ciertas realizaciones de la invencion comprenden el uso de un enlazador que es escindible por un agente de escision que esta presente en el medio intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveolae). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador de peptidilo que se escinde por una peptidasa intracelular o una enzima proteasa, incluyendo, pero no limitado a, un lisosomica o endosomica de la proteasa. En algunas realizaciones, el enlazador de peptidilo es de al menos dos aminoacidos de longitud o al menos tres aminoacidos de longitud. agentes de escision pueden incluir las catepsinas B y D y la plasmina, cada uno de los cuales se sabe que hidrolizan derivados de farmacos dipeptldicos dando como resultado la liberacion del farmaco activo dentro de las celulas diana. Los enlazadores peptldicos de ejemplo que son escindibles por la tiol proteasa dependiente de catepsina-B son se ha encontrado peptidos que comprenden Phe-Leu desde catepsina-B a ser altamente expresado en el tejido canceroso. Otros ejemplos de tales enlazadores se describen, por ejemplo, en el documento USPN 6.214.345 y USPN 2012/0078028.
[0195] En una realizacion preferida especlfica, el enlazador de peptidilo escindible mediante una proteasa intracelular es un enlazador Val-Cit, un enlazador de Ala-Val o un enlazador Phe-Lys tal como se describe en el documento USPN 6.214.345. Una ventaja de usar la liberacion proteolltica intracelular del agente terapeutico es que el agente es tlpicamente atenuada cuando se conjugan y las estabilidades sericas de los conjugados son generalmente altos.
[0196] En otras realizaciones, el enlazador escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrolisis a ciertos valores de pH. Tlpicamente, el enlazador sensible al pH hidrolizable en condiciones acidas. Por ejemplo, un enlazador labil en medio acido que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, oxima, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconltica, ortoester, acetal, cetal, o similares) pueden ser utilizados (Vease, por ejemplo, USPN 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929). Tales enlazadores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como las de la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma.
[0197] En otras realizaciones, el enlazador es escindible en condiciones reductoras (por ejemplo, un enlazador de disulfuro). Una variedad de enlazadores disulfuro son conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, los que se pueden formar usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridilditio) tolueno). En aun otras realizaciones especlficas, el enlazador es un enlazador de malonato (Johnson et al, 1995, Anticancer Res. 15:. 1387-1393), un enlazador de maleimidobenzoilo (Lau et al, 1995, Bioorg-Med-Chem 3 (10 ): 1299-1304), o un analogo de 3'-N-amida (Lau et al, 1995, Bioorg-Med-Chem 3 (10):.. 305-12). En aun otras realizaciones, la unidad de enlazador no es escindible y el farmaco se libera por la degradacion del anticuerpo. (Vease la publicacion N° 2005/0238649).
[0198] Mas particularmente, en realizaciones preferidas (expuestas en el documento USPN 2011/0256157) los enlazadores compatibles comprenderan:
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en el que el asterisco indica el punto de union con el agente citotoxico, CBA es un agente de union celular/modulador, L1 es un enlazador, a es un grupo de conexion que conecta L1 al agente de union celular, L2 es un enlace covalente o junto con -OC(=O)- forma un enlazador autoinmolativo, y L1 o L2 es un enlazador escindible.
[0199] L1 es preferiblemente el enlazador escindible, y puede ser referido como un desencadenante para la activacion del enlazador para la escision.
[0200] La naturaleza de L1 y L2, cuando estan presentes, puede variar ampliamente. Estos grupos se eligen sobre la base de sus caracterlsticas de escision, que puede ser dictada por las condiciones en el sitio al que se libera el conjugado. Se prefieren los enlazadores que se escinden por la accion de enzimas, aunque tambien pueden usarse enlazadores que son escindibles por cambios en el pH (por ejemplo labil a acido o base), la temperatura o tras irradiacion (por ejemplo, fotolabiles). Los enlazadores que son escindibles bajo condiciones de reduccion o de oxidacion tambien pueden usarse en la presente invencion.
[0201] L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoacidos. La secuencia de aminoacidos puede ser el sustrato diana para la escision enzimatica, permitiendo as! la liberation de R10 de la position N10.
[0202] En una realization, L1 es escindible por la accion de una enzima. En una realization, la enzima es una esterasa o una peptidasa.
[0203] En una realizacion, L2 esta presente y, junto con -C(=O)O- forma un enlazador autoinmolativo. En una realizacion, L2 es un sustrato para la actividad enzimatica, permitiendo as! la liberacion de R10 de la posicion N10.
[0204] En una realizacion, en la que L1 es escindible por la accion de una enzima y L2 esta presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L2.
L1 y L2, cuando estan presentes, pueden estar conectados por un enlace seleccionado de:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, y -NHC(=O)NH-.
[0205] Un grupo amino de L1 que se conecta a L2 puede ser el extremo N-terminal de un aminoacido o puede ser derivado de un grupo amino de una cadena lateral de aminoacido, por ejemplo una cadena lateral de aminoacido de lisina.
[0206] Un grupo carboxilo de L1 que se conecta a L2 puede ser el extremo C-terminal de un aminoacido o puede ser derivado de un grupo carboxilo de una cadena lateral de aminoacido, por ejemplo una cadena lateral de aminoacido de acido glutamico.
[0207] Un grupo hidroxilo de L1 que se conecta a L2 puede derivar de un grupo hidroxilo de una cadena lateral de aminoacido, por ejemplo, una cadena lateral de aminoacido serina.
[0208] El termino "cadena lateral de aminoacido" incluye aquellos grupos que se encuentran en: (i) aminoacidos de origen natural tales como alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistelna, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina; (ii) los aminoacidos menores, tales como ornitina y citrulina; (iii) los aminoacidos no naturales, beta-aminoacidos, analogos sinteticos y derivados de aminoacidos de origen natural; y (iv) todos los enantiomeros, diastereomeros, enriquecidos isomericamente, isotopicamente marcados (por ejemplo 2H, 3H, 14C, 15N), formas protegidas, y mezclas racemicas de los mismos.
[0209] En una realizacion, -C(=O)O- y L2 juntos forman el grupo:
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en el que el asterisco indica el punto de union a la posicion del farmaco o agente citotoxico, la ilnea ondulada indica el punto de union al enlazador L1, y es -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- o -C(=O)O-, y n es de 0 a 3. El anillo de fenileno esta opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como se describe en el presente documento. En una realizacion, el grupo fenileno esta opcionalmente sustituido con halo, NO2, R o OR.
[0210] En una realizacion, Y es NH.
[0211] En una realizacion, n es 0 o 1. Preferiblemente, n es 0.
[0212] Cuando Y es NH y n es 0, el enlazador autoinmolativo puede ser denominado como un enlazador p- aminobencilcarbonilo (ABC).
[0213] El enlazador autoinmolativo permitira la liberacion del compuesto protegido cuando se activa un sitio remoto, procediendo a lo largo de las lineas que se muestran a continuation (para n = 0):
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en el que L* es la forma activada de la portion restante del enlazador. Estos grupos tienen la ventaja de separar el sitio de activation del compuesto que se protege. Como se describio anteriormente, el grupo fenileno puede estar opcionalmente sustituido.
En una realizacion descrita en el presente documento, el grupo L* es un enlazador L1 como se describe en el presente documento, que puede incluir un grupo dipeptido.
[0214] En otra realizacion, -C(=O)O- y L2 juntos forman un grupo seleccionado de:
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en el que el asterisco, la llnea ondulada, Y y n son como se definen anteriormente. Cada anillo de fenileno esta opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes, tal como se describe en el presente documento. En una realizacion, el anillo de fenileno que tiene el sustituyente Y esta opcionalmente sustituido y el anillo de fenileno que no tiene el sustituyente Y esta no sustituido. En una realizacion, el anillo de fenileno que tiene el sustituyente Y no esta sustituido y el anillo de fenileno que no tiene el sustituyente Y esta opcionalmente sustituido.
[0215] En otra realizacion, -C(=O)O- y L2 juntos forman un grupo seleccionado de:
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en el que el asterisco, la llnea ondulada, Y y n son como se ha definido anteriormente, E es O, S o NR, D es N, CH, o CR, y F es N, CH o CR.
[0216] En una realizacion, D es N.
[0217] En una realizacion, D es CH.
[0218] En una realizacion, E es O o S.
[0219] En una realizacion, F es CH.
[0220] En una realizacion preferida, el enlazador es un enlazador labil de catepsina.
[0221] En una realizacion, L1 comprende un dipeptido. El dipeptido se puede representar como -NH-X1-X2-CO-, donde NH- y -CO- representan los extremos N y C terminales de los grupos de aminoacidos X1 y X2, respectivamente. Los aminoacidos en el dipeptido pueden ser cualquier combination de aminoacidos naturales. Cuando el enlazador es un enlazador labil de catepsina, el dipeptido puede ser el sitio de action para la escision mediada por catepsina.
[0222] Ademas, para aquellos grupos de aminoacidos que tienen funcionalidad carboxilo o amino de la cadena lateral, por ejemplo Glu y Lys, respectivamente, CO y NH pueden representar esa funcionalidad de la cadena lateral.
[0223] En una realizacion, el grupo -X1-X2- en dipeptido, -NH-X1-X2-CO-, se selecciona de:
-Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg- y -Trp-Cit- donde Cit es citrulina.
[0224] Preferiblemente, el grupo -X1-X2- en dipeptido, -NH-X1-X2-CO-, se selecciona de:
-Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys- y -Val-Cit-.
[0225] Mas preferiblemente, el grupo -X1-X2- en dipeptido, -NH-X1-X2-CO-, es -Phe-Lys- o -Val-Ala-.
[0226] Otras combinaciones de dipeptidos se pueden usar, incluyendo los descritos por Dubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13.855-869.
[0227] En una realizacion, la cadena lateral de aminoacido se derivatiza, cuando sea apropiado. Por ejemplo, un grupo amino o grupo carboxi de una cadena lateral de aminoacido puede derivatizarse.
[0228] En una realizacion, un grupo amino NH2 de la cadena lateral de aminoacido, tal como lisina, es una forma derivatizada seleccionada del grupo que consiste en NHR y NRR'.
[0229] En una realizacion, un grupo carboxi COOH de la cadena lateral de aminoacido, tal como acido aspartico, es una forma derivatizada seleccionada del grupo que consiste en COOR, CONH2, CONHR y CONRR'.
[0230] En una realizacion, la cadena lateral de aminoacidos se protege qulmicamente, cuando sea apropiado. El grupo protector de cadena lateral puede ser un grupo, tal como se discute a continuation, en relation con el grupo RL. Las secuencias de aminoacidos protegidas son escindibles por enzimas. Por ejemplo, se ha establecido que una secuencia de dipeptido que comprende un residuo de Lys protegido con cadena lateral Boc es escindible por la catepsina.
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[0231] Los grupos protectores para las cadenas laterales de aminoacidos son bien conocidos en la tecnica y se describen en el catalogo Novabiochem. Las estrategias de grupos protectores adicionales se exponen en Protective Groups in Organic Synthesis, Greene y Wuts.
[0232] Los posibles grupos protectores de cadena lateral se muestran a continuacion para aquellos aminoacidos que tienen funcionalidad de la cadena lateral reactiva:
Arg: Z, MTR, Tos;
Asn: Trt, Xan;
Asp: Bzl, t-Bu;
Cys: ACM, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt;
Glu: Bzl, t-Bu;
Gln: Trt, Xan;
His: Boc, el DNP, Tos, Trt;
Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc;
Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS;
Thr: Bz;
Trp: Boc;
Tyr: Bzl, Z, Z-Br.
[0233] En una realizacion, se selecciona la protection de la cadena lateral para ser ortogonal a un grupo proporcionado como, o como parte de, un grupo de termination, cuando esta presente. Por lo tanto, la elimination del grupo protector de cadena lateral no se elimina el grupo de terminacion, o cualquier funcionalidad de grupo protector que es parte del grupo de terminacion.
[0234] En otras realizaciones de la invention, los aminoacidos seleccionados son aquellos que tienen ninguna funcionalidad de cadena lateral reactiva. Por ejemplo, los aminoacidos pueden ser seleccionados de: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, y Val.
[0235] En una realizacion, el dipeptido se utiliza en combination con un enlazador autoinmolativo. El enlazador autoinmolativo puede estar conectado a -X2-.
[0236] Cuando un enlazador autoinmolativo esta presente, -X2- esta conectado directamente al enlazador autoinmolativo. Preferiblemente, el grupo -X2-CO- esta conectado a Y, donde Y es NH, formando de este modo el grupo -X2-CO-NH-.
[0237] -NH-X1- esta conectado directamente a A. A puede comprender la funcionalidad -CO- de este modo para formar un enlace amida con -X1-.
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[0238] En una realizacion, L1 y L2 junto con -OC(=O)- comprenden el grupo NH-X1-X2-CO-PABC-. El grupo PABC esta conectado directamente al agente citotoxico. Preferiblemente, el enlazador autoinmolativo y el dipeptido juntos forman el grupo -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-, que se ilustra a continuacion:
en el que el asterisco indica el punto de union al resto citotoxico seleccionado y la llnea ondulada indica el punto de union a la parte restante del enlazador L1 o el punto de union a A. Preferiblemente, la llnea ondulada indica el punto de union a A. La cadena lateral del aminoacido Lys puede estar protegida, por ejemplo, con Boc, Fmoc, o Alloc, tal como se describe anteriormente.
[0239] Alternativamente, el enlazador autoinmolativo y el dipeptido juntos forman el grupo -NH-Val-Ala-CO-NH- PABC-, que se ilustra a continuacion:
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en el que el asterisco y la llnea ondulada son como se definen anteriormente.
[0240] Alternativamente, el enlazador autoinmolativo y el dipeptido juntos forman el grupo -NH-Val-Cit-CO-NH- PABC-, que se ilustra a continuacion:
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en el que el asterisco y la llnea ondulada son como se definen anteriormente.
[0241] En algunas realizaciones de la presente invencion, se puede preferir que si el resto de farmaco contiene un enlace imina sin protection, por ejemplo, si la fraction B esta presente, entonces el enlazador no contiene un grupo amino libre (H2N). Asl, si el enlazador tiene la estructura -AL1-L2- entonces esta preferiblemente no contendrla un grupo amino libre. Esta preferencia es particularmente relevante cuando el enlazador contiene un dipeptido, por ejemplo, como L1; en esta realization, serla preferible que uno de los dos aminoacidos no se seleccione de lisina.
[0242] Sin desear estar ligado por la teorla, la combination de un enlace imina sin proteccion en el resto de farmaco y un grupo amino libre en el enlazador puede causar la dimerization del resto de farmaco-enlazador que puede interferir con la conjugation de dicho resto de farmaco-enlazador a un anticuerpo. La reaction cruzada de estos grupos puede ser acelerada en el caso de que el grupo amino libre este presente como un ion de amonio (H3N+-), tal como cuando un acido fuerte (por ejemplo, TFA) se ha utilizado para desproteger el grupo amino libre.
[0243] En una realizacion, A es un enlace covalente. Por lo tanto, L1 y el agente de union celular estan conectados directamente. Por ejemplo, cuando L1 comprende una secuencia de aminoacidos contigua, el extremo N-terminal de la secuencia puede conectarse directamente con el agente de union celular.
[0244] Por lo tanto, cuando A es un enlace covalente, la conexion entre el agente de union celular y L1 puede seleccionarse de:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -C(=O)NHC(= O)-, -S-, -SS-, -CH2C(=O)-, y =N-NH-.
[0245] Un grupo amino de L1 que se conecta al modulador de DLL3 puede ser el extremo N-terminal de un aminoacido o puede ser derivado de un grupo amino de una cadena lateral de aminoacido, por ejemplo cadena lateral de aminoacido lisina.
[0246] Un grupo carboxilo de L1 que se conecta al modulador puede ser el extremo C-terminal de un aminoacido o puede ser derivado de un grupo carboxilo de una cadena lateral de aminoacido, por ejemplo cadena lateral de aminoacido acido glutamico.
[0247] Un grupo hidroxilo de L1 que se conecta con el agente de union celular puede derivarse de un grupo hidroxilo de una cadena lateral de aminoacido, por ejemplo, una cadena lateral de aminoacido serina.
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[0248] Un grupo tiol de L1 que se conecta a un agente modulador puede derivarse de un grupo tiol de una cadena lateral de aminoacido, por ejemplo, una cadena lateral de aminoacido serina.
[0249] Los comentarios anteriores en relacion con los grupos amino, carboxilo, hidroxilo y tiol de L1 se aplican tambien al agente de union celular
[0250] En una realizacion, L2 junto con -OC(=O)- representa:
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en el que el asterisco indica el punto de union a la posicion N10, la llnea ondulada indica el punto de union a L1, n es 0 a 3, Y es un enlace covalente o un grupo funcional, y E es un grupo activable, por ejemplo por accion enzimatica o la luz, para generar as! una unidad autoinmolativa. El anillo de fenileno esta opcionalmente sustituido adicionalmente con uno, dos o tres sustituyentes, tal como se describe en el presente documento. En una realizacion, el grupo fenileno esta opcionalmente sustituido adicionalmente con halo, NO2, R o OR. Preferiblemente, n es 0 o 1, lo mas preferiblemente 0.
[0251] E se selecciona de manera que el grupo es susceptible a la activacion, por ejemplo por la luz o por la accion de una enzima. E puede ser -NO2 o acido glucuronico. El primero puede ser susceptible a la accion de una nitrorreductasa, la ultima a la accion de una b-glucoronidasa.
[0252] En esta realizacion, el enlazador autoinmolativo permitira la liberacion del compuesto protegido cuando se activa E, procediendo a lo largo de las llneas que se muestran a continuacion (para n = 0):
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en el que el asterisco indica el punto de union a la posicion N10, E* es la forma activada de E, e Y es como se describe anteriormente. Estos grupos tienen la ventaja de separar el sitio de activacion del compuesto protegido. Como se describio anteriormente, el grupo fenileno puede estar opcionalmente sustituido adicionalmente.
[0253] El grupo Y puede ser un enlace covalente a L1.
[0254] El grupo Y puede ser un grupo funcional seleccionado de entre:
-C(=O)-, -NH-, -O-, -C(O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O) NH-, -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)-, y -S-.
[0255] Cuando L1 es un dipeptido, se prefiere que Y sea -NH- o -C(=O)-, formando as! un enlace amida entre L1 y Y. En esta realizacion, la secuencia de dipeptido no tiene que ser un sustrato para una actividad enzimatica.
[0256] En otra realizacion, A es un grupo espaciador. Por lo tanto, L1 y el agente de union celular estan conectados indirectamente.
[0257] L1 y A pueden estar conectados por un enlace seleccionado de:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, y -NHC(=O)NH-.
[0258] Preferiblemente, el enlazador contiene un grupo funcional electrofilo para la reaccion con un grupo funcional nucleofilo sobre el modulador. Los grupos nucleofilos en los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cistelna, y (iv) hidroxilo o grupos amino de azucar, donde el anticuerpo esta glicosilado. Los grupos amina, tiol, y hidroxilo son nucleofilos y son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofilos en los restos de enlazador y reactivos enlazadores que incluyen: (i) grupos maleimida (ii) disulfuros activados, (iii)
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esteres activos, tales como esteres de NHS (N-hidroxisuccinimida), esteres de HOBt (N-hidroxibenzotriazol), haloformiatos y haluros de acido; (iv) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; y (v) aldehldos, cetonas, carboxilo, y, algunos de los cuales se ejemplifican a continuacion:
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[0259] Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducibles, es decir, puentes de cistelna. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugacion con reactivos enlazadores mediante el tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente de cistelna formara asl, teoricamente, dos nucleofilos de tiol reactivos. Se pueden introducir grupos nucleofilos adicionales en anticuerpos a traves de la reaccion de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), dando lugar a la conversion de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden ser introducidos en el anticuerpo (o fragmento del mismo) mediante la introduccion de uno, dos, tres, cuatro, o mas residuos de cistelna (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o mas residuos de aminoacido de cistelna no nativos). El documento US 7521541 ensena el diseno de anticuerpos mediante la introduccion de aminoacidos de cistelna reactivos.
[0260] En algunas realizaciones, un enlazador tiene un grupo nucleofilo reactivo que es reactivo con un grupo electrofilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrofilos utiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, grupos carbonilo de aldehldo y cetona. El heteroatomo de un grupo nucleofilo de un enlazador puede reaccionar con un grupo electrofilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente a una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleofilos utiles sobre un enlazador incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidroxilo, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, y arilhidrazida. El grupo electrofilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la union a un enlazador.
[0261] En una realizacion, el grupo A es:
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en el que el asterisco indica el punto de union a L1, la llnea ondulada indica el punto de union al agente de union celular, y n es 0 a 6. En una realizacion, n es 5.
[0262] En una realizacion, el grupo A es:
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en el que el asterisco indica el punto de union a L1, la llnea ondulada indica el punto de union al agente de union celular, y n es 0 a 6. En una realizacion, n es 5.
[0263] En una realizacion, el grupo A es:
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en el que el asterisco indica el punto de union a L1, la ilnea ondulada indica el punto de union al agente de union celular, n es 0 o 1, y m es de 0 a 30. En una realizacion preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, 1 a 8, preferiblemente de 4 a 8, y lo mas preferiblemente 4 u 8. En otra realizacion, m es de 10 a 30, y preferiblemente de 20 a 30. Alternativamente, m es de 0 a 50. En esta realizacion, m es preferiblemente 10-40 y n es 1.
[0264] En una realizacion, el grupo A es:
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en el que el asterisco indica el punto de union a L1, la llnea ondulada indica el punto de union al agente de union celular, n es 0 o 1, y m es de 0 a 30. En una realizacion preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, 1 a 8, preferiblemente de 4 a 8, y lo mas preferiblemente 4 u 8. En otra realizacion, m es de 10 a 30, y preferiblemente de 20 a 30. Alternativamente, m es de 0 a 50. En esta realizacion, m es preferiblemente 10-40 y n es 1.
[0265] En una realizacion, la conexion entre el agente de union celular y A es a traves de un residuo de tiol del agente de union celular y un grupo maleimida de A.
[0266] En una realizacion, la conexion entre el agente de union celular y A es:
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en el que el asterisco indica el punto de union a la parte restante de A y la linea ondulada indica el punto de union a la parte restante del agente de union celular. En esta realizacion, el atomo de S deriva tlpicamente del modulador.
[0267] En cada una de las realizaciones anteriores, puede utilizarse una funcionalidad alternativa en lugar del grupo derivado de maleimida que se muestra a continuacion:
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en el que la llnea ondulada indica el punto de union al agente de union celular como antes, y el asterisco indica el enlace a la parte restante del grupo A.
[0268] En una realizacion, el grupo derivado de maleimida se sustituye por el grupo:
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en el que la llnea ondulada indica el punto de union con el agente de union celular, y el asterisco indica el enlace a la parte restante del grupo A .
[0269] En una realization, el grupo derivado de maleimida se sustituye por un grupo, que opcionalmente junto con el agente de union celular, se selecciona de:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH- , -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)-, -S-, -SS-, -CH2C(=O)-, -C(=O)CH2-, =N-NH- y -NH-.
[0270] En una realizacion, el grupo derivado de maleimida se sustituye por un grupo que opcionalmente junto con el agente de union celular, se selecciona entre:
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en los que la llnea ondulada indica el punto de union al agente de union celular o el enlace con la parte restante del grupo A, y el asterisco indica el otro del punto de union al agente de union celular o la union a la parte restante del grupo A.
[0271] Otros grupos adecuados para la conexion de L1 al modulador seleccionado se describen en el documento WO 2005/082023.
[0272] En otro ejemplo preferido, los moduladores de la presente description pueden estar asociados con pollmeros biocompatibles que comprenden unidades enlazadoras de farmacos. A este respecto uno de dicho tipo de pollmero compatible comprende pollmeros Fleximer® (Mersana Therapeutics). Se ha descrito que tales pollmeros son biodegradables, bien tolerados y se han validado cllnicamente. Ademas, tales pollmeros son compatibles con un numero de tecnologlas y qulmicas de enlazadores personalizables que permiten el control de la farmacocinetica, la localization de la liberation del farmaco y una mejor biodistribucion.
[0273] Los moduladores seleccionados tambien pueden ser radioisotopos directamente conjugados o pueden comprender quelantes macroclclicos utiles para conjugar iones radiometalicos (tal como se describe en este documento). En ciertas realizaciones, el quelante macroclclico es acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N, N', N ' N' -tetraacetico (DOTA) que puede unirse al anticuerpo mediante una molecula enlazadora. Dichas moleculas enlazadoras son conocidas habitualmente en la tecnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10: 553; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Medicine. Biol. 26: 943.
[0274] Mas generalmente, las tecnicas para conjugar restos terapeuticos o agentes citotoxicos a los moduladores son bien conocidas. Como se discutio anteriormente los restos pueden conjugarse con moduladores mediante cualquier procedimiento reconocido en la tecnica, incluyendo, pero no limitado a union de aldehldo/Schiff, union de sulfhidrilo, union labil en medio acido, union cis-aconitilo, union de hidrazona, union enzimaticamente degradable (vease, en general Garnett , 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171). Tambien vease, por ejemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Eds.), pag. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (Eds.), Pp 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (Eds.), pag. 475-506 (1985); "Analysis, resultas and future prospective of the therapeutic use of radiolabeled antibody in cancer therapy”, in Monoclonal antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (Eds.), pag. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119. En ejemplos preferidos un modulador de DLL3 que se conjuga a un agente citotoxico o resto terapeutico puede ser internalizado por una celula tras la union a una molecula dLL3 asociada con la superficie celular, liberando de esta forma la carga util terapeutica.
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C. Modificadores biocompatibles
[0275] En los ejemplos seleccionados, los moduladores de la descripcion pueden conjugarse o asociarse de otro modo con modificadores biocompatibles que pueden utilizarse para ajustar, modificar, mejorar o moderar caracterlsticas del modulador, segun se desee. Por ejemplo, los anticuerpos o construcciones de fusion con mayor vida media in vivo se pueden generar uniendo moleculas polimericas de peso molecular relativamente alto, tales como polietilenglicol comercialmente disponible (PEG) o pollmeros biocompatibles similares. Los expertos en la tecnica entenderan que el PEG se puede obtener en muchas configuraciones moleculares y de peso molecular diferentes que se pueden seleccionar para impartir propiedades especlficas al anticuerpo (por ejemplo, se puede adaptar la vida media). El PEG se puede unir a moduladores o a fragmentos de anticuerpos o derivados con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a traves de la conjugation especlfica de sitio del PEG al extremo N o C-terminal de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o a traves de grupos epsilon-amino presentes en los residuos de lisina. Puede utilizarse la derivatizacion de pollmero lineal o ramificado que tiene como resultado una perdida minima de actividad biologica. El grado de conjugacion puede ser estrechamente monitorizado por SDS-PAGE y espectrometrla de masas para asegurar la conjugacion optima de moleculas de PEG a moleculas de anticuerpo. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, cromatografla de exclusion por tamano o cromatografla de intercambio ionico. De una manera similar, los moduladores descritos pueden conjugarse a albumina con el fin de hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea mas estable in vivo o tenga una vida media mas larga in vivo. Las tecnicas son bien conocidas en el setor, vease por ejemplo, la Publication Internacional No. WO 93/15199, WO 93/15200, y WO 01/77137; y la Patente Europea No. 0 413 622. Otros conjugados biocompatibles son evidentes para los expertos y pueden facilmente ser identificados segun las ensenanzas del presente documento.
D. Agentes de diagnostico o detection
[0276] En otros ejemplos preferidos, los moduladores de la presente descripcion, o fragmentos o derivados de los mismos, se conjugan a un agente de diagnostico o detectable, marcador o informador que puede ser, por ejemplo, una molecula biologica (por ejemplo, un peptido o nucleotido), una molecula pequena, fluoroforo, o un radioisotopo. Los moduladores marcados pueden ser utiles para monitorizar el desarrollo o progresion de un trastorno hiperproliferativo o como parte de un procedimiento de ensayo cllnico para determinar la eficacia de una terapia en particular que incluyen los moduladores descritos (es decir teragnostico) o para determinar una futura evolution del tratamiento. Tales marcadores o informadores tambien pueden ser utiles en la purification del modulador seleccionado, analisis de moduladores (por ejemplo, union a epltopo o agrupacion de anticuerpos), separation o aislamiento de TIC o en procedimientos precllnicos o estudios de toxicologla.
[0277] Dicho analisis de diagnostico y/o deteccion se puede lograr mediante el acoplamiento del modulador a sustancias detectables incluyendo, pero no limitado a, diversas enzimas que comprenden, por ejemplo peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; grupos prosteticos, tales como, pero no limitado a estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitado a, umbeliferona, fluorescelna, isotiocianato de fluorescelna, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescelna, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitado a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no limitado a, luciferasa, luciferina, y aecuorina; materiales radioactivos, tales como pero no limitados al yodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), azufre (15S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In,), y tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenon (133Xe), fluor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186R, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Tin; metales que emiten positrones usando diversas tomograflas de emision de positrones, iones metalicos paramagneticos no radioactivos, y moleculas que estan radiomarcadas o conjugadas a radioisotopos especlficos. En tales ejemplos, la metodologla de deteccion apropiada es bien conocida en la tecnica y esta facilmente disponible de numerosas fuentes comerciales.
[0278] Como se ha indicado anteriormente, en otros ejemplos, los moduladores o fragmentos de los mismos pueden fusionarse o conjugarse con secuencias marcadoras o compuestos, tales como un peptido o fluoroforo para facilitar procedimientos de purificacion o diagnostico o anallticos, tales como inmunohistoqulmica, interferometrla de biocapa, resonancia de plasmon de superficie, citometrla de flujo, ELISA competitivo, FACS, etc. En realizaciones preferidas, el marcador comprende una etiqueta de His tal como la proporcionada por el vector pQE (Qiagen), entre otros, muchos de los cuales estan disponibles comercialmente. Otras etiquetas peptldicas utiles para la purificacion incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epltopo derivado de la proteina hemaglutinina de la gripe: (Wilson et al, 1984, Cell 37 767) y la etiqueta "flag" (USPN 4.703.004).
B. Restos Terapeuticos
[0279] Tal como se ha aludido anteriormente, los moduladores o fragmentos o derivados de los mismos tambien pueden conjugarse, ligarse o fusionarse o en cualquier caso asociarse con un "resto terapeutico" o “farmaco”, tal como un agente antiproliferativa o agente contra el cancer, incluyendo, pero no limitado a, agentes citotoxicos, agentes citostaticos, agentes antiangiogenicos, agentes para la reduction de volumen, agentes quimioterapeuticos, radioterapia y agentes radioterapeuticos, agentes dirigidos contra el cancer, BRM, anticuerpos terapeuticos, vacunas
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contra el cancer, citoquinas, terapias hormonales, terapia de radiacion y agentes antimetastasicos y agentes inmunoterapeuticos.
[0280] Los agentes contra el cancer de ejemplo preferidos incluyen citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina, maitansinoides, tales como DM-1 y DM-4 (Immunogen, Inc.), diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procalna, tetracalna, lidocalna, propranolol, puromicina, epirubicina y ciclofosfamida y analogos u homologos de los mismos. Las citotoxinas compatibles adicionales comprenden dolastatinas y auristatinas, incluyendo monometil auristatina E (MMAE) y monometil auristatina F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitinas, tales como amanitina, beta-amanitina, gamma-amanitina o epsilon- amanitina (Heidelberg Pharma AG), agentes de union al surco menor de ADN, tales como derivados de duocarmicina (Syntarga, BV) y dlmeros de pirrolobenzodiazepinas modificados (Spirogen, Ltd.), inhibidores de corte y empalme tales como analogos meayamicina o derivados (por ejemplo, FR901464, tal como se establece en el documento USPN 7.825.267), agentes de union tubular, tales como analogos de epotilona y paclitaxel y agentes que danan el ADN, tales como caliqueamicinas y esperamicinas. Ademas, en ciertos ejemplos, los moduladores de DLL3 de la presente descripcion pueden estar asociados con moleculas de union anti-CD3 para reclutar celulas T citotoxicas y las tienen como dianas de celulas iniciadoras de tumores (tecnologla BiTE; vease, por ejemplo, Fuhrmann, S. et al. Annual Meeting of AACR Resumen N° 5625 (2010)).
[0281] Agentes contra el cancer compatibles adicionales incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, decarbazina 5-fluorouracilo), agentes alquilantes (por ejemplo, meclorotamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, y cisdiclorodiamin platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina), bleomicina y antramicina (AMC)), y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Una lista mas extensa de restos terapeuticos se puede encontrar en la publicacion PCT WO 03/075957 y el documento USPN 2009/0155255.
[0282] Como se indico anteriormente, realizaciones seleccionadas de la presente invencion se dirigen a los moduladores de DLL3 conjugados, tales como conjugados de anticuerpo anti-DLL3 y farmaco, que comprenden pirrolobenzodiazepina (PBD) como un agente citotoxico. Se entendera que las PBD son agentes alquilantes que ejercen actividad antitumoral mediante la union covalente a ADN en el surco menor y la inhibicion de la slntesis de acido nucleico. A este respecto, las PBD han demostrado tener propiedades antitumorales potentes mientras que exhiben depresion minima de la medula osea. Las PBD compatibles con la presente invencion pueden estar unidos al modulador de DLL3 usando uno cualquiera de varios tipos de enlazador (por ejemplo, un enlazador de peptidilo que comprende un resto maleimido con un sulfhidrilo libre) y, en ciertas realizaciones estan en forma dimerica (es decir, dlmeros de PBD). Se describen PBD compatibles (y enlazadores opcionales) que pueden estar conjugados a los moduladores descritos, por ejemplo, en USPNs 6.362.331, 7.049.311, 7.189.710, 7.429.658, 7.407.951, 7.741.319, 7.557.099, 8.034.808, 8.163.736 USPN 2011/0256157 y solicitudes PCT WO2011/130613, WO2011/128650 y WO2011/130616.
Por consiguiente, en realizaciones particularmente preferidas, el modulador comprendera un anticuerpo anti-DLL3 conjugado o asociado con uno o mas dlmeros de PBD (es decir, un ADC DLL3-PBD).
[0283] En realizaciones particularmente preferidas en el documento USPN 2011/0256157se describen PBD compatibles que pueden estar conjugadas a los moduladores descritos. En esta descripcion, los dimeros de PBD, es decir, los que comprenden dos restos de PBD, pueden ser preferibles. Por lo tanto, los conjugados preferidos de la presente invencion son aquellos que tienen las formulas (AB) o (AC):
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en las que:
las llneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C1 y C2 o C2 y C3 ;
R2 se selecciona independientemente de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R y COR, y opcionalmente seleccionados ademas de halo o dihalo;
en el que RD se selecciona independientemente de R, CO2R, COR, CHO, CO2H, y halo;
R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo;
R7 se selecciona independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo;
R10 es un enlazador conectado a un modulador o un fragmento o derivado del mismo, tal como se describe anteriormente;
Q se selecciona independientemente de O, S y NH;
R11 es H, o R o, cuando Q es O, SO3M, en el que M es un cation metalico;
R y R' se seleccionan cada uno independientemente de grupos alquilo C1-12, heterociclilo C3-20 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos, y opcionalmente en relacion con el grupo NRR'R y R' junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos forman un anillo heteroclclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; y en la que R2" , R6" , R7" , R9" , X", Q" y R11" son como se definen segun R2, R6, R7, R9, X, Q y R11 respectivamente, y RC es un grupo de terminacion.
Doble enlace
[0284] En una realizacion, no hay doble enlace presente entre C1 y C2, y C2 y C3.
[0285] En una realizacion, las llneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C2 y C3, tal como se muestra a continuation:
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[0286] En una realizacion, un doble enlace esta presente entre C2 y C3 cuando R2 es arilo C5-20 o alquilo C1-12.
[0287] En una realizacion, las llneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C1 y C2, tal como se muestra a continuacion:
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[0288] En una realizacion, un doble enlace esta presente entre C1 y C2 cuando R2 es arilo C5-20 o alquilo C1-12.
[0289] En una realizacion, R2 se selecciona independientemente de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2R, CO2R y COR, y opcionalmente seleccionados adicionalmente de halo o dihalo.
[0290] En una realizacion, R2 se selecciona independientemente de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2R, CO2R y COR.
[0291] En una realizacion, R2 se selecciona independientemente de H, =O, =CH2, R, =CH-RD y =C(RD)2.
[0292] En una realizacion, R2 es independientemente H.
[0293] En una realizacion, R2 es independientemente =O.
[0294] En una realizacion, R2 es independientemente =CH2.
[0295] En una realizacion, R2 es independientemente = CH-RD. Dentro del compuesto PBD, el grupo =CH-RD puede
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tener cualquier configuracion que se muestra a continuacion:
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[0296] En una realizacion, la configuracion es al configuracion (I).
[0297] En una realizacion, R2 es independientemente =C(RD)2.
[0298] En una realizacion, R2 es independientemente =CF2.
[0299] En una realizacion, R2 es independientemente R.
[0300] En una realizacion, R2 es independientemente arilo C5-20opcionalmente sustituido.
[0301] En una realizacion, R22 es independientemente alquilo Ci-i2opcionalmente sustituido.
[0302] En una realizacion, R2 es independientemente arilo C5-20opcionalmente sustituido.
[0303] En una realizacion, R2 es independientemente arilo C5-7opcionalmente sustituido.
[0304] En una realizacion, R2 es independientemente arilo Cs-i0opcionalmente sustituido.
[0305] En una realizacion, R2 es independientemente fenilo opcionalmente sustituido.
[0306] En una realizacion, R2 es independientemente naftilo opcionalmente sustituido.
[0307] En una realizacion, R2 es independientemente piridilo opcionalmente sustituido.
[0308] En una realizacion, R2 es independientemente quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituidos.
[0309] En una realizacion, R2 contiene de uno a tres grupos sustituyentes, con 1 y 2 siendo mas preferido, y grupos individualmente sustituidos los mas preferidos. Los sustituyentes pueden estar en cualquier posicion.
[0310] en la que R2 es un grupo arilo C5-7, un unico sustituyente esta preferiblemente en un atomo de anillo que no es adyacente a la union con el resto del compuesto, es decir, esta preferiblemente en beta o gamma con respecto al enlace con el resto del compuesto. Por lo tanto, cuando el grupo arilo C5-7 es fenilo, el sustituyente esta preferiblemente en las posiciones meta o para, y mas preferiblemente esta en la posicion para.
[0311] En una realizacion, R2 se selecciona de:
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donde el asterisco indica el punto de union
[0312] en la que R2 es un grupo arilo C8-10, por ejemplo quinolinilo o isoquinolinilo, que puede contener cualquier numero de sustituyentes en cualquier posicion de los anillos de quinolina o isoquinolina. En algunas realizaciones, contiene uno, dos o tres sustituyentes, y estos pueden estar en cualquiera de los anillos proximal y distal o ambos (si hay mas de un sustituyente).
[0313] En una realizacion, cuando R2 esta opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan de los
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sustituyentes indicados en la seccion de sustituyentes a continuacion.
[0314] Cuando R esta opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan preferiblemente de:
halo, hidroxilo, eter, formilo, acilo, carboxi, ester, aciloxi, amino, amido, acilamido, aminocarboniloxi, ureido, nitro, ciano y tioeter.
[0315] En una realizacion, en la que R o R2 esta opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan del grupo que consiste en R, OR, SR, NRR', NO2, halo, CO2R, COR, CONH2, CONHR y CONRR'.
[0316] en la que R2 es alquilo C1-12, el sustituyente opcional puede incluir adicionalmente grupos heterociclilo C3-20 y arilo C5-20.
[0317] en la que R2 es heterociclilo C3-20, el sustituyente opcional puede incluir adicionalmente grupos alquilo C1-12 y arilo C5-20.
[0318] en la que R2 es grupos arilo C5-20, el sustituyente opcional pueden incluir adicionalmente grupos heterociclilo C3-20 y alquilo C1-12.
[0319] Se entiende que el termino "alquilo" abarca las subclases alquenilo y alquinilo, as! como cicloalquilo. Por lo tanto, cuando R2 es alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, se entiende que el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o mas dobles o triples enlaces carbono-carbono, que pueden formar parte de un sistema conjugado. En una realizacion, el grupo alquilo C1-12 opcionalmente sustituido contiene al menos un doble o triple enlace carbono- carbono, y este enlace se conjuga con un doble enlace presente entre C1 y C2 o C2 y C3. En una realizacion, el grupo alquilo C1-12 es un grupo seleccionado de alquilo saturado C1-12, alquenilo C2-12, alquinilo C2-12 y cicloalquilo C3- 12.
[0320] Si un sustituyente en R2 es halo, es preferiblemente F o Cl, mas preferiblemente Cl.
[0321] Si un sustituyente en R2 es eter, es posible que en algunas realizaciones sea un grupo alcoxi, por ejemplo, un grupo alcoxi C1-7 (por ejemplo metoxi, etoxi) o en algunas realizaciones puede ser un grupo ariloxi C5-7 (por ejemplo fenoxi, piridiloxi, furaniloxi).
[0322] Si un sustituyente en R2 es alquilo C1-7, puede ser preferiblemente un grupo alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo).
[0323] Si un sustituyente en R2 es heterociclilo C3-7, en algunas realizaciones puede ser un grupo heterociclilo que contiene nitrogeno en C6, por ejemplo, morfolino, tiomorfolino, piperidinilo, piperazinilo. Estos grupos pueden estar unidos al resto de la fraccion de PBD a traves del atomo de nitrogeno. Estos grupos pueden estar sustituidos adicionalmente, por ejemplo, por grupos alquilo C1-4.
[0324] Si un sustituyente en R2 es bis-oxi-alquileno C1-3, este es preferiblemente bis-oxi-metileno o bis-oxi-etileno.
[0325] Los sustituyentes particularmente preferidos para R2 incluyen metoxi, etoxi, fluoro, cloro, ciano, bis-oxi- metileno, metil-piperazinilo, morfolino y metil-tienilo.
[0326] Los grupos particularmente preferidos R2 sustituidos incluyen, pero no se limitan a, 4-metoxifenilo, 3- metoxifenilo, 4-etoxi-fenilo, 3-etoxi-fenilo, 4-fluoro-fenilo, 4-cloro-fenil , 3,4-bisoximetilen-fenilo, 4-metiltienilo, 4- cianofenilo, 4-fenoxifenilo, quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo, isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo, 2-tienilo, 2-furanilo, metoxinaftilo, y naftilo.
[0327] En una realizacion, R2 es halo o dihalo. En una realizacion, R2 es -F o -F2, cuyos sustituyentes se ilustra a continuacion como (III) y (IV) respectivamente:
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[0328] En una realizacion, RD se selecciona independientemente de R, CO2R, COR, CHO, CO2H, y halo.
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[0329] En una realizacion, RD es independientemente R.
[0330] En una realizacion, RD es independientemente halo.
R6
[0331] En una realizacion, R6 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn- y Halo.
[0332] En una realizacion, R6 se selecciona independientemente de H, OH, OR, SH, NH2, NO2 y Halo.
[0333] En una realizacion, R6 se selecciona independientemente de H y halo.
[0334] En una realizacion, R6 es independientemente H.
[0335] En una realizacion, R6 y R7 juntos forman un grupo -O-(CH2)pO-, donde p es 1 o 2.
R7
[0336] R7 se selecciona independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo.
[0337] En una realizacion, R7 es independientemente OR.
[0338] En una realizacion, R7 es independientemente OR7A, donde R7A es independientemente alquilo C1-6 opcionalmente sustituido.
[0339] En una realizacion, R7A es independientemente alquilo C1-6 saturado opcionalmente sustituido.
[0340] En una realizacion, R7A es independientemente alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido.
[0341] En una realizacion, R7A es independientemente Me.
[0342] En una realizacion, R7A es independientemente CH2Ph.
[0343] En una realizacion, R7A es independientemente alilo.
[0344] En una realizacion, el compuesto es un dlmero en el que los grupos R7 de cada monomero forman juntos un puente dlmero que tiene la formula XR"-X que une los monomeros.
R8
[0345] En una realizacion, el compuesto es un dlmero en el que los grupos R8 de cada monomero forman juntos un puente dlmero que tiene la formula XR"-X que une los monomeros.
[0346] En una realizacion, R8 es independientemente OR8A, donde R8A es independientemente alquilo C1-4 opcionalmente sustituido.
[0347] En una realizacion, R8A es independientemente alquilo C1-6 saturado opcionalmente sustituido o alquenilo C2-4 opcionalmente sustituido.
[0348] En una realizacion, R8A es independientemente Me.
[0348] En una realizacion, R8A es independientemente CH2Ph.
[0350] En una realizacion, R8A es independientemente alilo.
[0351] En una realizacion, R8 y R7 juntos forman un grupo -O-(CH2)pO-, donde p es 1 o 2.
[0352] En una realizacion, R8 y R9 juntos forman un grupo -O-(CH2)pO-, donde p es 1 o 2.
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[0353] En una realizacion, R9 se selecciona independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn- y Halo.
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[0354] En una realizacion, R9 es independientemente H.
[0355] En una realizacion, R9 es independientemente R o OR.
R y R'
[0356] En una realizacion, R se selecciona independientemente de grupos alquilo C1-12, heterociclilo C3-20 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos. Estos grupos se definen cada uno en la seccion de sustituyentes a continuacion.
[0357] En una realizacion, R es independientemente alquilo C1-12 opcionalmente sustituido.
[0358] En una realizacion, R es independientemente heterociclilo C3-20 opcionalmente sustituido.
[0359] En una realizacion, R es independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido.
[0360] En una realizacion, R es independientemente alquilo C1-12 opcionalmente sustituido.
[0361] Descritos anteriormente en relacion con R2 hay diversas realizaciones que se refiere a grupos alquilo y arilo preferidos y la identidad y el numero de sustituyentes opcionales. Las preferencias establecidas para R2 como se aplica a R son aplicables, cuando sea apropiado, a todos los demas grupos R, por ejemplo en los que R6, R7, R8 o R9 es R.
[0362] Las preferencias para R se aplican tambien a R'.
[0363] En algunas realizaciones de la invencion, se proporciona un compuesto que tiene un grupo sustituyente - NRR'. En una realizacion, R y R' junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos forman un anillo heteroclclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido. El anillo puede contener un heteroatomo adicional, por ejemplo N, O o S.
[0364] En una realizacion, el anillo heteroclclico esta el mismo sustituido con un grupo R. Cuando esta presente un heteroatomo N adicional, el sustituyente puede estar en el heteroatomo N.
R"
[0365] R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o mas heteroatomos, por ejemplo O, S, N(H), NMe y/o anillos aromaticos, por ejemplo, benceno o piridina, cuyos anillos estan opcionalmente sustituidos.
[0366] En una realizacion, R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o mas heteroatomos y/o anillos aromaticos, por ejemplo benceno o piridina.
[0367] En una realizacion, el grupo alquileno esta interrumpido opcionalmente por uno o mas heteroatomos seleccionados de O, S y NMe y/o anillos aromaticos, cuyos anillos estan opcionalmente sustituidos.
[0368] En una realizacion, el anillo aromatico es un grupo arileno C5-20, en el que arileno se refiere a un resto divalente obtenido por eliminacion de dos atomos de hidrogeno de dos atomos de anillo aromatico de un compuesto aromatico, cuyo resto tiene de 5 a 20 atomos de anillo.
[0369] En una realizacion, R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o mas heteroatomos, por ejemplo O, S, N(H), NMe y/o anillos aromaticos, por ejemplo, benceno o piridina, cuyos anillos estan opcionalmente sustituidos por NH2.
[0370] En una realizacion. R" es un grupo alquileno C3-12.
[0371] En una realizacion, R" se selecciona de un grupo C3, C5, C7, C9 y C11.
[0372] En una realizacion, R" se selecciona de un grupo alquileno C3, C5 y C7.
[0373] En una realizacion, R" se selecciona de un grupo alquileno C3 y C5.
[0374] En una realizacion, R" es un grupo alquileno C3.
[0375] En una realizacion, R" es un grupo alquileno C5.
[0376] Los grupos alquileno mencionados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos y/o anillos aromaticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos estan opcionalmente sustituidos.
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[0377] Los grupos alquileno mencionados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o mas heteroatomos y/o anillos aromaticos, por ejemplo benceno o piridina.
[0378] Los grupos alquileno mencionados anteriormente pueden ser grupos alquileno alifaticos lineales no sustituidos.
X
[0379] En una realizacion, X se selecciona de O, S, o N (H).
[0380] Preferiblemente, X es O.
R0
[0381] Preferiblemente, los enlazadores compatibles, tales como los descritos anteriormente, unen un modulador de DLL3 (CBA/Ab/M), a un resto D del farmaco PBD a traves de un enlace o enlaces covalentes en la posicion R10 (es decir, N10). El enlazador es un resto bifuncional o multifuncional que puede ser utilizado para enlazar uno o mas restos de farmaco (D) y un modulador (preferiblemente un anticuerpo) para formar conjugados anticuerpo-farmaco (ADC). El enlazador (L) puede ser estable fuera de una celula, es decir, extracelular, o puede ser escindible por actividad enzimatica, hidrolisis u otras condiciones metabolicas. Los conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) se pueden preparar convenientemente usando un enlazador que tiene funcionalidad reactiva para la union al resto de farmaco y al anticuerpo. Una cistelna, tiol, o una amina, por ejemplo N-terminal o cadena lateral de aminoacido tal como lisina, del anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional de un enlazador o reactivo espaciador, resto de farmaco PBD (D) o reactivo enlazador a farmaco (D-L).
[0382] Muchos grupos funcionales en el enlazador unido a la posicion N10 del resto de PBD pueden ser utiles para reaccionar con el agente de union celular, por ejemplo, ester, tioester, amida, tioamida, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, eter, tioeter, o se pueden formar enlaces disulfuro a partir de la reaccion de los productos intermedios de enlazador-farmaco PBD y el agente de union celular.
[0383] En otra realizacion, el enlazador puede estar sustituido con grupos que modulan la agregacion, la solubilidad o reactividad. Por ejemplo, un sustituyente sulfonato puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo y facilitar la reaccion de acoplamiento del reactivo enlazador con el anticuerpo o el resto de farmaco, o facilitar la reaccion de acoplamiento de Ab-L con D, o D-L con Ab, dependiendo de la ruta sintetica empleada para preparar el ADC.
[0384] En una realizacion preferida, R10 es un grupo:
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en el que el asterisco indica el punto de union a la posicion N10, CBA es un agente de union celular/modulador, L1 es un enlazador, A es un grupo de conexion que conecta L1 al agente de union celular, L2 es un enlace covalente o junto con -OC(O)- forma un enlazador autoinmolativo, y L1 o L2 es un enlazador escindible.
[0385] L1 es preferiblemente el enlazador escindible, y puede ser referido como un desencadenante para la activacion del enlazador para la escision.
[0386] Como se discutio en la seccion anterior sobre enlazadores, la naturaleza de L1 y L2, cuando estan presentes, puede variar ampliamente. Estos grupos se eligen en base a sus caracterlsticas de escision, que pueden ser dictadas por las condiciones en el sitio al que se libera el conjugado. Se prefieren los enlazadores que se escinden por la accion de enzimas, aunque tambien pueden usarse enlazadores que son escindibles por cambios en el pH (por ejemplo labiles a acido o base), la temperatura o tras la irradiacion (por ejemplo, fotolabiles). Los enlazadores que pueden escindirse en condiciones oxidantes o reductoras tambien pueden usarse en la presente invencion.
[0387] L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoacidos. La secuencia de aminoacidos puede ser el sustrato diana para la escision enzimatica, permitiendo as! la liberation de R10 desde la posicion N10.
[0388] En una realizacion, L1 es escindible por la accion de una enzima. En una realizacion, la enzima es una esterasa o una peptidasa.
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[0389] En una realizacion, L2 esta presente y, junto con -C(=O)O- forma un enlazador autoinmolativo. En una realizacion, L2 es un sustrato para la actividad enzimatica, permitiendo as! la liberation de R10 desde la position N10.
[0390] En una realizacion, en la que L1 es escindible por la action de una enzima y L2 esta presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L2.
[0391] Con respecto a la union del enlazador elegido a un PBD seleccionado, el grupo RC es extralble de la posicion N10 de ciertos restos de PBD para dejar un enlace imina N10-C11, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, donde QR11 es OSO3M, un aducto de bisulfito, una tiocarbinolamina, una tiocarbinolamina sustituida, o una carbinalamina sustituida.
[0392] En una realizacion, RC puede ser un grupo protector que es extralble para dejar un enlace imina N10-C11, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, o, cuando QR11 es OSO3M, un aducto de bisulfito. En una realizacion, RC es un grupo protector que es extralble para dejar un enlace imina N10-C11.
[0393] El grupo RC pretende ser extralble en las mismas condiciones que las requeridas para la elimination del grupo R10, por ejemplo para producir un enlace imina N10-C11, una carbinolamina y as! sucesivamente. El grupo de termination actua como un grupo protector para la funcionalidad prevista en la posicion N10. El grupo de termination pretende no ser reactivo frente a un agente de union celular. Por ejemplo, RC no es el mismo que RL.
[0394] Los compuestos que tienen un grupo de terminacion pueden ser utilizados como intermedios en la slntesis de dlmeros que tienen un monomero de imina. Alternativamente, los compuestos que tienen un grupo de terminacion se pueden usar como conjugados, donde el grupo protector se elimina en la posicion diana para producir una imina, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida y as! sucesivamente. Asl, en esta realizacion, el grupo de terminacion puede ser denominado como un grupo protector de nitrogeno terapeuticamente extralble, tal como se define en el documento WO 00/12507.
[0395] En una realizacion, el grupo RC es extralble en las condiciones que escinden el enlazador RL del grupo R10. Por lo tanto, en una realizacion, el grupo de terminacion es escindible por la accion de una enzima.
[0396] En una realizacion alternativa, el grupo de terminacion es extralble antes de la conexion del enlazador RL al modulador. En esta realizacion, el grupo de terminacion es extralble en condiciones que no escinden el enlazador RL.
[0397] Cuando un compuesto incluye un grupo funcional G1 para formar una conexion con el agente de union celular, el grupo de terminacion es extralble antes de la adicion o desenmascaramiento de G1.
[0398] El grupo de terminacion puede ser usado como parte de una estrategia de grupo protector para asegurar que solo una de las unidades de monomero en un dlmero este conectado a un agente de union celular.
[0399] El grupo de terminacion puede ser utilizado como una mascara para un enlace imina N10-C11. El grupo de terminacion puede ser extraldo en el momento en el que se requiere la funcionalidad de imina en el compuesto. El grupo de terminacion es tambien una mascara para una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, y un aducto de bisulfito, tal como se describe anteriormente.
[0400] En una realizaciones RC es un grupo protector carbamato.
[0401] En una realizacion, el grupo protector carbamato se selecciona de:
Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ.
[0402] Opcionalmente, el grupo protector carbamato se selecciona ademas de Moc.
[0403] En una realizacion, RC es un grupo enlazador RL que carece del grupo funcional para la conexion al agente de union celular.
[0404] Esta solicitud se refiere particularmente a los grupos RC que son carbamatos.
[0405] En una realizacion, RC es un grupo:
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en el que el asterisco indica el punto de union a la posicion N10, G2 es un grupo de terminacion, L3 es un enlace covalente o un enlazador escindible L1, L2 es un enlace covalente o junto con OC(=O) forma un enlazador autoinmolativo.
donde L3 y L2 son ambos enlaces covalentes, G2 y OC(=O) juntos forman un grupo protector de carbamato tal como se definio anteriormente.
[0406] L1 es como se define anteriormente en relacion con R10
[0407] L2 es como se define anteriormente en relacion con R10
[0408] Varios grupos de terminacion se describen a continuacion, incluyendo los basados en grupos protectores bien conocidos.
[0409] En una realizacion L3 es un enlazador escindible L1, y L2, junto con OC(=O), forma un enlazador autoinmolativo. En esta realizacion, G2 es Ac (acetilo) o Moc, o un grupo protector de carbamato seleccionado de: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ. Opcionalmente, el grupo protector de carbamato se selecciona ademas de Moc.
[0410] En otra realizacion, G2 es un grupo acilo -C(=O)G3, en el que G3 se selecciona de alquilo (incluyendo cicloalquilo, alquenilo y alquinilo), heteroalquilo, heterociclilo y arilo (incluyendo heteroarilo y carboarilo). Estos grupos pueden estar opcionalmente sustituidos El grupo acilo junto con un grupo amino de L3 o L2, cuando sea apropiado, puede formar un enlace amida. El grupo acilo junto con un grupo hidroxi de L3 o L2, cuando sea apropiado, puede formar un enlace ester.
[0411] En una realizacion, G3 es heteroalquilo. El grupo heteroalquilo puede comprender polietilenglicol. El grupo heteroalquilo puede tener un heteroatomo, tal como O o N, adyacente al grupo acilo, formando de este modo un grupo carbamato o carbonato, cuando sea apropiado, con un heteroatomo presente en el grupo L3 o L2, cuando sea apropiado.
[0412] En una realizacion, G3 se selecciona entre NH2, NHR y NRR'. Preferiblemente, G3 es NRR'.
[0413] En una realizacion G2 es el grupo;
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en el que el asterisco indica el punto de union a L3, n es de 0 a 6 y G4 se selecciona de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, y halo. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR estan protegidos. En una realizacion, n es de 1 a 6 y preferiblemente n es 5. En una realizacion, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR'. En una realizacion, G4 es OR, SR, y NRR'. Preferiblemente G4 se selecciona de O y NRR', lo mas preferiblemente G4 es OR. Lo mas preferiblemente G4 es OMe.
[0414] En una realizacion, el grupo G2 es:
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en el que el asterisco indica el punto de union a L3, y n y G4 son como se definen anteriormente. [0415] En una realizacion, el grupo G2 es:
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en el que el asterisco indica el punto de union a L3, n es 0 o 1, m es de 0 a 50, y G4 se selecciona de OH, OR, SH, SR, cOoR, CONH2, CONHR, CONRR', NHR NHR, NRR', NO2, y halo. En una realizacion preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, 1 a 2, preferiblemente 4 a 8, y lo mas preferiblemente 4 u 8. En otra realizacion, n es 1 y m es de 10 a 50, preferiblemente 20 a 40. Los grupos Oh, SH, NH2 y NHR estan protegidos. En una realizacion, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR'. En una realizacion, G4 es OR, SR, y NRR'. Preferiblemente, G4 se selecciona de O y NRR', lo mas preferiblemente G4 es OR. Preferiblemente G4 es OMe.
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en el que el asterisco indica el punto de union a L3, y n, m y G4 son como se definen anteriormente. [0417] En una realizacion, el grupo G2 es:
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n es 1-20, m es 0-6, y G4 se selecciona de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, y halo. En una realizacion, n es 1-10. En otra realizacion, n es de 10 a 50, preferiblemente de 20 a 40. En una realizacion, n es 1. En una realizacion, m es 1. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR estan protegidos. En una realizacion, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR'. En una realizacion, G4 es OR, SR, y NRR'. Preferiblemente G4 se selecciona de O y NRR', lo mas preferiblemente G4 es OR. Preferiblemente, G4 es OMe.
[0418] En una realizacion, el grupo G2 es:
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en el que el asterisco indica el punto de union a L3, y n, m y G4 son como se definen anteriormente.
[0419] En cada una de las realizaciones anteriores G4 puede ser OH, SH, NH2 y NHR. Estos grupos estan preferiblemente protegidos.
[0420] En una realizacion, OH esta protegido con Bzl, TBDMS, o TBDPS.
[0421] En una realizacion, SH esta protegido con Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, o Trt.
[0422] En una realizacion, NH2 o NHR estan protegidos con Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z, o Alloc.
[0423] En una realizacion, el grupo G2 esta presente en combinacion con un grupo L3, cuyo grupo es un dipeptido.
[0424] El grupo de termination no esta destinado para la conexion al modulador. Por lo tanto, el otro monomero presente en el dlmero sirve como punto de conexion a los moduladores a traves de un enlazador. Por consiguiente, se prefiere que la funcionalidad presente en el grupo de terminacion no este disponible para la reaction con un modulador. Por lo tanto, preferiblemente, se evitan los grupos funcionales reactivos, tales como OH, SH, NH2, COOH. Sin embargo, dicha funcionalidad puede estar presente en el grupo de terminacion si se protege, tal como se describe anteriormente.
[0425] De este modo, segun las ensenanzas en el presente documento, una realizacion de la invention comprende un conjugado que comprende un compuesto:
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en el que CBA es un agente de union/modulador celular, y n es 0 o 1. L1 es tal como se ha definido anteriormente, y RE y RE" se seleccionan cada uno independientemente entre H o RD.
[0426] En otra realizacion, el conjugado comprende un compuesto:
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en el que CBA es un agente de union/modulador celular, L1 es como se define anteriormente, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido, y n es 0 o 1.
[0427] Los expertos en la tecnica entenderan que otros dlmeros PBD simetricos y asimetricos y enlazadores son compatibles con la presente invencion y podrlan seleccionarse sin experimentacion indebida basandose en las ensenanzas en el presente documento y la tecnica anterior.
[0428] Otro aspecto de la invencion incluye ADC que comprenden radioisotopos. Los radioisotopos de ejemplo que puedan ser compatibles con tales realizaciones incluyen, pero no estan limitados a, yodo (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), cobre (62Cu, 64Cu, 67Cu), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In,), bismuto (212Bi, 213Bi), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103pd), molibdeno (99Mo), xenon (133Xe), fluor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb,
51Cr, 54mn, 75Se, 113Sn, 117Sn, 225Ac, 76Br, y 211At. Otros radionucleidos estan disponibles tambien como agentes de diagnostico y terapeuticos, especialmente aquellos en el intervalo de energla de 60 a 4.000 keV. Dependiendo de la enfermedad a tratar y el perfil terapeutico deseado, los expertos en la tecnica pueden seleccionar facilmente el radioisotopo adecuado para su uso con los moduladores descritos.
[0429] Los moduladores de DLL3 de la presente descripcion tambien pueden conjugarse con un resto terapeutico o farmaco que modifica una respuesta biologica dada (por ejemplo, modificadores de respuesta biologica o BRM). Es decir, los agentes terapeuticos o restos compatibles con la presente descripcion no se deben interpretar como limitados a agentes terapeuticos qulmicos clasicos. Por ejemplo, en realizaciones particularmente preferidas, el resto de farmaco puede ser una protelna o polipeptido o fragmentos de los mismos que poseen una actividad biologica deseada. Tales protelnas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tales como abrina, ricina A, onconasa (u otra ARNasa citotoxica), exotoxina de Pseudomonas, toxina del colera, o toxina de la difteria; una protelna, tales como el factor de necrosis tumoral, interferon-a, interferon-b, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminogeno tisular, un agente apoptotico, por ejemplo, TNF-a, TNF-b, AIM I (vease, la Publication Internacional No. WO 97/33899), AIM II (vease, la publication International No. WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al, 1994, J. Immunol., 6: 1567), y VeGI (vease, la publicacion Internacional No. WO 99/23105), un agente trombotico o un agente antiangiogenico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o, un modificador de respuesta biologica, tal como, por ejemplo, una linfoquina (por ejemplo, interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina-2 ("IL- 2"), interleuquina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos ("GM-CSF"), y factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF")), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento ("GH")). Como se ha expuesto anteriormente, se conocen en la tecnica procedimientos para fusionar o conjugar los moduladores a restos de polipeptidos. Ademas de las referencias de los objetos dados a conocer previamente vease, por ejemplo, USP No. 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851, y 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; Publicaciones PCT WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al, 1991, PNAS EE.UU. 88: 10535;. Zheng et al, 1995, J Immunol. 154: 5590; y Vil et al, 1992, PNAS EE.UU. 89: 11337.
[0430] Ademas, tal como se ha expuesto anteriormente, la asociacion de un modulador con dichos restos no necesariamente tiene que ser directa, pero puede tener lugar a traves de secuencias enlazadoras. Tal como se ha indicado previamente, dichas moleculas de enlace se conocen habitualmente en la tecnica y se describen en Denardo et al, 1998, Clin Cancer Res. 4: 2483; Peterson et al, 1999, Bioconjug Chem 10: 553; Zimmerman et al, 1999, Nucl Med Biol 26: 943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171.
IX. Diagnostico y cribado
A. Diagnostico
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[0431] En aun otros ejemplos, la descripcion proporciona procedimientos in vivo o in vitro para la detection, diagnostico o monitorizacion de trastornos y procedimientos de cribado de celulas de un paciente para identificar las celulas tumorigenicas, incluyendo CSC. Tales procedimientos incluyen la identification de un individuo que tiene cancer para el tratamiento o la monitorizacion de la progresion de un cancer que comprende poner en contacto el paciente o una muestra obtenida de un paciente (es decir, in vivo o in vitro) con un modulador como se describe en el presente documento y detectar la presencia o ausencia, o el nivel de asociacion, del modulador a las moleculas diana unidas o libres en la muestra. En ejemplos particularmente preferidos, el modulador comprendera un marcador detectable o una molecula infomadora, tal como se describen en el presente documento.
[0432] En algunos ejemplos, la asociacion del modulador, tal como un anticuerpo, con celulas particulares en la muestra probablemente indica que la muestra puede contener CSC, lo que indica que el individuo que tiene cancer puede ser tratado eficazmente con un modulador, tal como se describe en el presente documento. Los procedimientos pueden comprender ademas una etapa de comparar el nivel de union con un control. A la inversa, cuando el modulador es un constructo de Fc, las propiedades de union pueden ser explotadas y monitorizadas (directa o indirectamente, in vivo o in vitro) cuando esta en contacto con la muestra para proporcionar la information deseada.
[0433] Los ejemplos de procedimientos de ensayo compatibles incluyen radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimaticos, ensayos de union competitiva, inmunoensayo fluorescente, ensayos de inmunotransferencia, analisis de transferencia Western, ensayos de citometrla de flujo y ensayos ELISA. Los teragnosticos o diagnosticos in vivo compatibles pueden comprender tecnicas de formation de imagenes o monitorizacion reconocidas en la tecnica, tales como imagenes por resonancia magnetica, tomografla computarizada (por ejemplo, barrido por TAC), tomografla de positrones (por ejemplo, barrido por PET), radiografla, ultrasonido, etc., tal como serla conocido por los expertos en la tecnica.
[0434] En otro ejemplo, la descripcion proporciona un procedimiento de analisis de la progresion del cancer y/o patogenesis in vivo. En otro ejemplo, el analisis de la progresion del cancer y/o patogenesis in vivo comprende la determination de la extension de la progresion del tumor En otro ejemplo, el analisis comprende la identificacion del tumor. En otro ejemplo, el analisis de la progresion del tumor se realiza en el tumor primario. En otro ejemplo, el analisis se realiza en el tiempo en funcion del tipo de cancer, tal como es conocido para un experto en la tecnica. En otro ejemplo, un nuevo analisis de tumores secundarios procedentes de celulas en metastasis del tumor primario se analiza in-vivo. En otro ejemplo, se analizan el tamano y la forma de tumores secundarios. En algunos ejemplos, se lleva a cabo un analisis ex vivo adicional.
[0435] En otro ejemplo, la invention proporciona un procedimiento de analisis de la progresion del cancer y/o patogenesis in vivo incluyendo la determinacion de la metastasis celular o detectar y cuantificar el nivel de celulas tumorales circulantes. En otro ejemplo adicional, el analisis de la metastasis celular comprende la determinacion del crecimiento progresivo de las celulas en un sitio que es discontinuo del tumor primario. En otro ejemplo, el sitio de analisis de la metastasis celular comprende la ruta de diseminacion neoplasica. En algun ejemplo, las celulas pueden dispersarse a traves de la vasculatura arterial, los vasos linfaticos, dentro de las cavidades del cuerpo o combinaciones de los mismos. En otros ejemplos, el analisis de la metastasis celular se lleva a cabo en vista de la migration celular, la difusion, la extravasation, la proliferation o combinaciones de los mismos.
[0436] Por consiguiente, en un ejemplo particularmente preferido, los moduladores de la presente invencion se pueden usar para detectar y cuantificar los niveles de DLL3 en una muestra del paciente (por ejemplo, plasma o sangre) que puede, a su vez, ser utilizada para detectar, diagnosticar o controlar trastornos asociados con DLL3, incluyendo trastornos proliferativos. En los ejemplos relacionados, los moduladores de la presente descripcion pueden utilizarse para detectar, monitorizar y/o cuantificar las celulas tumorales circulantes ya sea in vivo o in vitro (ver, por ejemplo, WO 2012/0128801). En todavla otras realizaciones preferidas, las celulas tumorales circulantes pueden comprender celulas madre cancerosas.
[0437] En determinados ejemplos, las celulas tumorigenicas en un sujeto o una muestra de un sujeto pueden evaluarse o caracterizarse utilizando los moduladores descritos antes de la terapia o regimen para establecer una llnea de base. En otros ejemplos, la muestra se deriva de un sujeto que se trato. En algunos ejemplos, la muestra se toma del sujeto al menos aproximadamente 1,2, 4, 6, 7, 8, 10. 12, 4, 15, 16, 18, 20, 34, 60, 90 dlas, 6 meses, 9 meses, 12 meses, o > 12 meses despues de que el sujeto inicie o finalice el tratamiento. En determinados ejemplos, las celulas tumorigenicas se evaluan o caracterizan despues de un cierto numero de dosis (por ejemplo, despues de 2, 5, 10, 20, 30 o mas dosis de una terapia). En otros ejemplos, las celulas tumorigenicas se caracterizan o evaluan despues de 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos o mas despues de recibir una o mas terapias.
[0438] En otro aspecto, y como se discute en mas detalle a continuation, la presente descripcion proporciona kits para la deteccion, monitorizacion o el diagnostico de un trastorno hiperproliferativo, la identificacion de un individuo que tiene un trastorno de este tipo para un posible tratamiento o la monitorizacion de la progresion (o la regresion) del trastorno en un paciente, en el que el kit comprende un modulador, tal como se describe en el presene documento, y reactivos para detectar el impacto del modulador en una muestra.
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[0439] Aun otro ejemplo de la presente descripcion comprende el uso de DLL3 marcado para inmunohistoqulmica (IHC). A este respecto, se puede usar DLL3 con IHC como herramienta de diagnostico para ayudar en el diagnostico de diversos trastornos proliferativos y para monitorizar la respuesta potencial a tratamientos, incluyendo terapia con el modulador de DLL3. Se pueden realizar ensayos de diagnostico compatibles en tejidos que han sido fijados qulmicamente (incluyendo, pero no limitados a: formaldehldo, glutaraldehldo, tetroxido de osmio, dicromato de potasio, acido acetico, alcoholes, sales de zinc, cloruro de mercurio, tetroxido de cromo y acido plcrico) y embebidos (incluyendo pero no limitado a: glicol metacrilato, parafina y resinas) o conservados mediante congelacion. Como se discute en mas detalle a continuacion tales ensayos se podrlan utilizar como gula en las decisiones de tratamiento y determinar los reglmenes de dosificacion y tiempos.
B. Cribado
[0440] En ciertos ejemplos, los moduladores tambien se pueden usar para detectar o identificar compuestos o agentes (por ejemplo, farmacos) que alteran una funcion o actividad de celulas tumorigenicas o progenie de las mismas mediante la interaccion con un antlgeno (por ejemplo, componentes genotlpicos o fenotlpicos del mismo). Tales compuestos y agentes pueden ser candidates a farmacos que son examinados para el tratamiento de un trastorno proliferativo, por ejemplo. En un caso, un sistema o procedimiento incluye celulas tumorigenicas que comprenden DLL3 y un compuesto o agente (por ejemplo, un farmaco), en el que las celulas y compuesto o agente estan en contacto entre si. En tales ejemplos, las celulas objetivo pueden haber sido identificadas, monitorizadas y/o enriquecidas utilizando los moduladores descritos.
[0441] En otro ejemplo, un procedimiento incluye poner en contacto, directa o indirectamente, celulas tumorigenicas o progenie de las mismas con un agente o compuesto de ensayo y determinar si el agente o compuesto de ensayo modula una actividad o funcion de las celulas tumorigenicas asociadas a antlgeno. Un ejemplo de una interaccion directa es la interaccion flsica, mientras que una interaccion indirecta incluye la accion de una composition sobre una molecula intermediaria que, a su vez, actua sobre la entidad referenciada (por ejemplo, celula o cultivo celular). Las actividades o funciones de ejemplo que pueden ser moduladas incluyen cambios en la morfologla o la viabilidad celular, la expresion de un marcador, la diferenciacion o desdiferenciacion, la respiration celular, la actividad mitocondrial, la integridad de la membrana, la maduracion, la proliferation, la viabilidad, la apoptosis o muerte celular.
[0442] Los procedimientos de cribado e identification de agentes y compuestos incluyen los adecuadas para cribado de alto rendimiento, que incluyen matrices de celulas (por ejemplo, micromatrices) posicionadas o colocados, opcionalmente en ubicaciones o direcciones predeterminadas. Por ejemplo, las celulas pueden colocarse o se colocan (presembradas) en una placa de cultivo, tubo, matraz, botella de rodillo o una placa (por ejemplo, una unica placa o plato de multiples pocillos, tal como una placa o plato de multiples pocillos con 8, 16, 32, 64, 96, 384 y 1536 pocillos). Los procedimientos de manipulation robotica o manual de alto rendimiento pueden sondar interacciones qulmicas y determinar los niveles de expresion de muchos genes en un corto perlodo de tiempo. Se han desarrollado tecnicas que utilizan senales moleculares (por ejemplo, a traves de fluoroforos) y analisis automatizado que procesan la information a una velocidad muy rapida (vease, por ejemplo, Pinhasov et al, Comb Chem High Throughput Screen 7: 133 (2004)). Por ejemplo, la tecnologla de micromatrices se ha utilizado ampliamente para sondar las interacciones de miles de genes a la vez, a la vez que proporciona la informacion para genes especlficos (vease, por ejemplo, Mocellin y Rossi, Adv Exp Med Biol 593: 19 (2007)).
[0443] Las bibliotecas que pueden ser cribadas incluyen, por ejemplo, las bibliotecas de moleculas pequenas, bibliotecas de presentation de fagos, bibliotecas de expresion en levadura de anticuerpos totalmente humanos (Adimab, LLC), bibliotecas de siARN, y vectores de transfection adenoviral.
X. Preparaciones farmaceuticas y usos terapeuticos
A. Formulaciones y vias de administration
[0444] Dependiendo de la forma del modulador junto con cualquier conjugado opcional, el modo de liberation previsto, la enfermedad que se trata o controla y numerosas otras variables, las composiciones de la descripcion se pueden formular como se desee utilizando tecnicas reconocidas en la tecnica. En algunas realizaciones, las composiciones terapeuticas de la invention se pueden administrar puras o con un mlnimo de componentes adicionales, mientras que otras opcionalmente se pueden formular para contener vehlculos adecuados farmaceuticamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares que son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20a ed (2003); Ansel et al, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a ed, Lippencott Williams y Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients. 3a ed., Pharmaceutical Press (2000)). Varios vehlculos farmaceuticamente aceptables, que incluyen vehlculos, adyuvantes y diluyentes, estan facilmente disponibles de numerosas fuentes comerciales. Ademas, tambien estan disponibles una variedad de sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables, tales como ajuste del pH y agentes tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizadores, agentes humectantes y similares. Ciertos
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portadores de ejemplo no limitantes incluyen solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
[0445] Mas particularmente, se entendera que, en algunas realizaciones, las composiciones terapeuticas de la invencion se pueden administrar puras o con un mlnimo de componentes adicionales. Por el contrario, los moduladores de DLL3 de la presente descripcion opcionalmente se pueden formular para contener vehlculos adecuados farmaceuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que son bien conocidos en la tecnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administracion del modulador o que ayudan en el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que estan optimizadas farmaceuticamente para la liberacion en el sitio de accion. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia o actuar como un diluyente para mejorar la farmacocinetica o la estabilidad del modulador. Los excipientes o aditivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes estabilizantes, humectantes y agentes emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones, y potenciadores de penetracion en la piel. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones farmaceuticas se pueden proporcionar en una forma liofilizada y reconstituirse en, por ejemplo, solucion salina tamponada antes de la administracion.
[0446] Los moduladores descritos para la administracion sistemica se pueden formular para la administracion enteral, parenteral o topica. De hecho, los tres tipos de formulacion pueden usarse simultaneamente para alcanzar la administracion sistemica del principio activo. Los excipientes, as! como las formulaciones para administracion de farmacos parenteral y no parenteral, se exponen en Remington, The Science y Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing (2000). Las formulaciones adecuadas para administracion parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Ademas, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones apropiadas para inyeccion oleosa. Los disolventes o vehlculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, poli(lactida) sustituidos por hexilo, aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos, por ejemplo oleato de etilo o trigliceridos. Las suspensiones de inyeccion acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, y/o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizantes. Los liposomas tambien se pueden utilizar para encapsular el agente para la liberacion en la celula.
[0447] Las formulaciones adecuadas para la administracion enteral incluyen capsulas duras o blandas de gelatina, plldoras, comprimidos, incluyendo comprimidos recubiertos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberacion controlada de los mismos.
[0448] En general, los compuestos y composiciones de la descripcion, que comprende moduladores de DLL3 pueden administrarse in vivo, a un sujeto en necesidad de los mismos, por diversas vlas, incluyendo, pero no limitado a, oral, intravenosa, intra-arterial, subcutanea, parenteral, intranasal, intramuscular, intracraneal, intracardiaca, intraventricular, intratraqueal, bucal, rectal, intraperitoneal, intradermica, topica, transdermica, e intratecal, o de otro modo por implantacion o por inhalacion. Las composiciones se pueden formular en preparaciones en forma solida, semisolida, llquida, o formas gaseosas; incluyendo, pero no limitado a, comprimidos, capsulas, polvos, granulos, pomadas, soluciones, supositorios, enemas, inyecciones, inhalantes y aerosoles. La formulacion y la via de administracion apropiados pueden seleccionarse segun la aplicacion prevista y regimen terapeutico.
B. Dosis
[0449] Del mismo modo, el regimen de dosificacion particular, es decir, dosis, tiempo y repeticion, dependeran del individuo particular y de la historia medica de ese individuo, as! como consideraciones emplricas, tales como la farmacocinetica (por ejemplo, vida media, tasa de aclaramiento, etc.). La frecuencia de administracion puede determinarse y ajustarse durante el transcurso de la terapia, y se basa en reducir el numero de celulas proliferativas o tumorigenicas, mantener la reduccion de tales celulas neoplasicas, reducir la proliferacion de celulas neoplasicas, o retrasar el desarrollo de metastasis. En otras realizaciones, la dosis administrada se puede ajustar o atenuar para manejar los efectos secundarios potenciales y/o toxicidad. Alternativamente, pueden ser apropiadas formulaciones de liberacion sostenida continuas de una composicion terapeutica en cuestion.
[0450] En general, los moduladores de la descripcion se pueden administrar en diferentes intervalos. Estos incluyen de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por dosis; de aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis; de aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dosis. Otros intervalos incluyen de aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis y de aproximadamente 0,5 mg de peso corporal/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertas realizaciones, la dosis es de al menos aproximadamente 100 mg/kg peso corporal, al menos aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 750 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.
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[0451] En ejemplos seleccionados, los moduladores se administraran a aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg de peso corporal por dosis. Otros ejemplos comprenderan la administracion de los moduladores a 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 mg/kg de peso corporal por dosis. En otros ejemplos preferidos los moduladores descritos se administraran a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg. En aun otros ejemplos, los moduladores pueden ser administrados a 12, 14, 16, 18 o 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En aun otros ejemplos, los moduladores pueden ser administrados a 25, 30, 35, 40, 45, 0, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 o 100 mg/kg de peso corporal por dosis. Segun las ensenanzas del presente documento, se entendera que las dosificaciones mencionadas anteriormente son aplicables tanto a los moduladores no conjugados como a los moduladores conjugados con un agente citotoxico. Un experto en la tecnica podrla determinar facilmente las dosis apropiadas para los diversos moduladores conjugados y no conjugados basandose en estudios precllnicos en animales, observaciones cllnicas y tecnicas y mediciones medicas y bioqulmicas estandar.
[0452] Con respecto a moduladores conjugados, realizaciones particularmente preferidas comprenderan dosificaciones de entre aproximadamente 50 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis. En este sentido los moduladores conjugados pueden administrarse a 50, 75 o 100 mg/kg o a 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 mg/kg de peso corporal por dosis. En otras realizaciones preferidas, los moduladores conjugados de la presente invencion se pueden administrar a 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 325, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75 o 5 mg/Kg de peso corporal por dosis. En realizaciones particularmente preferidas, tales dosis de modulador conjugado se pueden administrar por via intravenosa durante un perlodo de tiempo. Ademas, tales dosis pueden administrarse multiples veces durante un transcurso definido de tratamiento.
[0453] Otros reglmenes de dosificacion pueden basarse en el area de calculos del area superficial corporal (BSA) como se describe en la USPN 7.744.877. Como es bien sabido, el BSA se calcula utilizando la altura y el peso del paciente y proporciona una medicion del tamano de un sujeto tal como se representa por el area superficial de su cuerpo. En ciertos ejemplos, los moduladores se pueden administrar en dosis de 10 mg/m2 a 800 mg/m2, de 50 mg/m2 a 500 mg/m2 y en dosis de 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2 o 450 mg/m2
[0454] Tambien se entendera que se puede utilizar la tecnica reconocida y tecnicas emplricas para determinar la dosis apropiada para moduladores conjugados (es decir, ADCs).
[0455] En cualquier caso, los moduladores de DLL3 (tanto conjugados como no conjugados) se administran preferiblemente segun sea necesario a los sujetos en necesidad del mismo. La determinacion de la frecuencia de administracion se puede hacer por los expertos en la tecnica, tales como un medico a cargo, basandose en consideraciones de la afeccion a tratar, la edad del sujeto a tratar, la gravedad de la afeccion a tratar, el estado general de salud de la sujeto a tratar y similares. Generalmente, una dosis eficaz del modulador de DLL3 se administra a un sujeto una o mas veces. Mas en particular, una dosis eficaz del modulador se administra al sujeto una vez al mes, mas de una vez al mes, o menos de una vez al mes. En ciertos ejemplos, la dosis eficaz del modulador de DLL3 puede administrarse en multiples ocasiones, incluso durante perlodos de al menos un mes, al menos seis meses, al menos un ano, al menos dos anos o un perlodo de varios anos. En aun otros ejemplos, varios dlas (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o incluso un ano o varios anos pueden transcurrir entre la administracion de los moduladores descritos.
[0456] En ciertas realizaciones preferidas, el transcurso de tratamiento que implica moduladores conjugados comprendera multiples dosis del producto farmaco seleccionado (es decir, un ADC) durante un perlodo de semanas o meses. Mas especlficamente, los moduladores conjugados de la presente invencion pueden administrarse una vez al dla, cada dos dlas, cada cuatro dlas, cada semana, cada diez dlas, cada dos semanas, cada tres semanas, cada mes, cada seis semanas, cada dos meses, cada diez semanas o cada tres meses. A este respecto, se entendera que las dosificaciones pueden alterarse o el intervalo se puede ajustar en base a la respuesta del paciente y las practicas cllnicas.
[0457] Las dosis y reglmenes tambien se pueden determinar emplricamente para las composiciones terapeuticas descritas en individuos que han recibido una o mas de administraciones. Por ejemplo, a los individuos se les puede administrar dosis adicionales de una composicion terapeutica producida, tal como se describe en el presente documento. En ejemplos seleccionados, la dosis puede aumentarse gradualmente o se puede reducir o atenuar basandose en respectivamente en los efectos secundarios o la toxicidad determinada emplricamente u observada. Para evaluar la eficacia de la composicion seleccionada, puede seguirse un marcador de la enfermedad, trastorno o afeccion especlfica, tal como se ha descrito previamente. En ejemplos en los que el individuo tiene cancer, se incluyen mediciones directas del tamano del tumor a traves de la palpacion o la observacion visual, la medida indirecta del tamano del tumor por tecnicas de formation de imagenes o por rayos X; una mejora segun la evaluation de la biopsia directa del tumor y el examen microscopico de la muestra de tumor; la medicion de un marcador indirecto tumoral (por ejemplo, PSA para el cancer de prostata) o un antlgeno identificado segun los procedimientos descritos en el presente documento, una disminucion del dolor o paralisis; mejora del habla, la vision, la respiration u otra discapacidad asociada con el tumor; apetito incrementado; o un aumento en la calidad de vida, medida por pruebas aceptadas o prolongation de la supervivencia. Sera evidente para un experto en la tecnica
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que la dosificacion variara dependiendo de la persona, el tipo de afeccion neoplasica, la etapa de la afeccion neoplasica, si la condition neoplasica ha comenzado a metastatizar en otro lugar en el individuo, y los tratamientos anteriores y concurrentes que se estan utilizando.
C. Terapias de combination
[0458] Las terapias de combinacion pueden ser particularmente utiles en la disminucion o inhibition de la proliferation de celulas neoplasicas no deseadas, la disminucion de la aparicion de cancer, la disminucion o la prevention de la recurrencia del cancer, o la disminucion o prevention de la propagation o metastasis de cancer. En tales ejemplos, los moduladores de la presente description pueden funcionar como agentes sensibilizantes o quimiosensibilizantes mediante la elimination de las celulas madre cancerosas que de otro modo apoyan y perpetuan la masa tumoral y por lo tanto permiten un uso mas eficaz de la norma actual de agentes para la reduction de volumen o contra el cancer para tratamiento. Es decir, los moduladores descritos pueden, en ciertos ejemplos, proporcionar un efecto mejorado (por ejemplo, aditivos o sinergicos por naturaleza) que potencia el modo de action de otro agente terapeutico administrado. En el contexto de la presente descripcion, la "terapia de combinacion" debe ser interpretada en sentido amplio y simplemente se refiere a la administration de un modulador y uno o mas agentes contra el cancer que incluyen, pero no se limitan a, agentes citotoxicos, agentes citostaticos, agentes antiangiogenicos, agentes para la reduccion de volumen, agentes quimioterapeuticos, radioterapia y agentes radioterapeuticos, agentes contra el cancer dirigidos (incluyendo anticuerpos monoclonales y entidades de molecula pequena), BRM, anticuerpos terapeuticos, vacunas contra el cancer, citoquinas, terapias hormonales, radioterapia y agentes anti-metastaticos y agentes inmunoterapeuticos, incluyendo enfoques tanto especlficos como no especlficos.
[0459] No hay un requisito para que los resultados combinados sean aditivos de los efectos observados cuando cada tratamiento (por ejemplo, anticuerpo y el agente contra el cancer) se lleva a cabo por separado. Aunque son generalmente deseable al menos efectos aditivos, cualquier efecto anti-tumor aumentado por encima de una de las terapias individuales es beneficioso. Ademas, la invention no requiere el tratamiento combinado para exhibir efectos sinergicos. Sin embargo, los expertos en la tecnica entenderan que con ciertas combinaciones seleccionadas que comprenden realizaciones preferidas, se puede observar sinergismo.
[0460] En la practica de la terapia de combinacion, el modulador y el agente contra el cancer se se pueden administrar al sujeto simultaneamente, ya sea en una sola composition, o como dos o mas composiciones distintas usando las mismas o diferentes vlas de administracion. Alternativamente, el modulador puede preceder, o seguir, al tratamiento con el agente contra el cancer mediante, por ejemplo, intervalos que van de minutos a semanas. El perlodo de tiempo entre cada liberation es tal que el agente contra el cancer y modulador son capaces de ejercer un efecto combinado en el tumor. En al menos un caso, tanto el agente contra el cancer como el modulador se administran en menos de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente dos semanas de diferencia. En aun otros ejemplos varios dlas (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) pueden transcurrir entre la administracion del modulador y el agente contra el cancer.
[0461] La terapia de combinacion puede administrarse una vez, dos veces o al menos durante un perlodo de tiempo hasta que la afeccion se trata, palia o cura. En algunas realizaciones, la terapia de combinacion se administra varias veces, por ejemplo, de tres veces al dla a una vez cada seis meses. La administracion puede estar en una programacion de tres veces al dla, dos veces al dla, una vez al dla, una vez cada dos dlas, una vez cada tres dlas, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o puede administrarse de forma continua a traves de una minibomba. La terapia de combinacion se puede administrar por cualquier via, como se senalo anteriormente. La terapia de combinacion se puede administrar en un sitio distante del sitio del tumor.
[0462] En un ejemplo, un modulador se administra en combinacion con uno o mas agentes contra el cancer durante un ciclo de tratamiento corto a un sujeto en necesidad del mismo. La descripcion tambien contempla la administracion discontinua o dosis diarias divididas en varias administraciones parciales. El modulador y el agente contra el cancer se pueden administrar de forma intercambiable, en dlas alternos o semanas; o se puede proporcionar una secuencia de tratamientos de anticuerpos, seguido de uno o mas tratamientos de la terapia de agente contra el cancer. En cualquier caso, como sera entendido por los expertos en la tecnica, las dosis apropiadas de agentes quimioterapeuticos estaran generalmente alrededor de las ya empleadas en terapias cllnicas en donde los agentes quimioterapeuticos se administran solos o en combinacion con otros agentes quimioterapeuticos.
[0463] En otro ejemplo preferido, los moduladores de DLL3 de la presente descripcion pueden usarse en la terapia de mantenimiento para reducir o eliminar la probabilidad de recurrencia del tumor despues de la presentation inicial de la enfermedad. Preferiblemente, el trastorno se habra tratado y la masa tumoral inicial se habra eliminado, reducido o en cualquier caso mejorado para que el paciente sea asintomatico o en remision. En ese momento el sujeto se puede administrar con cantidades farmaceuticamente eficaces de los moduladores descritos una o mas veces, a pesar de que hay poca o ninguna indication de la enfermedad, usando los procedimientos de diagnostico estandar. En algunos ejemplos, los moduladores se pueden administrar en una programacion regular durante un perlodo de tiempo, por ejemplo, semanal, quincenal, mensual, cada seis semanas, cada dos meses, cada tres
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meses, cada seis meses o cada ano. Dadas las ensenanzas del presente documento, un experto en la tecnica podrla determinar facilmente las dosificaciones y reglmenes de dosificacion favorables para reducir el potencial de recurrencia de la enfermedad. Ademas, estos tratamientos podrlan continuar durante un perlodo de semanas, meses, anos o incluso indefinidamente, dependiendo de la respuesta del paciente y los parametros cllnicos y de diagnostico.
[0464] En otro ejemplo mas preferido, los moduladores de la presente descripcion pueden usarse para fines profilacticos o como terapia adyuvante para prevenir o reducir la posibilidad de metastasis de tumores despues de un procedimiento de reduccion de volumen. Tal como se utiliza en la presente descripcion, un "procedimiento de reduccion de volumen" se define ampliamente y significa cualquier procedimiento, tecnica o metodo que elimina, reduce, trata o mejora una proliferation tumoral o tumor. Los procedimientos de reduccion de volumen de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, cirugla, tratamientos de radiation (es decir, radiation de haces), quimioterapia, inmunoterapia o ablation. En los momentos apropiados determinados facilmente por un experto en la tecnica en vista de la presente descripcion, los moduladores descritos pueden ser administrados como se sugiere por los procedimientos cllnicos, de diagnostico o teragnostico para reducir la metastasis tumoral. Los moduladores se pueden administrar una o mas veces en dosis farmaceuticamente eficaces, tal como se determina utilizando tecnicas estandar. Preferiblemente, el regimen de dosificacion estara acompanado por tecnicas de diagnostico o de control adecuados que le permiten ser modificado.
[0465] Sin embargo, otros ejemplos de la descripcion comprenden administrar los moduladores descritos a sujetos que son asintomaticos pero en riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo. Es decir, los moduladores de la presente descripcion pueden usarse en un sentido verdaderamente preventivo y se administran a los pacientes que han sido examinados o probados y tienen uno o mas factores de riesgo destacados (por ejemplo, indicaciones genomicas, historia familiar, resultados de ensayo in vivo o in vitro, etc.) pero que no han desarrollado la neoplasia. En tales ejemplos, los expertos en la tecnica serlan capaces de determinar un regimen de dosificacion eficaz a traves de la observation emplrica o a traves de practicas cllnicas aceptadas.
D. Agentes anticancerosos
[0466] El termino "agente contra el cancer" o "agente antiproliferativo" significa cualquier agente que se puede utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular, tal como cancer, e incluye, pero no se limita a, agentes citotoxicos, agentes citostaticos, agentes antiangiogenicos, agentes para la reduccion de volumen, agentes quimioterapeuticos, agentes de radioterapia y radioterapeuticos, agentes dirigidos contra el cancer, BRM, anticuerpos terapeuticos, vacunas contra el cancer, citoquinas, terapias hormonales, terapia de radiacion y agentes antimetastasicos y agentes inmunoterapeuticos. Se entendera que, en ejemplos seleccionados, tal como se discutio anteriormente, tales agentes contra el cancer pueden comprender conjugados y pueden asociarse con moduladores antes de la administration. En ciertos ejemplos, el agente contra el cancer descrito estara unido a un modulador de DLL3 para proporcionar un ADC, tal como se expone en el presente documento.
[0467] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "agente citotoxico" significa una sustancia que es toxica para las celulas y disminuye o inhibe la funcion de celulas y/o causa la destruction de las celulas. Tlpicamente, la sustancia es una molecula de origen natural derivada de un organismo vivo. Los ejemplos de agentes citotoxicos incluyen, pero no se limitan a, toxinas de molecula pequena o toxinas enzimaticamente activas de bacterias (por ejemplo, toxina de la difteria, endotoxina y exotoxina de Pseudomonas, enterotoxina estafilococica A), hongos (por ejemplo, a-sarcina, restrictocina), plantas (por ejemplo, abrina, ricina, modecina, viscumina, protelna antiviral de fitolaca, saporina, gelonina, momoridina, tricosantina, toxina de cebada, protelnas de Aleurites fordii, protelnas de diantina, protelnas de Phytolacca Mericana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitegelina, restrictocina, fenomicina, neomicina, y tricotecenos) o animales (por ejemplo, ARNasas citotoxicas, tales como ARNasas pancreaticas extracelulares; ADNasa 1, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas).
[0468] Para los fines de la presente invention un "agente quimioterapeutico" comprende un compuesto qulmico que disminuye de forma no especlfica o inhibe el crecimiento, la proliferacion y/o supervivencia de celulas de cancer (por ejemplo, agentes citotoxicos o citostaticos). Tales agentes qulmicos se dirigen a menudo a procesos intracelulares necesarios para el crecimiento o division celular, y son por lo tanto particularmente eficaces contra las celulas cancerosas, que generalmente crecen y se dividen rapidamente. Por ejemplo, vincristina despolimeriza los microtubulos, y por lo tanto inhibe las celulas que entran en la mitosis. En general, los agentes quimioterapeuticos pueden incluir cualquier agente qulmico que inhibe, o esta disenado para inhibir, una celula cancerosa o una celula propensa a convertirse en cancerosa o a generar progenie tumorigenica (por ejemplo, TIC). Tales agentes son a menudo administrados, y son a menudo mas eficaces, en combination, por ejemplo, en reglmenes tales como CHOP o FOLFIRI. Una vez mas, en ejemplos seleccionados, dichos agentes quimioterapeuticos se pueden conjugar a los moduladores descritos.
[0469] Ejemplos de agentes contra el cancer que se pueden utilizar en combinacion con (o conjugado a) los moduladores de la presente descripcion incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, sulfonatos de alquilo, aziridinas, etileniminas y metilamelaminas, acetogeninas, camptotecina, briostatina, calistatina, CC-1065,
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criptoficinas, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongiestatina, mostazas de nitrogeno, antibioticos, antibioticos de enediina, dinemicina, bisfosfonatos, esperamicina, cromoprotelna, cromoforos de antibioticos de enediina, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo- L-norleucina, doxorubicina ADRIAMICINA®, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos, erlotinib, vemurafenib, crizotinib, sorafenib, Ibrutinib, enzalutamida, analogos de acido folico, analogos de purina, androgenos, antiadrenales, rellenador de acido folico, tales como acido frollnico, aceglatona, glucosido de aldofasfamida, acido aminolevullnico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinano, lonidainina, maitansinoides, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, acido podofillnico, 2-etilhidrazida, procarbazina, complejo polisacarido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara- C"); ciclofosfamida; tiotepa, taxoides, cloranbucilo; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina;
metobrexato; analogos de platino, vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar, CPT-11), inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina; retinoides; capecitabina; combretastatina; leucovorina; oxaliplatino, inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR y VEGF que reducen la proliferacion celular y sales, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmaceuticamente aceptables. Tambien se incluyen en esta definicion los agentes antihormonales que actuan para regular o inhibir la accion hormonal sobre tumores, tales como antiestrogenos y moduladores selectivos de receptores estrogenicos, inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regulan la production de estrogenos en las glandulas suprarrenales, y antiandrogenos, as! como troxacitabina (un analogo de 1,3-dioxolano nucleosido citosina); oligonucleotidos antisentido, ribozimas, tales como un inhibidor de la expresion VBGF y un inhibidor de la expresion de HER2; vacunas, rIL-2 PROLEUKIN®; inhibidor de topoisomerasa 1 LUrToTECAN®; RMrh ABARELIX®; vinorelbina y esperamicinas y sales, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmaceuticamente aceptables.
[0470] En otros ejemplos, los moduladores de la presente description se pueden usar en combination con uno cualquiera de un numero de anticuerpos (o agentes inmunoterapeuticos) actualmente en ensayos cllnicos o disponibles comercialmente. Con este fin los moduladores descritos pueden ser utilizados en combinacion con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en abagovomab, adecatumumab, efutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, cetuximab, citatuzumab, cixutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituximab, ertumaxomab, etaracizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuximab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moxetumomab, namatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomabn, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartu zumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, Racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, simtuzumab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituximab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumuinab, zalutumumab, CC49, 3F8 y combinaciones de los mismos.
[0471] Todavla otros ejemplos particularmente preferidos comprenderan el uso de anticuerpos aprobados para la terapia del cancer, incluyendo, pero no limitado a, rituximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamcin, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, tositumomab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab y brentuximab vedotin. Los expertos en la tecnica seran capaces de identificar facilmente agentes anticancerosos adicionales que son compatibles con las ensenanzas del presente documento.
E. Radioterapia
[0472] La presente descripcion tambien proporciona la combinacion de moduladores con radioterapia (es decir, cualquier mecanismo para inducir dano de ADN localmente dentro de las celulas tumorales, tales como radiation gamma, rayos X, radiacion UV, microondas, emisiones electronicas y similares). Tambien se contempla la terapia de combinacion usando la liberation dirigida de radioisotopos a las celulas tumorales, y puede ser utilizada en conexion con un agente contra el cancer dirigido u otros medios de reconocimiento. Tlpicamente, la radioterapia se administra en pulsos durante un perlodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. La terapia de radiacion puede ser administrada a sujetos que tienen cancer de cabeza y cuello durante aproximadamente 6 a 7 semanas. Opcionalmente, la radioterapia puede administrarse como una dosis unica o como dosis multiples secuenciales.
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XI. Indicaciones
[0473] Se entendera que los moduladores de la presente descripcion pueden usarse para diagnosticar, tratar o inhibir la aparicion o recurrencia de cualquier trastorno asociado a DLL3. Por consiguiente, tanto si se administra solo o en combinacion con un agente contra el cancer o radioterapia, los moduladores de la descripcion son particularmente utiles para tratar generalmente afecciones neoplasicas en pacientes o sujetos que pueden incluir tumores benignos o malignos (por ejemplo, carcinomas adrenal, hlgado, rinon, vejiga, mama, gastrico, de ovario, colorrectal, prostata, pancreas, pulmon, tiroides, hepaticos, de cuello uterino, endometrio, esofago y de utero; sarcomas; glioblastomas; y diversos tumores de cabeza y cuello); leucemias y tumores linfoides; otros trastornos, tales como neuronales, gliales, astrocitales, hipotalamicos y otros trastornos glandulares, macrofagicos, epiteliales, estromales y blastocoelicos; y trastornos inflamatorios, angiogenicos e inmunologicos causados por agentes patogenos. En particular, los objetivos principales para el tratamiento son las afecciones neoplasicas que comprenden tumores solidos, aunque tumores hematologicos estan dentro del alcance de la invencion. Preferiblemente, el "sujeto" o "paciente" para ser tratado sera humano, aunque, como se usa en el presente documento, los terminos se indican expresamente para comprender cualquier especie de mamlfero.
[0474] Mas especlficamente, las afecciones neoplasicas sujetas a tratamiento segun la presente invencion se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero no se limitan a, tumores de glandulas suprarrenales, canceres asociados con el SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, tumores astroclticos, cancer de vejiga (carcinoma de celulas escamosas y carcinoma de celulas de transition), cancer de hueso (adamantinoma, quistes oseos aneurismaticos, osteocondroma, osteosarcoma), canceres de cerebro y medula espinal, tumores cerebrales metastasicos, cancer de mama, tumores del cuerpo carotldeo, cancer de cuello de utero, condrosarcoma, cordoma, carcinoma de celulas renales cromofobas, carcinoma de celulas claras, cancer de colon, cancer colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutaneos, pequenos tumores de celulas redondas desmoplasicas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesqueletico, fibrogenesis imperfecta ossium, displasia fibrosa de los huesos, canceres de la veslcula biliar y el conducto biliar, enfermedad trofoblastica gestacional, tumores de celulas germinales, cancer de cabeza y cuello, tumores de celulas de los islotes, sarcoma de Kaposi, cancer de rinon (nefroblastoma, carcinoma papilar de celulas renales), leucemias, lipoma/ tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cancer de hlgado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), linfomas, canceres de pulmon (carcinoma de celulas pequenas, adenocarcinoma, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas grandes, etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina multiple, mieloma multiple, slndrome mielodisplasico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinomas papilares de tiroides, tumores paratiroideos, canceres pediatricos, tumores de la vaina del nervio periferico, feocromocitoma, tumores de la hipofisis, cancer de prostata, melanoma posterious unveai, trastornos hematologicos raros, cancer metastasico renal, tumor rabdoide, rabdomiosarcoma, sarcomas, cancer de piel, sarcomas de tejidos blandos, cancer de celulas escamosas, cancer de estomago, sarcoma sinovial, cancer testicular, carcinoma tlmico, timoma, cancer metastasico del tiroides y canceres uterinos (carcinoma del cuello uterino, carcinoma de endometrio y leiomioma).
[0475] En ciertas realizaciones preferidas, el trastorno proliferativo comprendera un tumor solido, incluyendo, pero no limitado a, adrenal, hlgado, rinon, vejiga, mama, gastrico, ovarico, cervical, uterino, de esofago, colorrectal, de prostata, de pancreas, de pulmon ( tanto de celulas pequenas y de celulas no pequenas), de tiroides, carcinomas, sarcomas, glioblastomas y diversos tumores de talon y el cuello. En otros ejemplos preferidos, y como se muestra en los Ejemplos a continuation, los moduladores descritos son especialmente eficaces en el tratamiento del cancer de pulmon de celulas pequenas (SCLC) y no pequenas de cancer de pulmon (NSCLC) (por ejemplo, de celulas escamosas no pequenas de cancer de pulmon de celulas o de celulas escamosas de cancer de pulmon de celulas pequenas). En una realization, el cancer de pulmon es refractario, en recalda o resistente a un agente de platino basado (por ejemplo, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, topotecan) y/o un taxano (por ejemplo, docetaxel; paclitaxel, larotaxel o cabazitaxel). Ademas, en ejemplos particularmente preferidos los moduladores descritos pueden ser utilizados en una forma conjugada para tratar el cancer de pulmon de celulas pequenas.
[0476] Con respecto al cancer de pulmon de celulas pequenas, las realizaciones particularmente preferidas comprenderan la administration de moduladores conjugados (ADC). En realizaciones seleccionadas, los moduladores conjugados se pueden administrar a pacientes que presentan la enfermedad en estadio limitado. En otros ejemplos, los moduladores descritos se pueden administrar a pacientes que presentan la enfermedad en etapa extendida. En otras realizaciones preferidas, los moduladores conjugados descritos se administraran a pacientes refractarios (es decir, aquellos que se presentan recurrencia durante o poco despues de completar un ciclo de tratamiento inicial). Aun otros ejemplos comprenden la administracion de los moduladores descritos a pacientes sensibles (es decir, aquellos cuya recalda es mas de 2-3 meses despues de la terapia primaria. En cada caso, se entendera que los moduladores compatibles pueden estar en un estado conjugado o no conjugado segun el regimen de dosificacion seleccionado y el diagnostico cllnico.
[0477] Como se discutio anteriormente los moduladores descritos pueden ademas ser utilizados para prevenir, tratar o diagnosticar tumores con caracterlsticas neuroendocrinas o fenotipos que incluyen tumores neuroendocrinos. Los tumores neuroendocrinos verdaderos o canonicos (NET) que surgen del sistema endocrino disperso son
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relativamente poco frecuentes, con una incidencia de 2-5 por cada 100.000 personas, pero altamente agresivo. Los tumores neuroendocrinos se producen en el rinon, el tracto genitourinario (vejiga, prostata, ovario, cuello uterino y endometrio), tracto gastrointestinal (colon, estomago), tiroides (cancer medular de tiroides), y pulmon (carcinoma de pulmon de celulas pequenas y carcinoma neuroendocrino de celulas grandes). Estos tumores pueden secretar varias hormonas incluyendo la serotonina y/o la cromogranina A que pueden causar slntomas debilitantes conocidos como el slndrome carcinoide. Tales tumores pueden ser indicados por marcadores inmunohistoqulmicos positivos, tales como la enolasa especlfica de neuronas (NSE, tambien conocida como enolasa gamma, slmbolo del gen = ENO2), CD56 (o NCAM1), cromogranina A (CHGA), y sinaptofisina (SYP) o por genes que se sabe que presentan elevada expresion tal como ASCL1. Desafortunadamente, las quimioterapias tradicionales no han sido particularmente eficaces en el tratamiento de los NET y la metastasis de hlgado es un resultado habitual.
[0478] Aunque los moduladores descritos pueden ser utilizados ventajosamente para tratar tumores neuroendocrinos, tambien pueden utilizarse para tratar, prevenir o diagnosticar tumores pseudo neuroendocrinos (pNET) que genotlpicamente o fenotlpicamente mimetizan, se parecen o presentan rasgos comunes con los tumores neuroendocrinos canonicos. Los tumores pseudoneuroendocrinos o los tumores con caracterlsticas neuroendocrinas son tumores que surgen de las celulas del sistema neuroendocrino difuso o de celulas en las que una cascada de diferenciacion neuroendocrina se ha reactivado de forma aberrante durante el proceso oncogenico. Tales pNET comparten habitualmente ciertas caracterlsticas fenotlpicas o bioqulmicas con tumores neuroendocrinos tradicionalmente definidos, incluyendo la capacidad para producir subconjuntos de aminas biologicamente activas, neurotransmisores y hormonas peptldicas. Histologicamente, estos tumores (NET y pNET) comparten un aspecto habitual que a menudo muestra celulas pequenas densamente conectadas con citoplasma mlnimo de citopatologla no tumoral y nucleos punteados de redondos a ovales. Para los fines de la presente invencion, los marcadores histologicos o marcadores geneticos habitualmente expresados que pueden ser utilizados para definir los tumores neuroendocrinos y pseudoneuroendocrinos incluyen, pero no se limitan a, la cromogranina A, CD56, sinaptofisina, PGP9.5, ASCL1 y enolasa especlfica de neurona (NSE).
[0479] Por consiguiente, los moduladores de la presente descripcion beneficiosamente pueden usarse para tratar tanto tumores pseudoneuroendocrinos como tumores neuroendocrinos canonicos. En este sentido, los moduladores se pueden utilizar como se describe en el presente documento para tratar tumores neuroendocrinos (tanto NET como pNET) que surjan en el rinon, el tracto genitourinario (vejiga, prostata, ovario, cuello uterino y endometrio), tracto gastrointestinat (colon, estomago), tiroides (cancer medular de tiroides), y pulmon (carcinoma de pulmon de celulas pequenas y carcinoma neuroendocrino de celulas grandes). Ademas, los moduladores de la presente descripcion se pueden usar para tratar tumores que expresan uno o mas marcadores seleccionados del grupo que consiste en NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A, ASCL1 y PGP9.5 (UCHL1). Es decir, la presente descripcion puede usarse para tratar un sujeto que padece un tumor que es NSB+ o CD56+ o PGP9.5+ o ASCL1 + o SYP+ o CHGA+ o alguna combinacion de los mismos.
[0480] Con respecto a tumores hematologicos, se entendera ademas que los compuestos y procedimientos de la presente descripcion pueden ser particularmente eficaces en el tratamiento de una variedad de linfomas de celulas B, incluyendo linfoma de celulas foliculares (FCC) de grado bajo/NHL, linfoma de celulas del manto (MCL), linfoma difuso de celulas grandes (DLL), NHL linfocltico pequeno (SL), NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblastico de alto grado, NHL linfoblastico de alto grado, NHL de celulas no hendidas pequenas de lato grado, NHL de enfermedad voluminosa, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma linfomaplasmacitoide (LPL), linfoma de celulas del manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma difuso de celulas grandes (DLCL), linfoma de Surkitt (BL), linfomas relacionados con el SIDA, linfoma de celulas B monoclticas, linfomadecopatla angioinmunoblastico, linfomablastoma linfocltico pequeno, folicular, difuso de celulas grandes, difuso de celulas pequenas hendidas, linfoblastoma inmunoblastico de celulas grandes, linfoma de celula pequena, no hendida, de Burkitt y no Burkitt, folicular, predominantemente grande; celulas folicular, predominantemente pequena hendida; y linfomas foliculares, de celulas mixtas grandes y hendidas pequenas. Vease, Gaidono et al, "Lymphomas", en CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita et al, eds, 5a ed 1997). Debe quedar claro para los expertos en la tecnica que estos linfomas a menudo tienen nombres diferentes debido a los cambios de los sistemas de clasificacion, y que los pacientes que tienen linfomas clasificados bajo nombres diferentes tambien puede beneficiarse de los reglmenes terapeuticos combinados de la presente invencion.
[0481] La presente descripcion tambien proporciona un tratamiento preventivo o profilactico de sujetos que presentan tumores benignos o precancerosos. Mas alla de ser un trastorno asociado a DLL3 no se cree que cualquier tipo particular de tumor o trastorno proliferativo deba excluirse del tratamiento usando la presente invencion. Sin embargo, el tipo de celulas tumorales puede ser relevante para el uso de la descripcion en combinacion con agentes terapeuticos secundarios, particularmente agentes quimioterapeuticos y agentes contra el cancer dirigidos.
XII. Articulos de fabricacion
[0482] Tambien se proporcionan envases y kits farmaceuticos que comprenden uno o mas recipientes, que comprenden una o mas dosis de un modulador de DLL3. En ciertas realizaciones, se proporciona una dosificacion unitaria en la que la dosificacion unitaria contiene una cantidad predeterminada de una composicion que comprende,
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por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL3, con o sin uno o mas agentes adicionales. Para otras realizaciones, dicha dosificacion unitaria se suministra en una jeringa precargada para la inyeccion de un solo uso. En todavla otras realizaciones, la composicion contenida en la dosificacion unitaria puede comprender solucion salina, sacarosa, o similares; un tampon, tal como fosfato, o similares; y/o puede ser formulada dentro de un intervalo de pH estable y eficaz. Alternativamente, en ciertas realizaciones, la composicion puede proporcionarse como un polvo liofilizado que puede reconstituirse tras la adicion de un llquido apropiado, por ejemplo, agua esteril. En ciertas realizaciones preferidas, la composicion comprende una o mas sustancias que inhiben la agregacion de protelnas, incluyendo, pero no limitado a, sacarosa y arginina. Cualquier etiqueta en, o asociada con, el recipiente o recipientes indica que la composicion incluida se utiliza para diagnosticar o tratar la afeccion patologica de eleccion.
[0483] La presente descripcion tambien proporciona kits para la produccion de unidades de administracion de dosis unica o dosis multiples de un modulador de DLL3 y, opcionalmente, uno o mas agentes contra el cancer. El kit comprende un recipiente y un prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plastico y contienen una cantidad farmaceuticamente eficaz de los moduladores descritos en una forma conjugada o no conjugada. En otros ejemplos preferidos, el recipiente o recipientes comprenden un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solucion intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). Tales kits contendran generalmente en un recipiente adecuado una formulacion farmaceuticamente aceptable del modulador de DLL3 y, opcionalmente, uno o mas agentes contra el cancer en los mismos o diferentes recipientes. Los kits tambien pueden contener otras formulaciones farmaceuticamente aceptables, ya sea para el diagnostico o la terapia combinada. Por ejemplo, ademas del modulador de DLL3 de la descripcion tales kits pueden contener uno cualquiera o mas de un conjunto de agentes contra el cancer, tales como farmacos quimioterapeuticos o radioterapeuticos; agentes antiangiogenicos; agentes antimetastasicos; agentes contra el cancer dirigidos; agentes citotoxicos; y/u otros agentes contra el cancer. Tales kits tambien pueden proporcionar reactivos apropiados para conjugar el modulador de DLL3 con un agente contra el cancer o agente de diagnostico (por ejemplo, vease el documento USPN 7.422.739).
[0484] Mas especlficamente, los kits pueden tener un unico recipiente que contiene el modulador de DLL3, con o sin componentes adicionales, o pueden tener distintos recipientes para cada agente deseado. Cuando se proporcionan agentes terapeuticos combinados para la conjugacion, puede mezclarse previamente una unica solucion, ya sea en una combinacion equivalente molar, o con un componente en exceso del otro. Alternativamente, el modulador de DLL3 y cualquier agente contra el cancer opcional del kit se pueden mantener por separado dentro de distintos recipientes antes de la administracion a un paciente. Los kits tambien pueden comprender un segundo/tercer medio de recipiente para contener un tampon aceptable farmaceuticamente esteril u otro diluyente tal como agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI), solucion salina tamponada con fosfato (PBS), solucion de Ringer y solucion de dextrosa.
[0485] Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o mas soluciones llquidas, la solucion llquida es preferiblemente una solucion acuosa, con una solucion acuosa esteril particularmente preferida. Sin embargo, los componentes del kit se pueden proporcionar como un polvo o polvos secos. Cuando los reactivos o componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo puede ser reconstituido mediante la adicion de un disolvente adecuado. Se preve que el disolvente tambien se pueda proporcionar en otro recipiente.
[0486] Como se ha indicado brevemente anteriormente, los kits pueden contener tambien un medio por el cual se administra el anticuerpo y cualquiera de los componentes opcionales a un animal o paciente, por ejemplo, una o mas agujas o jeringas, o incluso un cuentagotas, pipeta, u otros aparatos de este tipo, de los cuales se puede inyectar o introducir la formulacion en el animal o aplicar a un area enferma del cuerpo. Los kits de la presente descripcion tambien incluiran tlpicamente un medio para contener los viales, o similares, y otro componente en un confinamiento cerrado para la venta comercial, tal como, por ejemplo, recipientes de plastico moldeados por inyeccion o soplado en los que los viales deseados y otra aparato se colocan y se retienen. Cualquier etiqueta o prospecto indica que la composicion de modulador de DLL3 se utiliza para tratar el cancer, por ejemplo, cancer de pulmon de celula pequena.
[0487] En otros ejemplos preferidos, los moduladores de la presente descripcion pueden usarse en conjuncion con, o comprenden, dispositivos de diagnostico o terapeuticos utiles en el diagnostico o tratamiento de trastornos proliferativos. Por ejemplo, en el ejemplo preferido, los compuestos y composiciones de la presente descripcion pueden combinarse con ciertos dispositivos o instrumentos de diagnostico que pueden utilizarse para detectar, controlar, cuantificar o hacer el perfil celulas o compuestos marcadores implicados en la etiologla o manifestacion de trastornos proliferativos. Para los ejemplos seleccionados, los compuestos marcadores pueden comprender NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A, y PGP9.5.
[0488] En los ejemplos particularmente preferidos, los dispositivos pueden usarse para detectar, monitorizar y/o cuantificar las celulas tumorales circulantes in vivo o in vitro (vease, por ejemplo, WO 2012/0128801).
[0489] En todavla otras realizaciones preferidas, y como se discutio anteriormente, las celulas tumorales circulantes pueden comprender celulas madre cancerosas.
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XIII. Reactivos de investigation
[0490] Otros ejemplos preferidos de la description tambien explotan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento util para la identification, la monitorizacion, el aislamiento, el seccionamiento o enriquecimiento de poblaciones o subpoblaciones de celulas iniciadoras del tumor a traves de procedimientos, tales como la citometrla de flujo, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), clasificacion de celulas activadas por magnetismo (MACS) o seccionamiento mediado por laser. Los expertos en la tecnica entenderan que los moduladores pueden usarse en varias tecnicas compatibles para la caracterizacion y la manipulation de TIC incluidas las celulas madre cancerosas (por ejemplo, vease USSNs. 12/686.359, 12/669.136 y 12/757.649).
XIV. Varios
[0491] A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los terminos cientlficos y tecnicos utilizados en relation con la presente invention tendran los significados que se entienden habitualmente por los expertos en la tecnica. Ademas, a menos que se requiera de otro modo por el contexto, los terminos singulares incluiran pluralidades y los terminos en plural incluiran el singular. Mas especlficamente, tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asl, por ejemplo, la referencia a "una protelna" incluye una pluralidad de protelnas; la referencia a "una celula" incluye mezclas de celulas, y similares. Ademas, los intervalos que se proporcionan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas incluyen los dos puntos finales y todos los puntos entre los puntos finales. Por lo tanto, un intervalo de 2,0 a 3,0 incluye 2,4, 3,0, y todos los puntos entre 2,0 y 3,0.
[0492] En general, la nomenclatura utilizada en relacion con, y las tecnicas de, cultivos celular y de tejidos, biologla molecular, inmunologla, microbiologla, genetica y qulmica de protelnas y de acidos nucleicos e hibridacion descritos en este documento son bien conocidos y habitualmente utilizados en la tecnica. Los procedimientos y tecnicas de la presente descripcion se realizan generalmente segun procedimientos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describen en diversas referencias generales y mas especlficas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Vease, por ejemplo, Abbas et al, Cellular and Molecular Immunology, sexta ed, WB Saunders Company (2010); Sambrook y Russell J. D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2000); Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1998); y Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Las reacciones enzimaticas y tecnicas de purification se realizan segun las especificaciones del fabricante, tal como habitualmente se lleva a cabo en la tecnica o tal como se describe en el presente documento. La nomenclatura utilizada en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de, qulmica analltica, qulmica organica sintetica y qulmica medica y farmaceutica descritas en el presente documento son aquellos bien conocidos y habitualmente utilizados en la tecnica. Ademas, cualquier encabezado de section usado en este documento es con fines de organization solamente y no debe interpretarse como limitante del objeto descrito.
XV. Referencias de DLL3
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XVI. Casos seleccionados de la descripcion
[0494] Ademas de la descripcion y los ejemplos del presente documento, la presente descripcion se refiere a casos seleccionados expuestas especlficamente inmediatamente a continuacion.
Casos seleccionados:
[0495]
1. Un modulador de DLL3 aislado.
2. El modulador de DLL3 aislado de 1, en el que el modulador de DLL3 comprende un antagonista de DLL3.
3. El modulador de DLL3 aislado de 1, en el que el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
4. El modulador de DLL3 aislado de 3 en el que el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
5. El modulador de DLL3 aislado de 4, en el que el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos.
6. El modulador de DLL3 aislado de 4, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante.
7. El modulador de DLL3 aislado de 4, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo de agotamiento.
8. El modulador de DLL3 aislado de 4, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo de internalizacion.
9. El modulador de DLL3 aislado de 8, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende ademas un agente citotoxico.
10. El modulador de DLL3 aislado de 4, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende una region variable de cadena ligera que tiene tres regiones determinantes de la complementariedad y una region variable de cadena pesada que tiene tres regiones determinantes de complementariedad, en el que las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y ligera comprenden al menos una region determinante de la complementariedad establecida en figura 11A y la Figura 11B.
11. El modulador de DLL3 aislado de 4, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende una region variable de
cadena ligera y una region variable de cadena pesada, en el que dicha region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacido tal como se exponen en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 , SEQ ID NO: 34, SEQ
ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEC
ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ
ID NO: 64, SEQ ID NO : 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ
ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172 . SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEC ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 202 y en el que dicha region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacido que tiene al menos 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos tal como se exponen en SEQ ID NO: 21, S EQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35,

SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49,

SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63,

SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77,

SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81. SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91,
SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 1 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121 , SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEC ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID
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NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 1 167, SEC ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO : 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 203.
12. Un modulador de DLL3 aislado que comprende una CDR de una cualquiera de las regiones variables de cadena pesada o ligera expuesta en 11.
13. Un modulador de DLL3 aislado que comprende un anticuerpo competitivo en el que dicho anticuerpo competitivo inhibe la union de un modulador de DLL3 aislado de 10 o 11 a DLL3 en al menos aproximadamente el 40%.
14. Un acido nucleico que codifica una region variable de cadena pesada de aminoacidos o una region variable de cadena ligera de aminoacidos de 11.
15. Un vector que comprende el acido nucleico de 14.
16. El modulador de DLL3 aislado de 1, que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma.
17. El modulador de DLL3 aislado de 16, en el que el modulador de DLL3 comprende ademas al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina.
18. El modulador de DLL3 aislado de 1, en el que dicho modulador reduce la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores tras la administracion a un sujeto en necesidad del mismo.
19. El modulador de DLL3 aislado de 18, en el que la reduccion de la frecuencia se determina usando analisis citometrico de flujo de marcadores de superficie de celulas tumorales conocidas por enriquecer celulas iniciadoras de tumores.
20. El modulador de DLL3 aislado de 18, en el que la reduccion de la frecuencia se determina usando la deteccion inmunohistoqulmica de marcadores de superficie de celulas tumorales conocidos por enriquecer celulas iniciadoras de tumores.
21. El modulador de DLL3 aislado de 18, en el que dichas celulas iniciadoras de tumores comprenden celulas que perpetuan los tumores.
22. El modulador de DLL3 aislado de 1, que comprende ademas un agente citotoxico.
23. Una composicion farmaceutica que comprende el modulador de DLL3 aislado de 1.
24. La composicion farmaceutica de 23, en la que dicho modulador de DLL3 aislado comprende un anticuerpo monoclonal.
25. La composicion farmaceutica de 24, en la que dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado.
26. La composicion farmaceutica de 25, en la que dicho anticuerpo humanizado comprende un agente citotoxico.
27. La composicion farmaceutica de 26, en la que dicho agente citotoxico comprende una pirrolobenzodiazepina.
28. Un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado aDLL3 que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un modulador de DLL3 a un sujeto en necesidad del mismo.
29. El procedimiento de 28, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un antagonista de DLL3.
30. El procedimiento de 28, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
31. El procedimiento de 30, en el que el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
32. El procedimiento de 31, en el que el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos.
33. El procedimiento de 32, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende una region variable de cadena ligera y una region variable de cadena pesada, en el que dicha region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoacidos tal como se exponen en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEC ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:
38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO:
52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 , SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEC I D NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140 , SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEC ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 202 y en el que dicha region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoacidos tal como se exponen en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:

25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:

39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:

53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO:

67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO:
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81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:
95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO; 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID
NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 203.
34. El procedimiento de 33, en el que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.
35. El procedimiento de 31, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante.
36. El procedimiento de 31, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo de internalizacion.
37. El procedimiento de 36, en el que dicha anticuerpo de internalizacion comprende un agente citotoxico.
38. El procedimiento de 37, en el que dicho agente citotoxico comprende una pirrolobenzodiazepina.
39. El procedimiento de 38, en el que dicho trastorno asociado a DLL3 comprende un trastorno neoplasico.
40. El procedimiento de 39, en el que dicho trastorno neoplasico comprende un tumor que exhibe caracterlsticas neuroendocrinas.
41. El procedimiento de 40. en el que dicho tumor que exhibe caracterlsticas neuroendocrinas comprende un tumor neuroendocrino.
42. El procedimiento de 39, en el que dicho trastorno neoplasico comprende un tumor hematologico.
43. El procedimiento de 42, en el que dich tumor hematologico comprende leucemia o linfoma.
44. El procedimiento de 39, en el que el sujeto que sufre dicho trastorno neoplasico muestra tumores que comprenden celulas iniciadoras del tumor.
45. El procedimiento de la 44, que comprende ademas la etapa de reducir la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores en dicho sujeto.
46. El procedimiento de 45, en el que la reduction de la frecuencia se determina usando analisis citometrico de flujo de marcadores de superficie de celulas tumorales conocidos por enriquecer celulas iniciadoras de tumores o detection inmunohistoqulmica de marcadores de superficie de celulas tumorales conocidos por enriquecer celulas iniciadoras de tumores.
47. El procedimiento de 45, en el que la reduccion de la frecuencia se determina usando analisis de dilution limitante in vitro o in vivo.
48. El procedimiento de 47, en el que la reduccion de la frecuencia se determina usando analisis de dilucion limitante in vivo que comprende el trasplante de celulas tumorales humanas in vivo en ratones inmunocomprometidos.
49. El procedimiento de 48, en el que la reduccion de la frecuencia determinada utilizando un analisis de dilucion limitante in vivo comprende la cuantificacion de la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores usando estadlsticas de distribution de Poisson.
50. El procedimiento de 47, en el que la reduccion de la frecuencia se determina usando analisis de dilucion limitante in vitro que comprende limitar la deposition de dilucion de las celulas tumorales humanas vivas en condiciones de soporte de colonias in vitro.
51. El procedimiento de 50, en el que la reduccion de la frecuencia determinada usando analisis de dilucion limitante in vitro comprende la cuantificacion de la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores usando estadlsticas de distribucion de Poisson.
52. El procedimiento de la 28, que comprende ademas la etapa de administrar un agente contra el cancer.
53. El procedimiento de 28, en el que dicho modulador de DLL3 comprende una o mas CDR de una cualquiera de SEQ lD NOS: 20 a 203.
54. El procedimiento de 28, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un modulador de pan-DLL.
55. Un procedimiento para reducir la frecuencia de las celulas iniciadoras de tumores en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar un modulador de DLL3 a dicho sujeto.
56. El procedimiento de 55, en el que las celulas iniciadoras de tumores comprenden celulas que perpetuan los tumores.
57. El procedimiento de 56, en el que dichas celulas que perpetuan los tumores son celulas CD324+ o CD46+.
58. El procedimiento de 55, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo.
59. El procedimiento de 58, en el que dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
60. El procedimiento de 59, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende ademas un agente citotoxico.
61. El procedimiento de 55, en el que el sujeto padece un trastorno neoplasico seleccionado del grupo que consiste en cancer adrenal, cancer de vejiga, cancer cervical, cancer endometrial, cancer de rinon, cancer de hlgado, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer colorrectal, cancer de pancreas, cancer de prostata y cancer de mama.
62. El procedimiento de 55, en el que la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores se reduce en al menos 10%.
63. El procedimiento de 55, en el que la reduccion de la frecuencia se determina usando analisis citometrico de flujo
de marcadores de superficie de celulas tumorales conocidos por enriquecer celulas iniciadoras de tumores o deteccion inmunohistoqulmica de marcadores de superficie de celulas tumorales conocidos por enriquecer celulas iniciadoras de tumores.
64. Un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece un tumor hematologico que comprende la etapa de administrar un modulador de DLL3 a dicho sujeto.
65. El procedimiento de 64, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo monoclonal.
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66. Un procedimiento de sensibilizacion de un tumor en un sujeto para el tratamiento con un agente contra el cancer que comprende la etapa de administrar un modulador de DLL3 a dicho sujeto.
67. El procedimiento de 66, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo.
68. El procedimiento de 66, en el que dicho tumor es un tumor solido.
69. El procedimiento de 66, en el que dicho agente contra el cancer comprende un agente quimioterapeutico.
70. El procedimiento de 66, en el que dicho agente contra el cancer comprende un agente inmunoterapeutico.
71. Un procedimiento de diagnostico de un trastorno proliferativo en un sujeto en necesidad del mismo que comprende las etapas de:
a. obtener una muestra de tejido de dicho sujeto;
b. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de DLL3; y
c. detectar o cuantificar el modulador de DLL3 asociado con la muestra.
72. El procedimiento de 71, en el que el modulador de DLL3 comprende un anticuerpo monoclonal.
73. El procedimiento de 72, en el que el anticuerpo esta operativamente asociado con un informador.
74. Un artlculo de fabricacion util para diagnosticar o tratar trastornos asociados a DLL3 que comprende un recipiente que comprende un modulador de DLL3 y materiales de instruccion para el uso de dicho modulador de DLL3 para tratar o diagnosticar el trastorno asociado a DLL3.
75. El artlculo de fabricacion de 74, en el que dicho modulador de DLL3 es un anticuerpo monoclonal.
76. El artlculo de fabricacion de 74, caracterizado porque el recipiente comprende una placa legible.
77. Un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece trastorno neoplasico que comprende la etapa de administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un modulador de DLL3 de internalizacion.
78. El procedimiento de 77, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo.
79. El procedimiento de 78, en el que dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
80. El procedimiento de 79, en el que el anticuerpo monoclonal comprende ademas un agente citotoxico.
81. El procedimiento de la 80, que comprende ademas la etapa de administrar un agente contra el cancer.
82. Un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno neoplasico que comprende la etapa de administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un modulador de de DLL3 neutralizacion.
83. El procedimiento de 82, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo.
84. El procedimiento de 83, en el que dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
85. El procedimiento de 84, en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado.
86. El procedimiento de 85, en el que dicho anticuerpo humanizado comprende ademas un agente citotoxico.
87. El procedimiento de 82, en el que el trastorno neoplasico comprende un tumor que exhibe caracterlsticas neuroendocrinas.
88. Un procedimiento de identificar, aislar, seccionar o enriquecer una poblacion de celulas iniciadoras de tumores que comprende la etapa de poner en contacto dichas celulas iniciadoras de tumores con un modulador de DLL3.
89. El procedimiento de 88, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo.
90. Un modulador de DLL3 que comprende un anticuerpo humanizado en el que dicho anticuerpo humanizado comprende una region variable de cadena ligera y una region variable de cadena pesada en el que dicha region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoacidos tal como se exponen en SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210 y SEQ ID NO: 212 y en el que dicha region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 60% de identidad con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoacidos tal como se exponen en SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211 y SEQ ID NO: 213.
91. Un procedimiento de inhibir o prevenir la metastasis en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar una cantidad farmaceuticamente eficaz de un modulador de DLL3.
92. El procedimiento de la 91, en el que el sujeto se somete a un procedimiento de reduccion de volumen antes o despues de la administracion del modulador de DLL3.
93. El procedimiento de 92, en el que dicho procedimiento de reduccion de volumen comprende la administracion de al menos un agente contra el cancer.
94. Un procedimiento de realization de terapia de mantenimiento en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar una cantidad farmaceuticamente eficaz de un modulador de DLL3.
95. El procedimiento de 94, en el que dicho sujeto fue tratado por un trastorno neoplasico antes de la administracion del modulador de DLL3.
96. Un procedimiento de agotamiento de celulas iniciadoras de tumores en un sujeto que padece un trastorno proliferativo que comprende la etapa de administrar un modulador de DLL3.
97. Un procedimiento para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado a DLL3 in vivo en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar un modulador de DLL3.
98. Un procedimiento para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado a DLL3 en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la etapa de poner en contacto las celulas tumorales circulantes con un modulador de DLL3.
99. El procedimiento de 98, en el que dicha etapa de contacto se produce in vivo.
100. El procedimiento de 98, en el que dicha etapa de contacto se produce in vitro.
101. Un procedimiento de tratamiento de un tumor que presenta caracterlsticas neuroendocrinas en un paciente en necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un modulador de DLL3.
102. El procedimiento de la 101, en el que dicho tumor que exhibe caracterlsticas neuroendocrinas es un tumor
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neuroendocrino.
103. A modulador de DLL3 derivado de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15 , SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16 0.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56 , SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16 0.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110 , SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16 0.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139 , SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 y SC16.150.
104. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epltopo asociado con el dominio EGF1 de DLL3.
105. El modulador de DLL3 de 104, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
106. El modulador de DLL3 de 105, en el que dicho anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
107. El modulador de DLL3 de 106, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un ADC.
108. El modulador de DLL3 de 107, en el que dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazopina.
109. El modulador de DLL3 de 108, que comprende ademas un enlazador.
110. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epltopo asociado con el dominio EGF2 de DLL3.
111. El modulador de DLL3 de 110, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento
inmunorreactivo del mismo.
112. El modulador de DLL3 de 111, en el que dicho anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
113. El modulador de DLL3 de 112, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un ADC.
114. El modulador de DLL3 de 113, en el que dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
115. El modulador de DLL3 de 114 que comprende ademas un enlazador.
116. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epltopo asociado con el dominio EGF3 de DLL3.
117. El modulador de DLL3 de 116, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento
inmunorreactivo del mismo.
118. El modulador de DLL3 de 117, en el que dicho anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mism, comprende un anticuerpo monoclonal.
119. El modulador de DLL3 de 118, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un ADC.
120. El modulador de DLL3 de 119, en el que dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
121. El modulador de DLL3 de 120, que comprende ademas un enlazador.
122. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epltopo asociado con el dominio EGF4 de DLL3.
123. El modulador de DLL3 de 122, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento
inmunorreactivo del mismo.
124. El modulador de DLL3 de 123, en el que dicho anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
125. El modulador de DLL3 de 124, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un ADC.
126. El modulador de DLL3 de 125, en el que dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
127. El modulador de DLL3 de 126, que comprende ademas un enlazador.
128. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epltopo asociado con el dominio EGF5 de DLL3.
129. El modulador de DLL3 de 128, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento
inmunorreactivo del mismo.
130. El modulador de DLL3 de 129, en el que dicho anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
131. El modulador de DLL3 de 130, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un ADC.
132. El modulador de DLL3 de 131, en el que dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
133. El modulador de DLL3 de 132, que comprende ademas un enlazador.
134. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epltopo asociado con el dominio EGF6 de DLL3.
135. El modulador de DLL3 de 134, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento
inmunorreactivo del mismo.
136. El modulador de DLL3 de 135, en el que dicho anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
137. El modulador de DLL3 de 136, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un ADC.
138. El modulador de DLL3 de 137, en el que dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
139. El modulador de DLL3 de 138, que comprende ademas un enlazador.
140. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epltopo asociado con el dominio de DSL de DLL3.
141. El modulador de DLL3 de 140, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento
inmunorreactivo del mism.
142. El modulador de DLL3 de 141, en el que dicho anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
143. El modulador de DLL3 de 142, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un ADC.
144. El modulador de DLL3 de 143, en el que dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
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145. El modulador de DLL3 de 144, que comprende ademas un enlazador.
146. Un modulador de DLL3 aislado que se une a un epitopo asociado con el dominio N-terminal de DLL3.
147. El modulador de DLL3 de 146, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
148. El modulador de DLL3 de 147, en el que dicho anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
149. El modulador de DLL3 de 148, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un ADC.
150. El modulador de DLL3 de 149, en el que dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
151. El modulador de DLL3 de 150, que comprende ademas un enlazador.
152. Un modulador de DLL3 aislado que reside en un grupo seleccionado del grupo que consiste de grupo A, grupo B, grupo C, grupo D, grupo E, grupo F, grupo G, grupo H y grupo I.
153. Un modulador de DLL3 aislado que reside en un grupo definido por un anticuerpo de referencia seleccionado
del grupo que consiste en SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15,
SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC.16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31,
SC16.34, SC16. 35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50,
SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68,
SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16. 80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16. 125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16. 148, SC16.149 y SC16.150.
154. Un conjugado de anticuerpo y farmaco de la formula:
M-[L-D]n
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que
a) M comprende un modulador de DLL3;
b) L comprende un enlazador opcional;
c) D es un agente antiproliferativo; y
d) n es un numero entero de a aproximadamente 20.
155. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 154, en el que dicho modulador de DLL3 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
156. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 155, en el que dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
157. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 156, en el que dicho anticuerpo se deriva de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16. 31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16. 78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16. 123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 y SC16.150.
158. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 157, en el que dicho anticuerpo es humanizado.
159. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 154, en el que el enlazador comprende un enlazador escindible.
160. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 159, en el que dicho enlazador escindible comprende un enlazador de peptidilo.
161. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 154, en el que dicho agente antiproliferativo comprende un agente citotoxico.
162. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 161, en el que dicho agente citotoxico comprende una pirrolobenzodiazopina.
163. El conjugado de anticuerpo y farmaco de 162, en el que dicha pirrolobenzodiazepina comprende un dimero de pirrolobenzodiazepina.
164. Un modulador de DLL3 que comprende una CDR de una cualquiera de SEQ ID NOS: 20 a 203.
165. El modulador de DLL3 de 164, en el que dicho modulador comprende una pluralidad de CDR de una cualquiera de SEQ ID NOS: 20 a 203.
166. Un modulador anticuerpo de DLL3 que compite por la union a una proteina DLL3 con un anticuerpo de
referencia seleccionado del grupo que consiste en SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16. 11,
SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29,
SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47,
SC16.49, SC16.50, SC16. 52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65,
SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16. 108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113,
SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124,
SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136,
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SC16. 137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.1 49 y SC16.150, en el que la union del modulador anticuerpo de DLL3 a la protelna DLL3 es inhibida en al menos 30%.
167. Un modulador de DLL3 que se une a un epltopo de protelna DLL3 que comprende los aminoacidos Q93, P94, G95, A96 y P97 (SEQ ID NO: 9).
168. Un modulador de DLL3 que se une a un epltopo de protelna DLL3 que comprende los aminoacidos G203, R205 y P206 (SEQ ID NO: 10).
EJEMPLOS
[0496] La presente invencion, descrita en general anteriormente, se entendera mas facilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustracion y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion. Los ejemplos no pretenden representar que los experimentos siguientes son todos o los unicos experimentos realizados. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura esta en0Centlgrados y la presion es la atmosferica o proxima.
Ejemplo 1
Analisis de la expresion de marcadores en tumores seleccionados con caracterfsticas neuroendocrinas
[0497] Los tumores neuroendocrinos (NET) que derivan del sistema endocrino disperso son poco frecuentes, con una incidencia de 2-5 por cada 100.000 personas, pero altamente agresivo. Los tumores neuroendocrinos se producen en la glandula suprarrenal, rinon, tracto genitourinario (vejiga, prostata, ovario, cuello uterino y endometrio), pancreas, tracto gastrointestinal (estomago y colon), tiroides (cancer medular de tiroides), y carcinoma de pulmon (pulmon de celulas pequenas, carcinoma neuroendocrino de celulas grandes, y carcinoide). Estos tumores pueden secretar varias hormonas incluyendo la serotonina y/o la cromogranina A que pueden causar slntomas debilitantes conocidos como el slndrome carcinoide. Estos tumores se pueden indicar por marcadores inmunohistoqulmicos positivos, tales como la enolasa especlfica de neuronas (NSE, tambien conocida como enolasa gamma, slmbolo de gen = ENO2), CD56/NCAM1, y sinaptofisina. Las quimioterapias tradicionales no han tenido exito en el tratamiento de los NET, y la mortalidad debida a la diseminacion metastasica es un resultado habitual. Desafortunadamente, en la mayorla de los ejemplos la cirugla es el unico tratamiento curativo potencial, siempre que se lleve a cabo despues de la deteccion temprana y antes de la metastasis tumoral. En este contexto, se realizo un trabajo para identificar nuevas dianas terapeuticas asociadas con tumores que comprenden caracterfsticas neuroendocrinas.
[0498] Para identificar y caracterizar tales tumores tal como existen en pacientes con cancer, se desarrollo un banco de tumores de xenoinjerto no tradicional grandes (NTX) y se mantuvo usando tecnicas reconocidas en el sector. El banco de tumores de NTX, que comprende un numero sustancial de llneas de celulas tumorales discretas, se propago en ratones inmunocomprometidos a traves de multiples pasajes de celulas tumorales heterogeneos obtenidos originalmente de numerosos pacientes con cancer aquejados por una variedad de tumores solidos. (Observese que en algunos de los ejemplos y las figuras en el presente documento el numero de pasos de la muestra ensayada se indica por p0-p # anexa a la designacion de la muestra donde p0 es indicativa de una muestra no pasada obtenida directamente de un tumor del paciente y p # es indicativo del numero de veces que el tumor ha pasado a traves de un raton antes de la prueba). La disponibilidad continua de un gran numero de llneas de celulas tumorales NTX discretas de paso temprano que tienen linajes bien definidos facilitan en gran medida la identification y caracterizacion de las celulas purificadas de las llneas celulares. En tal trabajo el uso de llneas celulares de NTX mlnimamente pasadas simplifica la experimentation in vivo y proporciona resultados facilmente verificables. Por otra parte, los tumores de NTX de paso temprano responden a agentes terapeuticos, tales como reglmenes de irinotecan (es decir Camptosar®) y cisplatino/etoposido, que proporcionan cllnicamente conocimientos pertinentes sobre los mecanismos subyacentes que impulsan el crecimiento del tumor, resistencia a las terapias actuales y la recurrencia del tumor.
[0499] A medida que se establecieron las llneas celulares tumorales NTX, su fenotipo se caracterizo de diversas maneras para examinar la expresion genica global. Para identificar que llneas NTX en el banco podrlan ser NET, se generaron perfiles de expresion genica mediante secuenciacion del transcriptoma completo y/o el analisis de micromatrices. Especlficamente, los datos se examinaron para identificar tumores que expresan altos niveles de genes especlficos conocidos que se sabe que son elevados en NET o se utilizan como marcadores histoqulmicos de diferenciacion neuroendocrina (por ejemplo, ASCL1, NCAM1, CHGA), as! como tumores con cambios en los genes de la via Notch indicativos de supresion de la serialization de Notch (por ejemplo, reduction de los niveles de receptores Notch, y cambios en ligandos y moleculas efectoras).
[0500] Mas particularmente, al establecer diversas llneas celulares de tumor NTX como se hace habitualmente para los tumores humanos en ratones muy inmunocomprometidos, los tumores se extirparon despues de llegar a 800 - 2000 mm3 y las celulas se disociaron y se dispersaron en suspension usando el tecnicas de digestion enzimatica reconocidas (vease, por ejemplo, USPN 2007/0292414):
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[0501] Se agotaron las celulas murinas de preparaciones de celulas disociadas a partir de estas ilneas NTX y las subpoblaciones de celulas tumorales humanas se aislaron adicionalmente por clasificacion celular activadas por fluorescencia y se lisaron en tampon de lisis RLTplus RNA (Qiagen). Estos lisados se almacenaron a -80°C hasta su uso. Tras la descongelacion, el ARN total se extrajo utilizando un kit de aislamiento RNeasy (Qiagen) siguiendo las instrucciones del proveedor y se cuantifico en un espectrofotometro Nanodrop (Thermo Scientific) y un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) de nuevo usando los protocolos del fabricante y los ajustes del instrumento recomendados. Las preparaciones de ARN totales resultantes eran adecuadas para la secuenciacion genetica y analisis de expresion genica.
[0502] Se realizo una secuenciacion del transcriptoma completo utilizando el sistema de secuenciacion de nueva generacion SOLiD (secuenciacion por ligamiento/deteccion de oligonucleotidos) 4.5 o SOLiD 5500x1 de la marca Applied Biosystems (ABI) (Life Technologies) en muestras de ARN de llneas NTX. El ADNc se genera a partir de muestras de ARN total utilizando un protocolo de transcriptoma completo (WT) modificado de ABI disenado para ARn total de baja entrada o el sistema Ovation RNA-Seq Sistema V2® (NuGEN Technologies Inc.). El protocolo WT de baja entrada modificada utiliza 1,0 ng de ARN total para amplificar el ARNm en el extremo que conduce a una fuerte distorsion en 3' de la expresion genica asignada, mientras que el sistema de NuGen permite una amplificacion mas consistente a lo largo de la transcripcion, e incluye amplificacion de ambos ARNm y ADNc transcritos no poliadenilados utilizando hexameros al azar. La biblioteca de ADNc se fragmento y se anadieron codigos de barras adaptadores para permitir el agrupamiento de las bibliotecas de fragmentos de diferentes muestras.
[0503] Las plataformas de secuenciacion de nueva generacion ABI SOLiD 4.5 y 5500x1 SOLiD permiten la secuenciacion paralela de transcriptomas de multiples llneas de NTX y poblaciones clasificadas. Una biblioteca de ADNc se construyo a partir de cada muestra de ARN, que se fragmento y asigno un codigo de barras. Los codigos de barras de cada biblioteca de fragmentos permiten que multiples muestras puedan combinarse en concentraciones iguales y analizarse garantizando la especificidad de la muestra. Las muestras se extraen a traves de PCR en emulsion usando sistema robotico de microesferas SOLID™ EZ Bead™ de ABI, que garantiza la consistencia de la muestra. La secuenciacion de extremos emparejados genera una lectura de 50 bases en la direccion 5' a 3' y una lectura de 25 bases en la direccion de 3' a 5' para cada fragmento clonalmente amplificado en una unica microesfera que existe en la combinacion. En el caso de la plataforma de 5500x1, para cada conjunto de 8 muestras agrupadas en el procedimiento mencionado anteriormente, las microesferas se depositan uniformemente en 6 hileras de un unico canal en un unico chip. Esto, en promedio, generara mas de 50 millones lecturas de 50 bases y 50 millones de lecturas de 25 bases para cada una de las 8 muestras y genera una representacion muy precisa del nivel de transcrito de ARNm en las celulas tumorales. Los datos generados por la plataforma solida mapearon 34.609 genes, tal como indica RefSeq version 47 usando NCBI version hg19.2 del genoma humano publicado y proporcionaron mediciones verificables de los niveles de ARN en la mayorla de las muestras.
[0504] La plataforma SOLID es capaz de capturar no solo la expresion, sino los SNPs, eventos de empalme alternativos conocidos y desconocidos, ARN no codificante pequeno, y potencialmente nuevos descubrimientos de exones basados unicamente en la cobertura de la lectura (lecturas mapeadas especialmente para posiciones genomicas no anotadas previamente). Por lo tanto, el uso de esta plataforma de secuenciacion de nueva generacion acompanada con el analisis de datos registrados y software de visualizacion permite por lo tanto el descubrimiento de la expresion diferencial del transcrito, as! como las diferencias y/o preferencias para las variantes de corte y empalme especlficas de transcritos de ARNm expresados. Los datos de secuenciacion de la plataforma SOLID estan representados nominalmente como un valor de la expresion del transcrito usando las cifras de RPM (lecturas por millon) y RPKM (lecturas por kilobase por millon), lo que permite el analisis basico de la expresion diferencial segun la practica estandar.
[0505] La secuenciacion del transcriptoma completo de cuatro tumores (LU73, LU64, LU86 y LU95) debidos al carcinoma de pulmon de celula pequena (SCLC), un tumor ovarico (OV26) y un carcinoma de neuroendocrino de celulas grandes (LCNEC; LU37) dio como resultado la determination de los patrones de expresion genica que se encuentran habitualmente en NET (Figura 4A). Mas especlficamente, estos tumores presentaron una alta expresion de varios marcadores de NET (ASCL1, NCAM1, CHGA), as! como niveles reducidos de receptores Notch y moleculas efectoras (por ejemplo, HES1, HEY1) y elevation de expresion de marcadores de supresion de Notch (por ejemplo, DLL3 y HBS6). En cambio, 4 muestras de pulmon normal, tres tumores debido a adenocarcinoma de pulmon (LU137, LU146 y LU153), y 3 carcinomas de pulmon de celulas escamosas (LU49, LU70 y LU76) todos tienen expresion de diversos receptores Notch y moleculas efectoras, y no muestran una elevada expresion de supresores de Notch, tales como HES6 y DLL3.
[0506] Despues de identificar que NTX en el banco de tumor son NET, cada uno se analizo utilizando los datos de secuenciacion del transcriptoma completo para encontrar posibles dianas terapeuticas reguladas por ascenso en NET, en comparacion con los no NET (incluyendo LU_SCC, LU_Ad y pulmon normal). Se detecto una alta expresion de DLL3 en tumores NTX NET incluyendo SCLC, LCNEC, y OV26, en comparacion a la baja o inexistente expresion en pulmon normal, ovario normal, otra OV NTX, LU_Ad y LU_SCC NTX (Figura 4B). La alta expresion de DLL3 en NET en relation con una variedad de tipos de tejidos normales fue de gran interes, ya que DLL3 es un supresor conocido de la serialization de Notch. Debido a esto, y en vista de los datos generados, se selecciono DLL3 para su posterior analisis como una diana potencial inmunoterapeutica.
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[0507] Con el descubrimiento de que DLL3 puede llegar a ser una diana viable para la modulacion y el tratamiento de ciertos trastornos proliferativos, se llevo a cabo un trabajo para determinar el patron de expresion y los niveles de las variantes de DLL3. Como se discutio anteriormente, existen dos variantes de empalme conocidas de DLL3 que codifican protelnas que difieren solo en que la isoforma 1 tiene una C-terminal extendido intracelular (Figura 1E). Mas especlficamente la isoforma 2 es una protelna de 587 aminoacidos (figura 1D; SEQ ID NO: 4.) codificada por la variante de ARNm 2 (figura 1B; SEQ ID NO: 2), que contiene los exones 8a y 8c, mientras la isoforma 1 es una protelna de 618 aminoacidos (figura 1C; SEQ ID NO: 3) codificada por la variante de ARNm I (figura 1A; SEQ ID NO: 1), que contiene el exon 8b. Un diagrama esquematico que ilustra el dominio extracelular (ECD) identico de la isoforma 1 y la isoforma 2 se presenta en la Figura 1F.
[0508] De nuevo, usando los datos de transcriptoma completo obtenidos como se describio anteriormente, se examinaron tumores NET seleccionados para determinar los patrones de expresion de los exones mencionados anteriormente, que, por extension, proporciona la relacion de expresion de las dos isoformas. Como se muestra en la Figura 5 se encontro que mientras que la relacion de expresion particular entre las dos isoformas puede variar algo, la expresion de la isoforma 1 fue predominante en cada tumor. En este respecto, es importante senalar que, como se describio anteriormente, la expresion de DLL3 acumulativa (ambas isoformas) en cada uno de los tumores ensayados fue elevada con respecto a los tejidos normales. En consecuencia, mientras que relaciones de isoformas pueden ser indicativas de ciertos tipos de tumores y relevante para la seleccion del modulador genotlpico, no es tan crltica con respecto a las estrategias de modulador fenotlpicos. Es decir, dado que la region ECD de ambas isoformas de DLL3 es identica, se espera que un modulador fenotlpica de la presente descripcion dirigido a la region ECD (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL3) reaccione con cualquiera de las isoformas. Por lo tanto, la expresion absoluta de los niveles de ECD de DLL3 (independientemente de la isoforma) que es factor determinante en cuanto a la eficacia de tales estrategias.
Ejemplo 2
Analisis de micromatrices y por RT-PCR de la expresion genica en tumores NTX seleccionados con caracterfsticas neuroendocrinas
[0509] En un esfuerzo por identificar NET adicionales en el banco NTX mencionado anteriormente, mas alla de aquellos para los cuales existlan datos de transcriptoma completo obtenidos por SOLID, se exmaino un conjunto mas amplio de llneas NTX usando el analisis de micromatrices. Especlficamente, se analizaron 2-6 mg de muestras de ARN total derivadas de tumores enteros en 46 llneas NTX o de 2 tejidos normales usando una plataforma de micromatrices OneArray® (Phalanx Biotech Group), que contiene 29187 sondas disenadas contra 19.380 genes en el genoma humano. Mas especlficamente, se obtuvieron muestras de ARN (como se describe en el Ejemplo 1) a partir de tumores NTX enteros derivados cuarenta y seis pacientes que comprenden cancer colorrectal (CR), melanoma (SK), rinon (KD), pulmon (LU), de ovario (OV), endometrial (EM), mama (BR), el hlgado (LIV), o de pancreas (PA) canceres. Se utilizaron tejidos colorectales normales (NormCR) y de pancreas normal (NormPA) como controles. Todavla mas especlficamente, los tumores de pulmon se subclasificaron como los canceres de pulmon de celulas pequenas (SCLC), cancer de celulas escamosas (SCC), o carcinoma neuroendocrino de celulas pequenas (LCNEC). Las muestras de ARN se analizaron por triplicado usando los protocolos del fabricante y se analizaron los datos resultantes utilizando practicas estandar de la industria para normalizar y transformar los valores de intensidad medidos obtenidos para el gen en cuestion en cada muestra. Se utilizo un algoritmo de agrupamiento jerarquico no sesgado de Pearson Spearman en el conjunto de paquetes de R/BioConductor denominado hclust.2 para crear un dendrograma de micromatrices estandar para estas 48 muestras. Como se conoce en la tecnica R/BioConductor es un lenguaje de programacion estadlstico de codigo abierto ampliamente utilizado en el mundo academico, las finanzas y la industria farmaceutica para el analisis de datos. En general, los tumores se organizaron y agruparon sobre la base de patrones de expresion genica, la intensidad de la expresion, etc.
[0510] Como se muestra en la Figura 6A, el dendrograma derivado de las 48 muestras y para todos los 19380 genes, agrupo llneas NTX juntas en funcion de su tipo de turmo o tejido de origen. Varios tumores tlpicamente asociados con fenotipos neuroendocrinos se agruparon juntos en la rama indicada por (1); estos incluyen los canceres de piel, numerosos canceres de pulmon y otros NET. Curiosamente, una subrama, indicada por (2), mostro que dos canceres de pulmon de celulas grandes con caracterlsticas neuroendocrinas (LU50.LCNEC y LU37.LCNEC) y un cancer de pulmon de celulas pequenas (LU102.SCLC) se agruparon con un tumor de ovario (OV26) y rinon (KD66) (grupo C) lo que sugiere que estos ultimos tumores tambien poseen fenotipos neuroendocrinos. Por otra parte, la Figura 6A muestra el grupo D que consta de 3 tumores SCLC adicionales, y a su derecha un pequeno grupo que contiene un SCLC NTX adicional (LU100) y un tumor endometrial neuroendocrino (EM6), cabe esperar que todos posean algunas caracterlsticas neuroendocrinas como se entiende generalmente de la literatura y la experiencia patologica en la cllnica. El hecho de que el grupo G, compuesto de carcinomas de celulas escamosas del pulmon, se pueda encontrar en una rama completamente diferente del dendrograma de la Figura 6A indica que la agrupacion no depende exclusivamente del organo de origen para el tumor.
[0511] Una inspection mas exhaustiva de una coleccion de marcadores de genes asociados con NET (Figura 6B) muestra que estan fuertemente expresados en tumores que comprenden los grupos C y D, mientras que se
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expresan mlnimamente en los tumores en el grupo G (carcinoma de celulas escamosas de pulmon), lo que sugiere que los grupos C y D representan NET o tumores con un fenotipo neuroendocrino. Mas especlficamente, los NET de grupo C expresan altamente ASCL1, CALCA, CHGA, SST y NKX2-1, mientras que los NET del grupo D expresan altamente CHGA, ENO2 y NCAM1, y la expresion de estos genes de fenotipo neuroendocrino es en parte responsable de la agrupacion de estos tumores. Una caracterlstica interesante es la fuerte expresion de KIT en el grupo D, un gen cuya asociacion con tumores neuroendocrinos ha sido descrita ocasionalmente, pero claramente relacionado con la oncogenesis en otros contextos. Esto esta en contraste con los tumores SCC en el grupo G que carecen de expresion fuerte de cualquiera de estos genes (Figura 6B).
[0512] Con respecto a la senalizacion de Notch, los tumores en el grupo C muestran un fenotipo compatible con una reduccion de la senalizacion de Notch: una falta de expresion de cualquier receptor Notch, una relativa falta de expresion JAG1 y HES1, y fuertes niveles de expresion ASCL1 (Figura 6C). Curiosamente, el grupo D muestra alta expresion de HES6, un factor de transcripcion que puede apoyar la actividad ASCL1 antagonizando la actividad HES1 a traves de la formacion de heterodlmeros. Mas importante, estos datos de micromatrices muestran altos niveles de transcripcion de DLL3 en tumores en los grupos C y D (en relacion al grupo G), lo que sugiere que en estos tipos de tumores, DLL3 ofrece una atractiva diana terapeutica para el tratamiento de los NET.
[0513] En vista de los resultados anteriormente mencionados, la expresion de ARNm de HES6 se examino de varias llneas de NTX y tejidos normales utilizando un equipo Applied Biosystems 7900HT (Life Technologies) para llevar a cabo RT-PCR cuantitativa en tiempo real Taqman (qRT-PCR) segun los protocolos del fabricante. Se aislo el ARN como se describio anteriormente y se comprobo para garantizar que la calidad era adecuada para el analisis de la expresion genica. Se compro ARN de tejidos normales (Agilent Technologies y Life Technologies). Se utilizaron 200 ng de ARN para la slntesis de ADNc usando el kit de archivo de ADNc (Life Technologies). Se utilizo cDNA para el analisis de qRT-PCR en matrices Taqman de baja densidad (TLDA; Life Technologies) que contenla el ensayo Taqman de HES6 para medir los niveles de ARNm de HES6.
[0514] Los niveles de ARNm de HES6 se muestran para cada llnea NTX o muestra de tejido normal (solo un punto en el grafico) despues de la normalizacion con los controles endogenos. Los valores normalizados se representaron graficamente con respecto al promedio de expresion en los tejidos normales de interes para la toxicidad (NormTox). Esta tecnica permitio la rapida identificacion y caracterizacion de una variedad de tumores que tienen caracterlsticas neuroendocrinas a partir del banco de tumores NTX traves de la medicion de HBS6 y otros marcadores relevantes. La Figura 6D ilustra la sobreexpresion general de HBS6 en los tumores con caracterlsticas neuroendocrinas (por ejemplo, LU-SCLC, LU-LCNEC) en comparacion con los tejidos normales, tumores de mama, colon, hlgado y otros tumores seleccionados. Significativamente estos datos de micromatrices y qPCR muestran que al menos algunos tumores de endometrio, rinon y ovario pueden exhibir caracterlsticas de tumor neuroendocrino (Figuras 6A y 6D).
Ejemplo 3
Analisis por RT-PCR de DLL3 en los tumores con caracterlsticas neuroendocrinas
[0515] Para confirmar los datos micromatriciales y de SOLID generados y extender el analisis para muestras adicionales de NTX, se analizo la expresion de ARNm de DLL3 por qRT-PCR usando muestras de ARN de las diferentes llneas de NTX, biopsias primarias y tejidos normales. El analisis se realizo otra vez utilizando un equipo Applied Biosystems 7900HT (Life Technologies) sustancialmente como se describe inmediatamente mas arriba, pero optimizado para la deteccion de DLL3. La expresion de DLL3 se muestra en relacion con el promedio de expresion en tejidos normales y se normalizo para la expresion del gen endogeno de control ALAS 1. Como se ve en la Figura 7, el analisis por qRT-PCR de la expresion genica mostro que ARNm de DLL3 se eleva mas de 10.000.000 veces en poblaciones NET frente a tejidos normales. En este ejemplo los tumores de la muestra incluyen las llneas SCLC NTX adicionales mas alla de las ensayadas anteriormente, as! como un numero de muestras de ARN derivadas de biopsias primarias (P0). Tomados en conjunto estos datos demuestran que la expresion genica de DLL3 esta regulada positivamente de manera espectacular en los tumores que exhiben caracterlsticas neuroendocrinas y, dado que el mismo patron se observa en las muestras de biopsia primarios, la regulation por incremento observada no es una consecuencia del crecimiento tumores humanos en ratones.
[0516] Ademas, estan tambien representados en la Figura 7 tres subtipos de NSCLC definidos por patologla cllnica: LU25 es un carcinoma de pulmon de celulas fusiformes, LU50 es un carcinoma neuroendocrino de celulas grandes (LCNEC), y LU85 es un carcinoma de celulas escamosas (SCC). La expresion mas alta de DLL3 se observo en el tumor LU50 de LCNEC, aunque niveles elevados tambien se observaron en los tumores de celulas fusiformes y SCC. KDY66 y OV26, un tumor de rinon y de ovario, respectivamente, se agruparon en la micromatriz con tumores SCLC y LCNEC (Figura 6A), lo que sugiere que comprenden tumores que exhiben caracterlsticas neuroendocrinas (es decir, NET o pNET). Tal conclusion es corroborada por los altos niveles de ARNm de DLL3 observados en ambas muestras tumorales (Figura 7). Aunque todos los tumores muestran una regulacion por incremento sorprendente de ARnm de DLL3 en relacion con los tejidos normales (Figura. 7), la comparacion de tumores que se encuentran tanto en las figuras 6A y 7 muestra que las diferencias sutiles en la expresion de ARnm de DLL3 medida en la Figura 7 corresponde a la agrupacion diferencial en la Figura 6A; por ejemplo, el grupo C contiene KD66,
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LU50, OV26 y LU102, que estan en el extremo mas alto de expresion de DLL3 como se muestra en la figura 7, mientras que LU85 y LU100, cada uno de los cuales se agrupan lejos de los grupos C y D en la Figura 6A, se encuentran entre el extremo inferior de la expresion de DLL3 para las muestras tumorales medidas. Los tumores de cancer de pulmon de celulas pequenas en el grupo D en la Figura 6A (por ejemplo, LU86, LU64 y LU95) muestran niveles intermedios de la expresion de ARNmde DLL3 y pueden muy bien ser susceptibles de tratamiento con los moduladores de la presente description.
Ejemplo 4
Expresion de ARNm de DLL3 y protefna en varias muestras de tumor
[0517] Para extender el analisis de la expresion DLL3 a una gama mas amplia de muestras de tumor, se realizo una qRT-PCR Taqman sustancialmente como se describe en los ejemplos anteriores en una matriz de 384 pocillos TissueScan™ qPCR (Origene Technologies). Esta matriz permite la comparacion de la expresion genica a traves de 18 tipos de tumores solidos diferentes, con multiples muestras derivadas de pacientes para cada tipo de tumor y de tejido adyacente normal.
[0518] A este respecto, las Figuras 8A y 8B muestran los niveles de expresion genica relativos y absolutos, respectivamente, de DLL3 en muestras de tumores enteros (puntos grises) o de tejido normal adyacente (NAT; puntos blancos) de pacientes con uno de las dieciocho tipos de tumores solidos diferentes. Los datos se normalizaron en la Figura 8A contra la expresion genica media en NAT para cada tipo de tumor analizado. Las muestras en las que no se detecto DLL3 se les asigno un valor de Ct de 50, que representa el ultimo ciclo de la amplification en el protocolo experimental. Cada punto representa una muestra de tejido unico, con el valor de la media geometrica representada como una llnea de color negro. Utilizando esta matriz de Origene TissueScan, la sobreexpresion de DLL3 se observo en un subconjunto de canceres adrenal, mama, cervical, endometrial, de pulmon, de ovario, de pancreas, de tiroides y de vejiga, muchos de los cuales pueden representar NET o tumores con fenotipos neuroendocrinos pobremente diferenciados. Un subconjunto de tumores de pulmon mostro la mayor sobreexpresion de DLL3. La expresion mas alta se observo en 2 tumores LCNEC en la matriz. Como se muestra por la expresion absoluta de genes en la Figura 8B, el testlculo normal es el unico tejido normal con alta expresion de DLL3. Esto sugiere que la expresion de DLL3 en NET y otras celulas tumorigenicas podrla desempenar un papel en la tumorigenesis y/o la progresion del tumor en una amplia variedad de tumores.
[0519] Teniendo en cuenta los elevados niveles de transcription de DLL3 asociados con varios tumores, se realizo un trabajo para demostrar un incremento correspondiente en la expresion de la protelna DLL3 en NET en relation con otros tumores. Con este fin se ha desarrollado un ELISA sandwich para DLL3 utilizando la plataforma de descubrimiento MSD (Meso Scala Discovery, LLC) para detectar y cuantificar la expresion de DLL3 en muestras de tumores NTX seleccionados. Brevemente, las muestras tumorales NTX se lisaron y se cuantifico la concentration de protelna total, as! como la concentracion de protelna DLL3, en los lisados utilizando detection de electroquimioluminiscencia basada en ELISA sandwich. Mas especlficamente, las concentraciones de DLL3 de las muestras se interpolan a partir de los valores de electroquimioluminiscencia utilizando una curva estandar generada a partir de protelna recombinante purificada y se expresan en la Figura 8C como nanogramos de DLL3 por miligramo de protelna total.
[0520] Mas especlficamente, los tumores NTX fueron extirpados de los ratones y se congelaron rapidamente en hielo seco/etanol. Se anadio tampon para la extraction de protelnas (Biochain Institute, Inc.) a las piezas tumorales descongeladas y los tumores se pulverizaron utilizando un sistema lisador de tejidos (Qiagen). Los lisados se aclararon por centrifugation (20.000 g, 20 minutos, 4°C) y la protelna se cuantifico utilizando acido bicinconlnico (BCA). Los lisados proteicos se almacenaron a -80°C hasta el ensayo.
[0521] Se recubrieron placas estandar de MSD (Meso Scale Discovery, LLC) durante la noche a 4°C con 30 ml de anticuerpo SC16.S4 (obtenido tal como se expone en el Ejemplo 7 mas abajo) en 2 mg/ml en PBS. Las placas se lavaron en PBST y se bloquearon en 150 ul de solution de bloqueador A de MSD al 3% durante 1 hora. Las placas se lavaron de nuevo con PBST. Se conjugaron 25 ml del anticuerpo SC16.4 (obtenido tal como se expone en el Ejemplo 7 a continuation) con el sulfomarcador MSD y se anadieron a las placas lavadas en 0,5 mg/ml en bloqueador A de MSD al 1%. Tambien se anadieron 25 uL de lisado diluido en serie en bloqueador A de MSD al 1% que contenla un 10% de tampon de extraccion de protelnas a los pocillos y se incubaron durante 2 horas. Las placas se lavaron en PBST. Se diluyo tampon de lectura T de MSd con surfactante hasta 1X en agua y se anadieron 150 uL a cada pocillo. Las placas se leyeron en un lector Sector lmager 2400 de MSD usando un programa de analisis de software integrado para derivar concentraciones DLL3 en muestras NTX a traves de interpolation. Los valores se dividieron por la concentracion total de protelna para obtener nanogramos de DLL3 por miligramo de protelna total en el lisado. Las concentraciones resultantes se exponen en la Figura 8C en la que cada punto representa las concentraciones derivadas de una sola llnea de tumor NTX. Aunque cada punto se deriva de una unica llnea NTX, en la mayorla de ejemplos multiples se ensayaron muestras biologicas de la misma llnea NTX y los valores se promediaron para proporcionar el dato puntual.
[0522] En cualquier caso, la Figura 8C muestra que la expresion mas alta de DLL3 se encontro en SCLC, LCNEC,
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as! como otros tumores neuroendocrinos, incluyendo muestras de rinon seleccionados y un solo tumor de ovario. Figura 8C tambien demuestra que ciertas llneas NTX de melanoma exhiben una elevada expresion de protelnas DLL3 que es particularmente interesante, ya que que estas llneas NTX tambien se agruparon cerca de llneas NET NTX en el analisis de micromarices realizada en el Ejemplo 4 (Figura 6A).
[0523] Estos datos, combinados con los datos de la transcripcion para la expresion de DLL3 establecidos anteriormente, refuerza fuertemente la teorla de que los determinantes de DLL3 proporcionan dianas atractivas para la intervention terapeutica.
Ejemplo 5
Expresion de los receptores Notch y ligandos de tipo delta en la superficie celular de llneas tumorales NTX seleccionadas
[0524] Para ampliar aun mas las observaciones de los Ejemplos 1 y 2 anteriores, las celulas aisladas a partir de varios tumores NTX de los grupos C y D (KDY66, OV26, LU64; figura 6A), as! como un tumor SCLC del que se determino una alta expresion de DLL3 por secuenciacion SOLID o qRT-PCR (LU73, las figuras 4 y 7), se analizaron mediante citometrla de flujo para la determination de los niveles de expresion de la protelna para varios receptores Notch y otros miembros de la familia DLL. Generalmente, los datos de expresion de protelnas basados en citometrla de flujo se generaron usando un FACSCanto II (BD Biosciences) segun las instrucciones del fabricante. Los datos en la figura 9 muestran las celulas tumorales individuales que se muestran como graficos de histograma, en los que la tincion de fondo de anticuerpos de control de isotipo se muestra en gris en histogramas y la expresion de la protelna de interes, como se determina utilizando anticuerpos disponibles comercialmente, se muestra por la llnea negra gruesa.
[0525] Como puede verse graficamente en la Figura 9, poca o ninguna expresion de cualquiera de los receptores Notch (por ejemplo, NOTCH1-4) se observo en ninguno de estos tumores, como se determina en relation con la fluorescencia menos uno (FMO) de celulas tenidas con control de isotipo. Esto se indica graficamente por los histogramas, as! como numericamente en las intensidades de fluorescencia media (MFI) presentadas para cada medicion. Del mismo modo, dos canceres de pulmon derivados de celulas NTX no mostraron expresion de cualquiera de DLL1 o DLL4. La expresion leve de DLL4 solo (OV26) o DLL1 y DLL4 (KDY66) se pudo observar para dos de los tumores. En general, estas observaciones confirman los resultados obtenidos y presentados en los Ejemplos 1 y 2 anteriores, de que estos tipos de tumores muestran poca o ninguna expresion de componentes de la ruta de serialization Notch, en consonancia con la perdida de la serialization de Notch en NET o tumores pobremente diferenciados con fenotipos neuroendocrinos.
Ejemplo 6
Generacion de moduladores anti-DLL3
[0526] Los moduladores de DLL3 en forma de anticuerpos murinos se produjeron segun las ensenanzas en el presente documento a traves de la inoculation con DLL3-Fc recombinante humano o con DLL3-His humano (cada uno que comprende el ECD maduro de DLL3 expuesto en la figura 1C; SEQ ID NO: 3) en dos rondas de inmunizacion separadas. A este respecto, tres cepas de ratones (Balb/c, CD-1 y FVB) se inocularon con DLL3 recombinante humano para proporcionar hibridomas que secretaban moduladores de anticuerpo monoclonal murino de alta afinidad.
[0527] La construction de fusion hDLL3-Fc se obtuvo a partir Adipogen Internacional (Catalogo No. AG-40A-0113) donde habla sido purificado a partir del sobrenadante de celulas HEK 293 que sobreexpresaban DLL3-Fc, tal como se describe en la hoja de datos del producto del fabricante. La protelna recombinante hDLL3-His se purifico de los sobrenadantes de celulas CHO-K1 modificadas geneticamente para sobreexpresar hDLL3-His. 10 mg de inmunogeno hDLL3-Fc o hDLL3-His se emulsionaron con un volumen igual de TITERMAX® Gold (CytRx Corporation) o adyuvante de alumbre y se utilizaron para la inmunizacion de cada raton. Las emulsiones resultantes se inyectaron a continuation en tres ratones hembra (1 cada uno: Balblc, CD-1 y FVB) a traves de la almohadilla plantar.
[0528] Los ensayos de ELISA en fase solida se utilizaron para cribar los sueros de raton para detectar anticuerpos IgG de raton especlfico para DLL3 humano. Una senal positiva por encima del fondo era indicativo de anticuerpos especlficos para DLL3. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos (VWR International, Cat. # 610744) con DLL3-His recombinante a 0,5 mg/ml en tampon de recubrimiento ELISA durante la noche. Despues de lavar con PBS que contenla 0,02% (v/v) de Tween 20, los pocillos se bloquearon con 3% (p/v) de BSA en PBS, 200 mL/pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). El suero de raton se titulo (1:100, 1:200, 1:400, y 1:800) y se anadio a las placas recubiertas DLL3 a 50 mL/pocillo y se incubaron a TA durante 1 hora. Las placas se lavaron y despues se incubaron con 50 mL/pocillo de anticuerpos anti-IgG de raton producidos en cabra marcados con HRP diluidos 1:10000 en un 3% de BSA-PBS o 2% de FCS en PBS durante 1 hora a TA. De nuevo se lavaron las placas y se
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anadieron 40 mL/pocillo de una solucion de sustrato TMB (Thermo Scientific 34028) durante 15 minutos a TA. Despues de revelar, se anadio un volumen igual de H2SO4 2N para detener el revelado de sustrato y las placas se analizaron con espectrofotometro a DO 450.
[0529] Los ratones inmunizados sero-positivos fueron sacrificados y los ganglios linfaticos de drenaje (popliteales e inguinales, y illaca mediales si estan inflamados) se diseccionaron y se utilizaron como fuente de celulas productoras de anticuerpos. Una suspension de un unico tipo de celulas B (228,9 x 106 celulas) se fusiono con celulas de mieloma P3X63Ag8.653 no secretoras (ATCC # CRL-1580) en una proporcion de 1:1 por electrofusion. La electrofusion se realizo usando el sistema de BTX Hybrimmune™, (BTX Harvard Apparatus) segun las instrucciones del fabricante. Despues del procedimiento de fusion, las celulas se resuspendieron en medio de seleccion de hibridoma suplementado con azaserina (Sigma # A9666), medio DMEM alto en glucosa con piruvato de sodio (Cellgro cat # 15-017-CM) que contiene 15% de suero fetal Clone I (Hyclone), 10% de BM Condimed (Roche Applied Sciences), 4 mM de L-glutamina, 100 UI de penicilina-estreptomicina y 50 mM de 2-mercaptoetanol y despues se sembraron en tres matraces T225 en 90 ml de medio de seleccion por matraz. Los matraces se colocaron a continuacion en un incubador humidificado con 37°C que contiene 5% de CO2 y 95% de aire durante 6-7 dlas.
[0530] Despues de seis a siete dlas de crecimiento, la biblioteca que consta de las celulas cultivadas a granel en elos T225 se colocaron en placas a 1 celula por pocillo en placas de 96 pocillos Flacon de fondo en U utilizando el clasificador de celulas Aria I. Los hibridomas seleccionados se hicieron crecer en 200 mL de medio de cultivo que contiene 15% de suero fetal Clone I (Hyclone), 10% de BM-Condimed (Roche Applied Sciences), piruvato de sodio 1 mM, 4 mM de L-glutamina, 100 UI de penicilina-estreptamicina, 50 mM de 2-mercaptoetanol, y 100 mM de hipoxantina. Las posibles celulas de la biblioteca de hibridoma sin usar restantes se congelaron para futuras pruebas de la biblioteca. Despues de diez a once dlas de crecimiento, los sobrenadantes de cada pocillo de las celulas cultivadas en placas se analizaron para anticuerpos reactivos con DLL3 mediante ensayos ELISA y FACS.
[0531] Para el cribado por ELISA se rcubrieron placas de 96 pocillos con DLL3 humana desnaturalizada o lisados celulares de celulas 293 que sobreexpresan DLL3 humano (obtenido como se discute mas adelante), en tampon de carbonato de sodio durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron y se bloquearon con 3% de BSA en PBS/Tween durante una hora a 37°C y se usaron inmediatamente o se mantuvieron a 4°C. Los sobrenadantes de hibridoma no diluidos se incubaron en las placas durante una hora a TA. Las placas se lavaron y se sondaron con anticuerpo anti- IgG de raton producido en cabra marcado con HRP diluido con un factor de 1:10000 en 3% de BSA-PBS durante una hora a tA. Las placas se incubaron a continuacion con solucion de sustrato como se describe anteriormente y se leyo a DO 450. Los pocillos que contenlan inmunoglobulina que se unla preferiblemente a DLL3 humano, como se determina por una senal por encima del fondo, se transfirieron y se expandieron.
[0532] Los pocillos con hibridomas positivos del cltivo que secretaban inmunoglobulina murina tambien se cribaron para detectar la especificidad para DLL3 humana y la reactividad cruzada con DLL3 murina, de rata y cynomolgus utilizando un ensayo basado en citometria de flujo con celulas 293 modificadas geneticamente para que sobreexpresen protelnas DLL3 humanas (h293-hDLL3), cynomolgus (h293-cDLL3), rata (h293-rDLL3) o murino (h293-mDLL3). Las celulas h293-hDLL3 se crearon mediante la transduccion de celulas 293T utilizando un lentivirus generado a partir de un vector lentiviral bicistronico comercial (Open Biosystems) que expresa tanto hDLL3 como un marcador GFP. Las celulas h293-mDLL3 se crearon por transduccion de celulas 293T utilizando un vector lentiviral bicistronico que expresaba tanto mDLL3 como un marcador RFP, construido como se indica a continuacion. Un fragmento de ADN (figura 10A; SEQ ID NO: 5) que codifica la protelna DLL3 murina madura (figura 10B; SEQ ID NO: 6) se obtuvo mediante amplificacion por PCR a partir de una construccion de DLL3 murino comercial (Origene) y se subclono en direccion 3' con respecto a una secuencia de peptido senal de IgG K previamente modificada en direccion 5' respecto al sitio de clonacion multiple de Pcdh-EF1-MCS-IRES-RFP (Biosciences sistema) usando tecnicas de clonacion molecular convencionales. Del mismo modo, se crearon celulas h293-rDLL3 por transduccion de celulas 293T utilizando un vector lentiviral bicistronico que expresaba tanto DLL3 de rata como un marcador GFP, construido por clonacion de un fragmento de ADN sintetico (GENEWIZ) que comprende una secuencia de codones optimizados que codifica la protelna DLL3 madura de rata (acceso NP_446118.1, los residuos 25 a 589) en direccion 3' de una secuencia de peptido senal IgK previamente modificada en direccion 5' respecto al sitio de clonacion multiple de Pcdh-EF1-MCS-IRES-GFP (Sistema Biosciences) usando tecnicas de clonacion molecular convencionales. Finalmente, se dedujo la secuencia de DDL3 de cynomolgus (por ejemplo, Macaca fascicularis) (cDLL3) utilizando la secuencia DLL3 humano en BLAST frente a contigos aleatorios del genoma completo de Macaca fascicularis de acceso publico y ensamblando las secuencias exonicas del gen cinomologo con la suposicion de que la estructura exoncia se mantiene en el gen entre especies. Se utilizaron la amplificacion por PCR y la secuenciacion directa de los exones individualkes 2-7 del ADN genomico cinomologo (Zyagen) para confirmar que la secuencia deducida era correcta en toda la region ECD de la protelna. La secuencia de ADN de cDLL3 (Figura 10C; SEQ ID NO: 7.), que codifica la protelna cDLL3 (Fig.10D; SEQ ID NO: 8.), se fabrico sinteticamente (GENEWIZ) y se subclono en direccion 3' con respecto a una secuencia de peptido senal de IgG K modificada previamente en direccion 5' respecto al sitio de clonacion multiple de Pcdh-EF1-MCS-IRES-GFP (Sistema Biosciences) usando tecnicas de clonacion molecular convencionales. La transduccion de celulas 293T con este vector produjo las celulas h293-cDLL3.
[0533] Para los ensayos de citometria de flujo, se incubaron 50x104 celulas h293 transducidas, respectivamente, con
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DLL3 humano, cynomolgus, de rata o murino durante 30 minutos con 25-100 ml de sobrenadante de hibridomas. Las celulas se lavaron con PBS, FCS al 2%, dos veces y luego se incubaron con 50 mL de un fragmento Fc de anticuerpo anti-IgG de raton producido en cabra especlfico secundario conjugado a DyLight 649 diluido 1:200 en PBS/2% de FCS. Despues de incubar 15 minutos, las celulas se lavaron dos veces con PBS/2% de FCS y se resuspendieron en PBS/2% de FCS con DAPI y se analizaron por citometrla de flujo utilizando un FACSCanto II segun las instrucciones del fabricante. Los pocillos que contenlan inmunoglobulina que se unla preferiblemente a las celulas DLL3+ GFP+ se transfirieron y se expandieron. Los hibridomas clonales especlficos de hDLL3 resultantes fueron crioconservados en medio de congelacion CS-10 (Biolife Solutions) y se almacenaron en nitrogeno llquido. Los anticuerpos que se unen a celulas h293-hDLL3, h293-cDLL3, h293-rDLL3 y/o h293-mDLL3 se consideraron anticuerpos de reaccion cruzada (vease la Figura 12). Sobre la base de este ensayo, todos los moduladores seleccionados que tenlan reaccion cruzada con el antlgeno murino tambien presentaron reactividad cruzada con el antlgeno de rata.
[0534] Los analisis de ELISA y citometrla de flujo confirmaron que el anticuerpo purificado a partir de la mayorla o todos estos hibridomas se unla a DLL3 de una manera dependiente de la concentracion. Se realizo una fusion de cada campana de inmunizacion y se sembro en 64 placas (6144 pocillos con una eficacia de clonacion de aproximadamente el 60 - 70%). La campana de inmunizacion y el cribado de hDLL3-Fc produjeron aproximadamente 90 anticuerpos murinos especlficos para DLL3 humana, varios de los cuales eran de reactividad cruzada con DLL3 murino. La campana de inmunizacion de hDLL3-His produjo 50 anticuerpos murinos adicionales especlficos para DLL3 humano, un numero de los cuales presentaron reactivida cruzada con DLL3 murino.
Ejemplo 7
Secuenciacion de moduladores de DLL3 murinos
[0535] Sobre la base de lo anterior, se seleccionaron una serie de anticuerpos monoclonales distintos de ejemplo que se unen a DLL3 humano o celulas h293-hDLL3 inmovilizadas con alta afinidad aparentemente para la secuenciacion y el analisis adicional. Como se muestra de una forma tabular en las Figuras 11A y 11B, el analisis de secuencia de las regiones variables de cadena ligera (Figura 11A) y regiones variables de cadena pesada (Figura 11B) de anticuerpos monoclonales seleccionados generados en Ejemplo 6 confirmo que muchas tenlan nuevas regiones determinantes de la complementariedad y habitualmente presentaban disposiciones VDJ novedosas. Cabe indicar que la regiones determinantes de complementariedad establecidas en las figuras 11A y 11B se definen como en Chothia et al., Supra.
[0536] Como un primer paso en la secuenciacion de moduladores de ejemplo, las celulas de hibridoma seleccionadas se lisaron en reactivo Trizol® (Sistema de Purification de Trizol Plus ARN, Life Technologies) para preparar el ARN. A este respecto, entre 104 y 105 celulas se resuspendieron en 1 ml de Trizol y se agito vigorosamente despues de la adicion de 200 mL de cloroformo. Las muestras se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos y la fase acuosa se transfirio a un tubo de microcentrlfuga fresco donde se anadio un volumen igual de isopropanol. Los tubos se agitaron de nuevo vigorosamente y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de centrifugarse a 4°C durante 10 minutos. Los sedimentos de ARN resultantes se lavaron una vez con 1 ml de etanol al 70% y se secaron brevemente a TA antes de ser resuspendidos en 40 mL de agua tratada con DEPC. La calidad de las preparaciones de ARN se determino por fraccionamiento de 3 mL en un gel de agarosa al 1% antes de ser almacenado a - 80°C hasta su uso.
[0537] La region variable de la cadena pesada de Ig de cada hibridoma se amplifico usando una mezcla de cebadores 5' que comprendla treinta y dos cebadores de secuencia llder especlficos de raton, disenados para atacar el repetorio VH completo de ratono, en combination con un cebador Cg 3' de raton especlfico para todos los isotipos de Ig de raton. Se secuencio un fragmento PCR de 400 pb de la VH desde ambos extremos utilizando los mismos cebadores de PCR. Del mismo modo, se utilizo una mezcla de treinta y dos cebadores de secuencia llder de Vk 5' disenados para amplificar cada una de las familias Vk de raton combinados con un unico cebador inverso especlfico para la region constante kappa de raton para amplificar y secuenciar la cadena ligera kappa. Los transcritos de VH y VL se amplificaron a partir de 100 ng de ARN total usando la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
[0538] Se realizaron un total de ocho reacciones de RT-PCR se realizaron para cada hibridoma: cuatro para la cadena ligera Vk y cuatro para la cadena pesada Vg (g1). El kit de RT-PCR One Step se utilizo para la amplification (Qiagen). Este kit proporciona una mezcla de transcriptasas inversas Sensiscript y Omniscript, ADN polimerasa HotStarTaq, mezcla de dNTP, tampon y Q-Solution, un nuevo aditivo que permite la amplificacion eficiente de plantillas "diflciles"(por ejemplo, ricos en GC). Se prepararon mezclas de reaccion que inclulan 3 mL de ARN, 0,5 de 100 mM de cualquiera de los cebadores de la cadena pesada o ligera kappa (sintetizados a medida por IDT), 5 ml de tampon 5X RT-PCR, 1 mL dNTPs, 1 mL de mezcla de enzimas que contienen la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa, y 0,4 mL de inhibidor de ribonucleasa RNasin (1 unidad). La mezcla de reaccion contiene todos los reactivos necesarios tanto para la transcription inversa como para PCR. El programa de ciclador termico se fijo para una etapa de TA a 50°C durante 30 minutos, 95°C durante 15 minutos, seguido de 30 ciclos de PCR (95°C durante
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30 segundos, 49°C durante 30 segundos, 72°C durante un minuto). Hubo despues una incubacion final a 72°C durante 10 minutos.
[0539] Para preparar los productos de la PCR para la secuenciacion directa de ADN, se purificaron utilizando el kit de purificacion de PCR QIAquick™ (Qiagen) segun el protocolo del fabricante. El ADN se eluyo de la columna de centrifugacion usando 50 mL de esteril agua y a continuacion se secuencio directamente a partir de ambas cadenas. Los productos de PCR extraldos se secuenciaron directamente utilizando cebadores de la region V especlfica. Las secuencias de nucleotidos se analizaron usando IMGT para identificar los miembros de genes V, D y J de la llnea germinal con la mas alta homologla de secuencia. Las secuencias derivadas se compararon con secuencias de ADN de la llnea germinal conocida de las regiones V y J de Ig utilizando V-BASE2 (Retter et al., supra) y por alineacion de genes de VH y VL respecto a la base de datos de la llnea germinal del raton para proporcionar las secuencias indicadas establecidos en las Figuras 11A y 11B.
[0540] Mas especlficamente, la Figura 11A muestra las secuencias contiguas de aminoacidos de noventa y dos
nuevas regiones variables de cadena ligera murinas de anticuerpos anti-DLL3 (SEQ ID NOS: 20 - 202, incluso numeros) y cinco regiones variables de cadena ligera humanizadas (SEQ ID NOS: 204 - 212, numeros pares) derivadas de cadenas ligeras murinas representativas. Del mismo modo, la Figura 11B muestra las secuencias de aminoacidos contiguos de noventa y dos nuevas regiones variables de cadena pesada murinas (SEQ ID NOS: 21 - 203, numeros impares) de los mismos anticuerpos anti-DLL3 y cinco regiones variables de cadena pesada variable humanizadas (sEq ID NOS: 205 - 213, numeros impares) de los mismos anticuerpos murinos que proporcionan las cadenas ligeras humanizadas. Por lo tanto, en su conjunto, las figuras 11A y 11B proporcionan las secuencias anotadas de noventa y dos anticuerpos murinos anti-DLL3 oprables (denominados SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16 0.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31 , SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41,
SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16 0.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61,
SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16,67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79 , SC16.80, SC16.81,
SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16
0.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16,121, SC16.122, SC16.123, SC16.124 , SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136. SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 y SC16.150) y cinco anticuerpos humanizados (denominados hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 y hSC16.56). Cabe destacar que estas mismas designaciones se pueden referir al clon que produce el anticuerpo en cuestion y, como tal, el uso de cualquier denomination particular se debe interpretar en el contexto de la description relacionada.
[0541] Para los fines de la presente solicitud, las SEQ ID NOS de cada anticuerpo particular son secuenciales. De este modo, mAb SC16.3 comprende las SEQ ID NOS: 20 y 21 para la regiones variables de cadena ligera y pesada, respectivamente. A este respecto, SC16.4 comprende las SeQ ID NOS: 22 y 23, SC16.5 comprende las SEQ ID NOS: 24 y 25, y as! sucesivamente. Por otra parte, en el listado de secuencias que se presenta con el presente documento se adjuntan las secuencias de acido nucleico correspondientes para cada secuencia de aminoacidos de un anticuerpo de las figuras 11A y 11B. En el listado de secuencias en cuestion, las secuencias de acido nucleico incluidas comprenden SEQ ID NOS que son doscientas veces mayor que la correspondiente secuencia de aminoacidos (cadena ligera o pesada). Por lo tanto, las secuencias de acido nucleico que codifican las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de cadena ligera y pesada de mAb SC16.3 (es decir, SEQ ID NOS: 20 y 21) comprenden SEQ ID NOS: 220 y 221 en el listado de secuencias. A este respecto las secuencias de acidos nucleicos que codifican la totalidad de las secuencias de las regiones variables de cadena ligera y pesada descritss, incluyendo las que codifican las construcciones humanizadas, se numeran de manera similar y comprenden las SEQ ID NOS: 220-413.
Ejemplo 8
Humanizacion de moduladores de DLL3
[0542] Como se menciono anteriormente, cinco de los anticuerpos murinos del Ejemplo 7 fueron humanizados usando injertos de region determinante de complementariedad (CDR). Se seleccionaron estructuras humanas para cadenas pesadas y ligeras basandose en la similitud de secuencia y estructura con respecto a los genes de la llnea germinal humana funcional. En este sentido, la similitud estructural se evaluo mediante la comparacion de la estructura de CDR canonica de raton con candidatos humanos con las mismas estructuras canonicas, tal como se describe en Chothia et al. (supra).
[0543] Mas particularmente se humanizaron anticuerpos murinos SC16.13, SC16.15, SC16.25, SC16.34 y SC16.56 usando un procedimiento asistido por ordenador de injerto de CDR (Base de datos Abysis, UCL Business Plc.) y tecnicas de ingenierla molecular estandar para proporcionar los moduladores hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 y hSC16.56. Se seleccionaron las regiones de estructura humanas de las regiones variables en base a su secuencia de homologla mas alta con respecto a la secuencia de estructura de raton en cuestion y su estructura canonica. Para los fines del analisis humanizacion, la asignacion de aminoacidos a cada uno de los dominios de
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CDR se ajusta a la numeracion de Kabat et al. (supra).
[0544] Los procedimientos de ingenierla molecular se llevaron a cabo usando tecnicas reconocidas en el sector. A tal fin, se extrajo ARNm total de los hibridomas y se amplifico como se expone en el Ejemplo 7 inmediatamente antes.
[0545] A partir de la informacion de la secuencia de nucleotidos, se obtuvieron los datos con respecto a los segmentos de los genes V, D y J de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos en cuestion. Basandose en los datos de las secuencias, se designaron nuevos conjuntos de cebadores especlficos para la secuencia llder de la cadena ligera de Ig Vk y Vh de los anticuerpos para la clonacion del anticuerpo monoclonal recombinante. Posteriormente, las secuencias V-(D)-J se alinearon con secuencias de la llnea germinal de Ig de raton. Las disposiciones geneticas resultantes para cada uno de los cinco constructos humanizados se muestran en la Tabla 1 inmediatamente a continuacion.
TABLA 1
mAb
VH humana DH humana JH humana Cambios en FW VK humana JK humana Cambios en FW
hSC16.13
IGHV2-5 IGHD1-1 JH6 Ninguno IGKV-O2 JK1 Ninguno
hSC16.15
VH1-46 IGHD2-2 JH4 Ninguno IGKV-L4 JK4 87F
hSC16.25
IGHV2-5 IGHD3-16 JH6 Ninguno IGVK-A10 JK2 Ninguno
hSC16.34
IGHV1-3 IGHD3-22 JH4 Ninguno IGVK-A20 JK1 87F
hSC16.56
IGHV1-18 IGHD2-21 JH4 Ninguno IGKV-L2 JK2 Ninguno
[0546] Las secuencias representadas en la Tabla 1 corresponden a las secuencias de cadena pesada y ligera indicadas establecidas en las Figuras 11A y 11B para los clones en cuestion. Mas especlficamente, las entradas en la Tabla 1 anterior corresponden a las secuencias de la regiones variables contiguas establecidas en SEQ ID NOS: 204 y 205 (hSC16.13), SEQ ID NOS: 206 y 207 (hSC16.15), SEQ ID NOS: 208 y 209 (hSC16.25), SEQ ID NOS: 210 y 211 (hSC16.34) y SEQ ID NOS: 212 y 213 (hSC16.56). Ademas, la tabla 1 muestra que eran necesarios muy pocos cambios en la estructura para mantener las propiedades favorables de los moduladores de union. A este respecto no hubo cambios en la estructura ni retromutaciones en las regiones variables de cadena pesada y solo se realizaron dos modificaciones en la estructura en las regiones variables de cadena ligera (es decir, 87F en hSC16.15 y hSC16.34).
[0547] Despues de la humanizacion de todos los anticuerpos seleccionados mediante la insertion de injertos de CDR, se analizaron las secuencias de aminoacidos de region variable de cadena ligera y pesada resultantes para determinar su homologla con respecto a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada aceptoras humanas y donantes murinas. Los resultados mostrados en la Tabla 2 inmediatamente a continuacion, revelan que las construcciones humanizadas exhiben consistentemente una homologla mas alta con respecto a las secuencias aceptoras humanas que con respecto a las secuencias donantes murinas. Mas particularmente, las regiones variables de cadena pesada y ligera murinas muestran un porcentaje global similar de homologla al caso mas semejante de los genes de la llnea germinal humana (85%-93%) en comparacion con la homologla de los anticuerpos humanizados y las secuencias de protelnas de los hibridomas donantes (74%-83%).
TABLA 2
mAb
Homologla con respecto al humano (CDR receptor) Homologla con respecto al original murino (CDR donante)
hSC16.13 HC
93% 81%
hSC16.13 LC
87% 77%
hSC16.15HC
85% 83%
hSC16.15 LC
85% 83%
hSC16.25 HC
91% 83%
hSC16.25 LC
85% 79%
hSC16.34 HC
87% 79%
hSC16.34 LC
85% 81%
hSC16.56 HC
87% 74%
hSC16.56 LC
87% 76%
[0548] Tras las pruebas, y como se discute con mas detalle a continuacion, cada una de las construcciones humanizadas exhibieron caracterlsticas de union mas favorables o menos comparables con las que mostraban los anticuerpos originales murinos.
[0549] Ya sean humanizados o murinos, una vez que se determinan las secuencias de acidos nucleicos de las regiones variables, los anticuerpos de la presente description pueden expresarse y aislarse usando tecnicas
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reconocidas en el sector. A tal fin, se clonaron fragmentos de ADN sinteticos de la region variable de cadena pesada seleccionada (humanizada o murina) en un vector de expresion IgG1 humana. Del mismo modo, el fragmento de ADN de la region variable de cadena ligera (de nuevo humanizada o murina) se clono en un vector de expresion de cadena ligera humana. El anticuerpo seleccionado se expresa entonces por co-transfeccion de las construcciones de acido nucleico de las cadenas pesada y ligera derivadas en celulas CHO.
[0550] Mas particularmente, un procedimiento compatible de production de anticuerpos comprendio la donation direccional de genes de las regiones variables murinas o humanizadas (amplificados por PCR) en vectores de expresion de inmunoglobulina humana seleccionados. Todos los cebadores usados en PCR especlfica para genes de Ig inclulan sitios de restriction que permitlan la clonacion directa en vectores de expresion que contenlan regiones constantes de la cadena pesada y ligera de IgG1 humana. En resumen, los productos de PCR se purificaron con el kit de purification para PCR Qiaquick (Qiagen) seguido de la digestion con Agel y Xhol (para la cadena pesada) y Xmal y Dralll (para la cadena ligera), respectivamente. Los productos de PCR digeridos fueron purificados antes de la ligacion en vectores de expresion. Las reacciones de ligacion se realizaron en un volumen total de 10 mL con 200 U de ADN ligasa T4 (New England Biolabs), 7,5 mL de producto de PCR especlfico de gen digerido y purificado y 25 ng deADn vectorial linealizado. Se transformaron bacterias de E. coli DH10B competentes (Life Technologies) por medio de choque termico a 42°C con 3 mL de producto de ligacion y se sembraron en placas de ampicilina (100 mg/ml). El fragmento Agel-EcoRI de la region Vh se inserto a continuation en los mismos sitios del vector de expresion pEE6.4HuIgG1, mientras que el inserto de VK Xmal-Dralll sintetico se clono en los sitios Xmal- Dralll del vector de expresion pEE12.4Hu-Kappa respectivo.
[0551] Las celulas que producen el anticuerpo seleccionado se generaron mediante transfection de celulas 293 HEK con los plasmidos apropiados utilizando 293fectina. A este respecto, se purifico el ADN plasmldico con columnas de centrifugation QIAprep (Qiagen). Se cultivaron celulas renales embrionarias humanas (HEK) 293T (ATCC No CRL- 11268) en placas de 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) en condiciones estandar en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% FCS desactivado con calor, 100 mg/ml estreptomicina, 100 U/ml de penicilina G (todos de Life Technologies).
[0552] Para las transfecciones transitorias, se cultivaron las celulas a 80% de confluencia. Se anadieron cantidades euivalentes de IgH y de ADN vectorial de una cadena de IgL correspondiente (12,5 mg de cada uno) a 1,5 ml de Opti-MEM mezclados con 50 mL de reactivo de transfeccion de HEK 293 en 1,5 ml de Opti-MEM. La mezcla se incubo durante 30 min a temperatura ambiente y se distribuyo uniformemente en la placa de cultivo. Los sobrenadantes se recogieron tres dlas despues de la transfeccion, se reemplazaron por 20 ml de DMEM fresco suplementado con 10% FBS y se recogieron de nuevo en el dla 6 despues de la transfeccion. Los sobrenadantes de cultivo se limpiaron de restos de celulas por centrifugacion a 800 xg durante 10 min y se almacenaron a 4°C. Los anticuerpos quimericos y humanizados recombinantes se purificaron con microesferas de protelna G (GE Healthcare) y se almacenaron en condiciones apropiadas.
Ejemplo 9
Caracterfsticas de los moduladores de DLL3
[0553] Se utilizaron varios procedimientos para analizar las caracterfsticas inmunoqulmicas y de union de moduladores de DLL3 seleccionados generados como se ha expuesto anteriormente. Especlficamente, se caracterizo un numero de moduladores de anticuerpo segun la afinidad, la cinetica, la agrupacion, el lugar de union y reactividad cruzada con respecto al reconocimiento de antlgenos humanos, de cynomolgus, de rata y de raton (es decir, usando las celulas y los constructos del Ejemplo 6) mediante procedimientos reconocidos en la tecnica, incluyendo citometrla de flujo. Las afinidades y constantes cineticas kon y koff de los moduladores seleccionados fueron medidos usando analisis de interferometrla de biocapa en un ForteBio RED (ForteBio, Inc.) o resonancia de plasmon superficial usando un Biacore 2000, cada uno segun las instrucciones del fabricante.
[0554] Los resultados de la caracterizacion se exponen en forma de tabla en la Figura 12 en la que puede verse que los moduladores seleccionados generalmente exhiben afinidades relativamente altas en el rango nanomolar y, en muchos ejemplos, presentan reaction cruzada. La Figura 12 ademas enumera el grupo del modulador determinada emplricamente, as! como el dominio DLL3 al que se une el modulador en cuestion, tal como se determina usando la expresion fragmento de antlgeno mediada por levadura, tal como se describe en mas detalle en el Ejemplo 10 inmediatamente a continuacion. Ademas, la Fig. 12 incluye, ademas, la capacidad de los moduladores de mediar la muerte celular inducida citotoxicamente de una llnea de tumor de rinon NTX (% celulas vivas), determinado como se indica en el Ejemplo 12 a continuacion. Tomados en conjunto, estos datos demuestran las propiedades de union variadas de los moduladores descritos, as! como su potencial para su uso en un entorno farmaceutico.
[0555] En cuanto a la agrupacion de anticuerpos, se utilizo ForteBio RED segun las instrucciones del fabricante para identificar los anticuerpos competitivos que se unlan a los mismos o diferentes grupos. Brevemente, un anticuerpo de referencia (Ab1) fue capturado en un chip de captura de anticuerpos anti-raton, a continuacion, se utilizo una elevada concentration de anticuerpo no enlazante para bloquear el chip y se recogio una llnea de
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base. Posteriormente, la DLL3-Flag humana recombinante monomerica (Adipogen International) fue capturada por el anticuerpo especifico (Ab1) y la punta se sumergio en un pocillo con el mismo anticuerpo (Ab1) como control o en un pozo con un anticuerpo de prueba diferente (Ab2). Cuando se observo union adicional con un nuevo anticuerpo, a continuacion, se determino que Ab1 y Ab2 estaban en grupos diferentes. Si no se producia ninguna union adicional, tal como se determina mediante la comparacion de niveles de union con el control de Ab1, entonces se determino que Ab2 era del mismo grupo. Como es conocido en la tecnica, este proceso se puede ampliar para cribar grandes bibliotecas de anticuerpos unicos usando una fila completa de anticuerpos que representan grupos unicos en una placa de 96 pocillos. En el presente caso, este proceso agrupamiento mostro los anticuerpos seleccionados se unian a al menos nueve grupos diferentes (designados como grupos A-I en la Figura 12) en la proteina DLL3. Basandose en el tamano aparente del antigeno DLL3 (donde la ECD es de aproximadamente 56kD) y la resolucion de la metodologia de agrupacion empleada, se cree que los nueve grupos identificados representan la mayoria de los grupos presentes en el antigeno extracelular DLL3.
[0556] Ademas de evaluar los moduladores de ejemplo tal como se expuso anteriormente, se realizo una citometria de flujo con el fin de confirmar que los moduladores de tipo anticuerpo SC16 seleccionados se pueden asociar inmunoespecificamente con DLL3 humano y para determinar si los mismos moduladores presentan reaccion cruzada con DLL3 de cynomolgus, rata y/o murino. Mas particularmente, los moduladores murinos de ejemplo se analizaron por citometria de flujo utilizando un FACSCanto II y celulas 293 que sobreexpresan DLL3 murina, de rata, de mono cynomolgus o humano (es decir, h293-hDLL3, h293-cDLL3, h293-rDLL3 y h293-mDLL3 que expresaban GFP) sustancialmente como se descrito en el Ejemplo 6 anterior. En algunos ejemplos, los moduladores murinos de ejemplo se analizaron por citometria de flujo utilizando un FACSCanto II y las celulas de levadura se presentan DLL3 de cynomolgus usando los procedimientos descritos por Cochran et al. (Procedimientos J Immunol 287 (1-2): 147158. (2004).
[0557] Basandose en la citometria de flujo, se comprobo que todos los moduladores de anticuerpo seleccionados se unian a DLL3 humana sobre-expresada en celulas 293 (datos no mostrados), mientras que se comprobo que varios de los anticuerpos ensayados presentaban reaccion cruzada con DLL3 de cynomolgus y/o murino (todos los anticuerpos que reaccionan con el raton tambien reaccionan con la de rata). En este sentido, y como se indica en la Figura 12, se encontro que ocho de los trece moduladores que inmunoespecificamente reaccionan con DLL3 humana tambien reaccionan con DLL3 murino (o de rata). Se descubrio que especificamente mAbs SC16.4, SC16.8, SC16.15, SC16.34, SC16.39, SC16.46, SC16.51 y SC16.56 presentaban reactividad cruzada con DLL3 murino en un grado mayor o menor, mientras que los mAbs SC16.7, SC16.10, SC16.13, SC16.25 y SC16.65 no se asociaban apreciablemente con DLL3 murino. Tales resultados no son inesperados dado que DLL3 murino tiene aproximadamente 83% de homologia con la isoforma 2 de DLL3 humano (ver Figura 2B). Se entendera que esta reactividad cruzada puede ser explotada ventajosamente en el contexto de la presente invencion a traves del uso de modelos animales en el descubrimiento y desarrollo de farmacos.
[0558] Ademas de los ensayos mencionados anteriormente, se analizaron las construcciones humanizadas hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 y hSC16.56 del Ejemplo 8 para determinar si el proceso de injerto de CDR habia alterado de forma apreciable sus caracteristicas de union. A este respecto los constructos humanizados (con CDR injertadas) se compararon con anticuerpos quimericos "tradicionales" que comprendian los dominios variables de cadena pesada y ligera originales murinos (o donantes) y una region constante humana sustancialmente equivalentes a la utilizada en las construcciones humanizadas. Con estas construcciones se llevo a cabo resonancia de plasmon superficial (SPR) usando un Biacore 2000 (GE Healthcare) para identificar cualquier cambio sutil en las constantes de velocidad provocado por el proceso de humanizacion.
[0559] Los resultados de ejemplo para uno de los moduladores ensayados (SC16.15) y un resumen tabular de los resultados para cada uno de los constructos humanizados y quimericos se muestran en las Figuras 13A- 13C. Basandose en una serie de concentraciones entre 25 y 12,5 nM de antigeno DLL3 humano (generando las curvas de arriba a abajo en las figuras 13A y 13B para SC16.15) y usando un modelo de union de Langmuir 1:1, la Kd del anticuerpo SC16.15 de union a antigeno DLL3 humano se estimo en 0,2 nM. Posteriormente, se realizaron experimentos similares con las otras construcciones humanizadas y construcciones quimericas (datos no mostrados) para proporcionar los valores de afinidad establecidos en la Figura 13C. Tales resultados indican que el proceso de humanizacion no habia afectado sustancialmente a la afinidad de los moduladores.
Ejemplo 10
Mapeo de dominios y epftopos de moduladores de DLL3
[0560] Con el fin de caracterizar y posicionar los epitopos con los que se asocian o unen los moduladores de anticuerpo de DLL3 descritos, se realizo un mapeo de epitopos a nivel de dominio utilizando una modificacion del protocolo descrito por Cochran et al., 2004 (supra). Brevemente, los dominios individuales de DLL3 que comprenden secuencias de aminoacidos especificas se expresaron en la superficie de la levadura, y se determino la union de cada anticuerpo DLL3 a traves de citometria de flujo.
[0561] Mas especificamente, se crearon construcciones de plasmidos de presentacion en levadura para la expresion
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de las siguientes construcciones: dominio extracelular de DLL3 (aminoacidos 27 a 466); quimera DLL1-DLL3 que consiste en la region amino terminal y dominio DSL de DLL1 (aminoacidos 22-225) fusionado con los dominios 1-6 similares a EGF de DLL3 (aminoacidos 220-466); quimera DLL3-DLL1, que consiste en la region amino terminal y dominio DSL de DLL3 (aminoacidos 27-214) fusionado dominios 1-8 similares a EGF de DLL1 (aminoacidos 222518); dominio # 1 similar a EGF (aminoacidos 215 a 249); dominio # 2 similar a EGF (aminoacidos 274310); dominios #1 y # 2 similar a EGF (aminoacidos 215-310); dominio # 3 similar a EGF (aminoacidos 312351); dominio # 4 similar a EGF (aminoacidos 353-389); dominio # 5 similar a EGF (aminoacidos 391-427); y dominio # 6 similar a EGF (aminoacidos 429-465). (Para la informacion de dominio vease en general la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot en la entrada Q9NYJ7. Cabe indicar que la numeracion de los aminoacidos es por referencia a una protelna DLL3 sin procesar con una secuencia llder tal como se expone en SEQ ID NO. 3) Para el analisis de la region N-terminal o los dominios de EGF en conjunto, se utilizaron quimeras con el miembro de la familia DLL1 (DLL1-DLL3 y DLL3-DLL1) en lugar de fragmentos para minimizar los problemas potenciales con el plegamiento de protelnas. Los anticuerpos con dominios mapeados previamente se habla demostrado que no reaccionaban de forma cruzada con DLL1, lo que indica que cualquier union de estas construcciones se estaba produciendo a traves de la asociacion con la porcion DLL3 de la construccion. Estos plasmidos se transformaron en levadura, que despues se cultivo y se indujo como se describe en Cochran et al.
[0562] Para la prueba de union a una construccion particular, 200.000 celulas de levadura inducidas que expresan la construccion deseada se lavaron dos veces en PBS + 1 mg/ml de BSA (PBSA), y se incubaron en 50 pL de PBSA con 0,1 pg/ml de clon anti-HA 3F10 biotinilado (Roche Diagnostics) y, o bien anticuerpo purificado 50 nM o sobrenadante no purificado diluido con un factor de 1:2 procedente de hibridomas cultivados durante 7 dlas. Las celulas se incubaron durante 90 minutos en hielo, seguido de 2 lavados en PBSA. Las celulas fueron incubadas en 50 pL de PBSA con los anticuerpos secundarios apropiados: para anticuerpos murinos, se anadieron estreptavidina conjugada con Alexa 488, y un anticuerpo anti-raton producido en cabra conjugado con Alexa 647 (ambos de Life Technologies) con una concentracion de 1 mg/ml cada uno, y para los anticuerpos humanizaos o quimericos, se anadieron estreptavidina conjugada con Alexa 647 (Life Technologies) y un anticuerpo anti-humano producido en cabra conjugado con R-ficoeritrina (Jackson Immunoresearch) con una concentracion de 1 mg/ml cada uno. Despues de una incubacion de veinte minutos en hielo, las celulas se lavaron dos veces con PBSA y se analizaron en un FACS Canto II. Los anticuerpos que se unen a la quimera DLL3-DLL1 se designaron como de union a la region N- terminal + DSL. Los anticuerpos que se unen especlficamente a un epltopo presente en un determinado dominio de tipo EGF se designaron enlazantes a su respectivo dominio (Figura 14A).
[0563] Con el fin de clasificar un epltopo como conformacional (por ejemplo, discontinuo) o lineal, se trato con calor una levadura que mostraba el dominio extracelular de DLL3 durante 30 minutos a 80°C, despues se lavo dos veces con PBSA helada. Las levaduras que presentaban antlgeno desnaturalizado (levadura desnaturalizada) se sometieron entonces al mismo protocolo de tincion y analisis de citometrla de flujo, tal como se describe anteriormente. Los anticuerpos que se unen tanto a la levadura desnaturalizada como a la nativa se clasificaron como de union a un epltopo lineal, mientras que los anticuerpos que se unlan a levadura nativa pero no a la levadura desnaturalizado fueron clasificados como conformacionalmente especlficos.
[0564] Un resumen esquematico de los datos de mapeo de epltopos de nivel de dominio de los anticuerpos ensayados se presenta en la Figura 14A, con anticuerpos de union a un epltopo lineal subrayados y, cuando se determine, el grupo correspondiente se indica en parentesis. Una revision de la Figura 14A muestra que la mayorla de los moduladores tienden a mapearse con epltopos que se encuentran en la region N-terminal/DSL de DLL3 o con el segundo dominio de tipo EGF. Como se ha aludido previamente, la Figura 12 presenta datos similares con respecto a la determinacion del grupo y el mapeo de dominio para un numero de moduladores seleccionados en una forma tabular.
[0565] Para documentar la capacidad de los moduladores descritos para eliminar eficazmente las celulas tumorigenicas a pesar de unirse a diferentes regiones de DLL3, se correlacionaron los datos sobre la eliminacion con la union a dominio. Mas particularmente, la figura 14B muestra la eliminacion in vitro mediada por los moduladores de la llnea de PDX KDY66 (derivada como se expone en el Ejemplo 12 mas adelante) representada frente al dominio de union del modulador seleccionado. Estos datos muestran que la eliminacion debida a los moduladores especlficos para un dominio es algo variable, tal como se mide usando este ensayo de eliminacion in vitro. Sin embargo, para moduladores que son eficaces, aparece una tendencia interesante en la que la eliminacion maxima en cada dominio aumenta a medida que el epltopo se mueve hacia el extremo N-terminal en la secuencia primaria. En particular, la maxima eficiencia de eliminacion mejora de EGF6 a EGF2, y se estabiliza en todo el dominio N-terminal, EGF1, y EGF2. Ademas, entre los anticuerpos probados en este ensayo, el porcentaje mas alto de anticuerpos eficaces se unen al dominio N-terminal. Esto sugiere que los moduladores que se asocian o se unen con el dominio DSL o region N-terminal de DLL3 pueden demostrar ser particularmente eficaces como farmacos o como restos de direccionamiento para los agentes citotoxicos.
[0566] Ademas se realizo un mapeo detallado de los epltopos en anticuerpos seleccionados utilizando uno de dos procedimientos. El primer procedimiento emplea el kit de coleccion de peptidos de presentacion en fagos Ph.D.-12 (New England Biolabs E8110S) que se uso segun las instrucciones del fabricante. Brevemente, el anticuerpo para el
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mapeo de epltopos se recubrio durante la noche a 50 mg/ml en 3 ml de solucion de bicarbonato sodico 0,1 M, pH 8, en un tubo Nunc MaxiSorp (Nunc). El tubo se bloqueo con solucion de BSA al 3% en solucion de bicarbonato. A continuacion, se permitio que se unieran 1011 fagos de entrada en PBS + 0,1% de Tween-20, seguido de diez lavados consecutivos en 0,1% de Tween-20 para eliminar los fagos no unidos. Los fagos restantes se eluyeron con 1 ml de glicina 0,2 M durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitacion suave, seguido de neutralizacion con 150 mL de Tris-HCl 1 M pH 9. Los fagos eluidos se amplificaron y se mezclaron de nuevo con 1011 fagos de entrada, usando 0,5 % de Tween-20 durante los pasos de lavado para aumentar la rigurosidad de seleccion. Se aislo el ADN a partir de 24 placas de fagos eluidos de la segunda ronda utilizando el kit de centrifugacion Qiaprep M13 (Qiagen) y se secuencio. La union del fago clonal se confirmo usando un ensayo ELISA, en el que el anticuerpo asignado o un anticuerpo de control se aplicaron sobre una placa de ELISA, se bloqueo y se expuso a cada fago clonico. La union del fago se detecto utilizando anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rabano picante (GE Healthcare), y la solucion Turbo TMB ELISA 1-Step (Pierce). Las secuencias de peptidos de fagos correspondientes a fagos que se unen especlficamente fueron alineadas utilizando Vector NTI (Life Technologies) contra la secuencia del peptido del ECD del antlgeno para determinar el epltopo de union.
[0567] Alternativamente, se utilizo un procedimiento de presentacion en levadura (Chao et al, Nat Protoc 1 (2): 755768, 2007) para mapear epltopos de anticuerpos seleccionados. En resumen, se generaron bibliotecas de mutantes de ECD de DLL3 con PCR propensa a error usando analogos de nucleotidos 8-oxo-2'-desoxiguanosine-5'-trifosfato y 2'-desoxi-p-nucleosido-5' trifosfato (ambos de TriLink Bio) para una tasa de mutagenesis deseada de una mutacion de aminoacido por clon. Estos se transformaron en un formato de presentacion en levaduras. Usando la tecnica descrita anteriormente para el mapeo a nivel de dominios, la biblioteca se tino con el fin de determinar la union del anticuerpo y HA en una concentracion de 50 mM. Utilizando un FACS Aria (BD), se seleccionaron los clones que mostraron una perdida de union en comparacion con el ECD de DLL3 natural. Estos clones se volvieron a cultivar y se sometieron a otra ronda de clasificacion FACS para determinar la perdida de la union al anticuerpo diana. Se aislaron y se secuenciaron clones de ECD individuales utilizando el kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep (Zymo Research). Cuando fue necesario, las mutaciones se reformatearon como clones de ECD de un solo mutante utilizando el kit de mutagenesis dirigida de sitio Quikchange (Agilent).
[0568] Los clones individuales de ECD se cribaron a continuacion para determinar si la perdida de la union era debida a una mutacion en el epltopo, o una mutacion que causo un mal plegamiento. Las mutaciones que involucran cistelna, prolina, y codones de parada se descartaron automaticamente debido a la alta probabilidad de una mutacion que provocarla un mal plegamiento. El resto de los clones de ECD fueron entonces cribados para determinar la union a un anticuerpo no competitivo conformacionalmente especlfico. Se concluyo que los clones de ECD que perdieron la capacidad de union a anticuerpos no competitivos conformacionalmente especlficos contenlan mutaciones que provocaban un plegamiento inadecuado, mientras que los clones de ECD que retuvieron una union equivalente a la de ECD de DLL3 natural se plegaban de forma adecuada. Se concluyo que las mutaciones en los clones de ECD en el ultimo grupo estaban en el epltopo. Los resultados se enumeran en la TABLA 3 inmediatamente a continuacion.
TABLA 3
Clon del anticuerpo
Epltopo SEQ ID NO:
SC16.23
Q93, P94, G95, A96, P97 9
SC16.34
G203, R205, P206 10
SC16.56
G203, R205, P206 10
[0569] Mas en particular, un resumen de los anticuerpos seleccionados con sus epltopos derivados que comprenden residuos de aminoacidos que estan involucrados en la union del anticuerpo se indica en la Tabla 3. A este respecto, los anticuerpos SC16.34 y SC16.56 aparentemente interactuan con los residuos de aminoacidos habituales, lo que es consistente con la information sobre la agrupacion y los resultados del mapeo por dominio que se muestra en la Figura 14A. Por otra parte, se descubrio que SC16.23 interactuaba con un epltopo contiguo distinto y se encontro que no era del mismo grupo que SC16.34 ni que SC16.56. Cabe indicar que para los propositos del listado de secuencias adjunto, la SEQ ID NO: 10 comprendera un aminoacido marcador de position en la position 204.
Ejemplo 11
Deteccion basada en citometrfa de flujo de DLL3 en la superficie de las celulas y tincion inmunohistoqufmica de DLL3 en tumores
[0570] Para confirmar la naturaleza inmunoespeclfica de los moduladores descritos, los moduladores anticuerpos SC16 de ejemplo se ensayaron mediante citometrla de flujo para determinar su capacidad para reconocer selectivamente llneas celulares 293 manipuladas geneticamente para que expresen la protelna DLL3 en su superficie. En este sentido, se produjeron celulas que expresaban DLL3, tal como se expone sustancialmente en el Ejemplo 6, se expusieron a moduladores seleccionados y se examinaron por citometrla de flujo, tal como se describe en el presente documento. Se emplearon controles de tincion isotlpicos y de fluorescencia menos uno (FMO) para
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confirmar la especificidad de la tincion. Como se demuestra por los datos representativos que se muestran en la Figura 15 para el modulador SC16.56, algunos de los anticuerpos SC16 (por ejemplo, SC16.56) presentaron una fuerte tincion de celulas 293-hDLL3 (Figura 15B) y celulas 293-mDLL3 celulas (Figura 15C), pero no de celulas 293 parentales que no expresaban DLL3 (Figura 15A). Estos datos demuestran, por medio de citometrla de flujo, que los moduladores descritos inmunoespeclficamente reconocen DLL3 humano, y en el caso de SC16.56, tambien DLL3 murina tambien.
[0571] Para confirmar estos hallazgos y para demostrar que la expresion DLL3 se podia detectar en celulas tumorales humanas, la expresion de protelnas DLL3 en la superficie de los tumores NTX seleccionados fue evaluada por citometrla de flujo utilizando varios anticuerpos SC16 de ejemplo. A este respecto, los datos para uno de estos anticuerpos, SC16.56, y tres tumores particulares, OV26, KDY66, y LU37, se exponen en la Figura 16. Mas especlficamente, se recogieron, disociaron y tineron los tumores NTX conjuntamente con los anticuerpos comercialmente anti-CD45 de raton, anti-H-2Kd de raton, anti-EpCAM humana y los anticuerpos anti-DLL3 humano/raton (SC16.56) descritos anteriormente. De manera similar a los experimentos de tincion de 293 descritos anteriormente, se emplearon controles de tincion isotopicos y de fluorescencia menos uno (FMO) para confirmar la falta de tincion no especlfica. Como se ve en la Figura 16, la tincion anti-DLL3 fue mayor en una fraccion de las celulas tumorales NTX humanas, como se indica por el cambio de perfil fluorescente a la derecha, y por cambios en valores de intensidad media de fluorescencia (MFI) para las llneas de celulas de tumor de ovario OV26 NTX (Figura 16A), rinon KDY66 NTX (Figura 16B), y pulmon LU37 NTX (Figura 16C). Los tumores SCLC NTX tambien se tineron de manera identica y de manera similar mostraron expresion positiva de DLL3 (datos no mostrados). Estos datos sugieren que la protelna DLL3 se expresa en la superficie de diversos tumores NTX y por lo tanto puede ser modulada utilizando moduladores de tipo anticuerpo anti-DLL3.
[0572] Para corroborar aun mas la presencia de la protelna DLL3 y localizarla en la arquitectura tumor, se realizo un
estudio inmunohistoquimico (IHC) en tumores NTX derivados de un paciente humano, tejidos humanos normales y tumores SCLC primarios. Mas especlficamente, se realizo IHC en secciones de tejido embebidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE), utilizando un procedimiento de deteccion indirecta, que incluye un anticuerpo monoclonal primario murino anti-DLL3 (SC16.65), anticuerpos secundarios conjugados con biotina especificos de raton, complejo avidina/biotina acoplado a peroxidas de rabano picante, amplificacion de senal de tiramida y deteccion DAB (Nakene PK 1968; 16: 557-60). Cuando se tineron tumores NTX derivados de tumores de pacientes humanos, se utilizo un paso de bloqueo de IgG de raton para reducir la senal de fondo debida a la union no especifica. SC16.65 se valido primero y se confirmo que sera apropiado para IHC mostrando tincion especifica en las celulas 293 que sobreexpresaban DLL3, pero no en celulas 293 parentales que no expresaban DLL3, y la tincion disminuia en las celulas tratadas con horquillas orientadas a DLL3 disenadas y validadas para silenciar la expresion de la proteina DLL3 y su ARN (vease el Ejemplo 14 a continuacion, los datos no mostrados). IHC en un panel de tumores de xenoinjerto de NTX mostro que DLL3 se localiza tanto en la membrana como en el citoplasma de
muchos tumores SCLC NTX y NET que previamente dieron positivo para ARNm de DLL3 (Figura 16D). La
intensidad de la tincion se puntuo de tincion nula (-) a alta expresion (+++) anotando el porcentaje de celulas positivas. La tincion de tejidos humanos normales no mostro expresion detectable de DLL3 (Figura 16E). Significativamente, la tincion de muestras de tumores SCLC primarios confirmo que 36/43 tumores fueron positivos para DLL3 (Figura 16F). Tambien se realizo una tincion de Cromagranina A (CHGA) para confirmar que los
tumores eran de hecho tumores SCLC. La mayoria de los tumores que carecian de DLL3 tambien carecian de
tincion CHGA, indicando que estas secciones podrian no contener tejido tumoral o que el tejido se veia comprometido durante el procesamiento. Dos tumores que dieron positivo para DLL3 pero que fueron negativos para CHGA, eran ambos tumores SCLC en estadio avanzado (IIIa). Estos datos sugieren que DLL3 proporciona una diana terapeutica eficaz, ya que no se expresa generalmente en tejidos humanos normales, pero esta presente en la mayoria de los tumores de SCLC.
Ejemplo 12
Los moduladores de DLL3 facilitan el suministro de agentes citotoxicos
[0573] Para determinar si los moduladores de anticuerpo de DLL3 de la presente descripcion son capaces de mediar en la administracion de un agente citotoxico a celulas vivas, se realizo un ensayo de eliminacion celular in vitro usando moduladores de anticuerpos de DLL3 seleccionados al azar.
[0574] Especlficamente, se disociaron 2500 celulas/pocillo de KDY66 humano, un NET NTX que expresaba DLL3 endogeno, en una suspension de un unico tipo de celulas y se sembraron en placas BD Primaria™ (BD Biosciences) en medio sin suero suplementado con factor de crecimiento como se conoce en la tecnica, un dia antes de la adicion de anticuerpos y toxina. Se anadieron varias concentraciones de moduladores de DLL3 purificados, tales como los descritos en los Ejemplos 6 y 7, y una concentracion fija de fragmento de 4 nM de un fragmento Fab de anticuerpo anti-IgG de raton unido covalentemente a toxina saporinica (Advanced Targeting Systems, # IT-48) a los cultivos durante siete dias. Para la eliminacion en 293-hDLL3, se sembraron 500 celulas/pocillo en un unico tipo de celulas y se sembraron en placas de cultivo tisular BD en DMEM con FBS al 10% un dia antes de la adicion de anticuerpos y toxina. Se anadieron dos concentraciones de varios moduladores de DLL3 y una concentracion fija de 2 nM de fragmento de Fab de anticuerpo anti-IgG de raton unido covalentemente a saporina a los cultivos durante tres dias.
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La capacidad de los complejos de saporina para internalizar y eliminar las celulas se determino mediante la enumeration de los numeros de celulas viables usando Cell Titer Glo* (Promega) segun las instrucciones del fabricante. El recuento de luminiscencia sin procesar utilizando cultivos que contienen celulas con el fragmento Fab y saporina se establecieron como valores de referencia del 100% y todos los otros recuentos se calcularon en consecuencia (referidos como "RLU normalizadas"). Usando este ensayo se demostro que un subconjunto de anticuerpos DLL3 probados a 500 y 50 pM eliminaba celulas KDY66, as! como un subconjunto de anticuerpos probados a 250 y 25pM en celulas que sobreexpresan 293-hFLL3 (Figura 17A). Los controles isotlpicos no afectaron a los recuentos de celulas tal como se muestra por las barras IgG2a, IgG2b, y MOPC a la izquierda de la grafica (Figura 17A).
[0575] Se evaluo un subconjunto de moduladores de DLL3 que mostraban una elimination eficiente en el primer ensayo descrito anteriormente en una dilution para determinar los valores de EC50 para la actividad. Dos de tales anticuerpos representativos, SC16.34 y SC16.15, se muestran en la Figura 17B, en la que se determino que SC16.15 mostro una eliminacion eficiente de OV26, un tumor ovarico NET NTX, con una EC50 subpicomolar (por ejemplo, 0,14 pM) con relation al perfil de eliminacion que se muestra por SC16.34 (por ejemplo, 5,7 pM). Como la saporina elimina solo celulas al absorberse en el citoplasma donde se inactivan los ribosomas, este ensayo tambien demuestra que la internalization puede producirse tras la union del anticuerpo especlfica para DLL3 a la superficie celular, sin la necesidad de reticulation o dimerization adicional.
[0576] Por ultimo, se trato LU37 con SC16.15 humanizado conjugado con ADC1 o con un ADC1 de IgG1 humanizado de control (conjugado como en el Ejemplo 13 a continuation). Especlficamente, 2.500 celulas LU37 NTX se sembraron en cada pocillo en placas de BD PrimariaTM (BD Biosciences) en un medio sin suero suplementado con factor de crecimiento como se conoce en el unico dla arte antes de la adicion de los anticuerpos conjugados. Se anadieron varias concentraciones de huIgG1-ADC1 o hSC16.15-ADC a los cultivos durante siete dlas, y se determino la capacidad de los agentes citotoxicos para eliminar mediante la enumeracion de los numeros de celulas (como se detalla mas arriba). Utilizando este ensayo se demostro que hSC16.15-ADC1 eliminaba de manera eficiente LU37. En contraste con una concentration > 1.000 ng/ml de ADC de control necesaria para eliminar el 50% de LU37, < 10 ng/ml de hSC16.15-ADC1 elimino el 50% de LU37 (Figura 17C).
Ejemplo 13
Preparacion de conjugados de anticuerpo DLL3-farmaco
[0577] Basandose en los resultados anteriores con saporina y para demostrar aun mas la versatilidad de la presente description, se prepararon conjugados de anticuerpos anti-DLL3 y farmaco (DLL3-ADC) usando agentes citotoxicos unidos covalentemente. Mas especlficamente, se prepararon DLL3-ADC que comprendlan un enlazador como se describe en el presente documento, o en las referencias inmediatamente a continuacion, y dlmeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) seleccionados que se unen covalentemente a los moduladores descritos (vease, por ejemplo, USPNs. 2011/0256157 y 2012/0078028 y el documento USPN 6.214.345).
[0578] Se sintetizaron combinaciones farmaco PBD-enlazador y se purificaron usando tecnicas reconocidas en el sector en vista de las referencias citadas. Aunque se emplearon diversos dlmeros de PBD y enlazadores para fabricar las combinaciones de farmaco-enlazador seleccionados, cada unidad de enlazador comprendia un resto maleimido terminal con un sulfhidrilo libre. Usando estos enlazadores, se prepararon conjugaciones a traves de la reduction parcial del mAb con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) seguido de la reaction de reduction de residuos de Cys con la carga util del maleimido del enlazador.
[0579] Mas particularmente, el modulador de anticuerpo de DLL3 seleccionado se redujo con 1,3 mol de TCEP por mol de mAb durante 2 horas a 37°C en Tris HCl 25 mM pH 7,5 y tampon de EDTA 5 mM. La reaccion se dejo enfriar a 15°C y se anadio la carga util del enlazador en DMSO en una proportion de 2,7 mol/mol mAb, seguido de una cantidad adicional de DMSO a una concentracion final de 6% (v/v). La reaccion se dejo proceder durante 1 hora. El farmaco-enlazador sin reaccionar se desactivo mediante la adicion de un exceso de N-acetil cistelna. El DLL3-ADC (o SC16-ADC) se purifico mediante columna de intercambio ionico utilizando un sistema FPLC AKTA Explorer (GE Healthcare) para eliminar el anticuerpo agregado de alto peso molecular, el codisolvente y moleculas pequenas. El ADC eluido se sometio a un intercambio de tampon por filtration de flujo tangencial (TFF) en tampon de formulation, seguido por ajuste de la concentracion y adicion de un detergente. El ADC final se analizo para determinar la concentracion de protelna (mediante la medicion de UV), la agregacion (SEC), la proporcion de farmaco con respecto a anticuerpo (DAR) por HPLC de fase inversa (RP), la presencia de anticuerpo no conjugado por HPLC con cromatografla de interaction hidrofoba (HIC), material no protelnico por HPLC RP y citotoxicidad in vitro usando una llnea celular que expresaba DLL3.
[0580] Usando el procedimiento anteriormente mencionado, o metodologla sustancialmente similar, se genero un numero de ADC (es decir, M-[L-D]n) que comprendlan varios moduladores de DLL3 y dlmeros de PBD y se ensayaron en una variedad de modelos in vivo e in vitro. Para los fines de estos ejemplos y la presente divulgation, tales ADCs generalmente se pueden denominar DLL3-ADC o SC16-ADCs. Los aDc discretos se nombran segun la designation del anticuerpo (por ejemplo, SC16.13) y del enlazador-agente citotoxico especifico ADC1, ADC2, etc.
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Por lo tanto, los moduladores de ejemplo compatibles con la presente descripcion pueden comprender SC16.13- ADC1 o SC16.67-ADC2 donde ADC1 y ADC2 representan los agentes individuales citotoxicos dimericos de PBD (y opcionalmente un enlazador).
Ejemplo 14
Especificidad de la toxicidad mediada por conjugado de anticuerpo anti-DLL3-farmaco
[0581] Para demostrar que la toxicidad de los conjugados de anticuerpo anti-DLL3 y farmaco es especlfica de celulas que expresaban DLL3 endogeno, se realizaron experimentos para mostrar que las celulas tumorales conocidas por tener expresion de DLL3 endogeno ya no son eliminadas por SC16-ADC in vitro cuando la expresion de DLL3 es suprimida silenciando la expresion de protelna DLL3 y su ARNm usando un ARN horquilla corto (shRNA).
[0582] KDY66 es un xenoinjerto derivado del paciente con un carcinoma papilar de celulas renales que exhibe caracterlsticas neuroendocrinas y expresa la protelna DLL3 y su ARNm (por ejemplo, vease la Figura 7 y la Figura 16B). La expresion de DLL3 se redujo en celulas KDY66 mediante transduccion con shARN dirigido a DLL3 humano lentiviral GIPZ (Thermo Fisher Scientific Inc.) que contenla un shARN anti-DLL3. Mas especlficamente, el vector lentiviral se genero a traves de la transfeccion de celulas 293T con un plasmido lentiviral bicistronico que expresaba shRNA anti-DLL3 (DLL3HP2) o shARN de control no silenciador (DLL3NSHP) en presencia de plasmidos de empaquetamiento viral. Las partlculas lentivirales resultantes contenidas en el sobrenadante se concentraron y se recogieron por ultracentrifugacion. Estas partlculas se utilizaron luego para transducir los cultivos celulares de KDY66 e introducir el shRNA (es decir, DLL3HP2 o NSHP) en el que el shRNA anti-DLL3 se une a mARN de DLL3 endogeno y se dirige para su destruccion evitando de este modo la traduccion a protelna DLL3. Ambas construcciones de vector contenlan un modulo de expresion de GFP independiente para la verification de la transduccion exitosa y la selection de celulas transducidas.
[0583] Despues de la transduccion, la expresion de DLL3 se evaluo por citometrla de flujo. Brevemente, se marco una muestra de una suspension de un unico tipo de celulas disociadas correspondiente a celulas transducidas con DLL3HP2 con un modulador de DLL3 (SC16.34) conjugado con Alexa Fluor 647 (Life Technologies) y se analizo en un citometro de flujo FACS Canto II bajo condiciones estandar. Para demostrar una reduction de la expresion de la protelna DLL3 en la superficie de las celulas DLL3HP2 transducidas, la intensidad de fluorescencia se comparo con una muestra preparada de manera similar de las celulas KDY66 DLL3NSHP tenidas con un anticuerpo de control no reactivo (647-IgG1) y celulas KDY66 DLL3NSHP tenidas con 647-DLL3. Se encontro que las celulas DLL3NSHP.KDY66 exhiblan una expresion de protelnas DLL3 sustancialmente equivalente a las celulas KDY66 sin tratar (datos no mostrados). Como se ve en la Figura 18A, la expresion en la superficie de la protelna DLL3 se redujo en las celulas transducidas con DLL3HP2 en comparacion con las celulas no tratadas previamente tenidas con el mismo anticuerpo marcado con AlexaFluor-647.
[0584] Con el fin de examinar las consecuencias de la expresion de DLL3 sobre el crecimiento de tumores, se transplantaron celullas DLL3HP2 transducidas (DLL3‘) y celulas KDY66 si tratar (DLL3+) en ratones inmunodeficientes. A partir de la muestra preparada como se ha descrito anteriormente, se seleccionaron celulas GFP+ humanas vivas para recoger las celulas que contienen el shARN anti-DLL3. En cohortes de cinco ratones fueron inyectados (140 celulas/raton) celulas KDY66 o DLL3HP2 sin tratar y el crecimiento tumoral se controlo semanalmente. En cada cohorte, dos de los cinco receptores desarrollaron los tumores. La formation de tumores en los dos receptores de DLL3HP2.KDY66 se retraso aproximadamente 22 dlas tras la formacion de tumores en los dos receptores de KDY66 sin tratar (Figura 18B). Este retraso observado en el crecimiento sugiere que la expresion de DLL3 puede estar conectado a un aumento o aceleracion de la formacion de tumores, ya que el silenciamiento de DLL3 afecto al crecimiento del tumor.
[0585] Al llegar al volumen apropiado para la aleatorizacion (~ 160 mm3), los tumores DLL3HP2 KDY66 y tumores KDY66 sin tratar se xtirparon de ratones receptores y se dispersaron en suspensiones de celulas de un tipo. La reduccion continuada de expresion DLL3 (es decir, no se indujo la expresion de DLL3 durante el crecimiento in vivo) en celulas DLL3HP2 se confirmo en suspensiones de celulas tumorales de un tipo mediante citometrla de flujo como se describe anteriormente. A este respecto, la Figura 18C muestra que las celulas transducidas con DLL3HP2 cultivadas in vitro muestran una reduccion de expresion de protelna DLL3 cuando se compara con celulas sin tratar cultivadas en condiciones similares.
[0586] Usando tecnicas bioqulmicas estandar, se sembraorn celulas KDY66 sin tratar o celulas DLL3HP2 KDY66 en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medios libres de suero. Se anadio una serie de diluciones de conjugados de anticuerpo-farmaco hSC16.56 humanizado-ADC1 (SC16-ADC1) o IgG anti-hapteno humanizada-ADC1 (como control) producidos como se ha expuesto anteriormente a las celulas por triplicado. Despues de 7 dlas de exposition a conjugado anticuerpo-farmaco, la cantidad de celulas vivas se midio con una detection basada en la luminiscencia de ATP en los lisados celulares de cada pocillo (Cell Titer Glo, Promega) sustancialmente como se expone en el Ejemplo 12.
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[0587] Aunque el 50% de las celulas KDY66 sin tratar fueron eliminadas por una dosis relativamente baja de 13,27 pM de SC16-ADC, ninguna dosis de SC16-ADC1 fue capaz de eliminar ni el 20% de celulas de celulas DLL3HP2.KDY66 (Figuras 18D y 18E). Cabe destacar que la perdida de la expresion de la protelna DLL3 endogena dio lugar a una perdida completa de la eliminacion in vitro por SC16-ADC1. Esto demuestra que la citotoxicidad de hSC16-ADC1 se dirige especlficamente a las celulas que expresan DLL3 con poca, o ninguna, toxicidad especlfica.
Ejemplo 15
Los moduladores de DLL3 conjugados suprimen el crecimiento tumoral
[0588] Basandose en los resultados anteriormente mencionados, se realizaron estudios para demostrar que los moduladores de DLL3 conjugados de la presente descripcion reducen y suprimen el crecimiento de tumores humanos que expresan DLL3 in vivo. A este respecto, se asociaron varios moduladores de anticuerpos murinos seleccionados covalentemente con un agente citotoxico PBD y los ADC resultantes se ensayaron para demostrar su capacidad para suprimir el crecimiento del tumor NTX humano en ratones inmunodeficientes.
[0589] Con este fin, se indujo el crecimiento de tumores NTX derivados del paciente subcutaneamente en los flancos de ratones NOD/SCID receptores femeninos usando tecnicas reconocidas en la tecnica. Los volumenes del tumor y pesos de los ratones se controlaron dos veces por semana. Cuando los volumenes del tumor alcanzaron 150-250 mm3, los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento y se inyectaron con dosis indicadas de SC16-ADC2 o un control de IgG1-anti-hapteno-ADC2 (cada uno producido sustancialmente como se describe en el Ejemplo 13 anterior utilizando el dlmero de PBD ADC2) a traves de inyeccion intraperitoneal. Los ratones recibieron tres inyecciones iguales, espaciados uniformemente a lo largo de siete dlas. Despues del tratamiento, los volumenes tumorales y pesos de los ratones se monitorizaron hasta que los tumores excedieron 800 mm3 o los ratones cayeron enfermos. Para todas las pruebas, los ratones tratados no mostraron efectos adversos para la salud mas alla de los tlpicamente observados en ratones NOD inmunodeficientes portadores de tumores/SClD.
[0590] La Figura 19 muestra el impacto de los ADC descritos en el crecimiento del tumor en ratones portadores de diferentes tumores pulmonares que presentan caracterlsticas neuroendocrinas (dos cancer de pulmon de celulas pequenas y un cancer de pulmon de celulas grandes con caracterlsticas neuroendocrinas). A este respecto, el tratamiento de LU37, un carcinoma pulmonar neuroendocrino de celulas grandes, con tres moduladores de ejemplo (SC16.13, SC16.46 y SC16.67) conjugados con ADC2 dio lugar a la supresion del crecimiento tumoral que duro al menos 20 dlas en el caso de SC16.13-ADC2 y SC16.67-ADC2 (figura 19A); en cambio, aunque SC16.46 redujo moderadamente el crecimiento del tumor, exhibio una actividad menor que los otros moduladores ensayados. Del mismo modo, el tratamiento de LU73, un carcinoma de pulmon de celulas pequenas, con cuatro moduladores de ejemplo (SC16.4, SC16.13, SC16.15 y SC16.46) produjo remisiones duraderas que duraron, en algunos ejemplos, mas alla de 120 dlas despues del tratamiento (Figura 19B). Sin embargo, como con los anticuerpos probados contra LU37, los anticuerpos ensayados contra LU73 variaron un poco en la duracion de la represion del tumor. Finalmente, el tratamiento de LU86, otro carcinoma de pulmon de celulas pequenas, con dos moduladores conjugados (SC16.46-ADC2 y SC16.67-ADC2) produjo la reduction del tumor con un tiempo hasta producir un avance de 40 dlas en un caso (SC16.67-ADC2; Figura 19C). Cabe indicar que en la Figura 19C dos de las curvas se solapan sustancialmente (mIgG1-ADC2 y SC16.46-ADC2) y son diflciles de distinguir.
[0591] La sorprendente capacidad de una variedad de moduladores conjugados para retardar drasticamente o suprimir el crecimiento tumoral in vivo durante perlodos prolongados valida aun mas el uso de DLL3 como una diana terapeutica para el tratamiento de trastornos proliferativos.
Ejemplo 16
Los moduladores DLL3-ADC humanizados suprimen el crecimiento tumoral
[0592] Teniendo en cuenta los resultados impresionantes proporcionados por DLL3-ADC2, se realizaron experimentos adicionales para demostrar la eficacia de los moduladores de ADC humanizados de ejemplo en el tratamiento de diversos tipos de tumores (incluyendo cancer de ovario, pulmon y rinon) in vivo. Especlficamente, se conjugaron anticuerpos anti-DLL3 humanizados, seleccionados (hSC16.13, hSC16.15, hSC16.34 y hSC16.56 producidos como se expone en el Ejemplo 8 anterior) (a traves de una unidad de enlazador) a dos agentes citotoxicos PBD discretos (ADC1 y ADC2) como se describe anteriormente y se administraron con los controles a ratones inmunodeficientes implantados con tumores NTX, tal como se expone en el Ejemplo anterior. En cada estudio, los volumenes tumorales y los pesos de ratones de los animales de control se monitorizaron hasta que los tumores excedieron 800 mm3 o los ratones enfermaron. Los resultados de estos experimentos se presentan en las figuras 20A a 20F.
[0593] Una revision de las Figuras 20A - 20F muestra que se logro la reduccion del volumen del tumor y la remision duradera en varios tipos de tumores, algunos de los cuales mostraban caracterlsticas neuroendocrinas, despues del tratamiento con 1 mg/kg de hSC16-ADC. Por ejemplo, los reglmenes de tratamiento, donde la administration se define por las llneas verticales en las figuras en cuestion, producen eliminaciones completas y duraderas de la masa
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tumoral en el carcinoma de ovario con caracterlsticas neuroendocrinas (OV26, hSC16.15-ADC2, figura 20A), un carcinoma papilar de celulas renales con caracterlsticas neuroendocrinas (KDY66, hSC16.34-ADC1, Figura 20E) y tres carcinomas de pulmon de celulas pequuenas (LU86, hSC16.13-ADC1, Figura 20B), (LU64, hSC16.13-ADC1, figura 20C; LU64, hSC16.13-ADC2 + hSd6.13-ADC1, figura 20D). Se observo ausencia de recurrencia del tumor durante mas de 100 dlas en todos estos ejemplos, y en algunos ejemplos mas alla de 225 dlas despues del tratamiento, donde se monitorizaron los ratones durante un perlodo prolongado de tiempo. Ademas, el tratamiento con los moduladores descritos produjo la reduccion del volumen del tumor y la supresion del crecimiento en un xenoinjerto de carcinoma renal de celulas claras que exhibla altos niveles de DLL3 usando una dosis mas baja de 0,5 mg/kg (KDY27, hSC16.56-ADC1, Figura 20F).
[0594] Por ultimo, cabe senalar que ciertos tumores recurrentes permanecieron sensibles a la toxicidad de hSC16- ADC. Ochenta dlas despues del tratamiento inicial con SC16.13-ADC2, se observo recurrencia en LU64 (Figura 20D). El tratamiento de tumores recurrentes con hSC16.13-ADC1 dio lugar a la eliminacion de masa tumoral observable que persistio mas de 100 dlas despues del segundo tratamiento.
[0595] Una vez mas, estos resultados demuestran la sorprendente versatilidad y aplicabilidad de los moduladores de la presente invencion en el tratamiento de una variedad de trastornos proliferativos.
Ejemplo 17
Reduccion de la frecuencia de celulas madre cancerosas con conjugados de anticuerpo de DLL3-farmaco
[0596] Como se muestra en los ejemplos anteriores, los moduladores descritos son extremadamente eficaces en la supresion del crecimiento tumoral, particularmente en forma de ADC. Por otra parte, como se ha demostrado anteriormente, la expresion de DLL3 se asocia con cancer de celulas madre que en general se sabe que son resistentes a los medicamentos e inducen la recurrencia y metastasis del tumor. Por consiguiente, para demostrar que el tratamiento con DLL3-ADC reduce la potencial recurrencia de llneas NTX, se realizaron ensayos de dilucion limitante (LDA) in vivo para determinar la frecuencia de celulas iniciadoras del tumor (TIC) en tumores de cancer de pulmon de celulas pequenas despues del tratamiento con hSC16 0,13-ADC1 (denominado SC16-ADC en la figura 21).
[0597] Se indujo el crecimiento de tumores de xenoinjerto de cancer de pulmon de celulas pequenas de un paciente (LU95 y LU64) subcutaneamente en ratones huesped inmunodeficientes. Cuando los volumenes tumorales alcanzaron un valor promedio de 150 mm3-250 mm3, los ratones fueron separados al azar en dos grupos de siete ratones. A traves de inyeccion intraperitoneal, se inyectaron los ratones en los dlas 0, 4 y 7, con IgG1 humana-ADC1 (figuras 21A y 21D, las llneas de puntos verticales) (1 mg/kg; n = 7 ratones) como un control negativo o hSC16.13- ADC1 (1 mg/kg; n = 7 ratones). En el dla 8, dos ratones representativos de cada grupo fueron sacrificados y sus tumores se extirparon y se dispersaron en suspensiones de un tipo de celula. Como se muestra en las figuras 21A y 21D, aunque los tumores tratados con hIgG1-ADC1 (IgG1-ADC) continuaron creciendo en los cinco ratones restantes, los volumenes de los tumores tratados con hSC16.13-ADC1 (SC16-ADC) se redujeron a cero o casi cero en los cinco ratones restantes.
[0598] Usando tecnicas estandar de citometrla de flujo y un anticuerpo anti-DLL3 marcado, se confirmo que los dos tumores extirpados de cada uno de los dos grupos de tratamiento presentaban la expresion de DLL3 igualmente positiva. Las celulas tumorales de cada grupo de tratamiento respectivo se agruparon posteriormente y se aislaron las celulas humanas vivas por FACS utilizando un FACSAria III (Becton Dickenson) segun las instrucciones del fabricante y tecnicas reconocidas en el sector. Brevemente, las celulas se marcaron con FITC conjugado con anticuerpos anti-H2Kd murinos y anti-CD45 murino (de BioLegend, Inc.) y despues se resuspendieron en 1 mg/ml de DAPI. A continuacion, se hizo una seleccion de la suspension resultante en condiciones estandar con DAPI’, mH2Kd' y mCD45‘ y se eliminaron las celulas murinas.
[0599] A continuacion se trasplantaron en cohortes de cinco ratones receptores 2.000, 500, 120 o 30 celulas humanas vivas seleccionadas de los tumores tratados con hSC16.13-ADC1. Para la comparacion, se trasplantaron cohortes de cinco ratones receptores con cualquiera de 1000, 250, 60 o 15 celulas humanas vicvas seleccionadas de los tumores tratados con el control de IgG1-ADC1. Los tumores en los ratones receptores se midieron semanalmente, y los ratones individuales se sacrificaron antes de que los tumores alcanzaran 1500 mm3. Despues de la aparicion del crecimiento tumoral, el estudio se termino despues de cuatro semanas consecutivas sin que apareciera un nuevo tumor en ningun raton adicional. En ese momento, los ratones receptores se puntuaron como positivos o negativos para el crecimiento tumoral, con crecimiento positivo con volumenes superiores a 100 mm3.
[0600] En todas las dosis celulas inyectadas, los receptores de celulas LU95 tratadas con hSC16.13-ADC1 produjeron solo un tumor en comparacion con doce en los receptores de celulas LU95 tratadas con IgG1-ADC1 (Figura 21B). Del mismo modo, los receptores de celulas LU64 tratadas con SC16.13-ADC1 produjeron tres tumores, en comparacion con 13 tumores en receptores de celulas LU64 tratadas con IgG1-ADC1 (Figura 21E).
[0601] Usando el modelo estadlstico de distribucion de Poisson (software L-Calc, StemCell Technologies), se
5
10
15
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25
30
35
40
45
50
55
60
65
utilizaron dosis de celulas inyectadas de receptores con y sin tumores 18 semanas post-trasplante se utilizaron para calcular las frecuencias de celulas iniciadoras del tumor en cada poblacion. El numero de TIC por 10.000 celulas humanas vivas en LU95 se redujo mas de 100 veces, de 78,1 en los tumores tratados con IgG1-ADC a 0,769 en los tumores tratados con hSC16.13-ADC1 (figura 21C, de 1:128 en los tratados con el control a 1:12.998 en los tratados con el modulador). En LU64, el numero de TIC se redujo 16,6 veces, de 47,4 TIC a 2,86 TIC por 10.000 celulas humanas vivas en los tumores tratados con IgG1-ADC1 o hSC16.13-ADC1, respectivamente (figura 21F, de 1:211 celulas en los tratados con el control tratado a 1:3500 en slos tratados con el modulador). Esta reduccion sustancial en la frecuencia de TIC (por ejemplo, celulas madre cancerosas) demuestra que, ademas de reducir los volumenes tumorales como previamente se ha demostrado, el modulador de la presente descripcion reduce significativamente y especlficamente las poblaciones de celulas madre cancerosas y, por extension, el potencial de recurrencia, metatasis y recrecimiento de los tumores. Esta reduccion del potencial de recurrencia y recrecimiento queda claramente reflejada por la supervivencia significativa sin tumor observada en los Ejemplos previamente descritos.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0602]
<110> STEM CENTRX, INC.
<120> NUEVOS MODULADORES Y PROCEDIMIENTOS DE USO
<130> 11200.0013-00304
<140>
<141>
<150> 61/719,803 <151> 2012-10-29
<150> 61/603,173 <151> 2012-02-24
<160> 413
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 2387 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 1
agatataagg
cttggaagcc agcagctgcg actcccgaga cccccccacc agaaggccat 60
ggtctcccca
cggatgtccg ggctcctctc ccagactgtg atcctagcgc tcattttcct 120
cccccagaca
cggcccgctg gcgtcttcga gctgcagatc cactctttcg ggccgggtcc 180
aggccctggg
gccccgcggt ccccctgcag cgcccggctc ccctgccgcc tcttcttcag 240
agtctgcctg
aagcctgggc tctcagagga ggccgccgag tccccgtgcg ccctgggcgc 300
ggcgctgagt
gcgcgcggac cggtctacac cgagcagccc ggagcgcccg cgcctgatct 360
cccactgccc
gacggcctct tgcaggtgcc cttccgggac gcctggcctg gcaccttctc 420
tttcatcatc
gaaacctgga gagaggagtt aggagaccag attggagggc ccgcctggag 480
cctgctggcg
cgcgtggctg gcaggcggcg cttggcagcc ggaggcccgt gggcccggga 540
cattcagcgc
gcaggcgcct gggagctgcg cttctcgtac cgcgcgcgct gcgagccgcc 600
tgccgtcggg
accgcgtgca cgcgcctctg ccgtccgcgc agcgccccct cgcggtgcgg 660
tccgggactg
cgcccctgcg caccgctcga ggacgaatgt gaggcgccgc tggtgtgccg 720
agcaggctgc
agccctgagc atggcttctg tgaacagccc ggtgaatgcc gatgcctaga 780
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2387
60
120
180
240
gggctggact
gggcccgtcc
cccgtgtgcc
gcgtgggttc
cttcaacggc
cccacccggt
atgccgcaat
cggcttcgcg
taacggcggc
cggcggccgc
cggccgctgc
agcgcggtgt
gggcctcagg
ggccgcgggc
ccaggatgct
ggatgcactc
agattggaat
catctacgct
gcagaggcag
gtagagtctc
gcatccctct
aggaggtcac
aggggaggca
gcgtctcctc
ccagtctctg
ctgttgcaag
gaaacaccta
<210> 2 <211> 2052 <212> ADN <213> Homo
<400> 2 agatataagg
ggtctcccca
cccccagaca
aggccctggg
ggacccctct
tctgctacca
aatggaggca
tacgggctgc
ggcttgtgtg
ttccaaggct
ggcggactct
ggtcctcgct
acgtgtgtgg
gactgccgcg
tacgcccact
gagttcccag
cccggggacc
gtggccggcg
gggtctcgct
aacaacctaa
cgccctgaag
cgggaggtag
cacctgcttt
tggaaggttt
tatcgttttg
gatgccgact
gaggggcagc
catccgcacc
ccccagaggc
ttgtaaataa
taaaggctat
sapi ens
cttggaagcc
cggatgtccg
cggcccgctg
gccccgcggt
gcacggtccc
ccggatgcct
gctgtagtga
ggtgtgaggt
tcgggggtgc
ccaactgtga
gcctggacct
gcgagcacga
agggcggcgg
agcgcgcgga
tctccggcct
tgcaccccga
ctcagcgcta
ctgcgctctt
tgctggctgg
ggacgcagga
atgtagaccc
cgacgcccct
ttccctaccc
taagcccatt
agctacctgc
ccgccagagc
ctctctaatg
tggagtcaga
tttggagttc
tggttattta
tattgtgatc
agcagctgcg
ggctcctctc
gcgtcttcga
ccccctgcag
tgtctccacc
tgtccctggg
gacacccagg
gagcggggtg
agaccctgac
gaagagggtg
gggccacgcc
cctggacgac
cgcgcaccgc
cccgtgcgcc
cgtctgcgct
cggcgcaagc
ccttttgcct
gctggtccac
gaccccggag
gggttccggg
tcaagggatt
tttccccccg
ttcctcgatt
ttcagttcta
catcttctct
ttttccactg
cttcctactc
gcgtggattt
aatcttgaag
tatcctattt
agttttgact
actcccgaga
ccagactgtg
gctgcagatc
cgcccggctc
agcagctgcc
cctgggccct
tcctttgaat
acatgtgcag
tctgcctaca
gaccggtgca
ctgcgctgcc
tgcgcgggcc
tgctcctgcg
gcgcgcccct
tgcgctcccg
gccttgcccg
ccggctctgg
gtgcgccgcc
ccgtcagtcc
gatggtccga
tatgtcatat
ctacacactg
ctgtccgtga
acttactttc
ttgaaaaacc
attgtactca
attttgtttc
ttgtatttgc
gggtgtctgg
tttctcaccc
aacaaaa
cccccccacc
atcctagcgc
cactctttcg
ccctgccgcc
tcagccccag
gtgacgggaa
gcacctgccc
atggaccctg
tctgccactg
gcctgcagcc
gctgccgcgc
gcgcctgcgc
cgctgggctt
gtgctcacgg
gctacatggg
cggccccgcc
gactgctcgt
gtggccactc
acgcactccc
gctcgtccgt
ctgctccttc
ggcgcgctgg
aatgaattgg
atcctatttt
tatgggcttg
gcggggaggc
taggcctgac
tcggtggtgc
gggaacttta
catctctcta
agaaggccat
tcattttcct
ggccgggtcc
tcttcttcag
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2052
agtctgcctg
ggcgctgagt
cccactgccc
tttcatcatc
cctgctggcg
cattcagcgc
tgccgtcggg
tccgggactg
agcaggctgc
gggctggact
gggcccgtcc
cccgtgtgcc
gcgtgggttc
cttcaacggc
cccacccggt
atgccgcaat
cggcttcgcg
taacggcggc
cggcggccgc
cggccgctgc
agcgcggtgt
gggcctcagg
ggccgcgggc
ccaggatgct
ggatgcactc
agattggaat
catctacgct
tttttgtatt
aaggggtgtc
ttttttctca
actaacaaaa
<210> 3 <211> 618 <212> PRT <213> Homo
aagcctgggc
gcgcgcggac
gacggcctct
gaaacctgga
cgcgtggctg
gcaggcgcct
accgcgtgca
cgcccctgcg
agccctgagc
ggacccctct
tctgctacca
aatggaggca
tacgggctgc
ggcttgtgtg
ttccaaggct
ggcggactct
ggtcctcgct
acgtgtgtgg
gactgccgcg
tacgcccact
gagttcccag
cccggggacc
gtggccggcg
gggtctcgct
aacaacctaa
cgccctgaag
cgggaggcct
tgctcggtgg
tgggggaact
ccccatctct
aa
sapi ens
tctcagagga
cggtctacac
tgcaggtgcc
gagaggagtt
gcaggcggcg
gggagctgcg
cgcgcctctg
caccgctcga
atggcttctg
gcacggtccc
ccggatgcct
gctgtagtga
ggtgtgaggt
tcgggggtgc
ccaactgtga
gcctggacct
gcgagcacga
agggcggcgg
agcgcgcgga
tctccggcct
tgcaccccga
ctcagcgcta
ctgcgctctt
tgctggctgg
ggacgcagga
atgtagaccc
gacgcgtctc
tgcccagtct
ttactgttgc
ctagaaacac
ggccgccgag
cgagcagccc
cttccgggac
aggagaccag
cttggcagcc
cttctcgtac
ccgtccgcgc
ggacgaatgt
tgaacagccc
tgtctccacc
tgtccctggg
gacacccagg
gagcggggtg
agaccctgac
gaagagggtg
gggccacgcc
cctggacgac
cgcgcaccgc
cccgtgcgcc
cgtctgcgct
cggcgcaagc
ccttttgcct
gctggtccac
gaccccggag
gggttccggg
tcaagggatt
ctccatccgc
ctgccccaga
aagttgtaaa
ctataaaggc
tccccgtgcg
ggagcgcccg
gcctggcctg
attggagggc
ggaggcccgt
cgcgcgcgct
agcgccccct
gaggcgccgc
ggtgaatgcc
agcagctgcc
cctgggccct
tcctttgaat
acatgtgcag
tctgcctaca
gaccggtgca
ctgcgctgcc
tgcgcgggcc
tgctcctgcg
gcgcgcccct
tgcgctcccg
gccttgcccg
ccggctctgg
gtgcgccgcc
ccgtcagtcc
gatggtccga
tatgtcatat
acctggagtc
ggctttggag
taatggttat
tattattgtg
ccctgggcgc
cgcctgatct
gcaccttctc
ccgcctggag
gggcccggga
gcgagccgcc
cgcggtgcgg
tggtgtgccg
gatgcctaga
tcagccccag
gtgacgggaa
gcacctgccc
atggaccctg
tctgccactg
gcctgcagcc
gctgccgcgc
gcgcctgcgc
cgctgggctt
gtgctcacgg
gctacatggg
cggccccgcc
gactgctcgt
gtggccactc
acgcactccc
gctcgtccgt
ctgctccttc
agagcgtgga
ttcaatcttg
ttatatccta
atcagttttg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 3
Met
Val Ser Pro Arg Met Ser Gly
1
5
Al a
Leu Ile Phe Leu Pro Gl n Thr
20
Gln
Ile Hi s Ser Phe Gly Pro Gly
35 40
Pro
Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys
50 55
Lys
Pro Gly Leu Ser Glu Gl u Ala
65
70
Ala
Ala
Leu Ser Ala Arg Gly Pro
85
Pro
Ala Pro Asp Leu Pro Leu
Pro
100
Arg
Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe
115 120
Glu
Gl u Leu Gly Asp Gln Ile Gly
130 135
Arg
Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu
145
150
Asp
Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp
165
Arg
Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly
180
Pro
Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys
195 200
Pro
Leu Glu Asp Glu Cys Gl u Ala
210 215
Ser
Pro Glu His Gly Phe Cys Glu
225
230
Glu
Gly T rp Thr Gly Pro Leu Cys
245
Cys
Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser
260
Leu
Leu
Ser Gl n Thr Val Ile
Leu
10 15
Arg
Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu
25
30
Pro
Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser
45
Arg
Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu
60
Ala
Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly
75 80
Val
Tyr Thr Gl u Gln Pro Gly Ala
90 95
Asp
Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe
105
110
Ser
Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg
125
Gly
Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala
140
Ala
Al a Gly Gly Pro Q_ L. 1- Ala Arg
155 160
Glu
Leu Arg Phe Ser S_ 1- Arg Ala
170 175
Thr
Al a Cys Thr Arg Leu Cys Arg
185
190
Gly
Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala
205
Pro
Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys
220
Gln
Pro Gly Gl u Cys Arg Cys Leu
235 240
Thr
Val Pro Val Ser Thr Ser Ser
250 255
Ser
Al a Thr Thr Gly Cys Leu Val
265
270
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Pro
Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser
275 280 285
Cys
Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe
290 295 300
Tyr
Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro
305
310 315 320
cys
Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
325 330 335
Tyr
Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys
340 345 350
Arg
Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
355 360 365
Leu
Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
370 375 380
Gly
Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
385
390 395 400
Al a
Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
405 410 415
Cys
Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Gl u Arg Ala Asp Pro
420 425 430
Cys
Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe
435 440 445
Ser
Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys
450 455 460
Glu
Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro
465
470 475 480
Pro
Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala
485 490 495
Leu
Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Al a Gly Ala Ala
Leu
Leu
Leu
500 505 510
Val
Hi s Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu
515 520 525
Leu
Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val Hi s Ala Leu Pro Asp Ala
Leu
530 535 540
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Asn
Asn
Leu Arg Thr Gln Gl u Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser
545
550 555 560
Val
Asp Trp Asn Arg Pro Gl u Asp Val Asp Pro Gl n Gly Ile Tyr
Val
565 570 575
Ile
Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Val Ala Thr Pro Leu Phe
580 585 590
Pro
Pro
Leu His Thr Gly Arg Ala Gly Gln Arg Gl n His Leu Leu Phe
595 600 605
Pro
Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser Val Lys
610 615
<210> 4
<211> 587
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met
Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gl n Thr Val Ile Leu
1
5 10 15
Ala
Leu Ile Phe Leu Pro Gl n Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu
20 25 30
Gln
Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser
35 40 45
Pro
Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu
50 55 60
Lys
Pro Gly Leu Ser Glu Gl u Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly
65
70 75 80
Ala
Ala
Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Gl u Gln Pro Gly
Ala
85 90 95
Pro
Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe
100 105 110
Arg
Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp
Arg
115 120 125
Glu
Gl u Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala
130 135 140
Arg
Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Al a Gly Gly Pro Trp Ala
Arg
145
150 155 160
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Asp
Ile Gln Arg Ala Gly Ala Q_ L. 1- Glu Leu Arg Phe Ser S_ 1- Arg Ala
165 170 175
Arg
Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Al a Cys Thr Arg Leu Cys
Arg
180 185 190
Pro
Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala
195 200 205
Pro
Leu Glu Asp Glu Cys Gl u Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys
210 215 220
Ser
Pro Glu Hi s Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Gl u Cys Arg Cys Leu
225
230 235 240
Glu
Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser
245 250 255
cys
Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Al a Thr Thr Gly Cys Leu Val
260 265 270
Pro
Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser
275 280 285
Cys
Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe
290 295 300
Tyr
Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro
305
310 315 320
Cys
Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
325 330 335
Tyr
Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys
340 345 350
Arg
Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
355 360 365
Leu
Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
370 375 380
Gly
Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
385
390 395 400
Al a
Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
405 410 415
Cys
Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Gl u Arg Ala Asp Pro
420 425 430
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
cys
Ala Ala Arg Pro Cys Ala His
435 440
Ser
Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala
450 455
Glu
Phe Pro Val His Pro Asp Gly
465
470
Pro
Gly Leu Arg Pro Gly Asp
Pro
485
Leu
Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly
500
Val
Hi s Val Arg Arg Arg Gly His
515 520
Leu
Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser
530 535
Asn
Asn
Leu Arg Thr Gln Gl u Gly
545
550
Val
Asp Q_ L. 1- Asn Arg Pro Gl u Asp
565
Ile
Ser Ala Pro Ser Ile S_ 1- Ala
580
Gly
Gly
Arg Cys Tyr 445 Ala His Phe
Pro
Gly Tyr Met 460 Gly Ala Arg Cys
Ala
Ser Ala 475 Leu Pro Ala Ala Pro 480
Gln
Arg 490 Tyr Leu Leu Pro Pro 495 Ala
Val 505
Al a Gly Ala Ala Leu 510 Leu Leu
Ser
Gln Asp Ala Gly 525 Ser Arg Leu
Val
Hi s Ala Leu 540 Pro Asp Ala Leu
Ser
Gly Asp 555 Gly Pro Ser Ser Ser 560
Val
Asp 570 Pro Gl n Gly Ile Tyr 575
Val
Arg 585
Glu Ala
<210> 5 <211> 1686 <212> ADN <213> Mus :
<400> 5 gctggtgtct
cgctccccct
ggagtctccc
gtcccggtct
ctcgtacgtg
tggagagagc
gtcggccgta
acatgggagt
tgcgcgcgcc
tgcacgccat
gagcacggct
P-
tcgagctaca
gcaacgcccg
aggaggccac
atacggagca
tgcccttccg
agctgggaga
gacgcctggc
tgcacttctc
tgtgccgctc
tcccagacga
actgtgaaga
aattcattct
aggcccttgc
cgagtccctg
ccccggagag
cgatgcttgg
gcatgctgga
ggctgggggc
ctaccgcgcg
acgcagtgcc
gtgcgaagcc
gcctgatgaa
ttcgggccag
cgcctcttct
tgcgccctgg
tcagcggctg
ccgggcacct
gggcccgcct
ccgtgggccc
cggtgcgagc
ccctcgcggt
ccgtctgtgt
tgccgttgcc
gcccaggcct
tcagggtctg
gcgcagcact
ccctgccgct
tctccctcgt
ggaacctgct
gcgatgtgca
cgcccgccgt
gtggcccggg
gtcgaccagg
tggagggctg
cgggacccca
cctgaagccc
gagcacgagc
gcctgatggc
cattgaaacc
agcacgtgtg
gcgcacaggc
cggggccgcc
actgcgaccc
ctgcagcccc
gactggaccc
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1686
ctctgcacgg
agcactggat
ggcagctgta
cttcgatgtg
tgtgttggcg
ggctctaact
ctctgcctgg
cgctgcgagc
gtggagggcg
cgagaacgcg
cacttctctg
gctgtgcgcc
gatccacagc
ggcgccgcac
cgcctgcttt
ctgaggttac
gaagatggag
gcctga
tccctgtctc
gccttttacc
gtgaaacctc
aggtgagcgg
gtgaagatcc
gtgagaagag
acctgggcca
acgacctgga
gcggctcgcg
ccgacccctg
gcctggtctg
cggacggcgc
gctttcttct
tcttggtcat
ctgggacccg
aagacggtgc
actctagatc
caccagtagc
tgggcctgga
tggctccttt
ggtcacgtgc
tgactctgcc
ggtggaccgc
cgcgttgcgc
cgactgcgcc
ccgctgctcc
cgcctcccgc
cgcctgcgcg
ggacgcggtg
gcctcccgcc
ccacgttcgc
ggagccttcg
tggggatggc
catttatgtc
tgcctgaact
ccttgtgatg
gaatgtgcct
gcagatggac
tatgtctgtc
tgtagcctgc
tgccgctgtc
ggccgcgcct
tgtgcgctgg
ccctgcgcgc
cccggctaca
cccgccgccc
ttggggctgc
cgccgaggtc
gtccacacgc
cccagttcgt
ataccagccc
ccagggttcc
ggaacccatg
gtccccgggg
cctgcttcaa
attgcccacc
agccatgtca
gcgcgggatt
gtgccaacgg
gcttcggcgg
atggaggccg
tgggcgtgag
cgcggggcct
tggtggccgc
ctggccagga
tcccggatgc
cggctgactg
cttccattta
tggtcctgcc
tgccaatggg
attctacggg
tggcggcttg
tggtttccaa
gaatggcggc
cgccgggccg
cggcacgtgc
gcgcgactgc
ttgctacgcc
atgcgagttc
gaggcaggcg
cggtttggct
taccgggact
actcaacaac
gaatcatcct
tgcacgagag
<210> 6 <211> 561 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 6

Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile 1 5
Leu Gly Thr Pro Arg Ser Pro Cys 20

Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro 35 40

Ser Leu Cys Ala Leu Gly Ala Ala 50 55

Thr Glu His Pro Gly Glu Ser Ala 65 70
Leu Val Arg Val Pro Phe Arg Asp 85
Val Ile Glu Thr Trp Arg Glu Gln
His
Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly
10 15
Asn
Al a Arg Gly Pro Cys Arg Leu
25
30
Gly
Val Ser Gl n Glu Ala Thr Glu
45
Leu
Ser Thr Ser Val Pro Val Tyr
60
Ala
Al a Leu Pro Leu Pro Asp Gly
75 80
Ala
T rp Pro Gly Thr Phe Ser Leu
90 95
Leu
Gly Glu His Ala Gly Gly Pro
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
100 105 110
Al a
Trp Asn Leu Leu Ala Arg Val Val Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala
115 120 125
Gly
Gly
Pro Trp Ala Arg Asp Val Gln Arg Thr Gly Thr Trp Glu Leu
130 135 140
Hi s
Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Ala Ala
145
150 155 160
cys
Ala Arg Leu Cys Arg Ser Arg Ser Al a Pro Ser Arg Cys Gly Pro
165 170 175
Gly
Leu Arg Pro Cys Thr Pro Phe Pro Asp Glu Cys Glu Ala Pro Ser
180 185 190
Val
Cys Arg Pro Gly Cys Ser Pro Glu Hi s Gly Tyr Cys Glu Glu Pro
195 200 205
Asp
Gl u Cys Arg Cys Leu Gl u Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val
210 215 220
Pro
Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Asn Ser Arg Val Pro Gly Pro Ala
225
230 235 240
Ser
Thr Gly Cys Leu Leu Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro
245 250 255
Cys
Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Ser Gly Ser Phe Glu
Cys
260 265 270
Ala
Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Gl u Val Ser Gly Val
275 280 285
Thr
Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly
290 295 300
Glu
Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Val Cys Hi s Cys Pro Pro Gly Phe Gln
305
310 315 320
Gly
Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys
325 330 335
Gln
Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg
340 345 350
Cys
Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp
355 360 365
Cys
Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
60
120
180
240
300
360
370
375
380
Gly
Ser Arg Arg Cys Ser Cys Ala
385
390
Arg
Gl u Arg Ala Asp Pro Cys Ala
405
Arg
Cys Tyr Ala Hi s Phe Ser Gly
420
S_ 1-
Met Gly Val Arg Cys Gl u Phe
435 440
Ala
Val Pro Ala Ala Pro Arg Gly
450 455
Phe
Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly
465
470
Gly
Ala Ala Leu Leu Val Ile His
485
Asp
Thr Gly Thr Arg Leu Leu Ser
500
Thr
Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn
515 520
Asp
Gly Pro Ser Ser Ser Ala
Asp
530 535
Ser
Arg Ser Ile Tyr Val Ile Pro
545
550
Al a
<210> 7 <211> 1794 <212> ADN
<213> Macaca fascicularis <400> 7
ccccaagcca ggcccgctgg cgtgttcgaa ggacccggag cccctagaag cccttgttcc gtctgcctga agcctggcct gagcgaggag gccctcagcg ctaggggccc tgtctacacc cctctcccta acggcctgct gcaggtgccc ctcatcatcg agacctggag ggaggaactc
Leu
Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys
395 400
Ser
Arg Pro Cys Ala His Gly Gly
410 415
Leu
Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly
425
430
Ala
Val Arg Pro Asp Gly Ala Asp
445
Leu
Arg Gl n Ala Asp Pro Gl n Arg
460
Leu
Leu
Val Ala Ala Gly Leu Ala
475 480
Val
Arg Arg Arg Gly Pro Gly Gl n
490 495
Gly
Thr Arg Gl u Pro Ser Val His
505
510
Leu
Arg Leu Gl n Asp Gly Ala Gly
525
Q_ L. 1-
Asn His Pro Glu Asp Gly Asp
540
Ala
Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu
555 560
ctgcagatcc atagcttcgg ccctggccct gctagaggcc cctgcagact gttcttcaga gctgctgaga gcccttgtgc tctgggagct gagcaacctg aggctcccgc tcccgatctg ttcagggatg cttggcccgg aaccttcagc ggagaccaga ttggaggacc cgcctggtcc
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1794
ctgctcgcta
atccagagag
gccgtgggca
cccggactca
gccggatgca
ggctggaccg
ggcccttcct
ccttgtgcca
aggggctttt
tttaatggag
ccccccggct
tgtagaaatg
ggattcgccg
aatggaggaa
ggcggaagag
ggaaggtgct
gctaggtgcg
ggactgagac
gctgctggag
caggatgctg
gacgccctca
gactggaaca
atctatgcca
cagagacaga
<210> 8 <211> 597 <212> PRT
gagtgacaag
ctggcgcctg
ccgcttgtac
gaccttgcgc
gcctcgagca
gccctctctg
ccgctacaac
acggaggctc
acggcctcag
gactctgcgt
ttcagggctc
gcggcctctg
gacccaggtg
catgtgtgga
actgcagaga
acgcccattt
agtttcccgt
ctggagatcc
tcgctggagc
gaagcagact
acaacctgag
gacctgagga
gggaggtcgc
acctgctctt
aagaagaagg
ggagctcagg
caggctgtgt
tcctctcgag
cggcttctgt
tatggtgcct
cggatgtctg
ctgtagcgag
atgcgaggtc
gggaggagcc
caactgcgag
cctggatctg
cgagcatgat
aggaggcgga
gagggctgac
ctccggactc
ccaccctgat
tcagagatac
cgctctcctc
gctggccgga
gacccaggag
tgtggactcc
catgcccctc
cccctacccc
ctggctgctg
ttcagctaca
aggcccagat
gacgagtgtg
gagcagcctg
gtctccacct
gtccctggac
acccccggaa
agcggagtca
gaccctgata
aagagggtcg
ggacatgctc
ctcgacgatt
gcccacagat
ccttgtgccg
gtgtgcgcct
ggagtcagcg
ctgctccctc
ctgggacacg
acacccgagc
ggccctggag
aggggcatct
tttcctcctc
agcagcatcc
gcggaccttg
gggccagatg
ccgccccttc
aagctcctcc
gcgaatgtag
cctcctgtct
ctggaccttg
gctttgaatg
catgcgccga
gcgcttacat
acaggtgctc
tcaggtgcag
gtgctggcag
gcagctgcgc
ccaggccttg
gcgcccctgg
ctctccctgc
ctgccctcgg
tcaggagaag
cttccgtcca
atgtgcctag
acgtgatcag
tgcatacagg
tgtccgtgaa
ggctagagat
tgagctccct
cagatgtggc
cgtctgtagg
gtgcctcgaa
cggactgagg
cgacggaaac
tacctgcccc
cggaccctgc
ctgtcactgt
cctgcaaccc
atgtagagct
ggcctgcgct
tctcggcttc
tgctcatggc
atatatgggc
cgctcctcct
actcctggtc
aggccacgcc
tgccctgcct
cagctccgtc
cgccccctcc
cagagccggc
gtga
<213> Macaca fascicularis <400> 8
Pro Gln Ala Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu 1 5 10
Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser 20 25
Gly Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu 35 40
Gln Ile His Ser Phe 15
Pro Cys Ser Ala Arg 30
Lys Pro Gly Leu Ser 45
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Glu
Gl u Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala
50 55 60
Arg
Gly Pro Val Tyr Thr Gl u Gln Pro Glu Ala Pro Ala Pro Asp Leu
65
70 75 80
Pro
Leu Pro Asn Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp
Pro
85 90 95
Gly
Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Thr T rp Arg Gl u Glu Leu Gly Asp
100 105 110
Gln
Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Thr Arg Arg
115 120 125
Arg
Arg
Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Al a Arg Asp Ile Gln Arg Ala
130 135 140
Gly
Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Leu Pro
145
150 155 160
Al a
Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro
165 170 175
Ser
Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu
180 185 190
cys
Gl u Ala Pro Pro Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Leu Glu Hi s Gly
195 200 205
Phe
Cys Glu Gln Pro Gly Gl u Cys Arg Cys Leu Gl u Gly Trp Thr Gly
210 215 220
Pro
Leu Cys Met Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Gly Leu Arg
225
230 235 240
Gly
Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro
245 250 255
Cys
Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro
260 265 270
Gly
Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys
275 280 285
Glu
Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly
290 295 300
Leu
Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys
305
310 315 320
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Pro
Pro
Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys
325 330 335
Ser
Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His
340 345 350
Al a
Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu
355 360 365
Hi s
Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Al a Cys Ala Asn Gly Gly Thr
370 375 380
cys
Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe
385
390 395 400
Gly
Gly
Arg Asp Cys Arg Gl u Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro
405 410 415
cys
Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala Hi s Phe Ser Gly Leu Val Cys
420 425 430
Ala
Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys Gl u Phe Pro Val His
435 440 445
Pro
Asp Gly Val Ser Ala Leu Pro Ala Al a Pro Pro Gly Leu Arg
Pro
450 455 460
Gly
Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly Leu Leu Val
465
470 475 480
Ala
Ala
Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu Gly His Val Arg Arg
485 490 495
Arg
Gly His Ala Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu Leu Ala Gly Thr Pro
500 505 510
Glu
Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Al a Leu Asn Asn Leu Arg Thr
515 520 525
Gln
Gl u Gly Pro Gly Asp Val Pro Ser Ser Ser Val Asp Trp Asn Arg
530 535 540
Pro
Gl u Asp Val Asp Ser Arg Gly Ile Tyr Val Ile Ser Ala Pro Ser
545
550 555 560
Ile
Tyr Ala Arg Glu Val Ala Met Pro Leu Phe Pro Pro Leu His Thr
565 570 575
Gly
Arg Ala Gly Gln Arg Gl n Asn Leu Leu Phe Pro Tyr Pro Ser Ser
580 585 590
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ile Leu Ser Val Lys 595
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gln Pro Gly Ala Pro 1 5
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2)
<223> cualquier aminoacido
<400> 10 Gly Xaa Arg Pro 1
<210> 11
<400> 11 000
<210> 12
<400> 12 000
<210> 13
<400> 13 000
<210> 14
<400> 14 000
<210> 15
<400> 15 000
<210> 16
<400> 16 000
<210> 17 <400> 17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 18
<400> 18 000
<210> 19
<400> 19 000
<210> 20 <211> 108 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 20
Gln
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Ser Leu Gly
1
5 10 15
Glu
Arg Val Thr Met Thr cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr
Leu Hi s Trp Tyr Gln Gl n Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Q_ L. 1-
35 40 45
Ile
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Ser S_ 1- Phe Phe Thr Ile Ser Ser Met Glu
65
70 75 80
Ala
Gl u Asp Ala Ala Thr S_ 1- S_ 1- Cys Hi s Gln S_ 1- His Arg Ser Pro
85 90 95
Phe
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Lys Ile Arg
100 105
<210> 21 <211> 123 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 21
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Gly Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 22 <211> 107 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Leu 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Met Leu Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 117 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 23

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Gly Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 24 <211> 106 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 24

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Arg Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
<210> 25 <211> 124 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 25

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Val Asn Tyr Val Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 26 <211> 112 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 26
Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
5
10
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95

Lys His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
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Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

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Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

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Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

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Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 75 80

Leu Arg Ala Ala Asp Thr Gly Ile Tyr 90 95

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Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 10 15
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Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 40 45
Pro Gly Ile Ser Ser Arg Phe Ser Gly 60
Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 75 80
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Glu Ile Lys Arg 105
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

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Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile 35 40 45

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Glu Asp Phe Ala Asp His Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Phe 85 90 95
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100
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secuencia artificial: polipeptido sintetico"
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Ser Ser 120
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 10 15
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Lys
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secuencia artificial: polipeptido sintetico"
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Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 60
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 100 105
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
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Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Asn Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
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Gln
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu
Lys Val Thr Leu Thr cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Arg
20 25 30
Tyr
Leu Tyr Trp Tyr Gln Gl n Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Q_ L. 1-
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Ile
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Ser S_ 1- Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu
65
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Ala
Gl u Asp Ala Ala Ser S_ 1- Phe Cys Hi s Gln Q_ L. 1- Ser Asn Tyr Pro
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Leu
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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Gln
Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser
Gln
1
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Thr
Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
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Asn
Thr Gly Ile Gly Q_ L. 1- Ile Arg Gln Pro Ser Gly Thr Gly Leu Glu
5
10
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Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu 35 40 45

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Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

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Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

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Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30

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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

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Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Gly Thr 20 25 30

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Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

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Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Asp Tyr Asp Asn Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
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Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30

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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80
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Ser Ile Val Met Thr Gln Thr 1 5
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
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Leu Glu Ile Lys Arg 105
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 10 15
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Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Met Tyr 90 95
Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 105 110
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 10 15
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
5
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25
30
35
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50
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65
20
25
30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly 50 55 60

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Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

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Leu Gln Ile Ile Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Ile Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Phe 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Lys Ile Arg 100 105
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Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gln Ala Ile Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ser Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45

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Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln 35 40 45

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Lys
5
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20
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30
35
40
45
50
55
60
65
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<400> 92 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser 1 5
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65
50
55
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

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50
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60
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<400> 94
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Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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<400> 95
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Leu 1 5 10
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr 20 25
Trp Met Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly 35 40
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Thr Thr Gln Tyr 50 55 60
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Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 85 90
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Phe Ser Gly Ser
Met Glu Ala Glu 80
Asn Pro Tyr Thr 95
: polipeptido sintetico"
Arg Pro Gly Ala 15
Phe Ser Ser Tyr 30
Leu Glu Trp Ile 45
Asn Glu Lys Phe
Asn Thr Ala Tyr 80
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10
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20
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30
35
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50
55
60
65
Ser Ala
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<400> 96

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Asn Asn Pro Phe Thr 85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
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<400> 97

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

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<400> 98

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Ile Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60

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Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95

His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
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10
15
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65

Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Ala Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Arg Ile Arg Asn Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95

Tyr Cys Val Phe Tyr Tyr Asp Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala 115
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Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Asn Val Leu Ile 35 40 45

Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Met Pro Leu 85 90 95
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5
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35
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55
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65
100
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<400> 101

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Ala Ile Phe Pro Gly Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
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<400> 102

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser 1 5
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Ala Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Val Ala Tyr Tyr Ser Asn Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115
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<400> 130

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ser Arg Ser Gly Ser Gln Phe 65 70
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100
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<400> 131
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser 1 5
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys 20
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Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys 65 70
Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp 85
Pro Ala Tyr Tyr Arg Tyr Gly 100
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<400> 132
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser
Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 75 80
Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr 90 95
Leu Glu Ile Lys Arg 105
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 10 15
Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Trp Met Gln 25 30
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile 40 45
Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys 60
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu 75 80
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 90 95
Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 105 110
Ser
120
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
1
5
10
15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

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Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys 85 90 95

Ala Asn Met Arg Pro Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
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10
15
20
25
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55
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Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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<400> 135

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Thr Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Ile Val Asp Thr Ser Ser 65 70 75
Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 85 90
Ala Arg Ser Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp 100 105
Ser Val Thr Val Ser Ser 115
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<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 1 5 10
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 20 25
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 35 40
Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Met Lys Ile Asn 65 70 75
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Thr Tyr 85 90
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
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<400> 137
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu 1 5 10
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Gln Gly Thr 110
: polipeptido sintetico"
Ala Ser Val Gly 15
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Arg Phe Ser Gly
Ser Met Gln Pro 80
Asp Val Pro Leu 95
: polipeptido sintetico"
Lys Pro Gly Ala 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Lys Gln Lys Phe 50 55 60

Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser 115
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<400> 138

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30

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Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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<400> 139

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

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Leu Thr Val Ser Ser 115
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<221> fuente
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<400> 140

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

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5
10
15
20
25
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35
40
45
50
55
60
65
50
55
60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 65 70
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 85
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100
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<400> 141
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser 1 5
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr 20
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln 35
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn 50 55
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr 65 70
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr 85
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Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 75 80
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr 90 95
Glu Ile Lys Arg 105
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15
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Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val 105 110
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secuencia artificial: polipeptido sintetico"
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 142

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 143

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

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Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Asp Val Tyr Asp Gly Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110
5
10
15
20
25
30
35
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45
50
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65
Leu Thr Val Ser Ser 115
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<221> fuente
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<400> 144

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser 20 25 30

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Asp Tyr Ser Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 145

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Arg Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn 20 25 30

Gly Val Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Leu Gly Val Leu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe 50 55 60
5
10
15
20
25
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35
40
45
50
55
60
65
Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Tyr Lys 65 70 75
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala 85 90
Ala Arg Asn Asn Asn Arg Tyr Gly Ala Met Asp Tyr 100 105
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 146
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Val Ser Gln Asn 20 25
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro 35 40
Gln Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln 85 90
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 147 <211> 117 <212> PRT
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<400> 147
Ser Gln Val Phe 80
Ile Tyr Tyr Cys 95
Trp Gly Gln Gly 110
: polipeptido sintetico"
Ala Ser Leu Gly 15
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Ser Leu Gln Pro 80
Ser Tyr Pro Phe 95
: polipeptido sintetico"
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Pro Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30

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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 148

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95
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5
10
15
20
25
30
35
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65
100
105
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 149
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser 1 5
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 20
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<221> fuente
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<400> 150
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser 1 5
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys 20
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15
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secuencia artificial: polipeptido sintetico"

Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 10 15

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 25 30

Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 50 55
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Lys Arg
<210> 151 <211> 117 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 151
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser 1 5
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 20
Asn Met Tyr Trp Val Met Gln 35
Gly Tyr Val Asp Pro Tyr Asn 50 55
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 65 70
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Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 152 <211> 107 <212> PRT
<213> secuencia artificial
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 75 80
Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 105 110
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15
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Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 60
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<220>
<221> fuente
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<400> 152

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 153

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ile Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Met 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
5
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<213> secuencia artificial <220>
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<400> 154

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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10
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50
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65

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Gly Thr Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser 115
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Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80

Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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65
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Gln Val Ala Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val 65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45

Ser Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80
5
10
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35
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50
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65
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Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 10 15
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His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
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65
20
25
30

Tyr Lys Ala Ser Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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<400> 161

Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser 20 25 30

Gly Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu 35 40 45

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Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80

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Cys Ala Leu Glu Gly Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
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Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser 1 5
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys 20
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys 35
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His 50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe 65 70
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 100
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<400> 163
Gln Val Gln Met Lys Glu Ser 1 5
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr 20
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Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly 50 55
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys 65 70
secuencia artificial
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secuencia artificial
Gly Pro Gly Leu Val 10
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Pro Pro Gly Lys Gly 40
Ser Thr Asn Tyr Asn 60
Asp Asn Ser Lys Ser 75
: polipeptido sintetico"
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: polipeptido sintetico"
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Ser Ala Leu Met
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10
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35
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65
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Asp Trp Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ala 115
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<400> 164

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Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105
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<400> 165
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp 20 25 30
5
10
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20
25
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35
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50
55
60
65

Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 50 55 60

Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys His Tyr Gly His Tyr Ala Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala 115
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<400> 166

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser Ile His Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

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Glu Asp Phe Gly Tyr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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20
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35
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65
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secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 167 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser 1 5
Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 20
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln 35
Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn 50 55
Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 65 70
Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr 85
Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Ala Arg Gly Val Tyr Asp Gly Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100
105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115
Ser 120
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secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 168 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser 1 5
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys 20
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Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
5
10
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20
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35
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45
50
55
60
65
65
70
75
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<400> 169

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30

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Ser Val Thr Val Ser Ser 115
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<400> 170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15
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10
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25
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35
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65

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45

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Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val Val Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80

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<400> 172

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

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<400> 173

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30

Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80
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Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
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<400> 174

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp His Ala 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45

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Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110
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<400> 175
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
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Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60

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Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Asn Ala Glu Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala 115
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<400> 176

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr 20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Asp Tyr Asp Tyr Ala Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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<400> 179
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<400> 180
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser
Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp 90 95
Leu Glu Ile Lys 105
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
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1
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Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

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Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

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Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45
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Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Phe Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30

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Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Ile 50 55 60

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Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95

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Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95

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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Phe Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60

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Val Ser Ser 115
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Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

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Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val 35 40 45

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Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Val Gly Asp Tyr Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45

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Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Thr Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

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Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

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Leu Gln Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Gly Ile Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
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<400> 198

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45
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35
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<400> 199
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser 1 5
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys 20
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln 35
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr 50 55
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser 65 70
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys 85
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Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 60
Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 75 80
Gln Glu Trp Ser Asn Asn Pro Leu Thr 90 95
Glu Leu Lys 105
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 10 15
Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr 25 30
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 40 45
Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 60
Leu Glu Thr Ser Ala Arg Ile Val Tyr 75 80
Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 90 95
Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 105 110
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
5
10
15
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50
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<400> 200

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Lys Ala Ser His Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Leu Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys 100 105
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<221> fuente
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<400> 201

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Phe 20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Ser Ala Leu Met 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Trp Glu Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
5
10
15
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30
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65
Thr Val Ser Ala 115
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<213> secuencia artificial <220>
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<400> 202
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Met Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75
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Pro Gly Gln
Ser Gly Val
Thr Leu Thr 80
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Leu Glu Ile 110
Lys Arg
<210> 203 <211> 117 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
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<400> 203
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
5
10
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20
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35
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Asn Met Tyr Trp Val Ser Gln Ser His Gly Lys Ser 35 40
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr 50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 65 70 75
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 85 90
Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Phe Asp Phe Trp Gly 100 105
Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 204 <211> 107 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 204
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser 20 25
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser 85 90
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 205 <211> 124 <212> PRT
<213> secuencia artificial
Leu Glu Trp Ile 45
Asn Gln Lys Phe
Ser Thr Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Gln Gly Thr Thr 110
: polipeptido sintetico"
Ala Ser Val Gly 15
Val Ser Tyr Met 30
Leu Leu Ile Tyr 45
Phe Ser Gly Ser
Leu Gln Pro Glu 80
Asn Pro Phe Thr 95
5
10
15
20
25
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45
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55
60
65
<400> 205

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ile Val Ser Phe Asp Asn Asp Val Val Ser Ala Met Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 206 <211> 107 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polipeptido sintetico"
<400> 206

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe 85
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser 1 5
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 20
Trp Ile His Trp Ile Arg Gln 35
Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr 50 55
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr 65 70
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 85
Ala Arg Gly Gly Ser Asn Phe 100
Val Thr Val Ser Ser 115
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 208
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser 1 5
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys
Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Pro 90 95
Leu Glu Ile Lys 105
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 25 30
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 40 45
Val Tyr Thr Glu Phe Asn Gln Asn Phe 60
Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 75 80
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 105 110
secuencia artificial: polipeptido sintetico"
Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 10 15
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
20
25
30

Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Thr Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Val Asn Tyr Tyr Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
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25
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35
40
45
50
55
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65
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ala Arg Ile Gly Gly Asn Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser 115
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 213 <211> 118 <212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 213
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Gly
Met Asn Q_ L. 1- Val Arg Gl n Ala Pro Gly Gl n Gly Leu Glu Q_ L. 1- Met
35 40 45
Gly
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys
Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Gl u Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val S_ 1- Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp S_ 1- Q_ L. 1- Gly Gl n Gly Thr
100 105 110
Leu
Val Thr Val Ser Ser
115
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<400> 219 000
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50
55
60
65
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caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgtat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccaacaaaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttattttt tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccatt cacgttcggc 300

gcggggacaa agttgaaaat aagac 325
<210> 221 <211> 369 <212> ADN
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caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180

tataacccag ccctgaagag ccgactaact atctccaagg atacctccag cagccaggta 240

ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300

gctgactatg gcggagatta ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360

gtctcctca 369
<210> 222 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 222

gatatccaga tgacacagac tacatcttcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg cgtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcta 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtgatatgc ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 223
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaggatat 180

gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tcggtacgac 300

gggtatgcta tggactattg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 224 <211> 319 <212> ADN
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<221> fuente
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<400> 224

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagaaacc cgctcacgtt cggggctgga 300

accaagctgg agctgaaac 319
<210> 225 <211> 372 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 225

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag gagagggtct agagtggctg gcagacattt ggtgggatga caataagtac 180

tataacccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag caaccaggta 240

ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgctcgaaga 300
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
gttaactatg tttacgaccc gtactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
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aacattatga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact 60

atgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc 120

tggtaccaac agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc 240

atcagcactg tacaagttga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaac 337
<210> 227 <211> 357 <212> ADN
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<221> fuente
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<400> 227

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctataaaa tgcactgggt gaagcaaagc 120

catgtaaaga gccttgagtg gattggacgt attaatcctt acaatggtgc tactagctac 180

aaccagaatt tcaaggacaa ggccaccttg actgtagata agtcctccag cacagcctac 240

atggacctcc acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaggggac 300

tataggtacg actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 228 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 228
gaaatccaga tgacccagtc tccatcctct atgtctgcat ctctgggaga cagaataacc 60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

gggaaacccc cttcattcct gatctattat gcaattgaac tggcagaagg ggtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagac tattctctga caatcagcaa cctggagtct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacag ttttatgagt ttccgttcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 229 <211> 363 <212> ADN
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<221> fuente
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<400> 229

caggcccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacttga tagagtgggt aaagcagagg 120

cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaactggtgg tactaactac 180

aatgagaact tcaagggcaa ggcaactctg actgcagaca aatcctccag tactgcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtgc aagatccccc 300

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tca 363
<210> 230 <211> 410 <212> ADN
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<221> fuente
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<400> 230

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcat cccccaaact ctggatttat agcacttcca acctggcttc tggagtccca 180

actcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccatt cacgttcggc 300

tcggggacaa agttggaaat aaaaccagca tggaggctga agatgctgcc acttattact 360

gccaccagta tcatcgttcc ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg 410
<210> 231 <211> 360 <212> ADN
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<221> fuente
5
10
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35
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45
50
55
60
65
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caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagt cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180

tataacccag tcctgaagag ccgactgact atctccaagg atacctccag cagccaggta 240

ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactattg tgctcgatta 300

gttgatgatc tgtactactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
<210> 232 <211> 337 <212> ADN
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<400> 232

gatgttgaga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctca gacagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

atgtttcaga ggccaggccg gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tactattgct ggcaaggtaa acattttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaac 337
<210> 233 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 233
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactgttga gccaacatat 180 gcagatgact tcatgggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgccttt 240 ttgcagatca acaacctcga aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tagatttggt 300 tcctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
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<400> 234

caaattgttc tcacccagtc tccagcactc gtgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaaaccaaga 120

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ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

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acaaagttgg aaataaaac 319
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 235

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgg 120

cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180

tataacccag ccctgaagag ccgactgact atctccaagg atacctccag cagccaggta 240

ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgcata 300

gtttcctttg ataacgacgt tgtctctgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accgtctcct c 371
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 236

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctggctgcat ctgtgggaga aactgtcgcc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaacatttac tacaatttag catggtatca gcagaaacaa 120

gggaaatctc ctcagctcct gatctatact gcaaacagtt tggaagatgg tgtcccatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacacag tattctttga agatcaacag catgcagcct 240
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10
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ggcaccaagc tggaaatcaa ac
322
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<400> 237

caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgtaagg cttctggcta cacctttact cgctactgga tacactggat aaaacagagg 120

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aatcagaact tcaaggacaa ggccactttg actgcagaca aatcctccac cacagcctcc 240

atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaggcggt 300

agtaacttct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 238 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 238

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctttgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca gaatattatc aattatttaa actggtatca gcagaagcca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

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gaagatattg ccacttacta ttgtcaacag tatagtgagc gtccgtacac gttcgggggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acg 323
<210> 239 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 239
gaagtgaagc tggaggagtc aggaggaggc ttggtacaac ctggagaatc catgaaactc 60
tcttgtgctg cttctggatt cacttttagt gatgcctgga tggactgggt ccgccagtct 120
5
10
15
20
25
30
35
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55
60
65
tattatgctg agtctgtgaa agggaaattc accatctcaa gagatgattc caaaagtaga gtgtacctgc aaatgaacaa cttaagagct gcagacactg gcatttatta ctgtacggcc 300
tatagtaact ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctac a 351
<210> 240 <211> 320 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 240

gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60

ttcacttgca aggcaagcca agacattcac aagtatgtag cttggtacca acacaagcct 120

ggaaaaggtc ctaggctgct catacattac acatctacat tacagccagg catctcatca 180

aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240

gaagatattg caacttatta ttgtctacag tataataatc tgtacacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaacg 320
<210> 241 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 241

gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacagccttt tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgaaaagg gcctggagtg gattgggtgg attgatcctg aggatggtga aactaaatat 180

gccccgaact tccaggacaa ggccactata actacagact catcctccaa cacagcctac 240

ctgcaactca tcagcctgac atctgttgac actgccatct attactgtgc ctatggtaac 300

tacgtgcggc actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 242 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 242
gaaatccaga tgacccagtc tccatcctct atgtctgcat ctctgggaga cagaataacc 60
5
10
15
20
25
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50
55
60
65

atcacttgcc aggcaactca agacattgtt aagaatttaa actggtatca gcagaaacca gggaaacccc cttcattcct gatctattat gcaactgaac tggcagaagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagac tattctctga caatcaggaa cctggagtct 240

gaagactttg cagaccatta ctgtctacag ttttatgagt ttccgttcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 243 <211> 363 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 243

caggtccagt tgcagcagtc tggaactgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgagggtg 60

tcctgcaagg cttctggata cgccttcggt aatcacttga ttgagtgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaactggtgg tactcactac 180

aatgagaagt tcaaggacaa ggcaagactg accgcagaca aatcctccaa cactgcctac 240

atgcacctca acagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtgc aagatccccc 300

tatgattacc acgagggtgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363
<210> 244 <211> 339 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 244

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtagca atcaaaagaa ttatttggcc 120

tggtatcagc aggaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatcctttgc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240

atcagcggtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaaca ttatagcatt 300

ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 245 <211> 372 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
5
10
15
20
25
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35
40
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55
60
65
<400> 245

caggttcagc tacaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctcctgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggaaagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga tactaactac 180

aatgggaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct acttctgtgc aatgggtatt 300

tataactacg atggtagccg ttactattct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accgtctcct ca 372
<210> 246 <211> 315 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 246

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattaag aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaacccct gatctactac acatcaagag tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccagcag ggttatacgc ttccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaa 315
<210> 247 <211> 360 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 247

caggtccagc tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgtaagg cttctggata caccttcact acctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tacttactac 180

aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtgc aagaggggac 300

tatggtaacc cctatgctat ggactactgg ggtcaaggat cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 248
5
10
15
20
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60
65
<211> 325 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 248

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctcctgggga gaaggtcacc 60

ttgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tccaggtact tgtactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccct 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcataatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgcctctta tttctgccat cagtggagta attacccact cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaac 325
<210> 249 <211> 372 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 249

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctaata cgggcatagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggacgggtct ggagtggctg gcacacattt ggtggaatga tgataagtac 180

tataatccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg aaacctccaa caaccaggta 240

ttcctcaaga tcaccaatgt ggacactgca gatactgcct catacttctg tgttcaaatc 300

gggcgcgact acagtaacta cgcctggtat ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372
<210> 250 <211> 319 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 250

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgactca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
5
10
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20
25
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55
60
65
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg accaagctgg agctgaaac
319
<210> 251 <211> 372 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 251

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag gagagggtct agagtggctg acagacattt ggtgggatga caataagtac 180

tataacccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag caaccaggta 240

ttcctcaata tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgctcgaaga 300

gttaactatt attacgaccc gtactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accgtctcct ca 372
<210> 252 <211> 337 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 252

gatgttgaga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctca gacagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

atgtttcaga ggccaggccg gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tactattgct ggcaaggtaa acattttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaac 337
<210> 253 <211> 337 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 253
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
5
10
15
20
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60
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120
tcctgcaagg cttctggtta ttccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactgttga gccaacatat 180

gcagatgact tcatgggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgccttt 240

ttgcagatca acaacctcga aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tagatttggt 300

tcctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcag 337
<210> 254 <211> 320 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 254

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120

acttctccca aactctggat ttataccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacag tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtctttatc cgtacacgtt cggagggggg 300

accaaggtgg aaataaaacg 320
<210> 255 <211> 363 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 255

caggttcagc tacagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ccggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttcaggcta caccttcact gaccagtata taaactgggt gaagcagagg 120

actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcccg gaaggggtaa tacttactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagaggat 300

ggtggttacg acgatgcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360

gca 363
<210> 256 <211> 325 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
5
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<400> 256

caaattgttc tgacccagtc tccaacaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaact tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtttcatc gttccccatt cacgttcggc 300

tcggggacaa agttggaaat aaaac 325
<210> 257 <211> 360 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 257

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180

tataaaccag ccctgaagag ccgactgact gtctccaagg atacctccag caaccaggtt 240

ttcctcaaga tcgccactgt ggacgctgca gatactggca catactactg tgctcgaatc 300

gttgatggtc accccccgtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 258 <211> 337 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 258
gacattgtgc tgacccagtc tccactctct ctgcctgtca atattggaga tcaagcctct 60 atctcttgca agtctactaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120 tatttgcaga ggccaggcca gtctccacaa ttcctaatat atttggtttc taatcgattt 180 tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagta tattattgct tccagagtaa ctatcttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgagac 337
<210> 259 <211> 357 <212> ADN
5
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65
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 259

gaggtccaac tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcagt cgtttctata tgcactgggt gaagcaaagt 120

cctgaaaata gtcttgagtg gattggagag attaatccta gcactggggg tacaagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagata aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca agagcctgac atctgaagag tctgcagtct attactgtac taggggttac 300

gggagcaact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctccaca 357
<210> 260 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 260

agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60

ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120

gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacagtgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 261 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 261

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaggc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggata taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacgt acactggaga cccaacatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagaattggc 300
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<210> 262 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 262

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acg 323
<210> 263 <211> 363 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 263

tctgatgtgc agcttcagga gtcgggacct ggcctggtga aaccttctca gtctctgtcc 60

ctcacctgca ctgtcactgg ctactcaatc accagtgatt atgcctggaa ctggatccgg 120

cagtttccag gaaacaaact ggagtggatg ggctacataa gctacagtgg tagcactagc 180

tacaacccat ctctcaaaag tcgaatctct atcactcgag acacatccaa gaaccagttc 240

ttcctgcagt tgaattctgt gactactgag gacacagcca catattactg tgcaagattt 300

tactacggta gtagctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363
<210> 264 <211> 318 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 264
gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccgtga ctacaggaga aaaagtcact 60
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cgattctcca gcagtggcta tggcacaaat tttgttttta caattgaaaa cacgctctca gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataaca tgccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaata 318
<210> 265 <211> 352 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 265

caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcagtggtta tactgagtac 180

aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactaa gcagcctgac atctgaggac tcttcagtct attactgtgc aagaaagggt 300

agtaacaggg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tg 352
<210> 266 <211> 313 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 266

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtataaat tacatgcact ggtaccagca gaagccaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccatcagcgg agtacgtgga cgttcggtgg aggcaccaag 300

ctggaaatca aac 313
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 267
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
5
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65
120
tcctgcacag tttctggctt caacattaaa gacacctata tacactgggt gaagcagagg

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaccgacg 300

gggtactttg aatactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348
<210> 268 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 268

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctttgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggatgttatc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaaggt tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc taggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240

gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtgagc gtccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acg 323
<210> 269 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 269

gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaat ttggaggatc catgaaactc 60

tcttgtgctg cttctggatt cacttttagt gatgcctgga tggactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaaaca aagctaataa tcatgcaaca 180

tattatcctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtaga 240

gtgtacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtacgggt 300

tactcctcgt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 270 <211> 338 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
5
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15
20
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65
<400> 270

gatgttttga tgacacagtc tccactctcc ctgtctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgta gatctagtca gaacattgta cacagtgata gatacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtcgccaaaa ctcctgatat atggggtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tatgggagtt tattactgct ttcaaggtac acatgttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacg 338
<210> 271 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 271

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca actgctggaa tgcagtgggt gcaaaagatg 120

ccaggaaagg gttttaagtg gattggctgg ataaacaccc actctggaga gccaaaatat 180

gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttacagataa gcaacctcaa agacgaggac acggctacgt ttttctgtgc gcccctatgg 300

tccgatagta gttttgctta ctggggccaa ggaactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 272 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 272

gaaatccaga tgacccagtc tccatcctct atgtctgcat ctctgggaga cagaataacc 60

atcacttgcc aggcaactca agacattgtt aagaatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gggaaacccc cttcattcct gatctattat gcaactgaac tggcagaagg ggtcccagca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagac tattctctga caatcagcaa cctggagtct 240

gaagattttg cagactatca ctgtctacag ttttatgagt ttccgttcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 273 <211> 363 <212> ADN
<213> secuencia artificial
5
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65
<220>
<221> fuente
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<400> 273

caggtccagc tgcagcagtc tggagctgac ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggata ctccttcact aattacctga tagagtgggt aaagcagagg 120

ccaggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg aactcactac 180

aatgagaaat tcaaggacaa ggcagttctg actgcagaca aatcctccac tactgcccac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtgc aagatccccc 300

tatgattata acgatggtgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctct 360

tca 363
<210> 274 <211> 337 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 274

gatgttgttc tgacccagtc tccactctct ctgcctgtca atattggaga tcaagcctct 60

atctcttgca agtctactaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120

tatttgcaga ggccaggcca gtctccacaa ttcctaatat atttggtttc taatcgattt 180

tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagta tattattgct tccagagtaa ctatcttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgagac 337
<210> 275 <211> 357 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 275

gaggtccaac tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcagt cgtttctata tgcactgggt gaagcaaagt 120

cctgaaaata gtcttgagtg gattggagag attaatccta gcactggggg tacaagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagata aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca agagcctgac atctgaagag tctgcagtct attactgtac taggggttac 300
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<210> 276 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 276

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agttatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcga gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcaccag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgaat ttccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 277 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 277

caggttcaac tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctgggacttt agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta caccttcaca agctacgata taaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gacttgaatg gattggatgg atttatcctg gagatggtaa tactaagtac 180

agtgagaaat tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca ccagcctgac ttctgagaac tctgcagtct atttctgtgc aagagactat 300

gattaccctt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 278 <211> 319 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 278

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
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65
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcggacgtt cggtggaggc accaagctgg aaatcaaac
319
<210> 279 <211> 363 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 279

gaagtgcagc tggtggagtg tgggggatgc ttagtgaagc ctggagggta cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagtct 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcagaa atcagtattg gtggtagcta cacctactat 180

ccagacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagggagggc 300

tatgattacg acgtgagagc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363
<210> 280 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 280

gacatccaga tgattcagtc tccatcgtcc atgtttgcct ctctgggaga cagagtcagt 60

ctctcttgtc gggctagtca gggcattaga gggactttag actggtatca acagaaacca 120

aatggaacta ttaaactcct gatctactcc acatccaatt taaattctgg tgtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag cctagagtct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacag cgtaatgcgt atcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 281 <211> 357 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 281
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
5
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120
acgtgcgctg tctctggatt ttcattaacc agctttgcaa tacactggtt tcgcaagcct

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggactg gtggaaccac aaattataat 180

tcggctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag agacgattac 300

gacaataatt atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 282 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 282

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa actggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acg 323
<210> 283 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 283

gaggtgcagc ttgttgagtc tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60

tcatgtgcag tctctgcatt caccttcact acctacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg gtttggagtg ggttgctcgc ataagaaata aaagtaataa ttatgcaaca 180

tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240

ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaatt gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgttc 300

tactatgatt acgtctactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 284 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
5
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15
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<400> 284

agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60

ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag tatggtacca acagaagcca 120

gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180

cgcttcgctg gcagtggata tgggacggat ttctctttca ccatcagcac tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatacct ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcag ac 322
<210> 285 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 285

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatggcctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctct 240

ttgcagatca tcaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aaggatcggc 300

gatagtagtc cctctgacta ctgggggcag ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 286 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 286

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccatat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt atttttgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcattttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttacta ctgtcagcaa cattatggta ctccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tgaaaataag ac 322
<210> 287 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial
5
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<220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico
<400> 287

gaagtgaaac tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctaaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt agttatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga gactggagtg ggtcgcaacc attagcagtg gtggtagtta cacctattat 180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgtcaggga caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtttgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagacaggca 300

attgggacgt actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 288 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 288

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatcttcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaactt tagcagaagg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat cattatgatt ctccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgag ac 322
<210> 289 <211> 360 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 289

gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120

ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gcagtagtaa catctactat 180

gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240

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<400> 290

gatattgtga tgacacagtc tacatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60

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tggtaccagc aggaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatcctttgc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240

atcagcggtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaaca ttatagcatt 300

ccgctcacgt tcggtgctgg aaccaagctg gagctgaaac 340
<210> 291 <211> 360 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 291

gaggtcctgc tccaacggtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgacgata 60

ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaaat attaatactt acaatggtgg tactatctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agccctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagacgtcta 300

cggtatgggg gacactactt tgactactgg ggccaaggca ccgctctcac agtctcctca 360
<210> 292 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 292

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctttttaa gctggttcca gcggaaacca 120

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323
<210> 293 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 293

gaagtgatgc tggtagagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagcggtg gtggtgatca catctattat 180

ccagacagtg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagga caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt atgactgtgc aagagtgaga 300

gactggtact tcgatgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 294 <211> 316 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 294

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

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accaagctgg aaataa 316
<210> 295 <211> 342 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 295
caggttcagc tgcagcagtc tggaactgag ctgctgaggc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctactgga tggagtgggt aaagcagagg 120
5
10
15
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60
65
aatgagaagt tcaagggcaa ggccaccttc actgcagata catcctccaa cacagcctac atgcatctca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagagggact 300
aactctctct ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca 342
<210> 296 <211> 304 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 296

caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgtcacctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagcctaga 120

tcctccccca aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcgt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg aggaataacc cattcacgtt cggctcgggg 300

acaa 304
<210> 297 <211> 387 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 297

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg gcactcattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180

tataatccag ccctgaagag tcgactgact atctccaagg atgcctccag cagccaggtc 240

ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300

gcttcctatg attacgacgt agtctatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

agcgtctcct caaggtggaa ataaaac 387
<210> 298 <211> 328 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
5
10
15
20
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65

caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagtaact atgccaactg gatccaagaa 120

aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc tccaggtgtt 180

cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240

cagactgagg atgaggcaat atatttctgt ggtctatggt acagcaacca tttggtgttc 300

ggtggaggaa ccaaactgac tgtcctag 328
<210> 299 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 299

gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60

tcatgtgcag tctctgcatt caccttcact acctacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg gtttggagtg ggttgctcgc ataagaaata aaagtaataa ttatgcaaca 180

tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240

ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaatt gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgttc 300

tactatgatt acgtctactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 300 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 300

gaaacaactg tgacccagtc tccagcattc ctgtccgtgg ctacaggaga aaaagtcact 60

atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga actggtacca gcagaagcca 120

ggggaacctc ctaatgtcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 180

cgattctcca gcagtggcta tggcacagat tttgttttta caattgaaaa cacgctctca 240

gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataaca tgcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 301 <211> 363 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
5
10
15
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65
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico
<400> 301

caggtgcaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc aattacaata tgcactgggt aaagcagaca 120

cctggacagg gcctggaatg gattggggct atttttccag gaaatggtgg tacttcctac 180

aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca ccagtttgac atctggggac tctgcagtct attactgtgc aagatggggc 300

tacggtagtg gcctttatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363
<210> 302 <211> 320 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 302

gaaaatgtac tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga gaaggtcacc 60

atgagctgca gggccagctc aagtgtaaat tacatgtcct ggtaccagca gaagtcagat 120

gcctccccca aactatggat ttattacaca tccaacctgg ctcctggagt cccagctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gaactcttat tctctcacaa tcagcagcat ggagggtgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagttt actagttccc cgtacacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaacg 320
<210> 303 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 303

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180

aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagattgagg 300
5
10
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60
65
<211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 304

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga gagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggacattggt tatagcttaa actggcttca gcaggaacca 120

gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc acatccagtt tagattctgg tgtccccaaa 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240

gaagattttg tagactatta ctgtctacaa tatgctagtt ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 305 <211> 369 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 305

caggtgcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60

tcctgcaagg ctaatggcta cacattcagt agctactgga tagagtggtt aaggcagagg 120

cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtgataa tagtaattat 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggaa tctgccgtct attactgtac aaggggatta 300

cgacgagacg gctcatatta ctatgttatg gaacattggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360

gtctcctca 369
<210> 306 <211> 312 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 306

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaagcca 120

gggagatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180
5
10
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60
65
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgaat ttccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tg 312
<210> 307 <211> 357 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 307

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcggt cgctatgtca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagaaaaga aactggagtg ggtcgcatcc attactagtg gtggtactac ctactatcca 180

gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtaccta 240

caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag agtctactat 300

cattacgacg acatctttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 308 <211> 338 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 308

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300

tacacgttcg gaggggggac caagctgaaa ataaaacg 338
<210> 309 <211> 348 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 309
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc 120
5
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180
catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtgg tactagctac

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aaggggtccc 300

gcctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 310 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 310

gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga aaaagtcacc 60

atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga tctggtacca gcagaagcca 120

ggggaacctc ctaagctcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 180

cgattctcca gcagtggcta tggtacagat tttgttttta caattgaaaa catgctctca 240

gaagatgttg ccgattacta ctgtttgaaa agggatgact tgccttacac gttcggcggg 300

gggacacagg tggaaattaa acg 323
<210> 311 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 311

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggaggttc aaagaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacagta tgaactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga accttgagtg gattggactt attaatcctt acagtggtgg tactatctac 180

aaccagaaat tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaaggagt 300

gattacccgt tagtttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 312 <211> 325 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
5
10
15
20
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35
40
45
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60
65

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc ctgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

actcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcagaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtataatc gttccccgct cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaac 325
<210> 313 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 313

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctgtc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acttgcactg tctctgggtt ttcattaacc agctatggtg tacactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atttgggctg gtggaagtac aaattataat 180

tcagctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccaa acagggcaac 300

ttctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 314 <211> 319 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 314

gacatccaga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgcat ctctgggagg caaagtcacc 60

atcacttgca aggcaagcca agacattaag aagtatatag cttggtacca acacaagcct 120

ggaaaaggtc ctaggctact catacattac acatctacat tagagccagg catcccatca 180

aggttcagtg gaagtgggtc tgggagagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240

gaagatattg caacttatta ttgtctacaa tatgatattc tgtggacgtt cggtggaggc 300

accaagctgg aaatcaaac 319
<210> 315 <211> 363 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
5
10
15
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40
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50
55
60
65
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico
<400> 315

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggagcttc aatgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga accttgagtg gattggactt attaatcctt acaatggtgg tactacctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc attaggttac 300

tatggtaact acaggaggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360

tca 363
<210> 316 <211> 325 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 316

gaaaatgtgc tcacccagtc tccagcaata atggctgcct ctctggggca gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

tcaggcgctt cccccaaacc cttgattcat aggacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcgtggag 240

gctgaagatg atgcaactta ttactgccgg cagtggagtg gttacccgtg gacgttcggt 300

ggaggcacca agctggaaat caaac 325
<210> 317 <211> 357 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 317

caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctgtact agctactgga tgcagtgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggggct atttatcctg gagatggtga tactaggtac 180

actcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggggagg 300
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<211> 325 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 318

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtga gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag caacatggag 240

gctgaggatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccatt cacgttcggc 300

tcggggacaa agttggaaat aaaac 325
<210> 319 <211> 360 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 319

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctggatt ttcactgagc acttctggta tgggcgtagg ctggattcgt 120

cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180

tataacccag cccttaagag ccgactgact atctccaagg atgcctccag cagccaggta 240

ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gaaactgcca catactactg tgcccacatc 300

ctcgaccggg cttactactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtcacctca 360
<210> 320 <211> 334 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 320

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
5
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acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac
334
<210> 321 <211> 357 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 321

caagttactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtatagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180

tataacccat ccctgaagag ccagctcaca atctccaagg attcctccag aaaccaggtt 240

ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgctcgaaga 300

gggactgcgt actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210> 322 <211> 319 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 322

caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

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tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agcagtaatc cacccacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaac 319
<210> 323 <211> 345 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 323
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctgac cttgtgcagc cctcacagac cctgtctctc 60
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tcagctctaa aatctcgact gagcatcagc agggatacct ccaagaacca ggttttctta aaactgagca gtctgcaaac tgaagacaca gccatgtact actgtactag aggtgggacg 300
gggtttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 324 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 324

gacattgtga tgacccagtc gcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccatcc ggcacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 325 <211> 363 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 325

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagtg attaatccta gcaacggtcg tactaactac 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaagaagg 300

gaactgggaa ccctctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363
<210> 326 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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5
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65

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa ac 322
<210> 327 <211> 345 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 327

caggtgcaac tgaagcagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgttcatc 60

acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc agctatgaaa taaactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggactg gtggaagcac aaattataat 180

tcagctctca tatccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcct agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtaag aggtgtttat 300

gctatggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345
<210> 328 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 328

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag gctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta gtccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagg tggaaataaa acg 323
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
5
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65
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<400> 329

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact aactatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaaatac 180

aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccac cacagcctac 240

atggcgctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc agtagcctac 300

tatagtaact gggggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 330 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 330

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtagatc aggctcacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatggta ctccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acg 323
<210> 331 <211> 360 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 331
caggttcagc tggaggagtc aggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta tagctactgg atgcagtgga taaaacagag gcctggacag 120 ggtctggaat ggattggggc tatttatcct ggaaatggtg atactaggta cactcagaag 180 ttcaagggca aggccacatt gactgcagat aaatcctcca gcacagccta catgcaactc 240 agcagcttgg catctgagga ctctgcggtc tattactgtg caagatctcc ggcctactat 300 aggtacggcg agggctactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
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65
<213> secuencia artificial <220>
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<400> 332

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctctttc tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatactgcca cttattactg ccaggagtgg agtggtaatc cgctcacgtt cggtgatggg 300

accaagctgg agctgaaac 319
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 333

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccagcatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cgctgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctactt ttttctgtgc aaatatgagg 300

cccacgaggg ggtttgctta ctgggggcaa gggactctgg gcactgtctc tgca 354
<210> 334 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 334

aatattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60

ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120

gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctcctccgac gttcggtgga 300
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65
<210> 335 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 335

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctggg ctagtgagga ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggttactaca tgcactgggt caagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggatat attagttgtt acaatggtgc tactacctac 180

aaccagaact tcaagggcaa ggccacattt attgtagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagttca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatccgac 300

ggggggcatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 336

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctggctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaacatttac tacagtttag catggtatca gcagaagcaa 120

gggaaatctc ctcagctcct gatctataat gcaaacagct tggaagatgg tgtcccatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacacag tattctatga agatcaacag catgcagcct 240

gaagataccg caacttattt ctgtaagcag acttatgacg ttccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 337 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 337

gaggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacaaca tgaactgggt gaagcagagc 120

aatggaaaga gccttgagtg gattggaaat attgatcctt attatggtgg ttctagctac 180

aaacagaagt tcgagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
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atgcagctca agagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaggtggt 300
agtaacttct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
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<221> fuente
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<400> 338

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaacgacata tttgaattgg 120

ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaac 337
<210> 339 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 339

gacgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cccctactat 180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgtc 300

tatgatggtt actcctactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 340 <211> 320 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 340
caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
5
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tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc catacacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaacg 320
<210> 341 <211> 369 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 341

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagaa cttgtgaagc caggggcctc agtcaaattg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tacactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acaccagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaagctgg 300

cgaaactacg gtagtagttt ctggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360

gtctcctca 369
<210> 342 <211> 337 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 342

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaacgacata tttgaattgg 120

ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaac 337
<210> 343 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
5
10
15
20
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gacgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120

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ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgtc 300

tatgatggtt actcctactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
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<213> secuencia artificial <220>
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<400> 344

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca cgtccagtca gagtctgtta accagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240

atcagcagtt tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagtctc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac 334
<210> 345 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 345

caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc cgagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60

acctgcacag tctctggttt ttcattaact agcaatggtg tacactgggt tcgccagtct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg ctatggagtg gtggaagcac agactataat 180

gcagctttca tatccagact gagcatcagc aaggacaatt acaagagcca agttttcttt 240

aaaatgaaca gtctgcaagc taatgacaca gccatatatt actgtgccag aaataataat 300

aggtacggag ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
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<400> 346

gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

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ggaaatattc ctaaactatt gatccaaaag gcttccaact tgcacacagg cgtcccctca 180

aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa ac 322
<210> 347 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 347

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acttgcactg tctctgggtt ttcattaacc aactatggtg tacactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatgggctg gtggaatcac aaattataat 180

tcggctctca tgtccagact gagcatcagc gaagacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaatttaggt 300

ccctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
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<213> secuencia artificial <220>
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<400> 348

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

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gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

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tatgattacg ccgagggctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
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<213> secuencia artificial <220>
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<400> 350

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60

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ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac g 341
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 351

gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60

tcctgcaagg cttctggtta tgcattcact agctacaaca tgtactgggt gatgcagagc 120

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tataggtact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a
351
<210> 352 <211> 316 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 352

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120

acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataa 316
<210> 353 <211> 372 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 353

gaggtgcagc ttgttgagtc tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60

tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat acctacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaatta aaagtaataa ttatgcaaca 180

tattatgccg attcagtaaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaaacatg 240

ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag ccgtgtatta ctgtgtgaga 300

caaggctata gttacgactg gggaccctgg tttgcttact ggggccaagg gactctggtc 360

actgtctctg ca 372
<210> 354 <211> 320 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
5
10
15
20
25
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60
65
180

acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaacg 320
<210> 355 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 355

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgttttgggt tcgccagact 120

ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctacttt 180

ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgcccagaa caacctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagagccggg 300

accctctatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 356 <211> 325 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 356

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

actgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccctt cacgttcggc 300

tcggggacaa agttggaaat aaaac 325
<210> 357 <211> 366 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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5
10
15
20
25
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40
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65
caggttgctc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120 cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgtcaagcgc 180 tataacccag ccctgaagag ccgactgact atctccaagg atacctccag cagccaggta 240 ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaatg 300 gaggactacg gtagtagctc ctactttgac ttctggggcc acggcaccac tctcacagtc 360 tcctca 366
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 358

gacattcaga tgacccagtc tcctgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60

atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctcagctcct gatttctgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240

gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa ctttacagta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 359 <211> 369 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 359
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180 aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggggct 300 ctctactatg gtaactacct cgggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360 gtctcctca 369
<210> 360 <211> 321 <212> ADN
5
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65
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 360

gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120

ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccatct tacacacagg cgtcccatca 180

aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacttactc ctgtcaacag ggtcaaagtt atccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 361 <211> 355 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
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<400> 361

tctgatgtgc agcttcagga gtcaggacct gacctggtga aaccttctca gtcactttca 60

ctcacctgca ctgtcactgg ctactccatc accagtggtt atagctggca ctggatccgg 120

cagtttccag gaaacaaact ggaatggatg ggctacatac actacagtgg tagcactaac 180

tacaacccat ctctcaaaag tcgaatctct atcactcgag acacatccaa gaaccagttc 240

ttcctgcagt tcaaatctgt gactactgaa gactcagcca catattactg tgccctagag 300

gggaattacg acgggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctg 355
<210> 362 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 362

gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

atcacttgcc atgccagtca gaacataaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120

ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180

aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccattcac gttcggctcg 300
5
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65
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 363

caggtgcaga tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acttgcactg tctctgggtc ttcattaacc aactatggtg tacactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctagagtg gctgggagta atatgggctg gtggaagcac aaattataat 180

tcggctctca tgtccagact gagtatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag agactgggag 300

ggctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 364 <211> 323 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 364

gacattcaga tgacccagtc tcctgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60

atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240

gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa ctttacagta ctccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acg 323
<210> 365 <211> 348 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 365

caggtgcagc taaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acatgcactg tctcagggtt ctcattaacc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg gtggaagcac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240
5
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gaactgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattatggt 300
cactacgctg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 366 <211> 322 <212> ADN
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<221> fuente
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gacatccagt tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtgg gagtattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaagtctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagtagatgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg ggtattatta ctgtcaacat ttttggacta ctccgtggac attcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 367 <211> 360 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 367

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactgagtac 180

aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggggtc 300

tatgatggtt actcttactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
<210> 368 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 368
gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60
5
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ggaaatattc ctaaactatt gatccaaaag gcttccaact tgcacacagg cgtcccctca aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccattcac gttcggctcg gggacaaagt tggaaataaa ac
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<221> fuente
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<400> 369

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acttgcactg tctctgggtt ttcattaacc aactatggtg tacactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatgggctg gtggaatcac aaattataat 180

tcggctctca tgtccagact gagcatcagc gaagacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaatttaggt 300

ccctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 370

gacattcaga tgacccagtc tcctgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60

atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240

gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa ctttacagta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggagatcaa ac 322
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300
322
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<221> fuente
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60
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc

acatgcactg tctcagggtt ctcattaacc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta gtatggggtg gtggaagcac atactataat 180

tccgctctca aatccagact gagcatcacc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccaa acagaggggt 300

cagtacgggg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 372 <211> 322 <212> ADN
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<221> fuente
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<400> 372

agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgttt cagcaggaga cagggttacc 60

ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120

gggcagtctc ctaaactgct gatatactgt gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa ac 322
<210> 373 <211> 357 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 373

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

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ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg atggaagcac agactataat 180

gcagctttca tatctagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttcttt 240

aagatgaaca gtctgcaagc tgatgacaca gccatgtact actgtgcccg aaagaaagga 300

ggatggtttc cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
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<221> fuente
5
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<400> 374

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caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

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cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300

acgttcggag gggggaccaa gctggaaatc aaacg 335
<210> 375 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 375

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga ggcttgagtg gattggacgt gttaatccta acaatggtgg tactaactac 180

aaccagaaat tcaagggcaa ggccatatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggagt 300

tatgataacg ccgagggctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 376 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 376
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aggtatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa ac 322
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<400> 377

caggtccagt tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60

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tca 363
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<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 378

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcacctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 379 <211> 366 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 379

gagttccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120

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aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
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<221> fuente
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<400> 380

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga ggagatcacc 60

ctaacctgca gtgccagctc gagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acttctccca aactcttgat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gaccttttat tctctcacaa tcagcagtgt ggaggctgaa 240

gatgctgccg attattactg ccatcagtgg agtagttatc acacgttcgg aggggggacc 300

aagctggaaa taaaacgg 318
<210> 381 <211> 351 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctactat 180

ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacgaaga 300

gccgatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 382 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 382
gacattcaga tgacccagtc tcctgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60
atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120
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180

gggaaatctc ctcagctcct gatttattct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240

gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa ctttacagta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
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caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acatgcactg tctcagggtt ctcattaacc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta gtatggggtg gtggaagcac atactataat 180

tccgctctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccaa acagaggggt 300

cagtacgggg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 384 <211> 321 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 384

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag gctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta gtccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaattaa a 321
<210> 385 <211> 357 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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5
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gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg

tcctgcaagg cttctggata cacattcact aactatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaaatac 180

aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccac cacagcctac 240

atggcgctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc agtagcctac 300

tatagtaact gggggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
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gacattgtgc tgacacagtc tcttgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatttatc ttgcatcctc ggagggggga 180

ccaagctgga aataaagcga acctagaatc tggggtccct gccaggttca gtggcagtgg 240

gtctgggaca gacttcaccc tcaacatcca tcctgtggaa gacgaagatg ctgcaaccta 300

ttactgtcag cacagtaggg agcttccgtt cacgt 335
<210> 387 <211> 348 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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<400> 387

caggtccaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttcaggcta taccttcacc agctactgga tgcactgggt gaaacagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggcatg attgatcctt ccaatagtga aactaggtta 180

aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg aatgtagaca aatcctccaa cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc agtaatggac 300

tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348
<210> 388 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
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gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa ac 322
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caggtgcaac tgaagcagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgttcatc 60

acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc agctatgaaa taaactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggactg gtggaagcac aaattataat 180

tcagctctca tatccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcct agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtaag aggtgtttat 300

gctatggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345
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<400> 390
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aattatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acg 323
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<400> 391

gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggattc ttttatcctt acaacggtaa tactgtctac 180

agccagaagt tcaagagcaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagacttaac 300

tgggagggct actggggcca aggcaccacc ctc 333
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gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaac 337
<210> 393 <211> 357 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
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<400> 393

caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaggata 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca agctactata tacactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatcctg gaaatggtaa tactaagtac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagatca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagagagaga 300

tggttactac tatggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
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agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60

ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag gttggtacca acagaagcca 120

gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacaatgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
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cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg ggtgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180

gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagatcg acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagtgggg 300

gattacgtcg gctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
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<221> fuente
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<400> 396

gatatccaga tgacacagac tgcatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
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cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgacgaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cctctggata taccttcaca gactattcat tgcactgggt gaagcaggct 120

ctaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccagcatat 180

gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagatca acgacctcaa aaatgaggac acgactacat atttctgtgg tatttacgac 300

gggtatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
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caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

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gatactgcca cttattattg ccaggagtgg agtaataatc cgctcacgtt cggtgatggg 300

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cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
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ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aaaatatgag 300

gcccacgagg ggtttgttta ttggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
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gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

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ggaaatattc caaaactatt gatctataag gcttcccact tgcacacagg cgtcccatca 180

aggttgagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccattcac gttcggctcg 300

gggacaacgt tggaaataaa ac 322
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caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

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ggctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
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<400> 403

gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60

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catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtgg cactagctac 180

aaccagaagt tcaggggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctcaag cacagcctac 240

atgcatctca acagcctgac atctgaggac tcggcagtct attattgtgc aagagagaac 300

tataggtact ttgacttctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
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acaaagttgg aaataaaac 319
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gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

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<400> 408

gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gtgccagtag cagtgtgagc tacatgcact ggtaccagca gaaaccagat 120

cagtctccaa agctcctcat caaggatagt tccaaactcg cctcaggggt cccctcgagg 180

ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca tcaatagcct ggaagctgaa 240

gatgctgcaa cgtattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtcagggg 300

accaagctgg agatcaaac 319
<210> 409 <211> 354 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 409

cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60

acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggaa tgggtgtggg ctggatccgt 120

cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt acagacattt ggtgggatga taataagtac 180

tacaacccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240

gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacgaaga 300

gttaactatt attacgaccc gtactatgct atggactact ggggtcaagg aacc 354
<210> 410 <211> 322 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 410

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgca aggcgagtca gagcgttagc aatgatgtag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagttc ctaagctcct gatctattat gcatccaata ggtactcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
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65
ggcaccaagg tggaaatcaa ac
322
<210> 411 <211> 355 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 411 caggtccagc
ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg
cttctggata caccttcact aactatggta tgaattgggt gcgccaggcc 120
cccggacaaa
ggcttgagtg gatgggatgg atcaacactt acactggtga cccaacatat 180
gcagatgatt
tcaagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240
atggagctga
gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagaattggc 300
ggtaatagtc
cctctgatta ctggggccaa ggcaccactg tcacagtctc ctcag 355
<210> 412 <211> 324 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 412

gagatcgtga tgacccagtc ccctgccaca ctgtccgtgt cccctggaga gagggccacc 60

ctgtcctgca aggcctccca gtccgtgtcc aacgacgtgg tgtggtacca gcagaagccc 120

ggacaggctc ccaggctgct gatctactac gcctccaaca ggtacaccgg catccctgcc 180

aggttctccg gatccggatc cggcaccgag ttcaccctga ccatctcctc cctgcagtcc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag gactacacct ccccctggac ctttggccag 300

ggcaccaagc tggagatcaa gagg 324
<210> 413 <211> 353 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="descripcion de secuencia artificial: polinucleotido sintetico"
<400> 413
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgaa gtgaagaaac ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggct 120
5
10
15
20
25
30
35
40
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50
gccgacgact
atggagctga
gactcctccc
tcaagggcag ggtgaccatg accaccgaca ggtccctgag gtccgacgac accgccgtgt cctccgatta ctggggacag ggcaccctcg
cctccacctc
caccgcctac 240
actactgcgc
taggattggc 300
tgaccgtctc
ctc 353

Claims (26)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Conjugado de anticuerpo y farmaco supresor de tumores de formula M-[L-D]n, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que
    M comprende un anticuerpo anti-DLL3 que se une especlficamente a un epltopo en el dominio DSL de una protelna DLL3 establecida como la SEQ Id NO: 3 o 4;
    L comprende un enlazador opcional;
    D comprende un agente citotoxico; y n es un numero entero de 1 a 20.
  2. 2. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo anti-DLL3 se une especlficamente a un epltopo que comprende los aminoacidos G203, R205 y P206 (SEQ ID NO: 10).
  3. 3. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el anticuerpo anti- DLL3 es un anticuerpo de internalizacion.
  4. 4. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo anti- DLL3 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimerico, anticuerpo injertado con CDR, anticuerpo humanizado, aticuerpo humano, anticuerpo primatizado, anticuerpo multiespeclfico, anticuerpo biespeclfico, anticuerpo monovalente, anticuerpo multivalente, diacuerpo, fragmento Fab, fragmento F(ab')2, fragmento Fv y fragmento ScFv; o un fragmento inmunoreactivo de los mismos que se une especlficamente a un epltopo en el dominio DSL de una protelna DLL3 establecida como SEQ ID NO: 3 o 4.
  5. 5. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun la reivindicacion 4, en el que el anticuerpo anti-DLL3 es un anticuerpo quimerico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
  6. 6. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo anti- DLL3 comprende o compite por la union a una protelna DLL3 humana con un anticuerpo que comprende una region variable de cadena ligera estbalecida como SEQ ID NO: 60 y una region variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 61.
  7. 7. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo anti- DLL3 comprende tres CDR de una region variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 60 y tres CDR de una region variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 61.
  8. 8. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo anti- DLL3 comprende los residuos 23-34 de la SEQ ID No: 60 para CDR-L1, los residuos 50-56 de la SEQ ID NO: 60 para CDR-L2, los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 60 para CDR-L3, los residuos 26-32 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H1, los residuos 50-58 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H3, en el que los residuos se numeran segun Chothia.
  9. 9. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo anti- DLL3 comprende los residuos 30-36 de la SEQ ID No: 60 para CDR-L1, los residuos 46-55 de la SEQ ID NO: 60 para CDR-L2, los residuos 89-96 de la SEQ ID NO: 60 para CDR-L3, los residuos 30-35 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H1, los residuos 47-58 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H2 y los residuos 93-101 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H3, en el que los residuos se numeran segun MacCallum.
  10. 10. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo anti- DLL3 comprende los residuos 24-34 de la SEQ ID NO: 60 para CDR-L1, los residuos 50-56 de la SEQ ID NO: 60 para CDR-L2, los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 60 para CDR-L3, los residuos 31-35 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H1, los residuos 50-65 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 61 para CDR-H3, en el que los residuos se numeran segun Kabat.
  11. 11. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo anti- DLL3 comprende una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos establecida como SEQ ID NO: 210 y una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos establecida como SEQ ID NO: 211.
  12. 12. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo anti- DLL3 comprende o compite por la union a una protelna DLL3 humana con un anticuerpo que comprende una region variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 84 y una region variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 85.
  13. 13. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 12, en el que el anticuerpo anti-DLL3 comprende tres CDR de una region variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 84 y tres CDR de una region variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 85.
    5
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    15
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    35
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    55
    60
    65
  14. 14. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 12 o 13, en el que el anticuerpo anti-DLL3 comprende los residuos 23-34 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L1, los residuos 50-56 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L2, los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L3, los residuos 26-32 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H1, los residuos 50-58 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H3, en el que los residuos se numeran segun Chothia.
  15. 15. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 12 o 13, en el que el anticuerpo anti-DLL3 comprende los residuos 30-36 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L1, los residuos 46-55 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L2, los residuos 89-96 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L3, los residuos 30-35 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H1, los residuos 47-58 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H2 y los residuos 93-101 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H3, en el que los residuos se numeran segun MacCallum.
  16. 16. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 12 o 13, en el que el anticuerpo anti-DLL3 comprende los residuos 24-34 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L1, los residuos 50-56 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L2, los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 84 para CDR-L3, los residuos 31-35 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H1, los residuos 50-65 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 85 para CDR-H3, en el que los residuos se numeran segun Kabat.
  17. 17. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo anti- DLL3 comprende una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos establecida como SEQ ID NO: 212 y una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos establecida como SEQ ID NO: 213.
  18. 18. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que D es una pirrolobenzodiazepina (PBD).
  19. 19. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun la reivindicacion 18, en el que la pirrolobenzodiazepina comprende u conjugado de formula AC:
    imagen1
    en la que:
    las llneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace y en la que solo una de las llneas de puntos en un anillo determinado puede ser un doble enlace;
    R2 se selecciona de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R y COR, y halo; en el que RD se selecciona de R, CO2R, COR, CHO, CO2H, y halo, preferiblemente en la que R2 es R;
    R6 y R9 se seleccionan cada uno independientemente de H, R, oH, OR, SH, SR, NH2, NhR, NRR', NO2, Me3Sn y halo, preferiblemente en la que R6 y R9 son H;
    R7 se selecciona de H, R, Oh, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo, preferiblemente en la que R7 es OR, y preferiblemente en la que R es alquilo C1;
    R10 es un enlazador conectado al anticuerpo anti-DLL3;
    Q se selecciona de O, S y NH, preferiblemente en la que Q es O;
    R11 es H, o R o, cuando Q es O, SO3M, en la que M es un cation metalico, preferiblemente en la que R11 es H;
    R y R' se seleccionan cada uno independientemente de grupos alquilo C1-12, heterociclilo C3-20 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos, y opcionalmente en relacion con el grupo NRR', R y R' junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos forman un anillo heteroclclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; y X se selecciona de O, S y N(H);
    R2" , R6" , R7" , R9" y X" son como se definen segun R2, R6, R7, R9 y X, respectivamente, preferiblemente en la que X
    y X” son O; y
    R” es un grupo alquileno C3-12, que comprende una cadena opcionalmente interrumpida por uno o mas heteroatomos, uno o mas anillos, o ambos uno o mas heteroatomos y uno o mas anillos, en la que dichos uno o mas anillos opcionales estan sustituidos.
    5
    10
    15
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    55
    60
    65
  20. 20. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun la reivindicacion 19, que comprende la estructura:
    (i)
    en la que:
    CBA es un agente de union celular que es el anticuerpo anti-DLL3 n es 0 o 1,
    L1 es un enlazador
    y RE y RE” se seleccionan cada uno independientemente de H o R o
    (ii)
    D-
    en la que:
    CBA es un agente de union celular que es el anti-anticuerpo DLL3,
    L1 es un enlazador,
    Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido, y n es 0 o 1.
  21. 21. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en el que el enlazador comprende un enlazador escindible, opcionalmente un enlazador dipeptido.
  22. 22. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende la estructura:
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    en la que:
    CBA es un agente de union celular que es el anticuerpo anti-DLL3 M;
    A, L1 y L2 son componentes del enlazador L;
    A es un grupo de conexion que conecta L1 al agente de union celular (CBA);
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    L1 es opcionalmente un enlazador escindible;
    L2 es un enlace covalente o junto con el grupo -OC(=O)- forma un enlazador autoinmolativo; y en la que el enlazador L se une a una pirrolobenzodiazepina (PBD) en la posicion del asterisco (*); y en la que opcionalmente el resto:
    imagen5
    comprende la estructura:
    imagen6
    en la que la llnea ondulada indica el punto de union de la estructura directamente a A o a una parte restante de L1 que esta conectada adicionalmente a A.
  23. 23. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-22, para su uso como un producto farmaceutico.
  24. 24. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-22, para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno proliferativo en un sujeto, tal como en el que el trastorno proliferativo es cancer, opcionalmente en el que el cancer comprende un tumor neuroendocrino, y opcionalmente en el que el cancer es cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de prostata, cancer de tiroides o carcinoma neuroendocrino de celulas grandes.
  25. 25. Conjugado de anticuerpo y farmaco, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-22, para su uso en un procedimiento para reducir la frecuencia de celulas iniciadoras de tumores en un sujeto.
  26. 26. Composition farmaceutica que comprende un conjugado de anticuerpo y farmaco segun cualquiera de las reivindicaciones 1-22.
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