JP2022523781A - Ｄｌｌ３標的化キメラ抗原受容体および結合剤 - Google Patents

Abstract

ＤＬＬ３結合剤およびＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３結合分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ならびにこれらのＤＬＬ３特異的ＣＡＲを含む免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書で提供される。また、ＤＬＬ３特異的ＣＡＲを作製および使用する方法、ならびにＤＬＬ３特異的ＣＡＲを含む免疫細胞も提供される。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８１２，５８５号、および２０２０年２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９６９，９７６号に対する優先権の利益を主張し、そのすべての内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、ＤＬＬ３結合剤およびＤＬＬ３に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、それをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを使用して患者における癌を治療する方法に関する。

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子出願されており、．ｔｘｔフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、２０２０年２月４日に作成され、約１，０２６，７９８バイトのサイズを有する「ＡＴ－０１９＿０３ＵＳ＿ＳＬ」と題された配列表を含有する。本．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の部分であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、予後不良および限定された治療選択肢を有する侵襲的な形態の肺癌である。ＳＣＬＣは、すべての新たに診断された肺癌の約１０～１５％を表す。アメリカ癌協会は、２０１８年には約２３４，０００の新しい肺癌の症例が診断されるであろうと推定する。ＳＣＬＣの推定５年相対生存率は、３１％（ステージＩの場合）、１９％（ステージＩＩの場合）、８％（ステージＩＩＩの場合）、および２％（ステージＩＶの場合）である。ＳＣＬＣの生存率は、この形態の肺癌と闘うための新しい療法がないことが主な理由で、数十年間低いままであった。癌のための従来の治療的処置には、化学療法および放射線療法が含まれる。患者は、典型的には、エトポシドおよびシスプラチンを含む、現在の第一選択療法によく応答するが、化学療法抵抗性疾患で常にすぐに再発する。再発した難治性の状況での予後は非常に悪く、急速な疾患進行および６か月未満の短い生存期間の中央値を有する。したがって、増殖性障害のためのより標的化された強力な療法を開発する大きな必要性が残っている。

悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子修飾された免疫細胞の養子移入は、癌を治療するための新しいアプローチとして有望であることを示している（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２（２）：２５１－２５７（２０１０）、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，８（４）：２９９－３０８（２００８）を参照されたい）。免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＤＬＬ３抗原認識部分で構成される融合タンパク質、およびＴ細胞活性化ドメインを発現するように遺伝子修飾することができる（例えば、Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（２）：７２０－７２４（１９９３）、およびＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１（２）：２１５－２２３（２００９）を参照されたい）。ＣＡＲを含有する免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）は、標的細胞を認識し、殺滅するそれらの能力を保持または強化しながら、それらに抗原特異性を付与するように操作される。

ＤＬＬ３は、非カノニカルＮｏｔｃｈリガンドであり、細胞自律的に機能してＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害し、よって細胞間の相互作用および標的細胞におけるＮｏｔｃｈの内在化を遮断する。デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）は、ＳＣＬＣ腫瘍マーカーであり、癌幹細胞に関連していることがわかっている。ＤＬＬ３に関係する他の適応症には、黒色腫、低悪性度神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺髄様癌、カルチノイド、膵臓、膀胱、および前立腺における分散性神経内分泌腫瘍、精巣癌、ならびに神経内分泌特徴を伴う肺腺癌が含まれる。癌、特にＤＬＬ３の異常な発現を伴う悪性腫瘍の治療の必要性がある。この必要性に対処する方法および組成物が本明細書で提供される。

ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびこれらのＤＬＬ３特異的ＣＡＲを含む免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書で提供される。これらのＤＬＬ３特異的ＣＡＲを作製および使用する方法、ならびにＤＬＬ３特異的ＣＡＲを含む免疫細胞も提供される。本明細書に記載されるＤＬＬ－３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、良好な形質導入効率、インビトロ表現型、ならびに強力なインビトロおよびインビボ抗腫瘍活性を示す。

一態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１、１０、１９、２８、３７、４６、５５、６４、７３、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１４５、１５４、１６３、１７２、１８１、１９０、１９９、２０８、２１７、２２６、２３５、２４４、２５３、２６２、２７１、２８０、２８９、２９８、３０７、３１６、３２５、３３４、３４３、３５２、３６１、３７０、３７９、３８８、３９７、４０６、４１５、４２４、４３３、４４２、４５１、および４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２、１１、２０、３８、４７、５６、６５、７４、８３、９２、１０１、１１０、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、１７３、１８２、１９１、２００、２０９、２１８、２２７、２３６、２４５、２５４、２６３、２７２、２８１、２９０、２９９、３０８、３１７、３２６、３３５、３４４、３５３、３６２、３７１、３８０、３８９、３９８、４０７、４１６、４２５、４３４、４４３、４５２、４６１、および６９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３、１２、２１、３０、３９、４８、５７、６６、７５、８４、９３、１０２、１１１、１２０、１２９、１３８、１４７、１５６、１６５、１７４、１８３、１９２、２０１、２１０、２１９、２２８、２３７、２４６、２５５、２６４、２７３、２８２、２９１、３００、３０９、３１８、３２７、３３６、３４５、３５４、３６３、３７２、３８１、３９０、３９９、４０８、４１７、４２６、４３５、４４４、４５３、および４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４、１３、２２、３１、４０、４９、５８、６７、８５、９４、１０３、１１２、１２１、１３０、１３９、１４８、１５７、１６６、１７５、１８４、１９３、２０２、２１１、２２０、２２９、２３８、２４７、２５６、２６５、２７４、２８３、２９２、３０１、３１０、３１９、３２８、３３７、３４６、３５５、３６４、３７３、３８２、３９１、４００、４０９、４１８、４２７、４３６、４４５、４５４、４６３、および６９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号５、１４、２３、３２、４１、５０、５９、６８、７７、８６、９５、１０４、１１３、１２２、１３１、１４０、１４９、１５８、１６７、１７６、１８５、１９４、２０３、２１２、２２１、２３０、２３９、２４８、２５７、２６６、２７５、２８４、２９３、３０２、３１１、３２０、３２９、３３８、３４７、３５６、３６５、３７４、３８３、３９２、４０１、４１０、４１９、４２８、４３７、４４６、４５５、および４６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２、ならびに（ｆ）配列番号６、１５、２４、３３、４２、５１、６０、６９、７８、８７、９６、１０５、１１４、１２３、１３２、１４１、１５０、１５９、１６８、１７７、１８６、１９５、２０４、２１３、２２２、２３１、２４０、２４９、２５８、２６７、２７６、２８５、２９４、３０３、３１２、３２１、３３０、３３９、３４８、３５７、３６６、３７５、３８４、３９３、４０２、４１１、４２０、４２９、４３８、４４７、４５６、および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。

別の態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１、１０、１９、２８、３７、４６、５５、６４、７３、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１４５、１５４、１６３、１７２、１８１、１９０、１９９、２０８、２１７、２２６、２３５、２４４、２５３、２６２、２７１、２８０、２８９、２９８、３０７、３１６、３２５、３３４、３４３、３５２、３６１、３７０、３７９、３８８、３９７、４０６、４１５、４２４、４３３、４４２、４５１、および４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２、１１、２０、３８、４７、５６、６５、７４、８３、９２、１０１、１１０、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、１７３、１８２、１９１、２００、２０９、２１８、２２７、２３６、２４５、２５４、２６３、２７２、２８１、２９０、２９９、３０８、３１７、３２６、３３５、３４４、３５３、３６２、３７１、３８０、３８９、３９８、４０７、４１６、４２５、４３４、４４３、４５２、および６９５４６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２、ならびに（ｃ）配列番号３、１２、２１、３０、３９、４８、５７、６６、７５、８４、９３、１０２、１１１、１２０、１２９、１３８、１４７、１５６、１６５、１７４、１８３、１９２、２０１、２１０、２１９、２２８、２３７、２４６、２５５、２６４、２７３、２８２、２９１、３００、３０９、３１８、３２７、３３６、３４５、３５４、３６３、３７２、３８１、３９０、３９９、４０８、４１７、４２６、４３５、４４４、４５３、および４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３を含む。

一態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号４、１３、２２、３１、４０、４９、５８、６７、８５、９４、１０３、１１２、１２１、１３０、１３９、１４８、１５７、１６６、１７５、１８４、１９３、２０２、２１１、２２０、２２９、２３８、２４７、２５６、２６５、２７４、２８３、２９２、３０１、３１０、３１９、３２８、３３７、３４６、３５５、３６４、３７３、３８２、３９１、４００、４０９、４１８、４２７、４３６、４４５、４５４、４６３、および６９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５、１４、２３、３２、４１、５０、５９、６８、７７、８６、９５、１０４、１１３、１２２、１３１、１４０、１４９、１５８、１６７、１７６、１８５、１９４、２０３、２１２、２２１、２３０、２３９、２４８、２５７、２６６、２７５、２８４、２９３、３０２、３１１、３２０、３２９、３３８、３４７、３５６、３６５、３７４、３８３、３９２、４０１、４１０、４１９、４２８、４３７、４４６、４５５、および４６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２、ならびに（ｃ）配列番号６、１５、２４、３３、４２、５１、６０、６９、７８、８７、９６、１０５、１１４、１２３、１３２、１４１、１５０、１５９、１６８、１７７、１８６、１９５、２０４、２１３、２２２、２３１、２４０、２４９、２５８、２６７、２７６、２８５、２９４、３０３、３１２、３２１、３３０、３３９、３４８、３５７、３６６、３７５、３８４、３９３、４０２、４１１、４２０、４２９、４３８、４４７、４５６、および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３を含む。

別の態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号７、１６、２５、３４、４３、５２、６１、７０、７９、８８、９７、１０６、１１５、１２４、１３３、１４２、１５１、１６０、１６９、１７８、１８７、１９６、２０５、２１４、２２３、２３２、２４１、２５０、２５９、２６８、２７７、２８６、２９５、３０４、３１３、３２２、３３１、３４０、３４９、３５８、３６７、３７６、３８５、３９４、４０３、４１２、４２１、４３０、４３９、４４８、４５７、４６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、ならびに（ｂ）配列番号８、１７、２６、３５、４４、５３、６２、７１、８０、８９、９８、１０７、１１６、１２５、１３４、１４３、１５２、１６１、１７０、１７９、１８８、１９７、２０６、２１５、２２４、２３３、２４２、２５１、２６０、２６９、２７８、２８７、２９６、３０５、３１４、３２３、３３２、３４１、３５０、３５９、３６８、３７７、３８６、３９５、４０４、４１３、４２２、４３１、４４０、４４９、４５８、および４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖のうちの少なくとも１つを含み、可変重鎖および可変軽鎖は、少なくとも１つのリンカーによって連結される。

さらなる態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号７、１６、２５、３４、４３、５２、６１、７０、７９、８８、９７、１０６、１１５、１２４、１３３、１４２、１５１、１６０、１６９、１７８、１８７、１９６、２０５、２１４、２２３、２３２、２４１、２５０、２５９、２６８、２７７、２８６、２９５、３０４、３１３、３２２、３３１、３４０、３４９、３５８、３６７、３７６、３８５、３９４、４０３、４１２、４２１、４３０、４３９、４４８、４５７、および４６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、ならびに（ｂ）配列番号８、１７、２６、３５、４４、５３、６２、７１、８０、８９、９８、１０７、１１６、１２５、１３４、１４３、１５２、１６１、１７０、１７９、１８８、１９７、２０６、２１５、２２４、２３３、２４２、２５１、２６０、２６９、２７８、２８７、２９６、３０５、３１４、３２３、３３２、３４１、３５０、３５９、３６８、３７７、３８６、３９５、４０４、４１３、４２２、４３１、４４０、４４９、４５８、および４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、可変重鎖および可変軽鎖は、少なくとも１つのリンカーによって連結される。

一態様では、本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、表１ｄに提示されるｓｃＦｖからなる群から選択される配列を含む。

別の態様では、本開示は、ＤＬＬ３に特異的に結合するキメラ抗原受容体を提供し、キメラ抗原受容体は、配列番号４８２～５３３および配列番号６３２～６８３のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号４８２～５３３および６３２～６８３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３に特異的に結合するキメラ抗原受容体を提供し、キメラ抗原受容体は、シグナル配列ありまたはなしで、配列番号４８２～５３３および配列番号６３２～６８３のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、シグナル配列ありまたはなしで、配列番号４８２～５３３および６３２～６８３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体の共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１（ＣＤ１ １ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ １ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ １ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１ １ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１ １ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭＩ（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせのシグナル伝達領域である。

いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号５５０を含む。

いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７のシグナル伝達領域を含む。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメインは、配列番号４８０を含む。

いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、少なくとも１つの活性化ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、活性化ドメインは、ＣＤ３を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ＣＤ３ゼータを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータは、配列番号４８１を含む。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号５７１～６２１および６３１のいずれか１つのポリヌクレオチド配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、安全スイッチをさらに含む。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、ＣＤ２０ミモトープまたはＱＢＥＮＤ－１０エピトープを含む。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、１つ以上のＣＤ２０ミモトープもしくは１つ以上のＱＢＥＮＤ－１０エピトープ、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＱＲ３、ＳＲ２、ＲＳＲ、またはＲ２Ｓのフォーマットの１つ以上の安全スイッチを含む。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号６２２～６２８、４７４～４７６、５６５、および６８４～６９４のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、シグナル配列ありまたはなしで、配列番号６２２～６２８、４７４～４７６、５６５、および６８４～６９４のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれか１つをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、レンチウイルスベクター、またはそれらの任意の組み合わせである。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを発現する操作された免疫細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、自家Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、同種Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ノックアウトされたＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ）である。

一態様では、本開示は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を含む薬学的組成物を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、操作された免疫細胞または本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、癌である。

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、小細胞肺癌である。

いくつかの態様では、本開示は、操作された免疫細胞または本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞を含む薬学的組成物を含む、製品を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される抗ＤＬＬ３結合剤を提供する。

いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ３結合剤は、抗体、抗体コンジュゲート、またはそれらの抗原結合断片、任意に、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、またはｄＡｂ断片である。

いくつかの実施形態では、結合剤は、ＩｇＧ定常領域を含むモノクローナル抗体である。

いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ３結合剤は、表１ｂに提供されるＶＨ配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一である可変重（ＶＨ）鎖配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ３結合剤は、表１ｃに提供されるＶＬ配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一である可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ３結合剤は、表１ｄに提示されるｓｃＦｖ配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ３結合剤は、Ｆｃ定常領域に融合したｓｃＦｖ断片を含む融合タンパク質である。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される抗ＤＬＬ３結合剤および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるように、抗ＤＬＬ３結合剤、または抗ＤＬＬ３結合剤を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、癌である。

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、小細胞肺癌である。

本明細書に記載される精製抗ＤＬＬ３抗体が３つのＤＬＬ３発現小細胞肺癌細胞株（ＳＨＰ－７７、ＤＭＳ ２７３、およびＤＭＳ ４５４）に結合することを示す一連のプロットである。実線および破線は、それぞれ抗ＤＬＬ３抗体またはマウスＩｇＧ２Ａアイソタイプ対照抗体による染色を表す。 エピトープマッピング実験の結果を示す。図２Ａは、エピトープマッピングのためにＣＨＯ細胞上で発現された全長および短縮型ヒトＤＬＬ３タンパク質の概略図であり、すべてのタンパク質は、容易な検出のためにＮ末端でＨＡタグと融合された。図２Ｂおよび２Ｃは、図２Ａに示される全長および短縮型ヒトＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。図２Ｄは、抗ＤＬＬ３抗体のエピトープマッピングの結果、ならびにそれぞれＤＳＬ、ＥＧＦ１、およびＥＧＦ３ドメインを認識する抗ＤＬＬ３抗体の例を示す一連のプロットであり、ｘ軸は、ＰＥチャネルからのシグナルを示し、ｙ軸は、カウントを示す。 構造、２人の異なるドナーからの細胞の形質導入効率、および抗ＤＬＬ３ ＣＡＲの細胞毒性活性を示す一連のプロットおよび表である。図３Ａは、Ｎ末端からＣ末端まで、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８αからのヒンジおよび膜貫通領域、ヒト４１ＢＢからの細胞質領域、ならびにＣＤ３ζからの細胞質領域を含む抗ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする構築物の概略図である。図３Ｂは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲが初代Ｔ細胞の表面に発現し、組換えＤＬＬ３を認識することができることを示す実験データを示し、プロットを、生きているＣＤ３＋細胞でゲーティングし、プロット上の数字は、各抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージである。図３Ｃおよび３Ｄは、本明細書に記載されるｓｃＦｖ配列を含む抗ＤＬＬ３ ＣＡＲの形質導入効率を示す。 いくつかの抗ＤＬＬ３ ＣＡＲの殺滅データを示す一連のプロットである。図４Ａは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、示されたエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比での３日の細胞毒性アッセイにおいて、ヒトＤＬＬ３を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を特異的に殺滅したが、親ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を殺滅しなかったことを示す実験データを示す。抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現しなかったＴ細胞（標識された「空ベクター」）を陰性対照として使用した。図４Ｂは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、示されたエフェクター：標的比での３日の細胞毒性アッセイにおいて内因性ＤＬＬ３を発現するＳＨＰ－７７およびＷＭ２６６．４細胞を殺滅したことを示す実験データを示す。図４Ｃは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、示されたエフェクター：標的比での３日の細胞毒性アッセイにおいて内因性ＤＬＬ３を発現するＤＭＳ ４５４およびＤＭＳ ２７３小細胞肺癌細胞を殺滅したことを示す実験データを示す。図４Ａ～４Ｃにおけるすべてのプロットについて、Ｏｎｅ－ｇｌｏアッセイシステムを使用して、標的細胞生存率を評価した（ｎ＝３）。 ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＳＨＰ－７７細胞が１：１または１：９のエフェクター：標的比で２４時間インキュベートされた場合、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＤＬＬ３発現ＳＨＰ－７７細胞株との共インキュベーション後にサイトカインを放出したことを示す一連の棒グラフである。上清は、収集され、ＭＳＤからの炎症誘発性９プレックスキットを使用してＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、およびＴＮＦ－αレベルが測定された（ｎ＝３）。 ＤＬＬ３＋細胞株への抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の反復曝露後の連続殺滅アッセイの実験データを示すプロットである。図６Ａは、ＤＬＬ３＋ＷＭ２６６．４細胞に対する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の連続殺滅を示す。クローンのうちのいくつかは、アッセイの１２日目に活性のままであった。図６Ｂは、ＤＭＳ ４５４およびＷＭ２６６．４細胞に対する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の連続殺滅を示す。図６Ｃは、ＤＭＳ ２７３小細胞肺癌株に対する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔの連続殺滅を示す。図６Ａ～６Ｃにおけるすべてのプロットについて、ｏｎｅ－ｇｌｏアッセイまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ｇｌｏシステムを使用して、標的細胞生存率を評価した（ｎ＝３～５）。 抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、マウスにおける確立されたＳＨＰ－７７小細胞肺癌皮下腫瘍を用量依存的に排除したことを示すプロットである。 １０Ｇ１－Ｋ抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が確立されたＩＶ注射ＳＨＰ－７７小細胞肺癌腫瘍の成長を用量依存的に阻害したことを示すプロットである。統計分析は、反復測定（ダネットの多重比較）を伴うＡＮＯＶＡを使用して、１４日目～２８日目、ｎ＝４－５で行われた。＊、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１。 一次Ｔ細胞の構造、形質導入効率、安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲの細胞毒性活性を示している。図９Ａは、４つの異なる安全スイッチ（ＱＲ３、ＳＲ２、ＲＳＲ、およびＲ２Ｓ）を有するＣＡＲ設計の構造を示す概略図である。図９Ｂは、図９Ａに示される安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲが一次Ｔ細胞の表面に発現し、組換えＤＬＬ３を認識することができることを示すフローサイトメトリープロットを示す。プロットを、生きているＣＤ３＋細胞でゲーティングし、プロット上の数字は、各抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージを示す。図９Ｃは、安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲが連続殺滅アッセイにおいて活性であることを示す実験データを示す。 ２つの小細胞肺癌患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルが細胞表面にＤＬＬ３を発現することを示すプロットを示す。実線および破線は、それぞれ、抗ＤＬＬ３抗体または蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）による染色を表す。 抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔが同じ２つのＰＤＸモデルに対して細胞毒性活性を示すことを示す実験データを示す。 安全スイッチがリツキシマブによるＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の検出および枯渇を可能にすることを示す。図１１Ａは、８Ｅ１１－ＳＲ２および２６Ｃ８－Ｒ２Ｓ抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、増殖の１４日後に組換えＤＬＬ３およびＰＥコンジュゲートリツキシマブで染色し、フローサイトメトリーを使用して分析したことを示す。象限内の数字は、総Ｔ細胞のパーセンテージを表す。図１１Ｂは、８Ｅ１１－ＳＲ２および２６Ｃ８－Ｒ２Ｓ抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のリツキシマブ媒介補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞を２５％幼若ウサギ補体およびリツキシマブとともに３時間インキュベートし、フローサイトメトリーを使用して細胞毒性を評価した。 安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、皮下またはＩＶ注射された小細胞肺癌腫瘍の成長を阻害したことを示すプロットを示す。図１２Ａは、安全スイッチを有するＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、マウスにおける確立されたＳＨＰ－７７小細胞肺癌皮下腫瘍を排除したことを示す。図１２Ｂは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＩＶ注射されたＤＭＳ ２７３－ＤＬＬ３小細胞肺癌腫瘍の成長を阻害したことを示すプロットである。 ＮＳＧマウスの脳におけるマウスＤＬＬ３ ＲＮＡ発現の代表的な画像を示す。丸は、マウスＤＬＬ３ ＲＮＡのクラスターを示す。 非形質導入Ｔ細胞、１０Ｇ１－Ｋ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞または２Ｇ１ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が投与された動物の脾臓、下垂体、脳試料の抗ヒトＣＤ３染色を示す。矢印は、脾臓におけるＣＤ３陽性細胞を示す。 皮下ＬＮ２２９－ｍＤＬＬ３腫瘍モデルを使用したマウス安全性研究の実験設計および結果を示す。図１４Ａは、研究群および実験設計を示す。図１４Ｂは、非形質導入Ｔ細胞またはＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかを受けた動物の組織採取のタイミングおよび腫瘍体積を示す。図１４Ｃは、脳および下垂体試料のヒトＣＤ３染色スコアを示す表である。図１４Ｄは、採取された脳および下垂体試料の組織学的分析を示す表である。図１４Ｅは、抗バソプレシン抗体で染色された下垂体試料の画像を示す。図１４Ｆは、抗オキシトシン抗体で染色された下垂体試料の画像を示す。 頭蓋内ＬＮ２２９－ｍＤＬＬ３腫瘍モデルを使用したマウス安全性研究の実験設計および結果を示す。図１５Ａは、研究群および実験設計を示す。図１５Ｂは、非形質導入Ｔ細胞、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物の組織採取のタイミングおよび腫瘍体積を示す。図１５Ｃは、脳、下垂体、および脾臓試料のヒトＣＤ４５染色スコアを示す表である。図１５Ｄは、脳および下垂体試料の組織学的分析を示す表である。 解離されたマウス下垂体細胞のインビトロ細胞毒性の実験データを示す。図１６Ａは、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞との３日の共培養後の標的細胞の細胞毒性読み出しを示し、ＤＬＬ３ ＣＡＲＴがインビトロでマウス下垂体細胞に対して細胞毒性ではないことを示す。図１６Ｂは、標的と共培養されたＴ細胞の活性化マーカーＣＤ２５および４１ＢＢについての表面染色のフローサイトメトリー分析を示し、マウス下垂体細胞がインビトロでＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔを活性化しないことを示す。図１６Ｃは、ＭＳＤによって分析された、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞をマウス下垂体細胞とインビトロで３日間共培養した後、サイトカインが分泌されないことを示す、細胞培養培地で分泌されたサイトカインを示す。

ＤＬＬ３特異的抗体およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書で提供される。本明細書に記載されるＤＬＬ－３特異的ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメイン、およびこれらのＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのＤＬＬ３特異的ＣＡＲを含む免疫細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、およびこれらの免疫細胞を含む薬学的組成物も提供される。例えば、癌の治療のために、これらのＤＬＬ３特異的ＣＡＲおよびこれらのＤＬＬ３特異的ＣＡＲを含む免疫細胞を作製および使用する方法も開示される。

Ｉ．ＤＬＬ－３結合剤
本開示は、ＤＬＬ－３に特異的に結合するＤＬＬ－３結合剤（例えば、ＤＬＬ３抗原結合ドメイン、ＤＬＬ－３抗体、またはそれらの断片を含む分子）を提供する。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原（例えば、ＤＬＬ－３）への特異的結合を与えるのに十分なカノニカル免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当該技術分野で知られているように、自然界で産生されるインタクトな抗体は、一般に「Ｙ字型」構造と呼ばれるものに互いに会合する２つの同一の重鎖ポリペプチド（各々約５０ｋＤ）および２つの同一の軽鎖ポリペプチド（各々約２５ｋＤ）で構成される約１５０ｋＤの四量体剤である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各々約１１０アミノ酸長）－アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）と、続いて３つの定常ドメイン：ＣＨＩ、ＣＨ２、およびカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙのステムの基部に位置する）とで構成される。「スイッチ」として知られる、短い領域は、重鎖可変領域および定常領域を接続する。「ヒンジ」は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを抗体の残部に接続する。このヒンジ領域における２つのジスルフィド結合は、２つの重鎖ポリペプチドをインタクトな抗体において互いに接続する。各軽鎖は、２つのドメイン、別の「スイッチ」によって互いに分離された、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメインと、続いてカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインと、で構成される。当業者は、抗体構造および配列要素に精通しており、提供された配列における「可変」および「定常」領域を認識し、そのようなドメイン間の「境界」の定義におけるいくらかの柔軟性があり得、同じ抗体鎖配列の異なる提示が、例えば、同じ抗体鎖配列の異なる提示に対して１残基または数残基シフトした位置でそのような境界を示し得ることを理解する。

フレームワーク、ＣＤＲ、および可変ドメインの各々へのアミノ酸の割り当ては、典型的には、Ｋａｂａｔ番号付け（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．１９９１を参照にされたい）、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，（１９８７），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：７９９－８１７、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（１）：１７５－８２、および米国特許第７，７０９，２２６号を参照されたい）、接触番号付け、またはＡｂＭスキーム（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｅｌｉｎｇプログラム、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）の番号付けスキームに従う。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提示されるＤＬＬ３結合剤のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って番号付けされる。他の実施形態では、本明細書に提示されるＤＬＬ３結合剤のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って番号付けされる。他の実施形態では、本明細書に提示されるＤＬＬ３結合剤のＣＤＲは、接触番号付けスキームに従って番号付けされる。他の実施形態では、本明細書に提示されるＤＬＬ３結合剤のＣＤＲは、ＡｂＭ番号付けスキームに従って番号付けされる。

インタクトな抗体四量体は、重鎖および軽鎖が単一ジスルフィド結合によって互いに連結している２つの重鎖－軽鎖二量体で構成され、２つの他のジスルフィド結合は、重鎖ヒンジ領域を互いに接続し、その結果、二量体が互いに接続され、四量体が形成される。自然に産生された抗体はまた、典型的にはＣＨ２ドメイン上で、グリコシル化される。天然抗体における各ドメインは、圧縮された逆平行ベータバレルにおいて互いに詰め込まれた２つのベータシート（例えば、３、４、または５本鎖シート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「補体決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）として知られる３つの超可変ループ、および４つのやや不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を含有する。天然抗体が折り畳まれる場合、ＦＲ領域は、ドメインの構造フレームワークを提供するベータシートを形成し、重鎖および軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域は、それらがＹ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位が作成されるように、３次元空間に一緒にされる。天然発生抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、また、例えば、細胞毒性を媒介するエフェクター細胞を含む、エフェクター細胞上の受容体に結合する。当該技術分野で知られているように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性および／または他の結合属性は、グリコシル化または他の修飾によって調節することができる。いくつかの実施形態では、本発明に従って産生および／または利用される抗体は、修飾または操作されたそのようなグリコシル化を有するＦｃドメインを含む、グリコシル化されたＦｃドメインを含む。

本発明の目的のために、特定の実施形態では、天然抗体に見られるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが天然に産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）か、あるいは組換え操作、化学合成、または他の人工システムもしくは方法論によって産生されるかにかかわらず、「抗体」として言及および／または使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナルであり、いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列要素は、当該技術分野で知られているように、ヒト化、霊長類化、キメラなどである。

さらに、本明細書で使用される「抗体」という用語は、適切な実施形態では（別段に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り）、代替の提示において抗体の構造的および機能的特徴を利用するための当該技術分野で知られているか、または開発された構築物もしくはフォーマットのいずれかを指すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明に従って利用される抗体は、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体；二重または多重特異的抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）；Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離されたＣＤＲまたはそれらのセットなどの抗体断片；単鎖Ｆｖ；ポリペプチド－Ｆｃ融合体；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）；ラクダ抗体；マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰ（商標））；単鎖またはタンデムダイアボディー（例えば、ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）；およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるが、これらに限定されないフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体は、それが自然に産生される場合に有するであろう共有結合修飾（例えば、グリカンの付着）を欠き得る。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカンの付着、ペイロード（例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分など）、または他のペンダント基（例えば、ポリエチレングリコールなど）を含有し得る。

抗体は、抗体断片を含む。抗体は、ポリクローナルモノクローナル、キメラｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆ_ab、Ｆ_a、Ｆ_(ab)2断片、ｓｃＦｖ、およびＦ_ab発現ライブラリーも含むが、これらに限定されない。抗体は、全抗体、または免疫グロブリン、または抗体断片であり得る。

上で詳述されるように、全抗体は、「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）の２つの対からなる（そのような軽鎖（ＬＣ）／重鎖対は、本明細書ではＬＣ／ＨＣと略される）。そのような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。全抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨＩ、ＣＨ２、およびＣＨ３（抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）、ならびに任意に重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体クラスＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む。可変ドメインＶＨおよびＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が点在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ，ｅｔ ａｌ，（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．，５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、およびＷｏｏｆ，Ｊ．，Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４（２００４）８９－９９）。重鎖および軽鎖の２つの対（ＨＣ／ＬＣ）は、同じ抗原に特異的に結合することができる。よって、当該全抗体は、二価単一特異性抗体である。そのような「抗体」は、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびそれらの特徴的な特性が保持される限り、遺伝子操作された抗体（バリアントまたは変異体抗体）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または結合剤は、特に組換えヒトまたはヒト化抗体としてのヒト化抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体または結合剤は、「対称的」であり得る。「対称的」とは、抗体または結合剤が同じ種類のＦｖ領域を有することを意味する（例えば、抗体は、２つのＦａｂ領域を有する）。いくつかの実施形態では、抗体または結合剤は、「非対称的」であり得る。「非対称的」とは、抗体または結合剤が少なくとも２つの異なる種類のＦｖ領域を有することを意味する（例えば、抗体は、ＦａｂおよびｓｃＦｖ領域、ＦａｂおよびｓｃＦｖ２領域、またはＦａｂ－ＶＨＨ領域を有する）。様々な非対称抗体または結合剤構造が当該技術分野で知られている（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｍａｂｓ（９）（２）：１８２－２１２）。

本明細書で使用される場合、「抗体剤」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、用語は、特異的結合を与えるのに十分な免疫グロブリン構造要素を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を包含する。例示的な抗体剤には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体剤は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な１つ以上の定常領域配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体剤は、当該技術分野で知られているように、ヒト化、霊長類化、キメラなどである１つ以上の配列要素を含み得る。多くの実施形態では、「抗体剤」という用語は、代替の提示において抗体の構造的および機能的特徴を利用するための当該技術分野で知られているか、または開発された構築物もしくはフォーマットのうちの１つ以上を指すために使用される。例えば、本発明に従って利用される抗体剤は、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体；二重または多重特異的抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）；Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離されたＣＤＲまたはそれらのセットなどの抗体断片；単鎖Ｆｖ；ポリペプチド－Ｆｃ融合体；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）；ラクダ抗体；マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰ（商標））；単鎖またはタンデムダイアボディー（例えば、ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）；およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるが、これらに限定されないフォーマットである。

いくつかの実施形態では、抗体は、それが自然に産生される場合に有するであろう共有結合修飾（例えば、グリカンの付着）を欠き得る。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカンの付着、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコールなど］を含有し得る。多くの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者によって認識される１つ以上の構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含み、いくつかの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、参照抗体に見られるものと実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲおよび／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、免疫グロブリン可変ドメインとして当業者によって認識される構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分が相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。

本発明のコードされる抗体または抗原結合分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子は、一本鎖である。特定の実施形態では、抗原結合分子は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）₂、ｄＡｂ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ－３抗体剤は、単離される。いくつかの実施形態では、抗体剤は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％または９９％を超える純度に精製することができる（例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい）。いくつかの態様では、本開示は、ＤＬＬ－３結合剤（例えば、ＤＬＬ３特異的抗体）および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ－３抗体剤は、Ｆｃを含む。Ｆｃドメインは、細胞表面受容体と相互作用することができ、これは抗体が免疫系を活性化することを可能にすることができる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来する、２つの同一のタンパク質断片で構成され、ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（Ｃ_Hドメイン２～４）を含有する。ＩｇＧのＦｃ領域は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位（Ｎ２９７）を担持し得る。Ｆｃ断片のグリコシル化は、Ｆｃ受容体媒介性活性に不可欠であり得る。この部位に付着したＮ－グリカンは、主に複合体タイプのコア－フコシル化二分岐構造であり得る。

軽鎖および重鎖の定常領域は抗体の抗原への結合に直接関与しない場合がある一方で、定常領域は、可変領域の配向に影響を与え得る。定常領域はまた、エフェクター分子および細胞との相互作用を介した抗体依存性補体媒介性溶解または抗体依存性細胞毒性への関与などの、様々なエフェクター機能を示し得る。

開示される抗ＤＬＬ－３抗体剤は、アイソタイプＩｇＡ、アイソタイプＩｇＤ、アイソタイプＩｇＥ、アイソタイプＩｇＧ、またはアイソタイプＩｇＭを含む、任意のアイソタイプの抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ－３抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常ドメインを含有する。

ＤＬＬ３標的の様々な領域またはドメインに結合することができるＤＬＬ３結合剤（例えば、抗体）が本明細書で提供される。エピトープは、例えば、ＤＬＬ３標的の隣接アミノ酸（線状または隣接エピトープ）であるか、またはＤＬＬ３標的の２つ以上の非隣接領域（立体配座、非線状、不連続、または非隣接エピトープ）から一緒になり得る。ＤＬＬ３抗原結合ドメインが結合するエピトープは、様々なアッセイ、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析と組み合わせた水素／重水素交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アレイベースのオリゴ－ペプチド走査アッセイ、フローサイトメトリー、および／または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）によって決定することができる。

代表的なＤＬＬ３領域またはドメインを図２に示す。本明細書に記載される例示的なＤＬＬ３抗体は、表１ａに提供されるＤＬＬ３ドメインに結合する。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合剤は、可変重鎖（ＶＨ）を含み、ＶＨのアミノ酸配列は、表１ｂに提示されるＶＨ配列から選択される。いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ－３結合剤は、表１ｂに提示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合剤は、可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＬのアミノ酸配列は、表１ｃに提示されるＶＬ配列から選択される。いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ－３結合剤は、表１ｃに提示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する免疫グロブリン軽鎖を含む。

ＤＬＬ３抗原結合ドメインが可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖を含み、ＶＨのアミノ酸配列が表１ｂに提示されるＶＨ配列から選択され、ＶＬのアミノ酸配列が表１ｃに提示されるＶＬ配列から選択される、ＤＬＬ３結合剤（例えば、抗体）が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ－３結合剤は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、表１ｅに提示される重鎖ＣＤＲから選択される。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ－３結合剤は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、表１ｆに提示される軽鎖ＣＤＲから選択される。

本開示は、表１ｂ～１ｅに示される配列を含むＤＬＬ３抗体剤への修飾を包含し、それらの特性に有意に影響を及ぼさない修飾を有する機能的に同等のＤＬＬ３抗体剤ならびに増強または減少した活性および／または親和性を有するバリアントを含む。例えば、アミノ酸配列は、ＤＬＬ３への所望の結合親和性を有するＤＬＬ３抗原結合剤を得るために変異され得る。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野における日常的な慣行であり、本明細書で詳細に記載される必要はない。修飾されたポリペプチドの例は、アミノ酸残基の保存的置換を有する、機能的活性を顕著に有害に変化させない、もしくはそのリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟（増強）させるアミノ酸の１つ以上の欠失もしくは付加を有する、または化学的類似体の使用を伴うポリペプチドを含む。

アミノ酸配列挿入は、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入と同様に、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合された抗体を含む。抗体分子の他の挿入バリアントは、血液循環における抗体の半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの抗体のＮまたはＣ末端への融合を含む。

置換バリアントは、除去された抗原結合ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸残基およびその場所に挿入された異なる残基を有する。いくつかの実施形態では、置換変異誘発のための目的の部位は、超可変領域／ＣＤＲを含むが、ＦＲ変更も企図される。保存的置換を、「保存的置換」の見出しの下で表２に示す。かかる置換が生物学的活性の変化を生じる場合、表２において「例示的な置換」と称される、またはアミノ酸クラスへの参照において以下でさらに記載される、より実質的な変化は、導入され得、産物はスクリーニングされ得る。

ｉ．抗体断片
一態様では、上記実施形態のいずれかによる抗ＤＬＬ－３抗体剤は、抗体断片であり得る。抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域などの、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、ダイアボディ、線状抗体、抗体断片抗体およびｓｃＦｖ断片から形成される多重特異性、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、または本明細書に記載されるような他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。（例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９－１３４（２００３）、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）、ＷＯ９３／０１１６１、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号、同第５，８６９，０４６号、同第６，２４８，５１６号、および同第５，５８７，４５８号を参照されたい）。全長抗体、インタクトな抗体、または全抗体は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、または本明細書で定義されるようなＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体である。抗体断片は、当該技術分野で知られているように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができる。

Ｆｖ抗体断片は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む。この断片は、緊密な非共有会合における１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体を含み得る。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を与える６つの超可変ループ（各々Ｈ鎖およびＬ鎖からの３つのループ）が発生する。しかしながら、単一可変領域（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。

ダイアボディは、Ｖ_HドメインとＶ_Lドメインとの間の短いリンカー（例えば、約５～１０残基）でｓＦｖ断片を構築することによって調製される小さな抗体断片であり、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対形成が達成され、二価断片をもたらす。二重特異性ダイアボディは、２つのクロスオーバーｓＦｖ断片のヘテロ二量体であり、２つの抗体のＶ_HドメインおよびＶ_Lドメインは、異なるポリペプチド鎖上に存在する（例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）。

完全なヒト形態で産生することができる、ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、抗体の最小の既知の抗原結合断片であり、約１１ｋＤａ～約１５ｋＤａの範囲である。ＤＡｂは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の堅牢な可変領域（それぞれ、Ｖ_HおよびＶ_L）である。それらは、微生物細胞培養において高度に発現され、例えば、溶解性および温度安定性を含むが、これらに限定されない、好ましい生物物理学的特性を示し、例えば、ファージディスプレイなどのインビトロ選択システムによる選択および親和性成熟によく適している。ｄＡｂは、単量体として生物活性があり、それらの小さなサイズおよび固有の安定性のため、より大きな分子にフォーマットして、延長した血清半減期または他の薬理活性を有する薬剤を作製することができる。（例えば、Ｗ０９４２５５９１およびＵＳ２００３／０１３０４９６を参照されたい）。

ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を含まないインタクトな結合部位を有する種である。よって、それらは、インビボ使用中の低減した非特異的結合に適し得る。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）は、単一ポリペプチド鎖に接続されたＶ_HおよびＶ_L抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合の所望の構造を形成することを可能にするＶ_HドメインとＶ_Lドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含むことができる（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５、下記を参照されたい）。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築することができる。抗体断片はまた、「線状抗体」であり得る（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号を参照されたい）。そのような線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。例示的なＤＬＬ３特異的ｓｃＦｖを表１ｄに提供する。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、柔軟なリンカーによって結合されたＤＬＬ３特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖを含む。単鎖可変領域断片は、結合ペプチド（ｌｉｎｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用することによって軽鎖および／または重鎖可変領域を結合することによって作製され得る。結合ペプチドの例は、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_xを有するＧＳリンカーであり、ここで、ｘは１、２、３、４、または５である（配列番号４７０）。いくつかの実施形態では、ｘは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または約２０未満の任意の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）₄（配列番号４７８）である。一般に、リンカーは、短い、柔軟なポリペプチドであり得、いくつかの実施形態では、約２０以下のアミノ酸残基で構成される。次に、リンカーは、薬物の付着または固体支持物への付着のような、追加的機能のために修飾され得る。一本鎖バリアントは、組換えまたは合成的のいずれかで生み出され得る。ｓｃＦｖの合成産生のために、自動合成装置が使用され得る。ＳｃＦｖの組換え産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドは、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような真核生物、またはＥ．ｃｏｌｉのような原核生物のいずれかの好適な宿主細胞中に導入され得る。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションのような日常的な操作によって作製され得る。生じたｓｃＦｖは、当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離され得る。

例示的な実施形態では、表１ｂに示されるＶＨ配列のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、ならびに／または表１ｃに示されるＶＬ配列のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む、ＤＬＬ３抗原結合ドメインが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、リンカーによって一緒に連結されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７８）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣ（配列番号５６４）を含むＤＮＡ配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｇｇａｇｇａｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｃｔｃｃｇｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｃｔｃｔ（配列番号６３０）を含むＤＮＡ配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３４）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号５３５）を含み得る、ｓｃＦｖ Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーである。ｓｃＦｖ Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーは、ＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＡＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号５６６）を含むＤＮＡ配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、開示されるｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ配列は、ＳｃＦｖのＮ末端に位置しているＶＨ配列、続いてリンカー、次いでＶＬ配列で配向することができ、他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端におけるＶＬ配列、続いてリンカー、次いでＶＨ配列で配向することができる。

ｉｉ．キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ－３抗体剤は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体であるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＤＬＬ－３抗体剤は、キメラ抗体であり得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）を参照されたい）。キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体であり得る。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含むことができる。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体であり得る。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。

いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体であり得る（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１３：１６１９－１６３３（２００８）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８：４８９－４９８（１９９１）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：４３－６０（２００５）、Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：６１－６８（２００５）、ならびにＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）を参照されたい）。ヒト化抗体は、非ヒト超可変領域からのアミノ酸残基およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体である。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変領域（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。

非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化することができる。ヒト化抗体は、非ヒト抗体に由来する、１つ以上のＣＤＲ、またはその部分を含む１つ以上の可変ドメインを含むことができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体配列に由来する、１つ以上のＦＲ、またはその部分を含む１つ以上の可変ドメインを含むことができる。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体における１つ以上のＦＲ残基は、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体からの対応する残基（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）で置換される。

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」方法を使用して選択されるフレームワーク領域、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域、およびＦＲライブラリーをスクリーニングすることから誘導されるフレームワーク領域が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３）、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）、およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）。

ｉｉｉ．ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＤＬＬ－３抗体剤は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技法を使用して産生することができる（例えば、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５：３６８－７４（２００１）、およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０：４５０－４５９（２００８）を参照されたい）。ヒト抗体は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものであり得る。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。ヒト抗体は、インタクトなヒト抗体または抗原チャレンジに応答してヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原（例えば、ＤＬＬ－３タンパク質）を投与することによって調製され得る（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３：１１１７－１１２５（２００５）、米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，１５０，５８４号、同第５，７７０，４２９号、および同第７，０４１，８７０号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号を参照されたい）。そのような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾され得る。

ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。例えば、ヒト抗体は、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、および他の方法を使用して、ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株から産生することができる（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（１９８７）、Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：８６（１９９１）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）、米国特許第７，１８９，８２６号、Ｎｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）、およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）を参照されたい）。ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常領域と組み合わされ得る。

抗体中のオリゴ糖の修飾は、例えば、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するために行うことができる。例えば、抗体グリコシル化バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体など）が不要または有害である用途の望ましい候補となる、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体バリアントを企図することができる。ＣＤＣ活性の低減／枯渇を確認するために、インビトロおよび／またはインビボ細胞毒性アッセイを実施することができる。

ｉｖ．抗体誘導体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体剤は、当該技術分野で知られており、容易に入手可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれ得るが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれ得るが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造する際に利点を有し得る。

ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐または非分岐であり得る。抗体に付着したポリマーの数は変動し得、２つ以上のポリマーが付着している場合、それらは同じまたは異なる分子であり得る。

いくつかの実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体および非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブであり得る（例えば、Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１１６００－１１６０５（２００５）を参照されたい）。放射線は、任意の波長であり得、普通の細胞に害を及ぼさないが、非タンパク質性部分を抗体－非タンパク質性部分の近位の細胞が殺滅される温度に加熱する波長を含み得るが、これらに限定されない。

ＤＬＬ３結合剤（例えば、抗原結合ドメインを含む分子）は、解離定数（Ｋｄ）が約１ｎＭである場合、その標的抗原（例えば、ヒト、カニクイザル、またはマウスＤＬＬ３）に「特異的に結合」すると言われる。抗原結合ドメインは、Ｋｄが１～５ｎＭである場合は「高親和性」で、Ｋｄが０．１～０．５ｎＭである場合は「非常に高親和性」で、抗原に特異的に結合する。一実施形態では、抗原結合ドメインは、約１ｎＭのＫｄを有する。一実施形態では、オフレートは、＜１×１０^-5である。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒトＤＬＬ３に、約１×１０^-7Ｍ～１×１０^-12ＭのＫｄで結合し、さらに別の実施形態では、抗原結合ドメインは、約１ｘ１０^-5Ｍ～１ｘ１０^-12ＭのＫｄで結合するであろう。

本明細書で提供されるように、本開示の抗原結合ドメインは、哺乳動物ＤＬＬ３（例えば、ヒトＤＬＬ３、カニクイザルＤＬＬ３、またはマウスＤＬＬ３）に特異的に結合する。特定の実施形態では、本開示のＤＬＬ３抗原結合ドメインは、哺乳動物ＤＬＬ３に、１×１０^-6Ｍ未満、１×１０^-7Ｍ未満、１×１０^-8Ｍ未満、または１×１０^-9Ｍ未満のＫｄで結合する。１つの特定の実施形態では、ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、哺乳動物ＤＬＬ３（例えば、ヒトＤＬＬ３、カニクイザルＤＬＬ３、またはマウスＤＬＬ３）に、１×１０^-7Ｍ未満のＫｄで結合する。別の実施形態では、ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、哺乳動物ＤＬＬ３（例えば、ヒトＤＬＬ３、カニクイザルＤＬＬ３、またはマウスＤＬＬ３）に、１×１０^-8Ｍ未満のＫｄで結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、哺乳動物ＤＬＬ３（例えば、ヒトＤＬＬ３、カニクイザルＤＬＬ３）に、約１×１０^-7Ｍ、約２×１０^-7Ｍ、約３×１０^-7Ｍ、約４×１０^-7Ｍ、約５×１０^-7Ｍ、約６×１０^-7Ｍ、約７×１０^-7Ｍ、約８×１０^-7Ｍ、約９×１０^-7Ｍ、約１ｘ１０^-8Ｍ、約２×１０^-8Ｍ、約３×１０^-8Ｍ、約４×１０^-8Ｍ、約５×１０^-8Ｍ、約６×１０^-8Ｍ、約７×１０^-8Ｍ、約８×１０^-8Ｍ、約９×１０^-8Ｍ、約１×１０^-9Ｍ、約２×１０^-9Ｍ、約３×１０^-9Ｍ、約４×１０^-9Ｍ、約５×１０^-9Ｍ、約６×１０^-9Ｍ、約７×１０^-9Ｍ、約８×１０^-9Ｍ、約９×１０^-9Ｍ、約１×１０^-10Ｍ、または約５×１０^-10ＭのＫｄで結合する。特定の実施形態では、Ｋｄは、Ｋ_off／Ｋ_onの商として計算され、Ｋ_onおよびＫ_offは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴技術によって測定される、Ｆａｂ断片などの一価抗体を使用して決定される。他の実施形態では、Ｋｄは、Ｋ_off／Ｋ_onの商として計算され、Ｋ_onおよびＫ_offは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴技術によって測定される、Ｆａｂ断片などの二価抗体を使用して決定される。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、哺乳動物ＤＬＬ３（例えば、ヒトＤＬＬ３、カニクイザルＤＬＬ３、またはマウスＤＬＬ３）に、１×１０^-4Ｍ^-1ｓ－¹未満、２×１０^-4Ｍ^-1ｓ－¹未満、３×１０^-4Ｍ^-1ｓ－¹未満、４×１０^-4Ｍ^-1ｓ－¹未満、５×１０^-4Ｍ^-1ｓ－¹未満、７×１０^-4Ｍ^-1ｓ－¹未満、８×１０^-4Ｍ^-1ｓ－¹未満、９×１０^-4Ｍ^-1ｓ－¹未満、１×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、２×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、３×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、４×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、５×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、６×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、７×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、８×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、９×１０^-5Ｍ^-1ｓ－¹未満、１×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、２×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、３×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、４×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、５×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、６×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、７×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、８×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、９×１０^-6Ｍ^-1ｓ－¹未満、または１×１０^-7Ｍ^-1ｓ－¹未満の会合速度（ｋ_on）で結合する。特定の実施形態では、ｋ_onは、例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴技術によって測定されるように、Ｆａｂ断片などの一価抗体を使用して決定される。他の実施形態では、ｋ_onは、例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴技術によって測定されるような二価抗体を使用して決定される。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、哺乳動物ＤＬＬ３（例えば、ヒトＤＬＬ３、カニクイザルＤＬＬ３、またはマウスＤＬＬ３）に、１×１０^-2ｓ^-1未満、２×１０^-2ｓ^-1未満、３×１０^-2ｓ^-1未満、４×１０^-2ｓ^-1未満、５×１０^-2ｓ^-1未満、６×１０^-2ｓ^-1未満、７×１０^-2ｓ^-1未満、８×１０^-2ｓ^-1未満、９×１０^-2ｓ^-1未満、１×１０^-3ｓ^-1未満、２×１０^-3ｓ^-1未満、３×１０^-3ｓ^-1未満、４×１０^-3ｓ^-1未満、５×１０^-3ｓ^-1未満、６×１０^-3ｓ^-1未満、７×１０^-3ｓ^-1未満、８×１０^-3ｓ^-1未満、９×１０^-3ｓ^-1未満、１×１０^-4ｓ^-1未満、２×１０^-4ｓ^-1未満、３×１０^-4ｓ^-1未満、４×１０^-4ｓ^-1未満、５×１０^-4ｓ^-1未満、６×１０^-4ｓ^-1未満、７×１０^-4ｓ^-1未満、８×１０^-4ｓ^-1未満、９×１０^-4ｓ^-1未満、１×１０^-5ｓ^-1未満、または５×１０^-4ｓ^-1未満の解離速度（ｋ_off）で結合する。特定の実施形態では、ｋ_offは、例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴技術によって測定されるように、Ｆａｂ断片などの一価抗体を使用して決定される。他の実施形態では、ｋ_offは、例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴技術によって測定されるような二価抗体を使用して決定される。

ＩＩ．キメラ抗原受容体
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的抗原（例えば、癌細胞上の標的抗原）を特異的に認識するタンパク質である。標的抗原に結合される場合、ＣＡＲは、免疫細胞を活性化して、その抗原を担持する細胞（例えば、癌細胞）を攻撃および破壊し得る。ＣＡＲはまた、それらの効力を高めるために共刺激ドメインまたはシグナル伝達ドメインを組み込み得る。Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ １８８，Ｎｏ．４，１９９８（６１９－６２６）、Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６１：２７９１－２７９７，Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６（２０１２）、Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１）、およびＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３（２０１６）、米国特許第７，７４１，４６５号、および同第６，３１９，４９４号を参照されたい。

本明細書に記載されるキメラ抗原受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ－３特異的ＣＡＲは、５’から３’までの以下の要素：シグナル配列、ＤＬＬ３抗原結合ドメイン（例えば、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ）、ヒンジおよび膜貫通領域、ならびに１つ以上の連続するシグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、ＤＬＬ－３特異的ＣＡＲは、５’から３’までの以下の要素：ＣＤ８αシグナル配列、本明細書に記載されるＤＬＬ３可変重鎖および／または可変軽鎖を含むＤＬＬ３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域、４１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。（図４、表７）。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ－３特異的ＣＡＲは、安全スイッチおよび／またはモノクローナル抗体特異的エピトープをさらに含む。

ａ．抗原結合ドメイン
以上で議論されるように、本明細書に記載されるＤＬＬ３ ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」は、特定の標的抗原に結合する任意のポリペプチドを意味し、例えば、特定の標的抗原は、ＤＬＬ３（ＤＬＬ－３）タンパク質またはその断片であり得る（本明細書では「ＤＬＬ３抗原」、「ＤＬＬ３標的抗原」、または「ＤＬＬ３標的」と交換可能に呼ばれる）。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞上のＤＬＬ３抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、過剰増殖性疾患に関与する細胞上のＤＬＬ３抗原に結合する。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、可変重鎖、可変軽鎖、および／または本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、軽鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに重鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ－３特異的ＣＡＲは、表１ｂに示されるＶＨを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ－３特異的ＣＡＲは、表１ｃに示されるＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ－３特異的ＣＡＲは、表１ｅに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ－３特異的ＣＡＲは、表１ｆに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む。

抗原結合ドメインのバリアント（例えば、ＣＤＲ、ＶＨ、および／またはＶＬのバリアント）もまた、本開示の範囲内であり、例えば、各々が本明細書に記載される抗原結合ドメイン配列のアミノ酸配列と少なくとも７０～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、９７～９９％、または９９％超の同一性を有する可変軽鎖および／または可変重鎖である。いくつかの例では、そのような分子は、少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含むが、他の例では、バリアント形態は、２つの可変軽鎖および２つの可変重鎖（またはそのサブパート）を含有する。当業者は、周知の技法を使用して、本明細書に記載される抗原結合ドメインの好適なバリアントを決定することができるであろう。特定の実施形態では、当業者は、活性にとって重要であるとは考えられない領域を標的化することによって、活性を破壊することなく変更され得る分子の好適な領域を特定することができる。

特定の実施形態では、抗原結合ドメインのポリペプチド構造は、それぞれ、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）、およびそれらの断片を含む、抗体に基づく。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、アビマーを含むか、またはそれからなる。

ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、第２の標的に結合するよりも１つの標的に密接に結合する場合、「選択的」であると言われる。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３特異的ＣＡＲは、表１ｄに提供されるｓｃＦｖを含む。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３特異的ＣＡＲは、リーダーまたはシグナルペプチドを含み、いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号４７７）と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、配列番号４７７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、ＡＴＧＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＴＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣＣＣＧ（配列番号５５５）を含む核酸配列によってコードされる。

他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＤＬＬ３抗原結合ドメインのいずれか１つをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、表１０に記載されるＤＬＬ３ ＣＡＲをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドを含むベクター、およびそれを作製する方法も本明細書で提供される。

ｂ．安全スイッチおよびモノクローナル抗体特異的エピトープ
安全スイッチ
免疫細胞（１つ以上のＣＡＲを含有する）に自殺遺伝子を形質導入することによって、有害事象が最小限に抑えられ得ることが理解されるであろう。誘導性の「オン」または「促進因子」スイッチを免疫細胞に組み込むことが望ましい場合もあり得る。好適な技法には、細胞が本開示のＣＡＲ構築物で形質導入される前、後、またはそれと同時に、誘導性カスパーゼ－９（米国特許出願第２０１１／０２８６９８０号）またはチミジンキナーゼの使用が含まれる。自殺遺伝子および／または「オン」スイッチを導入するための追加の方法には、ＴＡＬＥＮＳ、ジンクフィンガー、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス技術、および当該技術分野で知られている他の技法が含まれる。

本開示によれば、追加のオンオフまたは他のタイプの制御スイッチ技法が本明細書に組み込まれ得る。これらの技法は、二量体化ドメインおよびそのようなドメイン二量体化の任意の活性化因子の使用を採用し得る。これらの技法には、例えば、特定の細胞においてＦＫＢＰ／ラパログ二量体化システムを利用するＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１４ ３５０（６２５８）によって記載されるものが含まれ、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。追加の二量体化技術は、例えば、Ｆｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，１１０，３３１５－３３３６ならびに米国特許第５，８３０，４６２号、同第５，８３４，２６６号、同第５，８６９，３３７号、および同第６，１６５，７８７号に記載され、これらの内容も参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。追加の二量体化対は、シクロスポリン－Ａ／シクロフィリン、受容体、エストロゲン／エストロゲン受容体（任意にタモキシフェンを使用）、グルココルチコイド／グルココルチコイド受容体、テトラサイクリン／テトラサイクリン受容体、ビタミンＤ／ビタミンＤ受容体が含み得る。二量体化技術のさらなる例は、例えば、ＷＯ２０１４／１２７２６１、ＷＯ２０１５／０９０２２９、ＵＳ２０１４／０２８６９８７、ＵＳ２０１５／０２６６９７３、ＵＳ２０１６／００４６７００、米国特許第８，４８６，６９３号、ＵＳ２０１４／０１７１６４９、およびＵＳ２０１２／０１３００７６に見出すことができ、その内容は、参照によってその全体が本明細書にさらに組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、例えば、ＲＱＲ８のような自殺ポリペプチド（ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１５３３９１Ａを参照されたい。ポリヌクレオチドを含むＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）細胞において、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の表面で発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号５５２：
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰ ＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳ ＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号５５２）に示されるアミノ酸配列を含む。

自殺ポリペプチドはまた、アミノ末端におけるシグナルペプチド、例えば、ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡ（配列番号５５３）を含み得る。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号５５４に示されるアミノ酸配列を含み、これは、配列番号５５３：
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号５５４）のシグナル配列を含む。

自殺ポリペプチドがＣＡＲ免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の表面で発現される場合、リツキシマブがポリペプチドのＲエピトープに結合することは、細胞の溶解を引き起こす。リツキシマブの２つ以上の分子は、細胞表面で発現されるポリペプチドごとに結合する可能性がある。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、リツキシマブの別々の分子に結合する可能性がある。ＤＬＬ３特異的ＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の欠失は、例えば、患者にリツキシマブを投与することによって、インビボで起こり得る。移入された細胞を欠失する決定は、例えば、許容されないレベルの毒性が検出される場合など、移入された細胞に起因する患者において検出されている望ましくない影響から生じ得る。

いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ構築物に含まれる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物の一部ではない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＤＬＬ３特異的ＣＡＲのうちのいずれか１つの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に特異的な（すなわち、これによって特異的に認識される）１つ以上のエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書ではｍＡｂ特異的エピトープとも称される。例示的なｍＡｂ特異的エピトープは、その全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１６／１２０２１６号に開示される。これらの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合する抗原結合ドメイン、および１つ以上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する１つ以上のエピトープを含む。ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲは、単鎖または多鎖であり得る。

本明細書に記載されるＣＡＲの細胞外ドメインにおけるモノクローナル抗体に対して特異的なエピトープの包含は、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞の選別および枯渇を可能にする。いくつかの実施形態では、この特徴はまた、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞の投与によって枯渇した内因性ＤＬＬ３発現細胞の回復を促進する。いくつかの実施形態では、枯渇を可能にすることは、例えば対象への投与時の有害な影響の場合に、安全スイッチを提供する。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲを付与された操作された免疫細胞を選別および／または枯渇させるための方法、ならびに内因性ＤＬＬ３発現細胞の回復を促進するための方法に関する。

いくつかのエピトープ－モノクローナル抗体カップルを使用して、モノクローナル抗体特異的エピトープ、特に、非限定的な例としてのＣＤ２０エピトープ／リツキシマブなどの、すでに医療用途で承認されているものを含むＣＡＲを生成することができる。

本開示はまた、ｍＡｂ特異的エピトープを発現するＤＬＬ３特異的ＣＡＲを付与された操作された免疫細胞を選別するための方法、およびこれらのＣＡＲを付与された操作された免疫細胞の活性化が、当該ＣＡＲの外部リガンド結合ドメインを標的とする抗体を使用して細胞を枯渇させることによって調節される治療方法を包含する。表４は、本開示のＣＡＲのうちのいずれか１つの細胞外ドメインに挿入することができる例示的なミモトープ配列を提供する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、以下の配列：
－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－、
－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－、
－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_x－、
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂、
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂、
－エピトープ１－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_x－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂、
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x、
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_x－、
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_x－エピトープ４－（Ｌ）_x－、
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_x－、
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－Ｖ₁－Ｌ₁－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_x－エピトープ４－（Ｌ）_x－、
－Ｖ₁－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₂、
－Ｖ₁－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x、
－Ｖ₁－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_x、
－Ｖ₁－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_x－エピトープ４－（Ｌ）_x、
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₁－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－Ｖ₂、または
－（Ｌ）_x－エピトープ１－（Ｌ）_x－Ｖ₁－（Ｌ）_x－エピトープ２－（Ｌ）_x－Ｖ₂－（Ｌ）_x－エピトープ３－（Ｌ）_xを含み、
－式中、
－Ｖ₁は、Ｖ_Lであり、Ｖ₂は、Ｖ_Hであるか、またはＶ₁は、Ｖ_Hであり、Ｖ₂は、Ｖ_Lであり、
－Ｌ₁は、Ｖ_H鎖をＶ_L鎖に連結するために適したリンカーであり、
－エピトープ１、エピトープ２、エピトープ３、およびエピトープ４は、ｍＡｂ特異的エピトープであり、同一であり、または

ｃ．ヒンジドメイン
本開示のＣＡＲの細胞外ドメインは、「ヒンジ」ドメイン（またはヒンジ領域）を含み得る。用語は、一般に、ＣＡＲにおける膜貫通ドメインをＣＡＲにおける細胞外抗原結合ドメインに連結するように機能する任意のポリペプチドを指す。特に、ヒンジドメインを使用して、細胞外抗原結合ドメインにより多くの柔軟性およびアクセス可能性を提供することができる。

ヒンジドメインは、最大３００個のアミノ酸、いくつかの実施形態では１０～１００個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態では２５～５０個のアミノ酸を含み得る。ヒンジドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、またはＩｇＧの細胞外領域の全部もしくは一部（特に、ＩｇＧのヒンジ領域、ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、もしくはその断片などの免疫グロブリンファミリーのメンバーの一部もしくは全部を含有し得ることが理解されるであろう）、または抗体重鎖定常領域の全部もしくは一部などの、天然発生分子の全部または一部に由来し得る。代替的には、Ａドメインは、天然に発生するＡ配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、当該Ａドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、当該ヒンジおよび膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲのヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＰＤ－１、またはＦｃγＲＩＩＩαのサブ配列、特に、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＰＤ－１、またはＦｃγＲＩＩＩαのうちのいずれかのヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ヒトＩｇＧ４、ヒトＰＤ－１、またはヒトＦｃγＲＩＩＩαヒンジを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ならびに４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む。表５は、本明細書で提供される例示的なヒンジのアミノ酸配列を提供する。

特定の実施形態では、ヒンジ領域は、本明細書において表５に記載される細胞外ドメインアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

ｄ．膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合している膜貫通ドメインで設計されている。同様に、ＣＡＲの細胞内ドメインに融合させることができる。いくつかの場合では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するために、アミノ酸置換によって選択または修飾することができる。いくつかの実施形態では、短いリンカーは、ＣＡＲの細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインのいずれかまたはいくつかの間の結合を形成し得る。

本明細書に開示されるＣＡＲに適した膜貫通ドメインは、（ａ）例えば、限定なく、Ｔヘルパー（Ｔ_h）細胞、細胞毒性Ｔ（Ｔ_c）細胞、Ｔ調節性（Ｔ_reg）細胞、もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球細胞などの免疫細胞を表面で発現する能力、ならびに／または（ｂ）標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を誘導するために細胞外抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力を有する。

膜貫通ドメインは、天然または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。

本開示における特定の使用の膜貫通領域は、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１－１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ １ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ １ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１ １ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１ １ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせに由来（これを含むか、またはこれに対応）し得る。

非限定的な例として、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、例えば、ＣＤ３複合体を構成するα、β、γ、もしくはδポリペプチド、ＩＬ－２受容体ｐ５５（鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖、特にＦｃγ受容体ＩＩＩもしくはＣＤタンパク質に由来するか、またはその一部分であり得る。代替的には、膜貫通ドメインは、合成的であり得、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態では、当該膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号５４９）を含むＣＤ８α膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号５４９の膜貫通アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにおけるヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号４７９のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインである。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５５０）のアミノ酸配列を含むＣＤ２８膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号５５０の膜貫通アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。

ｅ．細胞内ドメイン
本開示のＣＡＲの細胞内（細胞質）ドメインは、ＣＡＲを含む免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化、例えば、シグナル１／活性化および／またはシグナル２／共刺激を提供することができる。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性を指し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおける使用のための活性化細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、限定なく、抗原受容体の連結後にシグナル形質導入を開始するように協調して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。

好適な（例えば、活性化）細胞内ドメインは、これらに限定されないが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１－１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ １ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ １ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１ １ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１ １ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせに由来する（または対応する）シグナル伝達ドメインを含むことが理解されるであろう。

本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、以上に記載される活性化ドメインに加えて、それらの効力を高めるために、共刺激シグナル伝達ドメイン（本明細書では共刺激分子と交換可能に呼ばれる）を組み込み得る。共刺激ドメインは、本明細書に記載される活性化分子によって提供される一次シグナルに加えてシグナルを提供することができる。

本開示の範囲内の好適な共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１（ＣＤ１ １ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４、ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦＲ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１－１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１－１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１－１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１－１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンド、またはそれらの断片もしくは組み合わせに由来（または対応）することができる。以上に列挙されていない、追加の共刺激分子、またはその断片は、本開示の範囲内にあることが理解されるであろう。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、それ自体で、または本開示のＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせて、４１ＢＢ／ＣＤ１３７ドメインを含むように設計することができる。４１ＢＢ／ＣＤ１３７の完全天然アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１５５２．２に記載される。完全天然４１ＢＢ／ＣＤ１３７核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１５６１．５に記載される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、それ自体で、または本開示のＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせて、ＣＤ２８ドメインを含むように設計することができる。ＣＤ２８の完全天然アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６１３０．１に記載される。完全天然ＣＤ２８核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６１３９．１に記載される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、それ自体で、または本開示のＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせて、ＣＤ３ゼータドメインを含むように設計することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、表７における配列番号４８１で示されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むことができる。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達分子の一部分を含むことができる。本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結され得る。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータの活性化ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータの活性化ドメインおよび４－１ＢＢの共刺激／シグナル伝達ドメインを含むように設計される。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ（細胞内ドメイン）は、アミノ酸配列
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号４８０）を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ（細胞内ドメイン）は、核酸配列：ＡＡＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧ（配列番号５６８）によってコードされる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータの一部分を含むように設計され、細胞内ＣＤ２８は、配列番号５６７に示される核酸配列を含む。
ＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣ ＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣ（配列番号５６７）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、アミノ酸配列ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号５５１）を含むように設計される。ＣＤ３ゼータアミノ酸配列は、配列番号４８１または４６９を含み得、核酸配列は、配列番号５６９：
ＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＧ（配列番号５６９）を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８０および配列番号５５１で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の配列同一性、および／または配列番号５５１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の配列同一性を含む、アミノ酸配列を含む。

例示的な実施形態では、本開示のＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、（切断可能な）ＣＤ８αシグナル配列、ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞質（共刺激）シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ細胞質（刺激）シグナル伝達ドメインを含む。

ＩＩＩ．ＣＡＲを含む免疫細胞
ａ．免疫細胞
本開示のＣＡＲを発現する操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは、異なる細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは、同じ細胞外抗原結合ドメインを含む。

操作された免疫細胞は、同種または自家であり得る。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、炎症性Ｔリンパ球、細胞毒性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）、ヘルパーＴリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、またはＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞は、マクロファージである。いくつかの例示的な実施形態では、操作された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、例えば、限定なく、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血から得られるか、または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られるか、または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄から得られるか、または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、臍帯血から得られるか、または調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃（例えば、遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、ウイルストランスフェクション（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、ＡＡＶ）、またはポリプレックスからなる群から選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される。

いくつかの実施形態では、それらの細胞表面膜で本開示のＤＬＬ３特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を超える幹細胞メモリーおよびセントラルメモリー細胞のパーセンテージを含む。いくつかの実施形態では、それらの細胞表面膜で本開示のＤＬＬ３特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞は、約１０％～約１００％、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約１５％～約１００％、約１５％～約９０％、約１５％～約８０％、約１５％～約７０％、約１５％～約６０％、約１５％～約５０％、約１５％～約４０％、約１５％～約３０％、約２０％～約１００％、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３０％、約３０％～約１００％、約３０％～約９０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％、約３０％～約５０％、約３０％～約４０％、約４０％～約１００％、約４０％～約９０％、約４０％～約８０％、約４０％～約７０％、約４０％～約６０％、約４０％～約５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約５０％～約６０％、約６０％～約１００％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、約６０％～約７０％、約７０％～約９０％、約７０％～約８０％、約８０％～約１００％、約８０％～約９０％、約９０％～約１００％、約２５％～約５０％、約７５％～約１００％、または約５０％～約７５％の幹細胞メモリーおよびセントラルメモリー細胞のパーセンテージを含む。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲのうちのいずれか１つを発現する炎症性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲのうちのいずれか１つを発現する細胞毒性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲのうちのいずれか１つを発現する調節性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲのうちのいずれか１つを発現するヘルパーＴリンパ球である。

増殖および遺伝学的修飾の前に、細胞の供給源は、さまざまな非限定的な方法を通じて対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつもの非限定的な供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、当業者に利用可能であり、既知である任意の数のＴ細胞株を使用し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、健常ドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の部分であり得る。

上記の方法のうちのいずれかに従って形質転換された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）から得られる細胞株も本明細書で提供される。免疫抑制治療に耐性のある修飾細胞も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本開示による単離された細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。

本開示の免疫細胞は、一般に知られている方法を使用して、免疫細胞の遺伝子修飾の前または後のいずれかで、活性化および増殖することができる。一般に、本開示の操作された免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを作成するために、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３ ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激する薬剤と接触することにより、増殖し得る。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテート（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のような分裂促進性レクチンのような化学物質を、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを作成するために使用し得る。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、例えば、ＯＫＴ３抗体などの抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合断片、もしくは表面上に固定された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わされたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子を結合するリガンドを、使用する。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３抗体）および抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、プラスチックもしくは磁気ビーズなどのビーズ、またはプレートもしくは他の基板上に配置することができる。Ｔ細胞培養に適した条件は、血清（例えば、ウシ胎児もしくはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータ、およびＴＮＦ、または当業者に既知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＭｅｄｉａもしくはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の成長のための他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート（ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）、ならびにＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、血清を含まないか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは定義されたセットのホルモン、ならびに／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカイン（例えば、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５）が補充されているかのいずれかである、ＲＰＭＩ １６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含むことができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象中に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するために必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気および５％ＣＯ₂）下で維持される。さまざまな刺激時間に曝露されているＴ細胞は、異なる特徴を呈することができる。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖され得る。細胞はまた、例えば、細胞を対象中に投与した後、対象の血液においてインビボで増殖され得る。

いくつかの実施形態では、本開示による操作された免疫細胞は、１つ以上の破壊または不活化された遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示による操作された免疫細胞は、ＣＤ５２、ＤＬＬ３、ＧＲ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＨＬＡ、ＴＣＲα、およびＴＣＲβからなる群から選択される１つの破壊もしくは不活化された遺伝子を含み、かつ／またはＣＡＲ、多重鎖ＣＡＲ、および／もしくはｐＴα導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、単離された細胞は、多重鎖ＣＡＲを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示による単離された細胞は、ＣＤ５２およびＧＲ、ＣＤ５２およびＴＣＲα、ＣＤＲ５２およびＴＣＲβ、ＤＬＬ３およびＣＤ５２、ＤＬＬ３およびＴＣＲα、ＤＬＬ３およびＴＣＲβ、ＧＲおよびＴＣＲα、ＧＲおよびＴＣＲβ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ＰＤ－１およびＴＣＲα、ＰＤ－１およびＴＣＲβ、ＣＴＬＡ－４およびＴＣＲα、ＣＴＬＡ－４およびＴＣＲβ、ＬＡＧ３およびＴＣＲα、ＬＡＧ３およびＴＣＲβ、ＴＩＭ３およびＴＣＲα、Ｔｉｍ３およびＴＣＲβ、ＢＴＬＡおよびＴＣＲα、ＢＴＬＡおよびＴＣＲβ、ＢＹ５５およびＴＣＲα、ＢＹ５５およびＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲα、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲα、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲβ、２Ｂ４およびＴＣＲα、２Ｂ４およびＴＣＲβからなる群から選択される２つの破壊もしくは不活化された遺伝子を含み、かつ／またはＣＡＲ、多重鎖ＣＡＲ、およびｐＴα導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、方法は、選択的ＤＮＡ切断によって遺伝子を選択的に不活化することができるエンドヌクレアーゼを細胞中に導入することによって１つ以上の遺伝子を破壊または不活化することを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ／ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ（例えば、Ｃａｓ９）エンドヌクレアーゼであり得る。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子を破壊または不活化することにより、本開示に従って、細胞において機能的ではなくなる。いくつかの実施形態では、個体に由来する修飾細胞を得る方法が提供され、細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）シグナル伝達経路とは独立して増殖することができる。ＭＨＣシグナル伝達経路とは独立して増殖することができ、この方法によって得られやすい修飾細胞は、本開示の範囲に含まれる。本明細書に開示される修飾細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して治療を必要とする患者を治療するために使用することができ、したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して治療を必要とする患者を治療する方法であって、当該患者に破壊または不活化されたＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子を含む有効量の修飾細胞を投与することによって当該患者を治療することを含む方法は、本開示の範囲内である。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、１つ以上の化学療法薬に耐性があるように操作される。化学療法薬は、例えば、プリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）であり得、したがって、免疫細胞を、養子免疫療法と化学療法を組み合わせた癌治療に適したものにする。例示的なＰＮＡは、例えば、クロファラビン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびシタラビンを、単独でまたは組み合わせて含む。ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）によって一リン酸、二リン酸、および三リン酸のＰＮＡに代謝される。それらの三リン酸型は、ＤＮＡ合成についてＡＴＰと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。破壊または不活化されたｄＣＫ遺伝子を含むＤＬＬ３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ｄＣＫノックアウト細胞は、例えば、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによる、ｄＣＫ遺伝子に指向した特定のＴＡＬヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用するＴ細胞のトランスフェクションによって作製される。ｄＣＫノックアウトＤＬＬ３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、例えば、クロロファラビンおよび／またはフルダラビンを含むＰＮＡに耐性があり、ＤＬＬ３発現細胞に対するＴ細胞の細胞毒性活性を維持する。

いくつかの実施形態では、本開示の単離された細胞または細胞株は、ｐＴαまたはその機能的バリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、単離された細胞または細胞株は、ＴＣＲα遺伝子を破壊または不活化することによってさらに遺伝子修飾され得る。

本開示はまた、本明細書に記載されるＣＡＲポリヌクレオチドのいずれかを含む操作された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞中に導入され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを受けた細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含むことができる。

ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞中への導入後に、細胞においてインサイチュで合成され得る。代替的には、ＣＡＲポリペプチドは、細胞の外側で産生され、次いで細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を細胞中に導入するための方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、（例えば、レンチウイルスベクターを使用する）安定な形質転換方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノム中に組み込むことができる。他の実施形態では、一過性形質転換方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物、および細胞のゲノム中に組み込まれないポリヌクレオチド構築物を一過的に発現することができる。他の実施形態では、ウイルス媒介性方法が、使用され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどのような任意の好適な手段によって細胞中に導入され得る。一過性形質転換方法は、例えば、限定なく、微量注射、電気穿孔または粒子衝撃を含む。ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターのようなベクターに含まれ得る。

いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３抗原結合ドメイン、少なくとも１つの共刺激分子、および活性化ドメインをコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ウイルスベクター内に含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、プラスミド内に含まれる。

ｂ．作製の方法
本開示のＣＡＲおよびＣＡＲ含有免疫細胞を作製する方法が本明細書で提供される。

本開示による、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、抗原結合ドメイン、免疫細胞、組成物などを作製する際に、様々な既知の技法を利用することができる。

本明細書に記載される免疫細胞のインビトロ操作または遺伝子修飾の前に、細胞を対象から得ることができる。ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する細胞は、同種または自家プロセスに由来し得る。

ｉ．供給源材料
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源から得られることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの、当業者に知られている任意の数の技法を使用して、対象から収集される血液の単位から得ることができる。

細胞は、アフェレーシスによって個体の循環血液から得ることができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む、リンパ球を含有する。特定の実施形態では、アフェレーシスによって収集される細胞は、血漿画分を除去するために洗浄され得、その後の処理のために適切なバッファーまたは培地に入れられ得る。

特定の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離を使用して、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、ＰＢＭＣから単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団（例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤＳ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤＳ＋、ＣＤ６２－、ＣＤ９５－、ＣＤ９５＋、ＩＬ２Ｒβ＋、ＩＬ２Ｒβ－、ＣＣＲ７＋、ＣＣＲ７－、ＣＤＬ－、ＣＤ６２Ｌ＋、およびそれらの組み合わせ）は、当該技術分野で知られている正または負の選択技法によってさらに単離することができる。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５－、ＩＬ－２Ｒβ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒβ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒβ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒβ＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ６２Ｌ－である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒβ＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ６２Ｌ－である。例えば、負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負の選択をされた細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで達成することができる。本明細書における使用のための１つの方法は、負の選択をされた細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞選別もまた、本開示における使用のために目的の細胞集団を単離するために使用され得る。

ＰＢＭＣは、本明細書に記載される方法を使用して、免疫細胞（ＣＡＲまたはＴＣＲなど）による遺伝子修飾に直接使用され得る。特定の実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、Ｔリンパ球は、さらに単離することができ、細胞毒性およびヘルパーＴリンパ球の両方は、遺伝子修飾および／または増殖の前または後のいずれかで、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターＴ細胞亜集団に選別することができる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、これらのタイプのＣＤ８＋細胞の各々に関連する特徴的な細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ、幹細胞メモリー、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞にさらに選別される。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに対して陰性である。いくつかの実施形態では、幹細胞メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７に対して陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンに対して陽性である。

特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、亜集団にさらに選別される。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、特徴的な細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによって、ナイーブ、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞に選別することができる。

ｉｉｉ．幹細胞由来の免疫細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導性多能性幹細胞、ｉＰＳＣ、造血幹細胞、および間葉系幹細胞などの、幹細胞に由来し得る。ｉＰＳ細胞および他のタイプの幹細胞は、培養された不死細胞株であるか、または患者から直接単離され得る。幹細胞を単離、発達、および／または培養するための様々な方法が当該技術分野で知られており、本発明を実施するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、再プログラム化Ｔ細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、供給源材料は、Ｔ細胞または非Ｔ細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。あるいは、供給源材料は、Ｂ細胞、または末梢血単核細胞分離株からの任意の他の細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、または任意の他の体細胞型であり得る。

ｉｉ．単離された細胞の遺伝子修飾
Ｔ細胞などの免疫細胞は、既知の方法を使用して単離後に遺伝子修飾することができるか、または免疫細胞は、遺伝子修飾される前にインビトロで活性化および増殖（または前駆細胞の場合は分化）することができる。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、内因性ＴＣＲαおよび／またはＣＤ５２の発現を低減または排除するように遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ１２、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ）を使用して遺伝子修飾されて、内因性タンパク質の発現を低減または排除する（例えば、ＴＣＲαおよび／またはＣＤ５２）。別の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫細胞は、任意に、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体でさらに遺伝子修飾され（例えば、ＣＡＲをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで形質導入され）、次いで活性化および／またはインビトロで増殖される。

Ｔ細胞を活性化および増殖するための方法は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第６，９０５，８７４号、米国特許第６，８６７，０４１号、米国特許第６，７９７，５１４号、およびＰＣＴ ＷＯ２０１２／０７９０００に記載され、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。一般に、そのような方法は、ＩＬ－２などの適切なサイトカインを含む培養培地において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を刺激分子および共刺激分子、例えば、一般にプラスチックもしくは磁気ビーズまたは他の表面に付着した、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体と接触させることを含む。同じビーズに付着した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体は、「サロゲート」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。一例は、ヒトＴ細胞の生理学的活性化のためのＣＤ３／ＣＤ２８活性化因子／刺激因子システムである、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システムである。他の実施形態では、Ｔ細胞は、それらの内容が、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０４０，１７７号、米国特許第５，８２７，６４２号、およびＷＯ２０１２／１２９５１４に記載されるものなどの方法を使用して、フィーダー細胞ならびに適切な抗体およびサイトカインで増殖するように活性化および刺激され得る。

本開示の構築物および操作された免疫細胞を作製するための特定の方法は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／１４５２０に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞毒性リンパ球をさらに含むことができることが理解されるであろう。本明細書に開示されるようなキメラ受容体のコード配列を保有する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団に導入することができる。発現ベクターを保有する成功裏に形質導入されたＴ細胞を、フローサイトメトリーを使用して選別して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いでさらに増殖させて、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ－２または本明細書の他の場所に記載される当該技術分野で知られる他の方法を使用した細胞活性化に加えて、これらのＣＡＲ発現Ｔ細胞の数を増加することができる。標準的な手順は、ヒト対象における使用のための保存および／または調製のためにＣＡＲを発現するＴ細胞の凍結保存に使用される。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、および／または増殖は、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍおよびｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）などの非ヒト動物由来産物の不在下で行われる。一実施形態では、凍結保存は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）などの好適な培地において凍結することを含むことができる。

ポリヌクレオチドのクローニングのために、ベクターは、宿主細胞（単離された宿主細胞）に導入され、ベクター自体の複製を可能にし、それにより、その中に含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅し得る。クローニングベクターは、一般に、複製起点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、および選択可能なマーカーを含むが、これらに限定されない、配列成分を含有し得る。これらの要素は、当業者によって適切に選択され得る。例えば、複製起点は、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を促進するように選択され得る。

特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるベクターを含有する単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクターに含有されるポリヌクレオチドの発現またはクローニングに有用であり得る。好適な宿主細胞には、これらに限定されないが、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞などの高等真核細胞、より具体的にはヒト細胞が含まれ得る。

ベクターは、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質媒介送達、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイル衝撃、受容体媒介遺伝子送達、ポリリジン、ヒストン、キトサン、およびペプチドによって媒介される送達を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して宿主細胞に導入することができる。目的のベクターの発現のための細胞のウイルストランスフェクションおよび形質転換のための標準的な方法は、当該技術分野でよく知られている。さらなる実施形態では、異なる発現ベクターの混合物は、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子修飾する際に使用することができ、各ベクターは、本明細書に開示されるように異なるＣＡＲをコードする。結果として生じる形質導入された免疫エフェクター細胞は、操作された細胞の混合集団を形成し、ある割合の操作された細胞が２つ以上の異なるＣＡＲを発現する。

一実施形態では、本開示は、ＤＬＬ３タンパク質を標的とするＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞を保存する方法を提供する。一実施形態では、これは、細胞が解凍時に生存し続けるように免疫細胞を凍結保存することを含む。一実施形態では、凍結保存は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）などの好適な培地において凍結することを含むことができる。ＣＡＲを発現する免疫細胞の画分は、悪性腫瘍に罹患した患者の将来の治療のためにそのような細胞の恒久的な供給源を提供するために、当該技術分野で知られている方法によって凍結保存することができる。必要に応じて、凍結保存された形質転換免疫細胞は、解凍し、成長させ、より多くのそのような細胞のために増殖させることができる。

いくつかの実施形態では、細胞は、まずそれらの培養培地からそれらを採取し、次いで治療有効量での投与に適した培地および容器システム（「薬学的に許容される」担体）において細胞を洗浄および濃縮することによって製剤化される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には正常生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（商標）Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）、またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であり得るが、水中の５％デキストロースまたはリンゲルの乳酸も利用することができる。注入培地には、ヒト血清アルブミンを補充することができる。

ｉｖ．同種ＣＡＲ Ｔ細胞
簡潔には、同種ＣＡＲ Ｔ療法、またはＡｌｌｏＣＡＲ（商標）を製造するためのプロセスには、健康なドナーから健康な、選択され、スクリーニングされ、試験されたＴ細胞を採取することが含まれる。同種Ｔ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを低減し、同種拒絶を防止するための遺伝子編集である。選択されたＴ細胞受容体遺伝子（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ）は、ＧｖＨＤを回避するためにノックアウトされる。ＣＤ５２遺伝子をノックアウトして、ＣＡＲ Ｔ産物を抗ＣＤ５２抗体治療に対して耐性にすることもできる。したがって、抗ＣＤ５２抗体治療を使用して、宿主免疫系をリンパ球枯渇させ、ＣＡＲ Ｔ細胞を生着したままにさせて、完全な治療効果を達成することができる。次に、Ｔ細胞は、血液腫瘍または固形腫瘍で発現する特定の細胞表面タンパク質（例えば、ＤＬＬ－３）を認識する、ＣＡＲを発現するように操作される。次いで、操作されたＴ細胞は、精製ステップを経て、最終的には患者への送達のためにバイアルにおいて凍結保存される。

ｖ．自家ＣＡＲ Ｔ細胞
自家キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、患者自身の細胞（例えば、Ｔ細胞を含む白血球）を収集し、Ｔ細胞を遺伝子操作して、１つ以上の特異的癌細胞の細胞表面に発現した標的抗原を認識し、癌細胞を殺滅するＣＡＲを発現させることを含む。次いで、操作された細胞は凍結保存され、その後、操作のために細胞が取り出された患者に投与される。

ＩＶ．治療の方法
本開示は、患者における望ましくないおよび／または上昇したＤＬＬ３レベルに関連する状態を治療または予防するための方法を含み、それを必要とする患者に有効量の少なくとも１つのＣＡＲ、または本明細書に開示されるＣＡＲを含む免疫細胞を投与することを含む。

癌を含む、疾患または障害を治療するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、有効量の本出願の操作された免疫細胞を対象に投与することを含む、対象におけるＴ細胞媒介性免疫応答を形成することに関する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞媒介性免疫応答は、標的細胞に対して向けられる。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、当該方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載される少なくとも１つの単離された抗原結合ドメインを投与することを含む。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、当該方法は、それを必要とする対象に、有効量の少なくとも１つの免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、少なくとも１つのキメラ抗原受容体、および／または本明細書に記載される単離された抗原結合ドメインを含む。本開示の免疫細胞を含有するＣＡＲは、ＤＬＬ３の異常発現を伴う悪性腫瘍を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞を含有するＣＡＲを使用して、小細胞肺癌、黒色腫、低悪性度神経膠腫、神経膠芽腫、甲状腺髄様癌、カルチノイド、膵臓、膀胱、および前立腺における分散性神経内分泌腫瘍、精巣癌、ならびに神経内分泌特徴を有する肺腺癌などの悪性腫瘍を治療することができる。例示的な実施形態では、ＣＡＲ含有免疫細胞、例えば、本開示の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、小細胞肺癌を治療するために使用される。

本開示の操作された細胞を対象に投与することを含む、対象における腫瘍のサイズを低減するための方法も提供され、細胞は、ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を含み、腫瘍上のＤＬＬ３抗原に結合する。

いくつかの実施形態では、対象は、固形腫瘍、またはリンパ腫もしくは白血病などの血液悪性腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、小細胞肺癌に見られる腫瘍床などの腫瘍床に送達される。いくつかの実施形態では、癌は、対象の骨髄に存在する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、自家免疫細胞、例えば、自家Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、同種免疫細胞、例えば、同種Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、異種免疫細胞、例えば、異種Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、エクスビボでトランスフェクトまたは形質導入される。本明細書で使用される場合、「インビトロ細胞」という用語は、エクスビボで培養される任意の細胞を指す。

治療剤、例えば、操作されたＣＡＲ Ｔ細胞の「治療有効量」、「有効用量」、「有効量」、または「治療有効投与量」は、単独でまたは別の治療剤と組み合わせて使用される場合、疾患の発症に対して対象を保護するか、または疾患症状の重症度の低下、疾患無症状期間の頻度および期間の増加、もしくは疾患の苦痛による機能障害もしくは能力障害の予防によって証明される疾患の退行を促進する任意の量である。疾患の退行を促進する治療剤の能力は、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデルシステムにおいてなど、熟練した従事者（例えば、医師もしくは臨床医）に知られている様々な方法を使用して、またはインビトロアッセイで薬剤の活性をアッセイすることによって評価することができる。

「患者」および「対象」という用語は、交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物対象、ならびに正式に診断された障害を有する対象、正式に認識された障害を有しない対象、医療処置を受けている対象、障害を発症するリスクのある対象などを含む。

「治療する」および「治療」という用語は、治療的処置、予防的処置、および対象が障害または他のリスク因子を発症するリスクを低減する用途を含む。治療は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状または潜在的リスク因子を低減する実施形態を包含する。「予防する」という用語は、事象の可能性の１００％排除を必要としない。むしろ、それは、化合物または方法の存在下で事象の発生の可能性が低減したことを示す。

組成物中の細胞の所望の治療総量は、少なくとも２つの細胞（例えば、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞および少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞、もしくは２つのＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくは２つのＣＤ４＋Ｔ細胞）を含むか、またはより典型的には１０²個超の細胞、および最大１０⁶個、最大１０⁸または１０⁹個の細胞であり、１０¹⁰または１０¹²個以上の細胞であり得る。細胞の数は、組成物が意図される所望の用途、およびそこに含まれる細胞のタイプに依存するであろう。所望の細胞の密度は、典型的には１０⁶細胞／ｍｌ超であり、一般的には１０⁷細胞／ｍｌ超であり、一般的には１０⁸細胞／ｍｌ以上である。臨床的に関連する数の免疫細胞を、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰、１０¹¹、または１０¹²個の細胞に累積的に等しいか、またはこれを超える複数の注入に分配することができる。本開示のいくつかの態様では、特に、すべての注入された細胞が特定の標的抗原（例えば、ＤＬＬ３）に向け直されるので、１０⁶／キログラム（患者あたり１０⁶～１０¹¹）の範囲の、より低い数の細胞が投与され得る。ＣＡＲ治療は、これらの範囲内の投与量で複数回投与され得る。細胞は、療法を受けている患者に対して自家、同種、または異種であり得る。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効量は、約１Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、約２Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、約３Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、約４Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、約５Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、約６Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、約７Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、約８Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、約９Ｘ１０⁵細胞／ｋｇ、２Ｘ１０⁶細胞／ｋｇ、約３Ｘ１０⁶細胞／ｋｇ、約４Ｘ１０⁶細胞／ｋｇ、約５Ｘ１０⁶細胞／ｋｇ、約６Ｘ１０⁶細胞／ｋｇ、約７Ｘ１０⁶細胞／ｋｇ、約８Ｘ１０⁶細胞／ｋｇ、約９Ｘ１０⁶細胞／ｋｇ、約１Ｘ１０⁷細胞／ｋｇ、約２Ｘ１０⁷細胞／ｋｇ、約３Ｘ１０⁷細胞／ｋｇ、約４Ｘ１０⁷細胞／ｋｇ、約５Ｘ１０⁷細胞／ｋｇ、約６Ｘ１０⁷細胞／ｋｇ、約７Ｘ１０⁷細胞／ｋｇ、約８Ｘ１０⁷細胞／ｋｇ、または約９Ｘ１０⁷細胞／ｋｇである。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ＋／ＣＡＲ－Ｔ＋細胞の標的用量は、約１×１０⁶～約１×１０¹⁰細胞／ｋｇの範囲、例えば、約１×１０⁶細胞／ｋｇ、約１×１０⁷細胞／ｋｇ、約１×１０⁸細胞／ｋｇ、約１×１０⁹細胞／ｋｇ、または約１×１０¹⁰細胞／ｋｇである。この範囲の上下の用量は、特定の対象に適切であり得、適切な用量レベルは、必要に応じて医療提供者によって決定され得ることが理解されるであろう。加えて、本開示に従って、細胞の複数用量を提供することができる。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される少なくとも１つの抗原結合ドメインおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、追加の活性剤をさらに含む。

本開示のＣＡＲ発現細胞集団は、単独で、または希釈剤および／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わされた薬学的組成物として投与され得る。本開示の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されるＴ細胞などのＣＡＲ発現細胞集団を含み得る。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などのバッファー、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含み得る。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。

薬学的組成物（溶液、懸濁液など）は、以下：無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、固定油、例えば、溶媒または懸濁媒体として役立ち得る合成モノまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；バッファー、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張性の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースのうちの１つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入することができる。治療用途について、注射可能な薬学的組成物は、好ましくは無菌である。

いくつかの実施形態では、患者への投与時に、それらの細胞表面で本明細書に記載されるＤＬＬ３特異的ＣＡＲのうちのいずれか１つを発現する操作された免疫細胞は、患者の内因性ＤＬＬ３発現細胞を低減、殺滅、または溶解し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３特異的ＣＡＲのうちのいずれか１つを発現する操作された免疫細胞によるＤＬＬ３発現内因性細胞またはＤＬＬ３を発現する細胞株の細胞のパーセンテージ低減または溶解は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上である。一実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３特異的ＣＡＲのうちのいずれか１つを発現する操作された免疫細胞によるＤＬＬ３発現内因性細胞またはＤＬＬ３を発現する細胞株の細胞のパーセンテージ低減または溶解は、約５％～約９５％、約１０％～約９５％、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２５％～約７５％、または約２５％～約６０％である。一実施形態では、内因性ＤＬＬ３発現細胞は、内因性ＤＬＬ３発現骨髄細胞である。

一実施形態では、本開示のＤＬＬ３特異的ＣＡＲをそれらの細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞による、標的細胞、例えば、ＤＬＬ３を発現する細胞株のパーセント低減または溶解を、本明細書に開示されるアッセイを使用して測定することができる。

方法は、本明細書で提供される操作された細胞を投与する前に、１つ以上の化学療法剤を患者に投与することをさらに含むことができる。特定の実施形態では、化学療法剤は、リンパ球枯渇（プレコンディショニング）化学療法剤である。例えば、Ｔ細胞療法を必要とする患者をコンディショニングする方法は、患者に特定の有益な用量のシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｍ²／日～２０００ｍｇ／ｍ²／日、約１００ｍｇ／ｍ²／日～約２０００ｍｇ／ｍ²／日、例えば、約１００ｍｇ／ｍ²／日、約２００ｍｇ／ｍ²／日、約３００ｍｇ／ｍ²／日、約４００ｍｇ／ｍ²／日、約５００ｍｇ／ｍ²／日、約６００ｍｇ／ｍ²／日、約７００ｍｇ／ｍ²／日、約８００ｍｇ／ｍ²／日、約９００ｍｇ／ｍ²／日、約１０００ｍｇ／ｍ²／日、約１５００ｍｇ／ｍ²／日、または約２０００ｍｇ／ｍ²／日）、および特定の用量のフルダラビン（２０ｍｇ／ｍ²／日～９００ｍｇ／ｍ²／日、約１０ｍｇ／ｍ²／日～約９００ｍｇ／ｍ²／日、例えば、約１０ｍｇ／ｍ²／日、約２０ｍｇ／ｍ²／日、約３０ｍｇ／ｍ²／日、約４０ｍｇ／ｍ²／日、約４０ｍｇ／ｍ²／日、約５０ｍｇ／ｍ²／日、約６０ｍｇ／ｍ²／日、約７０ｍｇ／ｍ²／日、約８０ｍｇ／ｍ²／日、約９０ｍｇ／ｍ²／日、約１００ｍｇ／ｍ²／日、約５００ｍｇ／ｍ²／日、または約９００ｍｇ／ｍ²／日）を投与することを含む。例示的な投与レジメンは、治療有効量の操作されたＴ細胞の患者への投与前３日間に、約３０ｍｇ／ｍ²／日のフルダラビンを投与することと組み合わせて、またはその前もしくはその後に、約３００ｍｇ／ｍ²／日のシクロホスファミドを患者に毎日投与することを含む、対象を治療することを伴う。

いくつかの実施形態では、特に、本明細書に提供される操作された細胞がＣＤ５２の表面発現を除去または最小化するように遺伝子編集されている場合に、リンパ枯渇は、アレムツズマブのような抗ＣＤ５２抗体の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５２抗体は、約１～２０ｍｇ／日のＩＶ、例えば、約１３ｍｇ／日のＩＶの用量で、１、２、３日以上投与される。抗体は、リンパ枯渇レジメンの他の要素（例えば、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビン）の投与と組み合わせて、その前に、またはその後に、投与され得る。

他の実施形態では、抗原結合ドメイン、形質導入された（またはそうでなければ操作された）細胞、および化学療法剤は、各々対象における疾患または状態を治療するために有効な量で投与される。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と組み合わされて投与され得る。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオラミド、およびトリメチルオロメラミンレスメを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシッド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦ Ｓ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）、（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ファレストン）を含む抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。必要に応じて、ＣＨＯＰ、すなわち、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ドキソルビシン（ヒドロキシドキソルビシン）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびプレドニゾンを含むが、これらに限定されない、化学療法剤の組み合わせも投与される。

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞、ポリペプチド、または核酸の投与と同時に、またはその後１週間以内に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞、ポリペプチド、または核酸の投与後約１～７日、約１～約４週間、または約１週間～約１ヶ月、約１週間～約２ヶ月、約１週間～約３ヶ月、約１週間～約６ヶ月、約１週間～約９ヶ月、または約１週間～約１２ヶ月にわたって投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、細胞、ポリペプチド、または核酸を投与する少なくとも１ヶ月前に投与される。いくつかの実施形態では、方法は、２つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む。

様々な追加の治療剤は、本明細書に記載される組成物と組み合わせて使用され得る。例えば、潜在的に有用な追加の治療剤には、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびアテゾリズマブなどのＰＤ－１阻害剤が含まれる。

本開示との組み合わせでの使用に適した追加の治療剤には、イブルチニブ（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標））、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、パニツムマブ）（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、カツマキソマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アキシチニブ、マシチニブ、パゾパニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ、レスタウルチニブ、アキシチニブ、セディラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマキサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、バンデタニブ、エントレクチニブ、カボザンチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ラドチニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ルキソリチニブ、パクリチニブ、コビメチニブ、セルメチニブ、トラメチニブ、ビニメチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、アフリベルセプト、アジポチド、デニロイキンジフチトクス、エベロリムスおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ソニデギブおよびビスモデギブなどのヘッジホッグ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤（パルボシクリブ）などのＣＤＫ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ含有免疫細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒性を予防または低減するための治療レジメンとともに投与され得る。サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒性を予防するための治療レジメンには、レンジルマブ、トシリズマブ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アナキンラ、ｉＮＯＳ阻害剤（例えば、Ｌ－ＮＩＬまたは１４００Ｗ）が含まれ得る。追加の実施形態では、ＣＡＲ含有免疫細胞を含む組成物は、抗炎症剤とともに投与することができる。抗炎症剤または抗炎症薬には、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベータメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ医薬品、シクロホスファミド、およびマイコフェノラートを含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＮＳＡＩＤには、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ－２阻害剤、およびシアル酸塩が含まれる。例示的な鎮痛剤には、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン塩酸塩のトラマドールが含まれる。例示的なグルココルチコイドには、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンが含まれる。例示的な生物学的応答修飾因子には、細胞表面マーカーに向けられた分子（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）、サイトカイン阻害剤、例えば、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ケモカイン阻害剤、および接着分子阻害剤が含まれる。生物学的応答修飾因子には、モノクローナル抗体および組換え型の分子が含まれる。例示的なＤＭＡＲＤには、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋肉内）、およびミノサイクリンが含まれる。

特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－ベータなどの神経成長因子（ＮＧＦ）；血小板成長因子；ＴＧＦ－アルファおよびＴＧＦ－ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子－Ｉおよび－ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン－アルファ、ベータ、およびガンマなどのインターフェロン；マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）；ならびに顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）；ＩＬ－１、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ－アルファまたはＴＮＦ－ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源から、または組換え細胞培養からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な同等物を含む。

Ｖ．選別および枯渇の方法
いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団のインビトロ選別のための方法が提供され、免疫細胞の集団のサブセットは、モノクローナル抗体に特異的なエピトープ（例えば、例示的ミモトープ配列）を含むＤＬＬ３特異的ＣＡＲのうちのいずれか１つを発現する操作された免疫細胞を含む。方法は、免疫細胞の集団をエピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、モノクローナル抗体に結合する免疫細胞を選択して、ＤＬＬ３特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞に富む細胞の集団を得ることを含む。

いくつかの実施形態では、当該エピトープに特異的な当該モノクローナル抗体は、任意にフルオロフォアにコンジュゲートされる。この実施形態では、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択するステップは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行うことができる。

いくつかの実施形態では、当該エピトープに特異的な当該モノクローナル抗体は、任意に磁気粒子にコンジュゲートされる。この実施形態では、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択するステップは、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって行うことができる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫細胞を選別するための方法で使用されるｍＡｂは、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ムロモナブ－ＣＤ３、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ＱＢＥＮＤ－１０、および／またはウステキヌマブから選択される。いくつかの実施形態では、当該ｍＡｂは、リツキシマブである。別の実施形態では、当該ｍＡｂは、ＱＢＥＮＤ－１０である。

いくつかの実施形態では、以上で記載されるＣＡＲ発現免疫細胞をインビトロで選別するための方法を使用するときに得られるＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、ＣＡＲ発現免疫細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞をインビトロで選別するための方法を使用するときに得られるＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、ＣＡＲ発現免疫細胞の少なくとも８５％を含む。

いくつかの実施形態では、以上で記載されるＣＡＲ発現免疫細胞をインビトロで選別するための方法を使用するときに得られるＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、初期（選別されていない）細胞集団と比較して、インビトロで増加した細胞毒性活性を示す。いくつかの実施形態では、インビトロでの当該細胞毒性活性は、１０％、２０％、３０％、または５０％増加する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態では、ｍＡｂは、支持体または表面に予め結合される。固体支持体の非限定的な例には、ビーズ、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、磁気ビーズ、プラスチックウェルプレート、ガラスウェルプレート、セラミックウェルプレート、カラム、または細胞培養バッグが含まれ得る。

レシピエントに投与されるＣＡＲ発現免疫細胞は、供給源集団からインビトロで富化され得る。供給源集団を拡大する方法は、密度遠心分離、免疫磁気ビーズ精製、親和性クロマトグラフィー、および蛍光活性化細胞選別の組み合わせを使用して、ＣＤ３４抗原などの抗原を発現する細胞を選択することを含み得る。

フローサイトメトリーは、細胞集団内の特定の細胞型を定量化するために使用され得る。一般に、フローサイトメトリーは、主に光学的手段によって細胞の成分または構造的特徴を定量化するための方法である。構造的特徴を定量化することによって異なる細胞型を区別することができるため、フローサイトメトリーおよび細胞選別を使用して、混合物中の異なる表現型の細胞をカウントおよび選別することができる。

フローサイトメトリー分析には、２つの主要なステップ：１）選択された細胞型を１つ以上の標識マーカーで標識することと、Ｔ）集団中の細胞の総数に対する標識細胞の数を決定することと、が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞型を標識する方法は、標識された抗体を特定の細胞型によって発現されるマーカーに結合することを含む。抗体は、蛍光化合物で直接標識されるか、または、例えば、第１の抗体を認識する蛍光標識された第２の抗体を使用して間接的に標識されるかのいずれかであり得る。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現するＴ細胞を選別するために使用される方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）である。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）は、超常磁性ナノ粒子およびカラムを使用することによる、それらの表面抗原（ＣＤ分子）に応じた様々な細胞集団の分離のための方法である。ＭＡＣＳは、純粋な細胞集団を得るために使用され得る。単一細胞懸濁液中の細胞は、マイクロビーズで磁気標識され得る。試料は、細胞のすばやく穏やかな分離を可能にする細胞に優しいコーティングで覆われている、強磁性球で構成されるカラムに適用される。磁気標識された細胞がカラム内に保持される間、標識されていない細胞は通過する。フロースルーは、非標識細胞画分として収集することができる。洗浄ステップ後、カラムはセパレーターから取り外され、磁気標識された細胞はカラムから溶出される。

Ｔ細胞などの特定の細胞集団の精製のための詳細なプロトコルは、Ｂａｓｕ Ｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）に見出すことができる。（Ｂａｓｕ Ｓ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＨＭ，Ｄｉｔｔｅｌ ＢＮ，Ｒａｙ Ａ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（４１）：１５４６）。

いくつかの態様では、本開示は、インビボ枯渇によってＤＬＬ３特異的ＣＡＲ発現免疫細胞を枯渇させるための方法を提供する。インビボ枯渇は、阻害または排除によってＣＡＲ発現免疫細胞の増殖を停止することを目的とした哺乳動物生物への処置（例えば、ＣＡＲ上のエピトープに結合する分子）の投与を含み得る。

本発明の一態様は、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞をインビボで枯渇させるための方法に関し、当該操作された免疫細胞または当該ＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも１つのエピトープ特異的ｍＡｂと接触させることを含む。本発明の別の態様は、当該操作された免疫細胞をエピトープ特異的抗体と接触させることによって、キメラｓｃＦｖ（例えば、ｍＡｂ特異的エピトープの挿入によって形成される）を含む、ＣＡＲ発現免疫細胞をインビボで枯渇させるための方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞であり、かつ／または抗体は、モノクローナルである。

一実施形態によれば、免疫操作された細胞のインビボ枯渇は、本発明のインビトロ方法を使用して以前に選別された操作された免疫細胞に対して行われる。この場合、同じ注入されたｍＡｂが使用され得る。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ特異的抗原は、ＣＤ２０抗原であり、エピトープ特異的ｍＡｂは、リツキシマブである。いくつかの実施形態では、本発明は、当該ＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも１つのエピトープ特異的ｍＡｂと接触させることを含む、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲを発現する操作された免疫細胞（ＣＡＲ発現免疫細胞）をインビボで枯渇させる方法に関する。

いくつかの実施形態では、当該操作された免疫細胞または当該ＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも１つのエピトープ特異的ｍＡｂと接触させるステップは、患者にエピトープ特異的ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）を注入することを含む。いくつかの実施形態では、患者に投与されるエピトープ特異的ｍＡｂの量は、患者におけるＣＡＲ発現免疫細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を排除するために十分である。

いくつかの実施形態では、当該操作された免疫細胞または当該ＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも１つのエピトープ特異的ｍＡｂと接触させるステップは、患者に約３７５ｍｇ／ｍ²のリツキシマブを１回または数回注入することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）は、週に１回投与される。

いくつかの実施形態では、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲを発現する免疫細胞（ＣＡＲ発現免疫細胞）がエピトープ特異的ｍＡｂを使用する補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイにおいて枯渇される場合、生存ＣＡＲ発現免疫細胞の量は減少する。いくつかの実施形態では、生存ＣＡＲ発現免疫細胞の量は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少する。いくつかの実施形態では、当該ｍＡｂ特異的エピトープは、ＣＤ２０エピトープもしくはミモトープであり、かつ／またはエピトープ特異的ｍＡｂは、リツキシマブである。

特定の実施形態では、ＣＡＲ操作された免疫細胞のインビボ枯渇は、二重特異性抗体を注入することによって行われる。定義によって、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なるモノクローナル抗体の断片で構成され、結果として２つの異なるタイプの抗原に結合する人工タンパク質である。これらのＢｓＡｂおよび免疫療法におけるそれらの使用は、Ｍｕｌｌｅｒ Ｄ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．（２０１０）Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２４（２）：８９－９８において概説される。

別の特定の実施形態によれば、注入された二重特異性ｍＡｂは、キメラｓｃＦｖを発現する操作された免疫細胞上にあるｍＡｂ特異的エピトープと、エフェクターおよび細胞毒性細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫細胞）上の表面抗原の両方に結合することができる。そうすることによって、ＢｓＡｂによって引き起こされる操作された免疫細胞の枯渇は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を通して発生し得る。（Ｄｅｏ Ｙ Ｍ，Ｓｕｎｄａｒａｐａｎｄｉｙａｎ Ｋ，Ｋｅｌｅｒ Ｔ，Ｗａｌｌａｃｅ ＰＫ，ａｎｄ Ｇｒａｚｉａｎｏ ＲＦ，（２０００），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６５（１０）：５９５４－５９６１］）。

いくつかの実施形態では、細胞毒性薬物は、ＣＡＲ発現免疫細胞を枯渇させるために使用され得るエピトープ特異的ｍＡｂに結合される。モノクローナル抗体の標的化能力を細胞毒性薬物の殺癌能力と組み合わせることによって、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、薬物単独の使用と比較される場合、健康な組織と病気の組織との間の敏感な区別を可能にする。いくつかのＡＤＣについて市場の承認を受け、それらを、特にリンカー上で作製するための技術は、（Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７－２１２、Ｔｒａｉｌ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８－３３７、Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５－６１４、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ－Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１－１７２、米国特許第４，９７５，２７８号）。

いくつかの実施形態では、注入されるエピトープ特異的ｍＡｂは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を促進することができる分子と予めコンジュゲートされる。したがって、補体系は、生物から病原体を取り除く抗体の能力を支援または補完する。刺激される場合、活性化カスケードは、細胞殺滅膜侵襲複合体の応答および活性化の大規模な増幅として引き起こされる。グリカンなどの異なる分子を使用してｍＡｂをコンジュゲートし得る（Ｃｏｕｒｔｏｉｓ，Ａ，Ｇａｃ－Ｂｒｅｔｏｎ，Ｓ．，Ｂｅｒｔｈｏｕ，Ｃ，Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃ，Ｊ．，Ｂｏｒｄｒｏｎ，Ａ．ａｎｄ Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｃ．（２０１２），Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｍａｙ ｂｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｇｌｙｃａｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＳＳＮ：０７１７－３４５８、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｉｎｆｏ ＤＯＩ：１０．２２２５／ｖｏｌｌ５－ｉｓｓｕｅ５）。

ＶＩ．キットおよび製品
本出願は、本明細書に記載されるＤＬＬ３含有ＣＡＲまたはＤＬＬ３ ＣＡＲ含有免疫細胞のうちのいずれか１つを含むキット、およびその薬学的組成物を提供する。キットの一実施形態では、操作されたＣＡＲ細胞は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）などの好適な培地で凍結される。

いくつかの例示的な実施形態では、本開示のキットは、同種ＤＬＬ３ ＣＡＲ含有Ｔ細胞、ならびに対象にリンパ球枯渇レジメンおよびＣＡＲ－Ｔレジメンを投与するためのＣＤ５２抗体を含む。

本出願はまた、本明細書に記載される治療組成物またはキットのうちのいずれか１つを含む製品を提供する。製品の例には、バイアル（例えば、密封されたバイアル）が含まれる。

実施例１：ＤＬＬ３標的化抗体の生成および試験
本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって作製され得る。抗ＤＬＬ３抗体をまずＦｌａｇ－ＤＬＬ３（アジポゲン）ＥＬＩＳＡでスクリーニングし、次いでＦＡＣＳでスクリーニングして、ヒトＤＬＬ３発現ありまたはなしのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞への結合を決定した。

ＤＬＬ３特異的抗体が内因性ＤＬＬ３を発現する細胞を認識することができるかを試験するために、ＤＭＳ ２７３（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号９５０６２８３０）、ＤＭＳ ４５４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号９５０６２８３２）、およびＳＨＰ－７７（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－２１９５）細胞を、１％ＢＳＡで補充されたＰＢＳ中のマウスＩｇＧ２Ａバックボーン（ｍＩｇＧ２ａ）を含む２ｕｇ／ｍｌの精製ＤＬＬ３抗体または対照ｍＩｇＧ２ａ抗体で染色した。結合したＤＬＬ３抗体を、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５３０７）で検出した。試料をフローサイトメトリーによって分析した。ＤＬＬ３抗体のＤＭＳ ２７３、ＤＭＳ ４５４、およびＳＨＰ－７７細胞への結合を示す代表的な画像を図１に含める。

実施例２：ＤＬＬ３に対する抗ＤＬＬ３抗体の速度および親和性の決定
この実施例は、全長モノクローナル抗体（ＩｇＧ）、ならびにヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ）、およびマウスＤＬＬ３に対するｓｃＦｖの両方として、３７℃での様々な抗ＤＬＬ３抗体の結合速度および親和性を決定する。ｓｃＦｖについて、それらのそれぞれのハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３抗体の可変領域を、（ＧＧＧＧＳ）₃（配列番号４７２）または（ＧＧＧＧＳ）₄（配列番号４７８）リンカー、続いてヒトＩｇＧ２配列からのヒンジおよびＦｃの一部に隣接してクローニングし、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体をもたらし、Ｅｘｐｉ２９３を使用して発現させた。ヒト、カニクイザル、およびマウスＤＬＬ３からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、Ｃ末端８ｘＨｉｓエピトープタグ（配列番号４７３）およびＡｖｉタグと融合させ、Ｅｘｐｉ２９３を使用して発現させ、次いで固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。

抗体結合速度は、表面プラズモン共鳴（ＢｉａｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ ＰＡ）によって決定した。ＨＢＳ－Ｔ＋ランニングバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％体積／体積 Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で希釈された抗体を、抗ＤＬＬ３抗体定常ドメインに特異的な抗体で固定化したＣＭ４チップ上で捕捉した。精製されたＤＬＬ３をＨＢＳ－Ｔ＋で段階希釈し、３０ｕＬ／分で２分間注射し、１０分の解離時間後、注射間に１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ１．７またはリン酸のいずれかで表面を再生した。速度論的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡ評価プログラムを使用してデータを全体的に１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６．９９－１１０）に当てはめることによって同時に得られる。平衡解離定数（Ｋ_d）値は、ｋ_off／ｋ_onとして計算される。

試験された抗ＤＬＬ３抗体の速度および親和性パラメータを表８に示す。具体的には、表８は、ヒト、カニクイザル、およびマウスＤＬＬ３に対する抗ＤＬＬ３抗体（ＩｇＧまたはｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体のいずれか）の親和性を示す。最後の列は、抗ＤＬＬ３抗体の各々がヒトＤＬＬ３のどの細胞外ドメインを認識するかを示す。

実施例３：全長および短縮型ＤＬＬ３を発現するＣＨＯ細胞の生成
全長および様々な短縮型ヒトＤＬＬ３を発現するＣＨＯ細胞のパネルを使用して、各ＤＬＬ３標的化抗体がどのドメインを認識するかを決定した。ヒトＤＬＬ３の細胞外ドメインは、以下のアミノ酸位置：シグナルペプチド：１～２６、Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒ）：２７～１７５、ＤＳＬ：１７６～２１５、ＥＧＦ１：２１５～２４９、ＥＧＦ２：２７４～３１０、ＥＧＦ３：３１２～３５１、ＥＧＦ４：３５３～３８９、ＥＧＦ５：３９１～４２７、およびＥＧＦ６：４２９～４６５によって定義される異なるサブドメインに細分化することができる。

エピトープマッピングに使用される短縮型ＤＬＬ３タンパク質を生成するために、ヒトＤＬＬ３のそれぞれの８つの細胞外ドメイン（シグナルペプチドとＮ末端、ＤＳＬ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、およびＥＧＦ６）の配列を、Ｎ末端から開始して、抗原から１つずつ欠失した。表６は、生成された短縮型ＤＬＬ３タンパク質を示す（図２Ａ～２Ｄも参照されたい）。

Ｎ末端ＨＡタグを有する全長および短縮型ヒトＤＬＬ３を発現するＣＨＯ細胞を確立するために、全長ヒトＤＬＬ３（配列番号５５６、ＧｅｎｅＢａｎｋレコードＮＭ＿０１６９４１）および７ ＨＡタグ付き短縮型ヒトＤＬＬ３（配列番号５５７～５６３）をｐＬＶＸ－ＳＦＦＶ－Ｐｕｒｏ－Ｐ２Ａ－ＴｅｔＯ３Ｇベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。全長または短縮型ヒトＤＬＬ３のいずれかをコードするレンチウイルスは、２９３Ｔ細胞をｐＬＶＸ－ＳＦＦＶ－Ｐｕｒｏ－Ｐ２Ａ－ＴｅｔＯ３Ｇベクターと、ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２Ｇベクターと、でコトランスフェクトすることによって生成した。トランスフェクションの２日後、ウイルス粒子を含有する上清を収集し、５ｕｇ／ｍｌのポリブレンと一緒にＣＨＯ細胞を形質導入するために使用した。

全長および短縮型ＤＬＬ３の発現は、ＰＥコンジュゲート抗ＨＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号９０１５１８）を使用したＦＡＣＳアッセイで検証した。陰性対照として、細胞を、抗ＨＡ抗体の代わりに、アイソタイプが一致し、ＰＥ標識された抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１１１）とインキュベートした。図２Ａの下のパネルは、ＣＨＯ細胞上の全長および短縮型ＤＬＬ３の発現を示す。

実施例４：ＤＬＬ３標的化抗体のエピトープマッピング
全長および短縮型ＤＬＬ３を発現するＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中のハイブリドーマ上清または精製ＤＬＬ３抗体で染色した。結合したＤＬＬ３抗体を、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０５３０７）で検出した。試料をフローサイトメトリーによって分析した。各クローンの結合ドメインは、実施例２に記載される全長または短縮型ＤＬＬ３を発現するＣＨＯのパネルを使用して決定した。フローサイトメトリー分析は、例えば、クローンがＥＧＦ３を含むすべての短縮型タンパク質に結合するが、ＥＧＦ３を含まないいずれの短縮型タンパク質にも結合しない場合、そのようなクローンはＥＧＦ３を認識することを示した。図２Ｄにおける代表的な画像に示されるように、抗ＤＬＬ３抗体は、それぞれ、ＤＳＬ、ＥＧＦ１、およびＥＧＦ３ドメインを認識する。ＰＥチャネルからのシグナルを、ｘ軸上に示し、カウントをｙ軸上に示す。

実施例５：ＤＬＬ３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
この実施例は、抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築を説明する。

表１ａに列挙される抗ＤＬＬ３抗体をＣＡＲに再フォーマットした。これらの抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（表１ｂおよび表１ｃ）を使用して、以下の一般的な構造：重鎖可変領域－－リンカー－－軽鎖可変領域を有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（表１ｄ）を設計した。リンカーは、以下のアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７８）を有した。

キメラ抗原受容体をコードするタンパク質配列は、５’から３’までの以下の要素：ＣＤ８αシグナル配列（配列番号４７７）、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８α分子のヒンジおよび膜貫通領域（配列番号４７９）、４１ＢＢ分子の細胞質部分（配列番号２９１）、ならびにＣＤ３ζ分子の細胞質部分（配列番号２９２）を含有するように設計した（図３Ａ、表７）。

ＣＡＲ構造の概略図を図３Ａに示す。抗ＤＬＬ３クローンから再フォーマットされた代表的なＣＡＲ配列は、配列番号４８２～５３３に含まれる。コドン最適化ＤＬＬ３ ＣＡＲ配列を合成し、ＸｍａＩ（５’）およびＭｌｕＩ（３’）制限部位を使用して以下のレンチウイルスベクターｐＬＶＸ－ＥＦ１ａ－ＤＬＬ３ ＣＡＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。

ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために、ＰＢＭＣを、まずＦｉｃｏｌｌ勾配密度培地（Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してバフィーコート試料から精製した。Ｔ細胞を、市販のＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用してＰＢＭＣから精製した。あるいは、初代ヒトＴ細胞をＬｅｕｋｏＰａｋ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から直接精製することができる。

ＤＬＬ３ ＣＡＲをコードするレンチウイルスを作製するために、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、０日目に、６ウェルプレートのウェルあたり１０％ＦＢＳ（ＨｙｃｌｏｎｅまたはＪＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充された２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に１ｍＬあたり４０万細胞で播種した。１日目に、レンチウイルスを、６ウェルプレートのウェルあたり２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において、レンチウイルスパッケージングベクター１．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２、０．５ｕｇのｐＭＤ２Ｇ、および０．５ｕｇの適切なトランスファーＣＡＲベクターを一緒に混合することによって調製した（「ＤＮＡミックス」）。２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中の１０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いでＤＮＡミックスに添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、５００ｕＬの総体積をＨＥＫ－２９３Ｔを含有するウェルの側面にゆっくりと添加した。精製されたＴ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびヒトＴ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０、１：１００希釈）で補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地（Ｌｏｎｚａ）において活性化した。２日目に、６ウェルプレートの各ウェルからの培地を、ウェルあたり２ｍＬのＴ細胞形質導入培地、すなわち、１０％ＦＢＳで補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５で置き換えた。３日目に、Ｔ細胞を、Ｇｒｅｘ－２４プレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルあたり１ｍＬのＴ細胞形質導入培地において、１ｍＬあたり５０万細胞で再懸濁させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのレンチウイルス上清を、回収し、０．４５ミクロンフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して細胞片を除去し、次いで１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２とともにＴ細胞に添加した。５日目に、４．５ｍＬのＴ細胞増殖培地、すなわち、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）で補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５を、Ｇｒｅｘ－２４プレートの各ウェルに添加した。９日目および１３日目に、フローサイトメトリーを使用して組換えＤＬＬ３（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）を認識するＴ細胞のパーセンテージを検出することによって、形質導入効率を決定した。細胞を、Ｔ細胞増殖培地を使用して、必要に応じてより大きなフラスコまたはＧ－Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中に増殖させた。１４日目に、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を凍結保存した。組換えＤＬＬ３で染色された細胞のパーセンテージは、凍結保存の直前にクローンにわたって正規化した。

ＤＬＬ３ ＣＡＲで成功裏に形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを決定するために、Ｔ細胞をまずＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中の１ｕｇ／ｍｌのＦｌａｇタグ付き組換えＤＬＬ３（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）と４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで洗浄し、ＰＥ標識抗Ｆｌａｇ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号６３７３１０）で染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。

ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の例を図３Ｂに示す。図３Ｂは、実験データを示し、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲが初代Ｔ細胞の表面上に発現し、組換えＤＬＬ３を認識することができることを示す。プロットを、生きているＣＤ３＋細胞でゲーティングする。プロット上の数字は、各抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージである。

実施例６：インビトロ特徴分析
この実施例は、ＤＬＬ３についてのＣＡＲの特異性およびインビトロ活性を決定するために使用される実験を説明する。

ＳＨＰ－７７、ＷＭ２６６．４、ＤＭＳ ４５４、およびＤＭＳ ２７３は、ＡＴＣＣまたはＳｉｇｍａから購入されたＤＬＬ３＋細胞株である。ＨＥＫ－２９３Ｔは、ＤＬＬ３陰性細胞株である。ＨＥＫ－２９３ＴにおいてヒトＤＬＬ３を発現させるために、全長ヒトＤＬＬ３をコードするレンチウイルスを使用してＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を形質導入した。

ＤＬＬ３特異的殺滅を試験するために、ヒトＤＬＬ３発現ありまたはなしのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を発現するホタルルシフェラーゼを次いで、９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）にウェルあたり５，０００細胞の播種密度で播種した。ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、Ｔ細胞増殖培地、すなわち、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）で補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５において１：９～９：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、ヒトＤＬＬ３発現ありまたはなしの播種されたＨＥＫ－２９３Ｔに添加した。細胞生存は、ｏｎｅ－ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して７２時間後に測定した。代表的なＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨＥＫ－２９３Ｔ－ＤＬＬ３細胞に対する強力な殺滅を示したが、ＨＥＫ－２９３Ｔ親細胞では検出可能な活性を示さなかった（図４Ａ）。

内因性ＤＬＬ３を発現する細胞株に対するＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性活性を試験するために、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼ標識ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７、ＷＭ２６６．４、ＤＭＳ ４５４、またはＤＭＳ ２７３細胞と、Ｔ細胞増殖培地、すなわち、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）で補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５において１：９～９：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした。細胞生存は、ｏｎｅ－ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して７２時間後に測定した。各条件を３つの複製でアッセイした。生細胞の平均パーセンテージおよび標準偏差を播種した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。

図４Ａは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、示されたエフェクター：標的比での３日の細胞毒性アッセイにおいて、ヒトＤＬＬ３を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を特異的に殺滅したが、親ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を殺滅しなかったことを示す実験データを示す。抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現しなかったＴ細胞（標識された空ベクター）を陰性対照として使用した。

図４Ｂは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、示されたエフェクター：標的比での３日の細胞毒性アッセイにおいて内因性ＤＬＬ３を発現するＳＨＰ－７７およびＷＭ２６６．４細胞を殺滅したことを示す実験データを示す。

図４Ｃは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、示されたエフェクター：標的比での３日の細胞毒性アッセイにおいて内因性ＤＬＬ３を発現するＤＭＳ ４５４およびＤＭＳ ２７３小細胞肺癌細胞を殺滅したことを示す実験データを示す。図４Ｃにおけるすべてのプロットについて、Ｏｎｅ－ｇｌｏアッセイシステムを使用して、標的細胞生存率を評価した（ｎ＝３）。

ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞から分泌されるサイトカインを測定するために、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＤＬＬ３＋ＳＨＰ－７７細胞と、Ｔ細胞増殖培地、すなわち、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）で補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５において１：１または１：９のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした。２４時間後、組織培養上清を収集し、上清中の３つのサイトカイン［インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、およびＩＬ－２］のレベルを、ヒト炎症誘発性組織培養９プレックスアッセイ（ＭＳＤ）を製造業者のプロトコルに従って使用して測定した。図５は、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＤＬＬ３発現ＳＨＰ－７７細胞株との共インキュベーション後にサイトカインを放出したことを示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＳＨＰ－７７細胞を１：１または１：９のエフェクター：標的比で２４時間インキュベートした（ｎ＝３）。

実施例７：連続殺滅アッセイ
連続殺滅アッセイは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を増殖させ、特定の場合では、分化および枯渇を引き起こすＣＡＲ－Ｔ細胞のそれらの標的への繰り返し曝露を含む。このアッセイを使用して、標的細胞への数ラウンドの曝露後に、高い標的細胞溶解および増殖能力を有する最適なクローンを選択した。

アッセイの初日、ＤＬＬ３を発現することが知られている５，０００個のホタルルシフェラーゼ標識ＷＭ２６６．４、ＤＭＳ ４５４、またはＤＭＳ ２７３細胞を、５％のヒト血清を有する１００ｕｌのＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地において白い壁および平らな透明底を備えた９６ウェルプレートに播種した。標的細胞をプレートの底に付着させた後、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、５％のヒト血清を含むＸ－ＶＩＶＯ培地において１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で播種された標的細胞に添加した。その後２日毎に、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を含有する１００μｌの培地を、新たに播種された標的細胞に移し、ｏｎｅ－ｇｌｏアッセイシステムまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ｇｌｏシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、予め播種された標的細胞の溶解パーセンテージを測定した。各条件を３～６つの複製でアッセイした。溶解の平均パーセンテージおよび標準偏差を播種した（図６Ａ～６Ｃ）。最適なクローンは、１２日目のアッセイ全体中で最も高い標的細胞溶解を有するものであった。これらのデータは、連続殺滅アッセイの実験データを示して、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＤＬＬ３＋ＷＭ２６６．４細胞への繰り返し曝露後、クローンのうちのいくつかが活性のままであったことを示す。Ｏｎｅ－ｇｌｏアッセイシステムまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ｇｌｏを、示された各時点で使用して、標的細胞生存を評価した（ｎ＝３～６）。

実施例８：インビボ活性
ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を試験するために、ＳＨＰ－７７腫瘍担持ＮＳＧマウスを使用した。ＳＨＰ－７７細胞は、凍結ストックバイアルから入手し、解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞を完全成長培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）において５０×１０⁶個の生存細胞／ｍＬに希釈した。細胞懸濁液を移植まで氷上に保持した。移植した直後に、細胞をＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ（カタログ番号３５４２３４）と１：１に混合し、マウスあたり５ｘ１０⁶個のＳＨＰ－７７細胞を含有する２００μＬの細胞／マトリゲル懸濁液を皮下注射した。腫瘍成長を、移植後５日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積＝（幅＾２×長さ／２）という式を使用して計算した。移植後約２週間で腫瘍体積に基づいてマウスを５匹の群にランダム化した。群あたりの平均腫瘍体積は、３１４ｍｍ³以下であった。マウスをランダム化した１日後に、非形質導入Ｔ細胞およびＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、マウスあたり２００万または５００万個のＣＡＲ＋細胞で、マウスあたり２００ｕＬの体積の尾静脈ＩＶ注射によって注射した。腫瘍を、研究の終わりまで３～４日毎に監視し続けた。２６Ｃ８および１０Ｇ１－Ｋ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、用量依存的に腫瘍阻害を誘導した（図７Ａ～７Ｂ）。図７Ａ～７Ｂは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が確立された小細胞肺癌腫瘍を排除することができることを示す実験データを示す。

ヒト疾患と類似の転移を示すモデルにおいてＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を試験するために、ＳＨＰ－７７腫瘍を尾静脈注射で確立した。腫瘍を、肺、肝臓、脳、腎臓、および脾臓において観察した。具体的には、ＳＨＰ－７７細胞を解凍し、完全成長培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）において４０ｘ１０⁶個の生存細胞／ｍＬに希釈した。細胞懸濁液を移植まで氷上に保持し、マウスあたり２００μＬの細胞懸濁液を尾静脈ＩＶによって注射した。移植後７日目に、２００ｕＬのルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）を注射し、腫瘍成長をＩＶＩＳイメージングによって監視した。移植後１１日目に全光束に基づいてマウスを５匹の群にランダム化した。移植後１２日目に、ＣＡＲ－Ｔを解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、マウスあたり２００万または７００万個のＣＡＲ＋細胞で、マウスあたり２００ｕＬの体積の尾静脈ＩＶ注射によって注射した。腫瘍を、研究の終わりまで３～４日毎に監視し続けた。図８に示されるように、１０Ｇ１－Ｋ抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、用量依存的に、マウスにおいて確立された小細胞肺癌腫瘍を阻害することができる。

実施例９：安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物
この実施例は、安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲの構築、発現、および細胞毒性活性を説明する。表６における抗ＤＬＬ３ ＣＡＲは、以下に列挙される異なる安全スイッチ構造を含むように再フォーマットした（表８）。

安全スイッチを含む抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ構築物をコードするタンパク質配列を表９に示す。例示的な安全スイッチ構築物は、ＣＤ８αシグナル配列（配列番号４７７）、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ、ＣＤ２０ミモトープ（配列番号５３６）、ＱＢＥＮＤ－１０エピトープ（配列番号５４４）、ヒトＣＤ８α分子のヒンジおよび膜貫通領域（配列番号４７９）、４－１ＢＢ分子の細胞質部分（配列番号２９１）、ならびにＣＤ３ζ分子の細胞質部分（配列番号２９２）を含み得る。

ＣＡＲ－Ｔを、実施例５に記載される方法を使用して生成し、それらの細胞毒性活性は、実施例７に記載される方法を使用して調査した。図９Ａは、４つの異なる安全スイッチの構造を示すプロットである。図９Ｂは、安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ ２Ｇ１、４Ｈ８、および１０Ｇ１－Ｋが初代Ｔ細胞の表面に発現し、組換えＤＬＬ３を認識することができることを示す実験的フローサイトメトリーデータを示す。プロットを、生きているＣＤ３＋細胞でゲーティングし、プロット上の数字は、各抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージである。図９Ｃは、安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲが、ＤＬＬ３＋ ＷＭ２６６．４細胞株の連続殺滅アッセイにおいて活性であることを示す実験データを示す。

実施例１０：小細胞肺癌ＰＤＸモデルに対する細胞毒性
小細胞肺癌ＰＤＸモデルは、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。細胞表面のＤＬＬ３発現を調査するために、ＰＤＸモデルの凍結バイアルを解凍し、各染色試料に２００，０００個の細胞を使用した。ＤＬＬ３の発現は、ＰＥコンジュゲート抗ＤＬＬ３抗体を使用したＦＡＣＳアッセイで検証した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｖｉｏｌｅｔ ４２１コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５および抗マウスＣＤ４５抗体を同じ染色試料に添加して、ヒトおよびマウスのリンパ球を除外した。

図１０Ａは、ＤＬＬ３が２つの小細胞肺癌ＰＤＸモデルの表面に発現されることを示す実験データを示す。図１０Ｂは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、示されたエフェクター：標的比での３日の細胞毒性アッセイにおいて同じ２つの小細胞肺ＰＤＸモデルを殺滅したことを示す実験データを示す。抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現しなかったＴ細胞（標識された空ベクター）を陰性対照として使用した。

実施例１１：リツキシマブベースの安全スイッチを使用したＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ検出および枯渇
望ましくない活性の事象においてＣＡＲ Ｔ細胞を枯渇させるか、またはオフにするために、実施例９に記載されるＣＡＲの細胞外領域の様々な位置でのリツキシマブミモトープの挿入によってリツキシマブオフスイッチを開発した。補体依存性細胞毒性アッセイを使用して、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のリツキシマブ依存性インビトロ枯渇を評価した。このアッセイでは、凍結されたＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、１ｘ１０⁵個の細胞を９６ウェルプレートにおける１０％ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ１６４０培地でインキュベートした。細胞を、２５％子ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ＣＬ３４４１－Ｓ）およびリツキシマブ抗体（インハウスで製造、１００ｍｇ／ｍＬ）の不在または存在下で３時間インキュベートした。細胞を組換えＤＬＬ３（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）で染色し、細胞毒性をフローサイトメトリーによって分析した。図１１Ａは、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を組換えＤＬＬ３およびリツキシマブ染色の両方によって検出することができることを示す実験データを示す。図１１Ｂは、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞をリツキシマブ依存性および補体依存性の方法でインビトロで枯渇させたことを示す実験データを示す。

実施例１２：安全スイッチを有する抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ活性
安全スイッチを有するＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を試験するために、ＳＨＰ－７７腫瘍担持ＮＳＧマウスを使用した。ＳＨＰ－７７細胞を凍結バイアルから解凍し、カウントし、希釈した。マウスあたりＲＰＭＩ培地／マトリゲル懸濁液における５０×１０⁶個の生存細胞／ｍＬを皮下に注射した。腫瘍成長を、移植後５日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積＝（幅＾２×長さ／２）という式を使用して計算した。移植後約１４日で腫瘍体積に基づいてマウスを８匹の群にランダム化した。群あたりの平均腫瘍体積は、１７８ｍｍ³であった。マウスをランダム化した同じ日に、非形質導入Ｔ細胞およびＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、標準的な手順に従ってカウントした。細胞を、マウスあたり５×１０⁶個のＣＡＲ＋細胞で、マウスあたり２００ｕＬの体積の尾静脈ＩＶ注射によって、ＲＰＭＩに再懸濁した。腫瘍を、研究の終わりまで３～４日毎に監視し続けた。安全スイッチを有するＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のすべての群は、５０日目までに有意な腫瘍阻害および検出可能な腫瘍の完全またはほぼ完全な排除を誘導した（図１２Ａ）。

ヒト疾患のように転移を示すモデルにおけるＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を試験するために、外因性ＤＬＬ３を発現するＤＭＳ ２７３小細胞肺腫瘍（ＤＭＳ ２７３－ＤＬＬ３）を尾静脈注射で確立した。具体的には、ＤＭＳ ２７３－ＤＬＬ３細胞を解凍し、ＲＰＭＩ培地中で１ｍＬあたり５×１０⁵生存細胞まで希釈した。マウスあたり２００μＬの細胞懸濁液を尾静脈ＩＶによって注射した。移植後３日目に、マウスを９匹の群にランダム化した。同じ日に、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔを解凍し、カウントし、マウスあたり５ｘ１０⁶個のＣＡＲ＋細胞で、マウスあたり２００ｕＬの体積の尾静脈ＩＶ注射によって、ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。腫瘍を、研究の終わりまで、ＩＶＩＳイメージングシステムを使用して３～４日毎に監視し続けた。図１２Ｂに示されるように、異なるリツキシマブベースの安全スイッチを有する複数の異なるＤＬＬ３ ＣＡＲは、転移性腫瘍に対して有効であった。

実施例１３：非腫瘍担持動物を使用したマウス安全性研究
ＤＬＬ３ ＲＮＡは、ヒト脳および下垂体において報告されている（ＧＴｅｘ）。同様に、マウスＤＬＬ３ ＲＮＡはまた、下垂体において報告されている（Ｂｉｏ－ＧＰＳ）。マウス脳におけるＤＬＬ３ ＲＮＡ発現を理解するために、３匹のＮＳＧマウスからの脳を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で固定し、包埋し、４～６ミクロンで連続的に切片化し、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＬＳ Ｒｅｄ ＩＳＨアッセイ（ＡＣＤＢｉｏ）で分析した。ＤＬＬ３ ＲＮＡをＮＳＧマウスの脳試料において低レベルで検出した。図１３Ａは、このアッセイで観察されたマウスＤＬＬ３ ＲＮＡ染色の代表的な画像を示す。

脳および下垂体の非形質導入Ｔ細胞におけるＤＬＬ３ ＲＮＡ発現の潜在的な毒性の責任を理解するために、８ｘ１０⁶個の１０Ｇ１－Ｋ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞、または８ｘ１０⁶個の２Ｇ１ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＳＧマウスにＩＶ注射した。注射の７日後、脾臓、脳、および下垂体を採取し、１０％ＮＢＦで固定し、包埋し、４～６ミクロンで連続的に切片化し、抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５２９５９、１：５００希釈）で染色して、免疫組織化学によってヒトＴ細胞を検出した。Ｔ細胞はすべての動物からの脾臓において検出されたが、それらは、脳または下垂体試料では検出されなかった（図１３Ｂ）。よって、ＤＬＬ３ ＲＮＡは、非腫瘍担持ＮＳＧマウスでは低レベルで検出されたが、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、マウスの脳または下垂体試料では検出されなかった。

実施例１４：皮下腫瘍を担持する動物を使用したマウス安全性研究
潜在的な脳および下垂体の毒性の責任をさらに評価するため、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、外因性マウスＤＬＬ３（ＬＮ２２９－ｍＤＬＬ３）を発現する皮下ＬＮ２２９腫瘍を有するＮＳＧマウスに注射した。このモデルでは、腫瘍細胞によるＣＡＲ－Ｔの活性化は、潜在的にＤＬＬ３を発現する正常組織に対する増加された感度および活性をもたらし得る。実験設計を図１４Ａに示す。腫瘍移植の３日前（－３日目）に、ＩＬ－７およびＩＬ－１５をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｖｉｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、尾静脈を通して注射して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および持続を支持した。ＬＮ２２９－ｍＤＬＬ３細胞を、次いで凍結バイアルから解凍し、完全成長培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）において４．２５×１０⁷個の細胞／ｍＬに希釈した。細胞懸濁液を移植まで氷上に保持した。移植する直前に、細胞をＢＤマトリゲルマトリックス（カタログ番号３５４２３４）と１：１に混合し、マウスあたり４．２５ｘ１０⁶個のＬＮ２２９－ｍＤＬＬ３細胞を含有する２００μＬの細胞／マトリゲル懸濁液を皮下注射した。腫瘍成長を、移植後８日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積＝（幅＾２×長さ／２）という式を使用して計算した。移植後２２日目に、腫瘍体積ならびにＩＬ－７およびＩＬ－１５の血清濃度に基づいて、マウスを５匹の群にランダム化した。同日（２２日目）に、非形質導入Ｔ細胞およびマウス交差反応性１０Ｇ１－Ｋ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、マウスあたり１ｘ１０⁷個のＣＡＲ＋細胞で、マウスあたり２００ｕＬの体積の尾静脈ＩＶ注射によって注射した。腫瘍を研究の終わりまで３～４日毎に監視し続け、ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ治療によるロバストな抗腫瘍活性を観察した（図１４Ｂ）。

４９日目に、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物が腫瘍を有しなかった場合、動物からの脳組織を１０％ＮＢＦに固定し、包埋して、第３および第４の側脳室を含む、脳室系を明らかにし、３つの切片を単一ブロックに配置し、それを４～６ミクロンで連続的に切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、または免疫組織化学によってヒト特異的ＣＤ３（ｈＣＤ３）を検出するために染色した。下垂体を１０％ＮＢＦで固定し、処理し、Ｈ＆Ｅで染色するか、または免疫組織化学的に染色して、ｈＣＤ３を示した。Ｈ＆Ｅスライドが顕微鏡で検査され、組織病理学的所見が病理学者によって標準システムを使用してスコア付けられた。ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与は、下垂体中葉および神経葉における豊富なｈＣＤ３染色Ｔ細胞、前葉における比較的少ないＴ細胞をもたらした（図１４Ｃおよびデータは示されていない）。Ｔ細胞のまばら～中程度に低いまたは中程度～中程度に高いｈＣＤ３染色が、脳の神経網および血管系（循環Ｔ細胞として）に存在した（図１４Ｃおよびデータは示されていない）。他の下垂体または脳の所見は存在しなかった（図１４Ｃ～Ｄ）。Ｔ細胞浸潤の機能的結果を理解するために、神経葉において放出された２つのホルモン、バソプレシンおよびオキシトシンを、免疫組織化学を使用して染色した。バソプレシン検出のために、試料を室温で１時間１／７，０００希釈で抗バソプレシン抗体（ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ、２００６９）で、次いで室温で３０分間Ｒａｂｂｉｔ－ｏｎ－Ｒｏｄｅｎｔ ＨＲＰ－Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）で染色した。オキシトシン検出のために、試料を室温で１５分間１／１０，０００希釈で抗オキシトシン抗体（ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ、２００６８）で、次いで室温で３０分間Ｒａｂｂｉｔ－ｏｎ－Ｒｏｄｅｎｔ ＨＲＰ－Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）で染色した。両方のホルモンは、非形質導入Ｔ細胞またはＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物の下垂体神経葉において検出することができ、この領域におけるホルモン産生ニューロンが機能的なままであったことを示す（図１４Ｅ～Ｆ）。よって、病理学的評価およびホルモン染色に基づいて、組織損傷は試料には見られなかった。

実施例１５：頭蓋内腫瘍を担持する動物を使用したマウス安全性研究
脳へのＴ細胞浸潤を促進し、潜在的な脳毒性をさらに理解するために、外因性マウスＤＬＬ３およびヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＬＮ２２９－ｍＤＬＬ３－ｖＩＩＩ）を発現する頭蓋内ＬＮ２２９腫瘍を有するＮＳＧマウスを使用した。実験設計を図１５Ａに示す。ＬＮ２２９－ｍＤＬＬ３細胞を、凍結バイアルから解凍し、ＲＰＭＩにおいて１×１０⁷個の生存細胞／ｍＬに希釈した。次いで、マウスあたり３μＬの３×１０⁴個のＬＮ２２９－ｍＤＬＬ３細胞を含有する細胞懸濁液を、頭蓋内に注射した。腫瘍成長は、ＩＶＩＳイメージングシステムによって監視した。移植後１７日目に、腫瘍体積に基づいてマウスを１０匹の群にランダム化した。同日（１７日目）に、ＴＣＲノックアウトされた非形質導入Ｔ細胞、１０Ｇ１－Ｋ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞、およびＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、ＲＰＭＩに再懸濁し、１ｘ１０⁷個のＣＡＲ＋細胞／マウスで、２００ｕＬ／マウスの体積の尾静脈ＩＶ注射によって注射した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、脳における腫瘍崩壊によって引き起こされる潜在的な炎症を評価するための対照として含んだ。ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および持続を支持するために、０．５ｕｇのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－２００－１５）および３ｕｇのＩＬ－１５Ｒａ Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ７１９４－ＩＲ）を、１７日目に開始して研究の終わりまで週２回各動物に投与した。腫瘍を研究の終わりまで３～４日毎に監視し続け、明確な抗腫瘍活性を観察した（図１５Ｂ）。２２日目および３８日目に、すべての動物からの脳組織をトリミングし、処理し、包埋し、第３および第４の側脳室を含む、脳室系を明らかにし、３つの切片を単一ブロックに配置し、それを４～６ミクロンで連続的に切片化し、Ｈ＆Ｅで染色するか、免疫組織化学によってヒト特異的ＣＤ４５（ｈＣＤ４５）を検出するために染色した。下垂体組織は、神経葉、中葉、および前葉を含むように処理し、Ｈ＆Ｅで染色するか、または免疫組織化学的に染色して、ヒトＴ細胞のマーカーとしてｈＣＤ４５を検出した。

２２日目に、非形質導入Ｔ細胞または１０Ｇ１－Ｋ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物は、脳または下垂体にまれな／まばらなｈＣＤ４５染色Ｔ細胞を有した（データ記載せず）。一方、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理された動物について、ｈＣＤ４５＋染色は、浸潤／神経膠症または神経膠腫の領域においてまれ／まばらから中程度に低いか、または中程度から中程度に高い範囲であり、この群の抗腫瘍活性と一致した（データ記載せず）。３８日目に、非形質導入Ｔ細胞またはＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物は、脳および下垂体にまれな／まばらなｈＣＤ４５＋染色を有した。１０Ｇ１－Ｋ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物は、下垂体、主に中葉および神経葉において最小限または軽度の単核細胞浸潤を有した（図１５Ｃ－Ｄ）。また、これらの動物は、脳の他の領域（脳の血管系、脈絡叢、および髄膜）におけるまれな／まばらな染色と比較して、神経膠腫の小さな病巣に関連するわずかに多い（中程度に低い）ｈＣＤ４５＋染色を有し、図１５Ｂに示されるこの群の抗腫瘍活性と一致した。

実施例１６：解離されたマウス下垂体細胞のインビトロ細胞毒性
ＤＬＬ３ ＣＡＲＴが下垂体に対して活性であるかを直接試験するために、ＮＳＧマウスからのマウス下垂体をインビトロ分析のために無菌条件下で採取した。組織は、１ｍＬの解離ミックス［５ｍＬのＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０５６４）、５０ｕＬの酵素Ｈ、５ｕＬの酵素Ｒ、６．２５ｕＬの酵素Ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ腫瘍解離キット番号１３０－０９５－９２９）］において３７℃で３ラウンドのインキュベーションによって解離し、続いて粉砕を使用した機械的解離を行った。単一細胞を完全培地（ＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭａｘ、２０％、１Ｘインスリン－トランスフェリン－セレン溶液、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン）に移し、各ラウンド後にプールした。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解バッファーでＲＴで３分間処理し、続いて完全培地において中和した。細胞懸濁液を７０ｕフィルターに通して濾過し、遠心分離してバッファーを除去した。細胞をカウントし、９６ウェルプレートに完全培地においてウェルあたり５ｘ１０⁴細胞で播種し、ＣＡＲ－Ｔ細胞が添加される前に３日間回復させた。ＣＡＲ－Ｔ細胞が添加される時点で、予想される標的密度は、ウェルあたり１×１０⁴細胞である。対照について、ＤＬＬ３⁺細胞（ＤＭＳ－２７３）およびＤＬＬ３^-細胞（２９３Ｔ）を同じ密度で播種した。１０Ｇ１－Ｋおよび２Ｇ１ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＥ：Ｔ＝９：１、３：１、および１：１で添加し、標的と３日間共培養した。３日の共培養の終わりに、培地をウェルから分離し、遠心分離してＴ細胞をペレット化した。標的細胞を、５０ｕＬ／ウェルのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７０）で１０分間処理し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで細胞毒性読み取りについて分析した。

図１６Ａは、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＤＬＬ３＋ＤＭＳ ２７３細胞株に対して活性であるが、それらがインビトロでマウス下垂体細胞に対して細胞毒性ではないことを示す実験データを示す。Ｔ細胞をプールし、フローサイトメトリーによる分析のために活性化マーカー（４１ＢＢおよびＣＤ２５）について染色した。図１６Ｂは、マウス下垂体細胞がインビトロでＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化しないことを示す。上清を－８０℃で凍結し、次いでＨｕｍａｎ ＴＨ１／ＴＨ２ １０－Ｐｌｅｘ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｋ１５０１０Ｂ）を使用してサイトカイン分析のために解凍した。図１６Ｃは、１０Ｇ１－Ｋおよび２Ｇ１ ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方が、ＤＬＬ３＋ＤＭＳ ２７３細胞株と共培養される場合、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、およびＩＬ－２を分泌するが、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞をマウス下垂体細胞と共培養した後、サイトカイン分泌がないことを示す。よって、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビトロで下垂体細胞に対して細胞毒性ではなかった。

Claims (45)

1. 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
   （ａ）配列番号１、１０、１９、２８、３７、４６、５５、６４、７３、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１４５、１５４、１６３、１７２、１８１、１９０、１９９、２０８、２１７、２２６、２３５、２４４、２５３、２６２、２７１、２８０、２８９、２９８、３０７、３１６、３２５、３３４、３４３、３５２、３６１、３７０、３７９、３８８、３９７、４０６、４１５、４２４、４３３、４４２、４５１、および４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号２、１１、２０、３８、４７、５６、６５、７４、８３、９２、１０１、１１０、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、１７３、１８２、１９１、２００、２０９、２１８、２２７、２３６、２４５、２５４、２６３、２７２、２８１、２９０、２９９、３０８、３１７、３２６、３３５、３４４、３５３、３６２、３７１、３８０、３８９、３９８、４０７、４１６、４２５、４３４、４４３、４５２、４６１、および６９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２、
   （ｃ）配列番号３、１２、２１、３０、３９、４８、５７、６６、７５、８４、９３、１０２、１１１、１２０、１２９、１３８、１４７、１５６、１６５、１７４、１８３、１９２、２０１、２１０、２１９、２２８、２３７、２４６、２５５、２６４、２７３、２８２、２９１、３００、３０９、３１８、３２７、３３６、３４５、３５４、３６３、３７２、３８１、３９０、３９９、４０８、４１７、４２６、４３５、４４４、４５３、および４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３、
   （ｄ）配列番号４、１３、２２、３１、４０、４９、５８、６７、８５、９４、１０３、１１２、１２１、１３０、１３９、１４８、１５７、１６６、１７５、１８４、１９３、２０２、２１１、２２０、２２９、２３８、２４７、２５６、２６５、２７４、２８３、２９２、３０１、３１０、３１９、３２８、３３７、３４６、３５５、３６４、３７３、３８２、３９１、４００、４０９、４１８、４２７、４３６、４４５、４５４、４６３、および６９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１、
   （ｅ）配列番号５、１４、２３、３２、４１、５０、５９、６８、７７、８６、９５、１０４、１１３、１２２、１３１、１４０、１４９、１５８、１６７、１７６、１８５、１９４、２０３、２１２、２２１、２３０、２３９、２４８、２５７、２６６、２７５、２８４、２９３、３０２、３１１、３２０、３２９、３３８、３４７、３５６、３６５、３７４、３８３、３９２、４０１、４１０、４１９、４２８、４３７、４４６、４５５、および４６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２、ならびに
   （ｆ）配列番号６、１５、２４、３３、４２、５１、６０、６９、７８、８７、９６、１０５、１１４、１２３、１３２、１４１、１５０、１５９、１６８、１７７、１８６、１９５、２０４、２１３、２２２、２３１、２４０、２４９、２５８、２６７、２７６、２８５、２９４、３０３、３１２、３２１、３３０、３３９、３４８、３５７、３６６、３７５、３８４、３９３、４０２、４１１、４２０、４２９、４３８、４４７、４５６、および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む、キメラ抗原受容体。
2. 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
   （ａ）配列番号１、１０、１９、２８、３７、４６、５５、６４、７３、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１４５、１５４、１６３、１７２、１８１、１９０、１９９、２０８、２１７、２２６、２３５、２４４、２５３、２６２、２７１、２８０、２８９、２９８、３０７、３１６、３２５、３３４、３４３、３５２、３６１、３７０、３７９、３８８、３９７、４０６、４１５、４２４、４３３、４４２、４５１、および４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号２、１１、２０、３８、４７、５６、６５、７４、８３、９２、１０１、１１０、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、１７３、１８２、１９１、２００、２０９、２１８、２２７、２３６、２４５、２５４、２６３、２７２、２８１、２９０、２９９、３０８、３１７、３２６、３３５、３４４、３５３、３６２、３７１、３８０、３８９、３９８、４０７、４１６、４２５、４３４、４４３、４５２、４６１、および６９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２、ならびに
   （ｃ）配列番号３、１２、２１、３０、３９、４８、５７、６６、７５、８４、９３、１０２、１１１、１２０、１２９、１３８、１４７、１５６、１６５、１７４、１８３、１９２、２０１、２１０、２１９、２２８、２３７、２４６、２５５、２６４、２７３、２８２、２９１、３００、３０９、３１８、３２７、３３６、３４５、３５４、３６３、３７２、３８１、３９０、３９９、４０８、４１７、４２６、４３５、４４４、４５３、および４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３を含む、キメラ抗原受容体。
3. 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
   （ａ）配列番号４、１３、２２、３１、４０、４９、５８、６７、８５、９４、１０３、１１２、１２１、１３０、１３９、１４８、１５７、１６６、１７５、１８４、１９３、２０２、２１１、２２０、２２９、２３８、２４７、２５６、２６５、２７４、２８３、２９２、３０１、３１０、３１９、３２８、３３７、３４６、３５５、３６４、３７３、３８２、３９１、４００、４０９、４１８、４２７、４３６、４４５、４５４、４６３、および６９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号５、１４、２３、３２、４１、５０、５９、６８、７７、８６、９５、１０４、１１３、１２２、１３１、１４０、１４９、１５８、１６７、１７６、１８５、１９４、２０３、２１２、２２１、２３０、２３９、２４８、２５７、２６６、２７５、２８４、２９３、３０２、３１１、３２０、３２９、３３８、３４７、３５６、３６５、３７４、３８３、３９２、４０１、４１０、４１９、４２８、４３７、４４６、４５５、および４６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２、ならびに
   （ｃ）配列番号６、１５、２４、３３、４２、５１、６０、６９、７８、８７、９６、１０５、１１４、１２３、１３２、１４１、１５０、１５９、１６８、１７７、１８６、１９５、２０４、２１３、２２２、２３１、２４０、２４９、２５８、２６７、２７６、２８５、２９４、３０３、３１２、３２１、３３０、３３９、３４８、３５７、３６６、３７５、３８４、３９３、４０２、４１１、４２０、４２９、４３８、４４７、４５６、および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３を含む、キメラ抗原受容体。
4. 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
   （ａ）配列番号７、１６、２５、３４、４３、５２、６１、７０、７９、８８、９７、１０６、１１５、１２４、１３３、１４２、１５１、１６０、１６９、１７８、１８７、１９６、２０５、２１４、２２３、２３２、２４１、２５０、２５９、２６８、２７７、２８６、２９５、３０４、３１３、３２２、３３１、３４０、３４９、３５８、３６７、３７６、３８５、３９４、４０３、４１２、４２１、４３０、４３９、４４８、４５７、４６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、ならびに
   （ｂ）配列番号８、１７、２６、３５、４４、５３、６２、７１、８０、８９、９８、１０７、１１６、１２５、１３４、１４３、１５２、１６１、１７０、１７９、１８８、１９７、２０６、２１５、２２４、２３３、２４２、２５１、２６０、２６９、２７８、２８７、２９６、３０５、３１４、３２３、３３２、３４１、３５０、３５９、３６８、３７７、３８６、３９５、４０４、４１３、４２２、４３１、４４０、４４９、４５８、および４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖のうちの少なくとも１つを含み、
   前記可変重鎖および前記可変軽鎖が、少なくとも１つのリンカーによって連結される、キメラ抗原受容体。
5. 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、
   （ａ）配列番号７、１６、２５、３４、４３、５２、６１、７０、７９、８８、９７、１０６、１１５、１２４、１３３、１４２、１５１、１６０、１６９、１７８、１８７、１９６、２０５、２１４、２２３、２３２、２４１、２５０、２５９、２６８、２７７、２８６、２９５、３０４、３１３、３２２、３３１、３４０、３４９、３５８、３６７、３７６、３８５、３９４、４０３、４１２、４２１、４３０、４３９、４４８、４５７、および４６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖、ならびに
   （ｂ）配列番号８、１７、２６、３５、４４、５３、６２、７１、８０、８９、９８、１０７、１１６、１２５、１３４、１４３、１５２、１６１、１７０、１７９、１８８、１９７、２０６、２１５、２２４、２３３、２４２、２５１、２６０、２６９、２７８、２８７、２９６、３０５、３１４、３２３、３３２、３４１、３５０、３５９、３６８、３７７、３８６、３９５、４０４、４１３、４２２、４３１、４４０、４４９、４５８、および４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、
   前記可変重鎖および前記可変軽鎖が、少なくとも１つのリンカーによって連結される、キメラ抗原受容体。
6. 細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記細胞外ドメインが、ＤＬＬ３に特異的に結合するＤＬＬ３抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、表１ｄに提示されるｓｃＦｖからなる群から選択される配列を含む、キメラ抗原受容体。
7. ＤＬＬ３に特異的に結合するキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体が、配列番号４８２～５３３および配列番号６３２～６８３のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体。
8. 前記細胞内ドメインが、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
9. 前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１（ＣＤ１ １ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ １ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ １ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１ １ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１ １ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭＩ（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせのシグナル伝達領域である、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
10. 前記共刺激ドメインが、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７のシグナル伝達領域を含む、請求項９に記載のキメラ抗原受容体。
11. 前記４－１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメインが、配列番号４８０またはその断片を含む、請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。
12. 前記細胞内ドメインが、少なくとも１つの活性化ドメインを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
13. 前記活性化ドメインが、ＣＤ３を含む、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
14. 前記ＣＤ３が、ＣＤ３ゼータを含む、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
15. 前記ＣＤ３ゼータが、配列番号４８１またはその断片を含む、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
16. 前記キメラ抗原受容体が、配列番号５７０～６２１および６３１のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
17. 安全スイッチをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
18. 前記安全スイッチが、ＣＤ２０ミモトープまたはＱＢＥＮＤ－１０エピトープを含む、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体。
19. 前記安全スイッチが、１つ以上のＣＤ２０ミモトープもしくは１つ以上のＱＢＥＮＤ－１０エピトープ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載のキメラ抗原受容体。
20. 前記キメラ抗原受容体が、ＱＲ３、ＳＲ２、ＲＳＲ、またはＲ２Ｓのフォーマットの１つ以上の安全スイッチを含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
21. 前記キメラ抗原受容体が、配列番号６２２～６２８、４７４～４７６、５６５、および６８４～６９４のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
22. 請求項１～２１に記載のキメラ抗原受容体のうちのいずれか１つをコードする単離されたポリヌクレオチド。
23. 請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
24. 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、レンチウイルスベクター、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２３に記載のベクター。
25. 請求項１～２１に記載のキメラ抗原受容体のうちのいずれか１つを発現する操作された免疫細胞。
26. 請求項２２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２３もしくは２４に記載のベクターを発現する操作された免疫細胞。
27. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞である、請求項２５または２６に記載の操作された免疫細胞。
28. 前記細胞が、自家Ｔ細胞である、請求項２７に記載の操作された免疫細胞。
29. 前記細胞が、同種Ｔ細胞である、請求項２７に記載の操作された免疫細胞。
30. 請求項２５～２９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を含む、薬学的組成物。
31. 疾患または障害の治療を必要とする対象において疾患または障害を治療する方法であって、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、または請求項３０に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
32. 前記疾患または障害が、癌である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記疾患または障害が、小細胞肺癌である、請求項３１または３２に記載の方法。
34. 請求項２６～３２５～２９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、または請求項３０に記載の薬学的組成物を含む、製品。
35. （ａ）配列番号１、１０、１９、２８、３７、４６、５５、６４、７３、８２、９１、１００、１０９、１１８、１２７、１３６、１４５、１５４、１６３、１７２、１８１、１９０、１９９、２０８、２１７、２２６、２３５、２４４、２５３、２６２、２７１、２８０、２８９、２９８、３０７、３１６、３２５、３３４、３４３、３５２、３６１、３７０、３７９、３８８、３９７、４０６、４１５、４２４、４３３、４４２、４５１、および４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号２、１１、２０、３８、４７、５６、６５、７４、８３、９２、１０１、１１０、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、１７３、１８２、１９１、２００、２０９、２１８、２２７、２３６、２４５、２５４、２６３、２７２、２８１、２９０、２９９、３０８、３１７、３２６、３３５、３４４、３５３、３６２、３７１、３８０、３８９、３９８、４０７、４１６、４２５、４３４、４４３、４５２、４６１、および６９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号３、１２、２１、３０、３９、４８、５７、６６、７５、８４、９３、１０２、１１１、１２０、１２９、１３８、１４７、１５６、１６５、１７４、１８３、１９２、２０１、２１０、２１９、２２８、２３７、２４６、２５５、２６４、２７３、２８２、２９１、３００、３０９、３１８、３２７、３３６、３４５、３５４、３６３、３７２、３８１、３９０、３９９、４０８、４１７、４２６、４３５、４４４、４５３、および４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号４、１３、２２、３１、４０、４９、５８、６７、８５、９４、１０３、１１２、１２１、１３０、１３９、１４８、１５７、１６６、１７５、１８４、１９３、２０２、２１１、２２０、２２９、２３８、２４７、２５６、２６５、２７４、２８３、２９２、３０１、３１０、３１９、３２８、３３７、３４６、３５５、３６４、３７３、３８２、３９１、４００、４０９、４１８、４２７、４３６、４４５、４５４、４６３、および６９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１、
    （ｅ）配列番号５、１４、２３、３２、４１、５０、５９、６８、７７、８６、９５、１０４、１１３、１２２、１３１、１４０、１４９、１５８、１６７、１７６、１８５、１９４、２０３、２１２、２２１、２３０、２３９、２４８、２５７、２６６、２７５、２８４、２９３、３０２、３１１、３２０、３２９、３３８、３４７、３５６、３６５、３７４、３８３、３９２、４０１、４１０、４１９、４２８、４３７、４４６、４５５、および４６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２、ならびに
    （ｆ）配列番号６、１５、２４、３３、４２、５１、６０、６９、７８、８７、９６、１０５、１１４、１２３、１３２、１４１、１５０、１５９、１６８、１７７、１８６、１９５、２０４、２１３、２２２、２３１、２４０、２４９、２５８、２６７、２７６、２８５、２９４、３０３、３１２、３２１、３３０、３３９、３４８、３５７、３６６、３７５、３８４、３９３、４０２、４１１、４２０、４２９、４３８、４４７、４５６、および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＤＬＬ３結合剤。
36. 前記結合剤が、抗体、抗体コンジュゲート、またはそれらの抗原結合断片、任意に、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、またはｄＡｂ断片である、請求項３５に記載のＤＬＬ３結合剤。
37. 前記結合剤が、ＩｇＧ定常領域を含むモノクローナル抗体である、請求項３６に記載の抗ＤＬＬ３結合剤。
38. 表１ｂに提供されるＶＨ配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一である可変重（ＶＨ）鎖配列を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の抗ＤＬＬ３結合剤。
39. 表１ｃに提供されるＶＬ配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一である可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の抗ＤＬＬ３結合剤。
40. 前記結合剤が、表１ｄに提示されるｓｃＦｖ配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の抗ＤＬＬ３結合剤。
41. 前記結合剤が、Ｆｃ定常領域に融合されたｓｃＦｖ断片を含む融合タンパク質である、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の抗ＤＬＬ３結合剤。
42. 請求項３５～４１のいずれか一項に記載の抗ＤＬＬ３結合剤および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
43. 請求項３５～４１のいずれか一項に記載の抗ＤＬＬ３結合剤、または請求項４２に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害を治療する方法。
44. 前記疾患または障害が、癌である、請求項４３に記載の方法。
45. 前記疾患または障害が、小細胞肺癌である、請求項４３または４４に記載の方法。

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