ES2635014T3 - Antígeno gB del citomegalovirus - Google Patents

Abstract

Un polipéptido gB del citomegalovirus (CMV) que comprende un dominio transmembrana (TM) no funcional, en el que al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de los aminoácidos del dominio TM está suprimido, y al menos una porción del dominio extracelular de la proteína gB que comprende un dominio de bucle de fusión 1 (FL1) definido por los aminoácidos Y.I.Y emplazados en la posición 155-157 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB del CMV, y un dominio de bucle de fusión 2 (FL2) definido por los aminoácidos W.L.Y emplazados en la posición 240-242 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB del CMV, en el que al menos el dominio FL1 comprende la sustitución de al menos un aminoácido seleccionado de Y.I.Y emplazados en la posición 155-157 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB del CMV, por un aminoácido polar que no sea un aminoácido aromático.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(Del2) de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1.

La hidrofobicidad de una secuencia de aminoácidos, o de un fragmento de la misma, está estipulada por el tipo de aminoácidos que componen esta secuencia o un fragmento de la misma. Normalmente, los aminoácidos se clasifican en distintos grupos de acuerdo con sus cadenas laterales. Por ejemplo, algunas cadenas laterales se consideran no polares, es decir hidrófobas, mientras que otras se consideran polares. En el sentido de la presente invención, alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), prolina (P), fenilalanina (F) y triptófano (W) se consideran parte de los aminoácidos hidrófobos, mientras que serina (S), treonina (T), asparagina (N), glutamina (Q), tirosina (Y), cisteína (C), lisina (K), arginina (R), histidina (H), ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E) se consideran parte de los aminoácidos polares. Con independencia de su hidrofobicidad, los aminoácidos también se clasifican en subgrupos basados en las propiedades comunes compartidas por sus cadenas laterales. Por ejemplo, fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican en conjunto como aminoácidos aromáticos y se considerarán aminoácidos aromáticos dentro del significado de la presente invención. Aspartato (D) y glutamato (E) son parte de los aminoácidos ácidos o con carga negativa, mientras que lisina (K), arginina (R ) e histidina (H) son parte de los aminoácidos básicos o con carga positiva, y se considerarán como tales en el sentido de la presente invención. Están disponibles escalas de hidrofobicidad que usan las propiedades hidrófobas e hidrófilas de cada uno de los 20 aminoácidos y asignan una puntuación hidrofóbica a cada aminoácido, creando así una clasificación de hidrofobicidad. Únicamente como ejemplo ilustrativo se puede citar la escala de Kyte y Dolittle tratada anteriormente (Kyte y col. 1982. J. Mol. Bio. 157: 105-132). Esta escala permite calcular la hidrofobicidad promedio dentro de un segmento de longitud predeterminada. Por consiguiente, el experto en la materia puede identificar regiones hidrófobas en una secuencia de aminoácidos como posibles dianas para mutación en conformidad con la presente invención. La capacidad de la mutación de dichas regiones para inducir un perfil de producto mejorado de la proteína mutante resultante, es decir, favoreciendo la proporción de trímeros en la población, se puede analizar como se describe a continuación. La mutación de una región hidrófoba puede consistir en una deleción de dicha región como se indica anteriormente, o parte de ella, o en mutaciones puntuales que sustituyen aminoácidos hidrófobos con aminoácidos polares en dicha región. La relevancia de la mutación se determinará analizando el efecto resultante de dicha mutación sobre el perfil de producto del polipéptido mutado, tras la expresión recombinante en las células hospedadoras, es decir una mutación relevante es inducir un perfil mejorado enriquecido en trímeros, en el que al menos el 50 %, adecuadamente al menos el 60 % y más adecuadamente al menos el 70 % de los trímeros está presente en la población del polipéptido mutado. Los inventores observaron que el dominio citoplasmático C-terminal se podía suprimir en un grado variable al tiempo que se mantenía el perfil de producto mejorado, como describe anteriormente. Por consiguiente, la presente divulgación describe polipéptidos gB del CMV en los que adecuadamente se suprime el 10 %, más adecuadamente el 20 %, más adecuadamente el 60 %, más adecuadamente el 80 %, más adecuadamente el 90 % de los aminoácidos del dominio citoplasmático. Posiblemente se puede suprimir el dominio citoplasmático completo. En particular, los inventores observaron que cuando se suprime al menos el 70 %, adecuadamente al menos el 80 %, o más, del dominio citoplasmático, los polipéptidos gB del CMV resultantes mostraban un mejor nivel de expresión y secreción cuando se expresaban de forma recombinante en las células hospedadoras. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los polipéptidos gB del CMV de la invención comprenden la mutación de al menos un bucle de fusión (FL1 y/o FL2), adecuadamente FL1, o posiblemente ambos, y la deleción del dominio citoplasmático completo, por ejemplo los aminoácidos 776 a 906 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB del CMV.

Se puede usar para controlar el perfil de producto y, por lo tanto, para determinar si dadas mutaciones confieren un perfil de producto mejorado tal como se describe anteriormente, cualquier procedimiento que permita discriminar los componentes en una población, tales como polipéptidos purificados que posiblemente se agreguen entre sí, de acuerdo con su tamaño o densidad. Los procedimientos adecuados se pueden basar en la sedimentación, tal como la ultracentrifugación analítica (UCA), o en la cromatografía, en particular la cromatografía de exclusión por tamaño, tal como la cromatografía de exclusión por tamaño basada en UV (CET-UV). Como alternativa, un procedimiento para evaluar el nivel de agregación en una muestra de proteína o polipéptido puede consistir en tratar la muestra con un agente de reticulación, para formar enlaces covalentes entre dos proteínas o polipéptidos, o más. Adecuadamente, puede usarse glutaraldehído como reticulante. Tras la reticulación, la carga de la muestra en un gel en condiciones desnaturalizantes, tales como SDS-PAGE, y la tinción del gel para observar la presencia de proteínas con, por ejemplo, azul de Coomassie o nitrato de plata, presentará agregados, si los hubiere, que se separan de acuerdo con su peso molecular. La carga en paralelo de un marcador constituido por proteínas de un peso molecular conocido permitirá determinar el peso molecular de los distintos agregados. A condición de que se conozca el peso molecular de la unidad mínima, tal como un polipéptido en su forma monomérica, el peso molecular observado de los agregados será indicativo del nivel de multimerización en los agregados. Por ejemplo, el polipéptido gB de AD169 de CMV con el dominio transmembrana suprimido tiene una longitud de 838 aminoácidos. Si se considera que el peso molecular promedio de un aminoácido es 110 kDa, entonces el peso molecular esperado de este polipéptido es 92 kDa. Por lo tanto, si se agrega tal polipéptido, entonces cabría esperar que el peso molecular promedio de los multímeros resultantes sea un múltiplo de 92. En particular, si se forman trímeros, el peso molecular promedio esperado de tales trímeros constituidos por 3 moléculas de gB con el dominio transmembrana suprimido es 276 kDa.

9 5

15

25

35

45

55

Cualquiera de las mutaciones descritas anteriormente en los bucles de fusión FL1 y/o FL2 se pueden combinar con mutaciones adicionales. Debe entenderse que los polipéptidos gB del CMV de acuerdo con la presente invención tienen un dominio transmembrana no funcional y comprenden mutaciones específicas adicionales, tales como las mutaciones de los bucles de fusión. El emplazamiento de un dominio transmembrana dentro de un polipéptido se puede predecir a través del uso de programas informáticos capaces de formular una escala hidropatía a partir de la secuencia de aminoácidos, usando las propiedades hidrófobas e hidrófilas de los 20 aminoácidos (Kyte y col. 1982.

J. Mol. Bio. 157: 105-132). La hidropatía promedio dentro de un segmento de la secuencia de longitud predeterminada se calcula de forma continua a medida que el programa se mueve a través de la secuencia. Después, estas puntuaciones consecutivas de la hidropatía se representan del extremo N al extremo C y se imprime una línea de punto medio que corresponde con un promedio de hidropatía grande de las composiciones de aminoácidos encontrados en la mayoría de las proteínas secuenciadas conocidas. Las proteínas unidas a la membrana presentan grandes regiones ininterrumpidas en el lado hidrófobo de la línea que corresponden con una porción de la secuencia que está incluida en la bicapa lipídica de la membrana. Un dominio transmembrana es responsable del anclaje de un polipéptido a la membrana celular. En las glucoproteínas de la envoltura viral, el dominio transmembrana normalmente contiene tramos de 20-27 aminoácidos no cargados, principalmente hidrófobos, cerca de la parte C-terminal del polipéptido. Como ejemplo de la aplicación del análisis de hidropatía como se describe anteriormente, respecto a gB del CMV, se puede citar la publicación de Spaete y col. (Spaete y col., 1988, Virology 167: 207-225). De hecho, los autores identificaron en el polipéptido gB del CMV de las cepas AD169 y Towne, un supuesto dominio transmembrana hidrófobo fácilmente evidente como dos picos hidrófobos anchos adyacentes cerca del extremo C del polipéptido gB. El primero comprende los aminoácidos 715 a 748 y el segundo los aminoácidos 752 a 772 (la numeración corresponde a la secuencia de aminoácidos del polipéptido gB de la cepa AD169, como se representa en SEQ ID NO: 1). Una publicación de Reschke y col. (Reschke y col., 1995,

J. of Gen. Virology 76: 113-122) identificó de forma alternativa el segundo tramo de los aminoácidos 751 a 771 como el supuesto dominio transmembrana de gB del CMV AD169. Por lo tanto, estas dos publicaciones sugieren que el supuesto dominio transmembrana de gB del CMV AD169 incluye al menos los aminoácidos 751 a 771 y, posiblemente, los aminoácidos 714 a 771. En el sentido de la presente invención, el dominio transmembrana del polipéptido gB del CMV abarca al menos los aminoácidos 701 a 775 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB del CMV y, así, tiene una longitud de 74 aminoácidos.

Por “un dominio transmembrana no funcional” debe entenderse, dentro del significado de la presente invención, que al menos parte del supuesto dominio transmembrana se modifica para permitir la secreción del polipéptido resultante de una célula hospedadora tras la expresión en dicha célula. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido gB se suprime del dominio transmembrana completo. En aspectos alternativos de la divulgación, los polipéptidos gB del CMV conservan una parte del dominio transmembrana. En particular, los polipéptidos gB del CMV conservan al menos el 5 %, adecuadamente al menos el 10 %, más adecuadamente al menos el 20 %, más adecuadamente al menos el 30 % o al menos el 50 % de los aminoácidos del dominio transmembrana. Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación, al menos el 50 % de la cantidad de aminoácidos del dominio transmembrana se suprime en los polipéptidos gB del CMV de la invención, se suprime adecuadamente al menos el 70 %, más adecuadamente al menos el 80 %, más adecuadamente al menos el 90 % e incluso el 95 % de la cantidad de aminoácidos del dominio transmembrana. De acuerdo con una realización, el dominio transmembrana del polipéptido gB del CMV de la invención se hace no funcional suprimiendo los aminoácidos 701 a 775 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en otros polipéptidos gB del CMV. A base de la predicción descrita anteriormente para determinar el emplazamiento de un dominio transmembrana dentro de un polipéptido, el alcance de la deleción puede variar adicionalmente, siempre que el polipéptido gB del CMV suprimido resultante se secrete de las células hospedadoras tras la expresión en dichas células. La alteración funcional del dominio transmembrana no se limita a la deleción de aminoácidos. La alteración puede consistir en cualquier otro tipo de mutaciones de aminoácidos, tales como inserción y/o sustituciones. Las supresiones, inserciones y sustituciones de aminoácidos también se pueden combinar de cualquier modo, siempre que el polipéptido gB del CMV mutado resultante se secrete de las células hospedadoras tras la expresión en dichas células. Está dentro de las capacidades del experto en la materia evaluar el impacto de una mutación dada, tal como, por ejemplo, la deleción de una parte dada del dominio transmembrana, sobre la capacidad del polipéptido mutado resultante para que las células lo secreten. Se puede detectar la secreción de un polipéptido y se puede evaluar el nivel de secreción mediante cualquier técnica conocida en la materia. Como ejemplo ilustrativo no limitante, es posible medir por separado el contenido del polipéptido expresado que se retiene dentro de las células y que se secreta al sobrenadante del cultivo celular o al medio de cultivo celular tras la expresión. Normalmente, tras la expresión se recoge el sobrenadante del cultivo celular antes de que las células se lisen de acuerdo con cualquier procedimiento de lisis común, proporcionando así dos fracciones, una celular y una de sobrenadante. Después, se puede medir el contenido del polipéptido en cada fracción mediante cualquier técnica de detección de proteínas conocida en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede detectar mediante transferencia de Western o mediante ensayo de ELISA.

Por “que comprende al menos una parte del dominio extracelular” debe entenderse, en el sentido de la presente invención, como al menos la parte del dominio extracelular que comprende o abarca los bucles de fusión FL1 y FL2. La cantidad de aminoácidos adicionales fuera de los bucles de fusión en el dominio extracelular puede variar. La cantidad adecuada de aminoácidos, o el porcentaje de aminoácidos del dominio extracelular presente en los polipéptidos de la invención debería ser tal que los polipéptidos resultantes comprendan los epítopos antigénicos y presenten un perfil de trimerización mejorado. Adecuadamente, al menos el 50 %, más adecuadamente al menos el

10

imagen8

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

En determinadas realizaciones, el polipéptido gB del CMV de la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18. Como alternativa, en distintas realizaciones, el polipéptido gB del CMV de la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21.

Otro aspecto de la presente divulgación concierne a ácidos nucleicos que codifican los polipéptido gB del CMV de la presente invención. Las células en las que se introducen tales ácidos nucleicos o vectores (es decir, células hospedadoras) también son parte de la invención. Las células hospedadoras pueden ser células bacterianas, pero más comúnmente serán células eucariotas, tales como células de levaduras (por ejemplo, pichia), células vegetales, células de insectos o células de mamífero (por ejemplo, células CHO). En un aspecto de la divulgación, los polipéptidos gB del CMV se expresan de forma recombinante en células CHO.

Los términos “polinucleótido” y “secuencia de ácido nucleico” se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de una longitud de al menos 10 bases. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o formas modificadas de cualquier nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN. Por “polinucleótido aislado” se entiende un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo a ambas secuencias codificantes con las que es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5’ y una en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que procede. En un aspecto de la divulgación, un polinucleótido codifica un polipéptido. La dirección 5’ y 3’ de un ácido nucleico se define haciendo referencia a la conectividad de unidades nucleotídicas individuales y se designa en conformidad con las posiciones del carbono del anillo de azúcar desoxirribosa (o ribosa). El contenido de información (codificante) de una secuencia polinucleotídica se lee en la dirección 5’ a 3’.

Un ácido nucleico “recombinante” es uno que tiene una secuencia que no es de origen natural o tiene una secuencia que está formada por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial se puede llevar a cabo mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo mediante técnicas de ingeniería genética. Una proteína “recombinante” es una que está codificada por un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, recombinante) que se ha introducido en una célula hospedadora, tal como una célula bacteriana o eucariota. El ácido nucleico se puede introducir en un vector de expresión que tenga señales capaces de expresar la proteína codificada por el ácido nucleico introducido o el ácido nucleico se puede integrar en el cromosoma de la célula hospedadora.

En algunos aspectos de la divulgación, los ácidos nucleicos recombinantes tienen codones optimizados para la expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota seleccionada, tal como una célula de mamífero, vegetal

o de insecto. Para facilitar la replicación y la expresión, los ácidos nucleicos se pueden incorporar en un vector, tal como un vector de expresión procariota o eucariota. Aunque los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento se pueden incluir en una cualquiera de una diversidad de vectores (incluidos, por ejemplo, plásmidos bacterianos; ADN de fagos; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores obtenidos de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN vírico tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, seudorrabia, adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus y muchos otros), más comúnmente el vector será un vector de expresión adecuado para generar productos de expresión polipeptídicos. En un vector de expresión, el ácido nucleico que codifica el polipéptido gB del CMV normalmente está dispuesto cerca y con una orientación con respecto a una secuencia de control de la transcripción apropiada (promotor y, de forma opcional, uno o más potenciadores) para dirigir la síntesis de ARNm. Es decir, la secuencia polinucleotídica de interés está unida operativamente a una secuencia de control de la transcripción apropiada. Los ejemplos de tales promotores incluyen: el promotor inmediato temprano del CMV, una LTR o el promotor del SV40, el promotor de polihedrón de baculovirus, el promotor lac o trp de E. coli, el promotor PL del fago lambda y el de T7, y otros promotores conocidos que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. Normalmente, el vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. De forma opcional, el vector incluye secuencias adecuadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión comprenden, de forma opcional, uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas, tales como dihidrofolato reductasa, resistencia a neomicina o resistencia a kanamicina, para cultivo de células eucariotas, o tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector de expresión puede incluir también elementos de expresión adicionales para, por ejemplo, mejorar la eficiencia de la traducción. Estas señales pueden incluir un codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En algunos casos, por ejemplo, se insertan un codón de inicio de la traducción y los elementos de secuencia asociados en el vector de expresión adecuado de forma simultánea con la secuencia polinucleotídica de interés (por ejemplo, un codón de iniciación nativo). En tales casos no se necesitan señales de control de la traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta una secuencia codificante de polipéptido, o una parte de la misma, para la expresión de la secuencia de gB del CMV se proporcionan señales de control de la traducción exógenas, incluido un codón de iniciación ATG. El codón de iniciación se coloca en la fase de lectura correcta para garantizar la traducción de la secuencia polinucleotídica de interés. Los elementos transcripcionales exógenos y los codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. Si se desea se puede aumentar adicionalmente la eficacia de la expresión mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (Scharf y col. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bitter y col. (1987) Methods

13

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

presente divulgación son capaces de hibridar con al menos una de las SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 11, 13, 15 y 17, a lo largo de sustancialmente su longitud completa.

Los polipéptidos gB del CMV desvelados en el presente documento se producen usando procedimientos bien establecidos para la expresión y purificación de proteínas recombinantes. Se pueden encontrar procedimientos suficientes para guiar al experto en la materia en, por ejemplo, las referencias de Sambrook y de Ausubel citadas anteriormente. A continuación en el presente documento se proporcionan detalles adicionales y específicos. Los ácidos nucleicos recombinantes que codifican los polipéptidos gB del CMV, tales como (pero sin limitación) los ácidos nucleicos ejemplares representados por las SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 11, 13, 15 y 17, se introducen en las células hospedadoras mediante cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos, tales como electroporación, transfección mediada por liposomas, precipitación con fosfato cálcico, infección, transfección y similares, dependiendo de la selección de los vectores y las células hospedadoras. Las células hospedadoras que incluyen ácidos nucleicos que codifican el polipéptido gB del CMV recombinantes son, por lo tanto, también una característica de la presente divulgación. Las células hospedadoras favorables incluyen células hospedadoras procariotas (es decir, bacterianas), tales como E. coli, así como numerosas células hospedadoras eucariotas, incluidas células fúngicas (por ejemplo, levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae y Picchia pastoris), células de insecto, células vegetales y células de mamífero (tales como células CHO). Los ácidos nucleicos de gB del CMV recombinantes se introducen (por ejemplo, transducen, transforman o transfectan) en las células hospedadoras a través, por ejemplo, de un vector, tal como un vector de expresión. Como se describe anteriormente, el vector es, con mayor frecuencia, un plásmido, pero tales vectores también pueden ser, por ejemplo, una partícula viral, un fago etc. Los ejemplos de hospedadores de expresión adecuados incluyen: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Neurospora crassa; células de insecto tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda; células de mamífero, tales como 3T3, COS, CHO, BHK, HEK 293 o melanoma de Bowes; células vegetales, incluidas células de algas, etc.

Las células hospedadoras se pueden cultivar en medios nutritivos convencionales modificados, según sea adecuado, para activar los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar las secuencias polinucleotídicas insertadas. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son normalmente las usadas anteriormente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes para los expertos en la materia, y las de las referencias citadas en el presente documento, que incluyen, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas en el mismo. Los productos de expresión que corresponden con los ácidos nucleicos de la invención también se pueden producir en células no animales, tales como vegetales, de levaduras, hongos, bacterias y similares. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, se pueden encontrar detalles respecto al cultivo celular en Payne y col. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg y Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) y Atlas y Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el producto expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de un polipéptido o fragmentos del mismo para la producción de anticuerpos, se usan de forma favorable vectores que dirijan la expresión de altos niveles de proteínas que se purifican con facilidad. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, vectores de clonación y expresión multifuncionales de E. coli, tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia codificante de interés, por ejemplo un polinucleótido de la invención como describe anteriormente, se puede ligar en el vector en fase con las secuencias para la metionina de inicio de la traducción amino terminal y los posteriores 7 residuos de la beta-galactosidasa, que producen una proteína de fusión de beta galactosidasa catalíticamente activa; vectores pIN (Van Heeke y Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); vectores pET (Novagen, Madison WI), en los que la metionina amino terminal está ligado en fase con una marca de histidina; y similares. De forma similar, en levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, se pueden usar varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa y PGH, para la producción de los productos de expresión deseados. Para revisiones, véase Berger, Ausubel y, por ejemplo, Grant y col. (1987; Methods in Enzymology 153:516-544). En las células hospedadoras de mamífero se puede usar varios sistemas de expresión, incluidos plásmidos y sistemas basados en virus.

De forma opcional, una célula hospedadora se escoge por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada del modo deseado. Tales modificaciones de la proteína incluyen, pero sin limitación, glucosilación (así como, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, lipidación y acilación). Por ejemplo, el procesamiento postraduccional, que escinde una forma precursora para producir una forma madura de la proteína (por ejemplo, mediante una proteasa furina) se realiza de forma opcional en el contexto de la célula hospedadora. Distintas células hospedadoras, tales como 3T3, COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38, etc., tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales, y se pueden escoger para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña introducida. Para la producción prolongada de alto rendimiento del polipéptido gB del CMV recombinante codificado por los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento, normalmente se usan sistemas de expresión estables. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable un polipéptido gB del CMV de la invención se obtienen introduciendo en la célula hospedadora vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos o elementos de expresión endógenos, y un gen marcador de selección. Tras la introducción del

15 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

vector, se deja que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El fin del marcador de selección es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el cultivo y recuperación de células que expresan de forma satisfactoria las secuencias introducidas. Por ejemplo, se pueden hacer proliferar grupos o colonias resistentes de células transformadas de forma estable, usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo celular. Las células hospedadoras transformadas con un ácido nucleico que codifica un polipéptido gB del CMV se cultivan de forma opcional en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación a partir del cultivo celular de la proteína codificada.

Después de la transducción de una línea celular hospedadora adecuada y el cultivo de las células hospedadoras hasta una densidad celular adecuada, el promotor seleccionado se induce mediante medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química), y las células se cultivan durante un periodo adicional. Después, el producto polipeptídico secretado se recupera del medio de cultivo y se purifica. Como alternativa, las células se pueden recoger mediante centrifugación, romper por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se conserva para la purificación adicional. Las células eucariotas o microbianas empleadas en la expresión de proteínas, se pueden romper por cualquier procedimiento conveniente, incluidos ciclos de congelacióndescongelación, ultrasonido, rotura mecánica, o los polipéptidos gB del CMV de las células se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante cualquiera de varios procedimientos bien conocidos en la técnica, que incluyen precipitación en sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando cualquiera de los sistemas de marcaje indicados en el presente documento), cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Para completar la configuración de la proteína madura se pueden usar etapas de renaturalización de proteínas, según se desee. Por último, se puede emplear en las etapas de purificación finales cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Además de las referencias indicadas anteriormente, en la técnica se conocen bien una diversidad de procedimientos de purificación, que incluyen, por ejemplo, los expuestos en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; y Bollag y col. (1996) Protein Methods, 2ª edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, RU; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3ª Edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edición Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

En un ejemplo, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos gB del CMV se clonan en un vector adecuado para la introducción en células de mamífero (por ejemplo, células CHO). En este aspecto ejemplar de la divulgación, la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido gB del CMV se introduce en el vector pMax desarrollado por Amaxa. El polipéptido se expresa bajo un promotor constitutivo, el promotor temprano inmediato de CMV. La selección de las células transfectadas de forma estable que expresan la quimera se realiza a base de la capacidad de las células transfectadas para crecer en presencia de kanamicina. Las células que se han integrado de forma satisfactoria en pMax tienen la capacidad de crecer en presencia de kanamicina debido a que el vector pMax expresa un gen de resistencia a kanamicina. Las células seleccionadas pueden expandirse de forma clonal y caracterizarse por la expresión de los polipéptidos gB del CMV. Como alternativa, las secuencias polinucleotídicas que codifican los polipéptidos gB del CMV de la invención se pueden introducir en el vector pTT5 desarrollado por NRC, que expresa un gen de resistencia a ampicilina.

Después de la transfección y la inducción de la expresión (de acuerdo con el promotor y/o los potenciadores u otros elementos reguladores seleccionados), se recuperan los polipéptidos expresados (por ejemplo, se purifican o enriquecen). Lo siguiente es un procedimiento ejemplar para purificar los polipéptidos gB del CMV. Para facilitar la purificación, los polipéptidos gB del CMV incluyen una marca de polihistidina C-terminal. En resumen, el sobrenadante del cultivo celular se recogió 6 días después de la transfección. Tras el aclarado, los sobrenadantes se cargaron en columnas de níquel.

El término “purificación” se refiere al procedimiento de retirar los componentes de una composición cuya presencia no se desea. Purificación es un término relativo y no requiere que se retiren de la composición todos los rastros del componente no deseado. En el contexto de la producción de vacunas, la purificación incluye procedimientos tales como centrifugación, dializado, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño, purificación por afinidad o precipitación. Por lo tanto, el término “purificado” no requiere pureza absoluta; en su lugar, se pretende que sea un término relativo. Una preparación de ácido nucleico o proteína sustancialmente pura se puede purificar de manera que el ácido nucleico deseado, o la proteína, represente al menos el 50 % del contenido de ácido nucleico de la preparación. En algunos aspectos de la divulgación, un ácido nucleico, o proteína, sustancialmente puro representará al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %, o más, del contenido total de ácido nucleico o de proteína de la preparación.

En el sentido de la presente invención, un componente biológico “aislado” (tal como una molécula de ácido nucleico

o proteína) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que el componente se produce de forma natural, tales como otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que se han “aislado” incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación convencionales. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparadas mediante expresión recombinante en una célula hospedadora, así

16

imagen11

imagen12

imagen13

5

15

25

35

45

55

aspecto de la divulgación, los liposomas comprenden 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfoetanolamina. En un aspecto de la divulgación, se usa fosfatidilcolina altamente purificada y se puede seleccionar del grupo que comprende fosfatidilcolina (huevo), fosfatidilcolina hidrogenada (huevo) fosfatidilcolina (soja) fosfatidilcolina hidrogenada (soja). En un aspecto adicional de la divulgación, los liposomas comprenden fosfatidiletanolamina [POPE] o un derivado de la misma. El tamaño del liposoma puede variar de 30 nm a varios µm dependiendo de la composición de fosfolípidos y del procedimiento usado para su preparación. En aspectos particulares de la divulgación, el tamaño del liposoma estará en el intervalo de 50 nm a 500 nm y en aspectos adicionales de 50 nm a 200 nm. La dispersión de luz láser dinámica es un procedimiento usado para medir el tamaño de los liposomas bien conocido para los expertos en la materia. Los liposomas de la divulgación pueden comprender dioleoil fosfatidilcolina [DOPC] y un esterol, en particular colesterol. Por lo tanto, en un aspecto particular, las composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos gB del CMV de la invención, tales como los polipéptidos gB que tienen un dominio transmembrana no funcional y al menos uno de los bucles de fusión FL1 y FL2 mutados, posiblemente ambos, comprenden QS21 en cualquier cantidad descrita en el presente documento en forma de un liposoma, en el que dicho liposoma comprende dioleoil fosfatidilcolina [DOPC] y un esterol, en particular colesterol.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender uno o más inmunoestimulantes adicionales. En un aspecto de la divulgación, las composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos gB del CMV de la invención, tal como se describen en el presente documento, comprenden adicionalmente un lipopolisacárido, adecuadamente un derivado no tóxico de lípido A, de forma particular monofosforil lípido A o, de forma más particular, monofosforil lípido A 3-desacilado (3D -MPL). GlaxoSmithKline Biologicals N.A comercializa 3D-MPL con el nombre MPL y en toda la memoria descriptiva se lo denomina MPL o 3D-MPL. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos nº 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094. 3D-MPL estimula principalmente las respuestas de linfocitos T CD4+ con un fenotipo de IFN- (Th1). 3D-MPL se puede producir de acuerdo con los procedimientos desvelados en el documento GB2220211 A. Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 2-desacilado con cadenas 3, 4, 5 o 6 aciladas. En las composiciones de la presente divulgación se puede usar 3D-MPL de partícula pequeña. 3D-MPL de partícula pequeña tiene un tamaño de partícula de manera que se puede esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,22 µm. Dichas preparaciones se describen en el documento WO94/21292.

Las composiciones de la divulgación pueden comprender 3D-MPL en una cantidad de entre aproximadamente 1 µg a aproximadamente 100 µg, por ejemplo entre aproximadamente 1 µg y aproximadamente 60 µg o entre 10 µg y aproximadamente 50 µg, por ejemplo, aproximadamente 10 µg, aproximadamente 12,5 µg, aproximadamente 15 µg, aproximadamente 20 µg, aproximadamente 25 µg, aproximadamente 30 µg, aproximadamente 40 µg o, en particular, aproximadamente 50 µg. En particular 3D-MPL está presente en una cantidad de entre aproximadamente 40 µg y 60 µg o entre 45 y 55 µg, o entre 47 y 53 µg, o entre 48 y 52 µg, o entre 49 y 51 o aproximadamente 50 µg. Como alternativa, 3D-MPL está presente en una cantidad de entre 21 µg y 29 µg, o entre aproximadamente 22 µg y aproximadamente 28 µg, o entre aproximadamente 23 µg y aproximadamente 27 µg, o entre 24 µg y aproximadamente 26 µg, o aproximadamente 25 µg.

En otro aspecto de la divulgación, la dosis para seres humanos de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 10 µg, por ejemplo entre 5 y 15 µg, adecuadamente entre 6 y 14 µg, por ejemplo entre 7 y 13 µg, o entre 8 y 12 µg, o entre 9 y 11 µg, o 10 µg. En una realización adicional de la divulgación, la dosis para seres humanos de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 5 µg, por ejemplo entre 1 y 9 µg, o entre 2 y 8 µg, o, adecuadamente, entre 3 y 7 µg o 4 y 6 µg, o 5 µg. Una cantidad adecuada de 3D-MPL en las composiciones de la invención es, por ejemplo, cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 µg. En otros aspectos de la divulgación, el lipopolisacárido puede ser un disacárido β1-6) glucosamina, como se describe en la patente de Estados Unidos nº 6.005.099 y la patente EP nº 0 729 473 B1. Un experto en la materia sería capaz de producir fácilmente diversos lipopolisacáridos, tales como 3D-MPL, a base de las enseñanzas de estas referencias. Además de los inmunoestimulantes mencionados anteriormente (que son similares de estructura a la de LPS o MPL, o 3D-MPL), también son adyuvantes adecuados los derivados monosacáridos y disacáridos acilados que son una subporción de la estructura anterior de MPL. En otros aspectos de la divulgación, el adyuvante es un derivado sintético del lípido A, algunos de los cuales se describe como agonistas de TLR-4 e incluyen, pero sin limitación:

OM174 (2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono--D-glucopiranosil]-2[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]--D-glucopiranosildihidrogenofosfato), (documento WO 95/14026) OM 294 DP (3S, 9 R) –3--[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1,10-bis(dihidrogenofosfato) (documentos WO 99/64301 y WO 00/0462) OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9 R) –3-(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1 -dihidrogenofosfato 10-(6-aminohexanoato) (documento WO 46127)

En las composiciones con polipéptidos gB del CMV también se pueden usar combinaciones de distintos adyuvantes, tales como los mencionados anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, como ya se ha indicado, QS21 se puede formular junto con 3D-MPL. La proporción QS21 : 3D-MPL normalmente será del orden de 1 : 10 a 10 : 1; tal como de 1:5 a 5 : 1, y a menudo sustancialmente 1 : 1. Normalmente, la proporción está en el intervalo de 2,5 : 1 a 1 : 1 de 3D-MPL: QS21. Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación, las composiciones

20

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2