ES2628914T3 - Purificación de inhibidor de proteasa alfa1 derivado de cultivo celular - Google Patents
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Abstract
Método de disminución de una cantidad de colorante en una solución que comprende el inhibidor de proteinasa alfa1 derivado de cultivo celular (recA1PI), que comprende incubar la solución que comprende recA1PI con un agente reductor y separar el recA1PI del colorante.
Description
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DESCRIPCION
Purificacion de inhibidor de proteasa alfal derivado de cultivo celular SECTOR TECNICO
En el presente documento se describen metodos para purificar inhibidor de proteasa alfai (recAIPI) derivado de cultivo celular recombinante humano y eliminar una especie coloreada que se purifica conjuntamente con la protefna recAIPI.
ANTECEDENTES
El inhibidor de proteinasa alfai (abreviado en el presente documento como A1PI; tambien conocido como inhibidor de proteasa alfa-1, alfa-1 Pl, AiPI, a-1 Pl, alPI, inhibidor de tripsina alfa-1, alfai antitripsina, alfa-1 antitripsina, alfalAT, A1A y A1AT, AAT, entre otros), es el principal inhibidor de serina proteasa (serpina) en seres humanos. El A1PI se expresa como una protefna de 418 aminoacidos con los residuos 1-24 siendo un peptido senal. La protefna madura, que comprende los residuos 25-418, es una glucoprotefna de cadena sencilla que tiene un peso molecular de aproximadamente 51 kD. Vease la Figura 1. Aunque A1PI no contiene ningun puente disulfuro, la protefna esta altamente estructurada, con el 80% de los aminoacidos residiendo en ocho helices a bien definidas y tres grandes laminas p. Tres carbohidratos unidos a asparagina se encuentran en Asn 70, Asn 107 y Asn 271 (numerados como en la protefna de longitud completa). Esto da origen a multiples isoformas de A1PI, que tienen puntos isoelectricos en el intervalo de 4,0 a 5,0. Los monosacaridos de glicano incluyen N-acetilglucosamina, manosa, galactosa, fucosa y acido sialico.
Las concentraciones en plasma normales de A1 PI varfan entre 1,3 y 3,5 mg/ml. El A1 PI funciona protegiendo celulas de proteasas implicadas en la coagulacion y la inflamacion. El A1 PI inhibe tripsina, quimotripsina, diversas formas de elastasas, colagenasa cutanea, renina, uroquinasa y proteasas de linfocitos polimorfonucleares, entre otras. A1PI sirve como seudo-sustrato para estas proteasas, que atacan el bucle del centro reactivo de la molecula de A1PI (residuos Gly 368-Lys 392) escindiendo el enlace entre los residuos Met 358-Ser 359 que forman un complejo A1PI- proteasa. Este complejo es eliminado rapidamente de la circulacion sangufnea. Uno de los papeles endogenos de A1PI es regular la actividad de elastasa de neutrofilos, que degrada protefnas extranas y dana el tejido nativo presente en el pulmon. En ausencia de cantidades suficientes de A1PI, la elastasa degrada tejido pulmonar, lo que con el tiempo da como resultado danos cronicos al tejido pulmonar y enfisema.
El A1PI se purifica a menudo a partir del plasma sangufneo. Vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 6.284.874; 6.462.180; 6.093.804; 7.879.800; y los documentos WO 1998/000154; WO 2002/048176; WO 2010/009388, por ejemplo. Ademas, el A1PI recombinante (recA1PI) puede expresarse y purificarse a partir de diversas fuentes. Vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 4.931.373 y 5.134.119; las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos No. US 2004/0124143 y US 2007/0218535; las publicaciones PCT No. WO 2005/047323 y WO 2010/127939; y los documentos Archibald y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 87: 5178-5182 (1990); Wright y otros, Nat. Biotechnology 9: 830 (1991).
En el presente documento se describen metodos para expresar y purificar A1PI derivado de cultivo celular, recombinante humano para utilizacion terapeutica. Despues de la purificacion, la solucion de A1PI tenia un color amarillo o ambar que puede ser inaceptable para facultativos y/o pacientes. En el presente documento tambien se describen metodos para disminuir la coloracion.
La solicitud de patente PCT WO02/068455A2 da a conocer metodos para incrementar los rendimientos de una conformacion deseada de una protefna recombinante. Dichos metodos estan basados en el uso de reactivos de acoplamiento de reduccion/oxidacion.
La solicitud de patente PCT WO2007/112953A1 da a conocer un proceso de purificacion de alfa-1 antitripsina recombinante producida y mantenida dentro de las celulas, que comprende la eliminacion del medio de cultivo celular y una etapa de cromatograffa de intercambio anionico llevada a cabo con tampones que contienen fosfato y N-acetilcistefna.
La solicitud de patente PCT WO2005/014648A1 da a conocer un proceso para preparar A1AT a partir de soluciones que contienen A1AT, que comprende las siguientes etapas: (a) someter una solucion que contiene A1AT a una cromatograffa de intercambio ionico; (b) anadir detergentes y opcionalmente un disolvente para inactivar los virus con envoltura lipfdica; (c) seguida de un incremento de la concentracion de sal para los detergentes.
La solicitud de patente PCT WO2007/063299A1 da a conocer metodos de aislamiento de AAT a partir de soluciones que contienen albumina y AAT usando al menos dos etapas de cromatograffa de quelatos metalicos por separado. El producto puede purificarse adicionalmente y/o someterse a una o mas etapas de inactivacion o reduccion de virus. A continuacion, la AAT aislada puede formularse para uso farmaceutico.
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CARACTERISTICAS
Una realizacion descrita en el presente documento es un metodo de disminucion de una cantidad de colorante en una solucion que comprende inhibidor de proteinasa alfa1 derivado de cultivo celular (recA1PI) que comprende incubar la solucion que comprende recA1 PI con un agente reductor y separar el recA1 PI del colorante.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna o DTT.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna.
- En algunos aspectos descritos en el presente aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM
- documento, la concentracion de agente reductor es de
- En algunos aspectos descritos en aproximadamente 10 mM.
- el presente documento, la concentracion de agente reductor es de
- En algunos aspectos descritos en aproximadamente 1 mM.
- el presente documento, la concentracion de agente reductor es de
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la etapa de incubacion reductora se lleva a cabo durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la etapa de incubacion reductora se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 60°C.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna 10 mM y la incubacion se lleva a cabo durante una noche aproximadamente a temperatura ambiente.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la separacion del recA1PI del colorante comprende cromatograffa.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la cromatograffa comprende intercambio ionico, interaccion hidrofoba, filtracion en gel, afinidad, inmunoafinidad o combinaciones de las mismas.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el metodo comprende reducir la concentracion de hierro.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro se reduce (es decir, se rebaja) de 2 a 100 veces.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro se reduce (es decir, se rebaja) de 5 a 50 veces.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro es 10 pMI o menos.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro es 1 pMI o menos.
Otra realizacion descrita en el presente documento es un metodo de purificacion de A1PI humano derivado de cultivo celular a partir de una solucion acuosa que comprende recA1PI, que comprende: (a) realizar una etapa de inactivacion viral en una solucion que contiene recA1PI; (b) hacer pasar a la solucion inactivada viralmente a traves de un intercambiador de aniones, de modo que el recA1PI se una al intercambiador de aniones; (c) eluir el recA1PI de la resina de intercambio anionico para obtener un eluato de intercambio anionico que contiene recA1PI; (d) anadir un agente reductor al eluato de intercambio anionico que contiene recA1PI para obtener una solucion reductora; (e) incubar la solucion reductora; (f) hacer pasar a la solucion reductora a traves de una resina de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) de modo que recA1PI se una a la resina de HIC; y (g) eluir recA1PI de la resina de HIC para obtener un eluato de HIC que contiene recA1PI.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la inactivacion viral comprende una incubacion en disolvente/detergente.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el disolvente se anade en un intervalo del 0,01% a aproximadamente el 0,5%.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el detergente se anade de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 2,0% en peso por volumen de la mezcla resultante.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la incubacion en disolvente/detergente comprende anadir
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aproximadamente el 0,5% de polisorbato 20 y aproximadamente el 0,03% de tri(fosfato de n-butilo) a un pH de aproximadamente 8 y una temperatura de aproximadamente 30°C.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el intercambiador de aniones es una resina de amonio cuaternario.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la resina de amonio cuaternario es Capto™ Q.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna (Cys); cisteamina; ditiotreitol (DTT); ditioeritritol (DTE); glutation (GSH); 2-mercaptoetanol (2-ME); 2-mercaptoetilamina (2-MEA); tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP); acido oxalico; acido formico; acido ascorbico; nicotinamida adenfn dinucleotido (NADH); nicotinamida adenfn dinucleotido fosfato (NADPH); o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna o DTT.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de agente reductor es de
aproximadamente 1 mM a 100 mM.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de agente reductor es de
aproximadamente 10 mM.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de agente reductor es de
aproximadamente 1 mM.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la etapa de incubacion reductora se lleva a cabo durante aproximadamente de 1 a 24 horas.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la etapa de incubacion reductora se lleva a cabo de aproximadamente 2°C a 60°C
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna 10 mM y la incubacion se lleva a cabo durante una noche aproximadamente a temperatura ambiente.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la resina de HIC es Octil Sepharose™ o CaptoTM Octilo.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el metodo comprende reducir la concentracion de hierro.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro se reduce (es decir, se rebaja) de 2 a 100 veces.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro se reduce (es decir, se rebaja) de 5 a 50 veces.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro es 10 pMI o menos.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro es 1 pMI o menos.
Otra realizacion descrita en el presente documento es un metodo de purificacion de inhibidor de proteinasa alfa1 derivado de cultivo celular (recA1PI) que comprende incubar una solucion que comprende recA1PI con un agente reductor y separar el recA1PI del agente reductor y la especie reducida.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna o DTT.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de agente
aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de agente
aproximadamente 10 mM.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de agente
aproximadamente 1 mM.
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En algunos aspectos descritos en el presente documento, la etapa de incubacion se lleva a cabo durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la etapa de incubacion se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 60°C.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, el agente reductor es cistefna aproximadamente 10 mM y la incubacion se lleva a cabo durante una noche aproximadamente a temperatura ambiente.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la separacion de recA1PI del agente reductor y la especie reducida comprende cromatograffa.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la cromatograffa comprende intercambio ionico, interaccion hidrofoba, filtracion en gel, afinidad, inmunoafinidad o combinaciones de las mismas.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la especie reducida comprende hierro.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro se reduce (es decir, se rebaja) de 2 a 100 veces.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro se reduce (es decir, se rebaja) de 5 a 50 veces.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro es 10 pMI o menos.
En algunos aspectos descritos en el presente documento, la concentracion de hierro es 1 pMI o menos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 ilustra la secuencia primaria de A1 PI humano y sitios de modificacion destacados.
La figura 2 muestra un diagrama de flujo del proceso de purificacion utilizado para purificar recA1PI que da como resultado una solucion de recA1 PI purificado que tiene un color amarillo.
La figura 3 muestra un cromatograma de una muestra de recA1PI purificada mediante cromatograffa de inmunoafinidad (es decir, resina ATT Select, GE Healthcare Life Sciences).
La figura 4 muestra un espectro UV-Vis de una muestra de recA1PI purificada mediante cromatograffa de afinidad (es decir, resina ATT Select, GE Healthcare Life Sciences).
La figura 5 muestra un cromatograma de una muestra de recA1PI purificada mediante cromatograffa de filtracion en gel (es decir, exclusion por tamano) utilizando resina Superdex™ 200 prep grade (GE Healthcare Life Sciences).
La figura 6 muestra un espectro UV-Vis de una muestra de recA1PI purificada mediante cromatograffa de filtracion en gel (es decir, exclusion por tamano) utilizando resina Superdex™ 200 prep grade (GE Healthcare Life Sciences).
La figura 7 muestra espectros UV-Vis de tres muestras de A1PI derivado de cultivo celular, recombinante humano que tiene un color amarillo. La muestra 1 contiene clorhidrato de guanidina (GdnHCI) 4 M; la muestra 2 contiene ditiotreitol (DTT) 50 mM; la muestra 3 contiene tanto GdnHCI 4 M como DTT 50 mM.
La figura 8 muestra un cromatograma de recA1PI tratado con DTT 50 mM y a continuacion purificado mediante cromatograffa de filtracion en gel.
La figura 9 muestra un cromatograma de recA1PI sin tratamiento con DTT y a continuacion purificado mediante cromatograffa de filtracion en gel.
La figura 10 muestra espectros UV-Vis de muestras de recA1PI, recA1PI tratado con DTT 50 mM y A1PI derivado de plasma, altamente purificado.
La figura 11 muestra espectros UV-Vis de muestras de recA1PI, recA1PI tratado con DTT 50 mM y recA1PI tratado con DTT 10 mM.
La figura 12 muestra un cromatograma de una tanda de cromatograffa de filtracion en gel de DTT 50 mM en PBS.
La figura 13 muestra un cromatograma de una tanda de cromatograffa de filtracion en gel de recA1PI tratado con DTT 50 mM en PBS.
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La figura 14 muestra un cromatograma de una tanda de cromatograffa de filtracion en gel de A1PI derivado de plasma purificado tratado con DTT 10 mM.
La figura 15 muestra un cromatograma de una columna de cromatograffa de filtracion en gel de recA1PI tratado con cistefna 10 mM.
La figura 16 muestra un diagrama de flujo del procedimiento de purificacion de recA1PI revisado que incluye una etapa de incubacion con cistefna. Notese que la incubacion con cistefna puede realizarse en otras etapas en el proceso, tales como despues de cromatograffa de interaccion hidrofoba o despues de pasar a traves de la membrana de intercambio cationico (flechas en negrita).
La figura 17 muestra un cromatograma de cromatograffa de interaccion hidrofoba sobre Octil Sepharose™ con recA1PI no tratado con cistefna.
La figura 18 muestra un cromatograma de cromatograffa de interaccion hidrofoba sobre Octil Sepharose™ con recA1PI despues del tratamiento con cistefna 10 mM.
La figura 19 muestra espectros UV-Vis de recA1PI, recA1PI tratado con cistefna 10 mM o A1PI derivado de plasma altamente purificado.
DESCRIPCION DETALLADA
En el presente documento se describen metodos para purificar inhibidor de proteasa alfa1 derivado de cultivo recombinante y eliminar una especie coloreada que purifica conjuntamente con la protefna recA1PI.
Un aspecto descrito en el presente documento es un metodo de purificacion de A1PI humano derivado de cultivo celular recombinante a partir de una solucion acuosa que contiene recA1 PI.
Otro metodo descrito en el presente documento es un metodo de disminucion de la coloracion de una solucion de A1PI derivado de cultivo celular recombinante que comprende incubar la solucion de recA1PI con un agente reductor y separar la recA1PI del agente reductor y la especie coloreada.
Otro metodo descrito en el presente documento es un metodo de purificacion de A1PI derivado de cultivo celular recombinante que comprende incubar una solucion de recA1PI con un agente reductor y separar el recA1PI del agente reductor y la especie reducida.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Crecimiento celular y expresion de A1 PI recombinante humano Caracterfsticas
La expresion de A1PI humano recombinante comienza cultivando celulas PER.C6® humanas (Crucell, Leiden, Pafses Bajos) que contienen una construccion del plasmido pAAT0pST3 para expresar recA1PI humano glucosilado. Estas celulas son capaces de producir altos rendimientos de recA1PI glucosilado, es decir, hasta 22 picogramos de recA1PI por celula al dfa (pcd). El cultivo de PER.C6®/recAlPl se recogio mediante una serie de etapas de aumento progresivo mediante un biorreactor Wave de 10 l y un biorreactor de 200 l con un volumen de trabajo diana de 150 l. El sobrenadante del cultivo que contiene el recA1PI se recogio 13-14 dfas despues mediante centrifugado a 6.000 rpm en una centrffuga Celeros (Celeros Separations, Foxboro, MA) seguida por filtracion antes de la purificacion.
Serie de inoculos de descongelacion en vial y matraz oscilante
El proceso de cultivo celular comenzo con la descongelacion de un criovial de celulas humanas PER.C6® (Crucell) que contenfa una construccion del plasmido pAATopST3 para expresar recA1PI humano glucosilado. Las descripciones del clon del inhibidor de proteasa alfa1 recombinante humano, la expresion y analisis del A1PI recombinante expresado se describen en el documento WO 2010/127939 y la solicitud de patente de Estados Unidos No. 13/138.912, que se incorporan como referencia en el presente documento por dichas ensenanzas. Despues de que el vial de celulas se descongelo, las celulas se transfirieron a un matraz oscilante de fondo plano de 125 ml y se llevaron a un volumen final de 15-25 ml de medio basal CDM4PERMAbTM (Hyclone) para una densidad de celulas viables diana de 0,5 x 106 ± 0,1 x 106 celulas/ml. El matraz oscilante de 125 ml (Pase No. 1) se incubo durante 96 ± 4 horas a 90 rpm, 36,5°C, CO2 al 5,0%. Las celulas se transfirieron a continuacion a un matraz oscilante de fondo plano de 250 ml con un volumen diana de 100 ml y una densidad celular viable de 0,5 x 106 ± 0,1 x 106 celulas/ml. El matraz oscilante de fondo plano de 250 ml (Pase No. 2) se incubo durante de 72 a 96 horas (± 4
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Serie de inoculos en biorreactor Wave
El volumen procedente del matraz oscilante de 1 l se transfirio a una bolsa Cellbag® de 10 l en un biorreactor 20/50EH Wave™ (GE Healthcare Life Sciences) para conseguir un volumen de trabajo de 3,0-4,0 l y una densidad celular viable de 0,5 x 106 ± 0,1 x 106 celulas/ml. La bolsa Cellbag® de 10 l se acciono durante de 72 a 96 horas (±4 horas) a 25 rpm, angulo de balanceo 7°, 0,2 litros por minuto (lpm) de caudal de aire, 36,5°C, y CO2 al 3,0%. El volumen procedente de la bolsa Cellbag de 10 l se transfirio a una bolsa Cellbag® de 50 l en un biorreactor 20/50EH Wave para conseguir un volumen de trabajo de 22-25 l y una densidad celular viable de 0,5 x 106 ± 0,1 x 106 celulas/ml. La bolsa Cellbag® de 50 l se acciono durante de 72 a 96 horas (± 4 horas) a 22 rpm, angulo de balanceo 7°, 0,3 lpm de caudal de aire, 36,5°C y CO2 al 3,0%.
Biorreactor de 200 l
El contenido de la bolsa Cellbag® de 50 l se transfirio al biorreactor de 200 l Xcellerex a traves de una conexion Kleenpak™ esteril (Xcellerex, Marlborough, MA). El biorreactor de 200 l debe contener una cantidad minima (100 l) de medio basal CDM4PERMAb™ (Hyclone) y ser operativo a 36,5°C, 120 rpm, con un pH en el intervalo de 7,2 ± 0,4 antes de la adicion del inoculo. El volumen de trabajo diana era de 150 l a una densidad celular viable de 0,6 x 106 celulas/ml ± 0,1 x 106 celulas/ml. La banda muerta de pH (un area del intervalo de senal donde no se produce accion) era de 7,2 ± 0,4 y el punto de referencia de oxigeno disuelto era del 50%. El pH se mantuvo mediante adicion de carbonato sodico 1 N o gas de CO2. A las 96 horas (± 4 horas), se anadio medio de alimentacion PerMAB™ (Hyclone) como una embolada diaria igual al 0,3% del volumen de trabajo inicial en el biorreactor; El medio de alimentacion se anadio a un caudal de 100-300 ml/mm. El medio de alimentacion se mantuvo a temperatura ambiente durante la tanda y se cubrio para impedir cualquier degradacion por la luz. Se anadio antiespumante al comienzo de la tanda a 12 ppm y se anadio a pequenos incrementos para mantener un nivel de espuma en el biorreactor que era de 2 pulgadas (5,08 cm) o menos. El biorreactor de 200 l se recogio a las 308-340 horas (12,8-14,2 dias).
Centrifugado y Filtracion
El material procedente del biorreactor de 200 l se transfirio al recipiente Celeros APD-75 de 1 l a un caudal de 0,5 lpm con una velocidad de centrifugado de 6.000 rpm (Celeros Separations, Foxboro, MA). El valor de solidos porcentual se calculo antes de la transferencia para determinar el numero de descargas del recipiente necesarias (el recipiente de1 l puede contener 1 kg de solidos). El centrifugado central (la solucion clarificada despues del centrifugado) se transfirio a un soporte Millipore Pilot POD que contiene dos filtros A1HC de 1,1 m2 a 1 lpm (EMD Millipore, Billerica, MA). Despues de la filtracion en profundidad, el material se filtro a traves de un filtro SHC de 0,5/0,2 mm de Millipore.
Ejemplo 2
Purificacion de A1 PI recombinante humano a partir del sobrenadante de cultivo celular Caracteristicas
La purificacion de recA1PI comienza con un tratamiento de tres horas con disolvente/detergente para inactivacion viral. A continuacion, el recA1PI se capturo y se eluyo a partir de una columna Capto™ Q (GE Healthcare Life Science, Piscataway, NJ). Al dia siguiente, la purificacion continuo en una columna de Octil Sepharose™. El eluato de HIC se ultrafiltro y se diafiltro para permitir purificacion en membrana S a la que le siguio nanofiltracion para un aclaramiento viral adicional. Este material se intercambio con tampon en el tampon de formulacion final y la concentracion de proteina se ajusto para preparar la masa formulada.
Inactivacion viral del sobrenadante del cultivo celular
El sobrenadante de cultivo celular filtrado en profundidad se peso, la A280 se leyo, y se tomaron alicuotas para el muestreo. Los puntos de referencia de temperatura y pH para esta etapa de inactivacion viral eran de 28°C ± 2°C y un pH de 7,8 ± 0,2. Se utilizo una solucion madre 100-x de TNBP/polisorbato 20 para el tratamiento, preparado mezclando 0,5 kg de polisorbato 20, 0,06 kg de tri-(n-butil)fosfato (TNBp), y agua para inyeccion (WFI) para preparar un litro de la mezcla. Esta solucion madre se anadio al sobrenadante del cultivo celular a una dilucion de 100 veces y el tratamiento se llevo a cabo durante 2,5 horas con agitacion. Las condiciones finales eran el 0,5% para el polisorbato 20 y el 0,03% para el TNBP. Despues del tratamiento con TNBP/polisorbato 20, el sobrenadante del
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cultivo celular se filtro.
Filtracion
Un disco de filtro Cuno 120ZA (3M, St. Paul, MN) se aclaro con agua caliente para inyeccion (HWFI) a no mas de 1 l/min durante como mfnimo 10 minutos. A esto le siguio un aclarado con agua frfa para inyeccion (CWFI) de no menos de 2 l y finalmente se seco al aire a 20 psi. El sobrenadante de cultivo celular tratado con TNBP/polisorbato 20 se hizo pasar a traves de este filtro utilizando una presion de aire no menor de 20 psi y un flujo, no mayor de 1 l/minuto. Se tomaron alfcuotas para muestreo y en resto.
Cromatograffa de intercambio ionico
Esta etapa sirve para capturar recA1PI y eliminar protefnas de celula huesped (HCP) en el flujo a traves. Se utilizo una columna de 30 cm de diametro interno x 14 cm de altura del lecho (10 l de volumen del lecho). El pH del sobrenadante del cultivo celular tratado con TNBP/polisorbato 20 se volvio a ajustar a 7,0 ± 0,1. Se midio la conductividad del sobrenadante tratado con disolvente/detergente antes de la carga de la columna. La cantidad de diluyente WFI ambiente se determino para garantizar que la conductividad no fuera superior a 4 mS/cm durante la carga de la columna con dilucion en lfnea.
El programa Unicorn (GE Healthcare Life Sciences) se utilizo para hacer funcionar la columna CaptoTM Q (GE Healthcare Life Science) y las vfas de entrada del sistema de cromatograffa se colocaron en los tanques de compensacion apropiados. Un filtro en lfnea Durapore de 0,3 mm (Millipore) se cambio para cada tanda de cromatograffa. La columna CaptoTM Q se equilibro previamente con 1 volumen de columna (CV) de acido acetico glacial 0,5 M seguido por equilibrado con 5 Cv de Na2HPO4 20 mM, pH 6,0. El sobrenadante del cultivo celular se cargo en la columna CaptoTM Q mediante dilucion en lfnea con agua para inyeccion (WFI). El patfn de cromatograffa se programo para realizar la carga a una conductividad no superior a 4 mS/cm a un caudal lineal de 300 cm/h. A la carga le segufa una breve captura con WFI. La columna se lavo con 8 CV de tampon de lavado (Na2HPO4 20 mM, NaCI 20 mM, pH 6,0) antes de un reequilibrado de 2 CV con Na2HPO4 20 mM, pH 6,0. La elucion se realizo utilizando un gradiente de 8 CV que finalizaba con Na2HPO4 25 mM, NaCI 200 mM, pH 7,0 o mediante un aumento gradual de la concentracion de NaCI. El unico pico de elucion de recA1PI se recogio comenzando a 4 CV en el gradiente y la recogida termina con una compuerta UV-visible de 0,10 AU (Unidades de Absorbancia). La fraccion de elucion se muestreo para ensayar y se retuvo. Se anadio L-cistefna a la reserva de eluato a una concentracion de 10 mM y se dejo mezclar durante una noche a temperatura ambiente.
Cromatograffa de interaccion hidrofoba utilizando Octil Sepharose™ FF
Una columna de 45 cm de diametro interno x 9 cm de altura del lecho (15 l de volumen del lecho) de Octil Sepharose™ 4 FF de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) (GE Healthcare Life Sciences) se equilibro con 8 CV de tampon de equilibrado de HIC (Na2HPO4 25 mM, NaCI 0,1 M, sulfato de amonio 1,75 M, pH 7,0). El eluato de Capto Q que contenfa A1PI y cistefna se cargo mediante dilucion en lfnea con el tampon de dilucion de octilo (Na2HPO4 25 mM, NaCI 0,1 M, (NH4)2SO4 3 M, pH 7,0) a un caudal de 150 cm/h para conseguir una concentracion final de (NH4)2SO4 1,75 M en el material de carga. Despues de la carga, la columna se lavo con 5 CV del tampon de equilibrado de HIC. La elucion se consiguio con un gradiente de sal inverso desde el sulfato de amonio 1,75 M en el tampon de lavado al tampon de elucion (Na2HPO4 20 mM, pH 6,0) sobre 10 CV. Se utilizaron ordenes de absorbancia UV-visible de 0,05 AU en la parte delantera y 0,10 AU en la cola para recoger la reserva de eluato.
Ultrafiltracion y diafiltracion del eluato de HIC
Tres membranas de 0,1 m2 de lfmite de peso molecular (MWCO) de 30 kDa se lavaron abundantemente con WFI a 40-50°C hasta que el pH del permeato y el retentato estaban entre 5 y 7. La presion de alimentacion se ajusto a una diana de 25 (por ejemplo, un intervalo de 24 a 28) psig mientras que la presion de salida se ajusto a 5 psig (por ejemplo, un intervalo de 4 a 8 psig). El sistema se equilibro con 1-2 l del tampon de elucion de HIC durante no menos de 10 minutos. El eluato de HIC se mezclo y la temperatura se mantuvo a 15-25°C. El volumen de permeato se monitorizo y la UF se detuvo cuando la concentracion habfa alcanzado una diana de A280 de 30. Despues de la reduccion del volumen de la alimentacion, la diafiltracion se realizo con 6 diavolumenes (DV) del tampon de equilibrado cationico (citrato sodico 10 mM, pH 5,4). La A280 del retentato se comprobo para asegurarse de que era < 30 y el retentato se dreno en un recipiente limpio. Dos volumenes de 1 l de tampon de equilibrado cationico se recircularon con una presion de alimentacion de 10-15 psig durante no menos de 5 minutos. Los aclarados se combinaron con el retentato.
Cromatograffa de intercambio cationico utilizando una membrana S
Una capsula de utilizacion unica de membrana S Sartobind® (Sartorius, Gottingen, Alemania) con un area superficial de membrana de 2500 cm2 se equilibro con el tampon de equilibrado cationico (citrato sodico dihidrato 10 mM, pH 5,4) garantizando que la conductividad del efluente no era mayor de 4 mS/cm. El eluato de HIC tratado con UF/DF se cargo sobre la membrana S a 25 l/h utilizando una bomba peristaltica y posteriormente se lavo con tampon de
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Nanofiltracion
La nanofiltracion se realizo utilizando un Viresolve NFP (0,085 m Millipore) con el Prefiltro Viresolve (0,11 m ). La filtracion era mediante presion constante con un recipiente de presion a no mas de 50 psi. El nanofiltro se aclaro con cuatro volumenes de 500 ml de tampon de equilibrado cationico.
Ultrafiltracion/diafiltracion final
En esta etapa se utilizo una membrana de MWCO de 10 kDa con un area de membrana de 0,3 m2. El soporte y la membrana se lavaron abundantemente con WFI a 40-50°C hasta que el pH del permeato y el retentato estaba entre 5 y 7. La presion de alimentacion se ajusto a una diana de 25 psig (intervalo de 24 a 28 psi) mientras que la presion de salida se ajusto a 5 psig (intervalo de 4 a 8 psi). El sistema se equilibro con 1-2 l de Na2HPO4 20 mM, pH 7,0 durante no menos de 10 minutos. El nanofiltrado se mezclo bien y la temperatura se mantuvo a 15-25°C. El permeato se comprobo periodicamente en busca de perdida de recA1PI midiendo su absorbancia a 280 nm (es decir, A280) que debfa ser <0,04. Si se superaba este valor, la UF/DF se interrumpfa. El volumen de permeato se monitorizo y la UF se interrumpio cuando la concentracion habfa alcanzado una diana de A280 de ~30. Despues de la reduccion del volumen de la alimentacion, se realizo diafiltracion con 5 DV del tampon de diafiltracion (Na2HPO4 20 mM, NaCI 120 mM, pH 7,0). La A280 del retentato se comprobo para asegurarse de que era < 30 y el retentato se dreno en un recipiente limpio. Se calculo la cantidad de aclarado con tampon de diafiltracion que, cuando se anadfa al retentato, dara como resultado una concentracion final de 50-56 mg/ml. Este volumen de aclarado se dividio por la mitad y cada volumen se recirculo con una presion de alimentacion de no mas de 20 psig durante 3-5 minutos. Los aclarados se combinaron con el retentato.
Almacenamiento
El A1PI recombinante en masa concentrado se filtro de forma esteril en bolsas Flexel® (Sartorius) y se almaceno a - 70°C, antes del llenado final.
Se descubrio que el recA1PI producido mediante el metodo descrito anteriormente tiene un marcado color amarillo. La identidad de la especie amarilla se desconocfa. Aunque el recA1PI era altamente puro y activo, la eliminacion del colorante amarillo se deseaba por razones esteticas.
Ejemplo 3
Cromatograffa de inmunoafinidad con resina Select de alfa-1 antitripsina
Se realizo una columna de inmunoafinidad especffica de A1PI para determinar si la especie amarilla podia separarse del recA1PI purificado. Se lleno una columna de 1,6 cm de diametro interno x 10 cm de altura del lecho (volumen de columna de 20 ml) de resina Select de alfa-1 antitripsina (AAT-Select; GE Healthcare Life Science), especffica para el H1PI derivado de plasma. La columna se equilibro con TrisHCl 20 mM, pH 7,4. Aproximadamente 200 mg de recA1PI a 10 mg/ml se cargaron en esta columna a 5 ml/minuto. La columna se lavo con TrisHCl 20 mM, pH 7,4, NaCI 100 mM y se eluyo con TrisHCl 20 mM, pH 7,4, NaCI 2 M (vease la figura 3). Se recogieron fracciones en base al fraccionamiento en picos. Las fracciones por debajo del pico de elucion se reunieron y se concentraron utilizando concentradores de mWcO UltraCel™ de 30 kDa (EMD Millipore, Billerica, MA). Se adquirio un espectro de UV-Vis a partir de la muestra concentrada.
El eluato, despues de la concentracion, era de color amarillo de forma distintiva. Cuando se analizaba mediante espectroscopia UV-Vis (vease la figura 4), el espectro era muy similar al observado para recA1PI antes de hacer funcionar la columna de inmunoafinidad. La conclusion de este resultado era que la cromatograffa de inmunoafinidad era ineficaz para separar el color amarillo de recA1PI.
Ejemplo 4
Cromatograffa de filtracion en gel con resina Superdex™ 200
Un experimento de filtracion en gel (tambien conocida como cromatograffa de exclusion por tamano; SEC) tambien se intento para eliminar la especie amarilla de recA1PI. Se lleno una columna de 1,6 cm de diametro interno x 90 cm (volumen del lecho de 181 ml) de resina Superdex™ 200 prep grade (GE Healthcare Life Sciences). La columna se equilibro con solucion salina tamponada con fosfato (PBS; fosfatos 12 mM, pH 7,4, NaCI 137 mM, KCI 2,7 mM). Se cargo el recA1PI al 5% del volumen de la columna (9 ml) y una tanda a 2 ml/minuto (60 cm/h). Se recogieron fracciones de 12 ml de volumen para el analisis.
El cromatograma para esta columna se muestra en la figura 5. Aunque la carga es del 99% de recA1PI, se observo
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un pico de division, posiblemente debido a la saturacion del detector UV. Las fracciones por debajo de este pico se analizaron mediante espectrometna UV-Vis (figura 6). Las fracciones de recAlP seran visiblemente amarillas y los espectros UV-Vis de estas fracciones eran similares al del material de carga. Por consiguiente, la columna de filtracion en gel no eliminaba el color amarillo de recAIPI.
Ejemplo 5
Analisis del agente desnaturalizante y reductor
Dado que la cromatograffa de inmunoafinidad y de filtracion en gel no tuvieron exito para eliminar el color amarillo de recAIPI se busco la utilizacion de agentes desnaturalizantes y/o reductores como medios potenciales para eliminar o disminuir el color amarillo.
Aproximadamente 1 ml del recAIPI se mezclo con clorhidrato de guanidina 8 M o DTT 500 mM para conseguir concentraciones finales de clorhidrato de guanidina 4 M o DTT 50 mM, respectivamente. Una tercera muestra se mezclo con ambos reactivos. Las muestras se incubaron a 50°C durante aproximadamente 2 h y se hicieron pasar individualmente a traves de columnas desaladoras PD-10 (GE Healthcare Life Sciences). El flujo a traves de estas columnas se recogio mediante centrifugado a 1.000 x g durante 5 minutos.
El clorhidrato de guanidina no ayudo a la disminucion y esto se reflejaba en el espectro UV-Vis de esta muestra (figura 7). La muestra tratada con DTT 50 mM era de un amarillo mas claro en comparacion con la muestra tratada con clorhidrato de guanidina. Esta muestra no tema la firma espectral a 405 nm que se observaba de forma caractenstica para el recA1PI (figura 7). La muestra tratada con la combinacion de guanidina y DTT era casi incolora y se perdfa en los elementos espectrales en el intervalo de 300-400 nm. El hecho de que tanto el clorhidrato de guanidina como DTT se requirieran para disminuir el color amarillo puede indicar que la especie coloreada de amarillo esta unida covalentemente a recA1PI.
Ejemplo 6
Reduccion y cromatograffa por filtracion en gel
Se realizaron experimentos adicionales para realizar el seguimiento de la reduccion en DTT y la cromatograffa de filtracion en gel, realizadas con las columnas PD-10. El objetivo en este caso era utilizar una columna mas larga para conseguir mejor resolucion de la muestra tratada con DTT y para procesar una mayor cantidad de recA1PI reducido para analisis.
Se preparo una columna de 1,6 cm de diametro interno x 90 cm de altura del lecho (181 ml de volumen de la columna) de resina Superdex™ 200 prep grade (GE Healthcare Life Sciences). Esta columna se equilibro previamente con PBS que contema DTT 5 mM. Una muestra de recA1PI en un volumen de 9 ml se trato con DTT a una concentracion de 50 mM a temperatura ambiente, durante una noche. Esta muestra se cargo en la columna; la carga constitrna el 5% del volumen de la columna y la columna se hizo funcionar a 2 ml/minuto (60 cm/h). Se recogieron fracciones de volumen constante de 14,5 ml para el analisis. Las fracciones apropiadas se reunieron y se concentraron de vuelta a aproximadamente 50 mg/ml utilizando concentradores giratorios de MWCO Amicon UltraCel™ de 30 kDa (Millipore). Una muestra de control que no estaba tratada con DTT tambien se sometio al proceso en condiciones identicas.
El cromatograma para la muestra tratada con DTT 50 mM se muestra en la figura 8 y la muestra de control se muestra en la figura 9. Existe un segundo pico mas pequeno distinto que se observo en la tanda de SEC con la muestra tratada con DDT. Las fracciones B1-B3, que conteman el recA1PI se reunieron y se concentraron a aproximadamente 50 mg/ml utilizando un concentrador giratorio de MWCO de 30 kDa. La muestra concentrada se analizo mediante espectrofotometna UV-Vis. Los espectros UV-Vis mostrados en la figura 10, revelan que la firma caractenstica del material de partida amarillo, recA1PI, disminuye significativamente en el concentrado del eluato de filtracion en gel reducido. Se utilizo A1PI derivado de plasma humano altamente purificado como control.
Ejemplo 7
Analisis de la concentracion de DTT
Los efectos de concentraciones mas bajas de DTT se analizaron incubando recA1PI con DTT, purificando la muestra utilizando cromatograffa de filtracion en gel, y a continuacion obteniendo los espectros UV-Vis de las muestras purificadas concentradas. Se utilizo una columna de 1,6 cm de diametro interno x 90 cm de altura del lecho (181 m de volumen de la columna) de resina Superdex™ 200 prep grade (GE Healthcare Life Sciences). Esta columna se equilibro previamente con PBS que contema DTT 5 mM. El recA1PI en un volumen de 9 ml se trato con DTT a la concentracion apropiada a temperatura ambiente, durante una noche. La carga constitrna el 5% del volumen de la columna y la columna se hizo funcionar a 2 ml/minuto (60 cm/h). Se recogieron fracciones de volumen constante de 14,5 ml. Las fracciones apropiadas se reunieron y se concentraron de vuelta a aproximadamente 50
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Los espectros UV-Vis de las muestras tratadas con DTT 10 mM y DTT 50 mM muestran que la concentracion de DTT 10 mM es tan efectiva como DTT 50 mM para disminuir la firma espectral caracterfstica del recAIPI coloreado de amarillo (figura 11).
Ejemplo 8
Analisis bioanalftico en recA1Pl purificado por filtracion en gel, tratado con DTT Analisis MALDI TOF
Se realizaron experimentos de espectrometrfa de masa de tiempo de vuelo-desorcion/ionizacion laser asistida por matriz sobre recA1PI. La expectativa era que los pequenos picos generados mediante el tratamiento con DTT que tienen un color amarillo podrfan contener una especie identificable mediante espectrometrfa de masa. Sin embargo, no se identifico nada en estas muestras. Los efectos de la matriz pueden haber interferido en la ionizacion de moleculas en el intervalo de 100-10.000 Da.
Concentracion de hierro
Se sospechaba de los iones de hierro como una posible fuente del color amarillo. El hierro es un metal de transicion esencial en el cultivo celular y se anade al medio de cultivo celular aguas arriba como citrato de amonio ferrico, Fex(NH4)yC6H5O7. Los analisis de hierro mostraban que una reduccion de ~30 veces del contenido de hierro de las fracciones reunidas de recA1PI reducido con DTT de la columna de filtracion en gel en comparacion con el material de partida que tenia 66 pMI de hierro. Vease la figura 13. La especie amarilla indicada por la flecha en el cromatograma tenia ~50% del hierro de la cantidad cargada.
Analisis de la actividad
Aparte de las fracciones de pico principal, ninguna de las fracciones de pico mas pequeno tenia actividad de recA1PI.
Ejemplo 9
Analisis de filtracion en gel de DTT
Se completo una tanda de cromatograffa con DTT solo en ausencia de recA1PI para ver el perfil cromatografico de DTT en ausencia de recA1PI. Se observo un unico pico con un volumen de elucion de 201 ml (figura 12) que corresponde al ultimo pico, de volumen de elucion identico, observado en la tanda de ensayo con la muestra de recA1PI. La fraccion con un color ligeramente amarillo que corresponde al pico indicada mediante la flecha en la figura 13 es unica para las muestras de recA1PI tratadas con DTT y esta ausente en la tanda de control con solo DTT.
Ejemplo 10
Tratamiento de A1PI derivado de plasma purificado con DTT 10 mM
Un producto de A1PI derivado de plasma que tenia un aspecto amarillo se ensayo para determinar si el tratamiento con agente reductor tambien darfa como resultado una reduccion similar del color amarillo. Una alfcuota de 10 ml de A1PI derivado de plasma a aproximadamente 50 mg/ml se trato con DTT a una concentracion final de 10 mM. Se realizo cromatograffa de filtracion en gel en resina Superdex™ 200 prep grade tal como se ha descrito en el presente documento (GE Healthcare Life Sciences). El cromatograma de la tanda con el A1PI derivado de plasma tratado con DTT se muestra en la figura 14.
Las fracciones que corresponden a recA1PI debajo del pico principal se reunieron y se concentraron a 50 mg/ml. El color de la muestra no era diferente del de la muestra no tratada. Esto indicaba que la fuente de color amarillo de recA1PI derivado del cultivo celular era diferente de la del A1PI derivado de plasma.
Ejemplo 11
Analisis de cistefna como agente reductor
La cistefna se examino como agente reductor alternativo debido a que la cistefna es economica y facilmente disponible. Ademas, como aminoacido, la cistefna es un excipiente aceptable. Se completo un experimento donde una alfcuota de recA1PI se trato con cistefna 10 mM y se proceso en una columna de filtracion en gel. El cromatograma para la tanda se muestra en la figura 15. Las fracciones correspondientes a recA1PI se reunieron y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
se concentraron a 50 mg/ml. La cistefna tambien era aceptable como agente reductor.
Ejemplo 12 Analisis del color
Una comparacion del color de muestras tratadas con DTT o cistefna a concentracion 10 mM muestra una sustancial reduccion del color amarillo, a concentracion de protefna comparable (~50 mg/ml). La relacion A280/A405 se siguio como indicador del color amarillo de una muestra, siendo la base que la absorbancia de una solucion a 405 nm es una medida cuantitativa del color amarillo. Una relacion A280/A405 mas alta corresponde a un color amarillo mas claro de la muestra. El significativo color amarillo de la muestra no tratada es eliminado en gran medida por el tratamiento con DTT o cistefna. Sin embargo, la eliminacion del color amarillo no era completa y un matiz de amarillo queda en las muestras tratadas. La relacion A280/A405 rastrea esta tendencia bien y una reduccion de 3 veces se observa tfpicamente despues del tratamiento con agentes reductores. El A1PI derivado de plasma altamente purificado es practicamente transparente con una relacion A280/A405 de 428.
Recuperacion de la actividad de A1 PI derivado de cultivo celular recombinante
La recuperacion de actividad de recA1PI a partir de experimentos con cromatograffa de exclusion por tamano y tratamiento con agentes reductores variaba entre el 80-100% (vease la tabla 1).
- Tabla 1: recuperacion de la actividad de A1PI derivado de cultivo celular recombinante a partir de cromatograffa de exclusion por tamano despues del tratamiento con DTT o cistefna
- Muestra
- A280/A405 Recuperacion de actividad
- recA1PI N° 4
- 64 100%
- recA1PI N° 4 + DTT 50 mM
- 281 78%
- recA1PI N° 6
- 66 100%
- recA1PI N° 6 + DTT 50 mM
- 186 108%*
- recA1PI N° 6 + DTT 10 mM
- 194 87%
- recA1 PI N° 6 + cistefna 10 mM
- 171 90%
- *La actividad medida de >100% se debfa a la variabilidad de ensayo a ensayo y se interpreto que significa que no habfa perdida de actividad.
Contenido de hierro
La concentracion de hierro de las muestras tratadas se reducfa considerablemente despues del tratamiento con agentes reductores y la purificacion cromatografica. Se analizaron muestras reducidas y purificadas utilizando espectroscopfa de absorcion atomica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AA). El grado de reduccion de la concentracion ionica variaba entre aproximadamente 14 veces para la muestra tratada con cistefna y 27 veces para la muestra tratada con DTT 10 mM (tabla 2) en comparacion con las muestras no tratadas.
- Tabla 2: Concentracion de hierro de muestras de A1PI de cromatograffa exclusion por tamano despues del tratamiento con DTT o cistefna
- Muestra
- Concentracion de hierro (p.M)
- recA1PI N° 4
- 66,4
- recA1PI N° 4 + DTT 50 mM
- 3,0
- recA1PI N° 6
- 12,6
- recA1PI N° 6 + DTT 10 mM
- 0,5
- recA1 PI N° 6 + cistefna 10 mM
- 0,8
Ejemplo 13
Procedimiento de purificacion de recA1PI revisado: Adicion de agente reductor e incubacion despues de cromatograffa de intercambio anionico
La figura 16 muestra un diagrama de flujo del procedimiento de purificacion de recA1PI revisado, donde se anade cistefna al eluato de intercambio anionico reunido. A esto le sigue el procedimiento revisado. Despues de la etapa de inactivacion viral con disolvente/detergente, el sobrenadante de cultivo celular, que tiene una masa de 11,2 kg, se purifico en una columna de 5 cm de diametro interno x 25 cm de altura del lecho (500 ml) CaptoTM Q (GE Healthcare Life Sciences) a 300 cm/h. La columna se equilibro en Na2HPO4 20 mM, pH 6,0; se lavo con Na2HPO4 20 mM, NaCI 20 mM, pH 6,0; y se eluyo con Na2HPO4 25 mM, NaCI 200 mM, pH 7,0, durante 8 CV. La A280 del eluato Q era de 2,4, correspondiente a una potencia aproximada de 2 g/l. Una alfcuota de 500 ml de este eluato Q que contenfa aproximadamente 1 g de recA1PI por actividad se trato con cistefna 10 mM (Acros Chemicals; Thermo Fisher Scientific; Nueva Jersey) y se incubo a temperatura ambiente durante una noche (~25°C aproximadamente 16 h). La muestra tratada se diluyo a 42:58 con tampon de dilucion de HIC, Na2HPO4 25 mM, NaCI 100 mM, (NH4)2SO4 3 M,
Claims (15)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Metodo de disminucion de una cantidad de colorante en una solucion que comprende el inhibidor de proteinasaalfai derivado de cultivo celular (recA1PI), que comprende incubar la solucion que comprende recA1PI con un agente reductor y separar el recA1PI del colorante.
- 2. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que el agente reductor es cistefna o DTT.
- 3. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que el agente reductor es cistefna.
- 4. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que la concentracion de agente reductor es de aproximadamente 1 mM aaproximadamente 100 mM.
- 5. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que la concentracion de agente reductor es de aproximadamente 10 mM.6 Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que la concentracion de agente reductor es de aproximadamente 1 mM.
- 7. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de incubacion reductora se lleva a cabo durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas.
- 8. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de incubacion reductora se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 60°C.
- 9. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que el agente reductor es cistefna 10 mM y la incubacion se lleva a cabo durante una noche aproximadamente a temperatura ambiente.
- 10. Metodo, segun la reivindicacion 1, en el que la separacion del recA1PI del colorante comprende cromatograffa.
- 11. Metodo, segun la reivindicacion 10 en el que la cromatograffa comprende intercambio ionico, interaccion hidrofoba, filtracion en gel, afinidad, inmunoafinidad o combinaciones de las mismas.
- 12. Metodo, segun la reivindicacion 1, que comprende reducir la concentracion de hierro.13 Metodo, segun la reivindicacion 12, en el que la concentracion de hierro se reduce de 2 a 100 veces.
- 14. Metodo, segun la reivindicacion 12, en el que la concentracion de hierro se reduce de 5 a 50 veces.15 Metodo, segun la reivindicacion 12, en el que la concentracion de hierro es 10 p.M o menos.
- 16. Metodo, segun la reivindicacion 12, en el que la concentracion de hierro es 1 p.M o menos.MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYR QLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTL NQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQG KIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQH CKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITG TYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMS IPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKWNPTQK1-24 peptido serialE25-K418 peptido maduroN70 glucosilacionN107 glucosilacionN271 glucosilacionC256 S-nitrosilacionG368-K392 bucle del centra reactivoF376 sitio de escision proteolitica M382-S383 enlace reactivoFIG. 2
imagen1 imagen2 Centrifugadoimagen3 Filtracion Incubacion en detergenteimagen4 Columnaanionicaimagen5 Columna UF/DF de octilo<=J>Cz£>Membranacationicaimagen6 Nanofiltracionimagen7 UF/DFimagen8 Masaformuladaimagen9 Volumen de elucion / Numero de fraccionAbsorbanciaimagen10 Absorbancia, 280 nmni2000150010005000Iimagen11 F2 1 2 3f 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 50 100 150 200Volumen de elucion / Fraccion18 19 20 21 250 mlimagen12 Absorbancia - 3.5 3
- 2.5 2i m i ii* m|ml 1
- ii I .... ^m 1 Ijii! | / DTT 50 mM illpF ¥ / Gdn.HCI 4 M + DTT 50 ml' 0,5 IIP' * /
- A
- fl * ' ' ' ■■ ... • -.-.—. -
- \J
- 200 300 400 500 (
- >00 700
Longitud de onda (nm)mAUimagen13 imagen14 imagen15 Longituddeonda (nm)Absorbanciaimagen16 NJCD£imagen17 CO-Q<mAU 300 . 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100806040200imagen18 DTT▼imagen19 ■10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280Volumen de elucion / Numero de fraccionAbsorbancia, 280 nmmAUimagen20 Absorbancia, 280 nmimagen21 coromAUimagen22 imagen23 imagen24 mAUimagen25 Absorbanciaimagen26 Longitud de onda (nm)
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