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KR102284800B1 - 재조합 세포외 기질 단백질의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

재조합 세포외 기질 단백질의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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KR102284800B1
KR102284800B1 KR1020200188062A KR20200188062A KR102284800B1 KR 102284800 B1 KR102284800 B1 KR 102284800B1 KR 1020200188062 A KR1020200188062 A KR 1020200188062A KR 20200188062 A KR20200188062 A KR 20200188062A KR 102284800 B1 KR102284800 B1 KR 102284800B1
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South Korea
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protein
chromatography
recombinant
extracellular matrix
hcl
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KR1020200188062A
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김대경
정요경
황성미
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주식회사 하플사이언스
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Abstract

재조합 세포외 기질 단백질의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물, 고순도의 재조합 세포외 기질 단백질을 생산하는 방법, 및 재조합 세포외 기질 단백질의 단량체를 검정하는 방법을 제공한다.

Description

재조합 세포외 기질 단백질의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 방법{Medium composition for culturing animal cell for production of recombinant extracellular matrix proteins, and method using the same}
재조합 세포외 기질 단백질의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물, 고순도의 재조합 세포외 기질 단백질을 생산하는 방법, 및 재조합 세포외 기질 단백질의 단량체를 검정하는 방법에 관한 것이다.
세포외 기질(Extracellular Matrix, ECM)은 세포가 세포 밖으로 분비한 여러 물질들이 형성하는 생체 내 비세포 구성요소로서, 생물의 모든 조직과 기관 내에 존재한다. 세포외 기질은 세포 간 접착 및 물리적 지지체 역할 뿐 아니라, 세포의 분화 및 성장, 세포 간의 신호전달 및 조절 등 다양한 생물학적 기능을 수행하며, 다세포 생물의 각 조직 및 기관은 그 특성에 맞게 독립적으로 진화하였기에 세포외 기질의 구성 성분과 기능도 조직과 세포의 유형에 따라 다양한 모습을 나타낸다.
기본적으로 세포외 기질은 수분, 단백질 및 다당류로 이루어져 있으며, 그 중 세포외 기질 단백질은 해당 조직의 기능에 맞게 생체역학적 특성 및 조성 등이 조정되어 분자 지지체 내로 자가조립(Self-Assemble)되는데, 대다수의 세포외 기질 단백질은 조직 내에서 미량으로 발현되어 모듈(Module) 형태로 다중 결합을 이루어 기능한다. 이러한 구조적 특징으로 인해 세포외 기질 단백질의 재조합을 통한 대량 생산 및 기능 연구에는 수많은 기술적 과제가 도처에 산재해 있다. 일반적으로는 동물 조직에서 추출한 단백질을 이용하나, 추출양이 미량이다. 따라서, 희망하는 세포외 기질 단백질의 아미노산 시퀀스로 대량 생산하기 위해서는 보다 적절하고 비용 효율적인 생산 체계를 갖출 필요성이 제기된다.
한편, 세포외 기질 단백질 중 HAPLN (Hyaluronan and proteoglycan link protein) 단백질은 세포외 기질 내 히알루론산과 프로테오글리칸의 응집체를 안정화시키는 역할을 하며, 세포 간 접착에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 생체 내에는 발현되는 조직 또는 기관에 따라 총 4종의 HAPLN 단백질이 존재하는데, HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4가 그것으로, 각각의 조직 또는 기관 내에서의 기능 및 역할은 대동소이한 것으로 알려져 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1897340호는 HAPLN1 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 또는 주름 개선용 약학 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허공보 제10-2019-0024727호 및 제10-2020-0104831호는 HAPLN1 단백질을 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물 및 연골 관련 질환 치료용 조성물을 개시하고 있으며, 최근 대한민국 등록특허공보 제10-2166453호는 HAPLN1 단백질을 유효성분으로 포함하는 폐질환 치료용 조성물을 개시하는 등 HAPLN 단백질은 인간에게 유용한 기능을 제공할 것이 기대된다. 그러므로, 재조합 HAPLN 단백질을 대량 생산하기 위한 배양, 분리, 정제, 단량체 검정 방법에 대한 연구가 필요하나, 이러한 재조합 HAPLN 단백질을 대량 생산하는 방법에 대해서는 아직까지 연구된 바가 없다.
재조합 세포외 기질 단백질의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
고순도의 재조합 세포외 기질 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
재조합 세포외 기질 단백질의 단량체를 검정하는 방법을 제공한다.
일 양상은 구리화합물을 포함하는, 재조합 세포외 기질 단백질의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
용어 "세포외 기질(Extracellular Matrix, ECM) 단백질"은 세포외 기질에 존재하는 단백질을 의미한다. ECM 단백질의 예시적인 종류는 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신, HAPLN (Hyaluronan and proteoglycan link protein) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "HAPLN (Hyaluronan and proteoglycan link protein)"은 히알루론산 및 프로테오글리칸 연결 단백질이라고도 한다. 생체 내 주로 발현되는 조직 및 기관에 따라 총 4종의 HAPLN 단백질이 존재하며, 그 종류는 구체적으로 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4이다. HAPLN 단백질의 아미노산 서열은 HAPLN1을 예를 들어, 인간 HAPLN1 Accession No. NP_001875, 또는 마우스 HAPLN1 Accession No. NP_038528 등에 기재되어 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합 ECM 단백질 (recombinant ECM protein)"은 유전자 재조합 방법을 이용하여 만든 ECM 단백질을 코딩하는 DNA를 세포 내에서 발현시켜 얻어진 단백질을 의미한다. 상기 유전자 재조합은 이 기술분야의 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 재조합 세포외 기질 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신 또는 HAPLN일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합 HAPLN 단백질 (recombinant HAPLN, rHAPLN)"은 HAPLN 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터를 숙주세포로 도입하여 세포 내에서 발현시켜 수득한 단백질을 의미한다.
일 구체예에서, 상기 재조합 HAPLN 단백질은 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3 및 HAPLN4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질일 수 있다.
용어 "재조합 인간 HAPLN 단백질 (recombinant human HAPLN, rhHAPLN)"은 인간 HAPLN 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터를 숙주세포로 도입하여 세포 내에서 발현시켜 수득한 단백질을 의미한다.
상기 재조합 세포외 기질 단백질은 인체 또는 동물로부터 유래된 단백질일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 재조합 세포외 기질 단백질은 인체에서 유래된 단백질일 수 있다. 용어 "재조합 ECM 단백질의 생산을 위한 동물세포", 또는 "재조합 ECM 단백질을 생산하는 동물세포"는 재조합 ECM 단백질을 생산할 수 있도록 재조합 벡터가 도입된 동물세포를 의미한다.
상기 동물세포는 재조합 ECM 단백질을 생산할 수 있는 세포라면 그 종류를 제한하지 않는다. 상기 동물세포는 CHO (Chinese Hamster Ovary), VERO, BHK (Baby Hamster Kidney), HeLa, NiH 3T3, MDCK (Madin-Darby Canine Kidney), WI38, HEK (Human Embryonic Kidney), 하이브리도마 및 NSO 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 동물세포는 CHO 세포 또는 CHO 세포 변이체일 수 있다. 상기 CHO 세포는 CHO-K1, CHO-DXB11, CHO-DG44, CHO-S 또는 CHO-Pro minus 세포일 수 있다.
용어 "구리화합물(copper compound)"은 구리의 화합물을 의미하며, 구리의 산화상태가 +1, +2, +3의 것이 알려져 있다.
상기 배지 조성물에 포함되는 구리화합물은 그 종류를 제한하지 않는다. 상기 구리화합물은 구리(I)화합물, 구리(II)화합물 또는 구리(III)화합물일 수 있다. 상기 구리화합물은 산화구리(Cu2O), 염화구리(CuCl2), 질산구리(Cu(NO3)2), 산화구리II(CuO), 황화구리(CuS) 또는 황산구리(CuSO4)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배지 조성물은 상기 구리화합물을 약 50 μM 이상, 예를 들어, 약 50 μM 내지 약 1,000 μM, 약 50 μM 내지 약 900 μM, 약 50 μM 내지 약 800 μM, 약 50 μM 내지 약 700 μM, 약 50 μM 내지 약 600 μM, 약 50 μM 내지 약 500 μM, 약 50 μM 내지 약 400 μM, 약 50 μM 내지 약 300 μM, 약 50 μM 내지 약 200 μM, 약 50 내지 약 100 μM, 약 50 내지 약 90 μM, 약 50 내지 약 80 μM, 약 50 내지 약 70 μM, 약 50 내지 약 60 μM, 또는 약 50 μM의 농도로 포함할 수 있다. 상기 배지 조성물은 약 50 μM 이상의 농도로 구리화합물을 포함함으로써 재조합 ECM 단백질 다량체의 형성을 감소시킬 수 있다.
상기 배지 조성물은 동물세포 배양에 사용되는 일반적인 배지 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 일반적인 배지 성분은 재조합 단백질을 수득하기 위한 동물세포 배양을 위해 필요한 성분으로 공지된 것 또는 시판되는 것을 사용할 수 있다.
상기 배지 조성물은 추가적인 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 배지 조성물은 디메틸설폭사이드 (DMSO); 글리세롤; 폴록사머 188과 같은 폴록사머; EDTA; 폴리소르베이트 80과 같은 폴리소르베이트; 시스테인; 글루타티온 (Glutathione, GSH); 산화글루타티온 (Glutathione disulfide, GSSG); 및 염화마그네슘 (MgCl2) 중 1종 이상의 첨가제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 생산하는 동물세포 배양 시 배지에 황산구리를 첨가하면, 단백질 다량체 형성 감소 효과가 우수하여 단백질 생산량이 증가함을 확인하였다. 따라서, 구리화합물을 포함하는 배지 조성물은 동물세포로부터 재조합 ECM 단백질을 대량으로 수득하는데 유용하게 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 배지 조성물은 재조합 HAPLN 단백질의 대량 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물일 수 있고, 구체적으로 재조합 인간 HAPLN 단백질의 대량 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물일 수 있고, 보다 구체적으로 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 대량 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물일 수 있다.
상기 배지 조성물에서, 상기 재조합 세포외 기질 단백질은 단량체(monomer)일 수 있다. 상기 "단량체(monomer)"는 "단량체 단백질"과 상호교환적으로 사용되며, 다중 단백질 복합체를 구성하는 단백질들 중 하나를 지칭한다. 둘 이상의 폴리펩티드의 복합체를 "다량체(multimer)" 또는 "올리고머(oligomer)"라고 하며, 2개의 폴리펩티드의 복합체는 이량체(dimer), 3개의 폴리펩티드의 복합체는 삼량체(trimer), 4개의 폴리펩티드의 복합체는 사량체(tetramer)라고 한다. 상기 구리화합물을 포함하는 배지 조성물은 재조합 ECM 단백질 다량체 형성 감소 효과를 가지므로, 재조합 ECM 단백질 단량체의 생산을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 배지 조성물은 재조합 ECM 단백질 단량체의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물일 수 있다.
다른 양상은 (1) 일 양상에 따른 배지 조성물에 재조합 ECM 단백질을 생산하는 동물세포를 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및
(2) 상기 배양액으로부터 재조합 ECM 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 고순도의 재조합 세포외 기질 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배지 조성물, 재조합 ECM 단백질, 및 동물세포에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 재조합 ECM 단백질을 생산하는 방법에 의하면 고순도의 재조합 ECM 단백질을 대량 생산할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 재조합 ECM 단백질을 대량 생산하는 방법일 수 있고, 바람직하게는 재조합 HAPLN 단백질을 대량 생산하는 방법일 수 있고, 보다 바람직하게는 재조합 HAPLN1 단백질을 대량 생산하는 방법일 수 있고, 가장 바람직하게는 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 대량 생산하는 방법일 수 있다.
상기 단계 (1)의 배양은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 유가 배양, 연속식 배양, 또는 회분식 배양 등에 의해 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 단계 (1)의 배양은 유가 배양일 수 있다.
용어 "유가 배양 (fed-batch culture)"은 배지를 간헐적으로 공급하는 배양법으로, 배양액 중의 기질이 적당한 속도로 첨가되며 유출이 없기 때문에 공급되는 기질의 양을 자유롭게 제어할 수 있는 배양 방법을 의미한다.
용어 "연속식 배양 (continuous culture)"은 새로운 영양 배지가 계속 공급되며, 동시에 세포 및 생산물을 포함하는 배양액이 계속 제거되는 배양 방법을 의미한다.
용어 "회분식 배양 (batch culture)"은 처음 공급한 원료 기질이 모두 소비될 때까지 배양을 계속하는 방법으로, 기질의 농도, 대사생산물의 농도, 세포의 농도 등이 시간에 따라 계속 변화하는 배양 방법을 의미한다.
상기 단계 (1)의 배양은 약 5 내지 약 15일, 약 5 내지 약 13일, 약 8 내지 약 15일, 약 8 내지 약 13일, 약 10 내지 약 15일, 약 10 내지 약 13일, 약 11 내지 약 15일, 또는 약 11 내지 약 13일 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (1)에서, 세포 배양 중 배지 조성물에 구리화합물을 1회 또는 2회 이상 첨가할 수 있다.
상기 단계 (1)에서, 세포 배양 전에 배지 조성물에 구리화합물을 첨가하는 것에 의해 배양을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 0일차에 배지 조성물에 구리화합물을 첨가할 수 있다.
상기 재조합 ECM 단백질을 생산하는 방법에서, 상기 재조합 ECM 단백질은 단량체일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 재조합 ECM 단백질의 단량체를 생산하는 방법일 수 있고, 바람직하게는 재조합 HAPLN 단백질의 단량체를 생산하는 방법일 수 있고, 보다 바람직하게는 재조합 HAPLN1 단백질의 단량체를 생산하는 방법일 수 있고, 가장 바람직하게는 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 단량체를 생산하는 방법일 수 있다.
상기 단계 (2)는 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography), 음이온 교환 크로마토그래피(Anion Exchange Chromatography), 양이온 교환 크로마토그래피(Cation Exchange Chromatography), 수산화인회석 크로마토그래피(Hydroxyapatite Chromatography), 역상 크로마토그래피(Reversed-phase Chromatography), 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography), 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed Mode Chromatography) 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 단계 (2)는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "이온 교환 크로마토그래피 (Ion Exchange Chromatography, IEC)"는 고정상에 이온교환체를 사용하여 고정상과 이동상과의 사이에서 가역적인 이온교환을 하여, 시료 이온의 고정상에 대한 친화성 차를 이용하여 분리, 분석하는 방법을 말한다.
용어 "음이온 교환 크로마토그래피 (Anion Exchange Chromatography, AEX)"는 이온 교환 크로마토그래피의 일종으로, 아미노기 등의 양이온성 관능기를 갖는 음이온 교환체를 사용한다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 전평형화 단계, 평형화 단계, 샘플 로딩 단계, 세척 단계, 및 용출 단계를 포함할 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 통상적인 음이온 교환 수지를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 음이온 교환 수지의 예는 Fractogel® EMD TMAE (M), Fractogel® EMD TMAE Medcap (M), Fractogel® EMD TMAE Hicap (M), Eshmuno® Q, Eshmuno® QPX, Eshmuno® QPX Hicap, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q Sepharose® FF, Q Sepharose® HP, Q Sepharose® XL, Source® 30Q, Capto® Adhere, Capto® Adhere ImpRes, Poros® 50 HQ, Poros® 50 XQ, Poros® 50 PI, Q HyperCel, Toyopearl® GigaCap Q 650-M, Toyopearl® GigaCap Q 650-S, Toyopearl® Super Q, YMC® BioPro Q, Macro-Prep® High Q, Nuvia® Q 또는 UNOsphere® Q 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 작동 조건 및 단백질의 pI 에 따라 또한 디메틸아미노에틸 (DMAE) 작용기의 디에틸아미노에틸 (DEAE) 을 가지고 있는 약한 음이온 교환 수지가 사용될 수 있다. 그 예는 Fractogel® EMD DEAE, Fractogel® EMD DMAE, Capto® DEAE 또는 DEAE Ceramic HyperD® F 이다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 결합-및-용출(bind-and-elute) 모드로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피의 로딩 양은 10 내지 50 g/L 수지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 히스티딘 염산염(His-HCl)을 포함하는 것일 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 약 1 mM 내지 약 1000 mM, 약 10 mM 내지 약 800 mM, 약 20 mM 내지 약 600 mM, 약 40 mM 내지 약 400 mM, 약 60 mM 내지 약 200 mM, 예를 들어 약 100 mM의 히스티딘 염산염(His-HCl)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 농도 범위의 히스티딘 염산염을 사용하면, 우수한 순도 및 수율로 재조합 ECM 단백질을 분리할 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 EDTA를 더 포함할 수 있다. 상기 EDTA의 농도는 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 pH 4.0 내지 6.0, pH 4.5 내지 5.5, 예를 들어 pH 5.0인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 재조합 ECM 단백질을 포획할 수 있다. 따라서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 특정 재조합 ECM 단백질을 특이적으로 분리할 수 있다.
상기 단계 (2)는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계 이후에, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
용어 "양이온 교환 크로마토그래피 (Cation Exchange Chromatography, CEX)"는 이온 교환 크로마토그래피의 일종으로, 설폰기, 카복실기 등의 음이온성 관능기를 갖는 양이온 교환체를 사용한다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피는 평형화 단계, 샘플 로딩 단계, 세척 I 단계, 세척 II 단계, 세척 III 단계 및 용출 단계를 포함할 수 있다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피는 통상적인 양이온 교환 수지를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 양이온 교환 수지의 예는 Eshmuno® CPS, Eshmuno® CPX, 또는 SP Fast Flow Sepharose®, Eshmuno® S Resin, Fractogel® SO3(M), Fractogel SE Hicap (M), SP Cellthru BigBead Plus®, Streamline® SP, Streamline® SP XL, SP Sepharose® Big Beads, Toyopearl® M-Cap II SP-550EC, SP Sephadex® A-25, Express-Ion® S, Toyopearl® SP-550C, Toyopearl® SP-650C, Source® 30S, Poros® 50 HS, Poros® 50 XS, SP Sepharose® Fast Flow, SP Sepharose® XL, Capto® S, Capto® SP ImRes, Capto® S ImpAct, Nuvia® HR-S ,Cellufine® MAX S-r, Cellufine® MAX S-h, Nuvia® S, UNOsphere® S, UNOsphere® Rapid S, Toyopearl® Giga-Cap S-650 (M), S HyperCel Sorbent®, Toyopearl® SP-650M, Macro-Prep® High S, Macro-Prep® CM, S Ceramic HyperD® F, MacroCap® SP, Capto® SP ImpRes, Toyopearl® SP-650S, SP Sepharose® High Perform, Capto® MMC, Capto® MMC Imp Res, Eshmuno® HCX, Nuvia® High c-Prime 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 작동 조건 및 단백질의 pI 에 따라, 또한 약한 양이온 교환 수지, 예컨대 Fractogel® EMD COO (M), CM Sepharose® HP, CM Sepharose® FF, Toyopearl® AF Carboxy 650-M, Macro-Prep® CM, Toyopearl® GigaCap CM, CM Ceramic Hyper® D, 또는 Bio-Rex® 70 이 사용될 수 있다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피는 결합-및-용출 모드로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 로딩 양은 10 내지 15 g/L 수지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 세척 II 단계에서, 세척 버퍼 II는 약 1 mM 내지 약 1000 mM, 약 5 mM 내지 약 800 mM, 약 10 mM 내지 약 400 mM, 약 25 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 150 mM, 예를 들어 약 100 mM의 염화나트륨(NaCl)을 포함할 수 있다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 세척 III 단계에서, 세척 버퍼 III는 약 150 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 400 mM, 약 200 mM 내지 약 500 mM, 약 200 mM 내지 약 400 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 300 mM 내지 약 400 mM, 예를 들어 약 350 mM의 염화나트륨(NaCl)을 포함할 수 있다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 세척 버퍼 II 또는 III는 Tris-HCl, NaAc, EDTA, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 세척 버퍼 II 또는 III는 pH 5.0 내지 8.5, 예를 들어 pH 8.0 또는 pH 5.5인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 약 50 mM 내지 약 1000 mM, 약 100 mM 내지 약 800 mM, 약 200 mM 내지 약 600 mM, 약 300 mM 내지 약 500 mM, 예를 들어 약 370 mM의 염화나트륨(NaCl)을 포함할 수 있다. 염화나트륨의 농도는 상기 범위 내에서 생산물의 순도 및 수율의 균형을 고려하여 적절히 선택할 수 있다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 Tris-HCl, EDTA, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 pH 7.5 내지 8.5, 예를 들어 pH 8.0인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 단백질 응집체, HCP (Host cell protein) 및 기타 불순물을 제거할 수 있다.
용어 "응집체(aggregate)"는 여러 개의 물질이 하나로 모아진 형태를 의미한다. "단백질 응집체"는 단백질들이 축적 또는 집합된 형태를 의미하며, 정상적인 단백질들의 응집체뿐만 아니라 비정상적인 단백질들의 응집체도 포함한다. 단백질 응집체는 목적단백질과 함께 기타단백질도 결합된 상태를 포함하나, 다량체 단백질은 목적단백질끼리 결합된 것을 의미하는 점에서 차이가 있다.
용어 "HCP (Host cell protein)"는 생물치료제 제조 및 생산 과정에서 숙주 유기체에 의해 생성되는 공정 관련 단백질 불순물을 의미한다.
상기 단계 (2)는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계 이후에,　혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
용어 "혼합 모드 크로마토그래피 (Mixed-mode Chromatography, MMC)"는 고정상과 분석물 사이에 하나 이상의 형태의 상호작용을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피는 전평형화 단계, 평형화 단계, 샘플 로딩 단계, 세척 I 단계, 세척 II 단계, 및 용출 단계를 포함할 수 있다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피는 통상적인 혼합 모드 수지를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 혼합 모드 수지의 예는 Capto ® adhere 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피는 결합-및-용출 모드로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피의 로딩 양은 10 내지 15 g/L 수지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피의 세척 II 단계에서, 세척 버퍼 II는 약 200 mM 내지 약 400 mM, 약 200 mM 내지 약 400 mM, 또는 약 250 mM 내지 약 350 mM, 예를 들어 약 200 mM 또는 약 300 mM의 아르기닌을 포함할 수 있다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피의 세척 버퍼 II는 Tris-HCl, EDTA, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피의 세척 버퍼 II는 pH 8.5 내지 9.5, 예를 들어 pH 9.0인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피의 용출 버퍼는 약 100 mM 내지 약 1000 mM, 약 200 mM 내지 약 800 mM, 약 300 mM 내지 약 700 mM, 약 400 mM 내지 약 600 mM, 예를 들어 약 500 mM의 아르기닌을 포함할 수 있다. 아르기닌의 농도는 상기 범위 내에서 생산물의 순도 및 수율의 균형을 고려하여 적절히 선택할 수 있다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피의 용출 버퍼는 Tris-HCl, EDTA, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피의 용출 버퍼는 pH 7.5 내지 8.5, 예를 들어 pH 8.0인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 혼합 모드 크로마토그래피를 수행함으로써 단백질 응집체 및 HCP를 제거할 수 있다.
상기 단계 (2)는 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계 이후에, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)"는 고정상의 작용기와 분석물 사이의 소수성 상호작용을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 평형화 단계, 샘플 로딩 단계, 세척 I 단계, 세척 II 단계, 세척 III 단계, 및 용출 단계를 포함할 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 통상적인 소수성 상호작용 수지를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 소수성 상호작용 수지의 예는 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow, Capto Octyl, Octyl Sepharose 4 Fast Flow, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (low sub), Capto Butyl, Butyl Sepharose 4 Fast Flow, Phenyl Sepharose High Performance, Capto Phenyl ImpRes, Butyl Sepharose High Performance, Capto Butyl ImpRes, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub), Capto Phenyl (high sub) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 결합-및-용출 모드로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 로딩 양은 3 내지 6 g/L 수지일 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 세척 II 단계에서, 세척 버퍼 II는 약 0.1 M 내지 약 1.0 M, 약 0.1 M 내지 약 0.8 M, 약 0.1 M 내지 약 0.6 M, 약 0.1 M 내지 약 0.5 M, 약 0.2 M 내지 약 1.0 M, 약 0.2 M 내지 약 0.8 M, 약 0.2 M 내지 약 0.6 M, 약 0.2 M 내지 약 0.4 M, 약 0.3 M 내지 약 1.0 M, 약 0.3 M 내지 약 0.8 M, 약 0.3 M 내지 약 0.6 M, 또는 약 0.3 M 내지 약 0.5 M, 예를 들어 약 0.4 M 황산암모늄을 포함할 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 세척 버퍼 II는 Tris-HCl, EDTA, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 세척 버퍼 II는 pH 7.5 내지 8.5, 예를 들어 pH 8.0일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 세척 III 단계에서, 세척 버퍼 III은 약 0.5 M 내지 약 2.0 M, 약 0.5 M 내지 약 1.8 M, 약 1.0 M 내지 약 2.0 M, 약 1.0 M 내지 약 1.8 M, 약 1.2 M 내지 약 2.0 M, 또는 약 1.2 M 내지 약 1.8 M, 예를 들어 약 1.5 M의 염화나트륨을 포함할 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 세척 버퍼 III은 Tris-HCl, EDTA, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 세척 버퍼 III은 pH 7.5 내지 8.5, 예를 들어 pH 8.0일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용출 버퍼는 약 0.1 M 내지 약 1.5 M, 약 0.1 M 내지 약 1.2 M, 약 0.1 M 내지 약 1.0 M, 약 0.1 M 내지 약 0.8 M, 약 0.3 M 내지 약 1.5 M, 약 0.3 M 내지 약 1.2 M, 약 0.3 M 내지 약 1.0 M, 또는 약 0.3 M 내지 약 0.8 M, 예를 들어 약 0.5 M 염화나트륨(NaCl)을 포함할 수 있다. 상기 염화나트륨 농도가 1.5 M을 초과할 경우 재조합 ECM 단백질이 용출되지 않을 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용출 버퍼는 Tris-HCl을 더 포함할 수 있다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용출 버퍼는 pH 7.5 내지 8.5, 예를 들어 pH 8.0인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행함으로써 단백질 다량체 및 HCP를 제거할 수 있다.
상기 단계 (2)는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계를 순차적으로 포함할 수 있다.상기 단계 (2)는 재조합 단백질을 분리 및 정제할 수 있는 공지된 방법을 추가적으로 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 회수(Harvest and Clarification), 한외여과(Ultrafiltration), 투석여과(Diafiltration), S/D (Solvent/Detergent) 바이러스 불활성화, 중간 심층 여과, 또는 이들의 2 이상의 조합을 추가적으로 더 수행할 수 있다. 상기 회수, 한외여과, 투석여과, S/D 바이러스 불활성화, 및 중간 심층 여과 (Depth Filter)는 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다.
상기 단계 (2)는 단계 (1)에서 수득한 배양액의 회수 단계; 한외여과 및 투석여과 단계; 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; S/D 바이러스 불활성화 단계; 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계; 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; 한외여과 및 투석여과 단계; 및 중간 심층 여과 (Depth filter) 단계를 순차적으로 포함할 수 있다.
다른 양상은 재조합 ECM 단백질을 포함하는 시료를 염산염(Hydrochloride)을 포함하는 이동상을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
상기 크기 배제 크로마토그래피 결과를 기초로 시료 중의 재조합 ECM 단백질의 단량체를 분석하는 단계를 포함하는, 재조합 ECM 단백질의 단량체를 검정하는 방법을 제공한다.
상기 재조합 ECM 단백질의 단량체를 검정하는 방법은 재조합 HAPLN 단백질 단량체를 검정하는 방법일 수 있고, 보다 바람직하게는 재조합 HAPLN1 단백질 단량체를 검정하는 방법일 수 있고, 가장 바람직하게는 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 단량체를 검정하는 방법일 수 있다.
상기 이동상에 염산염을 포함함으로써 재조합 ECM 단백질의 분리능이 증가하고 크로마토그램의 부정확한 피크가 현저히 감소할 수 있다.
상기 이동상에 포함되는 염산염은 그 종류를 제한하지 않는다. 상기 염산염은 아르기닌 염산염(Arg-HCl), 아닐린 염산염, 아데닌 염산염, 구아닌 염산염, 구아디닌 염산염(Gdn-HCl), 히스티딘 염산염(His-HCl), 또는 리신 염산염(Lys-HCl)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 이동상은 염산염을 약 0.5 M 초과 내지 약 4.0 M, 약 0.8 M 내지 약 4.0 M, 약 0.8 M 내지 약 3.0 M, 약 0.8 M 내지 약 2.0 M, 약 0.8 M 내지 약 1.5 M, 또는 약 0.8 M 내지 약 1.2 M 농도로 포함할 수 있다. 상기 염산염의 농도가 0.5 M 이하일 경우 재조합 ECM 단백질의 분리능이 감소할 수 있다.
용어 "크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography, SEC)"는 "겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatography)"라고도 하며, 크기에 따라 단백질을 분리하는 방법이다. 다른 형태의 크로마토그래피와 달리 고정상과 용질 간에 인력이 존재하지 않으며, 단순히 이동상이 다공성의 고정상을 통과하게 된다.
상기 크기 배제 크로마토그래피는 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다.
상기 방법은 재조합 ECM 단백질의 단량체를 검정함으로써 재조합 ECM 단백질을 생산하는 과정에서, 각 분리 및/또는 정제 단계를 수행한 후의 결과물 중 재조합 ECM 단백질의 단량체와 기타 불순물의 비율을 정확하게 분석할 수 있고, 그에 따라 재조합 ECM 단백질의 단량체 비율을 분석할 수 있다. 상기 재조합 ECM 단백질 단량체 검정 방법은 재조합 HAPLN 단백질의 단량체 비율을 분석할 수 있고, 보다 바람직하게는 재조합 HAPLN1 단백질의 단량체 비율을 분석할 수 있고, 가장 바람직하게는 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 단량체 비율을 분석할 수 있다.
일 양상에 따른 배지 조성물에 의하면, 재조합 ECM 단백질을 생산하는 동물세포를 대량으로 배양할 수 있다.
다른 양상에 따른 재조합 ECM 단백질을 생산하는 방법에 의하면, 재조합 ECM 단백질을 높은 순도로 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 특정 재조합 ECM 단백질의 단량체를 특이적으로 분리할 수 있다.
다른 양상에 따른 재조합 ECM 단백질의 단량체를 검정하는 방법에 의하면, 재조합 ECM 단백질의 단량체를 높은 정확도로 분석할 수 있고, 그에 따라 재조합 ECM 단백질의 단량체와 기타 불순물의 비율을 분석할 수 있다.
도 1은 AEX 선형 그래디언트 (Linear Gradient) 용출의 크로마토그램이다.
도 2는 CEX 단계적 (step-wise) 용출의 크로마토그램이다.
도 3은 CEX 단계적 (step-wise) 용출의 SDS_PAGE_NR 결과이다.
도 4는 MMC 단계적 (step-wise) 용출의 크로마토그램이다.
도 5는 MMC 단계적 (step-wise) 용출의 SDS_PAGE_NR 결과이다.
도 6은 HIC 비교 용출의 크로마토그램이다.
도 7은 HIC 비교 용출의 SDS_PAGE_NR 결과이다.
도 8은 이동상으로 인산버퍼(phosphate buffer, PB)+NaCl, 5 mM EDTA, 또는 5 mM EDTA+4 M Gdn-HCl를 사용하여 rhHAPLN1을 포함하는 샘플에 대해 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 9는 이동상으로 50 mM PB+150 mM NaCl+1M Arg-HCl pH 6.3을 사용하여 rhHAPLN1을 포함하는 샘플에 대해 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 10은 이동상으로 50 mM PB+300 mM NaCl, 0.1 M Arg-HCl, 0.5 M Arg-HCl, 1.0 M Arg-HCl, 또는 1.0 M Gdn-HCl을 사용하여 샘플 3에 대해 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 11은 이동상으로 50 mM PB+300 mM NaCl, 0.1 M 우레아, 0.5 M 우레아, 1.0 M 우레아, 2.0 M 우레아, 4.0 M 우레아, 또는 6.0 M 우레아를 사용하여 샘플 3에 대해 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 12는 이동상으로 1.0 M Gdn-HCl, 4.0 M 우레아, 또는 1.0 M Arg-HCl을 사용하여 샘플 3에 대해 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 ECM 단백질을 생산하는 세포의 배양
ECM 단백질 중 인간 HAPLN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 CHO-K1 세포에 삽입하여 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 생산하는 CHO-K1 세포주를 제작하였다. 단백질 생산량 및 품질이 우수한 세포주를 MCB(Master Cell Bank)로 선정하였다.
상기 MCB를 계대배양하여 0.40±0.05×106 cells/mL의 농도로 Thermo사의 Hyperforma SUB 250 L 바이오리액터에 접종 하고 유가 배양(Fed-Batch Culture) 하였다.
기본 배지로는 22.36 g ActiPro™ 배지 + 0.5846 g 글루타민 + 10.00 g HT Supplement(Thermo Fisher Scientific사) + 4.29 g 10 N NaOH + 1.80 g NaHCO3를 사용하였다. 배양 온도는 36.5℃, 용존산소량(Dissolved oxygen, DO)은 40.0%, pH는 7.00±0.20로 설정하였다. pH 조절 용액으로 1 M 탄산나트륨 일수화물(Sodium Carbonate Monohydrate)을 사용하였다.
공급 배지(feeding medium, FM)로는 181.04 g HyClone™ Cell Boost 7a + 12.28 g 10 N NaOH의 FM020a 및 94.60 g HyClone™ Cell Boost 7b + 105.93 g 10 N NaOH의 FM020b를 사용하였다. 공급 전략은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
유가 배양
공급 배지 3일차 5일차 6일차 8일차 10일차
FM020a (%(w/w)) 3 5 3 3 3
FM020b (%(w/w)) 0.3 0.5 0.3 0.3 0.3
공급 첨가제로는 50 μM CuSO4를 사용하였으며, 이를 유가 배양 0일차에 바이오리액터에 첨가하였다.
포도당 (Glucose) 공급 스톡(stock)은 400 g 포도당/kg로 준비하였다. 유가 배양 3일차 내지 13일차까지, 포도당 농도가 5.0 g/L 미만으로 떨어지면 6.0 g/L까지 올려주는 방식으로 포도당을 공급하였다.
VCD (Viable Cell Density)가 20.00×106 cells/mL에 도달하면 온도를 31.0℃로 변경하였다. 유가 배양 12일차가 되거나 생존율이 60% 미만으로 떨어질 때 세포를 수확하였다.
실험예 1: 첨가제 종류에 따른 재조합 ECM 단백질 다량체 형성 감소 효과
재조합 인간 HAPLN1 단백질을 생산하는 세포를 배양할 때, 첨가제의 종류에 따른 단백질 다량체 형성 감소 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, 공급 첨가제의 종류, 농도 및 그의 공급 전략을 각각 달리하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법에 따라 세포를 배양하였다. 각 실험군의 공급 첨가제 종류, 농도, 그의 공급 전략과 그에 따른 세포 배양 및 단백질 생산 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
실험군 첨가제 종류* 첨가제 농도 공급 전략 Titer (g/L) Qp (pg/cell/day) SEC_LC
(Main)(%)
비교예 1 - - - 2.66 21.08 51.1
비교예 2 DMSO 0.5%(w/v) 4, 6, 8일차에 공급 2.22 18.01 44.8
비교예 3 DMSO 0.2%(w/v) 0, 3, 5, 7, 9일차에 공급 2.42 19.15 44.4
비교예 4 글리세롤 1.0%(w/v) 5일차에 공급 2.46 20.46 43.5
비교예 5 폴록사머 188 0.2%(w/v) 5일차에 공급 2.71 22.49 47.0
비교예 6 EDTA 1 mM 5일차에 공급 2.03 20.96 57.5
비교예 7 PS80 0.04%(w/v) 5일차에 공급 2.75 23.77 43.8
비교예 8 시스테인 1 mM 5, 7, 9일차에 공급 1.91 15.83 31.4
비교예 9 GSH 0.2 mM 6, 8일차에 공급 2.36 19.48 43.5
비교예 10 GSH 및 GSSG 0.2 mM 및 0.2 mM 6, 8일차에 공급 2.52 20.31 47.0
비교예 11 EDTA 및 MgCl2 1 mM 및 50 μM 5일차에 공급 2.16 22.34 -
실시예 1 CuSO4 50 μM 0일차에 공급 3.87 28.77 53.2
*DMSO: 디메틸설폭사이드, PS80: 폴리소르베이트 80, GSH: 글루타티온, GSSG: 산화글루타티온.
표 2에 나타낸 바와 같이, CuSO4 첨가제를 사용하였을 때 재조합 인간 HAPLN1 단백질 생산 Titer가 3.87 g/L로 가장 높았으며, 세포당 재조합 인간 HAPLN1 단백질 생산량도 28.77 pg/cell/day로 가장 많았다.
따라서, 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 생산하는 세포를 배양할 때 첨가제로 CuSO4와 같은 구리화합물을 사용하면, 단백질 다량체 형성 감소 효과가 우수하고, 단백질 생산량이 증가함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 50 μM 농도의 CuSO4를 세포 유가 배양 0일차에 공급하는 경우 단백질 다량체 형성 감소 효과와 단백질 생산량이 가장 우수함을 알 수 있었다. 그러므로, 이를 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 대량 생산에 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2: 구리화합물 농도에 따른 재조합 ECM 단백질 다량체 형성 감소 효과
재조합 인간 HAPLN1 단백질을 생산하는 세포를 배양할 때, 구리화합물 농도에 따른 단백질 다량체 형성 감소 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, 구리화합물의 농도를 각각 달리하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법에 따라 세포를 배양하였다. 각 실험군의 구리화합물의 농도와 그에 따른 단백질 생산 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
실험군
 CuSO4 농도
 Titer
(D10) (g/L)		 SEC Caliper_NR
Main Peak % HMW Peak % LMW Peak % Purity % peak1 % Peak2% Peak3%
실시예 1 50 μM 2.57 50.3 38.5 11.2 85.7 20.6 65.1 0.68
비교예 12 20 μM 2.42 51.8 38.8 9.4 86.7 20.9 65.8 0.67
비교예 13 5 μM 2.42 51.3 38.8 9.9 86.0 20.6 65.4 0.71
표 3에 나타낸 바와 같이, CuSO4를 50 μM 이상의 농도로 사용하였을 때 인간 HAPLN1 단백질 생산 Titer가 높아졌다. 따라서, 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 생산하는 세포를 배양할 때 CuSO4와 같은 구리화합물을 50 μM 이상의 농도로 사용하면, 단백질 다량체 형성 감소 효과가 우수하고, 단백질 생산량이 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 재조합 ECM 단백질의 분리 및 정제
상기 실시예 1에 따라 배양된 세포로부터 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 분리 및 정제하였다. 구체적으로, 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 분리 및 정제는 하기 순서에 따라 수행하였다.
(1) 회수(Harvest and Clarification)
회수를 위해 Millipore사의 DOHC 및 A1HC 심층 필터 (Depth filter)를 사용하였다. DOHC 및 A1HC 심층 필터의 권장 로딩(loading) 양은 각각 45 L/m2 및 90 L/m2이다.
(2) 한외여과/투석여과 1 (Ultrafiltration/Diafiltration 1, UF/DF1)
Millipore사의 Pellicon 3 (Ultracel, Type C Screen, 30 kDa)을 UF/DF1 막 (membrane)으로 선택하였다. 로딩 샘플 농도는 UF 단계에서 5 g/L 이하이며, 그 다음 6배 부피 이상의 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH9.0 버퍼로 투석여과 하였다. 공급 유속은 300 LMH 이하이고, 막통과 압력(transmembrane pressure, TMP)은 10-20 psi이다. 권장 로딩 양은 70 L/m2 이하이다.
(3) 음이온 교환 크로마토그래피 (Anion Exchange Chromatography, AEX)
Life Tech사의 Poros 50HQ 수지를 포획 수지(Capture resin)로 사용하였다. 이 단계는 결합-및-용출(bind-and-elute) 모드로 수행하였다. 권장 단백질 로딩 양은 10-50 g/L 수지이다. 선택된 용출 버퍼는 100 mM His-HCl, 5 mM EDTA, pH 5.0이다. 권장 UV 피크 수집 범위는 25-75 mAU/mm이다.
(4) S/D (Solvent/Detergent) 바이러스 불활성화
통상적인 방법에 따라 S/D 바이러스 불활성화를 수행하였다.
(5) 양이온 교환 크로마토그래피 (Cation Exchange Chromatography, CEX)
이 단계는 결합-및-용출 모드에서 수행하였다. Cytiva (구. GE Healthcare)사의 Capto S ImpAct 수지를 CEX 수지로 사용하였다. 권장 CEX 로딩 양은 10-15 g/L 수지이다. CEX를 수행함으로써 단백질 응집체, HCP (Host cell protein) 및 기타 불순물을 제거하였다. 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0이 세척 버퍼 II로 권장되고, 50 mM NaAc, 350 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 5.5가 세척 버퍼 III로 권장된다. 권장 용출 버퍼는 50 mM Tris-HCl, 370 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH8.0이다. 권장 UV 피크 수집 범위는 25-50 mAU/mm이다.
(6) 혼합 모드 크로마토그래피 (Mixed-mode Chromatography, MMC)
이 단계는 결합-및-용출 모드에서 수행하였다. Cytiva (구. GE Healthcare)사의 Capto adhere 수지를 MMC 수지로 사용하였다. 권장 로딩 양은 10-15 g/L 수지이다. 단백질 응집체 및 HCP를 추가적으로 제거하기 위하여, 용출 버퍼는 50 mM Tris-HCl, 0.5 M 아르기닌(Arg), 5 mM EDTA, pH 8.0을 사용하였다.
(7) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)
이 단계는 결합-및-용출 모드에서 수행하였다. Cytiva (구. GE Healthcare)사의 Butyl Sepharose 4 Fast Flow 수지를 HIC 수지로 사용하였다. 권장 로딩 양은 3-6 g/L 수지이다. 50 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 8.0이 세척 버퍼 III로 권장된다. 50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0을 사용하여 고순도로 목적 단백질을 용출하였다.
(8) 한외여과/투석여과 2 (Ultrafiltration/Diafiltration 2, UF/DF2)
Millipore사의 Pellicon 3 (Ultracel, Type C Screen, 10 kDa)을 UF/DF2 단계를 위해 선택하였다. 로드 샘플은 UF 단계에서 1-3 g/L로 농축된 후, 6배 부피 이상의 20 mM NaAc, pH 5.0 버퍼로 투석여과하였다. UF/DF2 풀(pool) 농도는 4.5-5.5 mg/mL이다. 공급 유속은 300 LMH 이하이고, 막통과 압력(TMP)은 10-20 psi이다. 로드 용량은 70 g/m2 이하이다.
(9) 중간 심층 여과 (Intermediate Depth Filtration, Int. DF)
중간 심층 여과를 위해 Millipore사의 X0SP 심층 필터를 선택하여 HCP를 제거하였다. X0SP 필터의 권장 로딩 양은 400-800 g/m2이다.
(10) 제형화 및 Bulk Fill
DS (drug substance)의 농도는 2.0±0.2 g/L이다. 제형 버퍼 조성은 DPD (Drug Product Development)에 의해 결정되었고, DSPD (Downstream Process Development)로 이전되었다. PS80 및 수크로오스 (Sucrose)는 VF 풀(pool) 시료에 각각 최종 농도 0.04%(w/v) 및 8%(w/v)로 첨가되었다. 최종 0.2 μm 여과 후 DS를 얻었다.
실험예 3: 특정 재조합 ECM 단백질을 특이적으로 분리하기 위한 AEX 조건
ECM 단백질 중 HAPLN1 단백질은 40 ~ 50 kDa의 분자량을 갖는다.
상기 실시예 2-(3)의 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 단계에서, 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 특이적으로 분리할 수 있는 AEX 조건을 최적화하기 위한 실험을 하였다.
(1) 용출 조건
(1.1) AEX 선형 그래디언트 비교 용출
재료:
- 컬럼: Poros 50HQ, 3.024 mL (0.5 cm × 15.4 cm)
- 로딩 물질: 농도 2.64 g/L, pH 9.06, 전도도 1.44 mS/cm
- 로딩 양: 30 g/L 수지
- 컬럼 세척 (sanitization) 용액: 1.0 M NaOH
- 전-평형화 버퍼: 50 mM Tris-HCl, 1 M (NH4)2SO4, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 평형화/세척 버퍼 I: 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 9.0
- 세척 버퍼 II: 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 9.0
- 용출 버퍼: 컨트롤: 50 mM Tris-HCl, 80mM (NH4)2SO4, 5mM EDTA, pH 8.5; 조건1-A: 20mM His-HCl, pH 7.5, B: 50 mM His-HCl, 30 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 5.8; 조건2-A: 100 mM His-HCl, pH 7.0, B: 100 mM His-HCl, 5 mM EDTA, pH 5.5; 조건3-A: 100 mM His-HCl, pH 7.0, B: 100 mM His-HCl, 5 mM EDTA, pH 5.0; 20 CV (Column Volume) 동안 A에서 B로 선형 그래디언트 용출.
- 스트립 버퍼: 50 mM Tris-HCl, 1 M (NH4)2SO4, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 컬럼 저장 용액: 20% 에탄올
실험 절차:
용출물은 25 mAU/mm 내지 25 mAU/mm에서 수집하였다. 크로마토그램을 사용하여 용출 조건을 검증하였다.
결과:
하기 표 4에 각 용출 조건에 따른 재조합 인간 HAPLN1 단백질 수율, SEC 분석 결과 및 HCP 농도를 나타내었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 용출버퍼에 염을 첨가한 것보다 염을 첨가하지 않고 100 mM His-HCl을 첨가하였을 때 재조합 인간 HAPLN1 단백질 포획 효과가 더 우수하였다. 또한, 100 mM His-HCl을 첨가한 경우, 컨트롤에 비해 HCP가 50% 감소하였다.
Run 세척 버퍼 II 용출 조건 (A에서 B로 선형 그래디언트 용출) 수율* (%) SEC(%)
M/H/L 		HCP
(ppm)
A B
1
(컨트롤)		 - - 50 mM Tris-HCl, 80 mM (NH4)2SO4, 5 mM EDTA, pH8.5 79 53.1/46.7/0.2 164608
2
(용출 조건 1)		 50 mM Tris-HCl,10 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH9.0 20 mM His-HCl, pH7.5 50 mM His-HCl, 30 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH5.8 74 56.7/43.3/ND 73112
3
(용출 조건 2)		 100 mM His-HCl, pH7.0 100 mM His-HCl, 5 mM EDTA, pH5.5 78 55.8/44.2/ND 79856
4
(용출 조건 3)		 100 mM His-HCl, 5 mM EDTA, pH5.0 85 54.4/45.6/ND 83654
(1.2) AEX 선형 그래디언트 용출
재료:
- 컬럼: Poros 50HQ, 3.024 mL (0.5 cm × 15.4 cm)
- 로딩 물질: 농도 2.64 mg/mL, pH 9.06, 전도도 1.44 mS/cm
- 로딩 양: 30 g/L 수지
- 위생화(sanitization) 용액: 1.0 M NaOH
- 전-평형화 버퍼: 50 mM Tris-HCl, 1 M (NH4)2SO4, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 평형화/세척 버퍼 I: 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 9.0
- 세척 버퍼 II: 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 9.0
- 용출 버퍼: A: 100 mM His-HCl, pH 7.0, B: 100 mM His-HCl, 5 mM EDTA, pH 5.0; 20 CV (Column Volume) 동안 A에서 B로 선형 그래디언트 용출.
- 스트립 버퍼: 50 mM Tris-HCl, 450 mM (NH4)2SO4, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 저장 용액: 20% 에탄올
실험 절차:
선형 그래디언트 비교 용출 결과를 바탕으로, UF/DF1 후 물질을 Poros 50HQ 컬럼에 로딩하고, 단계적 용출 방법을 사용하여 최적의 용출 버퍼를 결정하였다. SEC 순도 분석을 사용하여 최적의 용출 조건을 확인하였다.
결과:
도 1은 AEX 선형 그래디언트 용출의 크로마토그램이다.
표 4와 도 1에 나타낸 바와 같이, 100 mM His-HCl은 부가적인 염 첨가 없이도 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 효율적으로 포획했다. 순도와 수율의 균형을 맞추기 위해, pH 5.0을 용출을 위한 pH로 선택하였다.
따라서, 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 특이적으로 분리하기 위해, AEX 용출 버퍼로 100 mM 내외의 His-HCl을 선택할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 100 mM His-HCl을 사용하면 우수한 순도 및 수율로 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 분리할 수 있다. 예를 들어, AEX 용출 버퍼로 100 mM His-HCl, 5 mM EDTA, pH 5.0을 사용할 수 있다.
실험예 4: 재조합 ECM 단백질 응집체, HCP 및 기타 불순물을 제거하기 위한 CEX 조건
상기 실시예 2-(5)의 결합-및-용출 모드 CEX는 재조합 인간 HAPLN1 단백질 응집체, HCP 및 기타 불순물을 제거하기 위해 도입하였다. 따라서, 재조합 인간 HAPLN1 단백질 응집체, HCP 및 기타 분순물을 제거하기 위한 CEX 조건을 최적화하기 위한 실험을 하였다.
(1) 용출 조건
재료:
- 컬럼: Capto S ImpAct, 2.631 mL (0.5 cm × 13.4 cm)
- 로드 물질: AEX 용출물, 농도 11.844 mg/mL, pH 5.52, 전도도 11.70 mS/cm
- 로딩 양: 10 mg/mL 수지
- 평형화/세척 I 버퍼: 50 mM NaAc-HAc, 5 mM EDTA, pH 5.5
- 세척 II 버퍼: 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 세척 III 버퍼: 50 mM NaAC, 350 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 5.5
- 용출 버퍼: (A) 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0; (B) 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0; 단계적 용출: 20% B (100 mM NaCl), 5 CV; 40% B (200 mM NaCl), 5 CV; 60% B (300 mM NaCl), 5 CV; 75% B (375 mM NaCl), 5 CV; 85% B (425 mM NaCl)
- 스트립 버퍼: 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0
실험 절차:
단계적 용출 방법을 수행하여 최적 용출 조건을 확인하였다. 로딩 양은 10 g/L 수지였고, 용출물은 25 mAU/mm 내지 25 mAU/mm에서 수집하였다. 각 분획의 단백질 농도를 측정하고, 단계적 회수량을 계산하였다. 또한, 샘플 순도는 SDS_PAGE_NR에 의해 분석하였다.
결과:
용출 조건은 생산물의 품질에 중요하다. 최적 조건의 기준은 불순물 제거를 기반으로 한다.
도 2는 CEX 단계적 용출의 크로마토그램이다.
도 3은 CEX 단계적 용출의 SDS_PAGE_NR 결과이다.
CEX 단계적 용출에서 HCP 시험 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
분획 NaCl 농도 (mM) 수율 (%) HCP (ng/mg)
Load - - 121669
F01 0 2.0 -
E01 100 0.7 799110
E02 200 20.0 115447
E03 300 32.0
E04 375 9.8 35248
E05 425 1.6 -
S01 500 9.2 11179
도 3 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 100 mM NaCl (E01)을 사용하였을 때 HCP 제거가 가장 많이 되었고, 목적 단백질의 손실이 0.7%에 불과했다. 분획 E02-E04 및 분획 E05의 수율은 각각 61.8% 및 1.6%였다. NaCl이 증가함에 따라 HMW 함량이 증가하였다. 생산물의 순도 및 수율의 균형을 위해, 용출 버퍼로 50 mM Tris-HCl, 370 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0가 권장되었다.
실험예 5: 재조합 ECM 단백질 응집체 및 HCP를 제거하기 위한 MMC 조건
상기 실시예 2-(6)의 결합-및-용출 모드 MMC는 재조합 인간 HAPLN1 단백질 응집체 및 HCP를 추가적으로 제거하기 위해 사용되었다. 따라서, 재조합 인간 HAPLN1 단백질 응집체 및 HCP를 제거하기 위한 MMC 조건을 최적화하기 위한 실험을 하였다.
(1) 용출 조건
Capto adhere을 사용하여 재조합 인간 HAPLN1 단백질 응집체 및 HCP를 제거하였다. CEX 용출물을 Capto adhere 컬럼에 로딩하였다. 50 L 물질 생산의 선형 구배 용출 결과에 기초하여, 최적 용출 조건을 단계적 용출 방법에 의해 확인하였다.
재료:
- 컬럼: Capto adhere, 2.985 mL (0.5 cm × 15.2 cm)
- 로드 물질: CEX 용출물, 농도 3.105 mg/mL, HCP 155217 ng/mg, SEC 순도 52.9%
- 로딩 양: 7.5 g/L 수지
- 전-평형화 버퍼: 50 mM NaAc-HAc, 1 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 5.5
- 평형화/세척 버퍼 I: 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 용출 버퍼: (A) 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0; (B) 50 mM Tris-HCl, 1 M Arg, 5 mM EDTA, pH 8.0; 단계적 용출: 20% B (200 mM Arg), 5 CV; 40% B (400 mM Arg), 10 CV; 50% B (500 mM Arg), 10 CV; 60% B (600 mM Arg), 10 CV; 70% B (700 mM Arg), 10 CV
- 스트립 버퍼: 50 mM HAc
실험 절차:
단계적 용출을 사용하여 최적의 용출 조건을 결정하였다. CEX 용출물을 Capto adhere 컬럼에 7.5 g/L 수지로 로딩하고, 용출물을 25 mAU/mm 내지 25 mAU/mm에서 수집하였다. 각 분획의 단백질 농도를 측정하고, 단계적 회수량을 계산하였다. HCP 및 SDS_PAGE_NR 순도도 테스트하였다.
결과:
도 4는 MMC 단계적 용출의 크로마토그램이다.
도 5는 MMC 단계적 용출의 SDS_PAGE_NR 결과이다.
MMC 단계적 용출에서 HCP 시험 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
분획 아르기닌 농도 (mM) 수율 (%) HCP (ng/mg)
Load - - 155217
피크1 (E01) 200 0.2 2711333
피크2 (E02-E03) 400 39.5 39995
피크3 (E04-E05) 500 28.1 4295
피크4 (E06) 600 6.6 5865
피크5 (E07) 700 0.7 -
피크6 (S01) 1000 1.9 27198
도 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 200 mM 아르기닌 (피크1)을 사용하였을 때 HCP 제거가 가장 많이 되었고, 목적 단백질의 손실이 0.2%에 불과했다. 피크2 및 피크3의 수율은 각각 39.5% 및 28.1%였다. 아르기닌 농도가 높을 때 HMW가 가장 많이 용출되었다. 생산물의 순도 및 수율의 균형을 위해, 용출 버퍼로 50 mM Tris-HCl, 500 mM 아르기닌, 5 mM EDTA, pH 8.0이 권장되었다. 200 mM 아르기닌은 세척 단계에서 사용될 수 있다.
실험예 6: 재조합 ECM 단백질의 순도를 향상시키기 위한 HIC 조건
상기 실시예 2-(7)의 HIC는 재조합 인간 HAPLN1 단백질 다량체 및 HCP를 제거하기 위해 사용되었다. 따라서, 재조합 인간 HAPLN1 단백질 다량체 및 HCP를 제거하기 위한 HIC 조건을 최적화하기 위한 실험을 하였다.
(1) 용출 조건
재료:
- 컬럼: Butyl Sepharose 4 Fast Flow, 2.631 mL (0.5 cm × 13.4 cm)
- 로드 물질: 1) MMC 용출물, 농도 0.590 mg/mL, pH 8.09, 146.35 mS/cm, SEC 순도 68.9%; 2) MMC 용출물, 농도 0.543 mg/mL, pH 8.10, 145.82 mS/cm, SEC 순도 68.9%
- 로딩 양: 5 g/L 수지
- 평형화/세척 버퍼 I: 50 mM Tris-HCl, 1 M (NH4)2SO4, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 세척 버퍼 II: 50 mM Tris-HCl, 0.4 M (NH4)2SO4, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 세척 버퍼 III: 1) 50 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0; 2) 50 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0
- 용출 버퍼:
1) (A) 50 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0; (B) 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0; 단계적 용출: 25% B (1.5 M NaCl), 10 CV; 50% B (1 M NaCl), 10 CV; 75% B (0.5 M NaCl), 10 CV; 90% B (0.2 M NaCl), 10 CV; 100% B (0 M NaCl), 10 CV;
2) 50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0
- 스트립 버퍼: 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0
실험 절차:
단계적 용출 방법을 수행하여 세척 III 및 용출 조건을 결정하였다. MMC 용출물을 HIC 컬럼에 로딩하기 전에 ~1 M (NH4)2SO4로 조정하였다. 로딩 양은 5 g/L 수지였고, 용출물은 25 mAU/mm 내지 25 mAU/mm에서 수집하였다. 각 분획의 단백질 농도를 측정하고, 단계적 회수량을 계산하였다. SDS_PAGE_NR을 사용하여 순도를 테스트하였다.
결과:
도 6은 HIC 비교 용출의 크로마토그램이다.
도 7은 HIC 비교 용출의 SDS_PAGE_NR 결과이다.
HIC 단계적 용출의 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
Run No. 세척 III 조건 용출 조건 분획 수율 (%) SEC 순도 (%)
1) 2 M NaCl 단계적 (1.5 → 1 →0.5 →0.2 → 0 M NaCl) 세척 45.8 -
용출 15.3 -
2) 1.5 M NaCl 원스텝 (0.5 M NaCl) 세척 50.1 -
용출 34.8 96.7/3.3/ND
도 7 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 세척 버퍼 II에 의해 HMW가 가장 많이 제거되었고, 목적 단백질은 pH 8.0에서 1.5 M 초과의 NaCl 하에 용출되지 않았다. 따라서, Run2에서, 세척 III에 50 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0이 사용되었고, 용출에 50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0이 사용되었다. 최종적으로, 2번째 실험의 수율은 34.8%였다. 따라서, 세척 버퍼 III로 50 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0이 사용되었고, 용출 버퍼로 50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0이 사용되었다.
실시예 3: 재조합 ECM 단백질의 검정 방법
염산염을 포함하는 이동상을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행함으로써 시료 중의 재조합 ECM 단백질의 단량체 및 기타 불순물을 분석하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 구체적인 조건은 다음과 같다:
- 컬럼: TSKgel G3000SWXL, 7.8 x 300 mm, 5 μm Steel (Manuf. TOSOH)
- 이동상: 50 mM 인산버퍼(phosphate buffer, PB), 300 mM NaCl, 1 M Gdn-HCl 또는 Arg-HCl pH7.5 (±0.5)
- 검출 파장: 280 nm
- 유속: 1.0 mL/min
- 컬럼 온도: 25 ± 3℃
- 샘플 온도: 5 ± 3℃
- 시료 주입량: 100 μg
실험예 7: 재조합 ECM 단백질의 정확한 분석을 위한 첨가제 스크리닝
크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 재조합 ECM 단백질의 단량체 및 기타 불순물을 분석하는 경우, 부정확한 피크의 발생을 감소시켜 정확도를 향상시킬 수 있는 이동상의 첨가제를 스크리닝 하기 위한 실험을 하였다. 구체적으로, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 단량체 및 기타 불순물을 분석하기 위해 이동상으로 사용하는 첨가제의 종류 및 농도에 따른 SEC 분석 정확도를 확인하였다. 시료로는 실시예 2에 따른 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 분리 및 정제 과정 중의 중간 생성물을 사용하였다.
도 8은 이동상(mobile phase, MP)으로 인산버퍼(PB)+NaCl, 5 mM EDTA, 또는 5 mM EDTA+4 M Gdn-HCl를 사용하여 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 포함하는 샘플에 대해 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 9는 이동상으로 50 mM PB+150 mM NaCl+1M Arg-HCl pH 6.3을 사용하여 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 포함하는 샘플에 대해 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 8 내지 9에 나타낸 바와 같이, 염산염을 이동상에 첨가하였을 때 단량체(monomer) 피크가 가장 명확하게 나타났다.
도 10은 이동상으로 50 mM PB+300 mM NaCl, 0.1 M Arg-HCl, 0.5 M Arg-HCl, 1.0 M Arg-HCl, 또는 1.0 M Gdn-HCl을 사용하여 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다. 그 분석 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
이동상 단량체 (%) HMW (%) LMW (%)
50 mM PB+300 mM NaCl 22.4 76.9 0.8
0.1 M Arg-HCl 26.1 73.9 ND
0.5 M Arg-HCl 62.0 38.0 ND
1.0 M Arg-HCl 71.8 28.2 ND
1.0 M Gdn-HCl 77.2 22.8 ND
도 10 및 표 8에 나타낸 바와 같이, Arg-HCl의 농도가 증가함에 따라 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 분리가 잘 되었다. 특히, Arg-HCl과 Gdn-HCl을 1.0 M 농도로 사용하였을 때 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 분리능이 우수하였다.
도 11은 단량체 검정 첨가제로 알려진 우레아를 이동상으로 50 mM PB+300 mM NaCl, 0.1 M 우레아, 0.5 M 우레아, 1.0 M 우레아, 2.0 M 우레아, 4.0 M 우레아, 또는 6.0 M 우레아를 사용하여 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다. 그 분석 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
이동상 단량체 (%) HMW (%) LMW (%)
50 mM PB+300 mM NaCl 26.4 73.6 ND
0.1 M 우레아 26.4 73.6 ND
0.5 M 우레아 26.7 73.3 ND
1.0 M 우레아 27.7 72.3 ND
2.0 M 우레아 32.1 67.9 ND
4.0 M 우레아 75.6 24.4 ND
6.0 M 우레아 75.6 24.4 ND
도 11 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 우레아의 농도가 증가함에 따라 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 분리가 잘 되었다. 그러나, 염산염과 달리 우레아는 4.0 M 이상의 높은 농도로 사용하였을 때 재조합 인간 HAPLN1 단백질 분리가 가능하였다.
도 12는 이동상으로 1.0 M Gdn-HCl, 4.0 M 우레아, 또는 1.0 M Arg-HCl을 사용하여 SEC 분석을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다. 그 분석 결과는 하기 표 10에 나타내었다.
이동상 단량체 (%) HMW (%) LMW (%)
1.0 M Gdn-HCl 77.2 22.8 ND
4.0 M 우레아 75.6 24.4 ND
1.0 M Arg-HCl 71.8 28.2 ND
도 12 및 표 10에 나타낸 바와 같이, Gdn-HCl, Arg-HCl과 같은 염산염을 사용하면 1.0 M의 낮은 농도에서도 4.0 M의 높은 농도의 우레아를 사용하는 것과 동등 이상의 재조합 인간 HAPLN1 단백질 분리능이 나타나는 것을 확인하였다.
따라서, 이동상의 첨가제로 1.0 M의 염산염을 사용하여 SEC 분석을 수행하면, 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 분리능이 우수하고 크로마토그램의 부정확한 피크가 현저히 감소하여 재조합 인간 HAPLN1 단백질의 단량체를 정확하게 분석할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (30)

  1. 구리화합물을 50 μM 이상의 농도로 포함하는, 재조합 세포외 기질 단백질 단량체의 생산을 위한 동물세포 배양용 배지 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 구리화합물은 산화구리(Cu2O), 염화구리(CuCl2), 질산구리(Cu(NO3)2), 산화구리II(CuO), 황화구리(CuS) 또는 황산구리(CuSO4)인 것인 배지 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 세포외 기질 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신 또는 HAPLN(Hyaluronan and proteoglycan link protein)인 것인 배지 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 HAPLN 단백질은 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3 및 HAPLN4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질인 것인 배지 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 세포외 기질 단백질은 인체에서 유래된 단백질인 것인 배지 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 동물세포는 CHO 세포 또는 CHO 세포 변이체인 것인 배지 조성물.
  9. (1) 청구항 1 내지 2 및 5 내지 8 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물에 재조합 세포외 기질 단백질 단량체를 생산하는 동물세포를 배양하고 배양액을 수득하는 단계; 및
    (2) 상기 배양액으로부터 재조합 세포외 기질 단백질 단량체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 고순도의 재조합 세포외 기질 단백질 단량체를 생산하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 단계 (1)의 배양은 유가 배양, 연속식 배양, 또는 회분식 배양인 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 세포 배양 전에 배지 조성물에 구리화합물을 첨가하는 것인 방법.
  12. 삭제
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 재조합 세포외 기질 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신 또는 HAPLN(Hyaluronan and proteoglycan link protein)인 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 HAPLN 단백질은 HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3 및 HAPLN4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질인 것인 방법.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 재조합 세포외 기질 단백질은 인체에서 유래된 단백질인 것인 방법.
  16. 청구항 9에 있어서, 상기 동물세포는 CHO 세포 또는 CHO 세포 변이체인 것인 방법.
  17. 청구항 9에 있어서, 상기 단계 (2)는 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 크로마토그래피를 수행하는 단계는
    음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계:
    혼합 모드 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
    소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 60 내지 200 mM의 히스티딘 염산염(His-HCl)을 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 버퍼는 200 내지 600 mM의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피의 용출 버퍼는 200 내지 800 mM의 아르기닌을 포함하는 것인 방법.
  23. 청구항 19에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피의 용출 버퍼는 0.1 M 내지 1.5 M 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것인 방법.
  24. 청구항 9에 있어서, 상기 단계 (2)에서 분리 및 정제된 재조합 세포외 기질 단백질은 순도 90% 이상인 것인 방법.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
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