ES2607527T3

ES2607527T3 - Mejora de la discriminación en citometría de flujo con transformación geométrica implementada por ordenador

Info

Publication number: ES2607527T3
Application number: ES15153894.9T
Authority: ES
Inventors: George C. Malachowski; Paul Barclay Purcell; Edward Stanton
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2004-07-27
Filing date: 2005-07-27
Publication date: 2017-03-31
Anticipated expiration: 2025-07-27
Also published as: WO2006015056A2; WO2006015056A3; US20180180526A1; US11927523B2; EP1771729B1; DK1771729T3; US20160033387A1; US9625367B2; HK1211696A1; EP2884258B1; US11408813B2; EP1771729A2; DK2884258T3; US20200158622A1; PT1771729E; PT2884258T; US20230168177A1; USRE46559E1; ES2555126T3; US9835541B2

Abstract

Un programa informático para realizar los pasos en un sistema de citometría de flujo de: (a) transformar una primera señal y al menos una señal adicional relacionada con partículas individuales en una corriente fluida en un sistema de citometría de flujo en datos paramétricos ndimensionales, donde "n" es igual al número de señales, en donde al menos dos poblaciones de dichas partículas individuales se solapan en una de dichas n dimensiones; (b) alterar matemáticamente los datos paramétricos n-dimensionales mediante al menos la rotación (48) de los datos paramétricos n-dimensionales para crear una mejor separación espacial en la dimensión en que están solapados; y (c) clasificar (49) en tiempo real dichos datos paramétricos n-dimensionales de cada una de dichas partículas individuales en una de dichas al menos dos poblaciones (8) utilizando dichos datos paramétricos n-dimensionales rotados; para facilitar la separación de dichas partículas individuales basándose en dicha clasificación en tiempo real.

Description

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DESCRIPCION

Mejora de la discriminacion en citometna de flujo con transformacion geometrica implementada por ordenador Campo tecnico

La presente invencion incluye en realizaciones metodos y aparatos para la discriminacion en tiempo real de las partfculas a la vez que se separan mediante citometna de flujo. Mas concretamente, las realizaciones de la invencion pueden incluir la aplicacion de diversas operaciones matematicas para manipular datos en tiempo real que den como resultado una discriminacion mejorada entre poblaciones de partfculas.

Antecedentes de la invencion

Uno de los principales avances de los ultimos anos ha sido la aplicacion de separadores de chorro de aire de alta velocidad para discriminar partfculas y celulas con diferencias casi imperceptibles entre ellas. Por ejemplo, la citometna de flujo se puede utilizar para separar los espermatozoides portadores del cromosoma Y de los que llevan el cromosoma X. Aunque en este contexto se discuten algunas propiedades, debe entenderse que este es solo un ejemplo entre un amplio abanico de aplicaciones. La separacion de espermatozoides se ha aplicado por el momento en bovidos, caballos y cerdos, pero podna utilizarse con otros animales. Dentro de esta misma aplicacion, el objetivo puede ser obtener espermatozoides viables y moviles del semen o posiblemente incluso garantizar el sexo de la descendencia mediante el uso de espermatozoides sexados para inseminar a las hembras de una determinada especie. Su finalidad podna ser la mejora de la cna de animales. Por ejemplo, en ganadenas vacunas cuya produccion es fundamentalmente lactea, sena preferible la seleccion de hembras, mientras que si se trata de produccion carnica, podnan ser preferibles los machos.

Puede haber diferencias sutiles incluso de orden cuantitativo; por ejemplo, que los espermatozoides no expresen antigenos de superficie indicadores de la presencia de cromosomas X o Y. Sin embargo, los espermatozoides portadores del cromosoma X podnan tener mayor masa de material genetico. Un colorante, como puede ser el Hoechst, podna tener propiedades de union al ADN. En consecuencia, la luz emitida por los espermatozoides portadores del cromosoma X cuando incide sobre ellos el laser ultravioleta sena ligeramente mas brillante, lo cual podna utilizarse como una discriminacion para clasificacion y separacion de los espermatozoides.

Tambien puede haber diferencias sutiles debidas a las geometnas del citometro de flujo; siguiendo con el ejemplo de los espermatozoides, en los mairnferos suelen tener forma de pala y, cuando pasan a traves del citometro de flujo, pueden adquirir una orientacion aleatoria. Esta orientacion puede oscurecer la luz diferencial procedente de las celulas portadora del cromosoma X o Y. Por tanto, un citometro podna contar con una boquilla de orientacion especializada que utilice un efecto hidrodinamico para orientar las celulas en un grado razonable.

Se podna obtener un histograma bivariante, cuyos parametros senan la fluorescencia frontal y lateral. Una poblacion puede mostrar el efecto de la orientacion. Una separacion escasa de dos poblaciones podna dificultar el trazado de un contorno cerrado alrededor de cada poblacion. Un contorno puede ser necesario para establecer una region que pueda separarse de forma exclusiva.

En WO0032542A se describe un sistema para separar micropartfculas en una muestra en donde las micropartfculas se han codificado con al menos dos atributos detectables; las senales relacionadas con cada uno de los atributos se detectan y transforman en datos bidimensionales que se muestran en un grafico para diferenciar poblaciones distintas dentro de la muestra, utilizando regiones poligonales alrededor de las poblaciones del grafico y una citometna de flujo. En US-6662117B se describe un analizador de partfculas y un metodo para clasificar partfculas en el cual estas se caracterizan mediante al menos dos parametros detectables; las senales relacionadas con cada uno de los atributos se detectan y transforman en datos bidimensionales; los datos bidimensionales se someten a traslacion y rotacion y despues se muestran en un diagrama de dispersion, en el cual hay al menos dos poblaciones distinguibles con fines de clasificacion utilizando una lmea de clasificacion parabolica.

Descripcion de la invencion

En consecuencia, es deseable mejorar la discriminacion entre partfculas durante la citometna de flujo.

Segun un primer aspecto, se proporciona un programa informatico para realizar los pasos siguientes en un sistema de citometna de flujo:

(a) transformar una primera senal y al menos una senal adicional relacionada con partfculas individuales en una corriente fluida en un sistema de citometna de flujo en datos parametricos n-dimensionales, donde “n” es igual al numero de senales, en donde al menos dos poblaciones de dichas partfculas individuales se solapan en una de dichas n dimensiones;

(b) alterar matematicamente los datos parametricos n-dimensionales mediante al menos la rotacion de los datos parametricos n-dimensionales para crear una mejor separacion espacial en la dimension en que estan solapados; y

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(c) clasificar en tiempo real dichos datos parametricos n-dimensionales de cada una de dichas partfculas individuales en una de dichas al menos dos poblaciones utilizando dichos datos parametricos n-dimensionales rotados;

para facilitar la separacion de dichas partfculas individuales basandose en dicha clasificacion en tiempo real.

Dicho programa informatico podna comprender ademas los pasos de:

alterar matematicamente dichos datos parametricos n-dimensionales mediante al menos el escalado de dichos datos parametricos n-dimensionales; y

clasificar en tiempo real dichos datos parametricos n-dimensionales de cada una de dichas partfculas individuales en una de dichas al menos dos poblaciones basandose en al menos dichos datos parametricos alterados mediante escalado.

El programa informatico podna ademas comprender el paso de procesar simultaneamente dichos datos

parametricos n-dimensionales para alterar los datos tanto mediante escalado como rotacion.

El programa informatico podna ademas comprender los pasos de:

alterar matematicamente los datos parametricos n-dimensionales mediante al menos la traslacion de los datos parametricos n-dimensionales; y

clasificar en tiempo real dichos datos parametricos n-dimensionales de cada una de dichas partfculas individuales en una de dichas al menos dos poblaciones (8) basandose en al menos dichos datos parametricos n-dimensionales trasladados.

El programa informatico podna comprender ademas el paso de procesar simultaneamente dichos datos

parametricos n-dimensionales para alcanzar matematicamente resultados numericos tanto de dicha alteracion rotacional, dicha alteracion de escalado, como de dicha alteracion de traslacion.

El programa informatico podna comprender ademas la diferenciacion visual de dichas al menos dos poblaciones de dichos datos parametricos n-dimensionales.

Dicho paso de diferenciacion visual de dichas al menos dos poblaciones de dichos datos parametricos n- dimensionales podna comprender la expresion grafica de dichos datos parametricos n-dimensionales para cada una de dichas partfculas individuales en relacion con dichas al menos dos poblaciones.

Dicho paso de diferenciacion visual de dichas al menos dos poblaciones de dichos datos parametricos n- dimensionales podna comprender la representacion grafica de dichos datos parametricos n-dimensionales en un sistema de coordenadas cartesianas.

Dicho paso de representacion grafica de dichos datos parametricos n-dimensionales en un sistema de coordenadas cartesianas podna comprender el paso de representar dicha primera senal en un eje y representar dicha al menos una senal adicional en al menos un eje adicional.

El paso de diferenciacion visual de dichas al menos dos poblaciones de dichos datos parametricos n-dimensionales podna comprender los pasos de:

representar graficamente las poblaciones con forma elfptica de cada una de dichas al menos dos poblaciones con angulos de inclinacion no ortogonales con respecto a al menos un eje; y

orientar dichas poblaciones con forma elfptica en un angulo ortogonal con respecto a al menos un eje.

Dichas partfculas podnan comprender espermatozoides. Dichas al menos dos poblaciones podnan comprender una poblacion de espermatozoides portadores del cromosoma X y una poblacion de espermatozoides portadores del cromosoma Y. Dicha primera senal y dicha al menos una senal adicional podnan comprender la fluorescencia emitida por un elemento emisor de luz acoplado a dichas partfculas individuales tras pasar a traves de un haz laser.

Segun un segundo aspecto, se proporciona un citometro de flujo que comprende el programa informatico segun el primer aspecto.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es una muestra de una vision general de un proceso de separacion de acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invencion.

La Figura 2 muestra los sistemas de deteccion de la luz frontal y lateral de acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invencion.

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La Figura 3 es un ejemplo de un histograma de datos de separacion de espermatozoides antes de la rotacion.

La Figura 4 es un ejemplo de un histograma de los datos de separacion de espermatozoides despues del escalado.

La Figura 5 es un ejemplo de un histograma de los datos de separacion de espermatozoides despues de la rotacion.

La Figura 6 es un ejemplo de un histograma de los datos de separacion de espermatozoides despues del escalado y

la rotacion.

La Figura 7 es una representacion conceptual de un sistema para analizar los datos de la senal detectados en la realizacion.

Modo(s) de llevar a cabo la invencion

Las realizaciones de la invencion pueden incluir diversos metodos, aparatos, sistemas, y similares para distinguir partfculas durante la citometna de flujo. En un citometro de flujo se puede crear una corriente fluida (1) que arrastre las partfculas (2). En una realizacion, las partfculas pueden ser espermatozoides; sin embargo, tambien es posible que sean otros tipos de partfculas, todas las cuales se pretende incluir en la presente divulgacion. Las partfculas se pueden acoplar a un elemento emisor de luz; por ejemplo, una realizacion puede incluir un colorante Hoechst. Cada partfcula individual puede emitir una primera senal y posiblemente al menos una senal adicional. Se puede colocar tambien un detector (42) para captar las senales procedentes de las partfculas, tal como se desprende de las Figuras 1 y 2. En las realizaciones, un detector de primera senal puede captar una primera senal relacionada con una partfcula individual y posiblemente al menos un detector de senales adicional puede detectar como mmimo una senal adicional relacionada con una partfcula individual. Esto puede incluir cualquier tipo de senal que pudiera estar relacionada, quiza incluso estrechamente relacionada, con una partfcula individual, tal como fluorescencia, radiancia o similares, pero sin limitarse a ellos.

Como ejemplo, las Figuras 1 y 2 representan una vision general del proceso de separacion mediante citometna de flujo. Una boquilla (32) puede permitir que las partfculas (2) arrastradas en una corriente fluida (1) se muevan a traves de un haz laser (34) en un punto de interrogacion (33). Se puede colocar un detector (42) de senales, tal como un detector (30) de difusion frontal y posiblemente un objetivo (31) para captar la difusion lateral, a fin de capturar las senales relacionadas con una partfcula. Tambien sena deseable colocar lentes (43) para enfocar el laser primario. En las realizaciones, las senales pueden incluir la fluorescencia emitida por una partfcula emisora de luz acoplada a partfculas individuales tras pasar a traves de un haz laser. Las senales emitidas por una partfcula pueden pasar a traves de lentes y posiblemente de una banda perforada (44) para ayudar a recopilar los datos. Se puede conectar un detector de senales a un sistema, como se comenta mas adelante, en el cual se pueden procesar y analizar los datos indicativos de las senales para determinar la decision de separacion. Una decision de separacion podna tomarse con ayuda de ordenadores, programacion, equipos informaticos, software, y similares. Mientras se toma una decision de separacion, las partfculas pasanan a traves de un retardo (35) de gotas. Este espacio de tiempo puede ser muy corto. Tras realizar una decision de separacion, se puede aplicar un pulso de carga (37) a una gotfcula (23) que contiene una partfcula. Las gotfculas pueden pasar a traves de placas deflectoras (38) cargadas para separar las partfculas en un receptaculo de clasificacion (40) deseado con recipientes separados. Las realizaciones pueden incluir un tubo (39) colector de desechos.

Para distinguir las partfculas se pueden analizar los datos de la senal. Las realizaciones pueden incluir senales de conversion (p. ej., una primera senal y al menos una senal adicional) relacionadas con cada partfcula individual en datos parametricos n-dimensionales. Esto se puede hacer con un procesador de senales sensible a las senales. Un procesador de senales puede permitir una conversion de una primera senal y al menos una senal adicional en datos parametricos n-dimensionales Los datos parametricos n-dimensionales pueden incluir datos unidimensionales o posiblemente incluso multidimensionales (2d, 3D, 4D, etc.) que podnan asociarse con cada senal detectada. Los datos de las senales se convierten para relacionar cada senal con una coordenada, tal como una intensidad de un color y similar, y pueden incluso trasladarse a una grafica en un sistema de coordenadas cartesianas.

Las senales, posiblemente incluso los datos parametricos n-dimensionales, se pueden representaren una grafica (13). Como las diferencias entre partfculas pueden variar ligeramente, las senales asociadas con las partfculas tambien pueden variar ligeramente. Estas ligeras diferencias podnan ser tan pequenas que, al representarlas graficamente, los datos parametricos n-dimensionales correspondientes a las senales se pueden trasladar a puntos situados muy proximos unos de otros. Pueden estar tan cerca que dificultanan la clasificacion de los puntos de datos en una poblacion. Las tecnologfas convencionales pueden haber ignorado estos puntos situados tan cerca unos de otros y pueden haber rechazado esa partfcula porque no podna distinguirse. En las realizaciones sena deseable reconfigurar los datos para mejorar la separacion entre los puntos de datos.

Las realizaciones incluyen la distincion de al menos dos poblaciones (8) de datos parametricos n-dimensionales. Un elemento de diferenciacion poblacional incluye una transformacion geometrica y permite que los datos parametricos n-dimensionales se clasifiquen dentro de una de al menos dos poblaciones. Por ejemplo, un espermatozoide puede clasificarse dentro de una poblacion de portadores del cromosoma X y de una poblacion de portadores del cromosoma Y. Puede realizarse una transformacion geometrica bidimensional de los datos de la citometna de flujo, de manera que las partfculas, o incluso las celulas puedan separarse en distintos viales basandose en una

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propiedad adecuada. En el caso de los espermatozoides, un vial contiene celulas que danan origen a machos y otro contiene celulas que danan origen a hembras. Una transformacion incluye una operacion de rotacion y puede incluir una matriz de puntos producto de distintas traslaciones y operaciones de escalado para discriminar las celulas que determinaran el sexo masculino de las que determinaran el sexo femenino, e incluso puede mantener la identificacion del tipo celular correcto durante la deriva de la senal a lo largo del tiempo. Las transformaciones se pueden combinar en una sola matriz de transformacion de manera que los calculos puedan realizarse dentro del tiempo disponible para el procesamiento de la senal, como los de un procesador de senales digitales.

En las realizaciones, la presente invencion incluye la clasificacion en tiempo real de datos parametricos n- dimensionales de cada partfcula individual en una de al menos dos poblaciones. Un elemento de clasificacion en tiempo real incluye la clasificacion de datos de la senal en una poblacion, la toma de la decision de separacion y la separacion de una partfcula dentro del corto espacio de tiempo que necesita la partfcula para atravesar el citometro de flujo. En consecuencia, la presente invencion proporciona, en las realizaciones, la separacion de partfculas individuales basada en una clasificacion en tiempo real.

La presente invencion puede proporcionar, en las realizaciones, la distincion visual de al menos dos poblaciones de datos parametricos n-dimensionales. Esto puede ayudar al usuario a asegurarse de que la separacion se este llevando a cabo adecuadamente. Tambien puede permitir que el usuario contribuyese a la discriminacion entre poblaciones. Las realizaciones pueden incluir la expresion grafica de datos parametricos n-dimensionales de cada partfcula individual en relacion con al menos dos poblaciones. Por ejemplo, sena deseable representar los datos parametricos n-dimensionales en un sistema de coordenadas cartesianas. Una primera senal se representana en un eje (14) y al menos una senal adicional se puede representar en al menos un eje adicional (15), como se muestra en la Figura 3. En otras realizaciones incluso se puede proporcionar un histograma (17) de los datos parametricos n- dimensionales.

Determinadas partfculas o celulas pueden manifestar senales que pueden mostrar las diferencias aumentadas mediante traslacion o efectos de escalado. Por ejemplo, un espermatozoide que determina el sexo masculino no se discriminana de otro que determina el sexo femenino mediante una senal luminosa inalterada tfpica detectada por un citometro de flujo. Aunque una senal digitalizada puede tener una resolucion de 12 bits, un sistema electronico de separacion puede tener una resolucion de 8 bit, desechando posiblemente los 4 bits inferiores. Una luz detectada procedente de celulas espermaticas que determinan el sexo masculino y femenino puede ser tan parecida que se pueden necesitar los 4 bits inferiores para poder discriminarlas. Igualmente, debido a su similitud, las celulas no se pueden discriminar eficazmente en el analisis de datos del histograma de los parametros detectados, posiblemente porque los histogramas tambien tendnan una resolucion degradada.

Las partfculas o las celulas espermaticas pueden ocupar una zona pequena del histograma (17). La variacion en las senales detectadas procedentes de celulas o partfculas, al igual que en el caso de las celulas espermaticas que determinaran el sexo masculino respecto a las celulas espermaticas que determinaran el sexo femenino, puede ser pequena; como lo puede ser la variacion entre celulas o partfculas del mismo tipo. El intervalo total de variacion para ambos tipos de celulas o partfculas puede abarcar menos de la mitad del intervalo total disponible. Por tanto, los bits inferiores de la resolucion senan importantes para discriminar entre las celulas o partfculas, y posiblemente incluso los bits superiores pueden no ser necesarios para identificar ambos tipos de celulas o partfculas. Esta caractenstica se aprovechana trasladando una parte central del intervalo total de variacion de la senal para ambos tipos de celulas o partfculas a un origen de un sistema de coordenadas cartesianas, escalando los datos alrededor del origen para aumentar de forma eficaz la varianza entre los tipos y luego volviendo a trasladarlos a su situacion original. Como resultado, los datos del histograma pueden mostrar suficiente variacion para discriminar entre los dos tipos de celulas o partfculas, mientras se preserva suficiente informacion como para identificar ambos tipos de la perturbacion instrumental, las celulas muertas o destruidas, otras partfculas extranas, y similares. Esto se aplica en especial a la discriminacion por sexo de las celulas espermaticas.

Los datos parametricos n-dimensionales pueden combinarse para alcanzar matematicamente resultados numericos representativos de una alteracion. Un calculo de alteracion puede incluir cualquier tipo de manipulacion de los datos. La invencion incluye una alteracion rotacional aplicada a los datos parametricos n-dimensionales Las realizaciones pueden incluir una alteracion de traslacion. En otras realizaciones, los datos parametricos n-dimensionales pueden combinarse para alcanzar matematicamente resultados numericos representativos de una operacion de escalado. Por supuesto, podna utilizarse otro tipo de alteraciones y calculos y se podna aplicar cualquier alteracion como una sola operacion o quiza incluso en combinacion con otras. La clasificacion de una partfcula se basa en resultados numericos representativos de una alteracion.

En las realizaciones, como se puede entender conceptualmente en la Figura 7, puede detectarse una senal (45) asociada a una partfcula por al menos un detector (46) que enviana los datos de la senal a un procesador (47) de senales. En un procesador de senales, los datos de la senal se transforman en datos parametricos n-dimensionales, a los cuales se aplica al menos una alteracion (48), incluida una alteracion rotacional y una operacion de traslacion o una operacion de escalado o ambas. Basandose en esta alteracion, los datos parametricos n-dimensionales se clasifican dentro de una de al menos dos poblaciones proporcionando una clasificacion (49) en tiempo real. La decision (50) de diferenciar una partfcula se toma conforme a una clasificacion en tiempo real de los datos

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parametricos n-dimensionales, cuyas direcciones se pueden enviar a un citometo (51) de flujo para cargar y clasificar las partmulas.

Determinadas partmulas o celulas pueden manifestar senales que pueden mostrar diferencias aumentadas mediante una alteracion rotacional de los datos. La invencion implica rotar los datos para incrementar la separacion de datos entre las celulas espermaticas que determinan el sexo masculino y las celulas espermaticas que determinan el sexo femenino. Se pueden detectar dos fuentes de luz para cada celula. El intervalo de intensidad lummica de una fuente de celulas que determinaran el sexo masculino puede solapar el mismo intervalo de fuente lummica de las celulas que determinaran el sexo femenino. El uso de un factor de escalado, tal como se ha descrito anteriormente, puede aumentar la separacion de la distribucion media del intervalo de la senal, pero no puede eliminar completamente el solapamiento.

Para eliminar el solapamiento en este ejemplo concreto, la invencion puede considerar una forma de la distribucion de la senal en un analisis bidimensional en donde las senales de posiblemente dos fuentes de luz se pueden correlacionar en un sistema de coordenadas cartesiano bidimensional. En una representacion grafica, cada una de las poblaciones de estos tipos de celulas puede tener una poblacion (18) de forma elfptica con angulos de inclinacion no ortogonales similares de un eje mayor y puede tener incluso una longitud similar de un eje menor. La diferencia en la interseccion en Y del eje mayor de la elipse entre un tipo de celula y otro puede ser superior a la longitud del eje menor. Como los ejes mayores pueden ser casi paralelos, puede ser deseable orientar las poblaciones con forma elfptica en una posicion ortogonal con respecto a al menos un eje. Una rotacion alrededor de un punto medio entre los dos ejes mayores puede orientar cada elipse en un angulo ortogonal con respecto al eje Y, posiblemente eliminando de forma eficaz el solapamiento en el eje Y.

Senales tales como la intensidad de la luz se pueden variar a lo largo del tiempo, con lo que se puede descartar la configuracion de regiones fijas en las cuales se pueden basar las decisiones de separacion. Durante una separacion larga, las poblaciones pueden derivar debido a cambios ffsicos en los detectores, a la absorcion o degradacion del colorante e incluso a otras condiciones no controlables. Por tanto, las regiones de separacion pueden necesitar monitorizarse y ajustarse durante la separacion. Esto puede resultar pesado y arduo y aumentar las posibilidades de error.

Una realizacion de la presente invencion mantendna una poblacion en su situacion original utilizando una operacion de escalado en la matriz de transformacion. Un factor de escalado posible podna ser una relacion de un valor medio inicial del intervalo de la senal con respecto a la media actual; que puede escalar eficazmente la senal arriba o abajo proporcionalmente a la cantidad de deriva de la media inicial.

Como se ha senalado anteriormente, se utiliza un citometro de flujo para generar una corriente en la cual se pueden inyectar las celulas u otras partmulas. Se puede establecer un punto de deteccion que puede causar que una fuente de luz laser incidiese en las celulas, probablemente haciendo que el colorante que lleva el genoma emita fluorescencia. En una aplicacion, los espermatozoides pueden estar orientados por la hidrodinamica del dispositivo de inyeccion; y quiza el nivel de fluorescencia podna ser proporcional a la cantidad de masa genomica. Por tanto, se puede detectar una diferencia entre los espermatozoides portadores del cromosoma X y los portadores del cromosoma Y. La fluorescencia la pueden detectar sensores situados en posicion frontal respecto al punto de deteccion y posiblemente tambien en un angulo, tal como 90 grados, respecto a dicho punto, tal como se explica en las Figuras 1 y 2. Un sistema de sensores es capaz de pasar un impulso de luz a un dispositivo electrico que puede convertir un nivel de pulso en numeros binarios adecuados para su manipulacion por un procesador de senales digitales (DSP).

Un procesador de senales, tal como un procesador de senales digitales, puede contener algoritmos altamente optimizados capaces de realizar una transformacion especializada de al menos dos valores de senales. Esta transformacion puede hacer que una poblacion de senales resultante adoptase una forma, que sena similar a la que trazana la separacion de los espermatozoides portadores del cromosoma X y los portadores del cromosoma Y. La claridad en el trazado puede permitir seleccionar cada poblacion con mayor exactitud que con cualquier otro sistema de separacion.

La seleccion de que poblacion se va a separar puede hacerse mediante un sistema electronico similar al que controla un desprendimiento de las gotmulas en un citometro de flujo estandar. Puede haber un retraso entre la deteccion de fluorescencia y la cafda de una partmula en una ultima gota desprendida (36). Este tiempo puede ser conocido. Asf, un sistema electronico puede aplicar una carga electrica a la gota que contiene la partmula de interes. Los electrodos de alto voltaje situados por debajo de las gotas desprendidas hanan que estas se desplazasen y cayesen dentro de un vial de recogida. De esta forma puede recolectarse un alto nivel de partmulas seleccionadas, probablemente como celulas espermaticas puras, tal como se explica en la Figura 1.

Un procesador de senales digitales puede controlar la posicion de las poblaciones. Los citometros de flujo pueden tener cierta variabilidad en la exactitud de enfoque de un haz laser, lo que puede hacer que cambie la intensidad de la fluorescencia de cada celula. Un DSP puede actuar como un dispositivo sensor para monitorizar el cambio de intensidad de la luz e incluso puede aplicar una escala correctora para garantizar que las poblaciones que se encuentren en la bivariante de fluorescencia continuen en la misma posicion. Esto puede garantizar la separacion de

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los espermatozoides correctos. El proceso de transformacion, zoom y quizas incluso control se puede integrar en una transformacion geometrica. La transformacion multiple y el zoom se podnan incorporar quiza incluso con transformaciones no lineales; logantmicas, consulta de tablas, o incluso transformaciones de porciones de datos discretamente exclusivas. La transformacion puede aportar unicamente la exactitud requerida para proporcionar una separacion de partfculas de alta pureza.

Un metodo para obtener datos separados espacialmente puede ser el uso de algoritmos de compensacion que los expertos en la materia podnan apreciar. La rotacion de los datos (dispersion frontal respecto a dispersion lateral) puede ser un mecanismo mas preciso para hacerlo. Ademas de la rotacion, se ha descubierto que podna ser necesario realizar el rastreo y zoom de los datos. Estas combinaciones pueden ser significativas; por ejemplo, la seleccion del sexo no puede lograrse de forma optima con ningun otro metodo, de ah la importancia de esta invencion.

Al rotar un histograma bivariante en el cual esten presentes dos poblaciones que se solapen en una dimension, se crea una mejor separacion espacial en la dimension solapada. De acuerdo con la invencion, los datos rotados se utilizan como un parametro en las decisiones de separacion y posiblemente en otros histogramas. Si los datos se han rotado adecuadamente, un histograma univariante del parametro de interes puede contener espacios vacfos en las poblaciones. En las realizaciones, se puede utilizar una funcion de rotacion para configurar las poblaciones X e Y en una bivariante horizontal. Dado que las poblaciones de interes pueden estar normalmente muy juntas, sena deseable, ya sea solo o en combinacion con otros aspectos, ampliar una region mediante zoom para exagerar la distincion entre las poblaciones. Este puede ser otro mecanismo para separar las poblaciones. Ademas, los largos procesos tfpicos de la separacion de espermatozoides o similares pueden hacer que los datos se desplazasen a lo largo del tiempo. Estos desplazamientos se pueden fijar estableciendo una region de rastreo y utilizando esta region en un parametro calculado de nuevo. En las realizaciones, se puede implementar un algoritmo de configuracion automatica de la region. En otras realizaciones, se pueden configurar regiones de acuerdo con un nivel de pureza deseado.

Para rotar y separar datos, una rotacion se podna hacer utilizando un equipo informatico capaz de acceder a los datos en un soporte de adquisicion y de modificar un evento antes de adoptar una decision de separacion. Mas que disenar un nuevo equipo informatico, sena deseable implementarlo en un DSP, posiblemente utilizando un algoritmo de rotacion. Esto puede incluir la capacidad de compensacion de datos al rotar. Ademas de la rotacion, un usuario puede especificar la region sometida al zoom de ampliacion.

En las realizaciones, la presente invencion puede aportar la especificacion de un punto central de la rotacion. Esto puede permitir un control mas preciso de la rotacion para alcanzar la separacion maxima.

Los ejemplos incluinan facilitar una funcion de alteracion del espacio n-dimensional que tuviera al menos:

un primer valor de alteracion unidimensional, un segundo valor de alteracion unidimensional;

un primer valor de alteracion bidimensional, un segundo valor de alteracion bidimensional y un tercer valor de alteracion bidimensional, y similares.

Esto puede ser representativo de una matriz, como un experto en la materia puede apreciar y se puede entender de los ejemplos expuestos a continuacion.

Las funciones de alteracion del espacio n-dimensional se pueden combinar con un vector que tuviera puntos de datos para alterar los datos parametricos n-dimensionales. En una combinacion de ejemplo de una funcion y puntos de datos se podna incluir, aunque no de forma limitativa: el calculo de los tiempos de un primer valor de alteracion unidimensional, un punto de datos unidimensional sumado a los tiempos de un segundo valor de alteracion unidimensional, un punto de datos bidimensional sumado a los tiempos de un tercer valor de alteracion unidimensional, un punto de datos tridimensional para asf crear un primer punto de datos alterados dimensional; y el calculo de los tiempos de un primer valor de alteracion bidimensional, un punto de datos unidimensional sumado a los tiempos de un segundo valor rotacional bidimensional y un punto de datos bidimensional sumado a los tiempos de un tercer valor de alteracion bidimensional, un punto de datos tridimensional para asf crear un segundo punto de datos alterados dimensional.

En otros ejemplos, una funcion de alteracion del espacio n-dimensional puede incluir un primer valor de alteracion tridimensional, un segundo valor de alteracion tridimensional y un tercer valor de alteracion tridimensional. Ademas, una combinacion de datos puede incluir el calculo de los tiempos de un primer valor de alteracion tridimensional, un punto de datos unidimensional sumado a los tiempos de un segundo valor rotacional tridimensional, un punto de datos bidimensional sumado a los tiempos de un tercer valor de alteracion tridimensional, un punto de datos tridimensional para asf crear un tercer punto de datos alterados dimensional.

Pueden utilizarse muchos tipos distintos de valores de manipulacion de datos como un valor de alteracion. La alteracion rotacional incluye valores de alteracion basados en un angulo de rotacion que permita a puntos de datos alterados aumentar la discriminacion de al menos dos poblaciones de datos n-dimensionales. En otras realizaciones, una alteracion escalada puede incluir valores de alteracion basados en un elemento de zoom y rastreo que permita a

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puntos de datos alterados aumentar la discriminacion de al menos dos poblaciones de datos n-dimensionales. En otras realizaciones, una alteracion de traslacion puede incluir valores de alteracion que pueden trasladar los datos de parametros n-dimensionales, con respecto a un punto central de rotacion.

Los siguientes son ejemplos de matrices que se pueden utilizar para hacer la rotacion alrededor de un punto central dado e incluso zoom o rastreo en una region, y similares.

Trasladar datos:

Rotar los datos:

Escalar los datos (zoom y rastreo):

fT%/ jT*i V

1 (vCx, Cyj

'\ 0 CtN

0 t

,0 0 1,

cosd sen 0

imagen1

send cos 8

0 0

O'

0

S(D„ Dy) =

imagen2

0 O' Dy 0

0 h

Estos puede combinarse con las variables:

Res = Resolucion/2 z = Cantidad de zoom RC = Centro de rotacion Tr = Constante de rastreo ZC = Centro de rastreo 0 = Angulo de rotacion

en una sola transformacion producida por el producto de todas o alguna de las siguientes operaciones lineales:

- T(Resx, Resy)

- S(Zx, Zy)

- T(-ZCx, -ZCy)

- S(Trx, Try)

- T(RCx, RCy)

- R0

- T(-RCx, -RCy)

La ecuacion, T(-RCx, -RCy), puede trasladar un a un sistema de coordenadas apropiado. Esto cuadrante.

Cuando se aplica el zoom a los datos, estos pueden centrarse en el histograma. Esta puede ser la razon por la cual los datos podrian trasladarse a la mitad (^) de la resolution, en vez de volver al punto central de la region sometida a zoom.

evento a un origen y despues lo contrario para trasladarlo de nuevo se puede hacer con todos los datos en modo de lista en el primer

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Otros ejemplos de alteraciones de transformacion se pueden basar en operaciones tales como rotacion en el eje X, rotacion en el eje Y, rotacion en el eje Z, traslacion, escalado, la perspectiva, orden superior y similares. Algunos ejemplos incluyen los siguientes algoritmos 3D:

Rotacion en el eje X:

Rotacion en el eje Y

i 1 0 0 0|

Rx(6)= | 0 cos(9) -sen(0) 0|

j 0 sen(0) cos(0) 0|

| 0 0 0 I |

| cos(9) 0 sen{0) 01

Ry(0) = | 0 i 0 0 |

| *sen(0) 0 cos(0) 0 | | 0 0 0 1 |

Rotacion en el eje Z

Traslacion:

| cos(0) -sen(O) 0 01 Rz(0) - | sen(8) cos(0) 0 01 I 0 0 T 01

(0 0 0 1|

imagen3

S(SX,SY,SZ) =

I 1 o 0 Txl

10 1 OTv! |0 0 1 Til [0 0 0 1|

I Sx 0 0 Oj

| 0 Sy 0 01

| O' O' S:i 01

| 0 0 0 11

Se entiende que los ejemplos expuestos no son limitantes.

Los programas pueden resolver la ecuacion particular utilizada y pueden descargar el resultado en el DSP. El codigo del DSP puede realizar una simple multiplication de matrices utilizando las matrices proporcionadas por los programas informaticos. Ademas, un programa informatico puede crear parametros de zoom de manera que la media de las senales sometidas a zoom pueden permanecer inalteradas. La media puede permanecer en la misma position dentro de una region rastreada. El software permitiria al usuario designar limites de regiones por los que podria regirse una funcion de zoom. El software puede enviar a un DSP un centro de un zoom, el valor de zoom e incluso la ganancia de rastreo.

En las realizaciones, la aplicacion del zoom en una region cuadrada en una division de poblaciones (como las poblaciones X e Y) se puede mostrar en un histograma bivariante de fluorescencia directa frontal en comparacion con uno de fluorescencia lateral. Una region sometida a zoom puede tener una forma cuadrada o incluso no cuadrada con un tamano maximo que puede ser igual a un tamano de la bivariante. En las realizaciones, puede ser deseable usar una asignacion de ganancia de 1 y una compensation de 0 en ambos parametros. Una region sometida a zoom se puede establecer como una fraction porcentual del intervalo bivariante en unidades lineales. Como los expertos en la materia reconoceran, un valor de 1/16 puede ofrecer una ventaja digital. En las realizaciones puede alterarse la ganancia de software (distinto de la ganancia de zoom). Dado que el DSP puede ser

un procesador de punto fijo, podna utilizarse un codigo de ensamblaje altamente optimizado para definir la matematica de punto flotante.

Para conseguir unos calculos de datos eficaces en el corto periodo de separacion de la clasificacion en tiempo real, en realizaciones de la presente invencion incluinan el procesamiento simultaneo de dos o mas calculos de 5 alteraciones. Esto incluina el procesamiento simultaneo de los datos parametricos n-dimensionales para alcanzar matematicamente resultados numericos tanto de alteracion rotacional como de alteracion de escalado. Otras realizaciones incluinan el procesamiento simultaneo de los datos parametricos n-dimensionales para alcanzar matematicamente resultados numericos tanto de una alteracion rotacional, de una alteracion de escalado, como posiblemente de una alteracion de traslacion. Por supuesto, tambien se pueden procesar otras alteraciones de forma 10 simultanea o posiblemente de forma secuencial.

La Figura 3 es una imagen de los datos antes de la rotacion. La Figura 4 muestra una imagen de los datos despues del escalado; la Figura 5 muestra una imagen de los datos despues de la rotacion y la Figura 6 muestra una imagen de los datos despues del escalado y la rotacion, tambien es comun ver estas muestras de datos de los datos de separacion de espermatozoides. Aunque la rotacion permite al usuario obtener datos separados espacialmente, 15 puede distorsionar los valores relativos de intensidad y, en realizaciones, no se puede utilizar por otros motivos que ganar espacio entre poblaciones distintas. Puede ser posible eliminar los valores en el eje de los datos rotados, a fin de garantizar que el usuario disponga de una forma visual de reconocimiento.

Claims

1.

10

15 2.

20

3.

4.

25

30 5.

6.

35

7.

40 8.

9.

45

10.

REIVINDICACIONES

Un programa informatico para realizar los pasos en un sistema de citometna de flujo de:

(a) transformer una primera senal y al menos una senal adicional relacionada con partfculas individuales en una corriente fluida en un sistema de citometna de flujo en datos parametricos n- dimensionales, donde “n” es igual al numero de senales, en donde al menos dos poblaciones de dichas partfculas individuales se solapan en una de dichas n dimensiones;

(b) alterar matematicamente los datos parametricos n-dimensionales mediante al menos la rotacion (48) de los datos parametricos n-dimensionales para crear una mejor separacion espacial en la dimension en que estan solapados; y

(c) clasificar (49) en tiempo real dichos datos parametricos n-dimensionales de cada una de dichas partfculas individuales en una de dichas al menos dos poblaciones (8) utilizando dichos datos parametricos n-dimensionales rotados;

Un programa informatico segun la reivindicacion 1, que ademas comprende los pasos de:

alterar matematicamente dichos datos parametricos n-dimensionales mediante al menos el escalado (48) de dichos datos parametricos n-dimensionales; y

clasificar en tiempo real dichos datos parametricos n-dimensionales de cada una de dichas partfculas individuales en una de dichas al menos dos poblaciones (8) basandose en al menos dichos datos parametricos alterados mediante escalado.

Un programa informatico segun la reivindicacion 2, que ademas comprende el paso de procesar simultaneamente dichos datos parametricos n-dimensionales para alterar los datos tanto mediante escalado como rotacion.

Un programa informatico segun la reivindicacion 1 o 2, que ademas comprende los pasos de:

alterar matematicamente los datos parametricos n-dimensionales mediante al menos la traslacion (48) de los datos parametricos n-dimensionales; y

Un programa informatico segun la reivindicacion 4, cuando depende de la reivindicacion 2, que ademas comprende el paso de procesar simultaneamente dichos datos parametricos n-dimensionales para alcanzar matematicamente resultados numericos tanto de dicha alteracion rotacional, dicha alteracion de escalado, como de dicha alteracion de traslacion.

Un programa informatico segun la reivindicacion 1, que ademas comprende diferenciar visualmente dichas al menos dos poblaciones (8) de dichos datos parametricos n-dimensionales.

Un programa informatico segun la reivindicacion 6, en donde dicho paso de diferenciacion visual de dichas al menos dos poblaciones (8) de dichos datos parametricos n-dimensionales comprende la expresion grafica de dichos datos parametricos n-dimensionales para cada una de dichas partfculas individuales en relacion a dichas al menos dos poblaciones.

Un programa informatico segun la reivindicacion 6, en donde dicho paso de diferenciacion visual de dichas al menos dos poblaciones de dichos datos parametricos n-dimensionales comprende la representacion grafica de dichos datos n-parametricos n-dimensionales en un sistema de coordenadas cartesianas.

Un programa informatico segun la reivindicacion 8, en donde dicho paso de representacion grafica de dichos datos parametricos n-dimensionales en un sistema de coordenadas cartesianas comprende el paso de representar dicha primera senal (45) en un eje (14) y representar dicha al menos una senal adicional (45) en al menos un eje adicional (15).

Un programa informatico segun la reivindicacion 6, en donde dicho paso de diferenciacion visual de dichas al menos dos poblaciones de dichos datos parametricos n-dimensionales comprende los pasos de:

representar graficamente las poblaciones (18) con forma elfptica de cada una de dichas al menos dos poblaciones (8) con angulos de inclinacion no ortogonales con respecto a al menos un eje; y

12.

10 13.

orientar dichas poblaciones con forma eUptica en un angulo ortogonal con respecto a al menos un eje.

Un programa informatico segun la reivindicacion 1, en donde dichas partfculas comprenden espermatozoides; y en donde dichas al menos dos poblaciones (8) comprenden una poblacion de espermatozoides portadores del cromosoma X y una poblacion de espermatozoides portadores del cromosoma Y.

Un programa informatico segun la reivindicacion 1, en donde dicha primera senal (45) y dicha al menos una senal (45) adicional comprende fluorescencia emitida desde un elemento emisor de luz acoplado a dichas partfculas individuales tras pasar a traves de un haz laser (34).

Un aparato citometro de flujo que comprende el programa informatico segun cualquier reivindicacion anterior.