JP3121849B2 - フローイメージサイトメータ - Google Patents
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
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- G01N15/1433—Signal processing using image recognition
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- G—PHYSICS
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、血液や尿などの粒子成
分を含む試料液を扁平なシースフローにして流し、その
試料液扁平流にパルス光を照射して静止画像を得、画像
処理により試料液中の粒子成分の分類や計数などの分析
を行う装置に関し、さらに詳しくは、試料扁平流の撮像
エリヤ部分を常時監視し、粒子が到来した時に光を照射
するようにし、効率よく粒子成分の蛍光画像およびまた
は自然光画像を撮像するようにした粒子画像分析装置
(フローイメージサイトメータ)に関するものである。
分を含む試料液を扁平なシースフローにして流し、その
試料液扁平流にパルス光を照射して静止画像を得、画像
処理により試料液中の粒子成分の分類や計数などの分析
を行う装置に関し、さらに詳しくは、試料扁平流の撮像
エリヤ部分を常時監視し、粒子が到来した時に光を照射
するようにし、効率よく粒子成分の蛍光画像およびまた
は自然光画像を撮像するようにした粒子画像分析装置
(フローイメージサイトメータ)に関するものである。
【0002】
【従来の技術】染色された細胞などの粒子に励起光を当
て、その粒子から発せられる蛍光を検出することにより
粒子の分類などの分析を行うことは従来より行われてお
り、具体例としてはフローサイトメータや顕微鏡などが
知られている。
て、その粒子から発せられる蛍光を検出することにより
粒子の分類などの分析を行うことは従来より行われてお
り、具体例としてはフローサイトメータや顕微鏡などが
知られている。
【0003】フローサイトメータでは個々の粒子から発
せられる蛍光量を検出することができる。
せられる蛍光量を検出することができる。
【0004】顕微鏡ではより詳細な蛍光画像を観察する
ことができる。また、得られた蛍光像を画像処理するも
のもある。さらに、特開昭63−269875号公報に
は紫外、可視、赤外の3種の光像をとらえることができ
る撮像装置が開示されている。
ことができる。また、得られた蛍光像を画像処理するも
のもある。さらに、特開昭63−269875号公報に
は紫外、可視、赤外の3種の光像をとらえることができ
る撮像装置が開示されている。
【0005】一方、フローにして流した粒子の画像を撮
像し、画像処理により粒子の分析をする装置が特開昭5
7−500995号公報及び米国特許第4338024
号に開示されている。
像し、画像処理により粒子の分析をする装置が特開昭5
7−500995号公報及び米国特許第4338024
号に開示されている。
【0006】また、本件に先駆けて本出願人は、撮像領
域を常時監視しておき、フロー中の粒子がその領域に到
来したことを検出し、効率よく粒子画像を撮像するよう
にした装置を出願している。
域を常時監視しておき、フロー中の粒子がその領域に到
来したことを検出し、効率よく粒子画像を撮像するよう
にした装置を出願している。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】フローサイトメータに
おいて、単位時間当たりの処理能力は高いものの、粒子
からの蛍光をグロスでしか得ることができず、粒子のど
の部分からどれだけの蛍光が発せられているかなどの微
細な情報が得られなかった。顕微鏡では多くの情報を得
ることができるが、前処理などに手間がかかり、高速処
理ができなかった。これらの課題を克服し、本発明は個
々の粒子の微細な情報を含め高速に効率よく多くの粒子
情報を得ることができ、分析能力の高い粒子分析装置を
提供することを目的とする。
おいて、単位時間当たりの処理能力は高いものの、粒子
からの蛍光をグロスでしか得ることができず、粒子のど
の部分からどれだけの蛍光が発せられているかなどの微
細な情報が得られなかった。顕微鏡では多くの情報を得
ることができるが、前処理などに手間がかかり、高速処
理ができなかった。これらの課題を克服し、本発明は個
々の粒子の微細な情報を含め高速に効率よく多くの粒子
情報を得ることができ、分析能力の高い粒子分析装置を
提供することを目的とする。
【0008】
【課題の解決手段】本発明は上記目的を達成するために
次の構成を採るものである。
次の構成を採るものである。
【0009】被検出粒子成分を含む試料液を偏平な流れ
にするための偏平な流路が形成されたフローセルと、フ
ローセルの一方の側に配置されフローセル中の試料液に
光を照射する光源と、フローセルの他方の側に配置さ
れ、光源により照射された試料液中の被検出粒子の静止
画像を撮像する撮像手段と、撮像手段からの画像データ
に基づいて所望の分析を行う処理手段と、を含むフロー
イメージサイトメータにおいて、被検出粒子成分は蛍光
染色処理がなされており、上記フローセルの一方の側に
配置されフローセル中の試料液に蛍光励起用のパルス光
を照射するための第1の光源と、フローセルの他方の側
に配置され第1の光源により照射された試料液中の被検
出粒子の静止画像を撮像するための第1の撮像手段と、
上記フローセルの一方の側に配置されフローセル中の試
料液を常時照射するための第2の光源と、フローセルの
他方の側に配置され第2の光源により照射された粒子を
撮像するための第2の撮像手段と、第2の撮像手段の撮
像データに基づき被検出粒子を検出し、この検出に基づ
き第1の光源を第1の撮像手段の撮像期間中に動作させ
る制御手段と、を備え上記第1の撮像手段が試料液の流
れ上に2次元の撮像領域を有し、上記第2の撮像手段が
試料液の流れ上にライン状の撮像領域を有し、上記第2
の撮像手段の撮像領域が上記第1の撮像手段の撮像領域
内で試料液の流れを横切るように形成されるフローイメ
ージサイトメータを特色とする。さらに、本発明は、被
検出粒子成分を含む試料液を偏平な流れにするための偏
平な流路が形成されたフローセルと、フローセルの一方
の側に配置されフローセル中の試料液に光を照射する光
源と、フローセルの他方の側に配置され、光源により照
射された試料液中の被検出粒子の静止画像を撮像する撮
像手段と、撮像手段からの画像データに基づいて所望の
分析を行う処理手段と、を含むフローイメージサイトメ
ータにおいて、フローセルの一方の側に配置され光量を
切り換えてフローセル中の試料液に光を照射する第1の
光源と、上記フローセルの他方の側に配置され、第1の
光源により高輝度パルス照射された試料液中の被検出粒
子の静止画像を撮像する第1の撮像手段と、フローセル
の他方の側に配置され第1の光源により低輝度連続照射
された粒子を撮像するための第2の撮像手段と、第2の
撮像手段の撮像データに基づき被検出粒子を検出しこの
検出に基づき第1の光源の高輝度切換動作をさせる制御
手段と、を備え、被検出粒子成分は蛍光染色処理がなさ
れており、第1の光源は蛍光励起用であるフローイメー
ジサイトメータ、を特色とする。
にするための偏平な流路が形成されたフローセルと、フ
ローセルの一方の側に配置されフローセル中の試料液に
光を照射する光源と、フローセルの他方の側に配置さ
れ、光源により照射された試料液中の被検出粒子の静止
画像を撮像する撮像手段と、撮像手段からの画像データ
に基づいて所望の分析を行う処理手段と、を含むフロー
イメージサイトメータにおいて、被検出粒子成分は蛍光
染色処理がなされており、上記フローセルの一方の側に
配置されフローセル中の試料液に蛍光励起用のパルス光
を照射するための第1の光源と、フローセルの他方の側
に配置され第1の光源により照射された試料液中の被検
出粒子の静止画像を撮像するための第1の撮像手段と、
上記フローセルの一方の側に配置されフローセル中の試
料液を常時照射するための第2の光源と、フローセルの
他方の側に配置され第2の光源により照射された粒子を
撮像するための第2の撮像手段と、第2の撮像手段の撮
像データに基づき被検出粒子を検出し、この検出に基づ
き第1の光源を第1の撮像手段の撮像期間中に動作させ
る制御手段と、を備え上記第1の撮像手段が試料液の流
れ上に2次元の撮像領域を有し、上記第2の撮像手段が
試料液の流れ上にライン状の撮像領域を有し、上記第2
の撮像手段の撮像領域が上記第1の撮像手段の撮像領域
内で試料液の流れを横切るように形成されるフローイメ
ージサイトメータを特色とする。さらに、本発明は、被
検出粒子成分を含む試料液を偏平な流れにするための偏
平な流路が形成されたフローセルと、フローセルの一方
の側に配置されフローセル中の試料液に光を照射する光
源と、フローセルの他方の側に配置され、光源により照
射された試料液中の被検出粒子の静止画像を撮像する撮
像手段と、撮像手段からの画像データに基づいて所望の
分析を行う処理手段と、を含むフローイメージサイトメ
ータにおいて、フローセルの一方の側に配置され光量を
切り換えてフローセル中の試料液に光を照射する第1の
光源と、上記フローセルの他方の側に配置され、第1の
光源により高輝度パルス照射された試料液中の被検出粒
子の静止画像を撮像する第1の撮像手段と、フローセル
の他方の側に配置され第1の光源により低輝度連続照射
された粒子を撮像するための第2の撮像手段と、第2の
撮像手段の撮像データに基づき被検出粒子を検出しこの
検出に基づき第1の光源の高輝度切換動作をさせる制御
手段と、を備え、被検出粒子成分は蛍光染色処理がなさ
れており、第1の光源は蛍光励起用であるフローイメー
ジサイトメータ、を特色とする。
【0010】
【実施例】図1は本発明によるフローイメージサイトメ
ータの基本的構成を示すものである。図6はその測定フ
ロー図である。図において、28は染色処理がなされた
試料液(例えば、血液、尿などの試料)の周りをシース
液で包み、扁平な流れを形成させるためのフローセルで
ある。30は厚みの薄い、幅の広い扁平な流路である
(図では左右方向に狭く上下方向に広く示されてい
る)。試料液はこの扁平流路30をシース液とともに紙
面に垂直の方向に流れる。
ータの基本的構成を示すものである。図6はその測定フ
ロー図である。図において、28は染色処理がなされた
試料液(例えば、血液、尿などの試料)の周りをシース
液で包み、扁平な流れを形成させるためのフローセルで
ある。30は厚みの薄い、幅の広い扁平な流路である
(図では左右方向に狭く上下方向に広く示されてい
る)。試料液はこの扁平流路30をシース液とともに紙
面に垂直の方向に流れる。
【0011】10は第1の光源である蛍光励起用レーザ
(例えばHe−CdレーザやAr+ レーザ)、16は第
3の光源である自然光画像撮像用の白色ストロボ光源で
ある。24はハーフミラーである。レーザ10は1台で
細胞通過監視用と細胞静止画像撮像用を兼ねている。5
6、40、46はそれぞれ第1の撮像手段であるビデオ
カメラ、第2の撮像手段であるCCDラインセンサ、第
3の撮像手段であるビデオカメラである。第2の撮像手
段40は粒子検出用であり、第1、第3の撮像手段5
6、46はそれぞれ蛍光画像撮像用、自然光画像撮像用
である。レーザ10は必要に応じて光量を変えることが
できる。図5(a)の輝度曲線C1に示すように、通常
は低輝度の連続発光で粒子の検出を行い、粒子が検出さ
れたときには静止画像を撮像するために高輝度でパルス
発光図5(b)の(C3)する。
(例えばHe−CdレーザやAr+ レーザ)、16は第
3の光源である自然光画像撮像用の白色ストロボ光源で
ある。24はハーフミラーである。レーザ10は1台で
細胞通過監視用と細胞静止画像撮像用を兼ねている。5
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カメラ、第2の撮像手段であるCCDラインセンサ、第
3の撮像手段であるビデオカメラである。第2の撮像手
段40は粒子検出用であり、第1、第3の撮像手段5
6、46はそれぞれ蛍光画像撮像用、自然光画像撮像用
である。レーザ10は必要に応じて光量を変えることが
できる。図5(a)の輝度曲線C1に示すように、通常
は低輝度の連続発光で粒子の検出を行い、粒子が検出さ
れたときには静止画像を撮像するために高輝度でパルス
発光図5(b)の(C3)する。
【0012】図2は図1においてAから見た試料液の流
れ部分の拡大図である。第2の撮像手段40によるライ
ン状の撮像領域A2は、粒子の流れとほぼ直交する方向
に第1の撮像手段56による撮像領域A1および第3の
撮像手段46による撮像領域A3を横切るように形成さ
れている。
れ部分の拡大図である。第2の撮像手段40によるライ
ン状の撮像領域A2は、粒子の流れとほぼ直交する方向
に第1の撮像手段56による撮像領域A1および第3の
撮像手段46による撮像領域A3を横切るように形成さ
れている。
【0013】レーザ10からの光12は、シリンドカル
レンズからなる光形成部14及びコンデンサレンズ26
により、上記撮像領域A2を覆うように試料液の流れ領
域にその流れ方向には幅狭く(ただし対象とする粒子の
外径よりもやや広く)、流れに垂直の方向には幅広く照
射される(第1図においては紙面と垂直方向には幅狭
く、上下方向には幅広く照射される)。ライン状の撮像
領域(イメージセンサエリア)A2に光を照射する際、
このように長楕円に照射することにより、撮像領域A2
部分における光強度を均一化し粒子検出の安定化を図る
とともに光強度を上げ蛍光撮像時のS/N比を高めるこ
とができる。
レンズからなる光形成部14及びコンデンサレンズ26
により、上記撮像領域A2を覆うように試料液の流れ領
域にその流れ方向には幅狭く(ただし対象とする粒子の
外径よりもやや広く)、流れに垂直の方向には幅広く照
射される(第1図においては紙面と垂直方向には幅狭
く、上下方向には幅広く照射される)。ライン状の撮像
領域(イメージセンサエリア)A2に光を照射する際、
このように長楕円に照射することにより、撮像領域A2
部分における光強度を均一化し粒子検出の安定化を図る
とともに光強度を上げ蛍光撮像時のS/N比を高めるこ
とができる。
【0014】フローセル28からの光のうち励起光は対
物レンズ32、ハーフミラー34、ダイクロイックミラ
ー36、投影レンズ38を経てCCDライセンサ40上
に結像され、その光量に応じた電圧が順次取り出され
る。その信号に基づいて細胞通過判定部58にてリアル
タイムで粒子が来たかどうかの判定がなされる。粒子が
検出された場合には、直ちにレーザ10を高輝度でパル
ス発光させるための発光信号が出力される。この発光信
号によりイメージインテンシファイア52が駆動され
る。また、その発光信号に同期して白色ストロボ16を
パルス発光させるトリガ信号も出力される。図4はダイ
クロイックミラー36の特性図である。高輝度のレーザ
光は先程と同様にフローセル28に照射される。粒子が
蛍光を発していれば、その蛍光画像はダイクロイックミ
ラー36から反射され(励起光はダイクロイックミラー
38を反射せず透過する)、投影レンズ50をへて光電
変換イメージデバイスであるイメージインテンシファイ
ア52の入力面上に結像する。上記駆動信号により能動
状態となったイメージインテンシファイア52により1
03 〜106 倍に光増幅された蛍光画像は、リレーレン
ズ54を経てビデオカメラ56で撮像され、細胞粒子の
蛍光画像が得られる。粒子が未検出の状態で細胞通過判
定部58からトリガ信号または駆動信号が出力されない
ので、イメージインテンシファイア52は動作せず、光
はそこで遮断されビデオカメラ56には到達しない。念
のためダイクロイックミラー36と投光レンズ50の間
に励起光カットフィルタを設けてもよい。
物レンズ32、ハーフミラー34、ダイクロイックミラ
ー36、投影レンズ38を経てCCDライセンサ40上
に結像され、その光量に応じた電圧が順次取り出され
る。その信号に基づいて細胞通過判定部58にてリアル
タイムで粒子が来たかどうかの判定がなされる。粒子が
検出された場合には、直ちにレーザ10を高輝度でパル
ス発光させるための発光信号が出力される。この発光信
号によりイメージインテンシファイア52が駆動され
る。また、その発光信号に同期して白色ストロボ16を
パルス発光させるトリガ信号も出力される。図4はダイ
クロイックミラー36の特性図である。高輝度のレーザ
光は先程と同様にフローセル28に照射される。粒子が
蛍光を発していれば、その蛍光画像はダイクロイックミ
ラー36から反射され(励起光はダイクロイックミラー
38を反射せず透過する)、投影レンズ50をへて光電
変換イメージデバイスであるイメージインテンシファイ
ア52の入力面上に結像する。上記駆動信号により能動
状態となったイメージインテンシファイア52により1
03 〜106 倍に光増幅された蛍光画像は、リレーレン
ズ54を経てビデオカメラ56で撮像され、細胞粒子の
蛍光画像が得られる。粒子が未検出の状態で細胞通過判
定部58からトリガ信号または駆動信号が出力されない
ので、イメージインテンシファイア52は動作せず、光
はそこで遮断されビデオカメラ56には到達しない。念
のためダイクロイックミラー36と投光レンズ50の間
に励起光カットフィルタを設けてもよい。
【0015】60は遅延回路であり、上記トリガ信号を
一定時間遅延させて白色ストロボ光源16を発光させる
発光信号を得るためのものである。この信号を受けて白
色ストロボ光源16は図5(b)の輝度曲線C3で示す
ように、レーザ10の高輝度発光から一定時間遅れてパ
ルス発光する。白色ストロボ光源16から発せられた可
視光は、コリメータレンズ20、コンデンサレンズ2
2、ハーフミラー24、コンデンサレンズ26を経て、
粒子液の流れ部分に照射される(図2の撮像エリア、A
1、A3を覆うように照射される)。フローセル28か
らの自然光画像は対物レンズ32、ハーフミラー34、
励起光カットフィルタ42、投影レンズ44を経てビデ
オカメラ46に結像される。図3は励起光カットフィル
タの特性図である。
一定時間遅延させて白色ストロボ光源16を発光させる
発光信号を得るためのものである。この信号を受けて白
色ストロボ光源16は図5(b)の輝度曲線C3で示す
ように、レーザ10の高輝度発光から一定時間遅れてパ
ルス発光する。白色ストロボ光源16から発せられた可
視光は、コリメータレンズ20、コンデンサレンズ2
2、ハーフミラー24、コンデンサレンズ26を経て、
粒子液の流れ部分に照射される(図2の撮像エリア、A
1、A3を覆うように照射される)。フローセル28か
らの自然光画像は対物レンズ32、ハーフミラー34、
励起光カットフィルタ42、投影レンズ44を経てビデ
オカメラ46に結像される。図3は励起光カットフィル
タの特性図である。
【0016】ところで、レーザ10の高輝度パルス発光
時、ストロボ16のパルス発光時に励起光波長領域の光
がイメージセンサエリアに対応するCCDラインセンサ
40にも到達するが、その期間、禁止をかけておけば細
胞通過判定部58は誤動作せず不必要な信号も出力され
ることはない。そのために、例えば後述のように、ライ
ンセンサ40の前に高速度電子シャッタを設けることが
できる。
時、ストロボ16のパルス発光時に励起光波長領域の光
がイメージセンサエリアに対応するCCDラインセンサ
40にも到達するが、その期間、禁止をかけておけば細
胞通過判定部58は誤動作せず不必要な信号も出力され
ることはない。そのために、例えば後述のように、ライ
ンセンサ40の前に高速度電子シャッタを設けることが
できる。
【0017】また、後述の条件下において、図1に示す
構成で撮像領域A2を通過する粒子をすべて監視できる
ようになっている(励起光がそのまま透過してしまうよ
うな粒子については検出できないが)。この場合、図1
の構成において、フローセル28からの励起光を遮断
し、粒子からの蛍光を分けてビデオカメラ46とCCD
ラインセンサ40とに結像させることにより、CCDラ
インセンサ40は蛍光像のみを結像させることができ
る。このようにして、撮像領域A2を通過する粒子のう
ち蛍光を発する粒子だけを監視の対象とすることができ
る。蛍光の選別には例えば、励起光カットフィルタやダ
イクロイックミラーなどを用いることができる。蛍光の
分離にはハーフミラー34などを用いることができる。
構成で撮像領域A2を通過する粒子をすべて監視できる
ようになっている(励起光がそのまま透過してしまうよ
うな粒子については検出できないが)。この場合、図1
の構成において、フローセル28からの励起光を遮断
し、粒子からの蛍光を分けてビデオカメラ46とCCD
ラインセンサ40とに結像させることにより、CCDラ
インセンサ40は蛍光像のみを結像させることができ
る。このようにして、撮像領域A2を通過する粒子のう
ち蛍光を発する粒子だけを監視の対象とすることができ
る。蛍光の選別には例えば、励起光カットフィルタやダ
イクロイックミラーなどを用いることができる。蛍光の
分離にはハーフミラー34などを用いることができる。
【0018】
【作用】さて、上記の構成によるとラインセンサ40の
1ラインの走査周期は数十μsであるので、試料液の流
速を適当な値にしておけば粒子が撮像エリアA1、A3
内に存在するうちに蛍光画像および自然光画像を撮像す
ることができる。いま仮に、CCDラインセンサ40の
撮像領域A2の幅を1μm、ラインセンサの走査周期を
33μs、白血球の大きさを15μmとする。そのとき
には流速を例えば0.1m/sに設定しておけば1回の
走査時間内に細胞の移動する距離は3.3μmであるた
め白血球細胞がラインセンサの撮像領域A2 を通過する
間に必ず4回の走査が行なわれることになりこの走査に
より通過した細胞が目的の細胞であるか否かを判定す
る。この判定をリアルタイムに行ない目的の細胞である
と判定したら励起光源へのパルストリガをかける。仮に
ラインセンサ40の走査開始からパルストリガまでの所
要時間を50μsecと仮定すると、その間にサンプル
は約5μm移動していることになり励起光照射エリアを
約30μmとしておくことにより細胞全体に励起光を照
射することができる。この照射エリアはできるだけ目的
とする細胞の大きさと同じ程度であることが望ましいた
め、イメージセンサの信号処理時間、シース流速とのか
ねあいにより励起光照射エリア、イメージセンサ撮像エ
リアを設定する。励起光源はトリガにより数十μsec
の間高出力によるパルス照射を行なう。励起光および蛍
光は対物レンズ26、ハーフミラー34、ダイクロイッ
クミラー36、投影レンズ50を介して、蛍光成分のみ
がイメージインテンシファイア52の光電面に像を結ぶ
ことになる。その後イメージインテンシファイア52に
より蛍光像は103 〜106 倍に増幅され蛍光面側に像
を結ぶ。この像はリレーレンズ54を介してビデオカメ
ラ56に結像される。このとき撮像画面に白血球の蛍光
画像が写っていることになる。
1ラインの走査周期は数十μsであるので、試料液の流
速を適当な値にしておけば粒子が撮像エリアA1、A3
内に存在するうちに蛍光画像および自然光画像を撮像す
ることができる。いま仮に、CCDラインセンサ40の
撮像領域A2の幅を1μm、ラインセンサの走査周期を
33μs、白血球の大きさを15μmとする。そのとき
には流速を例えば0.1m/sに設定しておけば1回の
走査時間内に細胞の移動する距離は3.3μmであるた
め白血球細胞がラインセンサの撮像領域A2 を通過する
間に必ず4回の走査が行なわれることになりこの走査に
より通過した細胞が目的の細胞であるか否かを判定す
る。この判定をリアルタイムに行ない目的の細胞である
と判定したら励起光源へのパルストリガをかける。仮に
ラインセンサ40の走査開始からパルストリガまでの所
要時間を50μsecと仮定すると、その間にサンプル
は約5μm移動していることになり励起光照射エリアを
約30μmとしておくことにより細胞全体に励起光を照
射することができる。この照射エリアはできるだけ目的
とする細胞の大きさと同じ程度であることが望ましいた
め、イメージセンサの信号処理時間、シース流速とのか
ねあいにより励起光照射エリア、イメージセンサ撮像エ
リアを設定する。励起光源はトリガにより数十μsec
の間高出力によるパルス照射を行なう。励起光および蛍
光は対物レンズ26、ハーフミラー34、ダイクロイッ
クミラー36、投影レンズ50を介して、蛍光成分のみ
がイメージインテンシファイア52の光電面に像を結ぶ
ことになる。その後イメージインテンシファイア52に
より蛍光像は103 〜106 倍に増幅され蛍光面側に像
を結ぶ。この像はリレーレンズ54を介してビデオカメ
ラ56に結像される。このとき撮像画面に白血球の蛍光
画像が写っていることになる。
【0019】励起光源のトリガ後、適当な時間遅れてス
トロボ光源16にトリガをかける。この遅延は蛍光励起
用光源10として可視光領域の波長を使用した場合、目
的とする細胞が励起光照射エリアの外に出る(図2の
C)のを待つためである。撮像エリア中の励起光源によ
る輝度飽和部分の外側で静止画像をとるための処理であ
る。これは例えば、遅延時間を励起光トリガー後100
μs〜300μsの範囲で選べばよい。ストロボ光はコ
リメータレンズ20で平行光に直された後コンデンサレ
ンズ22で集光され、ハーフミラー24で反射された
後、コンデンサレンズ26で撮像画面に照射される。そ
の透過光は、対物レンズ32、ハーフミラー34、励起
光カットフィルタ42、投影レンズ44を介してビデオ
カメラ46のCCD面に結像される。このとき撮像画面
に白血球の自然光像が写っていることになる。
トロボ光源16にトリガをかける。この遅延は蛍光励起
用光源10として可視光領域の波長を使用した場合、目
的とする細胞が励起光照射エリアの外に出る(図2の
C)のを待つためである。撮像エリア中の励起光源によ
る輝度飽和部分の外側で静止画像をとるための処理であ
る。これは例えば、遅延時間を励起光トリガー後100
μs〜300μsの範囲で選べばよい。ストロボ光はコ
リメータレンズ20で平行光に直された後コンデンサレ
ンズ22で集光され、ハーフミラー24で反射された
後、コンデンサレンズ26で撮像画面に照射される。そ
の透過光は、対物レンズ32、ハーフミラー34、励起
光カットフィルタ42、投影レンズ44を介してビデオ
カメラ46のCCD面に結像される。このとき撮像画面
に白血球の自然光像が写っていることになる。
【0020】以上のようにして、目的とする細胞の自然
光像及び蛍光画像の双方を得ることができる。またイメ
ージセンサの前に励起光パルストリガと同期した高速度
電子シャッタを具備することによりストロボ光による蛍
光像への影響を軽減することもできる。本実施例におい
ては蛍光画像の撮像のみについて述べているが、ビデオ
カメラによって得られた像をイメージプロセッサによっ
て処理することにより、細胞内における蛍光量の3次元
分布等を得ることも可能である。また、励起用光源とし
て直線偏光されたレーザを用い、蛍光像撮像光学系内の
ダイクロイックミラーと、投影レンズの間に、励起光の
偏光方向に対して垂直な偏光成分を透過する検光子を配
することにより、細胞より得られる蛍光の偏光解消像を
得ることも可能である。その場合、ただし、本考案実施
例において蛍光励起用光源とに可視光を使用する場合、
自然光像撮像側の励起光カットフィルタとして、図3に
示すような狭帯域波長カットフィルタを使用する必要が
生ずる。
光像及び蛍光画像の双方を得ることができる。またイメ
ージセンサの前に励起光パルストリガと同期した高速度
電子シャッタを具備することによりストロボ光による蛍
光像への影響を軽減することもできる。本実施例におい
ては蛍光画像の撮像のみについて述べているが、ビデオ
カメラによって得られた像をイメージプロセッサによっ
て処理することにより、細胞内における蛍光量の3次元
分布等を得ることも可能である。また、励起用光源とし
て直線偏光されたレーザを用い、蛍光像撮像光学系内の
ダイクロイックミラーと、投影レンズの間に、励起光の
偏光方向に対して垂直な偏光成分を透過する検光子を配
することにより、細胞より得られる蛍光の偏光解消像を
得ることも可能である。その場合、ただし、本考案実施
例において蛍光励起用光源とに可視光を使用する場合、
自然光像撮像側の励起光カットフィルタとして、図3に
示すような狭帯域波長カットフィルタを使用する必要が
生ずる。
【0021】
【実施例2】実施例2の構成図を図7に示す。これは実
施例1から自然光画像の撮像機能を削除したもので、こ
の場合もすべての粒子を検出の対象としあるいは蛍光を
発する粒子を対象とすることができる。図8に示すよう
に、自然光像撮像エリアA3 の機能を備えていない。
施例1から自然光画像の撮像機能を削除したもので、こ
の場合もすべての粒子を検出の対象としあるいは蛍光を
発する粒子を対象とすることができる。図8に示すよう
に、自然光像撮像エリアA3 の機能を備えていない。
【0022】
【実施例3】実施例1、2とは異なり、光源を粒子監視
用(第2の光源)と撮像用(第1の光源)とに分けてい
る。
用(第2の光源)と撮像用(第1の光源)とに分けてい
る。
【0023】図9に構成図を示す。第2の光源は赤外半
導体レーザ64であり、常時発光している。
導体レーザ64であり、常時発光している。
【0024】操作用の第1の光源は先例と同様に蛍光励
起用のレーザであり、粒子が検出されたら図14に示す
ように撮像用パルスが発光しビデオカメラ56で蛍光画
像を撮像する。
起用のレーザであり、粒子が検出されたら図14に示す
ように撮像用パルスが発光しビデオカメラ56で蛍光画
像を撮像する。
【0025】図11は励起光と監視用の赤外光を分離で
きるダイクロイックミラー68の特性図、図12は励起
光や蛍光と赤外光とを分離するためのダイクロイックミ
ラー70の特性図、図13は励起光と蛍光を分離させる
ための励起カットフィルタ72の特性図である。
きるダイクロイックミラー68の特性図、図12は励起
光や蛍光と赤外光とを分離するためのダイクロイックミ
ラー70の特性図、図13は励起光と蛍光を分離させる
ための励起カットフィルタ72の特性図である。
【0026】図10は撮像領域部分を示し、励起光照射
領域B1と赤外光照射領域B2とを分けているが、重ね
てもよい。
領域B1と赤外光照射領域B2とを分けているが、重ね
てもよい。
【0027】また、赤外半導体レーザ64の代わりに励
起用レーザを用いることも可能である。
起用レーザを用いることも可能である。
【0028】
【実施例4】実施例3に自然光画像撮像機能を追加した
ものである。このため、図15に示すように蛍光像撮像
用ビデオカメラ56のイメージインテンシファイアの前
方に励起光同期高速シャッター72を配置している。
ものである。このため、図15に示すように蛍光像撮像
用ビデオカメラ56のイメージインテンシファイアの前
方に励起光同期高速シャッター72を配置している。
【0029】
【実施例5】実施例3において、図17に示すように、
第1の光源における励起用レーザの代わりに白色ストロ
ボ光源11とコリメータレンズ75、励起光選択フィル
タ76を用いることにより同様の機能を持たせたもので
ある。フィルタは必要に応じて交換し励起光や蛍光の選
定が自由に行うことができ、測定対象が限定されないた
め汎用性がある。
第1の光源における励起用レーザの代わりに白色ストロ
ボ光源11とコリメータレンズ75、励起光選択フィル
タ76を用いることにより同様の機能を持たせたもので
ある。フィルタは必要に応じて交換し励起光や蛍光の選
定が自由に行うことができ、測定対象が限定されないた
め汎用性がある。
【0030】すなわち、本構成例では励起用光源として
ハロゲンランプ等の白色光源11を使用し、励起光選択
フィルタ76を交換することにより、任意の励起光波長
による蛍光像を撮像するシステムを供給する。このシス
テムでは測定サンプルの処理に使用する染色液により、
励起光選択フィルタ及び励起光カットフィルタ72を手
動もしくは自動で交換する手段を備えることにより、C
CDラインセンサ40によって目的の細胞であると判断
された粒子に対して、光源をパルス照射し、ビデオカメ
ラ56に目的の細胞に対する蛍光画像を得るものであ
る。
ハロゲンランプ等の白色光源11を使用し、励起光選択
フィルタ76を交換することにより、任意の励起光波長
による蛍光像を撮像するシステムを供給する。このシス
テムでは測定サンプルの処理に使用する染色液により、
励起光選択フィルタ及び励起光カットフィルタ72を手
動もしくは自動で交換する手段を備えることにより、C
CDラインセンサ40によって目的の細胞であると判断
された粒子に対して、光源をパルス照射し、ビデオカメ
ラ56に目的の細胞に対する蛍光画像を得るものであ
る。
【0031】
【実施例6】図19に示すように、第1の光源における
励起用レーザの代わりに白色ストロボ光源11とコリメ
ータレンズ77、励起光透過フィルタ78を用いること
により同様の機能を持たせたものである。
励起用レーザの代わりに白色ストロボ光源11とコリメ
ータレンズ77、励起光透過フィルタ78を用いること
により同様の機能を持たせたものである。
【0032】必要に応じてフィルタの種類を交換するこ
とが可能である。つまり、励起光や蛍光の選定が自由に
行えるので、測定対象が限定されずより汎用的である。
とが可能である。つまり、励起光や蛍光の選定が自由に
行えるので、測定対象が限定されずより汎用的である。
【0033】本構成例では、実施例3における細胞通過
監視用光源64を励起用光源と兼用することによりシス
テムの簡略化を図るものである。励起用光源で常時低出
力で照射することによりCCDラインセンサ40で細胞
の通過監視を行ない、目的の細胞が通過したと判断され
た場合、励起用光源を高出力でパルス発光し、ビデオカ
メラに蛍光画像を得るものである。
監視用光源64を励起用光源と兼用することによりシス
テムの簡略化を図るものである。励起用光源で常時低出
力で照射することによりCCDラインセンサ40で細胞
の通過監視を行ない、目的の細胞が通過したと判断され
た場合、励起用光源を高出力でパルス発光し、ビデオカ
メラに蛍光画像を得るものである。
【0034】
【発明の効果】(1)本発明によるフローイメージサイ
トメータは、撮像領域を常時監視し,、粒子が到来した
ときに粒子の静止画像を撮像するようにしているので、
効率よく正確に粒子の蛍光画像を撮像することができ
る。
トメータは、撮像領域を常時監視し,、粒子が到来した
ときに粒子の静止画像を撮像するようにしているので、
効率よく正確に粒子の蛍光画像を撮像することができ
る。
【0035】(2)白色光源を設けた場合蛍光画像だけ
でなく自然光画像も得ることができるので、より高精度
の粒子分析を行うことができる。
でなく自然光画像も得ることができるので、より高精度
の粒子分析を行うことができる。
【0036】(3)監視用光源と撮像用光源を兼用させ
た場合には構成が簡単なものとなる。
た場合には構成が簡単なものとなる。
【0037】粒子検出のための第2の撮像領域をライン
状にすると撮像画面中の粒子の位置が限定されるので、
後の画像処理がし易くなる。
状にすると撮像画面中の粒子の位置が限定されるので、
後の画像処理がし易くなる。
【0038】(4)粒子の監視において、すべての粒子
を監視対象としたり、蛍光を発する粒子のみを対象とす
る切換えができる。
を監視対象としたり、蛍光を発する粒子のみを対象とす
る切換えができる。
【0039】(5)測定対象に応じてフィルタの交換な
どを行い、装置をより汎用的に用いることもできる。
どを行い、装置をより汎用的に用いることもできる。
【0040】
【0041】
【図1】本発明によるフローイメージサイトメータの第
1の実施例に関する構成を示す。
1の実施例に関する構成を示す。
【0042】
【図2】フローセル部における励起光エリアと撮像エリ
アの説明図を示す。
アの説明図を示す。
【0043】
【図3】励起光カットフィルタの特性例を示す。
【0044】
【図4】ダイクロイックミラーの特性例を示す。
【0045】
【図5】(a)は粒子検出に至る輝度曲線の例、(b)
は検出後発光される撮像用発光パルスの例を示す。
は検出後発光される撮像用発光パルスの例を示す。
【0046】
【図6】上記フローイメージサイトメータの測定フロー
チャートを示す。
チャートを示す。
【0047】
【図7】第2の実施例の構成を示す。
【0048】
【図8】図7に関連したフローセル部における各撮像エ
リアおよび各照明エリアの例を示す。
リアおよび各照明エリアの例を示す。
【0049】
【図9】第3の実施例の構成を示す。
【0050】
【図10】図9に関連した図8と同様のエリアの例を示
す。
す。
【0051】
【図11】図9に関連したダイクロイックミラーの特性
例を示す。
例を示す。
【0052】
【図12】図9に関連したダイクロイックミラーの特性
例を示す。
例を示す。
【0053】
【図13】図9に関連した励起光カットフィルタの特性
例を示す。
例を示す。
【0054】
【図14】粒子検出時の撮像用パルスの例を示す。
【0055】
【図15】第4の実施例の構成を示す。
【0056】
【図16】図15に関連した撮像および照明エリアの例
を示す。
を示す。
【0057】
【図17】第5の実施例の構成を示す。
【0058】
【図18】励起光選択(透過)フィルタの特性を例示す
る。
る。
【0059】
【図19】第6の実施例の構成を示す。
【0060】
28……フローセル 10……第1の光源 16……第2の光源 30……扁平流路 56……第1の撮像手段 46……第2の撮像手段 40,58,60……制御手段 64……第3の光源。
Claims (11)
- 【請求項1】被検出粒子成分を含む試料液を偏平な流れ
にするための偏平な流路が形成されたフローセルと、フ
ローセルの一方の側に配置されフローセル中の試料液に
光を照射する光源と、フローセルの他方の側に配置され
上記光源により照射された試料液中の被検出粒子の静止
画像を撮像する撮像手段と、上記撮像手段からの画像デ
ータに基づいて所望の分析を行う処理手段と、を含むフ
ローイメージサイトメータにおいて、被検出粒子成分は
蛍光染色処理がなされており、上記フローセルの一方の
側に配置されフローセル中の試料液に蛍光励起用のパル
ス光を照射するための第1の光源と、フローセルの他方
の側に配置され第1の光源により照射された試料液中の
被検出粒子の静止画像を撮像するための第1の撮像手段
と、前記フローセルの上記一方の側に配置されフローセ
ル中の試料液を常時照射するための第2の光源と、フロ
ーセルの他方の側に配置され第2の光源により照射され
た粒子を撮像するための第2の撮像手段と、第2の撮像
手段の撮像データに基づき被検出粒子を検出しこの検出
に基づき第1の光源を第1の撮像手段の撮像期間中に動
作させる制御手段と、を備え、上記第1の撮像手段が試
料液の流れ上に2次元の撮像領域を有し、上記第2の撮
像手段が試料液の流れ上にライン状の撮像領域を有し、
上記第2の撮像手段の撮像領域が上記第1の撮像手段の
撮像領域内で試料液の流れを横切るように形成されるこ
とを特徴とするフローイメージサイトメータ。 - 【請求項2】請求項1記載のフローイメージサイトメー
タにおいて、上記第2の光源が赤外光を発するものであ
ることを特徴とするフローイメージサイトメータ。 - 【請求項3】請求項1記載のフローイメージサイトメー
タにおいて、上記第2の光源が蛍光励起光を発するもの
であることを特徴とするフローイメージサイトメータ。 - 【請求項4】請求項1〜3のいずれかに記載のフローイ
メージサイトメータにおいて、フローセルの上記一方の
側に配置されフローセル中の試料液に白色光をパルス照
射するための第3の光源と、フローセルの他方の側に配
置され、上記第3の光源により照射された試料液中の被
検出粒子の静止画像を撮像するための第3の撮像手段
と、をさらに付加して設け、さらに、制御手段が上記第
2の撮像手段の撮像データに基づいて被検出粒子を検出
し、この検出に基づき所定時間ずらして上記第1、第3
の光源をそれぞれ上記第1、第3の撮像手段の撮像期間
中に動作させるようにしたことを特徴とするフローイメ
ージサイトメータ。 - 【請求項5】請求項4記載のフローイメージサイトメー
タにおいて、上記第1、第3の撮像手段が試料液の流れ
上にそれぞれ2次元の撮像領域を有し、上記第2の撮像
手段が試料液の流れ上にライン状の撮像領域を有し、上
記第2の撮像手段の撮像領域が第1、第3の撮像手段の
撮像領域内で上記試料液の流れを横切るように形成され
たことを特徴とするフローイメージサイトメータ。 - 【請求項6】請求項5記載のフローイメージサイトメー
タにおいて、上記第2の光源からの照射光を長楕円にす
る手段が設けられたことを特徴とするフローイメージサ
イトメータ。 - 【請求項7】被検出粒子成分を含む試料液を偏平な流れ
にするための偏平な流路が形成されたフローセルと、上
記フローセルの一方の側に配置されフローセル中の試料
液に光を照射する光源と、上記フローセルの他方の側に
配置され、上記光源により照射された試料液中の被検出
粒子の静止画像を撮像する撮像手段と、上記撮像手段か
らの画像データに基づいて所望の分析を行う処理手段
と、を含むフローイメージサイトメータにおいて、上記
フローセルの一方の側に配置され光量を切り換えてフロ
ーセル中の試料液に光を照射する第1の光源と、上記フ
ローセルの他方の側に配置され、上記第1の光源により
高輝度パルス照射された試料液中の被検出粒子の静止画
像を撮像する第1の撮像手段と、上記フローセルの他方
の側に配置され上記第1の光源により低輝度連続照射さ
れた粒子を撮像するための第2の撮像手段と、上記第2
の撮像手段の撮像データに基づき被検出粒子を検出しこ
の検出に基づき第1の光源の高輝度切換動作をさせる制
御手段と、を備え、上記被検出粒子成分は蛍光染色処理
がなされており、上記第1の光源は蛍光励起用であるこ
とを特徴とするフローイメージサイトメータ。 - 【請求項8】請求項7に記載のフローイメージサイトメ
ータにおいて、上記フローセルの他方の側に配置されフ
ローセル中の試料液に白色光をパルス照射するための第
3の光源と、上記フローセルの他方の側に配置され上記
第3の光源により照射された試料液中の被検出粒子の静
止画像を撮像するための第3の撮像手段と、をさらに付
加して設け、上記制御手段により上記第2の撮像手段の
撮像データに基づいて被検出粒子を検出しこの検出に基
づき所定時間ずらしてそれぞれ上記第1の光源の高輝度
切換動作および上記第3の光源の動作をさせることを特
徴とするフローイメージサイトメータ。 - 【請求項9】請求項7記載のフローイメージサイトメー
タにおいて、第1の撮像手段が試料液の流れ上に2次元
の撮像領域を有し、第2の撮像手段が試料液の流れ上に
ライン状の撮像領域を有し、上記第2の撮像手段の撮像
領域が上記第1の撮像手段の撮像領域内で試料液の流れ
を横切るように形成されたことを特徴とするフローイメ
ージサイトメータ。 - 【請求項10】請求項8記載のフローイメージサイトメ
ータにおいて、第1および第3の撮像手段が試料液の流
れ上にそれぞれ2次元の撮像領域を有し、第2の撮像手
段が試料液の流れ上にライン状の撮像領域を有し、第2
の撮像手段の撮像領域が第1および第3の撮像手段の撮
像領域内で試料液の流れを横切るように形成されたこと
を特徴とするフローイメージサイトメータ。 - 【請求項11】請求項9または10記載のフローイメー
ジサイトメータにおいて、第1の光源からの照射光を長
楕円にする手段が設けられたことを特徴とするフローイ
メージサイトメータ。
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