JPH0716392B2 - 細胞融合及び融合細胞選別システム - Google Patents
細胞融合及び融合細胞選別システムInfo
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- JPH0716392B2 JPH0716392B2 JP2284774A JP28477490A JPH0716392B2 JP H0716392 B2 JPH0716392 B2 JP H0716392B2 JP 2284774 A JP2284774 A JP 2284774A JP 28477490 A JP28477490 A JP 28477490A JP H0716392 B2 JPH0716392 B2 JP H0716392B2
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- JP
- Japan
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- cell
- cell fusion
- fusion
- protoplast
- flow
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、２種類の細胞を融合し、目的とする融合細胞
を分取するための装置に関する。
を分取するための装置に関する。
［従来の技術］ 一般に、目的とする融合細胞の選抜法としては、（１）
栄養要求性や薬剤耐性をマーカーとして利用して不要な
細胞を培養の過程で淘汰していく方法、（２）マイクロ
マニピュレーター等を利用して顕微鏡下で個々の目的細
胞をピックアップしていく方法の２つに大別できる。ま
た、最近では一度に大量の細胞を融合処理できる装置が
開発され、それに伴って細胞の高速解析や分取が行なえ
るフローサイトメーターの利用も試みられてきている。
フローサイトメーターを利用した細胞分取技術以外に
も、ヘテロカリオンを効率的に得る目的で様々な装置が
工夫されてきている。その方法は、以下に示すような２
つに大別できる。第１は目的細胞対のみを選択的に融合
する装置である。例えば、特開昭63−160575に見られる
ように、予め２種類の細胞を一対づつ微小容器に入れ細
胞融合剤を添加することにより異種細胞のみが融合でき
るようにした細胞融合装置や、融合剤の代わりに電気パ
ルスによって融合を行なう装置（特開平１−95768号）
が挙げられる。第２は目的細胞のみを選別収集する装置
である。例えば、特開昭63−126480に見られるように、
融合後の細胞懸濁液にレーザー光を照射し、目的細胞が
持つ蛍光を検出器で識別し、目的細胞以外の不要な細胞
に高圧電気パルスを印加して細胞を死滅させる装置や機
械的衝撃を与えて死滅させる装置（特開平１−291781）
が挙げられる。
栄養要求性や薬剤耐性をマーカーとして利用して不要な
細胞を培養の過程で淘汰していく方法、（２）マイクロ
マニピュレーター等を利用して顕微鏡下で個々の目的細
胞をピックアップしていく方法の２つに大別できる。ま
た、最近では一度に大量の細胞を融合処理できる装置が
開発され、それに伴って細胞の高速解析や分取が行なえ
るフローサイトメーターの利用も試みられてきている。
フローサイトメーターを利用した細胞分取技術以外に
も、ヘテロカリオンを効率的に得る目的で様々な装置が
工夫されてきている。その方法は、以下に示すような２
つに大別できる。第１は目的細胞対のみを選択的に融合
する装置である。例えば、特開昭63−160575に見られる
ように、予め２種類の細胞を一対づつ微小容器に入れ細
胞融合剤を添加することにより異種細胞のみが融合でき
るようにした細胞融合装置や、融合剤の代わりに電気パ
ルスによって融合を行なう装置（特開平１−95768号）
が挙げられる。第２は目的細胞のみを選別収集する装置
である。例えば、特開昭63−126480に見られるように、
融合後の細胞懸濁液にレーザー光を照射し、目的細胞が
持つ蛍光を検出器で識別し、目的細胞以外の不要な細胞
に高圧電気パルスを印加して細胞を死滅させる装置や機
械的衝撃を与えて死滅させる装置（特開平１−291781）
が挙げられる。
上記した一般的な方法は、多くの時間と手間がかかる
上、熟練したものでなければ操作が難しいという難点が
あった。また、マイクロマニピュレーターを用いて目的
細胞をピックアップする方法は、精度の面ではフローサ
イトメーターに匹敵するが、その分取速度は1/100以下
であり、実用上問題があった。従って、細胞融合処理後
の細胞懸濁液からフローサイトメーターによって目的融
合細胞だけを分取する方法が、分取精度、速度の両面か
ら適当な方法であるといえる。
上、熟練したものでなければ操作が難しいという難点が
あった。また、マイクロマニピュレーターを用いて目的
細胞をピックアップする方法は、精度の面ではフローサ
イトメーターに匹敵するが、その分取速度は1/100以下
であり、実用上問題があった。従って、細胞融合処理後
の細胞懸濁液からフローサイトメーターによって目的融
合細胞だけを分取する方法が、分取精度、速度の両面か
ら適当な方法であるといえる。
しかし、市販されている装置を用い、植物細胞を材料に
した細胞融合及びこれにより得られた融合細胞懸濁液中
の目的融合細胞をフローサイトメーターで選別する場合
には以下の問題点があった。
した細胞融合及びこれにより得られた融合細胞懸濁液中
の目的融合細胞をフローサイトメーターで選別する場合
には以下の問題点があった。
（１）プロトプラストの単離及びこれを材料にして細胞
融合を行ない、フローサイトメーターによる細胞分取ま
での一連の工程を完了するまでにはかなりの時間を要す
る。
融合を行ない、フローサイトメーターによる細胞分取ま
での一連の工程を完了するまでにはかなりの時間を要す
る。
（２）上記の全ての工程を無菌操作で行なうことは、装
置全体が閉鎖系でないため煩雑な操作を要する。
置全体が閉鎖系でないため煩雑な操作を要する。
［発明が解決しようとする問題点］ 従って、本発明は、簡便な又は自動化された操作によ
り、細胞融合及び融合細胞の選別を行なえる装置であっ
て、系内を容易に無菌状態にすることができるものを提
供することを目的とする。
り、細胞融合及び融合細胞の選別を行なえる装置であっ
て、系内を容易に無菌状態にすることができるものを提
供することを目的とする。
［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、植物融合細胞を短時間で純度良く選抜
する方法を求めて鋭意研究した結果、連続式細胞融合装
置とフローサイトメーターを輸送系で連結し、全体を制
御回路でコントロールするシステムを構築することによ
り、目的とするヘテロカリオンを効率良く迅速に分取す
る有効な手段を見出し本発明を完成するに至った。
する方法を求めて鋭意研究した結果、連続式細胞融合装
置とフローサイトメーターを輸送系で連結し、全体を制
御回路でコントロールするシステムを構築することによ
り、目的とするヘテロカリオンを効率良く迅速に分取す
る有効な手段を見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、プロトプラストに電気刺激を与え
るための２枚の平板電極を備えたフロー式細胞融合チャ
ンバーと、該細胞融合チャンバーの導入側に流路を介し
て接続された、２種類の懸濁プロトプラスト混合液を収
容するための容器と、該細胞融合チャンバーの排出側に
流路を介して接続されたフローサイトメーターと、前記
容器から前記細胞融合チャンバーへの送液及び前記細胞
融合チャンバーから前記フローサイトメーターへの送液
を行なうための手段を具備し、前記細胞融合チャンバ
ー、前記容器及び前記フローサイトメーターは前記流路
を介して閉鎖系を構成しているプロトプラスト細胞融合
及び融合細胞選別システムを提供する。
るための２枚の平板電極を備えたフロー式細胞融合チャ
ンバーと、該細胞融合チャンバーの導入側に流路を介し
て接続された、２種類の懸濁プロトプラスト混合液を収
容するための容器と、該細胞融合チャンバーの排出側に
流路を介して接続されたフローサイトメーターと、前記
容器から前記細胞融合チャンバーへの送液及び前記細胞
融合チャンバーから前記フローサイトメーターへの送液
を行なうための手段を具備し、前記細胞融合チャンバ
ー、前記容器及び前記フローサイトメーターは前記流路
を介して閉鎖系を構成しているプロトプラスト細胞融合
及び融合細胞選別システムを提供する。
［発明の具体的説明］ 以下、送液を行なうための手段が、前記閉鎖系に接続さ
れた加圧手段と、前記流路に設けられ、該加圧手段によ
り加圧される流路を変更するための複数のバルブを有す
るものである、本発明の好ましい一態様の一実施例を図
面に基づき説明する。
れた加圧手段と、前記流路に設けられ、該加圧手段によ
り加圧される流路を変更するための複数のバルブを有す
るものである、本発明の好ましい一態様の一実施例を図
面に基づき説明する。
第１図に示す如く、本発明の装置では、ノズルアームユ
ニット５に支えられたプロトプラストサンプリング用ノ
ズル１が、サンプルディスク６の同一円周上にあるプロ
トプラストＡ及びプロトプラストＢ収容ボトル（3a及び
3b）と、これらのプロトプラストが混合されて分注され
るサンプルボトル２の間を移動できる構造となってい
る。すなわち、1a〜1dは細胞を吸引及び吐出すすための
ノズルで、例えば約1mm程度の内径を持っている。該ノ
ズルは、ノズルアーム5a,5bで支えられ、プロトプラス
ト収容ボトル3a、3b及びサンプルボトル２の位置へ移動
できる構造となっている。それぞれのボトル２、3a、3
b、16には加圧のための上蓋22a〜22dが備えられてお
り、密閉でる構造となっている。サンプルボトル２及び
プロトプラスト収容ボトル3a及び3bには無菌フィルター
７によって浄化された空気が加圧機構８によってマニホ
ールド９を通して分配され加圧される。該加圧機構は、
空気に限られたものではなく、必要に応じて窒素ガス等
でも加圧することが可能である。調製されたプロトプラ
ストを収容するプロトプラスト収容ボトル3a及び3bは、
必要に応じて温度コントロールバス（18a及び18b）によ
ってプロトプラストを安定な状態で維持するために適当
な温度環境にすることが可能である。保温温度は、４〜
40℃の範囲で設定可能であるが、室温以下の低温、例え
ば４℃付近で維持することが望ましい。
ニット５に支えられたプロトプラストサンプリング用ノ
ズル１が、サンプルディスク６の同一円周上にあるプロ
トプラストＡ及びプロトプラストＢ収容ボトル（3a及び
3b）と、これらのプロトプラストが混合されて分注され
るサンプルボトル２の間を移動できる構造となってい
る。すなわち、1a〜1dは細胞を吸引及び吐出すすための
ノズルで、例えば約1mm程度の内径を持っている。該ノ
ズルは、ノズルアーム5a,5bで支えられ、プロトプラス
ト収容ボトル3a、3b及びサンプルボトル２の位置へ移動
できる構造となっている。それぞれのボトル２、3a、3
b、16には加圧のための上蓋22a〜22dが備えられてお
り、密閉でる構造となっている。サンプルボトル２及び
プロトプラスト収容ボトル3a及び3bには無菌フィルター
７によって浄化された空気が加圧機構８によってマニホ
ールド９を通して分配され加圧される。該加圧機構は、
空気に限られたものではなく、必要に応じて窒素ガス等
でも加圧することが可能である。調製されたプロトプラ
ストを収容するプロトプラスト収容ボトル3a及び3bは、
必要に応じて温度コントロールバス（18a及び18b）によ
ってプロトプラストを安定な状態で維持するために適当
な温度環境にすることが可能である。保温温度は、４〜
40℃の範囲で設定可能であるが、室温以下の低温、例え
ば４℃付近で維持することが望ましい。
制御回路10を通してサンプルボトルに一定量づつ分注さ
れたプロトプラスト混合液は、必要に応じて希釈用バッ
ファ液４により適当な細胞密度に希釈される。このよう
にして調製された２種類のプロトプラスト懸濁液12は、
必要に応じて温度コントロールバス18cによって適当な
温度環境下で一時的に保持される。保温温度は４〜40℃
の範囲で設定可能であるが、通常、室温付近で維持され
る。
れたプロトプラスト混合液は、必要に応じて希釈用バッ
ファ液４により適当な細胞密度に希釈される。このよう
にして調製された２種類のプロトプラスト懸濁液12は、
必要に応じて温度コントロールバス18cによって適当な
温度環境下で一時的に保持される。保温温度は４〜40℃
の範囲で設定可能であるが、通常、室温付近で維持され
る。
該プロトプラスト懸濁液12を送液系13aで電気パルスを
与えるためのフローチャンバー14へ送液する。送液量、
送液速度等は全て制御回路10からの指示に従い、該フロ
ーチャンバー内の細胞懸濁液に与える電気的条件等も、
該制御回路によってコントロールされた高周波発振器15
a及びパルス発生器15bによる。
与えるためのフローチャンバー14へ送液する。送液量、
送液速度等は全て制御回路10からの指示に従い、該フロ
ーチャンバー内の細胞懸濁液に与える電気的条件等も、
該制御回路によってコントロールされた高周波発振器15
a及びパルス発生器15bによる。
電気パルスを印加され、融合した細胞処理液は順次、送
液系13bを通って融合処理細胞捕集ボトル16に分注され
ると同時に、新しいプロトプラスト懸濁液が送液系13a
からフローチャンバー14へ導入され、電気パルスの印加
が繰返し連続して行なわれる。
液系13bを通って融合処理細胞捕集ボトル16に分注され
ると同時に、新しいプロトプラスト懸濁液が送液系13a
からフローチャンバー14へ導入され、電気パルスの印加
が繰返し連続して行なわれる。
フロー細胞融合チャンバー14は、２枚の平板電極が適当
な間隔を維持した状態で固定された構造を持ち、各電極
板にはプロトプラスト懸濁液を導入及び排出するための
孔が設けられている。高周波発振器15aについては、周
波数0.5〜2MHz、電界強度500V/cm以下の出力を持ち、パ
ルス発生器15bについては、パルス幅10μ秒〜10ミリ
秒、電界強度2kV/cm以下の矩形又は減衰波直流パルスを
出力することが好ましい。
な間隔を維持した状態で固定された構造を持ち、各電極
板にはプロトプラスト懸濁液を導入及び排出するための
孔が設けられている。高周波発振器15aについては、周
波数0.5〜2MHz、電界強度500V/cm以下の出力を持ち、パ
ルス発生器15bについては、パルス幅10μ秒〜10ミリ
秒、電界強度2kV/cm以下の矩形又は減衰波直流パルスを
出力することが好ましい。
未反応のプロトプラストや複数プロトプラストの融合体
等を含む該融合処理細胞液17も、動作注、必要に応じて
温度コントロールバス18dによって適当な温度環境化で
保管できる。保温温度は、４〜40℃の範囲で設定可能で
あるが、通常４℃付近で保温される。
等を含む該融合処理細胞液17も、動作注、必要に応じて
温度コントロールバス18dによって適当な温度環境化で
保管できる。保温温度は、４〜40℃の範囲で設定可能で
あるが、通常４℃付近で保温される。
該融合処理細胞液は、サンプルボトル２内の混合プロト
プラスト液12全ての融合処理が終了して、融合処理細胞
捕集ボトル16に完全に送液された段階、若しくは融合処
理直後の細胞を直接送液系13bを介してフローサイトメ
ーター19に輸送する。該フローサイトメーターは、一般
に市販されている装置を使用することが可能であるが、
好ましくは制御回路10によってプロトプラスト試料液の
導入等のコントロールが可能なタイプの装置（例えばコ
ールター社製、EPICS−752J改良型等）が良い。適当な
パラメーターを装置の制御部へ設定し、目的とするヘテ
ロカリオンのマーカーとなる蛍光及び散乱光の情報を得
る。他の細胞と識別されたヘテロカリオンをフローサイ
トメーターのソーティング機能を利用して目的融合細胞
捕集ボトルに分取する。
プラスト液12全ての融合処理が終了して、融合処理細胞
捕集ボトル16に完全に送液された段階、若しくは融合処
理直後の細胞を直接送液系13bを介してフローサイトメ
ーター19に輸送する。該フローサイトメーターは、一般
に市販されている装置を使用することが可能であるが、
好ましくは制御回路10によってプロトプラスト試料液の
導入等のコントロールが可能なタイプの装置（例えばコ
ールター社製、EPICS−752J改良型等）が良い。適当な
パラメーターを装置の制御部へ設定し、目的とするヘテ
ロカリオンのマーカーとなる蛍光及び散乱光の情報を得
る。他の細胞と識別されたヘテロカリオンをフローサイ
トメーターのソーティング機能を利用して目的融合細胞
捕集ボトルに分取する。
流路系の切り替えは、制御回路により開閉がコントロー
ルされる電磁弁（23、26、27、28、29、31）と三方バル
ブ（24、25、30、32、33、34）で行ない、全流路系の無
菌化をエタノール等を用いて行なうことが好ましい。
ルされる電磁弁（23、26、27、28、29、31）と三方バル
ブ（24、25、30、32、33、34）で行ない、全流路系の無
菌化をエタノール等を用いて行なうことが好ましい。
上記装置を使用する場合には、先ず、予め個々の予備実
験で細胞融合条件及びフローサイトメーター側の諸条件
を調べておき、適当な条件を制御回路10に入力する。さ
らに、融合する２種類のプロトプラストをサンプルボト
ル２へ分注するための条件、すなわち好ましい細胞密度
になるような各プロトプラスト懸濁液の容量と、必要に
応じて希釈用バッファ液４の容量を入力する。
験で細胞融合条件及びフローサイトメーター側の諸条件
を調べておき、適当な条件を制御回路10に入力する。さ
らに、融合する２種類のプロトプラストをサンプルボト
ル２へ分注するための条件、すなわち好ましい細胞密度
になるような各プロトプラスト懸濁液の容量と、必要に
応じて希釈用バッファ液４の容量を入力する。
システムを稼働させると、入力した条件に従って、プロ
トプラストＡ、Ｂが混合されてサンプルボトルに保持さ
れる。次に該混合プロトプラスト液12は、送液系13aを
通ってフローチャンバー14に送られ、ここで、入力され
たパラメーターに従ってパルス発生器からの電気刺激が
フローチャンバー内のプロトプラスト懸濁液に印加され
る。この電気刺激によってプロトプラストが融合され、
ヘテロカリオンを含む様々な融合体が形成される。融合
処理後の細胞懸濁液は融合処理細胞捕集ボトル16へ送液
された後、設定条件に従って順次フローサイトメーター
19へ送液される。
トプラストＡ、Ｂが混合されてサンプルボトルに保持さ
れる。次に該混合プロトプラスト液12は、送液系13aを
通ってフローチャンバー14に送られ、ここで、入力され
たパラメーターに従ってパルス発生器からの電気刺激が
フローチャンバー内のプロトプラスト懸濁液に印加され
る。この電気刺激によってプロトプラストが融合され、
ヘテロカリオンを含む様々な融合体が形成される。融合
処理後の細胞懸濁液は融合処理細胞捕集ボトル16へ送液
された後、設定条件に従って順次フローサイトメーター
19へ送液される。
フローサイトメーター19では、細胞懸濁液とシース液流
を小口径フローセル・チップから高速で流出させ、該液
流にレーザービームを照射して、細胞から発生する散乱
光、蛍光等のシグナルを検出部で検出し、ヘテロカリオ
ンとそれ以外の細胞を識別した後、ヘテロカリオンを含
む液滴に荷電を与える。荷電された液滴は、偏向プレー
ト通過時に、その極性によって決められた方向に偏向さ
れ目的融合細胞捕集ボトル20にソーティングされる。全
ての融合処理細胞懸濁液の識別分取操作が終了すると、
該捕集ボトルを上蓋22eで外部と遮断された状態のまま
で、他の構成部から外し、無菌条件下で捕集ボトルから
目的融合細胞懸濁液21を取り出すことができる。
を小口径フローセル・チップから高速で流出させ、該液
流にレーザービームを照射して、細胞から発生する散乱
光、蛍光等のシグナルを検出部で検出し、ヘテロカリオ
ンとそれ以外の細胞を識別した後、ヘテロカリオンを含
む液滴に荷電を与える。荷電された液滴は、偏向プレー
ト通過時に、その極性によって決められた方向に偏向さ
れ目的融合細胞捕集ボトル20にソーティングされる。全
ての融合処理細胞懸濁液の識別分取操作が終了すると、
該捕集ボトルを上蓋22eで外部と遮断された状態のまま
で、他の構成部から外し、無菌条件下で捕集ボトルから
目的融合細胞懸濁液21を取り出すことができる。
なお、プロトプラストＡ収容ボトル3aからの液の吸入
は、三方バルブ25をバルブ27側に開き、電磁バルブ27を
開いてボトル3a内を加圧することによって行なうことが
できる。同様にプロトプラストＢ収容ボトル3bからの液
の吸入は、三方バルブ25をバルブ28側に開き、バルブ28
を開いてボトル3b内を加圧することにより行なうことが
できる。ノズル1cからサンプルボトル２内への液の吐出
は、三方バルブ30を三方バルブ32側に開き、三方バルブ
32を電磁バルブ31側に開き、電磁バルブ31を開いて流路
13aを加圧することにより行なうことができる。希釈用
バッファ液４のサンプルボトル２への送液は、電磁バル
ブ26を開き、三方バルブ30を三方バルブ32側に開き、三
方バルブ32を電磁バルブ31側に開き、電磁バルブ31を開
いてバッファ液ボトル内を加圧することによって行なう
ことができる。また、サンプルボトル２からフローチャ
ンバー14への送液は、三方バルブ24をサンプルボトル２
側に開き、三方バルブ32をフローチャンバー側に開きか
つ電磁バルブ31を開いてサンプルボトル２内を加圧する
ことにより行なうことができる。さらに、フローチャン
バー14から融合処理細胞捕集ボトル16への送液は、三方
バルブ33をボトル16側に開いて上記サンプルボトル２か
らフローチャンバー14への送液を行なうことにより行な
うことができる。融合処理細胞捕集ボトル16からフロー
サイトメーター19への送液は、電磁バルブ29を開き、三
方バルブ33をフローサイトメーター19側に開いてボトル
16内を加圧することにより行なうことができる。
は、三方バルブ25をバルブ27側に開き、電磁バルブ27を
開いてボトル3a内を加圧することによって行なうことが
できる。同様にプロトプラストＢ収容ボトル3bからの液
の吸入は、三方バルブ25をバルブ28側に開き、バルブ28
を開いてボトル3b内を加圧することにより行なうことが
できる。ノズル1cからサンプルボトル２内への液の吐出
は、三方バルブ30を三方バルブ32側に開き、三方バルブ
32を電磁バルブ31側に開き、電磁バルブ31を開いて流路
13aを加圧することにより行なうことができる。希釈用
バッファ液４のサンプルボトル２への送液は、電磁バル
ブ26を開き、三方バルブ30を三方バルブ32側に開き、三
方バルブ32を電磁バルブ31側に開き、電磁バルブ31を開
いてバッファ液ボトル内を加圧することによって行なう
ことができる。また、サンプルボトル２からフローチャ
ンバー14への送液は、三方バルブ24をサンプルボトル２
側に開き、三方バルブ32をフローチャンバー側に開きか
つ電磁バルブ31を開いてサンプルボトル２内を加圧する
ことにより行なうことができる。さらに、フローチャン
バー14から融合処理細胞捕集ボトル16への送液は、三方
バルブ33をボトル16側に開いて上記サンプルボトル２か
らフローチャンバー14への送液を行なうことにより行な
うことができる。融合処理細胞捕集ボトル16からフロー
サイトメーター19への送液は、電磁バルブ29を開き、三
方バルブ33をフローサイトメーター19側に開いてボトル
16内を加圧することにより行なうことができる。
実施例 第２図は実験結果を示す細胞の蛍光分布図である。横軸
は緑色蛍光強度、縦軸は赤色蛍光強度を示すものであ
る。使用したプロトプラスト懸濁液は、プロトプラスト
ＡにトウアズキAbrus precatorius L.培養細胞由来のプ
ロトプラストを、プロトプラストＢにはカンゾウ（Glyc
yrrhiza glabra L.var.glandulifera Regel et Herde
r）培養細胞由来のプロトプラストを、それぞれ2.0×10
5個/mlになるようにCaCl2を含む0.4Mのマンニトール溶
液に懸濁したものである。プロトプラストＡは、プロト
プラスト自身にクロロフィルが含有されているため、適
当な励起光の存在で赤色の蛍光を発する。一方、プロト
プラストＢは、選抜のマーカーとなる自家蛍光を有しな
いため、FITC（fluorescein isothiocyanate）による細
胞染色を行なうことによる緑色蛍光マーカーとした。
は緑色蛍光強度、縦軸は赤色蛍光強度を示すものであ
る。使用したプロトプラスト懸濁液は、プロトプラスト
ＡにトウアズキAbrus precatorius L.培養細胞由来のプ
ロトプラストを、プロトプラストＢにはカンゾウ（Glyc
yrrhiza glabra L.var.glandulifera Regel et Herde
r）培養細胞由来のプロトプラストを、それぞれ2.0×10
5個/mlになるようにCaCl2を含む0.4Mのマンニトール溶
液に懸濁したものである。プロトプラストＡは、プロト
プラスト自身にクロロフィルが含有されているため、適
当な励起光の存在で赤色の蛍光を発する。一方、プロト
プラストＢは、選抜のマーカーとなる自家蛍光を有しな
いため、FITC（fluorescein isothiocyanate）による細
胞染色を行なうことによる緑色蛍光マーカーとした。
それぞれのプロトプラストは、予め細胞融合に適した電
気パルスのパルス幅、電界強度等を調べておき、制御回
路でコントロールされた高周波発信器及びパルス発生器
に至適条件をセットした。すなわち、高周波電界条件と
して、200V/cm、0.5MHz、パルス電界条件として1000V/c
m、200μ秒の直流パルスを２回自動的に印加するように
設定した。
気パルスのパルス幅、電界強度等を調べておき、制御回
路でコントロールされた高周波発信器及びパルス発生器
に至適条件をセットした。すなわち、高周波電界条件と
して、200V/cm、0.5MHz、パルス電界条件として1000V/c
m、200μ秒の直流パルスを２回自動的に印加するように
設定した。
また、フローサイトメーターによるセルソーティングの
条件についても予めフローサイトメーター側の制御部に
諸条件を設定しておいた。例えば、第２図に示すよう
に、融合前のプロトプラストＡ及びプロトプラストＢか
ら検出される蛍光は、それぞれ41、42で分布しているこ
とがわかるので、目的の融合細胞は赤色蛍光と緑色蛍光
を合わせ持つ43で示された部分に現われることがわか
る。従って、この部分の細胞のみが分取できる条件を入
力しておいた。
条件についても予めフローサイトメーター側の制御部に
諸条件を設定しておいた。例えば、第２図に示すよう
に、融合前のプロトプラストＡ及びプロトプラストＢか
ら検出される蛍光は、それぞれ41、42で分布しているこ
とがわかるので、目的の融合細胞は赤色蛍光と緑色蛍光
を合わせ持つ43で示された部分に現われることがわか
る。従って、この部分の細胞のみが分取できる条件を入
力しておいた。
以上の準備ができた段階で、第１図に示す上記した装置
を稼働させた結果、全混合プロトプラスト数の約2.5％
の目的融合細胞が得られた。
を稼働させた結果、全混合プロトプラスト数の約2.5％
の目的融合細胞が得られた。
第１図は、本発明の細胞融合及び細胞選別システムの１
実施例を模式的に示す図、 第２図は融合に供したプロトプラスト及び分取すべき細
胞の蛍光分布図である。 １……ノズル、２……サンプルボトル、３……プロトプ
ラスト収容ボトル、４……希釈用バッファ液ボトル、５
……ノズルアーム、６……サンプルディスク、７……滅
菌フィルター、８……加圧機構、９……マニホールド、
10……制御回路、14……フロー細胞融合チャンバー、15
a……高周波発振器、15b……パルス発生器、16……融合
処理細胞捕集ボトル、19……フローサイトメーター、20
……目的融合細胞捕集ボトル、23、26、27、28、29、31
……電磁バルブ、24、25、30、32、33、34……三方バル
ブ
実施例を模式的に示す図、 第２図は融合に供したプロトプラスト及び分取すべき細
胞の蛍光分布図である。 １……ノズル、２……サンプルボトル、３……プロトプ
ラスト収容ボトル、４……希釈用バッファ液ボトル、５
……ノズルアーム、６……サンプルディスク、７……滅
菌フィルター、８……加圧機構、９……マニホールド、
10……制御回路、14……フロー細胞融合チャンバー、15
a……高周波発振器、15b……パルス発生器、16……融合
処理細胞捕集ボトル、19……フローサイトメーター、20
……目的融合細胞捕集ボトル、23、26、27、28、29、31
……電磁バルブ、24、25、30、32、33、34……三方バル
ブ
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−126480（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−111680（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】プロトプラストに電気刺激を与えるための
２枚の平板電極を備えたフロー式細胞融合チャンバー
と、該細胞融合チャンバーの導入側に流路を介して接続
された、２種類の懸濁プロトプラスト混合液を収容する
ための容器と、該細胞融合チャンバーの排出側に流路を
介して接続されたフローサイトメーターと、前記容器か
ら前記細胞融合チャンバーへの送液及び前記細胞融合チ
ャンバーから前記フローサイトメーターへの送液を行な
うための手段を具備し、前記細胞融合チャンバー、前記
容器及び前記フローサイトメーターは前記流路を介して
閉鎖系を構成しているプロトプラスト細胞融合及び融合
細胞選別装置。 - 【請求項２】前記送液を行なうための手段は、前記閉鎖
系に接続された加圧手段と、前記流路に設けられ、該加
圧手段により加圧される流路を変更するための複数のバ
ルブを有する請求項１記載の装置。 - 【請求項３】前記細胞融合チャンバーにおける細胞融合
条件、前記フローサイトメーターにおける細胞選別条件
及び前記送液のための手段が制御回路によって自動制御
される請求項１又は２記載の装置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-161964 | 1990-06-20 | ||
| JP16196490 | 1990-06-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04126081A JPH04126081A (ja) | 1992-04-27 |
| JPH0716392B2 true JPH0716392B2 (ja) | 1995-03-01 |
Family
ID=15745421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2284774A Expired - Lifetime JPH0716392B2 (ja) | 1990-06-20 | 1990-10-23 | 細胞融合及び融合細胞選別システム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0716392B2 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6861265B1 (en) | 1994-10-14 | 2005-03-01 | University Of Washington | Flow cytometer droplet formation system |
| US5602349A (en) * | 1994-10-14 | 1997-02-11 | The University Of Washington | Sample introduction system for a flow cytometer |
| US5602039A (en) * | 1994-10-14 | 1997-02-11 | The University Of Washington | Flow cytometer jet monitor system |
| WO1996012171A2 (en) * | 1994-10-14 | 1996-04-25 | University Of Washington | High speed flow cytometer droplet formation system |
| US5643796A (en) * | 1994-10-14 | 1997-07-01 | University Of Washington | System for sensing droplet formation time delay in a flow cytometer |
| EP2264428B1 (en) | 1997-01-31 | 2017-05-03 | Xy, Llc | Optical apparatus with focussing reflector for converging radiation onto a flow of particles |
| US6248590B1 (en) | 1998-02-27 | 2001-06-19 | Cytomation, Inc. | Method and apparatus for flow cytometry |
| ATE383869T1 (de) | 1998-07-30 | 2008-02-15 | Xy Inc | System zur künstlichen nicht-chirurgischen besamung von pferden |
| AU3768902A (en) | 2000-11-29 | 2002-06-11 | Xy Inc | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| CN1674780A (zh) | 2002-08-01 | 2005-09-28 | Xy公司 | 低压精子分离系统 |
| CA2534394C (en) | 2002-08-15 | 2013-01-08 | Xy, Inc. | High resolution flow cytometer |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
| HUE026838T2 (en) | 2003-03-28 | 2016-07-28 | Inguran Llc | Method for providing sex-sorted animal sperm |
| NZ544103A (en) | 2003-05-15 | 2010-10-29 | Xy Llc | Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems |
| CA2561661C (en) | 2004-03-29 | 2015-11-24 | Monsanto Technology Llc | Sperm suspensions for sorting into x or y chromosome-bearing enriched populations |
| USRE46559E1 (en) | 2004-07-27 | 2017-09-26 | Beckman Coulter, Inc. | Enhancing flow cytometry discrimination with geometric transformation |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0658B2 (ja) * | 1984-11-07 | 1994-01-05 | 株式会社日立製作所 | 細胞取扱い装置 |
| JP2576478B2 (ja) * | 1986-11-14 | 1997-01-29 | 株式会社島津製作所 | 細胞識別収集装置 |
-
1990
- 1990-10-23 JP JP2284774A patent/JPH0716392B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04126081A (ja) | 1992-04-27 |
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