JP2939647B2 - フローイメージングサイトメータにおける自動焦点調整方法 - Google Patents
フローイメージングサイトメータにおける自動焦点調整方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は血液、尿等の試料を適宜の染色液で染色した
ものをフローセルに導いてこのセル内で平面シースフロ
ーを形成させ、ストロボ光をシースフロー流域に照射し
ビデオカメラで撮像された細胞画像を信号処理し分析す
るフローイメージングサイトメトリーに関し、さらに詳
言するとこのサイトメトリーにおける自動焦点調整方法
に関するものである。
ものをフローセルに導いてこのセル内で平面シースフロ
ーを形成させ、ストロボ光をシースフロー流域に照射し
ビデオカメラで撮像された細胞画像を信号処理し分析す
るフローイメージングサイトメトリーに関し、さらに詳
言するとこのサイトメトリーにおける自動焦点調整方法
に関するものである。
平面（フラット）シースフローとして流動する細胞を
撮像し、画像処理技術を利用してこの細胞を自動的に分
類し計数する細胞分析装置は特開昭57−500995号公報、
米国特許第4,338,024号明細書などで公表されてきた。
撮像し、画像処理技術を利用してこの細胞を自動的に分
類し計数する細胞分析装置は特開昭57−500995号公報、
米国特許第4,338,024号明細書などで公表されてきた。
一方、レンズによる物体像を既定の位置に自動的にピ
ントが合った状態で結像させる方法すなわちオートフォ
ーカス方法も公知である。例えば、特公昭42−14096号
公報には、微小面積の光電素子を列設し、隣接する光電
素子の出力差を合計すると合焦時にその出力差の合計値
が最大となることに注目し、この最大点を検出する技法
が記載されている。また、画像そのものの鮮明度を評価
する評価関係もいろいろと知られており、例えば特公昭
58−41485号公報には二乗平均関数を利用することが記
載されている。
ントが合った状態で結像させる方法すなわちオートフォ
ーカス方法も公知である。例えば、特公昭42−14096号
公報には、微小面積の光電素子を列設し、隣接する光電
素子の出力差を合計すると合焦時にその出力差の合計値
が最大となることに注目し、この最大点を検出する技法
が記載されている。また、画像そのものの鮮明度を評価
する評価関係もいろいろと知られており、例えば特公昭
58−41485号公報には二乗平均関数を利用することが記
載されている。
スチルカメラ、ビデオカメラなどでは、連続したフレ
ームで変化がほとんどない画面を取り扱うので、レンズ
また撮像素子群を微動させながら焦点調整することは、
比較的たやすい。
ームで変化がほとんどない画面を取り扱うので、レンズ
また撮像素子群を微動させながら焦点調整することは、
比較的たやすい。
しかしながら、フローイメージングサイトメータにお
ける細胞画像などの撮像に際しては、画像が１フレーム
（1/30秒）ごとに異った画像となり、一画面中に写る細
胞の位置と個数はたえず変化して一定でないので、レン
ズ等を微動させながら同じ画像について比較したり調節
することが困難であり、オートフォーカスを実施するこ
とはたやすいことでなかった。
ける細胞画像などの撮像に際しては、画像が１フレーム
（1/30秒）ごとに異った画像となり、一画面中に写る細
胞の位置と個数はたえず変化して一定でないので、レン
ズ等を微動させながら同じ画像について比較したり調節
することが困難であり、オートフォーカスを実施するこ
とはたやすいことでなかった。
本発明は、以上のような細胞分析技術における問題点
を解決し、迅速かつ適正な焦点調整を行う方法を提供す
るものであり、このため、細胞等の粒子成分を含む試料
液を、フローセル内の流路に沿ってシース液を外層にし
て試料流として流し、フローセルの両側に光照射手段と
撮像手段とを配置したうえ、試料流の静止画像を撮像
し、画像処理により試料流中の粒子成分の分類および計
数等の分析を行うフローイメージングサイトメトリーに
おいて、例えば寸法および形状の揃った粒子を含むコン
トロール用液をフローセルに模擬試料液（ダミー）とし
て流し、フローセルまたは光学測定用部品の位置をステ
ッピングモータ等の微動装置で移動させながら、順次撮
像していきそれらの画像の鮮明度を適確に表わす評価パ
ラメータを算定し、その評価パラメータの値が最大値を
与えるように上記フローセルまたは光学測定用部品の位
置調整を行って最終的に焦点調整を達成することを特色
とするものである。
を解決し、迅速かつ適正な焦点調整を行う方法を提供す
るものであり、このため、細胞等の粒子成分を含む試料
液を、フローセル内の流路に沿ってシース液を外層にし
て試料流として流し、フローセルの両側に光照射手段と
撮像手段とを配置したうえ、試料流の静止画像を撮像
し、画像処理により試料流中の粒子成分の分類および計
数等の分析を行うフローイメージングサイトメトリーに
おいて、例えば寸法および形状の揃った粒子を含むコン
トロール用液をフローセルに模擬試料液（ダミー）とし
て流し、フローセルまたは光学測定用部品の位置をステ
ッピングモータ等の微動装置で移動させながら、順次撮
像していきそれらの画像の鮮明度を適確に表わす評価パ
ラメータを算定し、その評価パラメータの値が最大値を
与えるように上記フローセルまたは光学測定用部品の位
置調整を行って最終的に焦点調整を達成することを特色
とするものである。
本発明の実施例について、以下添付図を参照しながら
詳述する。
詳述する。
本発明によるフローイメージングサイトメトリーあっ
ては、細胞等の画像に対するピントの合い具合を表わす
評価パラメータとして、画像の局所における微分値を画
面全体にわたって合計した累算値を用いる。この画像の
局所における微分値を求めるためのオペレータ（演算
子）の例として、第１図（ｂ）に示すSobelオペレータ
を用いることにする。第１（ａ）に示したような着目す
る画素Xijの周囲３×３＝９画素分の各データに対応す
る係数として、水平方向、垂直方向のSobelオペレータ
を上記画素に乗じて９画素分の値をもって着目する画素
点Xijに対応する新たな値とする。このことを３×３コ
ンボル−ションといい、画面全体のすべての画素につい
てのこのような新たな値を算出する。
ては、細胞等の画像に対するピントの合い具合を表わす
評価パラメータとして、画像の局所における微分値を画
面全体にわたって合計した累算値を用いる。この画像の
局所における微分値を求めるためのオペレータ（演算
子）の例として、第１図（ｂ）に示すSobelオペレータ
を用いることにする。第１（ａ）に示したような着目す
る画素Xijの周囲３×３＝９画素分の各データに対応す
る係数として、水平方向、垂直方向のSobelオペレータ
を上記画素に乗じて９画素分の値をもって着目する画素
点Xijに対応する新たな値とする。このことを３×３コ
ンボル−ションといい、画面全体のすべての画素につい
てのこのような新たな値を算出する。
すなわち、着目した画素点について水平方向、垂直方
向に微分した値としてそれぞれ、 に従って新たな値が算出される。画面中の粒子の写って
いないバックグラウンドの部分では、この新たな値はほ
ぼ０となるが、粒子が画面内に入ってくるとその輪郭部
における演算値はピントが合ってコントラストが強くな
るほど大きな値となる。従って、このような演算値を画
面全体にわたって累算した値をピントの合い具合を示す
評価パラメータとして利用することができる。
向に微分した値としてそれぞれ、 に従って新たな値が算出される。画面中の粒子の写って
いないバックグラウンドの部分では、この新たな値はほ
ぼ０となるが、粒子が画面内に入ってくるとその輪郭部
における演算値はピントが合ってコントラストが強くな
るほど大きな値となる。従って、このような演算値を画
面全体にわたって累算した値をピントの合い具合を示す
評価パラメータとして利用することができる。
本発明は、前述したように寸法と形状の揃った精度管
理用コントロール粒子を含む液をフローセルに導いて、
この粒子の写った画像を処理することによりピント調整
をして、実際の多様な粒子成分を含む試料の分類分析に
おける精度の向上を図る。この場合、１画面（フレー
ム）中に写る粒子の数は、低倍率時に数10個、高倍率時
には数個と少なく、従って１画面の累積微分値は他の画
面と対比したとき大きくばらつきを生ずる。
理用コントロール粒子を含む液をフローセルに導いて、
この粒子の写った画像を処理することによりピント調整
をして、実際の多様な粒子成分を含む試料の分類分析に
おける精度の向上を図る。この場合、１画面（フレー
ム）中に写る粒子の数は、低倍率時に数10個、高倍率時
には数個と少なく、従って１画面の累積微分値は他の画
面と対比したとき大きくばらつきを生ずる。
そこで、１画面に対する累積微分値を、数フレームな
いし数10フレーム分合計した値を最終的な評価パラメー
タとするが、このパラメータＰは次式による： 上式の評価パラメータを計算する式においてsbx,sby
を２乗しているのはピントの合い具合の感度およびＱ値
を高めるために有効であり、ｋなる係数はオーバーフロ
ーを防ぐための値とする。
いし数10フレーム分合計した値を最終的な評価パラメー
タとするが、このパラメータＰは次式による： 上式の評価パラメータを計算する式においてsbx,sby
を２乗しているのはピントの合い具合の感度およびＱ値
を高めるために有効であり、ｋなる係数はオーバーフロ
ーを防ぐための値とする。
評価パラメータＰの求め方として、この他にラプラシ
アンオペレータを用いる方法がある。第１図（Ｃ）に２
種類のラプラシアンオペレータ（Ｃ−１），（Ｃ−２）
が示されている。ラプラシアンオペレータ（Ｃ−１）を
用いたとき、３×3convolusionは次の値となる。
アンオペレータを用いる方法がある。第１図（Ｃ）に２
種類のラプラシアンオペレータ（Ｃ−１），（Ｃ−２）
が示されている。ラプラシアンオペレータ（Ｃ−１）を
用いたとき、３×3convolusionは次の値となる。
また、ラプラシアンオペレータ（Ｃ−２）を用いると、 式（４）または（５）を用いて評価パラメータＰを求め
る場合、次式による。
る場合、次式による。
または ここに、ｈは定数である。
Sobel法では水平方向のオペレータを使った微分値Sb
Xijと垂直方向のオペレータを使った微分値Sb Yijをそ
れぞれ求め、式（３）により評価パラメータＰを算出し
たが、Laplace法によれば１ステップの計算を省略でき
ることがわかる。
Xijと垂直方向のオペレータを使った微分値Sb Yijをそ
れぞれ求め、式（３）により評価パラメータＰを算出し
たが、Laplace法によれば１ステップの計算を省略でき
ることがわかる。
サイトメータに備設した画像処理部で画像データをリ
アルタイム処理することにより上記評価パラメータを求
めるが、１画面についてフローセルまたはレンズを微動
させながら評価パラメータをプロットすると、第２図の
ようになる。最大値の点がピントの合った位置である。
前記式３の評価パラメータは第３図示の画像処理部で求
められる。さらに、第３図の核となる画像処理プロセッ
サボードの回路例を第４図に示す。先にも述べたよう
に、モホロジープロセッサボードは、細胞画像を処理す
るために必要な一般的機能を搭載したボードであって、
画像の焦点調整のために特別に搭載するというものでは
ない。以下に１フィールド（1/60秒）を１ステップとし
た複数画面分の評価パラメータの求め方を示す。
アルタイム処理することにより上記評価パラメータを求
めるが、１画面についてフローセルまたはレンズを微動
させながら評価パラメータをプロットすると、第２図の
ようになる。最大値の点がピントの合った位置である。
前記式３の評価パラメータは第３図示の画像処理部で求
められる。さらに、第３図の核となる画像処理プロセッ
サボードの回路例を第４図に示す。先にも述べたよう
に、モホロジープロセッサボードは、細胞画像を処理す
るために必要な一般的機能を搭載したボードであって、
画像の焦点調整のために特別に搭載するというものでは
ない。以下に１フィールド（1/60秒）を１ステップとし
た複数画面分の評価パラメータの求め方を示す。
第３図および第４図において、ｉ）、ビデオ信号アナ
ログ／デジタル変換ボードであるA/DボードでA/D変換さ
れた奇数フィールド画面のデータを画像データバスＣを
介してモホロジープロセッサボードMPのプロセスチャン
ネル２に入力し、水平方向の微分値（sbx）2/kをリアル
タイムに求めそのデータを画像データバスＥを介してワ
ーキングメモリWMに記憶させていく。ii）、A/Dボード
でアナログ／デジタルに変換された偶数フィールド画面
のデータを画像データバスＣを介してモホロジープロセ
ッサMPのプロセスチャンネル２に入力し、垂直方向の微
分値（sby）2/kを求め、そのデータを画像データバスＥ
を介してプロセスチャンネル１に入力させ、同時にワー
キングメモリに記憶されている（sbx）2/kのデータを画
像バスへ読み出し、プロセスチャンネル１に入力させて
ALUに加算させ、ヒストグラマーでこの加算値のヒスト
グラムをリアルタイムに作成させる。iii）、デジタル
シグナルプロセッサボード内のデジタル信号プロセッサ
DSPで、ii）のステップで作成された第５図に示すよう
なヒストグラムの結果を積算させ、１画面（フレーム）
に対する評価パラメータを求める。
ログ／デジタル変換ボードであるA/DボードでA/D変換さ
れた奇数フィールド画面のデータを画像データバスＣを
介してモホロジープロセッサボードMPのプロセスチャン
ネル２に入力し、水平方向の微分値（sbx）2/kをリアル
タイムに求めそのデータを画像データバスＥを介してワ
ーキングメモリWMに記憶させていく。ii）、A/Dボード
でアナログ／デジタルに変換された偶数フィールド画面
のデータを画像データバスＣを介してモホロジープロセ
ッサMPのプロセスチャンネル２に入力し、垂直方向の微
分値（sby）2/kを求め、そのデータを画像データバスＥ
を介してプロセスチャンネル１に入力させ、同時にワー
キングメモリに記憶されている（sbx）2/kのデータを画
像バスへ読み出し、プロセスチャンネル１に入力させて
ALUに加算させ、ヒストグラマーでこの加算値のヒスト
グラムをリアルタイムに作成させる。iii）、デジタル
シグナルプロセッサボード内のデジタル信号プロセッサ
DSPで、ii）のステップで作成された第５図に示すよう
なヒストグラムの結果を積算させ、１画面（フレーム）
に対する評価パラメータを求める。
汎用の高速マイクロプロセッサまたはデジタルシグナ
ルプロセッサを用いた場合、１画面を256×256画素とす
ると、１画面の処理に１秒程度かかり、20画面分の評価
パラメータ値を得るには約20秒を要することになる。さ
らに、実際にはレンズあるいはフローセルを移動させな
がらピント調整を行うのでこれよりも長時間を要するこ
とになる。一方、1/30秒ごとに出現する１画面に対して
リアルタイムに評価パラメータを求める場合、20画面分
の評価パラメータを得るのに20/30秒を要する。このた
め、高速の乗算器と累積加算器を内蔵したデジタルフィ
ルタ、すなわち後述する３×３コンボルーションフィル
タを用いてピント調整のための評価値を求めることが好
適である。また、同時にiii）と併行して、次の画面に
対してｉ）のステップと同様の処理をする。iv）、次の
画面に対してステップii）と同様の処理をする。ｖ）、
次の画面に対してステップiii）と同様の処理をしてか
ら、さらに最初の画面の評価パラメータと次の画面の評
価パラメータとを加算する。これと同時に、次々画面に
対してステップｉ）と同じ処理をする。以下同様にし
て、次々画面も処理していく。
ルプロセッサを用いた場合、１画面を256×256画素とす
ると、１画面の処理に１秒程度かかり、20画面分の評価
パラメータ値を得るには約20秒を要することになる。さ
らに、実際にはレンズあるいはフローセルを移動させな
がらピント調整を行うのでこれよりも長時間を要するこ
とになる。一方、1/30秒ごとに出現する１画面に対して
リアルタイムに評価パラメータを求める場合、20画面分
の評価パラメータを得るのに20/30秒を要する。このた
め、高速の乗算器と累積加算器を内蔵したデジタルフィ
ルタ、すなわち後述する３×３コンボルーションフィル
タを用いてピント調整のための評価値を求めることが好
適である。また、同時にiii）と併行して、次の画面に
対してｉ）のステップと同様の処理をする。iv）、次の
画面に対してステップii）と同様の処理をする。ｖ）、
次の画面に対してステップiii）と同様の処理をしてか
ら、さらに最初の画面の評価パラメータと次の画面の評
価パラメータとを加算する。これと同時に、次々画面に
対してステップｉ）と同じ処理をする。以下同様にし
て、次々画面も処理していく。
１フレーム画面は奇数フィールド画面と偶数フィール
ド画面との和であるから（式３）の微分値sbx,sbyは、
プロセスチャンネル２の３×３コンボルータ（第４図）
として使用するFIRフィルタで、リアルタイムに求める
ことができ、さらに上記両微分値を２乗してから1/kに
する処理は、ルップアップテーブルLUT3でリアルタイム
で行うことができる。
ド画面との和であるから（式３）の微分値sbx,sbyは、
プロセスチャンネル２の３×３コンボルータ（第４図）
として使用するFIRフィルタで、リアルタイムに求める
ことができ、さらに上記両微分値を２乗してから1/kに
する処理は、ルップアップテーブルLUT3でリアルタイム
で行うことができる。
上記評価パラメータＰを用いた実際の焦点調整アルゴ
リズムについて以下に説明する。基本的なねらいを効率
よく正確な焦点調整におき、倍率を変えて撮像する必要
のあるシステムについて、ピント調整の概略フローを第
６図に従って説明する。本発明におけるピント調整は、
粗調整工程と微調整行程の２段階に分けられる。
リズムについて以下に説明する。基本的なねらいを効率
よく正確な焦点調整におき、倍率を変えて撮像する必要
のあるシステムについて、ピント調整の概略フローを第
６図に従って説明する。本発明におけるピント調整は、
粗調整工程と微調整行程の２段階に分けられる。
先ずフローセルにコントロール用液を流してビデオカ
メラにより撮像し、低倍率側での画像の評価パラメータ
初期値Po1を求める。この場合、フローセルまたはレン
ズを微動させながら数フレーム分ごとの累積微分値を求
めるが、微調整時には上記微動のスピードを余り速める
ことができないが、粗調整時には微動スピードを速める
ことができ、ピントが大きく外れていると判定されたと
きすなわち微調整領域か粗調整領域かの境界を与えるス
レシホールドth1に対して、Po1＜th1の時は、微動スピ
ードの速い粗調整をなすSTEP1を経ることによって、よ
り一層早く微調整領域にもっていく必要がある。
メラにより撮像し、低倍率側での画像の評価パラメータ
初期値Po1を求める。この場合、フローセルまたはレン
ズを微動させながら数フレーム分ごとの累積微分値を求
めるが、微調整時には上記微動のスピードを余り速める
ことができないが、粗調整時には微動スピードを速める
ことができ、ピントが大きく外れていると判定されたと
きすなわち微調整領域か粗調整領域かの境界を与えるス
レシホールドth1に対して、Po1＜th1の時は、微動スピ
ードの速い粗調整をなすSTEP1を経ることによって、よ
り一層早く微調整領域にもっていく必要がある。
上記スレシホールドth1は例えば次のようにして決定
する。ピント調整しようとする装置が初めて調整を受け
る場合には、同型式の調整ずみの他の数台の装置におけ
る温度、シース圧力を実用範囲内で最大限度まで変化さ
せた時の評価パラメータの平均値と平均変動率とを求め
ておき、この平均値に例えば0.9を乗じた値をth1の初期
値とする。一度ピント調整のすんだ装置に対し再調整す
る場合のth1は、初回調整時または前回調整時の評価パ
ラメータ値Pp1を使って次式により求める。
する。ピント調整しようとする装置が初めて調整を受け
る場合には、同型式の調整ずみの他の数台の装置におけ
る温度、シース圧力を実用範囲内で最大限度まで変化さ
せた時の評価パラメータの平均値と平均変動率とを求め
ておき、この平均値に例えば0.9を乗じた値をth1の初期
値とする。一度ピント調整のすんだ装置に対し再調整す
る場合のth1は、初回調整時または前回調整時の評価パ
ラメータ値Pp1を使って次式により求める。
th1＝Pp1（１−平均変動率）×0.9 このように、th1を決定することにより、一度ピント調
整された装置に対する再調整ではほとんどの場合、粗調
整をとばしてSTEP2の微調整からが始められる。
整された装置に対する再調整ではほとんどの場合、粗調
整をとばしてSTEP2の微調整からが始められる。
以上を前提として本発明における焦点調整行程をまと
めると第６図のようになるが、各手順を示すと次のとう
りである。
めると第６図のようになるが、各手順を示すと次のとう
りである。
（１）コントロール用液をフローセルに流す。
（２）低倍率側で評価パラメータの初期値Po1を求め
る。
る。
（３）その評価パラメータの初期値Po1と所定値Th1とを
比較し、 Po1＜Th1ならSTEP1へ Po1≧Th1ならSTEP1をとばしてSTEP2へ （４）STEP1 低倍率側でのピントの粗調整 フローセルを移動させながら評価パラメータPnを求
め、 Pn≧Th1になればSTEP2へ （５）STEP2 低倍率側でのピントの微調整 フローセルを移動させながら評価パラメータPnを求
め、評価パラメータPnが最大となる位置にフローセルを
移動させる。
比較し、 Po1＜Th1ならSTEP1へ Po1≧Th1ならSTEP1をとばしてSTEP2へ （４）STEP1 低倍率側でのピントの粗調整 フローセルを移動させながら評価パラメータPnを求
め、 Pn≧Th1になればSTEP2へ （５）STEP2 低倍率側でのピントの微調整 フローセルを移動させながら評価パラメータPnを求
め、評価パラメータPnが最大となる位置にフローセルを
移動させる。
（６）STEP3 高倍率側でのピントの微調整及び確認 第７図は、上記調整手順をSTEP1,2,3を通じて適用可
能とする調整アルゴリズムを示すものである。これは、
各ステップに対し６フレームで約180個の粒子が写る画
像につき調整エラーと判定されたときの異常例をも扱
う。STEP1を要する調整時間は0.5〜11秒であった。
能とする調整アルゴリズムを示すものである。これは、
各ステップに対し６フレームで約180個の粒子が写る画
像につき調整エラーと判定されたときの異常例をも扱
う。STEP1を要する調整時間は0.5〜11秒であった。
次に、低倍率時でピントが少しずれている時は、上記
調整アルゴリズムにおいてSTEP2が次の手順で行われ
る。このSTEP2の調整時間には６〜７秒要する。
調整アルゴリズムにおいてSTEP2が次の手順で行われ
る。このSTEP2の調整時間には６〜７秒要する。
STEP2（微調整）Po≧th1 右方向に６フレーム当たり1t/5連続移動させながら、
６フレーム分ごとのPnを求めていく。
６フレーム分ごとのPnを求めていく。
Pn＜th1になりかつ４ポイント以上のPnを得たら右方
向の連続移動をストップさせる。
向の連続移動をストップさせる。
左方向にと同様に６フレーム当たり1t/5連続移動さ
せながら、６フレーム分ごとのPnを求めていく。
せながら、６フレーム分ごとのPnを求めていく。
Pn＜th1になったら左方向の連続移動をストップさせ
る。
る。
とで求めた各ポイントのＰの値をスムージング処
理して、 ・バックラッシュがどのくらいあるか求める。
理して、 ・バックラッシュがどのくらいあるか求める。
・Ｐが最大となるポイントを求める。
で求めたポイントへ、バッククラッシュを考慮して
移動させる。
移動させる。
その位置での30フレーム分のＰの値を求めて、その値
Pp1と位置Ps1を記憶しておく。
Pp1と位置Ps1を記憶しておく。
Pp1が規定値Pp1sより小さい時、調整エラー２とす
る。
る。
STEP3へ 次に、低倍率側でピント調整をした後、高倍率側で微
調整を行うSTEP3は次のような手順に従う。
調整を行うSTEP3は次のような手順に従う。
STEP3高倍率側での微調整 高倍率側に切換えて、低倍率側で調整されたポイント
での30フレーム分のPohを求める。（30フレームで約60
個の粒子） Poh≧thh（高倍率側スレシホールド）の確認 Poh＜thhなら調整エラー３とする。
での30フレーム分のPohを求める。（30フレームで約60
個の粒子） Poh≧thh（高倍率側スレシホールド）の確認 Poh＜thhなら調整エラー３とする。
右方向に30フレーム当たり1th/5連続移動させながら3
0フレーム分ごとのPnhを求めていく。
0フレーム分ごとのPnhを求めていく。
Pnh＜thhになったら連続移動ストップ。
左方向にと同様に30フレーム当たり1th/5連続移動
させながら30フレーム分ごとのPnhを求めていく。
させながら30フレーム分ごとのPnhを求めていく。
で得られた各ポイントのＰの値をスムージング処理
して、Ｐが最大となるポイントを求める。
して、Ｐが最大となるポイントを求める。
で求めたポイントへ、バッククラッシュを考慮して
移動させる。
移動させる。
その位置での90フレーム分のＰの値を求めて、その値
Pphと位置Pshを記憶しておく。
Pphと位置Pshを記憶しておく。
Pphが既定値Pphsより小さい時、調整エラー４とす
る。
る。
低倍率に切換えて、高倍率側で調整されたポイントで
の30フレーム分のPo1を求める。
の30フレーム分のPo1を求める。
STEP2で求めたPp1と比較してPo1＜k2 Pp1の時調整エ
ラー５とする。（k2≒0.8〜0.85） 初回ピント調整時、前々回調整時、前回調整時および
今回調整時のPp1,Pph,Ps1,Pshを比較チェックして、そ
れらの差が規定値を超えている時は、調整エラー６とす
る。
ラー５とする。（k2≒0.8〜0.85） 初回ピント調整時、前々回調整時、前回調整時および
今回調整時のPp1,Pph,Ps1,Pshを比較チェックして、そ
れらの差が規定値を超えている時は、調整エラー６とす
る。
上記STEP3の調整に要した時間は28〜32秒であった。
以上の各STEPで派生したピント調整エラーはそれぞれ
次のような原因によるものと考えられる。
次のような原因によるものと考えられる。
１）調整エラー１ ・ステッピングモータによる駆動機構の異常。
・流体系の異常で、フローセルにコントロール粒子が正
常に流れない。ノズルのつまり等。
常に流れない。ノズルのつまり等。
２）調整エラー２ ・フローセル内を流れるサンプル流の位置がくるってい
る。
る。
・フローセル内を流れるサンプル流の厚みが厚過ぎる。
・ストロボの劣化。
３）調整エラー３ ・フローセル内を流れるサンプル流の中心位置が、低倍
率時と高倍率時とで厚み方向に変動する。
率時と高倍率時とで厚み方向に変動する。
・フローセル内を流れるサンプル流の厚みが厚過ぎる。
４）調整エラー４ ・フローセル内を流れるサンプル流の厚みが厚過ぎる。
・ストロボの劣化。
５）調整エラー５ ・フローセル内を流れるサンプル流の中心位置が、低倍
率時と高倍率時とで厚み方向に変動する。
率時と高倍率時とで厚み方向に変動する。
６）調整エラー６ ・フローセルまたはレンズ駆動部のゆるみ、摩耗。
・ストロボの劣化。
・レンズ，フローセル等にホコリが付着。
・フローセル内壁面の汚れ。
本発明の調整方法によれば、試料流の静止画像を1/30
秒ごとに撮像しているため、同一の画面は生じない。こ
れら時時刻刻変わっていく画像を用いて評価パラメータ
を求めるから、画面ごとの評価パラメータは大きくばら
つくが複数フレーム分の評価パラメータを足し合わせた
値を評価パラメータとすれば、大数の法則により複数フ
レームの画面間のばらつきを吸収させ、画像の特徴を顕
著化し細胞像の合焦状態を適確に反映することができ
る。
秒ごとに撮像しているため、同一の画面は生じない。こ
れら時時刻刻変わっていく画像を用いて評価パラメータ
を求めるから、画面ごとの評価パラメータは大きくばら
つくが複数フレーム分の評価パラメータを足し合わせた
値を評価パラメータとすれば、大数の法則により複数フ
レームの画面間のばらつきを吸収させ、画像の特徴を顕
著化し細胞像の合焦状態を適確に反映することができ
る。
フローセルやレンズを連続的に移動させながら、評価
パラメータの値をリアルタイムで求めその値の最大値の
位置を迅速に求める。また、まず、低倍率側でピントを
粗調整し高倍率側で微調整をすることで調整の所要時間
を短縮し得る。
パラメータの値をリアルタイムで求めその値の最大値の
位置を迅速に求める。また、まず、低倍率側でピントを
粗調整し高倍率側で微調整をすることで調整の所要時間
を短縮し得る。
なお、焦点調整ごとに得られた評価パラメータの最大
値をその都度記憶しておくと、その変動の監視によって
システムの異常を発見することができる。
値をその都度記憶しておくと、その変動の監視によって
システムの異常を発見することができる。
本発明方法は、以上に述べたところから次のような諸
効果を達成し得る。
効果を達成し得る。
（１）複数フレーム分の画面を使って評価パラメータを
求め、その際、精度管理用コントロール粒子を焦点調整
に流用することで、比較的短時間内に粗調整と微調整を
効率よく高精度で遂行できる。
求め、その際、精度管理用コントロール粒子を焦点調整
に流用することで、比較的短時間内に粗調整と微調整を
効率よく高精度で遂行できる。
（２）倍率切換の行程をさらに加えて、一画面中に多数
の粒子が写る低倍率側でまずピントの粗調整を、次で高
倍率側でピントの微（精）調整を行い効率をより一層向
上できる。
の粒子が写る低倍率側でまずピントの粗調整を、次で高
倍率側でピントの微（精）調整を行い効率をより一層向
上できる。
（３）ピントの合ったと判定された位置での評価パラメ
ータ値を記憶しておくことにより、この値の変動を監視
してシステムの異常を検知することができる。
ータ値を記憶しておくことにより、この値の変動を監視
してシステムの異常を検知することができる。
（４）本来的に細胞画像を処理するための細胞分析シス
テムのハードウェアをそのまゝ利用する、換言すれば焦
点調整のために別個のハードウェアを付加する必要はな
いから、上述の諸効果の実現に際してコストを最小限に
抑えることができる。
テムのハードウェアをそのまゝ利用する、換言すれば焦
点調整のために別個のハードウェアを付加する必要はな
いから、上述の諸効果の実現に際してコストを最小限に
抑えることができる。
添付図は本発明の実施例を説明するためのもので、第１
図（ａ），（ｂ）は画像の評価パラメータを求める際の
原画像データ、Sobelオペレータの例、第１図（Ｃ）の
（Ｃ−１），（Ｃ−２）はラプラシアンオペレータの
例、第２図は評価パラメータ曲線の例、第３図はイメー
ジングフローサイトメータ用の画像処理システムの実施
例、第４図は第３図のシステムに用いるのに好適なモホ
ロジープロセッサボードのブロック回路例、第５図は評
価パラメータのヒストグラム例、第６図はピント調整の
基本フローダイアグラム、第７図はピント粗調整の基本
フローダイアグラムを示す。
図（ａ），（ｂ）は画像の評価パラメータを求める際の
原画像データ、Sobelオペレータの例、第１図（Ｃ）の
（Ｃ−１），（Ｃ−２）はラプラシアンオペレータの
例、第２図は評価パラメータ曲線の例、第３図はイメー
ジングフローサイトメータ用の画像処理システムの実施
例、第４図は第３図のシステムに用いるのに好適なモホ
ロジープロセッサボードのブロック回路例、第５図は評
価パラメータのヒストグラム例、第６図はピント調整の
基本フローダイアグラム、第７図はピント粗調整の基本
フローダイアグラムを示す。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 15/00 -15/14
Claims (4)
- 【請求項１】細胞等の粒子成分を含む試料液をシース液
で挟んでフローセルの流路に流し、上記フローセルの両
側に配置された照光手段と撮像手段とによって試料流の
静止画像を撮像し、画像処理により上記試料液中に粒子
成分の分類、計数等の分析を行うフローイメージングサ
イトメータにおいて、上記フローセルに対して寸法、形
状の揃った粒子を含む精度管理用液を導入し、上記フロ
ーセルを移動せしめながら上記液の静止画像を撮像し、
上記画像の鮮明度を表す評価パラメータを算出し、該評
価パラメータの値を最大ならしめるように位置調整を行
うことによって、試料流に対する焦点調整を行うこと、
を特徴とするフローイメージングサイトメータにおける
自動焦点調整方法。 - 【請求項２】請求項１の方法において、上記精度管理用
液をフローセルに流した時、上記評価パラメータの初期
値Poと所定基準値thとを比較し、Po＜thのとき上記フロ
ーセルの位置を移動させながら評価パラメータPnを求め
てPo＞thの状態となし、上記評価パラメータPnが最大値
となる位置に位置設定すること、を特徴とするフローイ
メージングサイトメータにおける自動焦点調整方法。 - 【請求項３】請求項１ないし２のいずれかに記載の方法
において、上記評価パラメータを先ず光学系の低倍率側
で算出し、該評価パラメータが最大値となったとき上記
光学系の高倍率側でさらに評価パラメータを最大ならし
めること、を特徴とするフローイメージングサイトメー
タにおける自動焦点調整方法。 - 【請求項４】請求項１ないし３のいずれかに記載の方法
において、上記評価パラメータの最大値を記憶し、該評
価パラメータの最大値の変動を監視することによって測
定系の異常を検知するようにしたこと、を特徴とするフ
ローイメージングサイトメータにおける自動焦点調整方
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2195934A JP2939647B2 (ja) | 1990-07-24 | 1990-07-24 | フローイメージングサイトメータにおける自動焦点調整方法 |
| US07/633,783 US5083014A (en) | 1990-07-24 | 1990-12-26 | Automatic focal-point adjustment method in flow imaging cytometer |
| EP90125596A EP0468100B1 (en) | 1990-07-24 | 1990-12-27 | Automatic focal-point adjustment method in flow imaging cytometer |
| DE69017675T DE69017675T2 (de) | 1990-07-24 | 1990-12-27 | Verfahren zur automatischen Brennpunktregelung in einem "Strömungsabbildungscytometer". |
| CA002039897A CA2039897C (en) | 1990-07-24 | 1991-04-05 | Automatic focal-point adjustment method in flow imaging cytometer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2195934A JP2939647B2 (ja) | 1990-07-24 | 1990-07-24 | フローイメージングサイトメータにおける自動焦点調整方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0481640A JPH0481640A (ja) | 1992-03-16 |
| JP2939647B2 true JP2939647B2 (ja) | 1999-08-25 |
Family
ID=16349405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2195934A Expired - Fee Related JP2939647B2 (ja) | 1990-07-24 | 1990-07-24 | フローイメージングサイトメータにおける自動焦点調整方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5083014A (ja) |
| EP (1) | EP0468100B1 (ja) |
| JP (1) | JP2939647B2 (ja) |
| CA (1) | CA2039897C (ja) |
| DE (1) | DE69017675T2 (ja) |
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| WO2010140460A1 (ja) * | 2009-06-03 | 2010-12-09 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | フロー式粒子画像解析方法及び装置 |
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| US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
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| EP2283724B8 (en) | 2002-08-01 | 2016-03-16 | Xy, Llc | Heterospermic insemination to assess sperm function |
| US7855078B2 (en) | 2002-08-15 | 2010-12-21 | Xy, Llc | High resolution flow cytometer |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
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| NZ544103A (en) | 2003-05-15 | 2010-10-29 | Xy Llc | Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems |
| PT2151243E (pt) | 2004-03-29 | 2013-01-25 | Inguran Llc | Suspensões de esperma para separação em populações enriquecidas carregando o cromossoma x ou y |
| EP2269617B1 (en) | 2004-07-22 | 2016-04-27 | Inguran, LLC | Process for enriching a population of sperm cells |
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- 1990-12-27 EP EP90125596A patent/EP0468100B1/en not_active Expired - Lifetime
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