ES2331679B1 - Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la deteccion y cuantificacion de secuencias de adn especificas de brucella spp. - Google Patents
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Abstract
Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y
kit para la detección y cuantificación de secuencias de ADN
específicas de Brucella spp.
La presente invención se refiere a un conjunto
de cebadores, sonda, procedimiento y kit de diagnóstico molecular
de Brucella spp., y más concretamente para la detección de
ADN específico de gérmenes del género Brucella en muestras
clínicas basada en la amplificación y cuantificación de ADN mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. La
técnica es mucho más sensible que la PCR convencional, la
PCR-ELISA (PCR acoplada a un enzimoinmunoensayo),
los métodos bacteriológicos, y más específica que los métodos
serológicos habituales, permitiendo su utilización para la puesta
en práctica de un procedimiento fácil y rápido de diagnóstico
molecular de la infección por Brucella spp. en suero
sanguíneo y en otras muestras clínicas.
Description
Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y
kit para la detección y cuantificación de secuencias de ADN
específicas de Brucella spp..
La presente invención se refiere a un conjunto
de cebadores, sonda, procedimiento y kit de diagnóstico molecular
de Brucella spp., y más concretamente para la detección de
ADN específico de gérmenes del género Brucella en muestras
clínicas basada en la amplificación y cuantificación de ADN
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo
real.
La brucelosis es una zoonosis de distribución
mundial que provoca una alta morbilidad en humanos. La enfermedad
es endémica en amplias zonas del planeta. Los gérmenes del género
Brucella son capaces de sobrevivir e incluso multiplicarse
dentro de las células del sistema mononuclear fagocítico lo cual
explica la marcada tendencia de la enfermedad a producir
complicaciones e incluso recaídas una vez concluido el tratamiento.
Algunas de las complicaciones de la brucelosis son muy graves
pudiendo conducir a la muerte del paciente. Se ha demostrado que la
aparición de complicaciones se relaciona significativamente con una
demora en el diagnóstico de la infección [Colmenero J.D. et
al., 1996, Medicine (Baltimore), 75:
195-211].
Debido a lo heterogéneo y escasamente específico
de su cuadro clínico, actualmente el diagnóstico de la brucelosis
requiere siempre una confirmación mediante el aislamiento del
germen, o la detección de anticuerpos específicos mediante
diferentes pruebas serológicas. Ambos métodos poseen importantes
limitaciones. De los métodos bacteriológicos, el hemocultivo es la
muestra clínica más rentable para el diagnóstico microbiológico. Su
sensibilidad oscila entre el 53-90% en los casos de
brucelosis aguda producida por B. melitensis. Sin embargo,
esta sensibilidad se reduce considerablemente en los pacientes con
cuadros clínicos de larga evolución, en los pacientes con
complicaciones focales y en las infecciones causadas por B.
abortus y B. suis. Los resultados del hemocultivo son en
muchas ocasiones excesivamente lentos. Por otra parte, la
manipulación de estos gérmenes supone un alto riesgo para el
personal de laboratorio que se ve obligado a operar con cepas vivas
para su correcta identificación final, debido a que Brucella
spp. es un patógeno de clase III.
Aunque en la actualidad existe una amplia
batería de métodos serológicos aplicables al diagnóstico de la
brucelosis humana, todos ellos adolecen de importantes limitaciones.
Así, su sensibilidad es baja en las fases precoces de la
enfermedad, en la cual los niveles de anticuerpos aún pueden ser
bajos. Además su especificidad es escasa en zonas de alta endemia,
en personas profesionalmente expuestas, en pacientes que han
padecido una infección reciente y en las frecuentes recidivas de la
enfermedad.
Se ha demostrado que la amplificación de
secuencias específicas de ADN de Brucella mediante PCR es un
procedimiento mucho más sensible que los hemocultivos, y que su
positividad es una prueba bastante específica de enfermedad activa
(ES 2137124). Gracias a este método, la detección del germen, y por
tanto de la enfermedad, puede realizarse de forma rápida y fácil,
independientemente del tiempo de evolución de la infección y de la
respuesta serológica que pueda producirse en el paciente. Este
método también permite la monitorización del tratamiento y el
diagnóstico precoz de las recidivas.
Estas técnicas de amplificación del ADN mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permiten la
amplificación exponencial e identificación de un fragmento
especifico de ADN y se han mostrado muy útiles en el diagnóstico de
diversas enfermedades infecciosas producidas por gérmenes de
dificil aislamiento con las técnicas bacteriológicas
convencionales. Los gérmenes del género Brucella crecen
lentamente y requieren ocasionalmente medios y condiciones
especiales. En base a los conocimientos disponibles sobre la
biología molecular de los gérmenes del género Brucella, y
aplicando las técnicas de amplificación del ADN, se ha descrito
una técnica sensible y específica de PCR en muestras de sangre
humana (PCR-ELISA), que permite obtener mejores
resultados en el diagnóstico que mediante el uso de técnicas de
PCR o de técnicas microbiológicas convencionales, tanto de la
infección primaria como de las recidivas, así como en las
complicaciones de la enfermedad (ES 2220180). Sin embargo, la
PCR-ELISA, aunque es capaz de amplificar 10 fg de
ADN bacteriano (cantidad equivalente aproximadamente a 2 células
bacterianas), requiere la manipulación de los productos PCR una vez
completada la amplificación y es obligatoria la detección mediante
digoxigenín-ELISA. Además, esta técnica consume
excesivo tiempo, no siendo por ello muy adecuada para laboratorios
generales de diagnóstico clínico.
Otros autores han propuesto métodos para la
detección, identificación y diferenciación de todas las especies de
Brucella, incluidas las cepas vacunales, basados en la
aplicación de la técnica de PCR convencional, y utilizando 8
parejas diferentes de cebadores (WO 2006/097347). Los métodos
referidos requieren, para la detección de las diferentes especies
de Brucella, la realización de un cultivo previo a partir de
aislados procedentes de sangre u otros fluidos, tanto de origen
humano como animal, y no directamente desde el suero sanguíneo u
otras muestras clínicas, antes de la extracción del ADN bacteriano y
de la posterior detección por PCR. El hecho de tener que realizar
dicho cultivo incrementa el tiempo necesario para el diagnóstico y,
lo más importante, representa un riesgo para el personal de
laboratorio que maneja los microorganismos, al ser Brucella
un patógeno de clase III.
Con el objetivo principal de evitar estas
dificultades, la presente invención se refiere a una técnica de PCR
cuantitativa en tiempo real optimizada y evaluada conforme a su uso
diagnóstico en muestras de suero obtenido a partir de sangre
periférica y en otras muestras, clínicas (LCR, orina, pus, etc.) de
pacientes con brucelosis. La presente invención comprende cebadores
diferentes a los especificados en las patentes ES 2137124 y ES
2220180, en las que figuran los mismos inventores que en la
presente. Dichos cebadores, aunque corresponden a secuencias de ADN
que codifican para la misma proteína de membrana BCSP31 que los
especificados en la presente invención, amplifican una región
termodinámicamente inestable, imposibilitando el diseño de una
sonda de hidrólisis (tipo TaqMan) compatible. Además, el producto
amplificado usando los mismos puede dificultar, por su gran tamaño,
la detección y cuantificación mediante PCR a tiempo real.
En los últimos años otros autores han
desarrollado aplicaciones de la PCR a tiempo real para la
detección ADN de Brucella spp. en muestras sanguíneas de
pacientes con brucelosis. Debeaumont y colaboradores utilizaron la
tecnología LightCycler para la amplificación mediante PCR a tiempo
real (LC-PCR) en muestras de suero de un fragmento
de 169 pb de la proteína BCSP31, presente en todas las especies y
biovariedades de Brucella, usando cebadores distintos a los
especificados en la presente invención, así como sondas FRET
(Debeaumont C. et al., 2005, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.
Dis., 24: 842-845). La sensibilidad del método
propuesto por estos autores fue de 18 fg de ADN, lo que equivale a 6
células bacterianas, significativamente inferior a los 10 fg (3
células bacterianas) que permite detectar la presente invención.
Por otra parte, las sondas FRET son más complejas y su síntesis es
más costosa económicamente respecto de las sondas de hidrólisis
(también denominadas genéricamente sondas TaqMan) como la
comprendida en la presente invención.
Del mismo modo, Navarro y colaboradores,
utilizaron la tecnología LC-PCR para amplificar un
fragmento de 251 pb de la secuencia de inserción IS711 en muestras
de sangre total en lugar de suero (Navarro E. et al., 2006,
Clin. Infect. Dis., 42: 1266-1273). En este caso la
sensibilidad de los cebadores y la sonda TaqMan empleada fue de 15
fg (5 células bacterianas). El método propuesto por estos autores
no comprende la negativización de la PCR, lo que interfiere
notablemente a la hora de establecer un valor de
cut-off durante la cuantificación de la
carga bacteriana. Además, el hecho de utilizar sangre total aumenta
el riesgo de aparición de falsos negativos debido a una mayor
presencia de inhibidores de la PCR en este tipo de muestras.
Por último, Kattar y colaboradores han
desarrollado un ensayo de LC-PCR que comprende el
uso de sondas FRET para la detección de Brucella spp.
empleando tres secuencias génicas, dos de ellas codificantes de las
proteínas de membrana omop3l y omp25, y la tercera correspondiendo
a la región espaciadora de transcripción ribosomal
16S-23S (ITS) (Kattar M.M. et al., 2007,
Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 59: 23-32). El
ensayo propuesto se aplica en muestras de sangre total y de tejidos
parafinados, lo que dificulta el ensayo debido a la mayor cantidad
de inhibidores de la reacción de amplificación de dichas muestras.
De las tres secuencias empleadas, la secuencia ITS es la más
sensible, permitiendo la identificación de Brucella tanto en
tejidos como en sangre total, y la detección de hasta 2 células
bacterianas, sensibilidad comparable a la de la presente invención,
aunque ésta comprende el uso de sondas menos complejas y costosas,
y evita los problemas derivados del tipo de muestras antes
mencionadas.
La presente invención se refiere a un conjunto
de cebadores, sonda, procedimiento y kit de diagnóstico molecular
de Brucella spp., y más concretamente para la detección de
ADN específico de gérmenes del género Brucella en muestras
clínicas basada en la amplificación y cuantificación de ADN
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo
real. El procedimiento propuesto comprende la amplificación de un
fragmento de 140 pb de un gen que codifica la síntesis de una
proteína inmunogénica de membrana de 31 kDa específica del género
Brucella (BCSP31). Los productos amplificados resultantes son
hibridados con una sonda de hidrólisis marcada por fluorescencia
complementaria a una región interna del producto amplificado. Los
híbridos así obtenidos, son purificados, donados y transfectados a
E. coli. El ADN plasmídico una vez purificado y linealizado
es utilizado para realizar un análisis cuantitativo para obtener la
concentración de ADN de Brucella spp.
La técnica propuesta es significativamente más
sensible y específica que los métodos conocidos (métodos
bacteriológicos, métodos serológicos, PCR-ELISA) y
presenta las siguientes ventajas:
- -
- La detección de los productos PCR es rápida, fácil y objetiva, permitiendo un fácil y rápido diagnóstico de la infección;
- -
- No requiere utilizar electroforesis en geles de agarosa, luz ultravioleta, ni el uso de agentes tóxicos como el bromuro de etidio, o digoxigenín-ELISA para la detección de los productos obtenidos;
- -
- Debido a que la PCR a tiempo real es un sistema cerrado, que no requiere manipulación de los productos PCR, una vez completada la amplificación, para conocer los resultados, disminuye notablemente el riesgo de contaminación por arrastre;
- -
- Permite la monitorización de la respuesta al tratamiento y la detección precoz de las recidivas;
- -
- Evita el riesgo de manipulación del germen por el personal de laboratorio;
- -
- Permite el manejo simultáneo de un elevado número de muestras;
- -
- Es susceptible de ser automatizada, lo cual la hace muy atractiva para el uso en cualquier laboratorio clínico.
De este modo, constituye un primer objeto de la
presente invención un conjunto de cebadores para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras
clínicas, en el cual al menos dos de los cebadores de dicho
conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias
mostradas en las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 Preferentemente, dicho
conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia
comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 y
por un segundo cebador cuya secuencia comprende la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2. Más preferentemente, la
secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID
NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a
la SEQ ID NO 2.
Constituye un segundo objeto de la presente
invención una sonda para la detección y cuantificación de ADN
específico de Brucella spp. en muestras clínicas, que
presenta una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 3, siendo preferentemente la
secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3. Dicha sonda se
marca por fluorescencia en el extremo 5' con
fluorescina-6-carboxi y en el
extremo 3' con
tetrametilrodamina-5-carboxi.
Constituye un tercer objeto de la presente
invención un procedimiento para la detección y cuantificación de
ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas que
incluye las siguientes etapas:
- a.
- extracción y purificación del ADN de las muestras clínicas,
- b.
- amplificación mediante PCR cuantitativa en tiempo real de una secuencia de 140 pb del gen que codifica una proteína inmunogénica de la membrana celular de 31 kDa de Brucella spp. utilizando el conjunto de cebadores anteriormente referido, preferentemente un primer cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 1 y un segundo cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 2;
- c.
- simultáneamente con la etapa anterior, hibridación del producto amplificado mediante la sonda referida, preferentemente una sonda que presente una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3 marcada por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina 5-carboxi; y
- d.
- cuantificación mediante comparación con una curva patrón determinada a partir de ADN plásmido purificado y linealizado obtenido por donación del producto hibridado en un vector y posterior transfección en células de E. coli.
Las muestras clínicas pueden ser muestras de
orina, muestras de líquido. cefalorraquídeo, muestras de pus, o
muestras de suero obtenido a partir de sangre periférica (las
altas concentraciones de ADN humano presentes en las muestras de
sangre periférica interfieren en ocasiones la amplificación
deseada, lo que se evita utilizando suero).
Constituye un cuarto objeto de la presente
invención un kit para la detección y cuantificación de ADN
específico de Brucella spp. en muestras clínicas que
comprende:
- a.
- un conjunto de cebadores tal y como el anteriormente referido,
- b.
- una sonda como la referida, y
- c.
- una muestra control para la determinación de ADN de Brucella spp..
Preferentemente el kit comprende:
- a.
- dos cebadores con secuencias de nucleótidos idénticas a las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2,
- b.
- una sonda que presenta una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3 y marcada por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina-5-carboxi, y
- c.
- una muestra control para la determinación de ADN de Brucella spp..
Figura 1. Curvas de amplificación en muestras de
suero para la detección de Brucella spp.: curvas patrón (1),
pacientes con brucelosis (2), y controles negativos (paciente con
síndrome febril de etiología diferente y control negativo de la
reacción -agua-) (3).
\newpage
Figura 2. Curvas de amplificación en muestras de
orina para la detección de Brucella spp.: curvas patrón
(1), paciente con brucelosis (4), y controles negativos (paciente
con síndrome febril de etiología diferente y control negativo de la
reacción -agua-) (5).
Figura 3. Curvas de amplificación en muestras de
líquido cefalorraquídeo (LCR) para la detección de Brucella
spp.: curvas patrón (1), pacientes con brucelosis (6), y controles
negativos (paciente con síndrome febril de etiología diferente y
control negativo de la reacción -agua-) (7).
Figura 4. Curvas de amplificación en muestras de
pus procedente de abscesos para la detección de Brucella
spp.: curvas patrón (1), pacientes con brucelosis (8), y controles
negativos (paciente con síndrome febril de etiología diferente y
control negativo de la reacción -agua-) (9).
A continuación, se describe detalladamente, y
sin carácter limitativo, un modo de realización de la invención,
particularmente desarrollado para suero sanguíneo, optimizado para
la tecnología LightCycler (Roche Applied Science), y
comprendiendo el uso de una sonda TaqMan (Applied Biosystems).
El ADN total se extrae a partir de una muestra
de suero de sangre periférica, el cual se almacena a -20ºC. En esta
alícuota se encuentra el ADN genómico leucocitario y el bacteriano,
este último en baja concentración. Para la realización de la prueba,
el ADN total es extraído utilizando el kit UltraClean BloodSpin
DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories) a partir de muestras de
200 \muL de suero según las instrucciones del fabricante. El ADN
precipitado resultante del protocolo comercial es resuspendido en
200 \muL de agua. Posteriormente, el ADN es concentrado añadiendo
8 \muL de NaCl en una concentración de 5 mol/L y 400 \muL de
etanol absoluto frío, se mezcla y centrifuga a 15000 g durante 5
minutos. El ADN precipitado se resuspende en un volumen final de 40
\muL de agua y se almacena a 4ºC hasta su utilización. Para el
análisis por PCR se utilizan alícuotas de 5 \muL de la suspensión
obtenida.
Para la identificación de Brucella spp.
se amplificó una región de ADN de 140 pb del gen que codifica una
proteína de la superficie celular de Brucella abortus de 31
kDa (Mayfield J.E. et al., 1988, Gene, 63:
1-9), común a todas las biovariedades de
Brucella. Como iniciadores de la reacción de amplificación
de la secuencia diana, se emplean los cebadores identificados en
las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. La sonda TaqMan empleada se
corresponde a la secuencia identificada como SEQ ID NO 3, marcada
por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina
6-carboxi (FAM) como reporter dye y en el
extremo 3' con
tetrametilrodamina-5-carboxi
(TAMRA) como quencher dye.
El producto de 140 pb resultante de la
amplificación obtenida con referidos cebadores sé purifica en un
gel de agarosa mediante el kit QIAquick Gel Extraction Kit
(QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. El amplicón
purificado es donado en un vector PCR2.1-TOPO
(Invitrogen) y transfectado a E. coli DH-5
alpha mediante el kit de donación TOPO-TA
(Invitrogen). Se purifica el DNA plasmídico mediante el kit
QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) y se linealiza mediante
digestión enzimática con EcoRI. La absorbancia a 260 nm de
cada muestra es medida tres veces en un lector
ND-1000 (NanoDrop). El ADN plasmídico es utilizado
en la elaboración de una curva estándar externa que es exportada en
cada carrera utilizando el software del termociclador y que
es calibrada con el control positivo (calibrador) incluido en cada
carrera.
La mezcla de reacción se realiza en un volumen
final de 20 \muL, conteniendo 4 \muL de LightCycler
FastStart DNA MasterPLUS HybProbe (Roche Diagnostic), 0,6
\mumol/L de cada cebador iniciador de reacción, 200 nmol/L de
sonda TaqMan, y 5 \muL del ADN molde. La reacción se lleva a cabo
en un termociclador LightCycler (Roche Applied Science). Los
capilares son sellados, centrifugados a 500 g durante 5 segundos, y
amplificados en el termociclador. La activación de la polimerasa se
realiza a 95ºC durante 10 min y se llevan a cabo 45 ciclos
compuestos de 10 segundos a 95ºC, 20 segundos a 60ºC y 6 segundos a
72ºC. La temperatura de transición se fija a 20ºC/s durante todos
los pasos. La concentración de ADN de Brucella se calcula
mediante el software del termociclador. Todos los ensayos
realizados incluyen un control negativo y un control positivo de 2
x10^{4} copias por reacción del plásmido. Para prevenir la
contaminación de las muestras se realizan medidas estándares y
flujos unidireccionales en la extracción y amplificación del ADN. Un
ensayo se considera negativo para ADN de Brucella si el
valor Cp supera los 45 ciclos.
Los resultados obtenidos, resumidos en la figura
1, evidencian la fiabilidad del procedimiento propuesto en la
presente invención. Las curvas patrón (1) fueron elaboradas a
partir de 10 fg, 100 fg y 100 pg de ADN plasmidico. También se
aportan resultados obtenidos para otros tipos de muestras clínicas
(figuras 2, 3 y 4).
<110> Universidad de Málaga
\hskip1cmFundación IMABIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Conjunto de cebadores, sondas,
procedimiento y kit para la detección y cuantificación de
secuencias de ADN específicas de Brucella spp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SOLICITUD_IMABIS_UMA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador. Oligonucleótido Directo
para la amplificación de una región de ADN de 140 pb, del gen que
codifica una proteína de la superficie celular de Brucella
abortus de 31 kDa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccggagcc tataaggacg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador. Oligonucleótido Inverso
para la amplificación de una región de ADN de 140 pb, del gen que
codifica una proteína de la superficie celular de Brucella
abortus de 31 kDa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagtgcctt gcgtgtatcc
\hfill20
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<210> 3
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda. Oligonucleótido Directo para
la hibridación y detección de una región de ADN de 140 pb, del gen
que codifica una proteína de la superficie celular de Brucella
abortus de 31 kDa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccgaccctt gccgttgccg c
\hfill21
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Claims (14)
1. Conjunto de cebadores para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas, caracterizado porque al menos dos de los
cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a
las secuencias mostradas en las SEQ. ID. NO 1 y SEQ ID NO 2.
2. Conjunto de cebadores para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas según la reivindicación 1, caracterizado
porque dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya
secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ
ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2.
3. Conjunto de cebadores para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas según la reivindicación 2, caracterizado
porque la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a
la SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es
idéntica a la SEQ ID NO 2.
4. Sonda para la detección y cuantificación de
ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas,
caracterizado porque presenta una secuencia de nucleótidos
que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEQ ID NO 3.
SEQ ID NO 3.
5. Sonda para la para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas según la reivindicación 4, caracterizada
porque presenta una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID
NO 3.
6. Sonda para la detección y cuantificación de
ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según
las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque dicha sonda
se marca por fluorescencia en el extremo 5' con
fluorescina-6-carboxi y en el
extremo 3' con
tetrametilrodamina-5-carboxi.
7. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas caracterizado porque incluye las siguientes
etapas:
- a.
- extracción y purificación del ADN de las muestras clínicas,
- b.
- amplificación mediante PCR cuantitativa en tiempo real de una secuencia de 140 pb del gen que codifica una proteína inmunogénica de la membrana celular de 31kDa de Brucella spp. utilizando el conjunto de cebadores según las reivindicaciones 1-3, preferentemente un primer cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 1 y un segundo cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 2;
- c.
- simultáneamente con la etapa anterior, hibridación del producto amplificado mediante una sonda según las reivindicaciones 4-6, preferentemente una sonda que presente una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3 marcada por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina-5-carboxi; y
- d.
- cuantificación mediante comparación con una curva patrón determinada a partir de ADN plásmido purificado y linealizado obtenido por donación del producto hibridado en un vector y posterior transfección en células de E. coli.
8. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas según la reivindicación 7, caracterizado
porque las muestras clínicas son muestras de suero obtenido a
partir de sangre periférica.
9. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas según la reivindicación 7, caracterizado
porque las muestras clínicas son muestras de orina.
10. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas según la reivindicación 7, caracterizado
porque las muestras clínicas son muestras de líquido
cefalorraquídeo.
11. Procedimiento para la detección y
cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en
muestras clínicas según la reivindicación 7, caracterizado
porque las muestras clínicas son muestras de pus.
12. Kit para la detección y cuantificación de
ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas
caracterizado porque comprende:
- a.
- un conjunto de cebadores según las reivindicaciones 1-3,
- b.
- una sonda según las reivindicaciones 4-6, y
- c.
- una muestra control para la determinación de ADN de Brucella spp..
13. Kit para la detección y cuantificación de
ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según
la reivindicación 12, caracterizado porque comprende
- a.
- dos cebadores con secuencias de nucleótidos idénticas a las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2,
- b.
- una sonda que presenta una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3, y
- c.
- una muestra control para la determinación de ADN de Brucella spp..
14. Kit para la detección y cuantificación de
ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según
la reivindicación 13, caracterizado porque la sonda está
marcada por fluorescencia en el extremo 5' con
fluorescina-6-carboxi y en el
extremo 3' con
tetrametilrodamina-5-carboxi.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801280A ES2331679B1 (es) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la deteccion y cuantificacion de secuencias de adn especificas de brucella spp. |
| PCT/ES2009/000230 WO2010004061A1 (es) | 2008-07-11 | 2009-04-24 | Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la detección y cuantificación de secuencias de adn específicas de brucella spp |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801280A ES2331679B1 (es) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la deteccion y cuantificacion de secuencias de adn especificas de brucella spp. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2331679A1 ES2331679A1 (es) | 2010-01-12 |
| ES2331679B1 true ES2331679B1 (es) | 2010-09-30 |
Family
ID=41459942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200801280A Active ES2331679B1 (es) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la deteccion y cuantificacion de secuencias de adn especificas de brucella spp. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2331679B1 (es) |
| WO (1) | WO2010004061A1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114790490B (zh) * | 2022-03-09 | 2025-01-14 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10261468A1 (de) * | 2002-12-31 | 2004-07-15 | Bundesrepublik Deutschland, vertreten durch das Bundesministerium der Verteidigung, dieses vertreten durch das Bundesamt für Wehrtechnik und Beschaffung | Testkit zum Nachweis von Brucella melitensis und Brucella abortus |
-
2008
- 2008-07-11 ES ES200801280A patent/ES2331679B1/es active Active
-
2009
- 2009-04-24 WO PCT/ES2009/000230 patent/WO2010004061A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BAILY, G. G.et ak. "{}Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification"{}. Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1992, Vol. 95, páginas 271-275. ISSN 0022-5304. Ver página 271-272 y tabla 1. * |
| KANANI, A. N. "{}Serological, cultural and molecular detection of brucella infection in breeding bulls"{}. Tesis doctoral de la universidad de Anand, Gujarat (India). 08.01.2008. [recuperado el 27.07.2009] Recuperado de Internet: <URL:http://openmed.nic.in/2224/>. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010004061A1 (es) | 2010-01-14 |
| ES2331679A1 (es) | 2010-01-12 |
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