ES2331679A1

ES2331679A1 - Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la deteccion y cuantificacion de secuencias de adn especificas de brucella spp.

Info

Publication number: ES2331679A1
Application number: ES200801280A
Authority: ES
Inventors: Maria Isabel Queipo Ortuño; Juan De Dios Colmenero Castillo; Pilar Morata Losa
Original assignee: Universidad de Malaga; Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
Current assignee: Universidad de Malaga; Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
Priority date: 2008-07-11
Filing date: 2008-07-11
Publication date: 2010-01-12
Anticipated expiration: 2028-07-11
Also published as: WO2010004061A1; ES2331679B1

Abstract

Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la detección y cuantificación de secuencias de ADN específicas de Brucella spp. La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sonda, procedimiento y kit de diagnóstico molecular de Brucella spp., y más concretamente para la detección de ADN específico de gérmenes del género Brucella en muestras clínicas basada en la amplificación y cuantificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. La técnica es mucho más sensible que la PCR convencional, la PCR-ELISA (PCR acoplada a un enzimoinmunoensayo), los métodos bacteriológicos, y más específica que los métodos serolóqicos habituales, permitiendo su utilización para la puesta en práctica de un procedimiento fácil y rápido de diagnóstico molecular de la infección por Brucella spp. en suero sanguíneo y en otras muestras clínicas.

Description

Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la detección y cuantificación de secuencias de ADN específicas de Brucella spp..

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sonda, procedimiento y kit de diagnóstico molecular de Brucella spp., y más concretamente para la detección de ADN específico de gérmenes del género Brucella en muestras clínicas basada en la amplificación y cuantificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.

Estado de la técnica

La brucelosis es una zoonosis de distribución mundial que provoca una alta morbilidad en humanos. La enfermedad es endémica en amplias zonas del planeta. Los gérmenes del género Brucella son capaces de sobrevivir e incluso multiplicarse dentro de las células del sistema mononuclear fagocítico lo cual explica la marcada tendencia de la enfermedad a producir complicaciones e incluso recaídas una vez concluido el tratamiento. Algunas de las complicaciones de la brucelosis son muy graves pudiendo conducir a la muerte del paciente. Se ha demostrado que la aparición de complicaciones se relaciona significativamente con una demora en el diagnóstico de la infección [Colmenero J.D. et al., 1996, Medicine (Baltimore), 75: 195-211].

Debido a lo heterogéneo y escasamente específico de su cuadro clínico, actualmente el diagnóstico de la brucelosis requiere siempre una confirmación mediante el aislamiento del germen, o la detección de anticuerpos específicos mediante diferentes pruebas serológicas. Ambos métodos poseen importantes limitaciones. De los métodos bacteriológicos, el hemocultivo es la muestra clínica más rentable para el diagnóstico microbiológico. Su sensibilidad oscila entre el 53-90% en los casos de brucelosis aguda producida por B. melitensis. Sin embargo, esta sensibilidad se reduce considerablemente en los pacientes con cuadros clínicos de larga evolución, en los pacientes con complicaciones focales y en las infecciones causadas por B. abortus y B. suis. Los resultados del hemocultivo son en muchas ocasiones excesivamente lentos. Por otra parte, la manipulación de estos gérmenes supone un alto riesgo para el personal de laboratorio que se ve obligado a operar con cepas vivas para su correcta identificación final, debido a que Brucella spp. es un patógeno de clase III.

Aunque en la actualidad existe una amplia batería de métodos serológicos aplicables al diagnóstico de la brucelosis humana, todos ellos adolecen de importantes limitaciones. Así, su sensibilidad es baja en las fases precoces de la enfermedad, en la cual los niveles de anticuerpos aún pueden ser bajos. Además su especificidad es escasa en zonas de alta endemia, en personas profesionalmente expuestas, en pacientes que han padecido una infección reciente y en las frecuentes recidivas de la enfermedad.

Se ha demostrado que la amplificación de secuencias específicas de ADN de Brucella mediante PCR es un procedimiento mucho más sensible que los hemocultivos, y que su positividad es una prueba bastante específica de enfermedad activa (ES 2137124). Gracias a este método, la detección del germen, y por tanto de la enfermedad, puede realizarse de forma rápida y fácil, independientemente del tiempo de evolución de la infección y de la respuesta serológica que pueda producirse en el paciente. Este método también permite la monitorización del tratamiento y el diagnóstico precoz de las recidivas.

Estas técnicas de amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permiten la amplificación exponencial e identificación de un fragmento especifico de ADN y se han mostrado muy útiles en el diagnóstico de diversas enfermedades infecciosas producidas por gérmenes de dificil aislamiento con las técnicas bacteriológicas convencionales. Los gérmenes del género Brucella crecen lentamente y requieren ocasionalmente medios y condiciones especiales. En base a los conocimientos disponibles sobre la biología molecular de los gérmenes del género Brucella, y aplicando las técnicas de amplificación del ADN, se ha descrito una técnica sensible y específica de PCR en muestras de sangre humana (PCR-ELISA), que permite obtener mejores resultados en el diagnóstico que mediante el uso de técnicas de PCR o de técnicas microbiológicas convencionales, tanto de la infección primaria como de las recidivas, así como en las complicaciones de la enfermedad (ES 2220180). Sin embargo, la PCR-ELISA, aunque es capaz de amplificar 10 fg de ADN bacteriano (cantidad equivalente aproximadamente a 2 células bacterianas), requiere la manipulación de los productos PCR una vez completada la amplificación y es obligatoria la detección mediante digoxigenín-ELISA. Además, esta técnica consume excesivo tiempo, no siendo por ello muy adecuada para laboratorios generales de diagnóstico clínico.

Otros autores han propuesto métodos para la detección, identificación y diferenciación de todas las especies de Brucella, incluidas las cepas vacunales, basados en la aplicación de la técnica de PCR convencional, y utilizando 8 parejas diferentes de cebadores (WO 2006/097347). Los métodos referidos requieren, para la detección de las diferentes especies de Brucella, la realización de un cultivo previo a partir de aislados procedentes de sangre u otros fluidos, tanto de origen humano como animal, y no directamente desde el suero sanguíneo u otras muestras clínicas, antes de la extracción del ADN bacteriano y de la posterior detección por PCR. El hecho de tener que realizar dicho cultivo incrementa el tiempo necesario para el diagnóstico y, lo más importante, representa un riesgo para el personal de laboratorio que maneja los microorganismos, al ser Brucella un patógeno de clase III.

Con el objetivo principal de evitar estas dificultades, la presente invención se refiere a una técnica de PCR cuantitativa en tiempo real optimizada y evaluada conforme a su uso diagnóstico en muestras de suero obtenido a partir de sangre periférica y en otras muestras, clínicas (LCR, orina, pus, etc.) de pacientes con brucelosis. La presente invención comprende cebadores diferentes a los especificados en las patentes ES 2137124 y ES 2220180, en las que figuran los mismos inventores que en la presente. Dichos cebadores, aunque corresponden a secuencias de ADN que codifican para la misma proteína de membrana BCSP31 que los especificados en la presente invención, amplifican una región termodinámicamente inestable, imposibilitando el diseño de una sonda de hidrólisis (tipo TaqMan) compatible. Además, el producto amplificado usando los mismos puede dificultar, por su gran tamaño, la detección y cuantificación mediante PCR a tiempo real.

En los últimos años otros autores han desarrollado aplicaciones de la PCR a tiempo real para la detección ADN de Brucella spp. en muestras sanguíneas de pacientes con brucelosis. Debeaumont y colaboradores utilizaron la tecnología LightCycler para la amplificación mediante PCR a tiempo real (LC-PCR) en muestras de suero de un fragmento de 169 pb de la proteína BCSP31, presente en todas las especies y biovariedades de Brucella, usando cebadores distintos a los especificados en la presente invención, así como sondas FRET (Debeaumont C. et al., 2005, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 24: 842-845). La sensibilidad del método propuesto por estos autores fue de 18 fg de ADN, lo que equivale a 6 células bacterianas, significativamente inferior a los 10 fg (3 células bacterianas) que permite detectar la presente invención. Por otra parte, las sondas FRET son más complejas y su síntesis es más costosa económicamente respecto de las sondas de hidrólisis (también denominadas genéricamente sondas TaqMan) como la comprendida en la presente invención.

Del mismo modo, Navarro y colaboradores, utilizaron la tecnología LC-PCR para amplificar un fragmento de 251 pb de la secuencia de inserción IS711 en muestras de sangre total en lugar de suero (Navarro E. et al., 2006, Clin. Infect. Dis., 42: 1266-1273). En este caso la sensibilidad de los cebadores y la sonda TaqMan empleada fue de 15 fg (5 células bacterianas). El método propuesto por estos autores no comprende la negativización de la PCR, lo que interfiere notablemente a la hora de establecer un valor de cut-off durante la cuantificación de la carga bacteriana. Además, el hecho de utilizar sangre total aumenta el riesgo de aparición de falsos negativos debido a una mayor presencia de inhibidores de la PCR en este tipo de muestras.

Por último, Kattar y colaboradores han desarrollado un ensayo de LC-PCR que comprende el uso de sondas FRET para la detección de Brucella spp. empleando tres secuencias génicas, dos de ellas codificantes de las proteínas de membrana omop3l y omp25, y la tercera correspondiendo a la región espaciadora de transcripción ribosomal 16S-23S (ITS) (Kattar M.M. et al., 2007, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 59: 23-32). El ensayo propuesto se aplica en muestras de sangre total y de tejidos parafinados, lo que dificulta el ensayo debido a la mayor cantidad de inhibidores de la reacción de amplificación de dichas muestras. De las tres secuencias empleadas, la secuencia ITS es la más sensible, permitiendo la identificación de Brucella tanto en tejidos como en sangre total, y la detección de hasta 2 células bacterianas, sensibilidad comparable a la de la presente invención, aunque ésta comprende el uso de sondas menos complejas y costosas, y evita los problemas derivados del tipo de muestras antes mencionadas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sonda, procedimiento y kit de diagnóstico molecular de Brucella spp., y más concretamente para la detección de ADN específico de gérmenes del género Brucella en muestras clínicas basada en la amplificación y cuantificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. El procedimiento propuesto comprende la amplificación de un fragmento de 140 pb de un gen que codifica la síntesis de una proteína inmunogénica de membrana de 31 kDa específica del género Brucella (BCSP31). Los productos amplificados resultantes son hibridados con una sonda de hidrólisis marcada por fluorescencia complementaria a una región interna del producto amplificado. Los híbridos así obtenidos, son purificados, donados y transfectados a E. coli. El ADN plasmídico una vez purificado y linealizado es utilizado para realizar un análisis cuantitativo para obtener la concentración de ADN de Brucella spp.

La técnica propuesta es significativamente más sensible y específica que los métodos conocidos (métodos bacteriológicos, métodos serológicos, PCR-ELISA) y presenta las siguientes ventajas:

-: La detección de los productos PCR es rápida, fácil y objetiva, permitiendo un fácil y rápido diagnóstico de la infección;

-: No requiere utilizar electroforesis en geles de agarosa, luz ultravioleta, ni el uso de agentes tóxicos como el bromuro de etidio, o digoxigenín-ELISA para la detección de los productos obtenidos;

-: Debido a que la PCR a tiempo real es un sistema cerrado, que no requiere manipulación de los productos PCR, una vez completada la amplificación, para conocer los resultados, disminuye notablemente el riesgo de contaminación por arrastre;

-: Permite la monitorización de la respuesta al tratamiento y la detección precoz de las recidivas;

-: Evita el riesgo de manipulación del germen por el personal de laboratorio;

-: Permite el manejo simultáneo de un elevado número de muestras;

-: Es susceptible de ser automatizada, lo cual la hace muy atractiva para el uso en cualquier laboratorio clínico.

De este modo, constituye un primer objeto de la presente invención un conjunto de cebadores para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas, en el cual al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 Preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 2.

Constituye un segundo objeto de la presente invención una sonda para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas, que presenta una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 3, siendo preferentemente la secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3. Dicha sonda se marca por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina-5-carboxi.

Constituye un tercer objeto de la presente invención un procedimiento para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas que incluye las siguientes etapas:

a.: extracción y purificación del ADN de las muestras clínicas,

b.: amplificación mediante PCR cuantitativa en tiempo real de una secuencia de 140 pb del gen que codifica una proteína inmunogénica de la membrana celular de 31 kDa de Brucella spp. utilizando el conjunto de cebadores anteriormente referido, preferentemente un primer cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 1 y un segundo cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 2;

c.: simultáneamente con la etapa anterior, hibridación del producto amplificado mediante la sonda referida, preferentemente una sonda que presente una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3 marcada por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina 5-carboxi; y

d.: cuantificación mediante comparación con una curva patrón determinada a partir de ADN plásmido purificado y linealizado obtenido por donación del producto hibridado en un vector y posterior transfección en células de E. coli.

Las muestras clínicas pueden ser muestras de orina, muestras de líquido. cefalorraquídeo, muestras de pus, o muestras de suero obtenido a partir de sangre periférica (las altas concentraciones de ADN humano presentes en las muestras de sangre periférica interfieren en ocasiones la amplificación deseada, lo que se evita utilizando suero).

Constituye un cuarto objeto de la presente invención un kit para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas que comprende:

a.: un conjunto de cebadores tal y como el anteriormente referido,

b.: una sonda como la referida, y

c.: una muestra control para la determinación de ADN de Brucella spp..

Preferentemente el kit comprende:

a.: dos cebadores con secuencias de nucleótidos idénticas a las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2,

b.: una sonda que presenta una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3 y marcada por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina-5-carboxi, y

c.: una muestra control para la determinación de ADN de Brucella spp..

Descripción de los dibujos

Figura 1. Curvas de amplificación en muestras de suero para la detección de Brucella spp.: curvas patrón (1), pacientes con brucelosis (2), y controles negativos (paciente con síndrome febril de etiología diferente y control negativo de la reacción -agua-) (3).

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Figura 2. Curvas de amplificación en muestras de orina para la detección de Brucella spp.: curvas patrón (1), paciente con brucelosis (4), y controles negativos (paciente con síndrome febril de etiología diferente y control negativo de la reacción -agua-) (5).

Figura 3. Curvas de amplificación en muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) para la detección de Brucella spp.: curvas patrón (1), pacientes con brucelosis (6), y controles negativos (paciente con síndrome febril de etiología diferente y control negativo de la reacción -agua-) (7).

Figura 4. Curvas de amplificación en muestras de pus procedente de abscesos para la detección de Brucella spp.: curvas patrón (1), pacientes con brucelosis (8), y controles negativos (paciente con síndrome febril de etiología diferente y control negativo de la reacción -agua-) (9).

Modos de realización de la invención

A continuación, se describe detalladamente, y sin carácter limitativo, un modo de realización de la invención, particularmente desarrollado para suero sanguíneo, optimizado para la tecnología LightCycler (Roche Applied Science), y comprendiendo el uso de una sonda TaqMan (Applied Biosystems).

Extracción y purificación del ADN

El ADN total se extrae a partir de una muestra de suero de sangre periférica, el cual se almacena a -20ºC. En esta alícuota se encuentra el ADN genómico leucocitario y el bacteriano, este último en baja concentración. Para la realización de la prueba, el ADN total es extraído utilizando el kit UltraClean BloodSpin DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories) a partir de muestras de 200 \muL de suero según las instrucciones del fabricante. El ADN precipitado resultante del protocolo comercial es resuspendido en 200 \muL de agua. Posteriormente, el ADN es concentrado añadiendo 8 \muL de NaCl en una concentración de 5 mol/L y 400 \muL de etanol absoluto frío, se mezcla y centrifuga a 15000 g durante 5 minutos. El ADN precipitado se resuspende en un volumen final de 40 \muL de agua y se almacena a 4ºC hasta su utilización. Para el análisis por PCR se utilizan alícuotas de 5 \muL de la suspensión obtenida.

Amplificación

Para la identificación de Brucella spp. se amplificó una región de ADN de 140 pb del gen que codifica una proteína de la superficie celular de Brucella abortus de 31 kDa (Mayfield J.E. et al., 1988, Gene, 63: 1-9), común a todas las biovariedades de Brucella. Como iniciadores de la reacción de amplificación de la secuencia diana, se emplean los cebadores identificados en las SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. La sonda TaqMan empleada se corresponde a la secuencia identificada como SEQ ID NO 3, marcada por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina 6-carboxi (FAM) como reporter dye y en el extremo 3' con tetrametilrodamina-5-carboxi (TAMRA) como quencher dye.

Construcción del plásmido

El producto de 140 pb resultante de la amplificación obtenida con referidos cebadores sé purifica en un gel de agarosa mediante el kit QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. El amplicón purificado es donado en un vector PCR2.1-TOPO (Invitrogen) y transfectado a E. coli DH-5 alpha mediante el kit de donación TOPO-TA (Invitrogen). Se purifica el DNA plasmídico mediante el kit QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) y se linealiza mediante digestión enzimática con EcoRI. La absorbancia a 260 nm de cada muestra es medida tres veces en un lector ND-1000 (NanoDrop). El ADN plasmídico es utilizado en la elaboración de una curva estándar externa que es exportada en cada carrera utilizando el software del termociclador y que es calibrada con el control positivo (calibrador) incluido en cada carrera.

Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real

La mezcla de reacción se realiza en un volumen final de 20 \muL, conteniendo 4 \muL de LightCycler FastStart DNA MasterPLUS HybProbe (Roche Diagnostic), 0,6 \mumol/L de cada cebador iniciador de reacción, 200 nmol/L de sonda TaqMan, y 5 \muL del ADN molde. La reacción se lleva a cabo en un termociclador LightCycler (Roche Applied Science). Los capilares son sellados, centrifugados a 500 g durante 5 segundos, y amplificados en el termociclador. La activación de la polimerasa se realiza a 95ºC durante 10 min y se llevan a cabo 45 ciclos compuestos de 10 segundos a 95ºC, 20 segundos a 60ºC y 6 segundos a 72ºC. La temperatura de transición se fija a 20ºC/s durante todos los pasos. La concentración de ADN de Brucella se calcula mediante el software del termociclador. Todos los ensayos realizados incluyen un control negativo y un control positivo de 2 x10^{4} copias por reacción del plásmido. Para prevenir la contaminación de las muestras se realizan medidas estándares y flujos unidireccionales en la extracción y amplificación del ADN. Un ensayo se considera negativo para ADN de Brucella si el valor Cp supera los 45 ciclos.

Los resultados obtenidos, resumidos en la figura 1, evidencian la fiabilidad del procedimiento propuesto en la presente invención. Las curvas patrón (1) fueron elaboradas a partir de 10 fg, 100 fg y 100 pg de ADN plasmidico. También se aportan resultados obtenidos para otros tipos de muestras clínicas (figuras 2, 3 y 4).

<110> Universidad de Málaga

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Fundación IMABIS

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<120> Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para la detección y cuantificación de secuencias de ADN específicas de Brucella spp.

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<130> SOLICITUD_IMABIS_UMA

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<160> 3

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador. Oligonucleótido Directo para la amplificación de una región de ADN de 140 pb, del gen que codifica una proteína de la superficie celular de Brucella abortus de 31 kDa

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tgccggagcc tataaggacg

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador. Oligonucleótido Inverso para la amplificación de una región de ADN de 140 pb, del gen que codifica una proteína de la superficie celular de Brucella abortus de 31 kDa

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<400> 2

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cgagtgcctt gcgtgtatcc

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<223> Sonda. Oligonucleótido Directo para la hibridación y detección de una región de ADN de 140 pb, del gen que codifica una proteína de la superficie celular de Brucella abortus de 31 kDa

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accgaccctt gccgttgccg c

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21

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Claims

1. Conjunto de cebadores para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas, caracterizado porque al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ. ID. NO 1 y SEQ ID NO 2.

2. Conjunto de cebadores para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2.

3. Conjunto de cebadores para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 2.

4. Sonda para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas, caracterizado porque presenta una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEQ ID NO 3.

5. Sonda para la para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 4, caracterizada porque presenta una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3.

6. Sonda para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque dicha sonda se marca por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina-5-carboxi.

7. Procedimiento para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas caracterizado porque incluye las siguientes etapas:

a.: extracción y purificación del ADN de las muestras clínicas,

b.: amplificación mediante PCR cuantitativa en tiempo real de una secuencia de 140 pb del gen que codifica una proteína inmunogénica de la membrana celular de 31kDa de Brucella spp. utilizando el conjunto de cebadores según las reivindicaciones 1-3, preferentemente un primer cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 1 y un segundo cebador cuya secuencia es idéntica a SEQ ID NO 2;

c.: simultáneamente con la etapa anterior, hibridación del producto amplificado mediante una sonda según las reivindicaciones 4-6, preferentemente una sonda que presente una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3 marcada por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina-5-carboxi; y

8. Procedimiento para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 7, caracterizado porque las muestras clínicas son muestras de suero obtenido a partir de sangre periférica.

9. Procedimiento para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 7, caracterizado porque las muestras clínicas son muestras de orina.

10. Procedimiento para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 7, caracterizado porque las muestras clínicas son muestras de líquido cefalorraquídeo.

11. Procedimiento para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 7, caracterizado porque las muestras clínicas son muestras de pus.

12. Kit para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas caracterizado porque comprende:

a.: un conjunto de cebadores según las reivindicaciones 1-3,

b.: una sonda según las reivindicaciones 4-6, y

c.: una muestra control para la determinación de ADN de Brucella spp..

13. Kit para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 12, caracterizado porque comprende

b.: una sonda que presenta una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEQ ID NO 3, y

c.: una muestra control para la determinación de ADN de Brucella spp..

14. Kit para la detección y cuantificación de ADN específico de Brucella spp. en muestras clínicas según la reivindicación 13, caracterizado porque la sonda está marcada por fluorescencia en el extremo 5' con fluorescina-6-carboxi y en el extremo 3' con tetrametilrodamina-5-carboxi.