ES2573405T3

ES2573405T3 - Detección de bacterias y hongos

Info

Publication number: ES2573405T3
Application number: ES10714461.0T
Authority: ES
Inventors: Stuart Wilson; William Mullen
Original assignee: Momentum Bioscience Ltd
Current assignee: Momentum Bioscience Ltd
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2016-06-07
Anticipated expiration: 2030-04-19
Also published as: GB0906643D0; US20150322478A1; WO2010119270A1; US9096884B2; GB0907785D0; EP2419524B8; CA2758783A1; US20120107865A1; EP2419524B1; EP2419524A1; MX2011010840A; US9796997B2

Abstract

Un método de detección de un microorganismo que expresa ligasa en una muestra que contiene células de mamífero, que comprende: (a) lisis de células de mamífero y cualesquiera microorganismos presentes en la muestra (b) tratar la muestra lisada en condiciones de pH elevado que inhiben la actividad de ligasa dependiente de ATP procedente de células de mamífero pero que no inhiben la actividad de las ligasas microbianas, (c) poner en contacto la muestra o una parte de la muestra con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para actividad de ligasa en la muestra, (d) incubar la muestra puesta en contacto de este modo en condiciones adecuadas para actividad de ligasa; y (e) determinar específicamente la presencia y/o la cantidad de una molécula de ácido nucleico ligada que resulta de la acción de la ligasa sobre la molécula de ácido nucleico sustrato para indicar la presencia del microorganismo que expresa ligasa.

Description

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En ciertas realizaciones, el sustrato de ácido nucleico comprende, consiste esencialmente en o consiste en dos moléculas de ácido nucleico bicatenarias con salientes complementarios monocatenarios.

5 El extremo 3’ de moléculas sustrato de ácido nucleico que no están unidas de forma productiva en términos de producir un producto ligado que es detectado a continuación (que se desea unir), puede estar bloqueado con un grupo de bloqueo adecuado para garantizar que no puedan participar en una reacción de ligamiento. Puede utilizarse cualquier grupo de bloqueo apropiado.

En realizaciones específicas, la molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para actividad de ligasa dependiente de ATP o de NAD en la muestra comprende, consiste esencialmente en o consiste en una molécula de ácido nucleico bicatenario con muescas. En realizaciones específicas, el sustrato global puede estar compuesto por tres moléculas de ADN monocatenario específicas (ADNmc). Dos o más de las moléculas de ADNmc pueden ser de secuencia idéntica. Una molécula de ADNmc puede hibridar con las otras dos moléculas de ácido nucleico de tal

15 manera que se forme una región bicatenaria que contiene una muesca. La actividad de ligasa dependiente de NAD, si está presente en la muestra, puede sellar la muesca, produciendo de este modo una molécula de ADN bicatenario que puede ser detectada de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.

En realizaciones específicas adicionales, la molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para actividad de ligasa dependiente de ATP o de NAD en la muestra comprende, consiste esencialmente en o consiste en dos moléculas de ácido nucleico que pueden ligarse entre sí.

Preferentemente, el sustrato de ácido nucleico está presente en exceso, y en particular en gran exceso molar, respecto a la ligasa en la muestra. Ésta es una importante distinción técnica respecto a métodos de la técnica

25 anterior. Dado que una molécula de ácido nucleico ligada novedosa es detectada, solamente la presencia de esta molécula en la muestra es esencial para que los métodos de detección funcionen eficazmente. Por lo tanto, no es perjudicial para los métodos de la invención que otras moléculas de ácido nucleico estén presentes en la muestra, tal como procedente de las bacterias u hongos a detectar o de fuentes de mamífero que pueden encontrarse en la muestra a ensayar, por ejemplo.

Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico sustrato están diseñadas de modo que no tengan niveles elevados de homología con el genoma de las una o más bacterias u otros microorganismos que producen la ligasa dependiente de ATP o de NAD que debe detectarse en la muestra. Esto significa que, incluso en presencia de moléculas de ácido nucleico contaminantes, solamente la molécula de ácido nucleico ligada novedosa puede ser

35 detectada. Por lo tanto, el sustrato debe tener niveles suficientemente bajos de identidad de secuencia con el ADN genómico de las bacterias u hongos a detectar para prevenir la amplificación inespecífica de ADN genómico que produce un resultado falso positivo. La secuencia del sustrato puede estar diseñada, por lo tanto, con las bacterias diana en mente. En particular, los cebadores para amplificar específicamente la molécula de ácido nucleico ligada novedosa se diseñan de modo que no produzcan un producto de amplificación a partir del ADN genómico bacteriano. Por ejemplo, el sustrato y los cebadores pueden incorporar moléculas de origen no natural complementarias que pueden emparejar bases entre sí, y permiten la amplificación específica de ADN genómico bacteriano. Como ejemplo, pueden incorporarse pyDAD y puADA en cebadores y moléculas sustrato según sea apropiado (Sismour y col., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 2: 728-735).

45 Preferentemente, la homología es menor de aproximadamente el 5 %, menor de aproximadamente el 10 %, menor de aproximadamente el 12,5 %, menor de aproximadamente el 15 %, menor de aproximadamente el 20 %, menor de aproximadamente el 30 %, menor de aproximadamente el 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos correspondiente de las una o más bacterias u otros microorganismos que producen la ligasa dependiente de ATP o de NAD que debe detectarse en la muestra. En una realización, no existe ninguna identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos correspondiente de las una o más bacterias u otros microorganismos que producen la ligasa dependiente de ATP o de NAD que debe detectarse en la muestra sobre aproximadamente 10, 20, 30, 40 o 50 nucleótidos contiguos. En otra realización, existe menos de aproximadamente el 10 % o menos de aproximadamente el 12,5 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o 60 % de identidad de secuencia sobre aproximadamente 10, 20, 30, 40 o 50 nucleótidos contiguos con la secuencia de nucleótidos correspondiente

55 de las una o más bacterias u otros microondas que producen la ligasa dependiente de ATP o de NAD que debe detectarse en la muestra.

Una etapa adicional de los métodos de la invención comprende, consiste esencialmente en o consiste en incubar la muestra en condiciones adecuadas para actividad de ligasa dependiente de ATP y/o de NAD. Pueden emplearse cualesquiera condiciones adecuadas, tal como sería determinado fácilmente por un experto en la materia. Por ejemplo, puede producirse ligamiento a cualquier temperatura entre aproximadamente 4 y 80 °C dependiendo de la ligasa involucrada (las bacterias termófilas pueden detectarse usando reacciones incubadas a temperaturas más elevadas que bacterias mesófilas, por ejemplo). Las temperaturas de incubación preferidas están entre aproximadamente 4 y 40 °C, más preferentemente entre aproximadamente 20 y 37 °C y de la forma más preferente 65 a temperatura ambiente para detección bacteriana o fúngica general (viable). Los tiempos de incubación adecuados pueden estar entre aproximadamente 10 minutos y 10 horas, tal como entre aproximadamente 30 minutos, 1 hora o

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de ácido nucleico sustrato pueden diseñarse para evitar amplificación inespecífica de ADN genómico bacteriano.

Los cebadores adecuados para uso en los métodos de la invención comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las secuencias de nucleótidos presentadas como SEQ ID NO: 4 y 5 y las SEQ ID NO: 9 y 10 y se

5 describen con más detalle en la sección experimental a continuación. Estos cebadores forman un aspecto independiente de la invención. Se observa que variantes de estas secuencias pueden utilizarse en la presente invención. En particular, pueden añadirse secuencias flanqueantes específicas de secuencia adicionales, por ejemplo para mejorar la especificidad de unión, según se requiera. Las secuencias variantes pueden tener al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de nucleótidos de los cebadores presentados en el ejemplo. Los cebadores pueden incorporar análogos de nucleótidos sintéticos según sea apropiado o pueden basarse en ARN o APN por ejemplo, o mezclas de los mismos. Los cebadores pueden marcarse, tal como con marcas fluorescentes y/o pares FRET, dependiendo del modo de detección empleado. Pueden utilizarse sondas, de nuevo que pueden marcarse, según se desee.

15 Por lo tanto, en ciertos aspectos, los métodos de la invención se llevan a cabo usando técnicas de amplificación de ácidos nucleicos para detectar la molécula de ácido nucleico novedosa producida como un resultado directo de la acción de actividad de ligasa dependiente de ATP o de NAD sobre la molécula de ácido nucleico sustrato, lo que indica la presencia de una células bacteriana u otro microorganismo que expresa ligasa dependiente de NAD en la muestra. En ciertas realizaciones la técnica usada se selecciona entre PCR, NASBA, 3SR, TMA, SDA y autoensamblaje de oligómeros de ADN.

La detección de los productos de amplificación puede ser mediante métodos rutinarios, tales como, por ejemplo, electroforesis en gel pero se lleva a cabo preferentemente usando métodos de detección en tiempo real o de punto

25 final.

En la técnica se conocen una serie de técnicas para detección en tiempo real o de punto final de los productos de una reacción de amplificación. Éstas incluyen el uso de colorantes fluorescentes intercalantes tales como SYBR Green I (Sambrook y Russell, Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Tercera edición), lo que permite que el rendimiento de ADN amplificado se estime basándose en la cantidad de fluorescencia producida. Muchos de los métodos de detección en tiempo real producen una lectura fluorescente que puede monitorizarse de forma continua; ejemplos específicos que incluyen balizas moleculares y sondas de transferencia de energía por resonancia fluorescente. Las técnicas en tiempo real o de punto final son desventajosas porque mantienen la reacción en un “único tubo”. Esto significa que no hay necesidad de análisis aguas abajo para obtener resultados, lo que conduce a

35 resultados obtenidos más rápidamente. Además, mantener la reacción en un entorno de “único tubo” reduce el riesgo de contaminación cruzada y permite una salida cuantitativa de los métodos de la invención. Esto puede ser particularmente importante en el contexto de la presente invención donde las cuestiones de salud y seguridad pueden ser de vital importancia (tal como en la detección de contaminación bacteriana potencial de muestras de plaquetas, por ejemplo).

Cuantificación en tiempo real y de punto final de reacciones de PCR puede conseguirse usando el sistema TaqMan® (Applied Biosystems), véase los documentos Holland y col; Detection of specific polymerase chain reaction), Gelmini y col. Quantitative polymerase chain reaction-based homogeneous assay with flurogenic probes to measure C-Erb-2 oncogene amplification. Clin. Chem. 43, 752-758 (1997) y Livak y col. Towards fully automated

45 genome wide polymorphism screening. Nat. Genet. 9, 341-342 (19995). Este tipo de sonda puede denominarse genéricamente una sonda hidrófoba. Las sondas hidrolíticas/Taqman adecuadas para uso en detección en tiempo real y de punto final también se proporcionan. Éstas pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en la secuencia de nucleótidos presentada como SEQ ID NO: 11. La sonda está marcada adecuadamente, por ejemplo usando las marcas detalladas a continuación.

En el sistema Molecular Beacon, véase el documento Tyagi & Kramer. Molecular beacons -probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14, 303-308 (1996) y Tyagi y col. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16, 49-53 (1998)), las balizas son sondas en forma de horquilla con un fluoróforo inactivado internamente cuya fluorescencia se restaura cuando está unido a su diana. Estas sondas pueden

55 denominarse sondas de horquilla.

Un sistema basado en fluorescencia en tiempo real adicional que puede incorporarse en los métodos de la invención es el sistema Scorpion de Zeneca, Véase el documento Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence de Whitcombe y col. Nature Biotechnology 17, 804 -807 (01 de agosto de 1999). Técnicas de detección en tiempo real o de punto final adicionales que son conocidas por los expertos en la materia y que están disponibles en el mercado incluyen la tecnología Lightcycler®, la tecnología de cebadores Amplifluour®, cebadores DzyNA (Todd y col., Clinical Chemistry 46: 5, 625-630 (2000)), o los sistemas Plexor™ de qPCR y qRT-PCR.

Por lo tanto, en aspectos adicionales de la invención, los productos de amplificación de ácidos nucleicos se detectan

65 usando técnicas en tiempo real o de punto final. En realizaciones específicas de la invención, las técnicas en tiempo real consisten en usar una cualquiera de sondas hidrolíticas (el sistema Taqman®), sondas FRET (sistema

Lightcycler®), cebadores de horquilla (sistema Amplifluour®), sondas de horquilla (el sistema Molecular beacons), sondas de horquilla incorporadas en un cebador (el sistema de sondas Scorpion®), cebadores que incorporan la secuencia complementaria de una ADNzima y un sustrato de ADNzima fluorescente escindible (DzYNA), Plexor qPCR y sistemas de bloqueo de oligonucleótidos.

5 En ciertas realizaciones, la mezcla de reacción contendrá todos de; la muestra que está siendo ensayada, las una o más moléculas de ácido nucleico sustrato, reactivos, tampones y enzimas requeridas para amplificación de la molécula de ácido nucleico (ligada) novedosa opcionalmente, además, los reactivos requeridos para permitir detección en tiempo real o de punto final de productos de amplificación. Por lo tanto, todo el método de detección

10 para la ligasa dependiente de ATP o de NAD (procedente de las una o más células bacterianas u hongos de interés) puede producirse en una única reacción, con una salida cuantitativa, y sin necesidad de ninguna etapa de lavado intermedia. El uso de una reacción de “único tubo” es ventajosa porque no existe necesidad de análisis aguas abajo para obtener resultados, que conducen a resultados obtenidos más rápidamente. Además, mantener la reacción en un entorno de “único tubo” reduce el riesgo de contaminación cruzada y permite una salida cuantitativa de los

15 métodos de la invención. Además, las reacciones de único tubo single están más susceptibles a automatización, por ejemplo en un contexto de alto rendimiento.

Como alternativa, los métodos de la invención pueden llevarse a cabo por etapas. Por lo tanto, en una primera etapa puede ser necesario, en primer lugar, preparar la muestra en una forma adecuada para uso en el método de la 20 invención. Por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, puede requerirse lisis celular selectiva o permeabilidad celular en aumento.

Los métodos de la invención también pueden demostrar tener utilidad de diagnóstico, con lo que una infección puede detectarse de forma específica y sensible en las fases tempranas, cuando solamente niveles mínimos de las 25 células bacterianas o fúngicas infecciosas que expresan una ligasa dependiente de ATP o de NAD están presentes y se desea determinar qué tipo de organismo es activo en la infección. Por lo tanto, los métodos de la invención pueden usarse para diagnosticar el microorganismo responsable de una infección, o una enfermedad asociada con la presencia de un microorganismo. Todos los aspectos de la invención y etapas del método, tal como se describe en el presente documento son, por lo tanto, aplicables a un método de diagnóstico del organismo responsable de

30 una infección, o una enfermedad asociada con la presencia de un microorganismo, tal como una célula bacteriana o fúngica.

Por lo tanto, en un aspecto adicional específico, se proporciona un método de diagnóstico del organismo responsable de una infección, o una enfermedad asociada con la presencia de una célula bacteriana o fúngica, que 35 comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en las etapas de, en una muestra obtenida del sujeto:

(a) poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para actividad de ligasa dependiente de ATP en la muestra,

(b) incubar la muestra puesta en contacto de este modo en condiciones adecuadas para actividad de ligasa 40 dependiente de ATP; y

(c) determinar específicamente la presencia (y/o la cantidad) de una molécula de ácido nucleico ligada que resulta de la acción de la ligasa dependiente de ATP sobre la molécula de ácido nucleico sustrato para indicar la presencia de hongos y/o bacterias que causan la infección

45 El método puede comprender adicionalmente:

(d) poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para actividad de ligasa dependiente de NAD en la muestra,

(e) incubar la muestra puesta en contacto de este modo en condiciones adecuadas para actividad de ligasa 50 dependiente de NAD; y

(f) determinar específicamente la presencia (y/o la cantidad) de una molécula de ácido nucleico ligada que resulta de la acción de la ligasa dependiente de NAD sobre la molécula de ácido nucleico sustrato para indicar la presencia de bacterias que causan la infección solamente.

55 Análogamente, se proporciona un método de diagnóstico del organismo responsable de una infección, o una enfermedad asociada con la presencia de una célula bacteriana o fúngica, que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en las etapas de, en una muestra obtenida del sujeto:

(a) tratar la muestra en condiciones que inhiben el fondo de mamífero de ligasa dependiente de ATP pero que no 60 afectan a ligasas dependientes de NAD y dependientes de ATP microbianas

(b): lisar la muestra para liberar las ligasas dependientes de NAD y dependientes de ATP microbianas

(c): poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para actividad de ligasa dependiente de ATP en la muestra,

65

El método puede comprender adicionalmente:

(d) incubar la muestra puesta en contacto de este modo en condiciones adecuadas para actividad de ligasa dependiente de ATP; y

5 (e) determinar específicamente la presencia (y/o la cantidad) de una molécula de ácido nucleico ligada que resulta de la acción de la ligasa dependiente de ATP sobre la molécula de ácido nucleico sustrato para indicar la presencia de hongos y/o bacterias que causan la infección

(f): poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para actividad de ligasa dependiente de NAD en la muestra,

(g): incubar la muestra puesta en contacto de este modo en condiciones adecuadas para actividad de ligasa dependiente de NAD; y

(h): determinar específicamente la presencia (y/o la cantidad) de una molécula de ácido nucleico ligada que resulta de la acción de la ligasa dependiente de NAD sobre la molécula de ácido nucleico sustrato para indicar la presencia de bacterias que causan la infección solamente.

15 En este contexto la “muestra” será generalmente una muestra clínica. La muestra que está siendo usada dependerá de la condición que está siendo ensayada. Muestras típicas que pueden usarse, pero que no pretenden limitar la invención, incluyen muestras de sangre completa, suero, plasma, plaquetas y orina etc., tomadas de un paciente, de la forma más preferente un paciente humano. Tal como se ha mencionado anteriormente, las muestras contendrán células de mamífero. Los métodos de la invención permiten que la actividad de ligasa de células de mamífero se elimine de la muestra antes de la detección de la actividad de ligasa microbiana, permitiendo de este modo que los métodos tengan utilidad de diagnóstico.

En una realización preferida, el ensayo será un ensayo in vitro llevado a cabo en una muestra eliminada de un 25 sujeto.

Los métodos de diagnóstico descritos anteriormente pueden basarse adicionalmente en la etapa de obtener la muestra de un sujeto. Los métodos de obtener una muestra adecuada de un sujeto son bien conocidos en la técnica. El método puede llevarse a cabo comenzando con una muestra que ya ha sido aislada del paciente en un procedimiento independiente. Los métodos de diagnóstico se llevarán a cabo de la forma más preferente en una muestra procedente de un ser humano, pero el método de la invención puede tener utilidad de diagnóstico para muchos animales.

Los métodos de diagnóstico de la invención pueden usarse para complementar cualesquiera técnicas de diagnóstico

35 ya disponibles, potencialmente como un método de confirmación de un diagnóstico inicial. Como alternativa, los métodos pueden usarse como un método de diagnóstico preliminar por derecho propio, dado que los métodos proporcionan un medio de diagnóstico rápido y conveniente. Además, debido a su inherente sensibilidad, los métodos de diagnóstico de la invención requieren solamente una muestra mínima, impidiendo de este modo cirugía invasiva innecesaria. Además, una muestra grande pero no concentrada también puede ensayarse eficazmente de acuerdo con los métodos de la invención.

Por lo tanto, los métodos de la invención tienen múltiples aplicaciones más allá de la detección de organismos contaminantes en una muestra. La descripción proporcionada anteriormente con respecto a los aspectos de detección básica de la invención se aplica mutatis mutandis a los aspectos adicionales de la invención y no se repite

45 por razones de concisión. Por ejemplo, todas las etapas de los métodos y controles adecuados pueden incorporarse en estos métodos de la invención.

En realizaciones específicas la ligasa, más específicamente dependiente de NAD, microbiana se deriva de un microorganismo patógeno, en particular una bacteria patógena.

La bacteria puede ser cualquier bacteria que es capaz de causar infección o enfermedad en un sujeto, preferentemente un sujeto humano. En una realización, las bacterias comprenden o consisten esencialmente en o consisten en una o más cualquiera de especies de Staphylococcus, en particular Staphylococcus aureus y preferentemente cepas resistentes a meticilina, especies de Enterococcus, especies de Streptococcus, especies de

55 Mycobacterium, en particular Mycobacterium tuberculosis, especies de Vibrio, en particular Vibrio cholerae, Salmonella y/o Escherichia coli etc. Las bacterias pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en especies de Clostridium y en particular C. difficile en ciertas realizaciones. C. difficile es la causa principal de diarrea y colitis asociadas a antibióticos, una infección intestinal asociada a la atención sanitaria que afecta en su mayoría a pacientes ancianos con otras enfermedades subyacentes.

En realizaciones específicas, la ligasa, más específicamente dependiente de ATP, microbiana se deriva de hongos patógenos. Los hongos pueden ser cualesquiera hongos que son capaces de causar infección o enfermedad en un sujeto, preferentemente un sujeto humano. En una realización, el hongo comprende o consiste esencialmente en o consiste en uno o más cualquiera de Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei,

65 Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum y Pneumocystis jirovecii.

También se desvelan kits de ensayo para realizar estos métodos de la invención. El kit de ensayo puede ser un kit de ensayo desechable en ciertas realizaciones. Cada componente del kit de ensayo puede suministrarse en un compartimento un portador independiente, o uno o más de los componentes pueden combinarse -siempre que los componentes puedan almacenarse de forma estable conjuntamente.

5 Por lo tanto, se desvela un kit para uso en los métodos de la invención que comprende:

(a): al menos una molécula de ácido nucleico que actúa como sustrato para actividad de ligasa microbiana en la muestra

(b): medios para inhibir la actividad de ligasa dependiente de ATP procedente de células de mamífero, medios que no inhiben la actividad de las ligasas microbianas.

Todos los aspectos y realizaciones de los métodos de la invención se aplican mutatis mutandis a los kits de la divulgación. Por lo tanto, los medios para inhibir la actividad de ligasa dependiente de ATP de células de mamífero,

15 medios que no inhiben la actividad de las ligasas microbianas, pueden comprender un agente adecuado para alterar el pH de la muestra en la que tiene lugar la reacción. En realizaciones particulares, el agente comprende una solución a pH elevado. En realizaciones específicas, los medios para inhibir la actividad de ligasa dependiente de ATP procedente de células de mamífero, medios que no inhiben la actividad de las ligasas dependientes de ATP microbianas comprenden, consisten esencialmente en o consisten en hidróxido sódico (NaOH) o carbonato sódico (Na2CO3) (para elevar el pH). El agente puede estar presente en cualquier concentración o volumen adecuado como sería apreciado fácilmente por un experto en la materia. En una realización específica, el NaOH es NaOH 5 mM.

El tratamiento con medios adecuados para inhibir la actividad de ligasa dependiente de ATP procedente de células

25 de mamífero, tal como se describe en el presente documento, puede requerir inicialmente aplicación de un agente para penetrar selectivamente la membrana celular de células de mamífero. Por lo tanto, los kits de la divulgación pueden además comprender, consistir esencialmente en o consistir en un agente que permeabiliza la membrana celular de mamífero pero que no penetra en la pared celular del microorganismo. Pueden emplearse cualquier agente adecuado. En realizaciones específicas, el agente es un detergente, tal como Triton X-100.

Los kits pueden comprender además cebadores para detección específica de una molécula de ácido nucleico ligada producida mediante actividad de ligasa microbiana en la muestra sobre la molécula de ácido nucleico sustrato. Los cebadores adecuados comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las secuencias de nucleótidos presentadas como SEQ ID NO: 4 y 5 y SEQ ID NO: 9 y 10.

35 En realizaciones adicionales, la al menos una molécula de ácido nucleico se inmoviliza sobre un soporte sólido o se proporciona junto con medios para inmovilizar la molécula de ácido nucleico sustrato sobre dicho soporte sólido. La inmovilización de la molécula de ácido nucleico sustrato sobre un soporte sólido permite la captura eficaz de la ligasa microbiana procedente de la muestra. La interacción de la molécula de ácido nucleico sustrato inmovilizada con la ligasa da como resultado la generación de una molécula de ácido nucleico ligada, novedosa. Por lo tanto, los kits de la divulgación pueden comprender además un soporte sólido. El sustrato puede o no proporcionarse cargado previamente sobre el soporte sólido. Si no está inmovilizado previamente sobre el soporte sólido, reactivos adecuados para permitir la inmovilización pueden proporcionarse en el kit, opcionalmente junto con instrucciones adecuadas. Reactivos para permitir la inmovilización serían bien conocidos para un experto en la materia. Puede

45 utilizarse cualquier medio de inmovilización siempre que no tenga un efecto adverso sobre la implementación de los métodos de la invención, especialmente en términos de especificidad y sensibilidad de detección de la ligasa microbiana a partir de las una o más células bacterianas o fúngicas o microorganismos diana.

Cualquier soporte sólido adecuado puede incluirse en los kits de la divulgación. La naturaleza del soporte sólido no es crítica para el rendimiento de la invención, siempre que la molécula de ácido nucleico sustrato pueda inmovilizarse sobre él sin afectar de forma adversa a la actividad de ligasa microbiana, incluyendo la capacidad de la enzima para interactuar con la molécula de ácido nucleico. Ejemplos no limitantes de soportes sólidos incluyen cualquiera de perlas, tales como perlas de poliestireno y perlas paramagnéticas y derivados de las mismas, columnas de afinidad, placas de microvaloración, etc. Donde la molécula de ácido nucleico sustrato es, de hecho,

55 dos (o más) moléculas de ácido nucleico que están ligadas entre sí, una o ambas de las moléculas de ácido nucleico sustrato pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido. En realizaciones específicas, las moléculas de ácido nucleico sustrato independientes pueden inmovilizarse sobre el mismo soporte que otra. Esto permite que las moléculas estén próximas para garantizar que el ligamiento sea eficiente si la ligasa microbiana (bacteriana y/o fúngica) está presente en la muestra que se está ensayando. Reactivos de biotina y/o estreptavidina pueden incorporarse en los kits para facilitar la inmovilización, por ejemplo.

El kit también puede comprender medios para facilitar la lisis o para incrementar la permeabilidad de las células microbianas en la muestra, para permitir que la actividad de ligasa microbiana se detecte. La descripción de medios adecuados en el presente documento se aplica mutatis mutandis a los kits de la divulgación. En una realización, el

65 kit comprende además perlas para facilitar la lisis de células microbianas en la muestra (a través del uso de una técnica de rotura física con perlas “bead-beater”). En realizaciones específicas, las perlas tienen aproximadamente 1

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donde F y R se refiere a cebadores directo e inverso, S1, S2 y AS son los 3 componentes del sustrato.

Protocolo de ensayo

5 1. Añadir 10 ml de caldo de sangre (diluidos a 1:4) a tubos falcon de 15 ml estériles

2.: Añadir 10 perlas de cerámica bloqueadas y lavadas

3.: Añadir 0,2 ml de Triton al 10 %, invertir para mezclar

4.: Centrifugar a 4000 rpm durante 20 minutos en centrífuga de mesa

5.: Aspirar el sobrenadante

6.: Añadir 1 ml de H2O

7.: Resuspender el sedimento

8.: Añadir 9 ml de H2O

9.: Añadir 0,5 ml de BSA al 5 %

10. Añadir 50 l de NaOH 1 M (dando NaOH 5 mM pH 12), invertir para mezclar 15 11. Centrifugar a 4000 rpm durante 20 minutos

12.: Aspirar el sobrenadante, dejando perlas secas, neutralizar con 10 ml de TrisCl 50 mM pH 7,5, mezclar mediante vórtice durante 20 s

13.: Centrifugar a 4000 rpm durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante

14.: Retirar la solución restante

15.: Resuspender las perlas y las células de levadura sedimentada en 100 l de mezcla de lisis mecánica:

BSA al 5 %, 20 l

Triton-X-100 al 1 %, 10 l

25 Tween 20 1 %, 10 l 10x Tampón de reacción de ADN ligasa T4, 10 l ADN AS1318 1 ng/l, 10 l DTT 1 M, 1 l H2O, 39 l

16.: Transferir a tubos de lisis mecánica (tubos estériles Sarstedt de 2 ml, n.º de cat. 72. 694. 006)

17.: Ribolizar a potencia 5 m/s durante 45 s, esperar 2 minutos, a continuación repetir

18.: Breve etapa de centrifugado (2 minutos)

19. Incubar a 37 ºC durante 30 minutos 35 20. 2 l a PCR

Programa del ciclo térmico 50 grados, 2 minutos 95 grados, 15 minutos 1x 94 grados, 10 s 72 grados, 5 s 30x

La mezcla de PCR contenía 10 l de SYBR Green 2X (Eurogentec mix, n.º de cat. RT-SN2X-03+NR), 2,25 l de cebador F 10 M, 2,25 l de cebador R 10 M, 3,5 l de H2O 45 Resultados

La figura muestra resultados de ensayo en tiempo real para el ensayo de PCR, 10 curvas son (de izquierda a derecha): 24000 células, 2400 células, 240 células, 0 células, las trazas restantes son controles del tampón.

Ejemplo 2. Demostración de la inactivación de ligasa dependiente de ATP del anfitrión con NaOH

Fundamento. Este experimento se realizó para demostrar la capacidad del pH alcalino de inactivar ligasa dependiente de ATP del anfitrión liberada desde leucocitos de mamífero. 55 Método

Para células de mamífero se diluyeron 10 ml de sangre a 50 ml con agua para lisar los glóbulos rojos. Los leucocitos se recogieron mediante centrifugado.

Las células se resuspendieron en hepes 50 mM pH 7 y se lisaron mediante ribolisis tal como se describe en la etapa 15 del ejemplo 1 anterior y a continuación se diluyeron 100 veces en agua.

Una alícuota de las células lisadas se trató con NaOH 5 mM pH 12 durante 20 minutos mientras que otra alícuota 65 permanecía sin tratar. Después del tratamiento con NaOH, las células lisadas se diluyeron en mezcla de ligasa y se

ensayaron para actividad de ligasa, tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1.

Para bacterias

5 E. coli cultivada se diluyó en agua y se trató con NaOH 5 mM, NaOH 5 mM y BPer al 50 %(v/v) (Fisher, N.º de Cat. 78243) (para lisar las células bacterianas) o con Bper solamente. Después del tratamiento durante 20 minutos, las células se diluyeron en mezcla de ligasa y se ensayaron para actividad de ligasa, tal como se ha descrito en el ejemplo 1 excepto que se usó el tampón de ligasa de ADN de E. coli que contenía NAD.

10 Resultados

Después de la PCR, se registraron los ciclos en los que la PCR se volvió positiva (véase a continuación).

15 Leucocitos + NaOH 28.3 Leucocitos -NaOH 19,5

E. coli + NaOH 20,5

E. coli + NAOH + BPer 15,2

E. coli + BPer 15,2

20 Conclusión

El tratamiento de los leucocitos con NaOH redujo la señal generada por PCR en 9 ciclos en comparación con leucocitos no tratados. Esto se debe a la inactivación de la ligasa del anfitrión mediante NaOH. En contraste, E. coli

25 lisada con BPer producía la misma señal de PCR ya se tratara la ligasa con NaOH o no. Esto demuestra que la ligasa presente en las bacterias es mucho más resistente al tratamiento alcalino con NaOH. Si las bacterias se tratan con NaOH solamente, la señal es baja porque las bacterias permanecen intactas y la ligasa no es liberada en el ensayo.

30 Ejemplo 3. Ensayo en caldo de sangre para levadura.

El fin de este experimento es mostrar que la levadura (Candida albicans como ejemplo) puede detectarse de forma sensible en presencia de caldo de sangre. La preparación de soluciones de ensayo y los componentes del sustrato fueron tal como se enumeró anteriormente

35 en el ejemplo 1.

Protocolo de ensayo

Un protocolo de ensayo típico es el siguiente. 40

1.: A 0,25 ml de Triton X-100 al 10 % (v/v) en un tubo de centrífuga de 15 ml, añadir 10 ml de caldo de sangre y mezclar. Nota: si se adiciona con bacterias u hongos, añadirlos en esta etapa.

2.: Incubar durante 5 minutos en la mesa de trabajo, a continuación centrifugar a 3-4000 x g durante 20 minutos.

3.: Verter el sobrenadante e invertir el tubo sobre un pañuelo desechable para secar.

: 45 4. Añadir 1 ml de H2O y pipetear para resuspender.

5.: Añadir 9 ml de H2O e invertir para mezclar. Añadir 1 ml de NaOH 50 mM e invertir para mezclar

6.: Incubar 5 minutos en la mesa de trabajo, a continuación centrifugar a 3-4000 x g durante 20 minutos.

7.: Verter el sobrenadante e invertir el tubo para secar.

8.: Resuspender el sedimento en 1 ml de Tris 50 mM pH 7,5, transferir a un tubo de microcentrífuga, centrifugar a

: 50 8.000 rpm 3 minutos, eliminar pipeteando el sobrenadante

9.: Añadir 50 l de mezcla Ribomix y mezclar con el sedimento resuspendido.

10.: Transferir a un tubo de ribolisis de 2 ml que contenía perlas de ribolisis.

11.: Ribolizar a una potencia 4 durante 20 s.

12. Colocar el tubo a 37 °C durante 30 minutos para ligamiento. 55 13. Centrifugar a 8000 rpm durante 3 minutos

14. Retirar 2 l para PCR.

Mezcla Ribomix: BSA al 5 % 10 l

Tritonal 1 % 5 l

Tweenal 1 % 5 l

10 X tampón rxn 5 l (que contiene ATP/NAD)

ADN 0,1pmol/l/l5 l

H2O 20 l

Mezcla de PCR: Mezcla SYBR Stratagene 10 l (# 600830) Cebador F 10 M2 l Cebador R 10 M2 l UDGasa 0,4 l Muestra 2 l Agua 3,6 l

PROG de PCR

55 grados 10 minutos

95 grados 10 minutos 1x

95 grados 10 s

65 10s

72 10s 40x

Secuencias de ADN (todas leídas 5'-3')

imagen8

10 Cebador F GGA CAA CGG CCG AAC TGG GAA GGC G (SEQ ID NO: 9) Cebador R TAG GCG TCG GTG ACA AAC GGC CAG C (SEQ ID NO: 10) Resultados

15 Experimento 1a

C. albicans en medio de cultivo frente a C. albicans en caldo de sangre (tratado con NaOH). Cuando se midió C. albicans usando el protocolo anterior, con una etapa de tratamiento con NaOH, los resultados fueron tal como se muestra en la tabla 1 a continuación:

20 Tabla 1.

Medio de cultivo: Caldo de sangre

Número de C. albicans: Ct Diferencia de Ct Diferencia numérica respecto al control (veces) Ct Diferencia de Ct Diferencia numérica respecto al control (veces)

390 UFC/ml: 24,1 3,5 11,3 24,5 4,6 24,3

98 UFC/ml: 26,1 1,5 2,8 27,0 2,1 4,3

25 UFC/ml: 25,3 2,3 4,9 27,7 1,4 2,6

Control: 27,6 0 29,1 29,1 0

Dado que cada diferencia de Ct representa un incremento de dos veces en la señal, las cifras en la columna

25 “diferencia numérica” se dan para mostrar la diferencia real. Por ejemplo, 390 UFC/ml de C albicans dieron un incremento de 11,3 en la señal respecto al fondo o una diferencia de Ct de 3,5 en el medio de cultivo. Los resultados muestran:

1. C. albicans puede medirse de forma sensible en caldo de sangre.

30 2. La señal de fondo en caldo de sangre es muy baja cuando el tratamiento con NaOH ha sido usado.

imagen9

imagen10

Claims

imagen1

imagen2

(f) determinar específicamente la presencia (y/o la cantidad) de una molécula de ácido nucleico ligada que resulta de la acción de la ligasa dependiente de ATP sobre la molécula de ácido nucleico sustrato para indicar la presencia de hongos, donde la ausencia de una molécula de ácido nucleico ligada indica la ausencia de células fúngicas en la muestra.

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