ES2305646T3 - Deteccion de estreptococos del grupo b. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia o la ausencia de Estreptococos del Grupo B (GBS) en una muestra biológica de un individuo, dicho método comprendiendo: llevar a cabo al menos una etapa de ciclización, en donde una etapa de ciclización comprende una etapa de amplificación y una etapa de hibridación, en donde dicha etapa de amplificación comprende poner en contacto a dicha muestra con un par de iniciadores de pts para producir un producto de amplificación de pts si está presente una molécula de ácido nucleico de pts de GBS en dicha muestra, en donde dicha etapa de hibridación comprende poner en contacto a dicha muestra con un par de sondas de pts, en donde una de las sondas de pts está marcada con una mitad fluorescente donante y la otra sonda de pts está marcada con una mitad fluorescente aceptora correspondiente; y detectar la presencia o la ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre dicha mitad fluorescente donante y dicha mitad fluorescente aceptora de dicha sonda de pts. (i) en donde la presencia o la ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o la ausencia de GBS en dicha muestra, y (ii) en donde dicho par de iniciadores de pts comprende un primer iniciador de pts y un segundo iniciador de pts, en donde dicho primer iniciador de pts comprende la secuencia 5''-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3'' (SEQ ID NO: 1), y en donde dicho segundo iniciador de pts comprende la secuencia 5''-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3'' (SEQ ID NO: 2); o en donde dicho par de sondas de pts comprende una primera sonda de pts y una segunda sonda de pts, en donde dicha primera sonda de pts comprende la secuencia 5''-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA A-3'' (SEQ ID NO: 3), y en donde dicha segunda sonda de pts comprende la secuencia 5''-CAA GTA AAT GCA GAA ACA GG-3'' (SEQ ID NO: 4).
Description
Detección de estreptococos del grupo B.
Esta invención se relaciona con diagnósticos de
bacterias, y más particularmente con la detección de estreptococos
del grupo B (GBS).
Los Estreptococos del Grupo B (GBS) son unas
bacterias Gram positivas comúnmente encontradas en la garganta y en
el intestino delgado de adultos, y en la vagina de las mujeres.
Normalmente, este organismo no causa enfermedades en el huésped.
Durante el parto, sin embargo, un bebé puede llegar a infectarse con
GBS. Las infecciones causadas por GBS son la causa principal de
morbidez neonatal y de mortalidad en los Estados Unidos, con tasas
de mortalidad tan altas como del 50% en los casos no tratados. En
años recientes, los antibióticos administrados durante el parto han
reducido grandemente la incidencia de GBS en neonatales.
Las recomendaciones actuales de CDC piden que
las mujeres se analicen por GBS durante la semana 35 a la 37 del
período de gestación por medio de un cultivo. Las mujeres que se
encuentra que están colonizadas con GBS son tratadas con
antibióticos intravenosos durante el parto. Esté método ha reducido
la incidencia de infección neonatal y a pocas pacientes se les
suministra un tratamiento innecesario con antibióticos. Sin embargo,
el problema de sepsis neonatal por GBS no ha sido eliminado. La
colonización con GBS es a menudo transitoria, así que la falta de
colonización en la semana 35 de gestación no garantiza que no estará
presente el GBS en la semana 40. También, muchas pacientes se
presentan por primera vez a los proveedores del servicio médico al
momento del parto y no han sido examinadas por GBS. La decisión de
tratar con antibióticos en estos casos se debe tomar con base en
factores de riesgo tales como gestación < 37 semanas, ruptura de
membrana >12 semanas, la corta edad de la paciente, y/o ser de
etnia negra o hispana.
Idealmente, la determinación de la colonización
por GBS se haría durante el trabajo temprano del parto y los
resultados de laboratorio estarían disponibles dentro de unas pocas
horas. La identificación convencional de GBS requiere de cultivo.
Ya que el cultivo puede requerir hasta 72 horas para una respuesta
definitiva, los médicos pueden proporcionar innecesariamente
antimicrobianos al momento del suministro en forma empírica. El uso
excesivo de antimicrobianos puede predisponer el desarrollo de
resistencia antimicrobiana y añade el riesgo de reacciones adversas
incluida la anafilaxis letal. Las pruebas rápidas de antígeno (por
ejemplo, la aglutinación de látex) también han sido utilizadas para
diagnosticar GBS, pero estos análisis carecen de la sensibilidad
cuando se los compara con el cultivo. En realidad, la sensibilidad
de las pruebas de antígeno para detectar GBS es tan baja que la FDA
ha emitido una alerta de que estos tipos de ensayos no pueden ser
utilizados para diagnosticar GBS sin el respaldo de un cultivo.
Ke y colaboradores (Ke D y colaboradores, 2000,
Clin Chem. 46(3): 324-331) desarrollaron un
ensayo con base en la PCR para la detección rápida de GBS con base
en el gen cfb que codifica al factor
Christie-Atkins-Munch-Petersen
(CAMP), mientras que Bergeron y colaboradores (Bergeron y
colaboradores, 2000, N Engl J Med.
343(3):175-179) describieron un método
rápido para la detección de infecciones causadas por estreptococo
del Grupo B en mujeres embarazadas al momento del alumbramiento y
estudiaron la eficacia de dos ensayos de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para análisis de rutina de mujeres embarazadas.
WO 03/025216 se relaciona con métodos
moleculares de clasificación de estreptococos del grupo B, los
cuales comprenden analizar la secuencia de nucleótidos de una o más
regiones dentro de los genes cpsD, cpsE, cpsF, cpsG y/o cpsl/M de
dicha bacteria, dicha(s) región(es) comprendiendo uno
o más nucleótidos cuya secuencia varía entre especies, así como
polinucleótidos útiles en tales métodos.
La patente estadounidense No. 6.593.093 B1
provee métodos para detector Estreptococos del Grupo A (GAS) en
muestras biológicas utilizando PCR en tiempo real. También se
proveen los iniciadores y las sondas para la detección de GAS así
como los artículos de manufactura que contienen a tales iniciadores
y sondas para detectar GAS.
WO 03/093306 y WO 02/34771 divulgan proteínas de
estreptococo del grupo B (Streptococcus agalactiae) y de
estreptococo del grupo A (Streptococcus pyogenes), incluidas
las secuencias de aminoácidos y las correspondientes secuencias de
nucleótidos. En WO 02/34771 se suministran datos que muestran que
las proteínas son antígenos útiles para vacunas, composiciones
inmunogénicas, y/o diagnósticas. Las proteínas son también objetivos
para los antibióticos.
WO 02/092818 se relaciona con la secuencia del
genoma y con las secuencias de nucleótidos que codifican para los
polipéptidos de Streptococcus agalactiae, tal como los
polipéptidos de la envoltura celular, o polipéptidos específicos o
secretados, o polipéptidos involucrados en el metabolismo y los
procesos de replicación, así como vectores o células que contienen
dichas secuencias. La solicitud también se relaciona con el uso de
los mismos para desarrollar vacunas, herramientas de diagnóstico,
chips de ADN y para identificación de objetivos terapéuticos.
\newpage
En WO 00/37646, se identifican una serie de
genes en Estreptococos del Grupo B, cuyos productos se pueden
asociar con la superficie exterior del organismo. Los genes, o
fragmentos funcionales de los mismos, pueden ser útiles en la
preparación de compuestos terapéuticos, por ejemplo, vacunas para
inmunizar a un paciente contra una infección microbiana.
La invención provee métodos de identificación de
estreptococos del grupo B (GBS) en una muestra biológica o en una
muestra no biológica. Los iniciadores y las sondas para detectar GBS
son suministrados por la invención, en forma de kits que contienen
a tales iniciadores y sondas. Los métodos de la invención se pueden
utilizar para identificar rápidamente el ADN de GBS a partir de
especímenes para diagnosticar la infección con GBS. Para el uso de
iniciadores y sondas específicas, los métodos incluyen la
amplificación y el monitoreo del desarrollo de productos
específicos de amplificación utilizando transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia (FRET).
En un aspecto de la invención, se provee un
método para detectar la presencia o la ausencia de GBS en una
muestra biológica de un individuo o en una muestra no biológica. El
método para detectar GBS incluye llevar a cabo una etapa de un
ciclo, que incluye una etapa de amplificación y una etapa de
hibridación. La etapa de amplificación incluye poner en contacto a
la muestra con un par de iniciadores de pts para producir un
producto de amplificación de pts si está presente en la
muestra una molécula de ácido nucleico de pts de GBS. La etapa de
hibridación incluye poner en contacto a la muestra con un par de
sondas de pts. Generalmente, los miembros del par de sondas
de pts hibridan dentro de no más de cinco nucleótidos de cada
uno de los otros. Una primera sonda de pts del par de sondas
de pts es marcada típicamente con una mitad fluorescente
donante y una segunda sonda de pts del par de sondas de
pts es marcada con una mitad fluorescente aceptora
correspondiente. El método incluye además detectar la presencia o la
ausencia de FRET entre la mitad fluorescente donante de la primera
sonda de pts y la mitad fluorescente aceptora de la segunda
sonda de pts. La presencia de FRET es usualmente indicativa
de la presencia de GBS en la muestra, mientras que la ausencia de
FRET es usualmente indicativa de la ausencia de GBS en la
muestra.
Un par de iniciadores de pts generalmente
incluyen a un primer iniciador de pts y a un segundo
iniciador de pts. El primer iniciador de pts incluye
la secuencia 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT
AG-3' (SEQ ID NO: 1), y el segundo iniciador de
pts incluye la secuencia 5'-TGC ATG TAT GGG
TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NO: 2). Alternativamente,
una primera sonda de pts incluye la secuencia
5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA
A-3' (SEQ ID NO: 3), y la segunda sonda de
pts incluye la secuencia 5'-CAA GTA AAT GCA
GAA ACA GG-3' (SEQ ID NO: 4).
En algunos aspectos, uno de los iniciadores de
pts puede ser marcado con una mitad fluorescente (ya sea un
donante o un aceptor, según sea apropiado) y puede tomar el lugar de
una de las sondas de pts.
Los miembros del par de sondas de pts
pueden hibridar dentro de no más de dos nucleótidos de cada uno de
los otros, o pueden hibridar dentro de no más de un nucleótido de
cada uno de los otros. Una mitad fluorescente donante
representativa es fluoresceína, y las mitades fluorescentes
aceptoras correspondientes incluyen LC-Red 640,
LC-Red 705, Cy5, y Cy5.5. Las mitades fluorescentes
donante y aceptora correspondientes adicionales son conocidas en el
arte.
En un aspecto, la etapa de detección incluye
excitar la muestra a una longitud de onda absorbida por la mitad
fluorescente donante y visualización y/o medición de la longitud de
onda emitida por la mitad fluorescente aceptora (esto es,
visualización y/o medición de FRET). En otro aspecto, la etapa de
detección incluye la cuantificación de FRET. En aún otro aspecto,
la etapa de detección se puede realizar después de cada etapa de
ciclización (por ejemplo, en tiempo real).
Generalmente, la presencia de FRET dentro de 45
ciclos (por ejemplo, 20, 25, 30, 35, ó 40 ciclos) incluye la
presencia de una infección de GBS en el individuo. Además,
determinar la temperatura de fusión entre una o ambas sondas de
pts y el producto de amplificación de pts puede
confirmar la presencia o la ausencia del GBS.
La muestra biológica representativa incluye una
muestra anal y/o vaginal. Los métodos anteriormente descritos
pueden incluir además prevenir la amplificación de un ácido nucleico
contaminante. La prevención de la amplificación puede incluir
llevar a cabo la etapa de amplificación en presencia de uracilo y
tratar la muestra con uracil-ADN glicosilasa antes
de la amplificación.
Además, la etapa de ciclización se puede llevar
a cabo sobre una muestra de control. Una muestra de control puede
incluir la misma porción de la molécula de ácido nucleico de pts de
GBS. Alternativamente, una muestra de control puede incluir una
molécula de ácido nucleico diferente a una molécula de de ácido
nucleico de pts de GBS. Las etapas de ciclización se pueden llevar
a cabo sobre una muestra de control tal, utilizando un par de
iniciadores de control y un par de sondas de control. Los
iniciadores y las sondas de control son diferentes a los
iniciadores y a las sondas de pts. Una o más etapas de
amplificación producen un producto de amplificación de control.
Cada una de las sondas de control hibrida al producto de
amplificación de control.
En otro aspecto de la invención, se proveen
artículos de fabricación, o kits. Los kits de la invención pueden
incluir un par de iniciadores de pts, y un par de sondas de
pts, y una mitad donante y la correspondiente mitad aceptora
fluorescentes. El primer iniciador de pts suministrado en un
kit de la invención comprende la secuencia 5'-TGA
GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NO: 1) y el
segundo iniciador de pts comprende la secuencia
5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3'
(SEQ ID NO: 2). La primera sonda de pts suministrada en un
kit de la invención comprende la secuencia 5'-CAA
ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA A-3' (SEQ ID NO: 3) y la
segunda sonda de pts comprende la secuencia
5'-CAA GTA AAT GCA GAA ACA GG-3'
(SEQ ID NO: 4).
Los artículos de fabricación incluyen mitades
fluoróforas para marcar las sondas o las sondas ya marcadas con la
mitad fluorescente donante y la correspondiente aceptora. El
artículo de fabricación puede incluir también un inserto en el
paquete con las instrucciones sobre él para la utilización de los
iniciadores, sondas, y las mitades fluoróforas para detectar la
presencia o la ausencia de GBS en una muestra.
En aún otro aspecto de la invención, se provee
un método para detectar la presencia o la ausencia de GBS en una
muestra biológica de un individuo o en una muestra no biológica. Tal
método incluye llevar a cabo al menos una etapa de ciclización. Una
etapa de ciclización puede incluir una etapa de amplificación y una
etapa de hibridación. Generalmente, una etapa de amplificación
incluye poner en contacto la muestra con un par de iniciadores de
pts para producir un producto de amplificación de pts
si está presente una molécula de ácido nucleico de pts de GBS en la
muestra. Generalmente, una etapa de hibridación incluye poner en
contacto a la muestra con una sonda de pts. Tal sonda de
pts es usualmente marcada con una mitad fluorescente donante
y una mitad fluorescente aceptora correspondiente. Los iniciadores
y las sondas son como se las definió anteriormente. El método
incluye adicionalmente la detección de la presencia o la ausencia de
transferencia de energía de resonancia por resonancia de
fluorescencia (FRET) entre la mitad fluorescente donante y la mitad
fluorescente aceptora de la sonda de pts. La presencia o la
ausencia de fluorescencia son indicativas de la presencia o de la
ausencia de GBS en dicha muestra.
En un aspecto, la amplificación puede emplear
una enzima polimerasa que tiene actividad de exonucleasa 5' a 3'.
De esta forma, la primera y la segunda mitades fluorescentes
estarían dentro de no más de 5 nucleótidos de cada uno de los otros
a lo largo de la longitud de la sonda. En otro aspecto, la sonda de
pts incluye una secuencia de ácido nucleico que permite la
formación de una estructura secundaria. Tal formación de una
estructura secundaria generalmente resulta en una proximidad
espacial entre la primera y la segunda mitades fluorescentes. De
acuerdo con este método, la segunda mitad fluorescente sobre una
sonda puede ser un apagador.
En otro aspecto de la invención, se provee un
método para detectar la presencia o la ausencia de GBS en una
muestra biológica de un individuo o en una muestra no biológica. Tal
método incluye llevar a cabo al menos una etapa de ciclización. Una
etapa de ciclización puede incluir una etapa de amplificación y una
etapa de enlazamiento de colorante. Una etapa de amplificación
generalmente incluye poner en contacto a la muestra con un par de
iniciadores de pts para producir un producto de amplificación
de pts si está presente en la muestra una molécula de ácido
nucleico de pts de GBS. Los iniciadores son como se los definió
anteriormente. Una etapa de enlazamiento de colorante generalmente
incluye poner en contacto al producto de amplificación de
pts con un colorante que enlaza al ADN bicatenario dentro del
producto de amplificación. De acuerdo con la invención, la
presencia de enlazamiento es típicamente indicativa de la presencia
de GBS en la muestra, y la ausencia de enlazamiento es típicamente
indicativa de la ausencia de GBS en la muestra. Tal método puede
incluir además las etapas de determinar la temperatura de fusión
entre el producto de amplificación de pts y el colorante que
enlaza al ADN bicatenario. Generalmente, la temperatura de fusión
confirma la presencia o la ausencia de GBS. Los colorantes
representativos de enlazamiento al ADN bicatenario incluyen
SYBRGreenI®, SYBRGoId®, y bromuro de etidio.
A menos que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo
significado como comúnmente los entiende alguien normalmente
capacitado en el arte a la cual pertenece esta invención. Aunque se
pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a
aquellos descritos aquí en la práctica o el análisis de la presente
invención, los métodos y los materiales adecuados son descritos más
adelante. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son únicamente
ilustrativos y no pretenden ser limitantes. En caso de conflicto,
la presente descripción, incluidas las definiciones, lo
controlarán.
Los detalles de una o más modalidades de la
invención se exponen con los dibujos acompañantes y la descripción
que se da más adelante. Otras características, objetivos y ventajas
de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y de la
descripción detallada, y de las reivindicaciones.
Se describe aquí un ensayo en tiempo real para
detectar GBS en una muestra biológica o en una muestra no biológica,
que es más sensible y específico que los ensayos existentes. Los
isómeros y las sondas para detectar infecciones de GBS y artículos
de fabricación que contienen a tales iniciadores y sondas son
proveídos por la invención. La mayor sensibilidad de la PCR en
tiempo real para la detección de GBS comparada con otros métodos,
así como las características mejoradas de la PCR en tiempo real
incluyen la confinación de la muestra y la detección en tiempo real
del producto amplificado, hacen posible la implementación de esta
tecnología para diagnósticos de rutina de infecciones de GBS en el
laboratorio clínico.
La invención provee métodos para detectar GBS
por medio de amplificación, por ejemplo, una porción del ácido
nucleico de pts de GBS. Los ácidos nucleicos de GBS diferente a
aquellos ejemplificados aquí (por ejemplo, diferentes a pts)
también pueden ser utilizados para detectar GBS en una muestra y son
conocidos por aquellos capacitados en el arte. Las secuencias de
ácido nucleico de GBS están disponibles (ver, por ejemplo, Nos. De
Acceso en el GenBank NC_004368 y NC_004116). Específicamente, los
iniciadores y las sondas para amplificar y detectar moléculas de
ácido nucleico de pts de GBS son suministrados por la invención.
Los iniciadores que amplifican a una molécula de
ácido nucleico de GBS, por ejemplo, pts de GBS se pueden
diseñar utilizando, por ejemplo, un programa de computador tal como
OLIGO (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO). Las
características importantes cuando se diseñan oligonucleótidos que
van a ser utilizados como iniciadores de amplificación incluyen,
pero no se limitan a, un producto de amplificación de tamaño
apropiado para facilitar la detección (por ejemplo, por medio de
electroforesis), temperaturas de fusión similares para los miembros
de un par de iniciadores, y la longitud de cada iniciador (esto es,
los iniciadores necesitan ser lo suficientemente largos para
aparearse con especificidad de secuencia y para iniciar la síntesis,
pero no tan largos como para que se reduzca la fidelidad durante la
síntesis de oligonucleótidos). Típicamente, los iniciadores
oligonucleótidos son de 15 a 30 nucleótidos de longitud.
El diseño de los oligonucleótidos que van a ser
utilizados como sondas de hibridación se puede llevar a cabo en una
forma similar al diseño de iniciadores, aunque los miembros de un
par de sondas preferiblemente se aparean con un producto de
amplificación dentro de no más de 5 nucleótidos de cada uno de los
otros sobre la misma hebra para que pueda ocurrir FRET (por
ejemplo, dentro de no más de 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos de cada uno de
los otros). Este grado mínimo de separación trae típicamente a las
mitades fluorescentes respectivas en una proximidad suficiente para
que ocurra FRET. Sin embargo, se debe entender que son posibles
otras distancias de separación (por ejemplo, 6 o más nucleótidos)
siempre que las mitades fluorescentes estén posicionadas
relativamente entre sí en forma apropiada (por ejemplo, con un brazo
enlazador) para que pueda ocurrir FRET. Además, se pueden diseñar
las sondas para hibridar con objetivos que contengan un polimorfismo
o mutación, permitiendo por lo tanto detección diferencial de cepas
de GBS con base ya sea en hibridación absoluta de pares diferentes
de sondas correspondientes a la cepa particular de GBS que va a ser
clasificada o las temperaturas diferenciales de fusión, entre, por
ejemplo, miembros de un par de sondas y cada producto de
amplificación correspondiente a una cepa de GBS que va a ser
clasificada. Como con los iniciadores de oligonucleótido, las
sondas de oligonucleótido tienen temperaturas de fusión similares, y
la longitud de cada sonda debe ser suficiente para que ocurra
hibridación específica de la secuencia pero no tan larga para que se
reduzca la fidelidad durante la síntesis. Las sondas de
oligonucleótido tienen generalmente de 15 a 30 nucleótidos de
longitud.
Las construcciones incluyen vectores que
contienen una molécula de ácido nucleico de GBS, por ejemplo,
pts de GBS o un fragmento del mismo. Las construcciones
pueden ser utilizadas, por ejemplo, como moléculas molde de control
de ácido nucleico. Los vectores adecuados para uso en la presente
invención son comercialmente disponibles y/o producidos por métodos
de rutina en el estado del arte de tecnología de ADN recombinante.
Las moléculas de ácido nucleico de pts de GBS pueden ser
obtenidas, por ejemplo, por medio de síntesis química, por
clonación directa de GBS, o por medio de amplificación por PCR. Una
molécula de ácido nucleico de GBS o un fragmento de la misma puede
ser operativamente enlazada a un promotor o a otros elementos
reguladores tales como una secuencia reforzadora, un elemento de
respuesta, o un elemento inducible que modula la expresión de la
molécula de ácido nucleico de GBS. Como se lo utiliza aquí,
operativamente enlazado se refiere a la conexión de un promotor y/o
otros elementos reguladores a una molécula de ácido nucleico de GBS
de tal manera que permita y/o regule la expresión de la molécula de
ácido nucleico de GBS. Un promotor que normalmente no dirija la
expresión de pts de GBS puede ser utilizado para dirigir la
transcripción de un ácido nucleico de pts utilizando, por
ejemplo, una polimerasa viral, una polimerasa bacteriana, o una ARN
polimerasa II de eucariota. Alternativamente, se puede utilizar el
promotor nativo de pts para dirigir la transcripción de un
ácido nucleico de pts. Además, operativamente enlazado se
puede referir a una conexión apropiada entre un promotor de
pts de GBS o elemento regulador y una secuencia heteróloga de
codificación (esto es, una secuencia no codificadora de pts,
por ejemplo, un gen reportero) en forma tal de permitir la expresión
de la secuencia heteróloga de codificación.
Las construcciones adecuadas para uso en los
métodos de la invención típicamente incluyen, además de las
moléculas de ácido nucleico de pts de GBS, secuencias que
codifican a un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de
resistencia antibiótica) para seleccionar construcciones deseadas
y/o transformantes, y un origen de replicación. La escogencia de
sistemas de vectores usualmente depende de varios factores,
incluyendo, pero sin limitarse a, la escogencia de células huésped,
la eficiencia de replicación, la capacidad de selección, la
inducibilidad, y la facilidad de recuperación.
Las construcciones que contienen moléculas de
ácido nucleico de pts de GBS se pueden propagar en una célula
huésped. Como se lo utiliza aquí, el término célula huésped
significa que incluye células procariotas y eucariotas tales como
células de levadura, de planta y de animal. Los huéspedes
procariotas pueden incluir E. coli, Salmonella typhimurium,
Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Los huéspedes
eucariotas incluyen levaduras tales como S. cerevisiae, S.
pombe, Pichia pastoris, células de mamífero tales como células
COS o células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto,
y células de planta tales como Arabidopsis thaliana y
Nicotiana tabacum. Se puede introducir una construcción
dentro de una célula huésped utilizando cualquiera de las técnicas
comúnmente conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en el
arte. Por ejemplo, la precipitación con fosfato de calcio,
electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección, y
transferencia de ácido nucleico mediada por virus son métodos
comunes para la introducción de ácidos nucleicos en células
huésped. Además, se puede suministrar directamente a las células
ADN desnudo (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos.
5.580.859 y 5.589.466).
Las patentes estadounidenses Nos. 4.683.202,
4.683.195, 4.800.159, y 4.965.188 divulgan técnicas convencionales
de PCR. La PCR emplea típicamente dos iniciadores de oligonucleótido
que se enlazan a un molde seleccionado de ácido nucleico (por
ejemplo, ADN o ARN). Los iniciadores útiles en la presente invención
incluyen oligonucleótidos capaces de actuar como un punto de
iniciación de síntesis de ácido nucleico dentro de secuencias de
ácido nucleico de pts de GBS. Un iniciador puede ser
purificado a partir de una digestión de restricción por medio de
métodos convencionales, o puede ser producido en forma sintética. El
iniciador es preferiblemente monocatenario para máxima eficiencia
en amplificación, pero el iniciador puede ser bicatenario. Los
iniciadores bicatenarios son primero desnaturalizados, esto es,
tratados para separar las hebras. Un método para desnaturalizar
ácidos nucleicos bicatenarios es por medio de calentamiento.
El término "polimerasa termoestable" se
refiere a una enzima de polimerasa que es estable al calor, esto es,
la enzima cataliza la formación de productos de extensión del
iniciador en forma complementaria a un molde y no se desnaturaliza
en forma irreversible cuando es sometida a las elevadas temperaturas
durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de
loa ácidos nucleicos de molde bicatenario. Generalmente, se inicia
la síntesis en el extremo 3' de cada iniciador y procede en
dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra del molde. Las polimerasas
termoestables han sido aisladas de Thermus flavus, T. ruber, T.
thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus
stearothermophilus, y de Methanothermus fervidus. Sin
embargo, las polimerasas que no son termoestables también pueden ser
empleadas en ensayos de PCR siempre que la enzima sea
reabastecida.
Si el ácido nucleico molde de GBS es
bicatenario, es necesario separar las dos hebras antes de que pueda
ser utilizado como molde en PCR. La separación de la hebra se puede
lograr por medio de cualquier método de desnaturalización adecuado
incluido un medio físico, un medio químico o un medio enzimático. Un
método para separar las hebras de ácido nucleico involucra el
calentamiento del ácido nucleico hasta que esté predominantemente
desnaturalizado (por ejemplo, una desnaturalización superior al
50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%). Las condiciones de calentamiento
necesarias para desnaturalizar ácido nucleico de molde dependerán,
por ejemplo, de la concentración de la sal amortiguadora y de la
longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que
están siendo desnaturalizados, pero típicamente está en el rango
desde aproximadamente 90ºC hasta aproximadamente 105ºC durante un
tiempo que depende de las características de la reacción tales como
la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La
desnaturalización típicamente se lleva a cabo aproximadamente entre
los 30 segundos y los 4 minutos.
Si el ácido nucleico bicatenario es
desnaturalizado por calor, se le permita a la mezcla de reacción
enfriarse hasta una temperatura que promueva el apareamiento de
cada iniciador a su secuencia objetivo sobre el ácido nucleico de
GBS. La temperatura para apareamiento es usualmente aproximadamente
de 35ºC hasta aproximadamente 65ºC. Los tiempos de apareamiento
pueden ser aproximadamente desde 10 segundos hasta aproximadamente 1
minuto. Se ajusta luego la mezcla de reacción hasta una temperatura
a la cual la actividad de la polimerasa es promovida u optimizada,
esto es, una temperatura suficiente para que ocurra la extensión
desde el iniciador apareado para generar productos complementarios
al ácido nucleico del molde. La temperatura debe ser suficiente para
sintetizar un producto de extensión de cada iniciador que esté
apareado a un molde de ácido nucleico pero no debe ser tan alta
para desnaturalizar un producto de extensión de su molde
complementario (por ejemplo, la temperatura de extensión
generalmente está en el rango aproximadamente desde 40ºC hasta
80ºC). Los tiempos de extensión pueden ser aproximadamente desde 10
segundos hasta aproximadamente 5 minutos.
Los ensayos de PCR pueden emplear ácido nucleico
de GBS tal como ADN o ARN, incluido ARN mensajero (ARNm). El molde
de ácido nucleico no necesita ser purificado; puede ser una fracción
menor de una mezcla compleja, tal como ácido nucleico de GBS
contenido en células humanas. El ADN o el ARN pueden ser extraídos
de una muestra biológica tal como de una muestra anal y/o vaginal
por medio de técnicas de rutina tal como aquellas descritas en
Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications
(Persing y colaboradores (eds), 1993, American Society for
Microbiology, Washington D.C). Los ácidos nucleicos se pueden
obtener de cualquier cantidad de fuentes, tal como plásmidos, o
fuentes naturales incluidas bacterias, levaduras, virus, organelos,
u organismos superiores tales como plantas o animales.
Los iniciadores de oligonucleótido se combinan
con reactivos de PCR bajo condiciones de reacción que induzcan la
extensión del iniciador. Por ejemplo, las reacciones de extensión de
la cadena generalmente incluyen KCl 50 mM, Tris-HCl
10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,001% (p/v), 0,5 -
1,0 \mug de ADN de molde desnaturalizado, 50 pmoles de cada
iniciador de oligonucleótido, 2,5 U de Taq polimerasa, y DMSO al
10%). Las reacción contienen usualmente 150 a 320 \muM cada una
de dATP, dCTP, dTTP, dGTP, y uno o más análogos de los mismos.
Las hebras recientemente sintetizadas de una
molécula bicatenaria que pueden ser utilizadas en las etapas
sucesivas de la reacción. Las etapas de separación de las hebras,
apareamiento, y alargamiento se pueden repetir tan a menudo como se
requiera para producir la cantidad deseada de productos de
amplificación correspondientes a la molécula objetivo de ácido
nucleico de GBS. Los factores limitantes en la reacción son las
cantidades de iniciadores, la enzima termoestable, y los
trifosfatos de nucleósido presentes en la reacción. Las etapas de
ciclización (esto es, de desnaturalización, de apareamiento, y de
extensión) se repiten preferiblemente al menos una vez. Para uso en
detección, el número de etapas de ciclización dependerá, por
ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una
muestra compleja de ácidos nucleicos, se requerirán más etapas de
ciclización para amplificar la secuencia objetivo, suficientes para
detección. Generalmente, las etapas de ciclización se repiten
aproximadamente al menos 20 veces, pero se pueden repetir tantas
veces como 40, 60 o inclusive 100 veces.
La tecnología FRET (ver, por ejemplo, las
patentes estadounidenses Nos. 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y
6.162.603) se basa en el concepto de que cuando una mitad
fluorescente donante y una correspondiente aceptora se ubican
dentro de una cierta distancia una de otra, la transferencia de
energía tiene lugar entre las dos mitades fluorescentes que pueden
ser visualizadas o bien detectadas y/o cuantificadas. Dos sondas de
oligonucleótido, cada una conteniendo una mitad fluorescente,
pueden hibridar a un producto de amplificación en posiciones
particulares determinadas por la complementariedad de las sondas de
oligonucleótido con la secuencia de ácido nucleico objetivo de GBS.
Por hibridación de las sondas de oligonucleótido con el ácido
nucleico del producto de amplificación en las posiciones
apropiadas, se genera una señal de FRET. Las temperaturas de
hibridación pueden estar en el rango aproximadamente desde 35 hasta
aproximadamente 65ºC aproximadamente durante 10 segundos hasta
aproximadamente 1 minuto.
El análisis de fluorescencia se puede llevar a
cabo utilizando, por ejemplo, un sistema de microscopio de
epifluorescencia de recuento de fotones (que contiene el espejo
dicroico apropiado y filtros para monitoreo de la emisión
fluorescente en el rango particular), un sistema fotomultiplicador
para recuento de fotones o un fluorómetro. La excitación para
iniciar la transferencia de energía se puede llevar a cabo con un
láser de ion argón, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta
intensidad, una fuente de luz por fibra óptica, u otra fuente de luz
de alta intensidad apropiadamente filtrada para excitación en el
rango deseado.
Como se lo utiliza aquí con respecto a las
mitades fluorescentes donante y aceptora correspondiente,
"correspondiente" se refiere a una mitad fluorescente aceptora
que tiene un espectro de emisión que traslapa al espectro de
excitación de la mitad fluorescente donante. La longitud de onda
máxima del espectro de emisión de la mitad fluorescente aceptora
debe ser al menos 100 nm superior a la longitud de onda máxima del
espectro de excitación de la mitad fluorescente donante. Por lo
tanto, se puede producir allí entre ellas una transferencia
eficiente de energía no radioactiva.
Las mitades fluorescentes tanto donante como la
aceptora correspondiente se escogen generalmente para (a)
transferencia de energía Förster de alta eficiencia; (b) un gran
desplazamiento final de Stokes (>100 nm); (c) desplazamiento de
la emisión lo más lejos posible dentro de la porción roja del
espectro visible (>600 nm); y (d) desplazamiento de la emisión a
una longitud de onda más alta que la emisión fluorescente Raman del
agua producida por excitación a la longitud de la onda de excitación
del donante. Por ejemplo, se puede escoger una mitad fluorescente
donante que tenga su máxima excitación cerca de una línea láser (por
ejemplo, 442 nm del Helio-Cadmio o 488 nm del
Argón), un coeficiente de extinción alto, una alta producción de
cuantos, y un buen traslapamiento de su emisión fluorescente con el
espectro de excitación de la mitad fluorescente aceptora
correspondiente. Se puede escoger una mitad fluorescente aceptora
correspondiente que tenga un alto coeficiente de extinción, una
alta producción de cuantos, un buen traslapamiento de su excitación
con la emisión de la mitad fluorescente donante, y de emisión en la
parte roja del espectro visible (>600 nm).
Las mitades fluorescentes donantes
representativas que pueden ser utilizadas con diferentes mitades
fluorescentes aceptoras en tecnología de FRET incluyen
fluoresceína, Amarillo Lucifer, B-ficoeritrina,
9-acridinaisotiocianato, Amarillo Lucifer VS, ácido
4-acetamido-4'-isotio-cianatostilbeno-2,2'-disulfónico,
7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcoumarina,
succinimi-dil 1-pirenobutirato, y
derivados del ácido
4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2,2'-disulfónico.
Las mitades fluorescentes aceptoras representativas, que depende de
la mitad fluorescente donante utilizada, incluyen
LC^{TM}-Red 640, LC^{TM}-Red
705, Cy5, Cy5.5, cloruro de sulfonil rodamina B de Lisamina,
isotiocianato de tetrametil rodamina, rodamina x isotiocianato,
eritrosina isotiocianato, fluoresceína, dietilenetriamina
pentaacetato u otros quelatos de iones de Lantánido (por ejemplo,
Europio, o Terbio). Las mitades fluorescentes Donante y aceptora se
pueden obtener, por ejemplo, de Molecular Probes (Junction City, OR)
o de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Las mitades fluorescentes donante y aceptora
pueden ser unidas a la sonda apropiada de oligonucleótido a través
de un brazo enlazador. La longitud de cada brazo enlazador es
importante, ya que los brazos enlazadores afectarán la distancia
entre las mitades fluorescentes donante y aceptora. La longitud de
un brazo enlazador para los propósitos de la presente invención es
la distancia en Angstroms (\ring{A}) desde la base del nucleótido
hasta la mitad fluorescente. En general, un brazo enlazador es
aproximadamente de 10 hasta aproximadamente 25 \ring{A}. El brazo
enlazador puede ser del tipo descrito en WO 84/03285. WO 84/03285
también divulga métodos para unir brazos enlazadores a una base
nucleótida particular, y también para unir mitades fluorescentes a
un brazo enlazador.
Una mitad fluorescente aceptora tal como un
LC^{TM}-Red 640-NHS-éster puede
ser combinada con C6-Fosforamiditas (disponibles
con ABI (Foster City, CA) o Glen Research (Sterling, VA)) para
producir, por ejemplo, LC^{TM}-Red
640-Fosforamidita. Los enlazadores frecuentemente
utilizados para acoplar una mitad fluorescente donante tal como
fluoresceína a un oligonucleótido incluyen enlazadores de tiourea
(derivados de FITC, por ejemplo, fluoresceína-CPG's
de Glen Research o de ChemGene (Ashland, MA)), enlazadores de amida
(derivados de fluoresceína-NHS-éster, tales como
fluoresceína-CPG de BioGenex (San Ramon, CA)), o
3'-amino-CPG's que requieren
acoplamiento de un fluoresceína-NHS-éster después
de la síntesis de oligonucleótidos.
La presencia de GBS ha sido detectada por medio
de cultivo de organismos así como por análisis rápidos de antígeno.
También se han utilizado métodos convencionales de PCR para detectar
GBS. La amplificación con base en PCR convencional es generalmente
seguida por transferencia de los productos de amplificación a un
soporte sólido y detección utilizando una sonda marcada (por
ejemplo, un Southern o un Northern blot). Estos métodos son de
trabajo intensivo y frecuentemente requieren más de un día para
completarse. Adicionalmente, la manipulación de productos de
amplificación con el propósito de detección (por ejemplo, por medio
de las manchas) incrementan el riesgo de introducir contaminación y
de dar falsos positivos.
Por medio de uso de instrumentación para PCR en
tiempo real comercialmente disponible (por ejemplo,
LightCycler^{TM}, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), se puede combinar la amplificación por PCR y la detección del producto de amplificación en una cubeta individual cerrada con un tiempo de ciclización dramáticamente reducido. Ya que la detección ocurre en forma concomitante con la amplificación, los métodos de PCR en tiempo real obvian la necesidad de manipulación del producto de amplificación, y disminuyen el riesgo de contaminación cruzada entre los productos de amplificación. La PCR en tiempo real reduce grandemente el tiempo de respuesta y es una alternativa atractiva para las técnicas convencionales de PCR en el laboratorio clínico.
LightCycler^{TM}, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), se puede combinar la amplificación por PCR y la detección del producto de amplificación en una cubeta individual cerrada con un tiempo de ciclización dramáticamente reducido. Ya que la detección ocurre en forma concomitante con la amplificación, los métodos de PCR en tiempo real obvian la necesidad de manipulación del producto de amplificación, y disminuyen el riesgo de contaminación cruzada entre los productos de amplificación. La PCR en tiempo real reduce grandemente el tiempo de respuesta y es una alternativa atractiva para las técnicas convencionales de PCR en el laboratorio clínico.
La presente invención provee métodos para
detectar la presencia o la ausencia de GBS en una muestra biológica
de un individuo o en una muestra no biológica. Los métodos
suministrados por la invención evitan problemas de contaminación de
la muestra, falsos negativos, y falsos positivos. Los métodos
incluyen llevar a cabo al menos una etapa de ciclización que
incluye la amplificación de una porción de GBS de una molécula de
ácido nucleico de pts de una muestra, utilizando un par de
iniciadores de pts. Cada uno de los iniciadores de
pts se aparea a un objetivo dentro o adyacente a una molécula
de ácido nucleico de pts de GBS de tal manera que al menos
una porción de cada producto de amplificación contiene una secuencia
de ácido nucleico correspondiente a pts. Más importante aún,
el producto de amplificación debe contener las secuencias de ácido
nucleico que son complementarias a las sondas de pts. Se
produce el producto de amplificación de pts siempre que esté
presente el ácido nucleico de GBS. Cada etapa de ciclización incluye
además poner en contacto a la muestra con un par de sondas de
pts. De acuerdo con la invención, se marca un miembro de
cada par de las sondas de pts con una mitad fluorescente
donante y la otra es marcada con una mitad fluorescente aceptora
correspondiente. La presencia o la ausencia de FRET entre la mitad
fluorescente donante de la primera sonda de pts y la mitad
fluorescente aceptora correspondiente de la segunda sonda de
pts se detecta por hibridación de las sondas de pts
al producto de amplificación de pts.
Cada etapa de ciclización incluye una etapa de
amplificación y una etapa de hibridación, y cada etapa de
ciclización es usualmente seguida por una etapa de detección de
FRET. Se llevan a cabo múltiples etapas de ciclización,
preferiblemente en un termociclador. Los métodos de la invención se
pueden llevar a cabo utilizando al iniciador de pts y al
juego de sondas para detectar la presencia de GBS. La detección de
FRET en la reacción de pts indica la presencia de un GBS.
Como se lo utiliza aquí, "amplificación" se
refiere al proceso de sintetizar moléculas de ácido nucleico que
son complementarias a una o ambas hebras de una molécula molde de
ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico de
pts de GBS). La amplificación de una molécula de ácido
nucleico incluye típicamente la desnaturalización del molde de
ácido nucleico, el apareamiento de los iniciadores con el molde de
ácido nucleico a una temperatura por debajo de las temperaturas de
fusión de los iniciadores, y el alargamiento enzimático de los
iniciadores para generar un producto de amplificación. La
amplificación típicamente requiere de la presencia de trifosfatos
de desoxirribonucleósidos, una enzima de ADN polimerasa (por
ejemplo, Platinum® Taq) y un amortiguador apropiado y/o cofactores
para actividad óptima de la enzima polimerasa (por ejemplo,
MgCl_{2} y KCl).
Si ocurre la amplificación de ácido nucleico de
GBS y se produce el producto de amplificación, la etapa de
hibridación resulta en una señal detectable con base en FRET entre
las membranas del par de sondas. Como se lo utiliza aquí,
"hibridación" se refiere al apareamiento de sondas con un
producto de amplificación. Las condiciones de hibridación
típicamente incluyen una temperatura que está por debajo de la
temperatura de fusión de las sondas, pero que evita la hibridación
no específica de las sondas.
Generalmente, la presencia de FRET indica la
presencia de GBS en la muestra, y la ausencia de FRET indica la
ausencia de GBS en la muestra. La inadecuada recolección del
espécimen, los retrasos en el transporte, las condiciones
inapropiadas de transporte, o el uso de ciertos hisopos para
recolección (alginato de calcio o mango de aluminio) son todas
condiciones que pueden sin embargo, afectar el éxito y/o la
precisión del resultado de una prueba. Utilizando los métodos
divulgados aquí, la detección de FRET dentro de etapas de 45 ciclos
es indicativa de una infección con GBS.
Los métodos de la invención también pueden ser
utilizados para estudios de la eficacia de la vacuna de GBS o para
estudios de epidemiología. Por ejemplo, una GBS atenuada en una
vacuna de ántrax puede ser detectada utilizando los métodos de la
invención durante el tiempo cuando la bacteria está aún presente en
un individuo. Para tales estudios de la eficacia de una vacuna, se
pueden utilizar los métodos de la invención para determinar, por
ejemplo, la persistencia de una cepa atenuada de GBS usada en una
vacuna, o se pueden llevar a cabo junto con un ensayo adicional tal
como un ensayo serológico para monitorear la respuesta inmune de un
individuo a tal vacuna. Además, se pueden utilizar los métodos de
la invención para distinguir una cepa de GBS de otra para estudios
de epidemiología, por ejemplo, del origen o severidad de un brote de
GBS.
Las muestras biológicas representativas que
pueden ser utilizadas para practicar los métodos de la invención
incluyen frotis dérmico, fluido cerebroespinal, sangre, esputo,
lavado bronco-alveolar, aspirados bronquiales,
tejido de pulmón y heces. Los métodos de recolección y
almacenamiento de muestras biológicas son conocidos por aquellos
capacitados en el arte. Las muestras biológicas pueden ser
procesadas (por ejemplo, por medio de métodos de extracción de
ácido nucleico y/o de kits conocidos en el estado del arte) para
liberar al ácido nucleico de GBS o en algunos casos, se puede poner
en contacto a la muestra biológica directamente con los componentes
de la reacción PCR y los oligonucleótidos apropiados.
Las muestras biológicas pueden ser cultivadas en
un medio adecuado para crecimiento de GBS. El medio de cultivo
puede ser analizado entonces por la presencia o ausencia de GBS
utilizando los métodos de la invención como se describió aquí. Por
ejemplo, las muestras que llegan a un laboratorio clínico para
detección de GBS utilizando los métodos de la invención, pueden
estar en la forma de un cultivo líquido que ha sido inoculado con
una muestra biológica de un individuo.
El análisis de la curva de fusión es una etapa
adicional que puede ser incluida en un perfil de ciclización. El
análisis de la curva de fusión se basa en el hecho de que los
fundidos de ADN a una temperatura característica llamada la
temperatura de fusión (Tm), que es definida como la temperatura a la
cual la mitad de los dobletes de ADN se ha separado en las hebras
individuales. La temperatura de fusión de un ADN depende
principalmente de su composición de nucleótidos. De esta forma, las
moléculas de ADN ricas en nucleótidos G y C tienen Tm más alto que
aquellas que tienen una abundancia de nucleótidos A y T. Por medio
de la detección de la temperatura a la cual se pierde la señal, se
puede determinar la temperatura de fusión de las sondas. En forma
similar, por medio de la detección de la temperatura a la cual se
genera la señal, se puede determinar la temperatura de apareamiento
de las sondas. La(s) temperatura(s) de fusión de las
sondas de pts del producto de amplificación de pts
puede(n) confirmar la presencia o la ausencia de GBS en la
muestra.
Dentro de cada corrida del termociclador, se
ciclizan también las muestras de control. Las muestras de control
positivo pueden amplificar un molde de control de ácido nucleico de
GBS (diferente de pts) utilizando, por ejemplo, iniciadores
de control y sondas de control. Las muestras de control positivo
pueden amplificar también, por ejemplo, una construcción de
plásmido que contiene moléculas de ácido nucleico de pts de
GBS. Tal plásmido de control puede ser amplificado internamente (por
ejemplo, dentro de la muestra) o en una muestra separada que corre
al mismo tiempo con las muestras de los pacientes. Cada corrida del
termociclador debe incluir también un control negativo que, por
ejemplo, carece del ADN molde de GBS. Tales controles son
indicadores del éxito o del fracaso de la amplificación, hibridación
y/o reacción de FRET. Por lo tanto, las reacciones de control
pueden determinar fácilmente, por ejemplo, la habilidad de los
iniciadores para aparearse con especificidad a la secuencia y para
iniciar el alargamiento, así como la habilidad de las sondas para
hibridar con especificidad a la secuencia y para que ocurra
FRET.
En una modalidad, los métodos de la invención
incluyen etapas para evitar la contaminación. Por ejemplo, se
describe un método enzimático que utiliza uracil-ADN
glicosilasa en las patentes estadounidenses Nos. 5.035.996,
5.683.896 y 5.945.313 para reducir o eliminar la contaminación entre
una corrida de termociclador y la siguiente. Además, son deseables
las prácticas y procedimientos estándar de contención de laboratorio
cuando se llevan a cabo los métodos de la invención. Las prácticas
y procedimientos de contención incluyen, pero no se limitan a,
áreas de trabajo separadas para diferentes etapas de un método,
campanas de contención, puntas de pipeta con filtros de barrera y
pipetas dedicadas por desplazamiento de aire. Las prácticas y los
procedimientos consistentes de contención por parte del personal
son necesarios para lograr precisión en el manejo en un laboratorio
de diagnostico de muestras clínicas.
Los métodos convencionales de PCR junto con
tecnología FRET pueden ser utilizados para llevar a cabo los métodos
de la invención. En una modalidad, se utiliza un instrumento
LightCycler^{TM}. Una descripción detallada del Sistema
LightCycler^{TM} y de monitoreo en línea y en tiempo real de la
PCR puede ser encontrada en
http://biochem.roche.com/
lihtcycler. Las siguientes solicitudes de patente describen una PCR en tiempo real como la utilizada en la tecnología LightCycler^{TM}: WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712. El instrumento LightCycler^{TM} es un termociclador rápido combinado con un fluorómetro de microvolumen utilizando óptica de alta calidad. Esta técnica de termociclado rápido utiliza cubetas de vidrio delgado como recipientes de reacción. El calentamiento y el enfriamiento de la cámara de reacción se controlan alternando aire calentado y aire a temperatura ambiente. Debido a la baja masa de aire y a la alta proporción de área superficial para el volumen de las cubetas, se pueden lograr velocidades muy rápidas de intercambio de temperatura dentro de la cámara térmica LightCycler^{TM}. La adición de colorantes fluorescentes seleccionados a los componentes de la reacción permiten que la PCR sea monitoreada en tiempo real y en línea. Además, las cubetas sirven como un elemento óptico para la recolección de señales (similar a la óptica de la fibra de vidrio), concentrando la señal en la parte superior de la cubeta. El efecto es una iluminación eficiente y un monitoreo de la fluorescencia de las muestras de microvolumen.
lihtcycler. Las siguientes solicitudes de patente describen una PCR en tiempo real como la utilizada en la tecnología LightCycler^{TM}: WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712. El instrumento LightCycler^{TM} es un termociclador rápido combinado con un fluorómetro de microvolumen utilizando óptica de alta calidad. Esta técnica de termociclado rápido utiliza cubetas de vidrio delgado como recipientes de reacción. El calentamiento y el enfriamiento de la cámara de reacción se controlan alternando aire calentado y aire a temperatura ambiente. Debido a la baja masa de aire y a la alta proporción de área superficial para el volumen de las cubetas, se pueden lograr velocidades muy rápidas de intercambio de temperatura dentro de la cámara térmica LightCycler^{TM}. La adición de colorantes fluorescentes seleccionados a los componentes de la reacción permiten que la PCR sea monitoreada en tiempo real y en línea. Además, las cubetas sirven como un elemento óptico para la recolección de señales (similar a la óptica de la fibra de vidrio), concentrando la señal en la parte superior de la cubeta. El efecto es una iluminación eficiente y un monitoreo de la fluorescencia de las muestras de microvolumen.
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El carrusel del LightCycler^{TM} que alberga a
las cubetas puede ser removido del instrumento. Por lo tanto, las
muestras pueden ser cargadas por fuera del instrumento (en un Cuarto
Limpio para PCR, por ejemplo). Además, esta característica permite
que el carrusel para muestras pueda ser limpiado y esterilizado en
forma fácil. El fluorómetro, como parte del aparato
LightCycler^{TM}, alberga la fuente de luz. La luz emitida es
filtrada y enfocada por medio de una lente de
epi-iluminación sobre la parte superior de la
cubeta. La luz fluorescente emitida desde la muestra es luego
enfocada por medio de la misma lente, pasada a través de un espejo
dicroico, filtrada apropiadamente, y enfocada sobre fotohíbridos
para recolección de datos. La unidad óptica actualmente disponible
en el instrumento LightCycler^{TM} (Roche Molecular Biochemicals,
Catálogo No. 2011468) incluye tres filtros de paso de banda (350
nm, 640 nm, y 710 nm), proveyendo detección de tres colores y varias
opciones de adquisición de fluorescencia. Las opciones de
recolección de datos incluyen el monitoreo una vez por etapa de
ciclización, adquisición completamente continua de una muestra única
para análisis de la curva de fusión, muestreo continuo (en el cual
la frecuencia de muestreo depende del número de la muestra) y/o la
medición gradual de todas las muestras después de un intervalo
definido de temperatura.
El LightCycler^{TM} puede ser operado
utilizando una estación de trabajo de un PC y puede utilizar un
sistema operativo Windows NT. Las señales de las muestras se
obtienen en la medida en que la máquina posiciona los capilares
secuencialmente sobre la unidad óptica. El software puede mostrar
las señales de fluorescencia en tiempo real inmediatamente después
de cada medición. El tiempo de adquisición de fluorescencia es de 10
- 100 milisegundos (ms). Después de cada etapa de ciclización, se
puede actualizar continuamente una visualización cuantitativa de la
fluorescencia versus el número de ciclos para todas las muestras.
Los datos generados se pueden almacenar para análisis
adicionales.
Como una alternativa para FRET, se puede
detectar un producto de amplificación utilizando un colorante para
enlazamiento del ADN bicatenario tal como un colorante fluorescente
de enlazamiento del ADN (por ejemplo, SYBRGreene® o SYBRGoId®
(Molecular Probes)). Por interacción con el ácido nucleico
bicatenario, tales colorantes fluorescentes para enlazamiento del
ADN emiten una señal de fluorescencia después de excitación con luz
a una longitud de onda adecuada. Un colorante para enlazamiento del
ADN bicatenario tal como un ácido nucleico que intercala al
colorante, puede ser también utilizado. Cuando se utilizan
colorantes para enlazamiento del ADN bicatenario, se realza
usualmente un análisis de la curva de fusión para la confirmación de la presencia del producto de amplificación.
usualmente un análisis de la curva de fusión para la confirmación de la presencia del producto de amplificación.
Como se describió aquí, también se pueden
detectar los productos de amplificación utilizando sondas marcadas
de hibridación que toman ventaja de la tecnología de FRET. Un
formato común de la tecnología de FRET utiliza dos sondas de
hibridación. Cada sonda puede ser marcada con una mitad fluorescente
diferente y son generalmente diseñadas para hibridar en forma muy
próxima entre sí en una molécula de ADN objetivo (por ejemplo, un
producto de amplificación). Una mitad fluorescente donante, por
ejemplo, fluoresceína, es excitada a 470 nm por medio de una fuente
de la fuente de luz del instrumento LightCycler^{TM}. Durante la
FRET, la fluoresceína transfiere su energía a una mitad
fluorescente aceptora tal como
LightCycler^{TM}-Red 640
(LC^{TM}-Red 640) o
LightCycler^{TM}-Red 705
(LC^{TM}-Red 705). La mitad fluorescente aceptora
que emite luz de una longitud de onda más larga, que es detectada
por un sistema de detección óptico del instrumento
LightCycler^{TM}. La FRET eficiente únicamente tiene lugar cuando
las mitades fluorescentes están en una proximidad local directa y
cuando el espectro de emisión de la mitad fluorescente donante
traslapa con el espectro de absorción de la mitad fluorescente
aceptora. La intensidad de la señal emitida puede ser
correlacionada con el número de moléculas originales de ADN objetivo
(por ejemplo, el número de genomas de GBS).
Otro formato de FRET utiliza tecnología TaqMan®
para detectar la presencia o la ausencia de un producto de
aplicación, y por lo tanto, la presencia o la ausencia de GBS. La
tecnología TaqMan® utiliza una sonda de hibridación monocatenaria
marcada con dos mitades fluorescentes. Cuando se excita una primera
mitad fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la
energía absorbida es transferida a una segunda mitad fluorescente
de acuerdo con los principios de la FRET. La segunda mitad
fluorescente es generalmente una molécula apagadora. Durante la
etapa apareamiento de la reacción de la PCR, la sonda de hibridación
marcada enlaza al ADN objetivo (esto es, el producto de
amplificación) y es degradada por medio de la actividad de la
exonucleasa 5' a 3' de la Taq Polimerasa durante la fase
subsiguiente de alargamiento. Como resultado, la mitad fluorescente
excitada y la mitad apagadora se separan espacialmente una de otra.
Como consecuencia, por excitación de la primera mitad fluorescente
en ausencia del apagador, se puede detectar la emisión de
fluorescencia de la primera mitad de fluorescencia. A manera de
ejemplo, un Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7700
(Applied Biosystems, Foster City, CA) utiliza tecnología TaqMan®, y
es adecuado para realizar los métodos descritos aquí para detectar
GBS. La información sobre amplificación y detección de la PCR
utiliza un sistema ABI PRISM® 7700 puede ser encontrada en
http://www.appliedbiosystems.com/products.
Las guías moleculares junto con FRET también
pueden ser utilizadas para detectar la presencia de un producto de
amplificación utilizando los métodos de PCR en tiempo real de la
invención. La tecnología de guías moleculares utiliza una sonda de
hibridación marcada como una primera mitad fluorescente y una
segunda mitad fluorescente. La segunda mitad fluorescente es
generalmente un apagador, y las marcas de fluorescencia se localizan
típicamente en cada extremo de la sonda. La tecnología de guías
moleculares utiliza un oligonucleótido como sonda que tiene
secuencias que permiten la formación de una estructura secundaria
(por ejemplo, una horquilla). Como resultado de la formación de la
estructura secundaria dentro de la sonda, ambas mitades
fluorescentes están en proximidad espacial cuando la sonda está en
solución. Después de hibridación a los ácidos nucleicos objetivo
(esto es, productos de amplificación), se rompe la estructura
secundaria de la sonda y las mitades fluorescentes se separan una
de la otra de tal manera que después de la excitación con luz de una
longitud de onda adecuada, se puede detectar la emisión de la
primera mitad fluorescente.
Se entiende que la presente invención no está
limitada por la configuración de uno o más instrumentos
comercialmente disponibles.
La invención provee además artículos de
fabricación para detectar GBS. Un artículo de fabricación de acuerdo
con la presente invención incluye iniciadores y sondas como se
definió anteriormente y se los utiliza para detectar GBS,
opcionalmente junto con materiales de empaque adecuados. Los
iniciadores y las sondas representativas para detección de GBS son
capaces de hibridar a las moléculas de ácido nucleico de pts
de GBS. Los métodos para diseñar iniciadores y sondas son
divulgados aquí, y se proveen iniciadores y sondas representativos
que amplifican e hibridan a las moléculas de ácido nucleico de
pts de GBS.
Los artículos de fabricación de la invención
también incluyen una o más mitades fluorescentes para marcar a las
sondas o, alternativamente, se pueden marcar las sondas
suministradas con el kit. Por ejemplo, un artículo de fabricación
puede incluir una mitad fluorescente donante para marcar a una de
las sondas de pts y una mitad fluorescente aceptora para
marcar a las otras sondas de pts, respectivamente. Los
ejemplos de mitades fluorescentes donantes adecuadas de FRET y las
mitades fluorescentes aceptoras correspondientes son proveídas mas
arriba.
Los artículos de fabricación de la invención
pueden contener también un inserto dentro del paquete o marca sobre
el paquete que tiene instrucciones sobre él para utilizar a los
iniciadores y las sondas de pts para detectar GBS en una
muestra. Los artículos de fabricación pueden incluir adicionalmente
reactivos para llevar a cabo los métodos divulgados aquí (por
ejemplo, amortiguadores, enzimas de polimerasa, cofactores, o
agentes para evitar la contaminación). Tales reactivos pueden ser
específicos para uno de los instrumentos comercialmente disponibles
descritos aquí.
La invención será descrita adicionalmente en los
siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención
descrita en las reivindicaciones.
Se utilizó un ensayo con un LightCycler para
detectar patógenos bacterianos de estreptococos del grupo B (GBS) de
frotis vaginal/anal. Se utilizó una región conservada del gen de la
fosfotransferasa (pts) de GBS como un objetivo para la detección por
el ensayo de la PCR.
Las secuencias del iniciador fueron las
siguientes: iniciador 1: 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG
CTT AG-3' (SEQ ID NO: 1); e iniciador 2:
5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3'
(SEQ ID NO: 2). Las secuencias de la sonda y de las etiquetas fueron
las siguientes: sonda 1: 5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT
CGT GCA A-fluoresceina-3' (SEQ ID
NO: 3); y sonda 2: 5'-LCRed640-CAA
GTA AAT GCA GAA ACA GG-fosfato-3'
(SEQ ID NO: 4).
Los iniciadores fueron ajustados a 50 \muM
midiendo la A_{260} de una dilución 1/50 (196 \mul de agua + 4
\mul, Factor de Dilución (DF) = 50). Se estimó la concentración
por medio de la siguiente fórmula:
((\muM
encontrada/50) x \mul restante) - \mul restante = agua para
añadir
Se disolvieron las sondas en TE' hasta una
concentración de 20 \muM (suministrada con las sondas y
resuspendidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante). La
concentración de los oligonucleótidos y del colorante fue chequeada
dos veces por medio de absorción UV utilizando las siguientes
ecuacionces de Biochemica, 1999, 1:5-8:
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\newpage
La Tabla 1 muestra la Mezcla de Reacción para la
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron 5 \mul de la muestra de frotis
con 15 \mul de la Mezcla de Reacción de la PCR y se añadió a la
cubeta del LightCycler para termociclado. Se amplificaron las
muestras por PCR y se detectaron los productos en un instrumento
LightCycler (Roche Applied Science, catálogo 2011468). El
procedimiento de ciclización utilizado para la PCR es mostrado en la
Tabla 2.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la señal detectada en el canal de 640
nm del instrumento LightCycler. El análisis de la curva de fusión,
realizada después de la amplificación de la PCR, fue utilizado para
confirmar la detección de GBS. Las muestras positivas para GBS
demuestran un Tm de 58ºC más o menos 2ºC, y fueron comparadas
directamente con el control positivo. Las muestras negativas no
tuvieron curva de fusión.
Se produjeron controles de plásmido por medio de
la clonación del producto de pts amplificado por medio del
iniciador de pts dentro de un plásmido (TA Cloning® Kit,
Invitrogen, Carlsbad, CA). Se utilizó al plásmido que contiene al
inserto objetivo para determinar la sensibilidad analítica de los
ensayos. La concentración de plásmido o el número de copia del
inserto del gen objetivo se determinó con la siguiente fórmula:
DS ADN,
A_{260} para las
moléculas/ul
\newpage
Dado:
1.
(A_{260} x
Factor de Dilución)/20 = mg/ml = \mug/\mul DS
ADN
1 A260 = 50 \mug/ml
1 A260 (50) = \mug/ml
1 A260 (50)/1000 = \mug/\mul
\vskip1.000000\baselineskip
2.
(6,02 x
10^{23} moléculas/mol) / (10^{12} pmol/mol) = 6,02 x 10^{11}
moléculas/pmol
\vskip1.000000\baselineskip
3. Pares de bases de ADN por molécula = N
\vskip1.000000\baselineskip
Entonces:
(A_{260} x
DF)/20 \mug/\mul x10^{6} pg/\mug x 1 pmol/660 pg x 1/N x
6,02 x10^{11} moléculas/pmol=
moléculas/\mul
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo abreviado:
(A_{260} x
DF)/20 x (9,12 x 10^{14} /N) =
moléculas/\mul
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN extraido de los cultivos de una variedad
de organismos diferentes fue utilizado para determinar si el ensayo
de GBS reaccionaría en forma cruzada con organismos que no son GBS.
Los organismos similares a GBS fueron analizados así como los
organismos comúnmente encontrados en una muestra de frotis anal o
vaginal. La Tabla 3 muestra organismos similares analizados y los
resultados. La Tabla 4 muestra a los otros especímenes analizados y
esos resultados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se detectaron solamente 5 copias del ADN
objetivo de GBS por reacción, por medio del ensayo con el
LightCycler de GBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de la tecnología con el LightCycler, se
cultivó es estándar dorado para detección de GBS. Los resultados del
cultivo de los especímenes de frotis vaginal/anal de mujeres,
recolectados durante la semana 35 a 37 del embarazo fueron
comparados con el análisis de GBS con un LightCycler.
Los resultados más abajo se calcularon
utilizando el software StatsDirect versión 1.9.15 (StatsDirect Ltd,
Cheshire, Reino Unido) e incluyen intervalos de confianza del 95%
(mostrados entre paréntesis). Una explicación de los valores
mostrados más abajo y de cómo se calculan estos valores puede ser
encontrada en
http://www.musc.edu/dc/icrebm/
sensitivity.html.
sensitivity.html.
Prevalencia (porcentaje de pacientes afectados
analizados; [a+c/d]):
21,14% (15,34% a 27,95%)
\vskip1.000000\baselineskip
Valor predictivo positivo (porcentaje de
pacientes con prueba positiva que tienen la enfermedad;
[a/a+b]):
90,24% (76,87% a 97,28%)
\vskip1.000000\baselineskip
Valor predictivo negativo (porcentaje de
pacientes con prueba negativa sin la enfermedad; [d/d+c]):
100% (97,28% a *%)
\vskip1.000000\baselineskip
Sensibilidad (positivos verdaderos detectados
para los pacientes afectados totales analizados; [a/a+c]):
100% (90,51% a *%)
\vskip1.000000\baselineskip
Especificidad (negativos verdaderos para los
pacientes no afectados analizados; [d/b+d]):
97,1% (92,74% a 99,2%)
\vskip1.000000\baselineskip
Se debe entender que mientras que la invención
ha sido descrita junto con la descripción detallada de la misma, la
descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la
invención, que está definida por el alcance de las reivindicaciones
adjuntas. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones están dentro
del alcance de las reivindicaciones siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
- \bullet WO 03025216 A [0006]
- \bullet US 4996143 A [0041]
- \bullet US 6593093 B [0007]
- \bullet US 5565322 A [0041]
- \bullet WO 03093306 A [0008]
- \bullet US 5849489 A [0041]
- \bullet WO 0234771 A [0008] [0008]
- \bullet US 6162603 A [0041]
- \bullet WO 02092818 A [0009]
- \bullet WO 8403285 A [0046] [0046]
- \bullet WO 0037646 A [0010]
- \bullet US 5035996 A [0060]
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<120> Detección de Estreptococos del
Grupo B
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B
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Claims (32)
1. Un método para detectar la presencia o la
ausencia de Estreptococos del Grupo B (GBS) en una muestra biológica
de un individuo, dicho método comprendiendo:
- llevar a cabo al menos una etapa de ciclización, en donde una etapa de ciclización comprende una etapa de amplificación y una etapa de hibridación, en donde dicha etapa de amplificación comprende poner en contacto a dicha muestra con un par de iniciadores de pts para producir un producto de amplificación de pts si está presente una molécula de ácido nucleico de pts de GBS en dicha muestra, en donde dicha etapa de hibridación comprende poner en contacto a dicha muestra con un par de sondas de pts, en donde una de las sondas de pts está marcada con una mitad fluorescente donante y la otra sonda de pts está marcada con una mitad fluorescente aceptora correspondiente; y
- detectar la presencia o la ausencia de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre dicha mitad fluorescente donante y dicha mitad fluorescente aceptora de dicha sonda de pts.
- (i)
- en donde la presencia o la ausencia de fluorescencia es indicativa de la presencia o la ausencia de GBS en dicha muestra, y
- (ii)
- en donde dicho par de iniciadores de pts comprende un primer iniciador de pts y un segundo iniciador de pts, en donde dicho primer iniciador de pts comprende la secuencia 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NO: 1), y en donde dicho segundo iniciador de pts comprende la secuencia 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NO: 2); o
en donde dicho par de sondas de pts
comprende una primera sonda de pts y una segunda sonda de
pts, en donde dicha primera sonda de pts comprende la
secuencia 5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA
A-3' (SEQ ID NO: 3), y en donde dicha segunda sonda
de pts comprende la secuencia 5'-CAA GTA AAT
GCA GAA ACA GG-3' (SEQ ID NO: 4).
2. El método de la reivindicación 1, en donde
dicha amplificación emplea una enzima polimerasa que tiene actividad
de exonucleasa de 5' a 3'.
3. El método de la reivindicación 2, en donde
dicha primera y segunda mitades fluorescentes están dentro de no más
de 5 nucleótidos de cada uno de los otros sobre dicha sonda.
4. El método de la reivindicación 3, en donde
dicha segunda mitad fluorescente es un apagador.
5. El método de la reivindicación 1, en donde
dicha sonda de pts comprende una secuencia de ácido nucleico
que permite la formación de una estructura secundaria, en donde,
dicha formación de una estructura secundaria resulta en una
proximidad espacial entre dicha primera y dicha segunda mitades
fluorescentes.
6. El método de la reivindicación 5, en donde
dicha segunda mitad fluorescente es un apagador.
7. El método de la reivindicación 1, en donde
los miembros de dicho par de sondas de pts hibridan dentro de
no más de cinco nucleótidos de cada uno de los otros, en donde dicha
primera sonda de pts de dicho par de sondas de pts
está marcada con una mitad fluorescente donante y dicha segunda
sonda de pts de dicho par de sondas de pts está
marcada con una mitad fluorescente aceptora correspondiente; y en
donde la presencia de FRET es indicativa de la presencia de GBS en
dicha muestra, y en donde la ausencia de FRET es indicativa de la
ausencia de GBS en dicha muestra.
8. El método de la reivindicación 7, en donde
los miembros de dicho par de sondas de pts hibridan dentro de
no más de dos nucleótidos de cada uno de los otros.
9. El método de la reivindicación 7, en donde
los miembros de dicho par de sondas de pts hibridan dentro de
no más de un nucleótido de cada uno de los otros.
10. El método de la reivindicación 7, en donde
dicha mitad fluorescente donante es fluoresceína.
11. El método de la reivindicación 7, en donde
dicha mitad fluorescente aceptora correspondiente es seleccionada
del grupo que consiste de LC-Red 640,
LC-Red 705, Cy5, y Cy5.5.
12. El método de la reivindicación 7, en donde
dicha etapa de detección comprende excitar a dicha muestra a una
longitud de onda absorbida por dicha mitad fluorescente donante y
visualizar y/o medir la longitud de onda emitida por dicha mitad
fluorescente aceptora.
13. El método de la reivindicación 7, en donde
dicha detección comprende cuantificar dicha FRET.
14. El método de la reivindicación 7, en donde
dicha etapa de detección se lleva a cabo después de cada etapa de
ciclización.
15. El método de la reivindicación 7, en donde
dicha etapa de detección se lleva a cabo en tiempo real.
16. El método de la reivindicación 7, que
comprende además determinar la temperatura de fusión entre una o
ambas de dichas sonda(s) de pts y dicho producto de
amplificación de pts, en donde dicha temperatura de fusión
confirma dicha presencia o dicha ausencia de dicho GBS.
17. El método de la reivindicación 7, en donde
la presencia de dicha FRET dentro de etapas de 45 ciclos es
indicativa de la presencia de una infección de GBS en dicho
individuo.
18. El método de la reivindicación 7, en donde
la presencia de dicha FRET dentro de etapas de 40 ciclos es
indicativa de la presencia de una infección de GBS endicho
individuo.
19. El método de la reivindicación 7, en donde
la presencia de dicha FRET dentro de etapas de 30 ciclos es
indicativa de la presencia de una infección de GBS endicho
individuo.
20. El método de la reivindicación 7, que
comprende además: prevenir la amplificación de un ácido nucleico
concomitante.
21. El método de la reivindicación 20, en donde
dicha prevención comprende llevar a cabo dicha etapa de
amplificación en presencia de uracilo.
22. El método de la reivindicación 21, en donde
dicha prevención comprende además tratar dicha muestra con
uracil-ADN glicosilasa antes de una primera etapa de
amplificación.
23. El método de la reivindicación 7, en donde
dicha muestra biológica es seleccionada del grupo que consiste de
frotis anal y/o vaginal.
24. El método de la reivindicación 7, en donde
dicha etapa de ciclización se lleva a cabo sobre una muestra de
control.
25. El método de la reivindicación 24, en donde
dicha muestra de control comprende a dicha porción de dicha molécula
de ácido nucleico de pts de GBS.
26. El método de la reivindicación 7, En donde
dicha etapa de ciclización utiliza un par de iniciadores de control
y un par de sondas de control, en donde dichos iniciadores de
control y dichas sondas de control son distintas a dichos
iniciadores de pts y a dichas sondas de pts, en donde
dicha etapa de amplificación produce un producto de amplificación de
control, en donde dichas sondas de control hibridan a dicho producto
de amplificación de control.
27. Un artículo de fabricación, que
comprende:
- -
- un par de iniciadores de pts, en donde dicho par de iniciadores de pts comprenden un primer iniciador de pts y un segundo iniciador de pts, en donde dicho primer iniciador de pts comprende la secuencia 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NO: 1), y en donde dicho segundo iniciador de pts comprende la secuencia 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NO: 2);
- -
- un par de sondas de pts, en donde dicho par de sondas de pts comprenden una primera sonda de pts y una segunda sonda de pts, en donde dicha primera sonda de pts comprende la secuencia 5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCAA-3' (SEQ ID NO: 3), y en donde dicha segunda sonda de pts comprende la secuencia 5'-CAA GTAAAT GCA GAAACA GG-3' (SEQ ID NO: 4); y
- -
- una mitad fluorescente donante y una mitad fluorescente aceptora correspondiente.
28. El artículo de fabricación de la
reivindicación 27, en donde dicha primera sonda de pts está
marcada con dicha mitad fluorescente donante y en donde dicha
segunda sonda de pts está marcada con dicha mitad
fluorescente aceptora correspondiente.
29. El artículo de fabricación de la
reivindicación 27, que comprende además un inserto en el empaque que
tiene instrucciones sobre el mismo para utilizar a dicho par de
iniciadores de pts y a dicho par de sondas de pts para
detectar la presencia o la ausencia de GBS en una muestra.
30. Un método para detectar la presencia o la
ausencia de GBS en una muestra biológica de un individuo, dicho
método comprendiendo:
- llevar a cabo al menos una etapa de ciclización, en donde una etapa de ciclización comprende una etapa de amplificación y una etapa de enlazamiento de colorante, en donde dicha etapa de amplificación comprende poner en contacto a dicha muestra con un par de iniciadores de pts para producir un producto de amplificación de pts si está presente una molécula de ácido nucleico de pts de GBS en dicha muestra, en donde dicha etapa de enlazamiento de colorante comprende poner en contacto a dicha producto de amplificación de pts, con un colorante que enlaza al ADN bicatenario; y
- detectar la presencia o la ausencia de enlazamiento de dicho colorante que enlaza al ADN bicatenario dentro de dicho producto de amplificación,
- (i)
- en donde la presencia de enlazamiento es indicativa de la presencia de GBS en dicha muestra, y en donde la ausencia de enlazamiento es indicativa de la ausencia de GBS en dicha muestra, y
- (ii)
- en donde dicho par de iniciadores de pts comprende un primer iniciador de pts y un segundo iniciador de pts, en donde dicho primer iniciador de pts comprende la secuencia 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NO: 1), y en donde dicho segundo iniciador de pts comprende la secuencia 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NO: 2)
31. El método de la reivindicación 30, en donde
dicho colorante que enlaza al ADN bicatenario se selecciona del
grupo que consiste de SYBRGreenI, SYBRGold, y bromuro de etidio.
32. El método de la reivindicación 30, que
comprende además determinar la temperatura de fusión entre dicho
producto de amplificación de pts y dicho colorante que enlaza
al ADN bicatenario, en donde dicha temperatura de fusión confirma
dicha presencia o ausencia de dicho GBS.
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