DE602004013413T2

DE602004013413T2 - Nachweis von Streptococcus aus der B-Gruppe

Info

Publication number: DE602004013413T2
Application number: DE602004013413T
Authority: DE
Inventors: James R. Rochester Uhl; Franklin R. Rochester Cockerill; Christian Aichinger; Astrid Reiser
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 2003-11-18
Filing date: 2004-11-17
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2024-11-18
Also published as: DE602004013413D1; EP1541697A1; ATE393834T1; US7790875B2; EP1541697B1; US20050106578A1; US20090111111A1; US20100291582A1; ES2305646T3; US8097413B2; US7427475B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betriff die bakterielle Diagnostik und insbesondere den Nachweis von Gruppe B-Streptococcus (GBS; group B streptococcus).
HINTERGRUND
Gruppe B-Streptococcus (GBS) ist ein grampositives Bakterium, das im Allgemeinen im Hals und den unteren Eingeweiden Erwachsener und in der Vagina von Frauen auftritt. Normalerweise verursacht dieser Organismus im Wirt keine Krankheiten. Während der Geburt eines Kindes kann das Kind allerdings mit GBS infiziert werden. GBS-Infektionen sind die Hauptursache für frühkindliche Erkrankungen oder Sterblichkeit in den USA, wobei die Todesraten in unbehandelten Fällen 50% beträgt. In den vergangenen Jahren haben während der Wehen verabreichte Antibiotika das Auftreten von neonatalen GBS signifikant reduziert.
Die gegenwärtigen Empfehlungen der CDC (Center for Disease Control; amerikanische Gesundheitsbehörde) verlangen ein Screening der Frauen nach GBS durch Kultur während der 35. bis 37. Schwangerschaftswoche. Frauen, von denen gefunden wird, dass sie mit GBS kolonisiert sind, werden während der Wehen mit intravenösen Antibiotika behandelt. Dieser Ansatz reduzierte das Auftreten von neonatalen Infektionen und weniger Patienten werden unnötigerweise einer Antibiotika-Behandlung unterzogen. Allerdings wurde das Problem einer neonatalen GBS-Sepsis nicht völlig ausgeschlossen. Die Kolonisierung mit GBS ist häufig transient, so dass ein Fehlen einer Kolonisierung in der 35. Schwangerschaftswoche nicht garantiert, dass in der 40. Woche keine GBS vorhanden sein wird. Viele Patienten werden auch das erste Mal während der Wehen einem Leistungserbringer im Gesundheitswesen vorgestellt und wurden zuvor nicht auf GBS untersucht. Die Entscheidung zur Behandlung mit Antibiotika muss in diesen Fällen auf Grundlage von Risikofaktoren wie z. B. Schwangerschaftswoche < 37, Platzen der Fruchtblase > 12 Stunden, Schwangerschaft im jungen Alter und/oder schwarzer oder hispanischer ethnischer Herkunft getroffen werden.
Idealerweise würde die Bestimmung einer Kolonisierung mit GBS früh während der Wehen vorgenommen werden und die Laborergebnisse innerhalb weniger Stunden erhältlich sein. Die übliche Identifikation von GBS erfordert eine Kultur. Da die Kultur für eine definitive Aussage bis zu 72 Stunden erfordert, können die Ärzte unnötige antimikrobielle Mittel zum Zeitpunkt der Geburt auf einer empirischen Grundlage bereitstellen. Die übermäßige Verwendung von antimikrobielle Mitteln könnte zur Entwicklung von antimikrobieller Resistenz beitragen und das Risiko von Nebenreaktionen einschließlich lebensbedrohlicher Anaphylaxie erhöhen. Schnelle Antigentests (z. B. Latexagglutination) wurden auch zur Diagnose von GBS verwendet, aber diese Tests haben im Vergleich zu Kulturen einen Mangel an Empfindlichkeit. Tatsächlich sind die Empfindlichkeiten von Antigentests zum Nachweis von GBS so niedrig, dass die FDA (Fond and Drug Administration; US-amerikanische Nahrungsmittel- und Arzneimittelbehörde) eine Warnung herausgegeben hat, dass diese Testtypen nicht zur Diagnose von GBS ohne Kulturbackup verwendet werden können.
Ke und Mitarbeiter (Ke D et al., 2000, Clin Chem. 46(3): 324–331) entwickelten einen Test auf PCR-Basis zum schnellen Nachweis von GBS auf Grundlage des Gens cfb, das den Christie-Atkins-Munch-Petersen-(CAMP-)-Faktor kodiert, wohingegen Bergeron und Mitarbeiter (Bergeron et al., 2000, N Engl J Med. 343(3): 175–179) ein schnelles Verfahren zum Nachweis von Infektionen mit Gruppe B-Streptococcus bei schwangeren Frauen zum Zeitpunkt der Geburt beschrieben und die Wirksamkeit von zwei Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)-Tests für Routineuntersuchungen schwangerer Frauen untersuchten.
WO 03/025216 betrifft molekulare Verfahren zur Typisierung von Gruppe B-Streptococci, wobei die Verfahren das Analysieren der Nukleotidsequenz einer oder mehrerer Regionen innerhalb der Gene cpsD, cpsE, cpsF, cpsG und/oder cpsl/M des Bakterium umfassen, wobei diese Region(en) ein oder mehrere Nukleotide umfassen, deren Sequenz sich bei verschiedenen Typen unterscheidet, wie auch Polynukleotide, die in diesen Verfahren verwendbar sind.
US 6,593,093 B1 stellt Verfahren zum Nachweis von Gruppe A-Streptococcus (GAS) in biologischen Proben unter Verwendung von Real-Time-PCR bereit. Primer und Sonden zum Nachweis von GAS wie auch Artikel zur Herstellung, die solche Primer und Sonden zum Nachweis von GAS enthalten, werden auch bereitgestellt.
WO 03/093306 und WO 02/34771 offenbaren Proteine aus Gruppe B-Streptococcus (Streptococcus agalactiae) und Gruppe A-Streptococcus (Streptococcus pyogenes), einschließlich Aminosäuresequenzen und entsprechenden Nukleotidsequenzen. In WO 02/34771 werden Daten angegeben, die zeigen, dass die Proteine geeignete Antigene für Vakzine, immunogene Zusammensetzungen und/oder Diagnostika sind. Die Proteine sind auch Ziele für Antibiotika.
WO 02/092818 betrifft die Genomsequenz und Nukleotidsequenzen, die für Polypeptide aus Streptococcus agalactiae kodieren, wie z. B. zelluläre Envelope-Polypeptide oder sekretierte oder spezifische Polypeptide oder Polypeptide, die in den Metabolismus und den Replikationsprozess einbezogen sind, wie auch Vektoren oder Zellen, die diese Sequenzen umfassen. Die Anmeldung betrifft auch die Verwendung dieser zum Entwickeln von Vakzinen, diagnostischen Hilfsmitteln, DNA-Chips und zum Identifizieren therapeutischer Ziele.
In WO 00/37646 wird eine Reihe von Genen in Gruppe B-Streptococcus identifiziert, deren Produkte mit der äußeren Oberfläche des Organismus assoziiert sein könnten. Die Gene, oder funktionelle Fragmente davon, können bei der Herstellung von Therapeutika, z. B. Vakzinen zur Immunisierung eines Patienten gegen eine mikrobielle Infektion, verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren von Gruppe B-Streptococcus (GBS; group B streptococcus) in einer biologischen Probe oder in einer nicht-biologischen Probe. Primer und Sonden zum Nachweisen von GBS wie auch Kits enthaltend solche Primer und Sonden werden durch die Erfindung bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um schnell GBS-DNA aus Einzelproben zur Diagnose einer GBS-Infektion zu identifizieren. Unter Verwendung spezifischer Primer und Sonden schließen die Verfahren das Amplifizieren und das Beobachten der Entwicklung spezifischer Amplifikationsprodukte unter Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET; fluorescence resonance energy transfer) ein.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in einer biologischen Probe aus einem Individuum oder in einer nicht-biologischen Probe bereitgestellt. Das Verfahren zum Nachweisen von GBS schließt das Durchführen mindestens eines zyklischen Schritts ein, der einen Amplifizierungsschritt und einen Hybridisierungsschritt umfasst. Der Ampliflzierungsschritt schließt das Inkontaktbringen der Probe mit einem pts-Primerpaar ein, um ein pts-Amplifikationsprodukt herzustellen, wenn ein GBS-pts-Nukleinsäuremolekül in der Probe vorhanden ist. Der Hybridisierungsschritt schließt das Inkontaktbringen der Probe mit einem pts-Sondenpaar ein. Im Allgemeinen hybridisieren die Mitglieder des pts-Sondenpaars innerhalb von höchstens fünf Nukleotiden voneinander. Eine erste pts-Sonde des pts-Sondenpaars ist typischerweise mit einer Donorfluoreszenz-Komponente markiert und eine zweite pts-Sonde des pts-Sondenpaars ist mit einer entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponente markiert. Das Verfahren schließt das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von FRET zwischen der Donorfluoreszenz-Komponente der ersten pts-Sonde und der Akzeptorfluoreszenz-Komponente der zweiten pts-Sonde ein. Die Gegenwart von FRET ist im Allgemeinen indikativ für die Gegenwart von GBS in der Probe, wohingegen die Abwesenheit von FRET im Allgemeinen indikativ für die Abwesenheit von GBS in der Probe ist.
Ein pts-Primerpaar schließt im Allgemeinen einen ersten pts-Primer und einen zweiten pts-Primer ein. Der erste pts-Primer schließt die Sequenz 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NR. 1) ein und der zweite pts-Primer schließt die Sequenz 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NR. 2) ein. Alternativ schließt eine erste pts-Sonde die Sequenz 5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA A-3' (SEQ ID NR. 3) ein und die zweite pts-Sonde schließt die Sequenz 5'-CAA GTA AAT GCA GAA ACA GG-3' (SEQ ID NR. 4) ein.
In einigen Aspekten kann der pts-Primer mit einer Fluoreszenzkomponente (entweder einem Donor oder einem Akzeptor, wie geeignet) markiert sein und kann an die Stelle einer der pts-Sonden treten.
Die Mitglieder des pts-Sondenpaars können innerhalb von höchstens zwei Nukleotiden voneinander hybridisieren oder sie können innerhalb von nicht mehr als einem Nukleotid voneinander hybridisieren. Eine repräsentative Donorfluoreszenz-Komponente ist Fluorescein und entsprechende Akzeptorfluoreszenz-Komponenten schließen LC-Red 640, LC-Red 705, Cy5 und Cy5.5 ein. Zusätzliche entsprechende Donor- und Akzeptorfluoreszenz-Komponenten sind im Stand der Technik bekannt.
In einem Aspekt schließt der Nachweisschritt ein das Anregen der Probe bei einer Wellenlänge, die von der Donorfluoreszenz-Komponente absorbiert wird und das Sichtbarmachen und/oder Messen der Wellenlänge, die von der Akzeptorfluoreszenz- Komponente emittiert wird (d. h. Visualisieren und/oder Messen von FRET). In einem weiteren Aspekt schließt der Nachweisschritt das Quantifizieren von FRET ein. In noch einem weiteren Aspekt kann der Nachweisschritt nach jedem zyklischen Schritt durchgeführt werden (z. B. in Echtzeit).
Im Allgemeinen zeigt die Gegenwart von FRET innerhalb von 45 Zyklen (z. B. 20, 25, 30, 35 oder 40 Zyklen) die Gegenwart einer GBS-Infektion in dem Individuum an. Zusätzlich kann das Bestimmen der Schmelztemperatur zwischen einer oder beiden der pts-Sonde(n) und dem pts-Amplifikationsprodukt die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS bestätigen.
Repräsentative biologische Proben schließen anale und/oder vaginale Abstriche ein. Die vorstehend beschriebenen Verfahren können das Verhindern der Amplifikation einer kontaminierenden Nukleinsäure einschließen. Das Verhindern der Amplifikation kann das Durchführen des Amplifikationsschritts in Gegenwart von Uracil und das Behandeln der Probe mit Uracil-DNA-Glycosylase vor dem Amplifizieren einschließen.
Zusätzlich kann der zyklische Schritt mit einer Kontrollprobe durchgeführt werden. Eine Kontrollprobe kann den gleichen Teil des GBS-pts-Nukleinsäuremoleküls einschließen. Alternativ kann eine Kontrollprobe ein Nukleinsäuremolekül einschließen, das von einem GBS-pts-Nukleinsäuremolekül verschieden ist. Die zyklischen Schritte können mit einer solchen Kontrollprobe unter Verwendung eines Paars von Kontrollprimern und eines Paars von Kontrollsonden durchgeführt werden. Die Kontrollprimer und -sonden sind von den pts-Primern und -Sonden verschieden. Ein oder mehrere Amplifizierungsschritte produzieren ein Kontrollamplifikationsprodukt. Jede der Kontrollsonden hybridisiert mit dem Kontrollamplifikationsprodukt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Artikel zur Herstellung oder Kits bereitgestellt. Erfindungsgemäße Kits können ein pts-Primerpaar und ein pts-Sondenpaar und eine Donor- und entsprechende Akzeptorfluoreszenz-Komponente einschließen. Der erste pts-Primer, der in einem erfindungsgemäßen Kit bereitgestellt wird, umfasst die Sequenz 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NR. 1) und der zweite pts-Primer umfasst die Sequenz 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NR. 2). Die erste pts-Sonde, die in dem erfindungsgemäßen Kit bereitgestellt wird, umfasst die Sequenz 5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA A-3' (SEQ ID NR. 3) und die zweite pts-Sonde umfasst die Sequenz 5'-CAA GTA AAT GCA GAA ACA GG-3' (SEQ ID NR. 4).
Artikel zur Herstellung schließen fluorophore Komponenten zum Markieren der Sonden oder Sonden, die bereits mit Donor- und entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponenten markiert sind, ein. Der Artikel zur Herstellung kann auch einen Beipackzettel mit Anweisungen darauf zur Verwendung der Primer, Sonden und fluorophoren Komponenten zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in einer Probe einschließen.
In einem noch anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in einer biologischen Probe aus einem Individuum oder in einer nicht-biologischen Probe bereitgestellt. Ein solches Verfahren schließt das Durchführen mindestens eines zyklischen Schritts ein. Ein zyklischer Schritt kann einen Amplifizierungsschritt und einen Hybridisierungsschritt einschließen. Im Allgemeinen schließt ein Amplifizierungsschritt das Inkontaktbringen der Probe mit einem pts-Primerpaar ein, um ein pts-Amplifikationsprodukt herzustellen, wenn ein GBS-pts-Nukleinsäuremolekül in der Probe vorhanden ist. Im Allgemeinen schließt ein Hybridisierungsschritt das Inkontaktbringen der Probe mit einer pts-Sonde ein. Eine solche pts-Sonde ist im Allgemeinen mit einer Donorfluoreszenz-Komponente und einer entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponente markiert. Die Primer und Sonden sind wie vorstehend definiert. Das Verfahren schließt weiterhin das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET; fluorescence resonance energy transfer) zwischen der Donorfluoreszenz-Komponente und der Akzeptorfluoreszenz-Komponente der pts-Sonde ein. Die Gegenwart oder Abwesenheit von Fluoreszenz ist für die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in der Probe indikativ.
In einem Aspekt kann die Amplifikation ein Polymeraseenzym mit 5' nach 3' Exonukleaseaktivität einsetzen. Folglich würden die erste und die zweite Fluoreszenzkomponente innerhalb von nicht mehr als 5 Nukleotiden voneinander über die Länge der Sonde sein. In einem anderen Aspekt schließt die pts-Sonde eine Nukleinsäuresequenz ein, die die Bildung einer Sekundärstruktur erlaubt. Eine solche Bildung einer Sekundärstruktur resultiert im Allgemeinen in der räumlichen Nähe zwischen der ersten und der zweiten Fluoreszenzkomponente. Nach diesem Verfahren kann die zweite Fluoreszenzkomponente auf einer Sonde ein Quencher sein.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in einer biologischen Probe aus einem Individuum oder in einer nicht-biologischen Probe bereitgestellt. Ein solches Verfahren schließt das Durchführen mindestens eines zyklischen Schritts ein. Ein zyklischer Schritt kann einen Amplifizierungsschritt und einen Farbstoff-Bindeschritt einschließen. Ein Amplifizierungsschritt schließt im Allgemeinen das Inkontaktbringen der Probe mit einem pts-Primerpaar ein, um ein pts-Amplifikationsprodukt herzustellen, wenn ein GBS-pts-Nukleinsäuremolekül in der Probe vorhanden ist. Die Primer sind wie vorstehend definiert. Ein Farbstoff-Bindeschritt schließt im Allgemeinen das Inkontaktbringen des pts-Amplifikationsprodukts mit einem doppelsträngigen DNA-bindenden Farbstoff ein. Das Verfahren schließt weiterhin das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit der Bindung des Farbstoffs, der doppelsträngige DNA bindet, in dem Amplifikationsprodukt ein. Gemäß der Erfindung ist die Gegenwart von Bindung typischerweise indikativ für die Gegenwart von GBS in der Probe und die Abwesenheit von Bindung ist typischerweise indikativ für die Abwesenheit von GBS in der Probe. Ein solches Verfahren kann weiterhin die Schritte des Bestimmens der Schmelztemperatur zwischen dem pts-Amplifikationsprodukt und dem doppelsträngige DNA bindenden Farbstoff einschließen. Im Allgemeinen bestätigt die Schmelztemperatur die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS. Repräsentative doppelsträngige DNA bindende Farbstoffe schließen SYBRGreenI^®, SYBRGold^® und Ethidiumbromid ein.
Soweit nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung, in welcher sie im Allgemeinen von dem Fachmann auf dem jeweiligen Gebiet verstanden werden, zu welchem die Erfindung gehört. Obwohl Verfahren und Materialien, die zu den hierin beschriebenen ähnlich sind, in der Ausübung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind geeignete Verfahren und Materialien nachfolgend beschrieben. Zusätzlich sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend und von ihnen ist nicht beabsichtigt, dass sie beschränken sollen.
Im Falle eines Widerspruchs gilt die vorliegende Beschreibung einschließlich der Definitionen.
Die Details einer oder mehrerer Ausführungsformen der Erfindung sind in den begleitenden Zeichnungen und der folgenden Beschreibung dargelegt. Andere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus den Zeichnungen und der ausführlichen Beschreibung sowie aus den Ansprüchen offensichtlich.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Ein Real-Time-Test zum Nachweisen von GBS in einer biologischen Probe oder einer nicht-biologischen Probe, der empfindlicher und spezifischer als die existierenden Tests ist, ist hierin beschrieben. Primer und Sonden zum Nachweisen von GBS-Infektionen und Artikel zur Herstellung, die solche Primer und Sonden enthalten, werden von der Erfindung bereitgestellt. Die erhöhte Empfindlichkeit von Real-Time-PCR zum Nachweis von GBS im Vergleich zu anderen Verfahren wie auch die verbesserten Eigenschaften der Real-Time-PCR, einschließlich Probeninhalt und Echtzeitnachweis des amplifizierten Produkts, ermöglichen die Implementierung dieser Technologie für die Routinediagnose von GBS-Infektionen im klinischen Labor.
GBS-Nukleinsäuren und -Oligonukleotide
Die Erfindung stellt Verfahren zum Nachweisen von GBS durch Amplifizieren von z. B. einem Teil der GBS-pts-Nukleinsäure bereit. Andere als die hierin beispielhaft beschriebenen GBS-Nukleinsäuren (z. B. andere als pts), können auch verwendet werden, um GBS in einer Probe nachzuweisen und sind dem Fachmann bekannt. Die Nukleinsäuresequenzen von GBS sind verfügbar (siehe z. B. GenBank, Zugangsnummern NC_004368 und NC_004116). Genauer werden Primer und Sonden zum Amplifizieren und Nachweisen von GBS-pts-Nukleinsäuremolekülen durch die Erfindung bereitgestellt.
Primer, die ein GBS-Nukleinsäuremolekül, z. B. GBS-pts, amplifizieren, können z. B. unter Verwendung eines Computerprogramms wie OLIGO (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO) entwickelt werden. Wichtige Merkmale beim Entwickeln von Oligonukleotiden, die als Amplifikationsprimer verwendet werden sollen, schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, eine geeignete Größe des Amplifikationsprodukts, um den Nachweis zu ermöglichen (z. B. durch Elektrophorese), ähnliche Schmelztemperatur für die Mitglieder des Primerpaars und die Länge jedes Primers (d. h. die Primer müssen lang genug sein, um mit Sequenzspezifität zu annealen und die Synthese zu initiieren, aber nicht so lange, dass die Zuverlässigkeit während der Oligonukleotidsynthese reduziert wird). Typischerweise sind die Oligonukleotidprimer 15–30 Nukleotide lang.
Das Entwickeln von Oligonukleotiden, die als Hybridisierungssonden verwendet werden sollen, kann in ähnlicher Weise wie das Entwickeln von Primern durchgeführt werden, obwohl die Mitglieder des Sondenpaars vorzugsweise an ein Amplifikationsprodukt innerhalb von nicht mehr als 5 Nukleotiden voneinander auf dem gleichen Strang annealen, so dass FRET auftreten kann (z. B. innerhalb von nicht mehr als 1, 2, 3 oder 4 Nukleotiden voneinander). Dieses minimale Maß an Trennung bringt die entsprechenden Fluoreszenzkomponenten typischerweise in ausreichende Nähe, so dass FRET auftritt. Es soll allerdings verstanden werden, dass andere Trennungsentfernungen (z. B. 6 oder mehr Nukleotide) auch möglich sind, vorausgesetzt, dass die Fluoreszenzkomponenten relativ zueinander geeignet positioniert sind (z. B. mit einem Linkerarm), so dass FRET auftreten kann. Zusätzlich können die Sonden so entwickelt werden, dass sie an Ziele hybridisieren, die einen Polymorphismus oder eine Mutation enthalten, wodurch ein differentieller Nachweis von GBS-Strängen auf Grundlage entweder absoluter Hybridisierung von verschiedenen Sondenpaaren, die dem bestimmten GBS-Stamm, der zu unterscheiden ist, entsprechen, oder differentieller Schmelztemperaturen zwischen z. B. Mitgliedern des Sondenpaars und jedem Amplifikationsprodukt, das einem GBS-Stamm, der zu unterscheiden ist, entspricht. Wie die Oligonukleotidprimer besitzen die Oligonukleotidsonden für gewöhnlich ähnliche Schmelztemperaturen und die Länge jeder Sonde muss für eine sequenzspezifische Hybridisierung, die auftreten soll, ausreichend sein, aber nicht so lange, dass die Zuverlässigkeit während der Synthese reduziert wird. Oligonukleotidsonden sind für gewöhnlich 15–30 Nukleotide lang.
Konstrukte schließen Vektoren ein, die ein GBS-Nukleinsäuremolekül, z. B. GBS-pts, oder ein Fragment davon, enthalten. Die Konstrukte können z. B. als Kontroll-Template-Nukleinsäuremoleküle verwendet werden. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Vektoren sind kommerziell erhältlich und/oder werden durch rekombinante DNA-Technologieverfahren, die in der Wissenschaft Routine sind, hergestellt. Die GBS-pts-Nukleinsäuremoleküle können z. B. durch chemische Synthese, direktes Klonieren aus GBS oder durch PCR-Amplifikation erhalten werden. Ein GBS-Nukleinsäuremolekül oder Fragment davon kann mit einem Promotor oder einem anderen regulatorischen Element wie z. B. einer Enhancer-Sequenz, einem Response-Element oder einem induzierbaren Element, das die Expression des GBS-Nukleinsäuremoleküls moduliert, funktionsfähig verknüpft sein. Wie hierin verwendet, bezieht sich funktionsfähig verknüpft auf das Verbinden eines Promotors und/oder anderer regulatorischer Elemente mit einem GBS-Nukleinsäuremolekül in einer solchen Weise, dass die Expression des GBS-Moleküls erlaubt und/oder reguliert wird. Ein Promotor, der normalerweise die Expression von GBS-pts nicht steuert, kann zur Steuerung für die direkte Transkription einer pts-Nukleinsäure unter Verwendung von z. B. einer viralen Polymerase, einer bakteriellen Polymerase oder einer eukaryotischen RNA-Polymerase II verwendet werden. Alternativ kann der native pts-Promotor verwendet werden, um die Transkription einer pts-Nukleinsäure zu steuern. Zusätzlich kann sich „funktionsfähig verknüpft" auf eine geeignete Verbindung zwischen einem GBS-pts-Promotor oder regulatorischen Element und einer heterologen kodierenden Sequenz (d. h. einer nicht-pts-kodierenden Sequenz, z. B. einem Reportergen) in einer solchen Weise beziehen, dass die Expression der heterologen kodierenden Sequenz erlaubt wird.
Konstrukte, die für die Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, schließen typischerweise zusätzlich zu GBS-pts-Nukleinsäuremolekülen Sequenzen, die einen Selektionsmarker zum Selektionieren gewünschter Konstrukte und/oder Transformanden kodieren (z. B. ein Antibiotika-Resistenzgen), und einen Replikationsursprung ein. Die Wahl der Vektorsysteme hängt für gewöhnlich von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der Wahl der Wirtszellen, der Replikationseffizienz, der Selektionierbarkeit, der Induzierbarkeit und der Einfachheit der Gewinnung.
Die Konstrukte, die GBS-pts-Nukleinsäuremoleküle enthalten, können in einer Wirtszelle vermehrt werden. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Wirtszelle" bedeuten, dass Prokaryonten und Eukaryonten wie z. B. Hefe-, Pflanzen- und Tierzellen einbezogen sind. Prokaryotische Wirte können einschließen E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis. Eukaryotische Wirte schließen ein Hefen wie z. B. S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris, Säugerzellen wie z. B. COS-Zellen oder Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO cells; Chinese hamster ovary cells), Insektenzellen und Pflanzenzellen wie z. B. Arabidopsis thaliana und Nicotiana tabacum. Ein Konstrukt kann unter Verwendung jeder der Techniken in eine Wirtszelle eingeführt werden, die im Allgemeinen dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Zum Beispiel sind Calciumphosphatpräzipitation, Elektroporation, Hitzeschock, Lipofektion, Mikroinjektion und virusvermittelter Nukleinsäuretransfer übliche Verfahren zum Einführen von Nukleinsäuren in Wirtszellen. Zusätzlich kann nackte DNA direkt in Zellen verabreicht werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,580,859 und 5,589,466 ).
Polymerase-Kettenreaktion (PCR; polymerase chain reaction)
US-Patentnummern 4,683,202 , 4,683,195 , 4,800,159 und 4,965,188 offenbaren konventionelle PCR-Techniken. Die PCR setzt typischerweise zwei Oligonukleotidprimer ein, die an ein ausgewähltes Nukleinsäuretemplate (z. B. DNA oder RNA) binden. Die Primer, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen Oligonukleotide ein, die in der Lage sind, als ein Anfangspunkt der Nukleinsäuresynthese innerhalb von GBS-pts-Nukleinsäuresequenzen zu wirken. Ein Primer kann aus einem Restriktionsverdau durch konventionelle Verfahren gereinigt werden oder er kann synthetisch hergestellt werden. Der Primer ist für eine maximale Effizienz bei der Amplifikation bevorzugt einzelsträngig, aber der Primer kann auch doppelsträngig sein. Doppelsträngige Primer werden erst denaturiert, d. h. behandelt, um die Stränge zu trennen. Ein Verfahren zum Denaturieren doppelsträngiger Nukleinsäuren ist mittels Erhitzen.
Der Begriff „thermostabile Polymerase" bezieht sich auf ein Polymeraseenzym, das hitzestabil ist, d. h. das Enzym katalysiert die Bildung von Primer-Verlängerungsprodukten, die komplementär zu einem Template sind, und denaturiert nicht irreversibel, wenn es erhöhten Temperaturen für die Zeit ausgesetzt wird, die notwendig ist, um eine Denaturierung doppelsträngiger Template-Nukleinsäuren zu bewirken. Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers begonnen und geht in der 5'- nach 3'-Richtung über den Templatestrang fort. Thermostabile Polymerasen wurden isoliert aus Thermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus und Methanothermus fervidus. Nichtsdestotrotz können in PCR-Tests auch nicht-thermostabile Polymerasen eingesetzt werden, vorausgesetzt, das Enzym wird nachgefüllt.
Wenn die GBS-Template-Nukleinsäure doppelsträngig ist, ist es erforderlich, die beiden Stränge zu trennen, bevor sie als ein Template in der PCR verwendet werden kann. Die Strangtrennung kann durch jedes beliebige denaturierende Verfahren einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel durchgeführt werden. Ein Verfahren zum Trennen der Nukleinsäurestränge bezieht das Erhitzen der Nukleinsäure ein, bis diese vornehmlich denaturiert ist (z. B. mehr als 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% denaturiert). Die Erhitzungsbedingungen, die zum Denaturieren der Template-Nukleinsäure erforderlich sind, werden z. B. von der Puffersalzkonzentration und der Länge und der Nukleotidzusammensetzung der Nukleinsäuren, die zu denaturieren sind, abhängen und typischerweise im Bereich von ungefähr 90°C bis ungefähr 105°C für eine Zeit liegen, die von den Merkmalen der Reaktion abhängt, wie z. B. der Temperatur und der Nukleinsäurelänge. Die Denaturierung wird typischerweise für ungefähr 30 Sekunden bis 4 Minuten durchgeführt.
Wenn die doppelsträngige Nukleinsäure mittels Hitze denaturiert ist, wird dem Reaktionsgemisch erlaubt, auf eine Temperatur abzukühlen, die ein Annealen jeden Primers zu seiner Zielsequenz auf der GBS-Nukleinsäure erlaubt. Die Temperatur zum Annealen ist typischerweise von ungefähr 35°C bis ungefähr 65°C. Die Annealingzeiten können von ungefähr 10 Sekunden bis ungefähr 1 Minute sein. Das Reaktionsgemisch wird dann auf eine Temperatur eingestellt, die der Aktivität der Polymerase förderlich ist oder bei welcher diese optimiert ist, z. B. eine Temperatur, die ausreicht, damit eine Verlängerung von dem annealten Primer auftritt, um Produkte zu erzeugen, die zu der Template-Nukleinsäure komplementär sind. Die Temperatur sollte ausreichend sein, um ein Verlängerungsprodukt aus jedem Primer zu synthetisieren, der zu einem Nukleinsäure-Template annealt ist, aber sie sollte nicht so hoch sein, dass ein Verlängerungsprodukt von seinem komplementären Template degeneriert (z. B. liegt die Temperatur für die Verlängerung im Allgemeinen im Bereich von etwa 40°C bis 80°C). Die Verlängerungszeiten können von ungefähr 10 Sekunden bis ungefähr 5 Minuten sein.
Die PCR-Tests können GBS-Nukleinsäure, wie z. B. DNA oder RNA, einschließlich messenger RNA (mRNA) einschließen. Die Template-Nukleinsäure muss nicht gereinigt sein; sie kann eine Nebenfraktion einer komplexen Mischung, wie z. B. GBS-Nukleinsäure, die in humanen Zellen enthalten ist, sein. DNA oder RNA kann aus einer biologischen Probe wie z. B. einem Anal- und/oder Vaginalabstrich durch Routinetechniken, wie z. B. jene, die in Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Persing et al. (Hrsg.), 1993, American Society for Microbiology, Washington D. C.) beschrieben sind, extrahiert werden. Nukleinsäuren können aus jeder beliebigen Zahl von Quellen wie z. B. Plasmiden oder natürlichen Quellen, einschließlich Bakterien, Hefe, Viren, Organellen oder höheren Organismen, wie z. B. Pflanzen oder Tieren erhalten werden.
Die Oligonukleotidprimer können mit PCR-Reagenzien unter Reaktionsbedingungen kombiniert werden, die die Primerverlängerung induzieren. Zum Beispiel schließen Kettenverlängerungsreaktionen im Allgemeinen 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl₂, 0,001% (Gew/Vol) Gelatine, 0,5–1,0 μg denaturierte Template-DNA, 50 pMole eines jeden Oligonukleotidprimers, 2,5 U Taq-Polymerase und 10% DMSO ein. Die Reaktionen enthalten im Allgemeinen 150 bis 320 μM eines jeden von dATP, dCTP, dTTP, dGTP, oder ein oder mehrere Analoga davon.
Die neu synthetisierten Stränge bilden ein doppelsträngiges Molekül, das in den anschließenden Schritten der Reaktion verwendet werden kann. Die Schritte von Strangtrennung, Annealing und Verlängerung können so oft wie erforderlich wiederholt werden, um die gewünschte Menge an Amplifikationsprodukten entsprechend dem GBS- Zielnukleinsäuremolekül herzustellen. Die begrenzenden Faktoren in der Reaktion sind die Menge an Primern, thermostabilem Enzym und Nukleosidtriphosphaten, die in der Reaktion vorhanden sind. Die zyklischen Schritte (d. h. Denaturierung, Annealing und Verlängerung) werden vorzugsweise mindestens einmal wiederholt. Zur Verwendung beim Nachweis wird die Zahl der zyklischen Schritte z. B. von der Natur der Probe abhängen. Wenn die Probe eine komplexe Mischung von Nukleinsäuren ist, werden mehrere zyklische Schritte erforderlich sein, um die Zielsequenz für den Nachweis ausreichend zu ampflizieren. Im Allgemeinen werden die zyklischen Schritte mindestens ungefähr 20 Mal wiederholt, aber sie können auch so oft wie 40, 60 oder sogar 100 Mal wiederholt werden.
Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET; fluorescence resonance energy transfer) Die FRET-Technologie (siehe z. B. US-Patentnummern 4,996,143 , 5,565,322 , 5,849,489 und 6,162,603 ) basiert auf einem Konzept, dass, wenn eine Donor- und eine entsprechende Akzeptorfluoreszenz-Komponente in einer gewissen Entfernung zueinander positioniert werden, ein Energietransfer zwischen den beiden Fluoreszenzkomponenten stattfindet, der sichtbar gemacht oder anderweitig nachgewiesen und/oder quantifiziert werden kann. Zwei Oligonukleotidsonden, von denen jede eine Fluoreszenzkomponente enthält, können an ein Amplifikationsprodukt an bestimmten Positionen, die von der Komplementarität der Oligonukleotidsonden zu der GBS-Zielnukleinsäuresequenz bestimmt werden, hybridisieren. Nach Hybridisierung der Oligonukleotidsonden zu der Amplifikationsprodukt-Nukleinsäure an geeigneten Positionen wird ein FRET-Signal erzeugt. Die Hybridisierungstemperatur liegt im Bereich von ungefähr 35 bis ungefähr 65°C für ungefähr 10 Sekunden bis ungefähr 1 Minute.
Die Fluoreszenzanalyse kann unter Verwendung von z. B. einem Photonen zählenden Epifluoreszenzmikroskopsystem (enthaltend die geeigneten dichromatischen Spiegel und Filter zum Beobachten der Fluoreszenzemission in einem bestimmten Bereich), einem Photonen zählenden Photomultipliersystem oder einem Fluorometer durchgeführt werden. Die Anregung zum Initiieren des Energietransfers kann mit einem Argonionenlaser, einer hochintensiven Quecksilber-(Hg)-Bogenlampe oder Lichtleiterquellen oder anderen hochintensiven Lichtquellen, die geeignet für die Anregung im gewünschten Bereich gefiltert werden, durchgeführt werden.
Wie hierin verwendet im Hinblick auf die Donor- und entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponenten bezieht sich „entsprechend" auf eine Akzeptorfluoreszenz-Komponente mit einem Emissionspektrum, das mit dem Anregungsspektrum der Donorfluores zenz-Komponente überlappt. Das Wellenlängenmaximum des Emissionsspektrums der Akzeptorfluoreszenz-Komponente sollte mindestens 10 nm höher sein als das Wellenlängenmaximum des Anregungsspektrums der Donorfluoreszenz-Komponente. Folglich kann hierdurch ein wirksamer Nicht-Strahlungs-Energietransfer hergestellt werden.
Die Fluoreszenz-Donor- und entsprechenden -Akzeptorkomponenten werden im Allgemeinen ausgewählt im Hinblick auf: (a) eine hohe Wirksamkeit des Förster-Energietransfers; (b) einen großen finalen Stokes-Shift (> 100 nm); (c) eine Verschiebung der Emission so weit wie möglich in den roten Bereich des sichtbaren Spektrums (> 600 nm), und (d) eine Verschiebung der Emission zu höheren Wellenlängen als die Raman-Wasserfluoreszenzsemission, die durch Anregung der Donoranregungswellenlänge produziert wird. Zum Beispiel kann eine Donorfluoreszenz-Komponente gewählt werden, die ihr Anregungsmaximum nahe bei einer Laserlinie (z. B. Helium-Cadmium 442 nm oder Argon 488 nm), einen hohen Extinktionskoeffizienten, eine hohe Quantenausbeute und eine gute Überlappung ihrer Fluoreszenzemission mit dem Anregungsspektrum der entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponente besitzt. Eine entsprechende Akzeptorfluoreszenz-Komponente kann ausgewählt werden, die einen hohen Extinktionskoeffizienten, eine hohe Quantenausbeute, eine gute Überlappung ihrer Anregung mit der Emission der Donorfluoreszenz-Komponente und eine Emission im roten Bereich des sichtbaren Spektrums (> 600 nm) besitzt.
Repräsentative Donorfluoreszenz-Komponenten, die mit verschiedenen Akzeptorfluoreszenz-Komponenten in der FRET-Technologie verwendet werden können, schließen ein Fluorescein, Lucifer Yellow, B-Phycoerythrin, 9-Acridinisothiocyanat, Lucifer Yellow VS, 4-Acetamid-4'-isothio-cyanatstilben-2,2'-disulfonsäure, 7-Diethylamin-3-(4'-isothiocyanatphenyl)-4-methylcoumarin, Succinimdyl-1-pyrenbutyrat und 4-Acetamid-4'-isothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäurederivate. Repräsentative Akzeptorfluoreszenz-Komponenten schließen in Abhängigkeit von der verwendeten Donorfluoreszenz-Komponente ein LC^TM-Red 640, LC^TM-Red 705, Cy5, Cy5.5, Lissaminrhodamin B Sulfonylchlorid, Tetramethylrhodaminisothiocyanat, Rhodamin × Isothiocyanat, Erythrosinisothiocyanat, Fluorescein, Diethylentriaminpentaacetat oder andere Chelate von Lanthanidionen (z. B. Europium oder Terbium). Donor- und Akzeptorfluoreszenz-Komponenten können z. B. von Molecular Probes (Junction City, OR) oder Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten werden.
Die Donor- und Akzeptorfluoreszenz-Komponenten können an geeignete Sondenoligonukleotide über einen Linkerarm angelagert sein. Die Länge jedes Linkerarms ist wichtig, da die Linkerarme die Entfernung zwischen der Donor- und der Akzeptorfluoreszenz-Komponente beeinflussen werden. Die Länge eines Linkerarms für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist die Entfernung in Angström (Å) von der Nukleotidbase zu der Fluoreszenzkomponente. Im Allgemeinen ist ein Linkerarm ungefähr 10 bis ungefähr 25 Å lang. Der Linkerarm kann jeder der in WO 84/03285 beschriebenen Art sein. WO 84/03285 beschreibt auch Verfahren zum Anlagern von Linkerarmen an eine bestimmte Nukleotidbase und auch zum Anlagern von Fluoreszenzkomponenten an einen Linkerarm. Eine Akzeptorfluoreszenz-Komponente, wie z. B. ein LC^TM-Red 640-NHS-Ester, kann mit C6-Phosphoramitiden (erhältlich von ABI (Foster City, CA) oder Glen Research (Sterling, VA)) kombiniert werden, um z. B. LC^TM-Red 640-Phosphoramidit herzustellen. Häufig verwendete Linker zum Koppeln einer Donorfluoreszenz-Komponente, wie z. B. Florescein, an ein Oligonukleotid schließen Thioharnstofflinker (von FITC abgeleitet, z. B. Fluorescein-CPGs von Glen Research oder ChemGene (Ashland, MA)), Amidlinker (von Fluorescein-NHS-Estern abgeleitet, wie z. B. Fluorescein-CPG von BioGenex (San Ramon, CA)) oder 3'-Amino-CPGs ein, die ein Kuppeln eines Fluorescein enthaltenden Esters nach Oligonukleotidsynthese erfordern.
Nachweis von Gruppe B-Streptococcus
Die Gegenwart von GBS wurde durch Kultivieren des Organismus wie auch schnelle Antigentests nachgewiesen. Konventionelle PCR-Verfahren wurden ebenfalls verwendet, um GBS nachzuweisen. Auf konventionelle Amplifikationen auf Grundlage von PCR folgt normalerweise der Transfer der Amplifikationsprodukte an einen festen Träger und der Nachweis unter Verwendung markierter Sonden (z. B. einem Southern oder Northern Blot). Diese Verfahren sind arbeitsintensiv und erfordern häufig zur Vervollständigung mehr als einen Tag. Zusätzlich erhöht die Manipulation von Amplifikationsprodukten zum Zwecke des Nachweises (z. B. durch Blotten) das Risiko von Übertragungskontamination und falsch positiven Ergebnissen.
Unter Verwendung, kommerziell erhältlicher Real-Time-PCR-Instrumente (z. B. LightCycler^TM, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), können die PCR-Amplifikationen und der Nachweis des Amplifikationsproduktes unter dramatisch reduzierten Zyklierungszeiten in eine geschlossene Küvette kombiniert werden. Da der Nachweis gleichzeitig mit der Amplifikation auftritt, vermeiden die Real-Time-PCR-Verfahren das Erfordernis der Manipulation des Amplifikationsproduktes und erniedrigen das Risiko von Kreuzkontamination zwischen Amplifikationsprodukten. Die Real-Time- PCR reduziert die Durchsatzzeit im großen Ausmaß und ist eine attraktive Alternative zur konventionellen PCR-Technik im klinischen Labor.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in einer biologischen Probe aus einem Individuum oder in einer nicht-biologischen Probe bereit. Die von der Erfindung bereitgestellten Verfahren vermeiden die Probleme von Probenkontamination, falsch negativen wie auch falsch positiven Ergebnissen. Die Verfahren schließen das Durchführen mindestens eines zyklischen Schritts ein, der das Amplifizieren eines GBS-Teils eines pts-Nukleinsäuremoleküls aus einer Probe unter Verwendung eines pts-Primerpaars einschließt. Jeder der pts-Primer annealt zu einem Ziel innerhalb oder benachbart zu einem GBS-pts-Nukleinsäuremolekül, so dass mindestens ein Teil eines jeden Amplifikationsproduktes eine Nukleinsäuresequenz enthält, die pts entspricht. Noch wichtiger ist es, dass das Amplifikationsprodukt die Nukleinsäuresequenzen enthalten sollte, die zu den pts-Sonden komplementär sind. Das pts-Amplifikationsprodukt wird unter der Vorraussetzung, dass die GBS-Nukleinsäure vorhanden ist, hergestellt. Jeder zyklische Schritt schließt weiterhin das Inkontaktbringen der Probe mit einem pts-Sondenpaar ein. Gemäß der Erfindung ist ein Mitglied eines jeden pts-Probenpaars mit einer Donorfluoreszenz-Komponente markiert und das andere Mitglied ist mit einer entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponente markiert. Die Gegenwart oder Abwesenheit von FRET zwischen der Donorfluoreszenz-Komponente und der ersten pts-Sonde und der entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponente der zweiten pts-Sonde wird nach Hybridisieren der pts-Sonden mit dem pts-Amplifikationsprodukt nachgewiesen.
Jeder zyklische Schritt schließt einen Amplifikationsschritt und einen Hybridisierungsschritt ein und auf jeden zyklischen Schritt folgt für gewöhnlich ein FRET-Nachweisschritt. Mehrere zyklische Schritte werden durchgeführt, vorzugsweise in einem Thermocycler. Die erfindungsgemäßen Verfahren können unter Verwendung des pts-Primer- und -Sondensatzes durchgeführt werden, um die Gegenwart von GBS nachzuweisen. Der Nachweis von FRET in der pts-Reaktion zeigt die Gegenwart eines GBS an.
Wie hierin verwendet bezieht sich „Amplifizieren" auf einen Prozess des Synthetisierens von Nukleinsäuremolekülen, die zu einem oder beiden Strängen eines Template-Nukleinsäuremoleküls (z. B. GBS-pts-Nukleinsäuremoleküle) komplementär sind. Das Amplifizieren eines Nukleinsäuremoleküls schließt typischerweise das Denaturieren der Template-Nukleinsäure, das Annealen der Primer mit der Template-Nukleinsäure bei einer Temperatur, die unter den Schmelztemperaturen der Primer ist, und die enzymatische Verlängerung der Primer, um ein Amplifikationsprodukt zu erzeugen, ein. Die Amplifikation erfordert typischerweise die Gegenwart von Desoxyribonukleosid-Triphosphaten, einem DNA-Polymerase-Enzym (z. B. Platinum^® Taq) und einem geeigneten Puffer und/oder Cofaktor für die optimale Aktivität des Polymerase-Enzyms (z. B. MgCl₂ und/oder KCl).
Wenn eine Amplifikation von Nukleinsäure auftritt und ein Amplifikationsprodukt hergestellt wird, resultiert der Schritt des Hybridisierens auf Grundlage von FRET zwischen den Mitgliedern des Sondenpaars in einem nachweisbaren Signal. Wie hierin verwendet bezieht sich „Hybridisieren" auf das Annealing der Sonden mit einem Amplifikationsprodukt. Hybridisierungsbedingungen schließen typischerweise eine Temperatur ein, die unter der Schmelztemperatur der Sonden ist, aber die unspezifische Hybridisierung der Sonden verhindert.
Im Allgemeinen zeigt die Anwesenheit von FRET die Gegenwart von GBS in der Probe an und die Abwesenheit von FRET zeigt die Abwesenheit von GBS in der Probe an. Unsachgemäße Einzelprobensammlung, Transportverzögerungen, ungeeignete Transportbedingungen oder die Verwendung von bestimmten Sammlungsabstrichen (Calciumalginat oder Aluminiumstiel) sind allerdings alles Bedingungen, die den Erfolg und/oder die Genauigkeit eines Testsergebnisses beeinflussen können. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren ist der Nachweis von FRET innerhalb von 45 zyklischen Schritten indikativ für eine GBS-Infektion.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch für GBS-Vakzin-Wirksamkeitsstudien oder epidemiologischen Studien verwendet werden. Zum Beispiel kann ein abgeschwächtes GBS in einem Anthrax-Vakzin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren während der Zeit, wenn das Bakterium noch in einem Indiviuum vorhanden ist, nachgewiesen werden. Für solche Vakzin-Wirksamkeitsstudien können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um z. B. die Persistenz eines abgeschwächten Stamms von GBS, der in einem Vakzin verwendet wird, zu bestimmen, oder sie können in Verbindung mit einem zusätzlichen Test wie z. B. einem serologischen Test durchgeführt werden, um die Immunantwort eines Individuums auf ein solches Vakzin zu beobachten. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um für epidemiologische Studien, z. B. zum Ursprungs oder der Schwere eines Ausbruchs von GBS, einen GBS-Stamm von anderen zu unterscheiden.
Repräsentative biologische Proben, die bei der Ausübung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, schließen ein Hautabstriche, Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Sputum, Bronchioalveolar-Lavage, Bronchialaspirate, Lungengewebe und Fäzes. Sammel- und Lagerverfahren für biologische Proben sind dem Fachmann in dem Gebiet bekannt. Die biologischen Proben können verarbeitet werden (z. B. durch Nukleinsäure-Extraktionsverfahren und/oder bekannte Kits), um GBS-Nukleinsäure freizusetzen oder in einigen Fällen kann die biologische Probe direkt mit den PCR-Reaktionsbestandteilen und den geeigneten Oligonukleotiden in Kontakt gebracht werden.
Biologische Proben können in einem für das Wachstum von GBS geeigneten Medium kultiviert werden. Die Kulturmedien können dann auf die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, wie sie hierin beschrieben sind, getestet werden. Zum Beispiel können die Proben, die in einem klinischen Labor zum Nachweis für GBS unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ankommen, in Form einer Flüssigkultur sein, die mit einer biologischen Probe aus einem Individuum inokuliert wurde.
Die Schmelzkurvenanalyse ist ein zusätzlicher Schritt, der in ein zyklisches Profil eingeschlossen werden kann. Die Schmelzkurvenanalyse basiert auf der Tatsache, dass DNA bei einer charakteristischen Temperatur, die die Schmelztemperatur (Tm) genannt wird, schmilzt, welche als die Temperatur definiert ist, bei welcher die Hälfte der DNA-Doppelstränge in Einzelstränge getrennt wurde. Die Schmelztemperatur einer DNA hängt primär von ihrer Nukleotidzusammensetzung ab. So haben DNA-Moleküle, die an G- und C-Nukleotiden reich sind, eine höhere Tm als jene mit einem Überfluss an A- und T-Nukleotiden. Durch Nachweisen der Temperatur, bei welcher das Signal verloren geht, kann die Schmelztemperatur der Sonden bestimmt werden. In ähnlicher Weise kann die Annealingtemperatur von Proben durch Nachweisen der Temperatur, bei welcher ein Signal erzeugt wird, gemessen werden. Die Schmelztemperatur(en) von pts-Sonden aus dem pts-Amplifikationsprodukt kann die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in der Probe bestätigen.
Innerhalb eines jeden Thermocyclerlaufs werden auch Kontrollproben zykliert. Positive Kontrollproben können ein GBS-Nukleinsäurekontroll-Template (das von pts verschieden ist) unter Verwendung von z. B. Kontrollprimern und Kontrollsonden amplifizieren. Positive Kontrollproben können auch z. B. ein Plasmidkonstrukt amplifizieren, das GBS-pts-Nukleinsäuremoleküle enthält. Eine solche Plasmidkontrolle kann intern (z. B. innerhalb der Probe) oder in einer separaten Probe amplifiziert werden, die Seite an Seite mit den Patientenproben laufen gelassen wird. Jeder Thermocyclerlauf sollte auch eine negative Kontrolle einschließen, die z. B. keine GBS-Template-DNA enthält. Solche Kontrollen sind Indikatoren für den Erfolg oder das Versagen der Amplifikation, Hybridisierung und/oder FRET-Reaktion. Daher können Kontrollreaktionen leicht z. B. die Fähigkeit von Primern, mit Sequenzspezifität zu annealen und eine Verlängerung zu initiieren, wie auch die Fähigkeit von Sonden, mit Sequenzspezifität zu hybridisieren und für das Auftreten von FRET bestimmen.
In einer Ausführungsform schließen die erfindungsgemäßen Verfahren Schritte ein, um Kontamination zu vermeiden. Zum Beispiel ist ein enzymatisches Verfahren, das Uracil-DNA-Glycosylase verwendet, in den U.S.-Patentnrn. 5,035,996 , 5,683,896 und 5,945,313 beschrieben, um Kontamination zwischen einem Thermocyclerlauf und dem nächsten zu reduzieren oder zu eliminieren. Zusätzlich sind Laborsicherheitsmaßnahmen und Vorgehensweisen wünschenswert, wenn die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Sicherheitspraktiken und Maßnahmen schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, getrennte Arbeitsbereiche für verschiedene Schritte eines Verfahrens, Sicherheitshauben, Pipettenspitzen mit Barrierefilter und zweckbestimmte Luftverdrängungspipetten. Einheitliche Schutzpraktiken und Vorgehensweisen durch das Personal sind für die Genauigkeit in einem diagnostischen Labor, das klinische Proben handhabt, erforderlich.
Konventionelle PCR-Verfahren im Zusammenhang mit FRET-Technologie können verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Verfahren auszuüben. In einer Ausführungsform wird ein LightCycler^TM-Instrument verwendet. Eine ausführliche Beschreibung des LightCycler^TM-Systems und Real-Time- und On-Line-Monitoring von PCR kann gefunden werden unter http://biochem.roche.com/lightcycler. Die folgenden Patentanmeldungen beschreiben Real-Time-PCR unter Verwendung der LightCycler^TM-Technologie: WO 97/46707 , WO 97/46714 und WO 97/46712 . Das LightCycler^TM-lnstrument ist ein schneller thermischer Cycler kombiniert mit einem Mikrovolumen-Fluorometer unter Verwendung von hochqualitativer Optik. Diese schnelle thermozyklische Technik verwendet dünnwandige Glasküvetten als Reaktionsgefäße. Das Erhitzen und Abkühlen der Reaktionskammern wird durch Alternieren von erwärmter und Raumluft kontrolliert. Auf Grund der geringen Masse von Luft und des hohen Verhältnisses von Umgebungsluft zum Volumen der Küvetten können sehr schnelle Temperaturaustausch-Geschwindigkeiten innerhalb der LightCycler^TM-Thermalkammer erreicht werden. Der Zusatz von ausgewählten Fluoreszenz-Farbstoffen zu den Reaktionskomponenten erlaubt die PCR in Real-Time (in Echtzeit) und On-Line zu beobachten. Darüber hinaus dienen die Küvetten als ein optisches Element für die Signalsammlung (ähnlich zu Glasfaseroptik), welches das Signal auf der Spitze der Küvette konzentriert. Der Effekt ist eine effektive Beleuchtung und Fluoreszenzbeobachtung der Mikrovolumenproben.
Das LightCycler^TM-Karussell, das die Küvetten beherbergt, kann aus dem Instrument entfernt werden. Daher können die Proben außerhalb des Instruments (in einem PCR-Reinraum, z. B.) beladen werden. Zusätzlich erlaubt dieses Merkmal eine einfache Reinigung und Sterilisierung des Probenkarussells. Das Fluorometer beherbergt als Teil des LightCycler^TM-Geräts die Lichtquelle. Das emittierte Licht wird gefiltert und durch Epi-Illuminationslinsen auf die Spitze der Küvette fokussiert. Das Fluoreszenzlicht, das von der Probe emittiert wird, wird dann auf die gleiche Linse fokussiert, durch einen dichroitischen Spiegel passiert, geeignet gefiltert und auf Daten sammelnde Photohybride fokussiert. Die optische Einheit, die gegenwärtig in dem LightCycler^TM-Instrument (Roche Molecular Biochemicals, Katalog Nr. 2 011 468) verfügbar ist, schließt einen Dreibandpassfilter (530 nm, 640 nm und 710 nm) ein, welcher einen Dreifarbnachweis und einige Fluoreszenzerfassungsoptionen bereitstellt. Die Datensammlungsoptionen schließen eine Beobachtung einmal pro zyklischen Schritt, vollständig kontinuierliche Einzelprobenerfassung für Schmelzkurvenanalysen und kontinuierliches Abfragen (in welchem die Abfragefrequenz von der Probezahl abhängt) und/oder schrittweises Messen aller Proben nach definierten Temperaturintervallen ein.
Der LightCycler^TM kann unter Verwendung einer PC-Workstation betrieben werden und kann ein Windows NT Betriebssystem verwenden. Signale aus den Proben werden als Maschinenpositionen der Kapillaren nacheinander über die optische Einheit erhalten. Die Software kann die Fluoreszenz-Signale in Echtzeit sofort nach jeder Messung anzeigen. Die Fluoreszenz-Erfassungszeit beträgt 10–100 Millisekunden (msec). Nach jedem zyklischen Schritt kann eine quantitative Anzeige der Fluoreszenz gegen die Zykluszahlen kontinuierlich für alle Proben einem Update unterzogen werden. Die erzeugten Daten werden für die weitere Analyse gespeichert.
Als eine Alternative zu FRET kann ein Amplifikationsprodukt unter Verwendung eines doppelsträngige DNA bindenden Farbstoffs wie z. B. eines fluoreszierende DNA binden den Farbstoffs (z. B. SYBRGreenI^® oder SYBRGold^® (Molecular Probes)) nachgewiesen werden. Als Folge der Wechselwirkung mit doppelsträngiger Nukleinsäure emittieren solche fluoreszierenden DNA bindenden Farbstoffe ein Fluoreszenz-Signal nach Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge. Ein doppelsträngige DNA bindender Farbstoff wie z. B. ein mit Nukleinsäure interkalierender Farbstoff kann auch verwendet werden. Wenn doppelsträngige DNA bindende Farbstoffe verwendet werden, wird eine Schmelzkurvenanalyse für gewöhnlich zur Bestätigung der Gegenwart des Amplifikationsproduktes durchgeführt.
Wie hierin beschrieben können die Amplifikationsprodukte auch unter Verwendung markierter Hybridisierungssonden nachgewiesen werden, die den Vorteil der FRET-Technologie ausnutzen. Ein übliches Format der FRET-Technologie verwendet zwei Hybridisierungssonden. Jede Sonde kann mit einer unterschiedlichen Fluoreszenzkomponente markiert sein und sie sind im Allgemeinen so entwickelt, dass sie in enger räumlicher Nähe zueinander in einem Ziel-DNA-Molekül (z. B. einem Amplifikationsprodukt) hybridisieren. Eine Donorfluoreszenz-Komponente, z. B. Fluorescein, wird bei 470 nm von der Lichtquelle des LightCycler^TM-Instruments angeregt. Während des FRETs überträgt das Fluorescein seine Energie auf die Akzeptorfluoreszenz-Komponente wie z. B. LightCycler^TM-Red 640 (LC^TM-Red 640) oder LightCycler^TM-Red 705 (LC^TM-Red 705). Die Akzeptorfluoreszenz-Komponente emitiert dann Licht einer längeren Wellenlänge, welches durch das optische Nachweissystem des LightCycler^TM-Instruments nachgewiesen wird. Ein wirksamer FRET kann nur stattfinden, wenn die Fluoreszenzkomponenten in unmittelbarer lokaler Nähe sind und wenn das Emissionsspektrum der Donorfluoreszenz-Kompente mit dem Absorptionsspektrum der Akzeptorfluoreszenz-Komponente überlappt. Die Intensität des emitierten Signals kann mit der Zahl der ursprünglichen Ziel-DNA-Moleküle (z. B. der Zahl der GBS-Genome) korreliert werden.
Ein weiteres FRET-Format verwendet TaqMan^®-Technologie, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts und somit die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS nachzuweisen. Die TaqMan^®-Technologie verwendet eine einzelsträngige Hybridisierungssonde, die mit zwei Fluoreszenzkomponenten markiert ist. Wenn eine erste Fluoreszenzkomponente mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird, wird die absorbierte Energie auf eine zweite Fluoreszenzkomponente nach den Prinzipien von FRET übertragen. Die zweite Fluoreszenzkomponente ist im Allgemeinen ein Quencher-Molekül. Während des Annealingschritts der PCR-Reaktion bindet die markierte Hybridi sierungssonde an die Ziel-DNA (d. h. das Amplifikationsprodukt) und wird durch die 5'- nach 3'-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase während der anschließenden Verlängerungsphase abgebaut. Als ein Ergebnis werden die angeregte Fluoreszenzkomponente und die Quencher-Komponente räumlich voneinander getrennt. Als eine Konsequenz kann nach Anregung die erste Fluoreszenzfluoreszenz-Komponente in Abwesenheit des Quenchers die Fluoreszenzemission von der ersten Fluoreszenzkomponente nachgewiesen werden. Beispielsweise verwendet ein „ABI PRISM^® 7700 Sequence Detection System" (Applied Biosystems, Foster City, CA) die TaqMan^®-Technologie und ist für das Durchführen der hierin beschriebenen Verfahren zum Nachweisen von GBS geeignet. Die Information über die PCR-Amplifikation und Nachweis unter Verwendung eines „ABI PRISM^® 770 Systems" kann gefunden werden unter http://www.appliedbiosystems.com/products.
Molekulare Beacons in Verbindung mit FRET können auch verwendet werden, um die Gegenwart eines Amplifikationsprodukts unter Verwendung der erfindungsgemäßen Real-Time-PCR-Verfahren nachzuweisen. Die Molekular-Beacon-Technologie verwendet eine Hybridisierungssonde, die mit einer ersten Fluoreszenzkomponente und einer zweiten Fluoreszenzkomponente markiert ist. Die zweite Fluoreszenzkomponente ist im Allgemeinen ein Quencher und die Fluoreszenzmarker sind typischer Weise an den beiden Enden der Sonde lokalisiert. Die Molekular-Beacon-Technologie verwendet eine Oligonukleotidsonde mit Sequenzen, die die Bildung einer Sekundärstruktur erlauben (z. B. einer Haarnadel). Als ein Ergebnis der Bildung der Sekundärstruktur sind die beiden Fluoreszenzkomponenten in räumlicher Nähe, wenn die Sonde in Lösung ist. Nach Hybridisierung an die Zielnukleinsäuren (d. h. Amplifikationsprodukte) wird die Sekundärstruktur der Sonde zerstört und die Fluoreszenzkomponenten werden voneinander getrennt, so dass nach Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge die Emission der ersten Fluoreszenzkomponente nachgewiesen werden kann.
Es sollte verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung nicht durch die Konfiguration eines oder mehrerer kommerziell erhältlicher Instrumente zu beschränken ist.
Artikel zur Herstellung
Die Erfindung stellt weiterhin Artikel zur Herstellung zum Nachweisen von GBS bereit. Ein Artikel zur Herstellung gemäß der vorliegenden Erfindung schließt Primer und Sonden, wie vorstehend definiert und zum Nachweis von GBS verwendet, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Verpackungsmaterialien ein. Repräsentative Primer und Sonden zum Nachweis von GBS sind in der Lage mit den GBS-pts-Nukleinsäuremolekülen zu hybridisieren. Verfahren zum Entwickeln von Primer und Sonden sind hierin offenbart und repräsentative Primer und Sonden, die GBS-pts-Nukleinsäuremoleküle amplifizieren und mit ihnen hybridisieren, werden bereitgestellt.
Die erfindungsgemäßen Artikel zur Herstellung schließen auch eine oder mehrere Fluoreszenzkomponenten zum Markieren der Sonden ein oder alternativ können die Sonden, die mit dem Kit bereitgestellt werden, markiert sein. Zum Beispiel könnte ein Artikel zur Herstellung eine Donorfluoreszenz-Komponente zum Markieren einer der pts-Sonden und eine Akzeptorfluoreszenz-Komponente zum Markieren der anderen pts-Sonde einschließen. Beispiele geeigneter FRET-Donorfluoreszenz-Komponenten und entsprechender Akzeptorfluoreszenz-Komponenten werden vorstehend bereitgestellt.
Die erfindungsgemäßen Artikel zur Herstellung können durch einen Beipackzettel oder eine Packungsbeschriftung mit Instruktionen darauf zur Verwendung der pts-Primer und -Sonden zum Nachweis von GBS in der Probe enthalten. Die Artikel zur Herstellung könnten zusätzlich Reagenzien zum Durchführen der hierin offenbarten Verfahren einschließen (z. B. Puffer, Polymerase-Enzyme, Cofaktoren oder Mittel zum Verhindern einer Kontamination). Solche Reagenzien könnten für eine der kommerziell erhältlichen Instrumente, die hierin beschrieben sind, spezifisch sein.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, die nicht den Umfang der in den Ansprüchen beschriebenen Erfindung beschränken sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1 – LightCycler-Nachweis von Gruppe B-Streptococcus
Ein LightCycler-Test wurde verwendet, um bakterielle Pathogene von Gruppe B-Streptococcus (GBS) aus Vaginal/Anal-Abstrichen nachzuweisen. Eine konservierte Region des Phosphotransferase-Gens (pts) von GBS wurde als ein Ziel für den PCR-Testnachweis verwendet.
Die Primersequenzen waren wie folgt: Primer 1: 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NR: 1); und Primer 2: 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NR: 2). Die Sondensequenzen und Marker waren wie folgt: Sonde 1: 5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA A-Fluorescein-3' (SEQ ID NR: 3); und Sonde 2: 5'-LC-Red640-CAA GTA AAT GCA GAA ACA GG-Phosphat-3' (SEQ ID NR: 4).
Die Primer wurden auf 50 μM durch Messen der A₂₆₀ einer 1/50 Verdünnung (196 μl Wasser + 4 μl, Verdünnungsfaktor (DF; Dilution Factor) = 50) eingestellt. Die Konzentration wurde nach der folgenden Formel berechnet: (μM gefunden/50) × μl verbleibend) – μl verbleibend = hinzuzufügendes Wasser Die Proben wurden in TE' auf eine Konzentration von 20 μM (geliefert mit den Sonden und nach den Herstellerangabe resuspendiert) verdünnt. Die Konzentration der Oligonukleotide und des Farbstoffs wurde zweifach mittels UV-Absorption unter Verwendung der folgenden Gleichungen aus Biochemica, 1999, 1: 5–8 überprüft:

Absorption Emission

Farbstoff Abs max (nm) E_Farbstoff (M^–1cm^–1) E_{260(Farbstoff)} (M^–1cm^–1) Max (nm)

Fluorescein 494 68.000 2.000 524

LC Red 640 622 110.000 31.000 638

Tabelle 1 zeigt das PCR-Reaktionsgemisch. Tabelle 1

Bestandteil	Stockkonzentration	μl
Wasser		11
MgCl₂	50 mM	1,2
LC-FS-DNA MHP^*	10X	2
Primer 1	25 mM	0,24
Primer 2	25 mM	0,24
Fluorescein-Sonde	20 μM	0,2
Red 640-Sonde	20 μM	0,2
Gesamtvolumen		15

* LC-FS-DNA MHP = „LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes" (Roche, Katalog Nr. 3003249)

5 μl der Abstrichproben wurden mit 15 μl PCR-Reaktionsgemisch gemischt und zu der LightCycler-Küvette für das Thermocyclieren zugefügt. Die Proben wurden PCR amplifiziert und die Produkte wurden in einem LightCycler-Instrument (Roche Applied Science, Katalog 2011468) nachgewiesen. Die zyklische PCR-Vorgehensweise, die verwendet wurde, ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

PCR-Programm	Zyklus	Haltezeit (Sekunden)	Temperatur (°C)	Steigung (°C/sec)	Signal-Erfassung
Anfang	1	600	95	20	Keine
PCR	45	10	95	20	Keine
		15	55	20	Einfach
		15	72	20	Keine
Analyse der Schmelzkurve	1	0	95	20	Keine
		20	59	20	Keine
		20	45	0,2	Keine
		0	85	0,2	Kontinuierlich
Abkühlung	1	10	40	20	Keine

Das in dem 640 nm Kanal des LightCycler-Instruments nachgewiesene Signal wurde analysiert. Eine Analyse der Schmelzkurve, die nach der PCR-Amplifikation durchgeführt wurde, wurde verwendet, um den Nachweis von GBS zu bestätigen. GBS positive Proben zeigen eine Tm von 58°C plus oder minus 2°C und wurden direkt mit der positiven Kontrolle verglichen. Negative Proben hatten keine Schmelzkurve.
Plasmidkontrollen wurden durch Klonieren des pts-Produkts, das durch die pts-Primer amplifziert wurde, in ein Plasmid (TA Cloning^® Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA) hergestellt.
Das Plasmid, das das Ziel-Insert enthält, wurde verwendet, um die analytische Empfind lichkeit der Tests zu bestimmen. Die Plasmidkonzentration oder die Kopienzahl des Gen-Ziel-Inserts wurde nach der folgenden Formel bestimmt:
DS DNA, A₂₆₀ zu Molekülen/μl
Gegeben:

1. (A260 × Verdünnungsfaktor)/20 = mg/ml = μg/μl DS DNA 1 A₂₆₀ = 50 μg/ml 1 A₂₆₀ (50) = μg/ml 1 A₂₆₀ (50)/1000 = μg/μl
2. (6,02 × 1023 Moleküle/Mol)/(1012 pMol/Mol) = 6,02 × 1011 Moleküle/pMol
3. Basenpaare an DNA im Molekül = N

Dann: (A260 × DF)/20 μg/μl × 106 pg/μg × 1 pMol/660 pg × 1/N × 6,02 × 1011 Moleküle/pMol = Moleküle/μl
Gekürzte Berechnung:

((A260 × DF)/20) × (9,12 × 1014/N) = Moleküle/μl

Beispiel 2 – Spezifität des LightCycler-Tests von GBS

Die aus den Kulturen einer Vielzahl verschiedener Organismen extrahierte DNA wurde verwendet, um zu bestimmen, ob der GBS-Test mit nicht-GBS-Organismen kreuzreagiert. Organismen, die zu GBS ähnlich sind, wurden getestet aber auch Organismen, die im Allgmeinen in Vaginal- oder Analabstrichproben gefunden werden, wurden getestet. Tabelle 3 zeigt ähnliche Organismen, die getestet wurden, und die Ergebnisse. Tabelle 4 zeigt andere Einzelproben, die getestet wurden, und ihre Ergebnisse. Tabelle 3

Organismus	Lancefield	Quelle		LC-Test
	Gruppe	ATCC	Andere
S. pyogenes	A	19615		Neg
S. agalactiae	B		CAPXL36	Pos
S. suis		43765		Neg
L. lactis		19435		Neg
S. equi ss equi	C	33398		Neg 51°C geschmolzen
S. uberis		19436		Neg
S. can/s	G	43496		Neg 51°C geschmolzen
E. faecium			CAP-D-18-83	Neg
S. bovis			CAP-D-16-83	Neg
E. faecalis		29212		Neg
S. dysgalactiae	C	43078		Neg 51°C geschmolzen
S. salivarius		7073		Neg
S. equinus		9812		Neg
S. pneumoniae		49619		Neg
S. porciuns		43138		Neg
S. iniae		29178		Neg
S. anginosus		33397		Neg
S. MG-intermedius			CAP-D-17-87	Neg
Gruppe F strep	F		SCB-21-89	Neg
S. sanguis			SCB-33-83	Neg
S. mitis		49456		Neg
S. oralis		35037		Neg
S. gordonii		10558		Neg
S. mutans			QC-Stamm-Mayo	Neg
S. intermdius		27335		Neg
S. anginosus		33397		Neg

Tabelle 4

Respiratorisch
Organismus	Quelle	LC-Ergebnis
Acinetobacter bauminii	Patientenisolat	Neg
Acinetobacter lwoffii	QC-Stamm	Neg
Aeromonas hydrophilia	CAP-D-1-82	Neg
Bordetella bronchioseptica	Patientenisolat	Neg
Bordetella parapertussis	ATCC 15311	Neg
	CDC-AB2-C15-82	Neg
Campylobacter jejuni
Corynebacterium		Neg
(Archanobacterium)
haemolyticum	Patientenisolat
Corynebacterium diptheriae	SCB-25-86	Neg
Corynebacterium		Neg
pseudodiptheriae	NY-4-88
Escherichia coli	Patientenisolat	Neg
Haemophilus influenza	ATCC 49766	Neg
Human-DNA	MRC-5-Zellen	Neg
Klebsiella oxytoca	Patientenisolat	Neg
Klebsiella pneumoniae	Patientenisolat	Neg
Legionella jordanis	ATCC 33623	Neg
Legionella pneumophila	ATCC 33152	Neg
Listeria monocytogenes	Patientenisolat	Neg
Moraxella catarrhalis	Patientenisolat	Neg
Morganella morganii	CAP-D-5-79	Neg
Mycoplasma pneumoniae	Patientenisolat	Neg
Neiserria gonorrheae	Patientenisolat	Neg
Neiserria meningitides	Patientenisolat	Neg
Proteus vulgaris	Patientenisolat	Neg
Pseudomonas cepacia	Patientenisolat	Neg
Pseudomonas fluorescens	Patientenisolat	Neg
Staphylococcus aureus	ATCC 25923	Neg
Staphylococcus epidermidis	Patientenisolat	Neg
Stenotrophomonas maltophilia	SOB-33-77	Neg
Citrobacter freundii	Patientenisolat	Neg
Bordetella bronchioseptica	ATCC 19395	Neg

Stuhl-Erhebung

Organismus	Quelle	LC-Test
Actinomyces pyogenes	Klinisch	Neg
Aeromonas hydrophila	CAP-D-1-82	Neg
Bacteroides distasonis	ATCC 8503	Neg
Bacteroides fragilis	ATCC 25285	Neg
Bacteroides thetaiotaomicron	ATCC 29741	Neg
Bacteroides vulgatus	ATCC 29327	Neg
Citrobacier freundii	Klinisch ATCC 13124,	Neg Neg
Clostridium perfingens	C1417
E. coli O70:K:H42	ATCC 23533	Neg
Enterobacter cloacae	Klinisch – 1004	Neg
Enterococcus faecalis	Klinisch V583	Neg
Enterococcus faecium	Klinisch B7641	Neg
Escherichia hermanii	Klinisch	Neg
Escherichia vulneris	Klinisch	Neg
Eubacterium lentum	ATCC 43055	Neg
Fusobacterium nucleatum	ATCC 25559	Neg
Klebsiella pneumoniae	ATCC 700603	Neg
Proteus mirabilis	QC-Stamm	Neg
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 27853	Neg

Genital-Harnwegs-Erhebung

Organismus	Quelle	LC-Ergebnis
Acinetobacter lwoffi	Klinisch	Neg
Candida albicans	Klinisch	Neg
Neisseria gonorrheae	Klinisch	Neg
Corynebacterium		Neg
Pseudotubercuolsis	ATCC 10700
Gardnerella vaginalis	Klinisch	Neg
Mobiluncus curtissi	Klinisch	Neg
Mycoplasma	Klinisch	Neg
Neisseria lactamica	Klinisch	Neg
Peptostreptococcus magnus	Klinisch	Neg
Porphyromonas gingivalis	Klinisch	Neg
Prevotella bivia	Klinisch	Neg
Ureoplasma	Klinisch	Neg

Beispiel 3 – Analytische Empfindlichkeit des LightCycler-Tests
Nur 5 Kopien von GBS-Ziel-DNA pro Reaktion wurden durch den GBS LightCycler-Test nachgewiesen.
Beispiel 4 – Klinische Empfindlichkeit des LightCycler-Tests
Vor der LightCycler-Technologie war der Goldstandard zum Nachweis von GBS eine Kultur. Die Kulturergebnisse von Vaginal-/Analabstrich-Einzelproben von Frauen, die während der 35. bis 37. Schwangerschaftswoche gesammelt wurden, wurden mit dem LightCycler-GBS-Test verglichen. Kultur

LC Vorhanden Abwesend Gesamt

Positiv 37 4 41

Negativ 0 134 134

Gesamt 37 138 175
Die nachfolgenden Ergebnisse wurden unter Verwendung von StatsDirect Version 1.9.15 Software (StatsDirect Ltd, Cheshire, UK) berechnet und schließen 95% Vertrauensintervalle (gezeigt in Klammern) ein. Eine Erklärung der nachfolgend gezeigten Werte und wie jene Werte berechnet werden, kann gefunden werden unter http://www.musc.edu/dc/icrebm/sensitivity.html. Krankheit

Vorhanden Abwesend

Test + a (wahr) b (falsch)

– c (falsch) d (wahr)

Die Prävalenz (Prozentsatz betroffener Patienten, die getestet wurden; [a + c/d]): 21,14% (15,34% bis 27,95%)
Positiver Vorhersagewert (Prozentsatz der Patienten mit einem positiven Test mit Erkrankung; [a/a + b]):
90,24% (76,87% bis 97,28%)
Negativer Vorhersagewert (Prozentsatz der Patienten mit negativem Test ohne Krankheit [d/d + c]):
100% (97,28% bis *%)
Sensitivität (wahr positive Ergebnisse nachgewiesen pro Gesamtzahl betroffener Patienten, die getestet wurden [a/a + c]):
100% (90,51% bis *%)
Spezifität (wahrnegative Ergebnisse pro nicht betroffenen Patienten, die getestet wurden [d/b + d]):
97% (92,74% bis 99,2%)

ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es sollte verstanden werden, dass obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit einer ausführlichen Beschreibung hiervon beschrieben wurde, die vorangegangene Beschreibung der Veranschaulichung dient und den Schutzbereich der Erfindung, welcher durch den Umfang der beigefügten Ansprüche bestimmt wird, nicht beschränkt. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen sind innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von Gruppe B-Streptococcus (GBS) in einer biologischen Probe aus einem Individuum, wobei das Verfahren umfasst: Durchführen mindestens eines zyklischen Schrittes, wobei ein zyklischer Schritt einen Amplifizierungsschritt und einen Hybridisierungsschritt umfasst, wobei der Amplifizierungsschritt das Inkontaktbringen der Probe mit einem pts-Primerpaar umfasst, um ein pts-Amplifikationsprodukt herzustellen, wenn ein GBS-pts-Nukleinsäuremolekül in der Probe vorhanden ist, wobei der Hybridisierungsschritt das Inkontaktbringen der Probe mit einem pts-Sondenpaar umfasst, wobei eine der pts-Sonden mit einer Donorfluoreszenz-Komponente markiert ist, und die andere pts-Sonde mit einer entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponente markiert ist; und Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) zwischen der Donorfluoreszenz-Komponente und der Akzeptorfluoreszenz-Komponente der pts-Sonde, (i) wobei die Gegenwart oder Abwesenheit der Fluoreszenz für die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in der Probe indikativ ist, und (ii) wobei das pts-Primerpaar einen ersten pts-Primer und einen zweiten pts-Primer umfasst, wobei der erste pts-Primer die Sequenz 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NR 1) umfasst, und wobei der zweite pts-Primer die Sequenz 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NR. 2) umfasst; oder wobei das pts-Sondenpaar eine erste pts-Sonde und eine zweite pts-Sonde umfasst, wobei die erste pts-Sonde die Sequenz 5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA A-3' (SEQ ID NR. 3) umfasst, und wobei die zweite pts-Sonde die Sequenz 5'-CAA GTA AAT GCA GAA ACA GG-3' (SEQ ID NR. 4) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikation ein Polymerase-Enzym einsetzt, welches 5'- zu 3'-Exonuklease-Aktivität besitzt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei sich die erste und die zweite Fluoreszenz-Komponente auf der Sonde innerhalb von höchstens 5 Nukleotiden zueinander befinden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die zweite Fluoreszenz-Komponente ein Quencher ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die pts-Sonde eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die Sekundärstrukturausbildung erlaubt, wobei die Sekundärstrukturausbildung in einer räumlichen Nähe zwischen der ersten und der zweiten Fluoreszenz-Komponente resultiert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die zweite Fluoreszenz-Komponente ein Quencher ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mitglieder des pts-Sondenpaars innerhalb von höchstens fünf Nukleotiden voneinander hybridisieren, wobei die erste pts-Sonde des pts-Sondenpaars mit einer Donorfluoreszenz-Komponente markiert ist, und die zweite pts-Sonde des pts-Sondenpaars mit einer entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponente markiert ist, und wobei die Gegenwart von FRET für die Gegenwart von GBS in der Probe indikativ ist, und wobei die Abwesenheit von FRET für die Abwesenheit von GBS in der Probe indikativ ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Mitglieder des pts-Sondenpaars innerhalb von höchstens zwei Nukleotiden voneinander hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Mitglieder des pts-Sondenpaars innerhalb von höchstens einem Nukleotid voneinander hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Donorfluoreszenz-Komponente Fluorescein ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die entsprechende Akzeptorfluoreszenz-Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus LC-Red 640, LC-Red 705, Cy5 und Cy5.5.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Nachweisschritt das Anregen der Probe bei einer Wellenlänge, die von der Donorfluoreszenz-Komponente absorbiert wird, und das Sichtbarmachen und/oder das Messen der Wellenlänge, die von der Akzeptorfluoreszenz-Komponente emittiert wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Nachweisen das Quantifizieren von FRET umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Nachweisschritt nach jedem zyklischen Schritt durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Nachweisschritt in Echtzeit durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, zusätzlich umfassend das Bestimmen der Schmelztemperatur zwischen dem pts-Amplifikationsprodukt und einer oder beider pts-Probe(n), wobei die Schmelztemperatur die Gegenwart oder die Abwesenheit von GBS bestätigt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Gegenwart von FRET innerhalb 45 zyklischer Schritte für die Gegenwart einer GBS-Infektion in dem Individuum indikativ ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Gegenwart von FRET innerhalb 40 zyklischer Schritte für die Gegenwart einer GBS-Infektion in dem Individuum indikativ ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Gegenwart von FRET innerhalb 30 zyklischer Schritte für die Gegenwart einer GBS-Infektion in dem Individuum indikativ ist.
Verfahren nach Anspruch 7, zusätzlich umfassend das Verhindern der Amplifikation einer kontaminierenden Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Verhindern das Durchführen des Amplifikationsschrittes in der Gegenwart von Uracil umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Verhindern zusätzlich das Behandeln der Probe mit Uracil-DNA-Glycosylase vor einem ersten Amplifikationsschritt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Anal- und/oder Vaginalabstrichen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der zyklische Schritt mit einer Kontrollprobe durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Kontrollprobe den Teil des GBS-pts-Nukleinsäuremoleküls umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der zyklische Schritt ein Kontrollprimerpaar und ein Kontrollsondenpaar verwendet, wobei sich die Kontrollprimer und die Kontrollsonden von den pts-Primern und pts-Sonden unterscheiden, wobei der Amplifikationsschritt ein Kontrollamplifikationsprodukt herstellt, wobei die Kontrollsonden mit dem Kontrollamplifikationsprodukt hybridisieren.
Artikel aus Herstellung, umfassend: – ein pts-Primerpaar, wobei das pts-Primerpaar einen ersten pts-Primer und einen zweiten pts-Primer umfasst, wobei der erste pts-Primer die Sequenz 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NR. 1) umfasst, und wobei der zweite pts-Primer die Sequenz 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NR. 2) umfasst; – ein pts-Sondenpaar, wobei das pts-Sondenpaar eine erste pts-Sonde und eine zweite pts-Sonde umfasst, wobei die erste pts-Sonde die Sequenz 5'-CAA ATT AAA GAG ACT ATT CGT GCA A-3' (SEQ ID NR. 3) umfasst, und wobei die zweite pts-Sonde die Sequenz 5'-CAA GTA AAT GCA GAA ACA GG-3' (SEQ ID NR. 4) umfasst; und – eine Donorfluoreszenz-Komponente und eine entsprechende Akzeptorfluoreszenz-Komponente.
Artikel aus Herstellung nach Anspruch 27, wobei die erste pts-Sonde mit der Donorfluoreszenz-Komponente markiert ist, und wobei die zweite pts-Sonde mit der entsprechenden Akzeptorfluoreszenz-Komponente markiert ist.
Artikel aus Herstellung nach Anspruch 27, zusätzlich umfassend einen Beipackzettel mit Instruktionen darauf zur Verwendung des pts-Primerpaars und des pts- Sondenpaars, um die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in einer Probe nachzuweisen.
Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von GBS in einer biologischen Probe aus einem Individuum, wobei das Verfahren umfasst: Durchführen mindestens eines zyklischen Schrittes, wobei ein zyklischer Schritt einen Amplifizierungsschritt und einen Farbstoff-bindenden Schritt umfasst, wobei der Amplifizierungsschritt das Inkontaktbringen der Probe mit einem pts-Primerpaar umfasst, um ein pts-Amplifikationsprodukt herzustellen, wenn ein GBS-pts-Nukleinsäuremolekül in der Probe vorhanden ist, wobei der Farbstoff-bindende Schritt das Inkontaktbringen des pts-Amplifikationsproduktes mit einem Doppelstrang-DNA-bindenden Farbstoff umfasst; und Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit der Bindung des Doppelstrang-DNA-bindenden Farbstoffes in dem Amplifikationsprodukt, (i) wobei die Gegenwart der Bindung indikativ ist für die Gegenwart von GBS in der Probe, und wobei die Abwesenheit der Bindung indikativ ist für die Abwesenheit von GBS in der Probe, und (ii) wobei das pts-Primerpaar einen ersten pts-Primer und einen zweiten pts-Primer umfasst, wobei der erste pts-Primer die Sequenz 5'-TGA GAA GGC AGT AGA AAG CTT AG-3' (SEQ ID NR. 1) umfasst, und wobei der zweite pts-Primer die Sequenz 5'-TGC ATG TAT GGG TTA TCT TCC-3' (SEQ ID NR. 2) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Doppelstrang-DNA-bindende Farbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SYBRGreenI, SYBRGold und Ethidiumbromid.
Verfahren nach Anspruch 30, zusätzlich umfassend das Bestimmen der Schmelztemperatur zwischen dem pts-Amplifikationsprodukt und dem Doppelstrang-DNA-bindenden Farbstoff, wobei die Schmelztemperatur die Gegenwart oder Abwesenheit von GBS bestätigt.