ES2325573T3 - Granulos porosos de fosfato tricalcico beta y metodos para produccion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un Beta-TCP poroso que comprende un cuerpo poroso de gránulos de fosfato tricálcico beta que tienen un tamaño de partícula de 0,1-2 mm, comprendiendo dicho cuerpo poroso una multiplicidad de poros que tienen un tamaño de diámetro de poro de 20-500 mim, 410-460 mim, 40-190 mim, 20-95 mim o 50-125 mim, y que son huecos separados individuales tabicados por paredes y que no están interconectados.

Description

Gránulos porosos de fosfato tricálcico \beta y métodos para producción de los mismos.

Antecedentes de la invención

El tejido óseo en el cuerpo humano comprende la proporción máxima de masa del tejido conectivo del cuerpo. Sin embargo, al contrario que otros tejidos conectivos, su matriz está constituida por cristalitos diminutos fisiológicamente mineralizados, de un fosfato de calcio básico que contiene carbonato denominado hidroxiapatito, distribuido en una estructura organizada de colágeno. La reparación de este tejido es un proceso complejo que implica varias funciones celulares dirigidas hacia la formación de un entramado y mineralización del defecto seguidas por una eventual remodelación del sitio del defecto para alcanzar la estructura original.

Se ha encontrado que las implantaciones de biomateriales basados en fosfato de calcio son generalmente compatibles y conducentes a reparación ósea. La reparación ósea se ve influenciada por cierto número de variables fisicoquímicas asociadas con el fosfato de calcio tales como la relación molar de calcio a fosfato. El hidroxiapatito y el fosfato tricálcico se utilizan ampliamente en implantes óseos. El hidroxiapatito tiene la fórmula química Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH)_{2}, y la relación de calcio a fosfato es aproximadamente 1,67. El fosfato tricálcico (TCP) tiene la fórmula de Ca_{3}(PO_{4})_{2}, y la relación de calcio a fosfato es aproximadamente 1,5. El fosfato tricálcico tiene las propiedades biológicas de ser no reactivo y reabsorbible. El mismo actúa como entramado para crecimiento interno óseo y sufre degradación y reemplazamiento progresivos por hueso (Lange et al., Annals of Clinical and Laboratory Science, 16, pp. 467-472 (1986)). El TCP se degrada 10-20 veces más rápido que el hidroxiapatito. Un implante de TCP da generalmente como resultado una remodelación superior que el hidroxiapatito durante la etapa final de formación de hueso. Es digno de mención que el TCP es reabsorbido por las células osteoclastos, mientras que la reabsorción mucho más lenta del hidroxiapatito es efectuada principalmente por células gigantes de cuerpo extraño. Las células gigantes tienen un límite en cuanto a la cantidad de hidroxiapatito que reabsorberán.

A menudo se selecciona como la matriz para implantes óseos material cerámico poroso. Cuando dicho material se incrusta en el sitio de implante, el material poroso es reabsorbido por las células osteolíticas que infiltran los poros. Simultáneamente, el tejido óseo es regenerado por los osteoblastos. Se requiere cierto tamaño de poro para que los osteoblastos invadan el poro del material de implante. Parámetros tales como cristalinidad, solubilidad, tamaño de partícula, porosidad, estructura de poro y tamaño de poro del material implantado pueden influir notablemente en la compatibilidad con el hueso y la integración en el hueso. Una combinación inadecuada de los parámetros anteriores puede conducir a una reparación incorrecta del hueso.

El uso de materiales cerámicos porosos que tienen poros interconectados como material sólido implantable para sustitutos de hueso ha sido descrito (véase, v.g., la Patente de EE.UU. 5.171.720; véase también Frayssinet et al., Biomaterials, 14, pp. 423-429 (1993)). Tales materiales cerámicos porosos, sin embargo, son quebradizos y no son susceptibles de ser conformados fácilmente por el experto durante una operación.

Un tamaño de poro excesivamente grande y una porosidad alta del material cerámico pueden conducir a tasas de reabsorción excesivas, impidiendo así que la matriz proporcione un entramado para el hueso recién sintetizado. Cuando la tasa de reabsorción es más rápida que la tasa de crecimiento óseo, ello conduce a menudo a una respuesta inflamatoria. Un tamaño de poro pequeño y baja porosidad del material cerámico conducirán a tasas de reabsorción bajas causando encapsulación de partículas de la matriz en el hueso nuevo.

Por consiguiente, sería deseable identificar un biomaterial que pueda ser aplicado a un sitio de defecto y que pueda mejorar notablemente el proceso regenerativo, particularmente cuando se utiliza con otros agentes bioactivos tales como proteínas morfogénicas óseas y otros factores afines. Adicionalmente, sería deseable identificar y utilizar una matriz que actúe como soporte mecánicamente duradero, para los agentes bioactivos, y que sea un material de reemplazamiento óseo bien tolerado que favorezca la curación.

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Sumario de la invención

La presente invención resuelve estos problemas por identificación de un material cerámico poroso que tiene una composición, tamaño de poro, porosidad y tamaño de gránulo para mejorar la regeneración del tejido óseo en un cuerpo vivo, y reparar un defecto óseo en un humano o animal, como se describe en la reivindicación 1. La presente invención proporciona un material de fosfato tricálcico \beta (\beta-TCP) poroso para uso en aplicaciones de implante óseo. La invención proporciona formas porosas de gránulos de \beta-TCP que son biocompatibles y soportan el desarrollo de hueso nuevo en toda su forma estructural.

La invención proporciona también una composición que comprende el \beta-TCP poroso con un agente bioactivo tal como un antibiótico, una proteína morfogénica ósea (BMP), o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica BMP en presencia o ausencia de un factor estimulante de proteínas morfogénicas (MPSF) para mejorar la osteoconductividad. En una realización preferida, el agente bioactivo está encapsulado en un agente biodegradable. Preferiblemente, el tamaño de partícula del agente biodegradable es 20-500 \mum. El material \beta-TCP poroso o la mezcla \beta-TCP poroso/agente bioactivo puede utilizarse también en asociación con aglomerantes para formar una composición de masilla moldeable lista para conformación en el sitio de implante. La invención proporciona también un kit que comprende el \beta-TCP poroso, y al menos uno o más componentes adicionales que incluyen un agente bioactivo y un aglomerante.

En otro aspecto, la invención proporciona también un dispositivo implantable que comprende el material \beta-TCP poroso, y que comprende opcionalmente uno o más componentes adicionales que incluyen un agente bioactivo tal como una BMP, un antibiótico o un aglomerante. La invención proporciona también un dispositivo protésico implantable que comprende el material \beta-TCP poroso y que comprende opcionalmente uno o más componentes adicionales que incluyen un agente bioactivo tal como una BMP, un antibiótico o un aglomerante. El dispositivo protésico o dispositivo implantable que comprende el \beta-TCP poroso y BMP puede comprender opcionalmente un MPSF.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método de producción del material \beta-TCP poroso. El método comprende mezclar el polvo de TCP con un agente formador de poros, añadir una solución de granulación para formar una masa desmenuzable, pasar la masa desmenuzable a través de un tamiz para formar gránulos y sinterizar los gránulos para formar el \beta-TCP poroso.

La invención proporciona también un método de inducción de formación de hueso en un mamífero que comprende el paso de implantar en el sitio de defecto de un mamífero una composición que comprende el \beta-TCP poroso y opcionalmente un aglomerante y/o un agente bioactivo. La invención describe un método de suministro de un agente bioactivo a un sitio que requiere formación de hueso que comprende implantar en el sitio del defecto de un mamífero una composición que comprende el \beta-TCP poroso y un agente bioactivo, en donde el agente bioactivo está encapsulado opcionalmente en un agente biodegradable. La invención describe también un método de suministro de un agente bioactivo a un sitio que requiere formación de cartílago, que comprende implantar en el sitio de defecto de un mamífero una composición que comprende el agente bioactivo y agente biodegradable, en donde el agente bioactivo está encapsulado en el agente biodegradable.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Imagen histológica del animal número 297L (tibia izquierda) a las 4 semanas con placebo. De arriba abajo, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89B, masilla \beta-TCP 89C, y masilla \beta-TCP 89F, respectivamente.

Figura 2. Imagen histológica del animal número 297R (tibia derecha) a las 4 semanas con placebo. De arriba abajo, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno control, colágeno 48C, y masilla \beta-TCP 89A, respectivamente.

Figura 3. Imagen histológica del animal número 295L (tibia izquierda) a las 4 semanas con OP-1. De arriba abajo, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno colágeno 48C, masilla \beta-TCP 89A, y masilla \beta-TCP 89B, respectivamente.

Figura 4. Imagen histológica del animal número 295R (tibia derecha) a las 4 semanas con OP-1. De arriba abajo, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89C, masilla \beta-TCP 89F, y control, respectivamente.

Figura 5. Imagen histológica del animal número 299L (tibia izquierda) a las 8 semanas con placebo. De arriba abajo, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89B, masilla \beta-TCP 89C, y masilla \beta-TCP 89F, respectivamente.

Figura 6. Imagen histológica del animal número 299R (tibia derecha) a las 8 semanas con placebo. De arriba abajo, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno control, colágeno 48C, y masilla \beta-TCP 89A, respectivamente.

Figura 7. Imagen histológica del animal número 138L (tibia izquierda) a las 8 semanas con OP-1. De arriba abajo, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89A, masilla \beta-TCP 89B, y masilla \beta-TCP 89C, respectivamente.

Figura 8. Imagen histológica del animal número 138R (tibia derecha) a las 8 semanas con OP-1. De arriba abajo, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89F, control, y colágeno 48C, respectivamente.

Figura 9. Imagen radiográfica del animal número 297L (tibia izquierda) a las 4 semanas con placebo. A partir de la derecha, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89B, masilla \beta-TCP 89C, y masilla \beta-TCP 89F, respectivamente.

Figura 10. Imagen radiográfica del animal número 297R (tibia derecha) a las 4 semanas con placebo. A partir de la izquierda, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno control, colágeno 48C, y masilla \beta-TCP 89A, respectivamente.

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Figura 11. Imagen radiográfica del animal número 295L (tibia izquierda) a las 4 semanas con OP-1. A partir de la izquierda, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno colágeno 48C, masilla \beta-TCP 89A, y masilla \beta-TCP 89B, respectivamente.

Figura 12. Imagen radiográfica del animal número 295R (tibia derecha) a las 4 semanas con OP-1. A partir de la izquierda, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89C, masilla \beta-TCP 89F, y control, respectivamente.

Figura 13. Imagen radiográfica del animal número 299L (tibia izquierda) a las 8 semanas con placebo. A partir de la derecha, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89B, masilla \beta-TCP 89C, y masilla \beta-TCP 89F, respectivamente.

Figura 14. Imagen radiográfica del animal número 299R (tibia derecha) a las 8 semanas con placebo. A partir de la izquierda, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno control, colágeno 48C, y masilla \beta-TCP 89A, respectivamente.

Figura 15. Imagen radiográfica del animal número 138L (tibia izquierda) a las 8 semanas con OP-1. A partir de la derecha, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89A, masilla \beta-TCP 89B, y masilla \beta-TCP 89C, respectivamente.

Figura 16. Imagen radiográfica del animal número 138R (tibia derecha) a las 8 semanas con OP-1. A partir de la izquierda, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89F, control, y colágeno 48C, respectivamente.

Figura 17. Imagen de escaneo en parafina del animal número 297L (tibia izquierda) a las 4 semanas con placebo. A partir de arriba, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89B, masilla \beta-TCP 89C, y masilla \beta-TCP 89F, respectivamente.

Figura 18. Imagen de escaneo en parafina del animal número 297R (tibia derecha) a las 4 semanas con placebo. A partir de arriba, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno control, colágeno 48C, y masilla \beta-TCP 89A, respectivamente.

Figura 19. Imagen de escaneo en parafina del animal número 295L (tibia izquierda) a las 4 semanas con OP-1. A partir de arriba, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno colágeno 48C, masilla \beta-TCP 89A, masilla \beta-TCP 89B, respectivamente.

Figura 20. Imagen de escaneo en parafina del animal número 295R (tibia derecha) a las 4 semanas con OP-1. A partir de arriba, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89C, masilla \beta-TCP 89F, y control, respectivamente.

Figura 21. Imagen de escaneo en parafina del animal número 299L (tibia izquierda) a las 8 semanas con placebo. A partir de arriba, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89B, masilla \beta-TCP 89C, y masilla \beta-TCP 89F, respectivamente.

Figura 22. Imagen de escaneo en parafina del animal número 299R (tibia derecha) a las 8 semanas con placebo. A partir de arriba, los sitios son medio y distal, conteniendo cada uno colágeno 48C y masilla \beta-TCP 89A, respectivamente.

Figura 23. Imagen de escaneo en parafina del animal número 138L (tibia izquierda) a las 8 semanas con OP-1. A partir de arriba, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89A, masilla \beta-TCP 89B, y masilla \beta-TCP 89C, respectivamente.

Figura 24. Imagen de escaneo en parafina del animal número 138R (tibia derecha) a las 8 semanas con OP-1. A partir de arriba, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno masilla \beta-TCP 89F, control, y colágeno 48C, respectivamente.

Figura 25. Sitio medio del espécimen 295L que muestra uno de los cinco poros con crecimiento óseo, donde EP es un poro vacío y FP es un poro rellenado.

Figura 26. Sitio distal del espécimen 299L que muestra 7 u 8 poros con crecimiento óseo, donde EP es cualquier poro vacío y FP es un poro rellenado.

Figura 27. Imagen radiográfica del animal número 5333L (tibia izquierda) a las 4 semanas con OP-1 encapsulada en PLGA. A partir de la izquierda, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno control, formulación 5 y formulación 4, respectivamente.

Figura 28. Imagen radiográfica del animal número 5335L (tibia izquierda) a las 8 semanas con OP-1 encapsulada en PLGA. A partir de la izquierda, los sitios son proximal, medio y distal, conteniendo cada uno control, formulación 4 y formulación 5, respectivamente.

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Descripción detallada de la invención

Con objeto de que la invención descrita en esta memoria pueda comprenderse plenamente, se proporciona la descripción detallada que sigue.

"Homología de secuencia de aminoácidos" debe entenderse que incluye tanto identidad como semejanza de secuencia de aminoácidos. Las secuencias homólogas comparten residuos de aminoácidos idénticos y/o similares, donde los residuos similares son sustituciones conservadoras de, o "mutaciones puntuales permitidas" de, residuos de aminoácidos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. Así, una secuencia polipeptídica candidato que comparte 70% de homología de aminoácidos con una secuencia de referencia es una en la cual cualquier 70% de los residuos alineados son idénticos a, o son sustituciones conservadoras de, los residuos correspondientes en una secuencia de referencia. Ciertos polipéptidos morfogénicos particularmente preferidos comparten al menos 60%, y preferiblemente 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 102-106 del terminal C, que definen el dominio conservado de siete cisteínas de OP-1 humana, BMP-2, y proteínas afines.

La homología de secuencia de aminoácidos puede determinarse por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar el porcentaje de homología de una secuencia de aminoácidos candidato con la secuencia del dominio de siete cisteínas, se alinean en primer lugar las dos secuencias. La alineación puede hacerse con, v.g., el algoritmo de programación dinámica descrito en Needleman et al., J. Mol. Biol., 48, pp. 443 (1970), y el Programa Align, un paquete de software comercial producido por DNAstar, Inc. Una alineación inicial puede refinarse por comparación con una alineación de secuencias múltiples de una familia de proteínas afines. Una vez realizada y refinada la alineación, se calcula un registro de homología porcentual. Los residuos de aminoácidos alineados de las dos secuencias se comparan secuencialmente en cuanto a su semejanza mutua. Factores de semejanza incluyen tamaño similar, forma y carga eléctrica. Un método particularmente preferido de determinación de semejanzas de aminoácidos es la matriz PAM250 descrita en Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, pp. 345-352 (1978 y suplementos). Un registro de semejanza se calcula primeramente como la suma de los registros de semejanza de aminoácidos alineados por parejas. Las inserciones y deleciones se ignoran para los propósitos de homología e identidad porcentual. De acuerdo con ello, no se utilizan penalidades por laguna en este cálculo. El registro bruto se normaliza luego dividiéndolo por la media geométrica de los registros de la secuencia candidato y el dominio de siete cisteínas. La media geométrica es la raíz cuadrada

\hbox{del producto de estos
registros. El registro bruto normalizado es la homología
porcentual.}

"Biocompatible" hace referencia a un material que no provoca efectos perjudiciales asociados con los diversos sistemas protectores del cuerpo, tales como las respuestas inmunitarias celular y humoral-asociada, v.g., respuestas inflamatorias y respuestas fibróticas de cuerpos extraños. El término biocompatible implica también que no son causados efectos específicos indeseables citotóxicos o sistémicos de ningún tipo por el material cuando se implanta el mismo en el paciente.

"Aglomerante" hace referencia a cualquier material biocompatible que, cuando se mezcla con proteínas osteogénicas y/o con la matriz porosa promueve la formación de hueso. Ciertos aglomerantes preferidos promueven dicha reparación utilizando menos proteína osteogénica que los dispositivos osteogénicos estándar. Otros aglomerantes preferidos pueden promover la reparación utilizando la misma cantidad de la proteína osteogénica que los dispositivos osteogénicos estándar, en tanto que algunos requerirán más para promover la reparación. Como se expone en esta memoria, el profesional experto puede determinar una cantidad eficaz de proteína para uso con cualquier aglomerante adecuado utilizando exclusivamente experimentación rutinaria. Entre las otras características de un aglomerante preferido se encuentra la capacidad para hacer el dispositivo: flexible, conformable y/o maleable; inyectable; adherente a hueso, cartílago, músculo y otros tejidos, resistente a la desintegración por lavado y/o irrigación durante la cirugía; y resistente al desalojo durante la cirugía, suturación y postoperatoriamente, para citar sólo unos cuantos. Adicionalmente, en ciertas realizaciones preferidas, un aglomerante puede conseguir las características y ventajas mencionadas anteriormente cuando está presente en bajas proporciones.

"Agente biodegradable" hace referencia a un material reabsorbible y biocompatible tal como un material que se degrada gradualmente en el sitio de implantación. El material es capaz de encapsular un agente bioactivo para proporcionar suministro de liberación controlada o liberación prolongada del agente bioactivo. El material biodegradable abarca polímeros naturales y sintéticos. Ejemplos de material biodegradable son poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida) (PDLLA), poliglicolida (PGA), poli(lactida-co-glicolida) (PLGA) y copolímeros de los mismos.

"Hueso" hace referencia a un tejido conectivo calcificado (mineralizado) que comprende fundamentalmente un material compuesto de calcio y fosfato depositados en forma de hidroxiapatito, colágeno (principalmente colágeno tipo I) y células óseas tales como osteoblastos, osteocitos y osteoclastos, así como tejido de médula ósea que se forma en el interior del hueso endocondral verdadero. El tejido óseo difiere significativamente de otros tejidos, con inclusión del tejido cartilaginoso. Específicamente, el tejido óseo es tejido vascularizado compuesto de células y un medio bifásico que comprende un componente inorgánico mineralizado (principalmente cristales de hidroxiapatito) y un componente orgánico (fundamentalmente de colágeno tipo I). Los glucosaminoglucanos constituyen menos del 2% de este componente orgánico y menos del 1% del medio bifásico propiamente dicho, o del tejido óseo per se. Además, con relación al tejido cartilaginoso, el colágeno presente en el tejido óseo existe en una configuración paralela altamente organizada. Los defectos óseos, sean de etiologías degenerativa, traumática o cancerosa, plantean un reto formidable al cirujano reconstructor. Es particularmente difícil la reconstrucción o reparación de partes esqueléticas que comprenden parte de un complejo multitisular, tal como ocurre en las articulaciones de los mamíferos.

"Formación de hueso" significa formación de hueso endocondral o formación de hueso intramembranoso. En los humanos, la formación de hueso comienza durante las primeras 6-8 semanas del desarrollo fetal. Las células madre progenitoras de origen mesenquimático migran a sitios predeterminados, donde las mismas o bien: (a) se condensan, proliferan, y se diferencian en células formadoras de hueso (osteoblastos), un proceso observado en el cráneo y al que se hace referencia como "formación de hueso intermembranoso" o, (b) se condensan, proliferan y se diferencian en células formadoras de cartílago (condroblastos) como intermediarias, que son reemplazadas subsiguientemente con células formadoras de hueso. Más específicamente, las células madre mesenquimáticas se diferencian en condrocitos. Los condrocitos se calcifican posteriormente, sufren hipertrofia y son reemplazados por hueso de nueva formación constituido por osteoblastos diferenciados, que están presentes ahora en el sitio. Subsiguientemente, el hueso mineralizado se remodela extensivamente, llegando a quedar ocupado más tarde por un osículo rellenado con elementos funcionales de médula ósea. Este proceso se observa en los huesos largos y se hace referencia al mismo como "formación de hueso endocondral". En la vida postfetal, el hueso tiene la capacidad de repararse por sí mismo después de una lesión por mimetización del proceso celular de desarrollo de hueso endocondral embrionario. Es decir, las células madre mesenquimáticas progenitoras de la médula ósea, el periostio, y el músculo pueden verse inducidas a migrar al sitio del defecto y comenzar la cascada de sucesos arriba descrita. Allí, se acumulan, proliferan y se diferencian en el cartílago, que es reemplazado subsiguientemente con hueso de nueva formación.

"Proteína morfogénica ósea (BMP)" hace referencia a una proteína perteneciente a la familia BMP de la superfamilia de proteínas TGF-\beta (familia BMP) basada en homología de secuencias de DNA y aminoácidos. Una proteína pertenece a la familia BMP de acuerdo con la invención cuando la misma tiene al menos 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos un miembro conocido de la familia BMP dentro del dominio rico en cisteína C-terminal conservado que caracteriza a la familia de proteínas BMP. Los miembros de la familia BMP pueden tener menos de 50% de identidad de secuencia de DNA o aminoácidos globalmente.

"Sustituciones conservadoras" son residuos que son física o funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes. Es decir, una sustitución conservadora y su residuo de referencia tienen tamaño, forma, carga eléctrica y propiedades químicas similares que incluyen la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o análogas. Sustituciones conservadoras preferidas son aquéllas que satisfacen los criterios definidos para una mutación puntual aceptada en Dayhoff et al., supra. Ejemplos de sustituciones conservadoras son sustituciones dentro de los grupos siguientes: (a) valina, glicina; (b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido aspártico, ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina, tirosina. El término "variante conservadora" o "variación conservadora" incluye también el uso de un residuo de aminoácido sustituyente en lugar de un solo residuo de aminoácido en una secuencia de aminoácidos parental dada, donde los anticuerpos específicos para la secuencia parental son también específicos para, es decir, "reaccionan cruzadamente" o "inmunorreaccionan" con, la secuencia polipeptídica sustituida resultante.

"Defecto" o "sitio de defecto" hace referencia a un sitio que requiere reparación, construcción, fusión, regeneración o aumento de hueso, articulación, cartílago o ligamento. El sitio puede ser una rotura o anormalidad estructural ortopédica, o un sitio en el que el hueso no crece normalmente. El defecto puede definirse adicionalmente como un defecto osteocondral, que incluye una rotura estructural tanto del hueso como del cartílago suprayacente. Un defecto puede asumir la configuración de un "hueco" que se entiende significa un defecto tridimensional tal como, por ejemplo, una laguna, cavidad, orificio u otra rotura sustancial en la integridad estructural de un hueso o articulación. Un defecto puede ser resultado de accidente, enfermedad, manipulación quirúrgica, y/o fracaso protésico. En ciertas realizaciones, el defecto es un hueco que tiene un volumen incapaz de reparación endógena o espontánea. Defectos de este tipo en los huesos largos alcanzan generalmente dos veces el diámetro del hueso en cuestión y se denominan también defectos "de tamaño crítico". Por ejemplo, en un modelo de defecto del cúbito de los cánidos, la técnica reconoce que los defectos de este tipo son aproximadamente de 3-4 cm. Generalmente, los defectos de tamaño crítico son aproximadamente de 1,0 cm, y no son susceptibles de reparación espontánea. Véase, por ejemplo Schmitz et al., Clinical Orthopaedics and Related Research, 205, pp. 299-308 (1986); y Vukicevic et al., en Advances in Molecular and Cell Biology, 6, pp. 207-224 (1993) (JAI Press, Inc.). En modelos de defectos segmentarios de conejos y monos, la laguna es aproximadamente de 1,5 cm y 2,0 cm, respectivamente. En otras realizaciones, el defecto es un defecto segmentario de tamaño no crítico. Generalmente, éstos son susceptibles de reparación espontánea. En ciertas otras realizaciones, el defecto es un defecto osteocondral, tal como un tapón osteocondral. Un defecto de este tipo atraviesa la totalidad del cartílago suprayacente y penetra, al menos en parte, en la estructura ósea subyacente. En contraste, un defecto condral o subcondral atraviesa el cartílago suprayacente, en parte o en su totalidad, respectivamente, pero no implica el hueso subyacente. Otros defectos susceptibles de reparación utilizando la presente invención incluyen, pero sin carácter limitante, fracturas no consolidadas; cavidades óseas, resección de tumores, fracturas recientes (con distracción o sin distracción), anormalidades craneales, maxilofaciales y faciales, por ejemplo, en la reconstrucción del esqueleto facial, específicamente, reconstrucción del fondo orbital, aumento del reborde o seno alveolar, defectos periodontales y cavidades de extracciones dentales; craneoplastia, genioplastia, aumento de barbilla, reconstrucción del paladar, y otras grandes reconstrucciones óseas; vertebroplastia, fusiones intercorporales en la columna cervical, torácica y lumbar y fusiones posterolaterales en la columna torácica y lumbar; en osteomielitis para regeneración ósea; fusión apendicular, fusión de tobillo, fusiones totales o artroplastia de cadera, rodilla y otras articulaciones; corrección de defectos de tendones y/o tejido ligamentoso tales como, por ejemplo, los ligamentos anterior, posterior, lateral y medial de la rodilla, la rótula y los tendones de Aquiles, y análogos, así como aquellos defectos resultantes de enfermedades tales como cáncer, artritis, con inclusión de osteoartritis, y otros trastornos degenerativos óseos tales como osteocondritis disecante.

"Solución de granulación" hace referencia a una solución que tiene cierto grado de consistencia y cohesividad, y mejora la formación de gránulos.

"Proteína morfogénica" hace referencia a una proteína que tiene actividad morfogénica (véase más adelante). Preferiblemente, una proteína morfogénica de esta invención comprende al menos un polipéptido perteneciente a la familia de proteínas BMP. Las proteínas morfogénicas pueden ser capaces de inducir a las células progenitoras a proliferar y/o iniciar caminos de diferenciación que conducen a cartílago, hueso, tendón, ligamento, neural u otros tipos de formación de tejido que dependen de estímulos ambientales locales, y por consiguiente las proteínas morfogénicas pueden comportarse de modo diferente en diferentes entornos. Por ejemplo, una proteína osteogénica puede inducir tejido óseo en un sitio de tratamiento y tejido neural en otro sitio de tratamiento distinto.

"Factor estimulante de proteínas morfogénicas (MPSF)" hace referencia a un factor que es capaz de estimular la capacidad de una proteína morfogénica para inducir formación de tejido a partir de una célula progenitora. El MPSF puede tener un efecto directo o indirecto sobre la mejora de la actividad inductora de proteína morfogénica. Por ejemplo, el MPSF puede aumentar la bioactividad de otro MPSF. Agentes que aumentan la bioactividad de MPSF incluyen, por ejemplo, aquéllos que aumentan la síntesis, la semivida, la reactividad con otras biomoléculas tales como fijación de proteínas y receptores, o la biodisponibilidad del MPSF.

"Proteína osteogénica (OP)" hace referencia a una proteína morfogénica que es capaz de inducir la formación de cartílago y/o hueso por una célula progenitora. El hueso puede ser hueso intramembranoso o hueso endocondral. La mayor parte de las proteínas osteogénicas son miembros de la familia de proteínas BMP y son por tanto también BMP. Como se describe en otro lugar de esta memoria, la clase de proteínas está tipificada por la proteína osteogénica humana (hOP-1). Otras proteínas osteogénicas útiles en la práctica de la invención incluyen formas osteogénicamente activas de OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, DPP, Vgl, Vgr, proteína 60A, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, BMP-10, BMP-11, BMP-13, BMP-15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP o NEURAL y variantes de secuencias de aminoácidos de las mismas. En una realización actualmente preferida, la proteína osteogénica incluye una cualquiera de: OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, y variantes de secuencias de aminoácidos y homólogos de las mismas, con inclusión de homólogos de especies de las mismas. Proteínas osteogénicas particularmente preferidas son aquéllas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con los 102-106 aminoácidos del terminal C, que definen el dominio de siete cisteínas conservado, de OP-1 humana, BMP-2 y proteínas afines. Ciertas realizaciones preferidas de la presente invención comprenden la proteína osteogénica, OP-1. Como se describe adicionalmente en otro lugar de esta memoria, las proteínas osteogénicas adecuadas para uso con la invención de los solicitantes pueden identificarse por medio de experimentación rutinaria utilizando el bioensayo reconocido en la técnica descrito por Reddi y Sampath (Sampath et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, pp. 7109-13.

Proteínas útiles en esta invención incluyen proteínas eucariotas identificadas como proteínas osteogénicas (véase la Patente de EE.UU. 5.011.691, tales como las proteínas OP-1, OP-2, OP-3, y CBMP-2, así como proteínas afines en secuencia de aminoácidos, tales como DPP (de Drosophila), Vgl (de Xenopus), Vgr-1 (de ratón), GDF-1 (humana, véase Lee, PNAS, 88, pp. 4250-4254 (1991)), 60A (de Drosophila, véase Wharton et al. PNAS, 88, pp. 9214-9218 (1991)), dorsalin-1 (de pollo, véase Basler et al. Cell 73, pp. 687-702 (1993) y número de acceso a GenBank L12032) y GDF-5 (de ratón, véase Storm et al. Nature 368, pp. 639-643 (1994)). Se prefiere también BMP-3. Proteínas útiles adicionales incluyen constructos morfogénicos biosintéticos descritos en la Patente de EE.UU. No. 5.011.691, v.g., COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 y COP-16, así como otras proteínas conocidas en la técnica. Otras proteínas adicionales incluyen formas osteogénicamente activas de BMP-3b (véase Takao, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 219, pp. 656-662 (1996)). BMP-9 (véase WO95/33830), BMP-15 (véase WO96/35710), BMP-12 (véase WO95/16035), CDMP-1 (véase WO 94/12814), CDMP-2 (véase WO94/12814), BMP-10 (véase W094/26893), GDF-1 (véase WO92/00382), GDF-10 (véase W095/10539), GDF-3 (véase WO94/15965) y GDF-7 (véase W095/01802).

Debe entenderse que el término "reparación" significa formación de hueso y/o cartílago nuevo que es suficiente para rellenar al menos parcialmente el hueco o la discontinuidad estructural en el defecto. Reparación no significa, sin embargo, o por lo demás un proceso de curación completa o un tratamiento que sea 100% eficaz en cuanto al restablecimiento de un defecto a su estado fisiológico/estructural/mecánico previo al defecto.

"Interacción sinérgica" hace referencia a una interacción en la cual el defecto combinado de dos o más agentes es mayor que la suma algebraica de sus efectos individuales.

\beta-TCP poroso

Esta presente invención proporciona un \beta-TCP poroso que tiene un tamaño de poro y un tamaño de gránulo apropiados para la formación de hueso, regeneración ósea y reparación ósea en un sitio de defecto en un humano o animal. El cuerpo de \beta-TCP poroso descrito en esta invención comprende \beta-TCP que tiene una multiplicidad de poros. Cada poro es un hueco separado individual tabicado por paredes y no está interconectado. El cuerpo de \beta-TCP poroso de esta invención es distinto de las estructuras esponjosas o fenestradas que contienen caminos o interconexiones capilares huecos(as) entre poros adyacentes. El tamaño de diámetro de poro del \beta-TCP poroso de esta invención está comprendido en el intervalo de 20-500 \mum. En una realización, el tamaño de diámetro de poro está comprendido en el intervalo de 410-460 \mum. En una realización preferida, el tamaño de diámetro de poro es 40-190 \mum. En otra realización, el tamaño de diámetro de poro está comprendido en el intervalo de 20-95 \mum. En una realización más preferida, el diámetro de poro está comprendido en el intervalo de 50-125 \mum. Estos poros proporcionan espacios de residencia para las células osteolíticas y osteoblastos infiltrantes cuando el material de \beta-TCP se incrusta en el cuerpo vivo. En una realización, los poros son esféricos y están distribuidos uniformemente. Poros esféricos que tengan un diámetro comprendido en el intervalo de 20-500 \mum son apropiados para la infiltración de osteoblastos. Los poros esféricos proporcionan también al cuerpo poroso la resistencia mecánica necesaria durante el periodo que está siendo sintetizado hueso nuevo, evitando con ello que el hueso se fracture durante este
periodo.

El fosfato tricálcico (TCP) tiene la fórmula Ca_{3}(PO_{4})_{2}, siendo la relación Ca/P aproximadamente 1,5. El polvo de TCP tiene una estructura cristalina de apatito. Después de la sinterización, la estructura de apatito se convierte en la estructura de \beta-TCP rómbica. A temperaturas altas, puede formarse también la estructura metaestable, \alpha-TCP. Se sabe que \alpha-TCP tiene una solubilidad excesiva, lo cual no permite que la tasa de reabsorción sea complementaria a la tasa de sustitución por el tejido duro. Adicionalmente, \alpha-TCP es capaz de generar respuestas inflamatorias perjudiciales. En una realización preferida, el TCP se sinteriza a temperaturas elevadas de 1100-1200ºC. Por encima de 1300ºC, el TCP se convierte en el \alpha-TCP metaestable. La sinterización del TCP reduce su solubilidad en los fluidos corporales, lo cual conduce a una reducción correspondiente en su actividad química de tal manera que el TCP poroso es bien tolerado en el cuerpo y se evitan las reacciones inflamatorias agudas. Por esta razón, el \beta-TCP poroso se sinteriza preferiblemente. Más preferiblemente, el \beta-TCP comprende \beta-TCP que tiene una pureza de 95-
100%.

El material de \beta-TCP poroso de la presente invención puede tener cualesquiera forma y tamaño. En una realización, el \beta-TCP poroso es granular y tiene un tamaño de partícula comprendido entre 0,1 y 2 mm. En una realización preferida, el tamaño de partícula es 0,5-1,7 mm. En una realización más preferida, el tamaño de partícula es 1,0-1,7 mm. En una realización muy preferida, el tamaño de partícula es 0,5-1 mm. No es apropiado un \beta-TCP que tenga un tamaño de gránulo menor que 0,1 mm debido a que será desplazado fácilmente por los fluidos corporales fluyentes. Por otra parte, aunque la formación de hueso es más evidente en las partículas mayores, \beta-TCP que tenga un tamaño de gránulo mayor que 2 mm no es tampoco apropiado debido a que se formarán demasiadas lagunas o lagunas excesivamente grandes entre los gránulos, impidiendo con ello la coalescencia eficaz del \beta-TCP con el hueso recién sintetizado.

La porosidad del \beta-TCP influye en la tasa de reabsorción. Si la porosidad es demasiado alta, la solidez de los gránulos se reducirá. Si la porosidad es demasiado baja, la tasa de reabsorción será lenta. La porosidad total se mide utilizando el método del parámetro de intrusión de mercurio o métodos equivalentes. En una realización, la porosidad total está comprendida en el intervalo de 5-80%. En otra realización, la porosidad total está comprendida en el intervalo de 40-80%. En una realización más preferida, la porosidad total es 65-75%. En una realización muy preferida, la porosidad total es 70%.

El \beta-TCP poroso de esta invención puede combinarse también con uno o más agentes bioactivos. El agente bioactivo puede ser un agente que aumenta el crecimiento óseo o una sustancia que es médicamente útil o combinaciones de las mismas. Se contempla que el agente bioactivo puede incluir, pero sin carácter limitante, proteínas morfogénicas óseas, factores de crecimiento tales como EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-\alpha y TGF-\beta, citoquinas, MPSF, hormonas, péptidos, lípidos, agentes tróficos y composiciones terapéuticas que incluyen antibióticos y agentes quimioterapéuticos, insulina, quimioatrayente, factores quimiotácticos, enzimas, e inhibidores de enzimas. Se contempla también que agentes bioactivos tales como vitaminas, agentes citoesqueléticos, fragmentos de cartílago, aloinjertos, autoinjertos, células vivas tales como condrocitos, células de la médula ósea, células madre mesenquimáticas, trasplantes de tejidos o inmunosupresores pueden añadirse al \beta-TCP poroso.

En una realización, el agente bioactivo es una proteína morfogénica ósea. En una realización preferida, la proteína morfogénica ósea es OP-1 (BMP-7), OP-2, OP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16, BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, MP121, dorsalin-1, DPP, Vg-1, Vgr-1, proteína 60A, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL, y TGF-\beta. En una realización más preferida, la proteína morfogénica es OP-1.

En otra realización, la actividad morfogénica de la proteína morfogénica ósea se intensifica por la adición de un MPSF. En una realización preferida, el MPSF se selecciona del grupo constituido por el factor de crecimiento I afín a la insulina (IGF-I), estradiol, factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), hormona del crecimiento (GH), factor de crecimiento y diferenciación (GDF), hidrocortisona (HC), insulina, progesterona, hormona paratiroidea (PTH), vitamina D, ácido retinoico e IL-6. En una realización preferida, el MPSF se selecciona de IGF-1, IL-6, FGF y PTH. En una realización más preferida, el MPSF es IGF-1.

En otra realización, el agente bioactivo es preferiblemente un antimicrobiano o antibiótico que incluye, pero sin carácter limitante, eritromicina, bacitracina, neomicina, penicilina, polimixina B, tetraciclina, viomicina, cloromicetina y estreptomicina, cefazolina, ampicilina, azactam, tobramicina, clindamicina y gentamicina. Las concentraciones del antibiótico a utilizar son bien conocidas en la técnica. Tales antibióticos se han conocido y utilizado en conexión con materiales de cemento óseo. Véase, por ejemplo, Hoff, et al., J. Bone Joint Surg., 63A, pp. 798, (1981); y Dueland et al., Clin. Orthop., 169, pp. 264-268, (1982).

En otra realización preferida, el agente bioactivo es una célula de reparación. En una realización preferida, la célula de reparación es una célula de mamífero, más preferiblemente, una célula humana del mismo tipo que la del tejido que se repara o reconstruye. Ejemplos adecuados de células de reparación incluyen células óseas tales como células madre de médula ósea, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos y células progenitoras óseas. En otra realización, la célula está transfectada con una molécula de ácido nucleico que codifica una BMP.

En otra realización preferida adicional, el agente bioactivo es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una BMP, preferiblemente, OP-1 (SEQ ID NO: 10). En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico es una molécula de RNA o DNA. La secuencia de ácido nucleico que codifica la BMP puede insertarse en vectores de expresión recombinantes. Ejemplos de vectores incluyen, pero sin carácter limitante, pBR322, pH717, pH731, pH752, pH754 y pW24. Pueden utilizarse vectores SP6 para transcripción in vitro de RNA. Promotores de transcripción útiles para expresar la BMP incluyen, pero sin carácter limitante, el promotor temprano de SV40, el promotor de adenovirus (AdMLP), el promotor metalotioneína-I de ratón (mMT-I), la repetición del terminal largo (LTR) del virus del sarcoma de Rous (RSV), la repetición terminal larga del virus del tumor mamario del ratón (MMTV-LTR), y el promotor intermedio-temprano principal de citomegalovirus humano (hCMV). Las secuencias de DNA para todos estos promotores se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente. La secuencia de DNA puede insertarse también en el genoma de un virus recombinante tal como, por ejemplo, adenovirus recombinante, virus adeno-asociado o retrovirus. La célula de reparación o célula progenitora ósea se transfecta luego o se infecta con el vector o virus y expresa la proteína BMP. La secuencia de ácido nucleico puede transfectar de modo transitorio o estable la célula de reparación o la célula progenitora ósea.

En una realización, la molécula de ácido nucleico se inyecta directamente en el sitio de implante. Preferiblemente, el ácido nucleico está atrapado en un vehículo seleccionado del grupo constituido por manitol, sacarosa, lactosa, trehalosa, liposomas, proteoliposomas que contienen proteínas de la envoltura viral y complejos polilisina-glicoproteína. Véase, p.ej., Ledley, J. Pediatrics 110, pp. 1 (1987); Nicolau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, pp. 1068 (1983). En otra realización preferida, el ácido nucleico se transfecta o infecta en células diana tales como células progenitoras y células de reparación óseas que se han separado del cuerpo. La célula transfectada o las células infectadas se reimplantan luego en el cuerpo.

En una realización muy preferida, el agente bioactivo está encapsulado en un agente biodegradable. A medida que el agente biodegradable es reabsorbido lentamente por las células osteoblastos, el agente bioactivo encapsulado se libera gradualmente en la matriz. En el sitio de implante, puede suministrarse el agente bioactivo a través de una combinación de agentes biodegradables diferentes, que difieren preferiblemente en la tasa de reabsorción, hasta alcanzar un sistema de suministro reforzado múltiple. En otra realización preferida, el agente biodegradable está multiestratificado. Cada capa comprende un agente biodegradable diferente, que difiere preferiblemente en la tasa de reabsorción. Métodos de encapsulación del agente bioactivo incluyen, pero sin carácter limitante, el método de evaporación en emulsión de disolvente (Grandfils et al., Journal of Biomedical Materials Research, 26, pp. 467-479 (1992)) y el método descrito en Herbert et al., Pharmaceutical Research, 15, pp. 357-361 (1998). El último método es especialmente adecuado para encapsulación de proteínas. Otros métodos se describen en las Patentes U.S. 6.110.503, 5.654.008 y 5.271.961. En una realización preferida, la OP-1 se estabiliza por adición de lactosa durante el proceso de encapsulación.

Los agentes biodegradables de esta invención pueden encontrarse en forma de cuentas o de microesferas. Los agentes biodegradables pueden ser polímeros biocompatibles reabsorbibles que incluyen polímeros tanto naturales como sintéticos. Los polímeros naturales son absorbidos típicamente por degradación enzimática en el cuerpo, mientras que los polímeros reabsorbibles sintéticos se degradan típicamente por un mecanismo hidrolítico. Se prefiere que el tamaño de partícula del agente biodegradable sea 20-500 \mum, preferiblemente, 20-140 \mum, más preferiblemente 50-140 \mum, y muy preferiblemente 75-140 \mum.

En una realización, el agente biodegradable se selecciona del grupo constituido por etileno-acetato de vinilo, colágeno natural y sintético, poli(glaxanona), poli(fosfacenos), poliglactina, ácido poligláctico, ácido polialdónico, ácidos poliacrílicos, polialcanoatos, poliortoésteres, poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida) (PDLLA), poliglicolida (PGA), poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), poli(\zeta-caprolactona), poli(trimetilen-carbonato), poli(p-dioxanona), poli(\zeta-caprolactona-co-glicolida), poli(glicolida-co-trimetilen-carbonato), poli(D,L-lactida-co-trimetilen-carbonato), poliarilatos, polihidroxibutirato (PHB), polianhídridos, poli(anhídrido-co-imida) y copolímeros de los mismos, polímeros de aminoácidos, propileno-co-fumaratos, un polímero de uno o más monómeros de ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos, composiciones bioactivas de vidrio, mezclas de los mismos y cualesquiera derivados y modificaciones de los mismos. Preferiblemente, la modificación cambia menos del 50% de la estructura global del polímero.

En una realización preferida, el agente biodegradable se selecciona del grupo constituido por poliortoésteres, poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida) (PDLLA), poliglicolida (PGA), poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), poli(\zeta-caprolactona), poli(trimetilen-carbonato), poli(p-dioxanona), poli(\zeta-caprolactona-co-glicolida), poli(glicolida-co-trimetilen-carbonato), poli(D,L-lactida-co-trimetilen-carbonato), poliarilatos y copolímeros de los mismos.

En otra realización más preferida, el agente biodegradable se selecciona del grupo constituido por poli(glaxanona), poli(fosfacenos), etileno-vinilacetato, poliglactina, ácido poligláctico, ácido polialdónico, ácidos poliacrílicos, polialcanoatos, copolímeros de los mismos y colágeno natural y sintético.

En otra realización adicional más preferida, el agente biodegradable se selecciona del grupo constituido por polihidroxibutirato (PHB), anhídridos con inclusión de polianhídridos, poli(anhídrido-co-imida) y copolímeros de los mismos, polímeros de aminoácidos propileno-co-fumaratos, un polímero de uno o más monómeros de ácidos hidroxicarboxílicos (v.g., ácido \alpha-hidroxiacético (ácido glicólico) y/o ácido \alpha-hidroxipropiónico (ácido láctico)), composiciones bioactivas de vidrio. El ácido \alpha-hidroxipropiónico puede emplearse en su forma d- o l-, o como una mezcla racémica.

En una realización muy preferida, el agente biodegradable es poli(lactida-co-glicolida) (PLGA). Dependiendo de la tasa de liberación deseada del agente bioactivo, la relación molar de los monómeros lactida y glicolida puede ajustarse. En una realización preferida, la relación de monómeros es 50:50. En general, cuanto mayor es el peso molecular, tanto más lenta es la biodegradación. Preferiblemente, el intervalo del peso molecular del polímero es de aproximadamente 5.000 a 500.000 daltons, más preferiblemente 10.000 a 30.000 daltons.

Método de Producción \beta-TCP Poroso

La invención se refiere también a un método de producción de granos de \beta-TCP poroso. El TCP utilizado en la preparación del \beta-TCP poroso se prepara de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. El TCP se cosecha por medio de un secador de pulverización, preferiblemente hasta un tamaño de partícula inferior a 10 \mum. Si el tamaño de partícula es demasiado grande, interferirá con la formación de poros.

El polvo fino de TCP se mezcla luego con un agente formador de poros que se descompone a temperatura elevada en productos de descomposición gaseosos sin dejar residuo sólido alguno. Los agentes formadores de poros de esta invención pueden encontrarse en forma de cuentas o de resina. En una realización, los agentes formadores de poros se seleccionan de material que puede descomponerse térmicamente tal como naftaleno, prepolímeros de poliacrilatos, prepolímeros de polimetacrilatos, poli(metacrilato de metilo), copolímeros de acrilato de metilo y metacrilato de metilo y mezclas de los mismos, poliestireno, polietilenglicol, polvo de celulosa cristalino, celulosa fibrosa, poliuretanos, polietilenos, resinas de nailon y resinas acrílicas. En una realización más preferida, el agente formador de poros se selecciona del grupo constituido por poli(metacrilato de metilo), poliestireno y polietilenglicol. Se prefiere que el agente formador de poros cree un diámetro de tamaño de poro de 20-500 \mum, más preferiblemente 40-190 \mum, y muy preferiblemente 50-125 \mum después de la sinterización.

La proporción y el tamaño de partícula del agente formador de poros influyen en la porosidad y la estructura de los poros. Una cantidad excesiva del agente formador de poros conduce a poros interconectados y una disminución en la densidad del cuerpo de \beta-TCP y por tanto de la robustez mecánica del cuerpo sinterizado. Una diferencia en la cantidad del agente formador de poros puede dar como resultado una estructura porosa insuficientemente desarrollada. La proporción de agente formador de poros es preferiblemente 10-50% en peso, más preferiblemente 30-40% en peso, y muy preferiblemente 37,5% en peso.

Se añade luego una solución de granulación a la mezcla de polvo de TCP y agente formador de poros para producir una masa desmenuzable. Esto mejora el procedimiento del tamizado que sigue. Dependiendo de la viscosidad a alcanzar deseada y las propiedades acuosas del medio de dispersión, el compuesto utilizado para formar la solución de granulación puede seleccionarse del grupo constituido por polivinilpirrolidona, almidón, gelatina, poli(alcohol vinílico), poli(óxido de etileno), hidroxi-etilcelulosa, polivinilbutiral y acetato-butirato de celulosa. Preferiblemente, el compuesto en la solución de granulación se selecciona del grupo constituido por polivinilpirrolidona, almidón y gelatina.

La masa desmenuzable se tamiza luego para seleccionar un intervalo de tamaños de gránulo. El tamaño de los gránulos seleccionado por el proceso de tamizado puede estar comprendido en el intervalo de 250-1700 \mum, más preferiblemente 1000-1700 \mum, y muy preferiblemente 500-1000 \mum. Los gránulos tamizados se secan luego a 90-110ºC, más preferiblemente a 105ºC.

Los gránulos secados se calientan luego a 700-800ºC para eliminar el agente formador de poros. La temperatura se aumenta después a 1000-1200ºC, más preferiblemente 1150ºC, para la sinterización. Los gránulos sinterizados se someten a un proceso de enfriamiento lento para alcanzar el \beta-TCP cristalino puro. En una realización preferida, la temperatura se reduce desde 1150ºC a 39ºC en 6 horas. Después de la sinterización, tienen lugar en la muestra pérdida de peso y contracción. Se forman poros en el TCP y los poros quedan rodeados por el esqueleto de TCP sinterizado. Los gránulos sinterizados se tamizan de nuevo utilizando el mismo calibre de tamiz utilizado previamente y se mezclan con un aglomerante como se ha descrito arriba para formar una composición de masilla moldeable.

Como alternativa, los gránulos de \beta-TCP poroso pueden prepararse por mezcla del polvo de TCP con el agente formador de poros. La mixtura se mezcla hasta alcanzar homogeneidad y se prensa en redondos utilizando una prensa, máquina rotativa de fabricación de tabletas o Chilsonators. Los redondos se calientan luego a 700-800ºC para eliminar el agente formador de poros y se sinterizan a 1000-1100ºC, preferiblemente 1150ºC. Los redondos porosos se fracturan luego en el intervalo de tamaños de partícula apropiado de 250-1700 \mum, más preferiblemente 1000-1700 \mum, y muy preferiblemente 500-1000 \mum. Los gránulos porosos se mezclan luego con un aglomerante para formar una composición de masilla moldeable.

Composición de Masilla Moldeable

El \beta-TCP poroso de esta invención puede combinarse con un aglomerante biocompatible para formar una composición de masilla moldeable. La masilla moldeable puede encontrarse en la forma de una pasta o un semisólido que tenga viscosidad suficiente. La composición de masilla moldeable permite el posicionamiento y la conformación dentro de los huecos, defectos u otras áreas en las cuales se desea el crecimiento de hueso nuevo. La cohesividad de la masilla evita también los problemas de migración de las partículas asociados con los materiales de injerto para aplicaciones ortopédicas, maxilofaciales y dentales.

El aglomerante de acuerdo con esta invención debe ser biodegradable, biocompatible y tener propiedades de flujo fluidas. Los aglomerantes considerados como útiles en esta invención incluyen, pero sin carácter limitante: agentes de suspensión reconocidos en la técnica, agentes productores de viscosidad, agentes formadores de gel y agentes emulsionantes. Otros candidatos son agentes utilizados para suspender ingredientes para administración tópica, oral o parental. Sin embargo, otros candidatos son agentes útiles como aglomerantes de tabletas, desintegrantes o estabilizadores de emulsión. Otros candidatos adicionales son agentes utilizados en cosmética, productos de tocador y productos alimenticios. Manuales de referencia tales como la USP XXII -NF XVII (The Nineteen Ninety U.S. Pharmacopeia and the National Formulary (1990)) clasifican y describen tales agentes. Aglomerantes preferidos incluyen macromoléculas reabsorbibles de fuentes biológicas o sintéticas, con inclusión de alginato de sodio, ácido hialurónico, derivados de celulosa tales como alquilcelulosas con inclusión de metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa sódica, carboxi-metilcelulosa cálcica u otras sales, hidroxi-alquilcelulosas con inclusión de hidroxipropil-metilcelulosa, hidroxibutil-metilcelulosa, hidroxietil-metilcelulosa, hidroxietil-celulosa, alquilhidroxialquil-celulosas con inclusión de metilhidroxietil-celulosa, colágeno, péptidos, mucina, sulfato de condroitina y análogos.

La carboximetilcelulosa (CMC) sódica es un aglomerante preferido. La CMC está disponible comercialmente de suministradores tales como, pero sin carácter limitante: Hercules Inc., Aqualon® Division, Delaware; FMC Corporation, Pennsylvania; British Celanese, Ltd., Reino Unido; y Henkel KGaA, Reino Unido. La carboximetilcelulosa sódica es la sal de sodio de un policarboximetil-éter de celulosa con un peso molecular típico que oscila entre 90.000 y 700.000. Están disponibles comercialmente diversos grados de carboximetilcelulosa sódica, que tienen diferentes viscosidades. Las viscosidades de diversos grados de carboximetilcelulosa sódica se consignan en Handbook of Pharmaceutical Excipients (2ª edición), American Pharmaceutical Association & Royal Pharmaceutical Society of Great Britain. Por ejemplo, baja viscosidad de 50-200 cP, viscosidad media de 400-800 cP, y alta viscosidad de 1500-3000 cP. Están disponibles comercialmente diversos grados de carboximetilcelulosa sódica, teniendo el grado utilizado más frecuentemente un grado de sustitución (DS) de 0,7. El DS se define como el número medio de grupos hidroxilo sustituidos por unidad de anhidroglucosa. Es este DS el que determina la solubilidad en agua del polímero. El grado de sustitución y la viscosidad estándar de una solución acuosa de concentración determinada se indican en cualquier etiqueta de carboximetilcelulosa sódica. Actualmente se prefiere la CMC de baja viscosidad (Aqualon® Division, Hercules, Inc., Wilmington, DE). Los grados de sustitución preferidos actualmente oscilan entre 0,65 y 0,90 (DS = 0,7, Aqualon® Type 7L).

Además de aglomerantes que son capaces de fluir a la temperatura ambiente, los aglomerantes incluyen también reactivos tales como gelatina, que se disuelven en soluciones acuosas templadas o calientes, y se transforman en un gel que ya no fluye al enfriarse. La composición de gelatina se formula de tal manera que la composición es capaz de fluir a temperaturas superiores a la temperatura del cuerpo del mamífero para implante, pero que se transforma en un gel relativamente no fluido a o ligeramente por encima de dicha temperatura corporal.

En una realización, el aglomerante de esta invención se selecciona de una clase de hidrogeles de peso molecular alto que incluyen hialuronato de sodio (\sim 500-3000 kD), quitosano (\sim 100-300 kD), poloxámero (\sim 7-18 kD), y glucosaminoglucano (\sim 2000-3000 kD). En una realización preferida, el glucosaminoglucano es N,O-carboximetil-quitosan-glucosamina. Los hidrogeles son polímeros hidrófilos reticulados de forma de un gel que tienen un retículo tridimensional. Las matrices de hidrogel pueden llevar una carga positiva neta o negativa neta, o pueden ser neutras. Una matriz típica con carga negativa neta es alginato. Los hidrogeles que llevan una carga positiva neta pueden tipificarse por componentes de la matriz extracelular tales como colágeno y laminina. Ejemplos de componentes de la matriz extracelular disponibles comercialmente incluyen Matrigel^{TM} (medio de Eagle modificado por Dulbecco con 50 \mug/ml de gentamicina) y Vitrogen^{TM} (una solución estéril de colágeno dérmico de bovino purificado y solubilizado con pepsina, disuelto en HCl 0,012 N). Un ejemplo de un hidrogel neutro neto es poli(óxido de etileno) altamente reticulado, o poli(alcohol vinílico).

En otra realización, el aglomerante de esta invención puede seleccionarse también de una clase de polímeros seleccionada del grupo que comprende ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, ácido polihidroxibutírico, ácido polimálico, ácido poliglutámico, y polilactona. Con objeto de disponer de una sustitución gradual de polímero en el material por crecimiento interno de tejido en situ a lo largo de un periodo de varios días a varias semanas, el peso molecular del polímero debería ser compatible con la tasa de degradación requerida del polímero.

En otra realización preferida, el aglomerante es polietilenglicol. Una mezcla de polietilen-glicoles de peso molecular bajo y alto puede producir una pasta con la viscosidad apropiada. Por ejemplo, podría ser eficaz una mezcla de polietilenglicoles de peso molecular 400-600 daltons y 1500 daltons en la proporción adecuada.

En otra realización adicional, el aglomerante se selecciona de una clase de polisacáridos con un peso molecular medio de aproximadamente 200.000 a 5.000.000 daltons constituida por dextrano, sulfato de dextrano, dietilaminoetil-dextrano, fosfato de dextrano o mezclas de los mismos. Los polisacáridos de peso molecular inferior tienen la ventaja de una tasa de absorción de dextrano más rápida, dando como resultado una exposición más temprana del material poroso de \beta-TCP. Si se desea que los dextranos se mantengan en el sitio durante un periodo prolongado, pueden utilizarse dextranos de peso molecular relativamente alto. Otros polisacáricos preferidos incluyen almidón, almidón fraccionado, amilopectina, agar, goma arábiga, pululano, agarosa, carragenano, dextrinas, fructanos, inulina, mananos, xilanos, arabinanos, glucógenos, glucanos, goma de xantano, goma guar, goma de algarrobilla, goma tragacanto, goma karaya, y derivados y mezclas de los mismos.

En otra realización preferida, el aglomerante se selecciona del grupo constituido por manitol, petrolatum blanco, combinaciones manitol/dextrano, combinaciones manitol/petrolatum blanco, aceite de sésamo, cola de fibrina y mezclas de los mismos. La cola de fibrina es actualmente un aglomerante preferido, que comprende una mezcla de fibrinógeno y trombina de mamífero. El fibrinógeno humano está disponible comercialmente en productos tales como, pero sin carácter limitante, Tissucol® (Immuno AG, Viena, Austria), Beriplast® (Behringwerke, Marburg, Alemania), Biocoll® (Centre de Transfusion Sanguine de Lille, Pours, Francia) y Transglutine® (CNTS Fractionation Centre, Estrasburgo, Francia). La cola de fibrina puede estar constituida también por fibrinógeno y trombina de otras fuentes de mamífero, tales como, por ejemplo, fuentes de bovino y murino.

Se prefiere que el aglomerante se seleccione del grupo constituido por alginato de sodio, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, gelatina, colágeno, péptidos, mucina, sulfato de condroitina, quitosano, poloxámero, glucosaminoglucano, polisacárido, polietilenglicol, metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa sódica, carboxi-metilcelulosa cálcica, hidroxipropil-metilcelulosa, hidroxibutil-metilcelulosa, hidroxietil-metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietil-celulosa, hidroxietil-celulosa, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, ácido polihidributírico, ácido polimálico, ácido poliglutámico, polilactona, manitol, petrolatum blanco, combinaciones manitol/dextrano, combinaciones manitol/petrolatum blanco, aceite de sésamo, cola de fibrina y mezclas de los mismos.

Más preferiblemente, el aglomerante se selecciona del grupo constituido por alginato de sodio, ácido hialurónico, metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa sódica, carboxi-metilcelulosa cálcica, hidroxipropil-metilcelulosa, hidroxibutil-metilcelulosa, hidroxietil-metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietil-celulosa, hidroxietil-celulosa y mezclas de los mismos. Muy preferiblemente, el aglomerante se selecciona del grupo constituido por alginato de sodio, ácido hialurónico, carboxi-metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa sódica y carboxi-metilcelulosa cálcica.

La cantidad mínima de aglomerante es la cantidad necesaria para conseguir una conformabilidad fácil y proporcionar cohesión suficiente entre las partículas y retención de la forma durante el periodo de crecimiento interno del tejido. En una realización, la relación en peso de \beta-TCP poroso a carboximetilcelulosa sódica está comprendida en el intervalo de 1:0,1 a 1:1,25. En una realización preferida, la relación de \beta-TCP poroso a CMC sódica es
1:0,4.

La invención se refiere también a un kit para implante óseo que comprende el material de \beta-TCP poroso de la invención y al menos un agente bioactivo adicional seleccionado del grupo constituido por proteínas morfogénicas óseas y antibióticos. El kit que comprende el material de \beta-TCP poroso y una proteína morfogénica ósea puede comprender adicionalmente un factor estimulante de proteína morfogénica. En una realización, el kit comprende además un aglomerante. En otra realización, el kit comprende el material de \beta-TCP poroso de la invención y un aglomerante.

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Familia de Proteínas Óseas Morfogénicas

La familia BMP, así denominada por sus miembros representativos de la familia de proteínas morfogénicas óseas/
osteogénicas, pertenece a la superfamilia de proteínas TGF-\beta. De las "BMP" consignadas (BMP-1 a BMP-18), aisladas fundamentalmente sobre la base de la homología de secuencia, todas excepto BMP-1 siguen clasificadas como miembros de la familia BMP de proteínas morfogénicas (Ozkaynak et al., EMBO J., 9, pp. 2085-93 (1990)).

La familia BMP incluye otros miembros estructuralmente afines que son proteínas morfogénicas, con inclusión de los productos del complejo de genes decapentaplégicos (DPP) de Drosophila, el producto Vg1 de Xenopus laevis y su homólogo murino, Vgr-1 (véase, v.g., Massagué, Annu. Rev. Cell Biol., 6, pp. 597-641 (1990).

Los dominios C-terminales de BMP-3, BMP-5, BMP-6, y OP-1 (BMP-7) son idénticos aproximadamente en un 60% al de BMP-2, y los dominios C-terminales de BMP-6 y OP-1 son idénticos en un 87%. BMP-6 es verosímilmente el homólogo humano del Vgr-1 murino (Lyons, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, pp. 4554-59 (1989)); las dos proteínas son idénticas en un 92% globalmente al nivel de secuencia de aminoácidos (Patente de EE.UU. No. 5.459.047. BMP-6 es idéntica en un 58% al producto Vg-1 de Xenopus.

Propiedades Bioquímicas Estructurales y Funcionales de las Proteínas Óseas Morfogénicas

Los morfogenes de hueso existentes naturalmente comparten homología sustancial de secuencia de aminoácidos en sus regiones (dominios) C-terminales. Típicamente, las proteínas osteogénicas existentes naturalmente arriba mencionadas se traducen como un precursor, teniendo una secuencia de péptido señal N-terminal típicamente menor que aproximadamente 30 residuos, seguida por un dominio "pro" que se escinde para producir el dominio C-terminal maduro de aproximadamente 100-140 aminoácidos. El péptido señal se escinde rápidamente por traducción, en un sitio de escisión que puede predecirse en una secuencia dada utilizando el método de Von Heijne Nucleic Acids Research, 14, pp. 4683-4691 (1986). El dominio pro es por regla general aproximadamente tres veces mayor que el dominio C-terminal maduro totalmente procesado.

Otra característica de los miembros de la familia de proteínas BMP es su capacidad aparente para dimerizarse. Varias proteínas osteogéncias derivadas de hueso (OP) y BMP se encuentran como homo- y heterodímeros en sus formas activas. La capacidad de las OP y BMP para formar heterodímeros puede conferir capacidades inductivas morfogénicas adicionales o alteradas a las proteínas morfogénicas. Los heterodímeros pueden exhibir afinidades de fijación cualitativa o cuantitativamente diferentes que los homodímeros para las moléculas receptoras OP y BMP. Afinidades de fijación alteradas pueden conducir a su vez a activación diferencial de receptores que median caminos de señalización diferentes, los cuales pueden conducir finalmente a actividades o consecuencias biológicas diferentes. Podrían manifestarse también afinidades de fijación alteradas de una manera específica de tipo de tejido o célula, induciendo con ello sólo a tipos particulares de células progenitoras a sufrir proliferación y/o diferenciación.

En realizaciones preferidas, el par de polipéptidos morfogénicos tienen secuencias de aminoácidos que comprenden cada una una secuencia que comparte una relación definida con una secuencia de aminoácidos de un morfogén de referencia. En este contexto, los polipéptidos osteogénicos preferidos comparten una relación definida con una secuencia presente en la OP-1 humana osteogénicamente activa, SEQ ID NO: 1. Sin embargo, una cualquiera o más de las secuencias existentes naturalmente o biosintéticas descritas en esta memoria podría utilizarse análogamente como secuencia de referencia. Los polipéptidos osteogénicos preferidos comparten una relación definida con al menos el dominio C-terminal de seis cisteínas de la OP-1 humana, los residuos 335-431 de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, los polipéptidos osteogénicos comparten una relación definida con al menos el dominio C-terminal de siete cisteínas de OP-1 humana, residuos 330-431 de SEQ ID NO: 1. Es decir, los polipéptidos preferidos en una proteína dímera con actividad morfogénica ósea comprenden cada uno una secuencia que corresponde a una secuencia de referencia o es funcionalmente equivalente a la misma.

Secuencias funcionalmente equivalentes incluyen configuraciones funcionalmente equivalentes de residuos cisteína dispuestas dentro de la secuencia de referencia, que incluyen inserciones o deleciones de aminoácidos que alteran la configuración lineal de estas cisteínas, pero no deterioran materialmente su relación en la estructura plegada de la proteína dímera del morfogén, con inclusión de su capacidad para formar tales enlaces disulfuro intra- o intercatenarios que puedan ser necesarios para la actividad morfogénica. Secuencias funcionalmente equivalentes incluyen además aquéllas en las cuales uno o más residuos de aminoácido difieren del residuo correspondiente de una secuencia de referencia, v.g., el dominio C-terminal de siete cisteínas (al que se hace referencia también en esta memoria como el esqueleto conservado de siete cisteínas) de OP-1 humana, con tal que esta diferencia no destruya la actividad morfogénica ósea. De acuerdo con ello, se prefieren sustituciones conservadoras de aminoácidos correspondientes en la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácido que son sustituciones conservadoras de residuos correspondientes en una secuencia de referencia son aquéllos que son física o funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes, v.g., que tienen tamaño, forma, carga eléctrica y propiedades químicas similares, con inclusión de la capacidad para formar enlaces covalentes o enlaces de hidrógeno, o análogos. Sustituciones conservadoras particularmente preferidas son aquéllas que satisfacen los criterios definidos para una mutación puntual aceptada en Dayhoff et al., supra, cuyas doctrinas se incorporan por referencia en esta memoria.

Sustituciones conservadoras incluyen típicamente la sustitución de un aminoácido por otro con características similares, v.g., sustituciones dentro de los grupos siguientes: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. El término "variación conservadora" incluye también el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido afín no sustituido, tal que los anticuerpos generados para el polipéptido sustituido inmunorreaccionen también con el polipéptido no sustituido.

La proteína osteogénica OP-1 ha sido descrita (véase, v.g., Oppermann et al., Patente de EE.UU. No. 5.354.557). La proteína osteogénica de fuentes naturales en su forma madura nativa es un dímero glicosilado que tiene típicamente un peso molecular aparente de aproximadamente 30-36 kDa como se determina por SDS-PAGE. Cuando se reduce, la proteína de 30 kDa da lugar a dos subunidades de péptidos glicosilados que tienen pesos moleculares aparentes de aproximadamente 16 kDa y 18 kDa. En el estado reducido, la proteína no tiene actividad osteogénica detectable alguna. La proteína no glicosilada, que tiene también actividad osteogénica, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 27 kDa. Cuando se reduce, la proteína de 27 kDa da lugar a dos polipéptidos no glicosilados, que tienen pesos moleculares de aproximadamente 14 kDa a 16 kDa, capaces de inducir formación de hueso endocondral en un mamífero. Las proteínas osteogénicas pueden incluir formas que tienen patrones de glicosilación variables, términos N variables, y formas activas truncadas o mutadas de proteína nativa. Como se ha descrito arriba, secuencias particularmente útiles incluyen aquéllas que comprenden las secuencias C-terminales de 96 ó 102 aminoácidos de DPP (de Drosophila), Vg1 (de Xenopus), Vgr-1 (de ratón), las proteínas OP-1 y OP-2 (véase la Patente de EE.UU. No. 5.011.691 y Oppermann et al.), así como las proteínas a las que se hace referencia como BMP-2, BMP-3, BMP-4 (véase WO 88/00205, Patente de EE.UU. No. 5.013.649 y WO 91/18098), BMP-5 y BMP-6 (véase WO 90/11366, PCT/US90/01630), BMP-8 y BMP-9.

Las proteínas morfogénicas y osteogénicas preferidas de esta invención comprenden al menos un polipéptido seleccionado del grupo constituido por OP-1 (BMP-7), OP-2, OP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16, BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, MP121, dorsalin-1, DPP, Vg-1, Vgr-1, proteína 60A, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL, TGF-\beta y variantes de secuencia de aminoácidos y homólogos de las mismas, con inclusión de homólogos de especie de las mismas. Preferiblemente, la proteína morfogénica comprende al menos un polipéptido seleccionado del grupo constituido por OP-1 (BMP-7), BMP-2, BMP-4, BMP-5 y BMP-6; más preferiblemente, OP-1 (BMP-7) y BMP-2; y muy preferiblemente, OP-1 (BMP-7).

Publicaciones que describen estas secuencias, así como sus propiedades químicas y físicas, incluyen: OP-1 y OP-2 (Patente de EE.UU. No. 5.011.691; Patente de EE.UU. No. 5.266.683; Ozkaynak et al., EMBO J., 9, pp. 2085-2093 (1990); OP-3 (W094/10203 (PCT US93/10520)), BMP-2, BMP-3, BMP-4, (W088/00205; Wozney et al. Science, 242, pp. 1528- 1534 (1988)), BMP-5 y BMP-6, (Celeste et al., PNAS, 87, 9843-9847 (1991)), Vgr-1 (Lyons et al., PNAS, 86, pp. 4554-4558 (1989)); DPP (Padgett et al. Nature, 325, pp. 81-84 (1987)); Vg-1 (Weeks, Cell, 51, pp. 861-867 (1987)); BMP-9 (W095/33830 (PCT/US95/07084); BMP-10 (W094/26893 (PCT/US94/05290); BMP-11 (W094/26892 (PCT/US94/05288); BMP-12 (W095/16035 (PCT/US94/14030); BMP-13 (W095/16035 (PCT/US94/
14030); GDF-1 (W092/00382 (PCT/US91/04096) y Lee et al. PNAS, 88, pp. 4250-4254 (1991); GDF-8 (W094/21681 (PCT/US94/03019); GDF-9 (W094/15966 (PCT/US94/00685); GDF-10 (W095/10539 (PCT/US94/11440); GDF-11 (W096/01845 (PCT/US95/08543); BMP-15 (W096/36710 (PCT/US96/06540); MP-121 (W096/01316 (PCT/EP95/
02552); GDF-5 (CDMP-1, MP52) (W094/15949 (PCT/US94/00657) y W096/14335 (PCT/US94/12814) y W093/
16099 (PCT/EP93/00350)); GDF-6 (CDMP-2, BMP13) (W095/01801 (PCT/US94/07762) y W096/14335 y W095/
10635 (PCT/US94/14030)); GDF-7 (CDMP-3, BMP12) (W095/10802 (PCT/US94/07799) y W095/10635 (PCT/
US94/14030)). En otra realización, proteínas útiles incluyen constructos biosintéticos biológicamente activos, con inclusión de nuevas proteínas morfogénicas biosintéticas y proteínas quiméricas diseñadas utilizando secuencias de dos o más morfogenes conocidos.

En otra realización de esta invención, una proteína morfogénica puede prepararse por síntesis para uso en asociación con una MPSF a fin de inducir formación de tejido. Las proteínas morfogénicas preparadas por síntesis pueden ser nativas, o pueden ser proteínas no nativas, es decir, aquéllas que no se encuentran de otro modo en la
naturaleza.

Se han sintetizado proteínas osteogénicas no nativas utilizando una serie de secuencias de DNA de consenso (patente U.S: No. 5.324.819). Estas secuencias de consenso se diseñaron sobre la base de datos parciales de secuencias de aminoácidos obtenidos de productos osteogénicos naturales y de sus homologías observadas con otros genes consignados en la bibliografía que tienen una función de desarrollo supuesta o demostrada.

Varias de las secuencias biosintéticas de consenso (denominadas proteínas osteogénicas de consenso o "COP") han sido expresadas como proteínas de fusión en procariotas. Las proteínas de fusión purificadas pueden escindirse, replegarse, combinarse con al menos un MPSF (opcionalmente en una matriz o dispositivo), implantarse en un modelo animal establecido, y se ha demostrado que poseen actividad inductora de hueso y/o cartílago. Las proteínas osteogénicas sintéticas preferidas actualmente comprenden dos secuencias de aminoácidos sintéticas designadas COP-5 (SEQ ID NO: 2) y COP-7 (SEQ ID NO: 3).

Oppermann et al., patentes U.S. núms. 5.011.691 y 5.324.819, describen las secuencias de aminoácidos de COP-5 y COP-7 como se muestra a continuación:

1

En estas secuencias de aminoácidos, los guiones (-) se utilizan únicamente como relleno para alinear secuencias comparables en proteínas afines. Las diferencias entre las secuencias de aminoácidos alineadas están resalta-
das.

Las secuencias de DNA y aminoácidos de estos y otros miembros de la familia BMP se han publicado y pueden ser utilizadas por los expertos en la técnica a fin de determinar si una proteína recién identificada pertenece a la familia BMP. Por analogía, se espera que los nuevos productos génicos afines a BMP posean al menos una actividad morfogénica y se clasifican por tanto como una BMP.

En una realización preferida de esta invención, la proteína morfogénica comprende un par de subunidades disulfuro unidas para producir una especie dímera, en donde al menos una de las subunidades comprende un péptido recombinante perteneciente a la familia de proteínas BMP. En otra realización preferida de esta invención, la proteína morfogénica comprende un par de subunidades que producen una especie dímera formada por interacciones no covalentes, en donde al menos una de las subunidades comprende un péptido recombinante perteneciente a la familia de proteínas BMP. Las interacciones no covalentes incluyen interacciones de Van der Waals, puentes de hidrógeno, e interacciones hidrófobas y electrostáticas. La especie dímera puede ser un homodímero o heterodímero y es capaz de inducir proliferación celular y/o formación de tejido.

En ciertas realizaciones preferidas, las proteínas morfogénicas óseas útiles en esta invención incluyen aquéllas en las cuales las secuencias de aminoácidos comprenden una secuencia que comparte al menos 70% de homología o "semejanza" de secuencia de aminoácidos, y preferentemente homología o semejanza de 80%, con una proteína morfogénica de referencia seleccionada de las proteínas anteriores existentes naturalmente. Preferiblemente, la proteína de referencia es OP-1 humana, y la secuencia de referencia de la misma es el dominio C-terminal de 7 cisteínas presente en formas osteogénicamente activas de OP-1 humana, residuos 330-431 de SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, un polipéptido que se sospecha es funcionalmente equivalente a un polipéptido de morfogén de referencia se alinea con el mismo utilizando el método de Needleman, et al., supra, implementado convenientemente por programas de ordenador tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). Como se ha indicado arriba, las lagunas internas e inserciones de aminoácidos en la secuencia candidato se ignoran para los propósitos de calcular la relación definida, expresada convencionalmente como un nivel de homología o identidad de secuencia de aminoácidos, entre las secuencias candidato y de referencia. "Homología de secuencia de aminoácidos" debe entenderse en esta memoria que incluye tanto identidad como semejanza de secuencia de aminoácidos. Las secuencias homólogas comparten residuos de aminoácidos idénticos y/o similares, en donde los residuos similares son sustituciones conservadoras para, o "mutaciones puntuales toleradas" de, residuos correspondientes de aminoácidos en una secuencia de referencia alineada. Así, una secuencia de polipéptido candidato que comparte 70% de homología de aminoácidos con una secuencia de referencia es una en la cual cualquier 70% de los residuos alineados son idénticos a, o son sustituciones conservadoras de, los residuos correspondientes en una secuencia de referencia. En una realización actualmente preferida, la secuencia de referencia es OP-1. Proteínas morfogénicas óseas útiles en esta invención incluyen de acuerdo con ello equivalentes filogenéticos alélicos y otras variantes de la secuencia de referencia preferida, sea existente naturalmente o producida por biosíntesis (v.g., con inclusión de "muteínas" o "proteínas mutantes"), así como nuevos miembros de la familia morfogénica general de proteínas, con inclusión de los indicados e identificados anteriormente. Ciertos polipéptidos morfogénicos particularmente preferidos comparten al menos 60% de identidad de aminoácidos con la secuencia de referencia preferida de OP-1 humana, y todavía más preferiblemente al menos 65% de identidad de aminoácidos con la misma.

En otra realización, proteínas osteogénicas útiles incluyen aquéllas que comparten el dominio de 7 cisteínas conservado y que comparten al menos 70% de homología (semejanza) de secuencia de aminoácidos dentro del dominio activo C-terminal, como se define en esta memoria. En otra realización adicional, las proteínas osteogénicas de la invención pueden definirse como proteínas osteogénicamente activas que tienen una cualquiera de las secuencias genéricas definidas en esta memoria, con inclusión de OPX (SEQ ID NO: 4) y las Secuencias Genéricas 7 (SEQ ID NO: 5) y 8 (SEQ ID NO: 6), o Secuencias Genéricas 9 (SEQ ID NO: 7) y 10 (SEQ ID NO:
8).

La familia de polipéptidos morfogénicos óseos útiles en la presente invención, y miembros de la misma, pueden definirse por una secuencia de aminoácidos genérica. Por ejemplo, la Secuencia Genérica 7 (SEQ ID NO: 5) y la Secuencia Genérica 8 (SEQ ID NO: 6) son secuencias de 97 y 102 aminoácidos, respectivamente, y acomodan las homolo-gías compartidas entre miembros preferidos de la familia de proteínas identificados hasta la fecha, que incluyen al menos OP-1, OP-2, OP-3, CBMP-2A, CBMP-2b, BMP-3, 60A, DPP, Vg1, BMP-5, BMP-6, Vgr-1, y GDF-1. Las secuencias de aminoácidos para estas proteínas se describen en esta memoria y/o en la técnica, como se ha resumido anteriormente. Las secuencias genéricas incluyen tanto la identidad de aminoácidos compartida por estas secuencias en el dominio C-terminal, definido por los esqueletos de 6 y 7 cisteínas (Secuencias Genéricas 7 y 8, respectivamente), así como residuos alternativos para las posiciones variables dentro de la secuencia. Las secuencias genéricas proporcionan un esqueleto de cisteína apropiado donde pueden formarse enlaces disulfuro inter- o intramoleculares, y contienen ciertos aminoácidos críticos que influyen probablemente en la estructura terciaria de las proteínas plegadas. Adicionalmente, las secuencias genéricas toleran una cisteína adicional en la posición 36 (Secuencia Genérica 7) o la posición 41 (Secuencia Genérica 8), abarcando por tanto las secuencias morfogénicamente activas de OP-2 y
OP-3.

Secuencia Genérica 7

2

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en donde cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados definidos como sigue: "res. " significa "residuo" y Xaa en res.2 = (Tyr o Lys); Xaa en res.3 = Val o Ile); Xaa en res.4 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res.6 = (Arg, Gln, Ser, Lys o Ala); Xaa en res.7 = (Asp o Glu); Xaa en res.8 = (Leu, Val o Ile); Xaa en res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn o Ser); Xaa en res.12 = (Asp, Arg, Asn o Glu); Xaa en res. 13 = (Trp o Ser); Xaa en res.14 = (Ile o Val); Xaa en res.15 = (Ile o Val); Xaa en res.16 (Ala o Ser); Xaa en res.18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res.19 = (Gly o Ser); Xaa en res.20 = (Tyr o Phe); Xaa en res. 21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu o Gly); Xaa en res.23 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res.26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln, Ala o Ser); Xaa en res.28 = (Glu, Lys, Asp, Gln o Ala); Xaa en res.30 = (Ala, Ser, Pro, Gln, Ile o Asn); Xaa en res.31 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res.33 = (Leu, Val o Met); Xaa en res.34 = (Asn, Asp, Ala, Thr o Pro); Xaa en res.35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala o Lys); Xaa en res.36 = (Tyr, Cys, His, Ser o Ile); Xaa en res. 37 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res.38 = (Asn, Ser o Lys); Xaa en res.39 (Ala, Ser, Gly o Pro); Xaa en res.40 = (Thr, Leu o Ser); Xaa en res.44 = (Ile, Val o Thr); Xaa en res.45 = (Val, Leu, Met o Ile); Xaa en res.46 = (Gln o Arg); Xaa en res.47 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res.48 = (Leu o Ile); Xaa en res.49 = (Val o Met); Xaa en res.50 = (His, Asn o Arg); Xaa en res.51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res.52 = (Ile, Met, Asn, Ala, Val, Gly o Leu); Xaa en res.53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly o Phe); Xaa en res.54 = (Pro, Ser o Val); Xaa en res.55 (Glu, Asp, Asn, Gly, Val, Pro o Lys); Xaa en res.56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Gly, Ile o His); Xaa en res.57 = (Val, Ala o Ile); Xaa en res.58 = (Pro o Asp); Xaa en res.59 = (Lys, Leu o Glu); Xaa en res. 60 = (Pro, Val o Ala); Xaa en res.63 = (Ala o Val); Xaa en res.65 = (Thr, Ala o Glu); Xaa en res.66 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res.67 = (Leu, Met o Val); Xaa en res.68 = (Asn, Ser, Asp o Gly); Xaa en res.69 =(Ala, Pro o Ser); Xaa en res.70 (Ile, Thr, Val o Leu); Xaa en res.71 = (Ser, Ala o Pro); Xaa en res.72 = (Val, Leu, Met o Ile); Xaa en res.74 = (Tyr o Phe); Xaa en res.75 = (Phe, Tyr, Leu o His); Xaa en res.76 = (Asp, Asn o Leu); Xaa en res.77 = (Asp, Glu, Asn, Arg o Ser); Xaa en res.78 = (Ser, Gln, Asn, Tyr o Asp); Xaa en res.79 = (Ser, Asn, Asp, Glu o Lys); Xaa en res.80 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res.82 = (Ile, Val o Asn); Xaa en res.84 = (Lys o Arg); Xaa en res.85 = (Lys, Asn, Gln, His, Arg o Val); Xaa en res.86 = (Tyr, Glu o His); Xaa en res.87 = (Arg, Gln, Glu o Pro); Xaa en res.88 = (Asn, Glu, Trp o Asp); Xaa en res. 90 = (Val, Thr, Ala o Ile); Xaa en res.92 = (Arg, Lys, Val, Asp, Gln o Glu); Xaa en res.93 = (Ala, Gly, Glu o Ser); Xaa en res.95 = (Gly o Ala) y Xaa en res.97 = (His o Arg).

La Secuencia Genérica 8 (SEQ ID NO: 6) incluye la totalidad de la Secuencia Genérica 7 e incluye adicionalmente la secuencia siguiente (SEQ ID NO: 9) en su término N:

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3

De acuerdo con ello, comenzando con el residuo 7, cada "Xaa" en la Secuencia Genérica 8 es un aminoácido especificado definido como para la Secuencia Genérica 7, con la distinción de que cada número de residuo descrito para la Secuencia Genérica 7 está desplazado 5 posiciones en la Secuencia Genérica 8. Así, "Xaa en res. 2 = (Tyr o Lys)" en la Secuencia Genérica 7 se refiere a Xaa en res. 7 en la Secuencia Genérica 8. En la Secuencia Genérica 8, Xaa en res. 2 = (Lys, Arg, Ala o Gln); Xaa en res. 3 = (Lys, Arg o Met); Xaa en res. 4 = (His, Arg o Gln); y Xaa en res. 5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr, o Tyr).

En otra realización, las proteínas osteogénicas útiles incluyen las definidas por las Secuencias Genéricas 9 y 10, definidas como sigue.

Específicamente, las Secuencias Genéricas 9 y 10 son secuencias compuestas de aminoácidos de las proteínas siguientes: OP-1 humana, OP-2 humana, OP-3 humana, BMP-2 humana, BMP-3 humana, BMP-4 humana, BMP-5 humana, BMP-6 humana, BMP-8 humana, BMP-9 humana, BMP 10 humana, BMP-11 humana, Drosophila 60A, Xenopus Vg-1, erizo de mar UNIVIN, CDMP-1 humana (GDF-5 de ratón), CDMP-2 humana (GDF-6 de ratón, BMP-13 humana), CDMP-3 humana (GDF-7 de ratón, BMP-12 humana), GDF-3 de ratón, GDF-1 humana, GDF-1 de ratón, DORSALIN de pollo, dpp, SCREW de Drosophila, NODAL de ratón, GDF-8 de ratón, GDF-8 humana, GDF-9 de ratón, GDF-10 de ratón, GDF-11 humana, GDF-11 de ratón, BMP-15 humana, y BMP3b de rata. Al igual que la Secuencia Genérica 7, la Secuencia Genérica 9 es una secuencia de 97 aminoácidos que acomoda el esqueleto C-terminal de 6 cisteínas y, al igual que la Secuencia Genérica 8, la Secuencia Genérica 10 es una secuencia de 102 aminoácidos que acomoda el esqueleto de 7 cisteínas.

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Secuencia Genérica 9

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4

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en donde cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados definidos como sigue: "res. " significa "residuo" y Xaa en res. 1 = (Phe, Leu o Glu); Xaa en res. 2 = (Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gln, Val o Glu); Xaa en res. 3 = (Val, Ile, Leu o Asp); Xaa en res. 4 = (Ser, Asp, Glu, Asn o Phe); Xaa en res. 5 = (Phe o Glu); Xaa en res. 6 = (Arg, Gln, Lys, Ser, Glu, Ala o Asn); Xaa en res. 7 = (Asp, Glu, Leu, Ala o Gln); Xaa en res. 8 = (Leu, Val, Met, Ile o Phe); Xaa en res. 9 = (Gly, His o Lys); Xaa en res. 10 = (Trp o Met); Xaa en res. 11 = (Gln, Leu, His, Glu, Asn, Asp, Ser o Gly); Xaa en res. 12 = (Asp, Asn, Ser, Lys, Arg, Glu o His); Xaa en res. 13 = (Trp o Ser); Xaa en res. 14 = (Ile o Val); Xaa en res. 15 = (Ile o Val); Xaa en res. 16 = (Ala, Ser, Tyr o Trp); Xaa en res. 18 = (Glu, Lys, Gln, Met, Pro, Leu, Arg, His o Lys); Xaa en res. 19 = (Gly, Glu, Asp, Lys, Ser, Gln, Arg o Phe); Xaa en res. 20 = (Tyr o Phe); Xaa en res. 21 = (Ala, Ser, Gly, Met, Gln, His, Glu, Asp, Leu, Asn, Lys o Thr); Xaa en res. 22 = (Ala o Pro); Xaa en res. 23 = (Tyr, Phe, Asn, Ala o Arg); Xaa en res. 24 = (Tyr, His, Glu, Phe o Arg); Xaa en res. 26 = (Glu, Asp, Ala, Ser, Tyr, His, Lys, Arg, Gln o Gly); Xaa en res. 28 = (Glu, Asp, Leu, Val, Lys, Gly, Thr, Ala o Gln); Xaa en res. 30 = (Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Glu, Asp, Phe, Gln o Leu); Xaa en res. 31= (Phe, Tyr, Leu, Asn, Gly o Arg); Xaa en res. 32 = (Pro, Ser, Ala o Val); Xaa en res. 33 = (Leu, Met, Glu, Phe o Val); Xaa en res. 34 = (Asn, Asp, Thr, Gly, Ala, Arg, Leu o Pro); Xaa en res. 35 = (Ser, Ala, Glu, Asp, Thr, Leu, Lys, Gln o His); Xaa en res. 36 = (Tyr, His, Cys, Ile, Arg, Asp, Asn, Lys, Ser, Glu o Gly); Xaa en res. 37 = (Met, Leu, Phe, Val, Gly o Tyr); Xaa en res. 38 = (Asn, Glu, Thr, Pro, Lys, His, Gly, Met, Val o Arg); Xaa en res. 39 = (Ala, Ser, Gly, Pro o Phe); Xaa en res. 40 = (Thr, Ser, Leu, Pro, His o Met); Xaa en res. 41 = (Asn, Lys, Val, Thr o Gln); Xaa en res. 42 = (His, Tyr o Lys); Xaa en res. 43 = (Ala, Thr, Leu o Tyr); Xaa en res. 44 = (Ile, Thr, Val, Phe, Tyr, Met o Pro); Xaa en res. 45 = (Val, Leu, Met, Ile o His); Xaa en res. 46 = (Gln, Arg o Thr); Xaa en res. 47 = (Thr, Ser, Ala, Asn o His); Xaa en res. 48 = (Leu, Asn o Ile); Xaa en res. 49 = (Val, Met, Leu, Pro o Ile); Xaa en res. 50 = (His, Asn, Arg, Lys, Tyr o Gln); Xaa en res. 51 = (Phe, Leu, Ser, Asn, Met, Ala, Arg, Glu, Gly o Gln); Xaa en res. 52 = (Ile, Met, Leu, Val, Lys, Gln, Ala o Tyr); Xaa en res. 53 = (Asn, Phe, Lys, Glu, Asp, Ala, Gln, Gly, Leu o Val); Xaa en res. 54 = (Pro, Asn, Ser, Val o Asp); Xaa en res. 55 = (Glu, Asp, Asn, Lys, Arg, Ser, Gly, Thr, Gln, Pro o His); Xaa en res. 56 = (Thr, His, Tyr, Ala, Ile, Lys, Asp, Ser, Gly o Arg); Xaa en res. 57 = (Val, Ile, Thr, Ala, Leu o Ser); Xaa en res. 58 = (Pro, Gly, Ser, Asp o Ala); Xaa en res. 59 = (Lys, Leu, Pro, Ala, Ser, Glu, Arg o Gly); Xaa en res. 60 = (Pro, Ala, Val, Thr o Ser); Xaa en res. 61 = (Cys, Val o Ser); Xaa en res. 63 = (Ala, Val o Thr); Xaa en res. 65 = (Thr, Ala, Glu, Val, Gly, Asp o Tyr); Xaa en res. 66 = (Gln, Lys, Glu, Arg o Val); Xaa en res. 67 = (Leu, Met, Thr o Tyr); Xaa en res. 68 = (Asn, Ser, Gly, Thr, Asp, Glu, Lys o Val); Xaa en res. 69 = (Ala, Pro, Gly o Ser); Xaa en res. 70 = (Ile, Thr, Leu o Val); Xaa en res. 71 = (Ser, Pro, Ala, Thr, Asn o Gly); Xaa en res. 2 = (Val, Ile, Leu o Met); Xaa en res. 74 = (Tyr, Phe, Arg, Thr, Tyr o Met); Xaa en res. 75 = (Phe, Tyr, His, Leu, Ile, Lys, Gln o Val); Xaa en res. 76 = (Asp, Leu, Asn o Glu); Xaa en res. 77 = (Asp, Ser, Arg, Asn, Glu, Ala, Lys, Gly o Pro); Xaa en res. 78 = (Ser, Asn, Asp, Tyr, Ala, Gly, Gln, Met, Glu, Asn o Lys); Xaa en res. 79 = (Ser, Asn, Glu, Asp, Val, Lys, Gly, Gln o Arg); Xaa en res. 80 = (Asn, Lys, Thr, Pro, Val, Ile, Arg, Ser o Gln); Xaa en res. 81 = (Val, Ile, Thr o Ala); Xaa en res. 82 = (Ile, Asn, Val, Leu, Tyr, Asp o Ala); Xaa en res. 83 = (Leu, Tyr, Lys o Ile); Xaa en res. 84 = (Lys, Arg, Asn, Tyr, Phe, Thr, Glu o Gly); Xaa en res. 85 = (Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu o Val); Xaa en res. 86 = (Tyr, His, Glu o Ile); Xaa en res. 87 = (Arg, Glu, Gln, Pro o Lys); Xaa en res. 88 = (Asn, Asp, Ala, Glu, Gly o Lys); Xaa en res. 89 = (Met o Ala); Xaa en res. 90 = (Val, Ile, Ala, Thr, Ser o Lys); Xaa en res 91 = (Val o Ala); Xaa en res. 92 = (Arg, Lys, Gln, Asp, Glu, Val, Ala, Ser o Thr); Xaa en res. 93 = (Ala, Ser, Glu, Gly, Arg o Thr); Xaa en res. 95 = (Gly, Ala o Thr); Xaa en res. 97 = (His, Arg, Gly, Leu o Ser). Adicionalmente, después de res. 53 en rBMP3b y mGDF-10 se encuentra un Ile; después de res. 54 en GDF-1 se encuentra un T; después de res. 54 en BMP3 se encuentra un V; después de res. 78 en BMP-8 y Dorsalin se encuentra un G; y después de res. 37 en hGDF-1 se encuentra Pro, Gly, Gly,
Pro.

La Secuencia Genérica 10 (SEQ ID NO: 8) incluye la totalidad de la Secuencia Genérica 9 (SEQ ID NO: 7) e incluye adicionalmente la secuencia siguiente (SEQ ID NO: 9) en su término N:

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De acuerdo con ello, comenzando con el residuo 6, cada "Xaa" en la Secuencia Genérica 10 es un aminoácido especificado definido como para la Secuencia Genérica 9, con la distinción de que cada número de residuo descrito para la Secuencia Genérica 9 está desplazado en 5 posiciones en la Secuencia Genérica 10. Así, "Xaa en res. 1 = (Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gln, Val o Glu)" en la Secuencia Genérica 9 se refiere a Xaa en res. 6 en la Secuencia Genérica 10. En la Secuencia Genérica 10, Xaa en res. 2 = (Lys, Arg, Gln, Ser, His, Glu, Ala, o Cys); Xaa en res. 3 = (Lys, Arg, Met, Lys, Thr, Leu, Tyr, o Ala); Xaa en res. 4 = (His, Gln, Arg, Lys, Thr, Leu, Val, Pro, o Tyr); y Xaa en res. 5 = (Gln, Thr, His, Arg, Pro, Ser, Ala, Gln, Asn, Tyr, Lys, Asp, o Leu).

Como se ha indicado arriba, ciertas secuencias morfogénicas óseas de polipéptidos preferidas actualmente útiles en esta invención tienen más de 60% de identidad, preferiblemente más de 65% de identidad, con la secuencia de aminoácidos que define la secuencia de referencia preferida de hOP-1. Estas secuencias particularmente preferidas incluyen variantes equivalentes alélicas y filogenéticas de las proteínas OP-1 y OP-2, que incluyen la proteína 60A de Drosophila. De acuerdo con ello, en ciertas realizaciones particularmente preferidas, las proteínas morfogénicas útiles incluyen proteínas activas que comprenden pares de cadenas polipeptídicas dentro de la secuencia de aminoácidos genérica a la que se hace referencia en esta memoria como "OPX" (SEQ ID NO: 4), que define el esqueleto de 7 cisteínas y acomoda las homologías entre diversas variantes identificadas de OP-1 y OP-2. Como se describe en esta memoria, cada Xaa en una posición dada se selecciona independientemente de los residuos que existen en la posición correspondiente en la secuencia C-terminal de OP-1 u OP-2 de ratón o humana.

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en donde Xaa en res. 2 = (Lys o Arg); Xaa en res. 3 = (Lys o Arg); Xaa en res. 11 = (Arg o Gln); Xaa en res. 16 = (Gln o Leu); Xaa en res. 19 = (Ile o Val); Xaa en res. 23 = (Glu o Gln); Xaa en res. 26 = (Ala o Ser); Xaa en res. 35 = (Ala o Ser); Xaa en res. 39 = (Asn o Asp); Xaa en res. 41 = (Tyr o Cys); Xaa en res. 50 = (Val o Leu); Xaa en res. 52 = (Ser o Thr); Xaa en res. 56 = (Phe o Leu); Xaa en res. 57 = (Ile o Met); Xaa en res. 58 = (Asn o Lys); Xaa en res. 60 = (Glu, Asp o Asn); Xaa en res. 61 = (Thr, Ala o Val); Xaa en res. 65 = (Pro o Ala); Xaa en res. 71 = (Gln o Lys); Xaa en res. 73 = (Asn o Ser); Xaa en res. 75 = (Ile o Thr); Xaa en res. 80 = (Phe o Tyr); Xaa en res. 82 = (Asp o Ser); Xaa en res. 84 = (Ser o Asn); Xaa en res. 89 = (Lys o Arg); Xaa en res. 91 = (Tyr o His); y Xaa en res. 97 = (Arg o
Lys).

En otra realización preferida adicional, proteínas osteogénicamente activas útiles tienen cadenas polipeptídicas con secuencias de aminoácidos que comprenden una secuencia codificada por un ácido nucleico que se hibrida, en condiciones de hibridación de severidad baja, media o alta, a secuencias morfogénicas codificantes de referencia de DNA o RNA, v.g., secuencias C-terminales que definen los dominios conservados de 7 cisteínas de OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 60A, GDF-3, GDF-6, GDF-7 y análogas. Como se utiliza en esta memoria, condiciones de hibridación de severidad alta se definen como hibridación de acuerdo con técnicas conocidas en formamida al 40%, 5 X SSPE, 5 X Solución de Denhardt, y SDS al 0,1% a 37ºC durante una noche, y lavado en 0,1 X SSPE, SDS al 0,1% a 50ºC. Las condiciones de severidad estándar están bien caracterizadas en textos estándar de clonación molecular disponibles comercialmente. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, recopilado por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984): Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); y B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984).

Como se ha indicado arriba, proteínas útiles en la presente invención son generalmente proteínas dímeras que comprenden un par plegado de los polipéptidos anteriores. Tales proteínas morfogénicas son inactivas cuando están reducidas, pero son activas como homodímeros oxidados y cuando están oxidadas en combinación con otras de esta invención para producir heterodímeros. Así, miembros de un par plegado de polipéptidos morfogénicos en una proteína morfogénicamente activa pueden seleccionarse independientemente de cualquiera de los polipéptidos específicos arriba mencionados.

Las proteínas morfogénicas óseas útiles en los materiales y métodos de esta invención incluyen proteínas que comprenden cualquiera de las cadenas polipeptídicas arriba descritas, sea aisladas de fuentes existentes naturalmente, o producidas por técnicas de DNA recombinante u otras técnicas de síntesis, e incluyen variantes equivalentes alélicas y filogenéticos de estas proteínas, así como muteínas de las mismas, y diversos constructos truncados y de fusión. Se contemplan también como activos mutantes de deleción o adición, con inclusión de aquéllos que pueden alterar el dominio conservado C-terminal de seis o siete cisteínas, con tal que la alteración no rompa funcionalmente la relación de estas cisteínas en la estructura plegada. De acuerdo con ello, tales formas activas se consideran como el equivalente de los constructos descritos específicamente expuestos en esta memoria. Las proteínas pueden incluir formas que tienen patrones de glicosilación variables, términos N variables, una familia de proteínas afines que tienen regiones de homología de secuencia de aminoácidos, y formas activas truncadas o mutadas de proteínas nativas o biosintéticas, producidas por la expresión de DNA recombinante en células hospedadoras.

Las proteínas morfogénicas óseas contempladas en esta memoria pueden expresarse a partir de cDNA intacto o truncado o de DNA sintéticos en células hospedadoras procariotas o eucariotas, y purificarse, escindirse, replegarse, y dimerizarse para formar composiciones morfogénicamente activas. Células hospedadoras preferidas actualmente incluyen, sin limitación, procariotas con inclusión de E. coli o eucariotas con inclusión de levadura, o células de mamífero, tales como células CHO, COS o BSC. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que pueden utilizarse con ventaja otras células hospedadoras. Descripciones detalladas de las proteínas morfogénicas óseas útiles en la práctica de esta invención, con inclusión del modo de producirlas, utilizarlas y ensayarlas en cuanto a actividad osteogénica, se describen en numerosas publicaciones, con inclusión de las patentes U.S. núms. 5.266.683 y 5.011.691.

Así pues, teniendo en cuenta esta descripción y el conocimiento disponible de la técnica, los expertos en ingeniería genética pueden aislar genes a partir bibliotecas de cDNA o genómicas de diversas especies biológicas diferentes, que codifican secuencias de aminoácidos apropiadas, o construir DNA a partir de oligonucleótidos, y pueden expresarlos luego en diversos tipos de células hospedadoras, con inclusión tanto de procariotas como de eucariotas, para producir grandes cantidades de proteínas activas capaces de estimular la morfogénesis de hueso endocondral en un mamífero.

Factores Estimulantes de Proteínas Morfogénicas (MPSF)

Un factor estimulante de proteínas morfogénicas (MPSF) de acuerdo con esta invención es un factor que es capaz de estimular la capacidad de una proteína morfogénica para inducir formación de tejido a partir de una célula progenitora. El MPSF puede tener un efecto aditivo sobre la inducción de tejido por la proteína morfogénica. Preferiblemente, el MPSF tiene un efecto sinérgico sobre la inducción de tejido por la proteína morfogénica.

La célula progenitora cuya proliferación y/o diferenciación son inducidas por la proteína morfogénica de esta invención es preferiblemente una célula de mamífero. Células progenitoras incluyen condroblastos, mioblastos, osteoblastos, neuroblastos y células precursoras de tejido vascular de mamífero, todos los precursores previos del desarrollo de las mismas, y todas las células que se desarrollan a partir de ellas (v.g., condroblastos, pre-condroblastos y condrocitos). Sin embargo, las proteínas morfogénicas están altamente conservadas a lo largo de la evolución, y las células progenitoras de animales no mamíferos son estimuladas también probablemente por proteínas morfogénicas de la misma especie o de otras especies cruzadas, así como combinaciones de MPSF. Así pues, se contempla que cuando se disponga de esquemas para implantar células xenógenas en humanos sin causar reacciones inmunológicas adversas, las células progenitoras de animales no mamíferos estimuladas por proteína morfogénica y un MPSF de acuerdo con los procedimientos expuestos en esta memoria serán útiles para regeneración y reparación de tejidos en humanos.

Uno o más MPSF se seleccionan para uso en asociación con una o más proteínas morfogénicas de acuerdo con el tipo de tejido deseado a inducir y el sitio en el que se administrarán la proteína morfogénica y el MPSF. La elección particular de una combinación proteína(s) morfogénica(s)/MPSF y las concentraciones relativas en que se combinan los mismos pueden variarse sistemáticamente a fin de optimizar el tipo de tejido inducido en un sitio de tratamiento seleccionado utilizando los procedimientos descritos en esta memoria.

Los factores estimulantes de proteínas morfogénicas (MPSF) preferidos de esta invención se seleccionan del grupo constituido por hormonas, citoquinas y factores de crecimiento. MPSF muy preferidos para inducir formación de hueso y/o cartílago en asociación con una proteína osteogénica comprenden al menos un compuesto seleccionado del grupo constituido por factor I de crecimiento afín a la insulina (IGF-I), estradiol, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), hormona del crecimiento (GH), factor de crecimiento y diferenciación (GDF), hidrocortisona (HC), insulina, progesterona, hormona paratiroidea (PTH), vitamina D (1,25-(OH)_{2}D_{3}), ácido retinoico y una interleuquina, particularmente IL-6.

En otra realización preferida de esta invención, el MPSF comprende un compuesto o un agente que es capaz de aumentar la bioactividad de otro MPSF. Agentes que aumentan la bioactividad de MPSF incluyen, por ejemplo, aquéllos que aumentan la síntesis, la semivida, la reactividad con otras biomoléculas tales como proteínas de fijación y receptores, o la biodisponibilidad del MPSF. Estos agentes pueden comprender hormonas, factores de crecimiento, péptidos, citoquinas, moléculas portadoras tales como proteínas o lípidos, u otros factores que aumentan la expresión o la estabilidad del MPSF.

Por ejemplo, cuando el MPSF seleccionado es IGF-I, agentes que aumentan su bioactividad incluyen GH, PTH, vitamina D, e inductores de cAMP, que pueden funcionar por tanto como MPSF de acuerdo con esta invención. Por lo demás, prácticamente la totalidad del IGF-I en circulación y el espacio extracelular está fijado por un grupo de proteínas de fijación de alta afinidad denominadas IGFBP que pueden aumentar o inhibir la bioactividad de IGF-I (véase, v.g., Jones y Clemmons, Endocrine Reviews, 16, pp. 3-34 (1995)). Así, las IGFBP y los agentes que alteran los niveles de IGFBP tales que la concentración bioactiva de IGF-I se incremente finalmente funcionarán también como un MPSF de acuerdo con esta invención.

Estos u otros agentes que aumentan la bioactividad de IGF-I pueden utilizarse solos como el MPSF primario, o pueden utilizarse uno o más como MPSF adicionales en combinación con IGF-I, para estimular la actividad inductora de tejido de la proteína morfogénica. Una combinación preferida de este tipo que comprende al menos dos MPSF para formación de cartílago y hueso es proteína osteogénica OP-1, IGF-I y PTH.

Preferiblemente, el MPSF está presente en una cantidad capaz de estimular sinérgicamente la actividad inductora de tejido de la proteína morfogénica en un mamífero. Las concentraciones relativas de proteína morfogénica y MPSF que inducirán óptimamente la formación de tejido cuando se administra a un mamífero pueden ser determinadas empíricamente por el profesional experto utilizando los procedimientos que se describen en esta memoria.

Dispositivo de Implante

La invención se refiere también a un dispositivo de implantación para promover la formación, regeneración y la reparación de hueso. El dispositivo de implantación comprende el material \beta-TCP poroso de la invención, y opcionalmente al menos un agente bioactivo.

El dispositivo de implantación que comprende el material \beta-TCP poroso sirve como entramado y sustrato temporal para reclutamiento de células progenitoras migratorias, y como base para su anclaje y proliferación subsiguientes.

En una realización preferida, el dispositivo de implantación comprende la matriz porosa de \beta-TCP y un agente bioactivo, que está dispersado o absorbido en la matriz. Se contempla que el agente bioactivo puede incluir, pero sin carácter limitante, proteínas morfogénicas óseas, factores de crecimiento tales como EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-\alpha, y TGF-\beta, citoquinas, MPSF, hormonas, péptidos, lípidos, agentes tróficos y composiciones terapéuticas que incluyen antibióticos y agentes quimioterapéuticos, insulina, quimioatrayentes, factores quimiotácticos, enzimas, e inhibidores de enzimas. Se contempla también que agentes bioactivos tales como vitaminas, agentes citoesqueléticos, autoinjertos, aloinjertos, fragmentos de cartílago, células vivas tales como condrocitos, células de la médula ósea, células madre mesenquimáticas, trasplantes de tejidos, e inmunosupresores pueden añadirse al \beta-TCP poroso.

La matriz de \beta-TCP poroso proporciona un suministro o sistema de soporte sostenido para el agente bioactivo, que se libera a lo largo del tiempo en el sitio de implantación a medida que el material matriz se absorbe lentamente. En una realización preferida, el agente bioactivo está encapsulado en el agente biodegradable. La reabsorción del agente biodegradable y la liberación gradual del agente bioactivo proporcionan un sistema de liberación sostenida. La dosificación y tasa de suministro del agente bioactivo pueden controlarse sobre la base de la naturaleza de la matriz porosa, la naturaleza del agente biodegradable y la naturaleza de la interacción de fijación entre el agente bioactivo encapsulado en el agente biodegradable, la matriz porosa y el agente biodegradable. En una realización preferida, el agente bioactivo es una proteína morfogénica ósea o una molécula de ácido nucleico que codifica BMP. En una realización más preferida, la BMP es OP-1.

En una realización preferida, el agente bioactivo es una BMP. En una realización más preferida, la BMP es OP-1. La matriz porosa de \beta-TCP puede proteger la BMP y el MPSF de la proteólisis inespecífica, y puede acomodar cada paso de las respuestas celulares implicadas en la inducción de la célula progenitora durante el desarrollo del tejido.

Estudios realizados han demostrado que la metodología para combinar matriz y proteínas morfogénicas juega un papel en la consecución de una inducción de tejido satisfactoria. Las relaciones óptimas de proteína morfogénica a MPSF para una combinación y tipo de tejido específicos pueden ser determinadas empíricamente por los expertos en la técnica. Pueden utilizarse cantidades mayores para implantaciones grandes. Los procedimientos utilizados para formular BMP y MPSF en la matriz son sensibles al estado físico y químico tanto de las proteínas como de la matriz.

En el dispositivo osteogénico preferido con \beta-TCP poroso, la proteína osteogénica se difunde fuera de la matriz al sitio de implantación y permite la entrada y salida de células. La proteína osteogénica induce las células progenitoras a diferenciarse y proliferar. Las células progenitoras pueden migrar a la matriz y las células diferenciadas pueden desplazarse fuera de la matriz porosa al sitio de implantación. Las reacciones celulares secuenciales en la interfase de los implantes matriz ósea/proteína osteogénica incluyen: fijación de fibrina y fibronectina a la matriz implantada, migración y proliferación de células mesenquimáticas, diferenciación de las células progenitoras en condroblastos, formación de cartílago, calcificación de cartílago, invasión vascular, formación de hueso, remodelación, y diferenciación de la médula ósea. El dispositivo osteogénico preferido con el material de \beta-TCP poroso, puede aplicarse a la formación de hueso en diversos procedimientos ortopédicos, periodontales, y reconstructivos.

El dispositivo de implantación puede comprender también un aglomerante en una mezcla con el agente bioactivo y/o el material de \beta-TCP poroso. El aglomerante se añade para formar una masilla moldeable que puede conformarse para adaptarla a un sitio de defecto o para adquirir la forma de un tejido nuevo. La composición de masilla moldeable puede ser mantenida en su lugar por el tejido circundante o el músculo masticado. Se prefiere conformar la matriz para abarcar un defecto tisular y adquirir la forma deseada del tejido nuevo. En el caso de la reparación ósea de un defecto no consolidado, por ejemplo, es deseable utilizar dimensiones que abarquen la zona de falta de consolidación. Estudios realizados en ratas demuestran que el hueso nuevo se forma esencialmente de un modo que tiene las dimensiones del dispositivo implantado. Así pues, el material puede utilizarse para implantes subcutáneos o intramusculares. En los procedimientos de formación de hueso, el material es absorbido lentamente por el cuerpo y es reemplazado por hueso en la forma de o muy aproximadamente en la forma del implante.

Dispositivo Protésico

Se contempla también que el material de \beta-TCP poroso de la presente invención puede utilizarse en un dispositivo protésico. El dispositivo protésico comprende una región superficial que puede implantarse adyacente a un tejido diana de un mamífero, y una composición que está situada sobre la región superficial. Los dispositivos protésicos serán útiles para reparación de defectos ortopédicos, lesiones o anomalías en el mamífero tratado. Preferiblemente, el mamífero es un paciente humano. El dispositivo protésico puede estar hecho de un material que comprende metal, material cerámico o material polímero compuesto. Dispositivos preferidos comprenden un núcleo portador de carga seleccionado de aleaciones Co-Cr-Mo, aleaciones de titanio y acero inoxidable. Dispositivos protésicos preferidos se seleccionan del grupo constituido por un dispositivo de cadera, una estructura de fusión y un dispositivo maxilofacial.

La composición comprende el material de \beta-TCP poroso de la invención, y opcionalmente, uno o más agentes seleccionados del grupo constituido por un agente bioactivo o un aglomerante dispersado en el \beta-TCP poroso. En una realización preferida, el agente bioactivo está encapsulado en el agente biodegradable. En una realización preferida, el agente bioactivo es una BMP o un ácido nucleico codificante de BMP, más preferiblemente, OP-1. Los dispositivos protésicos recubiertos de proteína osteogénicas pueden mejorar la fase de unión entre la prótesis y el hueso existente. Rueger et al., patente de EE.UU. No. 5.344.654. La composición puede actuar como un recubrimiento para material óseo construido por síntesis, por ejemplo para una cadena artificial, reemplazamiento de un hueso dañado, corrección de defectos, o anclaje de dientes. La composición se dispone en la superficie del implante en una cantidad suficiente para promover el crecimiento de tejido mejorado en la superficie. La cantidad de la composición suficiente para promover el crecimiento intensificado de tejido puede ser determinada empíricamente por quienes poseen una experiencia en la técnica utilizando bioensayos descritos en Rueger et al., patente de EE.UU. No. 5.344.654. Preferiblemente, se realizan estudios en animales para optimizar la concentración de los componentes de la composición antes de utilizar un dispositivo protésico similar en el paciente humano.

En otra realización preferida, la composición se aplica al procedimiento clínico de artroplastia de articulación total en caderas, rodillas, codos y otras articulaciones, en donde una articulación natural enferma o deteriorada es reemplazada por una articulación protésica. Por ejemplo, en una artroplastia total de cadera, se inserta una copa acetabular con la composición en la hueco acetabular de la pelvis para reemplazar el acetábulo natural. La copa se mantiene en su lugar por la composición y se asegura mediante tornillos de fijación. Generalmente, la cavidad o hueco se adapta a la superficie externa de la copa acetabular. La composición puede aplicarse también para cirugía de revisión total de articulaciones, a fin de reforzar la unión entre dispositivos protésicos de articulaciones y el hueso.

En otra realización preferida adicional, la composición se aplica a un procedimiento clínico denominado vertebroplastia. La composición de inyecta en el interior de un cuerpo vertebral. Este método se utiliza en el tratamiento de la osteoporosis para aumentar la densidad del hueso.

En una realización preferida, el dispositivo protésico se selecciona del grupo constituido por una estructura de fusión, un clavo y otros dispositivos que tienen una bolsa o cámara, tales como una fusión intercorporal para contener la composición de la presente invención. Preferiblemente, el dispositivo de fusión intercorporal se produce a partir de material seleccionado del grupo constituido por titanio, PEEK (poli(eteretercetona)) y aloinjerto. La fusión intercorporal en la columna cervical, torácica y lumbar puede administrarse por un enfoque anterior o posterior. Como alternativa, la composición de esta invención puede utilizarse sin un dispositivo intercorporal asociado para alcanzar la fusión intercorporal.

Las estructuras de fusión espinales se colocan en el espacio intervertebral que queda después de la retirada de un disco espinal deteriorado a fin de eliminar el movimiento local y participar en la fusión ósea vértebra a vértebra. Como se describe en la patente de EE.UU. No. 5.015.247, las estructuras de fusión tienen la forma de un miembro hueco cilíndrico que tiene un diámetro exterior mayor que el espacio entre dos vértebras adyacentes a fusionar. El espacio interior dentro del implante cilíndrico hueco puede rellenarse con la composición de esta invención. Los implantes cilíndricos pueden incluir también un exterior roscado para permitir la inserción roscada en un orificio aterrajado formado en las vértebras adyacentes. Como alternativa, se han diseñado algunos implantes de fusión que se introducen por impacto en el espacio intradiscal. Como se describe en la patente de EE.UU. No. 6.146.420, el dispositivo de fusión incluye piezas extremas opuestas con un elemento central integral. El elemento central tiene un diámetro mucho menor a fin de que el dispositivo de fusión forme una bolsa anular alrededor del elemento central. La composición de esta invención puede disponerse en el interior de la bolsa anular entre las piezas extremas opuestas.

En una realización preferida, el dispositivo protésico se utiliza para reparación de inestabilidad ósea y discoligamentosa. La composición de esta invención puede aplicarse al área intervertebral, dando como resultado una fusión excelente y consiguiendo como consecuencia la estabilización definitiva de un segmento motor traumatizado por un enfoque dorsal simple. Esta aplicación puede eliminar la necesidad de sufrir una segunda operación en el caso de fracturas de la columna toracolumbar, que, en el momento actual, es necesaria a menudo pero implica altos riesgos adicionales. Asimismo, este método evita los problemas asociados con el trasplante de hueso esponjoso autógeno, con lo que podría evitarse el riesgo asociado de alta morbilidad. Véase, v.g., Rueger, et al., Orthopäde, 27, pp. 72-79 (1998).

En otra realización preferida, el dispositivo protésico es un dispositivo maxilofacial. Los dispositivos maxilofaciales se aplican externamente para corregir defectos faciales resultantes de cirugía de cáncer, accidentes, o deformidades congénitas. Con objeto de restaurar las deficiencias masticatorias, un paciente con masa ósea marginal se trata primeramente con la composición de esta invención para compactar y reconstruir el sitio quirúrgico. Puede aplicarse un sistema de anclaje y distracción maxilofacial, como se ilustra en la patente de EE.UU. No. 5.899.940, incorporada en esta memoria por referencia, para aumentar la calidad del hueso existente. Dispositivos de fijación, tales como un tornillo de hueso roscado estándar y tachuela simple con punta de clavo o autoinmovilización y dispositivo de tornillo-tachuela roscado de hueso (patente de EE.UU. No. 5,971.985), se utilizan para la retención de injertos de tejido y membranas sintéticas al sitio de injerto óseo maxilofacial. Una vez que el sitio ha cicatrizado, se realiza una segunda cirugía para insertar el implante dental endoóseo de longitud apropiada y erstablecer la función masticatoria.

La invención proporciona también un método para promover la integración en vivo de un dispositivo protésico implantable de esta invención en un tejido diana de un mamífero que comprende los pasos de a) proporcionar en una superficie del dispositivo protésico una composición que comprende el material de \beta-TCP poroso, opcionalmente, al menos un agente bioactivo o un aglomerante, y b) implantar el dispositivo en un mamífero en un lugar en el que el tejido diana y la superficie del dispositivo protésico se mantienen al menos parcialmente en contacto durante un tiempo suficiente para permitir el crecimiento de tejido entre el tejido diana y el dispositivo.

Método de Inducción de la Formación de Hueso y Suministro

La invención proporciona también un método de inducción de la formación de hueso en un mamífero. El mamífero es preferiblemente un paciente humano. El método comprende el paso de implantar en el sitio del defecto de un mamífero una composición que comprende el \beta-TCP poroso de la invención. En una realización preferida, la composición puede comprender adicionalmente un aglomerante y/o un agente bioactivo. El defecto puede ser un defecto endocondral, un defecto osteocondral o un defecto segmental. El método puede aplicarse a otros defectos, sin carácter limitante, tales como fracturas no consolidadas; cavidades óseas; resección de tumores; fracturas recientes (con distracción o sin distracción); anormalidades craneales, maxilofaciales y faciales, por ejemplo, en reconstrucción del esqueleto facial, especialmente, reconstrucción del fondo orbital, aumento del reborde o seno alveolar, defectos periodontales y cavidades de extracción dental; craneoplastia, genioplastia, aumento de barbilla, reconstrucción del paladar, y otras grandes reconstrucciones óseas; vertebroplastia, fusiones intercorporales en la espina cervical, torácica y lumbar y fusiones posterolaterales en la espina torácica y lumbar; en la osteomielitis para regeneración del hueso; fusión apendicular, fusión de tobillo, artroplastia total de cadera, rodilla y fusiones de otras articulaciones; corrección de defectos de tejido tendinal y/o ligamentoso tales como, por ejemplo, los ligamentos anterior, posterior, lateral y medial de la rodilla, la rótula y los tendones de Aquiles, y análogos, así como aquellos defectos resultantes de enfermedades tales como cáncer, artritis, con inclusión de osteoartritis, y otros trastornos degenerativos óseos tales como osteocondritis disecante. El método puede utilizarse en aumento de hueso, prótesis ósea, implante de tejido duro, entramado óseo, sistemas de fijación (v.g. tornillos, suturas, anclajes de sutura, grapas, tachuelas quirúrgicas, clips, placas y
tornillos).

La invención proporciona también un método de suministro de un agente bioactivo a un sitio que requiere formación de hueso, que comprende el paso de implantar el \beta-TCP y un agente bioactivo en el sitio de defecto de un mamífero. El método de suministro del agente bioactivo puede incluir adicionalmente un aglomerante. En una realización preferida, el agente bioactivo está encapsulado en un agente biodegradable. En una realización preferida, el agente bioactivo pertenece a la familia de las proteínas morfogénicas óseas. En otra realización preferida, el agente bioactivo es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una BMP. Preferiblemente, el ácido nucleico está atrapado en un portador. En otra realización adicional, el agente bioactivo es una célula ósea o una célula transfectada con ácido nucleico que codifica BMP. En otra realización preferida, el suministro del agente bioactivo tiene lugar por liberación sostenida. El agente biodegradable es preferiblemente un polímero biocompatible y no inmunógeno, más preferiblemente, PLGA. El agente bioactivo es preferiblemente OP-1. La tasa de liberación del agente bioactivo puede controlarse por alteración del peso molecular del PLGA. La degradación de PLGA comienza cuando el agua penetra en la matriz de cemento para hidrolizar las cadenas largas de polímero en fragmentos cortos solubles en agua. Esto da como resultado una reducción del peso molecular del PLGA sin pérdida de sus propiedades físicas. Gradualmente, la erosión ulterior del polímero conduce a la rotura del polímero, liberando con ello el agente bioactivo. Por ejemplo, en el caso de PLGA de 10 kd a 30 kd, la tasa de liberación para OP-1 es de 1 a 6
semanas.

La invención describe también un método de suministro de un agente bioactivo a un sitio que requiere formación de cartílago, que comprende implantar en el sitio del defecto de un mamífero una composición que comprende el agente bioactivo y agente biodegradable, en donde el agente bioactivo está encapsulado en el agente biodegradable. Preferiblemente, el agente bioactivo es OP-1 y el agente biodegradable es PLGA.

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Ejemplo 1

Preparación de Fosfato Tricálcico

Se prepara un lodo de cal (óxido-hidróxido de calcio) y se añade gota a gota al lodo ácido fosfórico diluido, que se mantiene constantemente en agitación. La proporción molar de óxido de calcio a ácido fosfórico es 3:2. Las características del producto se evalúan por difracción de rayos X, y se hacen ajustes respecto a las proporciones en caso requerido. El lodo resultante se recoge por secado con pulverización. Si el lodo se recoge por filtración, la torta seca se tritura para dar un polvo fino de TCP amorfo. El tamaño de partícula del TCP amorfa es preferiblemente menor que 10 \mum.

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Ejemplo 2

Preparación de Gránulos de \beta-TCP

El polvo de TCP se mezcló con cuentas de poliestireno (NUNC A/S-Dinamarca) (cuentas de 0-160 \mum). La solución de granulación de polivinil-pirrolidona (PVP) al 10% se preparó por adición de PVP C-30 (Plasdone C-30, ISP Technologies, lote #TX 60810) en pequeñas porciones en un vaso de precipitados o matraz con agua en agitación hasta que la solución se volvió transparente. Se añadieron aproximadamente 37 ml de solución de PVP al 10% a la mezcla de TCP en incrementos de 5 ml para formar una masa desmenuzable. Como se ilustra en la Tabla 1, se prepararon mezclas con proporciones diferentes de cuentas formadoras de poros y TCP.

TABLA 1

7

La masa desmenuzable se pasó a través de tamices < 500 \mum, 500-1000 \mum, o 1000-1700 \mum con un movimiento vibratorio para producir gránulos húmedos que tenían los intervalos de tamaño de partícula correspondientes. El material tamizado se secó a vacío a 105ºC durante 2-3 horas.

Los gránulos secados se sometieron luego a un ciclo de combustión para vaporizar/carbonizar el material formador de poros y se sinterizaron subsiguientemente a 1150ºC. La temperatura se elevó desde 39ºC a 300ºC durante un periodo de 18 horas, se mantuvo a 300ºC durante 1 hora, se elevó a 700ºC durante un periodo de 18 horas, se mantuvo a 700ºC durante 2 horas, y se elevó a 1150ºC durante un periodo de 6 horas, después de lo cual se mantuvo a 1150ºC durante 6 horas, y se enfrió lentamente a 39ºC durante un periodo de 6 horas.

Después del ciclo de sinterización, se confirmó por difracción de rayos X que el material resultante era \beta-TCP cristalino poroso.

Los gránulos sinterizados de 37,5% p/p, 500-1000 \mum se tamizaron de nuevo y se mezclaron con el aglomerante, carboximetilcelulosa sódica para formar una masilla moldeable. Las mezclas de masilla se formaron con diferentes proporciones de \beta-TCP y CMC. Todas las combinaciones de \beta-TCP y CMC producían una masilla que tenía propiedades de adherencia apropiadas, y no se descomponían en exceso de agua. La cohesividad de la masilla se intensificaba a medida que aumentaba la proporción de CMC. La masilla \beta-TCP/CMC 1:0,4/p/p) exhibía las características óptimas para manipulación. Se determinaron las propiedades reológicas de las diversas muestras.

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Ejemplo 3

Bioensayo en Modelo de Rata para Inducción de Hueso

Este ensayo consiste en la implantación de muestras en sitios subcutáneos en ratas receptoras bajo anestesia con éter. Pueden utilizarse ratas macho Long-Evans, de 28 a 32 días de edad. Se practica una incisión vertical (1 cm) en condiciones estériles en la piel de la región torácica, y se prepara una bolsa por disección roma. Se implantan profundamente aprox. 25 mg de la muestra de test en la bolsa y la incisión se cierra con un clip de piel metálico. El día de la implantación se designa como día 1 del experimento. Los implantes se retiran después de ello al cabo de tiempos variables (por ejemplo 12 días, 18 días). El sitio heterotrófico permite el estudio de la inducción de hueso sin las posibles ambigüedades resultantes del uso de sitios ortotrópicos.

El crecimiento de hueso se determina bioquímicamente por el contenido de calcio del implante. El contenido de calcio es proporcional a la cantidad de hueso formada en el implante. La formación de hueso se calcula por tanto determinando el contenido de calcio del implante en las ratas y se expresa como "unidades formadoras de hueso", donde una unidad formadora de hueso representa la cantidad de proteína que es necesaria para la actividad semi-máxima de formación de hueso del implante. La inducción de hueso exhibida por la matriz ósea intacta desmineralizada de la rata se considera que es la actividad máxima de diferenciación ósea para propósitos de comparación en este ensayo.

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Sucesos Celulares Durante la Formación de Hueso Endocondral

Los implantes exitosos exhiben una progresión controlada a lo largo de las etapas de desarrollo de hueso endocondral inducido por proteínas, que incluye: (1) infiltración transitoria por leucocitos polimorfonucleares; (2) migración y proliferación de células mesenquimáticas; (3) aparición de condrocitos; (4) formación de matriz cartilaginosa; (5) calcificación del cartílago; (6) invasión vascular, aparición de osteoblastos, y formación de hueso nuevo; (7) aparición de osteoclastos, remodelación ósea y disolución de la matriz implantada; y (8) diferenciación de la médula ósea hematopoyética en los osículos. Esta evolución temporal en las ratas puede acelerarse por aumento de las cantidades de OP-1 añadidas. Es posible que las cantidades crecientes de uno o más MPSF puedan acelerar también esta evolución temporal. La forma del hueso nuevo se ajusta a la forma de la matriz implantada.

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Evaluación Histológica

Se prefiere la división en secciones y la tinción histológica para determinar la extensión de la osteogénesis en los implantes. Los implantes se fijan en Solución de Bouins, se incrustan en parafina, y se cortan en secciones de 6-8 \mum. La tinción con azul de toluidina o hemotoxilina/eosina demuestra claramente el desarrollo final de hueso endocondral. Usualmente son suficientes implantes de 12 días para determinar si los implantes contienen hueso nuevo
inducido.

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Marcadores Biológicos

Puede utilizarse la actividad de fosfatasa alcalina (AP) como marcador para la osteogénesis. La actividad enzimática puede determinarse espectrofotométricamente después de la homogeneización del implante. La actividad alcanza un máximo al cabo de 9-10 días in vivo y después de ello disminuye lentamente. Los implantes que no muestran desarrollo alguno de hueso por histología proporcionan poca o ninguna actividad de fosfatasa alcalina en estas condiciones de ensayo. El ensayo es útil para cuantificación y obtención de una estimación de la formación de hueso poco después de la retirada de los implantes de la rata. Como alternativa, la cantidad de formación de hueso puede determinarse por medida del contenido de calcio del implante.

Los patrones de expresión génica que están correlacionados con la formación de hueso endocondral u otros tipos de formación de hueso pueden monitorizarse también por cuantificación de los niveles de mRNA utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica tales como el análisis por Transferencia Northern. Tales marcadores de expresión de genes de desarrollo pueden utilizarse para determinar la progresión a través de caminos de diferenciación tisular después de tratamientos con proteína osteogénica/MPSF. Estos marcadores incluyen proteínas de matriz relacionadas con los osteoblastos tales como procolágeno \alpha_{2} (I), procolágeno \alpha_{1} (I), procolágeno \alpha_{1} (III), osteonectina, osteopontina, biglicano, y fosfatasa alcalina para regeneración ósea v.g., Suva et al., J. Bone Miner. Res., 8, pp. 379-88 (1993); Benayahu et al., J. Cell. Biochem., 56, pp. 62-73 (1994)).

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Ejemplo 4

Bioensayo de Reparación Ósea en Modelo de Oveja

Se incluyeron en este estudio ovejas hembra esqueléticamente adultas. Se crearon tres defectos perforados en el área de la metáfisis proximal en ambas tibias izquierda y derecha de cada animal. Los defectos tenían 6 mm de diámetro y al menos 10 mm de profundidad. El tamaño del defecto era consistente en todos los animales sometidos al test. Los defectos se crearon a fin de mantener la estructura de la médula fibrograsa interósea. Esta médula actúa como barrera entre los materiales de implante e impide la mezcladura interósea de los materiales de matriz testados. Como se ilustra en la Tabla 2, se testaron masillas de \beta-TCP I, II, III, IV y colágeno en los sitios de defecto con y sin OP-1. La OP-1 se añadió directamente a las formulaciones de \beta-TCP o encapsulada en PLGA. La Tabla 3 representa ejemplos de formulaciones en las cuales la OP-1 está encapsulada en PLGA. De los seis sitios de defecto en cada animal, un sitio de defecto servía como control, que no contenía material de test
alguno.

Se practicó una incisión de 3 a 4 pulgadas (7,5 a 10,0 cm) en la metáfisis tibial proximal. La piel y el músculo subyacente se disecaron para dejar al descubierto el periostio. Se practicó una incisión en el periostio y se mantuvo intacta durante el cierre quirúrgico en caso posible. Se crearon 3 orificios transversales en la metáfisis. El primero y más superior se creó aproximadamente 2 cm por debajo de la superficie articular de la tibia. Los defectos se crearon de tal manera que formasen una línea orientada con el eje largo del hueso. Los implantes se espaciaron a intervalos de 1,6 cm medidos de centro a centro.

Se recogieron los materiales al cabo de 4 y 8 semanas después del tratamiento. Los animales se sacrificaron por eutanasia con pentobarbital a 75-100 mg/kg IV. Se tomaron las tibias proximales y se cortaron para permitir mejor la fijación del tejido. Los especímenes se fijaron en formalina neutra al 10% tamponada. Los especímenes se cortaron, en caso posible, de tal modo que capturaran todos los sitios de implante en un solo espécimen. Después de la fijación, los especímenes se descalcificaron, se incrustaron en plástico y se seccionaron en orientación longitudinal utilizando la técnica Exackt y se pulimentaron hasta un espesor de sección apropiado para interpretación histo-
lógica.

La evaluación radiográfica (Figuras 9-16, 27 y 28) y la evaluación histológica (Figuras 1-8) se realizaron al cabo de 4 y 8 semanas después de la operación en todos los sitios de implante. Se tomaron radiografías antero-posteriores a fin de lograr una imagen óptima de los tres defectos simultáneamente y observar los defectos cilíndricos desde el costado. Las descripciones histológicas cuantitativas identificaban formación de hueso nuevo, material de implante residual y cualquier evidencia de respuesta patológica. Las imágenes se capturaron para cada espécimen y se presentaron los registros de formación de hueso, inflamación aguda y crónica y matriz residual.

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La manipulación de los especímenes y las propiedades hemostáticas se registraron en el momento de la implantación. Los materiales variaban en forma y consistencia desde una masilla o forma granular hasta un cilindro
semisólido.

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TABLA 2

8

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TABLA 3

9

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Manipulación de las Formulaciones

Liofil 1 y Liofil 2 (placebo) se reconstituyeron por adición de 2,5 ml del medio de reconstitución a un vial del Liofil (todos los componentes se guardaron congelados a 2 hasta 8ºC hasta su utilización), agitando suavemente el medio mediante sacudidas durante 2 minutos hasta que se formó un gel homogéneo (transparente a turbio). Se añadieron 0,4 ml de gel Liofil reconstituido a la matriz porosa de \beta-TCP lentamente y con cuidado. Utilizando una espátula delgada, se mezcló la matriz porosa de \beta-TCP con el gel para formar un material semejante a una masilla.

Las microesferas de PLGA (tamaño de partícula 75-150 \mum, Alkermes, Inc.) encapsuladas con 0,3% (p/p) de OP-1 se mezclaron con la matriz porosa de \beta-TCP.

El material de masilla se implantó inmediatamente. Los materiales de implante se colocaron utilizando una pieza doblada de papel estéril. El papel se rellenó con el material de test y se utilizó para verterlo en el defecto mientras se compactaba continuamente el material en el sitio. Se registraron las propiedades de manipulación antes de la colocación y en el sitio del defecto.

Las formulaciones de masilla de \beta-TCP I, II, III, y IV se vertieron como un polvo seco granular. Una vez combinadas con la solución de vehículo, las masillas tenían una textura granular seca y crujiente. Las formulaciones absorbían la totalidad de la solución de Liofil. La formulación se implantó con una espátula. Una vez en el sitio de implante, los materiales se rellenaban bien con sangre.

La formulación de colágeno se vertió como un polvo harinoso. Una vez mezclada con una solución de vehículo, tenía una textura de masilla granujienta. La formulación podía situarse fácilmente con una jeringuilla en el sitio de implante. El sitio de implante quedó perfectamente rellenado con sangre.

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Resultados Histológicos

Las secciones proximales de la tibia contenían tres defectos. Estos defectos se sometieron a macrocorte grosero de tal modo que los tres estuvieran contenidos en una sola sección. Basándose en observaciones de la sección grosera, ensayos clínicos, y rayos X Faxitrón de esta sección, se consideró que dicha sección era representativa de la muestra. Esta orientación permitió la evaluación de la reacción del periostio suprayacente a los defectos y la respuesta intramedular a los materiales de test. Se evaluaron los especímenes de explantes de 4 y 8 semanas (Figuras 1-8). Los tres defectos dentro de una sola sección de la tibia recibieron placebo o solución de OP-1. Esta segregación de los implantes de placebo y OP-1 facilitaba la determinación de la naturaleza biológica activa o inactiva del material de implante.

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Evaluación durante Cuatro Semanas de los Materiales de Implante de OP-1 y Placebo

Al cabo de 4 semanas, la masilla I de \beta-TCP (89A) estaba presente en todos los sitios (sitio medio de la Figura 3 y sitio distal de la Figura 2). Generalmente, la matriz no se reabsorbía significativamente ni experimentaba reabsorción activa. Los sitios tratados con OP-1 daban como resultado cierta formación de hueso nuevo pero no muy acusada (Figura 3, sitio medio). Los sitios tratados con placebo exhibían formación de hueso al nivel de la corteza (Figura 2, sitio distal).

La masilla II de \beta-TCP (89B) estaba presente en todos los sitios a las 4 semanas en cantidades significativas (Figura 3, sitio distal y Figura 1, sitio proximal). No había evidencia significativa alguna de reabsorción de la matriz. Los sitios tratados con OP-1 daban como resultado pequeñas cantidades de formación de hueso nuevo predominantemente al nivel cortical y del periostio (Figura 3, sitio distal). De las 4 formulaciones de masilla \beta-TCP testadas, la masilla II de \beta-TCP daba como resultado más inflamación que las otras tres formulaciones. Se consignaron células gigantes de cuerpo extraño (FBGC) en asociación con esta inflamación.

La masilla III (89C) de \beta-TCP estaba presente en cantidades significativas en la totalidad de los 6 sitios tratados a las 4 semanas (Figura 1, sitio medio y Figura 4, sitio proximal). El tratamiento con OP-1 no alteraba apreciablemente los volúmenes de matriz residuales. La formación de hueso al nivel cortical era evidente en los especímenes tratados con OP-1 (Figura 4, sitio proximal) y menos común en los sitios tratados con placebo (Figura 1, sitio medio). Se observaba poca o ninguna inflamación en respuesta a la matriz de \beta-TCP con independencia del tratamiento de
OP-1.

La masilla IV (89F) de \beta-TCP estaba presente en cantidades significativas en la totalidad de los 6 sitios tratados a las 4 semanas (Figura 1, sitio distal y Figura 4, sitio medio). El tratamiento con OP-1 no tenía efecto aparente alguno sobre el volumen de matriz residual. Los sitios tratados con OP-1 daban como resultado mayor formación de hueso en toda la matriz con respuestas cortical y del periostio evidentes (Figura 4, sitio medio). Se observó poca o ninguna inflamación en respuesta a la matriz de \beta-TCP con independencia del tratamiento de OP-1.

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Evaluación a las 8 Semanas para los Materiales de Implante Tratados con OP-1 y Placebo

La masilla I (89A) de \beta-TCP estaba presente en todos los sitios a las 8 semanas (Figura 7, sitio proximal y Figura 6, sitio distal). Los implantes tratados con OP-1 exhibían por regla general evidencia de una respuesta inductiva de hueso fuerte (Figura 7, sitio proximal). En dos sitios tratados con OP-1, la matriz de \beta-TCP parecía haberse degradado significativamente. Los sitios tratados con OP-1 daban como resultado formación acusada de hueso nuevo al nivel cortical, con infiltración de hueso moderada en la matriz dentro del espacio medular. Los sitios tratados con placebo daban como resultado menos formación de hueso al nivel de la corteza (Figura 6, sitio
distal).

La masilla II (89B) de \beta-TCP estaba presente en todos los sitios a las 8 semanas en cantidades importantes (Figura 5, sitio proximal y Figura 7, sitio medio). No había evidencia significativa alguna de reabsorción de la matriz. Los sitios tratados con OP-1 daban como resultado pequeñas cantidades de formación de hueso nuevo predominantemente al nivel cortical y del periostio y cierre en el sitio del defecto (Figura 7, sitio medio). Los materiales tratados con placebo daban como resultado menos formación de hueso nuevo al nivel cortical y partículas de calcio que bloqueaban el cierre del defecto cortical (Figura 5, sitio proximal). La inflamación observada previamente en respuesta a este material no era evidente.

La masilla III (89C) de \beta-TCP estaba presente en cantidades significativas en la totalidad de los 6 sitios tratados a las 8 semanas (Figura 5, sitio medio y Figura 7, sitio distal). El tratamiento con OP-1 no alteraba apreciablemente los volúmenes de matriz residual. La formación de hueso al nivel cortical y una respuesta marcada del periostio eran evidentes en los especímenes tratados con OP-1 (Figura 7, sitio distal). Se observaba poca o ninguna inflamación en respuesta a la matriz de \beta-TCP con independencia del tratamiento de OP-1.

La masilla IV (89F) de \beta-TCP estaba presente en cantidades significativas en los 6 sitios tratados a las 8 semanas (Figura 5, sitio distal y Figura 8, sitio proximal). Algunos sitios tenían menos material residual que otros. Generalmente, el tratamiento con OP-1 no tenía defecto aparente alguno sobre el volumen de material residual. Los sitios tratados con OP-1 daban como resultado mayor formación de hueso en toda la matriz con una respuesta cortical y del periostio evidente (Figura 8, sitio proximal). Se observaba poca o ninguna inflamación en respuesta a la matriz de \beta-TCP con independencia de tratamiento de OP-1.

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Conclusión de los Resultados Anteriores

Comparadas con el material de colágeno que demostraba inflamación aguda y crónica acoplada con una respuesta de FBGC, las cuatro formulaciones porosas de \beta-TCP daban como resultado poca o ninguna inflamación al cabo de 4 y 8 semanas. El tratamiento con OP-1 en los materiales porosos de \beta-TCP exhibía consistentemente formación acusada de hueso al nivel cortical y una respuesta reactiva del periostio que daba a menudo como resultado el cierre del defecto cortical. Aunque la formulación granular grande (1-2 mm) de masilla IV de \beta-TCP parecía permitir un crecimiento interno más profundo de hueso en la matriz, se apreciaba mayor separación intergranular comparada con la observada en las masillas de \beta-TCP granulares pequeñas.

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Estudio Histológico en Parafina

Los tejidos del bioensayo del modelo de oveja se evaluaron utilizando secciones en parafina y tinción con hematoxilina y eosina para evaluar el efecto del tamaño de partícula y la porosidad del material de implante sobre la formación de hueso en y alrededor de las partículas.

Se seccionaron especímenes tibiales a fin de aislar los sitios de implante en los sitios proximal, medio y distal de cuatro animales (138, 299, 297, y 295). Estos explantes se descalcificaron, se incrustaron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina.

Las secciones se observaron utilizando microscopía óptica y se interpretaron respecto al efecto de tamaño de partícula y porosidad. Para los especímenes estratificados en formación de hueso, la respuesta del nivel cortical era robusta y profunda, y la respuesta era moderada en el compartimiento medular. Debido a esta estratificación, se evaluó el nivel que se extendía desde la corteza endosteal hasta un nivel de 2-3 mm de profundidad.

Cada una de las 4 formulaciones cerámicas se evaluaron respecto a la formación de hueso en los poros y el puenteado de hueso a través de las partículas. La formación de hueso en los poros se evaluó contando los poros que estaban completamente aislados dentro de una partícula del estroma adyacente. Se contaron los poros que eran obvios y generalmente redondos. A medida que se contaban los poros, se formó una relación de aquéllos que tenían hueso respecto a aquéllos que no lo tenían. Esto se indica como la relación poro-relleno.

El recuento de poros se realizó por escaneo del campo. En los materiales con pocos poros, la mayoría se contaban a medida que se escaneaba el campo (Figura 25). En los materiales con muchos poros, se contaron las regiones y se observó una región nueva que se contó posteriormente (Figura 26). El promedio de las regiones de recuento total se presentó en la relación.

El puenteado óseo entre partículas se registró de 0 a 2. Se asignó un registro de 0 a las partículas cuando el hueso no formaba puentes con partículas adyacentes. Se asignó un registro de 1 cuando un par a unas cuantas partículas exhibían consistentemente puenteado. Se asignó un registro de 2 cuando muchas de las partículas estaban unidas por trabéculas vitales de hueso.

Las Tablas 4 y 5 ilustran las relaciones poro-relleno y los registros de puenteado óseo para placebo y OP-1 al cabo de 4 semanas (Figuras 17-20). Las tablas 6 y 7 ilustran las relaciones poro-relleno y los registros de puenteado óseo para placebo y OP-1 a las 8 semanas (Figuras 21-24). La formación de puentes óseos era más pronunciada para las masillas de \beta-TCP constituidas por 37,5% (p/p) de agente formador de poros y que tenían el tamaño de gránulo más pequeño, 0,5-1 mm (Tablas 4-7). La relación poro-relleno era generalmente equivalente para la masilla de \beta-TCP constituida por 25% y 37,5% (p/p) de agentes formadores de poros. El \beta-TCP constituida por 12,5% (p/p) de agente formador de poros tenía una relación poro-relleno inferior (Tablas 4-7). La relación poro-relleno era consistentemente más alta en la formulación 89F debido al mayor tamaño de la partícula (1-2 mm) con más poros por partícula. Comparadas con las partículas pequeñas (0,5-1 mm), se registraba menos formación de puente óseo en las partículas mayores debido al hecho de que se requería más hueso para puentear las partículas
grandes.

TABLA 4

11

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Nota: La sección 297R-D corresponde al lado derecho (R), sitio distal (D) del animal 297. La sección 297L-P corresponde al lado izquierdo (L), sitio proximal (P) del animal 297. La sección 297L-M corresponde al lado izquierdo (L), sitio medio (M) del animal 297. La sección 297L-D corresponde al lado izquierdo (L), sitio distal (D) del animal 297.

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TABLA 5

12

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Nota: La sección 295L-M corresponde al lado izquierdo (L), sitio medio (M) del animal 295. La sección 295L-D corresponde al lado izquierdo (L), sitio distal (D) del animal 295. La sección 295R-P corresponde al lado derecho (R), sitio proximal (P) del animal 295. La sección 295R-M corresponde al lado derecho (R), sitio medio (M) del animal 295.

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TABLA 6

13

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Nota: La sección 299R-D corresponde al lado derecho (R), sitio distal (D) del animal 299. Sección 299L-P corresponde al lado izquierdo (L), sitio proximal (P) del animal 299. La sección 299L-M corresponde al lado izquierdo (L), sitio medio (M) del animal 299. La sección 299L-D corresponde al lado izquierdo (L), sitio distal (D) del animal
299.

TABLA 7

14

Nota: La sección 138L-P corresponde al lado izquierdo (L), sitio proximal (P) del animal 138. Sección 138L-M corresponde al lado izquierdo (L), sitio medio (M) del animal 138. La sección 138L-D corresponde al lado izquierdo (L), sitio distal (D) del animal 138. La sección 138R-P corresponde al lado derecho (R), sitio proximal (P) del animal 138.

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Conclusión del Estudio Histológico en Parafina

Para las formulaciones \beta-TCP, la formación de hueso en los poros era más evidente a medida que aumentaba la porosidad. La formación de hueso en los poros era menos frecuente en el material constituido por 12,5% de formador de poros comparada con el material constituido por 37,5% de formador de poros. Aunque la formación de hueso era más evidente en las partículas mayores (1-2 mm), se observaba menos puenteado óseo en estas partículas
grandes.

Las formulaciones de colágeno daban como resultado una formación nula de hueso y una respuesta patológica acusada. Además, estas formulaciones daban como resultado una FBGCR acusada y respuesta fibroinflamatoria
crónica.

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Ejemplo 5

Bioensayo en Modelo de Felino Para Reparación Ósea

Se prepara quirúrgicamente un defecto de osteotomía femoral. Sin intervención ulterior, el defecto de fractura simulado progresaría consistentemente hasta falta de consolidación. Los efectos de las composiciones y dispositivos osteogénicos implantados en los defectos creados en el hueso se evalúan por el protocolo de estudio siguiente.

Resumidamente, el procedimiento es como sigue: 16 gatos adultos, cada uno con un peso inferior a 10 libras (4,54 kg) se someten a preparación unilateral de un defecto óseo de 1 cm en el fémur derecho por un enfoque quirúrgico lateral. En otros experimentos, puede crearse un defecto óseo de 2 cm. Se fija inmediatamente el fémur en su cara interna por colocación lateral de una placa de orificio 8 para preservar las dimensiones exactas del defecto. Pueden implantarse 4 tipos de materiales diferentes en los defectos femorales del gato creados quirúrgicamente: el grupo I es un grupo de control negativo sin material de test alguno; el grupo II se implanta con \beta-TCP poroso biológicamente activo; el grupo III se implanta con \beta-TCP poroso y una proteína osteogénica; y el grupo IV se implanta con \beta-TCP, una proteína osteogénica y MPSF.

Se deja que todos los animales caminen ad libitum dentro de sus jaulas post-operatoriamente. Se inyectan todos los gatos con tetraciclina (25 mg/kg por vía subcutánea (SQ), cada semana durante 4 semanas) para marcación
ósea.

Se realizan estudios radiomorfométricos in vivo inmediatamente a las 4, 8, 12 y 16 semanas después de la operación tomando una imagen normalizada de rayos X del animal ligeramente anestesiado posicionado en un aparato de rayos X almohadillado diseñado para producir consistentemente una vista anteroposterior verdadera del fémur y el sitio de osteotomía. Todas las imágenes de rayos X se toman exactamente del mismo modo y exactamente en la misma posición en cada animal. La reparación ósea se calcula como función de la mineralización por medio de análisis puntual aleatorio. Un estudio radiográfico final de los especímenes del hueso cortado se realiza en dos planos después del sacrificio.

Los fémures de test cortados y normales pueden estudiarse inmediatamente por densitometría ósea, o envolverse en dos capas de toallas impregnadas en solución salina, colocarse en bolsas de plástico herméticamente cerradas, y guardarse a -20ºC hasta su estudio ulterior. La fuerza de la reparación ósea, la relación de carga a fallo, y la relación de trabajo a fallo se someten a test por carga hasta el fallo en un artefacto de flexión en 4 puntos de acero diseñado especialmente, conectado a una máquina de tests Instron para cuantificar la fuerza ósea, la rigidez, la energía absorbida y la deformación hasta el fallo. El estudio de los fémures de test y los fémures normales proporciona la fuerza ósea (carga) en libras (1 libra = 453,5 gramos) y el trabajo hasta el fallo en Julios. Los fémures normales exhiben una fuerza de 96 (\pm 12) libras (43,57 \pm 5,4 kg). La resistencia osteogénica del fémur implantado en el dispositivo debería corregirse respecto a la superficie externa en el sitio de fractura (debido a la forma en "vidrio de reloj" de la reparación del defecto óseo). Con esta corrección, el resultado debería correlacionarse estrechamente con la fuerza del hueso normal.

Después del testado biomecánico, los huesos se cortan inmediatamente en dos secciones longitudinales en el sitio del defecto, se pesan y se mide el volumen. Una mitad se fija para análisis histomorfométrico del hueso calcificado estándar con evaluación por incorporación de tinte fluorescente, y la otra mitad se fija para preparación descalcificada por histología con tinción hematoxilina/eosina.

Los especímenes seleccionados del sitio de reparación ósea se homogeneízan en NaCl 0,15 M frío, NaHCO_{3} 3 mM, pH 9,0 por medio de un molino congelador Spex. Se determinan luego la actividad de fosfatasa alcalina del sobrenadante y el contenido total de calcio de la fracción soluble en ácido del sedimento.

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Ejemplo 6

Bioensayo en Modelo de Conejo para Reparación Ósea

Este ensayo se describe en detalle en Oppermann et al., patente de EE.UU. No. 5.354.557; véase también Cook et al., J. of Bone and Joint Surgery, 76-A, pp. 827-38 (1994)). Se crean defectos de los fallos de consolidación del cúbito de 1,5 cm en conejos blancos adultos de Nueva Zelanda (peso inferior a 10 libras (4,54 kg)) con cierre epifisario documentado por rayos X. El experimento puede incluir la implantación de dispositivos en al menos 8 conejos por grupo como sigue: el grupo I, implantes de control negativo sin material de test; grupo II, implantes con \beta-TCP poroso; grupo III, implantes con \beta-TCP poroso y una proteína osteogénica; grupo IV, implantes con \beta-TCP poroso, proteína osteogénica y combinaciones MPSF. Los defectos del cúbito se siguen durante el curso total del estudio de 8 semanas en cada grupo de conejos.

En otro experimento, se rellena la cavidad medular del defecto cubital de 1,5 cm con proteína osteogénica activada en \beta-TCP poroso en presencia o ausencia de un MPSF. Los huesos se someten a aloinjerto de una manera intercalar. Los cúbitos de control negativo no se curan durante 8 semanas y revelan el aspecto clásico "marfileño". En contraste claro, los implantes osteogénicos tratados con proteína/MPSF "desaparecen" radiográficamente al cabo de 4 semanas con el comienzo de la remineralización a las 6 a 8 semanas. Estos aloinjertos se curan en cada extremo con formación proliferativa moderada de hueso a las 8 semanas. Este tipo de dispositivo sirve para acelerar la reparación del
aloinjerto.

Los implantes tratados con proteína osteogénica en presencia de un MPSF pueden exhibir una reparación acelerada, o pueden funcionar a la misma tasa utilizando menores concentraciones de la proteína osteogénica. Como se ha descrito anteriormente, el modelo de conejo puede utilizarse también para testar la eficacia de y optimizar las condiciones en las cuales una combinación particular proteína osteogénica/MPSF puede inducir formación local de hueso.

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Ejemplo 7

Bioensayo de Reparación Ósea de Defecto Cubital en el Perro

Este ensayo se realiza esencialmente como se describe en Cook et al., Clinical Orthopaedics and Related Research, 301, pp. 302-112 (1994)). Resumidamente, se utiliza un modelo de defecto segmental cubital para evaluar la curación de los huesos en perros macho adultos de 35-45 kg. Composiciones experimentales que comprenden 500 mg de \beta-TCP poroso se reconstituyen con cantidades variables de OP-1 en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de uno o más MPSF supuestos. En este ensayo puede utilizarse cualquier proteína osteogénica en lugar de OP-1. Los implantes en los sitios de defecto se realizan con un control portador y con la serie experimental de OP-1 y combinaciones OP-1/MPSF que se testan. El testado mecánico se realiza sobre cúbitos de animales que reciben composiciones al cabo de 12 semanas después de la implantación. Se realizan semanalmente radiografías de las patas delanteras hasta que los animales se sacrifican al cabo de 12 ó 16 semanas después de la operación. Las secciones histológicas se realizan a partir del sitio del defecto y de hueso adyacente normal.

La presencia de uno o más MPSF puede aumentar la tasa de reparación ósea en el perro. La presencia de uno o más MPSF puede permitir también el uso de concentraciones reducidas de proteína osteogénica por composición para alcanzar resultados similares o iguales.

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Ejemplo 8

Bioensayo de Reparación Ósea de Defectos Cubitales y Tibiales en los Monos

Este ensayo de curación ósea en monos verdes africanos se realiza esencialmente como se describe en Cook et al., J. Bone and Joint Surgery, 77A, pp. 734-50 (1995). Resumidamente, se crea un defecto osteoperiosteal de 2,0 cm en la parte media del eje cubital y se rellena con un implante que comprende matrices \beta-TCP porosos que contienen OP-1 en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de uno o más MPSF supuestos. Se utilizan composiciones experimentales que comprenden matrices porosas de \beta-TCP reconstituidas con cantidades variables de OP-1 en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de uno o más MPSF supuestos para rellenar defectos en el osteoperiostio de 2,0 cm creados en la diáfisis de la tibia. En este ensayo se puede utilizar cualquier proteína osteogénica en lugar de OP-1. Las implantaciones en los sitios de defecto se realizan con un control portador y con la serie experimental de OP-1 y combinaciones OP-1/MPSF que se testan. El testado mecánico se realiza sobre cúbitos y tibias de animales que reciben las composiciones. Se analizan radiografías y secciones histológicas de los sitios de defecto y de hueso adyacente normal como se describe en Cook et al.

La presencia de uno o más MPSF puede aumentar la tasa de reparación ósea en el mono. La presencia de uno o más MPSF puede permitir también el uso de concentraciones reducidas de proteína osteogénica por composición para alcanzar resultados similares o iguales.

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Ejemplo 9

Bioensayo de Curación de Fractura en Modelo de Cabra

Este ensayo de curación de fracturas en ovejas se realiza esencialmente como se describe en Blokhius et al., Biomaterials, 22, pp. 725-730 (2001). Se crea una fractura cerrada de la diáfisis media en la tibia izquierda de cabras hembra adultas con un dispositivo de flexión en tres puntos fabricado ex profeso. Las fracturas se estabilizan con un fijador externo, que se coloca en el costado lateral de la tibia. Se implantan 3 tipos diferentes de materiales en los defectos de la tibia por inyección: el grupo I es un grupo de control negativo sin material de test alguno; el grupo II se implanta con el \beta-TCP poroso biológicamente activa; el grupo III se implanta con \beta-TCP poroso y una proteína osteogénica; y el grupo IV se implanta con \beta-TCP poroso y una proteína osteogénica encapsulada en PLGA. El material de test se coloca en el espacio fracturado. El testado mecánico (test de flexión no destructiva de cuatro puntos) se realiza sobre los animales que reciben las composiciones al cabo de 2 semanas y 4 semanas. Después del testado mecánico, se sierran rodajas anterior, posterior, lateral y media del espacio fracturado para obtener radiografías y secciones histológicas.

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Ejemplo 10

Ensayo de Fusión del Segmento Motor Inestable de la Columna Lumbar de la Oveja

Este ensayo investiga la curación de una inestabilidad ósea y discoligamentosa. Un segmento motor de la columna es una unidad funcional constituida por dos cuerpos vertebrales situados uno encima del otro, y un disco interver-
tebral.

Un grupo de prueba está constituido por 12 ovejas. Se utilizan dos grupos de control de 12 ovejas cada uno. El área quirúrgica de la columna lumbar inferior se prepara después de la aplicación de anestesia general y colocación de los animales en posición prona. Se practica una incisión en la piel de aproximadamente 12 cm de longitud por encima de las apófisis espinales de la columna lumbar inferior. Después de la transsección del subcutis y las aponeurosis, se apartan hacia un lado los músculos del lomo.

Se aplica anestesia con intubación por inyección intramuscular de 1,5 ml de xilazina (Rompun®). Puede administrarse dosificación adicional en caso necesario. La sedación requiere colocación de un catéter residente intravenoso después de punción en una vena de la oreja. Se introduce la anestesia a través del catéter proporcionando 3-5 mg de tiopental (Trapanal®) por kilogramo de peso corporal. Después de la intubación endotraqueal, los animales se ventilan utilizando oxígeno (30%), óxido nitroso (gas hilarante) e isoflurano (Isofluran®). Durante la cirugía total, se administra el analgésico dihidrogeno-citrato de fentanilo (Fentanyl®) con una dosis de 0,2-0,4 mg. Al mismo tiempo, se consigue la relajación por administración de besilato de atracurio (Atracurium®) a una dosis de 0,5 mg/kg de peso
corporal.

Después de la exposición completa de los pedículos de los cuerpos vertebrales lumbares L4 a L6, tiene lugar una instrumentación bilateral de los pedículos L4 y L6. Esto se realiza utilizando tornillos pediculares de 5 mm o 6 mm de diámetro, dependiendo del diámetro encontrado en los pedículos. Subsiguientemente, se realiza una eliminación transpedicular bilateral del disco del segmento motor craneal L4/L5 a lo largo del pedículo de L5 bajo control pediculoscópico. Las placas terminales de los cuerpos vertebrales afectados se liberan de la corteza.

La aplicación inter- e intracorporal de las muestras de test tiene lugar por una cánula transpedicular en la totalidad de las 12 ovejas del grupo de prueba. Las muestras de test incluyen \beta-TCP poroso, proteína osteogénica o proteína osteogénica encapsulada en PLGA en concentraciones variables. En el primer grupo de control constituido por 12 ovejas, únicamente se aplica el \beta-TCP poroso. En el segundo grupo de control, se administra espongiosa autóloga en lugar de la composición de esta invención.

Finalmente, se instala completamente el fijador interno. El tipo de fijador interno, así como la instrumentación y el procedimiento quirúrgico necesarios están normalizados como es bien sabido por los profesionales expertos. Se colocan drenajes y se cierra la herida utilizando sutura absorbible para la aponeurosis y el subcutis, así como grapas epidérmicas.

Durante el procedimiento quirúrgico completo, está disponible un amplificador de imágenes de rayos X para fluoroscopia intraoperatoria. Esto facilita la orientación exacta durante la ejecución de los pasos anteriores.

La recogida de las 12 ovejas administradas con espongiosa autóloga se lleva a cabo bajo anestesia como sigue: se corta la piel de la cresta iliaca izquierda y la aponeurosis practicando una incisión longitudinal de aproximadamente 8 cm de longitud. Los músculos gluteales se desplazan por debajo del periostio y el injerto de hueso esponjoso se recoge de la cresta iliaca después de una osteotomía. El control de la hemorragia y la colocación de un drenaje se realizan después del cierre de la herida en capas. El procedimiento de recogida está normalizado y es conocido por cualquier persona con experiencia ordinaria en la técnica.

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Observaciones Clínicas

Se realizan exámenes neurológicos diarios para evaluar la andadura de los animales así como déficits neurológicos que pueden ocurrir postoperatoriamente. Las heridas operatorias se examinan detalladamente cada día. Los pesos corporales se miden preoperatoriamente y en el momento de la eutanasia.

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Análisis Radiográfico

Antes de la evaluación, la columna lumbar completa se diseca recientemente, y se retira cuidadosamente el fijador interno. Se obtienen radiografías laterales anteroposterior y plana de los segmentos medulares operados en condiciones consistentes de miliamperios, kilovoltios, y segundos al cabo de 0 y 8 semanas para ayudar a la evaluación de la fusión. El estado de la fusión se evalúa con el uso del sistema degradación documentado por Lenke et al., J. Spinal Disord, 5, pp. 433-442 (1992). Con este sistema, A indica una masa de fusión bilateral grande, sólidamente trabeculada (definitivamente sólida); B, una masa de fusión unilateral sólida grande con una pequeña masa de fusión contralateral (posiblemente sólida); C, una masa de fusión pequeña, bilateral fina con una grieta aparente (probablemente no sólida); y D, reabsorción bilateral del injerto o masa de fusión con una pseudoartrosis bilateral obvia (definitivamente no sólida).

Adicionalmente, se realizan escaneos por tomografía computerizada para evaluar la masa de fusión en secciones transversales y en reconstrucciones del plano sagital. Para cada masa de fusión, se realizan aproximadamente 40 escaneos secuenciales por tomografía computerizada con el uso de intervalo de rodajas de 2 milímetros y reconstrucción subsiguiente en el plano sagital bajo aumento y condiciones radiográficas consistentes.

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Tests Biomecánicos

Se evalúan biomecánicamente cuatro especímenes de cada grupo. Después del análisis radiográfico, se retiran cuidadosamente todos los músculos manteniendo las estructuras ligamentosas y óseas. Se congelan a -20ºC las columnas vertebrales. Para cada uno de estos especímenes, la mitad superior de las vértebras superiores y la mitad inferior de las vértebras inferiores del segmento de movimiento L4/L5 se incrustan en poli(metacrilato de metilo) (Technovit 3040; Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim/Ts, Alemania). Cada espécimen se fija luego y se testa sin precarga en un testador de columna en modo de test no destructivo. Se aplican continuamente secuencias alternantes de flexión/extensión, rotación axial derecha/izquierda, y momentos de flexión lateral derecho/izquierdo a una tasa constante de 1,7 grados/segundo por motores de velocidad gradual integrados en el cardán del testador de columna. Se aplican dos preciclos para minimizar el efecto del componente viscoso en la respuesta viscoelástica, y se recogen los datos en el tercer ciclo. Se determinan el intervalo de movimiento, la zona neutral, y dos parámetros de rigidez a partir de las curvas carga-deformación resultantes.

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Histología/Histomorfometría

Se evalúan histológicamente ocho especímenes de cada grupo después de dos, cuatro u ocho semanas, postoperatoriamente. Después del análisis radiográfico, las columnas se fijan en solución de formalina al 10%. Se obtienen secciones transversales de cada espécimen para evaluar la fusión ósea, las reacciones celulares, la biocompatibilidad, y los signos de integración/degradación del cemento. Se realiza una evaluación histológica cualitativa de la masa de fusión en el sitio operatorio respecto a la presencia de células gigantes, células inflamatorias, o respuestas fibrosas en las que pueden haberse encapsulado los materiales implantados. Adicionalmente, se evalúan el fondo osteoideo dentro de la masa de fusión trabecular y la cantidad de hueso trabecular. Se determinan las variables histomorfométricas, tales como el porcentaje de osteoide, el espesor osteoideo, el número de osteoblastos por milímetro de superficie de hueso, y el número de osteoclastos por milímetro de superficie de hueso.

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Marcación con Fluorocromo

Se someten ocho animales a aplicación intravenosa de 90 miligramos de anaranjado de xilenol por kilogramo de peso corporal dos semanas después de la operación, 10 miligramos de verde de calceína por kilogramo de peso corporal durante 4 semanas después de la operación, y 25 miligramos de amarillo de doxiciclinhiclato por kilogramo de peso corporal 6 semanas después de la operación. Este régimen sigue el método publicado por Rahn y Perren. Véase, v.g., Rahn et al., Stain Technology, 46, pp. 125-129 (1971); Rahn et al., Akt Traumatol., 10, pp. 109-115 (1980). El análisis secuencial del fluorocromo se realiza luego por microscopía de fluorescencia en los especímenes bajo luz UV para evaluación dinámica cualitativa y cuantitativa.

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Ejemplo 11

Reparación de Defectos Osteocondrales en los Perros

Se utilizan un total de 12 perros macho adultos. Se crean defectos osteocondrales bilaterales, de 5,0 mm de diámetro y 6 mm de profundidad, que penetran en el hueso subcondral, en la región que soporta la carga principal de cada cóndilo femoral medial. En 6 animales, los defectos derechos recibirán la OP-1 a dosis alta encapsulada en PLGA. El miembro izquierdo de todos los animales recibirá la matriz de colágeno más CMC para servir como control. Los 6 perros restantes reciben OP-1 a dosis baja encapsulada en PLGA en el lado derecho y un control en el lado izquierdo. Los animales se sacrifican a las 16 semanas después de la implantación. Durante el sacrificio, los fémures distales se recuperan en bloque y los sitios de defecto se evalúan histológica y groseramente basándose en el esquema de Moran et al., J. Bone Joint Surg. 74B, pp. 659-667 (1992).

Utilizando técnicas asépticas estándar, se realiza la cirugía bajo anestesia con gas isofluorano y los animales se monitorizan por electrocardiograma y monitores del ritmo cardíaco. La medicación prequirúrgica se administra aproximadamente 20-30 minutos después de la inducción de la anestesia. La medicación prequirúrgica consistirá en tartrato de butorfanol (0,05 mg/kg de peso corporal).

La anestesia se administra por inyección intravenosa de pentotal sodio (17,5 mg/kg de peso corporal). Después de la inducción, se coloca un tubo endotraqueal y se mantiene la anestesia por inhalación de isofluorano. La cirugía se realiza practicando una incisión pararrotuliana medial de aproximadamente 4 cm de longitud. La rótula se retrae lateralmente para dejar al descubierto el cóndilo femoral. En el cóndilo medial derecho, se crea un defecto de 5,0 mm de diámetro que se extiende a través de la estructura de cartílago y penetra en el hueso subcondral hasta una profundidad de 6 mm, con una barrena de taladro especialmente diseñada o modificada de 5,0 mm. Después de irrigación copiosa con solución salina para eliminar los residuos óseos y las células medulares esparcidas, se rellena la concentración apropiada de OP-1 encapsulada en PLGA en cada sitio de defecto con una sonda roma y manualmente. Se introduce una cantidad suficiente de OP-1 en el interior del defecto a fin de que el mismo quede enrasado con la superficie de la articulación. Mientras se protege el material implantado, la articulación se irriga para eliminar cualquier implante no colocado en el interior de los defectos. La cápsula de la articulación y los tejidos blandos se cierran luego meticulosamente en capas con sutura reabsorbible. El procedimiento se repite en el lado contralateral, con colocación de un control.

Se administra subcutáneamente tartrato de butorfanol (0,05 mg/kg de peso corporal) en caso requerido. Se administran a los animales antibióticos intramusculares durante cuatro días después de la cirugía y se toman radiografías antero-posteriores rutinarias inmediatamente después de la cirugía para asegurar una colocación quirúrgica apropiada. Los animales se mantienen en jaulas de recuperación de 3 x 4 pies (0,91 x 1,22 m) hasta que el animal es capaz de tolerar el soporte de su propio peso. A continuación, se transfieren los animales a corrales y se deja que se muevan sin restricción.

Se obtienen radiografías de los miembros traseros preoperatoriamente, inmediatamente después de la operación, y al cabo de 16 semanas (sacrificio). Las radiografías preoperatorias se utilizan para asegurar que no estaban presentes anormalidades preexistentes, y para comprobar la madurez del esqueleto. Se utilizan radiografías postoperatorias para evaluar la ubicación de los defectos. Se utilizan las radiografías del sacrificio para evaluar la tasa de curación y es restablecimiento del hueso subcondral y la superficie de articulación. Las radiografías se obtienen al cabo de una semana de la fecha de evaluación.

En el momento apropiado, los animales se sacrifican utilizando una sobredosis de barbiturato intravenoso. Los fémures distales se recogen inmediatamente en bloque y se guardan en toallas impregnadas en solución salina, se introducen en bolsas de plástico marcadas con el número del animal, la designación derecha o izquierda, y cualesquiera otros identificadores necesarios. Se toman fotografías de alta potencia de los sitios de defecto y se marcan cuidadosamente. Antes del sacrificio, se extrae sangre venosa para recuento rutinario de la sangre con diferencial de células. Los tejidos blandos se disecan meticulosamente apartándolos del sitio del defecto. El extremo proximal del fémur se retira. Todos los especímenes se preparan para evaluación histológica inmediatamente después de la clasificación grosera y fotografía. Se aísla cada sitio de defecto en una sierra de diamante refrigerada por agua.

El aspecto grosero de los sitios de defecto y el tejido de reparación se clasifica basándose en el estudio de Moran et al., supra. Los puntos se asignan de acuerdo con la presencia de adhesiones intraarticulares, restablecimiento de la superficie articular, erosión del cartílago y aspecto del cartílago.

Los especímenes individuales se fijan por inmersión en solución de paraformaldehído al 4% y se preparan para procesamiento histológico descalcificado, se cortan de cada bloque 3 secciones de 3 niveles. Los niveles 1 y 3 están más próximos al perímetro del defecto. El nivel 2 está localizado en el centro del defecto. Tres secciones de cada nivel pueden teñirse con azul de toluidina y safranina O, y verde fijo. Las secciones se clasifican basándose en el esquema de Moran et al., supra. Este análisis aporta puntos basándose en la naturaleza del tejido de reparación, las características estructurales, y los cambios celulares. Las estadísticas descriptivas se calculan para los parámetros groseros e histológicos.

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<110> Stryker Corporation et. al

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<120> GRÁNULOS POROSOS DE FOSFATO TRICÁLCICO BETA Y MÉTODOS PARA PRODUCCIÓN DE LOS MISMOS

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<130> STK-8 PCT

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<140> No asignado

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<141> Conjuntamente con este documento

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<150> 09/798,518,

\hskip1cm

09/960,789

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<160> 2001-03-02,

\hskip1cm

2001-09-21

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 431

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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15

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16

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<210> 2

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia sintética de Aminoácidos

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<400> 2

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17

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<210> 3

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia sintética de Aminoácidos

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<400> 3

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18

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<210> 4

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<211> 102

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<212> RPT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: OPX

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(102)

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<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se define en la memoria descriptiva

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 97

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia genérica 7

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<222> (1)..(97)

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<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se define en la memoria descriptiva

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<400> 5

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21

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<210> 6

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia genérica 8

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<222> (1)..(102)

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<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se define en la memoria descriptiva

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<400> 6

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22

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<210> 7

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<211> 97

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia genérica 9

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<222> (1)..(97)

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<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se define en la memoria descriptiva

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia genérica 10

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(102)

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<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se define en la memoria descriptiva

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<400> 8

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<210> 9

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de consenso

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (2)..(5)

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<223> Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como se define en la memoria descriptiva

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<400> 9

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25

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<210> 10

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<211> 1822

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (49)..(1341)

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<400> 10

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26

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27

\hskip0,8cm

28

Claims (73)

1. Un \beta-TCP poroso que comprende un cuerpo poroso de gránulos de fosfato tricálcico beta que tienen un tamaño de partícula de 0,1-2 mm, comprendiendo dicho cuerpo poroso una multiplicidad de poros que tienen un tamaño de diámetro de poro de 20-500 \mum, 410-460 \mum, 40-190 \mum, 20-95 \mum o 50-125 \mum, y que son huecos separados individuales tabicados por paredes y que no están interconectados.

2. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 1, en donde el fosfato tricálcico beta está sinterizado.

3. El \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el \beta-TCP es granular y tiene un tamaño de partícula de 0,5-1,7 mm, 1-1,7 mm o 0,5-1,0 mm.

4. El \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la porosidad total está comprendida en el intervalo de 5-80%, 40-80% o 65-75%.

5. El \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la porosidad total es del 70%.

6. El \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente un agente bioactivo.

7. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 6, en donde el agente bioactivo es una proteína morfogénica ósea.

8. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 7, en donde la proteína morfogénica ósea se selecciona del grupo constituido por OP-1, OP-2, OP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16, BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, MP121, dorsalin-1, DPP, Vg-1, Vgr-1, proteína 60A, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL, TGF-\beta y variantes de secuencias conservadoras de aminoácidos de las mismas que tienen actividad osteogénica.

9. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 6, en donde el agente bioactivo es una proteína osteogénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con los 102-106 aminoácidos C-terminales de OP-1 humana.

10. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un factor estimulante de proteínas morfogénicas.

11. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 10, en donde el factor estimulante de proteínas morfogénicas se selecciona del grupo constituido por factor de crecimiento I afín a la insulina (IGF-I), estradiol, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), hormona del crecimiento (GH), factor de crecimiento y diferenciación (GDF), hidrocortisona (HC), insulina, progesterona, hormona paratiroidea (PTH), vitamina D, ácido retinoico e IL-6.

12. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 6, en donde el agente bioactivo es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína morfogénica ósea.

13. El \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 6-12, en donde el agente bioactivo está encapsulado en un agente biodegradable.

14. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 13, en donde el agente biodegradable se selecciona del grupo constituido por etileno-acetato de vinilo, colágeno natural y sintético, poli(glaxanona), poli(fosfacenos), poliglactina, ácido poligláctico, ácido polialdónico, ácidos poliacrílicos, polialcanoatos, poliortoésteres, poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida) (PDLLA), poliglicolida (PGA), poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), poli(\zeta-caprolactona), poli(trimetilen-carbonato), poli(p-dioxanona), poli(\zeta-caprolactona-co-glicolida), poli-(glicolida-co-trimetilen-carbonato), poli(D,L-lactida-co-trimetilen-carbonato), poliarilatos, poli-hidroxibutirato (PHB), polianhídridos, poli(anhídrido-co-imida) y copolímeros de los mismos, polímeros de aminoácidos, propileno-co-fumaratos, un polímero de uno o más monómeros de ácidos \alpha-hidroxi-carboxílicos, composiciones bioactivas de vidrio, mezclas de las mismas y cualesquiera derivados y modificaciones de los mismos.

15. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 14, en donde la PLGA tiene un peso molecular de 5 kD a 500 kD o 10 kD a 30 kD.

16. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 6, en donde el agente bioactivo es un aloinjerto o autoinjerto.

17. Una composición de masilla moldeable que comprende el \beta-TCP poroso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un aglomerante.

18. La composición de masilla moldeable de la reivindicación 17, en donde el aglomerante se selecciona del grupo constituido por alginato de sodio, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, gelatina, colágeno, péptidos, mucina, sulfato de condroitina, quitosano, poloxámero, glucosaminoglucano, polisacárido, polietilenglicol, metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa sódica, carboxi-metilcelulosa cálcica, hidroxipropil-metilcelulosa, hidroxibutil-metilcelulosa, hidroxietil-metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietil-celulosa, hidroxietil-celulosa, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, ácido polihidroxibutírico, ácido polimálico, ácido poliglucámico, polilactona, manitol, petrolatum blanco, combinaciones manitol/dextrano, combinaciones manitol/petrolatum blanco, aceite de sésamo, cola de fibrina y mezclas de los mismos.

19. La composición de masilla moldeable de la reivindicación 18, en donde la cola de fibrina es una mezcla de fibrinógeno y trombina humanos.

20. La composición de masilla moldeable de la reivindicación 17, que comprende adicionalmente un agente bioactivo.

21. Un kit que comprende:

a)

el \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y

b)

un agente bioactivo.

22. El kit de la reivindicación 21, en donde el agente bioactivo es una proteína morfogénica ósea.

23. El kit de la reivindicación 22, en donde la proteína morfogénica ósea se selecciona del grupo constituido por OP-1, OP-2, OP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16, BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, MP121, dorsalin-1, DPP, Vg-1, Vgr-1, proteína 60A, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL, TGF-\beta y variantes de secuencias conservadoras de aminoácidos de las mismas que tienen actividad osteogénica.

24. El kit de la reivindicación 21, en donde el agente bioactivo es una proteína osteogénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con los 102-106 aminoácidos C-terminales de OP-1 humana.

25. El kit de la reivindicación 22 que comprende adicionalmente un factor estimulante de proteínas morfogénicas.

26. El kit de la reivindicación 25, en donde el factor estimulante de proteínas morfogénicas se selecciona del grupo constituido por factor I de crecimiento semejante a la insulina (IGF-I), estradiol, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), hormona del crecimiento (GH), factor de crecimiento y diferenciación (GDF), hidrocortisona (HC), insulina, progesterona, hormona paratiroidea (PTH), vitamina D, ácido retinoico e IL-6.

27. Un kit que comprende:

a)

el \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y

b)

un aglomerante.

28. El kit de la reivindicación 27, en donde el aglomerante se selecciona del grupo constituido por alginato de sodio, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, gelatina, colágeno, péptidos, mucina, sulfato de condroitina, quitosano, poloxámero, glucosaminoglucano, polisacárido, polietilenglicol, metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa sódica, carboxi-metilcelulosa cálcica, hidroxipropil-metilcelulosa, hidroxibutil-metilcelulosa, hidroxietil-metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietil-celulosa, hidroxietil-celulosa, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, ácido polihidroxibutírico, ácido polimálico, ácido poliglutámico, polilactona, manitol, petrolatum blanco, combinaciones manitol/dextrano, combinaciones manitol/petrolatum blanco, aceite de sésamo, cola de fibrina y mezclas de los mismos.

29. El kit de la reivindicación 28, en donde la cola de fibrina es una mezcla de fibrinógeno y trombina humanos.

30. Un dispositivo protésico implantable que comprende:

a) un implante protésico que tiene una región superficial implantable adyacente a un tejido diana; y

b) el \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 dispuesto en la región superficial.

31. El dispositivo protésico de la reivindicación 30 que comprende adicionalmente un agente bioactivo dispersado en el \beta-TCP poroso.

32. El dispositivo protésico de la reivindicación 31, en donde el agente bioactivo es una proteína morfogénica
ósea.

33. El dispositivo protésico de la reivindicación 32, en donde la proteína morfogénica ósea se selecciona del grupo constituido por OP-1, OP-2, OP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16, BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, MP121, dorsalin-1, DPP, Vg-1, Vgr-1, proteína 60A, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL, TGF-\beta y variantes de secuencias conservadoras de aminoácidos de las mismas que tienen actividad osteogénica.

34. El dispositivo protésico de la reivindicación 31, en donde el agente bioactivo es una proteína osteogénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con los 102-106 aminoácidos C-terminales de OP-1 humana.

35. El dispositivo protésico de la reivindicación 32, que comprende adicionalmente un factor estimulante de las proteínas morfogénicas.

36. El dispositivo protésico de la reivindicación 35, en donde el factor estimulante de proteínas morfogénicas se selecciona del grupo constituido por el factor I de crecimiento afín a la insulina (IGF-I), estradiol, factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), hormona del crecimiento (GH), factor de crecimiento y diferenciación (GDP), hidrocortisona (HC), insulina, progesterona, hormona paratiroidea (PTH), vitamina D, ácido retinoico e IL-6.

37. El dispositivo protésico de la reivindicación 31, en donde el agente bioactivo es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de codifica una proteína morfogénica ósea.

38. El dispositivo protésico de la reivindicación 31, en donde el agente bioactivo está encapsulado en un agente biodegradable.

39. El dispositivo protésico de la reivindicación 30, en donde el dispositivo se selecciona del grupo constituido por un dispositivo de cadera, una estructura de fusión y un dispositivo maxilofacial.

40. El dispositivo protésico de la reivindicación 30, que comprende adicionalmente un aglomerante.

41. El dispositivo protésico de la reivindicación 40, en donde el aglomerante se selecciona del grupo constituido por alginato de sodio, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, gelatina, colágeno, péptidos, mucina, sulfato de condroitina, quitosano, poloxámero, glucosaminoglucano, polisacárido, polietilenglicol, metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa, carboxi-metilcelulosa sódica, carboxi-metilcelulosa cálcica, hidroxipropil-metilcelulosa, hidroxibutil-metilcelulosa, hidroxietil-metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietil-celulosa, hidroxietil-celulosa, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, co-polímeros de ácido poliláctico y ácido poliglicólico, ácido polihidroxibutírico, ácido polimálico, ácido poliglutámico, polilactona, manitol, petrolatum blanco, combinaciones manitol/dextrano, combinaciones manitol/petrolatum blanco, aceite de sésamo, cola de fibrina y mezclas de los mismos.

42. El dispositivo protésico de la reivindicación 41, en donde la cola de fibrina es una mezcla de fibrinógeno y trombina humanos.

43. Un método de producción de gránulos de \beta-TCP poroso que comprende un cuerpo poroso de gránulos de fosfato tricálcico beta que tienen un tamaño de partícula de 0,1-2 mm, comprendiendo dicho cuerpo poroso una multiplicidad de poros, en donde los poros son huecos separados que tienen un tamaño de diámetro de poro de 20-500 \mum, individuales 410-460 \mum, 40-190 \mum, 20-95 \mum o 50-125 \mum y que son huecos individuales separados tabicados por paredes y que no están interconectados, que comprende los pasos de:

a) mezclar un polvo de TCP con un agente formador de poros;

b) añadir una solución de granulación para formar una masa desmenuzable;

c) hacer pasar la masa desmenuzable a través de un tamiz para formar gránulos; y

d) sinterizar los gránulos para formar \beta-TCP poroso.

44. El método de la reivindicación 43, en donde la proporción de agente formador de poros es 37,5% en peso.

45. El método de la reivindicación 43,

en donde el tamiz está comprendido en el intervalo de tamaño de 500-1000 \mum o 1000-1700 \mum.

46. El método de la reivindicación 43, en donde después del paso c) y antes del paso d) los gránulos se vaporizan a 700-800ºC.

47. El método de la reivindicación 43, en donde los gránulos se sinterizan a 1000-1200ºC y seguido por un paso de enfriamiento lento para formar \beta-TCP poroso.

48. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, en donde el agente formador de poros se selecciona del grupo constituido por prepolímeros de poliacrilatos, polimetacrilatos, poli(metacrilato de metilo), copolímeros de acrilato de metilo y metacrilato de metilo, poliestireno, polietilenglicol, celulosa cristalina, celulosa fibrosa, poliuretanos, polietilenos, resinas de nailon y resinas acrílicas.

49. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, en donde la solución de granulación comprende un compuesto seleccionado del grupo constituido por polivinilpirrolidona, almidón, gelatina, poli(alcohol vinílico), poli(óxido de etileno), hidroxietil-celulosas, polivinilbutiral y acetato-butirato de celulosa.

50. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, en donde el \beta-TCP poroso se tamiza de nuevo después de su formación.

51. Una composición que comprende polvo de fosfato tricálcico y un agente formador de poros,

en donde el agente formador de poros tiene un diámetro de 20-500 \mum, 410-460 \mum, 40-190 \mum, 20-95 \mum o 50-125 \mum, y

en donde el polvo de fosfato tricálcico comprende un \beta-TCP poroso que comprende un cuerpo poroso de gránulos de fosfato tricálcico beta que tienen un tamaño de partícula de 0,1-2 mm, comprendiendo dicho cuerpo poroso una multiplicidad de poros que tienen un tamaño de diámetro de poro de 20-500 \mum, 410-460 \mum, 40-190 \mum, 20-95 \mum o 50-125 \mum y que son huecos individuales separados tabicados por paredes y que no están interconecta-
dos.

52. La composición de la reivindicación 51, en donde la proporción de agente formador de poros es 30-40% en peso.

53. Uso de un \beta-TCP poroso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de una composición para inducir la formación de hueso en un mamífero.

54. Uso de la reivindicación 53, en donde la composición comprende adicionalmente un agente bioactivo.

55. Uso de la reivindicación 54, en donde el agente bioactivo es una proteína morfogénica ósea.

56. Uso de una cualquiera de las reivindicaciones 53-55, en donde la composición comprende adicionalmente un aglomerante.

57. Uso de una composición que comprende el \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un agente bioactivo para la preparación de un implante para suministrar un agente bioactivo en un sitio que requiere formación de hueso.

58. Uso de la reivindicación 57, en donde el agente bioactivo es una proteína morfogénica ósea.

59. Uso de la reivindicación 57 ó 58, en donde el agente bioactivo está encapsulado en un agente biodegrada-
ble.

60. Uso de la reivindicación 59, en donde el suministro del agente bioactivo es de liberación sostenida.

61. Uso de la reivindicación 57, en donde el agente bioactivo es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína morfogénica ósea.

62. Uso de una composición que comprende:

un \beta-TCP poroso que comprende un cuerpo poroso de gránulos de fosfato tricálcico beta que tienen un tamaño de partícula de 0,1-2 mm, comprendiendo dicho cuerpo poroso una multiplicidad de poros que tienen un tamaño de diámetro de poro de 20-500 \mum, 410-460 \mum, 40-190 \mum, 20-95 \mum o 50-125 \mum y que son huecos individuales separados tabicados por paredes y que no están interconectados;

un agente bioactivo; y

un agente biodegradable que tiene un tamaño de partícula de 20-500 \mum,

en donde el agente bioactivo está encapsulado en el agente biodegradable para la preparación de un implante para suministrar un agente bioactivo en un sitio que requiere formación de cartílago.

63. Una composición que comprende:

un \beta-TCP poroso que comprende: un cuerpo poroso de gránulos de fosfato tricálcico beta que tienen un tamaño de partícula de 0,1-2 mm, comprendiendo dicho cuerpo poroso una multiplicidad de poros que tienen un tamaño de diámetro de poro de 20-500 \mum, 410-460 \mum, 40-190 \mum, 20-95 \mum o 50-125 \mum y que son huecos individuales separados tabicados por paredes y que no están interconectados;

un agente bioactivo; y

un agente biodegradable,

en donde el agente bioactivo está encapsulado en el agente biodegradable, y en donde el agente biodegradable tiene un tamaño de partícula de 20-500 \mum, 20-140 \mum, o 75-140 \mum.

64. El dispositivo protésico de la reivindicación 38, o la composición de la reivindicación 63, en donde el agente biodegradable se selecciona del grupo constituido por etileno-acetato de vinilo, colágeno natural y sintético, poli(glaxanona), poli(fosfacenos), poliglactina, ácido poligláctico, ácido polialdónico, ácidos poliacrílicos, polialcanoatos, poliortoésteres, poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida) (PDLLA), poliglicolida (POA), poli(lactida-co-glicosida) (PLGA), poli(\zeta-caprolactona), poli(trimetilen-carbonato), poli(p-dioxanona), poli(\zeta-caprolactona-co-glicolida), poli-(glicolida-co-trimetilen-carbonato), poli(D,L-lactida-co-trimetilen-carbonato), poliarilatos, poli-hidroxibutirato (PHB), polianhídridos, poli(anhídrido-co-imida) y copolímeros de los mismos, polímeros de aminoácidos, propileno-co-fumaratos, un polímero de uno o más monómeros de ácidos \alpha-hidroxi-carboxílicos, composiciones bioactivas de vidrio, mezclas de las mismas y cualesquiera derivados y modificaciones de los mismos.

65. La composición o el dispositivo de la reivindicación 64, en donde el PLGA tiene un peso molecular de 5 kD a 500 kD, o 10 kD a 30 kD.

66. Un \beta-TCP poroso que comprende un cuerpo poroso de gránulos de fosfato tricálcico beta que tienen un tamaño de partícula de 0,1-2 mm, comprendiendo dicho cuerpo poroso una multiplicidad de poros que tienen un tamaño de diámetro de poro de 20-500 \mum, seleccionados de 410-460 \mum, 40-190 \mum, 20-95 \mum o 50-125 \mum y que son huecos individuales separados tabicados por paredes y que no están interconectados, que puede obtenerse por:

a) mezcla de un polvo de TCP con un agente formador de poros;

b) adición de una solución de granulación para formar una masa desmenuzable;

c) paso de la masa desmenuzable a través de un tamiz para formar gránulos; y

d) sinterización de los gránulos para formar \beta-TCP poroso.

67. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 66, en donde la proporción de agente formador de poros es 37,5% en peso.

68. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 66, en donde el tamiz está comprendido en el intervalo de tamaños de 500-1000 \mum o 1000-1700 \mum.

69. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 66, en donde a continuación del paso c) y antes del paso d) los gránulos se vaporizan a 700-800ºC.

70. El \beta-TCP poroso de la reivindicación 66, en donde los gránulos se sinterizan a 1000-1200ºC y seguido por un paso de enfriamiento lento para formar \beta-TCP poroso.

71. El \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 66 a 70, en donde el agente formador de poros se selecciona del grupo constituido por prepolímeros de poliacrilatos, polimetacrilatos, poli(metacrilato de metilo), copolímeros de acrilato de metilo y metacrilato de metilo, poliestireno, polietilenglicol, celulosa cristalina, celulosa fibrosa, poliuretanos, polietilenos, resinas de nailon y resinas acrílicas.

72. El \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 66 a 70, en donde la solución de granulación comprende un compuesto seleccionado del grupo constituido por polivinilpirrolidona, almidón, gelatina, poli(alcohol vinílico), poli(óxido de etileno), hidroxietil-celulosas, polivinilbutiral y acetato-butirato de celulosa.

73. El \beta-TCP poroso de una cualquiera de las reivindicaciones 66 a 70, en donde el \beta-TCP poroso se tamiza de nuevo después de su formación.