ES2321212T3 - Vectores alfavirus derivados de tc-83, particulas y metodos antecentes de la invencion. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar Partículas de replicón alfavírica del virus de encefalitis equina Venezolana, dicho método comprende las etapas de: (a) introducir un ácido nucleico replicón alfavírico en una célula anfitriona, dicho ácido nucleico replicón alfavírico comprende (i) una secuencia 5'' TC-83 de cepa de encefalitis equina Venezolana que inicia transcripción de ARN de alfavirus, (ii) una o más secuencias de nucleótido que juntas codifican aquellas proteínas no estructurales de alfavirus TC-83 necesario para la replicación del ARN replicón, (iii) una señal de empaque de virus, (iv) por lo menos un heterólogo que codifica o secuencias funcionales que se puede expresar en dicho ácido nucleico de replicón alfavírico, y (v) una secuencia de reconocimiento de polimerasa de ARN 3'' de TC- 83 de cepa de encefalitis equina Venezolana, en donde dicha célula anfitriona comprende por lo menos una función auxiliar que codifica una proteína de cápsido TC-83 y glucoproteínas TC-83, para producir una célula anfitriona modificada; (b) cultivar dicha célula anfitriona modificada bajo condiciones que permiten la expresión de por lo menos una función auxiliar, que permite la replicación de dicho ácido nucleico replicón alfavírico y empaque de dicho ácido nucleico replicón alfavírico para formar partículas de replicón alfavírico.

Description

Vectores alfavirus derivados de TC-83, partículas y métodos.

Antecedente de la invención

La presente invención se relaciona con tecnología de ADN recombinante, y en particular con la introducción de ácido nucleico externo en una célula eucariótica, y más particularmente con composiciones y métodos para producir partículas de replicón alfavírico útiles en inmunoterapias y/o aplicaciones de terapias de gen. En particular, la presente invención describe un antecedente genético para el sistema de partícula de replicón alfavírico que se basa en la cepa de vacuna del virus de encefalitis equina Venezolana (VEE), TC-83.

Una variedad de virus se incluye en el género alfavirus, que es un miembro de la familia Togaviridae. El genoma alfavírico es un ARN de sentido mensajero monocatenario, modificado en el extremo 5' con una tapa metilada y en el extremo 3' con un tracto poli (A) de longitud variable. Las subunidades estructurales que contienen una proteína vírica única, cápsido, se asocian con el genoma de ARN en un nucleocápsido icosahédrico. En el virión, el nucleocápsido está rodeado por una cubierta de lípido con un arreglo regular de añadidos de proteína de transmembrana, cada uno de los cuales consiste de tres complejos heterodiméricos de dos glucoproteínas, E1 y E2. Ver Paredes et al., (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:9095-9099. Los virus Sindbis y Semliki Forest consideran el alfavirus prototípico y se han estudiado extensivamente. Ver Schlesinger, The Togaviridae and Flaviviridae, Plenum Publishing Corp., New York (1986). El virus VEE también se ha estudiado extensivamente, ver, por ejemplo, Patente U.S. Nos. 5,185,440, 5,505,947, y 5,643,736.

El uso de partículas de alfavirus de propagación defectuosa, denominadas partículas de replicón alfavíricas, han mostrado ser promisorias como un sistema de suministro de vector vírico. Los replicones se construyen para llevar a cabo uno o más antígenos heterólogos en lugar de algunos o todos los genes estructurales de alfavirus. Los replicones se introducen en células permisivas de alfavirus junto con una construcción auxiliar que expresa la proteína (s) estructural vírica no codificada mediante el replicón o, alternativamente, el replicón se introduce en una célula de empaque capaz de expresar las proteínas estructurales. El replicón luego se empaca, análogo al empaque del genoma alfavírico intacto, mediante las proteínas estructurales expresadas. Estos replicones empacados, o partículas de replicón alfavíricas, se inoculan luego en un animal. Las partículas entran en la célula anfitriona, y los replicones luego expresan la codificación heteróloga introducida u otras secuencias funcionales en niveles muy altos del mARN subgenómico. Se evita que la progenia vírica posterior se ensamble en razón a que los replicones no codifican todos los genes de empaque vírico esencial (estructural).

El antecedente genético alfavírico para el replicón y las proteínas estructurales alfavíricas utilizadas para empacar el replicón tienen un impacto significativo en el desarrollo final de las partículas de replicón. El virus VEE se ha preferido como un vector de vacuna entre el alfavirus debido a su naturaleza linfotrófica, que conduce a respuestas inmunes humorales y celulares fuertes en dosis de inmunización relativamente bajas (Davis, NL et al. (1996) J. Virol. 70(6): 3781-7; MacDonald, GH y Johnston RE, (2000) J. Virol. 74(2): 914-922; Caley IJ et al. (1997) J. Virol. 71: 3031-3038; Hevey M et al. (1998) Virology 251 (1): 28-37; Caley IJ et al. (1999) Vaccine 17:23-24; Pushko, P et al. (2001) Vaccine 19:142-153).

Se conocen varias cepas del virus de encefalitis equina Venezolana (VEE), y dentro de aquellas cepas, se han reconocido subtipos. Las cepas VVE virulentas se han aislado durante encefalomielitis epidémica producida por mosquitos en équidos en áreas tropicales y sub-tropicales del Nuevo Mundo. Una de las cepas epizooticas más virulentas, la cepa Trinidad Donkey (TRD), que está en el subtipo IA/B, se pasa serialmente en el cultivo de tejido para crear una cepa atenuada viva (Berge et al. (1961) Amer. J. Hyg. 73:209-218) conocida como TC-83. Esta cepa provoca los anticuerpos neutralizantes específicos VEE en la mayoría de los humanos y equinos y se ha utilizado exitosamente como una vacuna en ambas especies (McKinney et al. (1972) "Inactivated and live VEE vaccines - A Review", in Venezuelan Encephalitis, pp. 369-376, Sc. Pub. No. 243 Pan American Health Organization, Washington, D.C.; Walton TE et al. (1972) Am. J. Epidemiol. 95:247- 254; Pittman PR et al. (1996) Vaccine 14(4): 337-343). No obstante, esta vacuna presenta varios problemas en términos de seguridad y eficacia. Primero, esta puede causar reacciones algunas veces moderadamente severas, adversas en vacunas humanas. Segundo, la cepa TC-83 muestra virulencia de murino residual y es letal para el reflejo de succión de los ratones después de inoculación intracerebral (i.e.) o subcutánea (s.c.) (Ludwig G et al. (2001) Am. J. Trop. Med. Hyg. Jan-Feb;64(1-2):49-55). Tercero, la cepa TC-83 tiene un porcentaje significativo de no respuestas en los humanos, es decir, los individuos quienes no muestran una respuesta humoral demostrable después de inoculación (Pittman PR et al. (1996) Vaccine 14(4): 337-343). Finalmente, la cepa TC-83 se conoce por ser especialmente sensible al interferón, como se compara la cepa TRD parenteral u otras cepas epizooticas de VEE (Spotts, DR et al. (1998) J. Virol. 72:10286-10291). Tal sensibilidad mejorada al interferón lo conduciría a uno a esperar que los genes heterólogos en una partícula de replicón se expresen menos eficientemente en una célula infectada y/o que tales partículas sean menos inmunogénicas n vivo. Todos estos factores perjudiciales asociados con la cepa de vacuna TC-83 de VEE han conducido investigaciones previas para buscar cepas mejor atenuadas para utilizarlas como vectores VEE de propagación competente o en sistemas de partícula de replicón (por ejemplo Davis NL et al. (1994) Arch. Virol. Suppl. 9:99-109; Davis NL et al. (1996) J. Virol. 70(6):3781; Pushko et al. (1997) Ibid.; Pratt WD et al. (2003) Vaccine 21 (25-26): 3854-3862).

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La publicación de patente US 2003/0119182 proporciona sistemas de vector replicón alfavírico para producir infecciones, replicación defectuosa, partículas de replicón alfavirus en células que permiten alfavirus. Se abarcan en la invención los ARN replicón mejorados y ácidos nucleicos auxiliares mejorados para expresar las proteínas estructurales de alfavirus. Durante la producción de partículas de alfavirus recombinantes, puede ocurrir la generación de partículas de virus de replicación competente a través de la recombinación sola o a través de una combinación de empaque auxiliar y recombinación. Así, se proporcionan construcciones que eliminan o minimizan la ocurrencia de uno o ambos de estos eventos. Este documento también proporciona métodos para elaborar partículas de alfavirus recombinantes utilizando las construcciones reivindicadas, y composiciones farmacéuticas que comprenden estas partículas de alfavirus recombinantes. Sin embargo, US 2003/0119182 no enseña el uso de proteínas estructurales de virus de encefalitis equina Venezolana TC-83 o ácidos nucleicos en la preparación de sistemas o partículas de vector de replicón alfavirus.

Existe una necesidad continua para optimizar la combinación de mutaciones y cepa de alfavirus para proporcionar la partícula de replicón alfavirus más efectiva para uso en la vacuna y/o aplicaciones de terapias de gen.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona composiciones de partículas de replicón alfavírico altamente inmunogénicas, de replicación defectuosa, inefectivas basadas en un cepa alfavirus particular, es decir, el TC-83 de VEE, y métodos para su preparación. Como se describió previamente (ver, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 5,792,462; 6,156,558; 5,811,407; 6,008,035; 6,583,121; WO 03/023026; Publicación U.S. No. 2003/0119182), partículas de replicón alfavírico funcionales se han hecho de varios alfavirus diferentes y sus quimeras (ver, por ejemplo, Publicación U.S. No 2003/0148262). Estas partículas son útiles en vacunas y aplicaciones de terapias de gen, y las características óptimas de las partículas de replicón alfavírico difieren en estas solicitudes. Por ejemplo, puede ser útil reducir la expresión de proteínas de replicón durante aplicaciones de terapias de gen, y así se han desarrollado técnicas en el arte para reducir tal expresión (ver por ejemplo Patente U.S. Nos. 5,843,723 y 6,451,592). En el caso de aplicaciones de vacuna, maximizar la expresión del ARN heterólogo del replicón, minimizar cualesquier respuestas anti-vector, y objetivar los tejidos y células del sistema inmune son características deseables. El virus de Encefalitis equina Venezolana alfavirus (VEE) y Arbovirus Africano del Sur No. 86 han probado ser útiles particularmente en las aplicaciones de vacuna. Para mejorar la seguridad de estos vectores alfavirus en el evento raro que se genere un virus de replicación competente, por lo menos una mutación de atenuación se ha introducido en los fragmentos genómicos alfavíricos. Los actuales inventores han descubierto ahora que la cepa TC-83 de VEE se puede utilizar como el antecedente genético para un sistema de partícula de replicón alfavirus que proporciona una preparación VEE sorprendentemente efectiva para uso en composiciones inmunogénicas y que tiene otras propiedades sorprendentemente ventajosas útiles en un sistema de vector de vacuna, que incluyen la capacidad de hacer preparaciones purificadas con facilidad.

Los actuales inventores han descubierto que la cepa TC-83 de VEE es una cepa de alfavirus sorprendentemente buena de la que se deriva una partícula de vacuna de replicón. Se publica una secuencia completa de la secuencia TC-83 (Kinney RM et al. (1989) Virology 170:19-30; con la corrección anotada en Kinney RM et al. (1993) J. Virol. 67(3): 1269-1277). El genoma de esta vacuna atenuada viva tiene 12 diferencias de la cepa parenteral virulenta de la que se deriva. Estas mutaciones son: una sustitución de nucleótido única (G \rightarrow A) en el nucleótido 3 de la región que no codifica 5'; sustituciones de aminoácido en nsP2-16 (Ala\rightarrowAsp), nsP3-260 (Ser\rightarrowThr), E2-7 (Lys\rightarrowAsn), E2-85 (His\rightarrowTyr), E2-120 (Thr\rightarrowArg), E2-192 (Val\rightarrowAsp), E2-296 (Thr\rightarrowIle), y E1-161 (Leu\rightarrowIle); sustituciones de nucleótido silenciosas 2 en E2-278 (U\rightarrowC) y E1-211 (A\rightarrowU), y una eliminación de nucleótido única 11,405 en la región que no codifica 3' (UU\rightarrowU). Kinney et al. 1993 Ibid. Han sugerido que el fenotipo atenuado de la cepa TC-83 viva (es decir neurovirulencia reducida en ratones) se debe a la mutación del nucleótido 3 (G a A) y las mutaciones E2, particularmente la mutación E2-120. Se ha mostrado que la mutación del nucleótido 3, cuando se introduce en una cepa tipo intacto de VEE, atenúa la cepa (White LJ et al. (2001) J. Virol 75: 3706-3718). Sin embargo, los métodos utilizados no excluyen contribuciones de otras mutaciones, y la existencia de numerosas otras mutaciones no conservadoras en el genoma TC-83 hace imposible predecir si puede servir como un antecedente genético efectivo para el sistema de partícula de replicón.

Los inventores ahora han producido una vacuna de partícula de replicón basada en la cepa TC-83, y tiene varias características sorprendentemente ventajosas para aplicaciones de terapias de gen y vacunas que incluyen, pero no se limitan a, rendimientos mucho mayores comparado con aquellos alcanzados con partículas basadas en VEE tipo intacto o en aquellos que llevan otras mutaciones atenuantes; respuestas anti-vector reducidas; pureza incrementada; excelente inmunogenicidad que es comparable con otras cepas VEE que llevan solo una, dos o tres mutaciones atenuantes, y sensibilidad, en contraste con la falta de sensibilidad notada de animales para la cepa TC-83 viva utilizada como una vacuna.

Adicionalmente, los inventores han descubierto que empacar un replicón alfavirus en las proteínas estructurales VEETC83 resulta en rendimientos significativamente mayores de vacunas de partícula de replicón de los cultivos celulares. Así, las proteínas estructurales VEETC83 se pueden utilizar ventajosamente para empacar replicones de otros alfavirus, que incluyen otras cepas de VEE.

Así, la presente invención proporciona una partícula de alfavirus recombinante que comprende (i) un ARN replicón alfavirus que codifica una o más secuencias de ARN heterólogas, en donde el replicón ARN comprende una secuencia 5' que inicia transcripción de alfavirus ARN, una o más secuencias de nucleótido que codifican aquellas proteínas no estructurales alfavirus TC-83 necesarias para la replicación del replicón ARN, unos medios para expresar el polipéptido codificado por el ARN heterólogo, y una secuencia de reconocimiento de polimerasa 3' ARN, (ii) una proteína cápsida derivada de TC-83; y (iii) glucoproteínas alfavirus derivadas de TC-83.

La presente invención también proporciona otras cepas de vacuna VEE, especialmente aquellas con características similares a aquellas de TC-83, que se pueden construir con ingeniería para uso en composiciones inmunogénicas de partícula de replicón.

También se proporciona una población de partículas de alfavirus de propagación defectuosa infecciosas, en donde la población comprende partículas replicón que comprenden un ARN replicón VEE TC- 83 que comprende una señal de empaque de alfavirus, una o más secuencias de ARN heterólogas que codifican un ácido nucleico de interés y que carece de secuencias que codifican las proteínas estructurales de alfavirus, y en donde la población contiene no más de 10 partículas víricas TC-83 de replicación competente por 10^{8} partículas replicón TC-83. También se proporciona una composición que comprende una población de partículas de alfavirus de propagación defectuosa infecciosas en donde (1) cada partícula comprende un ARN replicón alfavirus que codifica una o más secuencias de ARN heterólogas y que carece de secuencias que codifican cualesquier proteínas estructurales de alfavirus, (2) la población no tiene virus competentes de replicación detectable (RCV), según se mide por el paso en los cultivos celulares, (3) el replicón ARN se deriva de TC-83, y en donde la población se formula con un portador farmacéuticamente aceptable. Las proteínas estructurales de alfavirus se pueden derivar de la cepa de vacuna alfavirus VEE TC-83, una cepa VEE tipo intacto, u otras cepas de VEE que contienen una o más mutaciones atenuantes en las secuencias genómicas alfavíricas que codifican las proteínas estructurales. En una modalidad específica, las proteínas estructurales TC-83 pueden tener una o más mutaciones atenuantes adicionales introducidas, por ejemplo en E1-81 (por ejemplo de Phe a Ile).

También se proporciona una composición que comprende una población de partículas de alfavirus de propagación defectuosa infecciosas en donde (1) cada partícula comprende un ARN replicón alfavirus que codifica una o más secuencias de ARN heterólogas y que carece de secuencias que codifican cualesquier proteínas estructurales de alfavirus, (2) las proteínas estructurales comprenden el recubrimiento de las partículas que se derivan de VEETC83, y (3) la población no tiene virus competente de replicación detectable (RCV), como se mide por el paso en los cultivos celulares, y en donde la población se formula con un portador farmacéuticamente aceptable. En esta composición, el ARN replicón alfavirus se deriva de una cepa VEE tipo intacto u otras cepas no TC83 de VEE que contienen una o más mutaciones atenuantes en las secuencias genómicas alfavíricas contenidas dentro del replicón. En una modalidad específica, las proteínas estructurales TC-83 pueden tener una o más mutaciones atenuantes adicionales introducidas, por ejemplo en E1-81 (por ejemplo de Phe a Ile).

También se proporciona un método para producir una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que comprende una población de partículas de alfavirus de propagación defectuosa infecciosas en un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la composición comprende partículas que comprenden un ARN replicón VEE TC-83 que comprende una señal de empaque de alfavirus, una o más secuencias de ARN heterólogas que codifican un inmunógeno y que carecen de secuencias que codifican las proteínas estructurales de alfavirus, y en donde la composición tiene menos de 10 partículas TC-83 de replicación competente por 10^{8} partículas de replicón TC-83.

También se proporciona una célula auxiliar para producir una partícula de alfavirus de propagación defectuosa que comprende (1) un ARN replicón VEETC83 que comprende una secuencia de ARN heteróloga, por ejemplo, una secuencia heteróloga que codifica al virus, y que carece de secuencias que codifican las proteínas estructurales de alfavirus; y (2) uno o más ácidos nucleicos que codifican las proteínas estructurales TC-83. Alternativamente las proteínas estructurales se pueden seleccionar del grupo que consiste de glucoproteínas estructurales VEE tipo intacto, glucoproteínas estructurales VEE 3014, glucoproteínas VEE 3040, glucoproteínas VEE 3042, y glucoproteínas VEE 3526, pero preferiblemente de entre glucoproteínas estructurales VEE que contienen sustituciones de ácido nucleico que confieren virulencia atenuada, y el cápsido VEE se produce a partir de la secuencia tipo intacto o de una secuencia en la que se ha eliminado el sitio de división auto-proteolítico.

También se proporciona una célula auxiliar para producir una partícula de alfavirus de propagación defectuosa que comprende (1) un ARN replicón alfavirus que comprende una secuencia de ARN heteróloga, por ejemplo, una secuencia heteróloga que codifica al virus, y que carece de secuencias que codifican las proteínas estructurales de alfavirus; y (2) uno o más ácidos nucleicos que codifican las proteínas estructurales TC-83.

La presente invención proporciona adicionalmente un método para producir partículas de replicón TC-83 de propagación defectuosa infecciosas que comprenden introducir en una población de células una molécula de ADN recombinante que codifica todas las proteínas estructurales VEE, y un replicón ARN TC-83 que codifica por lo menos un ARN heterólogo, de tal manera que se producen partículas de replicón TC-83 de propagación defectuosa infecciosas, y en donde las glucoproteínas estructurales VEE se derivan de una de las siguientes cepas VEE: TC-83, 3014, 3040, 3042 y 3526. Estas cepas se refieren aquí como VEETC83, VEE3014, etc.

También se proporciona un método para producir partículas de replicón alfavírico de propagación defectuosa infecciosas que comprenden introducir en una población de células una molécula de ADN recombinante que codifica todas las proteínas estructurales VEETC83, y un ARN replicón alfavirus que codifica por lo menos un ARN heterólogo, de tal manera que se producen partículas de replicón de propagación defectuosa infecciosas, y en donde el ARN replicón VEE se deriva de una cepa VEE tipo intacto o incorpora por lo menos una mutación atenuada, tal como la mutación a un A en el nucleótido 3.

Un método para producir partículas de replicón alfavírico de propagación defectuosa infecciosas comprende introducir en una población de células (i) dos moléculas de ácido nucleico recombinante, cada uno de los cuales codifica por lo menos uno, pero no todas las proteínas estructurales VEE y (ii) un ARN replicón TC-83 que codifica por lo menos un ARN heterólogo, en donde las dos moléculas de ácido nucleico recombinante juntos codifican todas las proteínas estructurales VEE requeridas para producir partículas de replicón TC-83 de propagación defectuosa infecciosas en las células, y en donde adicionalmente las proteínas estructurales alfavíricas se derivan de una de las siguientes Cepas VEE: TC-83, 3014, 3040, 3042 y 3526. Estas cepas se refieren típicamente en esta solicitud como "VEETC83", "VEE3014", etc.

También se proporciona un método para proporcionar partículas de replicón TC-83 de propagación defectuosa infecciosas, ventajosamente purificadas mediante cromatografía de afinidad de heparina, mediante métodos de purificación de columna o tanda. Las características de unión a heparina únicas de las partículas de replicón derivadas de TC-83 permiten para la remoción de las proteínas contaminantes y ácidos nucleicos a través de una etapa de purificación única.

También se proporcionan métodos para provocar una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunogénica de la población de partículas de replicón de esta invención.

La presente invención también es aplicable a la producción de vacunas de alfavirus atenuadas vivas, que puede o no puede llevar a cabo genes heterólogos para la expresión en la vacuna, como se describe en la Patente U.S. No. 5,643,576, o vectores alfavirus atenuados vivos que dirigen la expresión de ARN funcionales (tal como los ARN supresores, anticodificantes o ARN interfiriente o ARN que codifican las proteínas terapéuticas. El método de la presente invención comprende las etapas de (a) introducir el ácido nucleico de replicón TC-83 en una célula anfitriona, en donde dicho ácido nucleico de replicón contiene por lo menos una señal de empaque de alfavirus y por lo menos una secuencia codificante para una proteína o ARN funcional de interés expresable en dicho ácido nucleico de replicón alfavírico, en donde la célula anfitriona es capaz de expresar proteínas estructurales de alfavirus requeridas para producir los ARP, para producir una célula anfitriona modificada; (b) cultivar dicha célula anfitriona modificada en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas estructurales y la replicación del ácido nucleico de replicón alfavírico, y luego empaque del ácido nucleico replicón alfavírico para formar ARP; (c), opcionalmente separar las células anfitrionas modificadas del medio, y (d) después de la etapa (b) o (c) poner en contacto las células anfitrionas modificadas con una solución acuosa que tiene una resistencia iónica de por lo menos aproximadamente 0.20 M, deseablemente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5 M, (aquí el "Medio de Liberación") para liberar los ARP en la solución acuosa para producir una solución que contiene ARP. La resistencia iónica del Medio de Liberación se puede alcanzar utilizando sales que no inactivan los viriones o los ARP, y sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de amonio, acetato de amonio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, bicarbonato de amonio, y Flujo Rápido de heparina. Deseablemente el Medio de Liberación comprende un amortiguador con un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, preferiblemente de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5. Cuando las células no se separan del medio, la resistencia iónica del medio puede surgir mediante la adición de sales sólidas o una solución concentrada para proporcionar la resistencia iónica incrementada para liberar los ARP (o viriones) de las células.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el perfil de elusión de Partículas de replicón del virus TC-83 durante cromatografía de afinidad de heparina.

La Figura 2 muestra los resultados de SDS-PAGE de Partículas de replicón del virus TC-83 después de cromatografía de afinidad de heparina, con las proteínas visualizadas al teñir con plata y mediante Western blot utilizando teñido y anticuerpos específicos de glucoproteína y específicos de cápsidos.

La Figura 3 es un mapa de plásmido del vector pVEK de Replicón TC-83.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan la siguiente discusión y definiciones para mejorar la claridad de la presente descripción para una persona medianamente versada en la técnica del arte relevante. En el contexto de la presente solicitud, nm significa nanómetro, ml significa mililitro, VEE significa Virus de Encefalitis Equina Venezolana, EMC significa virus Encefalomiocarditis, BHK significa células de riñón de hámster bebé, HA significa gen hemaglutinina, GFP significa gen de proteína fluorescente verde, N significa nucleocápsido, FACS significa clasificador de células activadas por fluorescencia, IRES significa sitio de entrada de ribosoma interno, y FBS significa Suero Bovino Fetal. La expresión "número de aminoácido E2" (por ejemplo, Lys, Thr, etc.) indica el aminoácido designado en el residuo designado del gen E2, y se utiliza también para referirse a aminoácidos en residuos específicos en el gen E1.

Como se utiliza aquí, el término "alfavirus" tiene su significado convencional en la técnica, e incluye las varias especies tal como VEE, SFV, Sindbis, virus Ross River, Virus de Encefalitis Equina Occidental, Virus de Encefalitis Equina Oriental, Chikungunya, S.A. AR86, virus Everglades, Mucambo, virus Barmah Forest, virus Middelburg, virus Pixuna, virus O'nyong-nyong, virus Getah, virus Sagiyama, virus Bebaru, virus Mayaro, virus Una, virus Aura, virus Whataroa, virus Banbanki, virus Kyzylagach, virus Highlands J, virus Fort Morgan, virus Ndumu, y virus Buggy Creek. El alfavirus preferido utilizado en las construcciones y métodos de la invención reivindicada son VEE, S.A. AR86, Sindbis (por ejemplo TR339, ver Patente U.S. No. 6,008,035), y SFV.

Se emplean "células permisivas de Alfavirus" en los métodos de la presente invención que son células, luego de transfección con un transcripto de ARN vírico completo, son capaces de producir partículas víricas. El alfavirus tiene un amplio rango de anfitriones. Ejemplos de células de empaque adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células Vero, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de fibroblasto de embrión de pollo, DF-1, 293, 293T, Células de Ovario de Hámster Chino (CHO), y células de insectos.

Como se utiliza aquí, las frases "mutación atenuada " y "aminoácido atenuado", significa una mutación de nucleótido (que puede o no puede estar en una región del genoma vírico que codifica los polipéptidos) o un aminoácido codificado por una mutación de nucleótido, que en el contexto de un virus vivo, resulta en una probabilidad reducida del alfavirus originando la enfermedad en su anfitrión (es decir, una pérdida de virulencia), de acuerdo con la terminología estándar en la técnica, Ver, por ejemplo, B. Davis, et al., Microbiology 132 (3d ed. 1980), si la mutación es una mutación de sustitución, o una eliminación en cuadro o mutación de adición. La frase "mutación atenuada" excluye las mutaciones que podría ser letal al virus, a menos que tal una mutación se utiliza en combinación con una mutación "restaurada" que rinde la viabilidad del virus, pero atenuado. Mutaciones atenuadas de ejemplo en las proteínas estructurales VEE incluyen, pero no se limitan a, aquellas descrias en la patente de los Estados Unidos No. 5,505,947 de Johnston et al., Patente U.S. No. 5,185,440 de Johnston et al., Patente U.S. No. 5,643,576 de Davis et al., Patente U.S. No. 5,792,462 de Johnston et al., y Patente U.S. No. 5,639,650 de Johnston et al., las descripciones de los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Las mutaciones atenuadas específicas para la glucoproteína VEE E1 incluye una mutación atenuada de una cualquiera de las posiciones de aminoácido 81, 272 o 253. Partículas de replicón alfavírico se hacen del mutante VEE-3042 que contiene la sustitución isoleucina en E1-81, (aminoácido 81 de la proteína E1) y partículas de replicón de virus hecho del mutante VEE-3040 que contiene una mutación atenuada en E1-253. Mutaciones atenuadas específicas para la glucoproteína VEE E2 incluye una mutación atenuada en una cualquiera de las posiciones de aminoácido 76, 120, o 209. Partículas de replicón alfavírico hechas del mutante VEE-3014 contienen mutaciones atenuadas en E1-272 y en E2-209 (ver Patente U.S. No. 5,792,492). Una mutación atenuada específica para la glucoproteína VEE E3 incluye una mutación que consiste de una eliminación de aminoácidos 56-59. Virus partículas de replicón hechos del mutante VEE-3526 que contiene esta eliminación en E3 (aa56-59) así como también una segunda mutación atenuada en E1-253. Para alfavirus generalmente, se atenúan mutaciones de sustitución o eliminación en el dominio de división entre E3 y E2, que resulta en la poliproteína E3/E2 que no se ha dividido.

Los términos "secuencia de reconocimiento de replicación alfavirus 5'" y "secuencia de reconocimiento de replicación alfavirus 3'" se refiere a las secuencias encontradas en alfavirus, o sus secuencia derivadas, que se reconocen mediante las proteínas de replicasa alfavirus no estructurales y conduce a la replicación de ARN vírico. Algunas veces existen lo que se refiere como los extremos 5' y 3', o alfavirus de secuencias 5' y 3'. En las construcciones de esta invención, el uso de estos extremos 5' y 3' resultará en la replicación de la secuencia de ARN codificada entre los dos extremos. La secuencia de reconocimiento de replicación alfavirus 3' encontrada en el alfavirus es típicamente aproximadamente 300 nucleótidos en longitud, que contiene mejor definido, secuencia de reconocimiento de replicación 3' mínima. La secuencia de reconocimiento de replicación 3' mínima, conservado entre alfavirus, es una secuencia de nucleótido 19 (Hill et al., J. Virology, 2693-2704, 1997). Estas secuencias se pueden modificar mediante técnicas biológicas moleculares estándar para minimizar adicionalmente el potencial para recombinación o para introducir los sitios de clonación, con la condición que ellos se pueden reconocer mediante maquinaria de replicación de alfavirus.

El término "secuencia de reconocimiento de replicación alfavirus 5' mínima" se refiere a la secuencia mínima que no permite el reconocimiento mediante las proteínas estructurales del alfavirus pero no resulta en empaque/recombinación significativa de las moléculas de ARN que contienen la secuencia. En una modalidad preferida, la secuencia de reconocimiento de replicación alfavirus 5' mínima resulta en cincuenta a cien veces la reducción en la frecuencia observada de empaque/recombinación del ARN que contiene la secuencia. El empaque/recombinación de los auxiliares se puede ensayar mediante varios métodos, por ejemplo el método descrito por Lu y Silver (J. Virol. Métodos 2001, 91 (1): 59-65).

Los términos "replicón de ARN alfavirus ", "ARN replicón alfavirus", "replicón de vector de ARN alfavirus", "replicón", y "vector de ARN replicón" se utilizan intercambiablemente para referirse a una molécula de ARN que expresa los genes de proteína no estructural de tal manera que estos se pueden dirigir a su propia replicación (amplificación) y comprende, en un mínimo, las secuencias de reconocimiento de replicación alfavirus 5' y 3' (que pueden tener las secuencias mínimas, como se definió anteriormente, pero puede alternativamente ser las regiones totales del alfavirus), que codifica las secuencias para proteínas no estructurales de alfavirus, y un tracto de poliadenilación. Esto adicionalmente puede contener un promotor y/o un IRES. Los replicones específicos útiles en la invención reivindicada incluyen: un replicón basado en VEETC83, denominado aquí como un "replicón VEETC83", un replicón con base en la secuencia tipo intacto de VEE, denominado aquí como un "replicón VEE3000"; y un replicón con base en VEE3000 pero incluye adicionalmente una de las mutaciones atenuadas presentes en TC83, denominadas mutación en un "A" al nucleótido 3, denominado aquí como "VEE3000nt3A".

El replicón de vector de ARN alfavirus se designa para expresar un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo un gen, de interés, también se refiere aquí como un ARN heterólogo o secuencia heteróloga, que se puede seleccionar de una amplia variedad de secuencias derivadas de virus, procariotes o eucariotes. Ejemplos de categorías de secuencias heterólogas incluyen, pero no se limitan a, inmunógenos, incluyendo proteínas antigénicas, citocinas, toxinas, proteínas terapéuticas, enzimas, secuencias anticodificantes, y moduladores de la respuesta inmune.

Los replicones de ARN alfavirus de esta invención se pueden construir por medio de ingeniería para expresar las proteínas estructurales de alfavirus, de esta forma generar una vacuna contra los alfavirus de los cuales las proteínas estructurales se derivan. Johnston et al. y Polo et al. (citados en el antecedente) describe numerosas construcciones para tales replicones de ARN alfavirus, y tales construcciones se incorporan aquí como referencia. Modalidades específicas de los replicones de ARN alfavirus utilizados en la invención reivindicada pueden contener una o más mutaciones atenuadas, una mutación atenuada es una eliminación de nucleótido, adición, o sustitución de uno o más nucleótidos, o una mutación que comprende redisposición o construcción quimérica que resulta en una pérdida de virulencia en un virus vivo que contiene la mutación como se compara con el alfavirus tipo intacto apropiado. Ejemplos de una sustitución de nucleótido atenuada (que resulta en un cambio de aminoácido en el replicón) incluyen una mutación en la posición 538 de aminoácido nsP1, posición 96 de aminoácido nsP2, o posición 372 de aminoácido nsP2 en el alfavirus S.A.AR86.

Los términos "proteína/proteínas estructurales de alfavirus" se refieren a una o una combinación de las proteínas estructurales codificadas mediante alfavirus. Estas se producen mediante el virus como una poliproteína y se representan generalmente en la literatura como C-E3- E2-6k-E1. E3 y 6k sirven como señales de translocación de membrana/transporte para las dos glucoproteínas, E2 y E1. Así, uso del término E1 aquí se puede referir E1, E3-E1, 6k-E1, o E3-6k-E1, y uso del término E2 aquí se refiere a E2, E3-E2, 6k-E2, o E3-6k-E2.

El término "auxiliar" o construcciones auxiliares se refieren a una molécula de ácido nucleico que es capaz de expresar una o más proteínas estructurales de alfavirus.

Los términos "célula auxiliar" y "célula de empaque" se utilizan intercambiablemente aquí y se refieren a la célula en la que las partículas de replicón alfavírico se producen. La célula auxiliar comprende un conjunto de auxiliares que codifican una o más proteínas estructurales de alfavirus. Como se describe aquí, los auxiliares pueden ser ARN o ADN. La célula puede ser cualquier célula que es alfavirus permisiva. En ciertas modalidades de la invención reivindicada, el auxiliar o célula de empaque puede incluir adicionalmente una polimerasa ARN dependiente de ARN heterólogo y/o una proteasa de secuencia específica.

Los términos "partículas de replicón alfavírico ", "partículas de replicón de virus", "VRP" o "partículas de alfavirus recombinante", utilizados intercambiablemente aquí, significan un complejo estructural similar a virión que incorpora un ARN replicón alfavirus que expresa una o más secuencias de ARN heterólogas. Típicamente, el complejo estructural similar a virión incluye una o más proteínas estructurales de alfavirus embebidas en una envoltura de lípido que encierra un nucleocápsido comprendido del cápsido y ARN replicón. La envoltura de lípido se deriva típicamente de la membrana de plasma de la célula en al que se producen las partículas. Preferiblemente, el ARN replicón alfavirus está rodeado por una estructura de nucleocápsido que comprende la proteína cápsida alfavirus, y las glucoproteínas alfavirus se embeben en la envoltura de lípido derivada de célula. Estas partículas de replicón son de propagación defectuosa (o sinónimamente "replicación defectuosa"), que significa que las partículas producidas en una célula anfitriona dada no pueden producir partículas de progenie en la célula anfitriona, debido a la ausencia en la función auxiliar, es decir las proteínas estructurales de alfavirus requeridas para empacar el ácido nucleico de replicón. Sin embargo, el ácido nucleico de replicón es capaz de replicarse a sí mismo y ser expresado dentro de la célula anfitriona en la cual se ha introducido. Partículas de replicón de esta invenciones puede referir como VEETC83 partículas de replicón, y esto se refiere a partículas que comprenden un ARN replicón TC83 o proteínas estructurales TC83, o un ARN replicón TC83 y proteínas estructurales TC83.

Cualesquier aminoácidos que ocurran en las secuencias de aminoácido mencionadas en la especificación tienen sus abreviaturas de tres y una letra usuales utilizadas en la técnica: A, Ala, Alanina; C, Cys, Cisteína; D, Asp, ácido Aspártico; E, GIu, ácido Glutámico; F, Phe, Fenilalanina; G, GIy, Glicina; H, His, Histidina; I, lie, Isoleucina; K, Lys, Lisina; L, Leu, Leucina; M, Met, Metionina; N, Asn, Asparagina; P, Pro, Prolina; Q, GIn, Glutamina; R, Arg, Arginina; S, Ser, Serina; T, Thr, Treonina; V, VaI, Valina; W, Try, Triptofan; Y, Tyr, Tirosina.

Como se utiliza aquí, la expresión dirigida mediante una secuencia particular es la transcripción de una secuencia en la dirección 3' asociada, es decir producción de ARN mensajero de una molécula de ADN o producción del ARN mensajero de un promotor subgenómico de alfavirus. Si es apropiado y si se desea para la aplicación particular, el mARN transcrito luego se traslada, es decir la proteína se sintetiza. Así, en una modalidad de esta invención, el replicón o construcción auxiliar comprende un promotor subgenómico que dirige la transcripción de un ARN mensajero que codifica el ácido nucleico heterólogo de interés (NOI) o la transcripción de un mARN que codifica una o más proteínas estructurales de alfavirus, respectivamente. Estos mARN se "tapan" dentro de la célula eucariótica, es decir una estructura metil-7-guanosina (5')pppN está presente en el extremo 5' del mARN (la "tapa" o "tapa 5'"), y esta tapa se reconoce mediante los factores de iniciación de traducción que sintetizan la proteína del mARN. Así, el promotor 26S dirige la transcripción, y la "tapa" proporciona la señal de inicio para la transducción.

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En otra modalidad, el replicón o construcción auxiliar comprende un promotor que dirige la transcripción; un elemento IRES; y una secuencia de codificación, y el elemento IRES se ubica operablemente tal que la transducción de la secuencia codificante es vía un mecanismo de tapa independiente dirigido mediante el elemento IRES, todo o en parte, se describe en detalle en la Publicación WIPO No. WO 2004/085660. En particular, el control de la expresión de ácido nucleico en el nivel de transducción se logra al introducir un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) en la dirección 3' de un promotor subgenómico 26S de alfavirus y corriente arriba de la secuencia codificante a ser traducida. El elemento IRES se posiciona dado que este se dirige a la transducción del mARN, por lo cual minimiza, limita o previene la transducción del mARN de la tapa 5'. Este "IRES dirigido", transducción independiente de tapa no requiere o resulta en cualquier modificación significante de genes de proteína no estructurales alfavirus que podrían alterar la replicación y transcripción. En modalidades específicas, el replicón y/o construcción auxiliar puede comprender un ácido nucleico espaciador ubicado entre el promotor y el elemento IRES. El ácido nucleico espaciador puede comprender o consistir de cualquier secuencia de ácido nucleico no codificante específica, aleatorizada que es de una longitud suficiente para evitar por lo menos alguna, y en algunas modalidades, toda la transducción de la tapa 5' de un ARN mensajero, tal que la transducción luego se dirige mediante IRES, en parte o completamente. Alternativamente, el ácido nucleico espaciador puede ser de una longitud y estructura de secuencia que imparte estructura secundaria suficiente al ácido nucleico para evitar por lo menos alguna y posiblemente toda la actividad de transducción de la tapa 51 de un ARN mensajero.

Elementos IRES adecuados incluyen, pero no se limitan a, elementos IRES víricos de picornavirus, por ejemplo, poliovirus (PV) o el enterovirus humano 71, por ejemplo las cepas 7423/MS/87 y sus BrCr; del virus encefalomiocarditis (EMCV); del virus de la enfermedad de fiebre aftosa (FMDV); de flavivirus, por ejemplo, virus de la hepatitis C (HCV); de pestivirus, por ejemplo, virus de fiebre porcino clásica (CSFV); del retrovirus, por ejemplo, virus de leucemia murino (MLV); del lentivirus, por ejemplo, virus de inmunodeficiencia del simio (SIV); de los elementos IRES de mARN celular tal como aquellos de los factores de iniciación de transducción, por ejemplo, elF4G o DAP5; de los factores de transcripción, por ejemplo, c-Myc (Yang y Sarnow, Nucleic acids Research 25: 2800-2807 (1997)) o factores de represión NF-\kappaB (NRF); de los factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto (FGF-2) y factor B de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF B); de genes homeóticos, por ejemplo, Antennapedia; de proteínas sobrevivientes, por ejemplo, inhibidor unido a X de apoptosis (XIAP) o Apaf-1; de chaperones, por ejemplo, proteína BiP de unión de cadena pesada a inmunoglobulina (Martinez-Salas et al., JouARNl of General Virology 82: 973-984, (2001)), del virus de las plantas, así como también cualesquier otros elementos IRES ahora mostrados o luego identificados.

En modalidades específicas, el elemento IRES de esta invención se puede derivar de, por ejemplo, virus encefalomiocarditis (EMCV, # de acceso GenBank NC001479), virus de la parálisis de los grillos (# de acceso GenBank AF218039), virus Drosófila C (# de acceso GenBank AF014388), virus del intestino Plautia stali (# de acceso GenBank AB006531), virus Rhopalosiphum padi (# de acceso GenBank AF022937), virus Himetobi P (# de acceso GenBank AB017037), virus de la parálisis aguda de la abeja acute bee paralysis virus (# de acceso GenBank AF150629), Black queen cell virus (# de acceso GenBank AF183905), virus Triatoma (# de acceso GenBank AF178440), virus Acyrthosiphon pisum (# de acceso GenBank AF024514), infectious flacherie virus (# de acceso GenBank AB000906), y/o virus Sacbrood (# de acceso GenBank AF092924). En adición, los elementos IRES sintéticos se han descrito, que se pueden diseñar, de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica para la función imitadora de los elementos IRES de ocurrencia natural (ver Chappell, SA et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA (2000) 97(4): 1536-41. En modalidades específicas, el elemento IRES puede ser el elemento IRES del elemento u otro elemento IRES de no mamífero que es funcional en la línea celular auxiliar particular seleccionada para empaque de partículas de alfavirus recombinante de esta invención, pero no podría ser funcional, o podría ser mínimamente funcional, en una célula anfitriona objetivo para las partículas (por ejemplo un sujeto humano). Esto es útil para aquellos NOI que son tóxicos para la célula de empaque o son perjudiciales para el proceso de empaque alfavirus.

La frases "proteína estructural" o "proteína estructural alfavirus " como se utiliza aquí se refiere a una o más de las proteínas codificadas alfavíricas que se requieren para empaque del replicón ARN, y típicamente incluyen la proteína cápsida, glucoproteína E1, y glucoproteína E2 en el alfavirus maduro (ciertos alfavirus, tal como virus Semliki Forest, que contiene una proteína adicional, E3, en el recubrimiento maduro). El término "proteínas estructurales alfavirus" se refiere a una o una combinación de las proteínas estructurales codificadas por alfavirus. Estos se sintetizan (del genoma vírico) como una poliproteína y se representan generalmente en la literatura como C-E3-E2- 6k-E1. E3 y 6k sirve como translocación de membrana/señales de transporte para las dos glucoproteínas, E2 y E1. Así, el uso del término E1 aquí se puede referir a E1, E3-E1, 6k-E1, o E3-6k-E1, y uso del término E2 aquí se puede referir a E2, E3-E2, 6k-E2, o E3-6k-E2.

Como se describe aquí, las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas estructurales del alfavirus se distribuyen entre una o más moléculas de ácido nucleico auxiliares (por ejemplo, un primer ARN auxiliar (o ADN) y un segundo ARN auxiliar (o DNA)). En adición, se puede ubicar una o más proteínas estructurales en la misma molécula como el ácido nucleico de replicón, dado que por lo menos una proteína estructural se elimina del replicón ARN de tal manera que el replicón y que resulta la partícula alfavirus son propagación defectuosa con respecto a la producción de partículas de alfavirus adicionales. Como se utiliza aquí, los términos "eliminado" o "eliminación" significa la eliminación total del segmento especificado o la eliminación de una porción suficiente del segmento especificado para producir el segmento no operativo o no funcional, de acuerdo con el uso estándar. Ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 4,650,764 de Temin et al. La distribución de las secuencias de ácido nucleico auxiliares entre moléculas de ácido nucleico múltiples minimiza la frecuencia en la cual se genera el virus competente de replicación (RCV) a través de los eventos de recombinación. En el caso de los auxiliares de construcción de ADN que no emplean señales de reconocimiento alfavírico para replicación y transcripción, la frecuencia teórica de recombinación es menor que los sistemas auxiliares de ARN bipartitos que emplean tales señales.

La célula auxiliar, también se refiere como la célula de empaque, utilizada para producir las partículas de alfavirus de propagación defectuosa infecciosas, puede expresar o ser capaz de expresar las proteínas estructurales de alfavirus suficiente para el empaque del ácido nucleico de replicón. Las proteínas estructurales se pueden producir de un conjunto de ARN, típicamente dos, que se introducen en la célula auxiliar concomitante con o antes de introducción del vector replicón. El primer ARN auxiliar incluye ARN que codifica por lo menos una proteína estructural de alfavirus pero no codifican todas las proteínas estructurales de alfavirus. El primer ARN auxiliar puede comprender ARN que codifica la glucoproteína E1 de alfavirus, pero que no codifica la proteína cápsida de alfavirus y la glucoproteína E2 de alfavirus. Alternativamente, el primer ARN auxiliar puede comprender ARN que codifica la glucoproteína E2 de alfavirus, pero que no codifica la proteína cápsida de alfavirus y la glucoproteína E1 de alfavirus. En una modalidad adicional, el primer ARN auxiliar puede comprender ARN que codifica la glucoproteína E1 de alfavirus y la glucoproteína E2 de alfavirus, pero no la proteína cápsida de alfavirus. En una cuarta modalidad, el primer ARN auxiliar puede comprender ARN que codifica el cápsido alfavirus, pero ninguna de las glucoproteínas de alfavirus. En una quinta modalidad, el primer ARN auxiliar puede comprender ARN que codifica el cápsido y una de las glucoproteínas, es decir E1 o E2, pero no ambas.

En modalidades preferidas emplean dos ARN auxiliares, en combinación con uno cualquiera de estos primeros ARN auxiliares, el segundo ARN auxiliar codifica la una o más proteínas estructurales de alfavirus que no se codifican mediante el primer ARN auxiliar. Por ejemplo, en donde el primer ARN auxiliar codifica solo la glucoproteína E1 de alfavirus, el segundo ARN auxiliar codifica la proteína de cápsido de alfavirus y la glucoproteína E2 de alfavirus. En donde el primer ARN auxiliar codifica solo la proteína de alfavirus cápsida, el segundo ARN auxiliar codifica las glucoproteínas de alfavirus. En donde el primer ARN auxiliar codifica solo la glucoproteína E2 de alfavirus, el segundo ARN auxiliar codifica la proteína de alfavirus cápsida y la glucoproteína E1 de alfavirus. En donde el primer ARN auxiliar codifica el cápsido y la glucoproteína E1 de alfavirus, el segundo ARN auxiliar puede incluir ARN que codifica uno o ambas de la proteína de alfavirus cápsida y la glucoproteína E2 de alfavirus. En todos los auxiliares de ácido nucleico, se entiende que estas moléculas pueden comprender adicionalmente secuencias necesarias para expresión (que abarca la traducción y cuando es apropiado las señales de transcripción o replicación) de las secuencias de proteína estructural codificada en las células auxiliares. Tales secuencias pueden incluir, por ejemplo, promotores (víricos, procarióticos o eucarióticos, inducibles o constitutivos), los IRES, y secuencias de reconocimiento de replicasa vírica 5' y 3'. En el caso de los auxiliares de ácido nucleico que expresan una o más glucoproteínas, se entiende de la técnica que estas secuencias se expresan ventajosamente con un líder o secuencia de señal en el terminal N de la región que codifica la proteína estructural en las construcciones de ácido nucleico. El líder o secuencia de señal se puede derivar del alfavirus, por ejemplo E3 o 6k, o esta puede ser una secuencia heteróloga tal como un péptido de señal activador de plasminógeno de tejido o una secuencia sintética. Así, como un ejemplo, un primer ácido nucleico auxiliar puede ser una molécula de ARN que codifica E3-E1 cápsido, y el segundo ácido nucleico auxiliar puede ser una molécula de ARN que codifica el cápsido E3-E2. Alternativamente, el primer ARN auxiliar puede codificar el cápsido solo, y el segundo ARN auxiliar puede codificar E3-E2-6k-E1. Adicionalmente, las señales de empaque o "secuencias de encapsidación" que están presentes en el genoma vírico no están presentes en todos los auxiliares de ácido nucleico. Preferiblemente, cualquiera de tales señales de empaque se elimina de todos los auxiliares de ácido nucleico.

Producción de partículas de alfavirus

Partículas de replicón alfavírico de esta invención se producen al introducir auxiliares de construcción y ácidos nucleicos de replicón en una célula auxiliar dado que el auxiliar y la función de las moléculas de replicón para producir partículas de replicón alfavírico. En modalidades los auxiliares de ARN utilizados, los auxiliares se pueden introducir en las células en un número de formas. Los ARN se pueden introducir a las moléculas de ARN o ADN que se puede expresar en la célula auxiliar sin integrar en el genoma celular. Métodos de introducción incluyen electroporación, vectores víricos (por ejemplo SV40, adenovirus, nodavirus, astrovirus), y transfección mediada por lípido. Alternativamente, ellos se pueden expresar de uno o más casetes de expresión que han sido transformados establemente en las células, que por lo tanto establecen las líneas celulares de empaque (ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 6,242,259). En otras modalidades, el auxiliar es una molécula de ADN única que codifica todos los polipéptidos necesarios para empacar el ARN replicón vírico en partículas de replicón alfavírico infectivas. El auxiliar de ADN único se puede introducir en la célula de empaque mediante cualquier significado conocido en la técnica, que incluye mediante electroporación, típicamente con un incremento en el voltaje como se compara como lo requerido para la retoma de ARN, pero un voltaje no suficientemente alto para destruir la capacidad de la célula de empacar para producir partículas de replicón alfavírico infecciosas. El auxiliar de ADN se puede introducir antes de, concomitantemente con, o después de introducción/expresión del replicón de vector de ARN alfavirus. Alternativamente, la función auxiliar, en este formato y bajo un promotor inducible, se puede incorporar en el genoma de célula de empaque antes de la introducción/expresión del replicón de vector de ARN alfavirus, y luego se induce con el estimulo apropiado justo antes de, concomitante con, o después de la introducción del replicón de vector de ARN alfavirus.

Las moléculas de ADN recombinantes que expresan las proteínas estructurales de alfavirus también se pueden generar de un único auxiliar que lo resuelve en dos moléculas separadas in vivo. Así, se preserva la ventaja de utilizar un auxiliar único en términos de caso de fabricación y de producción, mientras las ventajas de un sistema auxiliar bipartito se capturan en la ausencia de emplear un sistema de expresión bipartito. Una construcción auxiliar de ADN se utiliza, mientras en un segundo conjunto se utiliza un vector auxiliar de ARN. Tales sistemas se describen en detalle en Smith et al. "Alfavirus Replicon Vector Systems", Publicación de Patente U.S. 2003-0119182A1.

Para los auxiliares de construcción de ADN, se emplea un promotor para dirigir la transcripción de ARN a ADN, es decir una polimerasa ARN dependiente de ADN. En el presente contexto, un promotor es una secuencia de nucleótidos reconocida mediante una polimerasa y suficiente para originar la transcripción de una secuencia asociada (corriente abajo). En algunas modalidades de la invención reivindicada, el promotor es constitutivo (ver adelante). Alternativamente, el promotor se puede regular, es decir, no actuar constitutivamente para originar la transcripción de la secuencia asociada. Si es inducible, existen secuencias presentes que median la regulación de la expresión dado que la secuencia asociada se transcribe solo cuando (i) una molécula inductora está presente en el medio en o en el que las células se cultivan, o (ii) condiciones en las que las células se exponen se cargan para ser condiciones de inducción. En el presente contexto, una secuencia reguladora de transcripción incluye una secuencia promotora y puede incluir adicionalmente las secuencias activas cis para la expresión regulada de una secuencia asociada en respuesta a señales medio ambientales.

En las modalidades de auxiliar de ARN, el promotor se utiliza para sintetizar ARN en una reacción de transcripción in vitro, y promotores específicos adecuados para su uso incluyen los promotores de polimerasa ARN SP6, T7, y T3. En modalidades de ADN auxiliar, las funciones de promotor dentro de una célula para dirigir la transcripción de ARN. Los promotores potenciales para la transcripción in vivo de la construcción incluyen promotores eucarióticos tal como promotores II de polimerasa ARN, promotores III de polimerasa ARN, o promotores víricos tal como MMTV y MoSV la región temprana LTR, SV40, RSV o CMV. Muchos otros promotores víricos y mamíferos adecuados para la presente invención están disponibles en la técnica. Alternativamente, los promotores de polimerasa ARN dependientes de ADN de bacterias o bacteriófagos, por ejemplo SP6, T7, y T3, se pueden emplear para uso in vivo, con el case de la polimerasa de ARN que se proporciona a la célula, vía un plásmido separado, vector ARN, o vector vírico. En una modalidad específica, el case de la polimerasa de ARN puede ser establemente transformado en una línea de célula auxiliar bajo el control de un promotor inducible.

Las construcciones de ADN que funcionan dentro de una célula pueden funcionar como plásmidos autónomos que se transfectan en la célula o ellos pueden ser establemente transformados en el genoma. En estas modalidades, el promotor puede ser un promotor constitutivo, es decir un promotor que, cuando se introduce en una célula y se une operablemente a una secuencia en la dirección 3', que dirige la transcripción de la secuencia en la dirección 3' luego de la introducción en la célula, sin la necesidad para la adición de moléculas de inducción o un cambio en las condiciones de inducción. Alternativamente, el promotor puede ser inducible, dado que la célula solo producirá el ARN mensajero funcional que codifica mediante la construcción cuando la célula se expone al estímulo apropiado (induce). Cuando se utiliza un promotor inducible, los auxiliares de construcción se introducen en la célula de empaque concomitantemente con, antes de, o después de la exposición para el inductor, y la expresión de las proteínas estructurales de alfavirus ocurre cuando las construcciones y inductor están presentes. Alternativamente, las construcciones diseñadas para funcionar dentro de una célula se pueden introducir en la célula vía un vector vírico, por ejemplo adenovirus, poxvirus, virus asociado adeno, SV40, retrovirus, nodavirus, picornavirus, virus de estomatitis vesicular, y baculovirus con promotores II pol mamíferos.

Una vez un transcripto de ARN (mARN) que codifica los vectores de replicón de ARN auxiliares de esta invención están presentes en la célula auxiliar (vía métodos in vitro o in vivo como se describió anteriormente), se traslada eventualmente para producir los polipéptidos o proteínas codificadas. En ciertas modalidades, el replicón de vector de ARN alfavirus se transcribe in vitro desde un plásmido de ADN y luego se introduce en la célula auxiliar mediante electroporación. En otras modalidades, el replicón de vector ARN de esta invención se transcribe in vivo de un plásmido de vector de ADN que se transfecta en la célula auxiliar (por ejemplo ver Patente U.S. No. 5,814,482), o se libera para la célula auxiliar vía un virus o partícula similar a virus.

En las modalidades de esta invención, uno o más de los ácidos nucleicos que codifican el replicón de ARN de alfavirus o auxiliares se comprende de las secuencias derivadas del genoma VEETC83, que contiene mutaciones que contribuyen a la naturaleza atenuada de la cepa de vacuna TC83, como se describió anteriormente. En adición, uno o más de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas estructurales de alfavirus, es decir, el cápsido, Glucoproteína E1 y glucoproteína E2, o la construcción de replicón, pueden contener una o más mutaciones atenuadas adicionales.

Métodos para inmunizar sujetos

Como se utiliza aquí, "provocar una respuesta inmune" e "inmunizar un sujeto" incluye el desarrollo, en un sujeto, de una respuesta celular y/o humoral a una proteína y/o polipéptido producido mediante las partículas y/o composiciones de esta invención (por ejemplo un inmunógeno, un antígeno, un péptido inmunógenico, y/o uno o más epítopos). Una respuesta inmune "humoral", como este término es bien conocido en la técnica, se refiere a una respuesta inmune que comprende anticuerpos, mientras una respuesta inmune "celular", como este término es bien conocido en la técnica, se refiere a una respuesta inmune que comprende Linfocitos T y otros glóbulos blancos, especialmente la respuesta específica a inmunógeno mediante células T citolíticas restringidas por HLA, es decir, "CTL". Una respuesta inmune celular ocurre cuando los inmunógenos procesados, es decir, fragmentos de péptido, se exhiben en conjunto con las proteínas HLA del complejo de histocompatibilidad principal (MHC), que son de dos tipos generales, clase I y clase II. Los CTL restringidos por HLA clase I generalmente une péptidos 9-mer y están presentes aquellos péptidos en la superficie celular. Estos fragmentos de péptido en el contexto de la molécula HLA clase I se reconoce mediante proteínas del receptor de célula T específico (TCR) en Linfocitos T, que resulta en la activación de la célula T. La activación puede resultar en un número de resultados funcionales que incluyen, pero no se limitan a, la expansión de subconjunto de célula T específico que resulta en la destrucción de la célula que lleva el complejo de péptido HLA directamente a través de los eventos citotóxicos o apoptóticos o la activación de mecanismos no destructivos, por ejemplo, la producción de interferón/citoquinas. Presentación de inmunógenos vía proteínas MHC Clase 1 que estimula típicamente una respuesta CD8+ CTL.

Otro aspecto de la respuesta inmune celular involucra las respuestas de célula T restringido por HLA Clase II, que involucra la activación de las células T auxiliares, que estimula y enfoca la actividad de células efectoras no específicas contra células que exhiben los fragmentos de péptido en asociación con las moléculas MHC en su superficie. Por lo menos se reconocen dos tipos de células auxiliares: células T auxiliares 1 (Th1), que secretan las células interleuquina citoquina 2 (IL-2) y interferón-gamma y células T auxiliares 2 (Th2), que secretan la interleuquina citoquinas 4 (IL-4), interleuquina 5 (IL-5), interleuquina 6 (IL-6) y interleuquina 10 (IL-10). La presentación de inmunógenos vía proteínas MHC Clase Il típicamente provoca una respuesta CD4+ CTL así como también el estímulo de los linfocitos B, que conduce a una respuesta de anticuerpo.

Un "polipéptido inmunogénico", "péptido inmunogénico", o "inmunógeno" como se utiliza aquí incluye cualquier péptido, proteína o polipéptido que provoca una respuesta inmune en un sujeto y en ciertas modalidades, el polipéptido inmunogénico es adecuado para proporcionar algún grado de protección a un sujeto contra una enfermedad. Estos términos se pueden utilizar intercambiablemente con el término "antígeno".

En ciertas modalidades, el inmunógeno de esta invención puede comprender, consistir esencialmente de o consistir de uno o más "epítopos." Un "epítopo" es un conjunto de residuos de aminoácido que se involucra en el reconocimiento mediante una inmunoglobulina particular. En el contexto de las células T, un epítopo se define como los residuos de aminoácido necesarios para reconocimiento mediante las proteínas de receptor de célula T y/o receptores MHC. En un conjunto de sistema inmune, in vivo o in vitro, un epítopo se refiere a las características colectivas de una molécula, tal como la estructura de péptido primaria, secundaria y/o terciaria, y/o carga, que juntas forman un sitio reconocido mediante una inmunoglobulina, el receptor de célula T y/o molécula HLA. En el caso de un epítopo de célula B (anticuerpo) típicamente este es un mínimo de 3-4 aminoácidos, preferiblemente por lo menos 5, que varía hasta aproximadamente 50 aminoácidos. Preferiblemente, los epítopos que inducen la respuesta humoral están entre 5 y 30 aminoácidos, usualmente entre 12 y 25 aminoácidos, y más comúnmente entre 15 y 20 aminoácidos. En el caso de un epítopo de célula T, un epítopo incluye por lo menos aproximadamente 7-9 aminoácidos, y para un epítopo de célula T auxiliar, por lo menos aproximadamente 12-20 aminoácidos. Típicamente, tal un epítopo de célula T- incluirá entre aproximadamente 7 y 15 aminoácidos, por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos.

Se emplean partículas de alfavirus de esta invención para expresar un ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunógenico en un sujeto (por ejemplo, para vacunación) o para inmunoterapia (por ejemplo, para tratar un sujeto con cáncer o tumores). Así, en el caso de las vacunas, la presente invención proporciona de esta forma métodos para provocar una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunogénica de una población de partículas de alfavirus.

Una "cantidad inmunogénica" es una cantidad de las partículas de alfavirus infecciosas que es suficiente para inducir una respuesta inmune en el sujeto al cual se administra la formulación farmacéutica que comprende partículas de alfavirus. Se cree adecuada una cantidad de de aproximadamente 104 a aproximadamente 109, especialmente 10^{6} a 10^{8}, unidades infecciosas, por dosis, dependiendo de la edad y especie del sujeto a ser tratado. Portadores farmacéuticamente aceptables de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, solución salina fisiológica libre de pirógeno y en agua estéril libre de pirógeno.

Un "sujeto" de esta invención incluye, pero no se limita a, animales de sangre caliente, por ejemplo, humanos, primates no humanos, caballos, vacas, gatos, perros, cerdos, ratas y ratones. La administración de varias composiciones de esta invención (por ejemplo, ácidos nucleicos, partículas, poblaciones, composiciones farmacéuticas) se puede llevar a cabo mediante cualquiera de las varias rutas diferentes. En modalidades específicas, las composiciones se pueden administrar intramuscularmente, subcutáneamente, intraperitonealmente, intradérmicamente, intranasalmente, intracranealmente, sublingualmente, intravaginalmente, intrarectalmente, oralmente, o tópicamente. Las composiciones aquí se puede administra vía un método de cicatrización de la piel, o transdérmicamente vía un parche o líquido. Las composiciones se pueden liberar subdérmicamente en la forma de un material biodegradable que libera las composiciones durante un periodo de tiempo.

Las composiciones de esta invención se pueden utilizar profilácticamente para prevenir enfermedades o tratar la enfermedad terapéuticamente. Las enfermedades que se pueden tratar incluyen enfermedades infecciosas originadas por virus, bacterias, hongos o parásitos, y cáncer. Enfermedades crónicas involucran la expresión de proteínas aberrantes o anormales o la sobreexpresión de proteínas normales, también se puede tratar, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de esclerosis múltiple, apoplejía, etc.

Las composiciones de esta invención se pueden optimizar y combinar con otros regímenes de vacuna para proporcionar la respuesta humoral y celular más amplia posible (es decir, todos los aspectos de la respuesta inmune, incluyendo aquellas características descritas aquí anteriormente). En ciertas modalidades, esto puede incluir el uso de estrategias de refuerzo de cebador heterólogo, en las que se utilizan las composiciones de esta invención en combinación con una composición que comprende una modalidad diferente para vacunación, tal como uno o más de los siguientes: inmunógenos derivados de un patógeno o tumor, inmunógenos recombinantes, ácidos nucleicos desnudos, ácidos nucleicos formulados con grupos funcionales que contienen lípidos, vectores sin alfavirus (que incluyen pero no se limitan a vectores pox, vectores adenovíricos, vectores de herpes, vectores del virus de estomatitis vesicular, vectores paramixovíricos, vectores parvovirus, vectores papovavirus, vectores retrovíricos), y otros vectores alfavirus. Los vectores víricos pueden ser partículas o ácidos nucleicos similares a virus. Los vectores alfavirus pueden ser partículas que contienen replicón, vectores que contienen replicón basado en ADN (algunas veces se refiere a un sistema "ELVIS", ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 5,814,482) o vectores de ARN desnudos. En modalidades específicas, se pueden utilizar VRP como una inoculación previa, seguido por uno o más inoculaciones de refuerzo utilizando una de las composiciones mencionadas anteriormente. Alternativamente, los VRP se pueden utilizar en una o más inoculaciones de refuerzo siguiendo una inoculación previa con una de las composiciones mencionadas anteriormente.

Las composiciones de la presente invención también se pueden emplear para producir una respuesta inmune contra agentes infecciosos latentes o crónicos, que persisten típicamente debido a que ellos fallan en provocar una respuesta inmune fuerte en el sujeto. Los agentes infecciosos crónicos o latentes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, hepatitis B, hepatitis C, virus Epstein-Barr, virus del herpes, virus de inmunodeficiencia humano, y virus de papiloma humano. Partículas de replicón alfavírico de esta invención que codifican péptidos y/o proteínas de estos agentes infecciosos se pueden administrar a la célula o al sujeto de acuerdo con los métodos descritos aquí.

Alternativamente, la proteína inmunogénica o péptido puede ser cualquier antígeno de célula de cáncer o tumor. Preferiblemente, el antígeno de cáncer o tumor se expresa en la superficie de la célula de cáncer. Antígenos de cáncer de ejemplo para cánceres de mama específicos son los antígenos HER2 y BRCA1. Otros antígenos de célula de tumor y cáncer ilustrativos se describen en S.A. Rosenberg, (1999) Immunity 10:281) e incluyen, pero no se limitan a, MART-1/MelanA, gp100, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, \beta-catenina, MUM-1, Caspasa-8, KIAA0205, HPVE&, SART-1, PRAME, p15 y antígenos p53, antígeno de tumor de Wilms, tirosinasa, antígeno arcinoembriónico (CEA), antígeno específico de próstata (PSA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), antígeno de célula madre de próstata (PSCA), \beta-hidroxilasa aspartilo humano (asparaginilo) (HAAH), y EphA2 (una quinasa tirosina de célula epitelial, ver la Publicación de Patente Internacional No. WO 01/12172).

El polipéptido inmunogénico o péptido de esta invención también puede ser un antígeno de célula de tumor o cáncer "universal" o "artificial" como se describe en la publicación de patente internacional WO 99/51263, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad para las enseñanzas de tales antígenos.

En varias modalidades, el ácido nucleico heterólogo de esta invención puede codificar una secuencia de ácido nucleico anticodificante. Un ácido nucleico "anticodificante" es una molécula de ácido nucleico (es decir, ADN o ARN) que es complementaria (es decir, capaz de hibridar in vivo o bajo condiciones astringentes in vitro) para todo o una porción de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen, u cADN y/o mARN) que codifica o se involucra en la expresión del ácido nucleico que codifica un polipéptido a ser objetivo para inhibir o reducir la producción mediante la acción del ácido nucleico anticodificante. Cuando el ácido nucleico anticodificante es complementario para una porción del ácido nucleico que codifica el polipéptido a ser objetivo, el ácido nucleico anticodificante podría hibridar lo suficientemente cerca al extremo 5' del ácido nucleico que codifica el polipéptido tal que inhibe la transducción de un polipéptido funcional. Típicamente, esto significa que el ácido nucleico anticodificante debe ser complementario para una secuencia que está dentro de la mitad 5' o la tercera parte del ácido nucleico al que se hibrida.

Un ácido nucleico anticodificante de esta invención puede también codificar un ARN catalítica (es decir, un ribosoma) que inhibe la expresión del ácido nucleico objetivo en una célula al hidrolizar un mARN que codifica el producto de gen objetivo. Adicionalmente, ARN cabeza de martillo se puede utilizar como un ácido nucleico anticodificante para prevenir el corte y empalme. Un ácido nucleico anticodificante de esta invención se puede producir y probar de acuerdo con protocolos de rutina en la técnica para tecnología anticodificante.

Técnicas estándar para clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzimáticas involucra la ligasa de ADN, polimerasa de ADN, endonucleasas de restricción y similares, y varias técnicas de separación son aquellas conocidas y se emplean comúnmente por aquellos expertos en la técnica. Un número de técnicas estándar se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (ed.) (1993) Meth. Enzymol. 218, Parte I; Wu (ed.) (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu et al. (eds.) (1983) Meth. Enzymol. 100 y 101; Grossman y Moldave (eds.) Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old y Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif y Wensink (1982) Practical Métodos in Molecular Biology; Glover (ed.) (1985) DNA Cloning Vol. I y II, IRL Press, Oxford, UK; Hames y Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; Setlow y Hollaender (1979) Genetic Engineering: Principles y Métodos, VoIs. 1-4, Plenum Press, New York; y Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, NY, y en otras fuentes referenciadas aquí. Cuando se emplean abreviaturas y nomenclaturas, éstas son estándar en el campo y se utilizan comúnmente en revistas profesionales tal como aquellas mencionadas
aquí.

Todas las referencias citadas en la presente solicitud se incorporan aquí como referencia al grado que no hay inconsistencia con la presente descripción. Cuando un grupo Markush u otra agrupación se utiliza aquí, todos los miembros individuales del grupo y todas las combinaciones y subcombinaciones posibles del grupo se pretenden se incluyan individualmente en la descripción. Siempre que se dé un rango en la especificación, por ejemplo, un rango de temperatura, un rango de tiempo, o un rango de composición, todos los rangos intermedios y subrangos, así como también todos los valores individuales incluidos en los rangos dados están destinados a ser incluidos en la
descripción.

Como se utiliza aquí, "comprende" es sinónimo de "incluye", "contiene", o "caracterizado por", y es inclusivo o de extremo abierto y no excluye las etapas de método o elementos no mencionados adicionales. Como se utiliza aquí, "consiste de excluir cualquier elemento, etapa, o ingrediente no especificado en el elemento reivindicado. Como se utiliza aquí, "consiste esencialmente de no excluir materiales o etapas que no afectan materialmente las características novedosas y básicas de la reivindicación. Cualquier mención aquí del término "comprende", particularmente en una descripción de componentes de una composición o en una descripción de elementos de un dispositivo en la especificación y reivindicaciones, se puede intercambiar con "consiste esencialmente de" o "consiste de".

Un experto en la técnica apreciará que los métodos, técnicas, procedimientos, por ejemplo, técnicas o procedimientos de recolección y/o purificación, materiales de partida, medio de cultivo, y reactivos diferentes a aquellos ejemplificados específicamente se pueden emplear en la práctica de la invención sin acudir a la experimentación indebida. Todos los equivalentes funcionales conocidos en la técnica, de cualesquier tales métodos, técnicas, procedimientos, materiales de partida, medio de cultivo, y reactivos se destinan a ser incluidos en esta invención.

Aunque la descripción aquí contiene muchas menciones específicas y ejemplos, estas no se deben constituir como limitante del alcance de la invención, pero solamente proporciona ilustraciones de algunas modalidades de la invención. Algunas referencias proporcionadas aquí proporcionan detalles que se relacionan con materiales de partida adicionales, métodos adicionales de síntesis, métodos adicionales de análisis y usos adicionales de la invención.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para propósitos ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la invención como se reivindica aquí. Cualesquier variaciones en los artículos ejemplificados que ocurre para el experto pretenden caer dentro del alcance de la presente invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Producción de Replicones TC-83

Un plásmido replicón con base en la cepa TC-83 de VEE se produce a partir de un clon cADN que infecta TC-83, pVE/IC-92, obtenido de los Centros para Control y Prevención de Enfermedades. La secuencia de este clon se publica por Kinney et al. (1993) J. Virol. 67:1269. La secuencia pVE/IC-92 difiere de la secuencia genómica de virus TC-83 mediante la presencia de una mutación Ala-VaI en E1-119 (un artefacto de clonación introducido por Kinney) y tres mutaciones sinónimas en nsp1 (a 1613A\rightarrowG; a 1616C\rightarrowA; a 1619T\rightarrowC) se introduce a propósito para distinguir el virus derivado de clon de la secuencia genómica. Los actuales inventores han identificado una mutación sinónima adicional en la posición E1 en el clon pVE/IC-92. "Sinónimo" significa que el cambio en la secuencia de ácido nucleico no origina un cambio en el aminoácido que se codifica mediante la secuencia de ácido
nucleico.

El vector replicón TC-83 ("pVEK") se produce al primero transferir una secuencia de expresión que codifica la resistencia a la canamicina ("KN(R)") en el clon de longitud completa TC-83 para crear pVEK/IC-92. Se inserta un sitio de clonación múltiple en lugar de los genes de proteína estructural TC-83 al digerir un replicón VEE existente (tal como el plásmido pERK, ver Publicación de Patente U.S. No. 2002-141975, Ejemplo 2), que tiene el promotor VEE 26S y 3' UTR (región no traducida), con las enzimas de restricción Apal y Notl y el ligado del fragmento en los mismos sitios de pVEK/IC-92. El plásmido resultante se replica en las bacterias utilizando la replicación de origen COLE1 (ORI) y contienen las secuencias de proteína no estructural TC-83 5' y 3' UTR's, TC 83 (nsP), un promotor VEE 26S, y un sitio de clonación múltiple, todos puestos en la dirección 3' de un promotor polimerasa T7 pata transcripción de ARN in vitro.

Alternativamente, las proteínas estructurales del clon TC-83 se reemplazan con un gen heterólogo quimérico, por ejemplo el gen VIH gag (GAG), el gen que codifica la proteína fluorescente verde (GFP), o una secuencia de poliproteína glucoproteína alfavirus (VEE, EEE o WEE).

Un segundo replicón con base en TC-83 se produce en el promotor VEE 26S que conduce a la transcripción del gen heterólogo, mientras que el sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) se inserta en la dirección 3' del promotor se utiliza para traducción directa del ARN subgenómico (denominado aquí como un "replicón IRES" y específicamente "VEETC83IRES"). Este replicón se genera a partir de pERK- 342EnGGAG (también denominado aquí como "VEE3000IRES"), que es un replicón con base en VEE- tipo intacto que contiene una secuencia 342 bp (SEQ ID NO:1) (un fragmento AIuI de la digestión de pCADN3.1 AND; Invitrogen, Inc; Carlsbad, CA) insertado en el sitio de enzima de restricción EcoRV de pERK entre el promotor subgenómico y EMCV IRES, como un fragmento Apal-Sphl en pVEK-IC92. La secuencia 342 se inserta para asegurar que el IRES es el elemento de control para traducción, y tiene la siguiente secuencia:

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1

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La clonación se hace en dos etapas debido a la presencia de un sitio de enzima de restricción Apal en el EMCV IRES.

Los plásmidos de replicón se producen al transformar E. coli con el plásmido y luego aislar el plásmido ADN utilizando un Sistema de Purificación de Plásmido de Alta Pureza Marligen Biosciences (Ijamsville, MD, que utiliza una resina de intercambio de ión propietaria para producir plásmido de ADN altamente purificado. Alternativamente, otro procedimiento de purificación de ADN que resulta en ADN que es libre de ARN, proteína o endotoxina es aceptable.

Alícuotas del plásmido de replicón purificado se transcriben in vitro de ADN de plásmido linearizado Notl utilizando la polimerasa T7. Típicamente, se utiliza T7 RiboMAX Express System (Promega, Madison, Wl), que contiene una mezcla de polimerasa de ARN T7, Inhibidor ARNasa Recombinante ARNsin® y levadura de pirofosfatasa inorgánica que permite la producción de ARN a gran escala El ARN resultante luego se purifica utilizando el kit RNeasy Midi (Qiagen, Valencia, CA), que utiliza una membrana basada en gel de sílice para unir ARN y purificarlo lejos de contaminar la proteína. Alternativamente, otros esquemas de purificación de ARN que resulta en ARN purificado en agua que es libre de ARNasa es aceptable.

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Ejemplo 2

Producción de auxiliares TC-83 A. Auxiliar de ADN

Un auxiliar de ADN TC-83 se construye a partir de pCADN-VSp, que se describe en la Publicación de Patente U.S. No. 2003-0119182, Ejemplo 5. pCADN-VSp es un auxiliar de ADN en el que las proteínas estructurales VEE3014 VEE se expresan directamente a partir de un promotor CMV. La secuencia de gen glucoproteína que contiene las mutaciones TC-83 se digiere de pVE/IC-92 utilizando las enzimas de restricción Spel y Seal, y ligando en pCADN-Vsp que se ha digerido con las mismas enzimas. La mutación introducida a E1-119, que se ha notado pero no corregido por Kinney et al. (1993) J. Virol. supra como un artefacto del clon cADN para producir VE/IC-92, se repara utilizando el kit de mutagenia dirigida al sitio de cambio rápido (Stratagene, La Jolla, CA) y los cebadores TC83E1119F (GCCTTGCGGATCATGCTGAAGCATATAAAGCGC) (SEQ ID NO:2) y TC83E1119R (GCGCTTTATATGCTTCAGCATGATCCGCAAGGC) (SEQ ID NO:3) para generar pCADN-TC83r. Los cultivos E. coli transformados con los plásmidos auxiliares de ADN se envían a Puresyn, Inc. (Malvern, PA) en donde ellos crecen y el ADN resultante se purifica utilizando su tecnología PolyFlo®, que resulta en una preparación de ADN que es por lo menos 5 mg/ml y libre de ARN detectable, ssADN, ADN cromosómico o plásmido lineal.

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B. Auxiliares de ARN

La cepa VEE TC-83 ("VEETC83") no contiene cualesquier mutaciones de aminoácido en la proteína estructural cápsida, dado que un auxiliar cápsido TC-83 se puede construir de cualquier cepa VEE, por ejemplo como se describe en Pushko et al. 1997 y en la Patente U.S. Nos. 5,792,462; 6,156,558; 5,811,407; y 6,008,035. Los auxiliares de glucoproteína TC83 se construyen a partir de pCADN-TC83r, (descrito anteriormente) al digerir con Spel y Ndel y clonar en un ARN auxiliar de glucoproteína VEE (descrito en las referencias anteriores y en la Publicación de Patente U.S. No. 2002- 0141975, Ejemplo 4, incorporado aquí como referencia) que se ha digerido con las mismas enzimas para remover la secuencia de glucoproteína 3014, dejar las secuencias 5' y 3'. En ciertas modalidades, una mutación adicional en E181 (de Phe a lie) se construyen en el auxiliar de glucoproteína TC-83 mediante mutagenia dirigida al sitio, denominado aquí como "GP-E181 I".

Cada plásmido auxiliar se transcribe in vitro de ADN de plásmido linearizado Not I utilizando polimerasa T7, exactamente como se describe para los plásmidos replicón anteriores.

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Ejemplo 3

Empaque de Replicón TC-83 con Varios Auxiliares

Se producen partículas de replicón VEETC83 (VRP) mediante co-electroporación de un ARN replicón TC83 (que expresa el gen VIH GAG), y uno o más ácidos nucleicos auxiliares (ver Tabla 1) en células Vero. Luego de electroporación, las células se siembran en 2 frascos T300 que contienen OptiPRO® (Gibco, Carlsbad, CA) y se incuban durante aproximadamente 18 horas. La mitad se remueve de cada frasco, y 10 ml de una solución de lavado de sal 0.5 M en 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio se agrega a cada frasco y se incuba durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente antes de recolección y filtración. El VRP se titula al incubar diluciones seriales del lavado de sal y/o el medio recolectado sobre células Vero en placas de 96 pozos durante la noche a 37ºC y 5% CO_{2}. Las células infectadas GAG VRP se detectan utilizando un ensayo inmunofluorescente indirecto anti-GAG en células Vero fijadas con MeOH, y se determinan los títulos mediante conteo de Células positivas GAG en una dilución específica. De forma similar, se determinan los títulos GFP-VRP mediante conteo del número de Células positivas GFP en una dilución específica bajo un microscopio UV. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1

2

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Ejemplo 4

A. Empaque de Replicones VEETC83 que Expresan Varios genes Glucoproteína Alfavirus Heterólogos con Proteína Estructural TC-83

Los replicones que expresan varios ácidos nucleicos heterólogos se empacan utilizando un auxiliar de ADN TC-83 que expresa la poliproteína estructural alfavirus completa de la cepa TC-83. En este ejemplo, los genes heterólogos son casetes glucoproteína de otros alfavirus. También se incluyen Replicones TC-83 que expresan glucoproteínas VEE de la cepa TC-83 o 3014. En cada una de estas construcciones, el ácido nucleico heterólogo que codifica la glucoproteína comprende la poliproteína E3-E2-6k-E1 del respectivo virus. Los casetes glucoproteína se identifican como sigue: "WEE CBA87", de la cepa de virus encefalitis equina Western Cba 87 y "EEE4002" de la cepa de virus encefalitis equina Eastern Florida 91.

Para el casete WEE, la secuencia de nucleótido de los genes glucoproteína de virus WEE (cepa Cba 87) se clona en el Replicón TC-83, partiendo del codón serina de terminal amino de E3 a través del codón arginina de terminal carboxi de E1 (SEQ ID NO:4), como sigue:

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Para el casete EEE, la secuencia de nucleótido de los genes glucoproteína de virus EEE (cepa Florida 91) se clona en el Replicón TC-83, partiendo del codón serina de terminal amino de E3 a través del codón histidina de terminal carboxi de E1 (SEQ ID NO:5), como sigue:

4

Las partículas de replicón TC-83-VEE (VRP) se producen mediante co-electroporación de replicón ARN (que expresa la poliproteína glucoproteína alfavirus indicada), y el auxiliar de ADN único que codifica las proteínas estructurales TC-83 en células Vero 108. Luego de electroporación, las células se siembran en 2 frascos T300 que contienen OptiPRO® SFM (Gibco, Carlsbad, CA) y se incuban durante aproximadamente 18 horas. Luego se remueve la media del frasco, y se agrega 10 mls de una solución de lavado de sal 0.5 M en 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio a cada frasco y se incuba durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente antes de recolección y filtración. El VRP se titula al incubar diluciones seriales del VRP recolectado sobre células Vero en placas de 96 pozos durante la noche a 37ºC y 5% CO_{2}. Las células infectadas con VPR que expresan glucoproteína Alfavirus se detectan utilizando un ensayo de inmunofluorescencia indirecta anti-WEE, anti-VEE, o anti-EEE sobre células Vero fijadas con 1:1 Acetona:MeOH, y se determinan los títulos mediante conteo de células positivas- antígeno en una dilución específica. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

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B. Empaque de VEETC83 y Replicones VEE Tipo intacto que Expresan un Gen de SARS con Proteínas Estructurales VEETC83 o VEE3014

El gen glucoproteína S2 del virus de Síndrome Respiratorio Agudo Severo ("SARS-S2") es PCR amplificado de un clon cápsido coronavirus SARS (Urbani cepa de coronavirus SARS; # de acceso AY278741; obtenido de los Centros de los Estados Unidos para Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA) e insertado en un replicón pERK (descrito en el Ejemplo 1 anterior) como un fragmento de restricción BamHI inmediatamente en la dirección 3' del enterovirus 71 (EV71) IRES. Este replicón, capaz de expresar el gen glucoproteína SARS-S2, se empaca en VRP utilizando las proteínas estructurales 3014 o TC83. Las proteínas estructurales se expresan de dos auxiliares ARN separados o de un auxiliar ADN único. Para el método auxiliar de ARN dividido, 30 \mug de replicón ARN se combina con 30 \mug cada uno del auxiliar ARN de cápsido VEE y el auxiliar glucoproteína VEE (de VEE3014 o VEETC83, ver Ejemplo 2B anterior) y se co-electropora en células Vero1.2x10^{8}. En este experimento, la electroporación se lleva a cabo en cubetas gap de 0.4 cm utilizando cuatro pulsos, cada uno a 580V y 25 \muF. Para empacar con un auxiliar ADN único (que codifica la secuencia completa de la poliproteína estructural VEETC83 o la poliproteína estructural VEE3014), ARN replicón de 30 \mug se combina con 150 \mug del auxiliar ADN y se co-electropora en células Vero 1.2x10^{8} en una cubeta gap 0.4 cm, utilizando un pulso único a 250V y 950 \muF. Los VRP se producen, se cosechan y titulan como se describe en el Ejemplo 3A, y las producciones en base por célula se reportan en la Tabla 3. La producción por célula de VRP utilizando auxiliares glucoproteína TC-83 (como se describe anteriormente, la secuencia cápsido es la misma en VEETC83 y VEE3014), en el formato auxiliar 5 ARN o ADN, es casi 4 veces mayor de la producción recuperada con auxiliares glucoproteína 3014.

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TABLA 3 Producciones de SARS-S2 VRP de células electroporadas con auxiliares ARN vs. ADN que expresan genes glucoproteína VEE3014 o VEETC83

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C. Producción mejorada de los VRP utilizando un auxiliar ADN VEETC83

El experimento en 3B indica que el auxiliar ADN VEETC83 se asocia con producciones más altas de VRP (compara EP#3-5 con EP#6-8). Esto se confirma en una segunda pieza de experimentos, en los que los ARN replicón que expresan el gen GAG o GFP se empacan con pCADN-TC83r o el auxiliar pCADN-VSp (Ver Tabla 4). Estos estudios también confirman que la solución en la que el auxiliar ADN se resuspende antes de co-electroporación (por ejemplo agua (H_{2}O), solución salina amortiguada con fosfato (PBS) o Tris EDTA (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8.0) no proporciona efecto significativo, aún si el ADN se almacena durante muchos meses (por ejemplo 1, 3, 4, 5 o 6 meses) a -20ºC.

TABLA 4 Producción VRP de auxiliar ADN VEETC83 vs. Auxiliar ADN VEE3014

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7

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Ejemplo 5

Cromatografía de Afinidad Heparina de los VPR TC-83

Los VPR TC-83, se recolectan de células Vero vía un lavado con sal de 1 M de las células, se diluyen con fosfato de sodio 16 mM (SP) pH 7.4 en una concentración de cloruro de sodio 0.12 M o menos. La solución luego se carga en una columna que contiene resina de flujo rápido sefarosa Heparina (Amersham) en una velocidad lineal de 5 ml/min. Los VPR TC-83 se eluyen con un gradiente lineal de concentración de cloruro de sodio incrementada (aproximadamente 120 mM a 1 M). Los VPR TC-83 se eluyen en una concentración de cloruro de sodio de aproximadamente 3 M a un pH de 7.4. La Figura 1 muestra el perfil de elusión de VPR TC-83 purificados mediante este método. El pico UV afilado (entre fracciones 14 y 23) corresponde a la elusión VRP. Las fracciones que contienen el VPR mayor 1e9 (fracciones 18-23) se recolectan de la columna y se formulan mediante dilución directa en 1% de albúmina de suero humana y 5% sacarosa. Antes de formulación, las unidades infecciosas 1e8 (IU) de VPR de masa purificada se fraccionan mediante SDS- PAGE y se analizan mediante la teñido plata o western blot utilizando anticuerpos específicos de cápsido o glucoproteína para ensayar la pureza (Figura 2). En el gel teñido de plata, solo las bandas correspondientes en tamaño al cápsido y glucoproteínas son evidentes, indicando un nivel sorprendente de pureza.

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Ejemplo 6

Inmunogenicidad de los VPR TC-83

La inmunogenicidad de los VPR TC-83 ha sido estudiada en animales de laboratorio.

Ratones BALB/c, cinco animales por grupo, se inmunizan con las partículas VRP indicadas mediante inoculación subcutánea en la almohadilla plantaria en la dosis indicada. Los animales se inmunizan tres veces (en 3 intervalos semanales). Las respuestas humorales se miden mediante GAG ELISA 7 días después de la primera y segunda inoculaciones de refuerzo, y se miden las respuestas celulares mediante ELISPOT interferón-gamma 7- días después de la segunda inoculación de refuerzo. Los datos ELISA y ELISPOT presentados en la Tabla 6 son las medias geométricas y aritméticas, respectivamente, calculados de los cinco ratones de cada grupo. La respuesta para el vector VEE se ensaya mediante un ensayo de neutralización VEE (ver adelante).

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TABLA 6 Inmunogenicidad en Ratones, Experimento 1

8

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Para demostrar que cada ratón de cada grupo de tratamiento TC-83 responde a ambas respuestas humoral y celular, los rangos para las cinco respuestas registradas para cada grupo de tratamiento se presentan en la siguiente Tabla 7:

TABLA 7 Respuestas Inmunes Humoral y Celular (Experimento 1, Ratones)

9

TABLA 8 Respuestas Humoral y Celular (Experimento 2, ratones)

10

TABLA 9 Respuesta anti-vector (para los animales en la Tabla 8)

11

También se llevan a cabo estudios en primates. La inmunogenicidad de una vacuna Replicón TC-83 que contiene el mismo gen gag Clade VIH, se conduce en macacos cinomólogos en el Southern Research Institute, Frederick, MD. La construcción utilizada en este estudio es un replicón TC-83 IRES como se describió anteriormente, que contiene la secuencia espaciadora de nucleótido EMCV IRES, y una secuencia espaciadora de nucleótido 342 (ver Ejemplo 1). Cada vacuna se administra a seis animales mediante inyección subcutánea e intramuscular (tres animales/ruta). Los animales reciben tres inoculaciones de 1 x 10^{8} partículas de vacuna en 0, 1 y 6 meses. Las respuestas inmunes humorales para gag se analizan 2 semanas después de cada inoculación de refuerzo, así como también 20 semanas después del primer refuerzo, es decir antes del segundo refuerzo. Las respuestas anti-vector también se miden (ver Ejemplo 6C). Se obtienen datos de seguridad adicionales a través de las químicas clínicas y hematología (hemoglobina, WC, conteo de plaqueta) que se conduce dos semanas después de cada inoculación.

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TABLA 10 Inmunización en Primates: Respuestas ELISA para Macacos Cinomólogos (animales individuales)

12

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TABLA 11 ELISA GMT (Título de Media Geométrica, Macacos Cinomólogos)

13

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La inmunidad celular también se mide en el modelo primate. Las respuestas de célula T Anti-Gag en macacos cinomólogos vacunados con varios VRP (en los que se expresa la secuencia que codifica gag VIH) se miden utilizando ensayos ELISPOT interferón-gamma utilizando péptidos de polos de traslapo 9mer o 15mer de la proteína Gag VIH. Los datos se presentan en la Tabla 12 como el número de animales que responden positivamente/animales totales que reciben el protocolo de vacunación. Los animales que responden positivamente se definen como aquellos quienes responden más de 10 puntos después del antecedente de substracción de las respuestas a polos de péptido irrelevantes.

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TABLA 12 Respuestas de célula T anti-Gag en Cinomólogos como Macacos

14

También se analizan respuestas de célula T de Macaco utilizando análisis de cepa de citoquina intracelular (ICS), en los que se purifican las células 6 semanas post-refuerzo 2 se analizan para la producción IL-2 y IL-4 en respuesta a los péptidos de traslapado Gag 15mer mediante ICS. Los resultados se presentan en la Tabla 13, en donde los animales que responden positivamente se definen como aquellos quienes responden por lo menos 2 veces a los polos de péptido irrelevantes.

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TABLA 13 Análisis ICS de Macacos Vacunados

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15

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Las respuestas de célula T acumuladas en los macacos se resumen en la Tabla 14.

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TABLA 14 Resumen: Respuestas de célula T específicas Gag en Macacos

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16

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Se determina la inmunidad humoral utilizando un ELISA específico Gag (ensayo inmunoabsorbente unido a enzima). El objetivo histidina recombinante purificado (his)-p55 de VIH-1 subtipo C aislado DU-422 (AIDS Res. Hum. Retrovirus. 2003 Feb;19(2): 133-44) se utiliza como el antígeno de recubrimiento. En resumen, se preparan las células BHK se transfectan con ARN replicón VEE que expresa los lisatos his-p55, y Triton-X 100. Se purifica la proteína mediante cromatografía de afinidad de ión de metal (níquel) utilizando una resina disponible comercialmente y de acuerdo con las instrucciones del distribuidor.

Se evalúa suero murino, 7 días post-refuerzo, para la presencia de anticuerpos específicos Gag mediante un ELISA indirecto estándar. Para la detección de Ig total específico Gag, se utiliza un anticuerpo policlonal secundario que detecta IgM, IgG y IgA para determinación de título de punto final. En resumen, placas ELISA de 96 pozos Maxisorp (Nunc, Naperville, IL) se recubren con 50 \mul de 0.05 M de amortiguador de carbonato de sodio, pH 9.6 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) que contiene 40-80 ng his-p55 por pozo. Las placas se recubren con plástico adhesivo y se incuban durante la noche a 4ºC. Al siguiente día, se desecha el antígeno no unido, y las placas se incuban durante 1 hora con 200 \mul de amortiguador de bloqueo (PBS que contiene 3% p/v BSA) a temperatura ambiente. Los pozos se lavan 6 veces con PBS y 50 \mul de suero de prueba, se diluyen serialmente en dos veces amortiguador (PBS con 1% w/v BSA y 0.05% v/v Tween 20), se agrega a los pozos cubiertos con antígeno. El anticuerpo monoclonal anti-p24 de ratón (Zeptometrix, Buffalo, NY) se incluye en cada ensayo como un control positivo. Los controles negativos en cada ensayo incluyen blancos (también con todos los reactivos y tratamientos excepto suero) y el suero se pre-mezcla. Las placas se incuban durante una hora a temperatura ambiente, y luego se enjuagan 6 veces con PBS. 50 \mul/pozo de fosfatasa alcalina (AP)-conjugado de anticuerpo secundario de poli-isotipo anti-ratón de cabra (Sigma) diluido para una concentración predeterminada en amortiguador diluyente que se agrega a cada pozo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se enjuagan 6 veces con PBS la adición anterior de 100 \muL de sustrato de fosfato p-nitrofenilo (pNPP) (Sigma). El título ELISA de anticuerpo de suero se define como el inverso de la dilución de suero más grande dando una densidad óptica en 405 nm mayor de o igual a 0.2 anterior (pozos
blancos).

Las células que secretan interferón-gamma específicas a antígeno GAG (IFN-\gamma) se detectan utilizando un ensayo IFN-yELISPOT. Las suspensiones celulares únicas de linfocitos esplénicos de ratones BALB/c inmunizados TC-83 VRP-GAG- se preparan mediante interrupción física de la cápsula esplénica en medio R-10 (medio RPMI 1640 complementado con 100 U/ml penicilina, 100 \mug/ml estreptomicina, 0.1 mM de solución de aminoácidos no esenciales MEM, 0.01 M HEPES, 2 mM glutamina y 10% suero fetal de becerro inactivado por calor). Se aíslan los linfocitos mediante centrifugación de gradiente de densidad M (Accurate Scientific, Westbury, NY), se lavan dos veces y se resuspenden en medio R-10 fresco. Total, se ensayan las poblaciones de linfocito esplénico no separadas.

Un kit IFN y ELISPOT de ratón (Monoclonal Antibody Technology, Nacka, Sweden) se utiliza para desarrollar el ensayo. Se siembran células viables en pozos ELISPOT individuales en una placa Multiscreen Immobilon-P ELISPOT (placa de filtración de 96 pozos certificada ELISPOT, Millipore, Bedford, MA) que se ha precubierto con un anticuerpo monoclonal anti- IFN-Y, y se incuba durante 16-20 horas. Las células se remueve mediante lavados múltiples con amortiguador y los pozos se incuban con un anticuerpo monoclonal anti- IFN-Y biotinilado, seguido por lavado e incubación con complejo Avidin- Peroxidasa (Vectastain ABC Peroxidasa Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Luego de incubación, los pozos se lavan y se incuban durante 4 minutos a temperatura ambiente con sustrato (comprimidos de complejo de Avidin-Peroxidasa, Sigma) para facilitar la formación de manchas, que representan las posiciones de células que secretan IFN-\gamma individuales durante el cultivo. Las placas se enumeran mediante análisis automatizado con un sistema Zeiss KS ELISPOT.

Para enumerar las células que secretan IFN-\gamma específicas Gag en linfocitos de ratones inmunizados con varias construcciones VRP que expresan gag, los linfocitos se estimulan con el péptido VIH-Gag que restringe a CD8 H-2Kd inmunodominante, o un péptido Influenza-HA que restringe CD8 H-2Kd irrelevante durante 16-20 horas (5% CO_{2} a 37ºC). Los péptidos se prueban en 10 \mug/ml y el control nef se prueba a 20 \mug/ml. El péptido menos las células sirve como un control precedente. Como un control positivo, se estimulan células con 4 \mug/mL concanavalina A durante un periodo de tiempo similar. Se sintetizan péptidos y se purifican para >90% en el péptido Inglés Nuevo.

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C. Ensayo de Neutralización VEE

La actividad de anticuerpo neutralizante contra el virus de encefalitis equina Venezolana (VEE) se mide en muestras de suero de animales inmunizados (ratones o monos cinomólogos) utilizando partículas replicón VEE (VRP). Esta prueba se diseña para ensayar la prevención de infección VRP productiva de células susceptibles a VRP al neutralizar anticuerpos que están presentes en el suero. En este ensayo, una cantidad definida de proteína fluorescente verde que expresa VRP de propagación defectuosa (GFP) se mezcla con diluciones seriales del suero del animal, se incuba, y se inocula en monocapas celulares. Luego de otro periodo de incubación, las monocapas celulares se examinan para células positivas GFP bajo luz UV. La inefectividad de VPR que expresa GFP ("GFP-VRP") se previene, o "neutraliza", mediante anticuerpos neutralizantes específicos de virus VEE en el suero. Este ensayo se desarrolla como sigue: Día 1: Suero de animales inmunizados (ratones o monos cinomólogos) es inactivado por calor a 56ºC durante 30 minutos, y luego se diluye serialmente en el medio (MEM con sales Earle y L-glutamina, Invitrogen 11095072, complementado con 0.1 mM aminoácidos no esenciales, 100 U/ml penicilina y 100 \mug/ml estreptomicina). Estas diluciones se mezclan con una cantidad definida (entre 5 x 10^{3} y 1.5 x 10^{4}) de GFP-VRP y se incuba durante la noche a 4ºC. Día 2: 50 \mul del suero: mezcla de GFP-VRP se agrega a una placa de 96 pozos de células Vero confluentes y se incuba a 37ºC durante una hora. El suero: mezcla de GFP-VRP se remueve y se coloca con 100 \mul de medio fresco y se incuba durante la noche a 37ºC. Día 3: número de células positivas GFP se cuantifican bajo luz UV. El nivel de neutralización de 80% se determina para cada muestra y se define como la dilución de suero más grande dando media de células positivas GFP (GPC) por rejilla que es menor de o igual a 20% del número de GPC por rejilla en pozos de control infectados con GFP-VRP solo o con GFP-VRP pre-incubado con suero de control negativo (es decir suero
pre-inmunización).

TABLA 15 Respuestas Anti-VEE en Ratones inmunizados con GAG-VRP

17

TABLA 16 Respuestas Anti-VEE en monos Cinomólogos inmunizados con GAG-VRP

18

<110> Alphavax, Inc

\hskip1cm

Rayner, Jon

\hskip1cm

Smith, Jonathan F.

\hskip1cm

Hubby, Bolyn

\hskip1cm

Reap, Elizabeth

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<120> Vectores alfavirus Derivados TC-83, Partículas y Métodos

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<130> 124-03 WO

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<140> no asignado

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<141> 2005-05-18

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<150> US 60/572,212

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<151> 2004-05-18

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<160> 5

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 342

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Fragmento de ADN clonado para asegurar el control translacional propio

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<400> 1

19

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<210> 2

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido útil como un cebador

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

gccttgcgga tcatgctgaa gcatataaag cgc

\hfill

33

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<210> 3

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido útil como un cebador

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctttata tgcttcagca tgatccgcaa ggc

\hfill

33

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<210> 4

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<211> 2931

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Casete de virus encefalitis equino Western

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<400> 4

20

21

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<210> 5

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<211> 2943

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Casete de virus encefalitis equino Eastern

\newpage

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<400> 5

23

24

Claims (27)

1. Un método para preparar Partículas de replicón alfavírica del virus de encefalitis equina Venezolana, dicho método comprende las etapas de:

(a) introducir un ácido nucleico replicón alfavírico en una célula anfitriona, dicho ácido nucleico replicón alfavírico comprende

(i)

una secuencia 5' TC-83 de cepa de encefalitis equina Venezolana que inicia transcripción de ARN de alfavirus, (ii) una o más secuencias de nucleótido que juntas codifican aquellas proteínas no estructurales de alfavirus TC-83 necesario para la replicación del ARN replicón, (iii) una señal de empaque de virus, (iv) por lo menos un heterólogo que codifica o secuencias funcionales que se puede expresar en dicho ácido nucleico de replicón alfavírico, y (v) una secuencia de reconocimiento de polimerasa de ARN 3' de TC-83 de cepa de encefalitis equina Venezolana, en donde dicha célula anfitriona comprende por lo menos una función auxiliar que codifica una proteína de cápsido TC-83 y glucoproteínas TC-83, para producir una célula anfitriona modificada;

(b) cultivar dicha célula anfitriona modificada bajo condiciones que permiten la expresión de por lo menos una función auxiliar, que permite la replicación de dicho ácido nucleico replicón alfavírico y empaque de dicho ácido nucleico replicón alfavírico para formar partículas de replicón alfavírico.

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2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de:

(c) poner en contacto las células anfitrionas modificadas después de la etapa (b) con una solución acuosa que tiene una resistencia iónica de por lo menos 0.2 M para liberar las partículas de replicón alfavírico en la solución acuosa para producir una partícula de replicón alfavírico que contiene la solución, en donde la resistencia iónica está opcionalmente entre 0.5 M y 5 M;

(d) recolectar partículas de replicón alfavírico a partir de la partícula de replicón alfavírico que contiene la solución de la etapa (c).

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3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde por lo menos una función auxiliar en la célula anfitriona de la etapa (a) se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico estable integrado dentro del genoma de dicha célula anfitriona.

4. El método de la reivindicación 1, en donde por lo menos una función auxiliar en la célula anfitriona se introduce en por lo menos un ácido nucleico auxiliar que codifica una proteína de cápsido capaz de unir dicho ácido nucleico de replicón alfavírico, y por lo menos una glucoproteína alfavírica, en donde dicha glucoproteína alfavírica se asocia con dicho ácido nucleico replicón alfavírico y dicha proteína cápsida, en donde por lo menos una molécula de ácido nucleico auxiliar se introduce en la célula anfitriona junto con dicho ácido nucleico de replicón alfavírico.

5. El método de la reivindicación 1, en donde por lo menos una función auxiliar se codifica mediante por lo menos dos moléculas de ácido nucleico auxiliares, en donde cada una de dichas dos moléculas de ácido nucleico auxiliares codifica por lo menos una función auxiliar vírica.

6. El método de la reivindicación 1, en donde por lo menos una molécula de ácido nucleico auxiliar es una molécula de ADN.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico replicón alfavírico se introduce en dicha célula anfitriona mediante electroporación.

8. El método de la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente una etapa de lavado celular, antes de la etapa (c) de la reivindicación 2; en donde, opcionalmente, la solución de lavado celular no contiene sal y que comprende adicionalmente ADNasa.

9. El método de la reivindicación 7 para preparar partículas de replicón alfavírico que comprende introducir el ácido nucleico replicón alfavírico y una o más moléculas de ácido nucleico auxiliares en las células anfitrionas, las células anfitrionas comprenden células de alfavirus permisivas en un medio de cultivo durante electroporación están en una concentración de por lo menos medio 10^{8} células/ml y en donde el ácido nucleico replicón alfavírico se agrega a las células antes de electroporación en una concentración de aproximadamente 35 \mug por ml.

10. El método de la reivindicación 7 o 9, en donde la electroporación se lleva a cabo en una cubeta de electroporación en donde un espacio entre los electrodos está entre 0.4 y 1.0 cm.

\newpage

11. El método de la reivindicación 8, en donde el ácido nucleico auxiliar es una molécula de ADN única que codifica todas las proteínas estructurales de alfavirus; en donde el auxiliar de ADN está, opcionalmente, en una concentración de por lo menos 100 \mug/ml.

12. El método de la reivindicación 1 o 9, en donde el cultivo celular permisible de alfavirus es un cultivo de células Vero.

13. El método de la reivindicación 2 o 9, en donde la etapa (d) es seguida por una etapa de cromatografía de intercambio de ión.

14. El método de la reivindicación 2 o 9, en donde la etapa de lavado de sal utilizada en el método se selecciona del grupo que consiste de NaCl, KCI, MgCl_{2}, CaCl_{2}, NH_{4}Cl, (NH_{4})_{2}SO_{4}, NH_{4}HCO_{3} y acetato de NH_{4}.

15. Un ácido nucleico replicón alfavírico comprende (i) una secuencia 5' TC-83 de cepa de encefalitis equina Venezolana que inicia transcripción de ARN de alfavirus, (ii) una o más secuencias de nucleótido que juntas codifican aquellas proteínas no estructurales de alfavirus TC-83 necesarias para la replicación del ARN replicón, (iii) una señal de empaque de virus, (iv) por lo menos un heterólogo que codifica o secuencia funcional que se puede expresar en dicho ácido nucleico de replicón alfavírico, y (v) una secuencia de reconocimiento de polimerasa ARN 3' TC-83 de cepa de encefalitis equina Venezolana.

16. Uso de una composición que comprende partículas de alfavirus de propagación defectuosa, infecciosas y un portador farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para producir una respuesta inmune en un sujeto, en donde cada partícula comprende un ARN replicón alfavírico, que comprende una señal de empaque de alfavirus y una o más secuencias de ARN heterólogas que codifican un inmunógeno, y en donde dichas secuencias carecen de ARN replicón alfavírico que codifica las proteínas estructurales de alfavirus, y en donde cada partícula comprende proteínas estructurales de TC-83 de virus de encefalitis equina Venezolana.

17. El uso de la reivindicación 16, en donde la composición es para ser administrada vía inyección intramuscular, subcutánea o intraperitoneal.

18. El uso de la reivindicación 16, en donde el ARN replicón alfavírico es del virus equino Venezolano.

19. El uso de la reivindicación 16, en donde hay una secuencia de ARN heteróloga o existen dos secuencias de ARN heterólogas.

20. Una composición que comprende partículas de alfavirus de propagación defectuosa, infecciosas, en donde las partículas comprenden proteínas estructurales TC-83 de virus de encefalitis equina Venezolana y un ARN replicón alfavírico, dicho ARN replicón alfavírico comprende una señal de empaque de alfavirus y una o más secuencias de ARN heterólogas que codifica por lo menos un inmunógeno, y dichas secuencias que carecen de ARN replicón alfavírico codifican las proteínas estructurales.

21. La composición de la reivindicación 20, en donde el ARN replicón alfavírico es del Virus de encefalitis equina Venezolana; en donde el ARN replicón alfavírico es, opcionalmente, de TC-83 de virus de encefalitis equina Venezolana.

22. La composición de la reivindicación 20, en donde dicha composición es una composición farmacéutica.

23. Una célula auxiliar para producir partículas de alfavirus de propagación defectuosa, infecciosas que comprende:

(a) un ARN replicón alfavírico que codifica una secuencia de ARN heteróloga y que carece de secuencias que codifican las proteínas estructurales de alfavirus; (b) un primer ARN auxiliar que codifica por lo menos uno pero no todas las proteínas estructurales TC-83 de virus de encefalitis equina Venezolana; y (c) un segundo ARN auxiliar que no codifica por lo menos una proteína estructural TC-83 de virus de encefalitis equina Venezolana codificada mediante el primer ARN auxiliar y que codifica por lo menos una proteína estructural de virus de encefalitis equina Venezolana TC-83 mediante el primer ARN auxiliar, en donde el ARN replicón alfavírico es, opcionalmente, un ácido nucleico replicón alfavírico TC-83 de virus de encefalitis equina Venezolana.

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24. Una célula auxiliar para producir partículas de alfavirus de propagación defectuosa, infecciosas comprende:

(a) un ARN replicón alfavírico que codifica una secuencia de ARN heteróloga y que carece de secuencias que codifican las proteínas estructurales de alfavirus; y

(b) uno o más plásmidos de ADN auxiliares que codifican todas las proteínas estructurales del TC-83 de virus de encefalitis equina Venezolana, en donde el ARN replicón alfavírico es, opcionalmente, un ácido nucleico replicón alfavírico TC-83 de virus de encefalitis equina Venezolana.

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25. El uso de la reivindicación 16 o la composición de la reivindicación 20 o 22, en donde por lo menos una de las proteínas estructurales de TC-83 de encefalitis equina Venezolana se ha modificado para contener por lo menos una mutación de atenuación adicional.

26. La célula auxiliar de la reivindicación 23, en donde por lo menos uno del primero y segundo ARN auxiliar se ha modificado para codificar las proteínas estructurales de TC-83 de encefalitis equina Venezolana que contiene por lo menos una mutación de atenuación adicional.

27. La célula auxiliar de la reivindicación 24, en donde por lo menos una proteína estructural TC-83 de encefalitis equina Venezolana se ha modificado para contener por lo menos una mutación de atenuación adicional.