ES2327643T3 - Vacunas contra citomegalovirus basadas en alfavirus. - Google Patents
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Abstract
Una población de partículas de replicones de alfavirus en la que dichas partículas comprenden ARN de replicones de alfavirus, en la que un primer ARN de replicón comprende el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de las proteínas pp65 e IE1 del citomegalovirus o sus epítopos, y un segundo ARN de replicón que comprende el ácido nucleico que codifica la proteína gB del citomegalovirus o uno de sus epítopos, y en la que cada uno del primer y segundo ARN está contenido dentro de una partícula de replicón de alfavirus separada.
Description
Vacunas contra citomegalovirus basadas en
alfavirus.
El citomegalovirus humano (HCMV) es un
herpesvirus que causa infección extensa y que se encuentra en todas
las localizaciones geográficas y grupos socioeconómicos, con hasta
el 85% de adultos infectados para la edad de 40 años en los Estados
Unidos. Para las personas más sanas que adquieren el virus después
del nacimiento no hay consecuencias a largo plazo. Sin embargo, el
riesgo de infección por HCMV es significativo para varios grupos de
alto riesgo incluidos: (i) niños nonatos, (ii) adultos que trabajan
con niños, y (iii) personas inmunocomprometidas. La prevalencia de
estos grupos de riesgo subyace la importancia del desarrollo de una
vacuna segura y
eficaz.
eficaz.
El HCMV es secretado típicamente por una serie
de líquidos biológicos, por ejemplo, saliva, orina y semen. Por
consiguiente, la transmisión del virus entre las personas puede
producirse por contacto sexual o no sexual. Un individuo puede
contraer el HCMV a través de la sangre o de transplantes de órganos,
y una madre puede transmitirlo a su feto nonato.
El virus demuestra una latencia durante toda la
vida, pero es más comúnmente no sintomático en los individuos
sanos. Algunas veces puede causar una enfermedad con síntomas
similares a los asociados con la mononucleosis. Sin embargo, puede
causar enfermedad grave en individuos inmunocomprometidos, por
ejemplo, receptores de transplantes o en individuos con síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA), además de los efectos graves,
debilitadores en nonatos cuyos sistemas inmunes aún no han
madurado.
En el caso de los transplantes, los receptores
de transplantes de médula ósea muestran una incidencia relativamente
alta de neumonía inducida por HCMV, con la consiguiente elevada
mortalidad entre estos pacientes. En los pacientes con transplantes
de órganos sólidos, las enfermedades provocadas por el HCMV pueden
incluir un síndrome de HCMV (constituido por fiebre y leucopenia),
hepatitis, colitis y neumonía. La enfermedad inducida por HCMV en
estos receptores de transplantes está causada por los efectos
inmunosupresores de los fármacos necesarios para la aceptación del
transplante y la inducción de la enfermedad de injerto frente al
huésped (GVHD). El efecto de la GVHD es más grave en los casos
donde el donante del órgano/médula es seropositivo para HCMV y el
receptor es seronegativo para HCMV.
Para los pacientes con SIDA, el HCMV es la
infección oportunista más común, en gran parte por el hecho de que
más del 90% de los individuos infectados por VIH están infectados
también con HCMV. En estos pacientes, la infección se manifiesta
más comúnmente como retinitis, y se presenta usualmente cuando los
recuentos de células CD4+ son inferiores a 50/\mul. Antes de la
adopción de los protocolos antirretrovirales altamente activos
(HAART), del 20 al 44% de los pacientes con SIDA desarrollaban
enfermedad por HCMV. Mientras que el uso de los HAART ha dado
también lugar a la reducción de la enfermedad por HCMV, la falta de
disponibilidad de HAART para muchos pacientes con SIDA, así como la
incapacidad de muchos pacientes para tolerar los HAART durante
períodos de tiempo prolongados, hacen que la posibilidad de
enfermedad por HCMV sea una preocupación continua.
El HCMV congénito, un resultado de la
transmisión de la madre al feto, se produce en una tasa general de
aproximadamente 1%, pero las tasas son mucho más altas y la
enfermedad sintomática es más común cuando la madre tiene una
infección primaria. Las mujeres pueden infectarse a través del
contacto sexual, ya que la propagación del virus desde el cérvix y
en el semen es común. Los niños infectados pueden permanecer
virémicos durante hasta cinco años después del nacimiento,
convirtiéndose en una fuente importante de infección en las
guarderías.
El HCMV congénito puede tener manifestaciones
horrendas en los niños. Puede desarrollarse una enfermedad
fulminante de inclusión citomegálica, caracterizada por ictericia,
sarpullido petequial, hepatoesplenomegalia, microcefalia y
coriorretinitis. Con frecuencia se produce pérdida progresiva de la
audición y retraso mental, que puede ser grave. Los costes
estimados para la sociedad en términos de cuidados para las víctimas
del HCMV congénito son de aproximadamente cuatro mil millones de
dólares.
Por consiguiente, sigue existiendo una clara
necesidad de una vacuna segura y eficaz para combatir la infección
por HCMV, tanto de manera profiláctica (por ejemplo, en adolescentes
y en mujeres con capacidad para procrear para prevenir la infección
congénita o en candidatos a transplantes no infectados por HCMV)
como de manera terapéutica (por ejemplo, en pacientes de
transplantes infectados por HCMV antes y después del transplante de
un órgano o de médula ósea).
Se proporcionan revisiones del desarrollo de
diversas vacunas contra el citomegalovirus por Gonczol and Plotkin
(Expert Opinion of Biological Therapy, 2001, 1(3)
401-412) y por Temperton (International Journal of
Antimicrobial Agents; 2002, 19(3)
169-172.
McCue and Anders (Protein Expression and
Purification, 1998, 13(3) 301-312) describen
el uso del sistema de expresión del virus Semliki Forest para
expresar una serie de genes de citomegalovirus en células de
mamífero.
Rayner y col. (Reviews in Medical Virology,
2002, 12(5) 279-296) y Schlesinger and
Dubensky (Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10(5)
434-439) describen el uso de vectores de replicones
de alfavirus para vacunación.
La Figura 1 es un diagrama del vector de
replicón VRP-pp65/IE1/Tr-gB.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo
de neutralización de CMV tras la inmunización de ratones con
diversas vacunas de CMV-VRP.
Las Figuras 3A-B muestran los
resultados de un ensayo ELISPOT de IFN-\gamma tras
la inmunización de ratones con vacunas de CMV-VRP.
La Figura 3A muestra los resultados obtenidos usando el péptido pp65
Nº 3 y una combinación de péptidos pp65 para evaluar las respuestas
inmunes celulares. La Figura 3B muestra los resultados obtenidos
usando el péptido IE1 Nº 50 y una combinación de péptidos IE1 para
evaluar las respuestas inmunes celulares.
La presente invención proporciona una población
de partículas de replicones de alfavirus en la que dichas
partículas comprenden ARN de replicones de alfavirus, en la que un
primer ARN del replicón comprende el ácido nucleico que codifica
una proteína de fusión de citomegalovirus pp65 y las proteínas IE1 o
sus epítopos, y un segundo ARN del replicón comprende el ácido
nucleico que codifica la proteína gB del citomegalovirus o uno de
sus epítopos, y en la que cada uno del primer y segundo ARN del
replicón está contenido dentro de una partícula de replicón de
alfavirus separada.
Además, en el presente documento se proporciona
una población de partículas de replicones de alfavirus en la que
dichas partículas comprenden un ARN del replicón que comprende una
casete reguladora que dirige la transcripción y la traducción de un
ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de
citomegalovirus pp65 y las proteínas IE1, o sus epítopos.
En el presente documento también se proporcionan
usos de las poblaciones de esta invención en la fabricación de un
medicamento para inducir una respuesta inmune para el CMV en un
sujeto.
También se proporciona el uso de un primer
componente de inmunización seleccionado del grupo constituido por
una población de partículas de replicones de alfavirus que codifican
inmunógenos de CMV, inmunógenos de CMV, moléculas de ácido nucleico
que codifican inmunógenos de CMV, un vector viral no alfaviral que
codifica inmunógenos de CMV, y cualquiera de sus combinaciones en
la fabricación de un medicamento para cebar una respuesta inmune
para el CMV, previo a estimular la respuesta de cebado por medio de
la administración de un segundo componente de inmunización
seleccionado del grupo constituido por una población de partículas
de replicones de alfavirus que codifican inmunógenos de CMV,
inmunógenos de CMV, moléculas de ácido nucleico que codifican
inmunógenos de CMV, un vector viral no alfaviral que codifica
inmunógenos de CMV, y cualquier combinación, en el que el primer
componente de inmunización es diferente del segundo componente de
inmunización y en el que al menos el primer componente de
inmunización o el segundo componente de inmunización es una
población según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
También se proporciona el uso de un segundo
componente de inmunización seleccionado del grupo constituido por
una población de partículas de replicones de alfavirus que codifican
inmunógenos de CMV, inmunógenos de CMV, moléculas de ácido nucleico
que codifican inmunógenos de CMV, un vector viral no alfaviral que
codifica inmunógenos de CMV, y cualquiera de sus combinaciones en
la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta
inmune para el CMV, tras la respuesta de cebado de la administración
de un primer componente de inmunización seleccionado del grupo
constituido por una población de partículas de replicones de
alfavirus que codifican inmunógenos de CMV, inmunógenos de CMV,
moléculas de ácido nucleico que codifican inmunógenos de CMV, un
vector viral no alfaviral que codifica inmunógenos de CMV, y
cualquier combinación, en el que el primer componente de
inmunización es diferente del segundo componente de inmunización y
en el que al menos el primer componente de inmunización o el
segundo componente de inmunización es una población según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4.
Según se usa en el presente documento,
"un", "una", o "el", "la" pueden significar uno
o más de uno. Por ejemplo, "una célula" puede significar una
célula o una pluralidad de células.
"Alfavirus" significa un género de virus,
que son todos miembros de la familia Togaviridae. Los alfavirus
conocidos incluyen el virus de la encefalitis equina oriental (EEE),
el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus de
Everglades, el virus Mucambo, el virus Pixuna, el virus de la
encefalitis equina occidental (WEE), el virus Sindbis, el arbovirus
86 Sudafricano (S.A.AR86), el virus Semliki Forest, el virus
Middleburg, el virus Chikungunya, el virus
O'nyong-nyong, el virus Ross River, el virus Barmah
Forest, el virus Getah, el virus Sagiyama, el virus Bebaru, el
virus Mayaro, el virus Una, el virus Aura, el virus Whataroa, el
virus Babanki, el virus Kyzylagach, el virus Highlands J, el virus
Fort Morgan, el virus Ndumu y el virus Buggy Creek. El genoma
alfaviral es un ARN mensajero codificador monocatenario, modificado
en el extremo 5' con un casquete metilado y en el extremo 3' con
una extensión de poli (A) de longitud variable. Las subunidades
estructurales que contienen una sola proteína viral, cápside, se
asocian con el genoma de ARN en una nucleocápside icosaédrica. En
el virión, la cápside está rodeada por una cubierta lipídica
cubierta con una matriz regular de espículas de proteínas
transmembranarias, cada una de las cuales está constituida por un
complejo heterodimérico de dos glicoproteínas, E1 y E2. Véase
Pedersen y col., J. Virol. 14:40 (1974). Se considera que los virus
Sindbis y Semliki Forest son los alfavirus prototípicos, y se han
estudiado de manera extensa. Véase Schlessinger, The Togaviridae
and Flaviviridae, Plenum Publishing Corp., Nueva York (1986). Los
alfavirus de preferencia usados en las construcciones y
procedimientos de la invención reivindicada son VEE, S.A.AR86,
Sindbis (por ejemplo, TR339, véase la Patente de EEUU Nº 6.008.035)
y el virus Semliki Forest.
Dentro de cada uno de los alfavirus nombrados,
se conocen cepas y/o subtipos. Por ejemplo, se conocen varias cepas
del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). Dentro de las
cepas conocidas del VEE, se han reconocido subtipos. Por ejemplo,
la cepa Trinidad Donkey es un subtipo IA/B, y los subtipos
relacionados incluyen IC e IE. Se han aislado cepas virulentas del
VEE durante la encefalitis epizoótica transmitida por mosquitos en
équidos en áreas tropicales y subtropicales del Nuevo Mundo. La cepa
Trinidad Donkey es una de las cepas virulentas, epizoóticas, y se
ha pasado en serie en cultivo de tejidos para crear una cepa viva,
atenuada (Berge y col. Amer. J. Hyg. 73: 209-218
(1961)) conocida como TC-83. Esta cepa, que contiene
múltiples mutaciones de atenuación (véase a continuación, y Kinney
y col. 1989 Virology 170: 19-30 (1989); con
corrección informada en Kinney y col. J Virol 67(3):
1269-1277 (1993)) provoca la generación de
anticuerpos neutralizantes específicos de VEE en la mayoría de los
seres humanos y equinos y se ha usado exitosamente como una vacuna
en ambas especies (por ejemplo, Pittman y col. Vaccine
14(4): 337-343 (1996)). Por consiguiente, la
cepa TC-83 de VEE puede también servir como la base
genética para un sistema vector de replicones de alfavirus como se
describe en el presente documento.
Los términos "replicón de ARN del
alfavirus", "ARN replicón de alfavirus", "vector de
replicón de alfavirus" y "replicón vector de ARN de
alfavirus" se usan indistintamente para referirse a una molécula
de ARN que expresa genes de proteínas no estructurales de manera
tal que es capaz de dirigir su propia replicación (amplificación) y
comprende, como mínimo, las secuencias 5' y 3' de reconocimiento de
la replicación del alfavirus, secuencias codificadoras para
proteínas no estructurales de alfavirus, y una extensión de
poliadenosina. Puede contener además una casete reguladora y un
ácido nucleico heterólogo de interés que se expresa a partir de la
casete reguladora. Puede construirse también para que exprese una y
no todas las proteínas estructurales del alfavirus.
Las formas de realización de los replicones de
ARN del alfavirus utilizadas en la invención reivindicada pueden
contener una o más "mutaciones de atenuación", siendo una
mutación de atenuación una deleción, adición o sustitución de
nucleótidos, o una mutación que comprende construcciones quiméricas
o reorganizaciones que dan lugar a la pérdida de virulencia en un
virus vivo que contiene la mutación comparado con el alfavirus de
tipo salvaje adecuado. Previamente se han descrito varios ejemplos
de mutaciones de atenuación en las Patentes de EEUU Nº 5.639.650,
5.792.462 y 6.15.558. Las mutaciones de atenuación específicas para
la glicoproteína E1 del VEE pueden incluir una mutación de
atenuación en cualquiera de las posiciones de los aminoácidos 81,
272 y/o 253 de E1. Las partículas de alfavirus obtenidas a partir
del mutante VEE-3042 contienen una sustitución de
isoleucina en la posición 81 de E1, y las partículas de virus
obtenidas a partir del mutante VEE-3040 contienen
una mutación de atenuación en la posición 253 de E1. Las mutaciones
de atenuación específicas para la glicoproteína E2 del VEE pueden
incluir una mutación de atenuación en cualquiera de las posiciones
de los aminoácidos 76, 120 y/o 209 de E2. Las partículas de
alfavirus obtenidas a partir del mutante VEE-3014
contienen mutaciones de atenuación en las posiciones 272 de E1 y
209 de E2 (véase la Patente de EEUU Nº 5.792.492). Una mutación de
atenuación específica para la glicoproteína E3 del VEE incluye una
mutación de atenuación constituida por una deleción de los
aminoácidos 56-59 de E3. Las partículas de virus
obtenidas a partir del mutante VEE-3526, que
actualmente se están desarrollando como una cepa de vacuna,
contienen esta deleción en E3 (aa56-59) así como
una secunda mutación de atenuación en la posición 253 de E1.
Las mutaciones de atenuación específicas para la
glicoproteína E2 de S.A.AR86 incluyen una mutación de atenuación en
una cualquiera de las posiciones de los aminoácidos 304, 314, 372
y/o 376 de E2 (véase la Patente de EEUU Nº 5.639.650). Como
alternativa, la mutación de atenuación puede ser una sustitución,
deleción y/o inserción de un aminoácido en la glicoproteína E2, por
ejemplo, en una cualquiera o más de las siguientes posiciones de
aminoácidos en cualquier combinación: 158, 159, 160, 161 y/o 162
(véase Polo y col., Publicación PCT Nº WO 00/61772).
Las mutaciones de atenuación pueden también
estar presentes en las proteínas no estructurales del alfavirus,
nsp1-nsp4. Las mutaciones de atenuación ejemplares
en las proteínas no estructurales para S.A.AR86 incluyen, pero no
se limitan a; codones que especifican un aminoácido de atenuación en
una cualquiera o más de las siguientes: posición de aminoácido 538
de nsp1, posición de aminoácido 96 de nsp2, posición de aminoácido
372 de nsp2, posición de aminoácido 529 de nsp2, posición de
aminoácido 571 de nsp2, posición de aminoácido 682 de nsp2,
posición de aminoácido 804 de nsp2, posición de aminoácido 22 de
nsp3, y en combinación, codones en las posiciones 529, 571, 682 y
804 de nsp2 y en la posición de aminoácido en nsp3. Otras mutaciones
de atenuación ilustrativas para S.A.AR86 incluyen las descritas en
la Solicitud de PCT Nº PCT/US01/27644.
Otro tipo de mutación de atenuación de esta
invención puede ser una o más mutaciones de atenuación en las
regiones no traducidas del genoma del alfavirus que causan una
pérdida de virulencia en un virus vivo que contiene tales
mutaciones (por ejemplo, véase Niesters and Strauss "Defined
mutations in the 5' non-translated sequence of
Sindbis virus RNA" J. Virol 64: 4162-4168
(1990)). Un ejemplo de una de tales mutaciones es en el nucleótido
3 del ARN genómico de VEE, es decir, el tercer nucleótido después
del casquete metilado 5' (véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº
5.643.576, que describe una mutación G\rightarrowC en el
nucleótido 3; y White y col. "Role of alpha/beta interferon in
Venezuelan Equine Encephalitis virus pathogenesis: effect of an
attenuating mutation in the 5' untranslated region" J. Virol.
75:2706-2718 (2000)). La mutación puede ser una
G\rightarrowA, U o C, pero la mutación G\rightarrowA resulta de
preferencia para algunas formas de realización.
El término "proteína/proteínas
estructural(es) de alfavirus" se refiere a una o a una
combinación de las proteínas estructurales codificadas por un
alfavirus: Éstas son producidas por el virus como una poliproteína y
se representan generalmente en la bibliografía como
C-E3-E2-6k-E1.
E3 y 6k sirven como señales de translocación/transporte de membrana
para las dos glicoproteínas, E2 y E1. Por consiguiente, el uso del
término E1 puede referirse en el presente documento a E1,
E3-E1, 6k-E1, o
E3-6k-E1, y el uso del término E2
puede referirse en el presente documento a E2, PE2,
E3-E2, 6k-E2, o
E3-6k-E2. Como se analizó
anteriormente para el replicón, las formas de realización
específicas de las proteínas estructurales del alfavirus utilizadas
en la invención reivindicada pueden contener una o más mutaciones
de atenuación, siendo una mutación de atenuación una deleción,
adición y/o sustitución de nucleótidos de uno o más nucleótidos, o
una mutación que comprende reorganización o construcción quimérica
que da como resultado una pérdida de virulencia en un virus vivo que
contiene la mutación en comparación con el alfavirus de tipo
salvaje adecuado.
Los términos "partículas de replicón de
alfavirus (ARP)", "partículas de replicón de virus", y
"partículas de alfavirus recombinantes", usadas
indistintamente en el presente documento, significan un complejo
estructural análogo al virión que incorpora un ARN de replicón de
alfavirus que expresa una o más secuencias de ARN heterólogo.
Típicamente, el complejo estructural análogo al virión incluye una o
más proteínas estructurales de alfavirus incluidas en una envoltura
lipídica que encierra una nucleocápside que a su vez encierra el
ARN. La envoltura lipídica deriva típicamente de la membrana
plasmática de la célula en la que se producen las partículas. De
preferencia, el ARN de replicón de alfavirus está rodeado por una
estructura de nucleocápside que comprende la proteína de cápside
del alfavirus, y las glicoproteínas del alfavirus están incluidas en
la envoltura lipídica derivada de la célula. Las ARP son
infecciosas pero defectuosas para la propagación, es decir, el ARN
de replicón no puede propagarse más allá de la célula huésped
dentro de la que las partículas infectan inicialmente, en ausencia
del(los) ácido(s) nucleico(s) ayudantes que
codifica(n) las proteínas estructurales del alfavirus. Las
proteínas estructurales y el ARN de replicón de las ARP pueden
derivar mismo o de diferentes alfavirus. En una forma de
realización, el ARN de replicón y las proteínas estructurales
derivan ambos del VEE, y tales partículas se denominan algunas
veces en el presente documento "VRP" o "VRPs". En otra
forma de realización, el ARN de replicón deriva del VEE y las
proteínas estructurales derivan del virus Sindbis (véase, por
ejemplo, Dubensky y col., Patente de EEUU Nº 6.376.236).
El término "ayudante(s)" se refiere
a una o más moléculas de ácido nucleico capaces de expresarse para
producir una o más proteínas estructurales del alfavirus. Los
ayudantes pueden ser moléculas de ARN o ADN. En una forma de
realización, el ayudante es una molécula de ADN que comprende un
promotor capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico que
codifica todas las proteínas estructurales del alfavirus. En otra
forma de realización, el ayudante comprende dos moléculas de ARN
que expresan juntas el ácido nucleico que codifica todas las
proteínas estructurales del alfavirus. Estas dos moléculas de ARN
pueden producirse in vitro, o pueden generarse a partir de
un único ayudante de ADN que se resuelve a sí mismo en dos moléculas
separadas in vivo. En el caso de las construcciones de
ayudantes de ADN que no utilizan señales de reconocimiento
alfavirales para la replicación y la transcripción, la frecuencia
teórica de recombinación es inferior que los sistemas ayudantes de
ARN bipartitos que utilizan tales señales.
Los términos "célula ayudante" y "célula
empaquetadora" se usan indistintamente en el presente documento y
se refieren a la célula en la que se producen las partículas de
replicón de alfavirus. La célula ayudante comprende una serie de
ayudantes que codifican una o más proteínas estructurales del
alfavirus. Según se divulga en el presente documento, los ayudantes
pueden ser ARN o ADN. La célula puede ser cualquier célula que sea
permisiva para el alfavirus, es decir, células que son capaces de
producir partículas de alfavirus tras la introducción de un
transcripto de ARN viral. Las células permisivas para el alfavirus
incluyen, pero no se limitan a, células Vero, células de riñón de
cría de hámster (BHK), células 293, 293T, células de fibroblastos
de embrión de pollo (CEF), y células de ovario de hámster chino
(CHO). En ciertas formas de realización de la invención
reivindicada, la célula ayudante o empaquetadora puede incluir
además una polimerasa de ARN dependiente de ARN y/o una proteasa
específica de secuencia.
El término "fragmento inmunogénico"
significa un fragmento (por ejemplo, un péptido) de una proteína de
CMV que puede estimular respuestas inmunes humorales o celulares en
el huésped.
Para estimular la rama humoral del sistema
inmune, es decir, la producción de anticuerpos específicos de
antígeno, un fragmento inmunogénico puede incluir al menos
aproximadamente 5-10 residuos de aminoácidos
contiguos de la molécula de longitud total, de preferencia al menos
aproximadamente 15-25 residuos de aminoácidos
contiguos de la molécula de longitud total, y de más preferencia al
menos aproximadamente 20-50 o más residuos de
aminoácidos contiguos de la molécula de longitud total, que definen
un epítopo, o cualquier número entero entre cinco aminoácidos y la
secuencia de longitud total, a condición de que el fragmento en
cuestión conserve actividad inmunogénica, según se mide por medio
de cualquiera de los ensayos conocidos en la técnica, tales como los
que se describen en el presente documento.
Las regiones de un polipéptido dado que incluyen
un epítopo pueden identificarse usando cualquier serie de técnicas
de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. (Véase, por
ejemplo, Epitopen Mapping Protocols in Methods in Molecular
Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed., 1996, Humana Press, Totowa,
N.J.). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por
ejemplo, sintetizando al mismo tiempo grandes cantidades de
péptidos en soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a
porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los
péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están aún unidos a
los soportes. Tales técnicas son conocidas en la técnica y se
describen en, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 4.708.871; Geysen y
col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
3998-4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol. 23:
709-715.
De manera similar, los epítopos conformacionales
se identifican fácilmente determinando la configuración espacial de
los aminoácidos tal como, por ejemplo, por medio de cristalografía
de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por
ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones
antigénicas de las proteínas pueden identificarse también usando
gráficos de antigenicidad e hidropatía convencionales, tales como
los calculados usando, por ejemplo, el programa informático Omiga
versión 1.0 disponible del Oxford Molecular Group. Este programa
informático utiliza el método de Hopp/Woods (Hopp y col., Proc.
Natl. Acad. Sci USA (1981) 78: 3824-3828) para
determinar los perfiles de antigenicidad y la técnica de
Kyte-Doolittle (Kyte y col., J. Mol. Biol. (1982)
157: 105-132) para los gráficos de perfil
hidropático.
Por lo general, los epítopos de células T que
están involucradas en el estímulo de la rama celular del sistema
inmune de un sujeto son péptidos cortos de aproximadamente
8-25 aminoácidos, y éstos no se predicen típicamente
por medio de los procedimientos descritos anteriormente para
identificar epítopos humorales. Una manera común para identificar
los epítopos de células T es usar péptidos sintéticos de
superposición y analizar combinaciones de estos péptidos, o los
individuales, que son reconocidos por las células T de animales que
son inmunes al antígeno de interés, usando, por ejemplo un ensayo
de inmunotransferencia ligado a enzimas (ELISPOT). Estos péptidos
de superposición pueden también usarse en otros ensayos tales como
la estimulación de la liberación o secreción de citocinas, o pueden
evaluarse construyendo tetrámeros del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) que contienen el péptido. Tales
fragmentos inmunogénicos pueden identificarse también basándose en
su capacidad para estimular la proliferación de linfocitos en
respuesta al estímulo por diversos fragmentos del antígeno de
interés.
El término "epítopo", según se usa en el
presente documento, se refiere a una secuencia de al menos
aproximadamente 3 a 5, de preferencia aproximadamente 5 a 10 ó 15,
y no más de aproximadamente 1.000 aminoácidos (o cualquier número
entero incluido en el intervalo), que define una secuencia que por
sí misma o como parte de una secuencia mayor, se une a un
anticuerpo generado en respuesta a tal secuencia o estimula una
respuesta inmune celular. No hay un límite superior crítico para la
longitud del fragmento, que puede comprender prácticamente la
longitud total de la secuencia de la proteína, o incluso una
proteína de fusión que comprende dos o más epítopos de una única o
de múltiples proteínas de CMV. Un epítopo para uso en el sujeto de
la invención no está limitado a un polipéptido que tiene la
secuencia exacta de la porción de la proteína original de la que
deriva. De hecho, hay muchas cepas o aislamientos conocidos de CMV
y el virus conserva la capacidad para continuar la adaptación, y
hay varios dominios variables en el virus que exhiben grados
relativamente elevados de variabilidad entre los aislamientos. Por
consiguiente, el término "epítopo" abarca secuencias idénticas
a la secuencia nativa, así como modificaciones a la secuencia
nativa, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (por lo
general, pero no siempre, conservadoras en la naturaleza).
El término "casete reguladora" significa
una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más elementos
necesarios para dirigir la transcripción y/o traducción de un ácido
nucleico que codifica uno o más polipéptidos. En una forma de
realización, la casete reguladora comprende sólo un promotor
subgenómico del alfavirus para dirigir la transcripción de un ARN
localizado en el citoplasma que a continuación se remata, y el
extremo rematado del ARN dirige la traducción del ARN subgenómico.
En otra forma de realización, la casete reguladora comprende un
sitio interno de entrada de ribosomas, o IRES, que dirige la
traducción de una región codificadora secuencia abajo. En otra
forma de realización, la casete reguladora comprende un promotor
subgenómico del alfavirus y un IRES, y se construye para permitir
que el promotor subgenómico dirija la transcripción (y por
consiguiente, la amplificación) de la secuencia de ARN secuencia
abajo del promotor y para permitir que el IRES dirija la traducción
del ARN subgenómico.
"IRES" significa un sitio interno de
entrada de ribosomas. Se han encontrado secuencias de IRES en
numerosos transcriptos de virus que infectan células de vertebrados
e invertebrados así como en transcriptos de genes de vertebrados e
invertebrados. Los ejemplos de elementos IRES adecuados para uso en
esta invención incluyen: elementos IRES virales de Picornavirus,
por ejemplo, poliovirus (PV), virus de encefalimiocarditis (EMCV),
virus de la fiebre aftosa (FMDV), de Flavivirus, por ejemplo, virus
de hepatitis C (VHC), de Pestivirus, por ejemplo, virus de la peste
porcina clásica (CSFV), de Retrovirus, por ejemplo, virus de la
leucemia murina (MLV), de Lentivirus, por ejemplo, virus de
inmunodeficiencia en simios (VIS), o elementos celulares IRES de
ARNm tales como los de los factores de iniciación de la traducción,
por ejemplo, eIF4G o DAP5, de factores de transcripción, por
ejemplo, c-Myc (Yang and Sarnow, Nucleic Acids
Research 25: 2800-2807, 1997) o factor represor de
NF-\kappaB (NRF), de factores de crecimiento, por
ejemplo, factor vascular de crecimiento endotelial (VEGF), factor
de crecimiento de fibroblastos (FGF-2), factor B de
crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF B), de genes
homeóticos, por ejemplo, Antennapedia, de proteínas de
supervivencia, por ejemplo, inhibidor de la apoptosis ligado a X
(XIAP) o Apaf-1, o chaperones, por ejemplo, la
proteína BiP de unión a cadenas pesadas de inmunoglobulinas
(revisado en Martinez-Salas y col., Journal of
General Virology 82: 973-984 (2001)).
Las secuencias de IRES de preferencia que pueden
usarse en estas formas de realización derivan de: virus de
encefalomiocarditis (EMCV, ATCC Nº de acceso NC001479), virus de la
parálisis del grillo (Nº de acceso AF218039), virus de Drosophila C
ATCC Nº de acceso AF014388, virus intestinal de Plautia stali
(ATCC Nº de acceso AB006531), virus de Rhopalosiphum padi
(ATCC Nº de acceso AF022937), virus Himetobi P (ATCC Nº de acceso
AB017037), virus de la parálisis aguda de las abejas (ATCC Nº de
acceso AF150629), virus de la celda real negra (ATCC Nº de acceso
AF183905), virus de Triatoma (ATCC Nº de acceso AF178440), virus
Acyrthosiphon pisum (ATCC Nº de acceso AF024514), virus
infeccioso de flacherie (ATCC Nº de acceso AB000906), y virus
Sacbrood (ATCC Nº de acceso AF092924). Además de los elementos IRES
que se presentan en la naturaleza presentados anteriormente, pueden
usarse también secuencias sintéticas de IRES, diseñadas para imitar
la función de las secuencias de IRES que se presentan en la
naturaleza. Cuando se usa más de un IRES en una construcción de
replicón, los elementos IRES pueden ser iguales o diferentes.
"Estímulo" o "Estimulador" significa
una segunda inmunización, tras una inmunización inicial (o
"cebadora") que aumenta la respuesta inmune en el huésped. En
una forma de realización, la invención proporciona específicamente
una composición que produce una respuesta anamnésica contra un
herpesvirus, por ejemplo, infección por CMV, en un sujeto
sensibilizado, por ejemplo, un caballo, una vaca, o un ser humano,
que comprende una cantidad inductora de respuesta anamnésica de un
componente inmunizador de un herpesvirus, por ejemplo, CMV. Según
se utiliza en el presente documento, la expresión "respuesta
anamnésica" significa una respuesta inmune secundaria
"estimuladora" en un sujeto sensibilizado. Por "sujeto
sensibilizado" se entiende un sujeto que ha estado previamente
en contacto con antígenos de un herpesvirus, por ejemplo, CMV, ya
sea por exposición natural al virus o por vacunación (inmunización
primaria) con componentes inmunizadores del herpesvirus, por
ejemplo, partículas de replicón de alfavirus que expresan CMV.
Con 230 pares de kilobases de ADN de doble
cadena, el genoma del citomegalovirus es el
\beta-herpesvirus más grande conocido que infecta
a los seres humanos. Tiene más de 200 marcos de lectura abiertos
responsables de la codificación de al menos 165 genes; estos están
organizados en dos segmentos, denominados largo único (U_{L}) y
corto único (U_{S}), que están separados por secuencias de
nucleótidos inversas repetitivas. Por consiguiente, la elección de
potenciales antígenos para usar en una vacuna es muy grande.
Pueden obtenerse algunas sugerencias con
respecto a enfoques de vacunas de respuestas de individuos sanos,
seropositivos. En estos individuos, el 92% tienen células T
"CTL" presentes que tienen como diana el antígeno pp65, el 76%
tiene CTL para el antígeno IE1, el 33% para el antígeno gB, y el 30%
para el antígeno pp150 (Gyulaj y col., 2000 J. Infectious Diseases
181: 1537). En contraste, cuando se suprime esta inmunidad mediada
por células, las manifestaciones de la enfermedad por HCMV son más
graves. Además, el número reproductor (número de células infectadas
por virus liberados de una célula infectada) está reducido 2 a 7
veces en huéspedes que experimentaron contacto con HCMV. La
replicación del HCMV en huéspedes inmunocomprometidos que
experimentan contacto con HCMV está retrasada en comparación con
los huéspedes que no tuvieron contacto con HCMV (tiempo de
duplicación de 0,38 días y 1,12 días, respectivamente). Como
conclusión, se ha demostrado también que las respuestas celulares
para pp65 e IE1 protegen de la infección por CMV en modelos animales
usando los homólogos de los genes de HCMV que codifican pp65 e IE1
(véase Morello y col., J. Virol. 2000 Vol. 74: 3696). Finalmente,
la transferencia adoptiva de CTL específicas para pp65 a los
receptores de transplante de médula ósea los protege de la
enfermedad por CMV (Greenberg, P., Keystone Symposium, abril de
2001; véase también Walter y col., N. Engl. J. Med. 1995,
333: 1038).
333: 1038).
También están presentes anticuerpos para la
glicoproteína B (gB) en individuos infectados por HCMV; estos
anticuerpos son neutralizantes y se han implicado en la protección
de neonatos frente a la infección primaria en modelos animales
(Bourne y col., 2001 J. Infectious Diseases 183: 59; Chatterjee y
col., 2001 J. Infectious Diseases 183: 1547). Por consiguiente, se
espera que una vacuna de preferencia para seres humanos proporcione
tanto inmunidad celular como humoral para que resulte eficaz. Se han
usado las vacunas de virus vivos, atenuados, usando la cepa Towne
de HCMV en pacientes de transplantes para reducir la gravedad del
CMV inducido por el transplante en los receptores seronegativos que
recibieron un riñón seropositivo (Plotkin 1994, Transplantation 58:
1176). Sin embargo, por la preocupación en lo que respecta a la
seguridad de las vacunas de virus vivos, atenuados, derivados de un
virus que causa una infección crónica, persistente que puede
transmitirse al feto, y que puede reactivarse durante períodos de
inmunosupresión, resultan de preferencia los enfoques
alternativos.
El sistema de vectores de replicón de alfavirus
proporciona la oportunidad para inducir una potente inmunidad
humoral y celular en los seres humanos. El sistema de vectores de
replicón se basa en la maquinaria de replicación de un alfavirus,
constituida por un vector ARN de replicón y uno o más ácidos
nucleicos ayudantes (revisado en Rayner y col. (2002) Rev. Med.
Virol. 12: 279-296; véanse también las Patentes de
EEUU Nº 5.792.462; 6.156.558; Pushko y col. (1997) Virology 239:
389-401; Publicación de Patente de EEUU Nº
20020141975; Publicación PCT Nº WO 03/023026). El ARN del replicón
contiene secuencias necesarias para la replicación y el
empaquetamiento del ARN en una partícula análoga al virus. Éste
expresa las proteínas no estructurales necesarias para la
replicación del genoma y la transcripción del ARN subgenómico (si se
utilizan tales construcciones), pero carece de los genes de
proteínas estructurales necesarias para la formación de las
partículas virales. El replicón se construye de manera que una
casete reguladora pueda dirigir la expresión de un ácido nucleico
de interés, en esta invención, uno o más ácidos nucleicos que
codifican polipéptidos de CMV o sus fragmentos inmunogénicos. Uno o
más ácidos nucleicos ayudantes codifican la cápside y las
glicoproteínas del alfavirus. Cuando se introduce el vector de ARN
del replicón y el o los ácidos nucleicos ayudantes en una célula
permisiva para el alfavirus, el ARN del replicón se empaqueta en
las partículas análogas al virus, que se recogen y se purifican
para producir un inmunógeno, es decir, una composición de
vacuna.
En una forma de realización, se usa un replicón
basado en el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) como
el vector para los polipéptidos del CMV. Los ácidos nucleicos que
codifican las proteínas de CMV gB (por ejemplo, de la cepa Towne),
IE1 y pp65 (por ejemplo, de la cepa AD169) pueden clonarse en el
vector del alfavirus, por ejemplo, el vector de VEE,
individualmente o en diversas combinaciones. Tales combinaciones
abarcan secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína
de fusión o IE1 y pp65 (o sus epítopos) o pueden abarcar múltiples
casetes reguladoras dentro de un único replicón, en el que cada
casete dirige una única secuencia codificadora o una secuencia de
ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de dos o más
polipéptidos de CMV, o sus fragmentos inmunogénicos.
Cada inmunógeno deseado (es decir, un
polipéptido de CMV o uno de sus fragmentos inmunogénicos) puede
estar codificado por el ácido nucleico expresado en una partícula
de replicón de alfavirus separada, y las mezclas de dos o más ARP,
que comprenden cada una un ácido nucleico que codifica un único
inmunógeno de CMV, pueden prepararse y administrarse a un sujeto.
Pueden generarse composiciones que comprenden poblaciones de una,
dos o tres (o más) ARP diferentes, aunque las composiciones según la
reivindicación 1 tienen dos ARP diferentes. Por ejemplo, en el caso
de tres ARP diferentes, cada ARP codifica un único polipéptido de
CMV, por ejemplo, IE1, pp65 y gB (o sus fragmentos inmunogénicos) y
cada ARP no codifica los otros polipéptidos de CMV. En el caso de
dos ARP diferentes, una ARP puede expresar dos polipéptidos de CMV,
por ejemplo, IE1 y pp65, ya sea como proteínas de fusión o bajo el
control de casetes reguladoras separadas, como se describió
anteriormente, y la segunda ARP puede expresar un polipéptido de
CMV que es diferente, por ejemplo, gB. Como alternativa, una
primera ARP puede expresar IE1 y una segunda ARP puede expresar
pp65. En otra forma de realización de una composición que comprende
dos ARP diferentes, una primera ARP puede expresar pp65 y la segunda
ARP puede expresar gB. En una forma de realización que utiliza una
única ARP, el vector del replicón puede incluir una casete
reguladora que dirige la expresión de un ácido nucleico que codifica
una proteína de fusión que comprende al menos pp65 e IE1, y en una
forma de realización específica, que además comprende el ácido
nucleico que codifica gB. En otra forma de realización de ARP
única, una casete reguladora puede dirigir la expresión del ácido
nucleico que codifica gB, una segunda casete reguladora puede
dirigir la expresión del ácido nucleico que codifica IE1, y una
tercera casete reguladora puede dirigir la expresión del ácido
nucleico que codifica pp65. Los componentes del ácido nucleico que
codifican la casete reguladora (RC) pueden estar en cualquier
orden, por ejemplo,
RC-gB/RC-IE1/RC-pp65,
y/o
RC-pp65/RC-IE1/RC-gB.
En otra forma de realización de ARP única, una primera casete
reguladora puede dirigir la expresión de un ácido nucleico que
codifica una proteína de fusión pp65-IE1, y una
segunda RC puede dirigir la expresión del ácido nucleico que
codifica gB. En todas las formas de realización descritas en el
presente documento, el uso de los términos "pp65", "IE1" y
"gB" tienen la intención de abarcar los péptidos de longitud
total, los fragmentos inmunogénicos y/o sus epítopos. Pueden
clonarse las secuencias de ácidos nucleicos de cepas conocidas de
virus CMV, por ejemplo, Towne y AD 169, y/o pueden ser secuencias
sintéticas que representan secuencias de consenso de las secuencias
de CMV o epítopos de uno o más polipéptidos de CMV, o secuencias
quiméricas incluidos fragmentos o epítopos de diferentes cepas de
CMV.
Por consiguiente, en ciertas formas de
realización, la presente invención proporciona una población de
partículas de replicón de alfavirus en las que dichas partículas
comprenden ARN del replicón de alfavirus, en las que un primer ARN
de replicón comprende el ácido nucleico que codifica una proteína de
fusión de las proteínas pp65 e IE1 de citomegalovirus o sus
epítopos, y un segundo ARN de replicón comprende el ácido nucleico
que codifica la proteína gB de citomegalovirus o uno de sus
epítopos, y en las que cada uno del primer y segundo ARN de
replicón está contenido dentro de una partícula de replicón de
alfavirus separada. En ciertas formas de realización, los ARN de
replicón de las partículas de esta población puede codificar además
una proteína gB de CMV, y/o sus fragmentos inmunogénicos y la
producción de la proteína gB de CMV puede estar bajo el control de
una tercera casete reguladora, separada.
En el presente documento se proporciona además
una población de partículas de replicón de alfavirus en la que las
partículas comprenden un ARN de replicón que comprende una casete
reguladora que dirige la transcripción y la traducción de un ácido
nucleico que codifica una proteína de fusión de las proteínas pp65 e
IE1 de citomegalovirus, o sus epítopos.
En formas de realización de esta invención en
las que los ARN del replicón dirigen la expresión del ácido
nucleico que codifica las proteínas de CMV y/o sus fragmentos
inmunogénicos de esta invención a partir de casetes reguladoras
separadas (por ejemplo, una, dos o tres casetes reguladoras
presentes en el mismo ARN de replicón o en ARN de replicón
separados de partículas separadas en una población), las casetes
reguladoras pueden ser todas iguales, las casetes reguladoras
pueden ser todas diferentes y/o las casetes reguladoras pueden
estar presentes en cualquier combinación (por ejemplo, dos son
iguales y una es diferente).
En algunas formas de realización, la casete
reguladora de la invención puede ser un promotor subgenómico del
alfavirus. En otras formas de realización, la casete reguladora de
esta invención puede comprender (i) un promotor subgenómico del
alfavirus para dirigir la transcripción, y (ii) un elemento IRES
para dirigir la traducción.
Según la invención en la que el ácido nucleico
que codifica la proteína pp65 de CMV y el ácido nucleico que
codifica la proteína IE1 de CMV están presentes en el mismo
replicón, el ácido nucleico está presente como una secuencia
codificadora que produce una proteína de fusión de pp65 e IE1. Un
ejemplo no limitante de un ácido nucleico que codifica una proteína
de fusión pp65/IE1 se proporciona como SEC ID Nº: 3 y otro ejemplo
no limitante de una secuencia de aminoácidos de una proteína de
fusión pp65/IE1 se proporciona en el presente documento como SEC ID
Nº: 4. Un experto en la técnica podría determinar fácilmente otros
ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión pp65/IE1 de
esta invención y variaría basándose, por ejemplo, en sustituciones
conservadoras de aminoácidos, así como en deleciones y/o adiciones
que tengan un efecto neutro o nominal en las características
funcionales de la proteína de fusión.
En aquellas formas de realización de esta
invención en las que el ARN de replicón comprende un ácido nucleico
que codifica la proteína gB de CMV o uno de sus fragmentos
inmunogénicos, el dominio transmembranario de la proteína gB o uno
de sus fragmentos inmunogénicos puede estar presente o puede estar
delecionado. Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico que
codifica una proteína gB de CMV que se ha truncado para delecionar
el dominio transmembranario se proporciona en el presente documento
como SEC ID Nº: 1. Un ejemplo no limitante de una secuencia de
aminoácidos de una proteína gB de CMV truncada se proporciona en el
presente documento como SEC ID Nº: 2. Un experto en la técnica
podrá determinar fácilmente otros ácidos nucleicos que codifican la
proteína gB de esta invención y variarán basándose en la redundancia
del código del ADN. Un experto en la técnica podrá determinar
fácilmente otras secuencias de aminoácidos que tienen las
características funcionales de la proteína gB de esta invención y
variarán basándose, por ejemplo, en sustituciones conservadoras de
aminoácidos, así como en deleciones y/o adiciones que tienen un
efecto neutro o nominal sobre las características funcionales de la
proteína gB.
Un experto en la técnica podrá identificar
fácilmente los fragmentos inmunogénicos de las proteínas de CMV de
esta invención según procedimientos convencionales para identificar
regiones de inmunogenicidad en una secuencia de aminoácidos. Los
ejemplos no limitantes de fragmentos inmunogénicos de esta invención
se proporcionan en el Listado de Secuencias incluido en el presente
documento e identificados como SEC ID Nº: 5-262.
Estos fragmentos inmunogénicos pueden utilizarse en cualquier
combinación y en cualquier proporción relativa uno al otro en las
composiciones y procedimientos en la técnica (véase, por ejemplo,
Maecker y col. "Use of overlapping peptide mixtures as antigens
for cytokine flow citometry" Journal of Immunological Methods
255: 27-40 (2001)) y pueden utilizarse para evaluar
la respuesta inmune en sujetos infectados con HCMV o inmunizados con
vacunas de HCMV para identificar fragmentos inmunogénicos.
Las ARP que expresan CMV de esta invención se
formulan para uso como formulaciones farmacéuticas, vacunas o
composiciones inmunogénicas, para profilaxis y/o tratamiento. Estas
formulaciones farmacéuticas comprenden una composición de esta
invención (por ejemplo, ARP defectuosas para la propagación,
infección) en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Por consiguiente, en ciertas formas de
realización, la presente invención proporciona una composición que
comprende una partícula de alfavirus de esta invención en un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones que se
describen en el presente documento pueden formularse para
administración en un vehículo farmacéutico de acuerdo con técnicas
conocidas. Véase, por ejemplo, Remington, The Science And Practice
of Pharmacy (última edición). En la fabricación de una composición
farmacéutica según las formas de realización de la presente
invención, la composición de esta invención se mezcla típicamente
con, inter alia, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende un
vehículo que es compatible con otros componentes en la composición
farmacéutica y que no es dañino ni perjudicial para el sujeto. El
vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y se formula de
preferencia con la composición de esta invención como una
formulación monodosis. Las formulaciones farmacéuticas se preparan
por medio de cualquiera de las técnicas de farmacia bien conocidas
incluida, pero no limitado a, la mezcla de los componentes,
incluyendo opcionalmente uno o más componentes accesorios. Los
vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares incluyen, pero no
se limitan a, agua estéril libre de pirógenos y disolución salina
fisiológica estéril libre de pirógenos. Tales vehículos pueden
incluir proteínas (por ejemplo, albúmina sérica) y azúcar (sacarosa,
sorbitol, glucosa, etc.)
Las composiciones farmacéuticas de esta
invención incluyen las adecuadas para administración oral, rectal,
tópica, por inhalación (por ejemplo, por medio de aerosol), bucal
(por ejemplo, sublingual), vaginal, parenteral (por ejemplo,
subcutánea, intramuscular, intraarticular, intrapleural,
intraperitoneal, intracerebral, intraarterial o intravenosa),
tópica (es decir, piel y superficies mucosas, incluidas superficies
de las vías aéreas) y transdérmica. Las composiciones del presente
documento pueden administrarse también a través de un procedimiento
de escarificación de la piel, o por vía transdérmica a través de un
parche o líquido. Las composiciones pueden administrarse por vía
subdérmica en la forma de un material biodegradable que libera las
composiciones durante un período de tiempo. La vía más adecuada en
cualquier caso dado dependerá, como se sabe bien en la técnica, de
factores tales como la especie, la edad, el género y la condición
general del sujeto, la naturaleza y gravedad de la afección a
tratar y/o de la naturaleza de la composición particular (es decir,
dosificación, formulación) que se va a administrar.
Las ARP pueden también estar presentes en una
formulación de esta invención en una cantidad inmunogénica. Una
"cantidad inmunogénica" es una cantidad de las partículas de
replicón de alfavirus infeccioso que es suficiente para provocar
una respuesta inmune en el sujeto al que se administra la
formulación farmacéutica. Puede administrarse a un sujeto una
cantidad desde aproximadamente 10^{4} hasta aproximadamente
10^{10}, de preferencia 10^{5} hasta 10^{9}, y en particular
10^{6} hasta 10^{8} unidades infecciosas (UI., según se miden
por medio de un ensayo de inmunofluorescencia indirecta), o ARP,
por dosis, dependiendo de la edad y especie del sujeto que se está
tratando.
Los sujetos a quienes se administra cantidades
eficaces y/o inmunogénicas de las composiciones de la presenten
invención incluyen seres humanos y animales (por ejemplo, ratón,
mono, cobaya).
Las composiciones de vacuna de esta invención
comprenden además combinaciones de ARP que expresan polipéptidos de
CMV con otros sistemas que expresan polipéptidos de CMV para
proporcionar las más amplias respuestas celulares y humorales
posibles (es decir, todos los aspectos de la respuesta inmune,
incluidas las características descritas anteriormente en el
presente documento). En ciertas formas de realización, esto puede
incluir el uso de estrategias de estímulo primario heterólogo, en
las que se usan las composiciones de ARP en combinación con uno o
más de los siguientes: polipéptidos purificados de CMV, producidos
de manera recombinante (o sus fragmentos inmunogénicos), ácidos
nucleicos desnudos que codifican uno o más polipéptidos de CMV,
fragmentos o epítopos inmunogénicos, tales ácidos nucleicos
formulados con restos que contienen lípidos, vectores no alfavirales
(por ejemplo, vectores de pox, vectores adenovirales, vectores de
herpes, vectores del virus de la estomatitis vesicular, vectores
paramixovirales, vectores de parvovirus, vectores de papovavirus,
vectores de virus asociados a adenovirus y vectores retrovirales)
que expresan uno o más inmunógenos de CMV, y otros vectores de
alfavirus que expresan uno o más inmunógenos de CMV. Los vectores
virales pueden ser partículas análogas a virus o ácidos nucleicos.
Los vectores de alfavirus pueden ser partículas que contienen
replicones, vectores que contienen replicones basados en ADN
(denominados algunas veces como sistema "ELVIS", véase, por
ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.814.482) y/o vectores de ARN
desnudo.
Tales composiciones de vacuna pueden usarse en
un procedimiento para inducir una respuesta inmune para el CMV en
un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz
de las poblaciones, partículas y/o composiciones de esta invención,
o en un procedimiento para prevenir o tratar una infección por CMV
en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad
eficaz de una población, partícula y/o composición de esta
invención.
Según se usa en el presente documento, una
"cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto o
composición que es suficiente para producir un efecto deseado, que
puede ser un efecto terapéutico, profiláctico y/o beneficioso.
También, según se usa en el presente documento,
los términos "tratar" y "tratamiento" incluyen cualquier
tipo de mecanismo, acción o actividad que da como resultado un
cambio en el estado médico de un sujeto, incluida una mejora en la
condición del sujeto (por ejemplo, cambio o mejora en uno o más de
los síntomas y/o parámetros clínicos), retraso en la progresión de
la afección, prevención o retraso del inicio de una enfermedad o
afección, etc.
Las composiciones pueden usarse también en un
procedimiento para inducir en un sujeto una respuesta inmune para
el CMV, que comprende: a) cebar el sistema inmune del sujeto
administrando al sujeto una cantidad eficaz de un primer componente
inmunizador seleccionado del grupo constituido por: una población de
partículas de replicones de alfavirus que codifican inmunógenos de
CMV, inmunógenos de CMV, moléculas de ácido nucleico que codifican
inmunógenos de CMV, un vector viral no alfaviral que codifica
inmunógenos de CMV, y cualquiera de sus combinaciones; y b)
estimular la respuesta primaria del sujeto administrando al sujeto
una cantidad eficaz de un segundo componente inmunizador
seleccionado del grupo constituido por: una población de partículas
de replicones de alfavirus que codifican inmunógenos de CMV,
inmunógenos de CMV, moléculas de ácido nucleico que codifican
inmunógenos de CMV, un vector viral no alfaviral que codifica
inmunógenos de CMV, y cualquiera de sus combinaciones, en el que el
primer componente inmunizador es diferente del segundo componente
inmunizador y en el que al menos el primer componente inmunizador o
el segundo componente inmunizador es una población según la
reivindicación 1.
En los procedimientos descritos anteriormente,
el primer componente inmunizador puede ser una primera partícula de
replicones de alfavirus y el segundo componente inmunizador puede
ser una segunda partícula de replicones de alfavirus, con la
condición de que la primera y la segunda partículas de alfavirus se
obtengan de diferentes alfavirus.
En otras formas de realización, el primer
componente inmunizador puede comprender partículas de replicones de
alfavirus que codifican las proteínas pp65, IE1 y gB del
citomegalovirus o sus fragmentos inmunogénicos, y el segundo
componente inmunizador puede comprender una o más proteínas de CMV
y/o sus fragmentos inmunogénicos.
En los procedimientos, los componentes
inmunizadores pueden administrarse una vez o más de una vez (es
decir, múltiples veces). Por ejemplo, puede administrarse un primer
componente inmunizador de esta invención y/o un segundo componente
inmunizador de esta invención una, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve o diez veces en cualquier intervalo de tiempo
(por ejemplo, horas, días, semanas, meses, años, etc.) y en
cualquiera de las cantidades descritas en el presente documento, que
pueden ser la misma cantidad cada vez o diferentes cantidades en
diferentes tiempos de administración en cualquier combinación. En
otras formas de realización, la administración del primer y segundo
componentes inmunizadores puede combinarse u organizarse en
cualquier orden (por ejemplo, puede administrarse el primer y el
segundo componente en una secuencia alternada o en cualquier otro
orden).
En algunas formas de realización de la presente
invención, el primer y/o segundo componente inmunizador puede
administrarse con un adyuvante. Según se usa en el presente
documento, "adyuvante" describe a una sustancia, que puede ser
cualquier sustancia inmunomoduladora que tiene la capacidad de
combinarse con la vacuna de polipéptido o ácido nucleico para
potenciar, mejorar o de otra manera modular una respuesta inmune en
un sujeto sin causar efectos perjudiciales en el sujeto.
Un adyuvante de esta invención puede ser, pero
no está limitado a, una citocina inmunoestimuladora (incluidas,
pero no limitadas a, GM/CSF, interleucina 2, interleucina 12,
interferón gamma, interleucina 4, factor de necrosis tumoral alfa,
interleucina 1, factor hematopoyético ftl3L, CD40L, moléculas
coestimuladoras B7.1 y moléculas coestimuladoras B7.2), formulación
adyuvante SYNTEX 1 (SAF-1) compuesta de escualeno
(DASF, Parsippany, N.J.) al 5 por ciento (peso/volumen), Pluronic
al 2,5 por ciento, polímero L121 (Aldrich Chemical, Milwaukee), y
polisorbato (Tween 80, Sigma) al 0,2 por ciento en disolución salina
tamponada de fosfato. Los adyuvantes adecuados incluyen también
aceite en agua, saponina, una sal de aluminio tal como gel de
hidróxido de aluminio (alum), fosfato de aluminio, o algannmulin,
pero pueden ser también una sal de calcio, hierro o cinc, o pueden
ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares
acetilados, polisacáridos derivados de manera catiónica o aniónica,
o polifosfacenos.
En la técnica se conocen otros adyuvantes e
incluyen QS-21, adyuvante de Freund (completo e
incompleto), hidróxido de aluminio,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP),
N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina
(CGP 11637, denominado nor-MDP),
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-s-n-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina
(CGP 19835A, denominado MTP-PE) y RIBI, que
contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil
lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular
(MPL + TDM + CWS) en emulsión de escualeno al 2%/Tween 80.
Otros adyuvantes pueden incluir, por ejemplo,
una combinación de monofosforil lípido A, de preferencia
monofosforil lípido A
3-de-O-acilado
(3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Un sistema
adyuvante mejorado incluye la combinación de un monofosforil lípido
A y un derivado de saponina, en particular la combinación de QS21 y
3D-MPL según se divulga en la publicación PCV
número WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que
el QS21 se extingue con colesterol según se divulga en la
publicación PCT número WO 96/33739 (cuyo contenido completo se
incorpora en el presente documento por referencia). Una formulación
de adyuvante particularmente potente que incluye QS21,
3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua
se describe en la publicación PCT número WO 95/17210 (cuyo
contenido completo se incorpora en el presente documento por
referencia). Además, el ácido nucleico de esta invención puede
incluir una secuencia de nucleótidos que proporciona una señal
inmunoestimuladora y/o una función adyuvante, tales como las
secuencias CpG. Tales secuencias CpG, o motivos, son bien conocidos
en la técnica.
Un adyuvante de esta invención, tal como, por
ejemplo, una citocina inmunoestimuladora, puede administrarse a un
sujeto antes, a la vez, y/o dentro de unas pocas horas, varias
horas, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y/o 10 días antes o después de
la administración de una composición de esta invención.
Además, cualquier combinación de adyuvantes,
tales como citocinas inmunoestimuladoras, pueden administrarse
conjuntamente al sujeto antes, después o a la vez con la
administración de una composición de esta invención. Por ejemplo,
las combinaciones de citocinas inmunoestimuladoras, pueden estar
constituidas por dos o más citocinas inmunoestimuladoras de esta
invención, tales como GM/CSF, interleucina 2, interleucina 12,
interferón gamma, interleucina 4, factor de necrosis tumoral alfa,
interleucina 1, factor hematopoyético ftl3L, CD40L, moléculas
coestimuladoras B7.1 y moléculas coestimuladoras B7.2. La eficacia
de una adyuvante o combinación de adyuvantes puede determinarse
midiendo la respuesta inmune dirigida producida en respuesta a la
administración de una composición de esta invención a un sujeto con
o sin el adyuvante o la combinación de adyuvantes, usando
procedimientos convencionales, según se describe en el presente
documento y según se conoce en la técnica.
En diversas formas de realización de esta
invención que comprenden un vector viral no alfaviral, el vector
viral no alfaviral puede ser, pero no está limitado a, un vector
retroviral, un vector adenoviral, un vector de poxvirus, un vector
del virus de la estomatitis vesicular (VSV) o un vector de
picornavirus, así como cualquier otro vector viral no alfaviral
conocido ahora o identificado posteriormente.
Las partículas de alfavirus utilizadas en los
procedimientos de esta invención pueden ser partículas derivadas de
cualquier alfavirus, tales como, por ejemplo, el virus de la
encefalitis equina venezolana, el virus S.A.AR86, el virus Semliki
Forest, el virus Sindbis, el virus Ross River y cualquiera de sus
combinaciones. Las partículas de alfavirus de esta invención pueden
comprender también elementos (por ejemplo, proteínas
estructurales/ARN de replicón) de dos o más alfavirus diferentes
para producir partículas quiméricas de alfavirus (por ejemplo, una
partícula que comprende un ARN de replicón del virus Sindbis y
proteínas estructurales del VEE). La producción y el análisis de
tales partículas quiméricas son bien conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se utilizaron técnicas convencionales de
biología molecular en la clonación de todas las construcciones y
sus análisis. El vector de replicón de VEE (Rayner y col.) se
modificó para introducir sitios de restricción adicionales para la
transcripción de tipo run-off y para facilitar la
clonación. Los genes de CMV que codifican pp65 (UL83, cepa AD169
(American Type Culture Collection Nº VR-538)), el
gen Inmediato Temprano 1 (IE1, UL123, cepa AD169), la glicoproteína
B de longitud total (gB, UL55, cepa Towne (American Type Culture
Collection Nº VR-977)) o gB truncada en el extremo
C terminal (aminoácidos 1-692, excluye el dominio
transmembranario previsto) se clonaron bajo el control de un
promotor 26S subgenómico ("SG") para generar replicones con
genes de CMV únicos o múltiples. Además, se generó una construcción
de fusión de pp65-IE1, que se clonó en este vector
de VEE modificado de una manera similar. La Tabla 1 identifica las
diversas construcciones que se realizaron y analizaron. En algunas
formas de realización, se introdujo un sitio de restricción de
Csp45I en el replicón para linealizar el vector, ya que se
identificó un sitio de NotI en la secuencia codificadora de pp65 y
se usó Notl para linealizar este vector para otros usos, basándose
en un sitio de restricción de Notl en la secuencia del replicón. En
otras formas de realización, la secuencia codificadora de pp65 se
modifica para eliminar el sitio de restricción de Notl.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se obtuvieron partículas de replicones de VEE
(VRP) empaquetadas tras la electroporación de células CHO o Vero
con replicón transcripto in vitro y ARN ayudantes. Las
células se mantuvieron en medio EMEM (Vero) o F12-K
(CHO) suplementado con FBS al 10% en una atmósfera de CO_{2} al 5%
a 37ºC. Para la electroporación, se trataron las células con
tripsina y se lavaron con disolución salina tamponada de fosfato
(PBS). La electroporación se llevó a cabo usando un GenePulser
Electroporator (Bio-Rad; Hercules, CA) y cubetas de
0,4 cm. Tras la electroporación, se resuspendieron las células en
medio de cultivo, se sembraron en matraces de cultivo tisular que
contenían medio de cultivo y se incubaron durante la noche. Se
recogió el medio de cultivo que contenía las VRP liberada, se
filtró y se analizó para confirmar la ausencia del virus competente
para la replicación. Posteriormente se purificaron las VRP por
cromatografía de afinidad en columnas HP con heparina HiTrap®
(Amersham, Piscataway, NJ), que son agarosa altamente reticulada
(6%), activadas con N-hidroxisuccinimida y que
contienen heparina porcina como ligando. Las VRP se formularon con
seroalbúmina humana al 1% y sacarosa al 5% en disolución salina
tamponada de fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se analizó la expresión de los ácidos nucleicos
para producir proteínas de CMV por medio de SDS-PAGE
seguido por tinción con plata (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) o
análisis de transferencia western con anticuerpos monoclonales
(Rumbaugh-Goodwin Institute) o policlonales de cabra
específicos para el gen. Los anticuerpos policlonales de cabra se
generaron por inmunización con proteínas purificadas de CMV.
Las células se infectaron con las VRP
especificadas a una multiplicidad de infección (moi) de 10 UI/célula
y se incubaron durante 18-22 horas. Los lisados
celulares en SDS al 0,5%, NP-40 al 0,5%,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1M, EDTA 1 mM se
normalizaron por contenido proteico y se resolvió 1 \mug de
proteína total por carril en SDS-PAGE en gradiente
al 4-12% (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Las
proteínas se visualizaron por medio de tinción con plata según lo
recomendado por el fabricante (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). La
tinción con plata reveló bandas prominentes del peso molecular
esperado para los productos de los genes de CMV.
Los lisados celulares preparados según se
describe se analizaron por medio de transferencia western con
anticuerpos monoclonales o policlonales monoespecíficos de cabra
específicos para la proteína gB en condiciones reductoras o no
reductoras. El análisis de transferencia western reveló bandas
prominentes del peso molecular esperado para los productos de los
genes de CMV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se inyectaron grupos de ratones BALB/c hembra de
6 semanas de edad (Charles River Laboratories, Raleigh, NC) por vía
subcutánea en ambas patas traseras un total de 10^{6} UI de VRP en
las semanas 0, 3 y 8. Se recogieron muestras de suero por sangrado
retroorbital en el día -1 (toma de muestra de sangre previa) y en
las semanas 4 y 9. Se recogieron los bazos en la semana 15.
Algunos grupos de 12 ratones BALB/c hembra se
cebaron y estimularon con gB-VRP o gB
truncada-VRP en los días 1 y 22. Para la tercera
inoculación administrada en el día 51, se separaron los animales de
estos grupos por la mitad. Seis de los animales en cada grupo
(Grupos 3A y 4A) recibieron una tercera inoculación de VRP (la
misma VRP que recibieron para el cebado y la estimulación) y los
seis animales restantes (Grupos 3B y 4B) recibieron la proteína gB
truncada con el adyuvante RIBI (Corixa Corporation, Seattle, WA) y
endotoxina bacteriana preparada en disolución salina como su
tercera inoculación. Las VRP se administraron en una dosis de
inoculación de 1 x 10^{6} UI en las patas traseras por vía
subcutánea. Para las inoculaciones de proteína gB, se administraron
50 \mug de proteína en adyuvante por inyección
intraperitoneal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un ensayo de neutralización del CMV para
evaluar la respuesta inmune humoral para gB de CMV. Se determinó el
valor de neutralización de CMV inoculando diluciones en serie de
suero inactivado por calor con una concentración conocida de CMV
(cepa Towne) en presencia de complemento de cobaya al 5% (CerdaLane
Laboratories, Hornby, Ontario, Canada). La reducción de la
infección por CMV se determinó usando un ensayo de neutralización
viral, como se lo conoce convencionalmente en la técnica. El valor
de neutralización VN_{50}) se definió como el 50% de reducción en
la DO_{570} comparado con el control de sólo CMV.
La inmunización de los ratones con VRP que
expresan ácido nucleico que codifica la glicoproteína gB (de
longitud total o truncada) dio como resultado la inducción de
anticuerpos neutralizantes para el virus (Figura 2). Los valores de
anticuerpos neutralizantes aumentaron significativamente tras la
segunda estimulación. Se observaron valores más altos de
anticuerpos neutralizantes en los Grupos 3B y 4B con la adición de
proteína y adyuvante comparado con los grupos (Grupos 3A y 4A) que
tuvieron una tercera dosis de VRP en lugar de proteína y adyuvante
(Véase Figura 2, Día 63).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un ensayo ELISPOT de
IFN-\gamma para evaluar la respuesta inmune
celular para pp65 e IE1. Se prepararon linfocitos esplénicos usando
centrifugación en gradiente Lympholyte M después de la lisis de los
glóbulos rojos. Se recubrieron placas ELISPOT IP de 96 pocillos
(Millipore, Bedford, MA) con 1 \mug de anticuerpo monoclonal anti
IFN-\gamma de ratón (MabTech, Mariemont,
OH)/pocillo y se bloquearon con FCS al 10% en
RPMI-1640 (incluidos los suplementos). Se
plaquearon 10^{6} linfocitos/pocillo solos o tras mezclar con Con
A (4 \mug/ml) o péptido (10 \mug/ml). En todos los casos, se
probó cada péptido frente a linfocitos positivos y negativos
conocidos y se probó cada preparación de linfocitos contra péptidos
positivos y negativos conocidos. Para la detección, se añadieron
0,1 \mug de anticuerpo anti IFN-\gamma de ratón
biotinilado (MabTech) a cada pocillo, seguido por la incubación con
complejo avidina-peroxidasa (Vector Laboratories,
Burlingame, CA), y desarrollo de color con sustrato AEC. Las
manchas fueron cuantificadas por Zallnet, Inc. (Nueva York, NY)
usando un lector ELISPOT Zeiss.
La respuesta inmune celular de los ratones para
las VRP que expresan CMV se midió por medio del ensayo ELISPOT
según se describió anteriormente. Todas las construcciones indujeron
una respuesta inmune potente para las proteínas pp65 e IE1 (Figura
3).
\vskip1.000000\baselineskip
Puede probarse una vacuna de la invención en
estudios de "desafío" en seres humanos sometidos a cirugías de
transplante de órganos sólidos. Se inmunizaron pacientes
seronegativos para CMV en lista de espera para órgano/médula ósea y
a continuación se sometieron a la cirugía de transplante de dos
semanas a varios años después de la inmunización. El "desafío"
surge del transplante mismo, ya que la mayoría de los órganos
transplantados en los Estados Unidos (> 60%) provienen de
donantes seropositivos, y el virus CMV se transmite a través del
órgano. Además, a estos receptores seronegativos para CMV de órganos
seropositivos para CMV se les administran dosis de estímulo de la
vacuna después de la cirugía de transplante para mantener un nivel
de inmunidad suficiente para prevenir la enfermedad por CMV. Las
dosis de estímulo se administran inicialmente en intervalos de una
vez cada mes hasta cada seis meses. Los pacientes se controlan y
evalúan durante al menos un año, en intervalos mensuales o
trimestrales, y/o después del tratamiento por signos o síntomas de
enfermedad por CMV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Puede administrarse una vacuna de la invención a
receptores de médula ósea para reducir o eliminar la transmisión de
HCMV a través de la médula ósea del donante. El riesgo de enfermedad
de tal transmisión de HCMV es particularmente alto en los pacientes
seronegativos quienes reciben una médula ósea seropositiva. En un
protocolo de vacunación, se vacuna el donante de médula ósea con
una vacuna de la invención en una o más de una vez, por ejemplo,
seis o dos semanas antes del realizar la donación; el receptor de
TMO se vacuna en intervalos (por ejemplo, cada uno a seis meses)
comenzando aproximadamente cuatro semanas hasta aproximadamente seis
meses tras recibir la médula ósea transplantada. Se controla la
aparición de CMV en el paciente de transplante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Una vacuna de la invención puede probarse además
en mujeres con capacidad de procrear seronegativas para HCMV. Los
protocolos de inmunización incluirán típicamente una inmunización de
cebado seguida por una o dos inmunizaciones de "estímulo". Se
controla en estas mujeres el resultado del embarazo, incluyendo las
tasas de infección con CMV, enfermedad sintomática y secuelas
retrasadas en los neonatos.
Aunque el presente procedimiento se ha descrito
con referencia a detalles específicos de algunas de sus formas de
realización, no es la intención que tales detalles sean considerados
como limitaciones sobre el ámbito de la invención, excepto en y
hasta el alcance en que se incluyen en las reivindicaciones
adjuntas.
<110> Alphavax, Inc.
\hskip1cmChulay, Jeffrey D.
\hskip1cmDryga, Sergey A.
\hskip1cmReap, Elizabeth A.
\hskip1cmMorris, John S.
\hskip1cmOlmsted, Robert A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VACUNAS CONTRA CITOMEGALOVIRUS
BASADAS EN ALFAVIRUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 9368-7WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/486,501
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-07-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 262
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2079
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2076)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gB truncada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 692
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fusión de pp65-IE1
de hCMV
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3153)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1051
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fusión de pp65-IE1
de hCMV
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
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<213> Citomegalovirus humano
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> PRT
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
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<213> Citomegalovirus humano
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<213> Citomegalovirus humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
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<213> Citomegalovirus humano
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<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
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<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 225
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<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
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\hskip1cm
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 229
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 230
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 231
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 234
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 235
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 236
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 237
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 238
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 239
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 240
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 241
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 242
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 243
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 244
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 245
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 246
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 247
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 248
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 249
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 250
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 251
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 252
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 253
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 254
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 255
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 256
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 257
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 258
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 259
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 259
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 260
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 261
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 262
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 262
\hskip1cm
Claims (18)
1. Una población de partículas de replicones de
alfavirus en la que dichas partículas comprenden ARN de replicones
de alfavirus, en la que un primer ARN de replicón comprende el ácido
nucleico que codifica una proteína de fusión de las proteínas pp65
e IE1 del citomegalovirus o sus epítopos, y un segundo ARN de
replicón que comprende el ácido nucleico que codifica la proteína
gB del citomegalovirus o uno de sus epítopos, y en la que cada uno
del primer y segundo ARN está contenido dentro de una partícula de
replicón de alfavirus separada.
2. Una población de partículas de replicones de
alfavirus en la que dichas partículas comprenden un ARN de replicón
que comprende una casete reguladora que dirige la transcripción y la
traducción de un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión
de las proteínas pp65 e IE1 del citomegalovirus, o sus epítopos.
3. La población de la reivindicación 2, en la
que la casete reguladora es un promotor subgenómico del
alfavirus.
4. La población de la reivindicación 1, en la
que el ácido nucleico que codifica la proteína gB del
citomegalovirus o uno de sus epítopos codifica una proteína gB de
CMV o uno de sus epítopos, en el que se ha delecionado el dominio
transmembranario.
5. Una composición que comprende la población de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
6. Uso de la población de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un medicamento para
inducir una respuesta inmune para CMV en un sujeto.
7. El uso de la reivindicación 6, en el que la
población se administra múltiples veces.
8. Uso de un primer componente de inmunización
seleccionado del grupo constituido por una población de partículas
de replicones de alfavirus que codifican inmunógenos de CMV,
inmunógenos de CMV, moléculas de ácido nucleico que codifican
inmunógenos de CMV, un vector viral no alfaviral que codifica
inmunógenos de CMV, y cualquiera de sus combinaciones en la
fabricación de un medicamento para cebar una respuesta inmune para
el CMV, previo a estimular la respuesta de cebado por medio de la
administración de un segundo componente de inmunización
seleccionado del grupo constituido por una población de partículas
de replicones de alfavirus que codifican inmunógenos de CMV,
inmunógenos de CMV, moléculas de ácido nucleico que codifican
inmunógenos de CMV, un vector viral no alfaviral que codifica
inmunógenos de CMV, y cualquier combinación, en el que el primer
componente de inmunización es diferente del segundo componente de
inmunización y en el que al menos el primer componente de
inmunización o el segundo componente de inmunización es una
población según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Uso de un segundo componente de inmunización
seleccionado del grupo constituido por una población de partículas
de replicones de alfavirus que codifican inmunógenos de CMV,
inmunógenos de CMV, moléculas de ácido nucleico que codifican
inmunógenos de CMV, un vector viral no alfaviral que codifica
inmunógenos de CMV, y cualquiera de sus combinaciones en la
fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmune
para el CMV, tras la respuesta de cebado de la administración de un
primer componente de inmunización seleccionado del grupo
constituido por una población de partículas de replicones de
alfavirus que codifican inmunógenos de CMV, inmunógenos de CMV,
moléculas de ácido nucleico que codifican inmunógenos de CMV, un
vector viral no alfaviral que codifica inmunógenos de CMV, y
cualquier combinación, en el que el primer componente de
inmunización es diferente del segundo componente de inmunización y
en el que al menos el primer componente de inmunización o el
segundo componente de inmunización es una población según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4.
10. El uso de la reivindicación 8 o
reivindicación 9 en el que el primer componente de inmunización es
una primera población de partículas de replicones de alfavirus y el
segundo componente de inmunización es una segunda población de
partículas de replicones de alfavirus, con la condición de que las
partículas de replicones de alfavirus del primer componente de
inmunización y las partículas de replicones de alfavirus del segundo
componente de inmunización deriven de diferentes alfavirus.
11. El uso de la reivindicación 8 o
reivindicación 9, en el que el primer y/o el segundo
componente(s) de inmunización se administra(n)
múltiples veces.
12. El uso de la reivindicación 8 o
reivindicación 9, en el que el primer componente de inmunización o
el segundo componente de inmunización comprende inmunógenos de CMV
que comprenden una o más proteínas de CMV y/o sus epítopos.
13. El uso de la reivindicación 8 ó 9, en el que
la proteína gB de CMV del primer o segundo componente de
inmunización es una proteína gB truncada.
14. El uso de la reivindicación 8 ó 9, en el que
el primer y/o el segundo componente(s) de inmunización se
administra(n) con un adyuvante.
15. El uso de la reivindicación 14 en el que el
adyuvante se selecciona del grupo constituido por sales de
aluminio, aceite en agua, saponina, citocinas, oligonucleótidos que
codifican señales inmunoestimuladoras y cualquiera de sus
combinaciones.
16. El uso de la reivindicación 8 o
reivindicación 9, en el que el primer o el segundo componente de
inmunización es un vector viral no alfaviral y se selecciona del
grupo constituido por un vector retroviral, un vector adenoviral,
un vector de poxvirus, un vector del virus de la estomatitis
vesicular (VSV) o un vector de picornavirus.
17. El uso de la reivindicación 8 o
reivindicación 9, en el que el primer o el segundo componente de
inmunización comprende una partícula de replicón de alfavirus
seleccionada del grupo constituido por una partícula derivada del
virus de la encefalitis equina venezolana, el virus S.A.AR86, el
virus Semliki Forest, el virus Sindbis, el virus Ross River y
cualquiera de sus combinaciones.
18. El uso de la reivindicación 17 en el que la
partícula de replicón de alfavirus comprende elementos de dos o más
alfavirus.
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