CN111315409A - 狂犬病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于狂犬病毒的疫苗以及单独或与其他保护剂组合的疫苗的制备和使用方法。

Description

狂犬病毒疫苗

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年11月06日提交的美国临时申请系列号62/581,955的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及狂犬病毒的新疫苗。还提供了单独或与其他保护剂组合的疫苗的制备和使用方法。

背景技术

狂犬病是一种可预防的人畜共患病，可导致人类和其他哺乳动物的脑部炎症。临床上狂犬病是一种急性、进行性脑炎，通常将其分类为狂躁型狂犬病或麻痹型狂犬病。狂躁型狂犬病的特征是躁动不安、易怒和具有攻击性。麻痹型狂犬病的特征是流涎过多、呼吸深沉、呼吸困难、瘫痪并最终昏迷。

狂犬病的病原体是狂犬病毒，其能够感染大多数哺乳动物，并在野生动物和易感家畜中保持疾病库。狂犬病毒存在于世界的大部分地区，但在不同地理区域中作为狂犬病毒主要宿主的物种不同，包括野生犬、浣熊、臭鼬、狐狸、蝙蝠和猫鼬等[Robinson等，SeminVet Med Surg(small Anim)6:203-211(1991)]。狂犬病毒最常见是通过感染动物的咬伤传播。一旦狂犬病毒感染中枢神经系统，就会显示出狂犬病的临床症状。

狂犬病毒是一种有包膜的RNA病毒，其编码五个结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)，基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶[Dietzschold等，Crit Rev Immunol 10:427-439(1991)]。糖蛋白(G)被认为是诱导病毒中和抗体的保护性抗原[Cox等，InfectImmun 16:754-759(1977)]。已经生产了几种类型的狂犬病疫苗来对抗这种疾病。灭活细胞培养物衍生的全病毒灭活狂犬病毒疫苗是在美国最常用的疫苗。这些全病毒灭活狂犬病毒疫苗需要高水平的抗原，因此需要佐剂。不幸的是，这种佐剂的使用与注射部位的反应性、超敏反应，甚至与猫注射部位肉瘤的感知风险相关。最近，已将一种修饰的活疫苗成功地与口服疫苗诱饵一起用于野生动物的免疫[Mahl等，Vet Res 45(1):77(2014)]。此外，用于猫的表达糖蛋白(G)的重组疫苗目前已在美国上市销售。核酸疫苗也已用于实验室研究，但目前在美国均未获得批准。

多年来，已在疫苗中使用多种载体策略，以努力针对某些动物病原体产生保护作用。一种这样的载体策略包括使用α病毒衍生的复制子RNA颗粒(RP)[Vander Veen等，AnimHealth Res Rev.13(1):1-9.(2012)doi:10.1017/S1466252312000011；Kamrud等，J GenVirol.91(Pt 7):1723-1727(2010)]，其是由几种不同α病毒开发而成，包括委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)[Pushko等，Virology 239:389-401(1997)]、辛德毕斯(Sindbis)(SIN)[Bredenbeek等，Journal of Virology 67:6439-6446(1993)]和塞姆利基森林病毒(SFV)[Liljestrom和Garoff,Biotechnology(NY)9:1356-1361(1991)]。RP疫苗将繁殖缺陷的α病毒RNA复制子递送到宿主细胞中，并在体内表达一种或多种期望的抗原转基因[Pushko等，Virology 239(2):389-401(1997)]。当与一些传统疫苗制剂比较时，RP具有有吸引力的安全性和有效性性质[Vander Veen等，Anim Health Res Rev.13(1):1-9.(2012)]。已将RP平台用于编码致病性抗原，并且其是几种USDA许可的猪和家禽疫苗的基础。

尽管全病毒灭活狂犬病疫苗得到广泛应用，以及还引入了更新的疫苗，但是狂犬病仍然继续对家畜和人类构成威胁。因此，仍存在对新型狂犬病疫苗的长期需要，以帮助保护包括猫、犬、马、雪貂、绵羊和牛在内的哺乳动物免受这种使其衰弱的疾病的侵害。

不应将本文引用的任何参考文献解释为承认该参考文献可作为本申请的“现有技术”。

发明内容

因此，本发明提供了编码一种或多种狂犬病毒抗原的载体。可以将这样的载体用于包含这些载体的免疫原性组合物中。本发明的免疫原性组合物可以用于疫苗。在本发明的一个方面中，疫苗保护接种疫苗的受试者(例如，哺乳动物)免受狂犬病毒侵害。在这种类型的一个实施方式中，接种疫苗的受试者是犬。在另一个实施方式中，接种疫苗的受试者是猫。在这种类型的一个更具体的实施方式中，接种疫苗的受试者是家猫。在又一个实施方式中，哺乳动物是马(例如，马)。本发明还提供了用于激发对狂犬病和其他疾病(例如，其他犬、马和/或猫的感染性疾病)的保护性免疫的组合疫苗。还提供了本发明的免疫原性组合物和疫苗的制备和使用方法。

在具体的实施方式中，载体是α病毒RNA复制子颗粒，其编码来源于狂犬病毒的一种或多种抗原。在甚至更具体的实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒是委内瑞拉马脑炎(VEE)α病毒RNA复制子颗粒。在另外更具体的实施方式中，VEEα病毒RNA复制子颗粒是TC-83VEEα病毒RNA复制子颗粒。在其他实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒是辛德毕斯(SIN)α病毒RNA复制子颗粒。在另外其他实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒是塞姆利基森林病毒(SFV)α病毒RNA复制子颗粒。在一个替代的实施方式中，裸DNA载体包含编码狂犬病毒糖蛋白(G)抗原的核酸构建体。本发明包括本发明的所有核酸构建体，包括RNA质粒、RNA复制子、以及本发明的所有α病毒RNA复制子颗粒，裸DNA载体和免疫原性组合物和/或疫苗，其包含本发明的核酸构建体(例如，RNA质粒、RNA复制子)、α病毒RNA复制子颗粒和/或裸DNA载体。

在某些实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒编码一种狂犬病毒G抗原。在相关实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒编码一种或多种狂犬病毒G抗原或其抗原片段。在另外其他实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒编码两种至四种狂犬病毒G抗原或其抗原片段。在具体实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒是委内瑞拉马脑炎(VEE)α病毒RNA复制子颗粒。

本发明还提供了免疫原性组合物，其包含编码一种狂犬病毒G抗原的α病毒RNA复制子颗粒。在相关实施方式中，免疫原性组合物包含编码一种或多种狂犬病毒G抗原或其抗原片段的α病毒RNA复制子颗粒。在这种类型的具体实施方式中，免疫原性组合物包含编码两种至四种狂犬病毒G抗原或其抗原片段的α病毒RNA复制子颗粒。在更具体的实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒RNA复制子颗粒，其是委内瑞拉马脑炎(VEE)α病毒RNA复制子颗粒。

在其他实施方式中，免疫原性组合物包含两组或多组α病毒RNA复制子颗粒。在这种类型的具体实施方式中，一组α病毒RNA复制子颗粒编码狂犬病毒G抗原或其抗原片段，和第二组α病毒RNA复制子颗粒编码猫杯状病毒(FCV)抗原或其抗原片段。在这种类型的某些实施方式中，FCV抗原来源于恶性全身性猫杯状病毒。在其他实施方式中，FCV抗原来源于经典(F9-样)猫杯状病毒。在另外其他实施方式中，第二组α病毒RNA复制子颗粒编码两种FCV抗原，其中一种来源于恶性全身性猫杯状病毒，而另一种来源于经典(F9-样)猫杯状病毒。

因此，在某些实施方式中，本发明的核酸构建体编码一种或多种狂犬病毒G抗原或其抗原片段。在这种类型的具体实施方式中，核酸构建体编码两种至四种狂犬病毒G抗原或其抗原片段。在相关实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒包含编码一种或多种狂犬病毒G抗原或其抗原片段的核酸构建体。在另外其他实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒包含编码两种至四种狂犬病毒G抗原或其抗原片段的核酸构建体。

在具体的实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒RNA复制子颗粒，其包含编码一种或多种狂犬病毒G抗原或其抗原片段的核酸构建体。在相关实施方式中，免疫原性组合物包含编码两种至四种狂犬病毒G抗原或其抗原片段的α病毒RNA复制子颗粒。在这种类型的具体实施方式中，α病毒RNA复制子颗粒编码狂犬病毒G或其抗原片段。在更具体的实施方式中，免疫原性组合物包含α病毒RNA复制子颗粒，其是委内瑞拉马脑炎(VEE)α病毒RNA复制子颗粒。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含两组或多组α病毒RNA复制子颗粒。在这种类型的具体实施方式中，一组α病毒RNA复制子颗粒包含第一核酸构建体，而另一组α病毒RNA复制子颗粒包含第二核酸构建体。

在另外其他实施方式中，免疫原性组合物包含一组含有第一核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，另一组含有第二核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，和第三组含有第三核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒。在这种类型的一个具体实施方式中，第一核酸构建体编码狂犬病毒G抗原或其抗原片段，第二核酸构建体编码来源于恶性全身性猫杯状病毒的猫杯状病毒(FCV)抗原或其抗原片段，和第三核酸构建体编码来源于经典(F9-样)猫杯状病毒的猫杯状病毒(FCV)抗原或其抗原片段。在具体的实施方式中，猫杯状病毒(FCV)抗原是FCV衣壳蛋白。

在另外其他实施方式中，免疫原性组合物包含一组含有第一核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，另一组含有第二核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，第三组含有第三核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，第四组含有第四核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，和第五组含有第五核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒。在这样的实施方式中，第一核酸构建体、第二核酸构建体、第三核酸构建体、第四核酸构建体和第五核酸构建体的核苷酸序列均是不同的。

因此，本发明的免疫原性组合物可以包含α病毒RNA复制子颗粒，其另外包含编码用于激发针对非狂犬病毒病原体的保护性免疫的至少一种非狂犬病毒抗原的核酸构建体。在这种类型的具体实施方式中，非狂犬病毒抗原是来源于猫疱疹病毒(FHV)的蛋白抗原。在其他实施方式中，非狂犬病毒抗原是来源于猫杯状病毒(FCV)的蛋白抗原。在另外其他实施方式中，非狂犬病毒抗原是来源于猫肺炎病毒(FPN)的蛋白抗原。在另外其他实施方式中，非狂犬病毒抗原是来源于猫细小病毒(FPV)的蛋白抗原。

在另外其他实施方式中，免疫原性组合物包含一组含有第一核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，另一组含有第二核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，第三组含有第三核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，和第四组含有第四核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒。在这种类型的一个具体实施方式中，第一核酸构建体编码狂犬病毒G抗原或其抗原片段，第二核酸构建体编码来源于恶性全身性猫杯状病毒的猫杯状病毒(FCV)抗原或其抗原片段，第三核酸构建体编码来源于经典(F9-样)猫杯状病毒的猫杯状病毒(FCV)抗原或其抗原片段，和第四核酸构建体编码FeLV抗原或其抗原片段。

在另外其他实施方式中，免疫原性组合物包含一组含有第一核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，另一组含有第二核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，第三组含有第三核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，第四组含有第四核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒，和第五组含有第五核酸构建体的α病毒RNA复制子颗粒。在这样的实施方式中，第一核酸构建体、第二核酸构建体、第三核酸构建体、第四核酸构建体和第五核酸构建体的核苷酸序列均是不同的。

因此，本发明的免疫原性组合物可以包含α病毒RNA复制子颗粒，其包含编码用于激发针对非狂犬病毒病原体的保护性免疫的至少一种非狂犬病毒抗原的核酸构建体。在这种类型的具体实施方式中，非狂犬病毒抗原来源于猫疱疹病毒(FHV)的蛋白抗原。在其他实施方式中，非狂犬病毒抗原是来源于猫杯状病毒(FCV)的蛋白抗原。在另外其他实施方式中，非狂犬病毒抗原是来源于猫肺炎病毒(FPN)的蛋白抗原。在另外其他实施方式中，非狂犬病毒抗原是来源于猫细小病毒(FPV)的蛋白抗原。

本发明还提供了组合免疫原性组合物和/或疫苗，其包含编码来源于狂犬病毒和一种或多种修饰的活的(例如，减毒)或灭活的哺乳动物病原体的抗原或其抗原片段的α病毒RNA复制子颗粒。

在本发明具体的实施方式中，狂犬病毒抗原是狂犬病毒G。在这种类型的具体实施方式中，狂犬病毒G包含与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有95％或更高的同一性的氨基酸序列。在这种类型更具体的实施方式中，狂犬病毒G包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在这种类型甚至更具体的实施方式中，狂犬病毒G是由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列编码的。

本发明还包含含有本发明的免疫原性组合物的疫苗和多价疫苗。在具体的实施方式中，疫苗是非佐剂疫苗。本发明的疫苗可以帮助预防与狂犬病毒相关的疾病。在某些实施方式中，当使用疫苗免疫哺乳动物时，在哺乳动物受试者中诱导抗体。在具体的实施方式中，哺乳动物是犬。在其他实施方式中，哺乳动物是猫。在另外其他实施方式中，哺乳动物是马(马)。在另外其他实施方式中，哺乳动物是鼬科动物。在这种类型的具体实施方式中，鼬科动物是猫。在另外其他实施方式中，哺乳动物是牛科动物。在这种类型的具体实施方式中，牛科动物是牛。在这种类型的其他实施方式中，牛科动物是绵羊。

本发明还提供了针对狂犬病毒免疫哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用免疫有效量的本发明的疫苗。在具体的实施方式中，通过肌内注射施用疫苗。在替代的实施方式中，通过皮下注射施用疫苗。在其他实施方式中，通过静脉内注射施用疫苗。在另外其他实施方式中，通过皮内注射施用疫苗。在另外其他实施方式中，通过口服给药施用疫苗。在另外其他实施方式中，通过鼻内给药施用疫苗。在具体的实施方式中，哺乳动物是猫。在其他具体实施方式中，哺乳动物是犬。在另外其他实施方式中，哺乳动物是马。

本发明的疫苗(包括多价疫苗)可以作为初免疫苗和/或作为加强疫苗施用。在具体的实施方式中，本发明的疫苗作为一次接种疫苗(1剂)施用，不需要随后再施用。在某些实施方式中，在施用初免疫苗和加强疫苗两者的情况下，可以以相同途径施用初免疫苗和加强疫苗。在这种类型的其他实施方式中，初免疫苗和加强疫苗两者均通过皮下注射施用。在替代的实施方式中，初免疫苗的施用可以通过一种途径进行和加强疫苗的施用可以通过另一种途径进行。在这种类型的某些实施方式中，可以通过皮下注射施用初免疫苗和可以通过口服施用加强疫苗。

本发明还提供了针对狂犬病毒免疫哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物注射免疫有效量的本发明的疫苗。在具体的实施方式中，疫苗可以包含约1x 10⁵至约1x 10¹⁰个或更多RP。在更具体的实施方式中，疫苗可以包含约1x 10⁶至约1x 10⁹个RP。在甚至更具体的实施方式中，疫苗可以包含约1x 10⁷至约1x 10⁸个RP。

在某些实施方式中，本发明的疫苗以0.03mL至5mL剂量施用。在具体的实施方式中，本发明的疫苗以0.05mL至3mL剂量施用。在更具体的实施方式中，以0.1mL至2mL剂量施用。在另外更具体的实施方式中，以0.2mL至1.5mL剂量施用。在甚至更具体的实施方式中，以0.3mL至1.0mL剂量施用。在另外更具体的实施方式中，以0.4mL至0.8mL剂量施用。

通过参考下述具体实施方式，将更好地理解本发明的这些和其他方面。

具体实施方式

本发明提供了疫苗组合物，其包含免疫有效量的来自一种或多种狂犬病毒株的抗原，其有助于在接受疫苗接种的动物中激发保护性免疫。在本发明的一个方面中，疫苗包含α病毒RNA复制子颗粒(RP)，其包含委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)的衣壳蛋白和糖蛋白，并且其编码狂犬病糖蛋白(G)或其抗原片段。在甚至更具体的实施方式中，疫苗包含α病毒RNA复制子颗粒(RP)，其包含VEE的无毒TC-83株的衣壳蛋白和糖蛋白，并且其编码狂犬病糖蛋白(G)或其抗原片段。在本发明的另一个方面中，疫苗包含裸DNA载体，其编码狂犬病糖蛋白(G)。可以在不存在佐剂的条件下施用包含编码狂犬病糖蛋白(G)的α病毒RNA复制子颗粒的疫苗，并且所述疫苗仍能在接种的哺乳动物中有效辅助激发针对狂犬病毒的保护性免疫。

因此，本发明的一个方面提供了一种改进的、安全的无佐剂狂犬病毒疫苗。在一个相关的方面，本发明的疫苗不会诱发注射部位肉瘤，但仍为接种的哺乳动物提供至少与相应的佐剂疫苗一样有效的保护，使其免受因狂犬病毒感染引起的使其衰弱的疾病状态的侵害。

为了更充分地理解本发明，提供了以下定义。

为了便于描述所使用的单数形式的术语并非旨在是限制性的。因此，例如，提及组合物包含“一种多肽”时包括提及一种或多种这样的多肽。此外，除非另外说明，否则提及一个“α病毒RNA复制子颗粒”包括提及多个这样的α病毒RNA复制子颗粒。

如在本文中所使用的，术语“约(approximately)”与“约(about)”可以互换使用，表示在所示值百分之五十以内的值，即每毫升含有“约”1X 10⁸个α病毒RNA复制子颗粒的组合物每毫升含有5X 10⁷至1.5X 10⁸个α病毒RNA复制子颗粒。

如在本文中所使用的，术语“猫”指猫科动物的任何成员。家猫、纯种和/或杂种伴侣猫以及野生或流浪猫都是猫科动物。

如在本文中所使用的，除非另有说明，否则术语“犬”包括所有家犬(domesticdogs/Canis lupus familiaris/Canis familiaris)。

如在本文中所使用的，“雪貂”是一种哺乳动物，其是属于鼬科的一种哺乳动物。

如在本文中所使用的，“牛科”是偶蹄类、反刍哺乳动物的哺乳动物科，包括羚羊、绵羊(sheep/ovine)、山羊、麝牛和牛，例如野牛、非洲水牛、水牛和牛。

如在本文中所使用的，术语“复制子”指缺少一个或多个元件(例如，结构蛋白的编码序列)的经修饰的RNA病毒基因组，如果这些元件存在，其将能够使亲本病毒在细胞培养物或动物宿主中成功繁殖。在适宜细胞环境中，复制子将自身扩增并可以产生一种或多种亚基因组RNA种类(species)。

如在本文中所使用的，术语“α病毒RNA复制子颗粒”(简称为“RP”)是一种包装在结构蛋白(例如，衣壳和糖蛋白)中的α病毒衍生的RNA复制子，所述结构蛋白也来源于α病毒，例如如在Pushko等[Virology 239(2):389-401(1997)]中所描述的。RP无法在细胞培养物或动物宿主中繁殖(无辅助质粒或类似组分的情况下)，因为复制子不编码α病毒结构组分(例如，衣壳和糖蛋白)。

术语“非狂犬病毒”用于修饰术语，如病原体和/或抗原(或免疫原)，以表示相应病原体和/或抗原(或免疫原)既不是狂犬病毒，也不是狂犬病毒抗原(或免疫原)，以及非狂犬病毒蛋白抗原(或免疫原)不是来源于狂犬病毒。

针对给定蛋白抗原和天然编码其的病原体或该病原体的毒株，术语“来源于(originate/originates from/originating from)”可以互换使用，并且如在本文中所使用的，表示由该病原体或该病原体的毒株编码给定蛋白抗原的未经修饰和/或截短的氨基酸序列。在本发明核酸构建体中的来源于病原体的蛋白抗原的编码序列可以在遗传上操纵，以产生与作为其来源的病原体或病原体毒株(包括自然减毒株)中蛋白抗原的相应序列相比，所表达的蛋白抗原具有修饰的和/或截短的氨基酸序列。

如在本文中所使用的，术语“保护”、或“提供对……的保护”、或“激发对……的保护性免疫”、或“助于预防疾病”和“助于产生保护作用”不需要对感染的任何迹象提供全面的保护。例如，“助于产生保护作用”可以指保护作用是足够的，使得在受到攻击后，至少可以减轻潜在感染的症状，和/或减轻和/或消除引起症状的一种或多种潜在细胞、生理或生化原因或机制。应当理解的是，如在本文中所使用的，“减轻”指相对于感染的状态，包括感染的分子状态，而不仅仅是感染的生理状态。

如在本文中所使用的，“疫苗”是适于向动物应用的组合物，例如犬(在某些实施方式中，包括人，而在其他实施方式中，特定地不是用于人的)，所述组合物包含通常与药学上可接受的载体(如含有水的液体)组合的一种或多种抗原，在向动物施用后诱导足够强的免疫应答，使其至少能够帮助保护动物免受野生型微生物感染引起的疾病的侵害，即强度足以帮助预防疾病和/或预防、改善或治愈疾病。

如在本文中所使用的，多价疫苗是包含两种或多种不同抗原的疫苗。在这种类型的一个具体实施方式中，多价疫苗针对两种或多种不同病原体刺激受体的免疫系统。

术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可以互换使用，并且将其定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在这一背景下，将佐剂用于增强针对一种或多种疫苗抗原/分离物的免疫应答。因此，“佐剂”是非特异性增强对特定抗原的免疫应答的试剂，从而减少任何给定疫苗中所必需的抗原量和/或降低为产生针对感兴趣的抗原的充分免疫应答所必需的注射频率。在这一背景下，将佐剂用于增强针对一种或多种疫苗抗原/分离物的免疫应答。

如在本文中所使用的，“无佐剂疫苗”是不含佐剂的疫苗或多价疫苗。

如在本文中所使用的，术语“药学上可接受的”作为形容词用于表示所修饰的名词是适用于药品的。例如，当将其用于描述药物疫苗中的赋形剂时，其表征了该赋形剂是与组合物中的其他成分具有相容性，并且对目标受体动物(例如，犬)无不利的有害作用。

“胃肠外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和输注。

如在本文中所使用的，针对特定蛋白(例如，蛋白抗原)的术语“抗原片段”指该蛋白具有抗原性的片段，即能够与免疫系统的抗原识别分子(如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)发生特异性的相互作用。优选地，本发明的抗原片段对抗体和/或T细胞受体识别具有免疫优势。在具体的实施方式中，针对给定蛋白抗原的抗原片段是保留全长蛋白抗原性的至少25％的该蛋白的片段。在优选的实施方式中，抗原片段保留了全长蛋白抗原性的至少50％。在更优选的实施方式中，抗原片段保留了全长蛋白抗原性的至少75％。抗原片段可以小至20个氨基酸，或者在另一个极端，其是全长蛋白中仅缺失一个氨基酸的大片段。在具体实施方式中，抗原片段包含25至150个氨基酸残基。在其他实施方式中，抗原片段包含50至250个氨基酸残基。

如在本文中所使用的，当两条序列的氨基酸残基相同时，一条氨基酸序列与另一条氨基酸序列是100％“相同的”或具有100％“同一性”。因此，当两条氨基酸序列50％的氨基酸残基相同时，一条氨基酸序列与另一条氨基酸序列是50％“相同的”。序列比较是在给定蛋白(例如，所比较的蛋白或多肽的一部分)包含的氨基酸残基的连续嵌段上进行的。在一个具体的实施方式中，考虑了可能改变两条氨基酸序列之间对应性的选定的缺失或插入。

如在本文中所使用的，可以使用C,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC 27519)、Vector NTI(Informax,Inc.MD)、Oxford Molecular Group PLC(1996)和Clustal W算法，利用默认比对参数和针对同一性的默认参数确定核苷酸和氨基酸序列的同一性百分比。还可以使用相同或相似的默认参数，将这些可购买获得的程序用于确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级Blast检索，例如使用默认参数的GCG(Genetics ComputerGroup，GCG软件包程序手册，第7版，Madison,Wisconsin)累积程序。

为了本发明的目的，“灭活的”微生物是能够在动物中激发免疫应答，但不能感染动物的生物体。例如，可以通过选自下述的试剂将灭活的狂犬病毒灭活：二乙烯亚胺、福尔马林、β-丙内酯、硫柳汞或加热。

可以将本发明的α病毒RNA复制子颗粒冻干并使用无菌水稀释剂再水化。另一方面，当将α病毒RNA复制子颗粒单独保存，但意欲在施用前与其他疫苗组分混合时，可以将α病毒RNA复制子颗粒在那些组分的稳定溶液(例如，高浓度蔗糖溶液)中储存。

本发明的疫苗可以通过任何标准途径容易地施用，包括静脉内、肌内、皮下、口服、鼻内、皮内和/或腹膜内接种。本领域技术人员将意识到，疫苗组合物优选地针对每种类型的受体动物和施用途径适当地配制。因此，本发明还提供了针对狂犬病和/或其他哺乳动物病原体免疫哺乳动物的方法。一种这样的方法包括向哺乳动物注射免疫有效量的本发明的疫苗，以使得所述哺乳动物产生适当的狂犬病毒糖蛋白(G)抗体。

多价疫苗：

本发明还提供了多价疫苗。可以将适用于哺乳动物疫苗的任何抗原或这样的抗原的组合加入增殖缺陷的α病毒RNA复制子颗粒(RP)，所述颗粒在疫苗中编码狂犬病毒的哺乳动物抗原[例如，狂犬病糖蛋白(G)]。因此，这样的多价疫苗包括在本发明中。

序列表

序列

狂犬病糖蛋白(G)基因已针对人进行了密码子优化。尽管具有100％氨基酸同一性，但是所得到的基因与活狂犬病毒糖蛋白(G)序列仅具有～85％核苷酸同一性。

狂犬病毒G(SEQ ID NO：1)

狂犬病毒G(SEQ ID NO：2)

狂犬病毒G(SEQ ID NO：4)

实施例

下列实施例用于提供对本发明的进一步理解，但绝不意味着以任何方式限制本发明的有效范围。

实施例1

将狂犬病毒糖蛋白的编码序列掺入α病毒RNA复制子颗粒中

前言

可以将RNA病毒作为载体-载剂，以将经过基因工程化的疫苗抗原引入其基因组中。然而，迄今为止，其用途主要限于将病毒抗原掺入RNA病毒，然后将病毒引入受体宿主。结果是针对掺入的病毒抗原诱导保护性抗体。已将α病毒RNA复制子颗粒用于编码致病抗原。已由几种不同α病毒开发了这样的α病毒复制子平台，包括委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)[Pushko等，Virology 239:389-401(1997)]、辛德毕斯(Sindbis)(SIN)[Bredenbeek等，Journal of Virology 67:6439-6446(1993)，其全部内容通过引用并入本文]和塞姆利基森林病毒(SFV)[Liljestrom和Garoff,Biotechnology(NY)9:1356-1361(1991)，其全部内容通过引用并入本文]。此外，α病毒RNA复制子颗粒是几种USDA许可的猪和家禽疫苗的基础。这些包括：猪流行性腹泻疫苗，RNA颗粒(产品代码19U5.P1)、猪流感疫苗，RNA(产品代码19A5.D0)、禽流感疫苗，RNA(产品代码19O5.D0)和处方产品，RNA颗粒(产品代码9PP0.00)。

α病毒RNA复制子的构建

制备了包含使用委内瑞拉马脑炎病毒无毒TC-83毒株的衣壳蛋白和糖蛋白包装的编码狂犬病毒的狂犬病毒糖蛋白(G)的α病毒RNA复制子颗粒的疫苗。狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列已针对人进行了密码子优化。尽管具有100％氨基酸同一性，但是所得到的序列与活的狂犬病毒糖蛋白(G)序列仅具有～85％核苷酸同一性。疫苗可以以单一剂量施用给哺乳动物受试者，例如皮下给予12周龄或周龄数更大的猫和犬，或者多次给药，包括首次给药，随后一次或多次加强给药。

将狂犬病毒糖蛋白(G)的氨基酸序列用于通过计算机产生密码子优化(使用人密码子)的核苷酸序列。由商业供应商(ATUM,Newark,CA)以合成DNA形式制备优化序列。相应地，根据狂犬病毒糖蛋白的氨基酸序列设计合成的基因[SEQ ID NO：1]。构建体(RABV-G)是针对人进行密码子优化的野生型氨基酸序列[SEQ ID NO：2]，其侧翼序列适于克隆进入α病毒复制子质粒。

根据此前的描述[参见U.S.9,441,247B2，其全部内容通过引用并入本文]构建VEE复制子载体，其被设计为表达狂犬病毒G，该载体具有下述修饰。使用限制性内切酶AscI和PacI消化的来源于TC-83的复制子载体“pVEK”[在U.S.9,441,247B2中公开和描述]。使用限制性内切酶AscI和PacI同样地消化DNA质粒，所述DNA质粒含有具有5’侧翼序列(5’-GGCGCGCCGCACC-3’)[SEQ ID NO：3]和3’侧翼序列(5’-TTAATTAA-3’)的狂犬病毒G基因的密码子优化的开放阅读框核苷酸序列。然后，将合成的基因盒连接至经消化的pVEK载体，并将所得到的克隆重新命名为“pVHV-RABV-G”。选择“pVHV”载体命名法表示来源于pVEK的复制子载体，其含有在pVEK的多克隆位点通过AscI和PacI位点克隆的转基因盒。

根据此前描述的方法[U.S.9,441,247B2和U.S.8,460,913B2；其内容通过引用并入本文]制备TC-83RNA复制子颗粒(RP)。简言之，在使用MegaScript T7RNA聚合酶和帽类似物(Promega,Madison,WI)进行体外转录之前，用NotI限制性内切酶将pVHV复制子载体DNA和辅助DNA质粒线性化。重要的是，如此前所述[Kamrud等，J Gen Virol.91(Pt 7):1723-1727(2010)]，在制备中使用的辅助RNA缺乏VEE亚基因组启动子序列。将复制子和辅助组分的纯化RNA合并并与Vero细胞悬液混合，在4mm比色杯中电穿孔，然后再将其放入

SFM细胞培养基(Thermo Fisher,Waltham,MA)中。孵育过夜后，从细胞和培养基中纯化α病毒RNA复制子颗粒，使悬液通过ZetaPlus

深层过滤器(3M,Maplewood,MN)，使用含5％蔗糖(w/v)的磷酸盐缓冲液洗涤，最终使用400mM NaCl缓冲液洗脱保留的RP。将洗脱的RP配制成终浓度5％的蔗糖溶液(w/v)，通过0.22微米的膜过滤器，并于分装后保存。在感染的Vero细胞单层上使用免疫荧光测定法确定功能性RP的滴度。

实施例2

向犬施用含编码狂犬病毒糖蛋白的α病毒复制子颗粒的疫苗

进行了一项初步研究，以评价使用RP-狂犬病毒G疫苗接种后犬的安全性和血清反应。用于研究的RP-狂犬病毒疫苗在5％蔗糖和作为稳定剂的1％犬血清中配制，并且液态疫苗冷冻保存。将每组五只犬，共五组，接种疫苗，总结如下：

表1

向犬施用RP-狂犬病毒G疫苗

组别	动物数	疫苗	RP/剂	接种日
					1	5	RP-狂犬病毒	4.1x 10<sup>8</sup>	0
2	5	RP-狂犬病毒	5.0x 10<sup>7</sup>	0
					3	5	RP-狂犬病毒	8.3x 10<sup>6</sup>	0
4	5	市售疫苗<sup>#</sup>		0
					5	5	安慰剂<sup>*</sup>	3.9x 10<sup>7</sup>	0，21

^#市售疫苗为

3(由Zoetis销售)。

^*安慰剂疫苗为编码犬非狂犬病毒插入(RP-NR)而非狂犬病毒抗原的RP。

向12-13周龄的犬接种1.0mL相应疫苗(见上表1)，在右肩胛部位皮下施用。如所示的，在第4组中的犬接受目前已获批的由Zoetis销售的市售狂犬疫苗

3。在第5组中的犬接受无关RP构建体犬非狂犬病毒插入(RP-NR)作为安慰剂。接种后，通过进行临床评估观察犬对疫苗的不良反应，并且在接种后4-8小时和接种后7天每天触诊注射部位。未观察到疫苗的任何局部或全身性不良反应。在研究前三个月中，在疫苗接种前一天和疫苗接种后的每一个月间隔为犬抽血以获得血清。通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测血清中狂犬病毒的抗体滴度。

抗狂犬病毒血清学结果如下表2中所示。滴度以国际单位每mL(IU/mL)表示，将0.5IU/mL视为保护性滴度。

表2

向犬施用疫苗后3个月时间段的血清型结果

尽管该研究原计划在接种疫苗后三个月结束，但是由于RP-狂犬病毒组的血清滴度出现了下述令人吃惊的结果，因此将研究延长：(1)在这段时间内仍处于保护性水平，和(ii)优于目前已获批的市售狂犬疫苗。保留第1组5只犬，第2组3只犬和第4组2只犬。在接种后一年的研究中，每隔约一个月对其余犬抽血以获得血清。

选定犬第一年的抗狂犬病毒血清学结果如下表3所示。滴度以国际单位每mL(IU/mL)表示，将0.5IU/mL视为保护性滴度：

表3

向犬施用疫苗后1年时间段的血清型结果

这项初始研究之后进行了第二项研究(当前正在进行中)，该研究至少在过去的六个月内产生了相似的结果。

实施例3

向猫施用含编码狂犬病毒糖蛋白的α病毒复制子颗粒的疫苗

进行了一项初步研究，以评价使用RP-狂犬病毒G疫苗接种后猫的安全性和血清反应。用于这项研究的RP-狂犬病毒G疫苗是在实验性液体稳定剂[参见例如，U.S.9,314,519B2]中配制的，并在2-7℃下冷藏保存。向4组猫接种疫苗，总结在下表4中：

表4

向猫施用RP-狂犬病毒G疫苗

组别	动物数	疫苗	RP/剂
				1	10	RP-狂犬病毒	2.7x 10<sup>7</sup>
2	10	RP-狂犬病毒	2.6x 10<sup>6</sup>
				3	10	RP-狂犬病毒	4.0x 10<sup>5</sup>
4	5	市售疫苗<sup>#</sup>

^#市售疫苗为

3(由Zoetis销售)。

向15-16周龄的猫接种1.0mL相应疫苗(见上表4)，在右肩胛部位皮下施用。如所示的，在第4组中的猫接受目前已获批的由Zoetis销售的市售狂犬疫苗

3，其含有化学灭活的狂犬病毒以及氢氧化铝佐剂。

接种后，通过进行临床评估观察猫对疫苗的不良反应，并且在接种后4-8小时和接种后7天每天触诊注射部位。接种后，还立即观察10-15分钟猫的全身反应。在第1、2和3组的猫中观察到一些速发的全身反应，表明这些猫在注射后出现刺痛或疼痛反应。这些反应持续不超过五分钟。这些注射反应是由实验性液体稳定制剂的组分所致。疫苗接种后未观察到局部不良反应。在研究前三个月中，在疫苗接种前一天和疫苗接种后的每一个月间隔为猫抽血以获得血清。通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测血清中狂犬病毒的抗体滴度。抗狂犬病毒血清学结果如下表5中所示。滴度以国际单位每mL(IU/mL)表示，将0.5IU/mL视为保护性滴度。

表5

向猫施用疫苗后5个月时间段的血清型结果

当以单一剂量向猫施用时，RP-狂犬病毒疫苗诱导较高的血清抗-狂犬病毒滴度。值得注意的是，在猫中的RFFIT滴度高于在接种类似剂量的犬中观察到的结果。将通过RFFIT测试检测的滴度0.5IU/mL视为保护性滴度。然而，在长期免疫学研究中发现，血清滴度低于此水平的猫也通常受到保护，使其免于受到致命性攻击。接种不同剂量RP-狂犬病毒疫苗的全部三个组的组几何平均抗狂犬病毒RFFIT滴度均高于接种当前已获批市售狂犬病产品的组，该产品的说明书适应证为具有持续三年的免疫力。

这项初始研究之后进行了第二项研究(当前正在进行中)，该研究至少在过去的六个月内产生了相似的结果。

本发明不限于本文所述具体实施方式的范围。实际上，除了本文描述的那些以外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。这样的修改均旨在落入所附权利要求的范围内。

还应理解的是，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并提供用于描述。

Claims (17)

1.一种免疫原性组合物，其包含编码狂犬病毒抗原的α病毒RNA复制子颗粒。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述α病毒RNA复制子颗粒是委内瑞拉马脑炎(VEE)α病毒RNA复制子颗粒。

3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中所述狂犬病毒抗原是糖蛋白(G)或其抗原片段。

4.根据权利要求1、2或3所述的免疫原性组合物，其包含一种或多种另外的α病毒RNA复制子颗粒，所述另外的α病毒RNA复制子颗粒编码第二狂犬病毒抗原，所述第二狂犬病毒抗原与所述狂犬病毒抗原源自不同的狂犬病毒株。

5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述第二狂犬病毒抗原是糖蛋白(G)或其抗原片段。

6.根据权利要求4或5所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种另外的α病毒RNA复制子颗粒是VEEα病毒RNA复制子颗粒。

7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的免疫原性组合物，其中所述狂犬病毒糖蛋白(G)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

8.一种助于预防由狂犬病毒引起的疾病的疫苗，其包含权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的免疫原性组合物和药学上可接受的载体。

9.根据权利要求8所述的疫苗，其中当用所述疫苗免疫所述哺乳动物时，在哺乳动物中诱导抗体。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述哺乳动物选自下述：犬、猫、马、雪貂、绵羊和牛。

11.根据权利要求8、9或10所述的疫苗，其还包含用于激发对非狂犬病毒病原体的保护性免疫的至少一种非狂犬病毒抗原。

12.根据权利要求11所述的疫苗，其中非狂犬病毒病原体是灭活非狂犬病毒病原体或减毒活非狂犬病毒病原体。

13.根据权利要求8、9、10、11或12所述的疫苗，其还包含至少一种重组载体，所述重组载体包含编码来源于非狂犬病毒病原体的至少一种蛋白抗原或其抗原片段的核苷酸序列。

14.根据权利要求8、9、10、11、12或13所述的疫苗，其还包含α病毒RNA复制子颗粒，所述α病毒RNA复制子颗粒包含编码来源于非狂犬病毒病原体的至少一种蛋白抗原或其抗原片段的核苷酸序列。

15.根据权利要求8、9、10、11、12、13或14所述的疫苗，其是非佐剂疫苗。

16.一种针对狂犬病毒免疫哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物施用免疫有效量的权利要求8、9、10、11、12、13、14或15所述的疫苗。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述哺乳动物选自下述：犬、猫和马。