ES2311470T3 - Nuevas citocromo p450 monooxigenasas y su uso para oxidar compuestos organicos. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la oxidación microbiológica de un compuesto aromático mono o polinuclear N- O- o S-heterocíclico, que comprende: a1) cultivar un microorganismo recombinante que produce al citocromo P450, transformado por medio de un vector que comprende al menos una construcción de expresión que porta, bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico, una secuencia de codificación para monooxigenasa, en un medio de cultivo, en presencia de un sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia; o a2) incubar un medio de reacción que contiene al sustrato con una citocromo P450 monooxigenasa de origen bacteriano; y b) aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio. donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87 de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en las posiciones 87, 188 y 74, donde Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu; Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y Ala74 es reemplazado por Val o Gly.
Description
Nuevas citocromo P450 monooxigenasas y su uso
para oxidar compuestos orgánicos.
La presente invención se relaciona con nuevas
citocromo P450 monooxigenasas con especificidad modificada por el
sustrato que son capaces de oxidar sustratos orgánicos, por ejemplo
compuestos aromáticos N-heterocíclicos, secuencias
de nucleótidos que codifican para los mismos, construcciones de
expresión y vectores que comprenden estas secuencias,
microorganismos transformados con estos, procesos para la oxidación
microbiológica de diferentes sustratos orgánicos, tales como
compuestos aromáticos N-heterocíclicos y en
particular procesos para la preperación de índigo e indirubina.
Las enzimas que tienen nuevas funciones y
propiedades se pueden preparar ya sea por selección de muestras
naturales o por medio de ingeniería de proteínas de enzimas
conocidas. Bajo ciertas circunstancias, el método anteriormente
mencionado puede ser más adecuado para inducir características cuya
generación por medio de la vía de la selección natural es
improbable. A pesar de numerosos intentos por medio de modificación
genética de enzimas, hasta ahora existen solamente unos pocos
estudios exitosos para la promoción de la actividad catalítica de
mutantes enzimáticos con respecto a un cierto sustrato
(1-10). En estos casos conocidos, los sustratos
están estructuralmente muy relacionados con el sustrato nativo de la
enzima respectiva. Hasta ahora, no existen reportes sobre la
modificación genética de enzimas las cuales, después de
modificación, catalizan la reacción de un compuesto que
estructuralmente es completamente diferente del sustrato nativo de
la enzima.
La citocromo P450 monooxigenasa aislable de la
bacteria Bacillus megaterium usualmente cataliza la
hidroxilación subterminal de cadena larga, ácidos saturados y las
correspondientes amidas y alcoholes de los mismos o la epoxidación
de ácidos grasos insaturados de cadena larga o de ácidos grasos
saturados de longitud media de cadena (11-13). La
longitud óptima de cadena de ácidos grasos saturados es de 14 a 16
átomos de carbono. Los ácidos grasos que tienen una longitud de
cadena de menos de 12 no son hidroxilados (11).
Se determinó la estructura del dominio hemo de
P450 BM-3 por medio de análisis estructural por
rayos X (14-16). El sitio de enlazamiento del
sustrato está presente en la forma de una abertura larga tipo túnel
que se extiende desde la superficie de la molécula hasta la
molécula hemo y está bordeada casi exclusivamente por residuos
hidrófobos de aminoácidos. Los únicos residuos cargados sobre la
superficie del dominio hemo son los residuos Arg47 y Tyr51. Se
asume que éstos están involucrados en el enlazamiento del grupo
carboxilato del sustrato por medio de la formación de un enlace de
hidrógeno (14). La mutación de Arg47 en Glu da lugar a la
inactivación de la enzima por el ácido araquidónico (13), pero
incrementa su actividad comparada con compuestos de
alquiltrimetilamonio C_{12}-C_{14} (17). La
utilización del sustrato para compuestos aromáticos, en particular
mono, di, o polinucleares, si se desea heterocíclicos, aromáticos,
alcanos, alquenos, cicloalcanos y cicloalquenos, no ha sido
descrita para esta enzima. Hasta ahora, se ha asumido por lo tanto
en círculos especializados que sustratos diferentes a los sustratos
orgánicos hasta ahora descritos, por ejemplo indol, a causa de las
claras diferencias estructurales de los sustratos nativos de P450
BM-3, en particular a causa de la ausencia de
grupos funcionales que podrían enlazarse a los residuos
anteriormente mencionados en la cavidad del sustrato, no son un
sustrato.
Un objetivo de la presente invención para poner
a disposición nuevas citocromo P450 monooxigenasas que tienen
especificidad modificada por el sustrato o un perfil modificado por
el sustrato. En particular, se proveen mutantes de la monooxigenasa
los cuales, en comparación con la enzima tipo silvestre no mutada,
son enzimáticamente activos con sustratos claramente
estructuralmente diferentes.
Comparado con la enzima de tipo silvestre, se
puede observar un "perfil modificado del sustrato" para los
mutantes de acuerdo con la invención. En particular, para el mutante
en cuestión, se observa una mejora en la reactividad, por ejemplo
un incremento de la actividad específica (expresada como nmol de
sustrato convertido/minuto/nmol de enzima P450) y/o de al menos un
parámetro cinético seleccionado del grupo que consiste de Kcat, Km y
Kcat/Km (por ejemplo de al menos un 1%, tal como 10 a 1000%, 10 a
500% ó 10 a 100%) en la conversión de al menos uno de los
compuestos oxidables definidos en los grupos a) hasta d). La
reacción de oxidación de acuerdo con la invención incluye la
oxigenación catalizada por la enzima de al menos un sustrato
orgánico exógeno (esto es, añadido al medio de reacción) o endógeno
(esto es, ya presente en el medio de reacción). En particular, la
reacción de oxidación de acuerdo con la invención incluye una mono
y/o polihidroxilación, por ejemplo una mono y/o dihidroxilación, en
un grupo C-E aromático o alifático, o un epoxidación
en un grupo C=C que es preferiblemente no aromático. También son
posibles las combinaciones de las reacciones anteriores. Además, el
producto inmediato de la reacción puede ser convertido además en el
contexto de una reacción secundaria o subsiguiente no enzimática.
Tales combinaciones de procesos enzimáticos y no enzimáticos forman
parte además del objeto de la presente invención.
Hemos encontrado que el objetivo anterior se
logra sorprendentemente por medio de nuevas citocromo P450
monooxigenasas las cuales, por ejemplo, son capaces de la oxidación
de compuestos aromáticos N-heterocíclicos di o
polinucleares.
En particular, la invención se relaciona con
aquellas monooxigenasas cuya región de enlazamiento con el sustrato
es capaz por medio de mutagénesis específica para el sitio de la
incorporación funcional de nuevos sustratos, por ejemplo
N-heterocíclicos.
En una modalidad preferida de la invención, las
nuevas monooxigenasas son solubles, esto es existentes en forma no
enlazada la membrana, y enzimáticamente activa en esta forma.
Las monooxigenasas de acuerdo con la invención
se derivan preferiblemente de las citocromo P450 monooxigenasas de
origen bacteriano, como las derivadas, en particular, a partir de la
citocromo P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus
megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con
la secuencia SEQ ID NO: 2, que tiene al menos una mutación
funcional, esto es, que promueve la oxidación de nuevos sustratos
orgánicos (consultar en particular los grupos a) hasta d) de
compuestos como los definidos más abajo), por ejemplo compuestos
aromáticos N-heterocíclicos di o polinucleares, en
una de las regiones de la secuencia de aminoácidos
172-224 (región bucle F/G), 39-43
(hebra \beta 1), 48-52 (hebra \beta 2),
67-70 (hebra \beta 3), 330-335
(hebra \beta 5), 352-356 (hebra \beta 8),
73-82 (hélice 5) y 86-88 (hélice
6).
Los mutantes de la citocromo P450 monooxigenasa
suministrados de acuerdo con la invención son preferiblemente
capaces de al menos una de las siguientes reacciones:
- a)
- oxidación de compuestos aromáticos mono, di o polinucleares, N, O o S-heterocíclicos sustituidos o no sustituidos;
- b)
- oxidación de aromáticos mono o polinucleares sustituidos o no sustituidos;
- c)
- oxidación de alcanos y alquenos de cadena recta y ramificada; y
- d)
- oxidación de cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos o no sustituidos.
Los mutantes preferidos de la monooxigenasa
tienen al menos una mutación funcional, en particular una
sustitución de aminoácidos, en al menos una de las regiones de la
secuencia 73-82, 86-88 y
172-224. De este modo, por ejemplo, Phe87 puede ser
reemplazada por un aminoácido que tiene una cadena lateral
alifática, tal como Ala, Val, Leu, en particular Val; Leu188 puede
ser reemplazada por un aminoácido que tiene un cadena lateral de
amida, tal como Asn o, en particular, Gln; y Ala74 puede ser
reemplazada por otro aminoácidos que tiene una cadena lateral
alifática, tal como Val y, en particular, Gly.
Los mutantes de monooxigenasa particularmente
preferidos de este tipo son aquellos que tienen al menos una de las
siguientes sustituciones de mono o poliaminoácidos:
- 1)
- Phe87Val;
- 2)
- Phe87Val, Leu188Gln; o
- 3)
- Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly;
y equivalentes funcionales de los mismos. El
número indica la posición de la mutación; el aminoácido original
está indicado antes del número antes del número y el nuevo
aminoácido introducido, después del número.
En este contexto, "equivalentes
funcionales" o análogos de los mutantes que son divulgados
específicamente son mutantes que difieren de ellos en que además
tienen la especificidad deseada del sustrato con respecto al menos
a una de las reacciones de oxidación a) hasta d) descritas
anteriormente, esto es, por ejemplo, por aromáticos heterocíclicos
y que se hidroxilan, por ejemplo, indol, o exhibe además el
"perfil modificado del sustrato" con respecto a la enzima de
tipo silvestre.
"Equivalentes funcionales" se debe entender
también que significa de acuerdo con la invención, mutantes que
exhiben, en al menos una de las posiciones anteriormente mencionadas
de la secuencia, una sustitución de aminoácido diferente de la
mencionada específicamente, pero que aún conduce a un mutante que,
como el mutante que ha sido mencionado específicamente, muestra un
"perfil modificado de sustrato" con respecto la enzima de tipo
silvestre y cataliza al menos una de las reacciones de oxidación
anteriormente mencionadas. Existe equivalencia funcional en
particular también en el caso donde las modificaciones en el perfil
del sustrato corresponden cualitativamente, esto es, donde, por
ejemplo, se convierten los mismos sustratos, pero en diferentes
proporciones.
Los "equivalentes funcionales" también
abarcan naturalmente a los mutantes de P450 monooxigenasa los
cuales, como los mutantes P450 BM3 que han sido específicamente
mencionados, pueden ser obtenidos por mutación de enzimas P450 de
otros organismos. Por ejemplo, se pueden identificar las regiones de
regiones de secuencia homóloga por comparación de la secuencia.
Siguiendo los principios de lo que ha sido establecido
específicamente en la invención, los métodos modernos de
modelamiento molecular permiten entonces que se lleven a cabo
mutaciones equivalentes que afectan el patrón de la reacción.
Los "equivalentes funcionales" también
abarcan a los mutantes que pueden ser obtenidos por medio de una o
más adiciones, sustituciones, supresiones y/o inversiones de
aminoácidos adicionales, siendo posible para las modificaciones
adicionales anteriormente mencionadas que ocurran en cualquier
posición de la secuencia mientras dan lugar a un mutante con un
perfil modificado el sustrato en el sentido anterior.
Los sustratos del grupo a) que pueden ser
oxidados de acuerdo con la invención son compuestos aromáticos mono,
di o polinucleares heterocíclicos sustituidos o no sustituidos; en
particular compuestos aromáticos mono, di o polinucleares N, O o
S-heterocíclicos oxidables o hidroxilables. Ellos
incluyen preferiblemente anillos fusionados, en particular dos, de
4 a 7 miembros, en particular de 6 ó 5 miembros, done al menos uno,
preferiblemente todos los anillos tienen carácter aromático y donde
al menos uno de los anillos aromáticos porta de uno a tres,
preferiblemente un heteroátomo de N, O o S en el anillo. La
estructura total del anillo puede contener uno o dos heteroátomos
adicionales idénticos o diferentes. Los compuestos aromáticos pueden
portar adicionalmente de 1 a 5 sustituyentes en los carbonos del
anillo o heteroátomos. Los ejemplos de sustituyentes adecuados son
alquilo C_{1} a C_{4}, tales como metilo, etilo, n o isopropilo,
n, iso o t-butilo, o alquenilo C_{2} a C_{4},
tal como etenilo, 1-propenilo,
2-propenilo, 1-butenilo,
2-butenilo o 3-butenilo, hidroxilo y
halógeno, tal como F, Cl y Br. Los sustituyentes alquilo o
alquenilo mencionados pueden tener también un grupo ceto o
aldehído; siendo ejemplos el
propan-2-on-3-ilo,
butan-2-on-4-ilo,
3-buten-2-on-4-ilo.
Ejemplos no limitantes de sustratos heterocíclicos adecuados son,
en particular, heterociclos binucleares, tales como indol,
N-metil-indol, y los análogos
sustituidos de los mismos que portan de uno a tres de los
sustituyentes anteriormente definidos sobre átomos de carbono, por
ejemplo 5-cloro o 5-bromoindol; y
también quinolina y derivados de quinolina, por ejemplo
8-metilquinolina,
6-metil-quinolina y quinaldina; y
benzotiofeno, y los análogos sustituidos de los mismos que portan
de uno a tres de los sustituyentes anteriormente definidos sobre
átomos de carbono. Además, se pueden mencionar heteroaromáticos
trinucleares, tales como acridina y los análogos sustituidos de los
mimos que portan de uno a tres de los sustituyentes anteriormente
definidos sobre átomos de carbono.
Los sustratos del grupo b) que son oxidables
acuerdo con la invención son aromáticos mono o polinucleares
sustituidos o no sustituidos, en particular mono o binucleares,
tales como benceno y naftaleno. Los compuestos aromáticos pueden
ser no sustituidos o mono o polisustituidos y, por ejemplo, portar
de 1 a 5 sustituyentes sobre los átomos de carbono del anillo. Los
ejemplos de sustituyentes adecuados son alquilo C_{1} a C_{4},
tales como metilo, etilo, n o isopropilo, o n, iso o
t-butilo, o alquenilo C_{2} a C_{4}, tal como
etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo,
1-butenilo, 2-butenilo o
3-butenilo, hidroxilo y halógeno, tal como F, Cl y
Br. Los sustituyentes alquilo o alquenilo mencionados pueden tener
también un grupo ceto o aldehído; siendo ejemplos el
propan-2-on-3-ilo,
butan-2-on-4-ilo,
3-buten-2-on-4-ilo.
El aromático pues estar fusionado con un anillo no aromático de
cuatro a siete miembros. El anillo no aromático puede tener uno o
dos dobles enlaces C=C, estar mono o polisustituido por los
sustituyentes anteriormente mencionados y puede portar uno o dos
heteroátomos en el anillo. Los ejemplos de aromáticos
particularmente adecuados son los aromáticos mononucleares, tales
como el cumeno, y sustratos binucleares, tales como indeno y
naftaleno, y análogos sustituidos de los mismos que portan de uno a
tres de los sustituyentes anteriormente definidos sobre átomos de
carbono.
Sustratos del grupo c) que pueden ser oxidados
de acuerdo con la invención son alcanos o alquenos de cadena recta
o ramificados que tienen de 4 a 15, preferiblemente de 6 a 12,
átomos de carbono. Los ejemplos que pueden ser mencionados son
n-butano, n-pentano,
n-hexano, n-heptano,
n-octano, n-nonano,
n-decano, n-undecano y
n-dodecano, y los análogos de estos compuestos que
están ramificados una o más veces, por ejemplo compuestos análogos
que tienen de 1 a 3 grupos laterales metilo; o mono o
poliinsaturados, por ejemplo monoinsaturados, análogos de los
alcanos anteriormente mencionados.
Sustratos del grupo d) que pueden ser oxidados
de acuerdo con la invención son cicloalcanos y cicloalquenos
sustituidos o no sustituidos que tienen de 4 a 8 átomos de carbono
en el anillo. Los ejemplos de estos son ciclopentano, ciclopenteno,
ciclohexano, ciclohexeno, cicloheptano y ciclohepteno. La estructura
del anillo puede portar uno o más, por ejemplo 1 a 5 sustituyentes
de acuerdo con la definición anterior para los compuestos de los
grupos a) y b). Ejemplos no limitantes son los iononas, tales como
la \alpha, \beta y \gamma-iononas, y las
correspondientes metil iononas e iso-metil iononas.
Se da particular preferencia a la \alpha y
\beta-iononas.
La invención también se relaciona con secuencias
ácido nucleico que codifican para una de las monooxigenasas de
acuerdo con la invención. Las secuencias preferidas de ácido
nucleico se derivan de la SEQ ID NO: 1, que tiene al menos una
sustitución nucleótida que conduce a una de las mutaciones
funcionales de aminoácido descritas anteriormente. La invención se
relaciona además con análogos funcionales de los ácidos nucleicos
obtenidos por medio d adición, sustitución, inserción y/o supresión
de nucleótidos individuales o múltiples, que además codifican para
una monooxidasa que tiene la especificidad deseada por el sustrato,
por ejemplo que tiene la actividad oxidante del
indol.
indol.
La invención también abarca aquellas secuencias
de ácido nucleico que incluyen a las así llamadas mutaciones
silenciosas o que están modificadas en comparación con una secuencia
específicamente mencionada de acuerdo con el uso del codón de un
origen específico u organismo huésped, y variantes de ocurrencia
natural de tales secuencias de ácido nucleico. La invención también
abarca modificaciones de las secuencias de ácido nucleico obtenidas
por degeneración del código genético (esto es, sin ningún cambio en
la correspondiente secuencia de aminoácidos) o sustitución
conservadora de nucleótidos (esto es, el correspondiente aminoácido
es reemplazado por otro aminoácido de la misma carga, tamaño,
polaridad y/o solubilidad), y secuencias modificadas por adición,
inserción, inversión o supresión de nucleótidos, cuyas secuencias
codifican un monooxigenasa de acuerdo con la invención que tiene un
"perfil modificado de sustrato", y las correspondientes
secuencias complementarias.
La invención se relaciona además con
construcciones de expresión que comprenden una secuencia de ácido
nucleico que codifica a un mutante de acuerdo con la invención bajo
el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico; y
vectores que comprenden al menos una de estas construcciones de
expresión.
Preferiblemente, las construcciones de acuerdo
con la invención abarcan un promotor 5' secuencia arriba de la
secuencia de codificación en cuestión y una secuencia terminadora
secuencia abajo 3', y, opcionalmente, elementos reguladores
habituales adicionales, y, en cada caso operativamente enlazados con
la secuencia de codificación. Se entiende que el enlazamiento
operativo significa el arreglo secuencial del promotor, la secuencia
de codificación, la terminadora y, si es apropiado, otros elementos
reguladores de tal forma que cada uno de los elementos reguladores
pueden cumplir con su pretendida función sobre la expresión de la
secuencia de codificación. Los ejemplos de secuencias
operativamente enlazables son las secuencias de acceso, o si no
reforzadores de traducción, reforzadores, señales de
poliadenilación y similares. Otros elementos reguladores abarcan
marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de
replicación y similares.
Además de las secuencias reguladoras
artificiales, la secuencia reguladora natural puede estar presente
aún secuencia arriba del gen estructural real. Si se desea, esta
regulación natural puede ser desactivada por medio de modificación
genética, y se puede reforzar o disminuir la expresión de los genes.
Sin embargo, la construcción del gen puede ser también más simple
en su construcción, esto es, no se insertan señales reguladoras
adicionales secuencia arriba del gen estructural y no se remueve el
promotor natural con su regulación. En vez de eso, se muta la
secuencia reguladora natural de tal forma que no tenga lugar
nuevamente la regulación y se incremente la expresión del gen o se
reduzca. Una o más copias de las secuencias de ácido nucleico pueden
esta presentes en la construcción del gen.
Los ejemplos de promotores adecuados son: los
promotores cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac,
lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6,
1-PR o 1-PL, que son
convenientemente empleados en bacterias
Gram-negativas; y promotores
Gram-positivos amy y SPO2, los promotores de
levadura ADC1, MFa, Ac, P-60, CYC1, GAPDH, o los
promotores de la planta CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33,
nos o el promotor de ubiquitina o de faseolina. Se da particular
preferencia al uso de promotores inducibles, por ejemplo promotores
inducibles por luz y en particular por temperatura, tales como el
promotor P_{r}P_{1}.
En principio, todos los promotores naturales con
sus secuencias reguladoras pueden ser utilizados. Además, también se
pueden utilizar promotores sintéticos en una forma conveniente.
Las secuencias reguladoras anteriormente
mencionadas tienen como fin permitir la expresión dirigida de las
secuencias de ácido nucleico y de la expresión de proteínas.
Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por
ejemplo, que el gen se expresa o se sobreexpresa únicamente después
de que ha tenido lugar la inducción, o que se expresa y/o
sobreexpresa inmediatamente.
Las secuencias reguladoras o factores pueden
tener preferiblemente un efecto positivo sobre la expresión y de
esta forma incrementan o reducen a ésta última. Por lo tanto, un
refuerzo de los elementos reguladores puede tener lugar
convenientemente a nivel transcripcional por medio del uso de
señales fuertes de transcripción tales como promotores y/o
"reforzadores". Además, se puede reforzar también la traducción
mejorando, por ejemplo, la estabilidad del ARNm.
Se genera un casete de expresión por fusión de
un promotor adecuado con una secuencia adecuada de nucleótidos para
la monooxigenasa y una señal terminadora o señal de poliadenilación.
Con este propósito se utilizan técnicas de recombinación habituales
y de clonación tal y como se describen, por ejemplo, en T. Maniatis,
E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
(1989) y en T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquist, Experments
with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. y colaboradores, Current
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assoc. y Wiley
Interscience (1987).
Para expresión en un organismo huésped adecuado,
la construcción de ácido nucleico recombinante o construcción
génica es convenientemente insertada dentro de un vector huésped
específico que permite expresión génica óptima en el huésped. Los
vectores son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte y se
pueden encontrar, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwells
P. H. y colaboradores, Ed., Elsevier, Amsterdam-New
York-Oxford, 1985). Se entiende que los vectores no
significan únicamente plásmidos, pero todos los otros vectores
conocidos como tales por las personas capacitadas, por ejemplo,
fagos, virus, tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus,
transposones, elementos IS, plásmidos, cósmicos, y ADN lineal o
circular. Estos vectores pueden ser replicados autónomamente en el
organismo huésped o cromosómicamente.
Los vectores de acuerdo con la invención
permiten la generación de microorganismos recombinantes que son
transformados, por ejemplo, con al menos un vector de acuerdo con
la invención y que puede ser empleado para producir los mutantes.
Las construcciones recombinantes anteriormente descritas de acuerdo
con la invención son introducidas convenientemente dentro de un
sistema huésped adecuado y expresadas. Se prefiere utilizar métodos
usuales de clonación y de transfección conocidas por las personas
capacitadas con el propósito de llevara a cabo la expresión de los
ácidos nucleicos anteriormente mencionados en el sistema de
expresión en cuestión. Los sistemas adecuados están descritos, por
ejemplo, en protocolos actuales en biología molecular, F. Ausubel y
colaboradores, Ed., Wiley Interscience, New York, 1997.
Los organismos huéspedes adecuados son, en
principio, todos los organismos que permiten la expresión de los
ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, sus variantes
alélicas, y sus equivalentes funcionales o derivados. Los
organismos huéspedes se entiende que incluyen, por ejemplo,
bacterias, hongos, levaduras o plantas o células animales. Los
organismos preferidos son bacterias tales como aquellas del género
Escherichia, tales como, por ejemplo, Escherichia coli,
Streptomyces, Bacillus o Pseudomonas, microorganismos eucariotas
tales como Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, y células
eucariotas superiores de animales o plantas, por ejemplo, células
Sf9 o CHO.
Si se desea, la expresión del producto génico
puede ser también efectuada en organismos transgénicos tales como
animales transgénicos tales como, en particular, ratones, ovejas, o
plantas transgénicas. Los organismos transgénicos pueden ser
también animales genéticamente desactivados o plantas en las cuales
el gen endógeno correspondiente ha sido eliminado, tal como, por
ejemplo, por mutación o supresión parcial o completa.
Los organismos exitosamente transformados pueden
ser seleccionados por medio de genes marcadores que están así mismo
contenidos en el vector o en el casete de expresión. Los ejemplos de
tales genes marcadores son genes para resistencia a los
antibióticos y para enzimas que catalizan una reacción de color, que
causa la coloración de la célula transformada. Estas células
transformadas pueden ser entonces seleccionadas utilizando
selección celular automática. Los microorganismos que han sido
transformados exitosamente con un vector y que portan un gen
apropiado para resistencia a los antibióticos (por ejemplo G418 o
higromicina) pueden ser seleccionados por medio del uso apropiado
de medios o sustratos que contienen antibióticos. Las proteínas
marcadoras que están presentes sobre la superficie de la célula
pueden ser utilizadas por selección por medio de cromatografía de
afinidad.
La combinación de los organismos huéspedes y los
vectores apropiados para los organismos, tales como plásmidos,
virus o fagos, tales como, por ejemplo, plásmidos con el sistema
promotor/ARN polimerasa, fagos \lambda, \mu u otros fagos
templados o transposones y/o otras secuencias reguladoras ventajosas
forman un sistema de expresión. El término "sistema de
expresión" significa, por ejemplo, una combinación de células de
mamífero tales como células CHO, y vectores, tales como el vector
pcDNA3neo, que son adecuados para células de mamífero.
Como se describió más arriba, el producto génico
puede ser expresado también convenientemente en animales
transgénicos, por ejemplo, ratones, ovejas, o plantas transgénicas.
Es posible también programar sistemas de traducción libres de
células con el ARN derivado del ácido nucleico.
La invención provee además un proceso para
preparar una monooxigenasa de acuerdo con la invención, que
comprende el cultivo de un microorganismo productor de
monooxigenasa, si es apropiado induciendo la expresión de la
monooxigenasa, y aislando la monooxigenasa del cultivo. Si se desea,
la monooxigenasa de acuerdo con la invención puede por lo tanto ser
también producida a escala industrial.
Los microorganismos pueden ser cultivados y
fermentados por medio de métodos conocidos. Las bacterias, por
ejemplo, pueden ser cultivadas en un medio TB o LB y a
20-40ºC y un pH de 6-9. Las
condiciones de cultivo adecuadas están descritas en detalle en T.
Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1989), por ejemplo.
Si la monooxigenasa no es secretada dentro del
medio de cultivo, las células son entonces lisadas y se obtiene la
monooxigenasa a partir del lisado utilizando métodos conocidos para
el aislamiento de proteínas. Las células pueden ser lisadas
alternativamente por medio de ultrasonido de alta frecuencia, por
medio de alta presión, por ejemplo en una celda francesa de
presión, por osmólisis, por medio de la acción de detergentes, de
enzimas líticas o de solventes orgánicos, por medio de
homogenización o por medio de una combinación de un pluralidad de
los procesos mencionados. La purificación de la monooxigenasa puede
ser lograda por medio de procesos cromatográficos conocidos, tales
como cromatografía por tamiz molecular (filtración por gel), tal
como cromatografía a través de Sefarosa Q, cromatografía de
intercambio iónico y cromatografía hidrófoba, y por medio de otros
procesos habituales, tales como ultrafiltración, cristalización,
precipitación por salado, diálisis y electroforesis nativa en gel.
Los procesos adecuados son descritos, por ejemplo, en Cooper, F. G.,
Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Procedures], Verlag
Walter de Gruyter, Berlín, New York o en Scopes, R., Protein
Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlín.
Para aislar la proteína recombinante, es
particularmente conveniente utilizar sistemas de vectores u
oligonucleótidos que extienden el ADNc por ciertas secuencias de
nucleótidos y así codificar para polipéptidos modificados o
proteínas de fusión que sirven para simplificar la purificación. Las
modificaciones adecuadas de este tipo son, por ejemplo, las así
llamadas "etiquetas" que actúan como anclas, tal como, por
ejemplo, la modificación conocida como ancla de
hexa-histidina, o epítopos que pueden ser
reconocidos como antígenos por anticuerpos (descrito, por ejemplo,
en Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Estas anclas pueden ser
utilizadas para unir las proteínas a un soporte sólido tal como, por
ejemplo, a una matriz polimérica, que puede, por ejemplo, estar
empacada en una columna cromatográfica, o a una placa de
microtitulación o a otro soporte.
Estas anclas pueden ser utilizadas también al
mismo tiempo para reconocer las proteínas. También es posible
utilizarlas para el reconocimiento de los marcadores convencionales
de proteínas tales como tintes fluorescentes, marcadores
enzimáticos que forman un producto de reacción detectable después de
la reacción con un sustrato, o marcadores radioactivos, solos o en
combinación con las anclas para la formación de derivados de las
proteínas.
La invención se relaciona además con un proceso
para la oxidación microbiológica de compuestos orgánicos, por
ejemplo compuestos aromáticos mono, di o polinucleares
N-heterocíclicos de acuerdo con la definición
anterior, que comprende
- a1)
- cultivar un microorganismo recombinante de acuerdo con la definición anterior en un medio de cultivo, en presencia de un sustrato exógeno (añadido) o un sustrato intermedio formado, cuyo sustrato puede ser oxidado por la monooxigenasa de acuerdo con la invención, preferiblemente en presencia de oxígeno (esto es, aeróbicamente); o
- a2)
- incubar un medio de reacción que contiene al sustrato con una enzima de acuerdo con la invención, preferiblemente en presencia de oxígeno y un donante de electrones; y
- b)
- aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio.
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El oxígeno requerido para la reacción pasa o
bien desde la atmósfera al medio de reacción o, si se requiere,
puede ser añadido en una forma ya conocida.
El sustrato oxidable se selecciona
preferiblemente de
- a)
- oxidación de compuestos aromáticos mono, di o polinucleares, N, O o S-heterocíclicos sustituidos o no sustituidos;
- b)
- oxidación de aromáticos mono o polinucleares sustituidos o no sustituidos;
- c)
- oxidación de alcanos y alquenos de cadena recta y ramificada; y
- d)
- oxidación de cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos o no sustituidos
\vskip1.000000\baselineskip
Una variante preferida del proceso está dirigida
a la formación de índigo/indirubina y se caracteriza por el hecho
de que el sustrato es indol formado como un intermedio en el cultivo
y que el índigo y/o la indirubina formados en el medio de cultivo
se aíslan por medio de oxidación de los intermediarios de
hidroxiindol.
Si la oxidación de acuerdo con la invención se
lleva cabo utilizando un microorganismo recombinante, el cultivo de
los microorganismos se lleva a cabo primero preferiblemente en
presencia de oxígeno y en un medio complejo, tal como, por ejemplo,
medio TB o LB a una temperatura de cultivo de aproximadamente 20 a
40ºC y un pH de aproximadamente 6 a 9, hasta alcanzar una densidad
celular adecuada. La adición de indol exógeno usualmente no es
necesaria ya que el microorganismo lo forma en una etapa intermedia.
Sin embargo, cuando se utilizan otros sustratos, se puede requerir
la adición de sustrato exógeno. Con el propósito de poder controlar
mejor la reacción de oxidación, se prefiere el uso de un promotor
inducible, en particular un promotor inducible por temperatura. La
temperatura se incrementa en este caso hasta la temperatura de
inducción necesaria, por ejemplo 42ºC en el caso del promotor
P_{r}P_{1}, esta se mantiene durante un período suficiente de
tiempo, por ejemplo 1 a 10 ó 5 a 6 horas, para la expresión de la
actividad de la monooxigenasa y la temperatura es luego reducida
nuevamente hasta un valor aproximadamente de 30 a 40ºC. Se continúa
luego con el cultivo en presencia de oxígeno durante 12 horas hasta
3 días. En el caso particular e la oxidación del indol, se puede
incrementar el pH por medio de la adición de NaOH, por ejemplo hasta
9 ó 10, gracias al cual se promueve la formación adicional de
índigo o de indirubina por medio de oxidación a la atmósfera de los
productos de oxidación formados enzimáticamente 2 y
3-hidroxiindol.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
La formación de índigo/indirubina de acuerdo con
la invención se ilustra por medio del siguiente esquema de
reacción:
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\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, si se lleva a cabo la oxidación de
acuerdo con la invención utilizando mutantes de la enzima
purificados o enriquecidos, se disuelve la enzima de acuerdo con la
invención en un medio que contiene sustrato exógeno, por ejemplo un
medio que contiene indol (aproximadamente 0,01 a 10 mM, o 0,05 a 5
mM), y se lleva a cabo la reacción, preferiblemente en presencia de
oxígeno, a una temperatura de aproximadamente 10 a 50ºC, tal como,
por ejemplo, 30 a 40ºC, y un pH de aproximadamente 6 a 9 (tal como
se estableció, por ejemplo, utilizando fosfato 100 a 200 mM o
amortiguador tris), y en presencia de un reductor, el medio que
contiene al sustrato conteniendo además, con relación al sustrato
que va a ser oxidado, un exceso molar aproximadamente de 1 a 100
veces o de 10 a 100 veces de equivalentes de reducción. El reductor
preferido es NADPH. Si se requiere, se puede añadir el agente
reductor en porciones.
En forma similar, los sustratos oxidables que se
utilizan preferiblemente son: n-hexano,
n-octano, n-decano,
n-dodecano, cumeno, 1-metilindol,
5-Cl-, o Br-indol, indeno,
benzotiofeno, \alpha, \beta y \gamma-ionona,
acridina, naftaleno, 6-metil- u
8-metilquinolina, quinolina y quinaldina.
\newpage
La reacción de oxidación enzimática de acuerdo
con la invención se puede llevar acabo, por ejemplo, bajo las
siguientes condiciones:
- Concentración del sustrato:
- desde 0,01 hasta 20 mM
- Concentración de la enzima:
- desde 0,1 hasta 10 mg/ml
- Temperatura de reacción:
- desde 10 hasta 50ºC
- pH:
- desde 6 hasta 8
- Amortiguador:
- desde 0,05 hasta 0,2 M de fosfato de potasio, o Tris/HCl
- Donante de electrones:
- es preferiblemente añadido en porciones (concentración inicial aproximadamente desde 0,1 hasta 2 mg/ml)
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla puede ser preincubada brevemente (de 1
a 5 minutos) (aproximadamente entre 20 y 40ºC) antes de que se
inicie la reacción, por ejemplo por medio de la adición de los
donantes de electrones (por ejemplo, NADPH). La reacción se lleva a
cabo en forma aeróbica, si se requiere con la introducción adicional
de oxígeno.
En el proceso de oxidación del sustrato de
acuerdo con la invención, el oxígeno que está presente en, o que es
añadido al medio de reacción es escindido en forma reductora por la
enzima. Los equivalentes de reducción requeridos son suministrados
por el agente de reducción añadido (donante de electrones).
El producto de oxidación formado puede ser
separado entonces del medio y purificado en una forma convencional,
tal como, por ejemplo, por medio de extracción o por
cromatografía.
Los objetivos adicionales de la invención se
relacionan con biorreactores, que incluyen una enzima de acuerdo con
la invención o un microorganismo recombinante de acuerdo con la
invención en forma inmovilizada.
Un último objetivo de la invención se relaciona
con el uso de una citocromo P450 monooxigenasa de acuerdo con la
invención o de un vector o microorganismo de acuerdo con la
invención para la oxidación microbiológica de un sustrato de uno de
los grupos a) hasta d), en particular de compuestos aromáticos mono,
di o polinucleares N-heterocíclicos, y
preferiblemente para la formación de índigo y/o indirubina.
La presente invención se describe ahora en más
detalle con referencia a los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se llevaron a cabo
esencialmente como se describe en (19). Se asignaron en forma
aleatoria tres posiciones (Phe87, Leu188 y Ala74) con la ayuda de
mutagénesis específica para el sitio utilizando el kit QuikChange
de Stratagene (La Jolla, CA, EUA). Se utilizaron los siguientes
iniciadores para PCR para las posiciones individuales:
- Phe87:
- 5'-gcaggagacgggttgnnnacaagctggacg-3' (SEQ ID NO: 3),
- \quad
- 5'-cgtccagcttgtnnncaacccgtctcctgc-3' (SEQ ID NO: 4);
- Leu188:
- 5'-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3' (SEQ ID NO: 5),
- \quad
- 5'-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3' (SEQ ID NO: 6);
- Ala74:
- 5'-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3' (SEQ ID NO: 7),
- \quad
- 5'-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3' (SEQ ID NO: 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones para la PCR fueron idénticas
para todas las tres posiciones. En particular, 17,5 pmol de uno de
cada uno de los iniciadores, 20 pmol del ADN del plásmido molde, 3 U
de la Pfu polimerasa y 3,25 nmol de cada dNTP fueron utilizados por
50 \mul del volumen de reacción. La reacción PCR se inició a
94ºC/1 min y se realizó el siguiente ciclo de temperatura 20 veces:
94ºC, 1 min; 46ºC, 2,5 min; 72ºC, 17 min. Después de 20 ciclos, se
continuó la reacción a 72ºC durante 15 min. Después de la PCR, se
digirió el ADN de molde a 37ºC durante 3 h utilizando 20 U de DpnI.
Se transformaron luego las DH5\alpha de E. coli. Las
células transformadas de DH5\alpha fueron sembradas en placa
sobre placas de agar LB que contenían 150 \mug/ml de ampicilina.
Se llevó a cabo luego la incubación a 37ºC durante 18 h.
El gen para la P450 BM-3 y los
mutantes del mismo se expresaron bajo el control del promotor fuerte
P_{R}P_{L} inducible por temperatura del plásmido pCYTEXP1 en
células DH5\alpha de E. coli como ya se describió (20). Se
recogieron las colonias utilizando palillos de dientes estériles y
se las transfirió a placas de microtitulación de 96 pozos, que
contenían 200 \mul de medio TB y 100 \mug/ml de ampicilina por
pozo. Se llevó a cabo luego la incubación a 37ºC durante la noche.
Se transfirieron luego 40 \mul del cultivo celular de cada uno de
los pozos a un tubo de cultivo que contenía 2 ml de medio TB con 100
\mug/ml de ampicilina. Se llevó a cabo luego el cultivo a 37ºC
durante 2 h. Se incrementó luego la temperatura hasta 42ºC durante
6 h para la inducción. Se continuó luego con el cultivo a 37ºC
durante la noche, produciéndose un pigmento azul.
La producción preparativa de la enzima o del
pigmento azul se llevó a cabo comenzando a partir de un cultivo
celular de 300 ml (OD_{578} = 0,8 a 1,0). Para el aislamiento de
la enzima, se centrifugaron las células a 4.000 rpm durante 10 min
y se resuspendió en amortiguador de K_{x}PO_{4} 0,1 M, pH 7,4.
Se rompieron cuidadosamente las células enfriadas con hielo con la
ayuda de un sonicador W25 de Branson (Dietzenbach, Alemania) con
una salida de energía de 80 W, tres veces por períodos de 2 min cada
vez. Se centrifugaron las suspensiones a 32.570 x g durante 20 min.
Se empleó el extracto crudo para la determinación de la actividad o
para la purificación de la enzima. La purificación de la enzima fue
llevada a cabo como ya se describió en (21), a la cual se hace
referencia expresamente aquí. Se determinó la concentración de la
enzima purificada por medio de la diferencia en extinción a 450 y
490 nm, como ya se describió en (11), utilizando un coeficiente de
extinción \varepsilon de 91 mM^{-1} cm^{-1}.
Se aislaron 100 colonias en cada caso de los
mutantes de cada una de las posiciones, las cuales fueron producidas
por mutagénesis aleatoria del codón de la posición correspondiente.
Estas colonias fueron cultivadas en tubos de cultivo para la
producción de pigmento azul.
Después de lavar las células con agua y una
cantidad de etapas lentas de centrifugación (500 rpm), se extrajo
el pigmento azul utilizando dimetil sulfóxido (DMSO). La solubilidad
del pigmento azul fue mayor en DMSO. Se determinó la absorción del
extracto a 677 nm. Se utilizó ese mutante que produjo la mayor
cantidad de pigmento azul, especialmente los mutantes de una
posición específica , para la secuenciación del ADN (kit de
secuenciación de ADN de ABI; secuenciador de ADN ABI Prism^{TM}
377) y además como molde para la mutagénesis aleatoria específica
para el sitio.
Se analizó la actividad de hidroxilación del
indol en una solución que contenía 8 \mul de una solución de
indol 10-500 mM en DMSO, 850 \mul de amortiguador
tris/HCl (0,1 M, pH 8,2) y 0,6 nmol de P450 BM-3 de
tipo silvestre o de mutante en un volumen final de 1 ml. Se
preincubó la mezcla durante 9 min antes de que se iniciara la
reacción por medio de la adición de 50 \mul de una solución acuosa
1 mM de NADPH. Se detuvo la reacción después de 20 segundos por
medio de la adición de 60 \mul de KOH 1,2 M. En el lapso de 5 a 30
segundos (bajo condiciones aeróbicas), se convirtieron
completamente los productos de la enzima en índigo
([\Delta^{2,2'}-biindolin]-3,3'-diona)
e indirubina
([\Delta^{2,3'}-biindolin]-2',3-diona).
Se determinó la producción de índigo por medio de su absorción a
670 nm. Una curva de calibración utilizando índigo puro mostró un
coeficiente de extinción de 3,9 mM^{-1} cm^{-1} a esta longitud
de onda. Se obtuvo una curva lineal para la producción de índigo en
un tiempo de reacción de 40 segundos utilizando 0,6 nmol del tipo
silvestre o del mutante P450 BM-3 y de 0,5 hasta
5,0 mM de indol. La indirubina muestra una absorción muy débil a 670
nm y la cantidad de indirubina formada fue mucho más pequeña que la
cantidad de índigo formado. La formación de indirubina fue
despreciable en la determinación de los parámetros cinéticos. Se
determinó el consumo de NADPH a 340 nm y se hizo el cálculo como se
describe (17) utilizando un coeficiente de extinción de 6,2
mM^{-1} cm^{-1}.
Después de lavar las células con agua y de
centrifugación repetida a 500 g, se extrajo el precipitado azul
formado utilizando tetrahidrofurano (THF). Se evaporó el sustrato
casi hasta sequedad y se extrajo el pigmento rojo varias veces con
50 ml de etanol absoluto. Se disolvió el sólido azul residual en THF
y se lo analizó por medio de cromatografía en capa delgada (TLC).
Se evaporó la solución de etanol y se purificó por medio de
cromatografía en gel de sílice (TLC 60, Merck, Darmstat, Alemania; 2
cm x 30 cm) antes de que fuera lavada con THF y éter de petróleo en
una proporción de 1:2. Se evaporó la solución roja obtenida y se
determinó su pureza por medio de TLC. Se determinaron los espectros
de absorción del pigmento rojo y del pigmento azul en un rango de
400 a 800 nm con la ayuda de un espectrofotómetro Ultraspec 3000
(Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se analizaron adicionalmente el color
rojo y el color azul por medio de espectrometría de masas y
espectroscopía RMN ^{1}H.
La P450 BM-3 nativa no tiene la
habilidad para producir el pigmento que contiene índigo azul, o las
sustancias precursoras 2 ó 3-hidroxiindol. Con el
propósito de poder preparar una cantidad suficiente de pigmento
azul, se sometió a P450 BM-3 a evolución en una
forma controlada. Todos los mutantes que produjeron al pigmento
azul fueron secuenciados. Se encontró que al menos una de las tres
posiciones siguientes fue mutada: Phe87, Leu188 y Ala74. Por lo
tanto se asumió que estas tres posiciones juegan un papel crucial
para la actividad de P450 BM-3 en la producción de
pigmento azul. A partir de la estructura del dominio hemo del
citocromo P450 BM-3, acomplejado con ácido
palmitoleico, se observó que Phe87 evita que el sustrato se acerque
al grupo hemo (14). El mutante Phe87Val muestra una alta
regioselectividad y estereoselectividad en la epoxidación del ácido
(14S, 15R)-araquidónico (13) y el mutante Phe87Ala
cambia la posición de la hidroxilación de
\omega-1, \omega-2 y
\omega-3 hasta \omega (22). Se seleccionó por lo
tanto la posición 87como la primera para la mutagénesis aleatoria
específica para el sitio con la ayuda de la PCR. En los cultivos en
tubo, se obtuvieron 7 colonias que produjeron una pequeña cantidad
de pigmento azul después de la inducción. Se seleccionó la colonia
que produjo la mayor cantidad del pigmento azul para la
secuenciación del ADN. Los datos de la secuencia mostraron la
sustitución de Phe87 por Val. Se utilizó entonces al mutante
Phe87Val como molde para la segunda vuelta de la mutagénesis
aleatoria específica para el sitio sobre la posición Leu188. La
estructura del dominio hemo, acomplejado con ácido palmitoleico,
muestra que el reposicionamiento de las hélices F y G pone al
residuo Leu188 en contacto directo con el sustrato (14). Esta
posición puede jugar por lo tanto un importante papel en el
enlazamiento o la orientación del sustrato. Después de la segunda
pasada de selección, se observaron 31 colonias que produjeron al
pigmento azul. El mutante que produjo la cantidad más grande de
pigmento contenía las sustituciones Phe87Val y Leu188Gln. Se mutó
luego a este mutante en posición Ala74 en la tercera pasada de
mutagénesis aleatoria específica para el sitio. En este caso se
obtuvo al mutante triple F87L188A74 (Phe87Val, Leu188Gln y
Ala74Gly), que produjo varios mg de pigmento azul en un recipiente
de 2 litros, que contenía 300 ml de medio TB. Esta cantidad fue
suficiente para el aislamiento y la caracterización del pigmento
azul.
Después de lavarlas células, se extrajo el
precipitado azul residual con THF y se lo analizó por medio de TLC.
Se separó el pigmento azul en un componente azul de rápida migración
y en un componente rojo de migración más lenta. Ambos componentes
mostraron exactamente los mismos parámetros de movilidad que los
componentes de una muestra comercial de índigo.
Después de la purificación, se determinó el
espectro de absorción de ambos componentes en DMSO. El componente
azul mostró el mismo espectro que una muestra de índigo comercial.
Los componentes azul y rojo purificados fueron analizados cada uno
por medio de espectrometría de masas. El espectro de masas de ambos
pigmentos mostró un pico fuerte de un ión molecular con una m/e =
262 y dos picos de fragmentos una m/e = 234 y 205 (intensidad
relativa en cada caso 10%). Este patrón es típico de compuestos
indigoides. La composición elemental de estos iones fue determinada
por medio de espectrometría de masas de alta resolución como
C_{16}H_{10}N_{2}O_{2}, C_{15}H_{10}N_{2}O y
C_{14}H_{9}N_{2}. Esto es también característico de
estructuras del tipo índigo. El pigmento azul fue entonces
identificado como índigo y el pigmento rojo como indirubina. Para la
confirmación de la estructura, se llevaron a cabo espectros de RMN
^{1}H de 500 MHz de ambos pigmentos en solución de
DMSO-D_{6}. Los resultados están de acuerdo con
los datos de la literatura (23).
Se sabe que el índigo se puede obtener a partir
del indol por medio de transformación microbiana
(24-26). Sin embargo, ninguno de estos sistemas
microbianos contenía una P450 monooxigenasa. De acuerdo con la
invención, se determinó primero la actividad catalítica de la
enzima pura para el indol. Se mezcló al mutante F87L188A74 con
indol. No se podía observar reacción de color. Únicamente después de
la adición de NADPH a la mezcla de reacción se formó el pigmento
azul aproximadamente después de 20 minutos. Por medio del ajuste del
pH de la mezcla de reacción hasta un valor de aproximadamente 11,
30 segundos después de la adición de NADPH, se hizo visible la
coloración azul en el lapso de unos pocos segundos. Los experimentos
de control utilizando P450 BM-3 nativa fueron
siempre negativos, incluso utilizando concentraciones crecientes de
enzima, indol y NADPH. Se extrajo el pigmento azul utilizando
acetato de etilo y se analizó por medio de TLC. El pigmento azul se
separó nuevamente en un componente azul que corre más rápidamente y
en un componente rojo que corre más lentamente. Los valores de Rf y
el espectro de absorción fueron idénticos a aquellos valores de los
extractos del caldo de fermentación. El mutante F87L188A74 de P450
BM-3 es por lo tanto una indol hidrolasa.
Se han descrito previamente dos rutas para la
transformación enzimática del indol en índigo. Una ruta es
catalizada por una dioxigenasa, la otra por una estireno
monooxigenasa (24, 25). La estequiometría de NADPH es en ambos
casos 2. Se asumió por lo tanto que en contraste con las
dioxigenasas, el mutante F87L188A74 de acuerdo con la invención
hidroxila al indol únicamente en una posición para formar oxiindol
(2-hidroxiindol) o indoxilo
(3-hidroxiindol).
Se utilizaron muestras puras de la enzima tipo
silvestre P450 BM-3 y de los mutantes Leu188Gln,
Phe87Val, F87L188 y F87L188A74 para la determinación de los
parámetros cinéticos de la hidroxilación del indol. Los resultados
se resumen en la Tabla 1 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aún con un exceso de enzima purificada y una
alta concentración de indol, la enzima de tipo silvestre no es
capaz de oxidar al indol. La Leu188Gln mutante muestra una baja
actividad. La Phe87Val mutante muestra una actividad catalítica de
119 M^{-1} s^{-1} para la hidroxilación del indol. La eficiencia
catalítica de la F87L188 doble mutante (Phe87Val, Leu188Gln) se
incremento hasta 543 M^{-1} s^{-1} y se incremento hasta 1365
M^{-1} s^{-1} por medio de la introducción de la sustitución
adicional Ala74Gly. Los valores de K_{cat} se incrementaron desde
la Phe87Val hasta el mutante triple en un total del 35%, mientras
que los valore de K_{m} disminuyeron aproximadamente en siete
veces. Esto indica que Ala74Gly y Leu188Gln están involucradas
principalmente en el enlazamiento del sustrato.
Para la F87L188A74 triple mutante, las
velocidades de cambio del indol (K_{cat} = 2,73 s^{-1}) fueron
más de diez veces superiores que para la mayoría de las enzimas P450
(18).
Se llevaron a cabo las reacciones utilizando una
P450 BM-3 monooxigenasa mutante que comprende las
siguientes mutaciones: Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly.
El sustrato escogido fue
n-octano. Para la hidroxilación del
n-octano, se utilizó la siguiente mezcla de reacción
aeróbica:
- P450 BM-3 mutante:
- 17,5 mg (liofilizada)
- Amortiguador de reacción:
- 9,1 ml (amortiguador de fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5)
- Sustrato:
- 50 \mul de una solución 60 mM (en acetona)
- Temperatura:
- 25ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió la enzima liofilizada en 500 \mul
de amortiguador de reacción y se incubó inicialmente a temperatura
ambiente con sustrato y amortiguador de reacción durante 5 minutos.
Se añadieron entonces 300 \mul de solución de NADPH (5 mg/ml). Se
repitió la adición de NADPH dos veces más. Se monitoreó el progreso
de la reacción midiendo la absorción a 340 nm, lo que permite
observar la disminución de NADPH. Se añade NADPH en alícuotas de
300 \mul, ya que una concentración muy alta de NADPH en la
solución de la reacción resultaría en la inactivación de la enzima.
Para aislar los productos, se extrajo entonces la solución de la
reacción tres veces con 5 ml de éter dietílico. Se secaron las
fases orgánicas combinadas sobre MgSO_{4} y se concentró. Se
caracterizaron entonces los productos por medio de TLC, GC/MS y
RMN.
\newpage
El análisis por GC/MS de la mezcla de reacción
produjo los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- Se repitió el Ejemplo 6, pero utilizando, en vez de n-octano, al sustrato naftaleno. Los productos que fueron identificados fueron 1-naftol y cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidronaftaleno. 88% del material de partida naftaleno había sido convertido.
- Métodos analíticos para reacciones con naftaleno.
- GC:
- Aparato: Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160 sobre Inyector de Columna; Columna: DB5 30 m x 0,2 mm; Material: 5% de difenilo, 95% de dimetilpolisiloxano; Gas transportador: 0,5 bar de H_{2}; Programa de temperatura: 40ºC, 1 min isotérmico/10ºC/min hasta 300ºC. Rt (1-naftol) = 16,68.
- RMN:
- Se identificaron 1-naftol y cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-naftaleno en la RMN ^{1}H.
- b)
- Se repitió el Ejemplo 6 pero utilizando, en vez de n-octano, al sustrato 8-metilquinolina. Se identificó a la 5-hidroxi-8-metilquinolina como el producto principal, además de otros derivados (proporción de producto 5:1). 35% del material de partida utilizado había sido convertido.
- c)
- Se repitió el Ejemplo 6 pero utilizando, en vez de n-octano, al sustrato \alpha-ionona. Se identificó a la 3-hidroxi-\alpha-ionona como el producto principal, además de otros derivados (proporción de producto 76:24). 60% del material de partida utilizado había sido convertido.
- d)
- Se repitió el Ejemplo 6 pero utilizando, en vez de n-octano, al sustrato cumeno (isopropilbenceno). Se identificaron cinco productos monohidroxi y un producto dihidroxi. 70% del material de partida utilizado había sido convertido.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
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\vskip0.400000\baselineskip
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y su uso para la oxidación de sustratos orgánicos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M/40241
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus megaterium
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(3150)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1048
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus megaterium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador PRC
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<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador PRC
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador PRC
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<400> 5
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador PRC
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sintética: iniciador PRC
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador PRC
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<400> 8
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<212> PRT
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<213> Bacillus megaterium
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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Claims (16)
1. Un proceso para la oxidación microbiológica
de un compuesto aromático mono o polinuclear N- O- o
S-heterocíclico, que comprende:
- a1)
- cultivar un microorganismo recombinante que produce al citocromo P450, transformado por medio de un vector que comprende al menos una construcción de expresión que porta, bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico, una secuencia de codificación para monooxigenasa, en un medio de cultivo, en presencia de un sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia; o
- a2)
- incubar un medio de reacción que contiene al sustrato con una citocromo P450 monooxigenasa de origen bacteriano; y
- b)
- aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio.
donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo
P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus
megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con
la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87
de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en
las posiciones 87, 188 y 74, donde
Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu;
Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y
Ala74 es reemplazado por Val o Gly.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en donde el sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia se
selecciona de compuestos aromáticos mono o polinucleares N- O- o
S-heterocíclicos opcionalmente
sustitui-
dos.
dos.
3. Un proceso para la oxidación microbiológica
de un compuesto seleccionado de aromáticos mono o polinucleares
opcionalmente sustituidos; alcanos o alquenos de cadena recta o
ramificados; y cicloalcanos y cicloalquenos opcionalmente
sustituidos;
que comprende:
- a1)
- cultivar un microorganismo que produce al citocromo P450 recombinante, transformado por medio de un vector que comprende al menos una construcción de expresión que porta, bajo el control genético de secuencias reguladoras de ácido nucleico, una secuencia de codificación para monooxigenasa, en un medio de cultivo, en presencia de un sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia; o
- a2)
- incubar un medio de reacción que contiene al sustrato con una citocromo P450 monooxigenasa; y
- b)
- aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio.
donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo
P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus
megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con
la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87
de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en
las posiciones 87, 188 y 74, donde
Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu;
Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y
Ala74 es reemplazado por Val o Gly.
4. El proceso de acuerdo con la reivindicación
3, en donde el sustrato exógeno o formado en una etapa intermedia se
selecciona de:
- aromáticos mono o polinucleares opcionalmente sustituidos;
- alcanos y alquenos de cadena recta o ramificados; y
- cicloalcanos y cicloalquenos opcionalmente sustituidos.
5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde, como sustrato exógeno, al
menos un compuesto seleccionado de los grupos de compuestos
definidos anteriormente es añadido a un medio y se lleva a cabo la
oxidación por medio de una reacción enzimática del medio que
contiene al sustrato en presencia de oxígeno a una temperatura
aproximadamente de 20 a 40ºC y un pH de aproximadamente 6 a 9, donde
el medio que contiene al sustrato comprende adicionalmente un exceso
molar de aproximadamente 10 a 100 veces de equivalentes de reducción
con base en el sustrato.
6. El proceso de acuerdo a la reivindicación 5,
en donde, como sustrato exógeno, se emplea un compuesto seleccionado
de indol, n-hexano, n-octano,
n-decano, n-dodecano, cumeno,
1-metilindol, 5-Cl-, o
Br-indol, indeno, benzotiofeno, alfa, beta o
gama-ionona, acridina, naftaleno,
6-metil- u 8-metilquinolina,
quinolina y quinaldina.
7. Un proceso para la producción microbiológica
de índigo y/o indirubina, que comprende:
- a1)
- cultivar un microorganismo recombinante que produce una citocromo P450 monooxigenasa que oxida al indol en un medio de cultivo, en presencia de indol exógeno o formado en una etapa intermedia; o
- a2)
- incubar un medio de reacción que contiene indol con una citocromo P450 monooxigenasa que oxida al indol; y
- b)
- aislar el producto de oxidación formado o un producto secundario del mismo del medio.
donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo
P450 monooxigenasa BM-3 de Bacillus
megaterium que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con
la SEQ ID NO: 2, que tiene una mutación funcional en la posición 87
de la secuencia de aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en
las posiciones 87, 188 y 74, donde
Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu;
Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y
Ala74 es reemplazado por Val o Gly.
8. El proceso de acuerdo a la reivindicación 7,
en donde el índigo y/o la indirubina obtenidos, que fueron
producidos por oxidación del indol formado en una etapa intermedia,
se aíslan del medio.
9. El proceso de acuerdo a la reivindicación 8,
en donde la oxidación del indol se lleva a cabo por medio del
cultivo de los microorganismos en presencia de oxígeno con una
temperatura de cultivo de aproximadamente 20 a 40ºC y un pH de
aproximadamente 6 a 9.
10. El proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el mutante tiene al menos una
de las siguientes sustituciones de mono o poliaminoácidos:
- a)
- Phe87Val;
- b)
- Phe87Val, Leu188Gln; o
- c)
- Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly.
11. El uso de una citocromo P450 monooxigenasa,
donde la monooxigenasa se deriva de la citocromo P450 monooxigenasa
BM-4 de Bacillus megaterium que tiene una
secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, que tiene
una mutación funcional en la posición 87 de la secuencia de
aminoácidos; o en las posiciones 87 y 188; o en las posiciones 87,
188 y 74, donde
Phe87 es reemplazado por Ala, Val o Leu;
Leu188 es reemplazado por Asn o Gln; y
Ala74 es reemplazado por Val o Gly para la
- a)
- oxidación de compuestos aromáticos mono, di o polinucleares, N, O o S-heterocíclicos opcionalmente sustituidos;
- b)
- oxidación de aromáticos mono o polinucleares opcionalmente sustituidos;
- c)
- oxidación de alcanos y alquenos de cadena recta o ramificada
- d)
- oxidación de cicloalcanos y cicloalquenos opcionalmente sustituidos.
12. El uso de acuerdo a la reivindicación 11, en
donde la monooxigenasa comprende una de las siguientes sustituciones
de múltiples aminoácidos:
- a)
- Phe87Val;
- b)
- Phe87Val, Leu188Gln; o
- c)
- Phe97Val, Leu188Gln, Ala74Gly.
13. El uso de un vector que comprende al menos
una construcción de expresión que incluye, bajo el control genético
de secuencias reguladoras de ácido nucleico, una secuencia de
codificación que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica para una monooxigenasa de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 11 y 12 o de un microorganismo recombinante que
incluye al menos uno de tales vectores para la oxidación
microbiológica de
- a)
- compuestos aromáticos mono, di o polinucleares, N, O o S-heterocíclicos opcionalmente sustituidos;
- b)
- aromáticos mono o polinucleares opcionalmente sustituidos;
- c)
- alcanos y alquenos de cadena recta o ramificada; y/o
- d)
- cicloalcanos y cicloalquenos opcionalmente sustituidos.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13,
en donde el microorganismo se selecciona de bacterias del género
Escherichia.
15. El uso de un microorganismo que produce al
citocromo P450 que oxida al indol de acuerdo con la definición en la
reivindicación 13 ó 14 para la preparación de índigo y/o
indirubina.
16. Un biorreactor que comprende una enzima de
acuerdo con la definición en cualquiera de las reivindicaciones 11 y
12 o un microorganismo recombinante de acuerdo a la definición en
cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14 en forma inmovilizada,
donde la enzima utilizada tiene mutaciones funcionales en las
posiciones 87 y 188 o en las posiciones 87, 188 y 74.
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