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CN1183252C - 新型细胞色素p450单加氧酶及其在有机化合物的氧化方面的应用 - Google Patents

新型细胞色素p450单加氧酶及其在有机化合物的氧化方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有改良的底物特异性的新型细胞色素P450单加氧酶、其核酸编码序列、含有这些序列的表达构建体和载体，由其转化的微生物、对各种有机底物的微生物氧化方法，举例来说，如靛蓝和靛玉红的制备方法。

Description

新型细胞色素P450单加氧酶 及其在有机化合物的氧化方面的应用
技术领域
本发明涉及具有改良的底物特异性并能够氧化诸如N-杂环芳香化合物等有机底物的新型细胞色素P450单加氧酶、其核苷酸编码序列、含有这些序列的表达构建体和载体以及由其转化的微生物、诸如N-杂环芳香化合物等各种有机底物的微生物氧化方法，特别是靛蓝和靛玉红的制备方法。
背景技术
利用对天然样品的筛选或对已知酶的蛋白质工程方法均可制备出具有新功能和新特性的酶。而在某些情况下，后一种方法更适于诱发一些用自然选择方法不大可能产生的特性。尽管在酶工程领域已进行了多次尝试，但迄今为止只有少数几项研究成功地提高了酶突变体对于某一底物的催化活性(1-10)。在这些已知的实例中，底物在结构上都与相应酶的天然底物密切相关。至今仍未见有关对酶进行成功改造而使其经修饰后可催化在结构上与其天然底物完全不同的化合物的反应的报道。
可由巨大芽孢杆菌分离的细胞色素P450单加氧酶通常能够催化长链饱和酸及其相应的酰胺类和醇类的近端羟基化反应或长链未饱和脂肪酸或中链饱和脂肪酸的环氧化反应(11-13)。饱和脂肪酸的最佳链长为14-16个碳原子。链长小于12的脂肪酸不被羟基化(11)。
利用X-射线结构分析方法已确定了P450 BM-3的血红素结构域的结构(14-16)。底物结合位点以长隧道状孔道形式存在，从分子表面延伸至血红素分子，其边界几乎完全由疏水性氨基酸残基构成。血红素结构域表面的带电残基只有Arg47和Tyr51残基。它们被认为参与了以氢键形式与底物的羰基基团的结合(14)。将Arg47突变成Glu可导致该酶对花生四烯酸失活(13)，但相比之下会提高其对C12-C14-烷三甲铵化合物的活性(17)。该酶以芳香化合物，特别是单核、二核或多核、甚至杂环芳香化合物、链烷、链烯、环烷烃和环烯烃，为底物的应用仍未见报道。因而专家们至今仍认为，除诸如吲哚等迄今所述的有机底物之外的底物由于与P450 BM-3的天然底物的明显结构差异，特别是由于缺乏能够与底物袋中的上述残基结合的功能基团，而不能作为一种底物。
发明内容
本发明的目标是获得具有改进的底物特异性或底物总谱的新型细胞色素P450单加氧酶。特别是所提供的单加氧酶突变体与未突变的野生型酶相比，对结构明显不同的底物具有酶学活性。
与野生型酶相比，由本发明的突变体可获得“改进的底物总谱”。详细地说，在a)-d)组定义的至少一种可氧化化合物的转变反应中可观测到所述突变体的反应性有所改善，如比活(表示为被转变底物的nmol数/分钟/nmol P450酶)和/或选自Kcat、Km、Kcat/Km的至少一项动力学参数有所提高(例如至少1％，如10-1000％、10-500％或10-100％)。本发明的氧化反应包括至少一种外源性(即加到反应介质中的)或内源性(即已经存在于反应介质中的)有机底物由酶催化的加氧反应。详细地说，本发明的氧化反应包括脂肪族或芳香族C-H基团的单羟基化和/或多羟基化，如单羟基化和/或二羟基化，或C＝C基团，优选的为非芳香族C＝C基团，的环氧化。也可以是上述反应的组合。此外，直接反应产物还可以在不涉及酶作用的次反应或副反应环境中被进一步转化。这些酶作用与非酶作用的组合也同样构成本发明的主旨的一部分。
我们惊奇地发现，以上目标可借助于能够，例如，氧化N-杂环二核或多核芳香化合物的新型细胞色素P450单加氧酶来实现。
详细地说，本发明涉及那些通过定点诱变而使其底物结合区能够功能性摄取新型底物，如N-杂环型底物，的单加氧酶。
本发明的一项优选实施方案中的新型单加氧酶具有可溶性，即能够以非膜结合形式存在，并且在该形式下具有酶学活性。
优选地，本发明的单加氧酶衍生自源于细菌的细胞色素P450单加氧酶，特别是衍生自源于巨大芽孢杆菌的具有序列编号：2所示氨基酸序列的细胞色素P450单加氧酶，并且在172-224(F/G环区)、39-43(β链1)、48-52(β链2)、67-70(β链3)、330-335(β链5)、352-356(β链8)、73-82(螺旋5)和86-88(螺旋6)之一的氨基酸序列区域内具有至少一种功能性突变，即促进新有机底物(特别是参考如下文定义的a)-d)组的化合物)的氧化，如N-杂环单核、二核或多核芳香化合物。
本发明提供的细胞色素P450单加氧酶突变体优选地能够实现以下至少一种反应：
a)未取代的或取代的N-、O-或S-杂环单核、二核或多核芳香化合物的氧化；
b)未取代的或取代的单核或多核芳香化合物的氧化；
c)直链或支链烷烃和烯烃的氧化；以及
d)未取代的或取代的环烷烃和环烯烃的氧化。
优选的单加氧酶突变体至少在73-82、86-88和172-224之一的序列区域内具有至少一种功能性突变，特别是氨基酸置换。由此，举例来说，Phe87可被替换成一种带有脂肪族侧链的氨基酸，如Ala、Val、Leu，特别是Val；Leu188可被替换成一种带有酰胺侧链的氨基酸，如Asn或特别是G1n；而Ala74可被替换成另一种带有脂肪族侧链的氨基酸，如Val和特别是Gly。
此类型的特别优选的单加氧酶突变体是那些具有以下至少一种单氨基酸或多氨基酸置换的突变体：
1)Phe87Val；
2)Phe87Val、Leu188Gln；或
3)Phe87Val、Leu188Gln、Ala74Gly；
及其功能等价物。数字表明突变的位置；原有氨基酸标于数字前，新引入的氨基酸标于数字后。
本文中的“功能等价物”或特别公开的突变体类似物是指不同的突变体，这些突变体至少相对于上文a)-d)所述氧化反应之一，即对例如杂环芳香化合物以及使，例如，吲哚羟基化的氧化反应，而言另具有特定的底物特异性，或是相对于野生型酶而言另显示出特定的“改进的底物总谱”。
根据本发明的意图，一些突变体也可被理解为“功能等价物”，这些突变体至少在上述序列位置之一具有除特别提到的氨基酸置换之外的另一种氨基酸置换，但该置换仍能够产生一种相对于野生型酶而言具有“改进的底物总谱”并能够催化上述至少一种氧化反应的与特别提到的突变体相似的突变体。功能等价还特别适用于对底物总谱作定性修改的情况，即，例如，转化相同的底物，但速率不同。
“功能等价物”自然也包括可通过衍生自其它生物体的P450酶的突变而获得的与特别提到的P450 BM3相似的P450单加氧酶突变体。举例来说，可通过序列比较来确定同源序列区的位置。然后根据本发明特别叙述的原则，由现代分子模拟方法实现可影响反应模式的等价突变。
“功能等价物”还包括可通过一个或多个额外的氨基酸添加、置换、缺失和/或倒位而获得的突变体，上述额外修饰可出现在任一序列位置，只要其能够产生一种具有上文所述意义上的改进的底物总谱的突变体。
根据本发明，可被氧化的a)组底物是未取代的或取代的杂环单核、二核或多核芳香化合物；特别是可被氧化或被羟基化的N-、O-或S-杂环单核、二核或多核芳香化合物。其优选地是2或3员，特别是2员，4-7员，特别是6或5员，构成的稠环，其中至少有1个环，优选的为所有环，具有芳香性，并且至少有1个芳香环中带有1-3个，优选的为1个，N-、O-或S-杂原子。整个环结构可另含有一种或两种相同的或不同的杂原子。芳香化合物的环碳原子或杂原子可另带有1-5个取代基。适当的取代基实例有C1--C4-烷基，如甲基、乙基、正-或异丙基、正-、异-或叔-丁基，或C2--C4-烯基，如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基或3-丁烯基，羟基和卤素，如F、Cl和Br。所述烷基或烯基取代基还可带有一个酮基或醛基；例如丙烷-2-酮-3-基、丁烷-2-酮-4-基、3-丁烯-2-酮-4-基。详细地说，适当的杂环底物的非限定性实例有二核杂环，如吲哚、N-甲基-吲哚及其在碳原子上带有1-3个上述取代基的取代类似物，如5-氯-或5-溴-吲哚；还有喹啉和喹啉衍生物，如8-甲基喹啉、6-甲基-喹啉及喹哪啶；以及苯并噻吩及其在碳原子上带有1-3个上述取代基的取代类似物。此外还可包括三环杂芳化合物，如吖啶及其在碳原子上带有1-3个上述取代基的取代类似物。
根据本发明，可被氧化的b)组底物是未取代的或取代的单核或多核，特别是单核或二核，芳香化合物，如苯和萘。这些芳香化合物可以是未取代或单取代或多取代的，并且可以，例如，在环碳原子上带有1-5个取代基。适当的取代基实例有C1--C4-烷基，如甲基、乙基、正-或异丙基、或正-、异-或叔-丁基，或C2--C4-烯基，如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基或3-丁烯基，羟基和卤素，如F、Cl和Br。所述烷基或烯基取代基还可带有一个酮基或醛基；例如丙烷-2-酮-3-基、丁烷-2-酮-4-基、3-丁烯-2-酮-4-基。该芳香化合物可与主干由4-7个原子构成的非芳香环融合。该非芳香环可带有1或2个C＝C双键，可被上述取代基单取代或多取代，并可带有1或2个杂环原子。特别适当的芳香化合物实例有单环芳香化合物，如异丙苯，以及二环底物，如茚和萘及其在碳原子上带有1-3个上述取代基的取代类似物。
根据本发明，可被氧化的c)组底物为带有4-15个，优选的为6-12个，碳原子的直链或支链烷烃或烯烃。可提到的实例有正-丁烷、正-戊烷、正-己烷、正-庚烷、正-辛烷、正-壬烷、正-癸烷、正-十一烷和正-十二烷，以及这些化合物的分支一次或一次以上的类似物，如带有1-3个甲基侧基的类似化合物；或上述烷烃的单未饱和或多未饱和类似物，如单未饱和类似物。
根据本发明，可被氧化的d)组底物是带有4-8个环碳原子的未取代的或取代的环烷烃和环烯烃。其实例有环戊烷，环戊烯，环己烷环己烯，环庚烷，环庚烯。环结构可带有一个或多个，如1-5个，在a)和b)组化合物中所定义的取代基。非限定性实例有紫罗酮，如α-、β-及γ-紫罗酮，以及相应的甲基紫罗酮和异甲基紫罗酮。特别优选的为α-和β-紫罗酮。
本发明还涉及本发明所述单加氧酶之一的核酸编码序列。优选的核酸序列来源于序列编号：1并具有至少一个可导致上述功能性氨基酸突变之一的核苷酸置换。本发明还涉及由单个或多个核苷酸的添加、置换、插入和/或缺失而获得的核酸的功能性类似物，该类似物可进一步编码一种具有所需底物特异性，如吲哚氧化活性，的单加氧酶。
本发明还包括那些含有所谓沉寂突变，或与特别提到的序列相比根据特定来源或宿主生物的密码子选择加以修改的核酸序列，以及这些核酸序列的天然变异体。本发明还包括由遗传密码简并(即不导致相应氨基酸序列的任何改变)或保守核苷酸置换(即相应的氨基酸被置换成另一种电荷、大小、极性和/或溶解性相同的氨基酸)而获得的核酸序列变体，通过核苷酸添加、插入、倒位或缺失而改变的可编码本发明所述具有“改进的底物总谱”的单加氧酶的序列，以及相应的互补序列。
本发明还涉及含有本发明所述突变体的核酸编码序列并处于调节核酸序列的遗传调控之下的表达构建体；以及至少含有这些表达构建体之一的载体。
优选地，本发明的构建体在所述编码序列的5’上游含有一种启动子，在3’下游含有一种终止子，还可选择性地含有其它常用调节因子，并且均与编码序列有效连接。有效连接的含义应理解为，启动子、编码序列、终止子以及适当情况下的其它调节因子的顺序排列方式能够使各调节因子实现其在编码序列表达方面的预定功能。可有效连接的序列的实例有导向序列、或翻译增强子、增强子、多腺苷酸化信号等。其它调节因子包括可选标记、扩增信号、复制起始点等。
除人工调节序列外，真正的结构基因上游还可存在天然的调节序列。如果需要，可通过遗传修饰将这种天然调节作用关闭，并且可以增强或减弱基因的表达。但也可以将基因构建体作为单一因子加以构建，也就是在结构基因的上游不插入任何额外的调节信号，同时不去除天然的启动子及其调节作用。反之，也可将天然调节序列突变，使其不再具有调节作用，并提高或减弱基因的表达。在基因构建体中可存在一个或多个核酸序列拷贝。
适当的启动子实例有：利于使用在革兰氏阴性菌中的cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、1-PR或1-PL启动子；革兰氏阳性启动子amy和SPO2、酵母启动子ADC1、MFa、Ac、P-60、CYC1、GAPDH或植物启动子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或泛素启动子或菜豆球蛋白启动子。特别优选的是使用可诱导型启动子，例如光诱导型及特别是温度诱导型启动子，如PrP1启动子。
原则上讲，带有调节序列的所有天然启动子均可使用。此外还可通过有利的方式使用合成启动子。
上述调节序列可用来实现核酸序列以及蛋白的特定表达。这意味着，例如，可根据宿主生物的不同而选择只在诱导后才使基因进行表达或超表达，或是立即表达和/或超表达。
优选地，调节序列或调节因子可对表达具有正面效果，并可通过此方式加强或减弱表达。因此，使用诸如启动子和/或“增强子”等强转录信号可在转录水平上有利地加强调节因子。此外，还可通过提高，例如，mRNA稳定性来加强翻译。
通过将适当启动子与适当单加氧酶核苷酸序列及一种终止子信号或多腺苷酸化信号相融合可产生一种表达盒。为此，可按照，例如，T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，基因融合实验，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.et al.，最新分子生物学实验技术，GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中的描述使用常规的重组及克隆技术。
为了在适当的宿主生物中表达，可将重组核酸构建体或基因构建体插入到有利于在宿主内实现最佳基因表达的宿主特异性载体中。载体已为该领域的技术人员所熟知，并且可在，例如，《克隆载体》(Pouwels P.H.et al.，Ed.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中查明。对载体含义的理解不应只限于质粒，而是包括为技术人员所了解的所有其它载体，举例来说，如噬菌体、病毒，如SV40、CMV、杆状病毒及腺病毒，转座子、IS因子、噬粒、粘粒以及线状或环状DNA。这些载体能够在宿主生物内自主复制或通过染色体复制。
本发明的载体可用来产生重组微生物，这些微生物被，例如，至少一种本发明的载体所转化并可用于突变体的产生。本发明的上述重组构建体可被有利地引入到适当的宿主系统中而加以表达。为了实现上述核酸在所述表达系统中的表达，优选的是采用技术人员所了解的常用克隆及转染方法。适当的系统在，例如，最新分子生物学实验技术，Ausubel，F.M.et al.，Hrsg.and Wiley Interscience(New York1997)中有所描述。
原则上讲，适当的宿主生物包括能够表达本发明的核酸、其等位变异体及其功能等价物或衍生物的所有生物。宿主生物的含义应被理解为包括，例如，细菌、真菌、酵母或植物或动物细胞。优选的生物为诸如埃希氏菌属的细菌，例如大肠杆菌、链霉菌、芽胞杆菌或假单胞菌、真核微生物如酿酒酵母、曲霉，以及来自动物或植物的更高等真核细胞，如Sf9或CHO细胞。
如果需要，还可在诸如转基因动物，如特别是小鼠、绵羊，或转基因植物等转基因生物中实现基因产物的表达。转基因生物也可以是通过，例如，突变或部分缺失或完全缺失而去除相应内源基因的基因敲除动物或植物。
利用亦包含于载体或表达盒中的标记基因可筛选成功转化的生物。此类标记基因的实例有抗生素抗性基因和能够使被转化细胞着色的颜色反应催化酶基因。然后可利用自动的细胞分拣器对这些转化细胞进行筛选。利用含有适当抗生素的培养基或底物可筛选被载体成功转化并带有适当抗生素(例如G418或潮霉素)抗性基因的微生物。也可通过亲和层析利用存在于细胞表面的标记蛋白来进行筛选。
宿主生物与诸如质粒、病毒或噬菌体，例如带有RNA聚合酶/启动子系统的质粒、噬菌体λ、噬菌体μ或其它温和噬菌体或转座子和/或其它有利的调节序列，等适用于该生物的载体的组合构成一种表达系统。术语“表达系统”是指，举例来说，诸如CHO细胞等哺乳动物细胞与诸如pcDNA3neo载体等适用于哺乳动物细胞的载体的组合。
如上文所述，基因产物也可在诸如小鼠、绵羊等转基因动物或转基因植物中有利地表达。也有可能用来自核酸的RNA来设计无细胞翻译系统。
本发明还提供一种方法，用于制备本发明的单加氧酶，该方法包括培养产单加氧酶的微生物，在适当情况下诱导单加氧酶的表达，以及由培养物分离单加氧酶。如果需要，对本发明的单加氧酶还可进行工业规模的生产。
微生物可利用已知方法进行培养和发酵。举例来说，细菌可在20-40℃及pH 6-9的条件下在TB或LB培养基中生长。适当的培养条件在诸如T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中有详细描述。
如果单加氧酶不被分泌到培养基中，则可将细胞裂解并利用已知的蛋白分离方法由裂解物获取单加氧酶。作为选择，也可利用高频超声、高压如弗氏细胞压碎器、渗透裂解、去污剂作用、裂解酶或有机溶剂、匀化或多种所述方法的组合将细胞裂解。单加氧酶的纯化可通过已知的层析方法来实现，如分子筛层析(凝胶过滤)，如Q-Sepharose层析、离子交换层析和疏水层析，以及诸如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳等其它常用方法。适当的方法在诸如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden[生化方法]，Verlag Walter deGruyter，Berlin，New York或Scopes，R.，蛋白纯化，Springer Verlag，New York Heidelberg，Berlin中均有所描述。
使用在cDNA中另加有特定核苷酸序列从而可编码能够简化纯化方法的改良多肽或融合蛋白的载体系统或寡核苷酸特别有利于重组蛋白的分离。适当的此类修饰有，例如，可作为锚定物的所谓“标签”，如6-组氨酸锚定物修饰，或能够作为抗原被抗体识别的抗原决定簇(例如在Harlow，E.and Lane，D.，1988，抗体：实验手册，Cold SpringHarbor(N.Y.)Press中有所描述)。这些锚定物可用来将蛋白连接到诸如多聚体基质等能够，例如，被填装在层析柱中的固体支持物或微量滴定板或其它支持物上。
同时，这些锚定物还可用于蛋白的识别。也可使用诸如荧光染料、酶标记物等能够在与底物反应后形成可检测反应产物的常规标记来识别蛋白，或单独使用放射性标记或与锚定物组合使用来衍生化蛋白。
本发明还涉及一种方法，用于诸如上文定义的N-杂环单核、二核或多核芳香化合物等有机化合物的微生物氧化，该方法包括
a1)在可被本发明所述单加氧酶氧化的外源(添加)底物或中间形成底物存在的情况下，在培养基中培养上文定义的重组微生物，优选的是在存在氧气(即有氧)的条件下进行；或
a2)将含有底物的反应介质与本发明的一种酶共保温，优选的是在存在氧气和电子供体的情况下进行；以及
b)由培养基中分离所形成的氧化产物或其副产物。
反应所需的氧气可由大气进入反应介质，如果需要，也可通过已知的方式直接添加氧气。
可氧化的底物优选地选自
a)未取代的或取代的N-杂环单核、二核或多核芳香化合物；
b)未取代的或取代的单核或多核芳香化合物；
c)直链或支链烷烃和烯烃；
d)未取代的或取代的环烷烃和环烯烃。
优选的工序变化可参考靛蓝/靛玉红的形成方法，其特征在于底物是中间形成的吲哚，并且由培养基内分离出通过氧化中间形成的羟基吲哚而产生的靛蓝和靛玉红。
如果利用重组微生物来实现本发明的氧化，则优选的微生物培养方法是，首先在存在氧气的情况下于培养温度约20-40℃、pH约6-9的条件下在复合培养基，如TB或LB培养基，中将微生物培养至达到足够的细胞密度。通常情况下并非必须添加外源吲哚，因为微生物可形成中间形式的吲哚。但若使用其它底物，则可能要添加外源的该底物。为了能更好地控制氧化反应，优选的是使用可诱导型启动子，特别是温度诱导型启动子。此时可温度提高至所需的诱导温度，如在PrP1启动子的情况下是42℃，并将其保持足够的时间，例如对表达单加氧酶活性而言为1-10或5-6小时，然后再将温度降低至约30-40℃。然后在存在氧气的情况下继续培养12小时-3天。特别是在吲哚氧化的情况下，可通过添加NaOH将pH提高至，例如，9-10，由此可通过酶催氧化产物2-羟基吲哚及3-羟基吲哚的空气氧化来进一步促进靛蓝或靛玉红的形成。
以下反应图式说明本发明的靛蓝/靛玉红形成：
Figure C0081091800161
但若利用纯化的或浓缩的酶突变体来实现本发明的氧化，则可将本发明的酶溶解在含有外源底物，如吲哚，的介质中(浓度约0.01-10mM或0.05-5mM)并使其发生反应，优选的是在存在氧气的情况下发生反应，反应条件为温度约10-50℃，例如30-40℃，pH约6-9(举例来说，可使用，例如，100-200mM的磷酸缓冲液或Tris缓冲液来确定)并且存在还原剂，相对于要被氧化的底物而言，含有底物的介质中另含有摩尔数约1-100或10-100倍过量的等效还原剂。优选的还原剂为NADPH。如果需要，也可分步添加还原剂。
在类似的方式下，优选使用的可氧化底物有：正-己烷、正-辛烷、正-癸烷、正-十二烷、异丙苯、1-甲基吲哚、5-Cl-或Br-吲哚、茚、苯并噻吩、α-、β-及γ-紫罗酮、吖啶、萘、6-甲基或8-甲基喹啉、喹啉以及喹哪啶。
本发明的酶催氧化反应可在，例如，以下条件下进行：
底物浓度：    0.01-20mM
酶浓度：      0.1-10mg/ml
反应温度：    10-50℃
pH：          6-8
缓冲液：      0.05-0.2M磷酸钾缓冲液或Tris/HCl缓冲液
电子供体：    优选的为分步添加方式(起始浓度约0.1-2mg/ml)
在通过，例如，添加电子供体(如NADPH)使反应开始前，可将混合物简短地(1-5分钟)预保温(约20-40℃)。反应在有氧条件下进行，也可在适当情况下额外引入氧气。
本发明的底物氧化方法可通过酶将存在于或添加到反应介质中的氧还原分解。通过添加还原剂(电子供体)可提供所需的等效还原剂。
然后可利用常规方法，如提取或层析方法，由介质中分离并纯化所形成的氧化产物。
本发明的主题还涉及生物反应器，该生物反应器含有固定化形式的本发明所述酶或本发明所述重组微生物。
最后，本发明的主题涉及本发明所述细胞色素P450单加氧酶或本发明所述载体或微生物在选自a)-d)组的底物，特别是N-杂环单核、二核或多核芳香化合物，的微生物氧化方面的应用，优选的则是在靛蓝和/或靛玉红的制备方面的应用。
具体实施方式
以下实施例作为参考用于本发明的更详细描述。
实施例1：
P450 BM-3特定密码子的随机化
该实验基本上按照(19)所述进行。利用Stratagene QuikChange试剂盒(La Jolla，CA，USA)通过定点诱变对3个位置(Phe87、Leu188和Ala74)进行随机化。以下为每个位置所使用的PCR引物：
Phe87： 5′-gcaggagacgggttgnnnacaagctggacg-3′(SEQ ID NO：3)，
        5′-cgtccagcttgtnnncaacccgtctcctgc-3′，(SEQID NO：4)
Leu188：5′-gaagcaatgaacaagnnncagcgagcaaatccag-3′(SEQ ID NO：5)，
        5′-ctggatttgctcgctgnnncttgttcattgcttc-3′(sEQ ID NO：6)；
Ala74： 5′-gctttgataaaaacttaaagtcaannncttaaatttgtacg-3′(SEQ ID：
        NO：7)，
        5′-cgtacaaatttaagnnnttgacttaagtttttatcaaagc-3′(sEQ ID
        NO：8)
所有3个位置的PCR反应条件相同。详细地说，每50μl反应体积使用每种引物各17.5pmol、模板质粒DNA 20pmol、Pfu聚合酶3U以及每种dNTP各3.25nmol。PCR反应开始于94℃/1分钟，然后将如下温度循环进行20次：94℃，1分钟；46℃，2.5分钟；72℃，17分钟。20次循环完成后，将反应在72℃下持续15分钟。在PCR完成后，在37℃下用20U的DpnI将模板DNA消化3小时。然后转化大肠杆菌DH5α。将转化的大肠杆菌DH5α细胞铺在含有150μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。然后在37℃保温18小时。
实施例2：
P450 BM-3及其突变体的表达与纯化以及蓝色料的产生
P450 BM-3基因及其突变体在pCYTEXP1质粒的PRPL温度诱导型强启动子的调控下于(20)所述的大肠杆菌DH5α中表达。用无菌牙签挑取菌落并转到每孔含有200μl TB培养基和100μg/ml氨苄青霉素的96孔微量滴定板中。37℃保温过夜。然后将每孔的各40μl细胞培养物转移到含有2ml TB培养基和100μg/ml氨苄青霉素的培养管中。然后于37℃下培养2小时。再将温度提高至42℃，诱导6小时。然后于37℃继续培养过夜，从而产生蓝色颜料。
酶的制备性生产可由300ml细胞培养物(OD578nm＝0.8-1.0)开始。至于酶的分离，可将细胞4000rpm离心10分钟，然后重悬于pH7.4的0.1M KxPO4缓冲液。利用Branson超声波仪W25(Dietzenbach，Germany)将冰冷的细胞小心地破碎，能量输出为80W，超声3次，每次2分钟。悬浮液于32570×g离心20分钟。粗提物可用于活性测定或酶的纯化。酶的纯化在(21)中已有所描述，在此特别引入作为参考。纯化酶的浓度根据450nm与490nm下的消光差值来确定，该方法在(11)中已有所描述，消光系数ε的值为91mM-1cm-1。
实施例3：
可产生大量蓝色料的突变体的分离
对各位置的每种突变体都分离出100个菌落，这些突变体是通过相应位置的密码子随机诱变而产生的。在培养管中培养这些菌落，用于产生蓝色颜料。用水清洗细胞并进行一系列的满速离心步骤(500rpm)，然后用二甲亚砜(DMSO)抽提蓝色颜料。该蓝色颜料在DMSO中的溶解度最高。在677nm下测量抽提物的吸收值。对产生最大量蓝色颜料的突变体，特别是针对特定位置的突变体，进行DNA测序(ABIDNA测序试剂盒；ABI PrismTM 377 DNA测序仪)，并将其作为定点随机诱变的模板。
实施例4：
吲哚羟基化活性测试
吲哚羟基化的活性测试在含有8μl溶于DMSO的10-500mM吲哚溶液、850μl tris/HCl缓冲液(0.1M，pH8.2)以及0.5nmol野生型P450BM-3或其突变体的终体积为1ml的溶液中进行。将该混合物预保温9分钟，然后加入50μl 1mM的NADPH水溶液以起始反应。20秒后加入60μl 1.2M的KOH以终止反应。酶产物可在5-30秒内(有氧条件下)完全被转化成靛蓝([Δ2，2’-二吲哚]-3，3’-二酮)和靛玉红([Δ2，3’-二吲哚]-2’，3-二酮)。靛蓝产物可根据其在670nm下的吸收来测定。由纯靛蓝获得的校正曲线显示，该波长下的消光系数为3.9mM-1cm-1。利用0.6nmol野生型P450 BM-3或其突变体以及0.05-5.0mM吲哚可在40秒的反应时间内获得靛蓝产物的线性曲线。靛玉红在670nm下的吸收非常弱，并且靛玉红的产量远低于靛蓝的产量。在确定动力学参数时，靛玉红的形成被忽略。NADPH的消耗量在340nm下测定，并如(17)所述用6.2mM-1cm-1的消光系数进行计算。
实施例5：
靛蓝和靛玉红的纯化
用水清洗细胞并在500g下反复离心，然后将形成的蓝色沉淀用四氢呋喃(THF)抽提。将抽提物蒸发至几乎干燥，再用50ml无水乙醇数次抽提红色颜料。将剩余的蓝色固体溶解在THF中，并利用薄层层析(TLC)进行分析。将乙醇溶液蒸发并通过硅胶层析(TLC 60，Merck，Darmstadt，Germany；2cm×30cm)加以纯化，然后用比率为1∶2的THF与石油醚进行清洗。将获得的红色溶液蒸发并利用TLC测定其纯度。利用Ultraspec 3000分光光度计(Pharmacia，Uppsala，Sweden)在400-800nm范围内测定蓝色及红色颜料的吸收光谱。再利用质谱和1H-NMR对蓝颜色和红颜色进行分析。
实验结果
1.通过P450 BM-3诱变提高蓝色颜料的生产率
天然P450 BM-3不能产生含靛蓝的蓝色颜料或前体物质2-或3-羟基吲哚。为了能制备出足够的蓝色颜料，将P450 BM-3进行受控方式的演变。将所有可产生蓝色颜料的突变体测序。发现至少有以下3个位点之一被突变：Phe87、Leu188和Ala74。以此可认为这3个位点对P450 BM-3产生蓝色颜料的活性至关重要。通过与十六烯酸复合的细胞色素P450 BM-3血红素结构域的结构可看出，Phe87会阻止底物更接近血红素基团(14)。Phe87Val突变体在对(14S，15R)-花生四烯酸的环氧化作用中显示出很高的区域选择性和立体专一性(13)，而Phe87Ala突变体可将ω-1、ω-2和ω-3的羟基化位置移至ω处(22)。因此，位置87被选定为PCR定点随机诱变的第一个位置。在管培养物中获得了7个可在诱导后产生少量蓝色颜料的菌落。选择可产生最大量蓝色颜料的菌落进行DNA测序。测序结果显示Phe87被Val替代。然后以Phe87Val突变体为模板在Leu188位置进行第二轮定点随机诱变。与十六烯酸复合的血红素结构域的结构显示，F螺旋和G螺旋的位置变化会使Leu188残基与底物直接接触(14)。因此，该位置在底物的结合或定向过程中具有重要的作用。在第二次筛选后获得了31个可产生蓝色颜料的菌落。可产生最大量颜料的突变体则含有Phe87Val及Leu188Gln置换。然后将该突变体对Ala74位置进行第三次定点随机诱变。此时获得的三重突变体F87L188A74(Phe87Val、Leu188Gln和Ala74Gly)可在含有300ml TB培养基的2升三角瓶中产生数毫克的蓝色颜料。这一产量足以对蓝色颜料进行分离和定性。
2.蓝色颜料的分离与鉴定
清洗细胞之后，用THF抽提剩余的蓝色沉淀，并通过TLC进行分析。蓝色颜料被分离成迁移迅速的蓝色组分和迁移较慢的红色组分。这两种组分与商品化靛蓝样品的组分具有完全相同的迁移率参数。
在DMSO中测定纯化后的两种组分的吸收光谱。蓝色组分显示出与商品化靛蓝样品相同的光谱。利用质谱测定法对纯化的蓝色及红色组分进行分析。两种颜料的质谱均在m/e＝262位置显示出一个很强的分子离子峰，并在m/e＝234及205位置显示出两个碎片峰(两个峰的相对强度均为10％)。该模式是靛蓝类化合物的典型模式。利用高分辨率质谱法确定这些离子的元素组成为C16H10N2O2、C15H10N2O和C14H9N2。这也是靛蓝类的特有结构。因此，蓝色颜料被鉴定为靛蓝，而红色颜料被鉴定为靛玉红。为了对结构进行证实，在DMSO-D6溶液中对两种颜料进行了500MHz 1H-NMR谱测定。其结果与文献资料相符(23)。
3.利用分离的酶产生靛蓝
已知靛蓝可通过微生物转化由吲哚获得(24-26)。但这些微生物系统均不包含P450单加氧酶。根据本发明，首先测定纯酶对吲哚的催化活性。将F87L188A74突变体与吲哚相混合。未观察到任何颜色反应。只有在反应混合物中加入NADPH约20分钟后才形成蓝色颜料。在添加NADPH 30秒后，通过将反应混合物的pH值调整到约11，可在数秒钟内即观测到蓝颜色。使用天然P450 BM-3的对照实验始终为阴性反应，甚至提高酶、吲哚和NADPH的浓度也是如此。用乙酸乙酯抽提蓝色颜料，并利用TLC进行分析。蓝色颜料再次被分离成迁移迅速的蓝色组分和迁移较慢的红色组分。其Rf值和吸收光谱与提自发酵肉汤的提取物的值完全相同。因此，P450 BM-3的F87L188A74突变体是一种吲哚羟化酶。
根据前人的描述，已有两条途径可经酶的作用将吲哚转化成靛蓝。一个是双加氧酶催化，另一个是苯乙烯单加氧酶催化(24，25)。NADPH在这两种情况下的化学当量均为2。因此可认为，与双加氧酶相比，本发明的F87L188A74突变体能够只在一个位置使吲哚羟基化，从而可形成羟吲哚(2-羟基吲哚)或吲哚酚(3-羟基吲哚)。
4.吲哚羟基化作用的动力学参数
吲哚羟基化作用的动力学参数测定使用了野生型P450 BM-3酶纯样品和Leu188Gln、Phe87Val、F87L188及F87L188A74突变体纯样品。结果概述于下表1中。
表1：P450 BM-3突变体的吲哚羟基化动力学参数
突变体        Kcat(s-1)   Km(mM)     Kcat/Km(M-1s-1)
WT            -a)          -           -
Leu188Gln     n.d.b)       n.d.        n.d.
Phe87Val      2.03(0.14)    17.0(1.0)   119
F87L188       2.28(0.16)    4.2(0.4)    543
F87L188A74    2.73(0.16)    2.0(0.2)    1365
a)未观测到活性；
b)未测定(活性过低，无法测量)
甚至使用过量的纯化酶和高浓度的吲哚，野生型酶也无法氧化吲哚。Leu188Gln突变体显示出很低的活性。Phe87Val突变体对吲哚羟基化的催化活性为119M-1s-1。F87L188双突变体(Phe87Val、Leu188Gln)的催化效率提高到543M-1s-1，而引入另一置换Ala74Gly后则提高到1365M-1s-1。三重突变体与Phe87Val相比，Kcat值共提高了35％，而Km值降低了约7倍。这表明Ala74Gly和Leu188Gln主要参与了底物的结合。对三重突变体F87L188A74而言，其吲哚转换率(Kcat＝2.73s-1)比大多数P450酶都高出10倍以上(18)。
实施例6：
利用修饰的细胞色素P450单加氧酶对正-辛烷进行羟基化
利用含有以下突变的P450 BM-3单加氧酶突变体进行反应：Phe87Val、Leu188Gln、Ala74Gly。
选定的底物为正-辛烷。正-辛烷的羟基化使用以下有氧反应混合物：
P450 BM-3突变体：  17.5mg(冻干剂)
反应缓冲液：       9.1ml(磷酸钾缓冲液50mM，pH7.5)
底物：             50μl的60mM溶液(溶于丙酮)
温度：             25℃
将酶冻干剂溶解于500μl反应缓冲液，并在开始时与底物和反应缓冲液室温保温5分钟。然后加入300μl DADPH溶液(5mg/ml)。再重复两次添加NADPH。通过测量340nm下的吸收来监控反应的进度，这样可观测到NADPH的下降。将NADPH以300μl为一组分步添加，因为反应溶液中过高的NADPH浓度会导致酶的失活。然后用5ml乙醚将反应溶液抽提3次以分离产物。合并有机相，用MgSO4干燥并浓缩。然后利用DC、GC/MS和NMR对产物进行定性。
对反应混合物的GC/MS分析获得了以下结果：
化合物 Rt[min]1)  转化率[％]
4-辛烷 13.51  37
3-辛烷 14.08  47
2-辛烷 14.26  16
1)温度设置：40℃ 1分钟 等温/3℃/分钟 95℃/10℃/分钟 275℃；仪器：Finnigan MAT 95；GC：HP 5890 Series II Split Injector；柱：HP-5MS(甲基硅氧烷)30m×0.25mm；载气：0.065ml He/分钟未发现有原材料。
实施例7：
芳香化合物、杂芳化合物和三甲基环己烯化合物的羟基化
a)重复实施例6，但底物不是正-辛烷，而是萘。产物被鉴定为1-萘酚和顺-1，2-二羟基-1，2-二氢化萘。88％的萘原料被转化。
萘反应的分析方法
GC：
仪器：Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160 on ColumnInjector；柱：DB5 30m×0.2mm；材料：5％联苯-95％二甲聚硅氧烷；载气：0.5bar H2；温度设置：40℃1分钟等温/10℃/分钟直至300℃
Rt(1-萘酚)＝16.68
NMR：
利用1H NMR鉴定出1-萘酚和顺-1，2-二羟基-1，2-二氢化萘。
b)重复实施例6，但底物不是正-辛烷，而是8-甲基喹啉。主要产物被鉴定为5-羟基-8-甲基喹啉，此外还有其它一些衍生物(产物比率5∶1)。35％的所用原材料被转化。
c)重复实施例6，但底物不是正-辛烷，而是α-紫罗酮。主要产物被鉴定为3-羟基-α-紫罗酮，此外还有其它一些衍生物(产物比率76∶24)。60％的所用原材料被转化。
d)重复实施例6，但底物不是正-辛烷，而是异丙苯(异丙基苯)。共鉴定出5种单羟基化产物和1种二羟基化产物。70％的所用原材料被转化。
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22.Oliver，C.F.，Modi，S.，Sutcliffe，M.J.，Primrose，W.U.，Lian，L.Y.and Roberts，G.C.K(1997)Biochemistry 36，1567-1572.
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24.Murdock，D.，Ensley，B.D.，Serdar，C.and Thalen，M.(1993)Bio/Technology 11，381-385.
25.0’Connor，ICE.，Dobson，A-W.and Hartmans，S.(1997)Appl.Environ.Microbiol.63，4287-4291.
26.Eaton，R.W.and Chapman，P.J.(1995)J Bacteriol，177，6983-6988.
                                序列表
<110>BASF Aktiengesellschaft
<120>新型细胞色素P450单加氧酶及其在有机化合物的氧化方面的应用
<130>M/40241
<140>
<141>
<160>9
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>3150
<212>DNA
<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<220>
<221>CDS
<222>(4)..(3150)
<400>1
atg aca att aaa gaa atg cct cag cca aaa acg ttt gga gag ctt aaa    48
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys
  1                   5                      10                      15
aat tta ccg tta tta aac aca gat aaa ccg gtt caa gct ttg atg aaa    96
Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys
                    20                      25                      30
att gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt    144
Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg
                35                       40                      45
gta acg cgc tac tta tca agt cag cgt cta att aaa gaa gca tgc gat    192
Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp
            50                      55                      60
gaa tca cgc ttt gat aaa aac tta agt caa gcg ctt aaa ttt gta cgt    240
Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg
      65                      70                      75
gat ttt gca gga gac ggg tta ttt aca agc tgg acg cat gaa aaa aat    288
Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn
 80                      85                      90                      95
tgg aaa aaa gcg cat aat atc tta ctt cca agc ttc agt cag cag gca    336
Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala
                    100                      105                    110
atg aaa ggc tat cat gcg atg atg gtc gat atc gcc gtg cag ctt gtt    384
Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val
              115                     120                      125
caa aag tgg gag cgt cta aat gca gat gag cat att gaa gta ccg gaa    432
Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu
          130                    135                      140
gac atg aca cgt tta acg ctt gat aca att ggt ctt tgc ggc ttt aac    480
Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn
    145                     150                     155
tat cgc ttt aac agc ttt tac cga gat cag cct cat cca ttt att aca    528
Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr
160                     165                     170                  175
agt atg gtc cgt gca ctg gat gaa gca atg aac aag ctg cag cga gca    576
Ser Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala
                    180                    185                    190
aat cca gac gac cca gct tat gat gaa aac aag cgc cag ttt caa gaa    624
Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu
              195                    200                     205
gat atc aag gtg atg aac gac cta gta gat aaa att att gca gat cgc    672
Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg
          210                    215                       220
aaa gca agc ggt gaa caa agc gat gat tta tta acg cat atg cta aac    720
Lys Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn
    225                      230                     235
gga aaa gat cca gaa acg ggt gag ccg ctt gat gac gag aac att cgc    768
Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg
240                     245                    250                    255
tat caa att att aca ttc tta att gcg gga cac gaa aca aca agt ggt  816
Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly
                     260                      265                    270
ctt tta tca ttt gcg ctg tat ttc tta gtg aaa aat cca cat gta tta    864
Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu
              275                     280                     285
caa aaa gca gca gaa gaa gca gca cga gtt cta gta gat cct gtt cca    912
Gln Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro
          290                    295                      300
agc tac aaa caa gtc aaa cag ctt aaa tat gtc ggc atg gtc tta aac    960
Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn
     305                      310                     315
gaa gcg ctg cgc tta tgg cca act gct cct gcg ttt tcc cta tat gca    1008
Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala
320                     325                     330                    335
aaa gaa gat acg gtg ctt gga gga gaa tat cct tta gaa aaa ggc gac    1056
Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp
                    340                    345                    350
gaa cta atg gtt ctg att cct cag ctt cac cgt gat aaa aca att tgg    1104
Glu Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp
              355                      360                      365
gga gac gat gtg gaa gag ttc cgt cca gag cgt ttt gaa aat cca agt    1152
Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser
         370                     375                     380
gcg att ccg cag cat gcg ttt aaa ccg ttt gga aac ggt cag cgt gcg    1200
Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala
     385                      390                     395
tgt atc ggt cag cag ttc gct ctt cat gaa gca acg ctg gta ctt ggt    1248
Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly
400                     405                      410                    415
atg atg cta aaa cac ttt gac ttt gaa gat cat aca aac tac gag ctg    1296
Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu
                   420                    425                    430
gat att aaa gaa act tta acg tta aaa cct gaa ggc ttt gtg gta aaa    1344
Asp Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys
               435                     440                     445
gca aaa tcg aaa aaa att ccg ctt ggc ggt att cct tca cct agc act    1392
Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr
          450                      455                       460
gaa cag tct gct aaa aaa gta cgc aaa aag gca gaa aac gct cat aat    1440
Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn
    465                      470                     475
acg ccg ctg ctt gtg cta tac ggt tca aat atg gga aca gct gaa gga    1488
Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly
480                     485                     490                   495
acg gcg cgt gat tta gca gat att gca atg agc aaa gga ttt gca ccg    1536
Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro
                   500                      505                    510
cag gtc gca acg ctt gat tca cac gcc gga aat ctt ccg cgc gaa gga    1584
Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly
              515                      520                     525
gct gta tta att gta acg gcg tct tat aac ggt cat ccg cct gat aac  1632
Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn
          530                       535                     540
gca aag caa ttt gtc gac tgg tta gac caa gcg tct gct gat gaa gta    1680
Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val
     545                     550                     555
aaa ggc gtt cgc tac tcc gta ttt gga tgc ggc gat aaa aac tgg gct    1728
Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala
560                     565                     570                   575
act acg tat caa aaa gtg cct gct ttt atc gat gaa acg ctt gcc gct    1776
Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala
                    580                     585                    590
aaa ggg gca gaa aac atc gct gac cgc ggt gaa gca gat gca agc gac    1824
Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp
              595                      600                    605
gac ttt gaa ggc aca tat gaa gaa tgg cgt gaa cat atg tgg agt gac    1872
Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp
         610                     615                     620
gta gca gcc tac ttt aac ctc gac att gaa aac agt gaa gat aat aaa    1920
Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys
     625                     630                     635
tct act ctt tca ctt caa ttt gtc gac agc gcc gcg gat atg ccg ctt    1968
Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu
640                     645                     650                   655
gcg aaa atg cac ggt gcg ttt tca acg aac gtc gta gca agc aaa gaa    2016
Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu
                    660                    665                    670
ctt caa cag cca ggc agt gca cga agc acg cga cat ctt gaa att gaa    2064
Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu
              675                     680                      685
ctt cca aaa gaa gct tct tat caa gaa gga gat cat tta ggt gtt att    2112
Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile
          690                     695                     700
cct cgc aac tat gaa gga ata gta aac cgt gta aca gca agg ttc ggc    2160
Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly
     705                      710                     715
cta gat gca tca cag caa atc cgt ctg gaa gca gaa gaa gaa aaa tta    2208
Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu
720                     725                     730                    735
gct cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa    2256
Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln
                    740                      745                   750
tac gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg    2304
Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met
               755                    760                     765
gct gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg    2352
Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu
          770                     775                      780
ctt gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca    2400
Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr
    785                      790                     795
atg ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc    2448
Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser
800                    805                     810                    815
gaa ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att    2496
Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
                    820                      825                    830
tct tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc    2544
Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser
                835                     840                     845
gtt gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att    2592
Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile
          850                      855                      860
gcg tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc    2640
Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys
     865                     870                     875
ttt att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa    2688
Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu
880                      885                      890                   895
acg ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga    2736
Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg
                    900                     905                    910
ggc ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt    2784
Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu
              915                     920                     925
gga gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat    2832
Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr
         930                     935                      940
ctg tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg    2880
Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr
    945                     950                      955
ctt cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt    2928
Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val
960                     965                     970                    975
cag cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat    2976
Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp
                   980                     985                    990
caa gga gcg cac ttc tat att tgc gga gac gga agc caa atg gca cct    3024
Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro
               995                    1000                    1005
gcc gtt gaa gca acg ctt atg aaa agc tat gct gac gtt cac caa gtg    3072
Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val
         1010                    1015                    1020
agt gaa gca gac gct cgc tta tgg ctg cag cag cta gaa gaa aaa ggc    3120
Scr Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly
    1025                    1030                    1035
cga tac gca aaa gac gtg tgg gct ggg taa                            3150
Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1040                   1045
<210>2
<211>1048
<212>PRT
<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400>2
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn
  1                   5                      10                    15
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile
               20                      25                       30
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val
          35                       40                      45
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu
      50                      55                       60
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp
 65                      70                      75                    80
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp
                    85                      90                    95
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met
               100                      105                    110
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln
          115                    120                       125
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp
     130                    135                       140
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr
145                     150                     155                    160
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser
                   165                      170                    175
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn
              180                    185                     190
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp
         195                     200                    205
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys
      210                    215                       220
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Lcu Thr His Met Leu Asn Gly
225                     230                     235                    240
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr
                   245                     250                    255
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu
                260                      265                    270
Lcu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln
          275                     280                     285
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser
     290                     295                     300
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu
305                     310                     315                    320
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys
                   325                     330                    335
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu
              340                      345                    350
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly
         355                      360                     365
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala
    370                     375                     380
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys
385                      390                     395                    400
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met
                    405                     410                    415
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp
              420                    425                     430
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala
          435                     440                      445
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu
     450                      455                       460
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr
465                      470                    475                    480
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Mct Gly Thr Ala Glu Gly Thr
                   485                     490                    495
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln
              500                      505                     510
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala
          515                     520                     525
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala
     530                      535                      540
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys
545                     550                     555                    560
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr
                    565                     570                    575
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys
               580                      585                     590
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp
          595                     600                     605
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val
    610                      615                     620
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser
625                     630                     635                   640
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala
                    645                     650                    655
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu
              660                     665                      670
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu
          675                     680                      685
Pro Lys Glu Ala Scr Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro
     690                     695                     700
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu
705                     710                      715                   720
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala
                    725                     730                    735
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr
               740                      745                     750
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala
          755                     760                    765
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu
     770                      775                     780
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met
785                     790                     795                    800
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu
                  805                      810                    815
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser
               820                      825                     830
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val
          835                     840                       845
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala
     850                     855                      860
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe
865                     870                     875                    880
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr
                     885                     890                    895
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly
               900                     905                      910
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly
          915                    920                     925
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu
    930                     935                      940
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu
945                     950                     955                    960
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln
                    965                     970                    975
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln
              980                     985                     990
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro Ala
          995                    1000                    1005
Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val Ser
    1010                    1015                    1020
Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly Arg
1025                  1030                    1035                    1040
Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
                  1045
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>Description of the synthetic sequence：PCR primer
<400>3
gcaggagacg ggttgnnnac aagctggacg                                     30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>Description of the synthetic sequence：PCR primer
<400>4
cgtccagctt gtnnncaacc cgtctcctgc                                     30
<210>5
<211>34
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>Description of the synthetic sequence：PCR primer
<400>5
gaagcaatga acaagnnnca gcgagcaaat ccag                                34
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>Description of the synthetic sequence：PCR primer
<400>6
ctggatttgc tcgctgnnnc ttgttcattg                                     30
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>Description of the synthetic sequence：PCR primer
<400>7
gctttgaraa aaacttaaag tcaannnctt aaatttgtac g                        41
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>Description of the synthetic sequence：PCR primer
<400>8
cgtacaaatt taagnnnttg acttaagttt ttatcaaagc                          40
<210>9
<211>1049
<212>PRT
<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400>9
Met Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys
  1                   5                      10                    15
Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys
               20                      25                     30
Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg
           35                       40                      45
Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp
      50                      55                       60
Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg
 65                      70                      75                  80
Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn
                   85                       90                    95
Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala
              100                       105                    110
Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val
         115                     120                      125
Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu
     130                    135                      140
Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn
145                     150                     155                    160
Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr
                    165                     170                    175
Ser Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala
              180                     185                    190
Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu
         195                     200                    205
Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg
    210                      215                      220
Lys Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn
225                     230                     235                   240
Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg
                   245                         250                 255
Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly
                260                      265                    270
Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu
         275                     280                      285
Gln Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro
    290                      295                     300
Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn
305                      310                     315                  320
Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala
                   325                     330                    335
Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp
              340                     345                     350
Glu Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp
         355                      360                      365
Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser
    370                     375                     380
Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala
385                      390                     395                  400
Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly
                    405                     410                    415
Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu
              420                    425                     430
Asp Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys
          435                     440                      445
Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr
     450                      455                       460
Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn
465                     470                     475                   480
Thr Pro Leu Lcu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly
                    485                    490                    495
Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro
              500                     505                      510
Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly
          515                     520                    525
Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn
    530                       535                      540
Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val
545                     550                     555                   560
Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala
                    565                     570                   575
Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala
               580                      585                     590
Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp
          595                     600                     605
Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp
    610                     615                     620
Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys
625                     630                      635                  640
Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu
                    645                     650                    655
Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu
              660                     665                      670
Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu
         675                      680                     685
Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile
     690                     695                     700
Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly
705                     710                      715                   720
Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu
                   725                      730                    735
Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln
              740                      745                     750
Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met
          755                     760                     765
Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu
    770                      775                      780
Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr
785                     790                     795                   800
Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser
                  805                      810                    815
Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
               820                      825                     830
Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser
           835                    840                       845
Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile
    850                       855                     860
Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys
865                     870                     875                  880
Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu
                    885                      890                  895
Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg
                900                     905                     910
Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu
         915                     920                     925
Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr
     930                     935                     940
Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr
945                     950                     955                  960
Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val
                    965                    970                    975
Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp
               980                    985                     990
Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro
          995                     1000                   1005
Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val
    1010                    1015                    1020
Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly
1025                    1030                  1035                    1040
Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
                  1045

Claims (24)

1.一种细胞色素P450单加氧酶，该酶能够实现以下至少一种反应：
a)任意取代的N-、O-或S-杂环单核或多核芳香化合物的氧化；
b)任意取代的单核或多核芳香化合物的氧化；
c)直链或支链烷烃和烯烃的氧化；
d)任意取代的环烷烃和环烯烃的氧化；
其中的单加氧酶衍生自源于巨大芽孢杆菌的具有序列编号：2所示氨基酸序列的细胞色素P450 BM3单加氧酶，并且除Phe87Val单突变之外，至少在172-224、39-43、48-52、67-70、330-335、352-356、73-82和86-88之一的氨基酸序列区内具有至少一种功能性突变，这种功能性突变促进了至少一种a)，b)，c)或d)的氧化反应。
2.权利要求1的一种单加氧酶，该酶至少在73-82、86-88和172-224之一的序列区域内具有至少一种功能性突变。
3.权利要求1的一种单加氧酶，该酶具有以下的至少一种单氨基酸或多氨基酸置换：
a)Phe87Val、Leu188Gln；或
b)Phe87Val、Leu188Gln、Ala74Gly。
4.编码上述权利要求之一所要求的单加氧酶的一种核酸序列。
5.一种表达构建体，该构建体含有处于调节核酸序列的遗传调控之下的一种编码序列，该编码序列含有权利要求4的核酸序列。
6.一种载体，该载体至少含有一种权利要求5的表达构建体。
7.一种至少被权利要求6的一种载体转化的重组微生物。
8.权利要求7的一种微生物，该微生物选自埃希氏菌属的细菌。
9.一种方法，用于N-或S-杂环单核或多核芳香化合物的微生物氧化，该方法包括
a1)在存在外源底物或中间形成底物的情况下，于培养基中培养表达细菌来源的细胞色素P450单加氧酶的重组微生物；或
a2)将含有底物的反应介质与细菌来源的一种细胞色素P450单加氧酶共保温；以及
b)由介质中分离所形成的氧化产物或其二步产物，
其中的单加氧酶是权利要求1-3之任一的突变体，包括Phe87Val突变体。
10.权利要求9的方法，其中的外源底物或中间形成底物选自任意取代的N-或S-杂环单核或多核芳香化合物。
11.权利要求9或10的方法，其中的突变体具有以下的至少一种单氨基酸或多氨基酸置换：
a)Phe87Val；
b)Phe87Val、Leu188Gln；或
c)Phe87Val、Leu188Gln、Ala74Gly。
12.一种方法，用于权利要求1b)、c)或d)所述化合物的微生物氧化，该方法包括
a1)在存在外源底物或中间形成底物的情况下，于培养基中培养可产生细胞色素P450的权利要求7或8所述重组微生物；或
a2)将含有底物的反应介质与权利要求1-3的任一种细胞色素P450单加氧酶共保温；以及
b)由介质中分离所形成的氧化产物或其二步产物；
其中不排除Phe87Val单加氧酶突变体。
13.权利要求12的一种方法，其中的外源底物或中间形成底物选自
a)任意取代的单核或多核芳香化合物；
b)直链或支链烷烃和烯烃；
c)任意取代的环烷烃和环烯烃。
14.权利要求12或13的一种方法，其中的单加氧酶是权利要求1-3的任一种突变体，包括Phe87Val突变体。
15.权利要求14的一种方法，其中的突变体具有以下的至少一种单氨基酸或多氨基酸置换：
a)Phe87Val；
b)Phe87Val、Leu188Gln；或
c)Phe87Val、Leu188Gln、Ala74Gly。
16.权利要求9-15的任意一条所要求的一种方法，其中至少有一种选自上述a)-d)化合物组所定义的化合物作为外源底物被添加到介质中，并且氧化的实现方法是在氧气存在的情况下于培养温度约20-40℃且pH约6-9的条件下通过酶的作用将含有底物的介质转化，其中含有底物的介质另含有摩尔数基于底物的约10-100倍过量的等效还原剂。
17.权利要求16的一种方法，其中作为外源底物的化合物选自吲哚、正-己烷、正-辛烷、正-癸烷、正-十二烷、异丙苯、1-甲基吲哚、、5-Cl-或Br-吲哚、茚满酮(Indon)、苯并噻吩、α-、β-及γ-紫罗酮、吖啶、萘、6-甲基或8-甲基喹啉、喹啉以及喹哪啶。
18.一种方法，用于靛蓝和/或靛玉红的微生物生产，该方法包括
a1)在存在外源的或中间形成的吲哚的情况下于培养基中培养可产生吲哚氧化细胞色素P450的重组微生物；或
a2)将含有吲哚的反应介质与一种吲哚氧化细胞色素P450单加氧酶共保温；以及
b)由介质中分离所形成的氧化产物或其二步产物，
其中的单加氧酶是权利要求1-3的任一种突变体，包括Phe87Val突变体。
19.权利要求18的一种方法，其中通过将中间形成的吲哚氧化而产生的靛蓝和/或靛玉红是由培养基中分离出来。
20.权利要求19的一种方法，其中吲哚氧化的实现方法是在氧气存在的情况下于培养温度约20-40℃且pH约6-9的条件下培养微生物。
21.权利要求19或20的一种方法，其中的突变体具有以下的至少一种单氨基酸或多氨基酸置换：
a)Phe87Val；
b)Phe87Val、Leu188Gln；或
c)Phe87Val、Leu188Gln、Ala74Gly。
22.一种生物反应器，该生物反应器含有固定化形式的权利要求1-3之一所要求的一种酶或权利要求7或8之一所要求的一种重组微生物。
23.权利要求1-3之一所要求的一种细胞色素P450单加氧酶，或权利要求6所要求的一种载体，或权利要求7或8之一所要求的一种微生物在
a)任意取代的N-、O-或S-杂环单核或多核芳香化合物；
b)任意取代的单核或多核芳香化合物；
c)直链或支链烷烃和烯烃；和/或
d)任意取代的环烷烃和环烯烃，
的微生物氧化方面的应用，其中不排除Phe87Val单加氧酶突变体。
24.可产生吲哚氧化细胞色素P450的权利要求7或8的微生物在靛蓝和/或靛玉红的制备方面的应用。
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