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KR100564158B1 - 싸이토크롬 ｐ450 효소 및 이를 코딩하는 유전자 - Google Patents

싸이토크롬 ｐ450 효소 및 이를 코딩하는 유전자 Download PDF

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KR100564158B1
KR100564158B1 KR1020040066680A KR20040066680A KR100564158B1 KR 100564158 B1 KR100564158 B1 KR 100564158B1 KR 1020040066680 A KR1020040066680 A KR 1020040066680A KR 20040066680 A KR20040066680 A KR 20040066680A KR 100564158 B1 KR100564158 B1 KR 100564158B1
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Abstract

본 발명은 방향족 링(aromatic ring) 화합물에 하이드록시기를 도입하는 기능을 가지는 싸이토크롬 P450 효소(CYP105P2), 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 효소 또는 상기 형질전환된 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CYP105P2 효소는 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입시키고, 특히 벤젠링 화합물에 펜타하이드록시기를 도입시키는 기능을 가지고 있어 하이드록시기가 도입된 방향족 화합물의 제조에 유용하다.
싸이토크롬 P450, 7-에톡시쿠마린, 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산, 신나믹 산, 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산

Description

싸이토크롬 Ｐ450 효소 및 이를 코딩하는 유전자{Cytochrome P450 Enzyme and the Gene Encoding the Same}
도 1은 S. peucetius 및 S. avermitilis의 보존된 오페론 5.5kb 부위와 S. peucetius의 CYP105P2를 pET32a 벡터에 클로닝하는 방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 S. peucetius의 CYP105P2,  S. avermitilis의 CYP105P1 (PetD) 및 S. venezulae의 CYP105D6 (PikC)의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 회색박스는 각 종별 독특한 서열을 나타내고, 검은박스는 보존된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 대장균에서 대량발현된 CYP105P2의 SDS-PAGE 사진이다. 레인 1은 대장균 BL21(DE3)/pNP105P2의 세포 파쇄액이며, 레인 2는 분자량 마커이다.
도 4는 본 발명에 따른 CYP105P2에 의한 기질의 전환 메커니즘(7-에톡시쿠마린 →7-하이드록시쿠마린 →시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 CYP105P2에 의해 7-에톡시쿠마린이 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산으로 전환된 것을 보여주는 HPLC 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 CYP105P2에 의해 신나믹산이 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산으로 전환된 것을 보여주는 HPLC 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 CYP105P2에 의해 살리실산이 펜타하이드록시벤조산으로 전환되는 것을 보여주는 HPLC 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 CYP105P2에 의해 벤조산이 펜타하이드록시벤조산으로 전환되는 것을 보여주는 HPLC 결과이다.
도 9는 CYP105P2의 기질결합과 반응산물의 분비활성을 나타낸 것 이다.
도 10은 펜타하이드록시신나믹산의 1H-NMR 분석결과이다.
도 11은 펜타하이드록시신나믹산의 DEPT-NMR 분석결과이다.
도 12는 펜타하이드록시신나믹산의 13C-NMR 분석결과이다.
도 13은 펜타하이드록시신나믹산의 FAB-MASS 분석결과이다.
도 14는 CYP105P2에 의한 기질의 전환 메카니즘을 나타낸 개략도이다.
본 발명은 방향족 링(aromatic ring) 화합물에 하이드록시기(hydroxy group)를 도입하는 기능을 가지는 싸이토크롬 P450 효소(CYP105P2), 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물, 상기 효소 또는 상기 형질전환된 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 방법에 관한 것이다.
싸이토크롬 P450(CYP)은 원형동물, 식물, 동물, 곰팡이, 미생물에 존재하는 단백질 군으로 스트렙토마이세스 속 45개 종에서 CYPs가 발견되었다. 진핵생물의 CYP가 세포막에 부착된 상태인 것과는 반대로, 스트렙토마이세스 속의 CYP는 수용액 상태로 발현되며, 이들 중 극히 일부만의 특성이 알려져 있다. CYP는 대부분의 원핵세균의 기초대사에서 필수적인 것은 아니며, 탄수화물, 테르펜 등의 분해작용에 관여하여 세균에 탄소나 에너지원을 제공한다 (Omura, T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 266:690, 1999).
또한, 스테로이드, 담즙산, 지방산, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 바이오제닉 아민 및 이차대사산물과 같은 세포내에서 생산되는 여러 산물의 산화, 과산화 및 환원 작용에 관여한다.
CYP의 주된 역할은 여러 기질을 단일 산화시키는 것이다. 이 반응에는 산소분자와 NADPH 또는 NADH가 필요하며, 대부분의 세균성 CYP는 NADH로부터 필요한 전자를 얻는다. 이들은 알릴 위치, 이중결합 또는 비활성화된 C-H 결합에 산소원자를 결합시킨다. CYP는 헴-티오레이트를 포함하는 효소를 코딩하며, 주로 마크로라이드 항생제의 생합성 유전자 클러스터에 위치하여, 마크로라이드의 구조적 다양성을 가져오는 프리커서의 입체-특이적 및 부위-특이적 산화를 촉매한다(Lamb, D.C. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 307:610, 2003).
한가지 예로, Streptomyces erythraea 유래의 CYP107A1는 에리쓰로마이신(erythromycin)의 생합성에서 6-데옥시에리쓰로놀라이드(6-deoxyerythronolide) B 를 에리쓰로놀라이드(erythronolide) B로 수산화시키는 역할을 담당한다 (Weber, J.M. et al., Science, 252:114, 1991).
대부분의 스트렙토마이세스 속 CYP450은 7-에톡시쿠마린(7-ethoxycoumarin)에서 7-하이드록시쿠마린(7-hydroxycoumarin) 또는 6,7-디하이드록시쿠마린(6,7-dihydroxycoumarin)을 생산하고, 벤조피렌(benzo(α)pyrene)을 산화시킨다는 보고가 있었다. 그러나, 벤젠 링에 두개 이상의 하이드록시 그룹을 덧붙이는 세균성 P450은 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 S. avermitilis에서 항생물질인 필리핀(filipin) 및 폴리엔(polyene)의 생합성 경로를 담당하는 유전자 부위와 유사성을 가지는, 5.5kb의 유전자 클러스터를 S. peucetius에서 발견하고, 상기 유전자 클러스터중 CYP450을 코딩하는 유전자를 확인한 다음, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질이 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 기능을 가진다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 기능을 가지는 CYP105P2 효소 및 그 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소 또는 상기 형질전환된 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 방향족 링 화합물 에 하이드록시기를 도입하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 CYP105P2 효소를 제공한다. 상기 효소는 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 기능을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 특히, 벤젠 링에 펜타하이드록시기를 도입하는 기능을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 CYP105P2 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 CYP105P2 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, Streptomyces peucetius 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 CYP105P2 효소의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CYP105P2 효소, 상기 형질전환된 미생물 또는 그 파쇄물을 이용하는 것을 특징으로 하는 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방향족 링 화합물은 7-하이드록시쿠마린(7-hydroxycoumarin), 7-에톡시쿠마린(7-ethoxycoumarin) 또는 신나믹산(cinnamic acid)이고, 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하여 수득되는 화합물은 시스- 5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산(cis-5,6,7,8,9-pentahydroxycinnamic acid)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방향족 링 화합물은 벤젠 링(benzene ring) 화합물이고, 상기 벤젠 링 화합물에 펜타하이드록시기(pentahydroxy groups)를 도입하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 벤젠 링 화합물은 벤조산(benzoic acid) 또는 살리실산(salicylic acid)이고, 벤젠 링 화합물에 펜타하이드록시기를 도입하여 수득되는 화합물은 펜타하이드록시벤조산(pentahydroxybenzoic acid)인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1. 코스미드 라이브러리의 구축
S. peucetius ATCC 27952를 TSB 배지에 접종하여 28℃에서 2일동안 배양한 다음, 원심분리로 균체를 모은 후 샘브룩(Sambrook)의 방법으로 염색체 DNA를 분리하였다. 분리한 S. peucetius의 염색체 DNA를 제한효소 Sau3AI으로 절단하여 조각낸 후, pSuperCos1 벡터(Stratagene, USA)를 사용하여 염색체 DNA의 유전자 라이브러리를 구축하였다.
재조합 DNA는 Gigapack III XL 팩키징 익스트렉트(Stratagene Inc., USA)를 사용하여 인비트로 팩키징하였다. 염색체 DNA는 SEQ ID NO: 3과 4의 dnrF 및 SEQ ID NO: 5와 6의 dpsY를 사용한 스크리닝을 통해, 상기 서열을 포함하는 코스미드를 확인하였다.
서열번호 3: 5'-AGG TTT GAG GTG GCC TTG ACG-3'
서열번호 4: 5'-TCC GCG TCA GTT CGC CGG AGG-3'
서열번호 5: 5'-GGA CTG CCG GTG TGC TGT GGT-3'
서열번호 6: 5'CCG GAA CGT TCA TTC GTC GAC-3'
실시예 2. S. peucetius 게놈의 염기서열 결정 및 분석
실시예 1에서 구축된 코스미드의 염기서열을 결정하기 위하여, 우선 S. peucetius 염색체 DNA를 소니케이션하여 샷건 라이브러리를 구축하였다. 실시예 1에서 구축된 여러 코스미드와 상기 샷건방법으로 제작된 2-4kb의 게놈 단편을 이용하여 S. peucetius의 전체 게놈의 염기서열을 결정하였다. 중복되지 않은 모든 단편은 PHRED (Ewing, B. and Green, P., Genome Res., 8:186, 1998) 및 PHRAP (http://www.phrap.org)를 사용하여 정리하였다.
NCBI의 최근 비중복 단백질 데이타베이스를 사용하여 다른 생물에서 가장 유사성 있는 서열을 확인하는 GenBank의 BLAST 써치를 통해 전체 게놈 염기서열을 해석하였다.
실시예 3. CYPs의 동정 및 분석
S. peucetius의 게놈 데이타베이스는 본 발명자들에 의해 처음으로 구축되었 다(http://203.247.223.80). 싸이토크롬 P450은 헴 결합 도메인의 표지인 GXXXCXG를 사용하여 1차 스크리닝하였다. 모든 CYPs의 ORF(open reading frame)는 Glimmer 2.0 (http://www.tigr.org/software/glimmer/)을 사용하여 얻었으며, BLAST를 사용하여 해석하였다. 상기 GXXXCXG 모티브를 가지는 ORF는 I-헬릭스로 예상되는 부위에 높게 보존된 트레오닌을 가지고, K-헬릭스에 보존된 EXXR 모티브를 가지는 ORF로 2차 스크리닝하였다. 상기 세가지 모티브를 모두 포함하는 유전자를 BLAST 써치의 쿼리로 사용하여 검색을 수행하였다. 각 유전자의 아미노산 서열은 GeneDoc프로그램을 이용하여 예측하였다.
상기 방법으로 스크리닝한 S. peucetius의 CYP DNA 염기서열(CYP105P2)은 EMBL GenBank 뉴클레오티드 서열 데이타베이스에 등록번호 AJ605540으로 등록하였다 (서열번호 1).
본 발명의 CYP105P2의 염기서열은 S. avermitilis에서 모듈라 PKS 및 탈수소효소와 클러스터를 이루고, 항진균성 폴리엔(polyene), 필리핀(filipin)의 생합성에 관여하는 CYP105P1(PteC)와 89%의 상동성을 나타내었다 (도 1). 또한, S. peucetius에서도 동일한 PKS와 탈수소효소 상동체가 CYP105P2와 함께 배열되어 있었다.
CYP105P2는 ATG 시작코돈과 TGA 정지코돈을 가지며, 리보솜-부착 부위와 정방향으로 위치하여 존재하였으며, 명확한 I-헬릭스(237AAHDT241), K-헬릭스(276 ELLR279) 및 헴-부착 모티브인 (341FGFGAHQCIG350)을 가지고 있어 싸이토크롬 P450인 것을 알 수 있다 (도 2). CYP105P2의 염기서열에 의해 변환된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 나타내었다.
실시예 4. 재조합 플라스미드의 제작 및 형질전환
NdeI 절단부위를 포함하도록 제작된 SEQ ID NO: 7의 프라이머와 KpnI 절단부위를 포함하도록 제작된 SEQ ID NO: 8의 프라이머를 사용하여 S. peucetius의 게놈에서 CYP105P2유전자를 PCR로 증폭시켰다. 사용한 PCR 조건은 94℃에서 변성, 65℃에서 어닐링, 74℃에서 신장시켰으며, 2.5 유니트의 Taq-DNA 폴리머레이즈, 10% 디메틸설폭사이드, 2.5pmol의 상기 프라이머, 0.2mM dNTP 및 0.1㎍의 게놈 DNA를 적정 버퍼에 녹여 50㎕로 맞추어 사용하였다.
서열번호 7: 5'-AGA CATATG TCCCAGCCCACCG-3
서열번호 8: 5-TCA GGTACC AAGGAGCACCGTCGG-3
PCR 결과, 1200bp의 CYP105P2가 증폭되었으며, 상기 증폭된 CYP105P2(1200bp)를 pET32a 발현벡터(Novagen, USA)의 NdeI 및 KpnI 부위에 클로닝하여 플라스미드 pNP105P2를 제작하였다. 상기 제작된 pNP105P2를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pNP105P2를 수득하였다.
실시예 5. CYP105P2의 대장균에서의 발현
대장균 BL21(DE3)/pNP105P2에 의해 발현되는 재조합 CYP105P2는 수용성 형태로 발현되며, 0.4mM IPTG에 의해서 대량발현이 유도되었다. 3㎕/ml의 암피실린이 포함된 3ml의 LB 배지에 플라스미드 pNP105P2로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 접종하여 하룻밤 배양하였다. 50㎍의 암피실린이 첨가된 50ml의 새로운 LB배지에 상기 배양액을 옮겨 37℃에서 600nm에서 OD값이 0.6이 될때까지 배양한 후, IPTG 0.4mM을 첨가하고 20℃에서 37시간동안 재배양하여 CYP105P2의 발현을 유도하였다. 원심분리를 통해 균체를 얻은 후, 냉각된 50mM 트리스/HCl(pH7.5) 용액으로 두번 세척하였다. 균체를 초음파로 파쇄하고, 원심분리한 다음, 상층액의 시료를 채취하여 전기영동하였다. 표준 분자량 마커(Novagen Co., USA)를 사용하여 전기영동한 결과, 발현된 CYO105P2의 분자량은 약 44kDa이었다 (도 3).
실시예 6. CYP105P2 효소의 활성 측정
싸이토크롬 P450(CYP105P2)의 활성을 측정하기 위하여, 100㎕의 반응액[5mM 트리스/HCl(pH7.5), 1mM의 기질(7-에톡시쿠마린 또는 7-하이드록시쿠마린), 1.25mM NADH 및 30㎕의 세균추출액 및 50㎕ 증류수]을 37℃에서 24시간 반응시켰다. 그후, 1 ml의 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 4℃, 33,172×g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, DMSO에 펠렛을 녹였다.
이와 유사하게, in vivo 시스템에서의 생화학적 전환을 관찰하기 위하여, 실시예 3과 같은 방법으로 대장균 BL21(DE3)/pNP105P2을 배양하여 CYP105P2의 발현을 유도하고, 10분 후에 50ml의 배양액에 1mM의 기질을 첨가한 다음, 20℃에서 48시간 배양하였다. 100㎕의 배양 상층액에 1ml의 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 상기와 같은 후처리를 실시하였다.
상기 반응액에서 반응산물을 분리하기 위하여, 실리카겔 60 (70-230 메쉬 ASTM)으로 충진된 칼럼을 사용하였다. 상기 칼럼크로마토그래피는 헥산과 에틸아세테이트를 전개용매로 사용하여 여러 분획을 얻을 수 있었으며, 3:2/헥산:에틸아세테이트 용매를 이동상으로 사용하여 TLC를 수행하였다. 또한, Mightysil, RP-18 칼럼을 사용하여 역상 HPLC를 수행하여, 254nm에서 기질의 생화학적 전환을 분석하였다. 기질과 생성물은 유속 1ml/분으로 메탄올:아세토니트릴:물(3.5:3:3.5) 용매를 이동상으로 하여 분리하였다.
HPLC 분석결과, in vitro 시스템에서는 7-에톡시쿠마린과 7-하이드록시쿠마린으로부터 같은 반응산물인 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산을 생성되었다 (도 4 & 도 5). 많은 문헌에서 7-에톡시쿠마린의 디에틸레이션이 보고되었지만, 7-에톡시쿠마린을 기질로 사용한 in vivo 분석에서 7-하이드록시쿠마린이 발견되지 않았다 (Sarialani F.S. et al., Appl. Environ. Micrbiol., 46:468, 1983). 그러나, in vitro 분석에서는 디에틸레이션에 의한 7-하이드록시쿠마린의 형성이 관찰되었다.
한편, 상기 두 기질(7-에톡시쿠마린과 7-하이드록시쿠마린)은 37℃에서 4시간 이상 반응시켰을 때 효소와 효과적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다. 그러므로, 4시간 이내에는 확연한 반응산물의 형성을 관찰할 수 없었으며, 24시간 동안 반응시켰을 때 기질이 완전하게 전환되었다. 또한, CYP105P2 효소활성에 있어서, NADH가 중요한 역할을 하였다. 즉, CYP105P2가 지질을 완전하게 전환시키는데 NADH가 필수적이었다.
신나믹산을 기질로 사용하여 동일한 반응을 수행한 결과, 3가지의 다른 산물을 얻어졌으며, 그 중 주요한 산물은 7-에톡시쿠마린의 반응산물과 같은 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산이었다 (도 6) .
또한, 벤조산 및 살리실산을 기질로 사용하여 동일한 반응을 수행한 결과, 펜타하이드록시벤조산이 생성되는 것을 확인할 수 있었다 (도 7 및 도 8).
결국, 본 발명에 따른 싸이토크롬 P450(CYP105P2)은 7-에톡시쿠마린, 7-하이드록시쿠마린 및 신나믹산을 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산으로 전환시키고, 벤조산 및 살리실산을 펜타하이드록시벤조산으로 전환시키는 활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7. CYP105P2 효소의 기질 결합 스펙트럼
세균, 세포질 및 막 분획에 포함된 싸이토크롬 P450을 분광광도계를 사용하는 extinction coefficient(91mM/cm)를 사용한 오무라의 방법으로 정량하였다(Omura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 266:690, 1999). 기질결합 스펙트럼은 세포질에서 발현되는 CYP105P2를 시료큐벳에 분주하여 스플리트 셀(split cell) 방법으로 측정하여 얻었다. 대조군 큐벳과 시료 큐벳은 모두 측정용액[글리세롤:50mM 트리스/HCl(pH7.5)=1:8, 0.5mM~5mM의 기질(7-에톡시쿠마린, 에리쓰로마이신, 올랜도마이신(oleandomycin) 및 클로람페니콜)]을 포함하고 있었다. 100㎕의 CYP105P2 세포파쇄액을 시료큐벳에 첨가하고, 350nm 및 500nm에서 스펙트럼을 측정하였다. 상기 결합 스펙트럼을 통해 약물대사에서의 CYP105P2의 역할을 분석할 수 있다.
올랜도마이신 및 에리쓰로마이신을 사용한 효소측정은 반응액 100㎕[200mM 트리스/HCl(pH7.5), 5mM 기질, 1.25mM NADH, 5㎕, 페레독신, 5㎕의 페레독신 환원효소 및 30㎕의 CYP105P2]를 사용하였다.
기질의 생물학적 전환정도는 TLC와 LC-Mass로 측정하였다. TLC는 EtOAC:MeOH:암모니아(1:2:0.1) 용액으로 전개하였다.
그 결과, 2.5mM의 올랜도마이신 및 클로람페니콜은 138㎍/ml의 CYP105P2에 의해 대사되었다 (도 9). 2.7mM의 7-에톡시쿠마린과 1.5mM의 에리쓰로마이신 또한 같은 농도(138㎍/ml)의 CYP105P2에 의하여 대사되었다.
실시예 8. 반응산물의 구조분석
시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산과 펜타하이드록시벤조산의 구조를 밝히기 위하여 NMR과 질량분석(mass spectroscopy)을 행하였다. 또한 높은 해상도의 FAB-MASS(fast atom bonbarment mass spectroscopy)를 수행하였으며, KBr 디스크의 순수시료로부터 IR 스펙트라(Bio-Rad 모델 FT3000MX FT-IR)를 얻었다. 모든 NMR 데이터는 DMSO-d6로 기록하였다. DMSO-d6에서 시료의 1H-NMR은 ppm5.5(d, 1H-H2), 7.4(d, 1H, H-3)이었으며(도 10), 이는 두개의 탄소원자와 두개의 양자의 존재를 나타낸다. 또한, DEPT-NMR에서 두개의 수소원자의존재를 확인하였다 (도 11). DMSO-d6에서 13C-NMR로 탄소원자의 개수와 이들의 위치를 확인하였다 [C(1) 165.2ppm, C(2) 100.9ppm, C(3) 142.9 ppm, C(5)(9) 138.4 ppm, C(7) 129.1 ppm, C(6)(8) 126.7 ppm] (도 12). 상기 결과는 시료에 9개의 탄소원자가 존재한다는 것을 나타낸다. FAB-MASS 스펙트럼은 도 13에서와 같이 반응산물 성분의 단편화 패턴을 나타내었다. FT-IR 스펙트럼에서는 C=C 이중결합(1415cm-1), 페놀릭 하이드록시 그룹, 카르복실 그룹(2955-3554 cm-1의 넓은 밴드) 및 카르보닐 그룹(1563 cm-1)을 확인할 수 있었다.
결국, CYP105P2에 의한 7-에톡시쿠마린 및 7-하이드록시쿠마린의 전환에 의해 생성된 물질은 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산이라는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 도 14에 나타난 바와 같이, 7-에톡시쿠마린은 7-하이드록시쿠마린을 거쳐 최종적으로 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산으로 전환된다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 기능을 가지는 싸이토크롬 P450 효소(CYP105P2), 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물, 상기 효소 또는 상기 형질전환된 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 CYP105P2 효소는 7-에톡시쿠마린, 7-하이드록시쿠마린 및 신사믹산을 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산으로 전환시키거나, 벤조산 및 살리실산을 펜타하이드록시벤조산으로 전환시키거나, 또는 다른 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입시키는데 유용하다. 또한, 본 발명에서 제공되는 유전자 염기서열의 전체 또는 일부의 변형을 통하여 기존의 필리핀, 폴리엔 등의 생산성 증가를 기하거나, 필리핀, 폴리엔 등의 변이체를 제조하는데 이용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 CYP105P2 효소.
  2. 제1항에 있어서, 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 기능을 가지는 것임을 특징으로 하는 CYP105P2 효소.
  3. 제2항에 있어서, 벤젠 링에 펜타하이드록시기를 도입하는 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 CYP105P2 효소.
  4. 제1항의 CYP105P2 효소를 코딩하는 유전자.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  6. 제4항에 있어서, Streptomyces peucetius 유래인 것을 특징으로 하는 유전자.
  7. 제4항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
  8. 제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
  10. 제8항의 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 CYP105P2 효소의 제조방법.
  11. 제1항의 CYP105P2 효소, 제8항의 형질전환된 미생물 또는 그 파쇄물을 이용하는 것을 특징으로 하는 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 방향족 링 화합물은 7-하이드록시쿠마린, 7-에톡시쿠마린 또는 신나믹산이고, 방향족 링 화합물에 하이드록시기를 도입하여 수득되는 화합물은 시스-5,6,7,8,9-펜타하이드록시신나믹산인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 방향족 링 화합물은 벤젠 링 화합물이고, 상기 벤젠 링 화합물에 펜타하이드록시기를 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 벤젠 링 화합물은 벤조산 또는 살리실산이고, 벤젠 링 화합물에 펜타하이드록시기를 도입하여 수득되는 화합물은 펜타하이드록시벤조산인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, NADH를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
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