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CN101580821B - 用于制备抗癌药物靛玉红的2-萘酸单加氧酶 - Google Patents

用于制备抗癌药物靛玉红的2-萘酸单加氧酶 Download PDF

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CN101580821B CN2009100367185A CN200910036718A CN101580821B CN 101580821 B CN101580821 B CN 101580821B CN 2009100367185 A CN2009100367185 A CN 2009100367185A CN 200910036718 A CN200910036718 A CN 200910036718A CN 101580821 B CN101580821 B CN 101580821B
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Abstract

本发明公开了一种2-萘酸单加氧酶及其突变体，以及其在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用。本发明通过实验证明2-萘酸单加氧酶能够催化吲哚产生靛玉红，本发明还通过实验证明经过分子改良的2-萘酸单加氧酶突变体也能生物催化制备靛玉红，且其催化效率比野生型2-萘酸单加氧酶高，突变体的催化效率比野生型高2-4倍。本发明主要用于生物制备抗癌药物靛玉红。

Description

用于制备抗癌药物靛玉红的2-萘酸单加氧酶
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种2-萘酸单加氧酶在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用，及其经过分子改良的2-萘酸单加氧酶突变体在生物催化制备靛玉红中的应用。
背景技术：
最近研究证实：很多疾病，包括癌症、糖尿病、炎症是由于细胞信号传导中蛋白激酶紊乱引起的，临床药物治疗中，药物作用定位于信号传导的各个靶位点：癌症抑制蛋白pRb的CDK介导的磷酸化是有丝分裂周期G1期中必须的，很多人类癌症就是因为癌症抑制蛋白pRb及其调节出现了紊乱。因此，环化激酶CDK促进因子成为癌症治疗的有效药物。靛玉红是传统中药中治疗白血病“龙回丸”中药配方中当归所含的小分子成分，体外实验中对CDK有很明显的促进作用，在中医中用于治疗急性白血病，对核质变化紊乱引起疾病治疗效果很好，近年来在美国和日本的临床治疗中发现：靛玉红对类风湿性关节炎治疗和几种人类肿瘤细胞的生长抑制有明显的作用。
美国食品与药品监督局要求制药公司在新药的两种异构体有明显的药效和毒理作用差异时，必须以光学纯的药品形式上市。目前，靛玉红主要从板蓝根，大青叶等一些植物中药中提取获得的，但是中药中靛玉红的含量为＜3mg/g，制品含量低于90％，并且化学提取的步骤繁琐，成本比较高，药品纯度难以满足市场需求。
近年来，有机化学品的生物催化方法因其对环境友好，在制药和化学工业中需求越来越大。生物催化化学物质转换已经受到广泛重视，它是替代传统的化学合成有效方法，同时有利于解决合成过程中出现的难题。有机合成中，生物催化专一性强，反应条件温和。酶的手性催化有立体和结构域的特异性，其反应速度快、酶的底物范围广；同时，通过酶基因工程，可以进一步改善酶的稳定性、提高反应底物特异性、甚至改变其映像专一性。采用生物技术手段，改变酶分子结构，给传统生物催化带来了机遇和挑战。采用生物催化，可以合成复杂的大分子，同时生产过程对环境友好，天然的酶和改造的酶都可以通过DNA重组技术在适当的宿主内大量生产，因此，化学合成中酶的应用给化学和制药工业的进步带来了巨大的机会。
本发明申请人在生物基因工程研究中，提出一种制备降解2-萘酸活性的DNA片段的方法：从2-萘酸降解菌伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.JT1500)菌株中提取总DNA，经限制性内切酶部分水解，得到DNA片段，将其连接到pUC18载体并转化大肠杆菌HB101获得含有一段8050bp长度的，上有2-萘酸单加氧酶基因簇和辅酶A连接酶基因的DNA片段，上述序列已经在CN1618971A公开，并且该专利文件的序列表中的序列1中的第2793-3951位的1158bp的核苷酸序列为2-萘酸单加氧酶基因，编码的2-萘酸单加氧酶如该份专利文件的序列表的序列2所示。
本发明申请人(2-萘酸单加氧酶基因(nmo)的克隆及表达，方向平，丘晓颖，岑英华，孙国萍，微生物学报，第43卷第5期，第599～605页，2003年10月)通过酶切连接将Burkholderia sp.JT1500的一段DNA片段(4802bp)亚克隆到载体pUC18上，得到了重组子pEK123，测序后的pEK123重组子4802bp插入片段的序列已经登陆公开于欧洲EMBL基因库，序列号为AJ566333，该片段是上述专利文件公开的8050bp中的最前面的4802序列，该序列含有编码黄素还原酶NmoB和2-萘酸单加氧酶NmoA的碱基序列，其中从重组子pEK123中PCR扩增出的上述专利公开的1158bp的2-萘酸单加氧酶基因(在EMBL基因库接受号为AJ566333的序列的2793-3951位)编码的酶是含黄素还原酶的单加氧酶家族(FMO)中的一个新成员，与其他已登录的单加氧酶基因序列同源性较低，是一个新的单加氧酶，该基因编码的酶能对2-萘酸发生加氧转化。李小波和岑英华(2-萘酸单加氧酶基因及NADH：黄素还原酶基因的克隆分析，李小波，岑英华，孙国萍，微生物学报，第45卷第4期，第557～560页，2005年8月)研究发现该2-萘酸单加氧酶能够催化吲哚产生靛蓝。
发明内容：
本发明人通过对重组子pEK123的DNA片段进一步的研究，发现了另外一个开放阅读框，该开放阅读框位于pEK123的重组DNA片段上，EMBL基因库中AJ566333序列的2579-3892位，共1314bp，编码437个氨基酸，并且发现该开放阅读框编码的酶能够催化吲哚产生靛玉红，证明其是一个具有功能的基因，该开放阅读框与本发明人团队以前发现2-萘酸单加氧酶基因具有部分重叠序列。
因此本发明的目的是提供了一种能够催化吲哚产生靛玉红的2-萘酸单加氧酶及其编码基因，还提供了以该2-萘酸单加氧酶为基础衍生的，经过分子改良的、氨基酸序列发生功能性突变的2-萘酸单加氧酶突变体及其在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用。
本发明所述的能够催化吲哚产生靛玉红的2-萘酸单加氧酶的基因序列如SEQ1所示，其氨基酸如SEQ2所示。
本发明通过以下方案证明2-萘酸单加氧酶能够生物催化吲哚制备抗癌药物靛玉红：
(a)从来自Burkholderia sp.JT1500的2-萘酸单加氧酶基因簇(长度为4802bp序列号为AJ566333)的pUC18克隆重组子pEK123上克隆出2-萘酸单加氧酶基因片段。
(b)将2-萘酸单加氧酶基因片段与表达载体pET22b(+)连接。
(c)将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达。
(d)细菌超声波破碎后，提取2-萘酸单加氧酶，纯化目标蛋白，纯化后的酶经过验证具有催化吲哚生成抗癌药物靛玉红的能力。
本发明还证明含有2-萘酸单加氧酶的编码基因，能表达该酶的全细胞具有催化吲哚产生抗癌药物靛玉红的能力。
本发明以2-萘酸单加氧酶为基础衍生的，经过分子修饰的，引起氨基酸序列发生功能性突变的2-萘酸单加氧酶突变体具有生物催化制备抗癌药物靛玉红的能力。
其修饰步骤如下：
(a)从来自Burkholderia sp.JT1500的2-萘酸单加氧酶基因簇(长度为4802bp序列号为AJ566333)的pUC18克隆重组子pEK123上克隆出2-萘酸单加氧酶基因片段。
(b)通过易错PCR(error-prone PCR)介导的随机突变和DNA重组技术(DNA shuffling)等分子改良、筛选获得突变体基因。
(c)表达2-萘酸单加氧酶突变体基因，该基因编码的2-萘酸单加氧酶突变体能够催化吲哚产生抗癌药物靛玉红。
所述的修饰的2-萘酸单加氧酶突变体是在第118，201，245三个位点中任意和组合位点的氨基酸序列有功能性突变。
本发明证实以2-萘酸单加氧酶为基础，在201位由Phe突变为Ile，而衍生的经过修饰的2-萘酸单加氧酶突变体具有生物催化制备抗癌药物靛玉红中的能力，命名为2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile，其序列如SEQ3所示。
本发明还证实以2-萘酸单加氧酶为基础，在201位由Phe突变为Ile，245位由Trp突变为Ser，而衍生的经过修饰的2-萘酸单加氧酶突变体具有生物催化制备抗癌药物靛玉红中的能力，命名为2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser，其序列如SEQ4所示。
本发明还证实以2-萘酸单加氧酶为基础，在201位由Phe突变为Ile，245位由Trp突变为Ser，118位由Leu突变为Ala，而衍生的经过修饰的2-萘酸单加氧酶突变体具有生物催化制备抗癌药物靛玉红中的能力，命名为2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser/Leu118Ala，其序列如SEQ5所示。
本发明还证实含有上述含有酶突变体的编码基因，表达酶突变体的全细胞也能生物催化制备抗癌药物靛玉红。
本发明是通过反相高效液相色谱和光谱扫描测定验证靛玉红的产生。
本发明的2-萘酸单加氧酶能够催化吲哚产生靛玉红，从而为利用2-萘酸单加氧酶进行靛玉红生物转化，通过2萘酸单加氧酶基因重组大肠杆菌生物催化抗癌药物靛玉红的手性合成，实现酶法全细胞转化，生产品质优良，纯度高，手性合成效率高抗癌药物靛玉红提供了途径，生物催化制备具有反应条件温和，转化率高等优点，大大降低了靛玉红的生产成本。该2-萘酸单加氧酶催化效率(Kcat/Km值)为238M-1S-1，本发明还通过易错PCR和DNA shuffling技术制备了2-萘酸单加氧酶突变体基因，该突变体基因编码的2-萘酸单加氧酶突变体能够催化吲哚产生靛玉红：所述的2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile，酶催化效率(Kcat/Km值)为777M-1S-1；所述的2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser，酶催化效率(Kcat/Km值)为819(M-1S-1)；所述的2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser/Leu118Ala，酶催化效率(Kcat/Km值)为909M-1S-1，由此可见本发明构建的2-萘酸单加氧酶突变体不但具有催化吲哚产生靛玉红的能力，而且其产率也比野生型的提高了2-4倍。
表1 2-萘酸单加氧酶催化吲哚产生靛玉红反应动力学参数
  蛋白酶   Kcat/Km(M-1S-1)
  2-萘酸单加氧酶   238
  2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile   777
  2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser   819
  2-萘酸单加氧酶突变体-Phe201Ile/Trp245Ser/Leu118Ala   909
附图说明：
图1是蛋白的SDS-PAGE图谱，其中CK：转入空载体p ET22b(+)的大肠杆菌E coli BL21(DE3)，T：重组p ET22b(+)-nmoA大肠杆菌E coli TOP10，B：重组p ET22b(+)-nmoA大肠杆菌E coli BL21(DE3)，其中1，2，3代表不同的克隆子，M：Marker蛋白质分子量标准KDa，Nmo：纯化的2-萘酸单加氧酶；
图2是靛玉红标样的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；
图3是靛玉红标样的光谱扫描图；
图4是靛蓝标样的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；
图5是靛蓝标样的光谱扫描图；
图6是提纯的2-萘酸单加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；
图7是提纯的2-萘酸单加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的光谱扫描图；
图8是2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；
图9是2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的光谱扫描图；
图10是PCR产物的电泳图，其中1，2：2-萘酸单加氧酶基因簇重组子pEK123；3，4：PCR1(error-prone PCR)的产物；5，6，7，8：PCR1(error-prone PCR)产物经DNAaseI酶切后的产物；9-14：PCR2(自身引物PCR)的产物；M：DNAMarker(DL3000)；
图11是PCR产物的电泳图，其中1-3：p ET22b(+)-nmoA*，4-9：PCR3产物nmoA*；M：DNAMarker(DL3000)；
图12是野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶催化吲哚的上清液提取物光谱扫描图；
图13是突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化吲哚的上清液提取物光谱扫描图；
图14是可见光分光光度光谱分析图，其中1：色氨酸(底物)，2：吲哚(底物)，3：吲哚满二酮(中间体)；4：野生型pET22b(+)-nmoA重组的大肠杆菌催化吲哚后的发酵液萃取产物；5：靛玉红标样(2，3′-羟基吲哚)；6：突变型pET22b(+)-nmoA*重组的大肠杆菌催化吲哚后的发酵液萃取产物；7：靛蓝标样(2，2′-羟基吲哚)；
图15是蛋白SDS-PAGE电泳图，其中B是没有转入载体的大肠杆菌BL21(DE3)，B-22是带有空载体pET(22b+)的大肠杆菌BL21(DE3)，Bm是转入载体pET22b(+)-nmoA*(突变体)的大肠杆菌BL21(DE3)，Bw是转入载体pET22b(+)-nmoA(野生型)的大肠杆菌BL21(DE3)；M：蛋白Marker；
具体实施方式：
实施例1
(1)克隆2-萘酸单加氧酶基因。
以从来自Burkholderia sp.JT1500的2-萘酸单加氧酶基因簇(长度为4802bp序列号为AJ566333)的pUC18克隆重组子pEK123为模板，PCR扩增2-萘酸单加氧酶基因簇中2-萘酸单加氧酶nmoA片段。
根据EMBL基因库中接受号为AJ566333的序列，设计引物扩增该序列的2579-3892位的碱基，共1314bp，由于本发明需要利用His-tag标记的表达载体pET22b(+)，融合表达目的蛋白，因此去掉了该基因的TAA终止子，即扩增了该序列的2579-3889位的碱基，共1311bp。
其引物序列为：
引物：上游引物AF5＞TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG＜3引入酶切位点NdeI
下游引物AR5＞CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG＜3引入酶切位点HindIII
反应体系：
10×buffer   10μl；
10nM dNTP    2μl；
PfuTaq       2μl；
10nMAF       2μl；
10nMAR     2μl；
模板DNA    2μl；
超纯水     80μl；
反应的酶为上海生工Pfu DNA Polymerase(B0093)
PCR扩增条件：95℃变性5分钟(min)后；在95℃1min，57℃1min，72℃2min；经过30个循环，然后72℃延伸10min，12℃终止反应。
(2)2-萘酸单加氧酶基因nmoA与pET22b(+)连接
扩增的PCR产物2-萘酸单加氧酶基因nmoA，用上海生工UNlQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(SK1131)回收1311bp大小片段(经克隆、测序分析，其序列位于AJ566333序列的2579-3889位即SEQ1中的1-1311位，由于需要利用His-tag标记的表达载体pET22b(+)，融合表达目的蛋白，因此去掉了该基因的TAA终止子)，然后采用NdeI和HindIII双酶切后，与经过同样酶切后的线性质粒p ET22b(+)连接：酶切体系50μl：载体pET22b(+)或目标基因nmoA各10μl(0.1----1μg)，分别加NdeI和HindIII(10U/μl)1μl，，10×buffer 5μl，超纯水补足至50μl，37℃2---8小时双酶切。连接体系20μl：酶切产物pET22b(+)/NdeI+HindIII，nmoA/NdeI+HindIII各5μl等摩尔混合，T4DNA连接酶(1swiss/μl)1-2μl，10×连接buffer2μl，超纯水补充至20μl。16℃，连接1---12小时。
(3)连接产物转化到大肠杆菌E coli BL21(DE3)
连接产物转化大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)感受态细胞(如果效率低可以采用大肠杆菌TOP10预先转化，阳性克隆连接载体再转化E coli BL21(DE3)感受态细胞)，涂布到涂有IPTG与X-gal的的氨苄(100μg/.ml)LB琼脂平板上，37℃过夜培养。
(4)阳性克隆筛选
从上述过夜培养的平板上挑取白色的克隆，并转接到1ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液的96微孔板中培养24小时，离心取兰色菌体细胞，用DMF(二甲基甲酰胺)萃取兰色物质，在610nm与540nm处测定其光吸收值，筛选出540nm处光吸收值高的重组大肠杆菌克隆。
(5)2-萘酸单加氧酶纯化
挑取540nm光吸收值高的重组大肠杆菌单克隆接种到5ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液，37℃过夜培养；然后扩大接种到100ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液中，接种量0.5％～5％，培养基pH6.0～8.5，摇床转速为80～200转/分钟(rpm)，37℃，当OD600达到0.5～0.7时加入IPTG(终浓度0.5～1.0μM)28℃低温诱导，继续培养24～48小时，培养液以3000～12000rpm，4℃离心，去除上清夜，收集离心后的细胞，悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，在冰浴条件下超声波破菌(或高压)5分钟，再用8000～12000rpm，4℃离心5～15分钟，得到含有2-萘酸单加氧酶的细胞破碎液。
经过大肠杆菌诱导表达的2-萘酸单加氧酶的细胞破碎液，采用TOYOBO公司的NPK7蛋白纯化试剂盒纯化：NPK7蛋白纯化试剂盒MagExtractor-His-tag是主要用于纯化大肠杆菌中进行表达的His-tag融合蛋白质的试剂盒。添附的磁珠是与镍螯合的琼脂糖磁珠，与His-tag的选择性结合能力非常出色，能够从菌体破碎液中直接纯化His-tag融合蛋白质。
使用组氨酸tag(His-tag)进行纯化的方法，是利用了在组氨酸侧链位置处的唑环和金属离子(Ni2+等)相螯合的性质，可以使由基因重组技术制备的His-tag蛋白质的纯化效率大大提高。研究中，我们采用p ET22b(+)为载体诱导表达2-萘酸单加氧酶，经过表达的2-萘酸单加氧酶与载体pET22b(+)中组氨酸tag(His-tag)融合，融合蛋白纯化步骤参照TOYOBO公司的NPK7蛋白纯化试剂盒说明书。
经过诱导表达的pET22b(+)-nmoA，其体内蛋白及体外纯化蛋白SDS-PAGE的图谱见图1，由图1可以看出CK即为转入空载体pET22b(+)的大肠杆菌未表达2-萘酸单加氧酶，而转入pET22b(+)-nmoA的大肠杆菌表达了2-萘酸单加氧酶，经过提纯得到蛋白经过SDS-PAGE验证其大小合适，可以推断纯化的蛋白为2-萘酸单加氧酶。
(6)2-萘酸单加氧酶催化吲哚产生靛玉红。
纯化后2-萘酸单加氧酶(浓度2mg/ml)1ml，加入250μl的浓度为100nM吲哚溶液，37℃温浴6小时，10ml氯仿提取色素，热浴蒸干溶剂，得到紫红色的粉状物，将提取物经过反相高效液相色谱和光谱扫描分析测定。
本次测定的标样靛蓝与靛玉红由中国生物药品制品研究所提供，检测方法是反相高效液相色谱和光谱扫描分析。
光谱扫描分析测定是参照中国药典2005年版的测定方法。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)的条件及参考文献如下：
RP-HPLC采用Hyperclone C18柱，以0.1％H3PO4∶甲醇(30∶70)为流动相，流速0.9ml/min，检测波长292nm，检测温度为30℃，仪器：岛津LC-20A型高效液相色谱仪。
参考文献：
(刘晓芳，程弘.板蓝根质量检测应增加靛玉红、靛蓝检验项目[J].中国药品标准，2002年3月第二卷：32-33：
王燕桓，刘国瑞等.RP-HPLC法测定板蓝根浸膏中靛蓝、靛玉红的含量.河北大学学报(自然科学版)2005年9月第25卷第5期：507---509；
李莉，曹贺.反相高效液相色谱法测定锡类散中靛蓝及靛玉红的含量.时珍国医国药.2006年第17卷第5期725-726。)
本次测定的图2是靛玉红标样RP-HPLC的图谱，图3是靛玉红标样的光谱扫描图谱，图4是靛蓝标样的RP-HPLC的图谱，图5是靛蓝标样的光谱扫描图谱，图6是提纯的2-萘酸单加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；图7是提纯的2-萘酸单加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物的光谱扫描图；由图6与图2，4，图7与图3，5比较可知，图6和图7存在靛玉红的保留时间一致，在同一个位置出现的吸收峰，因此可以证明纯化的2-萘酸单加氧酶催化吲哚后的氯仿提取物含有靛玉红，从而证明2-萘酸单加氧酶能催化产生靛玉红。
以标样靛玉红(中国药品生物制品检定所提供)做浓度和光吸收的标准曲线，测定OD540nm处吸收，计算野生型的pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶，该2-萘酸单加氧酶催化效率(Kcat/Km值)为238M-1S-1
(7)含有2-萘酸单加氧酶的全细胞催化吲哚产生靛玉红。
挑取540nm光吸收值高的重组pET22b(+)-nmoA大肠杆菌E coli BL21 DE3单克隆接种到5ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液，37℃过夜培养；而后接种到100ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液中，接种量0.5％～5％，培养基pH6.0～8.5，摇床转速为80～200转/分钟(rpm)，37℃培养当OD600达到0.5～0.7时加入IPTG(终浓度0.5～1.0μM)28℃低温诱导，继续培养24～48小时，培养液以3000～12000rpm，4℃离心，去除上清夜，收集离心后的细胞，悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，以3000～12000rpm，4℃离心，去除上清夜，菌体细胞加入1000μl的浓度为100nM吲哚溶液，37℃温浴6小时，用8000～12000rpm，4℃离心5～15分钟，得到含有2-萘酸单加氧酶的细胞，10ml氯仿萃取色素，真空旋转，蒸干溶剂，得到紫红色的粉状物，经过反相高效液相色谱分析测定和光谱扫描测定。以未转入载体的大肠杆菌E coli BL21(DE3)和转入空载体p ET22b(+)的大肠杆菌E coli BL21DE3作为对照。
图8是2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的反相高效液相色谱RP-HPLC图谱；图9是2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物的光谱扫描图；图8与图2，4，图9与图3，5比较可知，图8，图9存在与标样靛蓝、靛玉红的保留时间一致，在同一个位置出现的吸收峰，因此可以证明2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆催化吲哚后的氯仿提取物含有靛玉红，未转入载体的大肠杆菌E coli BL21(DE3)和转入空载体p ET22b(+)的大肠杆菌E coli BL21 DE3，都没有红色或者蓝色色素的产生，没有检测到靛玉红及靛蓝，而从而证明2-萘酸单加氧酶重组大肠杆菌克隆能催化吲哚产生靛玉红。
实施例2
(1)2-萘酸单加氧酶基因分子体外定向进化技术和DNA shuffling过程(A1)进行第一步易错PCR1(error-prone PCR)
以从来自Burkholderia sp.JT1500的2-萘酸单加氧酶基因簇(长度为4802bp序列号为AJ566333)的pUC18克隆重组子pEK123为模板，在长度为4802bp的2-萘酸单加氧酶基因簇(AJ566333)上2579---3982bp位置处设计特异性引物。
引物：上游引物AF5＞TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG＜3引入酶切位点NdeI
下游引物AR5＞CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG＜3引入酶切位点HindIII
PCR反应体系：(100μl体系)上海生工Pfu DNA Polymerase(B0093)：
10×buffer                          10μl，
5mM MnCl2                           2μl
10nmdNTP                            2μl，
Pfu DNA Polymerase                  2μl，
10nmPrimersAF                       2μl，
10nmPrimers AR                      2μl
模板(Burkholderia sp.JT1500的总DNA) 2μl
超纯水                              78μl
PCR扩增条件：95℃变性5分钟(min)后；在95℃1min，57℃1min，72℃2min经过30个循环；然后72℃延伸10min，12℃终止反应。
经过琼脂糖电泳鉴定(图10)，扩增获得PCR产物2-萘酸单加氧酶基因片段nmoA，用上海生工UN1Q-10柱式DNA胶回收试剂盒(SK1131)回收1311bp大小片段的PCR1产物。然后用DNAaseI不完全酶切(降解)PCR1产物，DNAaseI酶切条件：3～4μg模板片段，0.01UDNase I，15℃8min，回收10-50bp碎片段，90℃灭活，冰乙醇+醋酸钠回收，70％乙醇洗涤，晾干，TE溶解保存。
(A2)无引物(自身引物)进行第二步PCR2
以第一步PCR1酶切得到的10～50bp碎片段的自身为模板，进行无引物PCR2反应体系：
10×buffer             10μl
10nmdNTP               2μl
Pfu DNA Polymerase     2μl
易错PCR的酶切回收产物  10μl
超纯水                 76μl
反应参数：
94℃变性5min，
94℃45s；
45-56℃45s；
72℃90s；进行50个循环
72℃延伸10min。
得到无引物PCR产物，其电泳图参见图10。
(A3)采用带酶切位点的特异性引物进行第三步PCR3得到目标大小产物，
引物：上游引物AF5＞TTATCATATGATGCGGCGGCATTCG＜3引入酶切位点NdeI
      下游引物AR5＞CTCTGAAG CTTCTGCGGCTTGTG＜3引入酶切位点HindIII
PCR的反应体系
10×buffer           10μl，
5mM MnCl2            2μl，
10nmdNTP             2μl，
Pfu DNA Polymerase   2μl，
10nmPrimersAF/AR     2μl，/2μl
模板(无引物PCR产物)  2μl
超纯水               78μl
PCR扩增条件：95℃变性5min后，在95℃1min，57℃1min，72℃2min，经过30个循环，然后72℃延伸10min，12℃终止反应，获得PCR产物，其电泳图参见图11。
(2)pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌的构建
步骤(1)A3步骤获得的PCR3产物用上海生工UN1Q-10柱式DNA胶回收试剂盒(SK1131)回收1311bp大小的2-萘酸单加氧酶突变体nmoA*片段的产物，采用NdeI和HindIII双酶切后，与经过同样酶切后的线性质粒载体pET22b(+)连接，构建片段pET22b(+)-nmoA*。
酶切体系50μl：载体pET22b(+)或PCR产物nmoA*各10μl(0.1～1μg)，分别加NdeI和HindIII(10U/μl)1μl，10×buffer 5μl，超纯水补足至50μl，37℃2～8小时双切。
连接体系20μl：酶切产物pET22b(+)/NdeI+HindIII以及nmoA*/NdeI+HindIII各5μl等摩尔混合，T4DNA连接酶(1swiss/μl)1～2μl，10×连接buffer2μl，超纯水补充至20μl。16℃，连接1～12小时。
连接产物转化大肠杆菌E coli BL21(DE3)感受态细胞(如果效率低可以采用大肠杆菌TOP10预先转化，阳性克隆连接载体再转化E coli BL21DE3感受态细胞)，涂布到涂IPTG与X-gal的的氨苄(100μg/.ml)LB琼脂平板上，37℃过夜培养。
从上述过夜培养的平板上挑取白色的克隆，并转接到1ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液的96微孔板中培养24小时，离心取兰紫色菌体细胞，用DMF(二甲基甲酰胺)提取兰紫色物质，在630nm与540nm处测定其光吸收值，筛选出540nm处光吸收值高的重组大肠杆菌。
每经过一轮易错PCR1(A1步骤)、无引物PCR2(A2步骤)、特异性引物扩增PCR3(A3步骤)等三步PCR，连接载体pET22b，筛选阳性克隆，为一轮DNA shuffling；提取筛选得到阳性克隆的重组质粒，以重组质粒为模版进行下一轮DNA shuffling。经过若干轮的易错PCR及DNA shuffling筛选，筛选得到540nm处光吸收值高的重组大肠杆菌，命名为突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌。
(4)2-萘酸单加氧酶进化后的突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌与其野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌表达蛋白催化吲哚产生靛玉红的催化效率比较：
所述的野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌是将2-萘酸单加氧酶(nmoA)基因与pET22b(+)连接，构建形成pET22b(+)-nmoA片段，然后将此片段转化进入大肠杆菌感受态细胞中，经过蓝白斑筛选，挑取白色克隆，然后将克隆转接到1ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液的96微孔板中培养24小时，离心取兰色菌体细胞，用DMF(二甲基甲酰胺)提取兰色物质，在610nm与540nm处测定其光吸收值，筛选获得540nm处光吸收值高的重组大肠杆菌，此重组的大肠杆菌即为野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌。
野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌及进化后突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌单克隆分别接种到5ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液，37℃过夜培养；而后接种到100ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液中，接种量0.5％～5％，培养基pH6.0～8.5，摇床转速为80～200转/分钟(rpm)，37℃培养当OD600达到0.5～0.7时加入IPTG(终浓度0.5-1.0μM)，28℃低温诱导，继续培养24小时，培养液以3000～12000rpm，4℃离心，去除上清夜，收集离心后的细胞，悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，以3000～12000rpm，4℃离心，去除上清夜，菌体细胞悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，在冰浴条件下超声破菌(或高压)5分钟，再用8000----12000rpm，4℃离心5---15分钟，分别得到含有2-萘酸单加氧酶或2-萘酸单加氧酶突变体的细胞破碎液。
经过大肠杆菌诱导表达的的细胞破碎液，采用TOYOBO公司的NPK7蛋白纯化试剂盒纯化。蛋白纯化步骤参照TOYOBO公司的NPK7蛋白纯化试剂盒说明书。分别在纯化后2-萘酸单加氧酶(浓度约2mg/ml)1ml，2-萘酸单加氧酶突变体(浓度约2mg/ml)1ml中加入250μl的浓度为100nM吲哚溶液，37℃温浴6小时，12000rpm，4℃离心，取上清产物，10ml氯仿提取红色色素，热浴蒸干溶剂，得到紫红色的粉状物，对其进行光谱扫描分析。
图3是靛玉红标样的光谱扫描图，图5是靛蓝标样的光谱扫描图，图12是野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶催化吲哚的上清液提取物，图13是突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化吲哚的上清液提取物。图12，图13中含有与标样靛玉红的保留时间一致，在同一个位置出现的吸收峰，因此可以证明两者的上清液提取物中含有靛玉红。
从图15中可以看出转入野生型的2-萘酸单加氧酶基因的大肠杆菌和转入经过筛选得到的2-萘酸单加氧酶突变体基因的大肠杆菌在40kDa的位置都有蛋白，而转入空载体和未转入载体的大肠杆菌在相应位置没有出现蛋白条带，因此2个基因重组的大肠杆菌获得了2-萘酸单加氧酶或突变体的表达。由于采用了蛋白His-tag特异性亲和吸附的提取方法，因此可以证明我们提纯的蛋白是转入基因编码的蛋白，即2-萘酸单加氧酶或2-萘酸单加氧酶突变体。
野生型的pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌表达的2-萘酸单加氧酶和突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌表达的2-萘酸单加氧酶突变体都能催化吲哚产生靛玉红。以标样靛玉红(中国药品生物制品检定所提供)做浓度和光吸收的标准曲线，测定OD540nm处吸收，计算野生型的pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶和突变型pET22b(+)-nmoA*大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体产率。
突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化效率(Kcat/Km值)为777M-1S-1。对pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)的2-萘酸单加氧酶突变体基因nmoA*测序分析发现，该突变体基因在2-萘酸单加氧酶基因的601位的T突变为A，从而造成了2-萘酸单加氧酶氨基酸序列的201位苯丙氨酸(Phe)突变为异亮氨酸(Ile)。(5)2-萘酸单加氧酶进化后的突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌的全细胞催化吲哚产生靛玉红。
挑取540nm光吸收值高的重组pET22b(+)-nmoA大肠杆菌及其突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌单克隆分别接种到5ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液，37℃过夜培养；而后接种到100ml含100μg/ml氨苄LB液体培养液中，接种量0.5％～5％，培养基pH6.0～8.5，摇床转速为80～200转/分钟(rpm)，37℃培养当OD600达到0.5～0.7时加入IPTG(终浓度0.5～1.0μM)28℃低温诱导，继续培养24～48小时，培养液以3000～12000rpm，4℃离心，去除上清夜，收集离心后的细胞，悬浮于5ml的pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)，以3000～12000rpm，4℃离心，去除上清夜，菌体细胞加入1000μl的浓度为100nM吲哚溶液，37℃温浴6小时，用8000～12000rpm，4℃离心5～15分钟，得到含有2-萘酸单加氧酶的细胞，10ml氯仿萃取色素，真空旋转，蒸干溶剂，得到紫红色的粉状物。光谱扫描(分析方法参照中国药典)，见图14，从图14中可以看出突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌和野生型pET22b(+)-nmoA重组大肠杆菌细胞破碎液的萃取的紫红色产物，存在与标样靛玉红保留时间一致，在特征吸收波长540nm处峰型一致的吸收峰，证明红色粉状物为靛玉红。将未转化该基因的大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)和转入空载体pET22b(+)的大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)未能提取到红色物质，即没有产生靛玉红。
实施例3
本实施例与实施例2相同，只是筛选得到的突变体不同，本实施例筛选到的突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化效率(Kcat/Km值)为819M-1S-1。
对pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌E coli BL21(DE3)的2-萘酸单加氧酶突变体基因nmoA*测序分析发现，该突变体基因在2-萘酸单加氧酶基因的601位的T突变为A，733位的T突变为A及735位的G突变为C，从而造成了2-萘酸单加氧酶氨基酸序列的201位苯丙氨酸(Phe)突变为异亮氨酸(Ile)，245位色氨酸(Trp)突变为丝氨酸(Ser)。
实施例4
本实施例与实施例2相同，只是筛选得到的突变体不同，本实施例筛选到的突变型pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌的2-萘酸单加氧酶突变体催化效率(Kcat/Km值)为909M-1S-1。
对pET22b(+)-nmoA*重组大肠杆菌E coli BL21(DE3)的2-萘酸单加氧酶突变体基因nmoA*测序分析发现，该突变体基因在2-萘酸单加氧酶基因的352--354位的CTC突变为GCA，601位的T突变为A，733位的T突变为A及735位的G突变为C，从而造成了2-萘酸单加氧酶氨基酸序列的118位的亮氨酸(Leu)突变为丙氨酸(Ala)，201位苯丙氨酸(Phe)突变为异亮氨酸(Ile)，245位色氨酸(Trp)突变为丝氨酸(Ser)。
序列表
<110>广东省微生物研究所
<120>用于制备抗癌药物靛玉红的2-萘酸单加氧酶
<160>5
<210>1
<211>1314
<212>DNA
<213>伯克霍尔德氏菌(Burkholdria sp.JT1500)
<220>
<221>CDS
<400>1
ATGCGGCGGC ATTCGACGCC GAAGTGCGCG CTTTCCTCGC AACACTCTAG AACCCTCCAG 60
GAGACTACCG TGGCCTATCA GCCCCCTTCG ATCGTCGGCG AGCATTACCC GCTCACGGAC 120
AAGCAGCGGC GCTTGCTGGC GCTGGCCGAG CAGGTGGGGC GCGAGTCGCT CGCGCCACGC 180
GCCGCGCGCT GGGACCGCGA AGCGTCGTTC CCGTTCGAGA ACTACGACGA CATGCGCGCC 240
GCCGGCTTGC TCAAGCTGTG CATTCCCGAA GCGGACGGCG GTCTGGGCGC CGACTTCGCC 300
ACGTACATGA TGGTTTCCGC CGAGTTGGGC CGCCACTGCG GTGCGACGGC GCTCACCTTC 360
AACATGCACA CGTGCTCGAT GATGTGGACA GGGATTCTCG CCGACGATCT CGACATGACG 420
CCCGAGCAAC GCGCCGAGCA TGCGCGTTAT CGCGAGCACC ACTTCGCCCG GGTGATCCAG 480
GACGGTGCGA TTTACGCACA GCCGTTCTCC GAGGGCAGCG CCGCGGCGGC GGGCAAGGCA 540
CCGTTCGGCA CCACGGCCAC CAAGGTCGAG GGCGGCTGGA AGATCAATGG CCGCAAGATT 600
TTCGCGTCGC TCTCGGGGGC CGCCAACTAC TACGGCGTGC TGTGTACCGA AGACAAGCCC 660
GAGCTGTCGA TGAAGGACAC GTTCTACATC GCGGTGCCGG GCGACGCGCC GGGCGTGACC 720
GTCACAGGTG ACTGGGATCC GCTGGGCATG CGCGGTACGG TCTCGCGCAC GTTGCTTTTC 780
AAGGACGTGT TCGTGCCCGA CGAGCTGCAA TTGATGCCGC GCGGCATCTA CCATCAGGCC 840
GCGAGCCGCT GGCCGCACAT GGTCATGACG CTCTCGCCGA CATACATGGG TATCGCCCAG 900
GCTGCCTATG ATTTCACCAT CCAGTACCTG CGGGGCGAAG CGCCCGGCAT GGGCGCGCCG 960
GTCAAGCGCC GCATGTATCC GACCAAGCAG ATCGCCGTCG CGCAAATGCA CATCCTGCTC 1020
GAGCAAACGC GCGCGCTGTT CCTGCGTGCA TTGCAGGACG GCCGCGCCGA TCCGGGCAAG 1080
GAAGCGCGCC TGCGTGCCTA TGCGGCGCAG TACACGATCA TGGAGAATGC CAACGAGCTG 1140
TGCCGGCTGG CCATTCGCAC CTGCGGCGGA CAGTCGATGC TCAAGACGCT GCCGCTCGAG 1200
CGCATGTACC GCGATTCGCG CTGCGGCGCC CTGATGCTGC CCTGGACGGC CGAGCTGTGT  1260
CTCGATCGCA TCGGCCGCGA AGCGCTCTAC GAACCGGGCG AGCGCGACGA GTAA        1314
<210>2
<211>437
<212>PRT
<213>伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.JT1500)
<400>2
Met Arg Arg His Ser Thr Pro Lys Cys Ala Leu Ser Ser Gln His
1                5                  10                   15
Ser Arg Thr Leu Gln Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Pro Pro Ser
                 20                 25                   30
Ile Val Gly Glu His Tyr Pro Leu Thr Asp Lys Gln Arg Arg Leu
                 35                 40                   45
Leu Ala Leu Ala Glu Gln Val Gly Arg Glu Ser Leu Ala Pro Arg
                 50                 55                   60
Ala Ala Arg Trp Asp Arg Glu Ala Ser Phe Pro Phe Glu Asn Tyr
                 65                 70                   75
Asp Asp Met Arg Ala Ala Gly Leu Leu Lys Leu Cys Ile Pro Glu
                 80                 85                   90
Ala Asp Gly Gly Leu Gly Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Met Met Val
                 95                 100                 105
Ser Ala Glu Leu Gly Arg His Cys Gly Ala Thr Ala Leu Thr Phe
                110                 115                 120
Asn Met His Thr Cys Ser Met Met Trp Thr Gly Ile Leu Ala Asp
                125                 130                 135
Asp Leu Asp Met Thr Pro Glu Gln Arg Ala Glu His Ala Arg Tyr
                140                 145                 150
Arg Glu His His Phe Ala Arg Val Ile Gln Asp Gly Ala Ile Tyr
                155                 160                 165
Ala Gln Pro Phe Ser Glu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Lys Ala
                170                 175                 180
Pro Phe Gly Thr Thr Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Trp Lys Ile
                185                 190                 195
Asn Gly Arg Lys Ile Phe Ala Ser Leu Ser Gly Ala Ala Asn Tyr
                200                 205                 210
Tyr Gly Val Leu Cys Thr Glu Asp Lys Pro Glu Leu Ser Met Lys
                215                 220                 225
Asp Thr Phe Tyr Ile Ala Val Pro Gly Asp Ala Pro Gly Val Thr
                230                 235                 240
Val Thr Gly Asp Trp Asp Pro Leu Gly Met Arg Gly Thr Val Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Leu Leu Phe Lys Asp Val Phe Val Pro Asp Glu Leu Gln
                260                 265                 270
Leu Met Pro Arg Gly Ile Tyr His Gln Ala Ala Ser Arg Trp Pro
                275                 280                 285
His Met Val Met Thr Leu Ser Pro Thr Tyr Met Gly Ile Ala Gln
                290                 295                 300
Ala Ala Tyr Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Leu Arg Gly Glu Ala Pro
                305                 310                 315
Gly Met Gly Ala Pro Val Lys Arg Arg Met Tyr Pro Thr Lys Gln
                320                 325                 330
Ile Ala Val Ala Gln Met His Ile Leu Leu Glu Gln Thr Arg Ala
                335                 340                 345
Leu Phe Leu Arg Ala Leu Gln Asp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Lys
                350                 355                 360
Glu Ala Arg Leu Arg Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr Thr Ile Met Glu
                365                 370                 375
Asn Ala Asn Glu Leu Cys Arg Leu Ala Ile Arg Thr Cys Gly Gly
                380                 385                 390
Gln Ser Met Leu Lys Thr Leu Pro Leu Glu Arg Met Tyr Arg Asp
                395                 400                 405
Ser Arg Cys Gly Ala Leu Met Leu Pro Trp Thr Ala Glu Leu Cys
                410                 415                 420
Leu Asp Arg Ile Gly Arg Glu Ala Leu Tyr Glu Pro Gly Glu Arg
                425                 430                 435
Asp Glu
    437
<210>3
<211>437
<212>PRT
<213>伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.JT1500)
<400>3
Met Arg Arg His Ser Thr Pro Lys Cys Ala Leu Ser Ser Gln His
1                5                  10                   15
Ser Arg Thr Leu Gln Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Pro Pro Ser
                 20                 25                   30
Ile Val Gly Glu His Tyr Pro Leu Thr Asp Lys Gln Arg Arg Leu
                 35                 40                   45
Leu Ala Leu Ala Glu Gln Val Gly Arg Glu Ser Leu Ala Pro Arg
                 50                 55                   60
Ala Ala Arg Trp Asp Arg Glu Ala Ser Phe Pro Phe Glu Asn Tyr
                 65                 70                   75
Asp Asp Met Arg Ala Ala Gly Leu Leu Lys Leu Cys Ile Pro Glu
                 80                 85                   90
Ala Asp Gly Gly Leu Gly Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Met Met Val
                 95                 100                 105
Ser Ala Glu Leu Gly Arg His Cys Gly Ala Thr Ala Leu Thr Phe
                110                 115                 120
Asn Met His Thr Cys Ser Met Met Trp Thr Gly Ile Leu Ala Asp
                125                 130                 135
Asp Leu Asp Met Thr Pro Glu Gln Arg Ala Glu His Ala Arg Tyr
                140                 145                 150
Arg Glu His His Phe Ala Arg Val Ile Gln Asp Gly Ala Ile Tyr
                155                 160                 165
Ala Gln Pro Phe Ser Glu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Lys Ala
                170                 175                 180
Pro Phe Gly Thr Thr Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Trp Lys Ile
                185                 190                 195
Asn Gly Arg Lys Ile Ile Ala Ser Leu Ser Gly Ala Ala Asn Tyr
                200                 205                 210
Tyr Gly Val Leu Cys Thr Glu Asp Lys Pro Glu Leu Ser Met Lys
                215                 220                 225
Asp Thr Phe Tyr Ile Ala Val Pro Gly Asp Ala Pro Gly Val Thr
                230                 235                 240
Val Thr Gly Asp Trp Asp Pro Leu Gly Met Arg Gly Thr Val Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Leu Leu Phe Lys Asp Val Phe Val Pro Asp Glu Leu Gln
                260                 265                 270
Leu Met Pro Arg Gly Ile Tyr His Gln Ala Ala Ser Arg Trp Pro
                275                 280                 285
His Met Val Met Thr Leu Ser Pro Thr Tyr Met Gly Ile Ala Gln
                290                 295                 300
Ala Ala Tyr Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Leu Arg Gly Glu Ala Pro
                305                 310                 315
Gly Met Gly Ala Pro Val Lys Arg Arg Met Tyr Pro Thr Lys Gln
                320                 325                 330
Ile Ala Val Ala Gln Met His Ile Leu Leu Glu Gln Thr Arg Ala
                335                 340                 345
Leu Phe Leu Arg Ala Leu Gln Asp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Lys
                350                 355                 360
Glu Ala Arg Leu Arg Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr Thr Ile Met Glu
                365                 370                 375
Asn Ala Asn Glu Leu Cys Arg Leu Ala Ile Arg Thr Cys Gly Gly
                380                 385                 390
Gln Ser Met Leu Lys Thr Leu Pro Leu Glu Arg Met Tyr Arg Asp
                395                 400                 405
Ser Arg Cys Gly Ala Leu Met Leu Pro Trp Thr Ala Glu Leu Cys
                410                 415                 420
Leu Asp Arg Ile Gly Arg Glu Ala Leu Tyr Glu Pro Gly Glu Arg
                425                 430                 435
Asp Glu
437
<210>4
<211>437
<212>PRT
<213>伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.JT1500)
<400>4
Met Arg Arg His Ser Thr Pro Lys Cys Ala Leu Ser Ser Gln His
1                5                  10                   15
Ser Arg Thr Leu Gln Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Pro Pro Ser
                 20                  25                  30
Ile Val Gly Glu His Tyr Pro Leu Thr Asp Lys Gln Arg Arg Leu
                 35                  40                  45
Leu Ala Leu Ala Glu Gln Val Gly Arg Glu Ser Leu Ala Pro Arg
                 50                  55                  60
Ala Ala Arg Trp Asp Arg Glu Ala Ser Phe Pro Phe Glu Asn Tyr
                 65                  70                  75
Asp Asp Met Arg Ala Ala Gly Leu Leu Lys Leu Cys Ile Pro Glu
                 80                  85                  90
Ala Asp Gly Gly Leu Gly Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Met Met Val
                 95                 100                 105
Ser Ala Glu Leu Gly Arg His Cys Gly Ala Thr Ala Leu Thr Phe
                110                 115                 120
Asn Met His Thr Cys Ser Met Met Trp Thr Gly Ile Leu Ala Asp
                125                 130                 135
Asp Leu Asp Met Thr Pro Glu Gln Arg Ala Glu His Ala Arg Tyr
                140                 145                 150
Arg Glu His His Phe Ala Arg Val Ile Gln Asp Gly Ala Ile Tyr
                155                 160                 165
Ala Gln Pro Phe Ser Glu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Lys Ala
                170                 175                 180
Pro Phe Gly Thr Thr Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Trp Lys Ile
                185                 190                 195
Asn Gly Arg Lys Ile Ile Ala Ser Leu Ser Gly Ala Ala Asn Tyr
                200                 205                 210
Tyr Gly Val Leu Cys Thr Glu Asp Lys Pro Glu Leu Ser Met Lys
                215                 220                 225
Asp Thr Phe Tyr Ile Ala Val Pro Gly Asp Ala Pro Gly Val Thr
                230                 235                 240
Val Thr Gly Asp Ser Asp Pro Leu Gly Met Arg Gly Thr Val Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Leu Leu Phe Lys Asp Val Phe Val Pro Asp Glu Leu Gln
                260                 265                 270
Leu Met Pro Arg Gly Ile Tyr His Gln Ala Ala Ser Arg Trp Pro
                275                 280                 285
His Met Val Met Thr Leu Ser Pro Thr Tyr Met Gly Ile Ala Gln
                290                 295                 300
Ala Ala Tyr Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Leu Arg Gly Glu Ala Pro
                305                 310                 315
Gly Met Gly Ala Pro Val Lys Arg Arg Met Tyr Pro Thr Lys Gln
                320                 325                 330
Ile Ala Val Ala Gln Met His Ile Leu Leu Glu Gln Thr Arg Ala
                335                 340                 345
Leu Phe Leu Arg Ala Leu Gln Asp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Lys
                350                 355                 360
Glu Ala Arg Leu Arg Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr Thr Ile Met Glu
                365                 370                 375
Asn Ala Asn Glu Leu Cys Arg Leu Ala Ile Arg Thr Cys Gly Gly
                380                 385                 390
Gln Ser Met Leu Lys Thr Leu Pro Leu Glu Arg Met Tyr Arg Asp
                395                 400                 405
Ser Arg Cys Gly Ala Leu Met Leu Pro Trp Thr Ala Glu Leu Cys
                410                 415                 420
Leu Asp Arg Ile Gly Arg Glu Ala Leu Tyr Glu Pro Gly Glu Arg
                425                 430                 435
Asp Glu
    437
<210>5
<211>437
<212>PRT
<213>伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.JT1500)
<400>5
Met Arg Arg His Ser Thr Pro Lys Cys Ala Leu Ser Ser Gln His
1                5                  10                   15
Ser Arg Thr Leu Gln Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Pro Pro Ser
                 20                 25                   30
Ile Val Gly Glu His Tyr Pro Leu Thr Asp Lys Gln Arg Arg Leu
                 35                 40                   45
Leu Ala Leu Ala Glu Gln Val Gly Arg Glu Ser Leu Ala Pro Arg
                 50                 55                   60
Ala Ala Arg Trp Asp Arg Glu Ala Ser Phe Pro Phe Glu Asn Tyr
                 65                 70                   75
Asp Asp Met Arg Ala Ala Gly Leu Leu Lys Leu Cys Ile Pro Glu
                 80                 85                   90
Ala Asp Gly Gly Leu Gly Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Met Met Val
                 95                 100                 105
Ser Ala Glu Leu Gly Arg His Cys Gly Ala Thr Ala Ala Thr Phe
                110                 115                 120
Asn Met His Thr Cys Ser Met Met Trp Thr Gly Ile Leu Ala Asp
                125                 130                 135
Asp Leu Asp Met Thr Pro Glu Gln Arg Ala Glu His Ala Arg Tyr
                140                 145                 150
Arg Glu His His Phe Ala Arg Val Ile Gln Asp Gly Ala Ile Tyr
                155                 160                 165
Ala Gln Pro Phe Ser Glu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Lys Ala
                170                 175                 180
Pro Phe Gly Thr Thr Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Trp Lys Ile
                185                 190                 195
Asn Gly Arg Lys Ile Ile Ala Ser Leu Ser Gly Ala Ala Asn Tyr
                200                 205                 210
Tyr Gly Val Leu Cys Thr Glu Asp Lys Pro Glu Leu Ser Met Lys
                215                 220                 225
Asp Thr Phe Tyr Ile Ala Val Pro Gly Asp Ala Pro Gly Val Thr
                230                 235                 240
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                245                 250                 255
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                275                 280                 285
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Asn Ala Asn Glu Leu Cys Arg Leu Ala Ile Arg Thr Cys Gly Gly
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Gln Ser Met Leu Lys Thr Leu Pro Leu Glu Arg Met Tyr Arg Asp
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                410                 415                 420
Leu Asp Arg Ile Gly Arg Glu Ala Leu Tyr Glu Pro Gly Glu Arg
                425                 430                 435
Asp Glu
    437

Claims (5)

1.一种2-萘酸单加氧酶，其特征在于所述的2-萘酸单加氧酶的氨基酸序列如SEQ2所示，其基因的核苷酸序列如SEQ1所示。
2.一种权利要求1所述的2-萘酸单加氧酶在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的基因，能够表达权利要求1所述的酶的全细胞在生物催化制备靛玉红中的应用。
4.以权利要求1所述的2-萘酸单加氧酶为基础衍生出的，经过分子修饰的，引起氨基酸序列发生功能性突变的2-萘酸单加氧酶突变体在生物催化制备抗癌药物靛玉红中的应用，其特征在于，所述的2-萘酸单加氧酶突变体的氨基酸序列如SEQ3、SEQ4或SEQ5所示。
5.一种表达权利要求4所述的酶突变体的全细胞在生物催化制备靛玉红中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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