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ES2310201T3 - Vacuna para inmunizacion transcutanea contra la diarrea de los viajeros. - Google Patents

Vacuna para inmunizacion transcutanea contra la diarrea de los viajeros. Download PDF

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ES2310201T3
ES2310201T3 ES02718962T ES02718962T ES2310201T3 ES 2310201 T3 ES2310201 T3 ES 2310201T3 ES 02718962 T ES02718962 T ES 02718962T ES 02718962 T ES02718962 T ES 02718962T ES 2310201 T3 ES2310201 T3 ES 2310201T3
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adjuvant
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Gregory M. Glenn
Frederick J. Cassels
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United States Department of the Army
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Abstract

Uso de entero toxina lábil al calor E. Coli (LT) como un inmunógeno en la fabricación de una vacuna para inmunización transcutánea para el tratamiento y/o prevención de la diarrea de viajero, en donde dicho inmunógeno está presente en cantidades efectivas para inducir una respuesta inmune contra una o más cepas de Escherichia Coli enterotoxigénica (ETEC).

Description

Vacuna para inmunización transcutánea contra la diarrea de los viajeros.
Campo de la invención
La invención se relaciona con el uso de enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT) cono un inmunógeno en la elaboración de vacunas para inmunización transcutánea para tratar y/o prevenir la diarrea de los viajeros al inducir una respuesta inmune contra una o más cepas de Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC).
Antecedentes de la invención
La piel, el órgano humano más grande, juega una parte importante en la defensa del cuerpo contra la invasión de agentes infecciosos y el contacto con sustancias nocivas. Pero esta función de barrera de la piel parece haber evitado que la técnica aprecie que la inmunización transcutánea suministra una alternativa efectiva a la administración entérica, de mucosa, y parenteral de vacunas.
Anatómicamente, la piel está compuesta de tres capas: la epidermis, la dermis, y la grasa subcutánea. La epidermis está compuesta de las capas basal, espinosa, la granular, y la cornificada; el estrato corneo comprende la capa cornificada y el lípido. El principal antígeno que presentan las células de la piel, las células Langerhans, se reportan por ser las capas espinosas media a superior de la epidermis en humanos. La dermis contiene principalmente tejido conectivo. La sangre y los vasos sanguíneos están confinados a la dermis y a la grasa subcutánea.
El estrato corneo, una capa de células de piel muerta y lípidos, se ha visto tradicionalmente como una barrera para el mundo hostil, excluyendo los organismos y las sustancias nocivas de las células viables por debajo del estrato corneo. El estrato corneo también sirve como una barrera para la pérdida de humedad de la piel: el estrato corneo relativamente seco se reporta por tener 5% a 15% de contenido de agua aunque las capas epidérmicas y dérmicas más profundas son relativamente bien hidratadas con 85% a 90% de contenido de agua. Solo recientemente se ha reconocido la protección secundaria suministrada por el antígeno que presentan las células (por ejemplo, las células Langerhans). Más aún, la capacidad de inmunizar a través de la piel con o sin el mejoramiento de penetración (es decir, la inmunización transcutánea) que utiliza un adyuvante activo de la piel se ha descrito solo recientemente. Aunque las reacciones indeseables de la piel tales como la atopia y la dermatitis eran conocidas en la técnica, el reconocimiento de las ventajas terapéuticas de la inmunización transcutánea (TCI) podría haberse no apreciado en el pasado en razón a que se creía que la piel suministraba una barrera al paso de moléculas mayores de aproximadamente 500 daltons.
Hemos mostrado que una variedad de adyuvantes se administran efectivamente por el TCI para provocar resuestas inmunes específicas de antígeno sistémicas y regionales a un antígeno separado, co-administrado. Ver WO 98/20734, WO 99/43350 y WO 00/61184; y las Patentes U.S. 5,910,306 y 5,980,898. Por ejemplo, los adyuvantes como las exotoxinas ribosilantes de ADP son seguras y efectivas cuando se aplican epicutáneamente, en contraste a las desventajas asociadas con su uso cuando se administra mediante una ruta entérica, de mucosa, o parenteral.
Las Patentes U.S. 4,220,584 y 4,285,931 utilizan la enterotoxina lábil al calor de E. coli para inmunizar contra diarrea inducida por E. coli. Se inyectan intramuscularmente con el inmunógeno y el adyuvante de Freund conejos. Se mostró protección contra la exposición a toxina y la neutralización de los efectos tóxicos sobre la actividad del ciclo ileal. La Patente U.S. 5,182,109 describe combinar vacuna y toxina (por ejemplo, toxina lábil al calor de E. coli) y la administración en forma inyectable, de pulverizado, u oral. La neutralización se demostró con calostro de vacas inmunizadas. Las versiones mutantes de la enterotoxina se han descrito por retener la inmunogenicidad y eliminar la toxicidad (por ejemplo, las Patentes U.S. 4,761,372 y 5,308,835).
La US 5 914 114 describe ciertos péptidos para provocar una respuesta inmune contra antígenos fimbriales de ciertas cepas de ETEC, y vacunas que comprenden los péptidos.
La US 5 980 898 describe una composición que comprende LT que se administra a ratones mediante inmunización transcutánea y que provoca una respuesta de anticuerpo anti-LT en los ratones, pero no describe ni sugiere el uso de LT en la elaboración de una vacuna para inmunización transcutánea efectiva en el tratamiento y/o prevención de la diarrea de los viajeros.
Las formulaciones de vacuna, así como también los procesos para hacerlas y utilizarlas, se describen aquí. En particular, el TCI y las ventajas derivadas de ésta en la vacunación de humanos para tratar la enfermedad de diarrea se demuestra. Una demostración importante es que la competición entre diferentes antígenos en una vacuna multivalente no era un obstáculo cuando se administraba mediante inmunización transcutánea. Otras ventajas de la invención se discuten adelante y serían evidentes de la presente descripción.
Resumen de la invención
La invención suministra el uso de LT como un inmunógeno en la elaboración de una vacuna para inmunización transcutánea para el tratamiento y/o prevención de la diarrea de los viajeros, como se define en la reivindicación 1 de las reivindicaciones finales a ésta. La vacuna puede comprender además un adyuvante. El adyuvante puede ser una exotoxina ribosilante de ADP (por ejemplo, enterotoxina lábil al calor de E. coli, toxina de cólera, toxina de difteria, toxina de pertusis) o derivados de éstos que tienen actividad adyuvante; la vacuna descrita puede comprender además una toxina bacteriana (por ejemplo, CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5, CS6, CS17, PCF 0166) o fragmentos o conjugados de péptido de éstos que tienen actividad inmunogénica. La subunidad o vacunas de célula completa comprendidas de un inmunógeno y un parche también se describen, junto con métodos para elaborar los productos anteriormente mencionados y utilizarlos para inmunización. La efectividad se puede evaluar mediante criterios clínicos o de laboratorio. La protección se puede evaluar utilizando marcadores subrogados o directamente en ensayos controlados. Aspectos adicionales de la invención serán evidentes para una persona experta en la técnica de la siguiente descripción y reivindicaciones detalladas, y las generalizaciones a ésta.
Descripción de los dibujos
Figura 1. El IgG y pico IgA individual generando doblez en el título de anticuerpo a LT (A y B) y CS6 (C y D) entre voluntarios humanos inmunizados con adyuvante combinado con antígeno (LT+CS6), o con antígeno solo (CS6). La barra transversal representa el pico medio que genera doblez en el título de anticuerpo.
Figura 2. Cinéticas de las respuestas de anticuerpo IgA e IgG anti-LT (A y B) y anti-CS6 (C y D) entre voluntarios inmunizados y con refuerzo (flechas) utilizando la ruta transcutánea. Los círculos indican el título de la media geométrica el día después de la primera inmunización, las barras denotan los intervalos de confianza al 95% correspondientes.
* p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, NS no significativo, prueba de rango firmada Wilcoxon, que compara las respuestas del título de anticuerpo entre inmunizaciones de refuerzo.
Figura 3. El número de picos individuales de anti-LT (A y B) y anti-CS6 (C y D) ASC por 10^{6} PBMC entre los que respondieron a la inmunización con adyuvante combinado con antígeno (LT+CS6), mediante la inmunización después de lo cual se logró un valor pico.
Figura 4. Respuesta de IgG en el suero a TCI con CS3 y CS6 con y sin adyuvante LTR192G. Los ratones se afectaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de la vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico y la cita se retiró 10 veces para afectar el estrato corneo. Parches de gasa se fijaron a un adhesivo por detrás y se cargó con 25 \mul de volumen de 25 \mug de CS6 o 25 \mug de CS6 con 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron a la piel preparada y se les permitió permanecer en su lugar durante \sim18 horas. Un grupo de ratones se inyectó intradérmicamente con 25 \mul de CS6 (25 \mug) en la base de la cola. Todos los ratones recibieron una vacunación el día 0, 14 y 28. Las muestras de suero se recolectaron 14 días después de la tercera vacunación (día 42). Los paneles muestran el título IgG del suero a CS3 (A), el título IgG del suero a CS6 (B), y el título IgG del suero a LTR192G. (C).
Figura 5. La respuesta IgG del suero a TCI con vacunas subunitarias ETEC divalente y trivalente. El sitio de vacunación en la base de la cola se preparó utilizando el procedimiento descrito en la Figura 4. Se fijaron parches de gasa a un respaldo adhesivo los cuales se cargaron con 25 \mul en volumen que consiste de las siguientes mezclas: 25 \mug de CS3 y 10 \mug de LTR192G; 25 \mug de CS3, 25 \mug de CS6 y 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron a la piel preparada y se les permitió permanecer en su lugar durante \sim18 horas. Todos los ratones recibieron una vacuna transcutánea en el día 0 y 14. El suero se recolectó 10 días después de la segunda inmunización (día 24). Los paneles muestran el título IgG del suero a CS3 (A) y el título IgG del suero a CS6 (B).
Figura 6. Respuesta IgG del suero a TCI utilizando vacunas multivalentes CS3, CS6 y LTR192G. El sitio de vacunación en la base de la cola se preparó utilizando el procedimiento descrito en la Figura 4. Fijados los parches de gasa a un respaldo adhesivo se cargaron con 25 \mul de volumen que consiste de las siguientes mezclas: 25 \mug de CS3; 25 \mug de CS6; 25 \mug de cada CS3 y CS6; 25 \mug de cada CS3 y CS6 y 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron a la piel pre-tratada y se les permitió permanecer en su lugar durante \sim18 horas. Todos los ratones recibieron dos vacunaciones transcutáneas en el día 0 y 14. Se recolectó el suero 10 días después de la segunda inmunización (día 24). Los paneles mostraron el título IgG del suero a CS3 (A) y el título IgG del suero a CS6 (B).
Figura 7. La falta de una reactividad cruzada del anticuerpo entre CS3 y CS6. El sitio en la base de la cola se preparó utilizando el procedimiento descrito en la Figura 4. Los parches de gasa que se fijaron a un respaldo adhesivo se cargaron con un volumen de 25 \mul que consiste de las siguientes mezclas: 25 \mug de CS3 con 10 \mug de LTR192G (paneles A y B) y 25 \mug de CS6 con 10 \mug LTR192G (paneles C y D). Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Todos los ratones recibieron dos vacunaciones transcutáneas en el día 0 y 14. Se recolectó el suero 10 días después de la segunda inmunización (día 24). Se determinaron los títulos IgG del suero para CS3 (paneles A y C) y CS6 (paneles B y D).
Figura 8. Subclases IgG del suero provocadas mediante vacunación transcutánea con CS3 con y sin LTR192G. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de la vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se sometió entonces a abrasión media con un papel lija 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de las siguientes mezclas: 25 \mug de CS3 o 25 \mug de CS3 con o sin 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Todos los ratones recibieron tres vacunaciones transcutáneas en el día 0, 14 y 28. Las muestras de suero se recolectaron 30 días después de la tercera vacunación (día 58). Los paneles mostraron los títulos IgG del suero total a CS3 (A), la subclase IgG1 de suero a CS3 (B), y la subclase IgG2a de suero a CS3 (C).
Figura 9. Las subclases IgG de suero provocadas por TCI con CS6 con y sin el LTR192G. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se sometió entonces a abrasión media con un papel lija 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de las siguientes mezclas: 25 \mug de CS6 o 25 \mug de CS3 con o sin 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Todos los ratones recibieron tres vacunaciones transcutáneas en el día 0, 14 y 28. Las muestras de suero se recolectaron 30 días después de la tercera vacunación (día 58). Los paneles mostraron los títulos IgG de suero total a CS6 (A), la subclase IgG1 de suero a CS6 (B), y la subclase IgG2a de suero a CS6 (C).
Figura 10. Las subclases IgG de suero provocadas por TCI con LTR192G. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se sometió entonces a abrasión media con un papel lija 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Todos los ratones recibieron tres vacunaciones transcutáneas en el día 0, 14 y 28. Las muestras de suero se recolectaron 30 días después de la tercera vacunación (día 58). Los paneles mostraron títulos del IgG del suero total a LTR192G (A), la subclase IgG1 de suero a LTR192G (B), y la subclase IgG2a de suero a LTR192G (C).
Figura 11. Las subclases IgG de suero provocadas por LTR192G co-administradas con CS3 o CS6. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se sometió entonces a abrasión media con un papel lija 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de lo siguiente: 25 \mug de CS3 con 10 \mug de LTR192G y 25 \mug de CS6 con 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Todos los ratones recibieron tres vacunaciones transcutáneas en el día 0, 14 y 28. Las muestras de suero se recolectaron 30 días después de la tercera vacunación (día 58). Los paneles muestran títulos IgG de suero total a LTR192G (A), la subclase IgG1 de suero a LTR192G (B), y la subclase IgG2a de suero a LTR192G (C).
Figura 12. Detección de IgA fecal específico de CS3 (paneles superiores) e IgG (paneles inferiores) luego de TCI. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se le retiró entonces la cinta 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de las siguientes mezclas: solución salina amortiguada de fosfato (paneles A y E); 25 \mug de CS3 (paneles B y F); y 25 \mug de CS3 con 10 \mug de LTR192G (paneles C y G). Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Un grupo de ratones se vacunó mediante inyección intradérmica (ID) de 25 \mug de CS3 (paneles D y H). Todos los ratones recibieron tres vacunaciones transcutáneas en el día 0, 14 y 28. Las muestras fecales se recolectaron una semana después de la tercera inmunización (día 35). Las muestras se procesaron y se evaluaron para IgA fecal (paneles A-D) e IgG (paneles E-H) contra CS3.
Figura 13. Detección de IgA fecal específico de CS6 (paneles superiores) e IgG (paneles inferiores) luego de TCI. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se le retiró entonces la cinta 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de las siguientes mezclas: solución salina amortiguada de fosfato (paneles A y E); 25 \mug de CS3 (paneles B y F); y 25 \mug de CS6 con 10 \mug de LTR192G (paneles C y G). Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Se vacunó un grupo de ratones mediante inyección intradérmica (ID) de 25 \mug de CS6 (paneles D y H). Todos los ratones recibieron tres vacunaciones en el día 0, 14 y 28. Las muestras fecales se recolectaron una semana después de la tercera inmunización (día 35). Las muestras se procesaron y se evaluaron para IgA fecal (paneles A-D) e IgG (paneles E-H) contra CS6.
Figura 14. Detección del IgA fecal específico del LTR192G (paneles superiores) e IgG (paneles inferiores) luego de TCI. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se le retiró entonces la cinta 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de las siguientes mezclas: solución salina amortiguada de fosfato (paneles A y E); 10 \mug de LTR192G (paneles B y F); y 25 \mug de CS3 con 10 \mug de LTR192G (paneles C y G); y 25 \mug de CS6 y 10 \mug de LTR192G (panel D y H). Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Todos los ratones recibieron tres vacunaciones en el día 0, 14 y 28. Las muestras fecales se recolectaron una semana después de la tercera inmunización (día 35). Las muestras se procesaron y se evaluaron para IgA fecal (paneles A-D) e IgG (paneles E-H) contra LTR192G.
Figura 15. Detección de CS3, CS6 y células que secretan anticuerpo específico de LTR192G (ASC) en el bazo de los ratones transcutáneamente vacunados con vacunas subunitarias ETEC monovalentes y divalentes. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se le retiró entonces la cinta 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de las siguientes mezclas: solución salina amortiguada de fosfato (vehículo); 25 \mug de CS3; 25 \mug de CS6; 25 \mug de CS3 con 10 \mug de LTR192G; y 25 \mug de CS6 con 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Además, los grupos de ratones se vacunaron mediante inyección intradérmica (ID) en la base de la cola con 25 \mug de CS3 o CS6. Todos los ratones se vacunaron tres veces en el día 0, 14 y 28. El bazo se cosechó 30 días después de la tercera inmunización (día 58). Los paneles muestran IgA-ASC específico de CS3 (A) e IgG-ASC (B); IgA-ASC específico de CS6 (C) e IgG-ASC (D), e IgA-ASC específico de LTR192G (A y C) e IgG-ASC (B y D).
Figura 16. Detección de células que secretan anticuerpo específicos de CS3, CS6 y LTR192G (ASC) en el bazo de los ratones transcutáneamente vacunados con vacuna subunitaria ETEC trivalente. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se le retiró entonces la cinta 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de una mezcla de la siguiente formulación: 25 \mug CS3/25 \mug CS6/10 \mug LTR192G. Los parches se aplicaron durante la noche (\sim 18 horas). Los ratones se vacunaron tres veces en el día 0, 14 y 28. El bazo se cosechó 30 días después de la tercera inmunización (día 58). Los paneles muestran IgA-ASC específico para CS3, CS6 y LTR192G (A) e IgG-ASC específico para CS3, CS6 y LTR192G (B).
Figura 17. Detección de células que secretan anticuerpo específicas de CS3, CS6 y LTR192G (ASC) en los nodos linfáticos inguinales de ratones transcutáneamente vacunados con vacunas subunitarias ETEC monovalentes y divalentes. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se le retiró entonces la cinta 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de las siguientes mezclas: solución salina amortiguada de fosfato (vehículo); 25 \mug de CS3; 25 \mug de CS6; 25 \mug de CS3 con 10 \mug de LTR192G; y 25 \mug de CS6 con 10 \mug de LTR192G. Además, los grupos separados de ratones se vacunaron mediante inyección intradérmica (ID) en la base de la cola con 25 \mug de CS3 o CS6. Todos los ratones se vacunaron tres veces en el día 0, 14 y 28. Los nodos linfáticos inginales se recolectaron 30 días después de la tercera inmunización (día 58). Los paneles muestran IgA-ASC específico de CS3 (A), IgG-ASC específico de CS6 (B), e IgG-ASC específico de LTR192G (A y B).
Figura 18. Detección de células que secretan anticuerpo específicas de CS3, CS6 y LTR192G (IgG-ASC) en los nodos linfáticos inginales de ratones transcutáneamente vacunados con vacuna subunitaria ETEC trivalente. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se le retiró entonces la cinta 10 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de una mezcla que consiste de 25 \mug de CS3, 25 \mug de CS6 y 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron durante la noche (\sim 18 horas). Todos los ratones se vacunaron tres veces en el día 0, 14 y 28. Los nodos linfáticos inginales se recolectaron 30 días después de la tercera inmunización (día 58).
Figura 19. La respuesta del IgG del suero a TCI con CFA/I con y sin adyuvante de LTR192G. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de la vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico y se sometieron a abrasión media con papel lija 5 veces para afectar el estrato corneo. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul en volumen de 25 \mug de CFA/I y 25 \mug de CFA/I con 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron a la piel preparada y se le permitió permanecer en su lugar durante \sim18 horas. Los grupos separados de ratones se inyectaron intradérmicamente con 25 \mul de CFA/I (25 \mug) en la base de la cola. Todos los ratones recibieron una vacunación en el día 0, 14 y 28. Las muestras de suero se recolectaron 10 días después de la segunda vacunación (día 24). Los paneles muestran título IgG de suero a CFA/I (A), y el título IgG de suero a LTR192G (B).
Figura 20. Detección de IgA fecal específico de CFA/I (paneles superiores) e IgG (paneles inferiores) luego de TCI. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se sometió entonces a abrasión media con papel lija 5 veces. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul de las siguientes mezclas: solución salina amortiguada de fosfato (paneles A y E); 25 \mug de CFA/I (paneles B y F); y 25 \mug de CFA/I con 10 \mug de LTR192G (paneles C y G). Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Un grupo de ratones se vacunó mediante inyección intradérmica (ID) de 25 \mug de CFA/I (paneles D y H). Todos los ratones recibieron tres vacunaciones en el día 0, 14 y 28. Las muestras fecales se recolectaron dos semanas después de la tercera inmunización (día 42). Las muestras se procesaron y se evaluaron para IgA fecal (paneles A-D) e IgG (paneles E-H) contra CFA/I.
Figura 21. Respuesta IgG de suero a TCI con la vacuna subunitaria ETEC tetravalente. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se sometió a abrasión media con papel lija 5 veces. Los parches de gasa, fijados a un respaldo adhesivo se cargaron con una mezcla que consiste de 25 \mug de CFA/I, 25 \mug de CS3, 25 \mug de CS6 y 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron a piel preparada y se les permitió permanecer en su lugar durante \sim18 horas. Todos los ratones recibieron vacunación transcutánea en el día 0 y 14. Se recolectó el suero 10 días después de la segunda inmunización (día 24).
Figura 22. Detección de IgA fecal (paneles superiores) y los anticuerpos IgG (paneles inferiores) a los antígenos del factor de colonización luego de TCI con la vacuna ETEC tetravalente. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La piel hidratada se sometió entonces a abrasión media con papel emery. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con la vacuna tetravalente: 25 \mug de CFA/I, 25 \mug de CS, 25 \mug de CS6 y 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron durante toda la noche (\sim18 horas). Todos los ratones recibieron tres vacunas en el día 0, 14 y 28. Las muestras fecales se recolectaron dos semanas después de la tercera inmunización (día 42). Las muestras se procesaron y se evaluaron para IgA fecal a CFA/I (A), CS3 (B), y CS6 (C). Las muestras procesadas también se evaluaron para IgG fecal a CFA/I (D), CS3 (E), y CS6 (F).
Figura 23. Detección de los anticuerpos IgA (paneles superiores) e IgG (paneles inferiores) fecales al LTR192G luego de TCI con la vacuna ETEC tetravalente. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación y abrasión como se describe en la Figura 18. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con lo siguiente: 10 \mug de LTR192G (mLT); 25 \mug de CFA/I y LTR192G; o 25 \mug de CFA/I, 25 \mug de CS, 25 \mug de CS6 y 10 \mug de LTR192G. Los parches se aplicaron durante la noche (\sim18 horas). Todos los ratones recibieron tres vacunas en el día 0, 14 y 28. Las muestras fecales se recolectaron una semana después de la tercera inmunización (día 35). Las muestras se procesaron y se evaluaron para IgA fecal a LTR192G (paneles A-C) y para el IgG fecal a LTR192G (paneles D-F).
Figura 24. La vacunación transcutánea con CS3 y las vacunas subunitarias LTR192G provocan anticuerpos de suero que reconocen células completas ETEC que expresan CS3. Los ratones se afeitaron en la base de la cola mediante procedimientos estándar. La piel afeitada se le retiró la cinta 10 veces inmediatamente antes de la aplicación del parche. El parche de gasa fijado a un respaldo adhesivo se cargó con 25 \mug de CS3 y 10 \mug de LTR192G inmediatamente antes de la aplicación. El parche se aplicó durante \sim18 horas. Un grupo de 10 ratones recibió dos parches en el día 0 y el día 14. Se recolectó el suero 10 días después de la segunda inmunización (día 24). El suero se evaluó para anticuerpos a las células completas CS3, LTR192G, y ETEC (E243778).
Figura 25. La vacunación transcutánea con células completas de E. coli enterotoxigénicas muertas (EWC). Las EWC se prepararon al cultivar ETEC (cepa E243778) en caldo bacteriano. Las células se cosecharon mediante centrifugación e inactivadas durante la noche (temperatura ambiente) fijación con 2.5% de formalina. Las células completas inactivadas, muertas se lavaron con solución salina amortiguada de fosfato para remover la formalina. Antes de la inmunización, los ratones se afeitaron en la base de la cola. A la piel afeitada se le retiró cinta 10 veces inmediatamente antes de la aplicación del parche. El parche de gasa sobre el respaldo adhesivo se cargó con 10^{9} de las EWC y 10 \mug de LTR192G. Un grupo de 10 ratones recibidos se vacunaron transcutáneamente en el día 0 y 14. Se recolectó el suero 10 días después de la segunda inmunización. El suero se evaluó para los anticuerpos de EWC y LTR192G utilizando el método ELISA como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados de la Figura 22 muestran que la vacunación transcutánea con las células completas bacterianas muertas provocaron anticuerpos que reconocen las células completas y el adyuvante LTR192G. Estos resultados demuestran que las bacterias ETEC muertas se pueden aplicar a la piel con el adyuvante para provocar una inmunidad específica. Estos resultados son significativos porque ésta es la primera demostración de que el TCI es aplicable a las vacunas subunitarias y para el suministro de vacunas de células completas muertas.
Figura 26. La vacunación transcutánea con una vacuna ETEC multivalente que consiste de factores de colonización múltiple y dos enterotoxinas, LT y ST. Los ratones se afeitaron sobre la superficie caudal dorsal en la base de la cola 48 horas antes de vacunación. La piel afeitada se pre-trató mediante hidratación con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico y la cinta se retiró 10 veces para afectar el estrato corneo. Los parches de gasa se fijaron a un respaldo adhesivo y se cargaron con 25 \mul en volumen de 25 \mug de CS3/25 \mug CS6; 25 \mug de CS3/25 \mug de CS6/10 \mug de LTR192G y 25 \mug de CS3/25 \mug de CS6/10 \mug de LTR192G/8 \mug de STa. Los parches se aplicaron a la piel preparada y se les permitió permanecer en su lugar durante \sim18 horas. Todos los ratones recibieron vacunación en el día 0, 14 y 28. Las muestras de suero se recolectaron 14 días después de la segunda vacunación (día 42). Los paneles muestran título IgG de suero a CS3 (A) y título IgG de suero a CS6 (B).
Figura 27. Las formulaciones de parche húmeda y seca son adecuadas para elaborar artículos para TCI. En estos estudios el LT se utilizó como un ejemplo para preparar diferentes formulaciones líquidas y de parche. En resumen, el LT se formuló en solución salina amortiguada de fosfato y lactosa al 5%; el LT se mezcló con un adhesivo (Klucel) y se esparció como una película delgada sobre un respaldo oclusivo y se le permitió secarse al aire a temperatura ambiente; la solución LT se aplicó directamente a una superficie de parche de gasa y se secó al aire antes de uso; y la solución LT se aplicó a un parche de gasa y se administró como un parche completamente hidratado. Para ratones que recibieron la formulación LT líquida, se aplicó 10 \mug de LT directamente a la piel durante 1 hora (con o sin cubrir con gasa) y se enjuagó. Para ratones que recibieron los parches, se aplicaron las diferentes formulaciones de parche durante \sim24 horas antes de la remoción. La piel se hidrató con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico seguido por afectación media del estrato corneo con un hisopo que contiene pómez (PDI/NicePark). Todos los ratones recibieron dos vacunas en el día 0 y el día 14 con un equivalente de 10 \mug (\sim 1 cm^{2} de área). El suero se recolectó dos semanas más tarde (día 28) y se evaluó para anticuerpos de suero a LT. Las soluciones acuosas, proteína en adhesivo, formulaciones de parche secadas al aire y completamente hidratadas son adecuadas para el suministro transcutáneo de antígenos ETEC.
Descripción de las modalidades específicas de la invención
Se describe un sistema para inmunización transcutánea (TCI) que induce una respuesta inmune (por ejemplo, efectuador humoral y/o celular específico para un antígeno) en un animal o humano. El sistema de suministro provee una aplicación simple, epicutánea de una formulación comprendida de LT y, opcionalmente, uno o más adyuvantes, antígenos, y/o polinucleótidos (que codifican adyuvante y/o antígeno) a la piel de un animal o un sujeto humano. La respuesta inmune específica de antígeno es provocada de esta manera contra uno o más patógenos que incluyen E. coli enterotoxigénica (ETEC) con o sin la ayuda de mejoramiento de penetración química y/o física. Por lo menos un ingrediente o componente de la formulación (es decir, antígeno o adyuvante) se puede suministrar en forma seca antes de la administración de la formulación y/o como parte de un parche. Este sistema también se puede utilizar en conjunto con técnicas de inmunización entérica, de mucosa, o parenteral.
La activación de uno o más adyuvantes, antígenos, y células que presentan antígeno (APC) puede ayudar a promover la respuesta inmune. El APC procesa el antígeno y luego presenta uno o más epítopos a un linfocito. La activación puede promover el contacto entre la formulación y el APC (por ejemplo, células Langerhans, otras células dendríticas, macrófagos, linfocitos B), toma de la formulación mediante el APC, procesamiento del antígeno y/o la presentación de los epítopos mediante el APC, migración y/o diferenciación del APC, interacción entre el APC y el linfocito, o combinaciones de éstos. El adyuvante puede en sí mismo activar el APC. Por ejemplo, una quimioquina puede reclutar y/o activar el antígeno que presenta las células a un sitio. En particular, el antígeno que presenta la célula puede migrar desde la piel a los nodos linfáticos, y entonces presentar el antígeno a un linfocito, induciendo de esta manera una respuesta inmune específica de antígeno. Adicionalmente, la formulación puede contactar directamente un linfocito que reconoce el antígeno, induciendo de esta manera una respuesta inmune específica de antígeno.
Además de provocar reacciones inmunes que conducen a la activación y/o expansión de la célula B específica de antígeno y/o las poblaciones de célula T, que incluyen los anticuerpos y los linfocitos T citotóxicos (CTL), la invención puede regular positiva y/o negativamente uno o más componentes del sistema inmune al utilizar inmunización transcutánea para afectar el ayudante específico de antígeno (Th1 y/o Th2) o los subconjuntos de célula T con hipersensibilidad de tipo retrasado (T_{DTH}). Esto se puede ejemplificar mediante el comportamiento diferencial de la toxina del cólera y la enterotoxina lábil al calor de E. coli que puede dar como resultado diferentes respuestas de ayudante T. La respuesta inmune deseada es preferiblemente sistémica o regional (por ejemplo, mucósica) pero es usualmente no indeseable respuestas inmunes (por ejemplo, atopia, dermatitis, eczema, soriasis, u otras reacciones alérgicas o hipersensibilidad). Como se ve aquí, las respuestas inmunes provocadas son de la cantidad y calidad que suministran respuestas inmunes terapéuticas o profilácticas útiles para el tratamiento de enfermedades infecciosas.
El TCI se puede practicar con o sin penetración de la piel. Por ejemplo, las técnicas de mejoramiento de penetración química o física se pueden utilizar en tanto la piel no se perfore a través de la capa dérmica. La hidratación del intacto o la piel antes, durante, o inmediatamente después de la aplicación de la formulación se prefiere y se puede requerir en algunos o muchos casos. Por ejemplo, la hidratación puede incrementar el contenido de agua en la capa más superior de la piel (por ejemplo, estrato corneo o capa de la epidermis superficial expuesta mediante técnicas de mejoramiento de penetración) por encima del 25%, 50% o 75%.
La piel puede ser tocada con un aplicador (por ejemplo, material adsorbente sobre una almohadilla o palillo) que contiene agentes de hidratación o de penetración química o ellos se aplicar directamente a la piel. Por ejemplo, soluciones acuosas (por ejemplo, agua, solución salina, otros amortiguadores), acetona, alcoholes (por ejemplo, alcohol isopropílico), detergentes (por ejemplo, dodecil sulfato de sodio), agentes depilatorios o queratinolíticos (por ejemplo, hidróxido de calcio, ácido salicílico, ureas), humectantes (por ejemplo, glicerol, otros glicoles), polímeros (por ejemplo, polietileno o propilenglicol, polivinil pirrolidona), o combinaciones de éstos se pueden utilizar o incorporar en la formulación. De manera similar, someter a abrasión la piel (por ejemplo, abrasivos como un cartón o papel emery, papel de lija, parches fibrosos, pómez), remover una capa superficial de la piel (por ejemplo, pelar o retirar con una cinta adhesiva), microporar la piel utilizando una fuente de energía (por ejemplo, calor, luz, sonido, electricidad, magnetismo) o un dispositivo de irrupción de barrera (por ejemplo, una pistola, microaguja), o combinaciones de éstas pueden actuar como un mejorador de la penetración física. Ver WO98/29134 para la microporación de la piel y las Patentes U.S. 6,090,790 para microagujas y 6,168,587 para pistolas transdérmicas que se podrían adaptar para uso en vacunación transcutánea. El objetivo del mejoramiento de la penetración química o física en conjunto con el TCI es remover por lo menos el estrato corneo o la capa epidérmica más profunda sin perforar la piel a través de la capa dérmica. Esto se logra preferiblemente con una incomodidad menor como máximo para el sujeto humano o animal y sin sangrar en el sitio. Por ejemplo, aplicar la formulación a la piel intacta puede no involucrar energía térmica, óptica, sónica, o electromagnética para perforar las capas de la piel por debajo del estrato corneo o la epidermis.
También se describen formulaciones que son útiles para la vacunación así como también procesos para su elaboración. La formulación puede estar en forma seca o líquida. Una formulación seca se almacena y transporta más fácilmente que las vacunas convencionales, ésta rompe la cadena de frío requerida del lugar de elaboración de la vacuna al local donde ocurre la vacunación. Sin estar limitados a ningún modo particular de acción, otra vía en la cual la formulación seca puede ser una mejora sobre las formulaciones líquidas es que altas concentraciones del componente activo de la formulación (por ejemplo, uno o más adyuvantes y/o antígenos) se pueda lograr mediante la solubilización directamente en el sitio de la inmunización durante un período de tiempo corto. La humedad de la piel (por ejemplo, transpiración) y una venda oclusiva puede acelerar este proceso. De esta manera, es posible que una concentración que se aproxime al límite de solubilidad del ingrediente activo se pueda lograr in situ. Alternativamente, el ingrediente seco, activo de la formulación per se puede ser una mejora al suministrar una forma de partícula sólida que se toma y se procesa por las células que presentan antígeno. Estos mecanismos posibles se discuten no para limitar el alcance de la invención o sus equivalentes, sino para suministrar la interioridad en la operación de la invención y para guiar el uso de esta formulación en inmunización y vacunación.
La formulación se puede suministrar como un líquido: crema, emulsión, gel, loción, ungüento, pasta, solución, suspensión, u otras formas líquidas. Las formulaciones secas se pueden suministrar en varias formas: por ejemplo, polvos finos o granulados, películas uniformes, microesferas, y tabletas. La formulación se puede disolver y luego secar en un recipiente o sobre una superficie plana (por ejemplo, piel), o ésta puede simplemente ser empolvada sobre la superficie plana. Ésta se puede secar al aire, se puede secar con temperatura elevada, congelada o secar por pulverizado, recubierta o rociada sobre un sustrato sólido y luego secada, empolvada sobre un sustrato sólido, rápidamente congelada y luego lentamente secada bajo vacío, o combinaciones de éstas. Si diferentes moléculas son ingredientes activos de la formulación, ellas se pueden mezclar en solución y luego secar, o mezclar en forma seca solamente. Los compartimientos o cámaras del parche se pueden utilizar para separar los ingredientes activos de tal forma que solamente uno de los antígenos o adyuvantes se mantiene en forma seca antes de la administración; separar el líquido y el sólido de esta manera permite controlar durante el tiempo la tasa de la disolución de por lo menos un ingrediente seco, activo.
Un "parche" se refiere a un producto que incluye un sustrato sólido (por ejemplo, una venda quirúrgica oclusiva o no oclusiva) así como también por lo menos un ingrediente activo. El líquido se puede incorporar en un parche (es decir, un parche húmedo). Se pueden aplicar uno o más componentes activos de la formulación sobre el sustrato, incorporar en el sustrato o adhesivo del parche, o combinaciones de éstos. Un parche seco puede o no utilizar un reservorio líquido para solubilizar la formulación.
La formulación en forma líquida o sólida se puede aplicar con uno o más adyuvantes y/o antígenos ambos en los mismos o separados sitios o simultáneamente o en aplicaciones frecuentes, repetidas. El parche puede incluir un reservorio de liberación controlada o se puede utilizar una matriz o membrana que controla la tasa que permita la liberación del adyuvante y/o antígeno por etapas. Éste puede contener un reservorio único con un adyuvante y/o antígeno, o múltiples reservorios para separar los antígenos y adyuvantes individuales. El parche puede incluir antígenos adicionales de tal forma que la aplicación del parche induce una respuesta inmune a los antígenos múltiples. En tal caso, los antígenos pueden o no ser derivados de la misma fuente, pero ellos tendrán diferentes estructuras químicas con el fin de inducir una respuesta inmune específica para diferentes antígenos. Múltiples parches se pueden aplicar simultáneamente; un parche único puede contener múltiples reservorios. Para un tratamiento efectivo, se pueden aplicar múltiples parches a intervalos o constantemente durante un período de tiempo; ellos se pueden aplicar en diferentes momentos, durante períodos traslapantes, o simultáneamente. Por lo menos un antígeno y/o adyuvante se puede mantener en forma seca antes de la administración. La liberación posterior del líquido del reservorio o la entrada del líquido en un reservorio que contiene el ingrediente seco de la formulación por lo menos disolverá parcialmente ese ingrediente.
También se pueden incorporar sólidos en la formulación (por ejemplo, partículas de dimensiones de nanómetro o micrómetro). Las formas sólidas, (por ejemplo, nanopartículas o micropartículas) pueden ayudar en la dispersión o solubilización de los ingredientes activos; ayudar a llevar la formulación a través de capas superficiales de la piel; suministra un punto de unión para el adyuvante, antígeno, o ambos a un sustrato que se pueda opsonizar mediante las células que presentan antígeno, o combinaciones de éstos. La liberación prolongada de la formulación de un sólido poroso formado como una lámina, barra, o microesfera actúa como un depósito.
La formulación se puede elaborar bajo condiciones asépticas aceptables para las agencias regulatorias apropiadas (por ejemplo, la Administración de Alimentos y Fármacos) para biológicos y vacunas. Opcionalmente, componentes tales como los disecantes, excipientes, estabilizadores, humectantes, conservantes, adhesivos, materiales de parche, o combinaciones de éstos se pueden incluir en la formulación aunque ellos sean inmunológicamente inactivos. Ellos pueden, sin embargo, tener otras propiedades o características deseables.
Se suministra una dosis única o unitaria da la formulación adecuada para la administración. La cantidad de adyuvante o antígeno en la dosis unitaria puede ser de cualquier manera de rango amplio desde aproximadamente 0.001 \mug a aproximadamente 10 mg. Este rango puede ser desde aproximadamente 0.1 \mug a aproximadamente 1 mg; un rango más estrecho es desde aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 500 \mug. Otros rangos adecuados están entre aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 10 \mug, entre aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 50 \mug, entre aproximadamente 50 \mug y aproximadamente 200 \mug, y entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 5 mg. Una dosis preferida de la toxina es de aproximadamente 50 \mug o 100 \mug o menos (por ejemplo, desde aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 50 \mug o 100 \mug). La proporción entre el antígeno y el adyuvante puede ser de aproximadamente 1:1 (por ejemplo, enterotoxina lábil al calor de E. coli cuando éste es tanto antígeno como adyuvante) pero proporciones mayores pueden ser adecuadas para antígenos pobres (por ejemplo, aproximadamente 1:10 o menos), o también se pueden utilizar proporciones inferiores del antígeno al adyuvante (por ejemplo, aproximadamente 10:1, o más). Las proporciones nativas entre los antígenos LT y ETEC se pueden utilizar para formulaciones de célula completa o lisado.
Una formulación que comprende el adyuvante y el antígeno o el polinucleótido se puede aplicar a la piel de un sujeto humano o animal, el antígeno se presenta a las células inmunes, y se induce una respuesta inmune específica del antígeno. Esto puede ocurrir antes, durante, o después de la infección por el patógeno. Solamente se puede requerir antígeno, pero no un adyuvante adicional, si la inmunogenicidad de la formulación es suficiente para no requerir la actividad adyuvante. La formulación puede incluir un antígeno adicional de tal forma que la aplicación de la formulación induce una respuesta inmune contra múltiples antígenos (es decir, multivalente). En tal caso, los antígenos pueden o no ser derivados de la misma fuente, pero los antígenos tendrán diferentes estructuras químicas con el fin de inducir respuestas inmunes específicas para diferentes antígenos. Los linfocitos específicos de antígeno pueden participar en la respuesta inmune y, en el caso de la participación de los linfocitos B, los anticuerpos específicos de antígeno pueden ser parte de la respuesta inmune. Las formulaciones descritas anteriormente pueden incluir disecantes, excipientes, humectantes, estabilizadores, conservantes, adhesivos, y materiales de parche conocidos en la técnica.
La vacuna se utiliza para tratar un sujeto (por ejemplo, un humano o un animal necesitado del tratamiento tal como prevención de la enfermedad, protección de los efectos de la infección, terapia de la enfermedad existente o los síntomas, o combinaciones de éstas). La vacuna se puede utilizar terapéuticamente para tratar la enfermedad existente, protectoramente para evitar la enfermedad, para reducir la severidad y/o la duración de la enfermedad, para mejorar los síntomas de la enfermedad, o combinaciones de éstas.
El sitio de aplicación se puede proteger con corticoesteroides anti-inflamatorios tales como hidrocortisona, triamcinolona y mometazona o fármacos anti-inflamatorios no esteroides (NSAID) para reducir posibles reacciones locales de la piel o modular el tipo de respuesta inmune. De manera similar, los esteroides anti-inflamatorios NSAID se pueden incluir en el material de parche, o las formulaciones líquidas o sólidas; y lo corticoesteroides o NSAID se pueden aplicar después de la inmunización. El IL-10, TNF-\alpha, otros inmunomoduladores se pueden utilizar en lugar de los agentes anti-inflamatorios. Más aún, la formulación se puede aplicar a la piel sobre puesta más que un campo de nodo linfático drenante que utiliza aplicaciones simples o múltiples. La formulación puede incluir antígenos adicionales de tal forma que la aplicación induce una respuesta inmune a múltiples antígenos. En tal caso, los antígenos pueden o no ser derivados de la misma fuente, pero los antígenos tendrán diferentes estructuras químicas con el fin de inducir una respuesta inmune específica para diferentes antígenos. Los parches multi-cámara podrían permitir más suministro efectivo de vacunas multivalentes en razón a que cada cámara cubre diferentes células que presentan antígeno. Así, las células que presentan antígeno encontrarían solamente un antígeno (con o sin adyuvante) y así eliminarían la competición antigénica y mejorarían de esta manera la respuesta a cada antígeno individual en la vacuna multivalente.
La formulación se puede aplicar epicutáneamente a la piel para iniciar o reforzar la respuesta inmune en conjunto con las técnicas de penetración u otras rutas de inmunización. El inicio mediante inmunización transcutánea (TCI) con aplicaciones únicas o múltiples se puede seguir con técnicas entéricas, de mucosa, parenterales y/o transdérmicas para reforzar la inmunización con los mismos o antígenos alterados. El inicio de la inmunización entérica, de mucosa, parenteral y/o transdérmica con aplicaciones únicas o múltiples se puede seguir con técnicas transcutáneas para reforzar la inmunización con los mismos o antígenos alterados. Se debe notar que el TCI se distingue de las técnicas tópicas convencionales como la inmunización de mucosa o transdérmica porque el anterior requiere una membrana de mucosa (por ejemplo, pulmón, boca, nariz, recto) no encontrada en la piel y la última requiere la perforación de la piel a través de la dermis. La formulación puede incluir antígenos adicionales de tal forma que la aplicación a la piel induce una respuesta inmune a antígenos múltiples.
Además al antígeno y adyuvante, la formulación puede comprender un vehículo. Por ejemplo, la formulación puede comprender una emulsión AQUAPHOR, Freund, Ribi, o Syntex; emulsiones de agua en aceite (por ejemplo, cremas acuosas, ISA-720), emulsiones de aceite en agua (por ejemplo, cremas aceitosas, ISA-51, MF59), microemulsiones, lípidos anhidros y emulsiones de aceite en agua, otros tipos de emulsiones; geles, grasas, ceras, aceites, siliconas, y humectantes (por ejemplo, glicerol).
Los antígenos diferentes del LT se pueden derivar de cualquier patógeno que infecta un sujeto humano o animal (por ejemplo, bacteria, virus, hongo, o protozoario). La estructura química del antígeno se puede describir como uno o más carbohidratos, ácido graso, y proteína (por ejemplo, glicolípido, glicoproteína, lipoproteína). Se prefiere el antígeno proteináceo. El peso molecular del antígeno puede ser mayor de 500 daltons, 800 daltons, 1000 daltons, 10 kilodaltons, 100 kilodaltons, o 1000 kilodaltons. El mejoramiento de la penetración química o física se puede preferir para las estructuras macromoleculares como células, partículas virales, y moléculas mayores de un megadalton (por ejemplo, antígeno CS6), pero las técnicas como la hidratación y la aplicación con hisopo con un disolvente pueden ser suficientes para inducir la inmunización a través de la piel. El antígeno se puede obtener mediante técnicas recombinantes, síntesis química, o por lo menos purificación parcial de una fuente natural. Estos pueden ser conjugados químicos o recombinantes: por ejemplo, enlace entre grupos químicamente reactivos o fusión de proteína. El antígeno se puede suministrar como una célula o virus vivo, una célula o virus vivo atenuado, una célula muerta, o un virus inactivo. Alternativamente, el antígeno puede ser por lo menos parcialmente purificado en forma libre de célula (por ejemplo, célula o lisado viral, membrana u otra fracción subcelular). En razón a que la mayoría de los adyuvantes también tendrían actividad inmunogénica y serían considerados antígenos, también se esperaría que los adyuvantes tuvieran las propiedades y características de antígenos anteriormente mencionados.
La elección del adyuvante puede permitir la penetración o la modulación de la respuesta inmune. Más aún, la selección del adyuvante adecuado puede dar como resultado la inducción preferencial de una respuesta inmune humoral o celular, los isotipos de anticuerpo específico (por ejemplo, IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, y/o IgG4), y/o los subconjuntos de célula T específicos (por ejemplo, CTL, Th1, Th2 y/o T_{DTH}). El adyuvante es preferiblemente una exotoxina ribosilante de ADP químicamente inactiva (por ejemplo, proteolíticamente digerida) o genéticamente activa (por ejemplo, fusiones, supresiones o puntos mutantes) o una subunidad de ésta. El adyuvante, antígeno o ambos se pueden suministrar opcionalmente en la formulación con un polinucleótido (por ejemplo, ADN, ARN, cADN, cARN) que codifica el adyuvante o el antígeno según sea apropiado. El ADN covalentemente cerrado circular tal como los plásmidos son las formas preferidas del polinucleótido; sin embargo, también se pueden utilizar las formas lineales. El polinucleótido puede incluir una región tal como un origen de replicación, centrómero, telómero, promotor, mejorador, silenciador, iniciación transcripcional o terminación de señal, aceptador de empalme o sitio donador, sitio de unión de ribosoma, iniciación transduccional o señal de terminación, señal de poliadenilación, señal de localización celular, sitio de clivaje de proteasa, sitio poliligador, o combinaciones de éstos como se encuentran en los vectores de expresión.
Un "antígeno" es un componente activo de la formulación que se reconoce específicamente mediante el sistema inmune de un sujeto humano o animal después de la inmunización o vacunación. El antígeno puede comprender epítopos inmunogénicos únicos o múltiples reconocidos por el receptor de célula B (es decir, anticuerpo secretado o unido a membrana) o un receptor de célula T. Los epítopos proteináceos reconocidos por los receptores de célula T tiene longitudes típicas y residuos de amino ácido conservados que dependen del si ellos están unidos por complejos de histocompatibilidad principales (MHC) moléculas Clase I o Clase II sobre la célula que presenta el antígeno. En contraste, los epítopos proteináceos reconocidos por el anticuerpo pueden ser de longitud variable que incluyen oligopéptidos cortos extendidos o mayores, polipéptidos doblados. La diferencia del amino ácido único entre los epítopos se puede distinguir. El antígeno es capaz de inducir una respuesta inmune contra una molécula de un patógeno (por ejemplo, un antígeno CS6 es capaz de inducir una respuesta inmune específica contra la molécula CS6 del ETEC). Así, el antígeno es usualmente idéntico o por lo menos derivado de la estructura química de una molécula específica del patógeno, pero los miméticos que están solamente distantemente relacionados a tales estructuras químicas también se pueden utilizar exitosamente.
Un "adyuvante" es un componente activo de la formulación para ayudar a inducir una respuesta inmune al antígeno. La actividad del adyuvante es la capacidad a incrementar la respuesta inmune a un antígeno heterólogo (es decir, el antígeno que es una estructura química separada del adyuvante) mediante la inclusión del adyuvante mismo en la formulación o en combinación con otros componentes de la formulación o técnicas de inmunización particular. Como se anotó anteriormente, la molécula puede contener tanto actividades del antígeno como del adyuvante mediante antígeno químicamente conjugante y el adyuvante o regiones codificantes genéticamente fusionantes del antígeno y el adyuvante; así, la formulación puede contener solamente un ingrediente o componente.
El término "cantidad efectiva" pretende describir esa cantidad de adyuvante o antígeno que induce una respuesta inmune específica de antígeno. Un inmunógeno o vacuna "subunitaria" es una formulación comprendida de componentes activos (por ejemplo, adyuvante, antígeno) que se han aislado de otros componentes celulares o virales del patógeno (por ejemplo componentes de membrana o polisacárido como endotoxina) mediante técnicas recombinantes, síntesis química, o por lo menos purificación parcial de una fuente natural.
La inducción de una respuesta inmune puede suministrar un tratamiento tal como, por ejemplo, vacunación profiláctica o terapéutica para una enfermedad infecciosa. Un producto o método "induce" cuando su presencia o ausencia origina un cambio estadísticamente significativo en la magnitud de la respuesta inmune y/o cinética; cambio en los elementos inducidos del sistema inmune (por ejemplo, humoral versus celular, Th1 versus Th2); el efecto sobre la salud y el bienestar del sujeto; o combinaciones de éstas.
El término "campo de nodo linfático drenante" como se utiliza en la invención significa el área anatómica sobre la cual el linfático recolectado se filtra a través de un conjunto de nodos linfático definidos (por ejemplo, cervical, axilar, inguinal, epitroquelar, popliteal, aquellos del abdomen y toráx). Así, el mismo campo de nódulo linfático drenante puede ser objetivo por inmunización (por ejemplo, entérica, de mucosa, parenteral, transcutánea, transdérmica) a los pocos días requerido para células que presentan antígeno para que migren a los nódulos linfáticos si los sitios y momentos de inmunización son espaciados y llevan diferentes componentes de la formulación juntos (por ejemplo, dos parches cercanamente espaciados) con adyuvante o antígeno pueden ser efectivos cuando ninguno solo podría utilizarse exitosamente). Por ejemplo, un parche que suministra adyuvante mediante la técnica transcutánea se puede colocar sobre el mismo brazo como si se inyectara con una vacuna convencional para reforzar su efectividad en poblaciones viejas, pediátricas, u otras inmunológicamente comprometidas. En contraste, aplicar parches a diferentes limbos puede evitar que el parche que contenga adyuvante refuerce la efectividad de un parche que solo contiene antígeno.
Sin estar ligados por ninguna teoría particular para la operación de la invención sino solamente para suministrar una explicación para nuestras observaciones, tenemos la hipótesis de que este sistema de suministro transcutáneo lleva antígeno a las células del sistema inmune donde se induce una respuesta inmune. El antígeno puede pasar a través de capas de piel exteriores protectoras normalmente presentes (es decir, estrato corneo) e induce la respuesta inmune directamente, o a través de un antígeno que presenta población celular en la epidermis (por ejemplo, macrófago, macrófago de tejido, células Langerhans, otras células dendríticas, linfocito B, o célula Kupffer) que presenta antígeno procesado a los linfocitos. Así, con o sin técnicas de mejoramiento de penetración, la dermis no se penetra en una inyección subcutánea o técnicas transdérmicas. Opcionalmente, el antígeno puede pasar a través del estrato corneo por vía del folículo piloso o un organelo de la piel (por ejemplo, glándula sudorípara, glándula aceitosa).
La inmunización transcutánea con exotoxinas ribolisantes de ADP bacteriano (bARE) como un ejemplo, pueden apuntar a células Langerhans epidérmicas, conocidas por estar entre las más eficientes de las células que representan el antígeno (APC). La maduración del APC se puede evaluar mediante morfología y fenotipo (por ejemplo, expresión de las moléculas Clase II MHC, CD83, o moléculas co-estimulatorias). Hemos encontrado que el bARE parece activar las células Langerhans cuando se aplica epicutáneamente a la piel intacta. Los adyuvantes tal como el bARE clivado con tripsina pueden mejorar la activación de las células Langerhans. Las células Langerhans dirigen respuestas inmunes específicas a través de fagocitosis de los antígenos, y la migración de los nódulos linfáticos donde ellos actúan como APC para presentar el antígeno a los linfocitos, e inducir de esta manera una respuesta de anticuerpo potente. Aunque la piel se considera generalmente como una barrera para los patógenos, la imperfección de esta barrera se prueba por numerosas células Langerhans distribuidas a través de la epidermis que se diseñan para orquestar la respuesta inmune contra organismos que invaden a través de la piel. De acuerdo con Udey (Clin Exp Immunol, 107:s6-s8, 1997):
Las células Langerhans son células derivadas de la médula ósea que están presentes en el epitelio escamoso estratificado de todos los mamíferos. Ellos comprenden toda la actividad celular accesoria que está presente en epidermis no inflamada, y en el paradigma corriente son esenciales para la iniciación y la propagación de las respuestas inmunes dirigidas contra los antígenos aplicados epicutáneamente. Las células Langerhans son miembros de una familia de células accesorias potentes ("células dendríticas") que son ampliamente distribuidas, pero infrecuentemente representadas, en los órganos epiteliales y sólidos así como también en el tejido linfoide.
Se reconoce ahora que las células Langerhans (y presumiblemente otras células dendríticas) tienen un ciclo de vida con al menos dos etapas distintas. Las células Langerhans que se localizan en la epidermis constituyen una red regular de células "centinela" que atrapan antígeno. Las células Langerhans epidérmicas pueden ingerir partículas, que incluyen microorganismos, y son procesadores eficientes de los antígenos de complejo. Sin embargo, ellos expresan solamente bajos niveles de antígenos clase I y II MHC y moléculas co-estimulatorias (ICAM-1, B7-1 y B7-2) y son pobres estimuladores de células T no iniciadas. Después del contacto con el antígeno, algunas células Langerhans se activan, salen de la epidermis y migran a regiones dependientes de célula T de los nódulos linfáticos regionales donde ellos se localizan como células dendríticas maduras. En el curso de la salida la epidermis y migrar a los nódulos linfáticos, las células Langerhans epidérmicas que llevan antígeno (ahora los "mensajeros") exhiben cambios dramáticos en la morfología, fenotipo de superficie y función. En contraste con las células Langerhans epidérmicas, las células dendríticas linfoides son esencialmente no fagocíticas y procesan los antígenos de proteína ineficientemente, pero expresan altos niveles de antígenos clase I y clase II MHC y varias moléculas co-estimulatorias y son los estimuladores más potentes de células T no diferenciadas que se han identificado.
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El antígeno potente que presenta la capacidad de las células Langerhans se puede explotar para los inmunógenos y las vacunas suministradas transcutáneamente. Una respuesta inmune que utiliza el sistema inmune de la piel se puede logar al suministrar la formulación solamente a las células Langerhans en el estrato corneo (es decir, la capa más exterior de la piel que consiste de células cornificadas y lípidos) y posteriormente activar las células Langerhans al tomar el antígeno, migrar a los folículos de la célula B y/o las regiones dependientes de célula T, y presentar el antígeno a los linfocitos B y/o T. Si los antígenos diferentes al bARE (por ejemplo, toxina, factor de colonización o virulencia) van a ser fagocitosados por las células Langerhans, entonces estos antígenos se podrían también transportar a los nódulos linfáticos para la presentación a los linfocitos T y posteriormente inducir una respuesta inmune específica para ese antígeno. Así, una característica del TCI es la activación de la célula Langerhans, presumiblemente mediante bARE o derivados de éste, quimioquinas, citoquinas, PAMP, u otra sustancia que activa la célula Langerhans que incluyen sensibilizadores y adyuvantes de contacto. Incrementar el tamaño de la población de la piel de las células Langerhans o su estado de activación se esperaría también que mejorara la respuesta inmune (por ejemplo, pretratamiento de acetona). En sujetos de edad o en piel sin células Langerhans (es decir, por daño UV), puede ser posible reabastecer la población de células Langerhans (por ejemplo, pretratamiento con tretinoina).
Los adyuvantes tales como el bARE se conocen por ser altamente tóxicos cuando se inyectan o se dan sistémicamente. Pero si se colocan sobre la superficie de la piel intacta (es decir, epicutánea), ellas poco probablemente inducirán toxicidad sistémica. Así, la ruta transcutánea puede permitir la ventaja de efectos adyuvantes sin toxicidad sistémica. Una ausencia similar de toxicidad se podría esperar si la piel se penetrara solo por debajo del estrato corneo (por ejemplo, cerca o en la epidermis), pero no a través de la dermis. Así, la capacidad de inducir la activación del sistema inmune a través de la piel le confiere la ventaja inesperada de respuestas inmunes potentes sin toxicidad sistémica.
La magnitud de la respuesta del anticuerpo inducida por la maduración de afinidad y el cambio de isotipo a anticuerpos predominantemente IgG se logra generalmente con la ayuda de la célula T, y se sugiere la activación tanto de las sendas Th1 como Th2 mediante la producción de IgG1 e IgG2. Alternativamente, una respuesta grande de anticuerpo se puede inducir a un antígeno independiente de timo tipo 1 (TI-1) que activa directamente el linfocito B o podría tener efectos activantes similares sobre los linfocitos B tal como la regulación hacia arriba de las moléculas Clase II MHC, BT, CD40, CD25 e ICAM-1.
El espectro de las respuestas inmunes de la piel comúnmente conocidas se representa mediante la atopia o dermatitis de contacto. La dermatitis de contacto, una manifestación patogénica de la activación de la célula Langerhans, está dirigida por las células Langerhans las cuales fagocitan el antígeno, migran a los nódulos linfáticos, presentes en el antígeno, y sensibilizan los linfocitos T que migran a la piel y originan la respuesta celular destructiva intensa que ocurre en sitios de la piel afectados. Tales respuestas no se conocen en general por estar asociadas con anticuerpos IgG específicos de antígeno. La dermatitis atópica puede utilizar la célula Langerhans en una forma similar, pero se identifica con las células Th2 y se asocia generalmente con altos niveles de anticuerpo IgE.
De otra parte, la inmunización transcutánea con bARE suministra una respuesta inmune útil y deseable. Usualmente no existen hallazgos típicos de atopia o dermatitis de contacto dados los altos niveles de IgG que se inducen. La toxina del Cólera o la enterotoxina lábil al calor de E. coli aplicada epicutáneamente a la piel puede lograr la inmunización en la ausencia de la infiltración de linfocito 24, 48 y 120 horas después de la inmunización. La reactividad menor de la piel vista en ensayos preclínicos se trató fácilmente. Esto indica que las células Langerhans acopladas mediante inmunización transcutánea en la medida en que ellas "comprendan toda la actividad celular accesoria que está presente en la epidermis no inflamada, y en el paradigma habitual son esenciales para la iniciación y la propagación de las respuestas inmunes dirigidas contra los antígenos aplicados epicutáneamente" (Udey, 1997). La unicidad de la respuesta inmune transcutánea aquí también se indica mediante tanto altos niveles del anticuerpo IgG específico de antígeno, como del tipo de anticuerpo producido (por ejemplo, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA) y generalmente la ausencia del anticuerpo IgE específico de antígeno. La imunización transcutánea podría ocurrir concebiblemente en tandem con la inflamación de la piel si la activación suficiente de las células que presentan antígeno y los linfocitos T ocurriera en una respuesta transcutánea que coexiste con la atopia o la dermatitis de contacto.
El blanco transcutáneo de las células Langerhans también se puede utilizar en tandem con agentes para desactivar todo o parte de su función que presenta el antígeno, modificando de esta manera la inmunización o evitando la sensibilización. Las técnicas para modular la activación Langerhans u otras células inmunes de la piel incluyen, por ejemplo, el uso de agente esteroides y no esteroides anti-inflamatorios (NSAID); ciclosporina, FK506, rapamicina, ciclofosfamida, glucocorticoides, u otros inmunosupresores; interleuquina-10; anticuerpos monoclonales con interleuquina-1 (mAB) o antagonistas receptores solubles (RA); inhibidores de enzima convertidora de interleuquina-1 (ICE); o el vaciamiento por vía de superantígenos tal como a través del vaciamiento de las células Langerhans epidérmicas inducidas por la enterotoxina A Staphylococcica (SEA). Los compuestos similares se pueden utilizar para modificar la respuesta innata de las células Langerhans e inducir diferentes respuestas de ayudante T (Th1 o Th2) o puede modular respuestas inflamatorias de la piel para disminuir los efectos colaterales potenciales de la inmunización. De manera similar, los linfocitos se pueden inmunosuprimir antes, durante o después de la inmunización al administrar separadamente inmunosupresores o mediante la coadministración de inmunosupresores con la formulación. Por ejemplo, puede ser posible inducir respuestas potentes inmunes protectoras sistémicas con agentes que normalmente darían como resultado hipersensibilidad de contacto alérgica o irritante pero agregar los inhibidores de ICE puede aliviar las reacciones adversas de la piel.
El TCI se puede lograr a través de la actividad de unión GM1 de gangliósido de CT, LT, o subunidades de éstas (por ejemplo, CTB o LTB). El gangliósido GM1 es un glicolípido de membrana celular ubicuo encontrado en todas las células de mamífero. Cuando la subunidad CT B pentamérica se une a la superficie celular, se forma un poro hidrofílico que le permite a la subunidad A insertarse a través de la bicapa de lípido. Se pueden utilizar otros objetivos de unión sobre el APC. La subunidad LTB se une al GM1 de gangliósido además de otros gangliósidos y sus actividades de unión pueden contar por el hecho de que el LT es altamente inmunogénico sobre la piel.
El TCI con bARE o los fragmentos o conjugados que contienen la subunidad B de éste pueden requerir su actividad de unión de gangliosido GM1. Cuando los ratones se inmunizaron transcutáneamente con CT, CTA y CTB, se requirió CT y CTB para inducción de una respuesta inmune. El CTA contiene la actividad de exotoxina ribosilante de ADP pero solamente el CT y el CTB que contienen la actividad de unión son capaces de inducir una respuesta inmune indicando que la subunidad B era necesaria y suficiente para inmunizar a través de la piel. Concluimos que las células Langerhans u otro APC se puede activar mediante unión CTB a su superficie celular dando como resultado una respuesta inmune transcutánea.
Antígeno
El sistema de inmunización transcutáneo suministra agentes a las células especializadas (por ejemplo, células de presentación de antígeno, linfocitos) que producen una respuesta inmune. Estos agentes como una clase se denominan antígenos. El antígeno puede estar compuesto de estructuras químicas tales como, por ejemplo, carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípidos, lipoproteína, fosfolípidos, polipéptidos, conjugados de éstos, o cualquier otro material conocido por inducir una respuesta inmune. El antígeno puede ser un organismo completo tal como, por ejemplo, una bacteria o un virión; el antígeno se puede obtener de un extracto o lisado, de células completas o membrana sola; o el antígeno se puede sintetizar químicamente o se produce mediante tecnología recombinante.
El antígeno se puede expresar mediante tecnología recombinante, preferiblemente como una fusión con una etiqueta de afinidad o epítopo: síntesis química de un oligopéptido, libre o conjugado a las proteínas portadoras, se puede utilizar para obtener un antígeno. Los oligopéptidos se consideran un tipo de polipéptido. Se prefieren longitudes del oligopéptido de 6 residuos a 20 residuos. Los polipéptidos también se pueden sintetizar como estructuras ramificadas (por ejemplo, Patentes U.S. 5,229,490 y 5,390,111). Los polipéptidos antigénicos incluyen, por ejemplo, los epítopos de célula B y célula T sintéticos o recombinantes, los epítopos de célula T universales, y los epítopos de célula T mezclados de un organismo o enfermedad y los epítopos de célula B de otra. El antígeno obtenido a través de tecnología recombinante o de síntesis de péptido, así como también el antígeno obtenido de fuentes o extractos naturales, se puede purificar mediante las características físicas y químicas del antígeno, preferiblemente mediante fraccionamiento o cromatografía. Los recombinantes pueden combinar subunidades B o quimeras de bARE. Se puede utilizar una formulación de antígeno multivalentes para inducir una respuesta inmune a más de un antígeno al mismo tiempo. Los conjugados se pueden utilizar para inducir una respuesta inmune a múltiples antígenos, para reforzar la respuesta inmune, o ambas. Adicionalmente, las toxinas se pueden reforzar mediante el uso de toxóides, o toxoides reforzados por el uso de toxinas. La inmunización transcutánea se puede utilizar para reforzar las respuestas inducidas inicialmente por otras rutas de inmunización tal como por rutas oral, nasal o parenteral. El antígeno incluye, por ejemplo, toxinas, toxoides, subunidades de éstas, o combinaciones de éstas (por ejemplo, toxina del cólera, toxoide del tétanos); adicionalmente las toxinas, toxoides, subunidades de éstas, o combinaciones de éstas pueden actuar tanto como antígeno como adyuvante. Tal inmunización oral/transcutánea o transcutánea/oral puede ser especialmente importante para mejorar la inmunidad de la mucosa en enfermedades donde la inmunidad de la mucosa se correlaciona con la protección.
El antígeno se puede solubilizar en un amortiguador o agua o disolventes orgánicos tales como alcohol o DMSO, o incorporar en geles, emulsión, microemulsiones, y cremas. Los amortiguadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, solución salina amortiguada de fosfato libre de Ca^{++}/Mg^{++}, solución salina amortiguada de fosfato, solución salina normal (150 mM de NaCl en agua), y Hepes o amortiguador Tris. El antígeno no soluble en un amortiguador neutro se puede solubilizar en ácido acético 10 mM y diluir luego al volumen deseado con un amortiguador neutro tal como un PBS. En el caso del antígeno soluble solamente a pH ácido, acetato-PBS a pH ácido se puede utilizar como un diluyente después de la solubilización en ácido acético diluido. El glicerol puede ser un amortiguador no acuoso adecuado para uso en la vacuna.
Un antígeno hidrófobo se puede solubilizar en un detergente o tensoactivo, por ejemplo un polipéptido que contiene un dominio que abarca la membrana. Adicionalmente, para los liposomas que contienen formulaciones, se puede mezclar un antígeno en una solución detergente (por ejemplo, extracto de membrana celular) con lípidos, y se pueden formar entonces liposomas al remover el detergente mediante disolución, diálisis, o cromatografía de columna. Ciertos antígenos (por ejemplo, proteínas de membrana) no necesitan ser solubles per se, pero se pueden insertar directamente en una membrana de lípido (por ejemplo, un virosoma), en una suspensión de virión sola, o suspensiones de microesferas o de bacterias inactivadas por calor que se pueden tomar mediante células que presentan antígeno activo (por ejemplo, opsonización). Los antígenos también se pueden mezclar con un mejorador de la penetración como se describe en la WO 99/43350.
Muchos antígenos se conocen en la técnica los cuales se pueden utilizar para vacunar sujetos humanos o animales e inducir una respuesta inmune específica para patógenos particulares, así como también métodos para preparar el antígeno, determinar una dosis adecuada de antígeno, ensayar la inducción de una respuesta inmune, y tratar la infección por un patógeno (por ejemplo, bacteria, virus, hongo, o protozoario).
El efecto de la infección de Escherichia coli de los mamíferos depende de la cepa particular del organismo. Muchas E. coli benéficas están presentes en los intestinos. En razón a la asociación inicial con la enfermedad diarréica, se han identificado cinco categorías de E. coli diarréicas: la enterotoxigénica (ETEC), la enteropatogénica (EPEC), la enterohemorrágica (EHEC), la enteroagregante (EAggEC), y la enteroinvasiva (EIEC). Ellas se agrupan de acuerdo con las propiedades de virulencia características, tales como la elaboración de toxinas y los factores de colonización y/o mediante los tipos específicos de interacciones con las células epiteliales intestinales. Las ETEC son las más comunes de las E. coli diarréicas y poseen los riesgos más grandes para los viajeros. Las cepas que se han cultivado de humanos incluyen la B7A (CS6, LT, STa), H10407 (CFA/I, LT, STa) y E24377A (CS3, CS1, LT, STa). Ellas se pueden utilizar únicamente o en combinación con fuentes de células completas de antígeno que suministran una variedad de diferentes toxinas y factores de colonización.
Existe necesidad de vacunas que sean específicas contra E. coli enterotoxigénica que den origen a anticuerpos que reaccionen de manera cruzada y que protejan de manera cruzada contra la colonización más común y los factores de virulencia. La familia CS4-CFA/I de proteínas fimbriales se encuentra sobre algunas de las cepas de E. coli eterotoxigénicas más prevalentes: existen seis miembros de esta familia de antígenos ETEC, CFA/I, CS1, CS2, CS4, CS17, y PCF 0166.
Los antígenos de factor de colonización (CFA) del ETEC son importantes en la etapa inicial de colonización y la adherencia de bacterias a los epitelios intestinales. En estudios epidemiológicos de adultos y niños con diarrea, se encontró CFA/I en un gran porcentaje de morbilidad atribuido al ETEC. El CFA/I está presente sobre las superficies de las bacterias en la forma de (fimbriae) pilli, que son fibras de proteína de 7 nm de diámetro rígidas compuestas de subunidades de pilin repetidas. Los antígenos CFA/I promueven la unión resistente a manosa a los límites de barrido humano con una aparente sensibilidad al ácido siálico. De esta manera, se ha postulado que una vacuna que estabiliza la inmunidad contra estas proteínas puede evitar la unión a tejidos suaves y a la posterior enfermedad.
Otros antígenos que incluyen CS3, CS5 y CS6, CFA/I, CS3 y CS6 pueden ocurrir sola, pero con rara excepción el CS1 solo se encuentra con el CS3, CS2 con CS3, CS4 con CS6 y CS5 con CS6. Los estudios serológicos muestran que estos antígenos ocurren en cepas que cuentan hasta con el 75% o menos tanto como el 25% de casos de ETEC, dependiendo de la localización del estudio.
Los péptidos de consenso se han descrito en la Patente U.S. 5,914,114 que elevan los anticuerpos contra los antígenos de todos los miembros de la familia de E. coli CS4-CFA/I. Aunque el terminal N de los miembros de esta familia muestra un alto grado de identidad, el resto de la secuencia de las proteínas muestra menos relación a través de las cepas. Los péptidos de consenso comprenden los epítopos de la célula B y la célula T lineales conocidos, y lleva un alto grado de relación de evolución a través de los seis diferente factores de colonización. Por ejemplo, los péptidos de consenso que tengan la secuencia de amino ácido (un residuo de amino ácido se puede agregar al su terminal o modificarse internamente para suministrar un enlace reactivo): VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPA (SEQ ID NO: 1) y VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPASVALTYSPA (SEQ ID NO: 2).
Estos péptidos de consenso se construyeron con base en las regiones homólogas de los antígenos CFA/I, CS1, CS2, CS4, CS17, y PCF 0166.
TABLA 1 Alineamiento de antígenos de la familia CS4-CFA/I (SEQ ID NOS: 3-8)
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El CS6, un componente del factor de colonización IV (CFA/I), también se puede encontrar en más del 25% de las cepas de ETEC en inspecciones serológicas (por ejemplo, los soldados en el Medio Este). Las secuencias de nucleótido de los antígenos CS3 y CS6, junto con el proceso para producirlos, se describen en la Patente U.S. 5,698,416.
Otros antígenos que se pueden utilizar son toxinas que originan enfermedades entéricas tales como, por ejemplo, la toxina shiga y las enterotoxinas de E. coli. La enterotoxina lábil al calor (LT) se describe adelante, pero las enterotoxinas estables al calor (por ejemplo, STa, STb) que originan los síntomas de la enfermedad también se pueden neutralizar por el anticuerpo. El LT es una toxina periplasmática y el ST es una toxina extracelular. El STa es metanol soluble y el STb es metanol insoluble. Se utilizan dos precursores diferentes: el STa es un péptido de 18-19 amino ácidos y el STb es un péptido de 48 amino ácidos sin secuencia de similitud entre ellas. Los conjugados entre los multímeros LT y ST o ST también se pueden utilizar (ver Patente U.S. 4,886,663).
Sería ventajoso para una vacuna que se desarrolle para un amplio rango de enfermedades comunes de viajeros, especialmente las enfermedades infecciosas entéricas. Por ejemplo, el campilobacteriosis (Campylobacter jejuni), giardiasis (Giardia intestinales), hepatitis (virus de la hepatitis A o B), malaria (Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, y P. malariae), shigellosis (Shigella boydii, S. dysenteriae, S. flexneri, y S. sonnei), gastroenteritis viral (rotavirus), y combinaciones de éstas se pueden tratar al incluir antígenos derivados del patógenos responsable. Son deseables los anticuerpos sistémicos o de mucosa que neutralizan la toxicidad o bloquean la unión y la entrada a la célula. Una respuesta inmune que es específica para moléculas asociadas con patógenos (por ejemplo, toxinas, proteínas de membrana) se puede inducir mediante varias rutas de administración (por ejemplo, entérica, de mucosa, parenteral, transcutánea).
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Adyuvante
La formulación contiene un adyuvante, aunque la molécula única puede contener tanto propiedades adyuvantes como de antígeno (por ejemplo, enterotoxina lábil al calor de E. coli). Los adyuvantes son sustancias que se utilizan para potenciar específica o no específicamente una respuesta inmune específica de antígeno, quizás a través de la activación de células que presentan antígeno (por ejemplo, células dendríticas en varias capas de la piel, especialmente células Langerhans). Ver también Elson et al. (in Handbook of Mucosal Immunology, Academic Press, 1994). Aunque la activación puede ocurrir inicialmente en la epidermis o la dermis, los efecros pueden persistir en la medida en que las células dendríticas migran a través del sistema linfático y la circulación. El adyuvante se puede formular y aplicar con o sin el antígeno, pero generalmente, la activación de las células que presentan antígeno por el adyuvante ocurre antes de la presentación del antígeno. Alternativamente, ellas se pueden presentar separadamente dentro de un intervalo corto de tiempo pero apuntando a la misma región anatómica (por ejemplo, el mismo campo de nódulos linfáticos drenantes).
Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, quimioquinas (por ejemplo, defensinas, HCC-1, HCC-4, MCP-1, MCP-3, MCP-4, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIP-1\delta, MIP-3\alpha, MIP-2, RANTES); otros ligandos de receptores de quimioquina (por ejemplo, CCR1, CCR-2, CCR-5, CCR-6, CXCR-1); citoquinas (por ejemplo, IL-1\beta, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12; IFN-\gamma; TNF-\alpha; GM-CSF); otros ligandos de receptores para aquellas citoquinas, motivos CpG inmunoestimulatorios en ADN bacteriano u oligonucleótidos; dipéptido de muramilo (MDP) y derivados de éstos (por ejemplo, murabutide, treonil-MDP, muramil tripéptido); proteínas de choque térmico y derivados de éstos; homólogos de Leishmania del elF4a y derivados de éstos; exotoxinas ribosilantes de ADP bacterianas y derivados de éstas (por ejemplo, mutantes genéticos, fragmentos que contienen la subunidad A y/o B, versiones químicamente toxoides); conjugados químicos o recombinantes genéticos que contienen exotoxinas ribosilantes de ADP bacteriano o derivados de éstos; el arreglo del tandem C3d; el lípido A y los derivados de éstos (por ejemplo, monofosforilo o lípido difosforilo A, los análogos del lípido A, AGP, AS02, AS04, DC-Chol, Detox, OM-174); ISCOMS y saponinas (por ejemplo, Quil A, QS-21); escualeno; super antígenos; o sales (por ejemplo, hidróxido o fosfato de aluminio, fosfato de calcio). Ver también Nohria et al. (Biotherapy, 7:261-269, 1994) y Richards et al. (in Vaccine Design, Eds. Powell et al., Plenum Press, 1995) para otros adyuvantes útiles.
El adyuvante se puede escoger para inducir preferencialmente el anticuerpo o los efectuadores celulares, isotipos de anticuerpo específico (por ejemplo, IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgA secretorio, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, y/o IgG4), o subconjuntos de célula T específica (por ejemplo, CTL, Th1, Th2, y/o T_{DTH}). Por ejemplo, las células que presentan antígeno pueden presentar antígeno restringido Clase II a las células CD4+ T precursoras, y se pueden ingresar la senda Th1 o Th2. Las células ayudantes T que seleccionan activamente la citoquina son las células efectuadoras primarias; ellas son células de memoria si están descansando. La reactivación de las células de memoria produce células efectuadoras de memoria. El Th1 secreta característicamente IFN-\gamma (también se pueden secretar TNF-\beta e IL-2) y se asocian con "ayuda" para inmunidad celular, aunque el Th2 secreta característicamente IL-4 (también se pueden secretar IL-5 e IL-13) y están asociadas con "ayuda" para inmunidad humoral. Dependiendo de la patología de la enfermedad, se pueden escoger los adyuvantes para preferir una respuesta Th1 (por ejemplo, células citolíticas específicas de antígeno) versus una respuesta Th2 (por ejemplo, anticuerpos específicos de antígeno).
Los dinucleótidos CpG no metilados o los motivos similares se conocen por activar los linfocitos B y los macrófagos (ver la Patente U.S. 6,218,371). Se puede utilizar como adyuvantes otras formas de ADN bacteriano. El ADN bacteriano está entre la clase de estructuras que tiene patrones que le permiten al sistema inmune reconocer sus orígenes patogénicos para estimular la respuesta inmune innata que conduce a las respuestas inmunes adaptativas. Estas estructuras se denominan patrones moleculares asociados a patógeno (PAMP) e incluyen lipopolisacáridos, ácidos teicóico, motivos CpG no metilados, ARN de doble cadena, y maninas. Los PAMP inducen señales endógenas que pueden mediar su respuesta inflamatoria, actúan como coestimuladores de la función de la célula T y el control de la función efectuadora. La capacidad de los PAMP para inducir estas respuestas juega un papel en su potencial como adyuvantes y sus objetivos son células que presentan antígeno tal como células dendríticas y macrófagos. Las células que presentan antígeno de la piel podrían de manera similar ser estimuladas mediante PAMP trasmitido a través de la piel. Por ejemplo, las células Langerhans, un tipo de célula dendrítica, se podría activar mediante PAMP en una solución sobre la piel con una molécula transcutáneamente pobremente inmunogénica y ser inducida para migrar y presentar esta molécula pobremente inmunogénica a las células T en el nodo linfático, induciendo una respuesta de anticuerpo a la molécula pobremente inmunogénica. Los PAMP se podrían utilizar también en conjunto con otros adyuvantes de la piel tal como la toxina del cólera para inducir moléculas coestimulatorias diferentes y controlar las funciones efectuadoras diferentes para guiar la respuesta inmune, por ejemplo de una respuesta Th2 a Th1.
La mayoría de las exotoxinas ribosilantes de ADP (bARE) se organizan como heterodímeros A:B con una subunidad B que contiene la actividad de unión del receptor y una subunidad A que contiene la actividad de ribosiltransferasa de ADP. El bARE de ejemplo incluye la toxina del cólera (CT) la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT), la toxina de difteria, la exotoxina A de las Pseudomonas (ETA), la toxina pertussis (PT), la toxina de C. botulinum C2, la toxina de C. botulinum C3, la exoenzima del C. limosum, la exoenzima del B. cereus, el sitio de clivaje de las Pseudomonas (por ejemplo, Dickenson et al., Infect Immun, 63:1617-1623, 1995) o se pueden utilizar mutaciones que afectan la ribosilación del ADP (por ejemplo, Douce et al., Infect Immun, 65:28221-282218, 1997).
El CT, LT, ETA y PT, a pesar de que tienen diferentes sitios de unión celular, son adyuvantes potentes para la inmunización transcutánea, induciendo anticuerpos IgG pero no anticuerpos IgE. El CTB sin el CT puede también inducir anticuerpos IgG. Así, tanto el bARE como un derivado de éste pueden inmunizar efectivamente cuando se aplican epicutáneamente a la piel. El LT nativo como un adyuvante y antígeno, sin embargo, es claramente no tan potente como el CT nativo. Pero el bARE activado puede actuar como adyuvantes para antígenos débilmente inmunogénicos en un sistema de inmunización transcutáneo. Así, la inmunización terapéutica con uno o más antígenos se podría utilizar separadamente o en conjunto con inmunoestimulación de las células que presentan antígeno para inducir una respuesta inmune profiláctica o terapéutica.
En general, las toxinas se pueden inactivar químicamente para formar toxoides que son menos tóxicos pero que permanecen inmonogénicos. Nosotros visualizamos que el sistema de inmunización transcutáneo que utiliza inmunógenos basados en toxina y adyuvantes puede lograr niveles de anti-toxina adecuados para la protección contra estas enfermedades. Los anticuerpos anti-toxina se pueden inducir a través de inmunización con las toxinas, o los toxoides genéticamente destoxificados mismos, o con toxoides y adyuvantes. Las toxinas genéticamente toxoides que han alterado la actividad de la exotoxina ribosilante de ADP o el sitio de clivaje de tripsina, pero no la actividad de unión, se prevé que sean especialmente útiles como activadores no tóxicos de células que presentan antígeno utilizadas en inmunización transcutánea y pueden reducir las preocupaciones sobre el uso de toxina.
El bARE también puede actuar como una adyuvante para inducir inmunización transcutánea a través de CTL específico de antígeno. El adyuvante bARE se puede conjugar químicamente a otros antígenos que incluyen, por ejemplo, carbohidratos, polipéptidos, glicolípidos, y antígenos glicoproteína. La conjugación química con toxinas, sus subunidades, o los toxoides con estos antígenos se esperaría que mejorara la respuesta inmune de estos antígenos cuando se aplica epicutáneamente. Para solucionar el problema de la toxicidad de las toxinas (por ejemplo, la toxina de la difteria se conoce porque es tan tóxica que una molécula puede matar una célula) y para solucionar los problemas de trabajar con tales toxinas potentes como el tétano, varios trabajadores han tomado una aproximación recombinante para producir toxoides genéticamente producidos. Esto se basa en inactivar la actividad catalítica de la ribosil trasferasa de ADP mediante supresión genética. Estas toxinas retienen sus capacidades de unión, pero les falta la toxicidad, de las toxinas naturales. Tales exotoxinas genéticamente toxoides se esperaría que indujeran una respuesta inmune transcutánea y actuaran como adyuvantes. Ellos pueden suministrar una ventaja en el sistema de inmunización transcutánea porque ellas no crearían una preocupación de seguridad en la medida en que los toxoides no se consideraran tóxicos. La activación a través de una técnica tal como el clivaje de tripsina, sin embargo, se esperaría que mejorara las calidades de adyuvante del LT a través de la piel que le falta a las enzimas similares a la tripsina. Adicionalmente, existen varias técnicas para modificar químicamente las toxinas y poder manejar el mismo problema. Estas técnicas podrían ser importantes en ciertas aplicaciones, especialmente a aplicaciones pediátricas, en las cuales las toxinas ingeridas podrían crear posiblemente reacciones adversas.
El adyuvante puede ser bioquímicamente purificado de una fuente natural (por ejemplo, pCT o pLT) o producirse recombinantemente (por ejemplo, rCT o rLT). La exotoxina ribosilante de ADP se puede purificar antes o después de la proteolisis (es decir, activación). También se puede utilizar la subunidad B de la exotoxina ribosilante de ADP: purificada de la enzima nativa después de la proteolisis o producida de un fragmento de la región codificante completa de la enzima. La subunidad de la exotoxina ribosilante de ADP se puede utilizar separadamente (por ejemplo, CTB o LTB) o junta (por ejemplo, CTA-LTB, LTA-CTB) o mediante conjugación química o fusión genética.
Las mutaciones puntuales (por ejemplo, las sustituciones de amino ácidos simples, dobles, o triples), las supresiones (por ejemplo, el sitio de reconocimiento de proteasa), y también se pueden utilizar los dominios funcionales aislados de la exotoxina ribosilante de ADP como adyuvantes. Se han descrito derivados que son menos tóxicos o que han perdido su actividad ribosilante de ADP, pero que retienen su actividad adyuvante. Los mutantes específicos de la enterotoxina lábil al calor de E. coli incluyen LT-K63, LT-R72, LT (H44A), LT (R192G), LT (R192G/L211A), y LT (\Delta192-194). La toxicidad se puede ensayar con el ensayo de célula adrenal Y-1 (Clements and Finkelstein, Infect Immun, 24:760-769, 1979). La ribosilación del ADP se puede ensayar con el ensayo de NAD-agmatina ADP-ribosiltransferasa (Moss et al., J Biol Chem, 268:6383-6387, 1993). Las exotoxinas ribosilantes de ADP particulares, los derivados de éstas, y los procesos para su producción y caracterización se describen en las Patentes U.S. 4,666,837; 4,935,364; 5,308,835; 5,785,971; 6,019,982; 6,033,673; y 6,149,919.
Un activador de las células Langerhans también se puede utilizar como un adyuvante. Ejemplos de tales activadores incluyen: inductores de proteína de choque térmico; sensibilizadores de contacto (por ejemplo, trinitroclorobenceno, dinitrofluoronbenceno, mostaza de nitrógeno, pentadecicatecol): toxinas (por ejemplo, toxina Shiga, enterotoxina Staph B); lipopolisacárido (LPS), lípido A, o derivados de éstos; ADN bacteriano; citoquinas (por ejemplo, TNF-\alpha, IL-1\beta, IL-10, IL-12); los miembros de la super familia TGF\beta, los iones de calcio en solución, ionóforos de calcio, y quimioquinas (por ejemplo, defensinas 1 o 2, RANTES, MIP-1\alpha, MIP-2, IL-8).
Si un antígeno inmunizante tiene suficientes células Langerhans que activan las capacidades entonces un adyuvante separado puede no requerirse, como en el caso del LT que es tanto antígeno como adyuvante. Alternativamente, tales antígenos se pueden considerar que no requieren un adyuvante porque ellos son suficientemente inmunogénicos. Se prevé que la célula viva o las preparaciones de virus, las células vivas atenuadas o los virus, las células muertas, los virus inactivos, y los plásmidos de ADN se podrían utilizar efectivamente para la inmunización transcutánea. También puede ser posible utilizar bajas concentraciones de sensibilizadores de contacto u otros activadores de células Langerhans para inducir una respuesta inmune sin inducir lesiones en la piel.
Otras técnicas para mejorar la actividad de los adyuvantes puede ser efectiva, tal como agregar tensoactivos y/o fosfolípidos a la formulación para mejorar la actividad adyuvante de la exotoxina ribosilante de ADP mediante el factor ribosilante de ADP. Uno o más factores de ribosilación de ADP (ARF) se pueden utilizar para mejorar la adyuvanticidad del bARE (por ejemplo, ARF1, ARF2, ARF3, ARF4, ARF5, ARF6, ARD1). De manera similar, uno o más ARF se podrían utilizar con una exotoxina ribosilante de ADP para mejorar su actividad adyuvante.
Las propiedades indeseables o los efectos colaterales dañinos (por ejemplo, la reacción alérgica o hipersensible; la atopia, la dermatitis de contacto, o eczema; la toxicidad sistémica) se puede reducir mediante la modificación sin destruir su efectividad en inmunización transcutánea. La modificación puede involucrar, por ejemplo, la remoción de una modificación química reversible (por ejemplo, proteólisis) o encapsulación en un recubrimiento que aísla reversiblemente uno o más componentes de la formulación del sistema inmune. Por ejemplo, uno o más componentes de la formulación se pueden encapsular en una partícula para suministro (por ejemplo, en microesferas, nanopartículas) aunque hemos mostrado que la encapsulación en vesículas de lípido no se requiere para la inmunización transcutánea y parece tener un efecto negativo. La fagocitosis de una partícula puede, en sí misma, mejorar la activación de una célula que presenta el antígeno al regular hacia arriba la expresión de las moléculas Clase I y/o Clase II del MHC y/o las moléculas coestimulatorias (por ejemplo, CD40, familia de miembros B7 como CD80 y CD86).
Formulación
Los procesos para elaborar una formulación farmacéutica se conocen bien. Los componentes de la formulación se pueden combinar con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, así como también cualquier combinación de aditivos opcionales (por ejemplo, por lo menos un diluyente, ligador, excipiente, estabilizador, disecante, conservante, colorante, o combinaciones de éstos). Ver, en general Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. (electronic edition, 1998); Remington`s Pharmaceutical Sciences, 22nd (Gennaro, 1990, Mack Publishing); Pharmaceutical Dosage Forms, 2nd Ed. (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Ansel et al., 1994, Williams & Wilkins).
Las buenas prácticas de manufactura se conocen en la industria farmacéutica y se regulan por agencies gubernamentales (por ejemplo, La Administración de Alimentos y Fármacos). Las formulaciones líquidas estériles se pueden preparar al disolver un componente pretendido de la formulación en una cantidad suficiente de un disolvente apropiado, seguido por la esterilización mediante la filtración para remover microbios contaminantes. En general, las dispersiones se preparan al incorporar los varios componentes esterilizados de la formulación en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico. Para la producción de las formas sólidas que se requieren para ser estériles, se puede utilizar el secado al vacío o el secado por congelamiento. Las formas de dosis sólidas (por ejemplo, polvos, gránulos, microesferas, tabletas) o formas de dosis líquidas (por ejemplo, líquidos en ampollas, cápsulas, frascos) se pueden hacer de por lo menos un ingrediente activo o componente de la formulación.
Se conocen los procedimientos adecuados para elaborar las varias formas de dosis y la producción de parches. La formulación también se puede producir al encapsular las formas sólidas o líquidas de por lo menos un ingrediente o componente activo, o mantenerlas separadas en compartimientos o cámaras. La tanda puede incluir un compartimiento que contiene un vehículo (por ejemplo, una solución salina) que se afecta por la presión y posteriormente solubiliza la formulación seca del parche. El tamaño de cada dosis y el intervalo de la dosificación al sujeto se pueden utilizar para determinar el tamaño y la forma adecuada del recipiente, compartimiento o cámara.
Las formulaciones contendrán una cantidad efectiva de los ingredientes activos (por ejemplo, antígeno y adyuvante) junto con el portador de cantidades adecuadas de vehículo con el fin de suministrar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración a un humano o animal. La formulación que incluye un vehículo puede estar en forma de crema, emulsión, gel, loción, ungüento, pasta, solución, suspensión, u otra forma líquida conocida en la técnica; especialmente aquellas que mejoran la hidratación de la piel.
Las cantidades relativas de los ingredientes activos dentro de una dosis y el programa de dosificación se pueden ajustar adecuadamente para la administración eficaz a un sujeto (por ejemplo, animal o humano). Este ajuste puede depender de la enfermedad o condición particular del sujeto, y si se pretenden terapia o profilaxis. Para simplificar la administración de la formulación al sujeto, cada dosis unitaria contendría los ingredientes activos en cantidades predeterminadas para una ronda única de inmunización.
Existen numerosas causas de inestabilidad o degradación de la proteína, que incluyen la hidrólisis y la desnaturalización. En el caso de la desnaturalización, la conformación de la proteína se afecta y la proteína puede desdoblarse de su estructura globular usual. En lugar de redoblarse a su conformación natural, la interacción hidrófoba puede originar el agrupamiento de moléculas (es decir, agregación) o redoblamiento a una conformación no natural. Cualquiera de estos resultados puede implicar la disminución o la pérdida de la actividad antigénica o adyuvante. Los estabilizadores se pueden agregar para disminuir o evitar tales problemas.
La formulación, o cualquier intermedio en su producción, se puede pre-tratar con agentes protectores (es decir, crioprotectores y estabilizadores secos) y luego someterse a tasas de enfriamiento y temperaturas finales que minimizan la formación de cristal de hielo. Por la selección adecuada de agentes crioprotectores y el uso de parámetros de secado preseleccionados, casi cualquier formulación se podría criopreparar para un uso final deseado adecuado.
Se debe entender en la siguiente discusión de los aditivos opcionales como los excipientes, estabilizadores, disecantes, y conservantes que se describen por su función. Así, un químico particular puede actuar como una combinación de excipientes, estabilizador, disecante, y/o conservante. Tales químicos se considerarían inmunológicamente inactivos porque éstos no inducen directamente una respuesta inmune, sino que incrementan la respuesta al mejorar la actividad inmunológica del antígeno o adyuvante: por ejemplo, al reducir la modificación del antígeno o adyuvante, o la desnaturalización durante los ciclos de secado y disolución.
Los estabilizadores incluyen ciclodextrina y derivados de ésta (ver la Patente U.S. 5,730,969). Los conservantes adecuados tales como la sacarosa, manitol, sorbitol, tehalosa, dextrano, y glicerina también se pueden agregar para estabilizar la formulación final. Un estabilizador seleccionado de tensoactivos no iónicos, la glucosa D, la galactosa D, la xilosa F, el ácido D-glucurónico, las sales de ácido D-glucurónico, la trehalosa, los dextranos, los almidones de hidroxietilo, y las mezclas de éstos se pueden agregar a la formulación. La adición de una sal de metal alcalino o cloruro de magnesio puede estabilizar un polipéptido, incluyendo opcionalmente albúmina de suero y secado por congelamiento para mejorar adicionalmente la estabilidad. Un polipéptido también se puede estabilizar al ponerlo en contacto con un sacárido seleccionado del grupo que consiste de dextrano, condroitina, ácido sulfúrico, almidón, glicógeno, insulina, dextrina, y sal de ácido algínico. Otros azúcares se pueden agregar incluyendo monosacáridos, disacáridos, alcoholes de azúcar, y mezclas de éstos (por ejemplo, glucosa, manosa, galactosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa, manitol, xilitol). Los polioles pueden estabilizar un polipéptido, y son miscibles en auga o solubles en agua. Los polioles adecuados pueden ser alcoholes polihidroxi, monosacáridos y disacáridos que incluyen manitol, glicerol, etilenglicos, porpilenglico, trimetilglico, vinil pirrolidona, glucosa, fructosa, arabinosa, manosa, maltosa, sacarosa, y polímeros de éstos. Varios excipientes también pueden estabilizar polipéptidos, incluyendo sero albúmina, amino ácidos, heparina, ácidos grasos y fosfolípidos, tensoactivos, metales, polioles, agentes reductores, agentes quelantes de metal, polivinil pirrolidona, gelatina hidrolizada, y sulfato de amonio.
Las formulaciones de dosis únicas se pueden estabilizar en microesferas de poli(ácido láctico) (PLA) y poli (lacturo-co-glicolido) (PLGA) mediante la elección adecuada del excipiente o estabilizador. La trehalosa se puede utilizar ventajosamente como un aditivo porque es un sacárido no reductor, y por lo tanto no origina las reacciones de aminocarbonilo con sustancias que llevan grupos amino tales como las proteínas.
Es concebible que una formulación que se pueda administrar al sujeto en una forma seca, no líquida, pueda permitir el almacenamiento en condiciones que no requieran una cadena de frío. Un antígeno (por ejemplo, CS6) en solución se puede mezclar en solución con un adyuvante tal como LT y colocarse sobre una almohadilla de gasa con un respaldo oclusivo tal como un envoltorio plástico y permitírsele secar. Este parche se puede entonces colocar sobre la piel con el lado de la gasa en contacto directo con la piel durante un período de tiempo y se puede mantener en su lugar cubierto con un oclusivo simple tal como una envoltura plástica o una cinta adhesiva. El parche puede tener muchas composiciones. El sustrato puede ser gasa de algodón, combinaciones de rayon-nylon u otros materiales sintéticos y puede tener respaldos sólidos oclusivos que incluyen polivinil cloruro, rayones, otros plásticos, geles, cremas, emulsiones, ceras, aceites, parapelículas, cauchos (sintético o natural), prendas o membranas. El parche se puede mantener sobre la piel y los componentes del parche se pueden mantener juntos utilizando varios adhesivos. Uno o más adyuvantes y/o antígenos se pueden incorporar en el sustrato o las partes adhesivas del parche.
Se puede aplicar una formulación líquida o cuasi líquida directamente a la piel y permitirle al aire secar; ser restregado en la piel o escalpo; ubicada en la oreja, regiones inguinal o intertriginosas, especialmente en animales; colocar sobre los tejidos anal/rectal; mantener el lugar con una venda, parche, o material absorbente; inmersión; mantener de otra manera mediante un dispositivo tal como media, chancla, guante o camisa; o rociada sobre la piel para maximizar el contacto con la piel. La formulación se puede aplicar en una venda o gasa absorbente. La formulación se puede cubrir con una venda oclusiva tal como, por ejemplo, AQUAPHOR (una emulsión de petrolato, aceite mineral, cera mineral, cera de lana, pantenol, bisabol, y glicerina de Beiersdorf), película plástica, COMFEEL (Coloplast) o gelatina de petróleo VASELINA; o una venda no oclusiva tal como, por ejemplo, TEGADERM (3M), DUODERM (3M) u OPSITE (Smith & Napheu). Una venda oclusiva excluye el pasaje de agua. Tal formulación se puede aplicar a sitios únicos o múltiples, a limbos únicos o múltiples, o a áreas de superficie grande de la piel mediante la inmersión completa. La formulación se puede aplicar directamente a la piel. Otros sustratos que se pueden utilizar son los adhesivos sensibles a la presión tales como los acrílicos, poliisobutilenos, y siliconas. La formulación se puede incorporar directamente en tales sustratos, quizás con el adhesivo per se en lugar de la absorción a almohadilla porosa (por ejemplo, gasa) o tiras biliosas (por ejemplo, papel de filtro).
Sea o no utilizado un parche, los polímeros agregados a la formulación pueden actuar como un excipiente, estabilizador, y/o conservante de un ingrediente activo así como también reducir la concentración del ingrediente activo que satura una solución utilizada para disolver una forma seca del ingrediente activo. Tal reducción ocurre porque el polímero reduce el volumen efectivo de la solución al llenar el espacio "vacío". De esta manera, las cantidades de antígeno/adyuvante se pueden conservar sin reducir la cantidad de solución saturada. Una consideración termodinámica importante es que un ingrediente activo en la solución saturada será "manejado" en regiones de concentración más baja (por ejemplo, a través de la piel). En solución, los polímeros también pueden estabilizar y/o preservar la actividad del antígeno/adyuvante de los ingredientes solubilizados de la formulación. Tales polímeros incluyen etileno o propilenglicol, vinil pirrolidona, y los polímeros y compolímeros de \beta-ciclodextrina.
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Suministro transcutáneo
El suministro transcutáneo de la formulación puede apuntar a células Langerhans y, así, lograr inmunización efectiva y eficiente. Estas células se encuentran en abundancia en la piel y son células que presentan antígeno eficiente (APC), que pueden conducir a la memoria de célula T y a respuestas inmunes potentes. En razón a la presencia de grandes números de células Langerhans en la piel, la eficiencia del suministro transcutáneo se puede relacionar con el área de superficie expuesta al antígeno y adyuvante. De hecho, la razón de que la inmunización transcutánea sea tan eficiente puede ser que ésta apunte a un número mayor de estas células que presentan antígeno eficiente que la inmunización intramuscular.
La descripción mejorará el acceso a la inmunización, aunque induciendo una respuesta inmune potente. En razón a que la inmunización transcutánea no requiere la inyección con una aguja hipodérmica (es decir, penetración o a través de la dermis) se reducen las complicaciones y dificultades de ésta, los requisitos del personal médicamente sofisticado, la técnica estéril, y el equipo estéril. Adicionalmente, se disminuyen las barreras a la inmunización en sitios múltiples o a inmunizaciones múltiples. La inmunización mediante una aplicación única de la formulación también se prevé.
La inmunización se puede lograr utilizando aplicación tópica o epicutánea de una formulación única de antígeno y adyuvante, cubierta opcionalmente mediante una venda oclusiva o utilizando otras tecnologías de parche, a piel intacta con o sin penetración química o física. La inmunización se podría dar a personal no entrenado, y es adecuada para la auto-aplicación. La inmunización de campo a gran escala podría ocurrir dada la fácil accesibilidad a la inmunización. Adicionalmente, un procedimiento de inmunización simple mejoraría el acceso a la inmunización por la población pediátrica, de edad, y del Tercer Mundo. La inmunización transcutánea de acuerdo con la descripción puede suministrar un método por medio del cual los antígenos y adyuvantes se pueden suministrar al sistema inmune, especialmente las células de presentación de antígeno especializadas que subyacen en la piel (por ejemplo, las células Langerhans).
Para las vacunas tradicionales, sus formulaciones se inyectaron a través de la piel con agujas. La inyección de vacunas que utilizan agujas tienen ciertos inconvenientes que incluyen la necesidad por agujas y jeringas estériles, personal médico entrenado para administrar la vacuna, incomodidad de la inyección, enfermedades generadas por la aguja, y complicaciones potenciales llevada por el punzamiento de la piel con agujas potencialmente reutilizables. La inmunización a través de la piel sin el uso de agujas hipodérmicas representa un avance para el suministro de vacunas al evitar las agujas hipodérmicas.
Más aún, la inmunización transcutánea puede ser superior a la inmunización utilizando agujas hipodérmicas en razón a que las células más inmunes serían el blanco por el uso de varias áreas de superficie grande objetivo de la piel. Una cantidad terapéuticamente efectiva del antígeno suficiente para inducir una respuesta inmune se puede suministrar transcutáneamente en un sitio cutáneo único, o sobre un área de la piel que cubre campos de nodos linfáticos drenantes múltiples (por ejemplo, cervical, axilar, inguinal, epitroquelear, popliteal, aquellos del abdomen y el tórax). Tales sitios cerca a numerosos nodos linfáticos diferentes en todos los sitos sobre el cuerpo suministrarán un estímulo más ampliamente esparcido al sistema inmune que cuando se inyectan cantidades pequeñas de antígeno en un sitio único mediante inyección transdérmica, subcutánea o intramuscular.
Un antígeno que pasa a través o hacia la piel puede encontrar células que presentan antígeno que procesan el antígeno de la manera que induce una respuesta inmune. Los sitios de inmunización múltiples pueden reclutar un número mayor de células que presentan antígeno y la mayor población de células que presentan antígeno que se reclutaron darían como resultado la mayor inducción de la respuesta inmune. Es concebible que el uso de la piel pueda suministrar antígeno a células fagocíticas de la piel tal como, por ejemplo, células dendríticas, células Langerhans, macrófagos, y otras células que presentan antígeno de la piel; el antígeno también se puede suministrar a células fagocíticas del hígado, bazo, y médula ósea que se conocen por servir como las células que presentan antígeno a través del torrente sanguíneo o el sistema linfático.
Las células Langerhans, otras células dendríticas, macrófagos, o combinaciones de éstos se pueden específicamente ser blanco utilizando su receptor de asialoglicoproteína, receptor de manosa, receptor Fc\gamma CD64, receptor de alta afinidad para IgE, u otras proteínas de membrana altamente expresada. Un ligando o anticuerpo específico para cualquiera de aquellos receptores se puede conjugar o producir recombinantemente como una fusión de proteína con adyuvante, antígeno, o ambos. Adicionalmente, el adyuvante, antígeno, o ambos se puede conjugar o producir recombinantemente como una fusión de proteína con una proteína A o proteína G para apuntar a la inmunoglobulina de superficie de linfocitos B. El resultado previsto sería una distribución de amplio esparcimiento del antígeno a las células que presentan antígeno a un grado que es raramente logrado, si es que se logra, por las prácticas de inmunización habituales.
La inmunización genética se ha descrito en las Patentes U.S. 5,589,466, 5,593,972, y 5,703,055. El contenido de ácido(s) nucleico en la formulación puede codificar el antígeno, el adyuvante, o ambos. El ácido nucleico puede o no ser capaz de replicación; éste puede ser no integrante o no infeccioso. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar un polipéptido de fusión que comprende el antígeno y un dominio de ubiquitina para dirigir la respuesta inmune a una respuesta restringida clase I. El ácido nucleico puede además comprender una región regulatoria operablemente ligada a una secuencia que codifica el antígeno o adyuvante. El ácido nucleico se puede agregar con un adyuvante. El ácido nucleico se puede complejar con un agente que promueva la transfección tal como lípido catiónico, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, polibreno-DMSO, o una combinación de éstos. Las células inmunes pueden ser el objetivo mediante la conjugación de ADN a un receptor Fc o proteína A/G, o agregar ADN a un agente que ligue éste a una macroglobulina \alpha_{2} o proteína A/G o un material de objetivo APC similar.
Una respuesta inmune específica puede comprender brazos efectuadores humorales (es decir, anticuerpos específicos de antígeno) y/o celulares (es decir, linfocitos específicos de antígeno tales como los linfocitos B, las células CD4^{+}, células CD8^{+} T, CTL, células Th1, células Th2, y/o células T_{DTH}). Más aún, la respuesta inmune puede comprender células NK y otros leucocitos que median la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC).
La respuesta inmune inducida por la formulación de la invención puede incluir la provocación de anticuerpos específicos de antígeno y/o linfocitos. El anticuerpo se puede detectar mediante técnicas de inmunoensayo. La detección de varios isotipos de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgA secretorio, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) puede ser indicativa de una respuesta inmune sistémica o regional. Las respuestas inmunes también se pueden detectar mediante un ensayo neutralizante. Los anticuerpos son proteínas protectoras producidas por los linfocitos B. Ellos son altamente específicos, generalmente apuntan a un epítopo de un antígeno. A menudo, los anticuerpos juegan un papel en la protección contra la enfermedad al reaccionar específicamente con los antígenos derivados de los patógenos que originan la enfermedad. La inmunización puede inducir anticuerpos específicos para inmunizar antígenos (por ejemplo, toxina bacteriana).
Las CTL son células inmunes producidas para proteger contra la infección por un patógeno. Ellas también son altamente específicas. La inmunización puede inducir CTL específico para el antígeno, tal como un oligopéptido sintético con base en una proteína de malaria, en asocio con un antígeno de histocompatibilidad auto mayor. El CTL inducido por inmunización con el sistema de suministro transcutáneo puede matar las células infectadas patógenas. La inmunización también puede producir una respuesta de memoria como se indica por las respuestas de refuerzo en anticuerpos y CTL, la proliferación de linfocitos por el cultivo de los linfocitos estimulados con el antígeno, y las respuestas de hipersensibilidad del tipo retrasado a la exposición de piel intradérmica del antígeno solo.
La protección exitosa también se podría demostrar por estudios de exposición que utilizan infección por el patógeno o la administración de toxina, o la medición de un criterio clínico (por ejemplo, títulos de anticuerpo alto o producción de células que secretan anticuerpo IgA en membranas de mucosa se pueden utilizar como un marcador subrogado).
Lo siguiente pretende ser ilustrativo de la invención, pero la práctica de la invención no se limita o restringe de ninguna manera por los siguientes ejemplos.
Ejemplos animales
Se obtuvieron ratones BALB/c y C57BU6 de Jackson Laboratories. Los ratones (6-10 semanas de edad) se mantuvieron en condiciones libres de patógeno y se alimentaron con comida de roedores y agua ad limitum. Conejillos de india hembras Hartley, 4-6 semanas de edad, se consiguieron de Charles River Laboratories, y se mantuvieron en condiciones libres de patógeno recibiendo alimento y agua ad limitum.
La toxina del Cólera (CT) se compró de la lista de Biológicos de la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT) se compró del Swiss Serum and Vaccine Institute (SSVI).
Para preparar el CS6 recombinante (rCS6) el operón de cuatro genes completo para CS6 (aproximadamente 5 kb) se clonó en una cepa de E. coli y HB101 (Wolf et al., 1997; Wolf et al., 1997) sobre un plásmido derivado de pUC19 que contiene un gen resistente a la canamicina. El rCS6 se produjo utilizando este clon en un fermentador New Brunswick BioFlo 3000. El cultivo de fermentación se cosechó mediante centrifugación, y el rCS6 se purificó mediante filtración de flujo tangencial seguido por precipitación en sulfato de amonio (Wolf et al., 1997). El rCS6 se intercambió entonces con amortiguador con solución salina amortiguada de fosfato (PBS). Este rCS6 purificado se almacenó a -30ºC hasta inmunización. La pureza del rCS6 se determinó como >98% mediante dodecil sulfato de sodio-electroforesis de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), tenido con azul Coomassie, y explorado densitométricamente (Cassels et al., 1992; Schagger & von Jagow, 1987).
Las cepas ETEC clínicas E8775 y E9034A se utilizaron como fuentes para el CS6 nativo (nCS6) y CS3, respectivamente. El calor y los extractos salinos de las dos cepas crecieron sobre un agar CFA (Evans et al., 1977) se trataron con sulfato de amonio secuencialmente a intervalos de saturación del 10% (Wolf et al., 1997). El precipitado a 60% y 30% de saturación contenía la cantidad más grande y la pureza más alta del CS6 nativo y el CS3 nativo, respectivamente, determinado mediante SDS-PAGE y ensayo ELISA.
Se expreso P. falciparum MSP (MSP-1_{42}, 3D7) en E. coli BL21 (DE3) con una etiqueta de polihistidina (Novagen). El antígeno se purificó hasta cerca de homogenidad utilizando tres etapas cromatográficas: afinidad de níquel, intercambio de anión Q, y el intercambio de catión CM.
Los ratones se inmunizaron transcutáneamente como se describió previamente (Scharton-Kersten et al., 2000). En resumen, los animales se afeitaron sobre el dorso con un clipper No. 40, que no deja irritación o cambios visibles en la piel, y descansan durante 48 horas. Los ratones y los conejillos de indias se anestesiaron en el muslo del cuarto trasero intramuscularmente (IM) o intraperitonealmente (IP) con una mezcla de quetamina/xilacina durante el procedimiento de inmunización para evitar el auto-cepillado. La superficie expuesta de la piel se hidrató con gasa empapada en agua durante 5-10 min, y fue ligeramente electrotransferida con gasa seca antes de la inmunización. Se colocó veinticinco a 100 \mul de solución de inmunización en la piel afeitada sobre un área por encima de 2 cm^{2} durante una hora. Los animales se lavaron entonces extensivamente, la cola se bajo, después de hacer correr agua de llave durante aproximadamente 30 segundos, secada a palmadas, y lavado de nuevo.
La inmunización pasiva se logró mediante la inyección en la vena de la cola del suero hiperinmune agrupado de una cepa de ratones coincidentes que contiene un título anti-LT IgG mayor de 10,000 unidades ELISA. Los ratones BALB/c sin tratamiento se inyectaron con 0.5 ml de suero una hora antes de exposición oral con LT o amortiguador de bicarbonato. Los ratones C57BU6 sin tratamiento también se inmunizaron pasivamente utilizando el mismo procedimiento 12 horas antes de la exposición.
Un modelo de exposición de exotoxina se ha descrito (Richardson et al., 1984). Los ratones BALB/c se alimentaron LT (10 \mug en 500 \mul) suspendidos en una solución de bicarbonato de sodio al 10% (NaHCO_{3}). Los ratones C57BU6 se alimentaron LT (100 pg por peso en gramos en 500 \mul de 10% de NaHCO_{3}) con base en el peso corporal. Los animales de control recibieron 500 \mul de 10% de NaHCO_{3} solo. Para evitar la coprofagía, los ratones se transfirieron a jaulas con un piso de malla de alambre. A los ratones se les dio 10% de agua de glucosa pero no se alimentaron durante 12 horas antes de la exposición o durante la exposición. Seis horas después de la exposición, los animales se pesaron y se sacrificaron. Los intestinos delgados se disectaron entonces (válvula pilórica a unión ileal-cecal), atados para evitar la pérdida de fluidos, y pesado. La acumulación de fluido se calculó utilizando la fórmula: FA = (G/(B-G))*1000, donde G = peso del intestino + fluido en gramos y B = peso corporal en gramos. Utilizando esta fórmula, la acumulación de fluido de línea base en animales no tratados o alimentados con bicarbonato es 30 a 150, dependiendo del peso corporal inicial del animal.
Estudios histopatológicos se desarrollaron por Gary M. Zaucha, AVP, ABT, y ACVPM de la División de Patología Comparativa en el Instituto de Investigación de la Armada Walter Reed. Se designaron para patología dos conejillos de indias por grupo de tratamiento y un animal de control. Los animales se sometieron a eutanasia en el día dos luego de la exposición a cada una de las tres vacunaciones y se sometió a una necropsia neta completa. El examen histopatológico del grupo de alta dosis excluyó el examen de un complemento completo de tejidos con la piel (piel vellosa y sitio de exposición lumbar dorsal) y se evaluó el hígado en los grupos restantes. Los tejidos recolectados y la formalina fijada en el grupo de alta dosis fueron cerebro, pituitaria, lengua, pulmón, tráquea, esófago, tiroides, timo, corazón, páncreas, bazo, hígado (con la vesícula biliar asociada), estómago, intestino delgado, seco, colon, nodo linfático mesentérico, riñón, adrenal, vejiga urinaria, ovario, útero, glándulas salivales, nodo linfático submandibular, médula ósea (esternón), piel vellosa, sitio de exposición lumbar dorsal, y lesiones brutas. Los hallazgos histopatológicos para los animales individuales se califican en una escala de 1 a 5 (1= mínima, 2=media, 3=moderada, 4=marcada, y 5=severa).
Los niveles de anticuerpo contra CT, LT CS3 nativo, CS6 nativo, rCS6 y MSP-1_{42} se determinaron mediante ELISA. Las placas de poliestireno de imulón-2 (Dynex Laboratories) se recubrieron con 0.1 \mug/pozo de antígeno, incubadas a temperatura ambiente durante la noche, bloqueadas con un amortiguador en PBS de 5% de caseína, lavadas, se aplicaron disoluciones en serie del espécimen, y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo IgG (H+L) se detectó utilizando IgG anti-ratón de cabra ligado a HRP (H+L) (Biorad) durante 1 hora. Los niveles IgA específicos anti-LT se determinaron como anteriormente con IgA anti-ratón de carba ligado a HRP (Zymed) sustituido como el anticuerpo secundario. Los niveles de anticuerpo IgA secretorio (S-IgA) también se midieron mediante ELISA, en donde las placas recubiertas con LT se incubaron secuencialmente con heces, lavado de pulmón, o lavado vaginal de animales sin tratar e inmunizados, anticuerpo de cadena anti-secretoria de conejo purificada (SC) (16-24 horas a 4ºC) (Crottet et al., 1999) e IgG anti-conejo de cabra marcado con peroxidasa (H+L) (Kirkegaard y Perry) durante 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo unido se reveló utilizando sustrato de 2,2'-azino-di (ácido 3-etilbenztiazolino sulfónico) (ABTS; Kirkegaard y Perry) y la reacción se detuvo después de 30 minutos utilizando una solución SDS al 1%. Las placas se leyeron a 405 nm. Los resultados del título de anticuerpo se reportaron en unidades OD (405 nm) o ELISA, que se definen como la disolución inversa del suero que produce una densidad óptica (OD) de 1.0. Los ELISA anti-rCS6 de cerdo de guinea se condujeron como anteriormente con IgG de cerdo anti-guinea de cabra conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch) incluido en la etapa de detección. El anticuerpo secundario anti-SC reaccionó con placas recubiertas con antígeno (rCS6), que resultan en alto trasfondo, que hace este ensayo inadecuado para una detección anti-rCS6 SC.
Un microlítro de rCS6 (0.5 \mug), CS6 nativo (1.6 \mug) y CS3 nativo (0.5 \mug) se mancharon sobre tiras de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell), y secadas durante la noche. Las tiras se bloqueron mediante incubación en PBS con 0.05% de Tween 20 y (PBS-T, Sigma) y 1% de sero albúmina bovina durante 2 horas. El anticuerpo de ratón primario se diluyó a 1:1000 y 1:4000 y se incubó con tiras durante 1 hora, seguido por tres lavados de 1,5, y 10 minutos, todos en PBS-T. Las tiras se incubaron entonces en IgG de anti-ratón de carba marcada con peroxidasa de cola de caballo (1:5000 en PBS-T, 30 min). Después de lavar en PBS tres veces con 10 min cada una, las tiras se desarrollaron con 3,3' diaminobencidina (DAB, Sigma), peróxido de hidrógeno (Sigma), y cloruro de cobalto (Mallinckrodt), como se describe en Harlow & Lane (1988). Todas las incubaciones y lavados tuvieron lugar en un agitador orbital a temperatura ambiente.
Siete días después de la última inmunización, se aislaron las células mononucleares de los nódulos cervicales ventrales del bazo y superficiales y se lavaron en RPMI 1640 con 50 mg de gentamicina por ml antes de utilizarla en el ensayo ELISPOT como se describió previamente (Harman et al., 1994; Hartman et al., 1999). Las células de bazo y nódulo linfático lavadas se contaron y diluyeron en un medio de cultivo (RPMI 1640 con 2 mM de glutamina, 50 mg de gentamicina por ml, y 10% de suero bovino fetal) a una densidad de 2.5 x 10^{6}/ml. Cien ml de suspensión de célula se inocularon en micropozos previamente recubiertos con 0.1 \mug/pozo de antígeno CS6 en un amortiguador con recubrimiento de carbonato, pH 9.6, o un amortiguador con recubrimiento solo. Cada muestra se ensayó en cuadruplicado. Después de la incubación a 37ºC durante 4 horas, las placas se lavaron en IgG de cerdo anti-guinea de conejo (1:1200), IgA (1:700), o IgM (1:800) (ICN Laboratories) se agregaron. Después de incubación durante toda la noche a 4ºC, se lavaron las placas y el anti-suero de anti-conejo de carba conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) a una dilución de 1:1200 se agregó. Después de 2 horas a 37ºC, se lavaron las placas y las manchas se visualizaron mediante la adición de 100 ml de agarosa molida que contiene 100 mg de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo por ml. Las células que forman la mancha se contaron con un estereomicroscópio.
La contaminación de la sangre no fue evidente luego de la inspección visual de las heces de murino recientemente recolectadas, el lavado de pulmón o el espécimen de lavado vaginal. Pruebas adicionales con tiras HEMASTIX (Bayer) indicaron que la contaminación de la sangre era de \leq 5-20 células sanguíneas rojas intactas por \mul o s 0.015-0.062 mg de hemoglobina libre por dL.
Las microesferas de heces se recolectaron el día antes de la exposición mediante defecación espontánea, pesadas, homogenizadas en 1 ml de PBS por 100 mg de materia fecal, centrifugadas, y el sobrenadante recolectado y almacenado a -20ºC.
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Los ratones se exanguinearon, la tráquea transfectada, insertado un tubo de polipropileno calibre 22, y el PBS suavemente infusionado para inflar los pulmones. El material infundido se retiró luego, re-infundido durante un total de tres ciclos, y almacenado a -20ºC.
La cavidad vaginal se lavó suavemente y se repitió la inserción y aspiración de PBS (80 \mul) en la cavidad vaginal durante un total de tres ciclos. El material vaginal se giró a 10 min a 3,000 rpm y el sobrenadante transferido a un recipiente limpio y almacenado a -20ºC.
Se inmunizaron ratones BALB/c sobre la piel con MSP1 sola o CT y MSP1 en las semanas 0, 4, 8 y 12. Los tejidos de bazo y nódulos linfáticos drenantes (inguinales) se removieron 24 semanas después de la inmunización primaria. Se prepararon suspensiones de célula simple de tejido de bazo de ratones individuales o de los LN agrupados dentro de cada grupo. Se cultivaron las células a 4 x 10^{5} por pozo en placas de 96 pozos durante 5 días a 37ºC, 5% de CO_{2} en la presencia o ausencia de 10 \mug/ml de antígeno MSP1. La convanavalina A (ConA) a 5 \mug/ml se utilizó como un control positivo. El medio de cultivo contenía RPMI 1640 (BioWhittaker) suplementado con 10% de suero de becerro fetal (Gibco), penicilina (10 U/ml, BioWhittaker), estreptomicina (100 \mug/ml, BioWhittaker), L-glutamina (2 mM, Sigma), y Hepes (10 \muM, BioRad). [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pozo) se agrego a los cultivos durante las últimas 20 horas del período de cultivo de 5 días. La incorporación de la timidina se evaluó al cosechar ADN celular sobre filtros de fibra de vidrio, seguido por un conteo de centelleo líquido.
Las células CD4^{+} T se aislaron de células de bazo agrupadas del grupo de inmunización CT/MSP1 utilizando una columna de selección de células T CD4^{+} y las instrucciones del fabricante (R&D Systems). Las células eluidas de la columna (CD4^{+}) se cultivaron en placas de 96 pozos a 1 x 10^{5} células por pozo en la presencia o ausencia de 3 x 10^{5} células alimentadoras irradiadas (3000 rad) de ratones sin tratamiento. Los ensayos de proliferación se condujeron en la presencia o ausencia de estimulación de antígeno como se describió anteriormente.
A menos que se indique otra cosa, los datos de ELISA mostrados son la media geométrica de los valores de los animales individuales, y las barras de error representan dos desviaciones estándar de la media. Las comparaciones entre los títulos del anticuerpo y la acumulación de fluido (FA) en grupos se desarrollaron utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas y los valores p < 0.05 se consideran como significativos.
La inmunización sobre la piel con adyuvante bacteriano y el factor de colonización CS6 dan como resultado una respuesta de anticuerpo protectora. Para determinar si el TCI sería un método efectivo para inducir respuestas inmunes ETEC relevantes, los ratones se inmunizaron cuatro veces mediante TCI con CT y rCS6, ensayados para respuestas anti-CS6, posteriormente expuesto oralmente con CT holotoxina, y el grado de hinchamiento intestinal (acumulación de fluidos) cuantificado 6 horas más tarde. Un grupo de control positivo se inmunizó mediante la ruta intramuscular (IM) con 5 \mug de rCS6 en alúmina, y un grupo de control negativo recibió rCS6 solo sobre la piel. Los anticuerpos que reaccionaron con el antígeno rCS6 fueron evidentes después de la primera inmunización en animales que reciben una dosis de adyuvante baja (10 \mug) o alta (100 \mug), y los títulos continuaron elevándose después de la primera y segunda inmunización de refuerzo. La respuesta inmune al CS6 en la presencia del adyuvante (10 o 100 \mug) fue mayor (p < 0.05) que la respuesta vista al antígeno solo suministrado mediante TCI a las 12 semanas. Los títulos anti-CS6 de la media geométrica fueron los más grandes en el grupo de dosis alta (CT 100 \mug) luego de la tercera inmunización, y el título anti-CS6 de la media geométrica más alta se produjo utilizando TCI comparado con la inmunización intramuscular, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa. Los títulos anti-CT se elevaron en ambos grupos de adyuvantes CT en todos los puntos de tiempo. Los animales inmunizados con CS6 solo sobre la piel no desarrollaron una respuesta de anticuerpo consistente al antígeno o al adyuvante.
Antígeno no procesado, solo, y CT + CS6 (100 \mug/100 \mug) sobre los grupos de piel se seleccionaron para exposición oral con CT después de inmunización utilizando TCI. El CS6 solo y los grupos CT/CS6 se reforzaron 11 semanas luego de la tercera inmunización (punto de estudio de 19 semanas). Dos semanas más tarde, los animales se alimentaron con amortiguador de bicarbonato solo (10% de NaHCO_{3}) o amortiguador de bircarbonato que contiene 10 \mug de CT, y se determinó el hinchamiento intestinal resultante. Los intestinos de los ratones sin tratar alimentados con bicarbonato solo tuvieron una acumulación de fluido de línea base de 103 (rango 78 a 146). La administración oral del CT en los ratones sin tratar resultó en un incremento de dos veces en la acumulación de fluido (media 209; rango 164 a 359). De manera similar, los ratones vacunados con rCS6 solos y alimentados posteriormente CT también desplegaron un incremento de aproximadamente dos veces en acumulación de fluido (media 192; rango 119 a 294). En contraste, los ratones vacunados con CT por TCI desarrollaron un hinchamiento intestinal despreciable luego de exposición (media 105; rango 84 a 120), y la respuesta del fluido no fue distinguible de aquella observada por el grupo no tratado alimentado con amortiguador de bicarbonato solo (p<0.5).
Los efectos adyuvantes comparables del CT y LT para antígenos CS6 transcutáneamente administrado. El uso de LT como un adyuvante para una vacuna ETEC puede ser deseable, en la medida en que el LT es el agente causante de un número significativo de casos de diarrea ETEC (Wolf et al., 1993), y así puede funcionar tanto el antígeno como el adyuvante. Para probar las potencias relativas del CT y los adyuvantes LT para rCS6, los ratones se inmunizaron sobre la piel tres veces a intervalos de 4 semanas con 100 \mug de rCS6 y un rango de dosis de CT o LT (10, 20, y 100 \mug). El anti-rCS6 de suero resultante y los títulos del adyuvante se evaluaron dos semanas después de la inmunización final. Como se esperaba, los títulos IgG del anti-adyuvante (CT o LT) fueron evidentes en todas las dosis, y los títulos fueron mayores y más consistentes entre los animales con dosis altas (100 \mug). En contraste, aunque todos los grupos CS6 y LT/CT desarrollaron títulos anti-CS6 elevados, las respuestas fueron las mayores a las dosis LT más bajas (10 \mug versus 100 \mug), y en general comparables con la experiencia previa por la ruta IM.
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Los anticuerpos de suero provenientes de ratones inmunizados con rCS6 y LT reconocieron el CS6 nativo. Los ratones inmunizados con rCS6 produjeron un título alto de suero IgG que reaccionó con la proteína recombinante utilizada en el ensayo ELISA. Aunque estos resultados sugieren que el TCI podría ser efectivo en atenuar la infección y la enfermedad ETEC, es importante determinar si los anticuerpos inducidos reaccionaron con el CS6 nativo (nCS6) presente en aislados de E. coli. Para probar la especificidad de la respuesta anti-CS6, el suero proveniente de ratones inmunizados con rCS6 se analizaron para reactividad de la proteína CS6 nativa en ELISA y ensayos de inmunoelectrotransferencia. En el ELISA, cada una de las tres muestras con reactividad a rCS6 y LT demostraron especificidad por la proteína CS6 nativa, pero no por la proteína CS3 nativa. De manera similar, mediante el ensayo de imunoelectrotransferencia, los ratones inmunizados con rCS6 y LT reaccionaron tanto con el antígeno rCS6 inmunizante como con CS6 nativo parcialmente purificado, con título o sin reacción por suero preinmune. Ninguno de los sueros de ratón reaccionó con el control del antígeno CS3 nativo. El suero proveniente de un ratón que se inmunizó parenteralmente (inyección IM) con rCS6 respondió de manera similar tanto al CS6 como al rCS6 nativo como lo hizo el suero de ratones transcutáneamente inmunizados. Además el ratón BALB/c respondió en forma similar como lo hicieron los ratones C57BU6. Así, el TCI que utiliza rCS6 indujo anticuerpo de suero capaz de reconocer antígeno
nativo.
Los anticuerpos al LT protegieron activa y pasivamente los ratones de exposición oral con LT. Aunque el LT, el agente causante en enfermedad ETEC mediada por LT, se muy similar al CT y muestra protección cruzada con los anticuerpos de la subunidad B de la toxina de cólera (CTB) (Clemens et al., 1988), la protección directa contra la exposición oral LT utilizando anticuerpos LT no se ha mostrado previamente. Los ratones inmunizados con LT y rCS6 fueron expuestos oralmente con LT como se describió. Los altos niveles de IgG anti-LT se detectaron en el suero de ratones inmunizados (media geométrica para BALB/c = 36,249 unidades ELISA; C57BU6 = 54,792 unidades ELISA). Para exposición a toxina oral, se utilizaron dos cepas de ratones con diferentes sensibilidades a la exposición. Los ratones C57BU6 son altamente sensibles a los efectos de la exposición a la toxina LT comparados con los BALB/c, y la protección en ambas cepas sugiere que el efecto protector se podría observar en configuraciones genéticamente más diversas. La protección significativa contra la exposición a LT se vio en ambas cepas (p<0.05).
Los estudios de enfermedades ETEC en perros y humanos sugieren que el anticuerpo de suero contribuya a la protección contra diarrea de bacterias intactas así como también de la toxina aislada (Pierce et al., 1980; Pierce et al., 1972; Pierce & Reynolds, 1974). Consistente con esta premisa, nosotros, y otros, habíamos reportado previamente que el factor de suero transcutáneamente provocado protege a los animales de una exposición intranasal letal con CT (Beignon et al., 2001; Glenn et al., 1998b). Así, postulamos que el factor de suero, presumido por ser anticuerpo de antitoxina, también podría contribuir a la prevención del hinchamiento intestinal inducido por toxina en ratones transcutáneamente inmunizados. El papel protector del huésped del suero de anticuerpo de antitoxina se evaluó al cuantificar el hinchamiento intestinal provocado por exposición a la toxina oral de ratones no tratados y pasivamente inmunizados que recibieron suero de animales que se trataron mediante TCI. El efecto de la inmunización pasiva se evaluó tanto en cepas de ratones BALB/c como C57BU6. La administración oral del LT a ratones sin tratar indujo constantemente la acumulación de fluido que fue evidente luego de la inspección visual. En contraste, los ratones pasivamente inmunizados desarrollaron acumulación de fluido despreciable de una magnitud comparable con aquella observada en los grupos alimentados con amortiguador solo. Así, el anticuerpo dado por ratones pasivamente inmunizados de los ratones transcutáneamente inmunizados fueron protegidos de las secuelas de la exposición a toxina oral. Junto, estos resultados indicaron que los ratones transcutáneamente inmunizados producen anticuerpos de suero capaces de proteger animales de la exposición a toxina.
Las respuestas IgG de mucosa IgA e IgA secretoria específica para antígeno ETEC siguió al TCI. Aunque las respuestas IgG del suero están asociadas con la protección del huésped contra muchos agentes infecciosos, las respuestas inmunes de la mucosa se consideran como importantes para la atenuación y prevención de los patógenos adquiridos por la mucosa, los patógenos particularmente los intestinales, tales como el ETEC. Para determinar si el TCI con rCS6 induce respuestas de anticuerpo detectables en la mucosa, se analizaron las respuestas de IgG y S-IgA en especímenes fecales, de pulmón y vaginal cosechados de ratones inmunizados sobre la piel con rCS6 y adyuvante. Los ratones C57BU6 se inmunizaron tres veces con CS6 solo, LT/CS6, o CT/CS6. El IgG específico de CS6 se evaluó en especímenes de lavado fecal, de pulmón y vaginal recolectados nueve semanas después de la tercera inmunización. La inmunización con rCS6 solo fallaron en inducir IgG específico de CS6 elevado en especímenes de lavado fecal, de pulmón o vaginal. En contraste, 3 de 3 animales en el grupo CT/CS6 contenían IgG anti-CS6 detectable tanto en los especímenes de lavado de pulmón como vaginal. De manera similar, el anticuerpo IgG específico de CS6 se observó en especímenes de pulmón y vaginal del grupo adyuvante LT y en el espécimen fecal proveniente de los grupos CT y LT adyuvantes, aunque las respuestas fueron menos consistentes. El método de recolección con muestras fecales puede haber impedido la consistencia de los resultados de anticuerpo fecal, especialmente si las respuestas fueron modestas, y otros métodos de recolección se están investigando.
El IgA localmente producido es típicamente una proteína dimérica asociada con una cadena secretoria (SC) que permite el transporte a través de las membranas epiteliales. Para determinar si el TCI podría inducir la producción de IgA secretorio (S-IgA), los animales se inmunizaron dos veces sobre la piel con títulos LT, IgG, IgA y S-IgA específico de antígeno, evaluados en espécimen de mucosa mediante ELISA. Comparado con el espécimen proveniente de animales no tratados, la inmunización con LT indujo un IgG e IgA específico de antígeno en el espécimen fecal y vaginal de 10 de 10 ratones inmunizados. Más importante, el S-IgA se detectó fácilmente en todos los 10 especímenes fecales y vaginales probados.
Inducción de la inmunidad de antitoxina protectora que sigue a la co-administración del CT y el antígeno de vacuna de malaria. La vacunación de objetivo contra múltiples agentes infecciosos es deseable en países en desarrollo donde las expectativas de vida relativamente bajas y las altas tasa de morbilidad y mortalidad están asociadas con la infección de individuos con más de un patógeno. Para determinar si el TCI se podría emplear para inducir protección contra múltiples agentes infecciosos no relacionados, los ratones se vacunaron simultáneamente con CT y un fragmento de 42 kDa C-terminal de proteína de Plasmodium falciparum, proteína de superficie de merozoito 1 (MSP-1_{42}). Las proteínas CT (0, 10 o 100 \mug) y MSP (100 \mug) se aplicaron a la piel a la semana 0, 4, 8 y 13. Los ratones se consideraron como que respondían al MSP si el título de post-inmunización era de tres veces el OD medido en el suero de pre-inmunización a una disolución de 1:100. Con base en este criterio los anticuerpos MSP se detectaron en el suero proveniente de ratones inmunizados con CT y MSP juntos pero no en suero recolectado del grupo de control (MSP solo) ni el cosechado antes de la inmunización (presangrado). Para evaluar la efectividad de la respuesta del anticuerpo anti-CT en los ratones inmunizados dobles, los animales provenientes del grupo CT (100 \mug) más MSP (100 \mug) que desarrollaron altos niveles de anticuerpos anti-CT fueron oralmente expuestos con CT y el grado de hinchamiento intestinal (acumulación de fluido) se comparó con aquel inducido en ratones vacunados con MSP solo. Todos los animales inmunizados sobre la piel con CT y MSP juntos exhibieron niveles de acumulación de fluido inferior (p < 0.01) que los ratones comparablemente expuestos en el grupo expuesto solo a MSP. Más aún, las células de bazo y nódulo linfático drenantes provenientes de ratones inmunizados exhibieron una fuerte respuesta proliferativa específica de antígeno in vitro en el nódulo linfático drenante y el bazo, a los cuales contribuyeron las células T CD4^{+}. Estos resultados sugieren que los anticuerpos al adyuvante pueden conferir protección contra enfermedad mediada por LT aunque funcionando como un adyuvante para otros antígenos, tal como los antígenos de vacuna de malaria candidata.
Las respuestas inmunes a los antígenos ETEC en conejillos de indias. Para evaluar la capacidad para la inducción de células que secretan anticuerpo (ASC) mediante TCI, se seleccionó un modelo de animal ASC de conejillo de indias establecido. El conejillo de indias es un modelo convencional para la evaluación de reacciones tóxicas en respuesta a la administración epicutánea de adyuvante y antígeno. Los conejillos de indias fueron expuestos a dosis crecientes de LT (12 a 100 \mug) y rCS6 (25 a 200 \mug) sobre la piel en los días 0, 21 y 42. El suero se recolectó para serología en los días 1, 20, 41 y 56, y los títulos del anticuerpo al antígeno y el adyuvante se determinaron mediante ELISA. Similar a los resultados de los estudios de los ratones, la administración del TCI de la vacuna rCS6 y LT dio como resultado la inducción de las respuestas de anticuerpo CS6 y LT que parecieron ser la dosis relacionada con respecto a la concentración de CS6 y LT (Tabla 2). El hallazgo del anticuerpo del suero al CS6 se confirmó mediante la observación del ASC específico para CS6 en los tejidos del bazo y del nódulo linfático drenante. El ensayo ELISPOT conducido sobre células recientemente aisladas provenientes de animales inmunizados PBS y CS6/LT de control revelados a una elevación significativa (p<0.05) en el número de células que producen IgG específico de rCS6 en 4 de 4 de los animales expuestos a antígenos. Las células que producen el IgA y el IgM específico de antígeno también parecieron mejorar aunque el número actual de células detectadas era más pequeño y menos consistente (Tabla 3).
TABLA 2 Suero anti-CS6 y anti-LT IgG en conejillos de indias después de TCI con CS6 y LT
2
Se designaron dos conejillos de indias para patología por grupo de tratamiento y uno del grupo de control en cada una de las tres exposiciones (Tabla 2). Un complemento completo de tejidos se sometió a evaluación histopatológica en el grupo a dosis altas. Los tejidos recolectados de los grupos restantes (rango de control, bajo y medio) se limitaron a la piel y el hígado. En la necropsia bruta y la histopatología del grupo de dosis alta no demostró lesiones sistémicas que se pudieran atribuir a la administración del artículo de prueba a cualquiera de las exposiciones. La necrosis hepática se observó de manera general en animales que incluyen los controles PBS, pero no hubo una correlación del hallazgo con los grupos de tratamiento. La alanina aminotransferasa del suero, el aspartato aminotransferasa, la fosfatasa alcalina, sodio, potasio, y nitrógeno de urea en la sangre se evaluaron y se determinaron como normales en todos los grupos de tratamiento.
El TCI con LT/CS6 dio como resultado cambios inflamatorios mínimos a medios limitados al sitio local de exposición y al incremento en la dosis por encima de 25 \mug LT/50 \mug CS6 no tuvieron un efecto apreciable sobre la severidad de la respuesta local. Los hallazgos típicos fueron la infiltración de la dermis superficial por números bajos de granulocitos y linfocitos (inflamación), engrosameinto medio de la epidermis mediante hiperplasia de queratinocitos (acantosis), y focos pequeños ocasionales donde las células epidérmicas tenían perdida de cohesión, dando como resultado la formación de vesículas intraepidérmicas que contienen queratinocitos libres (acantolisis). Se vieron cambios mínimos en el grupo de dosis más baja (LT 12 \mug/CS6 125 \mug) en tres puntos de tiempo, y no se observaron cambios en la piel en los controles expuestos a PBS. Tanto los ratones como los conejillos de indias, no hubo una progresión clínica en la severidad de los hallazgos de la piel con inmunización repetida, y donde se vieron, las vesículas resueltas o enmascarada y resueltas espontáneamente durante varios días.
TABLA 3 Anticuerpos anti-CS6 ASC e IgG de conejillos de indias individuales inducidos por TCI
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Ejemplos humanos
Voluntarios machos y hembras saludables, de edad entre 18 y 45 años se reclutaron del área metropolitana de Washinton, D.C. Los criterios de exclusión incluyeron viajar a un área endémica ETEC en el año previo, historia reciente de diarrea de viajero, embarazo, infección con VIH, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, y alergia a los antibióticos.
Los componentes de la vacuna consistieron de un antígeno CS6 mezclado con LT. El CS6 se produjo bajo las buenas prácticas de manufactura habituales (GMP) en la Instalación del Forest Glen Pilot BioProduction del Walter Reed Army Institute of Research. La cepa bacteriana utilizada para la producción de CS6 se construyó de una cepa de E. coli HB101 y un plásmido que contiene el operón de cuatro genes necesario para la expresión del CS6 insertado mediante técnicas recombinantes. Los genes CS6 se clonaron de la cepa ETEC E8875 (Wolf et al., 1997). Las principales etapas en la producción del CS6 incluyeron: fermentación bacteriana; purificación del CS6 proveniente del caldo de fermentación mediante filtración de flujo tangencial seguido por precipitación de sulfato de amonio; almacenamiento intermedio de la proteína CS6 de masa en solución salina amortiguada de fosfato (PBS) a -80ºC; descongelamiento, agitación, y distribución en frascos; y almacenamiento a -80ºC. El CS6 se formuló como proteína purificada en frascos de suero de 2 ml con tapones de caucho divididos grises sellados con ondulaciones de aluminio. Cada frasco contenía 0.9 ml de proteína CS6 (1.3 mg/ml) en PBS. El LT nativo de E. coli se produjo bajo GMP habitual en el Swiss Serum and VAccine Institute (SSVI). El LT se produjo de una cepa de E. coli HE22 TP 235 Km. El LT se suministró como un polvo liofilizado. Cada frasco contenía 500 \mug de LT liofilizado, y se reconstituyó con 1 ml de agua estéril. Las dosis de adyuvante (LT) y antígeno (CS6) por el grupo de vacunación se muestran en la Tabla 4.
La vacuna se administró en tres dosis. La primera dosis se administró en el día 0, y la segunda y tercera inmunización en los días 28 y 84 respectivamente después de la primera inmunización. La vacuna se administró transcutáneamente utilizando un parche semi-oclusivo que consiste de una matriz de gasa de algodón de 2x2 pulgadas (two-ply Kendall #2556) con un polietileno de 2x2 pulgadas (Saran Wrap) recubierto en el espaldar por una venda Tegaderm de 4x4 pulgadas (semi-oclusiva, 3M cat # 1616).
Al momento de la vacunación la vacuna se aplicó en 500 \mul de solución salina estéril y se administró a una dosis dividida sobre cada brazo superior. Cada una de las dosis divididas contenía la dosis correspondiente de CS6 (antígeno) solo o en combinación con 250 \mug de LT (adyuvante). El brazo superior se ubicó a manera de brazo extendido en una mesa de examen y se preparó al frotar suavemente cinco veces con un hisopo con alcohol isopropílico (70%). La gasa de algodón se colocó sobre cada brazo superior y la solución de inmunización se aplicó a la gasa con una jeringa. El respaldo de polietileno se colocó entonces sobre la gasa con algodón impregnado y cubierta con la venda Tegaderm. Los voluntarios permanecieron en la clínica de investigación durante 20 min luego de la aplicación del parche para observación. Los voluntarios se instruyeron de no tocar los parches o involucrarse en actividad física fuerte durante el tiempo en que portaran los parches. Los parches se removieron 6 horas después de la aplicación (rango: 4.8 horas). Los sitios de inmunización se enjuagaron con 500 ml de agua y se secaron con palmadas. Los voluntarios se instruyeron para bañarse en la noche pero se abstuvieron de frotar fuertemente el sitio de inmunización con jabón para evitar la irritación inusual de la piel. Los voluntarios se reinmunizaron a los 28 y 84 días después de la primera inmunización. Cada voluntario recibió la misma dosis de vacuna en cada inmunización.
Los voluntarios se observaron durante 20 minutos después de cada dosis para ocurrencia de los efectos adversos inmediatos. A los voluntarios se les dio un diario para registrar los signos y síntomas observados después de la vacunación. Los síntomas reportados se calificaron como medio (notable), moderado (que afecta las actividades diarias normales), o severo (suspende las actividades diarias normales). Los voluntarios se evaluaron a las 24 horas y 48 horas para la evaluación clínica y la evaluación de posibles efectos colaterales. Los voluntarios que mostraron signos de reacciones de la vacuna en la piel se instruyeron para regresar a la clínica a las 72 horas para una evaluación clínica adicional. Los voluntarios se siguieron entonces según se necesitara hasta que se habían resuelto completamente los efectos colaterales. Uno de los voluntarios que desarrollo sarpullido en la piel en el sitio de inmunización se le solicitó someterse a una biopsia de piel. Esta biopsia se desarrollo por un dermatólogo, luego del procedimiento estándar, y bajo un consentimiento informado escrito separado.
Las respuestas inmunes de las células secretoras de anticuerpo (ASC) a los antígenos de vacuna se escogieron como un punto final inmunológico para este estudio, en razón a que estudios previos han mostrado que las respuestas ASC se correlacionaban con las respuestas inmunes intestinales de la mucosa (Wenneras et al., 1992). Las muestras de sangre venosa se obtuvieron de voluntarios en el día 0 antes de la inmunización, y en los días 7, 28, 35, 56, 84, 91, 98, y 112 después de la primera inmunización. Los especímenes de sangre se recolectaron utilizando el sistema VACUTAINER de tubos tratados con EDTA (Becton Dickinson). Las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) se aíslan de la muestra de sangre por centrifugación de gradiente en Ficoll-Hypaque (sigma) y se ensaya para números específicos de vacuna y totales de IgA e IgG ASC por técnica ELISpot (Czerkinsky et al., 1988; Weneras et al., 1992). Pozos individuales de placas de 96 pozos con fondo de nitrocelulosa (Millititer HA; Millopore, Bedford, MA) se cubre con 0.1 ml de CS6 purificado (20 \mug/ml) o gangliosida GM_{1} (0.5 \mug /ml) y se incuba durante la noche 4ºC. Después de un lavado con PBS, las células cubiertas con GM_{1} se exponen a LT (0.5 \mug /ml) durante 2 hr a 37ºC. Después de ser lavadas con PBS, las placas se bloquean con medio TPMI complementado (Gibco) complementado con 5% de suero fetal de becerro (Gibco) y 50 \mug/ml de gentamicina (Gibco). El PBMC se ajusta a 2 x 10^{7} células viables/ml en medio TPMI completo. Una suspensión final de 0.1 ml de PBMC se agrega a cada pozo (1 x 10^{6} PBMC agradado por poso), y las placas se incuban a 4 hr a 37ºC en 5.0% CO_{2}. Las placas se lavan, se incuban durante la noche a 4ºC con una mezcla de dos anticuerpos de inmunoglobulina antihumana de cabra purificado por afinidad con distintas especificidades de isotipo, una conjugada con fosfatasa alcalina (IgG) y la otra conjugada con peroxidasa de rábano (IgA) (Southern Biotech Associates) y expuesto al substrato de encima cromogen apropiado (sigma). Las manchas, que corresponden a una zona de anticuerpos secretados por células individuales, se enumeran en pozos triplicados bajo magnificación 40X, con datos expresados como el número de células que forman manchas por 10^{6} PBMC.
Como se describió previamente (Ahren et al., 1998; Jertborn et al., 1998; Jertborn et al., 2001), definimos una respuesta ASC positiva como un incremento \geq 2 veces sobre un valor inicial de ASC por 10^{6} PBMC, cuando el número de ASC \geq 0.5 por 10^{6} PBMC en la muestra inicial. Si el número de ASC preinmune es menor 0.5 por 10^{6} PBMC, un valor de > 1.0 por 10^{6} PBMC después de dosificación se considera una respuesta positiva
Se obtiene muestra de sangre venosa de voluntarios antes de inmunización y en los días 14 y 28 después de cada inmunización para medición de títulos de anticuerpo de suero. Los títulos de anticuerpo IgA e IgG contra LT se miden por el método GM1-ELISA (Jertborn et al., 1998; Svennerholm et al., 1983), y aquellos contra CS6 se determinan por métodos ELISA como se describió previamente (Hall et al., 2001; Stoll et al., 1986). El LT (suministrado por SSVI) Y CS6 (GMP Lot 0695, WRAIR) se utilizan como antígenos de fase sólida. El LT y CS6 utilizados para ensayos ELISA son de los mismos lotes utilizados para la preparación de vacunas. Se cubren posos de microtítulo individuales (inmuno placas Nunc) con gangliosida GM1 gangliosida (0.5 \mug/ml) (Sigma) a temperatura ambiente durante la noche, o con 0.1 ml de una preparación de 1.0 \mug/ml de CS6 a 37ºC durante la noche. Los pozos recubiertos con GM1 se lavan luego con PBS y se incuban con 0.1 ml de LT (0.5 \mug/ml) durante 2 hr a 37ºC. Después de bloquear con 0.1% de albúmina de suero bovina (Sigma), las muestras de suero se eluyen seriamente por triplicado (dilución inicial 1:5) y luego se incuban a temperatura ambiente durante 90 min. Los anticuerpos unidos de demuestran por la adición de IgA o IgG antihumano de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA) e incubado a temperatura ambiente durante 90 min, seguido por la adición de O-fenilenediamina (OPD)-H202 (Sigma). Se asignan títulos de punto final como diluciones interpoladas de las muestras que dan un OD de 450 nm de 0.4 por encima del fondo (absorbancia a 450 nm). Los títulos se ajustan en relación a un espécimen de referencia incluido en cada prueba para compensar la variación día a día. Para ambos antígenos, las muestras de suero pre y post dosificación del mismo voluntario siempre se probaron lado a lado. El titulo de anticuerpo adscrito a cada muestra representa la media geométrica de las determinaciones duplicadas desarrolladas en diferentes días. Los títulos de punto final recíprocos < 5 se le asigna un valor de 2.5 para propósitos computacionales. Basados nuestros cálculos del error metodológico de cada ELISA, previo el estudio, definimos una respuesta significativa (seroconversión) como \geq incremento de dos veces en el titulo de punto final entre espécimen pre y post-inmunización (Jertborn et al., 1986), con el criterio agregado de que el titulo recíproco post inmunización es \geq 10.
Todos los voluntarios que reciben las tres dosis programadas de vacunas están incluidos en los análisis de inmunogenecidad y seguridad post dosificación las proporciones se comparan utilizando 2 x n x^{2} en \alpha= 0.05, energía= 0.80. La prueba exacta de Fisher se utiliza en tablas 2 x 2 cuando el número contenido en una de las células es menor de 5 (Sahai & Khurshid, 1995). El número medio de ASC y los incrementos de titulo de anticuerpo en plasma medios de comparan separadamente utilizando la prueba de clasificación Wilcoxon para evaluar el efecto boosting de cada dosis consecutiva de vacunación (Forrester & Ury, 1969). Todas las pruebas estadísticas son de dos colas.
Se obtiene el obtiene el consentimiento informado de todos los voluntarios, y se siguen las guías de uso humano del departamento de defensa de los de los Estados Unido en la conducción de éste ensayo. Se reclutan treinta y tres voluntarios y se reciben por lo menos una dosis de la vacuna de estudio. El protocolo se aprueba por Junta de Revisión Institucional de la Oficina del Cirujano General, Ejercito de los Ejercito de los Estados Unidos. Los voluntarios son de 21 a 44 años de edad; 17 mujeres y 16 hombres, 15 negros, 16 blancos, y 2 asiáticos. Los 33 voluntarios, 7 no completan el estudio por razones no relacionadas con el estudio: conflicto con su programa de trabajo (4), movimiento del área metropolitana de puntos D.C. (2), y admisión a una clínica local por uso ilegal de drogas (1). Veintiséis voluntarios reciben las tres dosis programadas de la vacuna y completan todas las visitas luego de post vacunación, y se muestran los datos en estos voluntarios. Estos voluntarios son de 21 a 44 años de edad; 13 mujeres y 13 hombres; 12 negros, 12 blancos, y 2 asiáticos. El número de voluntarios por dosis de vacuna se muestra en la tabla 4.
TABLA 4 Número de voluntarios por grupo revacuna (n=26)
4
De los voluntarios que reciben una combinación de LT/CS6, 74% (14/19) desarrollan una erupción maculo-papular en el sitio de vacunación. Ningún voluntario que recibe CS6 solo desarrolla una erupción. La reacción es leve en 13 voluntarios y moderada en un voluntario. Los voluntarios blancos desarrollaron la erupción significativamente más frecuentemente que voluntarios negros (11/11 vs. 3/8, p < 0.005). Siete reacciones ocurren después de la administración de la segunda dosis y 14 ocurren después de la tercera dosis; todos los 7 voluntarios con una segunda erupción relacionada con la dosis también desarrollan la erupción después de la aplicación de la tercera dosis. El diagnostico clínico es dermatitis de contacto (hipersensibilidad del tipo retrasada-DTH). Un voluntario con la erupción característica experimenta una biopsia de la piel afectada después de recibir la tercera dosis de LT/CS6. La biopsia mostró inflamación crónica dérmica leve (linfocítica) con espongiosis focal. El diagnostico patológico fue dermatitis espongietica subaguda, característica de DTH. La erupción usualmente comenzó dentro de las 24 horas después de la aplicación del parche. La erupción se desarrolla después de la segunda dosis que dura una media de 9 días, (rango 1-14); la erupción de la tercera dosis dura una media de 6 días, (rango 1-11)
Se le ofrece a los voluntarios 0.1% de crema de triamcinolona para aliviar los potenciales síntomas relacionados con la vacuna. Ninguno de los sujetos utiliza la crema después de la primera o segunda inmunizaciones. Ocho pacientes con erupciones que ocurren después de la tercera dosis se tratan con la crema de triamcinolona. No hubo diferencias clínicas evidentes que se relacionan con la apariencia y severidad de los síntomas locales (prurito) o síntomas (eritema, pápulas) cuando se compara por dosis de vacunación. No hubo diferencias estadísticamente significativas en la magnitud de las respuestas inmunes serológicas entre los usuarios de la crema triamcinolona según se compara con no usuarios.
Las respuestas inmunes se detectan solo en voluntarios que reciben el adyuvante y el antígeno, aunque un voluntario que no recibe solo las dos dosis de CS6 solo tuvo una respuesta anti-CS6 IgA positiva (pero no CS6 IgG) en un único punto de tiempo. No hubo diferencia significativas en la frecuencias o en la magnitud de las respuestas ASC o de anticuerpo de suero para LT o CS6 entre los cuatros grupos que reciben el adyuvante y la combinación de antígeno; por lo tanto, los datos se agrupan para presentación y análisis estadístico adicional. Todos los voluntarios (100%) que reciben LT demuestran una respuesta IgG anti-LT de suero, y 90% producen anti-LT IgA. Las proporciones de respuesta de anticuerpo de suero Anti-CS6 fueron menores que la proporción de respuesta anti-LT con 68% y 53% de voluntarios que muestran un incremento de más de dos veces en los títulos IgA e IgG anti-CS6, respectivamente. Los incrementos de pico individuales en anticuerpo de sueros para LT y CS6 se describen en la Figura 1. Las respuestas robustas para LT y CS6 se observan con anticuerpo de suero, aunque hubo una gran variabilidad en la magnitud de la respuesta. IgG anti-LT media para LT excede la respuesta media previamente descrita por un log (Glenn et al., 2000),y es mayor que la respuesta para CS6.
Las cinéticas de las respuestas de anticuerpo de suero se describen en la Figura 2. Los títulos de anticuerpo de suero post dosis para cada grupo se combinan y se presentan como títulos de media geométrica con 95% de intervalos de confidencia. Las cinéticas de las respuestas inmunes para LT difieren marcadamente de las cinéticas de las respuestas para CS6 en que las respuestas de amortiguación y cebado fuertes para LT se ven mientras que las respuestas CS6 se ven principalmente con amortiguación. Las respuestas de memoria para CS6 parecen que ocurren, como se sugiere por la diferencia significativa en las respuestas IgA IgG anti-CS6 después de la segunda y tercera inmunización.
El porcentaje de la proporción de respuesta ASC y el número medio de PBMC ASC x 10^{6} específicos de antígeno se muestran en la tabla 5. Se detecta el ASC LT-específico y CS6. El tiempo y la magnitud del ASC de número de pico para cada respondedor individual por tipo de ASC específico se describen en la Figura 3. En la mayoría de respondedores, el pico ASC se detecta después de la segunda o tercera inmunización. Todos los siete voluntarios que demuestran CS6 IgG anti-CS6 tienen su número de pico de ASC después de la tercera inmunización.
TABLA 5 Respuesta ASC especifica de Antígeno (n=19)
5
\text{*}
Una respuesta ASC positiva se define como un incremento \geq2 veces sobre el valor inicial de ASC por 10^{6} PBMC, cuando el número de ASC es menor de 0.5 por 10^{6} PBMC en la muestra de valor inicial. Si el número de ASC es menor de 0.5 por 10^{6} PBMC, un valor de >1.0 por 10^{6} PBMC después de dosificación se considera una respuesta positiva.
\text{**}
solo se incluyen respuestas positivas cuando se calcula el número medio de ASC (rango)
\vskip1.000000\baselineskip
Las Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) es una de las causas más comunes de diarrea infantil en países desarrollados. También es la causa principal de la diarrea del viajero. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad se originan por las bacterias que secretan una o dos enterotoxinas, enterotoxina lábil por calor (LT) y enterotoxinas estables al calor inmunogénicamente pobres (ST), ambas interactúan con el intestino para originar la diarrea acuosa característica de la enfermedad. Un requerimiento para infección es la capacidad del organismo ETECO para adherirse al epitelio intestinal. Esto ocurre a través de estructuras sobre la membrana externa llamadas fimbridas. Como una clase, estas estructuras son anti-higiénicamente distintas y son antígenos de factor de colonización mencionados (CFA). A la fecha se han identificado 20 diferentes factores de colonización (CF). El más prevalente, y relevante para la enfermedad humana, incluyen CFA/I CFA/II y CFA/IV. El CFA/III está compuesto de tres antígenos separados mencionados como antígeno de superficie coli 1 (CS1), CS2 y CS3. El CFA/IV está compuesto de tres antígenos, CS4, CS5 y CS6.
En la declinación asociada con la edad en la incidencia de infecciones ETEC en el mundo desarrollado se ha atribuido al desarrollo de la inmunidad protectora. Estudios epidemiológicos demuestran que los niños infectados llegan a ser resistentes (protegidos) de la reinfección con la misma cepa. Se mostró que los voluntarios infectados experimentalmente están protegidos de re exposición con una sepa homóloga. Los voluntarios expuestos con una cepa ETEC heteróloga no están protegidos contra enfermedad clínica.
El CFA se ha identificado como el candidato probable para la evaluación de vacunas ETEC. Sin embargo, para un amplio rango de cubrimiento contra la infección natural, una vacuna ETEC debe consistir de múltiples antígenos de factor de colonización. El rango más amplio de cubrimiento (80%-95%) requiere el desarrollo de una vacuna multivalente que consiste de varios CFA (CS3, CS6 y CFA/I) y enterotoxina (LT y ST). Aunque es posible la administración oral, estos antígenos de proteínas son sensibles a hidrólisis a pH bajo y degradación enzimática en el estomago. En adición, se requieren grandes dosis de vacuna para vacunación oral que no es práctico como un producto. La vacuna ETEC no se puede someter a otras rutas de administración ya que las enterotoxinas (LT y ST) son reactogénicas (diarrea) e inflamatorias cuando se administran por otras rutas, que incluyen oral, nasal, pulmonar, rectal y parenteral.
La eficiencia y seguridad del TCI se ha aplicado a este problema de vacunación. En los siguientes ejemplos, se demuestra que las combinaciones multivalentes de CS3, CS6 CFA/I, LT y ST se pueden suministrar efectivamente a través del estrato corneo con o sin mejora de penetración y ellas inducen una respuesta inmune contra cada componente de vacuna multivalente. La vacunación por TCI requiere una baja dosis de antígenos (CS3, CS6 y CFA/I) y la respuesta inmune se aumenta significativamente por la coadministración simultanea de una adyuvante. El TCI se puede desarrollar de forma segura y sin provocar efectos colaterales adversos, serios. Describimos dosis de adyuvante y antígeno que son efectivas, regímenes de dosificación, métodos para optimizar el suministro de la vacuna dentro de la piel a las células que presentan antígeno, y formulaciones que son estabilizantes y aceptables farmacéuticamente para inmunización transcutánea.
Materiales y métodos
Se conducen estudios preclínicos para establecer el método óptimo para TCI con una mezcla compleja de CFA y LT. El objetivo del siguiente estudio es demostrar la viabilidad de la vacunación transcutánea con mezclas de CS3, CS6, CFA/I, LT y STA. En estos estudios, se utilizan ratones C57BU6 adultos (7-8 semanas de edad).
Se afeitan ratones en la superficie ventral, dorsal, en la base de la cola (24-48 horas) antes de vacunación. Todos los ratones se anestesian por inyección intraperitoneal de 25 \mul de una mezcla de cetamia (100 mg/ml) y xilazina (100 mg/ml). El sitio afectado se pretrata por hidratación con solución salina o una mezcla de 10% de glicerol y 70% alcohol isopropílico. Mientras todavía está completamente hidratado, la piel se trata gentilmente mediante uno de dos métodos para interrumpir la capa más externa de la piel, el estrato córneo (SC). Se ejecuta el hado de cinta al aplicar cinta adhesiva 3 M o D-squame® a la superficie separada seguido por remoción gentil de la cinta 10 veces. Alternativamente, la piel hidratada se pretrata por abrasión leve con papel lija (GE Medical Systems) o un hisopo que contiene piedra pómez (PDI/NicePak). La superficie de la piel se amortigua gentilmente 10 veces utilizando un movimiento ascendente y descendente. Inmediatamente antes de la aplicación, una almohadilla de gasa Nu (\sim1 cm^{2}), fijada sobre el respaldo adhesivo, se carga con 25 \mul en volumen que contiene diferentes combinaciones de CS3 (25 \mug), CS6 (25 \mug), CFA/I (25 \mug), STa (8 \mug) y LTR192G (25 \mug). Los parches cargados con vacunas se aplican durante la noche (\sim18 hr), se remueven, y se enjuaga la piel con agua. Todos los ratones reciben dos o tres dosis dos semanas aparte en el día 0, 14 y 28.
Se obtiene sangre periférica al lacerar la vena de la cola. Se recolecta la sangre en un tubo, se permite coagularse, se centrífuga, y se recolecta el suero. Las muestras de suero se recolectan el día 0 (preinmune), día 14, día 28 y día 42 (dos semanas después de la tercera dosis. El suero se congela a -20ºC hasta que se evalúa para anticuerpos para antígenos de vacunación (CS3, CS6, CFA/I y STA) y adyuvante (LTR192G). El último se proporciona por el centro de investigación médico de la Armada de los Estados Unidos.
Se recolectan muestras fecales en el día 35 (7 días después de la tercera inmunización). Se recolectan muestran frescas de cada ratón y se extraen con PMSF (3 \mug/ml en solución salina). Las muestras se agitan (mezclador de vórtice) para formar una suspensión se clarifica por centrifugación (3000 rpm, microfuga). Se recuperan los supernadantes purificados y se almacena a -20ºC hasta que se evalúa con un método ELISA para IgA e IgG de mucosa.
Se utiliza un método de ensayo inmuno absorbente ligado a enzimas (ELISA) para evaluar el IgG en suero. Se cubren placas de noventa y seis posos con 1 \mug de antígeno/100 \mul por un pozo durante la noche a 4ºC después de lavar con solución salina amortiguada con fosfato y Tween 20 (PBS-T), las placas se bloquean con 100 \mul de amortiguador de bloqueo (0.5% de caseína y 0.5% de albúmina de suero bovino) durante 1 hr a temperatura ambiente. Después de lavar las placas con PBS-T, las muestras se diluyen en serie (albúmina de suero) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las placas con PBS-T, las muestras se diluyen en serie (dilución en serie de tres veces muestras de suero y dilución en serie de dos veces muestras fecales) se incuban las placas durante la noche 4ºC. Las placas se lavan con amortiguador PT y 100 \mul de IgG conjugado anti-ratón de cabra óptimamente diluido (1:2,000) con HRP (Bio Rap) o se agrega a cada pozo IgA (Zymed) anti-ratón de cabra conjugado HRP. Las placa se incuban durante 2 hr a temperatura ambiente, se lavan con amortiguador PT y se agrega 100 \mul de sustrato ABTS (KPL) a los pozos y a la reacción se le permite desarrollarse durante 30 min. La reacción se detiene al agregar 100 \mul de 1% de solución STS (Gibco). La densidad óptica se lee a 405 nm con un lector de placa ELISA y los datos se analizan utilizando software Softmax Pro 2.4 (Molecular Devices).
Los anticuerpos de suero para células completas ETEC inactivadas por formalina se determina por el método ELISA. Se cultiva la cepa E243778 E. coli enterotoxigénica sobre placas agar, las células se cosechan e inactivan en 2.5% de formalina durante la noche a temperatura ambiente. Los pozos se cubren con 5 x 10^{5} células completamente muertas (EWC). Las placas se preparan como se describió para otros antígenos. Los anticuerpos de suero para EWC se determinan por el método descrito anteriormente.
Se sacrifican los ratones al asfixiarlos con dióxido de carbono y se remueven los nodos linfáticos inguinales y del bazo. Los tejidos se mantienen en hielo en tubos que contienen medio 1640 RPMI (Gibco). Las suspensiones celulares sencillas se preparan al moler el tejido con el barril de una jeringa de 5cc. Los residuos de tejido se les permite decantarse al fondo del tubo y la suspensión celular se transfiere a otro tubo. Las células se lavan dos veces con medio RPI 1640 y se suspenden en medio del cultivo (RPMI 1640, 10% FBS, 2 mmol de L-Glutamina y 2 mmol pen-strep).
Noventa y seis placas de filtración (Millipore Bedford, MA) se recubren con 100 \mul de 3 mg/ml de antígenos en PBS y se incuban durante la noche a 4ºC. Las placas se enjuagan tres veces con PBS, se bloquean con 2% BSA (Sigma) durante 1 hr y se enjuagan con PBS. Las células se dispensan a 100 \mul por pozo en medio del cultivo (RPMI 1640, 10% FBS, 2 mmol de L- glutamina y 2 mmol de pen-strep) y las placas se incuban durante la noche a 37ºC en una incubadora de 5% CO_{2} humidificado. Las placas se enjuagan cuatro veces con PBS-0.05% Tween 20 (PBS-T). Las células se lisan por choque hipotónico con agua. 100 \mul de IgA anti-ratón de cabra conjugado con biotina (Soutthern Biotecnology) o IgG anti-ratón de cabra conjugado con biotina (Amer-Shan) dilusión 1:2,000 en 2% de BSA en PBS. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 2 hr. Después de lavan las placas con PBS-T, 100 \mul de abidina etiquetada con fosfata alcalina en anticuerpo D (Vector) 1:2,000 se agrega a cada pozo e incuba durante 2 hr adicional a temperatura ambiente. Las placas se lavan con PBS-T y 100 \mul de solución BCIP/NBT (Kinkergaard & Perry) se agrega a los pozos y las placas se incuban 5 a 30 min a temperatura ambiente hasta que se desarrollan manchas azules. Las placas se lavan con agua destilada para detener la reacción. El ASC específico de antígeno se visualiza como manchas azules, que se cuentan con un microscopio de disección y se registran como IgG-ASC o IgA-ASC por 10^{6} células.
Ensayo in vitro para caracterizar anticuerpos neutralizantes para la enterotoxina LT ETEC
Enterotoxinas lábiles por calor de colin (LT) se producen como toxinas multi sub unidad con unas sub unidades Ay B. Después de la interacción inicial de enterotoxina con el receptor de membranas celular anfitrión (galgliosida GM1), la sub unidad B facilita la penetración de la sub unidad A a través de la membrana celular y dentro de la célula eucariótica. Con reducción química, esta subunidad A se disocia en dos péptidosmás pequeños A_{1} cataliza la rivosilación ADP de la proteína de unión GTP estimuladora en el complejo de enzima ciclasa adenilato en la superficie vaso lateral de las células epiteliales. Esto resulta en el incremento del nivel intracelular del AMP cíclico (cAMP). El incremento del cAMP origina la secreción de agua y electrolitos en el intestino delgado que resulta en enfermedad clínica.
En cultivos celulares, el LT se une con alta afinidad (K_{D}=7.3 x 10^{-10}) al receptor gangliosida GM1, que se expresa por muchos tejidos y células eucarióticas. El LT origina cambios morfológicos importantes para muchas células eucarióticas (por ejemplo, CHO y Y1) en cultivos celulares. Utilizando esta propiedad, se desarrolla un método de ensayo in vitro para determinar si los anticuerpos provocados a través del TCI inhiben LT (neutraliza) la unión al receptor glagliosida GM1. En estos estudios, las células CHO se cultivan en medio F13 complementado con 10% de suero de becerro fetal (FCS). Las células se mantienen en crecimiento de fase log a 37ºC en 5% CO_{2}. Las células luego se tripsinizan a partir de frascos T y se colocan en placas de 96 pozos a 5 x 10^{3} en 0.2 ml de F12 complementado con 1% FCS. Se recolecta suero pre inmune (día 0) y post inmune (DIA 321) de voluntarios que se han vacunado transcutáneamente con LT y se determina por el método de ELISA para tener anticuerpos para LT. Estos sueros se diluyen 1:4 con medio de cultivo y se diluyen serialmente dos veces hasta 1:8192. Un volumen igual de suero diluido se mezcla con LT durante 1 hr a 37ºC. 50 \mul de suero/LT (que contiene 6.5 ng de LT se transfiere a cultivos de células CHO colocadas en placas frescas por duplicado (5 x 10^{3} células en medio de 150 \mul). Las células se cultivan a 37ºC durante 24 hr. Al final del periodo de cultivo, se remueve el medio, las células se lavan con F12, se fijan con metanol y se tiñen con tinte Giemsa. Los cultivos se examinan con microscopio de luz invertida y los cultivos se gradúan para apariencia normal o morfología alargada. Los resultados se expresan como la dilución más baja del suero que bloquea la elongación celular (neutraliza) por más del 90% dentro del cultivo.
Métodos para conjugar toxina estable por calor (STa) para LT otra proteína portadora para mejorar la inmunogenicidad y el suministro transcutáneo.
La conjugación STa (lote 1184A, List Biological) para LT involucra 2 etapas. La primera etapa es LT activado por maleimida, 400 \mug de LT (lote 200100, Berna Biotech) se disuelve en 400 \mul de amortiguador de fosfato 0.1 M 0.15 M de amortiguador NaCl (pH 7.2). 160 \mul de succimidil 6 [(\beta-maleimidopropipropionamido)hexanoato] (SMPH, Pierce) aproximadamente 8 \mul para solución LT e incubado durante 90 min a temperatura ambiente. La reacción se desaliniza en una columna de desalinización (Pierce) al utilizar PBS y se recolectan las fracciones.
El pico LT activo se agrupa y la proteína se determina mediante un ensayo BCA (Pierce). La segunda etapa es conjugación; 80 \mug de STa se mezcla con LT activado con maleimida y se incuba durante la noche a 4ºC. El conjugado ST-LT se dializa contra 500 ml de amortiguador PBS.
El STa purificado (100 \mug) se acopla a 800 \mug de ovalbúmina de huevo de pollo (OVA, Sigma) en 1 ml de mezcla de reacción que contiene 10 mg de 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida (Pierce) y 0.1 M de amortiguador de fosfato de sodio (pH 5.5). La mezcla de reacción se dializa contra solución salina amortiguada con fosfato (20 nm, pH 7.2, PBS) durante 4 hr.
La conjugación se confirma mediante cambio en el peso molecular de ovalbúmina y LT-B utilizando el método SDS-PAGE. Cada muestra se disuelve en amortiguador de muestra 4x (In vitrogen) y se calienta 100ºC durante 5 min y se analiza el gel Bis-Tris 4-12% NuPAGE (In vitrogen). Después de electroforesis, las bandas de proteínas se visualizan utilizando un kit de teñido de plata (In vitrogen) y los pesos moleculares de los conjugados se determinan con relación a los estándares de referencia internos que corren sobre los geles.
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Ejemplo 1 Comparación de la respuesta IgG en suero para vacunación intradérmica y transcutánea con factores de colonización ETEC
El propósito de éste estudio es comparar la respuesta inmune producida por vacunación transcutánea, con aquella de la vacunación intradérmica con CS3 y CS6. Los grupos de ratón se pre-tratan mediante pelado por cinta 10 veces para remover el estrato corneo. Grupos de 5 ratones se vacunan luego transcutáneamente con CS3 (25 \mug), CS6 (25 \mug) con y sin 10 \mug de adyuvante LTR192G. Los parches se cargan con un volumen de 25 \mul que contiene CS3 o CS6 solo o CS3 más LTR192G o CS6 más LTR192G. Los parches se aplican durante la noche (\sim18 hr). Se inyecta grupos separados de ratones intradermicamente con 25 \mug de CS3 o CS6. Todos los ratones reciben tres vacunaciones (día 0,14 y 28). El suero se recolecta dos semanas después de la tercera inmunización y se evalúan para anticuerpos para CS3, CS6 y LTR192G.
Los resultados son mostrados en Figura 4 demuestran que el CS3 y CS6 producen anticuerpos de suero cuando se aplican apicutáneamente a la piel. La respuesta de anticuerpo de suero se mejora adicionalmente mediante la co-administración de dosis bajas de LTR192G (10 \mug). Como se describe en la Figura 4, los títulos de suero para CS3 y CS6 se incrementa dos veces y doce veces, respectivamente, mediante la adición de adyuvante LTR192G. La inyección intradérmica de CS3 provoca una respuesta de alto titulo (1: 273,695) comparado con la aplicación epicutánea (1: 30,581). La vacunación transcutánea con CS6 produce anticuerpos de titulo muy alto (1: 188,984), que son 10 veces mayor comparado con la inyección intradérmica del CS6 (1: 17,036). Adicionalmente, los altos títulos de anticuerpo para LTR192G también se detectan si el LTR192G se aplica epicutáneamente sola o en combinación con CS3 o CS6. Estos resultados demuestran que los antígenos ETEC de alto peso molecular (CS3,\sim3 megadaltons y CS6\sim1 megadalton) son inmunogénico cuando se administran en un parche la piel que se ha pretratado para remover el estrato corneo. La magnitud de la respuesta inmune se mejora grandemente mediante la co-administración de un adyuvante (LTR192). El mutante LTR192G también provoca la producción de anticuerpos de titulo alto contra sí mismo cuando se aplican epicutáneamente solos o en combinación con CS3 o CS6.
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Ejemplo 2 Vacunación transcutánea con combinaciones divalentes y trivalentes de vacunas de subunidad ETEC
La piel se pretrata como se describe en el ejemplo 1. Los ratones se vacunan transcutáneamente con parches que contienen 25 \mug CS3/10 \mug LTR192G; 25 \mug CS6/10 \mug LTR192G; o un cóctel de 25 \mug CS3/25 \mug CS6/10 \mug LTR192G. Los resultados se muestran en la Figura 5. Estos resultados demuestran que la combinación de vacunas trivalentes (CS3/CS6/LTR192G) provocan títulos IgG en suero que son comparables con las vacuna divalentes (CS3/LTR192G y CS6/LTR192G).
Esto demuestra claramente la viabilidad de combinar múltiples de subunidad ETEC en un único parche y que múltiples de subunidades también se pueden co-administrar sin afectar negativamente la magnitud de la respuesta inmune para cualquier subunidad (es decir, CS3 o CS6).
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Ejemplo 3 TCI con CS3/CS6 con y sin adyuvante LTR192G co-administrado
Se tomo el siguiente estudio para determinar si el LTR192G podría adyuvar la respuesta inmune para una combinación administrada epicutáneamente de CS3 y CS6. Los animales se pretratan como se describe en el ejemplo 1 y se aplican parches cargados con vacuna (durante la noche) a la piel pretratada (base de la cola). Los resultados mostrados en la Figura 6 demuestran que las respuestas inmunes para CS3 y CS6 se mejoran grandemente 5 veces y 24 veces, respectivamente, es la adición de 10 \mug LT a la mezcla trivalente. Esto establece que es factible vacunar transcutáneamente con tres antígenos ETEC. El LTR192G es un antígeno y adyuvante importante, y éste mejora la respuesta inmune para CS3 por 5 veces CS6 por 24 veces.
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Ejemplo 4 Moléculas CS3 y CS6 son antihigiénicamente distintas
Se determina la especificidad de la respuesta inmune para CS3 y CS6. Los ratones se pretratan con pelado de cinta y reciben dos parches uno en el día 0 y el otro en el día 14. Los grupos de animales se vacunan con 25 \mug CS3/10 \mug LTR192G o con 25 \mug CS6/10 \mug LTR192G. Diez días después de la segunda dosis (día 24) de recolecta el suero y se evalúa para anticuerpo para CS3 y CS6. Los resultados mostrados en la Figura 7 demuestran que la vacunación con CS3 provocan anticuerpos específicos que no exhiben reactividad cruzada con CS6. De la misma manera, los anticuerpos CS6 no reconocen el CS3. Estos resultados muestran claramente que la inmunidad para hacer CS3 y CS6 es altamente especifica y que las vacuna ETEC destinadas para protección de amplio rango contra cepas E. coli enterotoxigénicas necesitara ser multivalente.
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Ejemplo 5 TCI con CS3 y LTR192G provoca anticuerpo de subclase IgG1 y IgG2a
Se pre-afeitan ratones en la base de sus colas y se hidrata la piel con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. Su piel hidratada se pretrata con papel lija 10 veces. Los grupos de ratones se vacunan con 25 \mug CS3 solo o con una combinación de 25 CS \mug 3/10 L \mug TR192G. Los ratones se vacunan transcutáneamente tres veces (día 0,14 y 28) y se recolecta el suero 30 días después de la tercera inmunización (día 58). Los resultados mostrados en la Figura 8 demuestran que el IgG1 es la subclase IgG principal provocada aquí. Los títulos IgG1 son mayores cuando el adyuvante LTR192G se co-administra con CS3. En adición, También se detecta el IgG2a específico de antígeno medible. La subclase IgG2a, sin embargo, solo se detecta cuando el adyuvante se co-administra. Estos resultados se confirman y extienden la observación anterior de que el adyuvante LTR192G no aumenta la respuesta de anticuerpo de suero a CS3 y demuestra adicionalmente que el adyuvante también puede dirigir respuestas inmunes Th2 y Th1 suministrados por la ruta epicutánea.
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Ejemplo 6 TCI con CS6 y LTR192G provocan anticuerpo de subclase IgG1 e IgG2a
Se afeitan los ratones pretratados como se describió en el ejemplo 5. Los grupos de ratones se vacunan transcutáneamente con 25 \mug CS6 solo o con una combinación de 25 \mug CS6/10 L \mug TR192G. Los ratones reciben tres vacunaciones (día 0,14 y 28) y se recolecta el suero 30 días después de la tercera inmunización. Los resultados en la Figura 9 demuestran que el adyuvante LTR192G (es decir, aumento) la respuesta IgG en suero a CS6. Como con el CS3, los anticuerpos para CS6 son subclases IgG1 e IgG2a. Las generaciones IgG2a específica de CS6, sin embargo, es dependiente del uso del adyuvante LTR192G.
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Ejemplo 7 Subclase IgG de suero provocada para LTR192G luego de TCI
Se pretratan ratones mediante el mismo procedimiento descrito en los ejemplos 5 y 6. Los ratones reciben tres vacunaciones transcutáneas (día 0,14 y 28) y se recolecta el suero 30 días después de la tercer de la tercera inmunización (día 58). Los resultados mostrados en la Figura 10 muestran que el IgG1 es una subclase anticuerpo de suero principal provocada pro TCI. Como con las subclases CS3, CS6, IgG2a específico de LTR192G también se provoca por TCI.
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Ejemplo 8 Subclase IgG de suero provocado para LTR192G cuando se co-administra con CS3 o CS6 en TCI
Se pretratan ratones mediante los procedimientos descritos en los ejemplo 5-7. en éste estudio, 10 \mug de LTR192G se mezcla con 25 \mug de CS3 o 25 \mug de CS6. los grupos de ratones reciben tres vacunaciones transcutáneas en el día 0,14 y 28 y se recolecta el suero 30 días después de la tercera inmunización (día 58). Como se observa en el ejemplo 7, el IgG1 de suero es el anticuerpo de subclase principal provocado contra el LTR192G (Figura 11). También se produce IgG2a medible. Este estudio demuestra adicionalmente que la vacunación con una combinación de CS3/LTR192G o CS6/LTR192G no afecta negativamente la producción de anticuerpos para el adyuvante. Estos resultados indican que como un componente de vacuna ETEC el LTR192G sirve un doble propósito, como un adyuvante y como un antígeno en la vacuna.
La significancia de la caracterización de la subclase IgG se relaciona con el mecanismo mediante el cual una vacuna ETEC transcutánea puede proteger contra infección natural. Estos resultados demuestran que la vacunación transcutánea provoca dos subclases de anticuerpo IgG que se espera funcionen de forma diferente en la protección del anfitrión contra la infección natural. Estos mecanismos son por "neutralización" y" citotoxicidad mediada por complemento". Los anticuerpos IgG1 para CS3 y CS6, por ejemplo, se espera que funcionen al bloquear (neutralizar) la capacidad de las cepas CS3^{+} y CS6^{+} ETEC de colonizar el intestino delgado, una etapa que es esencial para la patogenia. Los anticuerpos de clase IgG2a se espera que protejan al anfitrión de la infección mediante un mecanismo diferente. Esta clase de anticuerpo, cuando está en complejo con los antígenos CS3 o CS6 sobre la superficie de E. coli enterotoxigénico, mediara la activación de complemento, que a través de una serie de etapas enzimáticas, resultara en la lisis (muerte) de las células bacterianas. Ambos mecanismos son efectivos al proteger el sujeto contra la infección.
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Ejemplo 9 Respuesta inmune de mucosa para antígeno CS3 después de TCI
Se caracteriza la respuesta inmune de mucosa (gastrointestinal) por TCI con vacunas de subunidad ETEC. Se conduce a un estudio para determinar si el TCI con CS3 con y sin el LTR192G resultaría en la producción de anticuerpos en la mucosa gástrica. Se afeitan ratones (48 hr por adelantado) en la base de la cola, la piel hidratada y pelado de cinta 10 veces se colocan parques cargados con vacuna sobre la piel pretratada. Los grupos de ratones reciben parches con las siguientes formulaciones: Solución salina amortiguada con fosfato (PBS); 25 \mug de CS3 sólo; y 25 \mug de CS3/10 \mug LTR192G. Los parches se aplican durante la noche. Se vacuna un grupo separado de ratones mediante inyección intradérmica de 25 \mug CS3. Todos los ratones reciben tres vacunaciones en el día 0, 14 y 28. Se recolectan muestras fecales frescas siete días después de la tercera inmunización (día 35). Se procesan muestras como se describe en Materiales y Métodos. La vacunación con CS3 sólo no provoca anticuerpo específico de antígeno, con la excepción de un animal (figura 12 B y C). Los ratones vacunados con CS3/LTR192G desarrolla IgG fecal detectable para CS3. El IgA fecal para CS3 es de bajo nivel (Figura 12 C y G). La vacunación intradérmica con CS3 resulta en títulos IgG e IgA fecal medibles para CS3.
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Ejemplo 10 Respuesta inmune de mucosa para antígenos CS6 después de TCI
Se pretratan ratones e inmunizan como se describe en el ejemplo 9. Se vacunan ratones transcutáneamente con parches que contienen las siguientes formulaciones: solución salina amortiguada con fosfato (PBS); 25 \mug CS6; y 25 \mug CS6 con 10 \mug LTR192G. Los parches se aplican durante la noche. Se inmuniza un grupo de ratones separados mediante inyección intradérmica con 25 \mug de CS6 sólo. Todos los ratones reciben tres vacunaciones (días 14 y 28) y se recolectan muestras fecales 7 días después de la tercera inmunización. Estos resultados se muestran en la figura 13. Los ratones que reciben CS6 sólo desarrollan poca o ningún IgA o IgG fecal detectable (paneles B y F). Los ratones que se vacunan transcutáneamente con CS6/LTR192G tienen bajo título, pero medible, y IgA CS6 específico (panel C). El IgG específico CS6 ya se detecta fácilmente en las muestras de todos los ratones (panel G). Ratones que reciben CS6 intradérmico desarrollan IgA e IgG de antígeno medible (paneles D y H, respectivamente).
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Ejemplo 11 Respuesta inmune de mucosa para antígeno LTR192G después de TCI
Se pretratan e inmunizan ratones como se describe en el ejemplo 9. Los grupos de ratones se vacunan transcutáneamente con parches que contienen las siguientes formulaciones: solución salina amortiguada con fosfato (PBS); 10 \mug de LTR192G sólo; 25 \mug CS3/10 \mug LTR192G; y 25 \mug CS6/10 \mug LTR192G. Los parches se aplican durante la noche. Se inmunizan grupo separado de ratones mediante inyección intradérmica con 25 \mug de CS6 sólo. Estos resultados se muestran en la figura 14. Los ratones que reciben LTR192G sólo por TCI desarrollan IgG e IgA fecal medible (paneles B y F). Los ratones vacunados transcutáneamente con CS3/LTR192G desarrollan IgA específico de LTR192G medible (panel C) e IgG fecal (Panel G). Ratones que se vacunan transcutáneamente con CS6/LTR192G desarrollan IgG e IgA fecal medible para LTR192G (paneles D y H). Estos resultados soportan el papel dual del LTR192G en una vacuna ETEC multivalente como un adyuvante potente para respuestas inmunes de mucosa y sistémicas de amortiguación para colonización de antígenos de factor y como una vacuna para enterotoxina lábil por calor, una toxina responsable de enfermedades clínicas.
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Ejemplo 12 TCI con vacunas ETEC divalentes provoca anticuerpo específico de antígeno que secreta células en el bazo (ASC)
Células B específicas de antígeno se detectan luego en el bazo de ratones vacunados. Los ratones se pretratan y se vacunan transcutáneamente como se describe en el ejemplo 9. Los grupos de ratones se vacunan con una de las siguientes formulaciones: 25 \mug CS3; 25 \mug CS3/10 \mug LTR192G; 25 \mug CS6; 25 \mug CS6/10 \mug LTR192G. Se aplican parches durante la noche a la piel pretratada. Los grupos separados de ratones se vacunan mediante inyección intradérmica en la base de la cola con 25 \mug de CS3 y 25 \mug de CS6. Todos los ratones reciben tres vacunaciones (día 0, 14 y 28). Los bazos se recolectan 30 días después de la tercera inmunización (día 58) y se preparan suspensiones de células únicas y las células cultivadas y teñidas para identificación de células B que producen IgG específico de antígeno (IgG-ASC) y IgA (IgA-ASC) como se describe en Materiales y Métodos. No se detecta IgA-IgG-ASCs en bazos de ratones inmunizados transcutáneamente con CS3 sólo (figura 15, paneles A y B) o CS6 sólo (figura 15, paneles C y D). En contraste, ratones inmunizados transcutáneamente con CS3/LTR192G o CS6/LTR192G desarrollan IgA e IgG-ASC específico de CS6 y CS3, lo que indica que la generación de ASC en el bazo es dependiente de la coadministración del adyuvante. En adición, el IgA-IgG-ASC específico de LTR192G está presente en suspensiones de células de bazo de ratones vacunados con vacunas divalentes (es decir, CS3/LTR192G y CS6/LTR192G). Estos resultados demuestran que la generación de la inmunidad de células B específicas de antígeno mediante TCI es dependiente de la coadministración del LTR192G para estos antígenos.
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Ejemplo 13 TCI con vacuna ETEC trivalente (CS3, CS6 y LTR192G) provoca células que secretan anticuerpo específico de antígeno en el bazo
El propósito de este estudio es caracterizar la respuesta de células B en el bazo después de TCI con una vacuna ETEC trivalente. Se pretratan ratones y se vacunan como se describe en el ejemplo 12. Los ratones se vacunan con parches que contienen un cóctel de 25 \mug CS3/ 25 \mug CS6/10 \mug LTR192G. Los parches se aplican durante la noche y todos los ratones reciben 3 vacunaciones transcutáneas (día 0, 14 y 28). Los bazos se recolectan 30 días después de la tercera inmunización (día 58). Los esplenocitos se cultivan y el ASC específico de antígeno teñido y contado como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se muestran en la figura 16. Los ratones vacunados con la vacuna trivalente (CS3, CS6 y LTR192G), se encuentra que tienen IgA-ASC (panel A) y IgG-ASC (panel B) generados para cada uno de los antígenos ETEC en la vacuna. Esos resultados demuestran que es viable vacunar transcutáneamente con una mezcla de antígenos de subunidad ETEC y provocar expansión clónica de células B específica de antígeno dentro del bazo.
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Ejemplo 14 TCI con vacunas de subunidad ETEC monovalentes y divalentes provoca células que secretan anticuerpo específico de antígeno en nodos linfáticos
Se hace hipótesis de que la vacunación transcutánea en la base de la cola puede resultar en expansión clónica de células B dentro de los nodos linfáticos que drenan la superficie de la piel caudal dorsal. Para probar esta hipótesis, se inmunizan epicutáneamente ratones en la base de la cola sobre la piel que ha sido pelada con cinta 10 veces. Grupos de ratones reciben tres dosis de las siguientes formulaciones: 25 \mug CS3; 25 \mug CS6; 25 \mug CS3/10 \mug LTR192G; 25 \mug CS6/10 \mug LTR192G. Los Parches se aplican durante la noche. Grupos separados reciben inyecciones intradérmicas de 25 \mug CS3 o 25 \mug CS6. Todos los grupos se vacunan tres veces (día 0, 12 y 28) y los nodos linfáticos inguinales se recolectan 30 días después de la tercera inmunización. Se preparan suspensiones celulares únicas y se cultivan con antígenos que se colocan en placas en micro pozos. Se visualiza IgG-IgG-ASC al teñir como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados mostrados en la figura 17 demuestran que la generación del CS3 o IgG-ASC específico de CS6 (paneles A y B, respectivamente) son dependientes de la coadministración del adyuvante. También se observa que el CS3, CS6 y el LTR192G específico del ASC no es numeroso en el nodo linfático a diferencia del bazo (Figura 15). Esto es consistente con la hipótesis de que la inmunización de la piel mejora probablemente la movilización y activación de las células Langerhans residentes en la piel para llegar a ser activadas por la interacción LTR192G con el receptor GM1. El antígeno cargado y las células Langerhans activas se considera que egresan de la epidermis, migran a través de la dermis, y entran al drenaje linfático. Las células Langerhans de antígeno que tienen residencia en el nodo linfático son células B que tienen lugar en la expansión clónica, por lo tanto la abundancia relativa de CS3, CS6 y LTR192G dentro del drenaje del nodo linfático inguinal.
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Ejemplo 15 Generación de inmunidad de células B para mezclas complejas de antígenos ETEC suministrados por TCI
También demostramos que el TCI es adecuado para inmunizar con una mezcla compleja de antígenos. Los ratones se pretratan e inmunizan como se describe en el ejemplo 14. El parche se carga con un cóctel de tres antígenos ETEC en la siguiente formulación: 25 \mug CS3, 25 \mug CS6 y 10 \mug LTR192G. Después de tres inmunizaciones epicutáneas, los nodos linfáticos inguinales se recolectan y se determina el CS3, CS6 e IgG-ASC específico de LTR192G. La figura 18 muestra TCI con la vacuna ETS trivalente que estimula la degradación del ASC específico para cada uno de los antígenos de Sub unidad en la vacuna.
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Ejemplo 16 Vacunación transcutánea con CFA/I provoca inmunidad sistémica
Habiendo establecido que es posible inmunizar por vía de la piel con mezclas de antígenos de alto peso molecular, investigamos luego la viabilidad del TCI con una vacuna ETEC tetravalente. El CFA/I se expresa ampliamente por las cepas ETEC asiladas a través del mundo. Se estima que el 30% de todas las cepas ETEC humanas expresan CFA/I inicialmente, determinamos si el CFA/I es inmunogénico cuando se suministra dentro de la piel. En estos estudios, se afectan los ratones en la base de la cola, se hidrata la piel y se raspa gentilmente con lijas 5 veces para interrumpir el estrato corneo. El parche se carga con una de las siguientes formulaciones: 25 \mug CFA/I o 25 \mug CFA/I/10 \mug LTR192G. Los parches se aplican durante la noche. Se Inmuniza un grupo separado por inyección intradérmica con 25 \mug CFA/I. Todos los ratones reciben dos dosis (dia 0 y 14) y se recolecta el suero para análisis diez días después de la segunda inmunización (día 24). Como se muestra en la figura 19, los ratones vacunados transcutáneamente con CFA/I desarrollan anticuerpos de suero después de dos inmunizaciones (panel A). La coadministración con LTR192G incrementa la respuesta serológica aproximadamente 8 veces, lo que indica que el LTR192G es un adyuvante general para estimular la respuesta inmune a antígenos presentados en la piel. Como se espera, ratones vacunados transcutáneamente también desarrollan anticuerpos para LTR192G (panel B).
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Ejemplo 17 Vacunación Transcutánea con CFA/I provoca inmunidad de mucosa
Se recolectan muestras fecales frescas de ratones que se han inmunizado transcutáneamente con CFA/I en el ejemplo 16. Las muestras fecales se prueba para IgA e IgG específico de CFA/I. como se muestra en la Figura 20, el CFA/l solo no provoca la generación de IgA fecal (panel B) o IgG fecal (panel F) detectables. Los ratones que reciben CFA/l y LTR192G producen IgA (panel C) y IgG (panel G) luego de vacunación. De manera interesante, los ratones que reciben CFA/I por inyección intradérmica no generan anticuerpos fecales para el antígeno (paneles D y H).
Los ejemplos 16 y 17 demuestran que es viable vacunar transcutáneamente con CFA/l y que esa producción de una respuesta de mucosa y sistémica que es, en alto grado, dependiente de la co-administración del adyuvante.
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Ejemplo 18 Vacunación Transcutánea con una vacuna ETEC tetravalente provoca la inmunidad sistémica
Un amplio cubrimiento mediante una vacuna para evitar la infección ETEC requerirá el uso de una vacuna multivalente. Estudios epidemiológicos demuestran que un amplio cubrimiento de la vacuna ETEC (80%-90% de cepas ETEC) requerirá probablemente una combinación de por lo menos tres antígenos de factor de colonización con enterotoxina lábil por calor E. coli (LT). Se conducen los siguientes estudios para demostrar la viabilidad de la vacunación transcutánea con una vacuna tetravalente. Se preafeitan ratones aproximadamente 48 hr antes de TCI y se hidrata la piel con 10% glicerol y 70% alcohol isopropílico. El sitio de vacunación se pretrata con lija 5 veces y se aplica a la piel parche cargado con vacuna. La formulación utilizada aquí es 25 \mug CFA/I, 25 \mug CS3, 25 \mug CS6 y 10 \mug LTR192G. Los ratones se vacunan dos veces en el día 0 y 14 y se recolecta el suero para evaluación 10 días después de segunda inmunización (día 24). Los resultados en la Figura 21 muestran que todos los cuatros componentes de la vacuna provocaron respuestas en suero después de dos inmunizaciones. También se debe destacar que la dosis de adyuvante LTR192G (10 \mug) no necesita ser incrementada adicionalmente con el fin de alcanzar la inmunización. está observación es significativa ya que esto indica claramente que las mezclas complejas de vacunas de subunidad también se pueden suministrar por vía de la piel y que la actividad adyuvante del LTR192G no requiere incremento adicional en la dosis del adyuvante. Adicionalmente, la antigenicidad del LTR192G no se disminuye por la co-administración con múltiples antígenos s (CS3, CS6 oCFA/I).
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Ejemplo 19 Vacunación transcutánea con vacuna ETEC tetravalentes provoca inmunidad mucosa para antígenos de factor de colonización
Se pretratan ratones como se describe en el ejemplo 18. Se vacunan grupos de ratones con parches que contiene la siguiente formulación: 25 \mug CFA/l, 25 \mug CS3, 25 \mug CS6 y 10 \mug LTR192G. Todos los ratones se vacunan transcutáneamente en la base de la cola en el día 0, 14 y 28. Se recolectan muestras fecales 2 semanas después de la tercera inmunización (día 42). Las muestras se procesan y evalúan para anticuerpos para cada uno de los antígenos en la vacuna. Los resultados mostrados en la Figura 22 demuestran que el IgG e IgA fecal se provoca para CFA/I (paneles A y D), CS3 (paneles B y E), y CS6 (paneles C y F).
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Ejemplo 20 TCI con Vacuna ETEC tetravalente provoca inmunidad antitoxina (LT)
Se recolectan muestras fecales de ratones que se vacunan como en los ejemplo 18 y 19. Las muestras se procesan como se describe en Materiales y Métodos y se evalúa para IgA y IgG fecales para LTR192G. como se muestra en la Figura 23, el LTR192G provoca títulos significativos de anticuerpos IgA y IgG específicos de antígeno, en donde el adyuvante se administra solo (paneles A y D), con CFA/I (paneles B y E), o como una cóctel tetravalente (paneles C y F).
Estos ejemplos anteriores demuestran claramente que las vacunas multivalentes pueden ser suministradas eficientemente por vía de la piel sin el uso de una aguja hipodérmica, inyector de chorro, u otros interruptores de barrera. Estos ejemplos también demuestran que el adyuvante LT tiene un papel significativo en la estimulación de la producción de anticuerpos de suero de alto tipo, dirigir la respuesta humoral al mediar la producción de IgG1 e IgG2a específico de antígeno; y es esencial en algunos casos para promover una respuesta de anticuerpo de mucosa para antígenos de factor de colonización ETEC. Hemos demostrado que la vacuna multivalente se suministra efectivamente por TCI sin competición perjudicial entre el cóctel de antígenos. Esto es importante en el tratamiento de enfermedades originadas por patógenos que expresan una variedad de especificidad antigénica debido a que asegura el cubrimiento de la mayoría de aislados diferentes que probablemente requerirán incluir cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más antígenos en una vacuna. La neutralización de toxina y la prevención de infección suministran tratamiento en dos puntos críticos (terapéutica y profiláctico) de interacción de anfitrión-patógeno. Esta es una mejora inesperada sobre la técnica anterior.
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Ejemplo 21 TCU provoca anticuerpos neutralizantes de larga vida contra LT
Se reclutan voluntarios humanos en un ensayo clínico de fase I. los voluntarios se inmunizan transcutáneamente sobre la piel sobre el músculo deltoide. La piel se pretrata con alcohol isopropílico y se hidrata con una mezcla del 10% glicerol y 70% isopropílico. Se fija un parche de gasa (4 x 4 pulgadas) a un respaldo adhesivo y una solución acuosa de LT se aplica al parche. Las formulaciones de parche húmedo están en PBS con 5% de lactosa que contiene una de las siguientes cantidades de LT: 50 \mug, 100 \mug, 250 \mug o 500 \mug. los voluntarios reciben dos dosis (día 0 y 30). El suero se recolecta antes de inmunización (pre-inmune) y 312 días después de la primera inmunización (post-inmunización). Por ELISA, el suero exhibe titulo de anticuerpo para LTR192G que esta sobre sus títulos pre inmunes (Tabla 6).
TABLA 6 Detección de anticuerpo de suero después de dos rondas de TCI
6
Se utilizan ensayos de células CHO In Vitro para determinar si este suero contiene anticuerpos que puedan neutralizar la unión del receptor LT y la toxicidad In Vitro. Se encuentra que todo el suero tiene anticuerpos que bloquean la toxicidad LT (neutraliza) In Vitro. Este resultado muestra que el TCI provoca anticuerpos que funcionan para neutralizar los efectos tóxicos de enterotoxinas lábiles por calor LT en las células. El TCI provoca inmunidad a largo plazo para LT y los anticuerpos inducidos por lo tanto neutralizan la toxina.
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Ejemplo 22 Vacunación transcutánea con vacunas de subunidad CS3 y LTR192G provoca anticuerpo de suero que reconocen antígenos en células completas CS3^{+} ETEC
Mostramos luego que los anticuerpos provocados por vacunación transcutánea son inmuno reactivos con epitopos conformacionales nativos expresados por organismos E. coli enterotoxigénico. Los ratones se preafeitan y se hidrata la piel el parche se prepara al aplicar directamente una solución acuosa (25 \mul) que consiste de 25 \mug CS3 y 10 \mug de LTR192G al parche de gasa mientras la piel se mantiene aún hidratada, se aplica el parche y se mantiene en el lugar durante \sim18 hr. Un grupo 10 ratones recibe dos parches en el día 0 y 14. El suero se recolecta 10 días después de la segunda inmunización en el día 24. El suero se evalúa por el método ELISA para anticuerpos para CS3, LTR192G y CS3 que expresan E. coli enterotoxigénicas (cepa E243778). Los resultados mostrados en la Figura 24 demuestran que los ratones inmunizados desarrollan títulos de anticuerpo significativos CS3 purificado (1:70,464), y LTR192G (1:32,657). Estos sueros también se encuentra que tienen títulos de anticuerpo de sueros significativos para células completas ETEC (1:11,206). Estos resultados demuestran que el TCI con vacuna de subunidad ETEC (por ejemplo CS3 y LTR192G) resulta en la producción de anticuerpo que reconocen determinantes conformacionales nativos sobre una cepa ETEC que expresa CS3.
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Ejemplo 23 TCI con ETEC muerto provoca inmunidad contra patógeno bacteriano
Es viable vacunar transcutáneamente con un organismo bacteriano muerto aplicado a la piel. El ETEC (cepa E243778) crece en un medio de crecimiento bacteriano.
La bacteria se cosecha de los cultivos por centrifugación y se lava con solución salina amortiguada con fosfato. Un 2% de solución de formalina se agrega al glóbulo de células y las células se suspenden a una suspensión celular única. Las células se mezclan durante la noche a temperatura ambiente con el fin de matar todas las bacterias. Las células muertas se lavan y se resuspenden en PBS. Los ratones se afeitan y la piel en la base de la cola se pretrata con pelado de cinto 10 veces para remover el estrato corneo. Se carga el parche de gasa con 25 \mug de volumen que contiene 10^{9} células completas ETEC muertas (EWC) y se agrega 10 \mug LTR192G a la mezcla. El parche se aplica durante la noche. Un grupo de 10 animales se vacunan el día 0 y 14 se recolecta el suero 10 días después de la segunda inmunización. El suero se evalúa para anticuerpo para EWC y LTR192G utilizando el método ELISA descrito en Materiales y Métodos. Los resultados se describen en la Figura 25. se encuentra que todos los ratones se han convertido serológicamente y tienen anticuerpos de suero para las células completas bacterianas (1: 324) así como también LTR192G (1: 21,044). Estos resultados son la primera demostración de que es viable vacunar transcutáneamente con células completas bacterianas muertas y provocar una respuesta inmune especifica de organismo.
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Ejemplo 24 TCI con factor de colonización ETEC, entero toxina lábil al calor (LT), y antígenos de toxina estable al calor (ST)
Se conocen ciertas cepas de E. coli enterotoxigénicas para producir una segunda entero toxina llamada entero toxina estable al calor (ST). Similar a la entero toxina lábil al calor (LT), el ST es altamente reactogénico en humanos y es una causa de diarrea severa en niños y adultos. Las cepas de ETEC pueden productor STa sola, LT sola, o una combinación de STa y LT. STa es un péptido de bajo peso molecular 19 amino ácidos y contiene 6 cisteínas. El STa es conocido como inmunogénico pobre cuando se administra por inyección. Este estudio se conduce para demostrar que es posible suministrar transcutáneamente una vacuna ETEC compleja que consiste de múltiples factores de colonización (CS3 y CS6) y entero toxinas (LT y ST). Los ratones se pretratan mediante pelado de cinta 10 veces en la base de la cola utilizando el método descrito aquí. Las formulaciones de parche utilizadas aquí son las siguientes: 25 \mug CS3/25 \mug CS6; 25 \mug CS3/25 \mug CS6 110 \mug LTR192G; 25 \mug CS3/25 \mug CS6/10 \mug LTR192G/8 \mugST. Los ratones reciben tres vacunaciones transcutáneamente en el día 0, 14 y 28 y se recolecta el suero dos semanas después de la tercera inmunización. Los resultados mostrados en la figura 26 demuestran que la inmunidad para los factores de colonización se mejoró significativamente por la adición de LTR192G. Este estudio también demuestra que la adición del ST se puede agregar a la vacuna ETEC multivalente sin afectar adversamente la acción adyuvante del LTR192G o la generación de la respuesta inmune de estos factores de colonización. Esto sugiere que será posible desarrollar una vacuna ETEC pentavalente que consiste de SC3, CS6, CFA/I, LT y STa o cualquier otra combinación de antígenos. Estos antígenos se pueden administrar de forma segura por vía de TCI sin toxicidad o serios efectos colaterales adversos.
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Ejemplo 25 Formulaciones de parches secados al aire y de proteína en adhesivo para suministra de antígenos ETEC
Los parches son vehículos versátiles para suministrar vacunas ETEC mediante TCI. Aquí, el LT se formula en cuatro formas diferentes. Primero, el LT (10 \mug) se formula en una solución acuosa que consiste de solución salina amortiguada con fosfato de de pH neutro que contiene 5% de lactosa (P/V). Esta formulación se aplica directamente a la piel hidratada con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico. La solución se deja sin interrupción o se deja reposar con una almohadilla de gasa durante 1 hr. Segundo, el LT se mezcla con varios adhesivos (por ejemplo, Klucel). Luego la formulación se esparce como una capa delgada sobre un respaldo oclusivo. El LT se esparce con una prensa Rotograveur como una película fina a una concentración efectiva de 10 \mug en un área de 1 cm^{2}. La película se seca al aire a temperatura ambiente y contenido de humedad que varia entre menos de 0.2% a 5% de agua. Los parches se perforan (\sim1 cm^{2}) desde la lámina. Los parches se almacenan a temperatura ambiente y exhibe 4ºC las mismas características de suministro. Tercero, el LT se aplica directamente a una almohadilla de gasa y se esparce uniformemente sobre la superficie a una concentración de 10 \mug/cm^{2}. Estos parches se secan al aire durante la noche. Cuarto, LT (10 \mug en 25 \mul de PBS y 5% de lactosa) en una formulación acuosa se deja caer directamente sobre la almohadilla de gasa (\sim1 cm^{2}) que se fija a un respaldo adhesivo. Estos parches se secan al aire durante la noche a temperatura ambiente. Estos parches se almacenan a 4ºC durante un mes antes de uso.
Los parches se comparan para suministro de antígeno LT utilizando el modelo de ratón descrito en Materiales y Métodos. La piel afectada en la base de la cola se hidrata y se pretrata con un hisopo que contiene piedra pómez (formulado con 10% de glicerol y 70% de alcohol isopropílico) para interrumpir el estrato corneo. Grupos de cinco ratones reciben dos parches: Uno en el día 0 y el otro en el día 14. El parche secado al aire se rehidrata con 25 \mul de agua antes de aplicación. Los parches se remueven después de 24 hr. Para la formulación líquida, la solución que contiene LT se deja sobre la piel durante 1 hr antes de enjuagar con agua para remover el exceso de LT. El suero se recolecta de cada animal dos semanas después de la segunda inmunización (día 28). Los resultados se muestran en la figura 27. Estos resultados demuestran que todos los métodos son adecuados para suministro transcutáneo de LT a través de la piel. Este ejemplo muestra que la formulación de parche puede ser un líquido acuoso que se aplica directamente a la piel y sobre ella con un parche; un parche seco con los antígenos incorporados dentro del adhesivo (proteína en adhesivo) y se esparce como una cubierta delgada sobre un respaldo oclusivo; un parche en el que los antígenos se aplican en la solución directamente (en forma separada o como un cóctel) a una superficie adecuada y se le permite secar al aire; o como un parche hidratado en el que los antígenos están en un solución y la cantidad apropiada de la solución se aplica directamente a la superficie del parche brevemente antes de aplicar el parche.
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Ejemplo 26 Formulaciones proteína en adhesivo para suministro transcutáneo de vacunas de subunidad ETEC y entero toxinas
Las formulaciones proteína en adhesivo están destinadas a incorporar uno o más antígenos de subunidad ETEC dentro de una formula adhesiva. La formula también es adecuada para incorporar células completas ETEC muertas (\sim10^{4} a 10^{8} bacterias muertas por dosis) con o sin adyuvante LT. Luego la mezcla se moldea sobre una hoja de respaldo oclusiva (o semi oclusiva) como una película delgada. La mezcla de vacunas/adhesivo se le permite curar (temperatura ambiente o 40ºC) hasta que se seca la película (contenido de agua puede variar entre 0.5% y 5%; 1-2% se desea). La película moldeada se corta del molde a la forma y tamaño deseado. Los parches secos se sellan luego en una bolsa de lámina o plástico impermeable al agua, hermética a la luz. Los parches producidos de esta forma se pueden almacenar refrigerados o a temperatura ambiente. La proteína en adhesivo es flexible en que la mezcla de vacuna multivalente se puede variar para incorporar diferentes cantidades y proporciones de uno o más antígenos múltiples y adyuvantes. En adición, el tamaño del parche se puede variar con el fin de ajustar la dosificación. Dependiendo de la edad del individuo, se puede variar el tamaño del parche (dosis) para uso en niños y adultos.
Las formulaciones de proteínas en adhesivo son flexibles y permiten únicamente que las vacunas se cubran en capas. Estos parches se fabrican en una forma en donde cada componente de vacuna se cubre de forma separada en la parte de respaldo del parche. El objetivo es crear una membrana multilaminar en donde el componente uno se cubre en la lámina de respaldo, la película del componente dos se cubre sobre uno, el componente tres está cubierto en la parte superior de los componentes uno y dos y el componente cuatro es la capa más externa. La ventaja de este método es que proporciona flexibilidad a la formulación (es decir, los parches se pueden producir a partir del mismo proceso utilizando diferentes proporciones de antígeno y adyuvante o en el caso en donde la vacuna se fabrique para contener sólo uno o dos componentes). Esta fórmula multicapa también tiene la ventaja de controlar la proporción de liberación de calentador de agua antígeno y el adyuvante. En algunos casos, será deseable tener el adyuvante LT liberado inmediatamente con el fin de preimprimir las células dendríticas de la piel (células Langerhans) antes de liberar los otros antígenos. En tales formulaciones, las células Langerhans cebadas con LT pueden capturar más eficientemente y procesar la toxina y los antígenos de factor de colonización. El suministro controlado es un uso más eficiente del adyuvante y los antígenos y permitirá que las dosis se reduzcan adicionalmente.
La tablas 7-8 describen formulaciones que pueden ser adecuadas para estabilizar adyuvantes y/o antígenos dentro de un adhesivo. Los siguientes están destinados a ser ejemplos de tales formulaciones y no están destinados a restringir la formulación.
TABLA 7 Formulación EPO Eudragit
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TABLA 8 Formulación adhesiva con CS6 E. coli y LT
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Ejemplo 27 Las formulaciones en gel para suministro de vacunas de subunidad ETEC (CS3, CS6, CFA/I, ST y LT) y células completas ETEC muertas
Los geles son ejemplos de parches húmedos o completamente hidratados. Estas formulaciones están destinadas a incorporar uno o más antígenos de subunidad ETEC entrapados dentro de una matriz de gel. Esta formulación también es adecuada para suministro transcutáneo de células completas ETEC muertas (\sim10^{4} a 10^{8} bacterias muertas por dosis) con o sin LT. Las vacunas se formula al mezclar una solución que contiene los antígenos en las cantidades deseadas y proporciones con un carbómero, plurónico, o una mezcla de los dos componentes de gel (ver adelante). La vacuna que contiene gel se cubre luego sobre una tira del material que mantiene el gel en el lugar sin pérdida. Es importante que el material tenga una baja capacidad de unión para las proteínas en la vacuna. La tira puede comprender materiales tales como polímeros, tejidos naturales y sintéticos, no tejidos, láminas, papel, caucho, o combinaciones de estos. La tira puede ser una capa única o un laminado de más de una capa. Generalmente, la tira es sustancialmente impermeable al agua y ayuda a mantener la piel en condición hidratada. El material puede ser cualquier tipo de polímero que cumpla la flexibilidad requerida y la baja capacidad de unión para las proteínas. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietileno, vinilacetato de etilo, alcohol etinil vinilo, poliésteres, o teflón. La tira de material para soportar el gel es de menos de 1 mm de espesor, preferiblemente menos de 0.05 mm de espesor, más preferiblemente 0.001 a 0.03 mm de espesor.
La tira cargada con gel puede ser de diferentes tamaños y formas. Se prefiere que las esquinas sean redondeadas para facilidad de aplicación. La longitud de la tira puede variar y es dependiente del usuario (es decir. niños o adultos). Esta puede ser de aproximadamente 2 cm a aproximadamente 12 cm, y es preferiblemente de aproximadamente 4 cm a aproximadamente 9 cm. El ancho de la tira variara pero será de aproximadamente 0.5 cm a aproximadamente 4 cm.
La tira puede contener bolsillos poco profundos u hoyuelos. Para mantener en el lugar, cuando el gel que contiene la vacuna se cubre con la tira, el gel debe llenar los bolsillos poco profundos que proporcionan reservorios para el gel. Los bolsillos poco profundos pueden ser de aproximadamente 0.4 mm de largo y aproximadamente 0.1 mm de profundidad. El parche cargado de gel es de aproximadamente 1 mm de espesor, con un espesor preferido de aproximadamente 0.5 mm o menos.
La rigidez a la flexión es importante ya que el máximo contacto entre el gel y la piel se debe mantener. La tira necesitara conformar el contorno de la ubicación anatómica en donde se aplica el parche (por ejemplo, la piel sobre el músculo deltoides, el antebrazo, nuca, detrás de la oreja, u otras ubicaciones). La rigidez a la fracción se pude medir con un -Handle- O-Meter (Thwing Albert Instruments). La rigidez a la fricción debe ser menor de 5 gm/cm, más preferiblemente menos de 3 gm/cm. La relativamente baja rigidez permite que la tira de material para cubrir la superficie contorneada con poca fuerza.
La tira cargada con gel se mantiene en el lugar al fijar la tira a un respaldo adhesivo con la superficie de gel que está lejos del respaldo de adhesivo. El material de respaldo puede ser oclusivo o semi oclusivo (por ejemplo, Tegaderm). El respaldo está diseñado para soportar el parche en el lugar, para ayudar a mantener el máximo contacto entre la piel y el gel, y evitar que el gel se deshidrate durante uso.
Para evitar la deshidratación del parche húmedo durante almacenamiento y manejo, este se puede colocar enana tira plástica inerte, que es bastante rígido. La superficie de gel estará en contacto directo con la tira plástica, y la interfaz gel/plástico tiene baja fuerza de pelado haciendo más fácil separar la tira de gel de la tira plástica. La tira plástica puede ser hecha de material de polietileno o similar. El parche de gel se puede empacar en una bolsa de lámina o plástica hermética al agua y aprueba de luz. La bolsa se puede almacenar refrigerada o a temperatura ambiente.
Los siguientes está propuestos como ejemplos de la formulación de gel hidratada y no están destinados a restringirla: geles en solución salida amortiguada con fosfato; 1% de carbonero 1342; 1.5% de carbonero 940; 1.5% de carbonero 934; 1.5% de carbómero 940; 2% de sacarosa, 10% de alcohol isopropílico, 10% de gricerol, 50% de F87 blurónico; y 30% de F108 plurínico.
Los polímeros carbonero son polímeros basados en ácido acrílico de alto peso molecular que se pueden reticular con sacarosa alilo o alil pentaeritritol, y/o modificar con alquil acrilatos C10-C30. Estos pueden o no ser incorporados dentro de un parche o se pueden suministrar por otros medios conocidos en la técnica dentro de la piel.
Las formulaciones pueden estar comprendidas de carbómeros de diferentes promedios de peso molecular. Por ejemplo los polímeros pueden ser carbómero 1342 (por ejemplo, 1% de carbómero 1342, 0.6 mg/ml LT, 0.3% de metilparabeno, 0.1% propilparabeno, 2.5% lactosa, PBS 1X); carbonero 934 (por ejemplo, 1.5% Carbonero 934, 0.6 mg/ml LT, 0.3% metilparabeno, 0.1% propilparabeno, 2.5% lactosa, PBS 1X); o carbonero 940 (por ejemplo, 1.5% carbonero 940, 0.6 mg/ml LT, 0.3% de metilparabeno, 0.1% propilparabeno, 2.5% lactosa, PBS 1X). Cada formulación se puede preparar en una solución salina amortiguada con fosfato y contiene LT enana concentración de aproximadamente 0.6 mg/ml o menos pero los antígenos y adyuvantes también se pueden formular de aproximadamente 0.001 mg/ml a aproximadamente 0.6 mg/ml o de aproximadamente 0.6 mg/ml, a aproximadamente 6 mg/ml. Adicionalmente los agentes antimicrobianos tal como metilparabeno y propilparabeno se pueden incluir.
Las combinaciones de carbonero 940 y pluronic F87 (por ejemplo 1.5% carbonero 940, 0.5% plurónico F 87,0.6 mg/ml LT, 0.3% de metilparabeno, 0.1% propilparabeno, 2.5% lactosa, PBS 1X) se puede utilizar. Los plurónicos son otra clase de hidrogel que contiene segmentos de repetición de óxido de etileno-óxido de propileno-óxido de etileno. La cantidad de LT y los agentes antimicrobianos en la formulación puede ser idéntica.
Otras formulaciones pueden mejorar el suministro utilizando mejoradores de penetración y carbómeros. Por ejemplo, un gel puede comprender carbómero 940 con farmasolv (por ejemplo, 1.5% carbómero 940, 10% farmasolv, 0.6 mg/ml LT, 0.3% de metilparabeno, 0.1% propilparabeno, 2.5% lactosa, PBS 1X), mientras el gel final puede contener carbómero 940, glicerol e isopropanol (por ejemplo, 1.5% carbómero 940, 10% glicerol, 10% isopropanol, 0.6 mg/ml LT, 0.3% de metilparabeno, 0.1% propilparabeno, 2.5% lactosa, PBS 1X). La concentración de LT y agentes antimicrobianos puede permanecer idéntica a las formulaciones anteriores o puede estar en otros rangos especificados.
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Ejemplo 28 Dosificación para CS3, CS6, CFA/I, ST y LT
El rango de dosis puede variar y puede ser dependiente de la edad y afección médica del sujeto. Las dosis de 1 mg a menos de 5 \mug puede provocar respuestas inmunes específicas de antígeno en sujetos animales y humanos. La dosis de adulto deseado puede variar para factores de colonización de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 100 \mug de cada uno (por ejemplo, CS3, CS6 y CFA/1); la dosis preferida de cada factor de colonización es de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug. La dosis de adulto deseada puede variar para LT de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 100 \mug; la dosis preferida de LT es de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug. La dosis de adulto deseada puede variar para ST (no conjugado a una proteína portadora) de aproximadamente 1 \mug aproximadamente 100 \mug. En razón a que el ST es pobremente inmunogénico, la dosis de adulto puede ser de aproximadamente 25 \mug a aproximadamente 100 \mug. si el ST se acopla químicamente a LT (LT-ST) la dosis equivalente de ST puede ser de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug. La inmunogenicidad se puede mejorar al conjugar el ST con otras proteínas portadoras, que incluye, por ejemplo, albúminas, KLH o anticuerpos agregados. Este último caso, la dosis de ST puede ser de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug.
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Una reivindicación que utiliza la transición "que comprende" permite la inclusión de otros elementos para estar dentro del alcance de la reivindicación; la invención también se describe mediante tales reivindicaciones utilizando la frase de transición "que consiste esencialmente de" (es decir, que permite la inclusión de otros elementos para estar dentro del alcance de la reivindicación si ellas no afectan materialmente la operación de la invención) y la transición "que consiste de" (es decir, que solo permite los elementos listados en la reivindicación diferentes de las impurezas o actividades sin consecuencia que se asocian ordinariamente con la invención) en cambio del término "que comprende". No hay relación particular entre limitaciones de una reivindicación significa que a menos que la relación se mencione explícitamente en la reivindicación (por ejemplo, la disposición de componentes en una reivindicación de producto u orden de etapas en una reivindicación de método no es una limitación de la reivindicación a menos que se establezca explícitamente). Así, todas las combinaciones posibles y permutaciones de los elementos individuales descritos aquí están destinadas a ser considerados parte de la invención.
De lo anterior, será evidente para una persona experta en la técnica que se puede incorporar en otras formas específicas sin apartarse de su espíritu o características esenciales. Las modalidades descritas se deben considerar sólo como ilustrativas, no restrictivas ya que el alcance de la protección legal suministrada para la invención se indicará por las reivindicaciones adjuntas a diferencia de esta especificación.
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<110> El gobierno de los Estados Unidos, representado por el secretario del Ejército Glenn, Gregory M.
\hskip1cm Cassels, Frederick J.
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<120> Vacuna para inmunización transcutánea
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<130> 4057-55
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<140> PCT/US02/04254
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2002-02-13
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<150> US 60/268,016
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<151> 2001-02-13
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<150> US 60/304,110
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<151> 2001-07-11
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/310,447
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<151> 2001-08-08
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<150> US 60/310,483
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<151> 2001-08-08
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<160> 8
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 36
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Péptido consensus
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<400> 1
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10 
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<210> 2
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<211> 36
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Péptido consensus
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<400> 2
11 
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<210> 3
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<211> 37
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli 
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 37
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli 
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli 
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<400> 5
14 
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<210> 6
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<211> 37
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli 
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 36
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli 
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<400> 7
16 
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<210> 8
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli 
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<400> 8
17

Claims (14)

1. Uso de entero toxina lábil al calor E. Coli (LT) como un inmunógeno en la fabricación de una vacuna para inmunización transcutánea para el tratamiento y/o prevención de la diarrea de viajero, en donde dicho inmunógeno está presente en cantidades efectivas para inducir una respuesta inmune contra una o más cepas de Escherichia Coli enterotoxigénica (ETEC).
2. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la vacuna se aplica a la piel junto con mejorador de penetración físico y/o químico.
3. Un uso de recuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la vacuna comprende adicionalmente por lo menos un adyuvante.
4. Un uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el adyuvante es una endotoxina de ribosilación ADP - o un derivado de esta que tiene actividad adyuvante, el derivado se selecciona del grupo que consiste de: mutantes genéticos; versiones químicamente toxoides; y conjugados químicos o recombinantes genéticos que contienen una exotoxina de ribosilación ADP bacteriana; fragmentos que contienen subunidades A y/o B; y una subunidad B activada genéticamente.
5. Un uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de toxina colera (CT), LT y mutantes de estos que tienen actividad adyuvante.
6. Un uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de LT-K63, LT-R72, y LT(r192G).
7. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el LT es un adyuvante y antígeno.
8. Una formulación de vacuna que comprende endotoxina lábil al calor E. coli (LT) como un inmunógeno para el tratamiento y/o prevención de diarrea del viajero mediante inmunización transcutánea, en donde dicho LT está presente en cantidades efectivas para inducir una respuesta inmune contra una o más cepas de E. coli enterotoxigénicas (ETEC).
9. Una formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la formulación se aplica a la piel junto con mejoradores de penetración físicos y/o químicos.
10. Una formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende adicionalmente por lo menos un adyuvante.
11. Una formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el adyuvante es una exotoxina de ribosilación ADP o un derivado de esta que tiene actividad adyuvante, el derivado se selecciona del grupo que consiste de: mutantes genéticos; versiones químicamente toxoides; y conjugados químicos o recombinantes genéticos que contienen exotoxina de ribosilación ADP bacteriana; fragmentos que contiene subunidad A y/o B; y una subunidad B activada genéticamente.
12. Una formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de CT, LT y mutantes de estos que tienen actividad adyuvante.
13. Una formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de: LT-K63, LT-R72, y LT(R192G).
14. Una formulación de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en donde LT es un adyuvante y antígeno.
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